JP3124344B2 - 重合ダニアレルゲン - Google Patents
重合ダニアレルゲンInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアレルゲン活性を有する
重合ダニアレルゲンに関するものである。
重合ダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】屋内塵性
ダニは、アトピー性気管支喘息等のアレルギー疾患の主
要な原因として重要である。従来、アレルギー疾患の治
療法としては、アレルギーの原因物質であるアレルゲン
を投与して減感作する減感作療法が、最も重要な根本療
法とされ、特に花粉症を始め昆虫アレルギー等、抗原が
特定され易い疾患においては、その評価は今や確立され
たものといえる。しかしながら、この減感作療法ではア
レルゲンによるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全
な治療用抗原の投与が必要とされる。ダニアレルギー疾
患については、屋内塵中のダニアレルゲンとして、ヤケ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及び
コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種
が重要であると報告されている[ J. Allergy : 42,14-2
8,(1968)] 。従来、主要ダニアレルゲンとしてはダニ排
泄物および／またはダニ虫体中に含有されている分子量
24〜28kDの糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、および／または分子
量14.5〜20kDの蛋白（pI 5〜8.3)が報告されている[J.
Immunol. : 125,587-592,(1980）／ J. Allergy Clin.
Immunol. : 76,753-761,(1985)／ Immunology : 46,679
-687,(1982）／ Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. :
81,214-223,(1986)／ J. Allergy Clin. Immunol. : 7
5,686-692,(1985)等] 。
ダニは、アトピー性気管支喘息等のアレルギー疾患の主
要な原因として重要である。従来、アレルギー疾患の治
療法としては、アレルギーの原因物質であるアレルゲン
を投与して減感作する減感作療法が、最も重要な根本療
法とされ、特に花粉症を始め昆虫アレルギー等、抗原が
特定され易い疾患においては、その評価は今や確立され
たものといえる。しかしながら、この減感作療法ではア
レルゲンによるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全
な治療用抗原の投与が必要とされる。ダニアレルギー疾
患については、屋内塵中のダニアレルゲンとして、ヤケ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及び
コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種
が重要であると報告されている[ J. Allergy : 42,14-2
8,(1968)] 。従来、主要ダニアレルゲンとしてはダニ排
泄物および／またはダニ虫体中に含有されている分子量
24〜28kDの糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、および／または分子
量14.5〜20kDの蛋白（pI 5〜8.3)が報告されている[J.
Immunol. : 125,587-592,(1980）／ J. Allergy Clin.
Immunol. : 76,753-761,(1985)／ Immunology : 46,679
-687,(1982）／ Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. :
81,214-223,(1986)／ J. Allergy Clin. Immunol. : 7
5,686-692,(1985)等] 。
【０００３】一方、前記の主要ダニアレルゲンよりも高
分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清
IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒス
タミン遊離を誘導する成分が存在することを本発明者ら
は報告している（日本農芸化学会，62:411, 1988）。し
かし、減感作治療用抗原として用いることができる程度
までの精製は未だなされていなかった。従来、屋内塵性
ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、
屋内塵（ハウスダスト）抽出液が用いられてきている
が、化学的にはその組成が極めて不明確であり、また多
種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性が
あるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて
低いのが現状である。したがって、有効性及び安全性の
観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されて
いる。
分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清
IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒス
タミン遊離を誘導する成分が存在することを本発明者ら
は報告している（日本農芸化学会，62:411, 1988）。し
かし、減感作治療用抗原として用いることができる程度
までの精製は未だなされていなかった。従来、屋内塵性
ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、
屋内塵（ハウスダスト）抽出液が用いられてきている
が、化学的にはその組成が極めて不明確であり、また多
種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性が
あるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて
低いのが現状である。したがって、有効性及び安全性の
観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されて
いる。
【０００４】また、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、前記の屋内塵（ハウスダ
スト）抽出液および／またはダニ虫体抽出液を用いる皮
内反応試験が殆どであり、まれにRAST法による血清中の
IgE 抗体価の測定値（相対値）を併用する程度で、ダニ
アレルギー疾患を直接的に断定するのはかなり困難であ
った。従って、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診
断は、ダニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要
であり、診断システムの確立が期待されている。
ては、従来、問診を主体とし、前記の屋内塵（ハウスダ
スト）抽出液および／またはダニ虫体抽出液を用いる皮
内反応試験が殆どであり、まれにRAST法による血清中の
IgE 抗体価の測定値（相対値）を併用する程度で、ダニ
アレルギー疾患を直接的に断定するのはかなり困難であ
った。従って、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診
断は、ダニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要
であり、診断システムの確立が期待されている。
【０００５】本発明者らは、先にダニ培養中の排泄物抽
出液に含まれる糖蛋白質であって、分子量が約 4,000
（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）のダニアレルゲ
ン、またはこのダニアレルゲンから糖部分を除去して得
られる蛋白質であって、分子量約2,400のダニアレルゲ
ンが、ダニアレルギー疾患の診断薬として極めて有用で
あることを見出した。しかし、これらのダニアレルゲン
はダニアレルギー患者に対する皮内反応活性やＨＰＬＣ
を用いた患者白血球ヒスタミン遊離試験によりアレルゲ
ン活性を有していることが確認されたものの、ダニアレ
ルゲン自体の分子量が小さいため減感作治療用抗原とし
て要求される免疫原性が充分でないことが判った。従っ
て、本発明の目的は、低分子量の所定のダニアレルゲン
を高分子化させてなる重合ダニアレルゲンを提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、該重合ダニアレルゲン
を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤を提供する
ことにある。本発明のさらに他の目的は、該重合ダニア
レルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬を
提供することにある。
出液に含まれる糖蛋白質であって、分子量が約 4,000
（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）のダニアレルゲ
ン、またはこのダニアレルゲンから糖部分を除去して得
られる蛋白質であって、分子量約2,400のダニアレルゲ
ンが、ダニアレルギー疾患の診断薬として極めて有用で
あることを見出した。しかし、これらのダニアレルゲン
はダニアレルギー患者に対する皮内反応活性やＨＰＬＣ
を用いた患者白血球ヒスタミン遊離試験によりアレルゲ
ン活性を有していることが確認されたものの、ダニアレ
ルゲン自体の分子量が小さいため減感作治療用抗原とし
て要求される免疫原性が充分でないことが判った。従っ
て、本発明の目的は、低分子量の所定のダニアレルゲン
を高分子化させてなる重合ダニアレルゲンを提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、該重合ダニアレルゲン
を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤を提供する
ことにある。本発明のさらに他の目的は、該重合ダニア
レルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬を
提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記のダニ
アレルゲンのアレルゲン活性を保持したままで充分な免
疫原性を有するダニアレルゲンを模索したところ、該ダ
ニアレルゲンを高分子化して得られる重合ダニアレルゲ
ンが有用であることを見出し、本発明に至った。
アレルゲンのアレルゲン活性を保持したままで充分な免
疫原性を有するダニアレルゲンを模索したところ、該ダ
ニアレルゲンを高分子化して得られる重合ダニアレルゲ
ンが有用であることを見出し、本発明に至った。
【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１） ダニ培養
中の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セファ
デックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有する
糖蛋白質を高分子化させてなる、平均分子量が約20,000
〜100,000 の重合ダニアレルゲン、（２） ダニ培養中
の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セファデ
ックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有する糖
蛋白質の糖部分を除去して得られる分子量が約 2,400の
蛋白質を高分子化させてなる、平均分子量が約20,000〜
100,000 の重合ダニアレルゲン、（３） 前記（１）ま
たは（２）記載の重合ダニアレルゲンを有効成分とする
ダニアレルギー疾患治療剤、および（４） 前記（１）
または（２）記載の重合ダニアレルゲンを有効成分とす
るダニアレルギー疾患診断薬に関する。
中の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セファ
デックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有する
糖蛋白質を高分子化させてなる、平均分子量が約20,000
〜100,000 の重合ダニアレルゲン、（２） ダニ培養中
の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セファデ
ックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有する糖
蛋白質の糖部分を除去して得られる分子量が約 2,400の
蛋白質を高分子化させてなる、平均分子量が約20,000〜
100,000 の重合ダニアレルゲン、（３） 前記（１）ま
たは（２）記載の重合ダニアレルゲンを有効成分とする
ダニアレルギー疾患治療剤、および（４） 前記（１）
または（２）記載の重合ダニアレルゲンを有効成分とす
るダニアレルギー疾患診断薬に関する。
【０００８】この明細書においては、アミノ酸等につい
て、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および当該分野に
おける慣用略号で表示する場合があり、それらを例示す
ると次の通りである。アミノ酸残基に対する略号は、以
下の通りである。 Asp アスパラギン酸； Thr スレオニン； Se
r セリン；Glu グルタミン酸； Glyグリシ
ン； Ala アラニン；Val バリン；
Ile イソロイシン； Leu ロイシン；Tyr
チロシン； Phe フェニルアラニン； L
ys リジン；His ヒスチジン； Arg アル
ギニン； Pro プロリン；Cys システイン；
Met メチオニン 糖に対する略号は、以下の通りである。 Pen ペントース； dHex デオキシヘキソー
ス; Hex ヘキソース；HexN ヘキソサミン
て、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および当該分野に
おける慣用略号で表示する場合があり、それらを例示す
ると次の通りである。アミノ酸残基に対する略号は、以
下の通りである。 Asp アスパラギン酸； Thr スレオニン； Se
r セリン；Glu グルタミン酸； Glyグリシ
ン； Ala アラニン；Val バリン；
Ile イソロイシン； Leu ロイシン；Tyr
チロシン； Phe フェニルアラニン； L
ys リジン；His ヒスチジン； Arg アル
ギニン； Pro プロリン；Cys システイン；
Met メチオニン 糖に対する略号は、以下の通りである。 Pen ペントース； dHex デオキシヘキソー
ス; Hex ヘキソース；HexN ヘキソサミン
【０００９】以下、本発明の重合ダニアレルゲンの具体
例について、より詳細に説明する。本発明においてダニ
培養中の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セ
ファデックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有
する糖蛋白質を以下ＬＭ−２と、また該糖蛋白質の糖部
分を除去して得られる分子量が約 2,400の蛋白質をＬＭ
−２ｐと略すが、これらＬＭ−２またはＬＭ−２ｐを高
分子化させてなる本発明の重合ダニアレルゲンとして
は、次のようなものが例示される。
例について、より詳細に説明する。本発明においてダニ
培養中の排泄物抽出液に含まれる分子量が約 4,000（セ
ファデックスＧ５０ゲル濾過法）のアレルゲン活性を有
する糖蛋白質を以下ＬＭ−２と、また該糖蛋白質の糖部
分を除去して得られる分子量が約 2,400の蛋白質をＬＭ
−２ｐと略すが、これらＬＭ−２またはＬＭ−２ｐを高
分子化させてなる本発明の重合ダニアレルゲンとして
は、次のようなものが例示される。
【００１０】１）同一のダニアレルゲン分子間で重合さ
せた重合ダニアレルゲン、例えば、ＬＭ−２同士あるい
はＬＭ−２ｐ同士を重合させたもの（それぞれ重合ＬＭ
−２、重合ＬＭ−２ｐと略す）が挙げられる。 ２）異なるダニアレルゲン分子間で重合させた重合ダニ
アレルゲン、例えば、ＬＭ−２とＬＭ−２ｐを重合させ
たもの（重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐと略す）が挙げられ
る。 ３）ダニアレルゲン分子と異種分子間で重合させた重合
ダニアレルゲン、即ち(1) ヒト由来蛋白質〔例えば、血
清アルブミン（ＨＳＡ、分子量約66,000) 、免疫グロブ
リンの単量体（分子量約 72,000)、Ｈ鎖（分子量約 50,
000)、Ｌ鎖（分子量約 22,000)、唾液α−アミラーゼ
（分子量約 60,000)等〕、(2) 合成高分子〔例えば、ポ
リオルニチン（分子量約 5,000〜15,000) 、ポリリジン
（分子量約 4,000〜15,000) 、ポリアスパラギン酸（分
子量約 5,000〜15,000) 等のポリアミノ酸〕、(3) 天然
高分子〔例えば、Ｅｉ−Ｍ（分子量約 23,000)、ＤIIIa
（分子量約 10,000)、ＨＰＳ（分子量約 7,000) と呼ば
れるホヤ抗原等〕、などの異種分子からなる担体にダニ
アレルゲンを結合させ、高分子化させたものである。
せた重合ダニアレルゲン、例えば、ＬＭ−２同士あるい
はＬＭ−２ｐ同士を重合させたもの（それぞれ重合ＬＭ
−２、重合ＬＭ−２ｐと略す）が挙げられる。 ２）異なるダニアレルゲン分子間で重合させた重合ダニ
アレルゲン、例えば、ＬＭ−２とＬＭ−２ｐを重合させ
たもの（重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐと略す）が挙げられ
る。 ３）ダニアレルゲン分子と異種分子間で重合させた重合
ダニアレルゲン、即ち(1) ヒト由来蛋白質〔例えば、血
清アルブミン（ＨＳＡ、分子量約66,000) 、免疫グロブ
リンの単量体（分子量約 72,000)、Ｈ鎖（分子量約 50,
000)、Ｌ鎖（分子量約 22,000)、唾液α−アミラーゼ
（分子量約 60,000)等〕、(2) 合成高分子〔例えば、ポ
リオルニチン（分子量約 5,000〜15,000) 、ポリリジン
（分子量約 4,000〜15,000) 、ポリアスパラギン酸（分
子量約 5,000〜15,000) 等のポリアミノ酸〕、(3) 天然
高分子〔例えば、Ｅｉ−Ｍ（分子量約 23,000)、ＤIIIa
（分子量約 10,000)、ＨＰＳ（分子量約 7,000) と呼ば
れるホヤ抗原等〕、などの異種分子からなる担体にダニ
アレルゲンを結合させ、高分子化させたものである。
【００１１】具体的にはＬＭ−２またはＬＭ−２ｐとヒ
ト由来蛋白質を重合させたものとして、例えば重合ＬＭ
−２−ヒト血清アルブミン（ＬＭ−２とヒト血清アルブ
ミンを重合させたものを表す、以下同様の表現で略
す）、重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンなど、ＬＭ
−２またはＬＭ−２ｐと合成高分子を重合させたものと
して、例えば重合ＬＭ−２−ポリオルニチン、重合ＬＭ
−２ｐ−ポリオルニチン、重合ＬＭ−２−ポリリジン、
重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジン、重合ＬＭ−２−ポリアス
パラギン酸、重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸な
ど、ＬＭ−２またはＬＭ−２ｐと天然高分子を重合させ
たものとして、例えば重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−
Ｍ、重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍ、重合ＬＭ−２
−ホヤ抗原ＤIIIa、重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIaな
どが挙げられる。
ト由来蛋白質を重合させたものとして、例えば重合ＬＭ
−２−ヒト血清アルブミン（ＬＭ−２とヒト血清アルブ
ミンを重合させたものを表す、以下同様の表現で略
す）、重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンなど、ＬＭ
−２またはＬＭ−２ｐと合成高分子を重合させたものと
して、例えば重合ＬＭ−２−ポリオルニチン、重合ＬＭ
−２ｐ−ポリオルニチン、重合ＬＭ−２−ポリリジン、
重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジン、重合ＬＭ−２−ポリアス
パラギン酸、重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸な
ど、ＬＭ−２またはＬＭ−２ｐと天然高分子を重合させ
たものとして、例えば重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−
Ｍ、重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍ、重合ＬＭ−２
−ホヤ抗原ＤIIIa、重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIaな
どが挙げられる。
【００１２】前記のような本発明の重合ダニアレルゲン
は、以下のような性状を有する。 （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）平均分子量：約20,000〜100,000 （20,000、40,0
00、60,000、80,000および100,000 : 平均分子量60,000
未満のものは Ultrogel AcA 54ゲル濾過法、分子量60,0
00以上のものは Ultrogel AcA 44ゲル濾過法による） （４）組成成分：後記のＬＭ−２およびＬＭ−２ｐのア
ミノ酸組成のうち反応に関与したＬｙｓおよびＮ−末端
アミノ酸残基分が減少する。但し、反応によりアミド結
合を生じる場合は、反応に関与したアミノ酸残基部分に
は変化はない。 （５）アレルゲン活性を有する。ダニアレルギー患者に
対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患者白血球ヒス
タミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを用いた実験では、アナフィラキシー反
応は観察されない。
は、以下のような性状を有する。 （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）平均分子量：約20,000〜100,000 （20,000、40,0
00、60,000、80,000および100,000 : 平均分子量60,000
未満のものは Ultrogel AcA 54ゲル濾過法、分子量60,0
00以上のものは Ultrogel AcA 44ゲル濾過法による） （４）組成成分：後記のＬＭ−２およびＬＭ−２ｐのア
ミノ酸組成のうち反応に関与したＬｙｓおよびＮ−末端
アミノ酸残基分が減少する。但し、反応によりアミド結
合を生じる場合は、反応に関与したアミノ酸残基部分に
は変化はない。 （５）アレルゲン活性を有する。ダニアレルギー患者に
対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患者白血球ヒス
タミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを用いた実験では、アナフィラキシー反
応は観察されない。
【００１３】本発明の重合ダニアレルゲンを製造するた
めに用いる高分子化反応には、通常の公知の方法を適用
することができ、特に制限されるものではない。例え
ば、ＬＭ−２において高分子化させる場合には、グル
タールアルデヒドによる重合、クロスリンク化試薬
（Dimethyl suberimidate dihydrochloride(DMS) 、Bis
(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3 ) 、Traut's rea
gent/m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide
ester (Sulfo-MBS)またはN-Succinimidyl 3-(2-pyridyl
dithio)propionate (SPDP) 、1-Ethyl-3-(3-dimethylam
inopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)/N-Hydro
xysulfosuccinimide (Sulfo-NHS))による重合、糖鎖
を過沃素酸酸化した後、α，ω−アルキルジアミンとシ
ッフ塩基を形成させ、次いで水素化シアノホウ素ナトリ
ウム、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤により重合
するなど種々の方法が挙げられる。
めに用いる高分子化反応には、通常の公知の方法を適用
することができ、特に制限されるものではない。例え
ば、ＬＭ−２において高分子化させる場合には、グル
タールアルデヒドによる重合、クロスリンク化試薬
（Dimethyl suberimidate dihydrochloride(DMS) 、Bis
(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3 ) 、Traut's rea
gent/m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide
ester (Sulfo-MBS)またはN-Succinimidyl 3-(2-pyridyl
dithio)propionate (SPDP) 、1-Ethyl-3-(3-dimethylam
inopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)/N-Hydro
xysulfosuccinimide (Sulfo-NHS))による重合、糖鎖
を過沃素酸酸化した後、α，ω−アルキルジアミンとシ
ッフ塩基を形成させ、次いで水素化シアノホウ素ナトリ
ウム、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤により重合
するなど種々の方法が挙げられる。
【００１４】具体的には、１）同一のアレルゲン分子間
での重合は、前記のの方法が例示される。２）異
なるアレルゲン分子間での重合および３）アレルゲン分
子と異種分子間の重合では、の方法およびの方法
（但し、糖鎖を過沃素酸酸化した後、２）ではＬＭ−２
ｐと、３）では担体のアミノ基とシッフ塩基を形成させ
水素化シアノホウ素ナトリウムなどにより還元する方
法）が例示される。また、３）のアレルゲン分子と異種
分子（特に、酸性ポリアミノ酸）間の重合では、予めED
C ／Sulfo-NHS でカルボキシル基を活性エステル化し、
ＬＭ−２のアミノ基と反応させる方法が例示される。重
合方法は上記のいずれか、または組み合わせた方法が適
宜選択される。
での重合は、前記のの方法が例示される。２）異
なるアレルゲン分子間での重合および３）アレルゲン分
子と異種分子間の重合では、の方法およびの方法
（但し、糖鎖を過沃素酸酸化した後、２）ではＬＭ−２
ｐと、３）では担体のアミノ基とシッフ塩基を形成させ
水素化シアノホウ素ナトリウムなどにより還元する方
法）が例示される。また、３）のアレルゲン分子と異種
分子（特に、酸性ポリアミノ酸）間の重合では、予めED
C ／Sulfo-NHS でカルボキシル基を活性エステル化し、
ＬＭ−２のアミノ基と反応させる方法が例示される。重
合方法は上記のいずれか、または組み合わせた方法が適
宜選択される。
【００１５】また、ＬＭ−２ｐにおいて、１）、２）お
よび３）の担体として特にヒト由来蛋白質並びに塩基性
ポリアミノ酸を用いる場合、の方法が例示される。
３）の担体として特に酸性ポリアミノ酸を用いる場合、
予めEDC／Sulfo-NHS でカルボキシル基を活性エステル
化し、ＬＭ−２ｐのアミノ基と重合させる方法が例示さ
れる。３）の担体として特にホヤ抗原を用いる場合、
の方法が例示される。重合方法は上記のいずれか、
または組み合わせた方法が適宜選択される。
よび３）の担体として特にヒト由来蛋白質並びに塩基性
ポリアミノ酸を用いる場合、の方法が例示される。
３）の担体として特に酸性ポリアミノ酸を用いる場合、
予めEDC／Sulfo-NHS でカルボキシル基を活性エステル
化し、ＬＭ−２ｐのアミノ基と重合させる方法が例示さ
れる。３）の担体として特にホヤ抗原を用いる場合、
の方法が例示される。重合方法は上記のいずれか、
または組み合わせた方法が適宜選択される。
【００１６】次に本発明において、重合ダニアレルゲン
の合成原料となるダニアレルゲンについてより詳細に説
明する。即ち、ＬＭ−２、およびＬＭ−２ｐは以下の性
状を有する。 （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：約 4,000の糖蛋白質（ＬＭ−２）または
約 2,400の蛋白質（ＬＭ−２ｐ）である〔インタクトな
糖蛋白質の分子量（約4,000,セファデックスＧ５０ゲル
濾過法）からその糖蛋白質の糖含量約４０％（約1,600)
を引いた値〕。
の合成原料となるダニアレルゲンについてより詳細に説
明する。即ち、ＬＭ−２、およびＬＭ−２ｐは以下の性
状を有する。 （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：約 4,000の糖蛋白質（ＬＭ−２）または
約 2,400の蛋白質（ＬＭ−２ｐ）である〔インタクトな
糖蛋白質の分子量（約4,000,セファデックスＧ５０ゲル
濾過法）からその糖蛋白質の糖含量約４０％（約1,600)
を引いた値〕。
【００１７】（４）組成成分： １）ＬＭ−２およびＬＭ−２ｐのアミノ酸組成は、次の
操作により得られる。即ち、0.2%サンプル溶液２００μ
l を１２Ｍ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした密
封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解する。乾固
させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作を
３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ
酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミノ
酸アナライザー（日立製作所）により定量する。これに
より次の結果が得られる。
操作により得られる。即ち、0.2%サンプル溶液２００μ
l を１２Ｍ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした密
封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解する。乾固
させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作を
３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ
酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミノ
酸アナライザー（日立製作所）により定量する。これに
より次の結果が得られる。
【００１８】ＬＭ−２のアミノ酸（計 6.6μmol/mg) Asp 0.9 ； Thr 0.4 ； Ser 0.6 ； Glu 1.2 ； G
ly 1.6 ；Ala 0.5 ； Val 0.2 ； Cys 0.0 ；Ile
0.1 ； Leu 0.1 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； Lys
0.2 ； His 0.1 ； Arg 0.1 ；Pro 0.5 ＬＭ−２ｐのアミノ酸（計９．６μmol/mg) Asp 1.1 ； Thr 0.5 ； Ser 0.9 ； Glu 1.5 ； G
ly 2.3 ；Ala 0.7 ； Val 0.3 ； Ile 0.2 ； Leu
0.3 ； Phe 0.1 ；Lys 0.4 ； His 0.2 ； Arg
0.4 ； Pro 0.7
ly 1.6 ；Ala 0.5 ； Val 0.2 ； Cys 0.0 ；Ile
0.1 ； Leu 0.1 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； Lys
0.2 ； His 0.1 ； Arg 0.1 ；Pro 0.5 ＬＭ−２ｐのアミノ酸（計９．６μmol/mg) Asp 1.1 ； Thr 0.5 ； Ser 0.9 ； Glu 1.5 ； G
ly 2.3 ；Ala 0.7 ； Val 0.3 ； Ile 0.2 ； Leu
0.3 ； Phe 0.1 ；Lys 0.4 ； His 0.2 ； Arg
0.4 ； Pro 0.7
【００１９】２）ＬＭ−２の糖含量は、Glucose を標準
としてフェノール硫酸法で全中性糖を定量した場合、約
４０％である。個々の中性糖とアミノ糖は、サンプルを
４ＭＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中で１００℃４時間加
水分解し、ＮａＢＨ4 で還元後、無水酢酸を用いて１０
０℃４時間加熱してアセチル化した後、ＧＬＣ法で定量
した場合、次の結果が得られる。 ＬＭ−２の糖（計 2.9μmol/mg) Pen 1.4 ； dHex 0.1 ； Hex1.1 ； HexN 0.3 一方、ＬＭ−２ｐの糖成分は、検出されない。
としてフェノール硫酸法で全中性糖を定量した場合、約
４０％である。個々の中性糖とアミノ糖は、サンプルを
４ＭＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中で１００℃４時間加
水分解し、ＮａＢＨ4 で還元後、無水酢酸を用いて１０
０℃４時間加熱してアセチル化した後、ＧＬＣ法で定量
した場合、次の結果が得られる。 ＬＭ−２の糖（計 2.9μmol/mg) Pen 1.4 ； dHex 0.1 ； Hex1.1 ； HexN 0.3 一方、ＬＭ−２ｐの糖成分は、検出されない。
【００２０】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患
者白血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを用いた実験では、アナフィラキシー反
応は観察されない。
ルギー患者に対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患
者白血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを用いた実験では、アナフィラキシー反
応は観察されない。
【００２１】ＬＭ−２およびＬＭ−２ｐの製造方法とし
ては、たとえば次のような方法が例示される。 ａ）粗ダニ排泄物抗原の調製 ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではな
いが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニの
いずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で
培養し、これを抽出処理する。抽出処理は飽和食塩水お
よび／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で30分
間静置した後に、遠心分離(3000 rpm 、30分) を行い上
清をプールする。この際、抽出溶媒としては他に、中程
度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよい。
例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。上清表
面にダニ虫体が浮遊するのでこれを濾過して取り除く。
プールした上清を濾過およびイオン交換水に対して透析
したもの（粗ダニ排泄物抽出液）を出発材料とする。次
に、この粗ダニ排泄物抽出液を、例えば限外分子量１万
の濾過膜（UF-20CS-10PS) に通し、この膜を通過しない
高分子粗ダニ排泄物抗原と通過する低分子粗ダニ排泄物
抗原に分画する。
ては、たとえば次のような方法が例示される。 ａ）粗ダニ排泄物抗原の調製 ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではな
いが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニの
いずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で
培養し、これを抽出処理する。抽出処理は飽和食塩水お
よび／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で30分
間静置した後に、遠心分離(3000 rpm 、30分) を行い上
清をプールする。この際、抽出溶媒としては他に、中程
度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよい。
例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。上清表
面にダニ虫体が浮遊するのでこれを濾過して取り除く。
プールした上清を濾過およびイオン交換水に対して透析
したもの（粗ダニ排泄物抽出液）を出発材料とする。次
に、この粗ダニ排泄物抽出液を、例えば限外分子量１万
の濾過膜（UF-20CS-10PS) に通し、この膜を通過しない
高分子粗ダニ排泄物抗原と通過する低分子粗ダニ排泄物
抗原に分画する。
【００２２】ｂ）低分子粗ダニ排泄物抗原の精製 低分子粗ダニ排泄物抗原の精製は、(i) ダニ喘息患者
血清特異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ排泄物抗血清、ウサ
ギ抗ダニ排泄物抗体、排泄物抗原に特異的なマウスモノ
クローナル抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) に
より測定することによる、各フラクションの抗原活性の
測定(Immunochemistry: 8, 871,(1971))、(ii) ウサギ
抗ダニ排泄物抗血清を用いたラジオイムノアッセイによ
る、各フラクションの抗原活性の測定、(iii) 皮内反
応活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測
定、(iv) ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活
性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、等
のモニターの下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマ
トグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を単独ま
たは組み合わせて精製することができる。
血清特異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ排泄物抗血清、ウサ
ギ抗ダニ排泄物抗体、排泄物抗原に特異的なマウスモノ
クローナル抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) に
より測定することによる、各フラクションの抗原活性の
測定(Immunochemistry: 8, 871,(1971))、(ii) ウサギ
抗ダニ排泄物抗血清を用いたラジオイムノアッセイによ
る、各フラクションの抗原活性の測定、(iii) 皮内反
応活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測
定、(iv) ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活
性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、等
のモニターの下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマ
トグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を単独ま
たは組み合わせて精製することができる。
【００２３】例えば、具体的には低分子粗ダニ排泄物抗
原の精製は、低分子粗ダニ排泄物抗原をセファデックス
Ｇ５０（Pharmacia LKB Biotechnology AB) でゲル濾過
する。その時の溶出パターンをダニ喘息患者の白血球ヒ
スタミン遊離能、ELISA による患者血清特異IgE および
ウサギ抗ダニ排泄物血清に対する反応性でモニターし、
蛋白含量および２８０ｎｍの吸収をガイドに画分に分け
る。強い皮内反応活性が認められる画分を、更にイオン
交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、デ
ュアルモードクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精
製手段を適宜組み合わせることにより本発明で用いられ
るダニアレルゲンの活性成分を精製することができる。
原の精製は、低分子粗ダニ排泄物抗原をセファデックス
Ｇ５０（Pharmacia LKB Biotechnology AB) でゲル濾過
する。その時の溶出パターンをダニ喘息患者の白血球ヒ
スタミン遊離能、ELISA による患者血清特異IgE および
ウサギ抗ダニ排泄物血清に対する反応性でモニターし、
蛋白含量および２８０ｎｍの吸収をガイドに画分に分け
る。強い皮内反応活性が認められる画分を、更にイオン
交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、デ
ュアルモードクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精
製手段を適宜組み合わせることにより本発明で用いられ
るダニアレルゲンの活性成分を精製することができる。
【００２４】本発明の重合ダニアレルゲンの合成原料と
なるダニアレルゲンは、前記のように分子量が約 4,000
の糖蛋白質（ＬＭ−２）および該糖蛋白質の糖部分を除
去して得られる分子量約2,400 の蛋白質（ＬＭ−２ｐ）
であるが、この糖部分を除去する工程は通常の公知の方
法を適用することができ、特に制限されるものではな
い。例えば、過沃素酸酸化した後スミス分解により糖鎖
を切断する方法、グリコペプチダーゼ、Ｎ−グリカナー
ゼ、エンドＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ等の酵素
を用いて糖鎖を遊離する方法など種々の方法が挙げら
れ、いずれの方法であってもよい。過沃素酸酸化による
場合は、例えば前記のような方法が用いられる。
なるダニアレルゲンは、前記のように分子量が約 4,000
の糖蛋白質（ＬＭ−２）および該糖蛋白質の糖部分を除
去して得られる分子量約2,400 の蛋白質（ＬＭ−２ｐ）
であるが、この糖部分を除去する工程は通常の公知の方
法を適用することができ、特に制限されるものではな
い。例えば、過沃素酸酸化した後スミス分解により糖鎖
を切断する方法、グリコペプチダーゼ、Ｎ−グリカナー
ゼ、エンドＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ等の酵素
を用いて糖鎖を遊離する方法など種々の方法が挙げら
れ、いずれの方法であってもよい。過沃素酸酸化による
場合は、例えば前記のような方法が用いられる。
【００２５】本発明の重合ダニアレルゲンはダニアレル
ギー疾患治療剤として有用であり、例えば減感作治療剤
として使用される。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。前記の方法により
高分子化されてなる本発明の重合ダニアレルゲンは、溶
液状又はシロップ状とするか、更に乾燥して粉末状でダ
ニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられ
る。本減感作治療剤はそのままで、又は必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を添加した配合剤として用いる
ことができる。
ギー疾患治療剤として有用であり、例えば減感作治療剤
として使用される。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。前記の方法により
高分子化されてなる本発明の重合ダニアレルゲンは、溶
液状又はシロップ状とするか、更に乾燥して粉末状でダ
ニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられ
る。本減感作治療剤はそのままで、又は必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を添加した配合剤として用いる
ことができる。
【００２６】本減感作治療剤は、通常の投与経路、例え
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治
療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治
療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対し
て安全に用いることができる。
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治
療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治
療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対し
て安全に用いることができる。
【００２７】本発明の重合ダニアレルゲンはダニアレル
ギー疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血
液、及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分
を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ重
合ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレ
ルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離す
るヒスタミン量を測定する〔アレルギー：33,692,(198
4) ／アレルギー：33, 733,(1984)〕。このヒスタミン
遊離滴定では、最大遊離量の50％量( 滴定曲線の変曲
点) から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定で
は、（i) 血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感
受性を直接測定することになる。（ii）血液の滴定値
は、通常、血球浮遊液の値より高い値が得られる。これ
は血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG 抗体（遮断抗
体）が存在するためである。従って、対血液滴定曲線
の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、
遮断抗体価が得られる。感受性とこの遮断抗体価から表
１のように、ダニアレルギーの正確な診断が可能とな
る。また、減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
ギー疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血
液、及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分
を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ重
合ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレ
ルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離す
るヒスタミン量を測定する〔アレルギー：33,692,(198
4) ／アレルギー：33, 733,(1984)〕。このヒスタミン
遊離滴定では、最大遊離量の50％量( 滴定曲線の変曲
点) から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定で
は、（i) 血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感
受性を直接測定することになる。（ii）血液の滴定値
は、通常、血球浮遊液の値より高い値が得られる。これ
は血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG 抗体（遮断抗
体）が存在するためである。従って、対血液滴定曲線
の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、
遮断抗体価が得られる。感受性とこの遮断抗体価から表
１のように、ダニアレルギーの正確な診断が可能とな
る。また、減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【実施例】以下に、参考例および実施例を挙げて本発明
を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら
限定されるものではない。 参考例１低分子粗ダニ排泄物抗原の調製 ラット、マウス、ハムスター用飼料Ｍ（オリエンタル酵
母社）中で、温度２６±２℃、湿度７５％ＲＨの環境
で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培地になるようにコナヒ
ョウヒダニを飼育し、ダニ培養培地１００ｇに対して、
飽和食塩水を１リットル加えてよく攪拌した。室温で３
０分間静置した後、３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離を
行った。この時、ダニ虫体は上清表面に浮遊するので、
これを濾過して取り除く。沈澱に再び飽和食塩水を加え
て同じ操作を繰り返した。さらに沈殿に、１０ｍＭリン
酸緩衝液を１リットル加え飽和食塩水の場合と同じ操作
を繰り返した（２回）。得られた抽出液を水道水に対し
て一夜透析し、分画分子量１万の限外濾過（膜はUF-20C
S-10PS，東ソー) により分子量１万以上とそれ以下に分
画した。各画分を濃縮し、凍結乾燥して、それぞれ高分
子粗ダニ排泄物抗原および低分子粗ダニ排泄物抗原とし
た。ダニ培養培地３．７ｋｇから、高分子粗ダニ排泄物
抗原（ＨＭ）１２７．０ｇ、低分子粗ダニ排泄物抗原
（ＬＭ）６９．７ｇを得た。
を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら
限定されるものではない。 参考例１低分子粗ダニ排泄物抗原の調製 ラット、マウス、ハムスター用飼料Ｍ（オリエンタル酵
母社）中で、温度２６±２℃、湿度７５％ＲＨの環境
で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培地になるようにコナヒ
ョウヒダニを飼育し、ダニ培養培地１００ｇに対して、
飽和食塩水を１リットル加えてよく攪拌した。室温で３
０分間静置した後、３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離を
行った。この時、ダニ虫体は上清表面に浮遊するので、
これを濾過して取り除く。沈澱に再び飽和食塩水を加え
て同じ操作を繰り返した。さらに沈殿に、１０ｍＭリン
酸緩衝液を１リットル加え飽和食塩水の場合と同じ操作
を繰り返した（２回）。得られた抽出液を水道水に対し
て一夜透析し、分画分子量１万の限外濾過（膜はUF-20C
S-10PS，東ソー) により分子量１万以上とそれ以下に分
画した。各画分を濃縮し、凍結乾燥して、それぞれ高分
子粗ダニ排泄物抗原および低分子粗ダニ排泄物抗原とし
た。ダニ培養培地３．７ｋｇから、高分子粗ダニ排泄物
抗原（ＨＭ）１２７．０ｇ、低分子粗ダニ排泄物抗原
（ＬＭ）６９．７ｇを得た。
【００３０】参考例２低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）からのアレルゲン活性
画分の分画 参考例１で得られた低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）５
００ｍｇを３０ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶出液に溶解
後、Ultrogel AcA 54 カラム(IBF, サイズ 4.4×100 ｃ
ｍ）にかけ、この溶出液を用いて、１２０ｍｌ／時間の
流速でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、アレルゲン
活性をもつ成分を分画した。各フラクションについて、
抗原性を抗血清との応答で（図には示されていない）、
更にアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球に対す
るヒスタミン遊離試験で検定したところ、図１のヒスト
グラムで示されるようにヒスタミン遊離活性が大きく２
つに分かれた。そこでフラクションNo. 27-31 とNo. 37
-39 をアレルゲン活性成分を含む画分として集め、それ
ぞれをＬＭ−１画分、ＬＭ−２画分とした。なお、図中
のＢＤはボイドボリュームに相当しブルーデキストラン
の溶出位置を、ＢＳＡは牛血清アルブミンの溶出位置
を、またＴＶはトータルボリュームでＫ2 ＣｒＯ4 の溶
出位置である。破線は２８０ｎｍの紫外部吸収を示す。
それぞれの凍結乾燥後の収量は、ＬＭ−１画分２３．４
ｍｇ、ＬＭ−２画分７０．８ｍｇであった。また、ダニ
アレルギー患者に対する皮内反応試験も同時に検定した
ところ、どちらの画分にも強いアレルゲン活性を認め
た。
画分の分画 参考例１で得られた低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）５
００ｍｇを３０ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶出液に溶解
後、Ultrogel AcA 54 カラム(IBF, サイズ 4.4×100 ｃ
ｍ）にかけ、この溶出液を用いて、１２０ｍｌ／時間の
流速でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、アレルゲン
活性をもつ成分を分画した。各フラクションについて、
抗原性を抗血清との応答で（図には示されていない）、
更にアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球に対す
るヒスタミン遊離試験で検定したところ、図１のヒスト
グラムで示されるようにヒスタミン遊離活性が大きく２
つに分かれた。そこでフラクションNo. 27-31 とNo. 37
-39 をアレルゲン活性成分を含む画分として集め、それ
ぞれをＬＭ−１画分、ＬＭ−２画分とした。なお、図中
のＢＤはボイドボリュームに相当しブルーデキストラン
の溶出位置を、ＢＳＡは牛血清アルブミンの溶出位置
を、またＴＶはトータルボリュームでＫ2 ＣｒＯ4 の溶
出位置である。破線は２８０ｎｍの紫外部吸収を示す。
それぞれの凍結乾燥後の収量は、ＬＭ−１画分２３．４
ｍｇ、ＬＭ−２画分７０．８ｍｇであった。また、ダニ
アレルギー患者に対する皮内反応試験も同時に検定した
ところ、どちらの画分にも強いアレルゲン活性を認め
た。
【００３１】参考例３精製ＬＭ−２活性成分の製造 ＬＭ−２画分をセファデックスＧ５０（Pharmacia LKB
Biotechnology AB) を用いてゲル濾過し分画した。同時
にオボアルブミン、チトクロームＣ、インシュリンβ鎖
およびビタミンＢ12を用いて、キャリブレーションを行
い、ＬＭ−２画分中の活性成分の分子量推定を行った。
その結果を図２に示す。ゲル濾過の条件は、サンプル量
５０ｍｇ（濃度５０ｍｇ／３ｍｌ ０．９％ＮａＣｌ水
溶液）、溶離液０．９％ＮａＣｌ、流速３０ｍｌ／時
間、カラムサイズ1.5×100 ｃｍである。ＬＭ−２画分
の中に含まれるアレルゲン活性成分は低分子量であるた
め、抗血清との反応性が弱くELISA 測定が難しいので、
各フラクションをすべて白血球ヒスタミン遊離活性でモ
ニターした。
Biotechnology AB) を用いてゲル濾過し分画した。同時
にオボアルブミン、チトクロームＣ、インシュリンβ鎖
およびビタミンＢ12を用いて、キャリブレーションを行
い、ＬＭ−２画分中の活性成分の分子量推定を行った。
その結果を図２に示す。ゲル濾過の条件は、サンプル量
５０ｍｇ（濃度５０ｍｇ／３ｍｌ ０．９％ＮａＣｌ水
溶液）、溶離液０．９％ＮａＣｌ、流速３０ｍｌ／時
間、カラムサイズ1.5×100 ｃｍである。ＬＭ−２画分
の中に含まれるアレルゲン活性成分は低分子量であるた
め、抗血清との反応性が弱くELISA 測定が難しいので、
各フラクションをすべて白血球ヒスタミン遊離活性でモ
ニターした。
【００３２】図中、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊
離活性を、ＯＶＡは分子量 45,000のオボアルブミンの
溶出位置を、また Cyt. C は分子量 13,500 のチトクロ
ームＣの溶出位置を、Insulin βはインシュリンβ鎖
を、さらにＢ12はビタミンＢ12の溶出位置を示す。各成
分のピークの溶出位置までの体積とそれぞれの分子量の
片対数とのプロットから、白血球ヒスタミン遊離活性を
示すＬＭ−２画分中の活性成分の分子量は、約 4,000で
あると推定した。ここで、図中に矢印で示した画分（フ
ラクションNo. 24-27 ）をプールし、ＬＭ−２活性画分
とし、透析後凍結乾燥を行った。その収量は１５ｍｇで
あった。この画分はダニアレルギー患者に対して強い皮
内反応活性を示した。この画分を精製ＬＭ−２活性成分
とした。
離活性を、ＯＶＡは分子量 45,000のオボアルブミンの
溶出位置を、また Cyt. C は分子量 13,500 のチトクロ
ームＣの溶出位置を、Insulin βはインシュリンβ鎖
を、さらにＢ12はビタミンＢ12の溶出位置を示す。各成
分のピークの溶出位置までの体積とそれぞれの分子量の
片対数とのプロットから、白血球ヒスタミン遊離活性を
示すＬＭ−２画分中の活性成分の分子量は、約 4,000で
あると推定した。ここで、図中に矢印で示した画分（フ
ラクションNo. 24-27 ）をプールし、ＬＭ−２活性画分
とし、透析後凍結乾燥を行った。その収量は１５ｍｇで
あった。この画分はダニアレルギー患者に対して強い皮
内反応活性を示した。この画分を精製ＬＭ−２活性成分
とした。
【００３３】参考例４精製ＬＭ−２活性成分の性状 参考例３で得られた精製ＬＭ−２活性成分のアミノ酸分
析およびＧＬＣ法での糖分析を行ったところ、アミノ酸
6.6μmol/mgおよび糖 2.9μmol/mgが検出された。 アミノ酸および糖の組成分析の結果は以下の通りであっ
た。 アミノ酸： Asp 0.9 ； Thr 0.4 ； Ser 0.6 ； Glu 1.2 ； G
ly 1.6 ；Ala 0.5 ； Val 0.2 ； Cys 0.0 ；Ile
0.1 ； Leu 0.1 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； Lys
0.2 ； His 0.1 ； Arg 0.1 ；Pro 0.5 糖： Pen 1.4 ； dHex 0.1 ； Hex1.1 ； HexN 0.3 この精製ＬＭ−２活性成分をフェノール硫酸法で定量し
たところ、約４０％が中性糖であった。
析およびＧＬＣ法での糖分析を行ったところ、アミノ酸
6.6μmol/mgおよび糖 2.9μmol/mgが検出された。 アミノ酸および糖の組成分析の結果は以下の通りであっ
た。 アミノ酸： Asp 0.9 ； Thr 0.4 ； Ser 0.6 ； Glu 1.2 ； G
ly 1.6 ；Ala 0.5 ； Val 0.2 ； Cys 0.0 ；Ile
0.1 ； Leu 0.1 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； Lys
0.2 ； His 0.1 ； Arg 0.1 ；Pro 0.5 糖： Pen 1.4 ； dHex 0.1 ； Hex1.1 ； HexN 0.3 この精製ＬＭ−２活性成分をフェノール硫酸法で定量し
たところ、約４０％が中性糖であった。
【００３４】参考例５精製ＬＭ−２ｐ活性成分の製造 （ａ）精製ＬＭ−２活性成分の過沃素酸酸化 参考例３で得られた約４０％の中性糖を含む精製ＬＭ−
２活性成分のプロナーゼ消化と過沃素酸酸化を行った。
その結果を図３に示す。この図からわかるように、精製
ＬＭ−２活性成分はプロナーゼ消化により完全にアレル
ゲン活性が消失していたが、過沃素酸酸化処理ではその
約７０％の活性が保存されていた。そこで、この精製Ｌ
Ｍ−２活性成分を、過沃素酸酸化して、活性に直接関係
のない糖部分を酸化した。この処理で、アレルゲンは低
分子化され、透析膜を通過する成分（以下、ＬＭ−２ｐ
画分という）と通過しない成分の２つの画分に分画され
た。精製ＬＭ−２活性成分１０ｍｇから、ＬＭ−２ｐ画
分３ｍｇ、通過しない画分７ｍｇが得られた。いずれの
画分も、ダニアレルギー患者の白血球ヒスタミン遊離活
性と患者の皮膚に強い皮内反応活性を示した。
２活性成分のプロナーゼ消化と過沃素酸酸化を行った。
その結果を図３に示す。この図からわかるように、精製
ＬＭ−２活性成分はプロナーゼ消化により完全にアレル
ゲン活性が消失していたが、過沃素酸酸化処理ではその
約７０％の活性が保存されていた。そこで、この精製Ｌ
Ｍ−２活性成分を、過沃素酸酸化して、活性に直接関係
のない糖部分を酸化した。この処理で、アレルゲンは低
分子化され、透析膜を通過する成分（以下、ＬＭ−２ｐ
画分という）と通過しない成分の２つの画分に分画され
た。精製ＬＭ−２活性成分１０ｍｇから、ＬＭ−２ｐ画
分３ｍｇ、通過しない画分７ｍｇが得られた。いずれの
画分も、ダニアレルギー患者の白血球ヒスタミン遊離活
性と患者の皮膚に強い皮内反応活性を示した。
【００３５】（ｂ）ＬＭ−２ｐ画分のイオン交換クロマ
トグラフィー （ａ）で得られたＬＭ−２ｐ画分３ｍｇをＱＡＥ−セフ
ァデックスＡ２５(Pharmacia LKB Biotechnology AB 、
サイズ1.5×30ｃｍ）でイオン交換クロマトグラフィー
を行い分画した。溶離液に水を用い、サンプルを注入し
て２０分後から、塩酸の３Ｍ／２０時間の直線グラジエ
ントにより、流速０．５ｍｌ／分で溶出を行った。その
結果を図４に示す。ここで、ヒストグラムは白血球ヒス
タミン遊離活性を、○は２１５ｎｍの紫外部吸収を、さ
らに実線は塩酸の濃度を示す。図中、ヒストグラムで示
したヒスタミン遊離活性のうち、フラクションNo. 23-2
4 に溶出した画分を集め、減圧乾固後、水に溶解し、凍
結乾燥して活性画分１５０ｍｇを得た。この画分には、
ダニアレルギー患者の白血球ヒスタミン遊離活性と患者
の皮膚に強い皮内反応活性が存在した。
トグラフィー （ａ）で得られたＬＭ−２ｐ画分３ｍｇをＱＡＥ−セフ
ァデックスＡ２５(Pharmacia LKB Biotechnology AB 、
サイズ1.5×30ｃｍ）でイオン交換クロマトグラフィー
を行い分画した。溶離液に水を用い、サンプルを注入し
て２０分後から、塩酸の３Ｍ／２０時間の直線グラジエ
ントにより、流速０．５ｍｌ／分で溶出を行った。その
結果を図４に示す。ここで、ヒストグラムは白血球ヒス
タミン遊離活性を、○は２１５ｎｍの紫外部吸収を、さ
らに実線は塩酸の濃度を示す。図中、ヒストグラムで示
したヒスタミン遊離活性のうち、フラクションNo. 23-2
4 に溶出した画分を集め、減圧乾固後、水に溶解し、凍
結乾燥して活性画分１５０ｍｇを得た。この画分には、
ダニアレルギー患者の白血球ヒスタミン遊離活性と患者
の皮膚に強い皮内反応活性が存在した。
【００３６】（ｃ）ＬＭ−２ｐ画分の逆相クロマトグラ
フィー （ｂ）で得られたＬＭ−２ｐ画分１０ｍｇ（濃度１０ｍ
ｇ／0.1 ｍｌ）を、TSKgel ODS-120T （東ソー、サイズ
0.46×25ｃｍ) で逆相ＨＰＬＣを行い分画した。溶離液
に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い、サンプ
ルを注入して１０分後から、メタノールの１％／分の直
線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で溶出を行っ
た。その結果を図５に示す。ここで、ヒストグラムは白
血球ヒスタミン遊離活性を、実線は２８０ｎｍの紫外部
吸収を、さらに破線はメタノールの濃度を示す。図中、
ヒストグラムからわかるように、ヒスタミン遊離活性は
フラクションNo. 11-13 に溶出した。この操作を１４回
繰り返し、それぞれ相当するフラクションをＬＭ−２ｐ
画分として集め、凍結乾燥して１．２ｍｇを得た。この
画分でダニアレルギー患者に対する皮内反応試験も同時
に検定したところ、強いアレルゲン活性を認めた。
フィー （ｂ）で得られたＬＭ−２ｐ画分１０ｍｇ（濃度１０ｍ
ｇ／0.1 ｍｌ）を、TSKgel ODS-120T （東ソー、サイズ
0.46×25ｃｍ) で逆相ＨＰＬＣを行い分画した。溶離液
に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い、サンプ
ルを注入して１０分後から、メタノールの１％／分の直
線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で溶出を行っ
た。その結果を図５に示す。ここで、ヒストグラムは白
血球ヒスタミン遊離活性を、実線は２８０ｎｍの紫外部
吸収を、さらに破線はメタノールの濃度を示す。図中、
ヒストグラムからわかるように、ヒスタミン遊離活性は
フラクションNo. 11-13 に溶出した。この操作を１４回
繰り返し、それぞれ相当するフラクションをＬＭ−２ｐ
画分として集め、凍結乾燥して１．２ｍｇを得た。この
画分でダニアレルギー患者に対する皮内反応試験も同時
に検定したところ、強いアレルゲン活性を認めた。
【００３７】（ｄ）ＬＭ−２ｐ画分のデュアルモードク
ロマトグラフィー（ＤＭＣ） （ｃ）で得られたＬＭ−２ｐ画分１．１ｍｇを、 Asahi
pack GS-320 （旭化成、サイズ0.76×50ｃｍ) カラムを
用いて、ＤＭＣを行い分画した。溶離液に５０ｍＭ酢酸
アンモニウムを用い、流速 0.5ｍｌ／分でアイソクラテ
ィックに溶出を行った。その結果を図６に示す。ここ
で、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性を、実線
は２１５ｎｍの紫外部吸収を示す。図に示すようにヒス
タミン遊離活性は、フラクションNo. 10, 12, 17に認め
られたが、多くの症例で共通に活性の検出されるフラク
ションNo. 10をＬＭ−２ｐ画分として集め、凍結乾燥し
たが、微量で充分な精度で計量することができなかっ
た。しかし、ダニアレルギー患者に対する皮内反応試験
も同時に検定したところ、強いアレルゲン活性を認め
た。
ロマトグラフィー（ＤＭＣ） （ｃ）で得られたＬＭ−２ｐ画分１．１ｍｇを、 Asahi
pack GS-320 （旭化成、サイズ0.76×50ｃｍ) カラムを
用いて、ＤＭＣを行い分画した。溶離液に５０ｍＭ酢酸
アンモニウムを用い、流速 0.5ｍｌ／分でアイソクラテ
ィックに溶出を行った。その結果を図６に示す。ここ
で、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性を、実線
は２１５ｎｍの紫外部吸収を示す。図に示すようにヒス
タミン遊離活性は、フラクションNo. 10, 12, 17に認め
られたが、多くの症例で共通に活性の検出されるフラク
ションNo. 10をＬＭ−２ｐ画分として集め、凍結乾燥し
たが、微量で充分な精度で計量することができなかっ
た。しかし、ダニアレルギー患者に対する皮内反応試験
も同時に検定したところ、強いアレルゲン活性を認め
た。
【００３８】（ｅ）ＬＭ−２ｐ画分の精製 （ｄ）で得られたＬＭ−２ｐ画分（フラクションNo. 1
0）を、TSKgel ODS-120T ( 東ソー、サイズ0.46×25ｃ
ｍ）カラムを用いて、逆相ＨＰＬＣを行い、精製した。
溶離液に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い、
サンプルを注入して５分後から、メタノールの１％／分
の直線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で溶出を行
った。その結果を図７に示す。ここで実線は２１５ｎｍ
の紫外部吸収を、破線はメタノールの濃度を示す。図
中、矢印で示したピークを含む画分にヒスタミン遊離活
性が検出された。また、ダニアレルギー患者に対する皮
内反応試験も同時に検定したことろ、強いアレルゲン活
性を認めた。この画分を分取して精製ＬＭ−２ｐ活性成
分とした。
0）を、TSKgel ODS-120T ( 東ソー、サイズ0.46×25ｃ
ｍ）カラムを用いて、逆相ＨＰＬＣを行い、精製した。
溶離液に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い、
サンプルを注入して５分後から、メタノールの１％／分
の直線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で溶出を行
った。その結果を図７に示す。ここで実線は２１５ｎｍ
の紫外部吸収を、破線はメタノールの濃度を示す。図
中、矢印で示したピークを含む画分にヒスタミン遊離活
性が検出された。また、ダニアレルギー患者に対する皮
内反応試験も同時に検定したことろ、強いアレルゲン活
性を認めた。この画分を分取して精製ＬＭ−２ｐ活性成
分とした。
【００３９】参考例６精製ＬＭ−２ｐ活性成分の性状 参考例５の（ｅ）で得られた精製ＬＭ−２ｐ活性成分の
アミノ酸分析、およびフェノール硫酸法で糖分析したと
ころ、アミノ酸２７．５μｇが検出されたが、糖は全く
検出されなかった。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 1.1 ； Thr 0.5 ； Ser 0.9 ； Glu 1.5 ； G
ly 2.3 ；Ala 0.7 ； Val 0.3 ； Ile 0.2 ； Leu
0.3 ； Phe 0.1 ；Lys 0.4 ； His 0.2 ； Arg
0.4 ； Pro 0.7
アミノ酸分析、およびフェノール硫酸法で糖分析したと
ころ、アミノ酸２７．５μｇが検出されたが、糖は全く
検出されなかった。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 1.1 ； Thr 0.5 ； Ser 0.9 ； Glu 1.5 ； G
ly 2.3 ；Ala 0.7 ； Val 0.3 ； Ile 0.2 ； Leu
0.3 ； Phe 0.1 ；Lys 0.4 ； His 0.2 ； Arg
0.4 ； Pro 0.7
【００４０】この精製ＬＭ−２ｐ活性成分の分子量は、
参考例３で推定された糖蛋白質の分子量である約4,000
から糖含量約４０％（約1,600)を差し引くことにより、
約 2,400と推定された。このようにして得られた分子量
約 2,400の蛋白質の色および性状は、白色（凍結乾燥
物）であり水には易溶性のものであった。また、モルモ
ットを用いたアナフィラキシー反応試験ではアナフィラ
キシー反応を誘導しないものである。これらの性質・性
状は、分子量約4,000 の精製ＬＭ−２活性成分について
も同様であった。しかしながら、これらの精製ＬＭ−２
活性成分および精製ＬＭ−２ｐ活性成分は、低分子量で
あるため、充分な免疫原性が認められず、遮断抗体誘導
能を持たないものである。従ってこのままでは減感作治
療用抗原として用いることはできないものと判断され
た。
参考例３で推定された糖蛋白質の分子量である約4,000
から糖含量約４０％（約1,600)を差し引くことにより、
約 2,400と推定された。このようにして得られた分子量
約 2,400の蛋白質の色および性状は、白色（凍結乾燥
物）であり水には易溶性のものであった。また、モルモ
ットを用いたアナフィラキシー反応試験ではアナフィラ
キシー反応を誘導しないものである。これらの性質・性
状は、分子量約4,000 の精製ＬＭ−２活性成分について
も同様であった。しかしながら、これらの精製ＬＭ−２
活性成分および精製ＬＭ−２ｐ活性成分は、低分子量で
あるため、充分な免疫原性が認められず、遮断抗体誘導
能を持たないものである。従ってこのままでは減感作治
療用抗原として用いることはできないものと判断され
た。
【００４１】実施例１グルタールアルデヒド法を用いた重合ダニアレルゲンの
調製 ｉ）一段階グルタールアルデヒド法による重合ダニアレ
ルゲンの調製 重合ＬＭ−２および重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの調製 前記の参考例により調製された精製ＬＭ−２活性成分ま
たは精製ＬＭ−２ｐ活性成分（以下、それぞれ単にＬＭ
−２、ＬＭ−２ｐと略す）１０ｍｇを、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
した。ここへ、最終濃度が０．２％（ｖ／ｖ）となるよ
うにグルタールアルデヒドを加え、室温で２時間反応さ
せた。次に２０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え還
元したのち、４℃で脱イオン水溶液に透析し、凍結乾燥
することによりＬＭ−２同士が重合した重合ＬＭ−２ま
たはＬＭ−２とＬＭ−２ｐが重合した重合ＬＭ−２−Ｌ
Ｍ−２ｐを得た。
調製 ｉ）一段階グルタールアルデヒド法による重合ダニアレ
ルゲンの調製 重合ＬＭ−２および重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの調製 前記の参考例により調製された精製ＬＭ−２活性成分ま
たは精製ＬＭ−２ｐ活性成分（以下、それぞれ単にＬＭ
−２、ＬＭ−２ｐと略す）１０ｍｇを、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
した。ここへ、最終濃度が０．２％（ｖ／ｖ）となるよ
うにグルタールアルデヒドを加え、室温で２時間反応さ
せた。次に２０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え還
元したのち、４℃で脱イオン水溶液に透析し、凍結乾燥
することによりＬＭ−２同士が重合した重合ＬＭ−２ま
たはＬＭ−２とＬＭ−２ｐが重合した重合ＬＭ−２−Ｌ
Ｍ−２ｐを得た。
【００４２】得られた重合ＬＭ−２または重合ＬＭ−２
−ＬＭ−２ｐを、Ultrogel AcA 54（ＩＢＦ、カラムサ
イズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４
万、２万の３画分に分画した。更に、平均分子量６万以
上の画分は、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ
１．６×１００ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８
万、６万の３画分に分画した。それぞれの画分を、同じ
カラムで再ゲル濾過（６万以上：Ultrogel AcA44 、４
万および２万： Ultrogel AcA 54) を行い、それぞれの
分子量に相当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜
で適当な濃度に濃縮した。これをそのまま使用するか、
または脱イオン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２
万、４万、６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２または重
合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を
表２に示す。
−ＬＭ−２ｐを、Ultrogel AcA 54（ＩＢＦ、カラムサ
イズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４
万、２万の３画分に分画した。更に、平均分子量６万以
上の画分は、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ
１．６×１００ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８
万、６万の３画分に分画した。それぞれの画分を、同じ
カラムで再ゲル濾過（６万以上：Ultrogel AcA44 、４
万および２万： Ultrogel AcA 54) を行い、それぞれの
分子量に相当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜
で適当な濃度に濃縮した。これをそのまま使用するか、
または脱イオン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２
万、４万、６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２または重
合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を
表２に示す。
【００４３】重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの調
製 前記のにおいて、ＬＭ−２、ＬＭ−２ｐを１０ｍｇ用
いる代わりに、ＬＭ−２ｐ５ｍｇ、ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍ５
ｍｇを用いる以外は同様にして高分子化させることによ
り重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。
製 前記のにおいて、ＬＭ−２、ＬＭ−２ｐを１０ｍｇ用
いる代わりに、ＬＭ−２ｐ５ｍｇ、ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍ５
ｍｇを用いる以外は同様にして高分子化させることによ
り重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。
【００４４】得られた重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−
Ｍを、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６
×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を
用いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万の２画分
に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultr
ogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万： Ultrogel Ac
A 54) を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量４万、６万、８万、１０万の
重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収
した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成およ
び糖組成を表２に示す。
Ｍを、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６
×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を
用いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万の２画分
に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultr
ogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万： Ultrogel Ac
A 54) を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量４万、６万、８万、１０万の
重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収
した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成およ
び糖組成を表２に示す。
【００４５】ｉｉ） 二段階グルタールアルデヒド法に
よる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンの調製 ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび
１．２５％グルタールアルデヒドを含む１０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌに溶解する。室温で１８
時間反応させた後、過剰のグルタールアルデヒドを除く
ために、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biot
echnology AB、サイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に
０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いてゲル濾過して活性化ＬＭ
−２ｐを得た。これに同量のヒト血清アルブミンを加
え、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液で全容を２ｍｌとした。
これに０．１ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）を加え、４℃で２４時間反応させた。次に１０
ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加えて還元した
のち、４℃で脱イオン水に透析した後、凍結乾燥するこ
とにより重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンを得た。
よる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンの調製 ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび
１．２５％グルタールアルデヒドを含む１０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌに溶解する。室温で１８
時間反応させた後、過剰のグルタールアルデヒドを除く
ために、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biot
echnology AB、サイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に
０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いてゲル濾過して活性化ＬＭ
−２ｐを得た。これに同量のヒト血清アルブミンを加
え、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液で全容を２ｍｌとした。
これに０．１ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）を加え、４℃で２４時間反応させた。次に１０
ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加えて還元した
のち、４℃で脱イオン水に透析した後、凍結乾燥するこ
とにより重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンを得た。
【００４６】得られた重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブ
ミンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．
６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液
を用いてゲル濾過し、平均分子量１０万、８万の２画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限
外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これを
そのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後に
それぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ヒ
ト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重
合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表２に示す。
ミンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．
６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液
を用いてゲル濾過し、平均分子量１０万、８万の２画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限
外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これを
そのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後に
それぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ヒ
ト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重
合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】 重合ＬＭ−２−ポリオルニチンおよび
重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチンの調製 前記のにおいて、ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを用いたのと同
様にしてＬＭ−２またはＬＭ−２ｐ１０ｍｇを用いて活
性化ＬＭ−２または活性化ＬＭ−２ｐを得、また前記の
においてヒト血清アルブミンを用いた代わりにポリオ
ルニチンを用いる以外は同様にして高分子化させること
により重合ＬＭ−２−ポリオルニチンまたは重合ＬＭ−
２ｐ−ポリオルニチンを得た。得られた重合ＬＭ−２−
ポリオルニチンまたは重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチン
を、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44(ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過（６万以上： Ultrogel AcA 44、４万及び２万： U
ltrogel AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリオルニチンまたは重
合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチンの凍結乾燥物を回収し
た。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および
糖組成を表３に示す。
重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチンの調製 前記のにおいて、ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを用いたのと同
様にしてＬＭ−２またはＬＭ−２ｐ１０ｍｇを用いて活
性化ＬＭ−２または活性化ＬＭ−２ｐを得、また前記の
においてヒト血清アルブミンを用いた代わりにポリオ
ルニチンを用いる以外は同様にして高分子化させること
により重合ＬＭ−２−ポリオルニチンまたは重合ＬＭ−
２ｐ−ポリオルニチンを得た。得られた重合ＬＭ−２−
ポリオルニチンまたは重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチン
を、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44(ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過（６万以上： Ultrogel AcA 44、４万及び２万： U
ltrogel AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリオルニチンまたは重
合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチンの凍結乾燥物を回収し
た。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および
糖組成を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】 重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの調製 前記のにおいて、ヒト血清アルブミンを用いる代わり
に、ポリリジンを用いる以外は同様にして高分子化させ
ることにより重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを得た。得ら
れた重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを、Ultrogel AcA 54
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液
に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均
分子量６万以上および４万、２万の３画分に分画した。
更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万： Ultrogel
AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの凍結乾燥物を回収
した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表
４に示す。
に、ポリリジンを用いる以外は同様にして高分子化させ
ることにより重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを得た。得ら
れた重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを、Ultrogel AcA 54
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液
に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均
分子量６万以上および４万、２万の３画分に分画した。
更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万： Ultrogel
AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの凍結乾燥物を回収
した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表
４に示す。
【００５１】実施例２クロスリンク化試薬を用いた重合ダニアレルゲンの調製 ｉ） ホモ二価性試薬（ＢＳ3 、ＤＭＳ）を用いる重合
ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐの調製 ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解した。ここへ１５ｍｇのＢＳ3 を加え、室温
で一晩反応させた。脱イオン水に透析した後、凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２ｐを得た。
ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐの調製 ＬＭ−２ｐ１０ｍｇを、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解した。ここへ１５ｍｇのＢＳ3 を加え、室温
で一晩反応させた。脱イオン水に透析した後、凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２ｐを得た。
【００５２】得られた重合ＬＭ−２ｐを、Ultrogel AcA
54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶
出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、
平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。
更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ultrogel A
cA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物を回収した。得られ
た重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表４に示す。
54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶
出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、
平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。
更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ultrogel A
cA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物を回収した。得られ
た重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表４に示す。
【００５３】重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIaの調製 ＬＭ−２ｐおよびホヤ抗原ＤIIIaそれぞれ５ｍｇを、１
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。ここへ、
ジメチルフォルムアミドに溶解した１５ｍｇのＤＭＳを
加え、ｐＨ９．２で室温一晩反応させた。４℃で脱イオ
ン水に透析した後、凍結乾燥することにより重合ＬＭ−
２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIaを得た。
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。ここへ、
ジメチルフォルムアミドに溶解した１５ｍｇのＤＭＳを
加え、ｐＨ９．２で室温一晩反応させた。４℃で脱イオ
ン水に透析した後、凍結乾燥することにより重合ＬＭ−
２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIaを得た。
【００５４】得られた重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIa
を、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１０
０ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２
万：Ultrogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相
当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃
度に濃縮した。これをそのまま使用するか、または脱イ
オン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、
６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIa
の凍結乾燥物を回収した。得られた重合ダニアレルゲン
のアミノ酸組成および糖組成を表４に示す。
を、Ultrogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１０
０ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２
万：Ultrogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相
当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃
度に濃縮した。これをそのまま使用するか、または脱イ
オン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、
６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原ＤIIIa
の凍結乾燥物を回収した。得られた重合ダニアレルゲン
のアミノ酸組成および糖組成を表４に示す。
【００５５】
【表４】
【００５６】ｉｉ） ヘテロ二価性試薬（ＳＰＤＰ）を
用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンの調製 ３μｍｏｌのＬＭ−２および担体としてヒト血清アルブ
ミンを０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した。ここに、エタノールに溶解
した１０倍モル量のＳＰＤＰをゆっくり滴下し、加え終
わったのち更に室温で３０分反応を続けた。次に、セフ
ァデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology A
B、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオ
ン水を用いてゲル濾過して未反応のＳＰＤＰを除いた。
ジチオピリジル化した担体を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
に溶解した。ここに、最終濃度２５ｍＭとなるようにジ
チオスレイトールを加え、室温で３０分反応した。同様
に、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechn
ology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に
脱イオン水を用いてゲル濾過して未反応のジチオスレイ
トールを除いた。ジチオピリジル化した３０ｍｇのＬＭ
−２とチオール化したヒト血清アルブミン３０ｍｇとを
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、室温で２
０時間反応させた。脱イオン水に透析した後に凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンを得
た。
用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンの調製 ３μｍｏｌのＬＭ−２および担体としてヒト血清アルブ
ミンを０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した。ここに、エタノールに溶解
した１０倍モル量のＳＰＤＰをゆっくり滴下し、加え終
わったのち更に室温で３０分反応を続けた。次に、セフ
ァデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology A
B、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオ
ン水を用いてゲル濾過して未反応のＳＰＤＰを除いた。
ジチオピリジル化した担体を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
に溶解した。ここに、最終濃度２５ｍＭとなるようにジ
チオスレイトールを加え、室温で３０分反応した。同様
に、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechn
ology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に
脱イオン水を用いてゲル濾過して未反応のジチオスレイ
トールを除いた。ジチオピリジル化した３０ｍｇのＬＭ
−２とチオール化したヒト血清アルブミン３０ｍｇとを
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、室温で２
０時間反応させた。脱イオン水に透析した後に凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンを得
た。
【００５７】得られた重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミ
ンを、Ultrogel AcA 44(ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限
外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これを
そのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後に
それぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２−ヒト
血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重合
ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表５に示
す。
ンを、Ultrogel AcA 44(ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限
外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これを
そのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後に
それぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２−ヒト
血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重合
ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表５に示
す。
【００５８】 重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの調製 前記のにおいて、ＬＭ−２の代わりにＬＭ−２ｐを、
また担体としてヒト血清アルブミンを用いる代わりに、
ポリリジンを用いる以外は同様にして高分子化させるこ
とにより重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを得た。得られた
重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを、Ultrogel AcA 54 （Ｉ
ＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液に
０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均分
子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。更に、
平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44 （ＩＢ
Ｆ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画し、平均
分子量１０万、８万、６万の３画分に分画した。それぞ
れの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万以上：Ultr
ogel AcA 44 、４万および２万：Ultrogel AcA 54）を
行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限外分
子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これをその
まま使用するか、または脱イオン水に透析した後にそれ
ぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１０万の重合
ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表５に示す。
また担体としてヒト血清アルブミンを用いる代わりに、
ポリリジンを用いる以外は同様にして高分子化させるこ
とにより重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを得た。得られた
重合ＬＭ−２ｐ−ポリリジンを、Ultrogel AcA 54 （Ｉ
ＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出液に
０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平均分
子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。更に、
平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44 （ＩＢ
Ｆ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画し、平均
分子量１０万、８万、６万の３画分に分画した。それぞ
れの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万以上：Ultr
ogel AcA 44 、４万および２万：Ultrogel AcA 54）を
行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、限外分
子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これをその
まま使用するか、または脱イオン水に透析した後にそれ
ぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１０万の重合
ＬＭ−２ｐ−ポリリジンの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表５に示す。
【００５９】 重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの
調製 前記のにおいて、ＬＭ−２の代わりにＬＭ−２ｐを、
また担体としてヒト血清アルブミンを用いる代わりに、
ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを用いる以外は同様にして高分子化さ
せることにより重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得
た。得られた重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを、Ul
trogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、
限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これ
をそのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後
にそれぞれ平均分子量６万、８万、１０万の重合ＬＭ−
２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を
表５に示す。
調製 前記のにおいて、ＬＭ−２の代わりにＬＭ−２ｐを、
また担体としてヒト血清アルブミンを用いる代わりに、
ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを用いる以外は同様にして高分子化さ
せることにより重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得
た。得られた重合ＬＭ−２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを、Ul
trogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、
限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これ
をそのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後
にそれぞれ平均分子量６万、８万、１０万の重合ＬＭ−
２ｐ−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を
表５に示す。
【００６０】
【表５】
【００６１】ｉｉｉ） ヘテロ二価性試薬（ Sulfo−Ｍ
ＢＳ）を用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンの調製 ５ｍｇのＬＭ−２ｐを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶解した。ここに４０倍モル量の Sulfo−ＭＢＳ
を加え、室温で３０分間反応を続けた。次に、セファデ
ックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology AB、カ
ラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオン水を
用いてゲル濾過して未反応のSulfo-ＭＢＳを除去して、
Sulfo-ＭＢＳ活性化ＬＭ−２ｐを得た。
ＢＳ）を用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンの調製 ５ｍｇのＬＭ−２ｐを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶解した。ここに４０倍モル量の Sulfo−ＭＢＳ
を加え、室温で３０分間反応を続けた。次に、セファデ
ックスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology AB、カ
ラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオン水を
用いてゲル濾過して未反応のSulfo-ＭＢＳを除去して、
Sulfo-ＭＢＳ活性化ＬＭ−２ｐを得た。
【００６２】次に担体として２ｍｇ／ｍｌのヒト血清ア
ルブミンを、１％２−メルカプトエタノールを含む６０
ｍＭトリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
溶解した。ここに、窒素気流下、２−イミノチオラン
（１ｍＭ）を加え、０℃、９０分間反応させた。次に、
セファデックスＧ−２５（Pharmacia LKB Biotechnolog
y AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イ
オン水を用いてゲル濾過して未反応の２−イミノチオラ
ンを除いた。
ルブミンを、１％２−メルカプトエタノールを含む６０
ｍＭトリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
溶解した。ここに、窒素気流下、２−イミノチオラン
（１ｍＭ）を加え、０℃、９０分間反応させた。次に、
セファデックスＧ−２５（Pharmacia LKB Biotechnolog
y AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イ
オン水を用いてゲル濾過して未反応の２−イミノチオラ
ンを除いた。
【００６３】このチオール誘導体化担体５ｍｇを、５０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したSulfo-ＭＢＳ
活性化ＬＭ−２ｐに加え、室温で３時間反応させた。得
られた反応生成物を脱イオン水に透析した後に凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンを
得た。
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したSulfo-ＭＢＳ
活性化ＬＭ−２ｐに加え、室温で３時間反応させた。得
られた反応生成物を脱イオン水に透析した後に凍結乾燥
することにより重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブミンを
得た。
【００６４】得られた重合ＬＭ−２ｐ−ヒト血清アルブ
ミンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．
６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液
を用いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２
ｐ−ヒト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表６に示す。
ミンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．
６×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液
を用いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２
ｐ−ヒト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得ら
れた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成を表６に示す。
【００６５】 重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaの調製 前記のにおいて、ＬＭ−２ｐをSulfo-ＭＢＳで活性化
し、ヒト血清アルブミンをチオール誘導体化する代わり
に、ホヤ抗原ＤIIIaをSulfo-ＭＢＳで活性化し、ＬＭ−
２をチオール誘導体化する以外は同様にして高分子化さ
せることにより重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaを得た。
得られた重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaを、Ultrogel A
cA54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で
溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過
し、平均分子量６万以上、４万および２万の３画分に分
画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel
AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）
で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分
画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過
（６万以上： Ultrogel AcA 44、４万および２万： Ult
rogel AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する画
分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮
した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水に
透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８
万、１０万の重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaの凍結乾燥
物を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸
組成および糖組成を表６に示す。
し、ヒト血清アルブミンをチオール誘導体化する代わり
に、ホヤ抗原ＤIIIaをSulfo-ＭＢＳで活性化し、ＬＭ−
２をチオール誘導体化する以外は同様にして高分子化さ
せることにより重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaを得た。
得られた重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaを、Ultrogel A
cA54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で
溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過
し、平均分子量６万以上、４万および２万の３画分に分
画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel
AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）
で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分
画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過
（６万以上： Ultrogel AcA 44、４万および２万： Ult
rogel AcA 54）を行い、それぞれの分子量に相当する画
分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮
した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水に
透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８
万、１０万の重合ＬＭ−２−ホヤ抗原ＤIIIaの凍結乾燥
物を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸
組成および糖組成を表６に示す。
【００６６】ｉｖ） ペプチド合成化試薬（ＥＤＣ／Su
lfo-ＮＨＳ）を用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンの調製 カルボキシル基量として３ｍＭのＬＭ−２、担体として
０．１ｍＭのヒト血清アルブミンおよび６．７ｍＭ Su
lfo-ＮＨＳ水溶液３ｍｌに０．１Ｍ ＥＤＣを加え、カ
ップリング反応を開始した。室温で一晩反応した後、セ
ファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB BiotechnologyA
B、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオ
ン水を用いてゲル濾過して重合ＬＭ−２−ヒト血清アル
ブミンを得た。
lfo-ＮＨＳ）を用いる重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミンの調製 カルボキシル基量として３ｍＭのＬＭ−２、担体として
０．１ｍＭのヒト血清アルブミンおよび６．７ｍＭ Su
lfo-ＮＨＳ水溶液３ｍｌに０．１Ｍ ＥＤＣを加え、カ
ップリング反応を開始した。室温で一晩反応した後、セ
ファデックスＧ−１０（Pharmacia LKB BiotechnologyA
B、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオ
ン水を用いてゲル濾過して重合ＬＭ−２−ヒト血清アル
ブミンを得た。
【００６７】得られた重合ＬＭ−２−ヒト血清アルブミ
ンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６
×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を
用いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、
限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これ
をそのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後
にそれぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２−ヒ
ト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重
合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表６に
示す。
ンを、Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６
×１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を
用いてゲル濾過し、平均分子量１０万および８万の２画
分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル
濾過を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集め、
限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。これ
をそのまま使用するか、または脱イオン水に透析した後
にそれぞれ平均分子量８万、１０万の重合ＬＭ−２−ヒ
ト血清アルブミンの凍結乾燥物を回収した。得られた重
合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表６に
示す。
【００６８】
【表６】
【００６９】 重合ＬＭ−２−ポリアスパラギン酸お
よび重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸の調製 前記のにおいて、カルボキシル基量として３ｍＭのＬ
Ｍ−２またはＬＭ−２ｐを用い、担体としてヒト血清ア
ルブミンの代わりにポリアスパラギン酸を用いる以外は
同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−２−ポ
リアスパラギン酸または重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラ
ギン酸を得た。
よび重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸の調製 前記のにおいて、カルボキシル基量として３ｍＭのＬ
Ｍ−２またはＬＭ−２ｐを用い、担体としてヒト血清ア
ルブミンの代わりにポリアスパラギン酸を用いる以外は
同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−２−ポ
リアスパラギン酸または重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラ
ギン酸を得た。
【００７０】得られた重合ＬＭ−２−ポリアスパラギン
酸または重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸を、Ultr
ogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル
濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分
画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel
AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）
で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分
画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過
（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ultr
ogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画
分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮
した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水に
透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８
万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリアスパラギン酸または
重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸の凍結乾燥物を回
収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成お
よび糖組成を表７に示す。
酸または重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸を、Ultr
ogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル
濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分
画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel
AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）
で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分
画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過
（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ultr
ogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画
分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮
した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水に
透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８
万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリアスパラギン酸または
重合ＬＭ−２ｐ−ポリアスパラギン酸の凍結乾燥物を回
収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成お
よび糖組成を表７に示す。
【００７１】
【表７】
【００７２】 重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチンの調
製 前記のにおいて、ＬＭ−２の代わりにＬＭ−２ｐを、
またヒト血清アルブミンの代わりにポリオルニチンを用
いる以外は同様にして高分子化させることにより重合Ｌ
Ｍ−２ｐ−ポリオルニチンを得た。
製 前記のにおいて、ＬＭ−２の代わりにＬＭ−２ｐを、
またヒト血清アルブミンの代わりにポリオルニチンを用
いる以外は同様にして高分子化させることにより重合Ｌ
Ｍ−２ｐ−ポリオルニチンを得た。
【００７３】得られた重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチン
を、UltrogelAcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１０
０ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２
万：Ultrogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相
当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃
度に濃縮した。これをそのまま使用するか、または脱イ
オン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、
６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチン
の凍結乾燥物を回収した。得られた重合ダニアレルゲン
のアミノ酸組成を表８に示す。
を、UltrogelAcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３
画分に分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、
Ultrogel AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１０
０ｃｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３
画分に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲ
ル濾過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２
万：Ultrogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相
当する画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃
度に濃縮した。これをそのまま使用するか、または脱イ
オン水に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、
６万、８万、１０万の重合ＬＭ−２ｐ−ポリオルニチン
の凍結乾燥物を回収した。得られた重合ダニアレルゲン
のアミノ酸組成を表８に示す。
【００７４】実施例３過沃素酸酸化を利用した重合ダニアレルゲンの調製 重合ＬＭ−２の調製 ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した１０ｍｇ
のＬＭ−２に、糖残基換算で等モル量の１０ｍＭ過沃素
酸ナトリウム溶液を加え、暗所で一晩酸化した。この反
応液を濃縮後、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LK
BBiotechnology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）
で溶離液に１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いてゲ
ル濾過、または１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対し
て透析し、過沃素酸酸化したＬＭ−２を得た。
のＬＭ−２に、糖残基換算で等モル量の１０ｍＭ過沃素
酸ナトリウム溶液を加え、暗所で一晩酸化した。この反
応液を濃縮後、セファデックスＧ−１０（Pharmacia LK
BBiotechnology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃｍ）
で溶離液に１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いてゲ
ル濾過、または１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対し
て透析し、過沃素酸酸化したＬＭ−２を得た。
【００７５】過沃素酸酸化したＬＭ−２反応液をｐＨ
９．５にした後、糖残基換算で等モル量のエチレンジア
ミンを加え、室温で２時間反応した。これに、１０ｍｇ
の水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で４時間還元し
た。この反応液を、セファデックスＧ−１０（Pharmaci
a LKB Biotechnology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃ
ｍ）で溶離液に脱イオン水を用いてゲル濾過、または脱
イオン水に対して透析して重合ＬＭ−２を得た。
９．５にした後、糖残基換算で等モル量のエチレンジア
ミンを加え、室温で２時間反応した。これに、１０ｍｇ
の水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で４時間還元し
た。この反応液を、セファデックスＧ−１０（Pharmaci
a LKB Biotechnology AB、カラムサイズ０．９×６０ｃ
ｍ）で溶離液に脱イオン水を用いてゲル濾過、または脱
イオン水に対して透析して重合ＬＭ−２を得た。
【００７６】得られた重合ＬＭ−２を、Ultrogel AcA 5
4 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出
液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平
均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。更
に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：UltrogelAc
A 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２の凍結乾燥物を回収した。得られた
重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表８
に示す。
4 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で溶出
液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲル濾過し、平
均分子量６万以上、４万、２万の３画分に分画した。更
に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrogel AcA 44
（ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃｍ）で分画
し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分に分画し
た。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾過（６万
以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：UltrogelAc
A 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、８万、１
０万の重合ＬＭ−２の凍結乾燥物を回収した。得られた
重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および糖組成を表８
に示す。
【００７７】 重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの調
製 前記のにおいて、ＬＭ−２を過沃素酸酸化する代わり
に５ｍｇのＬＭ−２と５ｍｇのホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを混合
し同様に処理することにより過沃素酸酸化したＬＭ−２
および過沃素酸酸化したホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。過沃
素酸酸化したＬＭ−２を含む過沃素酸酸化したホヤ抗原
Ｅｉ−Ｍの反応液をｐＨ９．５にした後、糖残基換算で
等モル量のエチレンジアミンを加え、室温で２時間反応
した。これに、１０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加
え、室温で４時間還元した。この反応液を、セファデッ
クスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology AB、カラ
ムサイズ ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオン水を
用いてゲル濾過、または脱イオン水に対して透析して重
合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。
製 前記のにおいて、ＬＭ−２を過沃素酸酸化する代わり
に５ｍｇのＬＭ−２と５ｍｇのホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを混合
し同様に処理することにより過沃素酸酸化したＬＭ−２
および過沃素酸酸化したホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。過沃
素酸酸化したＬＭ−２を含む過沃素酸酸化したホヤ抗原
Ｅｉ−Ｍの反応液をｐＨ９．５にした後、糖残基換算で
等モル量のエチレンジアミンを加え、室温で２時間反応
した。これに、１０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加
え、室温で４時間還元した。この反応液を、セファデッ
クスＧ−１０（Pharmacia LKB Biotechnology AB、カラ
ムサイズ ０．９×６０ｃｍ）で溶離液に脱イオン水を
用いてゲル濾過、または脱イオン水に対して透析して重
合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍを得た。
【００７８】得られた重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍ
を、UltrogelAcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万の２画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万：Ultrogel AcA
54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量４万、６万、８万、１０万の
重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収し
た。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および
糖組成を表８に示す。
を、UltrogelAcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×
１００ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用
いてゲル濾過し、平均分子量６万以上、４万の２画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万：Ultrogel AcA
54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する画分を集
め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃縮した。
これをそのまま使用するか、または脱イオン水に透析し
た後にそれぞれ平均分子量４万、６万、８万、１０万の
重合ＬＭ−２−ホヤ抗原Ｅｉ−Ｍの凍結乾燥物を回収し
た。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組成および
糖組成を表８に示す。
【００７９】 重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの調製 前記のにおいて、過沃素酸酸化したＬＭ−２反応液に
エチレンジアミンを加える代わりに、アミノ基換算で生
成したアルデヒド基の２倍モル量のＬＭ−２ｐを加える
以外は同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−
２−ＬＭ−２ｐを得た。
エチレンジアミンを加える代わりに、アミノ基換算で生
成したアルデヒド基の２倍モル量のＬＭ−２ｐを加える
以外は同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−
２−ＬＭ−２ｐを得た。
【００８０】得られた重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐを、Ul
trogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲ
ル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ul
trogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物
を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組
成および糖組成を表８に示す。
trogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲ
ル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ul
trogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ＬＭ−２ｐの凍結乾燥物
を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組
成および糖組成を表８に示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】 重合ＬＭ−２−ポリリジンの調製 前記のにおいて、過沃素酸酸化したＬＭ−２反応液に
エチレンジアミンを加える代わりに、アミノ基換算で生
成したアルデヒド基の２倍モル量のポリリジンを加える
以外は同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−
２−ポリリジンを得た。
エチレンジアミンを加える代わりに、アミノ基換算で生
成したアルデヒド基の２倍モル量のポリリジンを加える
以外は同様にして高分子化させることにより重合ＬＭ−
２−ポリリジンを得た。
【００８３】得られた重合ＬＭ−２−ポリリジンを、Ul
trogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲ
ル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ul
trogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリリジンの凍結乾燥物
を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組
成および糖組成を表９に示す。
trogel AcA 54 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００
ｃｍ）で溶出液に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いてゲ
ル濾過し、平均分子量６万以上、４万、２万の３画分に
分画した。更に、平均分子量６万以上の画分は、Ultrog
el AcA 44 （ＩＢＦ、カラムサイズ１．６×１００ｃ
ｍ）で分画し、平均分子量１０万、８万、６万の３画分
に分画した。それぞれの画分を、同じカラムで再ゲル濾
過（６万以上：Ultrogel AcA 44 、４万および２万：Ul
trogel AcA 54 ）を行い、それぞれの分子量に相当する
画分を集め、限外分子量１万の濾過膜で適当な濃度に濃
縮した。これをそのまま使用するか、または脱イオン水
に透析した後にそれぞれ平均分子量２万、４万、６万、
８万、１０万の重合ＬＭ−２−ポリリジンの凍結乾燥物
を回収した。得られた重合ダニアレルゲンのアミノ酸組
成および糖組成を表９に示す。
【００８４】
【表９】
【００８５】実施例４減感作治療用抗原製剤の調製 0.5 ％フェノールを添加した0.9 ％食塩水を溶媒とし、
実施例１〜３で得られた各種の重合ダニアレルゲンを１
ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液と
する。
実施例１〜３で得られた各種の重合ダニアレルゲンを１
ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液と
する。
【００８６】実施例５ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製 ハンクス緩衝液を溶媒とし、実施例１〜３で得られた各
種の重合ダニアレルゲンを１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解
し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とする。
種の重合ダニアレルゲンを１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解
し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とする。
【００８７】
【発明の効果】本発明の重合ダニアレルゲンは、有効性
および安全性の観点からダニアレルギー疾患治療剤およ
び診断薬として有用である。本発明の重合ダニアレルゲ
ンを用いた減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用
もなく人体に対して安全に用いることができる。また、
本発明の重合ダニアレルゲンを用いた診断薬によりダニ
アレルギー疾患の迅速かつ正確な診断システムの確立が
期待される。
および安全性の観点からダニアレルギー疾患治療剤およ
び診断薬として有用である。本発明の重合ダニアレルゲ
ンを用いた減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用
もなく人体に対して安全に用いることができる。また、
本発明の重合ダニアレルゲンを用いた診断薬によりダニ
アレルギー疾患の迅速かつ正確な診断システムの確立が
期待される。
【図１】図１は参考例２においてＬＭをゲル濾過して得
た各フラクションについて、アレルゲン活性をダニアレ
ルギー患者白血球に対するヒスタミン遊離試験で検定し
た結果を示す。図中、ＢＤはボイドボリュームに相当し
ブルーデキストランの溶出位置を、ＢＳＡは牛血清アル
ブミンの溶出位置を、またＴＶはトータルボリュームで
Ｋ2 ＣｒＯ4 の溶出位置を示す。また、破線は２８０ｎ
ｍの紫外部吸収を示す。
た各フラクションについて、アレルゲン活性をダニアレ
ルギー患者白血球に対するヒスタミン遊離試験で検定し
た結果を示す。図中、ＢＤはボイドボリュームに相当し
ブルーデキストランの溶出位置を、ＢＳＡは牛血清アル
ブミンの溶出位置を、またＴＶはトータルボリュームで
Ｋ2 ＣｒＯ4 の溶出位置を示す。また、破線は２８０ｎ
ｍの紫外部吸収を示す。
【図２】図２は参考例３においてＬＭ−２画分をオボア
ルブミン、チトクロームＣ、インシュリンβ鎖およびビ
タミンＢ12と共にセファデックスＧ５０でのゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い、ＬＭ−２画分中の活性成分の
分子量推定を行った図である。図中、ヒストグラムは白
血球ヒスタミン遊離活性を、ＯＶＡは分子量 45,000 の
オボアルブミンの溶出位置を、またCyt. C は分子量 1
3,500 のチトクロームＣの溶出位置を、Insulin βはイ
ンシュリンβ鎖を、さらにＢ12はビタミンＢ12の溶出位
置を示す。
ルブミン、チトクロームＣ、インシュリンβ鎖およびビ
タミンＢ12と共にセファデックスＧ５０でのゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い、ＬＭ−２画分中の活性成分の
分子量推定を行った図である。図中、ヒストグラムは白
血球ヒスタミン遊離活性を、ＯＶＡは分子量 45,000 の
オボアルブミンの溶出位置を、またCyt. C は分子量 1
3,500 のチトクロームＣの溶出位置を、Insulin βはイ
ンシュリンβ鎖を、さらにＢ12はビタミンＢ12の溶出位
置を示す。
【図３】図３は参考例３で得られた精製ＬＭ−２活性成
分１０ｍｇをプロナーゼ消化と過沃素酸酸化を行い、各
生成物についてヒスタミン遊離活性を調べ、その結果を
示す図である。図中、○はインタクトなものを、△は過
沃素酸酸化処理したもの、□はプロナーゼ消化をしたも
のを示す。
分１０ｍｇをプロナーゼ消化と過沃素酸酸化を行い、各
生成物についてヒスタミン遊離活性を調べ、その結果を
示す図である。図中、○はインタクトなものを、△は過
沃素酸酸化処理したもの、□はプロナーゼ消化をしたも
のを示す。
【図４】図４は参考例５において（ａ）で得られたＬＭ
−２ｐ画分３ｍｇをＱＡＥ−セファデックスＡ２５でイ
オン交換クロマトグラフィーを行い分画した結果を示
す。図中、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性
を、○は２１５ｎｍの紫外部吸収を、実線は塩酸の濃度
を示す。
−２ｐ画分３ｍｇをＱＡＥ−セファデックスＡ２５でイ
オン交換クロマトグラフィーを行い分画した結果を示
す。図中、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性
を、○は２１５ｎｍの紫外部吸収を、実線は塩酸の濃度
を示す。
【図５】図５は参考例５において（ｂ）で得られたＬＭ
−２ｐ画分１０ｍｇを、TSKgelODS-120T を用いて逆相
ＨＰＬＣを行い分画した結果を示す。図中、ヒストグラ
ムは白血球ヒスタミン遊離活性を、実線は２８０ｎｍの
紫外部吸収を、また破線はメタノールの濃度を示す。
−２ｐ画分１０ｍｇを、TSKgelODS-120T を用いて逆相
ＨＰＬＣを行い分画した結果を示す。図中、ヒストグラ
ムは白血球ヒスタミン遊離活性を、実線は２８０ｎｍの
紫外部吸収を、また破線はメタノールの濃度を示す。
【図６】図６は参考例５において（ｃ）で得られたＬＭ
−２ｐ画分１．１ｍｇを Asahipack GS-320 カラムを用
いたＤＭＣの結果を示す。図中、ヒストグラムは白血球
ヒスタミン遊離活性を、実線は２１５ｎｍの紫外部吸収
を示す。
−２ｐ画分１．１ｍｇを Asahipack GS-320 カラムを用
いたＤＭＣの結果を示す。図中、ヒストグラムは白血球
ヒスタミン遊離活性を、実線は２１５ｎｍの紫外部吸収
を示す。
【図７】図７は参考例５において（ｄ）で得られたＬＭ
−２ｐ画分を、TSKgel ODS-120T を用いて逆相ＨＰＬＣ
を行った結果を示す。図中、実線は２１５ｎｍの紫外部
吸収を、破線はメタノールの濃度を示す。
−２ｐ画分を、TSKgel ODS-120T を用いて逆相ＨＰＬＣ
を行った結果を示す。図中、実線は２１５ｎｍの紫外部
吸収を、破線はメタノールの濃度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 和田 武志 広島県佐伯郡大野町908番地334号 (56)参考文献 特開 平３−81300（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/435 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】 ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれる分
子量が約 4,000（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）の
アレルゲン活性を有する糖蛋白質を高分子化させてな
る、平均分子量が約20,000〜100,000 の重合ダニアレル
ゲン。 - 【請求項２】 ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれる分
子量が約 4,000（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）の
アレルゲン活性を有する糖蛋白質の糖部分を除去して得
られる分子量が約 2,400の蛋白質を高分子化させてな
る、平均分子量が約20,000〜100,000 の重合ダニアレル
ゲン。 - 【請求項３】 糖蛋白質がダニ培養中の排泄物を飽和食
塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液により抽
出処理し、得られた抽出液をゲル濾過等の手法を用いて
分画して得られたものである請求項１または２記載の重
合ダニアレルゲン。 - 【請求項４】 請求項１記載の糖蛋白質同士を重合させ
てなる請求項１記載の重合ダニアレルゲン。 - 【請求項５】 請求項２記載の蛋白質同士を重合させて
なる請求項２記載の重合ダニアレルゲン。 - 【請求項６】 請求項１記載の糖蛋白質と他のダニアレ
ルゲンとを重合させてなる請求項１記載の重合ダニアレ
ルゲン。 - 【請求項７】 請求項２記載の蛋白質と他のダニアレル
ゲンとを重合させてなる請求項２記載の重合ダニアレル
ゲン。 - 【請求項８】 請求項１記載の糖蛋白質とヒト由来蛋白
質、合成高分子、または天然高分子とを重合させてなる
請求項１記載の重合ダニアレルゲン。 - 【請求項９】 請求項２記載の蛋白質とヒト由来蛋白
質、合成高分子、または天然高分子とを重合させてなる
請求項２記載の重合ダニアレルゲン。 - 【請求項１０】 請求項１〜９いずれか記載の重合ダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療
剤。 - 【請求項１１】 請求項１〜９いずれか記載の重合ダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03320032A JP3124344B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | 重合ダニアレルゲン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03320032A JP3124344B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | 重合ダニアレルゲン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05125098A JPH05125098A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3124344B2 true JP3124344B2 (ja) | 2001-01-15 |
Family
ID=18116990
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03320032A Expired - Fee Related JP3124344B2 (ja) | 1991-11-06 | 1991-11-06 | 重合ダニアレルゲン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3124344B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2019422413A1 (en) * | 2019-01-17 | 2021-08-26 | LETI Pharma S.L. | Methods of purifying an allergen extract |
-
1991
- 1991-11-06 JP JP03320032A patent/JP3124344B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05125098A (ja) | 1993-05-21 |
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