JP3980016B2 - ペプチドとその用途 - Google Patents

Description

この発明は、新規ペプチドとその用途、とりわけ、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化するペプチドと、そのペプチドを有効成分として含んでなる免疫療法剤に関する。

ここ十数年来、我国においては、春先になるとスギ花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が増加し続けている。患者の数が多いことと、発症季がいろいろな行事が続く春先ということもあり、マスコミなどでも頻繁に取上げられ、今や、公衆衛生上無視できない問題の一つになっている。

スギ花粉症はアレルギー症の一種であり、その主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花粉アレルゲンであると云われている。大気中に飛散したスギ花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲンに対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状態で次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のアレルゲンとこのイムノグロブリンＥ抗体が免疫反応を起し、アレルギー症状を呈することとなる。

現在、スギ花粉中には、抗原性の相違する少なくとも二種類のアレルゲンの存在することが知られている。その一つは、ヤスエダらが『ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙ ｊ Ｉ」と呼称されている。もう一つは、タニアイら『エフ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチら『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙ ｊ ＩＩ」と呼称されている。スギ花粉中には、通常、Ｃｒｙ ｊ ＩとＣｒｙ ｊ ＩＩが約５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採取した血清の殆どがＣｒｙ ｊ ＩにもＣｒｙ ｊ ＩＩにも反応すると云われている。澤谷らは、『アレルギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９９３年）において、Ｃｒｙ ｊ ＩＩが、皮内試験やＲＡＳＴ試験すると、Ｃｒｙ ｊ Ｉと同程度の抗原性を発揮すると報告している。

このように、スギ花粉アレルゲンが既に幾つか単離され、その性質・性状もある程度解明されたことから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減感作することにより、スギ花粉症を治療・予防できる見通しがついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか考案されており、例えば、特開平１−１５６９２６号公報や特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端からのアミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ又はＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎで表わされるスギ花粉アレルゲンに糖質を共有結合せしめ、生成した複合体を減感作剤としてヒトに投与する提案が為されている。しかしながら、アレルギー症の診断や減感作療法には、通常、高純度のアレルゲンが大量に必要とされるところ、スギ花粉中のアレルゲンは僅少であるうえに安定性が低く、スギ花粉症の診断剤や減感作剤をスギ花粉だけで賄おうとすると、多大の困難が伴なうと予想される。

このようなことから、最近のアレルギー疾患の治療・予防においては、これまでのように、患者にアレルゲン全体を投与するのではなく、アレルゲンにおけるＴ細胞が特異的に認識する最小領域、すなわち、本質的にＴ細胞エピトープからなる低分子のペプチドを投与する免疫療法が注目を浴びつつある。

一般に、アレルゲンは、マクロファージなどの抗原提示細胞に取込まれると、そこで消化され、消化断片が免疫提示細胞表層のＨＬＡ蛋白質に結合し、抗原提示されることとなる。抗原提示される断片は、ＨＬＡ蛋白質に対する親和性などにより、アレルゲンにおける一部の特定領域に限られ、斯かる領域のうち、Ｔ細胞が特異的に認識する領域は、通常、「Ｔ細胞エピトープ」と呼称される。本質的にＴ細胞エピトープからなるペプチドを投与する免疫療法には、
（ｉ） ペプチドがＢ細胞エピトープを欠いている、すなわち、アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体が反応しないので、従来の粗製又は精製アレルゲンで頻発していたアナフィラキシーなどの副作用が起こり得ない。
（ｉｉ） 少量からスタートし、有効投与量に達するまでの期間が、従来の減感作剤に比較して、大幅に短縮できる。
などの利点がある。

目下、種々のアレルゲンのＴ細胞エピトープが精力的に解析されているが、Ｔ細胞エピトープの解析には、通常、アレルゲンの全アミノ酸配列が必須となり、少なくともスギ花粉アレルゲンに関するかぎり、Ｔ細胞エピトープは実質的に解明されるに到っていないというのが実状である。

斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるペプチド及びそれに相同的なペプチドを提供することにある。

この発明の第二の課題は、有効成分として上記ペプチドを含んでなる免疫療法剤を提供することにある。

この発明は、前記第一の課題を、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、³Ｈ−チミジンの取込みにより判定する方法で 試験すると、陰性対照と比較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化するペプチドにより解決するものである。

この発明は、前記第二の課題を、有効成分として斯かるペプチドを含んでなる免疫療法剤により解決するものである。

この発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化する。

有効成分として斯かるペプチドを含んでなるこの発明の免疫療法剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。

以下、実験例、実施例等によりこの発明を説明するに、この発明は、本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるペプチドの発見に基づくものである。

本発明者らは、長年に亙るスギ花粉アレルゲンに係わる研究の一成果として、昨年、スギ花粉アレルゲンの主たる１成分が配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列を有することを突止め、特願平５−３４４５９６号明細書に開示した。一方、国際特許公開第９３／０１２１３号明細書には、スギ花粉アレルゲンの別の１成分が、配列表における配列番号１５に示すアミノ酸配列を有すると開示されており、本発明者らも、平成６年４月１４乃至１６日に熊本県熊本市で開催された『第６回日本アレルギー学会春期臨床大会』において、同じアミノ酸配列を発表している。

そこで、本発明者が、スギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープを解明すべく、これら配列番号１４及び１５に示すアミノ酸配列に基づき、それらアミノ酸配列における連続する１１、１４又は１７個のアミノ酸残基からなる、１８０余種の互いに相違するアミノ酸配列のペプチドを合成し、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に対する反応性と、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞に対する活性化作用につき試験した。その結果、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、また、³Ｈ−チミジンの取込み により判定する方法で試験すると、陰性対照と比較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化することが明らかとなった。このことは、それら配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列を有するペプチドが本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるものであることを示唆している。また、その配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列をさらに解析したところ、配列表の配列番号１乃至７に示すアミノ酸配列は、Ｔ細胞が配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドを認識するために不可欠の配列であることが判明した。

次の実験例１及び２では、これら事実を解明するに到った一連の実験について説明する。

＜実験１：ペプチド及びスギ花粉アレルゲンの調製＞

＜実験例１−１：ペプチドの調製＞
前述のとおり、これまで、スギ花粉には、性質・性状の相違する、少なくとも２種類のアレルゲンの存在することが知られている。これらスギ花粉アレルゲンの成熟蛋白質は、組換えＤＮＡ技術により、配列表における配列番号１４又は１５に示すアミノ酸配列を有することが明らかにされており、現に、スギ花粉からは、配列番号１４に示すアミノ酸配列における第４６乃至４３３番目又は第５１乃至４３３番目に相当するアミノ酸配列のスギ花粉アレルゲン（以下、「アレルゲンＡ」と云う。）と、配列番号１５に示すアミノ酸配列における第１乃至３５３番目のアミノ酸配列を有するスギ花粉アレルゲン（以下、「アレルゲンＢ」と云う。）が単離されている。なお、アレルゲンＡをコードする遺伝子においては、未だ、シグナルペプチドが確定されていないので、配列番号１４においては、暫定的に、ｃＤＮＡの塩基配列から解読したアミノ酸配列におけるＮ末端側の最初のアミノ酸残基に符号「１」を付している。

本実験例では、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列については、その第４６乃至４３３番目の領域に亙り、アミノ酸残基を１０個ずつ重複させながら、１１又は１４個のアミノ酸残基からなる、９５種類の相違するアミノ酸配列のペプチド（試料Ａ−１乃至Ａ−９５）を化学合成する一方、配列番号１５に示すアミノ酸配列については、その第１乃至３５３番目の領域に亙り、同じく、アミノ酸残基を１０個ずつ重複させながら、１４個のアミノ酸残基からなる、８６種類の相違するアミノ酸配列のペプチド（試料Ｂ−１乃至Ｂ−８６）を化学合成し、この発明のペプチドを検索するための後記実験例２に供した。

すなわち、常法にしたがって、１１又は１４個のアミノ酸残基からなり、後記表１乃至６に示すアミノ酸配列を有する１８１種類のペプチドをケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ製ペプチド合成キット『マルチピン』を使用する固相法により合成し、合成後、その一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシーケンサー『４７０Ａ型』により分析して所期のアミノ酸配列を有していることを確認した。

＜実験例１−２：スギ花粉アレルゲンの調製＞
秋田県産ウラスギの雄花から採取した花粉１重量部を約１６重量部の０．１２５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．２）に浸漬し、穏やかに攪拌しながら、４℃で１時間抽出した。抽出物を遠心分離し、残渣を上記と同様に再度抽出し、得られた上清と初回の上清をプールし、これにセタブロンを０．１％（ｗ／ｖ）になるように加え、緩やかに攪拌しながら、４℃で１時間静置して多糖類を沈澱させ、遠心分離後、上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え、４℃で一昼夜静置して塩析した。

塩析物における沈澱部を採取し、これを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に対して１０時間透析し、濾過後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファデックスカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液して蛋白質成分を含む画分を溶出させた。この画分を採取し、酢酸を加えてｐＨ５．０に調整後、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させておいたＣＭ−セファデックスカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、カラムに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、蛋白質成分を含む画分を採取した。

次に、この画分に予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させておいたＭｏｎｏ Ｓカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液したところ、０．１乃至０．３付近の塩化ナトリウム濃度でアレルゲンＢが、また、０．４Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度でアレルゲンＡが溶出した。アレルゲンＡ又はＢを含む画分を別々に採取し、適宜濃縮後、凍結乾燥して次の実験例２に供した。収量は、原料スギ花粉固形分当たり、アレルゲンＡで約０．０１％、アレルゲンＢで約０．０２％であった。

＜実験例２：スギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープを含むペプチドの検索＞

＜実験例２−１：スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞の活性化＞
フィコール・ハイパック比重遠心法により、花粉症患者のヘパリン加末梢血からスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を含む単核細胞群を分離した。この単核細胞群を５％（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．０）に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレート上に５×１０^５個／ウェルずつ分注 し、実験例１−１及び１−２で調製したペプチド又はスギ花粉アレルゲンを１μｇ／ウェル加え、新鮮な同一培地で２００μｌ／ウェルとした後、５％ＣＯ2培 養器中、３７℃で２日間インキュベートした。その後、³Ｈ−チミジンを１．０ μＣｉ／ウェルずつ加え、同一条件下でさらに１６時間インキュベートした後、シンチレーションカウンタを使用する公知の方法により、単核細胞群における³Ｈ−チミジンの取込み量を測定した。同時に、ペプチドもスギ花粉アレルゲンも含まない系を設け、上記と同様に処置して陰性対照とした。

スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞に対する活性化作用の有無は、同Ｔ細胞を含む単核細胞群における³Ｈ−チミジンの取込み量（ｃｐｍ）に基づき判定し、取込み量が陰性対照の略２倍以上に達した系を「陽性」、達しなかった系を「陰性」とした。結果を表１乃至６に示す。

表１乃至６の結果は、試験に供したペプチド及びスギ花粉アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞に対して明らかに異なる挙動をしたことを示している。すなわち、試料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ−２３、Ａ−４８、Ａ−４９、Ａ−８９、Ｂ−３９、Ｂ−８０又はスギ花粉アレルゲンＡ若しくはＢを添加した系では、陰性対照と比較して、明らかに有意な³Ｈ−チミジンの取込み促進が認 められたのに対して、その余の試料を添加した系においては、有意な取込み促進が認められなかった。このことは、試料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ−２３、Ａ−４８、Ａ−４９、Ａ−８９、Ｂ−３９、Ｂ−８０並びにスギ花粉アレルゲンＡ及びＢのみが、単核細胞群中のスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化したことを意味している。

さらに、アミノ酸配列が互いに重複する試料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ−４８及びＡ−４９並びにＴ細胞活性化作用が他の陽性試料に比べてやや低かった試料Ａ−２３及びＡ−８９につき、別途、１７個のアミノ酸残基からなる、配列表における配列番号８乃至１１に示すアミノ酸配列のペプチドを化学合成した。

すなわち、ミリジェン／バイオリサーチ製ペプチド合成機『エクセル』を使用し、常法にしたがって、配列表における配列番号８乃至１１に示すアミノ酸配列のペプチド（試料Ｃ−１乃至Ｃ−４）を別々に合成し、バイオラド製クロマトグラフィーカラム『Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ−３１８型』を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーによりそれぞれ純度９５％まで精製した。精製後、試料Ｃ−１乃至Ｃ−４の一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシーケンサ『４７０Ａ型』により分析したところ、合成に係る４種類のペプチドすべてが所期のアミノ酸配列を有していた。

これら試料Ｃ−１乃至Ｃ−４につき、上記と同様に試験したところ、いずれも陽性であり、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化することが判明した。

＜実験例２−２：スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に対する反応性＞
実験例２−１においてスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化することが明らかとなった試料Ｂ−３９、Ｂ−８０、Ｃ−１乃至Ｃ−４並びにアレルゲンＡ及びＢに、タニアイらが『モレキュラー・イムノロジー』、第３０巻、第２号、第１８３〜１８９頁（１９９３年）に報告しているＥＩＡ法を適用し、スギ花粉症患者の血液から採取したスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体との反応性を調べた。

すなわち、ピアス製架橋剤『（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）』１ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、ヌンク製『コバリンク型』９６ウェルマイクロプレートに５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３時間インキュベートした。蒸留水でマイクロプレートを洗浄し、実験例１及び２で調製した試料Ｂ−３９、Ｂ−８０、Ｃ−１乃至Ｃ−４又はアレルゲンＡ若しくはＢを２０μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し、マイクロプレートに５０μｌ／ウェル分注し、３７℃でさらに３時間インキュベートしてマイクロプレートに共有結合させた。そして、マイクロプレートに１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを５０μｌ／ウェル加え、４℃で一晩静置して未反応の活性基をブロックした後、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し、ウシ血清アルブミンを同量含む新鮮なＰＢＳで５倍希釈したスギ花粉症患者の血清を５０μｌ／ウェル加え、３７℃で１時間反応させた。

次に、マイクロプレートを０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し、ウシ血清アルブミンを同量含む新鮮なＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したキルケガード・アンド・ペリー製ビオチン標識抗ヒトε鎖抗体を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで再度洗浄後、ウシ血清アルブミンを同量含む新鮮なＰＢＳで５，０００倍に希釈したザイメッド製パーオキシダーゼ標識アビジンを５０μｌ／ウェル加え、３７℃でさらに１時間インキュベートした。そして、マイクロプレートを０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄後、過酸化水素を０．０３％（ｖ／ｖ）とオルトフェニレンジアミンを０．５ｍｇ／ｍｌ含む０．１Ｍクエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ウェル加え、室温下で５分間静置して酵素反応させた。２Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ加えて反応を停止させた後、分光光度計を使用する公知の方法で４９２ｎｍの波長下における吸光度を測定した。

同時に、スギ花粉患者の血清に代えて健常者の血清を使用する系を設け、同様に処置して陰性対照とした。結果を表１乃至６に示す。

表１乃至６に示す結果から明らかなように、アレルゲンＡ及びＢがスギ花粉症患者由来のスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に強く反応したのに対して、試料Ｂ−３９、Ｂ−８０及びＣ−１乃至Ｃ−４は実質的に反応しなかった。このことは、これら試料がアレルゲンＡ及びＢに含まれるスギ花粉アレルゲンのＢ細胞エピトープを欠いていることを意味している。これらの結果と実験例２−１の結果を総合的に判断すると、上記試料、すなわち、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドは、本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるものであると判断される。

＜実験例３：Ｔ細胞がＴ細胞エピトープを認識するために不可欠なアミノ酸配列の検索＞
本実験例では、実験例２で明らかにした６種類のＴ細胞エピトープをさらに解析し、Ｔ細胞がそれらを認識するために不可欠なアミノ酸配列を検索した。

すなわち、実験例１−１の方法により、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列並びに表５乃至６において陽性を否定し切れなかった試料Ｂ−３８、Ｂ−８１及びＢ−８２のアミノ酸配列につき、それらの一端又は両端のアミノ酸の１個又は２個以上をアラニンで置換したアミノ酸１４個又は１７個からなる種々のペプチドを化学合成した。そして、それらペプチドにつき、実験例２の方法により、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞の活性化とスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に対する反応性を調べた。

その結果、表７に示すように、配列表の配列番号１乃至７に示すアミノ酸配列を含んでなる試料Ｄ−１乃至Ｄ−７のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞及びスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に対して配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドとほぼ同様の挙動を示すことが判明した。このことは、配列表の配列番号１乃至７に示すアミノ酸配列は、Ｔ細胞が配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドを認識するために不可欠な配列であることを強く示唆している。

以上説明したように、この発明は、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、³Ｈ−チミジンの取込みにより判定する方法 により試験すると、陰性対照と比較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化するペプチドに関するものである。この発明は、ペプチドが斯かる性質を具備するかぎり、その構造、出所・由来、調製方法に係わりなく、すべて包含するものとする。

この発明のペプチドは、通常、５乃至５０個、望ましくは、１０乃至２０個のアミノ酸がペプチド結合してなる。個々のペプチドとしては、例えば、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列を有するものと、それらアミノ配列に相同的なアミノ酸配列を有するものが挙げられる。相同的なアミノ酸配列のペプチドは、上記の免疫学的作用を実質的に変えることなく、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換するか、それらアミノ酸配列の一端又は両端に適宜のアミノ酸を１個又は２個以上結合させることにより得ることができる。

具体的には、例えば、配列表の配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列において、Ｔ細胞がそれらを認識するために不可欠なアミノ酸配列のみを不変とし、それ以外のアミノ酸については、スギ花粉のＴ細胞エピトープとしての免疫学的作用を実質的に変えない範囲で他のアミノ酸により置換する。あるいは、その不可欠なアミノ酸配列の一端又は両端に、必要に応じて、例えば、アラニンなどの適宜アミノ酸を１個又は２個以上結合させ、得られるペプチドが全体としてＴ細胞の認識し得る長さ、すなわち、通常、アミノ酸残基数にして１０乃至２０個になるようにする。斯かるアミノ酸配列としては、例えば、配列表における配列番号１乃至７に示すアミノ酸配列が挙げられ、また、斯かる相同体の例として、例えば、配列表における配列番号１６乃至２４に示すアミノ酸配列のペプチドを挙げることができる。

この発明のペプチドは、「固相法」又は「液相法」として知られる斯界において慣用のペプチド合成法により、容易に調製することができる。この発明はペプチド合成そのものに係わるものではないので、詳しい説明は省略するが、例えば、社団法人日本生化学会編『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されている。ただし、この発明のペプチドは化学合成により調製されたものに限定されず、例えば、スギの花粉又は雄花から採取するか、組換えＤＮＡ技術により調製したスギ花粉アレルゲンを適宜分解し、分解物から採取したものであってもよい。あるいは、例えば、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列又はそれらに相同的なアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物からこの発明のペプチドを採取してもよい。配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、特願平５−３４４５９６号明細書や国際特許公開第９３／０１２１３号明細書に記載されたｃＤＮＡの塩基配列に基づいて調製することができる。さらに、この発明のペプチドは、斯くして得られるペプチドに糖質やポリエチレングリコールを付加して得られる複合体としての形態、さらには、ペプチドをアセチル化、アミド化及び／又は多官能試薬により架橋重合させて得られる誘導体又は重合体としての形態であってもよい。

この発明のペプチドは、比較的粗な形態で投与しても所期の治療・予防効果を発揮するが、通常は使用に先立って精製される。精製には、例えば、濾過、濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグフラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などのペプチド乃至蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。

前述のとおり、この発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、しかも、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化するので、スギ花粉症を治療・予防するための免疫療法剤として広範な用途を有する。有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる免疫療法剤は、スギ花粉症に罹患したヒトを含む哺乳類一般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することができる。一方、この発明の免疫療法剤を、スギ花粉が飛散し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に著効を発揮する。

この発明の免疫療法剤につきさらに詳しく説明すると、この発明の免疫療法剤は、通常、この発明によるペプチドの１種又は２種以上を０．０１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０５乃至５０％（ｗ／ｗ）、さらに望ましくは、０．５乃至５．０％（ｗ／ｗ）含んでなる。この発明の免疫療法剤は、当該ペプチド単独の形態はもとより、それ以外の生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、マンニトール、マルトース、トレハロースなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、ステロイドホルモンやクリモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤を含む１種又は２種以上の他の薬剤との組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の免疫療法剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明のポリペプチドを、例えば、１日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）又はその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。

この発明の免疫療法剤の使用方法について説明すると、この発明の免疫療法剤は、スギ花粉症の治療・予防を目的に、ヒトを含む哺乳類一般に経皮、経口、点鼻、点眼又は注射投与される。ヒトにおける投与量は、投与の目的や症状に依っても変わるが、通常、対象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１日当たり０．０１乃至１．０ｇ、望ましくは、０．０１乃至０．１ｇを目安に、毎週１回乃至毎月１回の頻度で、約１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら反復投与される。

以下、この発明によるペプチドの調製と用途につき、２〜３の実施例を挙げて説明する。

＜実施例Ａ−１：ペプチドの調製＞
ミリジェン／バイオリサーチ製ペプチド合成機『エクセル』を使用し、常法にしたがって、配列表における配列番号８乃至１１に示すアミノ酸配列のペプチドを別々に合成し、バイオラド製クロマトグラフィーカラム『Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ−３１８型』を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーによりそれぞれ純度９５％まで精製後、凍結乾燥して固状物とした。固状物の一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシーケンサ『４７０Ａ型』により分析したところ、合成に係る４種類のペプチドすべてが所期のアミノ酸配列を有していた。

＜実施例Ａ−２：ペプチドの調製＞
ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ製ペプチド合成キット『マルチピン』を使用し、常法にしたがって、配列表における配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列のペプチドを別々に化学合成し、実施例Ａ−１と同様にしてそれぞれ純度９５％まで精製後、凍結乾燥して固状物とした。固状物の一部をとり、実施例Ａ−１と同様に分析したところ、いずれも所期のアミノ酸配列を有していた。

＜実施例Ａ−３：ペプチドの調製＞
実施例Ａ−１と同様にして、配列表における配列番号１６に示すアミノ酸配列のペプチドを化学合成し、純度９５％まで精製した。精製後、ペプチドの一部をとり、実施例Ａ−１と同様に分析したところ、所期のアミノ酸配列を有していた。

＜実施例Ａ−４：ペプチドの調製＞
実施例Ａ−２と同様にして、配列表における配列番号１７に示すアミノ酸配列のペプチドを化学合成し、純度９５％まで精製した。精製後、ペプチドの一部をとり、実施例Ａ−１と同様に分析したところ、所期のアミノ酸配列を有していた。

＜実施例Ａ−５：ペプチドの調製＞
実施例Ａ−１乃至Ａ−２と同様にして、実験例３の試料Ｄ−１乃至Ｄ−７に相当する配列表における配列番号１８乃至２４に示すアミノ酸配列のペプチドを化学合成し、それぞれ純度９５％まで精製後、凍結乾燥して固状物とした。固状物の一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシーケンサ『４７０型』により分析したところ、合成に係る７種類のペプチドすべてが所期のアミノ酸配列を有していた。

＜実施例Ｂ−１：液剤＞
実施例Ａ−１及びＡ−２の方法により得た６種類のペプチドのいずれかを最終濃度０．１ｇ／ｍｌになるように安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して６種類の液剤を得た。

この発明のペプチドに対する感受性は、個体ごとに変わるのが通例であるから、本品は、個々の個体に最も適した組成になるよう、６種類の液剤を適宜配合して使用する。安定性に優れた本品は、スギ花粉症を治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用である。

＜実施例Ｂ−２：注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１及びＡ−２の方法により得た６種類のペプチドをそれぞれ最終濃度０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。

本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分としてこの発明による６種類のポリペプチドを含んでなる本品は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。

＜実施例Ｂ−３：錠剤＞
平均分子量約２０，０００ダルトンの精製プルラン２ｇを蒸留水１００ｍｌに均一に溶解し、溶液に塩化シアヌルの１．７％（ｗ／ｖ）アセトン溶液を２ｍｌ加え、５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを７付近に保ちつつ、攪拌下、５℃で２時間反応させた。その後、同様にして反応物のｐＨを７付近に保ちながら、４℃の冷水に対して一晩透析し、活性化プルランを含む水溶液２０ｍｌを得た。

この水溶液に実施例Ａ−１の方法により得た配列表における配列番号８、１０及び１１に示すアミノ酸配列のペプチドと、実施例Ａ−２の方法により得た配列表に配列番号１３に示すアミノ酸配列のペプチドと、実施例Ａ−３の方法により得たペプチドと、実施例Ａ−４の方法により得たペプチドをそれぞれ０．２ｍｇ加え、溶液のｐＨを７付近に保ちつつ、緩やかに攪拌しながら、３７℃で１２時間反応させた。反応後、反応物にグリシンを４ｇ加え、緩やかに攪拌しながら、３７℃で５時間インキュベートし、未反応の活性基をブロックした。

反応物を濃縮し、予め０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させておいたセファデックスＧ−５０カラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液して、この発明のペプチドとプルランの複合体を含む画分を採取した。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。

常法にしたがって、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕後、マンニトールを均一に混合し、混合物を打錠して製品１錠（２００ｍｇ）当たり複合体を２、１０又は５０ｍｇ含む錠剤を得た。

摂取性、安定性に優れた本品は、スギ花粉症を治療・予防するための舌下剤として有用である。

＜実施例Ｂ−４：シロップ剤＞
大腸菌由来の精製リポ多糖１ｇを１０ｍＭ燐酸カルシウム水溶液１００ｍｌに溶解し、溶液に１００ｍＭ過沃素酸ナトリウムを６ｍｌ加え、室温下で２０分間反応させてリポ多糖を活性化した。反応物を４℃の１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して一晩透析して未反応の過沃素酸を除去した後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液によりｐＨ９．５付近に調整する一方、別途、実施例Ａ−１及びＡ−２の方法により得た６種類のペプチドを０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌにそれぞれ１０ｍｇずつ溶解し、活性化リポ多糖を含む上記反応物に加え、室温下で１２時間静置して反応させた。

その後、新たに得られた反応物を実施例Ｂ−３の方法により精製し、得られたこの発明のペプチドとリポ多糖の複合体を含む画分を濃縮し、凍結乾燥し、粉砕して固状物とした。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。

この固状物と蔗糖をそれぞれ最終濃度が０．１若しくは１ｍｇ／ｍｌ又は５０％（ｗ／ｗ）になるように安定剤として精製ゼラチンを１％（ｗ／ｖ）含む蒸留水に溶解し、溶液を常法により滅菌濾過してシロップ状物を得た。このシロップ状物を２ｍｌずつ滅菌バイアル瓶に分注し、密栓して製品とした。

安定性に優れ、有効成分としてこの発明のペプチドとリポ多糖の複合体を含む本品は、スギ花粉症を治療・予防するためのシロップ剤として有用である。

＜実施例Ｂ−５：液剤＞
実施例Ａ−５の方法により得た７種類のペプチドのいずれかを最終濃度０．１ｇ／ｍｌになるように安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して７種類の液剤を得た。

この発明のペプチドに対する感受性は、個体ごとに変わるのが通例であるから、本品は、個々の個体に最も適した組成になるよう、７種類の液剤を適宜配合して使用する。安定性に優れた本品は、スギ花粉症を治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用である。

＜実施例Ｂ−６：注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−５の方法により得た７種類のペプチドをそれぞれ最終濃度０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。

本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分としてこの発明による７種類のポリペプチドを含んでなる本品は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。

＜実施例Ｂ−７：シロップ剤＞
精製ゼラチンを１％（ｗ／ｖ）含む蒸留水に実施例Ａ−５の方法により得た７種類のペプチドをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌと蔗糖を５０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、溶液を常法により滅菌濾過してシロップ状物を得た。このシロップ状物を２ｍｌずつ滅菌バイアル瓶に分注し、密栓して製品とした。

安定性に優れ、有効成分としてこの発明のペプチドを含む本品は、スギ花粉症を治療・予防するためのシロップ剤として有用である。

＜実験例４：急性毒性試験＞
常法により、生後２０日目のマウスに実施例Ｂ−１乃至Ｂ−７の方法により得た免疫療法剤を経口又は腹腔内投与した。その結果、これら免疫療法剤は、いずれの投与経路によっても２００ｍｇ／ｋｇ以上のＬＤ５０であることが判明した。このことは、この発明のペプチドが、ヒトを含む哺乳類に投与する免疫療法剤に安全に配合使用し得ることを示している。

以上説明したように、この発明は、本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるペプチドの発見に基づくものである。この発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化する。したがって、有効成分として斯かるペプチドを含んでなるこの発明の免疫療法剤は、ヒトを含む哺乳類に投与すると、副作用少なく、短期間でスギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。しかも、この発明のペプチドは、所望量を容易に製造でき、品質管理も容易なことから、スギ花粉症の治療・予防にきわめて安全に使用できるものである。

斯くも顕著な作用効果を発揮するこの発明は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明と云える。

Claims (1)

1. スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、^３Ｈ−チミジンの取込みにより判定する方法で試験すると、陰 性対照と比較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化することを特徴とする、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２又は１３で表されるアミノ酸配列のペプチドを２種以上を含んでなる免疫療法剤。