JPH10506877A

JPH10506877A - ライグラス花粉アレルゲンのｔ細胞エピトープ

Info

Publication number: JPH10506877A
Application number: JP8502928A
Authority: JP
Inventors: イアンヴィクターリューィン; アリゴーラムブンギー
Original assignee: ペプチドセラピュティックスリミテッド
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-26
Publication date: 1998-07-07
Also published as: WO1996000238A1; GB9412714D0; AU2748795A; AU707740B2; EP0772629A1; CA2193860A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ライグラスの免疫優性Ｔ細胞エピトープ、その最小配列、花粉症におけるその役割、及び花粉症の治療又は予防用医薬を調製するためのその使用に関する。本発明により、６つのアミノ酸残基ＶＸＲＩＤＴを含む９つのアミノ酸残基からなるポリペプチド、その類縁体又は擬態物が提供される。このポリペプチドを投与することにより、アレルギー、詳しくはライグラスアレルギー又は花粉症の治療又は予防方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ライグラス花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープ本発明は、ライグラスの免疫優性(immunodominant)Ｔ細胞エピトープ、その最小配列、枯草熱におけるその役割、及び枯草熱の治療又は予防用の薬剤の製造へのその使用に関する。以下で使用するアミノ酸残基の記号は、IUPAC-IUB 生化学命名会議によって特定されたものであり、全てＤ又はＬ−アミノ酸又はその類縁体若しくは誘導体を含む。記号Ｘは、未特定のアミノ酸又はその類縁体を意味する。ヨーロッパにおける枯草熱の主要な原因の一つは、ライグラス（Lolium peren ne）の花粉であり、普通の花粉である。ライグラス花粉からの幾つかの蛋白質が単離されており、これらの蛋白質の内、３種類に対する完全なアミノ酸配列（Lo l pI、Lol pII 及びLol pIII）が公表されている。 Lolium perenne（L．perenne）の主要な画分は、Lol pIという、２４０個のアミノ酸残基の糖蛋白質であることが分かり、草花粉に敏感なヨーロッパの殆ど（約８０％）の枯草熱患者は、この蛋白質に対する特定のＩｇＥ抗体を有する。Lo l pIの完全な配列は公表されており、Lol pIの免疫源性の決定基を含む１４個の連続するアミノ酸残基のポリペプチド配列があることが示唆されている(Bungyら、Clin Exp Immunol 1993, 94, 111-116）。インビボによる皮内試験をすると、このようなポリペプチドは、アトピー性ライグラス感受性患者において、２４〜４８時間後に、典型的な遅延型の過敏性を示し得る。現在の指針は、鼻に限定されるアレルギー症状（例えば、枯草熱の症状）は、特に、枯草熱が従来の薬剤によってコントロールできないような場合には、免疫治療によって処置すべきであることを示唆している。また、花粉喘息を有する患者は、潜在的な副作用のために、かかる処置から排除されるべきことが示唆されている。天然の花粉を使用して患者の感受性を低下させる免疫治療は、感作剤の全てが潜在的に、気管支痙攣や、アナフィラキー、更には死のような重いアレルギー反応を誘発する可能性があるという不利益を有する。アレルゲンの全抽出物を増大させながら注射する計画を使用する枯草熱に対する臨床的減感作は、症状を緩和するけれども、治療効果のあるものではない。しかしながら、全抽出物は、アナフィラキーショック、更には死に至らしめ得るＩｇＥ結合部位を含有する。薬学的処置は、温和な症状を回復させることができるが、重篤な場合、特に、喘息を伴う場合の免疫的な「治療」はない。これらの問題を克服する方法の一つは、最初は、より効果的なもので、２番目は、遙に安全なものとなる、ワクチン用の変性アレルゲンの開発である。安全かつ効果的なワクチンが利用できれば、大変重要な一群の患者に治療法を適用できる。Ｔ細胞のエピトープを含有する酵素消化物の減感作の研究は、花粉に対するアレルギー応答を、動物及びヒトの両者において減少できることを示唆する（上記 Bungy ら）。もし免疫決定Ｔ細胞エピトープをライ又は他の草のような主要なアレルゲンに対してアレルギーを有する患者において、局部的又は全身的にアネルギー又は特定のＴ細胞非応答性を誘導するのに使用することができるならば、潜在的かつ臨床的な利益がある。枯草熱の症状は、細胞から細胞外空間へ血管活性アミン媒介物（例えば、ヒスタミン）を放出させる特定のリンパ球による活性化によって引き起こされる。アレルギー反応を媒介するＩｇＥ抗体の役割（例えば、枯草熱におけるもの）は、周知である。Ｔ細胞をトリガーする能力を利用すると、このＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープを組み合わせることにより、Ｂ細胞エピトープに対する抗体を製造することができる。このような抗体を使用して、アレルゲンに対するＩｇＥ介在応答を阻害することができる（例えば、細胞に対するＩｇＥの結合の阻害）。ＩｇＥは、ジスルフィド結合により結合した２本の軽ポリペプチド鎖と２本の重ポリペプチド鎖を有する。重鎖は１個の可変ドメイン（Ｖ_H）と４個の定常ドメイン（ＣΣ１、ＣΣ２、ＣΣ３及びＣΣ４としても知られる、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３及びＣ_H４）を有する。重鎖の部分を含むＩｇＥの領域はＦ_c領域として知られている。 Stanworth ら(WO 90/15778，その内容はここに引用されたものとする。）が記載しているように、ヒスタミン放出をもたらす免疫学的シグナルを与えると考えられるＩｇＥＦ_c領域内の“エフェクター”部位の性質を定義するために、様々な研究が行われている。モデルヒスタミン放出ポリペプチドについて、構造−活性研究が行われており、塩基性アミノ酸のクラスターが、ヒスタミン放出の直接トリガリングに必須であることが示されている。さらに、隣接する疎水性残基の存在と、そのＣ−末端カルボン酸残基のアミド化が、ヒスタミン放出のトリガリングを高くすることが見出されている。上記の観察に基づいて、その構造が明確になっているヒトＩｇＥのＦ_c領域について、この規準を満たすアミノ酸残基配列が研究された。ＣΣ４ドメインの残基４９６−５０６：ＲＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦ（ＳＥＱＩＤ：１）のアミノ酸残基配列がこの規準を最もよく満たすもののように思われた。 WO 90/15778 には、ある種の免疫活性ペプチドと抗体、並びにこれらをアレルギーの処置に使用して、ヒスタミンの放出のトリガリングを阻害することが記載されている。このStanworth 出願には、カチオン性Ｎ−末端頭部と疎水性Ｃ−末端尾部を含むヒスタミン放出ペプチドの残基と、該ペプチドに対する抗体を誘導するが該ペプチドによるヒスタミンの放出を阻害することができる残基とを含む免疫原が抗アレルギー処置に有効であることが記載されている。好ましくは、このヒスタミン放出ペプチドは、式：ＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦ（ＳＥＱＩＤ：２）を有するものであり、任意にＣ−末端がアミド化されていてもよい。このヒスタミン放出ペプチドに対する抗体は、受動免疫に使用される。本発明は、花粉症を持つアトピー性患者のＴ細胞刺激活性を有する免疫優性９量体ポリペプチドである、ライグラスの最小Ｔ細胞エピトープを提供するものである。この免疫優性９量体（９−ｍｅｒ）は、各種タンパク質ＬｏｌｐＩ、ＬｏｌｐＩＩ及びＬｏｌｐＩＩＩのいずれかまたは幾つかに特異的に感受性のＴ細胞を刺激することができる。本発明は、９個のアミノ酸残基を有し、６個のアミノ酸配列ＶＸＲＩＤＴ（ＳＥＱＩＤ：３）を含むポリペプチドを提供するものである。この配列ＶＸＲＩＤＴはＴ細胞エピトープモチーフとも呼ばれる。本発明はまた、配列ＸＶＸＲＩＤＴＸＸ（ＳＥＱＩＤ：４）の９個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを提供するものである。さらに本発明は、そのアミノ酸残基の０、１または２個が他のアミノ酸残基に置換された、配列ＡＶＷＲＩＤＴＰＤ（ＳＥＱＩＤ：５）またはＶＷＲＩＤＴＰＤＫ（ＳＥＱＩＤ：６）の９個のアミノ酸残基からなる配列を有するポリペプチドを提供するものである。本発明の９個のアミノ酸残基を有するポリペプチドは、ハプテン（例えば、ホスホリルコリンまたは２，４ジニトロフェニル）または薬理学的に許容される担体または両者に結合することができ；結合は直接的に、またはポリペプチドや炭化水素のようなスペーサーにより間接的に行われ、あるいは同時に投与することもできる。従って、本発明は、薬理学的に許容される担体と、Ｔ細胞エピトープモチーフＶＸＲＩＤＴを有する９個のアミノ酸残基、または配列ＸＶＸＲＩＤＴＸＸの９個のアミノ酸残基、またはそのアミノ酸残基の０、１または２個が他のアミノ酸残基に置換された、配列ＡＶＷＲＩＤＴＰＤまたはＶＷＲＩＤＴＰＤＫの９個のアミノ酸残基からなる配列を有するポリペプチドを含む複合体を提供するものである。さらに本発明は、本発明の９個のアミノ酸ポリペプチドに特異的な抗体ドメインを有するリガンドを提供するものである。この抗体ドメインは、その、モノ−またはポリクローナル、または抗原結合性断片であり得る。本発明の免疫優性ポリペプチド９量体はＴ細胞活性化の誘導に使用してもよい。これは次にＴ細胞の抗体に対する応答を、アネルギー（無作動）、減少または喪失させることができる。第２の観点において、本発明は、カチオン性Ｎ末端頭部及び疎水性Ｃ末端尾部を含むヒスタミン放出残基を、このペプチドに対する抗体を誘導し得る残基と、上述したポリペプチド９量体と共に含む免疫源を提供する。この第２の観点における本発明の目的は、ライグラスの花粉に対して感受性である個体において、免疫源に対する抗体の産生を誘導することである。本発明は、配列ＫＴＫを有するカチオン性Ｎ末端頭部及び配列ＦＦを有する疎水性Ｃ末端尾部を含むヒスタミン放出ペプチド残基を含む免疫源を含むことができる。上記Ｃ末端はアミド化によりブロックされていてもよい。上記Ｎ末端頭部はＣ末端尾部から、主に非極性及び非疎水性のアミノ酸残基２〜６により、分離していてもよい（例えばＧＳＧ）。本発明は、上述した９つのアミノ酸残基を有するポリペプチドと共に、ペプチド配列ＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦを含む免疫源を提供することができ、ポリペプチド９量体は免疫源と直接複合しているか、または、例えばポリペプチド若しくは炭化水素のようなスペーサーを介して、間接的に結合しているか、またはポリペプチド９量体は免疫源と共に投与されてもよい。本発明は、配列ＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦを有するヒスタミン放出ポリペプチド残基、及び配列ＡＶＷＲＩＤＴＰＤを有するＴ細胞エピトープポリペプチドの両方を含む免疫源を提供することが好ましく、これらは、直接複合しているか、または、例えばポリペプチド若しくは炭化水素のようなスペーサーを介して、間接的に結合しているか、またはポリペプチド９量体は免疫源と共に投与されてもよい。Ｃ末端はアミド化によりブロックされていることが好ましい。第３の観点において、本発明は、上記の本発明化合物及び免疫源を、特にライグラスアレルギーまたは花粉症といったアレルギーの処置または予防用薬剤の製造に使用する方法を提供する。第４の観点において、本発明は、上記化合物または免疫源の有効量を投与することによる、特にライグラスアレルギーまたは花粉症といったアレルギーの処置または予防の方法を提供する。本発明に従い製造された薬剤は、当業者に既に知られているどのような投与方法によって患者に投与してもよい。第５の観点において、本発明は、ライグラスアレルギーに対する感受性のアッセイ、即ち花粉症を患っているかどうかの測定を提供する。このようなアッセイにおいて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は免疫優性９量体Ｔ細胞エピトープの存在下培養されてもよく、リンパ球活性化は、決定要素としてチミジン取り込み (incorporation)を用いて測定してもよい。ライグラスの主たる抗体のいずれかに対してアレルギーである被験者の細胞は反応することが予想される。第６の観点において、本発明は、Lol pIのような、ライグラスアレルギーに対して感受性である、特異的Ｔ細胞個体群のアッセイを提供するものであり、アッセイは、上記に述べた９量体に対する反応を試験し、反応するＴ細胞を選択してかつそれからＴ細胞系を形成し、及びそれから９量体に対して特異性を有するＴ細胞クローンのクローニングをすることにより行われる。図を参照して本発明をさらに具体的に説明する。図１は、Lol pIに対するアトピー患者（コード名ＡＳ３）の末梢血単核細胞応答を示す。図２は、２０ペプチドプールに対するＰＢＭＣ応答を示す。図３は、免疫優性プール１７の解読を示す。図４は、プール１７のペプチドに対する投与量応答曲線を示す。図５は、９量体に対するアトピー患者ＡＳ３のＰＢＭＣ応答を示す。図６は、Lol pIに対するＴ細胞系特異性を示す。図７は、９量体ペプチドに対するＴ細胞系及びＰＢＭＣ応答の比較を示す。図８は、１４アミノ酸ポリペプチドの各アミノ酸残基が、Lol pIのＴ細胞エピトープが個々にリジンに置換されていると思われるとき、リジン置換の結果を示す。図９は、１４アミノ酸ポリペプチドの各アミノ酸残基が、Lol pIのＴ細胞エピトープが個々にグリシンに置換されていると思われるとき、グリシン置換の結果を示す。ドームラボラトリー（ストークコート、英国）から提供されたライグラス（ペレニアルライグラス）花粉抽出物を、33％アンモニウムスルフェート沈殿物に供した。上澄みをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。透析したサンプルを、ゲル濾過カラムスパロース１２上でタンパク質分離するためにＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）（ファルマシア、ＬＫＢ、スウェーデン）に注入し、画分0.3 ｍＬを捕集した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、垂直スラブ−ゲル装置（バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ）上で行った。15％勾配アクリルアミドゲルをこの研究に使用して、180 Ｖで12時間行った。アレルゲンの見掛けの分子量を、前染色したタンパク質標準を使用して概算した。 Lol pIのイソ−アレルゲン(iso-allergen)クローン５Ａは、240のアミノ酸からなる。Lol pIのイソ−アレルゲンクローン５Ａの全長に及ぶ、一組の115重複した12量体ペプチドを、Ｔ細胞決定子を迅速にマッピングすることができるマルチ−ピンを使用して、ポリエチレンロッド（pins）上で合成した。全部のペプチドをＮ末端でアセチル化し、かつ、ピンから離れた結果、Ｃ末端ジケトピペラジン（ＤＫＰ）基を有した。 β−アラニン残基を取り込んで、ＤＫＰ基からの限定した配列にスペースをいれた。Maeji らの方法により、0.1 Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７）を、４時間室温で使用してペプチドを固相から離した。プール−１及び１５（５ペプチド）及びペプチド−２０（３ペプチド）を除く、６つの連続したペプチドの組をプールした。それにより、２０ペプチドプールをエピトープマッピングに使用した。プール−１７において全てのペプチドを含む、選択したペプチドの純度を、逆相ＨＰＬＣ分析により確定し、アミノ酸組成をアミノ酸分析により検討した。各被検者からの血液100 ｍＬを、防腐剤フリーヘパリン中に捕集した。ヘパリンで凝血防止した静脈血を、RPMI 1640で１対１に希釈し、リンパプレップ(Lymp hoprep)（ニコメド、オスロ、ノルウェー）上に層状に積み重ねた。勾配を400ｇにおいて、25分間、室温下で遠心分離した。単核細胞を捕集して、RPMI1640（ギフコ、グランドアイランド、ニューヨーク、米国）中で２回洗浄し、次に、10％ヒトＡＢ−血清（ＩＣＮフロー、バックス、英国）、２ｍＭの１−グルタミン及び20μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ギフコ、グランドアイランド、ニューヨーク、米国）で補ったＲＰＭＩ中で２×10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁した。ウェル当たり２×10⁵の濃度で、Ｕ底96−ウェルミクロ滴定プレートにおいて0.2ｍＬの完全培地で細胞を培養した。精製したLol pI又はペレニアルライグラス抽出物（ＬＰＥ）を、濃度範囲で添加し、ＰＰＤ又はＣｏｎ−Ａを陽性コントロールとして使用した。培養物を37℃ において、空気中に５％ＣＯ₂ を含有する、加湿雰囲気中でインキュベートした。５〜６日後、0.4 μCi/well[メチル−³H] ＴｄＲ（アメルシャム、英国）を添加し、６〜18時間後、細胞をタイターテックガラス−繊維紙（ＩＣＮフロー、バックス、英国）上で捕集した。ＤＮＡへの³H−チミジン組み込みを、液体シンチレーション（ナショナルダイアグノスチックス、アトランタ、米国）カウンター（ミナキシートリス−カーブ4000シリーズ、パッカード）により測定した。いかなるペプチドに特異的なＴ細胞の前駆体頻度(precursor frequncy)が非常に低いので、各ペプチドが１μｇ／ｍｌである最終濃度で20個のペプチドプールの各々に対して、12- 24個の複製培地を用いた。ペプチドの20個のプールをスクリーニングした。各プールは、６つがオーバーラップしているペプチドを含有しており（例外を上述した）、出発（Ｎ末端）残基の２つのアミノ酸だけが異なっている一連のペプチドを有している。各複製物のチミジン取込みを、別個に測定した。ＦＰＬＣによるライグラス抽出物の精製により、２つのピークを得た（ピーク１及び２）。プロテイン染色に次いで還元条件下でのL．perenne抽出物の電気泳動により、ピーク１の分子量が約31 kDaであり、その位置が高度に精製したLol pIと等価であることがわかった。その他のピークは、分子量が11 kDaである、Lo l pII及びLol pIIIの混合物であると同定した。ヒト末梢血単核細胞のL．perenneの主な精製フラクション（Lol pI）への増殖応答性を見出した（図１）。実験の範囲のこの投与により、アレルゲン及び抗原で見られる、リンパ球活性化の典型的なベル型の投与応答曲線を示している。トリチウム化チミジンのピーク取込みは、精製したLol pIの10μｇ／ｍｌで見られる。これは、アトピー患者のライグラスタンパク質の主なフラクションに対するリンパ球反応性の証拠である。アトピー患者は、予期されるように、Lol pI及び LPEの双方に応答する。非アトピー患者は、Lol pIに応答しないが、LPEで少なからず刺激をうける。ペプチドの20個のプール内のＴ細胞エピトープの存在を、６人のライグラス感受性患者及び７人の非アトピーのコントロール患者のＰＢＭＣについてのインビトロ（in vitro）増殖テストにより調べた。６人のうち５人がプール17に応答したが、患者Ｂはプール15及びプール19に反応した。また、患者Ｅはプール６に応答し、患者Ｆはプール13に応答した。プール17は、免疫優性エピトープを明確に含んでいた。非アトピー患者は、20個のペプチドプールのどれにも応答しなかった。アトピー患者に、クラスIIＭＨＣ（主要組織適合性複合体）ドクター制限（ Dr restriction）はなかった。 Lol pIの全長にわたる、20個の異なるペプチドプールに正の増殖応答を示す末梢血単核細胞を含むウェルの数を、図２に示す。各プールは、２つの残基で差替えられており、６個（１、15及び20を除く）がオーバーラップする12量体（12-m er）ペプチドからなっており、よってタンパク質配列の22残基にわたっており、各患者からの12個の同じ培地に対してテストした。これらのデータは、プール17 を、ライグラスの主なエピトープを含むものとして同定している。応答するウェルの数に関して重要な切捨て(cut-off)は、ポワソン分布に基づく統計学的手法により決定した。この例において、プール17は、試験する他のプールすべてと、統計学的に異なっている。さらに、他のアトピー患者からのデータにより、プール17が免疫優性であることを確認した。上述のように、プール17は、試験する他のプールすべてと、統計学的に異なっている。さらに、他のアトピー患者からのデータにより、プール17が免疫優性であることを確認した。上述のように、プール17は、22個のアミノ酸のスパンをカバーする６個がオーバーラップするペプチドからなっている。プール17を免疫優性プールとして同定したので、それが含んでいるペプチドの各々を別々に試験した。実験から、プール17のペプチド３及び４がインビトロで主な刺激性ペプチドであることがわかった（図３）。Lol pI (3)の活性ポリペプチドは、¹³⁹WGAVWRIDTPDK²⁰⁴（配列番号：９）及び(4) ¹⁹⁵AVWRIDTPDKLT²⁰⁶（配列番号：10）であり、各々は、すべてのプールと同じように、リンパ球増殖アッセイに活性であった。多くの複製物を任意の抗原でテストしたとき、正のウェルが通常分布していないことが明確である。これは、複製ウェルの中で、Ｔ細胞に特異な抗原が数少なくランダム分布しているためである。この理由により、通常の分布データに基づく統計学的手法ではなく、ポワソンモデルを用いて増殖データを処理しなければならなかった。非応答性ウェルは通常分布しており、ゆえに正又は負としてウェルを数えるために、平均＋／−３ＳＤを切捨てとして勘定していた。上記のカウントで、平均及び３つの標準偏差を正とみなしている。プール１７において、６個のペプチドのうち２個のみが刺激活性を有していた。この異なるプール１７ペプチドの活性又は活性の不在は、投与量に関係付けることが可能なものであり、これにより投与応答曲線を作成した。ある濃度範囲のａ）プール１７、ｂ）プール１７のペプチド４及びｃ）プール８（非刺激性ペプチドプール）を用いて、ＰＢＭＣを温置した。カルチャー中の細胞を６日後に採集した。プール１７のペプチド４の投与応答はプール１７全体と同等であったが、プール８は、ペプチドの濃度が１００倍であってもリンパ球を刺激することに関してなお不活性であった。従って、非刺激性プール（プール８）が高濃度においてもなお不活性であることから、プール１７が支配的であると認められるのは、最終濃度に起因するものではない。アトピー症患者（ＡＳ３）から採取したＰＢＭＣを使用して、１個の残基による８個のオーバーラップする９量体ペプチドオフセットをスクリーニングした。各ペプチドに対し、インビトロ増殖試験により、最小Ｔ細胞エピトープの存在を調べた。各同型のチミジン導入を、別個に測定した。図５は、ＬｏｌｐＩの免疫優勢な（immunodominant）エピトープの全長にわたる９量体ペプチドの各ペプチドに対して陽性の増殖反応を与える、ライグラス感受性患者（ＡＳ３）から採取した末梢血単核細胞を含むウェルの百分率を表す。驚くべきことに、図５に示すように、連鎖（５）ＡＶＷＲＩＤＴＰＤの９アミノ酸残基ポリペプチドが、２個の連続する免疫優勢なポリペプチドの長さにわたる９、１０、１１、１２、１３及び１４アミノ酸残基ポリペプチドの中で、最も活性であることが見いだされた。また、連鎖（６）ＶＷＲＩＤＴＰＤＫの９アミノ酸残基ポリペプチドも、活性であることが見いだされた。更に驚くべきことに、これら６個のアミノ酸残基が、ポリペプチドが免疫優勢であるか否かを決定する際に最も重要であることも見いだされた。９量体ペプチドに対するＰＢＭＣの応答から得られたデータを補足するために、９量体ペプチドに対するＴ細胞線の応答を調べた。次のようにして、ＬｏｌｐＩ特異性Ｔ細胞線を得た。即ち、免疫優勢なＴ細胞エピトープに対し活性な患者ＡＳ３から採取した、１ｍｌ当たり0.5×１０⁶個のＰＢＭＣを、２ｍＭのＬ−グルタミン、５×１０-⁵Ｍの２−メルカプトエタノール、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び１０％のヒトＡＢ血清を補充したＰＲＭＩ１６４０によるＬｏｌｐＩ溶液（１０μｇ／ｍｌ）により、２４個のウェルを有する平底培養プレート中で５日間刺激した。次いで、ヒト組換えＩＬ−２（ｈｒＩＬ−２）（２５単位／ｍｌ）を添加し、更に７日間カルチャー中に保持した。目視できるＴ細胞の芽細胞を次いでフィコル−ハイペーク（Hypaqu e）密度勾配により分離し、Ｔ細胞線のＬｏｌｐＩ特異性を検定した。ＩＬ− ２及びＬｏｌｐＩを用いた刺激により生成したＴ細胞線の特異性を調べた。５ ×１０⁴個のＴ細胞線細胞を、５×１０⁴個の被照射のオートロガス抗原提供細胞（ＡＰＣ）及び１、５及び１０μｇ／ｍｌのＬｏｌｐＩの存在下、重複する２００μｌのカルチャー中で、９６個のウェルを有する丸底ミクロタイタープレートを用いて３日間３７℃で、二酸化炭素５％の加湿雰囲気中で温置し、次いで0. 4μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを用いてパルスした。シンチレーション計測により、放射性核種の取込みを測定した。図６に示すように、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＬｏｌｐＩの投与応答を用いることにより、このＴ細胞線がＬｏｌｐＩに関して特異的であることが明らかとなった。Ｔ細胞線(Ｔ)と被照射のＡＰＣ^* （Ａ）の和は、比較の低バックグラウンド計数を与える。５×１０⁴のＴ細胞系を、重複する２００μｌのカルチャー中において、被照射のオートロガスＡＰＣと９量体(9-mers)の個々の単一ペプチド7.5μｇ／ウェルの存在下において、96個のウェルを有する丸底ミクロタイタープレートにおいて３日間３７℃で、二酸化炭素５％の加湿雰囲気中でインキュベートし、次いで、0.4μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを用いて一晩中パルスした。放射性核種の取込みを、シンチレーション計測により測定した。２種のペプチド(5)及び(6) は、明らかに、アトピー症患者からのＴ細胞系を興奮させる際に、他のペプチドより活性的なものである。ＰＢＭＣ及びＴ細胞系の応答の比較（図７）から、Ｔ細胞系及びＰＢＭＣが同様に応答することが分かる。従来から知られている１４量体(14-mer)のペプチドにおける実験を、他のアミノ酸で置換することができるＴ細胞エピトープの最小配列の部分を確認するために行った。図８においては、単一リシン(K)置換を有する、一連の１４量体のペプチドについての結果、また、図９においては単一グリシン(G)置換を有する一連のものについての結果を示す。活性についての損失及び減少を引き起こす位置での置換により、その位置での通常のアミノ酸が、重要であり又は本質的なものであることが示される。対象的に、数種のポイントでの数種の置換は、応答についての効果がほとんど又は全くない。この情報から、Ｔ細胞エピトープのモチーフVXRIDTを含む、９つのアミノ酸残基のポリペプチド、又は配列XVXRIDTXX 又は配列AVWRIDTPD 若しくはVWRIDTPDK を有する９つのアミノ酸残基（その中において、０、１又は２個のアミノ酸残基が、任意の他のアミノ酸残基により置換されている）は、ライグラスの共通免疫優性Ｔ細胞エピトープである。ライグラスにおける共通のエピトープモチーフの存在は、明らかなものではなかった。また、その確認の臨床的意義は非常に高い。植物アレルギーの他の領域（例えば、ラグウイードアレルギー）においては、今までは、タンパクを含む種々の主要なアレルギーの全てについて共通のエピトープを特徴付けることは不可能であった。免疫学の当業者にとっては、ライグラスについてのＴ細胞エピトープモチーフ及び免疫優性Ｔ細胞エピトープの意外な特徴付けにより、従来は不可能であった、ライグラスのアレルゲンに対する免疫応答の分子環境(molecular environment )の詳細な分析が可能になることは明らかであろう。具体的には、そのモチーフ及びエピトープのモデルを、構造及び活性化の間の関係の決定のためにポリペプチドの型及び配置、帯電(charge)の立体分布、分子の立体拘束(steric constrai nt)のレベルを決定するためにつくることができる。そのような情報により、当業者が、化学式は異なるが、本質的に同一又は類似の機能活性を示すであろう、モチーフ及びエピトープのアナログ又はミネティックス(mimetics)を造ることできると予知される。例えば、幾つかの又は全てのアミノ酸残基は、当量の非−アミノ酸成分により置き換えることができる。本発明は、そのような機能的に活性のアナログ又はミネティックＴ細胞エピトープ又はモチーフ当量(equivalent)をカバーすべきことが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 7/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＭＧ０１Ｎ 33/53 ＡＢＦＡＥＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブンギーアリゴーラムイギリスロンドンダブリュー１ピー９ピージートーテナムストリート 40 −50 アーサースタンリーハウスメディカルスクールユニヴァーシティーカレッジロンドンデパートメントオヴイミューノロジー

Claims

【特許請求の範囲】１．６つのアミノ酸残基ＶＸＲＩＤＴを含む９つのアミノ酸残基からなるポリペプチド、その類縁体又は擬態物。２．アミノ酸残基配列ＸＶＸＲＩＤＴＸＸを有する請求項１記載のポリペプチド。３．アミノ酸残基配列ＡＶＷＲＩＤＴＰＤを有し、そのアミノ酸残基の０、１又は２つが他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、その類縁体又は擬態物。４．アミノ酸残基配列ＶＷＲＩＤＴＰＤＫを有し、そのアミノ酸残基の０、１又は２つが他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、その類縁体又は擬態物。５．アミノ酸残基配列ＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦを有するポリペプチドが直接複合化しているか、ポリペプチド又は炭化水素のようなスペーサーを介して間接的に結合しているか、又は共に投与される、請求項１〜４のいずれか、１項記載のアミノ酸残基配列を有するポリペプチド。６．カチオン性Ｎ末端頭部と疎水性Ｃ末端尾部とを含むヒスタミン放出ペプチドの残基、このペプチドに対する抗体を誘導することができる残基、及び請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド９量体を含む免疫原。７．配列ＫＴＫを含有するカチオン性Ｎ末端頭部と配列ＦＦを含有する疎水性Ｃ末端尾部とをを有し、該Ｎ末端頭部が該Ｃ末端尾部から２〜６の主に非極性で非疎水性アミノ酸残基で隔てられているヒスタミン放出ペプチドの残基、及び請求項１〜４のいずれか、１項記載のポリペプチド９量体を含む免疫原。８．該Ｃ末端がアミド化によりプロックされている請求項７記載の免疫原。９．配列ＧＳＧが該Ｎ末端を該Ｃ末端から隔てている請求項７又は８記載の免疫原。 10．ハプテン、医薬的に許容される担体、又はこれらの両方に複合化しているか、直接複合化しているか、ポリペプチド又は炭化水素のようなスペーサーを介して間接的に結合しているか、又は共に投与される、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。 11．アレルギー、詳しくはライグラスアレルギー又は花粉症の治療又は予防用医薬を調製するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド又は免疫原の使用。 12．請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド又は免疫原の有効量を投与することを含む、アレルギー、詳しくはライグラスアレルギー又は花粉症の治療又は予防方法。 13．アッセイ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドの存在下で培養し、リンパ球の活性化を決定要素としてチミジンの取込みを用いて測定することを特徴とする花粉症耐性の決定のためのライグラスアレルギーへの感受性検定。 14．請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド９量体に対するＴ細胞の反応をテストし、反応性Ｔ細胞を選択し、そしてそれからＴ細胞ラインを形成し、それから該ポリペプチド９量体に対する特異性を有するＴ細胞クローンをクローニングすることを含む、ＬｏｌｐＩのようなライグラスアレルギーに対して感受性である特異的Ｔ細胞群の検定。