JPH08503697A - Ｔ細胞を寛容化するペプチドおよびその組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 個体の、抗原（例えばアレルゲン、自己抗原または移植抗原）に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化することができる寛容化性ペプチドであって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＭＨＣと結合する能力を有し、該ペプチド−ＭＨＣ複合体との個体のＴ細胞の少なくとも一部のＴ細胞受容体の結合を生起し、（１）該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞を用いる生体外検定において、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を生起する能力、（２）個体の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定において、ＩＬ−２の検出可能な産生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起する能力、（３）個体の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定において、ＩＬ−３の検出可能な産生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起する能力、および（４）個体の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定において、γＩＦＮの検出可能な産生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起する能力のうち少なくとも一項、好ましくはすべてを有するペプチド、ならびに少なくとも１種類のかかる寛容化性ペプチドを含有する治療用組成物。該寛容化性ぺプチドまたは該治療用組成物は、該抗原に対する個体の感受性に起因する病的状態（例えばアレルギー、移植体拒絶および自己免疫疾患）の治療に効果的である。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞を寛容化するペプチドおよびその組成物 発明の背景 いくつかの無関係に見える病態、例えばアレルギー、移植体拒絶および自己免 疫疾患は、少なくとも部分的にはＴ細胞の活性化が関与する有害な免疫反応によ って生起されるという共通の特徴を共有する。このＴ細胞活性化へと導く分子的 事象の一連の流れは、抗原となるペプチド（Ｔ細胞の少なくとも１エピトープを 含む発病性抗原蛋白質に由来するプロセシングされたペプチド）と主要組織適合 複合体分子（ＭＨＣ）との間の複合体の形成によって間始される。これらの抗原 −ＭＨＣ複合体はリガンドであって、次に、その発病性抗原に特異的であるＴ細 胞の表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に認識される。三分子性の抗原−ＭＨＣ−Ｔ ＣＲ複合体におけるＴＣＲの咬合は、補助刺激性シグナルとともに、Ｔ細胞の活 性化を招き、それに続いてＴ細胞活性化に特徴的である一連の分子的事象、例え ば、チロシンリン酸化、Ｃａ²⁺流入、イノシトールリン酸の代謝回転、サイトカ イン類（すなわちＩＬ−２、ＩＬ−３、γインターフェロン）およびサイトカイ ン受容体の合成、ならびにＴ細胞の増殖の増大が生起する。 何人かの研究者は、ＭＨＣ分子の抗原結合部位の遮断 によってＴ細胞活性化の阻害を生起する高親和性ＭＨＣ結合性ペプチドを用いる ことによって、この認識過程に干渉する治療法の開発を追求している。別の研究 者らは、様々な機序によってＴ細胞の寛容化を招く治療法を考案しようと試みて いるが、こうした機序には、適切なＭＨＣ複合体に、しかし適切な補助剌激性シ グナルなしに結合され、そのために、標的Ｔ細胞が寛容化されるようにする標的 抗原に由来する抗原ペプチドとＴＣＲとを咬合させることが含まれる。寛容化さ れたＴ細胞は、低い抗原濃度で刺激されたときには増殖せず、いかなる条件下で もＩＬ−２を産生しなくなる。標的にされた抗原Ｔ細胞の寛容化を生起する（す なわち、このＴ細胞は増殖しないか、または最小限にのみ増殖するにすぎず、更 に、上記に考察したＴ細胞活性化に付随する他のいかなる機能も果たさない）ア レルギー、移植体拒絶または自己免疫疾患に対する治療を提供することは好都合 であろうし、その上、Ｔ細胞の寛容化が適切な補助刺激性シグナルの存在下また は不在下で発生し得るならば、好都合であろう。発明の要約 本発明は、治療的有効量で個体に投与したときに、該個体の、抗原（例えばア レルゲン、自己抗原または移植抗原）に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を 寛容化することができる寛容化性ペプチドであって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の ＭＨＣと結合する能力を有し、該ペプ チド−ＭＨＣ複合体との個体のＴ細胞の少なくとも一部のＴ細胞受容体の結合を 生起し、そして下記の特性：すなわち（１）該ペプチドおよび組織適合抗原提示 細胞を用いる生体外検定において、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少な くとも一部の検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を生起 する能力、（２）個体の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特 異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定において、ＩＬ−２の検出可能な産 生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起する能力、（３）個体の、 該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を 用いる生体外検定において、ＩＬ−３の検出可能な産生を全く生起しないか、ま たは最小限度の産生を生起する能力、および（４）個体の、該抗原、該ペプチド および組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定に おいて、γＩＦＮの検出可能な産生を全く生起しないか、または最小限度の産生 を生起する能力のうち少なくとも一項、好ましくはすべてを有するペプチド、な らびに少なくとも１種類のかかる寛容化性ペプチドを含有する治療用組成物を提 供する。好ましくは、該寛容化性ペプチドは、免疫原の形態で該ペプチドを生体 内に投与したときに、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の 検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を生起する能力を有 する。好ましくは、本発明の 治療用組成物は、かかる個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべて を該抗原に対して不応性にするのに充分な数の寛容化性ペプチドを含む。 本発明は、個体における特定の抗原に対する感受性を治療する方法であって、 好ましくは非免疫原の形態で、本発明の少なくとも１種類の治療用組成物を、該 個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部、好ましくは全部を該抗 原に対して不応性にするのに有効な量で該個体に投与することによる方法も提供 する。本発明の少なくとも２種類の異なる治療用組成物を同時に、または逐次的 に該個体に投与することができる。本発明のもう一つの実施態様は、個体の免疫 系による抗原特異性抗体応答の少なくとも一部を阻害する方法であって、好まし くは非免疫原の形態で、本発明の少なくとも１種類の治療用組成物を、該個体の 、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にする のに有効な量で該個体に投与することによる方法を提供する。 本発明の更にもう一つの実施態様では、本発明の寛容化性ペプチドを設計する 方法、および該寛容化性ペプチドを用いて、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞 の集団の少なくとも一部を寛容化する方法が提供される。図面の説明 図１ａは、マウスヘモグロビンＢｄの短鎖の野生型ペプチド（ＨｂＢ（６４− ７６）、グラフではＷｔＨｂと して示されている）、または本発明の置換されたＨｂＢ（６４−７６）であるＳ ｅｒ７０に対するＴ細胞クローンであるＰＬ−１７のＩ−Ｅ^k移入Ｌ細胞という 繊維芽細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に用いたＴ細胞増殖検定のグラフ表示であ る。 図１ｂは、図１ａと同様であるが、２種類の置換されたＨｂＢ（６４−７６） ペプチド、すなわちＳｅｒ７０およびＧ１ｎ７２をＴ細胞増殖検定に用いている 。 図２ａは、ＷｔＨｂまたは置換ペプチドＳｅｒ７０で刺激されたＴｈ１クロー ンであるＰＬ−１７によるＩＬ−２について、ＩＬ−２依存性細胞系であるＣＴ ＬＬの増殖として定量した生物検定のグラフ表示であって、ＣＨ２７Ｂ細胞とい うリンパ腫をＡＰＣに用いた。 図２ｂは、図２ａと同様であるが、２種類の置換ＨｂＢ（６４−７６）ペプチ ド、すなわちＳｅｒ７０およびＧ１ｎ７２を検定に用いている。 図３ａは、ＷｔＨｂおよび置換ペプチドＳｅｒ７０で刺激されたＴｈ１クロー ンのＰＬ−１７によるγＩＦＮ産生についての生物検定の棒グラフ形態でのグラ フ表示であって、Ｌ細胞という繊維芽細胞を抗原提示細胞に用い、ＥＬＩＳＡを 用いてγＩＦＮを定量した。 図３ｂは、図３ａと同様であるが、置換ペプチドＧ１ｎ７２も試験したγＩＦ Ｎ産生についての生物検定の折れ線グラフ形態でのグラフ表示である。 図４は、ＷｔＨｂまたは置換ペプチドＳｅｒ７０で剌 激されたＴｈ１クローンのＰＬ−１７によるＩＬ−３産生についての生物検定の グラフ表示であって、ＩＬ−３産生は、ＩＬ−３依存性細胞系であるＧＧ１．１ ２の増殖として定量し、Ｂ１０．ＢＲ／ｓｇＳｎｊという脾臓細胞をＡＰＣに用 いた。 図５ａは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０もし くは５０μＭのＧ１ｎ７２のいずれかとともに一晩温置し、１日休止させてから 野生型Ｈｂペプチド（６４−７６）で挑戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を 用いた寛容性検定の結果のグラフ表示であって、ＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞 またはＢ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細胞をＡＰＣに用いた。 図５ｂは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０とと もに一晩温置し、３日間休止させてから野生型Ｈｂペプチド（６４−７６）で挑 戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を用いた寛容性検定の結果のグラフ表示で あって、ＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞またはＢ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細 胞をＡＰＣに用いた。 図５ｃは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０とと もに一晩温置し、５日間休止させてから野生型Ｈｂペプチド（６４−７６）で挑 戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を用いた寛容性検定の結果のグラフ表示で あって、ＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞またはＢ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細 胞をＡＰＣに 用いた。 図５ｄは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０とと もに一晩温置し、７日間休止させてからＨｂペプチド（６４−７６）で増殖検定 として挑戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を用いた寛容性検定の結果のグラ フ表示であって、ＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞またはＢ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎ ｊ脾臓細胞をＡＰＣに用いた。 図６は、ペプチドなしで、またはＨｂ（６４−７６）、Ｓｅｒ７０もしくはＧ １ｎ７２とともに温置したＴｈ１クローンのＰＬ−１７細胞によるイノシトール リン酸生成についての、ＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞またはＢ１０．ＢＲ／Ｓ ｇＳｎｊ脾臓細胞のいずれかをＡＰＣに用いた検定の結果のグラフ表示であって 、シンチレーション計数によって総遊離イノシトールリン酸を定量した。 図７ａは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０（５ ０μＭｓ７０ｏ／ｎ）、５０μＭのＧ１ｎ７２（５０μＭＱ７１ｏ／ｎ）もしく は１００μＭのＧ１ｎ７２（１００μＭＱ７２ｏ／ｎ）のいずれかとともに一晩 温置したＴｈ１クローンのＰＬ−１７細胞、およびＡＰＣとしてＤＣＥＫ−Ｈｉ ７というＬ細胞の移入体を用い、次いで、抗原としてのＨｂ（６４−７６）で挑 戦試験した寛容性検定の結果のグラフ表示である。 図７ｂは、様々な濃度の置換ペプチドＳｅｒ７０とともに一晩温置したＴｈ１ クローンのＰＬ−１７、およびＡＰＣとしてＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞の移 入体を用い、次いで、抗原としてのＨｂ（６４−７６）で挑戦試験した寛容性検 定の結果のグラフ表示である。 図８は、抗原なしで、または置換ペプチドＳｅｒ７０ととともにか、または抗 原なしでシクロスポリンＡとともにか、または置換ペプチドＳｅｒ７０およびシ クロスポリンＡとともに一晩温置したＰＬ−１７細胞、およびＡＰＣとしてＤＣ ＥＫ−Ｈｉ７というＬ細胞を用い、次いで、抗原としてのＨｂ（６４−７６）で 挑戦試験した寛容性検定の結果のグラフ表示である。 図９は、ＤＣＥＫ／Ｈｉ７というＬ細胞のみとともにか、または５０μＭの置 換ペプチドのＳｅｒ７０もしくはＧ１ｎ７２とともに温置したＰＬ−１７細胞の 表面のＩＬ−２受容体のレベルについてのＦＡＣＳｃａｎ分析試験を示すグラフ である。 図１０は、ＤＣＥＫ／Ｈｉ７というＬ細胞のみとともにか、または５０μＭの 濃度の置換ペプチドのＳｅｒ７０もしくはＧ１ｎ７２と組合せて温置したＰＬ− １７細胞の表面のＬＦＡ−１という粘着分子のレベルについてのＦＡＣＳｃａｎ 分析試験を示すグラフである。 図１１ａは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０と ともに一晩温置し、３日間休止させてから野生型Ｈｂペプチド（６４−７６）で 増殖検 定として挑戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を用いた寛容性検定の結果のグ ラフ表示である。 図１１ｂは、抗原なし（ＮｏＡｇｏ／ｎ）で、または５０μＭのＳｅｒ７０と ともに一晩温置し、３日間休止させてから野生型Ｈｂペプチド（６４−７６）で 増殖検定として挑戦試験したＴｈ１クローンＰＬ−１７を用いた寛容性検定の結 果のグラフ表示である。発明の詳細な説明 本発明は、治療的有効量で個体に投与したときに、該個体の、抗原（例えばア レルゲン、自己抗原または移植抗原）に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を 寛容化することができる寛容化性ペプチド（ここでは寛容化性置換ペプチドとも 呼ぶ）であって、組織適合抗原提示細胞を用いた生体外検定において、該個体の 、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起し ないか、または最小限度の増殖を生起する寛容化性ペプチド、ならびに少なくと も１種類のかかる寛容化性ペプチドを含有する治療用組成物を提供する。ここで 用いられる限りでの「寛容化」「寛容化性」「アネルギー」および「アネルギー 作用性」等々という用語は、Ｔ細胞が、ＭＨＣと複合体化された抗原による刺激 に応答できなくされることを意味する。ここでは、寛容化は、寛容化性ペプチド およびＭＨＣの複合体とのＴ細胞受容体の結合を包含する。最小限度のＴ細胞増 殖、最小限度のリンホカイン産生等々を考察するときにここで用 いられる限りで、最小限度という用語は、有意ではない量を意味する。組織適合 抗原提示細胞とは、Ｔ細胞の集団に対して組織適合性である抗原提示細胞（ＡＰ Ｃ）のことである。これは、Ｔ細胞およびＡＰＣが同じ供給源から得られた場合 に自動的である。しかし、それらを別個に調製してもよい。ヒトに関係する検定 については、同一被験者からの不死化されたＢ細胞系、ＭＨＣクラス２適合細胞 系、または適格末梢血単核細胞をＡＰＣとして用いることができる。好ましくは 、該寛容化ペプチドは、該ペプチドを免疫原の形態で生体内に投与したときに、 個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く 生起しないか、または最小限度の増殖を生起する能力を有する。免疫原の形態と は、免疫応答を誘導する、すなわちペプチドと特異的に免疫反応性であるＴ細胞 の活性化または抗体の産生を生起する傾向がある形態を意味する。アジュバント に混入して投与されたペプチドは免疫原性となる傾向があるが、アジュバントの 不在下で、および可溶性形態（非免疫原形態）で投与されたペプチドは寛容原性 となる傾向があることは周知である。本発明の寛容化性ペプチドのその他の特徴 は、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の一部、および組織適合抗原提示細胞 を用いる生体外検定において、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、γインターフェ ロン等々を包含するがそれらに限定されないリンホカイン類の検出可能な産生を 全く生起しないか、または最 小限度の産生を生起する能力を包含する。 好ましくは、本発明の治療用組成物は、本発明の少なくとも１種類の寛容化性 ペプチド、および製薬上許容され得る担体または希釈剤を含む。製薬上許容され 得る希釈剤は、食塩水および水性緩衝液を包含する。製薬上許容され得る担体は 、ポリエチレングリコール［Wie ら、International Archives of Allergy and Applied Immunology、第64巻84〜99ページ（1981年）］およびリポソーム類［St rejan ら、Journal of Neuroimmunology、第７巻27ページ（1984年）］を包含す る。一般に、かかる組成物は、注射（皮下、静脈内等々）、経口投与（例えば、 カプセルの形態として）、吸入、経皮塗布または直腸投与によって投与されるで あろう。好ましくは、本発明の治療用組成物は、かかる個体の、該抗原に特異的 であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原に対して不応性にするのに充分な数の寛 容化性ペプチドを含む。これは、１種類の寛容化性ペプチド、２種類の寛容化性 ペプチド、３種類の寛容化性ペプチド等々であると判明してもよい。本発明の治 療用組成物は、抗原に対する個体の感受性を低下させるのに有効な投与量および 時間で、該個体に投与される。ここで用いられる限りで、感受性の低下とは、抗 原に対する不応性または症状の軽快（すなわち、個体は、臨床的および／または 科学的操作によって測定される限りで、抗原に対して免疫学的に応答し得ること がより少なくなるであろう）として定義することがで きる。この軽快は主観的であってもよい（すなわち、個体は、抗原の存在にもか かわらず、より快適に感じる）。治療用組成物の有効量は、抗原に対する個体の 感受性の程度、個体の年齢、性別および体重等々のような要因に従って変動する であろう。 本発明は、個体における特定の抗原に対する感受性を治療する方法であって、 好ましくは非免疫原の形態で、本発明の少なくとも１種類の治療用組成物を、該 個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部、好ましくは全部を該抗 原に対して不応性にするのに有効な量で該個体に投与することによる方法も提供 する。本発明の少なくとも２種類の異なる治療用組成物を同時に、または逐次的 に該個体に投与することができる。Ｔ細胞の少なくとも一部を抗原に不応性にす ることによって、抗原特異性抗体応答のの少なくとも一部が阻害される。Ｔ細胞 のエピトープは、それもまた疾患の臨床的症状の原因となる、蛋白質または蛋白 質複合体である抗原に対する免疫応答の開始および永続化に関与するものと考え られる。これらのＴ細胞エピトープは、ＡＰＣ表面の適切なＨＬＡ分子と結合し 、Ｔ細胞の適格な下位集団を刺激することによって、Ｔヘルパー細胞のレベルで の初期の事象を誘発するものと考えられる。適格なＴ細胞下位集団を抗原に対し て不応性にしておくならば、抗体の産生に導くＢ細胞の一連の動きの活性化をは じめとする様々な事象は発生しないであろう。この個体が、アレルギー 反応もしくはアレルギー性ぜんそく、リウマチ様関節炎、または移植片拒絶の症 状のような疾患に対する感受性を示す臨床的症状を経験しているならば、本発明 の治療用組成物の投与に際して、これらの症状を停止させ、または軽減すること ができる。 本発明の更にもう一つの実施態様では、本発明の寛容化性ペプチドを設計する 方法が提供される。一つの方法では、アレルギー、移植拒絶または自己免疫疾患 の原因となることが知られている抗原からの免疫原ペプチドを最初に単離するこ とによって、寛容化性ペプチドを設計してよい。これは、例えば、免疫原ペプチ ドである（すなわち、その抗原の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを有する） ことが以前に知られている抗原に由来する合成または組換えペプチドを用いるこ とによって、実施することができる。これは、問題の抗原の構造を調べ、問題の 抗原に対して感受性であることが知られているＴ細胞の集団中での、Ｔ細胞の応 答に影響を及ぼし得るそれらの能力について調べようとするペプチドを（合成に よるか、またはその他の手段で、表現系を通じて）製造し、そして細胞によって 認識された少なくとも１エピトープを有する適切なペプチドを選ぶことによって も、実施することができる。エピトープに言及すると、エピトープは、受容体、 特に免疫グロブリン、組織適合抗原およびＴ細胞の受容体による認識の基本的要 素または最小単位となるものと思われ、受容体の認識に不可欠であるア ミノ酸を含む。 問題の抗原の少なくとも１エピトープを有する少なくとも１アミノ酸配列（免 疫原ペプチド）を単離または決定したならば、その免疫原ペプチド（ここでは野 生型ペプチドまたは自生ペプチドとも呼ぶ）の各アミノ酸を異なるアミノ酸（保 存的アミノ酸、自然界には見いだされないアミノ酸またはアラニンでもよい）と 置き換えることによって、置換ペプチドを生成する。したがって、各置換ペプチ ドは、問題の免疫原ペプチド（または野生型ペプチド）の同じ部位のアミノ酸と は異なる１個またはそれ以上の置換アミノ酸を有する。保存的アミノ酸置換の例 は、表１に示したものを包含するが、それらに限定されない。 次いで、置換ペプチドを、問題の抗原に特異的なＴ細胞の一部を寛容化できる か否かを判定するために試験する。本発明に適した寛容化性置換ペプチドである と判定された置換ペプチドは、抗原提示細胞のＭＨＣと結合する能力を有し、該 ペプチド−ＭＨＣ蛋白質複合体との個体のＴ細胞の少なくとも一部のＴ細胞受容 体の結合を生起し、下記の特性：すなわち（１）該ペプチドおよび組織適合抗原 提示細胞を用いる生体外検定において、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の 少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を 生起する能力、（２）個体の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞 に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検定において、ＩＬ−２の検出可能 な産生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起する能力、（３）個体 の、該抗原、該ペプチドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一 部を用いる生体外検定において、ＩＬ−３の検出可能な産生を全く生起しないか 、または最小限度の産生を生起する能力、および（４）個体の、該抗原、該ペプ チドおよび組織適合抗原提示細胞に特異的であるＴ細胞の一部を用いる生体外検 定において、γＩＦＮの検出可能な産生を全く生起しないか、または最小限度の 産生を生起する能力のうち少なくとも一項、好ましくはすべてを有する。 本発明は、ペプチド結合で結合されたサブユニットですべてが構成されてはい ないが、他の結合（例えばチオ ールエステル結合）で結合されている化合物のような、上記の本発明の寛容化性 置換ペプチドを模倣するいかなる化合物も包含してよいが、この非ペプチド化合 物は、増殖および／またはサイトカイン産生の不在下で非ペプチドとＭＨＣとの 複合体とのＴ細胞受容体の結合を通じてＴ細胞を寛容化できる寛容化性ペプチド を模倣することを条件とする。 最も好ましくは、本発明の寛容化性置換ペプチド（または該ペプチドを模倣す る化合物）は、問題の抗原に特異的であるＴ細胞の集団の少なくとも一部の検出 可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を生起し、ＩＬ−２、Ｉ Ｌ−３等々のリンホカイン類の検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小 限度の増殖を生起するが、本発明の好適な寛容化性ペプチドは、ＩＬ−２受容体 の上方調節および／またはＬＦＡ−１粘着分子産生を刺激することができ、こう して、この置換ペプチドが、適切なクラス２ＭＨＣ複合体とともにＴ細胞を結合 かつ咬合させ、そしてＴ細胞の部分的活性化を生起していることを示す。 本発明の寛容化性置換ペプチドがここに記載されたように機能する理由に関す る一つの仮説は、Ｔ細胞受容体とのペプチド−ＭＨＣ複合体の接触は、複合的な 細胞内経路が活性化されるのを誘発するということかもしれない。したがって、 Ｔ細胞受容体を自生または野生型の免疫原ペプチドとは異なって結合させなけれ ばならない本 発明の置換ペプチドは、これらの経路のうちの自生ペプチドより少ない経路を刺 激し、誘発された細胞内経路は、Ｔ細胞が寛容化されるようにする経路である可 能性がある。 上記の寛容化性ペプチドは、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の集団の少な くとも一部を、初めに上記の方法を用いて寛容化性ペプチドを生成し、そして該 ペプチドを治療用組成物として、Ｔ細胞の該集団の少なくとも一部の寛容化を生 起するのに有効な量で投与することによって寛容化するための方法に用いてよい 。 下記の限定的ではない実施例において、本発明を更に説明する。 実施例１ Ｔｈ１クローンであるＰＬ−１７（ここではＰＬ−１７細胞とも呼ぶ）は、Ｉ −Ｅ^kの状況では、マウスヘモグロビンβ^dの短鎖であるＨｂβ（６４−７６）（ ここでは自生ペプチド、自生免疫原性ペプチドまたは野生型ペプチド（ＷｔＨｂ ）とも呼ぶ）という公知の免疫原ペプチドに特異的である。表２に示したとおり 、保存的な単一のアミノ酸置換を自生ペプチドのアミノ酸第６７〜７６残基のい ずれか１個所で導入することによって、置換Ｈｂ（６４−７６）ペプチドを生成 した。 Ｈｂ（６４−７６）ペプチドおよび置換ペプチドは、DuPontのＲａＭＰＳ装置 を用いて合成し、Beckman６３００というアミノ酸分析機での逆相ＨＰＬＣを用 いて精製した。 Ｉ−Ｅ^k移入Ｌ細胞という繊維芽細胞であるＤＣＥＫ−Ｈｉ７をＡＰＣとして 用い、７０番の位置のＡ１ａをＳｅｒに置き換えることによって生成したペプチ ド（ここではＳ７０、Ｓｅｒ７０またはＳｅｒ７０−Ｈｂ（６４−７６）とも呼 ぶ）は、自生免疫原ペプチドで最大の増殖を生起する濃度（実施例２）より１０ 倍も高い濃度でさえ、増殖性応答を完全に抑止することが見いだされた（図１ａ および１ｂ）。その上、置換ペプチドＧ１ｎ７２（ここではＧ７２、Ｇ１ｙ７２ −Ｈｂ（６４−７６ ）とも呼ぶ）はＰＬ−１７がサイトカインを産生するのを刺激できなかった。図 ２ａおよび２ｂは、自生Ｈｂ（６４−７６）で提示したときには、Ｔ細胞は有意 量のＩＬ−２を製造するが、いずれの置換ペプチドによっても、刺激に対して検 出可能なＩＬ−２は全く認められなかったことを示している。他者による報告は 、Ｔｈ１クローンによるＩＬ−３およびγＩＦＮの産生は、ＴＣＲの咬合のみに よって発生し得るが、ＩＬ−２の産生には追加の補助刺激が必要であることを示 唆している。そのため、ペプチド類似体による刺激後に、γＩＦＮ（図３ａおよ び３ｂ）またはＩＬ−３（図４）の産生（実施例２）について上清を分析した（ 実施例２）。しかし、ＩＬ−２の様相に関する限り、自生免疫原ペプチドＨｂ（ ６４−７６）のみが、ＰＬ−１７がγＩＦＮ（図３ａおよび３ｂ）およびＩＬ− ３（図４）を合成するのを可能にする適切な活性化を与え得たにすぎなかった。 類似の実験で新鮮なＢ１０ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細胞をＡＰＣとして用いたとき も、同様な結果が見いだされた（データは示さず）。 ＴＣＲの咬合後に発生するはずの最も初期の細胞内事象の一つは、膜のリン脂 質の分解とイノシトールリン酸の生成とを触媒するホスホリパーゼＣの活性化で ある。上記の仮説で考察したとおり、サイトカイン産生より初期の活性化という 事象は、置換Ｈｂペプチドによって剌激され得る可能性がある。したがって、自 生Ｈｂ（６４ −７６）または置換ペプチド（Ｓｅｒ７０もしくはＧ１ｙ７２）の一つ、および ＤＣＥＫ−Ｈｉ７細胞でＴ細胞を刺激した後に、総イノシトールリン酸産生につ いてＰＬ−１７細胞を検定した（実施例２）。自生Ｈｂ（６４−７６）ペプチド は、有意レベルのイノシトールリン酸の産生を可能にしたが、置換ペプチドＳｅ ｒ７０およびＧ１ｎ７２は可能にしなかった（図６）。したがって、Ｔｈ１クロ ーンＰＬ−１７に関しては、保存的アミノ酸置換を自生免疫原ペプチドの様々な 残基で導入することは、検出可能な増殖、サイトカイン産生、およびイノシトー ルリン酸生成を刺激する活性化シグナルの欠失を招いた。 更に、活性化の際に、Ｔ細胞は、ＬＦＡ−１およびＩＬ−２Ｒをはじめとする 各種の細胞表面分子を上方調節することが公知である。そのため、Ｈｂ（６４− ７６）、Ｇ１ｎ７２またはＳｅｒ７０で刺激した後のＰＬ−１７でのこれらの分 子のレベルを比較した。ＦＡＣＳｃａｎ（ＦＡＣＳ）分析（実施例３）は、Ｇ１ ｎ７２での刺激は、概して、いずれの受容体も対照レベルを超えて増大させなか ったが、Ｓｅｒ７０による刺激は、ＬＦＡ−１（図１０）およびＩＬ−２Ｒ（図 ９）のレベルをともに有意に上方調節した。これらの結果は、ＴＣＲの咬合の際 に、Ｓｅｒ７０は、部分的なシグナルをＰＬ−１７に送達しているが、それはイ ノシトールリン酸の生成とは無関係であることを示唆した。更に、これらの結果 は 、Ｇ１ｎ７２がＴ細胞に結合していなかったことを示唆するが、これは、上記の とおり、本発明の寛容化性置換ペプチドの必要条件である。 部分的なＴ細胞の刺激は、Ｔ細胞の活性化および増殖ではなく寛容性の誘導に 導き得るという仮説によって、置換ペプチドＳｅｒ７０およびＧ１ｎ７２で提示 された後に免疫原ペプチドに応答できるというＴ細胞の能力が示された。生存す る機能性ＡＰＣのみの供給源としてのＤＣＥＫ−Ｈｉ７（図１１ａ）もしくはＢ １０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細胞（図１１ｂ）、またはＳｅｒ７０およびＧ１ｎ ７２というペプチド類似体で予め刺激しておいたＰＬ−１７細胞を用いて、増殖 の挑戦検定を実施した。Ｇ１ｎ７２という類似体を予め認めていたＴ細胞は、こ の挑戦検定で正常に応答したものの、Ｓｅｒ７０で予め提示されていたＰＬ−１ ７は、このとき免疫原ペプチドに完全に不応性であった（図１１ａおよび１１ｂ ）が、外来ＩＬ−２（データは示さず）またはＰＭＡおよびイオノマイシン（デ ータは示さず）には充分に応答することができた。これらの結果は、単一の保存 的アミノ酸置換のみが自生免疫原ペプチドと異なるにすぎない置換ペプチドは、 部分的シグナルをＴ細胞に形質導入すること（Ｔ細胞の部分的活性化）が可能で あり、それがＴ細胞を自生免疫原ペプチドによるその後の挑戦に不応性にさせ、 そのため、不応性となり、寛容化されると思われることを示唆する。この観察結 果は、増殖、サイトカ イン産生およびＦＡＣＳ検定においてＳｅｒ７０と同様な結果を与えていた（デ ータは示さず）もう一つの置換ペプチドであるＡｓｐ７３の寛容化能を研究する ことによって、更に拡張された。Ａｓｐ７３で予め提示しておいたＰＬ−１７細 胞は、Ｈｂ（６４−７６）ペプチドで挑戦試験したときには、増殖することが完 全に不可能であった。しかし、このアネルギー状態を誘導するには、Ｓｅｒ７０ 置換ペプチドより多量のＡｓｐ７３置換ペプチドを必要とするように思われ（１ ０μＭのＳｅｒ７０と比較して少なくとも３０μＭのＡｓｐ７３）、おそらく、 自生ペプチドのこれら２ケ所の位置に対する変化が、ＴＣＲが置換ペプチド−Ｍ ＨＣ複合体によって咬合される方式に対して異なる効果を有するということを示 唆する。 次に、この不応性の状態がどれだけ長期間持続し得るかを調べる研究を実施し た。Ｔ細胞を１、３、５および７日間休止させてから（実施例５）Ｈｂ（６４− ７６）で挑戦試験したときは、それらは依然として増殖性応答を演じることがで きず（図５ａ〜５ｄ）、置換ペプチドＳｅｒ７０は、ＰＬ−１７を深いアネルギ ーの状態に誘導したという結論に導いた。同様な実験（実施例６）では、Ｓｅｒ ７０の相対的低濃度をはじめとする様々な濃度が寛容性を誘導できることが示さ れた（図７ａおよび７ｂ）。しかしながら、図７ａの結果は、Ｇ１ｎ７２は寛容 性を誘導できなかったことを示し、それがＴＣＲに 結合しておらず、本発明の寛容化性置換ペプチドに要求されるように、Ｔ細胞を 部分的に活性化してもいないことを示した。 アネルギーを誘導するために化学的に固定したＡＰＣ（すなわちＥＣＤＩで処 理したＡＰＣ）および免疫原ペプチドを用いた以前の研究では、培養物へのシク ロスポリンＡまたは同種脾臓の添加は、生存する固定されたＡＰＣでのその後の 挑戦に対してＴ細胞が不応性になるのを防止することが示された。本系でも同様 に、Ｓｅｒ７０とともにシクロスポリンＡを加えることはこのアネルギーの誘導 を防止するが（図８）、補助刺激源としてのＴ枯渇同種脾臓細胞の添加は効果が ない（データは示さず）ことが見いだされた。これらの結果は、専門的ＡＰＣに 対する置換ペプチドＳｅｒ７０によって誘導されるアネルギーの機序は、固定さ れたＡＰＣによるペプチドの提示によって生起されたそれと似てはいるが、明確 に異なることを示唆する。 他の研究では、非免疫原ペプチド類似体は、Ｔ細胞に対するいかなる検出可能 なシグナルも形質導入することなくＴＣＲ部位について競合することによって、 拮抗するように機能することはできないことが示された。しかし、この系で、Ｓ ｅｒ７０は、Ｔ細胞をアネルギー化ささせるので、Ｔ細胞に何らかのシグナルを 送っているはずであるのに対し、Ｇ１ｎ７２は、Ｔ細胞をアネルギー化しないの で、Ｔ細胞にシグナルを送ってはいない。こ れがどのように発生するかの根源的機序は、現在のところ未知である。しかし、 この系では、補助刺激がＡＰＣから与えられているのであるから、この寛容化は 補助刺激的シグナルの存在下でさえ発生する。 ＴＣＲとのペプチド−ＭＨＣ複合体の接触が、おそらくはそれぞれＣＤ３複合 体の異なる鎖に接続された、複合的な細胞内経路が活性化されるのを誘発すると も考えられ得る。この考えの裏付けとして、多くの最近の研究は、ＣＤ３複合体 を構成する分子のいくつかが、機能性ドメインを包含し、複合体の残余とは無関 係にシグナルを発することができることを示している。したがって、免疫原ペプ チドとは異なる方式でＴＣＲを結合するに相違ない置換ペプチドは、自生ペプチ ドより少ないこれらの経路を刺激し、Ｓｅｒ７０およびＡｓｐ７３に関しては、 誘発される細胞内経路は、アネルギーを生起するそれであることがあり得る。こ れが真実であるならば、アネルギー誘導のためのシグナルは、すべての抗原性刺 激に対するＴ細胞の応答の正常な部分であるが、通常は、増殖性の応答を許す刺 激性の経路によって優先されることになる。Ｔ細胞によって自生ペプチドとは僅 かに異なって認識されるにすぎない置換ペプチドを選ぶことによって、これらの 活性化の経路を分離することが可能になる。 実施例２ 本発明のＨｂ（６４−７６）の置換ペプチドに対する ＰＬ−１７というＴｈ１クローン（ＰＬ−１７細胞）の増殖、リンホカインおよ びイノシトール生成という応答を示す研究を実施した。 増殖検定（結果を図１ａおよび１ｂに示す）を、９６穴平底プレートにおいて 、１０％ウシ胎児血清（Hyclone社、米国ユタ州ローガン）、２mMのグルタミン 、５０μｇ／mlのゲンタマイシン、１０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液および２−ＭＥ（ ２ｘ１０^-5モル）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養液２００μｌ中で実施した 。２．１０⁴細胞／ウエルのＰＬ−１７クローン、Ｉ−Ｅ^kの構成を用いて５ｘ１ ０⁴細胞／ウエルで移入したマイトマイシンＣで処理したＤＣＥＫ／Ｈｉ７とい うＬ細胞である繊維芽細胞（ＨＢＳＳ中で７７μｇ／mlとして３７℃で９０分、 Sigma Chemical社、米国ミズーリ州セントルイス）、およびＨｂペプチド（０〜 １００μＭ）を適切なウエルに加えた。検定物を３７℃で７２時間温置し、最後 の２０時間は³Ｈ−チミジン（０．４μlCi／ウエル）を加えた。図１ａおよび１ ｂに示した結果は、置換ペプチドＳｅｒ７０は、免疫原ペプチドＨｂ（６４−７ ６）で最大の増殖を与える濃度より１０倍も高い濃度でさえ、Ｔ細胞の増殖性応 答を抑止することを示す。その上、置換ペプチドＧ１ｎ７２は増殖を刺激するこ とができなかった。 上記培養物からの２４時間（ＩＬ−２）または４８時間（γＩＦＮ）の上清を 用いて、ＩＬ−２（図２ａおよ び２ｂ）およびγＩＦＮ（図３ａおよび３ｂ）のリンホカインの応答を評価した 。ＩＬ−２検出には、検定の感度を上昇させるために、Ｌ細胞である繊維芽細胞 に代えてＣＨ−２７Ｂ細胞というリンパ腫（上記のとおりマイトマイシンで処理 、３〜５ｘ１０⁴細胞／ウエル）をＡＰＣとして用いた。ＩＬ−２は、ＩＬ−２ 依存性細胞系であるＣＴＬＬの増殖として生物検定で定量した。略述すると、Ｃ ＴＬＬ細胞（５ｘ１０³細胞／ウエル）を試験上清とともに４８時間温置した。 最後の２０時間はトリチウム化チミジンを含有させた。図２ａおよび２ｂの結果 は、Ｈｂ（６４−７６）で提示されたときには、細胞は有意量のＩＬ−２を産生 したが、いずれの置換ペプチドでの刺激に対しても、検出可能なＩＬ−２が全く 認められなかったことを示す。 R．Schreiber（ワシントン大学、米国ミズーリ州セントルイス）によって提供 された試薬とともに記載されたとおりにＥＬＩＳＡを用いて、γＩＦＮを定量し た。γＩＦＮ特異性モノクローナル抗体（Ｈ２２）を、pH９．６の炭酸緩衝液中 で４℃で一晩かけてImmulon２（Dynatech社）９６穴プレートに吸着させた。多 価ウサギ抗マウスγＩＦＮ、次いで、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ （ＴＡＧＯ）を用いて、結合したγＩＦＮを同定した。ＡＢＴＳ試薬で基質を展 開し、４１４nmで読み取った。図３ａおよび３ｂに示したとおり、結果は、免疫 原ペプチドのＨｂ（６４−７６）のみが、ＰＬ−１ ７細胞にγＩＦＮを合成させる適切な活性化を与えることができたにすぎないこ とを示す。 ＩＬ−３依存性細胞系であるＧＧ１．１２（J．McKearn、Monsanto社、米国ミ ズーリ州チェスターフィールド）の増殖としての生物検定で、ＩＬ−３を定量し た。略述すると、ＧＧ１．１２細胞（１ｘ１０⁴細胞／ウエルを）上記の試験上 清（４８時間で捕集）とともに４８時間温置し、最後の２０時間は³Ｈ−チミジ ンを含有させた。図４に示したとおり、結果は、免疫原ペプチドのＨｂ（６４− ７６）のみが、ＰＬ−１７細胞にγＩＦＮを合成させる適切な活性化を与えるこ とができたにすぎないことを示す。 イノシトールリン酸生成の検出には、２０〜５０μCi／mlのミオ［２−³Ｈ］ イノシトール（Amersham社）および１０％ＦＣＳ（ＰＢＳ中で透析してイノシト ールを除去）を含有するイノシトール不含ＲＰＭＩ中で、ＰＬ−１７細胞を１〜 ２ｘ１０⁷細胞／mlで一晩温置した。次いで、細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、ＲＰ ＭＩ１６４０完全培地および１０mMＬｉＣｌ（イノシトール−１−リン酸の阻害 剤）に再懸濁した。７〜１０ｘ１０⁵細胞でのＴ細胞を指示量のＨｂ（６４−７ ６）またはペプチド類似体、およびＤＣＥＫ−Ｈｉ７ｃＬ細胞（５．１０⁴細胞 ／ウエル）または照射Ｂ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細胞（５．１０⁵細胞／ウ エル）とともに９６穴平底プレートで９０〜１２０分間温置した。遊離イノシト ー ルリン酸の蓄積について試料を検定した。略述すると、培養物をクロロホルムお よびメタノールの１：２混合物１ml次いでクロロホルムおよびＨ₂ ００．２５ml で抽出した。遠心分離によって相を分離し、水溶性分画をＡＧ１−Ｘ８ギ酸０． ２５mlのイオン交換カラム（Bio-Rad社）に載せ、次いで５mMのミオーイノシト ールで何度も洗浄した。１．５mlの体積とした０．１モルのギ酸および１モルの ギ酸ナトリウムを用いて総遊離イノシトールリン酸をカラムから溶出させ、シン チレーション計数によって放射能標識を定量した。図６に示したとおり、結果は 、免疫原ペプチドＨｂ（６４−７６）は有意レベルのイノシトールリン酸を産生 させたが、置換ペプチドＳｅｒ７０およびＧ１ｎ７２は産生させなかったことを 示す。 増殖およびリンホカインのいくつかの検定には、Ｌ細胞の移入体を照射ＢＲ／ ＳｇＳｎｊ脾臓細胞（２，０００ラド、５ｘ１０⁵細胞／ウエル）で置き換えた 。 実施例３ ＦＡＣｓｃａｎ分析機を用いた研究を用いて、ＰＬ−１７細胞でのＬＦＡ１粘 着分子およびＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の存在を判定し、結果を図９および １０に示す。ＰＬ−１７（５ｘ１０⁵細胞／ウエル）を、マイトマイシンＣで処 理したＤＣＥＫ／Ｈｉ７のＬ細胞（５ｘ１０⁵細胞／ウエル）のみと、または５ ０μＭでの類似体ペプチドであるＳｅｒ７０−Ｈｂ（６４−７６）も しくはＧ１ｎ７２−Ｈｂ（６４−７６）とともに２４穴プレート中で４８時間温 置した。次いで、Ficoll-Paque（１．０７７ｇ／ml、Pharmacia LKB社、米国ニ ュージャージー州）上での３００rpm、１５分間の遠心分離によって、Ｔ細胞を Ｌ細胞から分離し、３回洗浄してからＦＡＣＳ分析のために標本作成した。各群 について、１．１０⁵細胞を、ａ．ＦＯ４４１．９（抗ＬＦＡ１、ＲａｇＩｇＧ ）またはｂ．抗ＩＬ−２Ｒ（ラットＩｇＧ、E．Unanue、ワシントン大学、米国 ミズーリ州セントルイス）とともに氷上で３０分間温置し、０．５％ＢＳＡおよ び０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤ ギ抗ラットＩｇＧ（Southern Biotech．社）とともに氷上で３０分間温置し、次 いで、再び２回洗浄し、上記のＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎ分析機で細 胞を分析した。 図９および１０に示したとおり、結果は、Ｈｂ（６４−７６）およびＳｅｒ７ ０Ｈｂ（６４−７６）の剌激は、ＬＦＡ−１（図１０）およびＩＬ−２Ｒ（図９ ）双方のレベルを有意に上方調節したことを示す。これらの結果は、Ｓｅｒ７０ は、ＴＣＲの咬合の際に、イノシトールリン酸生成とは無関係である部分的シグ ナルをＰＬ−１７に送達していたことを示唆する。 実施例４ 置換ペプチドＳｅｒ７０−Ｈｂ（６４−７６）がＰＬ−１７のアネルギーを誘 導するか否かを判定するため、 寛容性検定の形態での研究を実施し、結果を図１１ａおよび１１ｂに示す。 ＰＬ−１７細胞（５ｘ１０⁵細胞／ウエル）および、マイトマイシンＣを投与 した、（図１１ａ）ＤＣＥＫ／Ｈｉ７というＬ細胞の移入体（５ｘ１０⁵細胞／ ウエル）もしくは（図１１ｂ）Ｂ１０．ＢＲ／ＳｇＳｎｊ脾臓細胞（５ｘ１０⁶ 細胞／ウエル）を、それらのみで、または５０μＭの指示された類似体ペプチド とともに、最終体積を７００μｌとして２４穴組織培養プレート中で３７℃で２ ０〜２４時間温置した。次いで、Ficoll-Paque（１．０７７ｇ／ml、Pharmacia LKB社、米国ニュージャージー州）上での３，０００rpm、１５分間の遠心分離に よってＴ細胞をＡＰＣから分離し、ＨＢＳＳ中で３回洗浄し、４８穴組織培養プ レート中、ＲＰＭＩ培養液中で３日間休止させた。次いで、抗原としてＨｂ（６ ４−７６）を用いて、実施例２に記載の増殖検定でＴ細胞を挑戦試験した（図１ １ａ）。挑戦検定では、マイトマイシンを投与したＤＣＥＫ−Ｈｉ７というＬ細 胞の移入体またはＣＨ−２７細胞（３〜５ｘ１０⁴細胞／ウエル）を脾臓細胞と 置き換えることができる（データは示さず）。 図１１ａおよび１１ｂに示したとおり、結果は、予めＧ１ｎ７２を認めていた Ｔ細胞は、挑戦検定で正常に応答したが、予めＳｅｒ７０で提示しておいたＰＬ −１７は、今度は、免疫原ペプチドＨｂ（６４−７６）に対し て完全に不応性であったことを示す。 実施例５ Ｓｅｒ７０で誘導されたアネルギーは、（ａ）長期的であり、（ｂ）シクロス ポリンＡによって防止されることを示す研究を実施し、結果を図５ａ−ｄおよび 図８に示す。 実施例４に記載のマイトマイシンＣ投与ＤＣＥＫ／Ｈｉ７というＬ細胞を用い 、図８に示した研究で用いた細胞にシクロスポリンＡ（１μｇ／ml）（Pharmaci a社）を加えて、ＰＬ−１７細胞を寛容性検定に用いた。実施例２に記載のとお り、Ficollを用いてＴ細胞をＡＰＣから分離した。次いで、Ｔ細胞を４８穴組織 培養プレート中で（ａ）１日間（図５ａ）、（ｂ）３日間（図５ｂ）、（ｃ）５ 日間（図５ｃ）および（ｄ）７日間（図５ｄ）休止させてから、実施例２に記載 した増殖検定として挑戦試験した。 図５ａ〜５ｄの結果は、Ｔ細胞は、７日間まで休止させてからＨｂ（６４−７ ６）で挑戦試験してさえ、依然として増殖性応答を演じることができなかったこ とを示し、それは、置換ペプチドＳｅｒ７０が、誘導されたＰＬ−１７に作用し て寛容化の状態に至らせていたことを示す。その上、図８に示した結果は、培養 物へのシクロスポリンＡの添加は、Ｔ細胞がその後の生存ＡＰＣによる挑戦試験 に不応性になるのを防止したことを示す。 実施例６ 様々な濃度の本発明の置換ペプチドＳｅｒ７０は寛容化を誘導することができ ることを示す研究を実施し、図７ａおよび７ｂに示す。 ＰＬ−１７を実施例５に記載の寛容性検定に用いたが、ＡＰＣの存在下で、Ｔ 細胞を様々な濃度の置換ペプチドＳｅｒ７０（Ｓ７０）（図７ａおよび７ｂ）お よびＧ１ｎ７２（Ｑ７２）（図７ａのみ）とともに一晩温置した。 図７ａに示した結果は、Ｓｅｒ７０とともに温置したＴ細胞は寛容化されたの に対し、抗原なしに、またはＧ１ｎ７２とともに温置したＴ細胞は寛容化されな かったことを示す。図７ｂに示した結果は、非常に低濃度のＳｅｒ７０とともに 温置したＴ細胞は、免疫原ペプチドＨｂ（６４−７６）の高い濃度でさえ、依然 として寛容化されたことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＫ，ＵＡ (72)発明者 エバボルド，ブライアン ディー. アメリカ合衆国 63021 ミズーリ，ボル ウィン，シェパズ クロシング 520

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．製薬上許容され得る担体または希釈剤、および治療的有効量で個体に投与し たときに、該個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化する ことができる少なくとも１種類の寛容化性ペプチドを含む治療用組成物であって 、該ペプチドが、寛容化性ペプチドと主要組織適合複合体蛋白質（ＭＨＣ）との 複合体とのＴ細胞受容体の結合を生起すること、更に、組織適合抗原提示細胞を 用いる生体外検定において、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも 一部の検出可能な増殖を全く生起しないか、または最小限度の増殖を生起するこ とを特徴とする治療用組成物。 ２．ペプチドが、該ペプチドを免疫原の形態で生体内に投与したときに、個体の 、抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起しな いか、または最小限度の増殖を生起することを特徴とする請求項１記載の治療用 組成物。 ３．抗原が、アレルゲン、自己抗原および移植抗原からなる群から選ばれる請求 項１記載の治療用組成物。 ４．組成物が少なくとも２種類の異なる寛容化性ペプチドを含む請求項１記載の 治療用組成物。 ５．組成物が、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原に 対して不応性にするのに充分な数の寛容化性ペプチドを含む請求項１記載の治療 用組成 物。 ６．製薬上許容され得る担体または希釈剤、および治療的有効量で個体に投与し たときに、該個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化する ことができる少なくとも１種類の寛容化性ペプチドを含む治療用組成物であって 、該ペプチドが、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の一部および組織適合抗 原提示細胞を用いる生体外検定において、ＩＬ−２の検出可能な産生を全く生起 しないか、または最小限度の産生を生起することを特徴とする治療用組成物。 ７．抗原が、アレルゲン、自己抗原および移植抗原からなる群から選ばれる請求 項６記載の治療用組成物。 ８．組成物が少なくとも２種類の異なる寛容化性ペプチドを含む請求項６記載の 治療用組成物。 ９．組成物が、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原に 対して不応性にするのに充分な数の寛容化性ペプチドを含む請求項６記載の治療 用組成物。 １０．製薬上許容され得る担体または希釈剤、および治療的有効量で個体に投与 したときに、該個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化す ることができる少なくとも１種類の寛容化性ペプチドを含む治療用組成物であっ て、該ペプチドが、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の一部および組織適合 抗原提示細胞を用いる生体外検定において、ＩＬ−３の検出可能な産 生を全く生起しないか、または最小限度の産生を生起することを特徴とする治療 用組成物。 １１．抗原が、アレルゲン、自己抗原および移植抗原からなる群から選ばれる請 求項１０記載の治療用組成物。 １２．組成物が少なくとも２種類の異なる寛容化性ペプチドを含む請求項１０記 載の治療用組成物。 １３．組成物が、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原 に対して不応性にするのに充分な数の寛容化性ペプチドを含む請求項１０記載の 治療用組成物。 １４．製薬上許容され得る担体または希釈剤、および治療的有効量で個体に投与 したときに、該個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化す ることができる少なくとも１種類の寛容化性ペプチドを含む治療用組成物であっ て、該ペプチドが、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の一部および組織適合 抗原提示細胞を用いる生体外検定において、γＩＦＮの検出可能な産生を全く生 起しないか、または最小限度の産生を生起することを特徴とする治療用組成物。 １５．抗原が、アレルゲン、自己抗原および移植抗原からなる群から選ばれる請 求項１４記載の治療用組成物。 １６．組成物が少なくとも２種類の異なる寛容化性ペプチドを含む請求項１４記 載の治療用組成物。 １７．組成物が、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原 に対して不応性にするのに充分 な数の寛容化性ペプチドを含む請求項１４記載の治療用組成物。 １８．個体における抗原に対する感受性を治療する方法であって、該個体の、該 抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にするのに 有効な量の請求項１記載の少なくとも１種類の治療用組成物を該個体に投与する ことを含む方法。 １９．抗原が疾患を生起する抗原であり、寛容化性ペプチドが、組織適合抗原提 示細胞を用いる生体外検定において個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少な くとも一部の検出可能な増殖を全く生起せず、そして該個体が該疾患の臨床的症 状を経験している時間中に治療用組成物を該個体に投与する請求項１８記載の方 法。 ２０．抗原が移植抗原であり、寛容化性ペプチドが、組織適合抗原提示細胞を用 いる生体外検定において個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部 の検出可能な増殖を全く生起せず、そして該個体が移植片拒絶の臨床的症状を経 験している時間中に治療用組成物を該個体に投与する請求項１８記載の方法。 ２１．治療用組成物を非免疫原の形態で個体に投与する請求項１８記載の方法。 ２２．個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原に対して不 応性にする請求項１８記載の方法。 ２３．個体における抗原に対する感受性を治療する方法 であって、該個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に 対して不応性にするのに有効な量の請求項１記載の少なくとも２種類の異なる組 成物を同時に、または逐次的に該個体に投与することを含む方法。 ２４．個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原に対して不 応性にする請求項２３記載の方法。 ２５．個体における抗原に対する感受性を治療する方法であって、該個体の、該 抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にするのに 有効な量の請求項４記載の少なくとも１種類の治療用組成物を該個体に投与する ことを含む方法。 ２６．組成物が、個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の実質的にすべてを該抗原 に対して不応性にするのに充分な数の寛容化性ペプチドを含む請求項２５記載の 方法。 ２７．個体の免疫系による抗原特異性抗体反応の少なくとも一部を阻害する方法 であって、該個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に 対して不応性にするのに有効な量の請求項１記載の少なくとも１種類の治療用組 成物を該個体に投与することを含む方法。 ２８．個体における抗原に対する感受性を治療する方法であって、該個体の、該 抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にするのに 有効な 量の請求項６記載の少なくとも１種類の治療用組成物を該個体に投与することを 含む方法。 ２９．個体における抗原に対する感受性を治療する方法であって、該個体の、該 抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にするのに 有効な量の請求項１０記載の少なくとも１種類の治療用組成物を該個体に投与す ることを含む方法。 ３０．個体における抗原に対する感受性を治療する方法であって、該個体の、該 抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を該抗原に対して不応性にするのに 有効な量の請求項１４記載の少なくとも１種類の治療用組成物を該個体に投与す ることを含む方法。 ３１．個体の、抗原に特異的であるＴ細胞の集団の少なくとも一部を寛容化する 方法であって、 該抗原に由来する、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む少なくとも１ペ プチドを単離する段階、 該ペプチドの少なくとも１アミノ酸残基を異なるアミノ酸で置き換える結果、 置換されたペプチドが、組織適合抗原提示細胞を用いる生体外検定では、個体の 、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起し ないか、または最小限度の増殖を生起するが、治療的有効量で該個体に投与した ときには、個体の、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化する ことができるようにする段階、および そのＴ細胞を寛容化することが望まれる個体に、該置 換ペプチドおよび製薬上許容され得る担体または希釈剤を含む治療用組成物を、 Ｔ細胞の該集団の少なくとも一部の寛容化を生起するのに有効な量で投与する段 階を含む方法。 ３２．アミノ酸の置換が保存的アミノ酸置換である請求項３１記載の方法。 ３３．置き換えようとするアミノ酸を、自然界に見いだされる天然アミノ酸では ないアミノ酸で置き換える請求項３１記載の方法。 ３４．寛容化性ペプチドが、該寛容化性ペプチドを模倣する化合物である請求項 １記載の治療用組成物。 ３５．治療的有効量で個体に投与したときに、該個体の、抗原に特異的であるＴ 細胞の少なくとも一部を寛容化することができるペプチドを設計する方法であっ て、該ペプチドが、組織適合抗原提示細胞を用いる生体外検定において、個体の 、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起し ないか、または最小限度の増殖を生起することを特徴とし、 該抗原に由来する、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む少なくとも１ペ プチドを単離する段階、および 該ペプチドの少なくとも１アミノ酸残基を異なるアミノ酸で置き換える結果、 置換されたペプチドが、組織適合抗原提示細胞を用いる生体外検定では、個体の 、該抗原に特異的であるＴ細胞の少なくとも一部の検出可能な増殖を全く生起し ないか、または最小限度の増殖を生起 するが、治療的有効量で該個体に投与したときには、個体の、該抗原に特異的で あるＴ細胞の少なくとも一部を寛容化することができるようにする段階を含む方 法。