KR20170138414A - Ache의 t14 펩타이드를 인식하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체, 및 특히, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 장애의 진단 및 치료에 사용되는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 신경퇴행성 장애의 진단 및 치료 방법, 및 상기 질환을 치료하기 위한 신규한 치료 화합물을 단리시키기 위한 검정 및 선별로 확장된다.

Description

ACHE의 T14 펩타이드를 인식하는 항체
본 발명은 항체, 및 특히, 신경퇴행성 장애, 예컨대, 알츠하이머병 및 파킨슨병의 진단 및 치료에 사용되는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 신경퇴행성 장애의 진단 및 치료 방법, 및 이러한 질환을 치료하기 위한 신규 치료 화합물을 단리하기 위한 분석 및 선별로 확장된다.
알츠하이머병은 주로 65세가 넘는 남성 및 여성에게 영향을 미치며 상기 질환을 가진 것으로 진단받을 가능성은 나이가 들어감에 따라 실질적으로 증가한다. 65세가 넘는 성인의 비율이 향후 40년 동안 전 세계적으로 증가할 것으로 예상되기 때문에, 알츠하이머병의 발병률은 2010년에 2천백 만건에서 2050년에 5천3백 만건으로 두 배 넘게 증가할 것으로 예상된다(www.alzheimersresearchuk.org 및 www.alz.org로부터의 통계). 이러한 알츠하이머병을 나타낼 것으로 예상되는 환자의 수의 기하급수적인 증가는 의학적 필요성이 충족되지 않은 주요 분야라는 것을 나타낼 뿐만 아니라, 상기 질환을 치료하는 충분히 효과적인 방법이 현재 없기 때문에 치료 및 진단을 위한 상당한 시장 기회를 제공한다.
지난 10년 동안 알츠하이머병을 특이적으로 퇴치하거나 신경퇴행을 더욱 일반적으로 퇴치하는 새로운 약물은 없었다. 그 이유는 결과적으로 약제학적으로 표적화될 수 있는 기본적인 뇌 기전이 아직 확인되지 않았기 때문이다. 신경퇴행의 과정을 설명하기 위한 주요 경쟁자는, 사후 알츠하이머 뇌의 특징이며 아밀로이드 전구체 단백질의 비정상적인 절단으로부터 비롯되는 아밀로이드의 독성 침착에 의한 세포막의 파괴가 뉴런 사멸의 원인이라는 '아밀로이드 가설'이다. 그러나, 이러한 '아밀로이드 가설'은 알츠하이머병 및 파킨슨병에서 흔히 관찰되는 공동-병리학(co-pathology)을 설명하지 못할 뿐만 아니라, 모든 뇌 세포에서의 아밀로이드의 잠재적인 편재에도 불구하고 퇴행에 취약한 세포의 특징적인 선택성, 또는 치매 동물 모델에서 아밀로이드 침착의 부존재, 또는 실제로 인지 결손이 분명하지 않은 특정 뇌 영역에서 아밀로이드의 존재를 설명하지 못한다. 지난 20여년간 약제학적 표적으로서 아밀로이드 형성의 인기에도 불구하고, 이 이론에 근거한 치료는 아직 효과적인 것으로 입증되지 않았다. 보다 그럴듯한 가능성은 신경퇴행 과정이 진행되면, 아밀로이드가 이차적인, 덜 특이적인 악화 효과로서 부가적으로 생성될 것이라는 것이다.
신경퇴행의 주요 기전을 확인하기 위한 한 가지 단서는, 오직 다양한 뉴런 그룹만이 주로 취약하다는 것일 수 있다. 또한, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 운동 뉴런 질환에 취약한 다양한 세포 하위그룹은 그럼에도 불구하고 서로 인접해 있으며, 뇌간에서 전뇌로 확장되는 연속적인 '허브(hub)'를 형성하여, 모두 더 높은 뇌 중심에 대해 위쪽 및 바깥쪽으로 분산된 돌기(diffuse projection)를 보낸다. 따라서, 전달물질에서의 이들의 이질성에도 불구하고, 이러한 뉴런 그룹은 소뇌(cerebellum), 시상(thalamus), 피질(cortex) 등과 같은 뇌의 대부분의 다른 부분에서의 보다 친숙하고 국소화된 세포 회로와 구별하기 위해 총칭하여 '글로벌' 뉴런으로 명명되었다. 이러한 선택적으로 취약한 글로벌 뉴런은, 비록 신경퇴행에서 중추적인 것으로서 상이한 용어('isodendritic core')를 사용하긴 하였으나, 이전에 확인되었다.
글로벌 뉴런의 하위그룹은 이들 세포만이 점진적인 사멸에 굴복하는 반면 뇌의 다른 곳에 있는 이들의 상대물(counterpart)은 뇌졸중에 의해 손상된 경우에도 점진적인 사멸에 굴복하지 않는 이유에 관한 난해하고 아직 풀리지 않은 질문에 대해 설명할 수 있는 공통된 특이적 특징을 갖는다: 이들은 성장을 돕고 유지하는 물질인 '영양 인자(trophic factor)'에 대한 특이적 민감성을 수반하여, 성인기에 그리고 내내 견고한 가소성(plasticity)을 유지한다. 발달하고 있는 뇌에서, 영양 인자는 칼슘 유입을 자극하여 작동하며, 이는 세포 내에서 사건의 캐스캐이드를 촉발시키고, 결국 선택적 분화와 성장을 야기한다. 그러나, 더 높은 용량 또는 더 긴 노출시, 지속적인 칼슘 유입은 뉴런에 독성을 나타낼 수 있다. 가장 중요하게도, 칼슘 유입이 영양 또는 독성 효과를 나타내는지에 결정하는 추가적인 인자는 연령이며, 뉴런이 성숙함에 따라 지금까지의 세포내 칼슘의 영양 수준은 치명적이 된다.
본 발명자들은 신경퇴행성 과정이 사실상 비정상적으로 활성화된 발달 과정이라는 것을 이전에 제안한 바 있다. 이 가설을 뒷받침하기 위해, 뇌간 '허브' 뉴런의 비대(hyper-trophy)가 알츠하이머 뇌에서 보고되었다(Bowser 등, 1997, Brain Pathol. 7:723-30). 이 허브의 큰 영역이 손상되면, 빈번하게 관찰되나 아직까지 설명되지 않는 알츠하이머 및 파킨슨병을 갖는 공동-병리학의 사례가 나타나는 것처럼, 둘 이상의 신경퇴행성 질환이 나타날 것이다. 흥미롭게도, 글로벌 뉴런의 취약한 허브 내의 모든 뉴런은, 전달물질 이질성에도 불구하고, 모두 친숙한 효소 아세틸콜린에스테라제(AChE)를 함유한다. 따라서, AChE는 그의 정상 기능을 수행할 수 없는 뉴런 내에 존재하는데, 노르아드레날린성 청색반점(noradrenergic locus coeruleus), 도파민성 흑색질(dopaminergic substantia nigra), 또는 세로토닌성 솔기핵(serotonergic raphe nuclei)과 같은 세포의 이러한 하위그룹이 어떠한 경우에도 일반적인 기질인 아세틸콜린을 함유하지 않기 때문이다. 그의 정상적인 효소적 역할에서 예상치 못한 추가적인 한 일탈은 AChE가 실제로 아마도 그 자체로 일종의 세포간 전달자로서 글로벌 뉴런으로부터 방출된다는 것이다. 일반적으로, AChE는 신경 및 비신경 조직 모두에서 다양한 상황에서 영양 활성을 갖는 신호전달 분자로서 현재 널리 잘 확립되어 있다.
본 발명자들은 그의 효소 작용과 독립적으로 영양 물질로서 작동하는 AChE가 실제로 뉴런 내로 칼슘의 유입을 촉발한다는 것을 이전에 보여주었다. 따라서, 글로벌 뉴런 내에서, AChE는 양, 이용가능성의 지속 시간, 및 가장 중요하게는, 연령에 따라, 영양-독성 축을 따라 변화하는 이중 비전형적 행동을 가질 수 있다. 만약 표준 뉴런이 뇌졸중에서와 같이 성인기에 손상되면, 다른 것이 기능적으로 보상할 것이다. 반면, 글로벌 뉴런은 재생을 위한 시도로 이들의 영양 자원을 요청함으로써 반응할 것이다. 그러나, 후속 칼슘 유입은 노화된 성숙한 세포에서는 치명적일 것이기 때문에, 결과로 초래된 손상은 신경퇴행을 특징으로 하는 치명적인 사이클에서 보상하고자 하는 추가 시도를 유발할 것이다.
아세틸콜린에스테라제(AChE)는 상이한 발달 단계에서 다양한 형태로 발현되며, 이들 모두는 동일한 효소 활성을 가지나, 매우 상이한 분자 조성을 갖는다. '테일드(tailed)'(T-AChE)는 시냅스에서 발현되며, 본 발명자들은 "T30"으로 알려진 다른 펩타이드 내에 "T14"로 불리는, C-말단으로부터 절단될 수 있는 2개의 펩타이드를 이전에 확인하였고, 이들 모두는 β-아밀로이드의 대등한 영역에 대해 강한 서열 상동성을 갖는다. AChE C-말단 펩타이드 "T14"'는 비가수분해 작용의 범위를 담당하는 AChE 분자의 중요한 부분인 것으로 확인되었다. 합성 14개 아미노산 펩타이드 유사체(즉, "T14"), 및 그 뒤에 T14가 삽입된 더 크고 더 안정하며 더 강력한 아미노산 서열(즉, "T30")은 '비콜린성' AChE에 대해 보고된 것과 동등한 작용을 나타내는 반면, T30 서열 내의 불활성 잔기(즉, "T15")는 효과가 없다.
T14 및 T30의 급성 효과는 다음과 같다: (i) 이들은 밀리초에서 시간까지의 시간 척도 동안 뇌 슬라이스에서 뉴런으로의 칼슘 유입을 조절하고; (ii) 시험관내에서 PC 12 세포 및 또한 시험관내 뉴런 기관형적(organotypic) 배양에서 세포 생존율을 낮추고; (iii) 뉴런 및 PC 12 세로부터 '보상성(compensatory)' 칼슘 유도된 AChE 방출을 조절하며; (iv) 뇌 슬라이스에서 난모 세포 및 뉴런에서 칼슘 전류를 활성화시키고; (v) 독성 효과에서 아밀로이드와 상승작용하며; (vi) 아밀로이드 전구체 단백질 생산 및 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 방출에 관여한다. T14 및 T30의 만성 효과는 다음과 같다: (i) 이들은 뉴런 성장을 감소시키고; (ii) 세포자멸사를 유도하며; (iii) AChE 방출을 증가시키고; (iv) α7 니코틴-수용체에 결합하여 이를 조절하며; 및 (v) 24시간 동안 세포 표면 상에서 α7 수용체의 발현을 향상시켜, 추가 독성에 대한 피드포워드(feedforward) 기전을 제공한다.
T14 및 T30은 독성을 유도하는데 있어 β-아밀로이드보다 더 선택적이고 또한 아밀로이드 악화 독성과 상승작용을 하므로, T14 또는 T30의 독성 효과를 차단하는 임의의 제제가 아밀로이드의 덜 선택적이고 후속적인 독성을 감소시킬 것임이 가정되었다.
실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 T14 펩타이드(서열번호: 3)에 높은 특이성으로 결합하고, T30 펩타이드(서열번호: 2) 또는 β-아밀로이드에 결합하지 않는 신규 항체를 단리하였다. 따라서, 이 항체는 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 장애의 진단 및 치료에 상당한 유용성을 가질 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에 따르면, 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
유리하게도, 실시예에 기재된 데이터는 본 발명의 항체가 매우 높은 특이성으로 T14 펩타이드에 결합한다는 것을 나타낸다. T30에 결합하는 임의의 항체는 피해야 될, 사실상 더 큰 펩타이드의 불활성 성분인 항원을 검출할 위험성을 제기할 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 항체는 단지 T14, 또는 이의 변이체 또는 단편에만 특이적으로 결합하고, T30에는 결합하지 않으므로, 그의 생물활성, 독성 작용은 분리되고 차단될 것으로 확신할 수 있다. 상기 항체는 놀랍게도 생물학적 조직, 심지어 급속 동결된 조직에서 생존한다. 가장 놀라운 것은 대조군 뇌와 비교하여 알츠하이머병 샘플에서 유의한 차이가 검출될 수 있다는 것이다. 따라서, 이러한 발견은 본 발명의 항체가 진단 도구뿐만 아니라 치료적 개입에서 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
아세틸콜린에스테라제는 아세틸콜린을 가수분해하는 세린 프로테아제이며, 숙련가에게 널리 알려져 있다. 뇌에서 발견되는 아세틸콜린에스테라제의 주요 형태는 테일드 아세틸콜린에스테라제(T-AChE)로서 알려져 있다. 인간 테일드 아세틸콜린에스테라제의 일 구현예의 단백질 서열(Gen Bank: AAA68151.1)은 614 아미노산 길이이며, 하기와 같이 서열번호:1로서 본원에 제공된다:
Figure pct00001
[서열번호:1]
T30의 아미노산 서열(서열번호:1의 마지막 30개 아미노산 잔기에 해당함)은 하기와 같이 서열번호:2로서 본원에 제공된다:
Figure pct00002
[서열번호:2]
바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:2에 결합하지 않는다. 상기에 논의된 바와 같이, T30을 표적화하는 항체를 개발함으로써, 사실상 더 큰 펩타이드의 불활성 성분인 항원을 검출할 위험성이 있을 것이다. 그러나, 유리하게도, 본 발명의 항체는 대신에 T14에 특이적으로 결합하므로, T14만의 생물활성, 독성 작용을 분리시키고 차단할 것임이 확실하다.
T14의 아미노산 서열(서열번호:1의 말단 쪽에 위치한 14개의 아미노산 잔기에 해당하며, T30에서 발견되는 최종 15개 아미노산이 결여됨)은 하기와 같이 서열번호:3으로서 본원에 제공된다:
Figure pct00003
[서열번호:3]
T15의 아미노산 서열의 아미노산 서열(서열번호:1의 마지막 15개 아미노산에 해당함)은 하기와 같이 서열번호:4로서 본원에 제공된다:
Figure pct00004
[서열번호:4]
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 결합하지 않는다. T15는 T30의 불활성 성분이며, 이와 같이 T14의 항체 선택성에 대한 적절한 조절 역할을 한다.
β-아밀로이드(Aβ) 부분의 아미노산 서열은 하기와 같이 서열번호:8로서 본원에 제공된다:
Figure pct00005
[서열번호:8]
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:8에 결합하지 않는다.
본 발명은 서열번호:3에 대해 면역 특이성을 갖는 전체 항체(즉, 면역글로불린), 뿐만 아니라 상응하는 전장 항체의 항원-결합 단편 또는 영역으로 확장된다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 1가 항체는 디설파이드 다리에 의해 경쇄(L)와 결합된 중쇄(H)를 포함하는 이량체(HL)이다. 2가 항체는 적어도 하나의 디설파이드 다리에 의해 결합된 2개의 이량체를 포함하는 사량체(H2L2)이다. 다가 항체는 또한, 예를 들어 다수의 이량체를 연결함으로써 생산될 수 있다. 항체 분자의 염기성 구조는 비공유적으로 결합하고 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 약 110개 아미노산의 아미노-말단 가변 영역, 및 사슬의 나머지에 불변 서열을 함유한다. 가변 영역은 항체 분자의 항원-결합 부위를 형성하고 항원, 즉, 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편(예컨대, 에피토프)에 대한 그의 특이성을 결정하는 몇 개의 초가변 영역, 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR의 어느 한 쪽에는, CDR을 고정시키고 배향시키는 상대적으로 보존된 아미노산 서열인 프레임워크 영역이 있다. 항체 단편은 이중특이적 항체(BsAb) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다.
불변 영역은 5개의 중쇄 서열(μ, γ, ξ, α, 또는 ε) 중 하나 및 2개의 경쇄 서열(κ 또는 λ) 중 하나로 이루어진다. 중쇄 불변 영역 서열은 항체의 아이소타입 및 분자의 효과기 기능을 결정한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단리되거나 정제된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 토끼, 마우스 또는 랫트에서 생성될 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 토끼로부터 매우 특이적인 다클론 항체를 제조하였다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 숙주 동물을 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편으로 면역화시킨 다음, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수집함으로써 수득된다. 숙주 동물은 가장 바람직하게는 토끼이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편에 대해 특이성을 나타내는 특정 인간 항체에서 발견되는 실질적으로 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는, 단클론 항체와 같은 항체를 의미할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 CDR과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 참조 서열과 비교하여 상당량의 서열 동일성을 나타낸다. 이러한 동일성은 특정 인간 항체의 아미노산 서열을 나타내는 것으로서 명확하게 알려져 있거나 인식가능하다. 실질적으로 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열은, 예를 들어, 아미노산의 작은 변형 또는 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 인간 항체는 서열번호:3 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적으로 결합하는 그의 기능을 유지한다.
용어 "인간 단클론 항체"는, 예를 들어 파아지 라이브러리에 의한 생산, 림프구에 의한 생산 또는 하이브리도마 세포에 의한 생산과 같은 재조합 방법에 의해 생산된 실질적으로 또는 전적으로 인간의 CDR 아미노산 서열을 갖는 단클론 항체를 포함할 수 있다.
용어 "인간화된 항체"는 인간에서 자연적으로 생산된 항체와의 유사성을 증가시키기 위해 단백질 서열이 변형된 비인간 종(예컨대, 마우스 또는 토끼)으로부터의 항체를 의미할 수 있다.
항체는 재조합 항체일 수 있다. 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된 인간 항체를 포함할 수 있다. 용어 "항원-결합 영역"은 그의 표적 항원, 예를 들어, 서열번호:3의 펩타이드, 또는 이의 변이체 또는 단편에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항체의 영역을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 단편은 에피토프이다. 결합 영역은 초가변 CDR 또는 이의 기능적 부분일 수 있다. 용어 CDR의 "기능적 부분"은 표적 항원에 대해 특이적 친화도를 나타내는 CDR 내의 서열을 의미할 수 있다. CDR의 기능적 부분은 서열번호:3 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다.
용어 "CDR"은 중쇄 및 경쇄 가변 내의 초가변 영역을 의미할 수 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 각각에는 1, 2, 3 또는 그 이상의 CDR이 있을 수 있다. 일반적으로, 각 사슬 상에 적어도 3개의 CDR이 있으며, 이는 함께 구성될 경우, 항원-결합 부위, 즉, 항원이 결합하거나 특이적으로 반응하는 3차원 결합 부위를 형성한다. 그러나, 일부 항체의 중쇄에 4개의 CDR이 존재할 수 있음이 상정되었다.
CDR의 정의는 또한 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위집단을 포함한다. 특정 CDR 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 정확한 잔기수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 본 기술분야의 숙련가는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 잔기가 특정 CDR을 포함하는지 일상적으로 결정할 수 있다.
용어 항체의 "기능적 단편"은 기능적 활성을 보유하는 항체의 부분을 의미할 수 있다. 기능적 활성은, 예를 들어 항원 결합 활성 또는 특이성일 수 있다. 기능적 활성은 또한, 예를 들어, 항체 불변 영역에 의해 제공되는 효과기 기능일 수 있다. 용어 "기능적 단편"은 또한, 예를 들어, 인간 단클론 항체의 프로테아제 소화 또는 감소에 의해 그리고 본 기술분야의 숙련가에게 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 생산된 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 인간 단클론 항체 기능적 단편은, 예를 들어 개별적인 중쇄 또는 경쇄 및 이의 단편, 예컨대 VL, VH 및 Fd; 1가 단편, 예컨대 Fv, Fab, 및 Fab'; 2가 단편, 예컨대 F(ab')2; 단쇄 Fv(scFv); 및 Fc 단편을 포함한다.
용어 "VL 단편"은 CDR을 포함하는, 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 단클론 항체의 경쇄의 단편을 의미할 수 있다. VL 단편은 경쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "VH 단편"은 CDR을 포함하는, 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 단클론 항체의 중쇄의 단편을 의미할 수 있다.
용어 "Fd 단편"은 제1 중쇄 불변 영역, 즉, VH 및 CH-1에 결합된 중쇄 가변 영역을 의미할 수 있다. "Fd 단편"은 경쇄, 또는 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역을 포함하지 않는다.
용어 "Fv 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 없는, 인간 단클론 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은, 예를 들어, CDR을 포함한다. 예를 들어, Fv 단편은 중쇄 및 경쇄 모두의 약 110개 아미노산 중 아미노 말단 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다.
용어 "Fab 단편"은 Fv 단편보다 큰 인간 단클론 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fab 단편은 가변 영역, 및 중쇄 및 경쇄의 제1 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 따라서, Fab 단편은 중쇄 및 경쇄의 약 110 내지 220 아미노산 잔기를 부가적으로 포함한다.
용어 "Fab' 단편"은 Fab 단편보다 큰 인간 단클론 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fab' 단편은 경쇄의 전부, 중쇄의 가변 영역의 전부, 및 중쇄의 제1 및 제2 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, Fab' 단편은 중쇄의 아미노산 잔기 220 내지 330의 일부 또는 전부를 부가적으로 포함할 수 있다.
용어 "F(ab')2 단편"은 인간 단클론 항체의 2가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. F(ab')2 단편은, 예를 들어, 2개의 중쇄-및 2개의 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 제1 불변 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "단쇄 Fv(scFv)"는 짧은 링커 펩타이드와 연결된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들의 융합을 의미할 수 있다.
용어 "이중특이적 항체(BsAb)"는 더 짧은 연결된 펩타이드에 의해 서로 연결된 2개의 scFv를 포함하는 이중특이적 항체를 의미할 수 있다.
본 기술분야의 숙련가는 항체의 단편의 정확한 경계는 단편이 기능적 활성을 유지하는 한 중요하지 않다는 것을 알고 있다. 널리 공지된 재조합 방법을 사용하여, 본 기술분야의 숙련가는 폴리뉴클레오타이드 서열을 조작하여 특정 용도에 요구되는 임의의 종점(endpoint)을 갖는 기능적 단편을 발현시킬 수 있다. 항체의 기능적 단편은 인간 항체와 실질적으로 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 단편을 포함하거나 구성될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면과 관련하여, 이의 항원-결합 단편은 서열번호:3에 특이적이거나 또는 서열번호:3 내의 에피토프에 대해 면역 특이적이다. 이의 항원-결합 단편은 VH, VL, Fd, Fv, Fab, Fab', scFv, F(ab')2 및 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 단편을 포함하거나 구성될 수 있다.
이의 항원-결합 단편은 VL의 항원 결합 영역 서열 중 어느 하나, VH의 항원 결합 영역 서열 중 어느 하나, 또는 인간 항체의 VL 및 VH 항원 결합 영역의 조합을 포함하거나 구성될 수 있다. VH 및 VL 항원 결합 영역 서열의 적절한 수 및 조합은 원하는 친화도 및 특이성 및 항원-결합 단편의 의도된 용도에 따라 본 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 항체의 기능적 단편 또는 항원-결합 단편은 본 기술분야의 숙련가에게 널리 공지된 방법을 사용하여 용이하게 생산되고 단리될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 단백질분해 방법, 재조합 방법 및 화학적 합성을 포함한다. 기능적 단편의 단리를 위한 단백질분해 방법은 출발 물질로서 인간 항체를 사용하는 것을 포함한다. 인간 면역글로불린의 단백질분해에 적합한 효소는, 예를 들어, 파파인, 및 펩신을 포함할 수 있다. 적절한 효소는, 예를 들어, 1가 또는 2가 단편이 요구되는지 여부에 따라 본 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 파파인 절단은 항원 및 Fc 단편에 결합하는 2개의 1가 Fab' 단편을 야기한다. 펩신 절단은, 예를 들어, 2가 F(ab') 단편을 야기한다. 본 발명의 F(ab')2 단편은, 예를 들어, DTT 또는 2-머캅토에탄올을 사용하여 추가로 단축되어 2개의 1가 Fab' 단편을 생산할 수 있다.
단백질분해에 의해 생산된 기능적 또는 항원-결합 단편은 친화성 및 컬럼 크로마토그래피 절차에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 소화되지 않은 항체 및 Fc 단편은 단백질 A에 결합함으로써 제거될 수 있다. 또한, 기능적 단편은, 예를 들어, 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 이들의 전하 및 크기에 의해 정제될 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합 방법론에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는, 항체 중쇄 및 경쇄의 원하는 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 초기에 단리한다. 이러한 영역은, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 영역은 특히 중쇄 및 경쇄의 항원 결합 영역, 바람직하게는 항원 결합 부위, 가장 바람직하게는 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 기술분야에서 공지된 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 의해 직접 합성될 수 있다. 대안적으로, 더 작은 단편이 합성되고 연결되어 본 기술분야에서 공지된 재조합 방법을 사용하여 더 큰 기능적 단편을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역특이성"은 결합 영역이 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편과 특이적으로 결합함으로써 이들과 면역반응할 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대략 10-5 내지 10-13 M-1, 바람직하게는 10-6 내지 10-9 M-1, 더욱더 바람직하게는, 10-10 내지 10-12 M-1의 친화 상수로, 항원(예컨대, 서열번호:3 또는 이의 변이체 또는 단편)과 선택적으로 상호작용할 수 있다. 물질 및 방법 섹션에서, 항체 농도가 결정되는 방법을 설명하는 세부내용이 제공된다.
용어 "면역반응하다"는 결합 영역이 서열번호:3, 또는 이의 에피토프와의 결합시 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 영역을 유발하고 이와 결합하는 능력을 갖는 항원의 임의의 영역을 의미할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:3의 C-말단 내의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호. 5(즉, 서열번호.3의 C-말단 아미노산 수 7-14인 SYMVHWK)에서의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 에피토프 내의 C-말단 라이신(K) 잔기에 특이적으로 결합한다.
실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 서열번호. 6(즉, 서열번호.3의 C-말단 아미노산 수 10-14)으로서 본원에 기재된 서열번호:3에서의 C-말단 아미노산 서열 VHWK가 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 에피토프로서 작용한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 더욱 바람직하게는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호.6에서의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호.6에 특이적으로 결합한다. 따라서, 항체가 결합하는 에피토프가 서열번호.6을 포함하거나 구성된다는 것이 이해될 것이다.
본원에 기재된 다클론 항체는 T14 펩타이드, 및 특히 C-말단 서열, -VHWK에 매우 특이적인 것으로 입증되었다. 더욱이, 전체 AChE 단백질의 그의 인식은 이러한 에피토프 서열이 노출되고 3차 구조에서 접근가능하다는 것을 시사한다. 상기 항체가 선형 T30 펩타이드 단편(내부에 T14가 존재함)을 인식하지 못한다는 사실은 T30 서열의 C-말단에 노출된 라이신(K)의 부존재 때문인 것으로 여겨진다.
T14 펩타이드 내의 -VHWK 에피토프의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 이들 서열이 유용한 항체의 생산을 위한 항원으로서 사용될 수 있다고 생각한다. 실시예에 기재된 바와 같이, T14 펩타이드(서열번호:3)는 숙주에서 면역 반응을 자극하는 캐리어 단백질로서 작용하는 키홀 림페트 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH)에 시스테인-가교되었다. T14에 가교된 KLH 단백질은 본원에서 서열번호:7로서 지칭된다.
따라서, 제2 측면에서, 항원으로서 사용하기 위한, 서열번호:3 또는 서열번호:7, 또는 이의 변이체 또는 단편이 제공된다.
바람직하게는, 상기 항원은 항체가 결합하는 에피토프로서 작용한다. 바람직하게는, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호:6을 포함하거나 구성된다.
제3 측면에서, 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다:
(i) 숙주 유기체를 서열번호:3 또는 서열번호:7, 또는 이의 변이체 또는 단편으로 면역화시키는 단계; 및
(ii) 상기 숙주로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수집하는 단계.
숙주는 포유동물일 수 있고, 인간, 토끼 또는 마우스일 수 있다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열번호:6을 포함하거나 구성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 숙주 동물을 번식시킨 다음, 혈청으로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 혈청은 공유결합된 펩타이드-지지체를 갖는 중력 컬럼을 통과한다. 세척 후, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 산성 완충액에 용출되고, 이후 상기 용액은 중화될 수 있다. 상기 방법은 적합한 완충액(예컨대, PBS)에 대한 투석 및, 선택적으로, 동결건조를 추가로 포함할 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 그 자체로 치료제의 유용성을 갖는다. 그러나, 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 ADCC(항체-의존적 세포-매개 세포독성) 및/또는 CDC(보체-의존적 세포독성) 활성을 향상시키기 위한 당화 조작, 세포독성 모이어티, 예컨대 방사선, 세포독성 약물 또는 독소에의 접합을 포함하는, 약물 효능을 최대화하기 위한 기술이 평가되어 왔다.
따라서, 제4 측면에서, 제1 또는 제3 측면의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 세포독성 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)가 제공된다.
항체-약물 접합체(ADC)는 강력한 세포독성 약물을 항체를 통해 표적 세포에 선택적으로 전달하는데 사용될 수 있다. ADC 개발의 한 가지 핵심 변수는 항체가 표적 항원, 즉, 서열번호:3 또는 서열번호:6에 결합시 세포내이입될 수 있다는 점이다. 따라서, 세포내이입된 항체는 접합된 약물을 표적 세포 내로 전달할 수 있다.
세포독성 모이어티는 문헌[Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins: From Pre-Clinical Development to therapeutic applications(118페이지 참고)]에 기재된 것과 같은 임의의 독소일 수 있다. 또한 AD에서 항체 요법의 구체적인 예는 다음과 같다: 솔라네주맙(SOLANEZUMAB; Lilly):
http://www.alzforum.org/therapeutics/solanezumab
간테네르맙(GANTENERUMAB; Roche):
http://www.alzforum.org/therapeutics/solanezumab
다른 예(I상 내지 III상 중인 알츠하이머에 대한 면역요법 모두를 포함)는 다음과 같다:
http://www.alzforum.org/therapeutics/search?fda_statuses=&target_types%5B%5D=170&therapy_types%5B%5D=162&conditions%5B%5D=145&keywords-entry=&keywords=
약물 모이어티는 알파 방출 방사성뉴클레오타이드, 예컨대 225Ac 표지일 수 있다. 이러한 독소는 절단가능한 링커, 예컨대 디설파이드 결합, 하이드라존 링커 또는 펩타이드 링커를 통해, 또는 비절단가능한 링커, 예컨대 SMCC(N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트) 링커를 사용한 티오에테르 결합을 통해 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 연결될 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 매우 높은 특이성으로 T14 펩타이드에 결합한다. 상기 항체는 놀랍게도 생물학적 조직, 심지어 급속 동결된 조직에서 생존할 수 있다. 데이터는 또한 T14-유사 펩타이드(즉, 서열번호:3 또는 이의 변이체 또는 단편)가 신경퇴행성 장애, 예컨대 알츠하이머병을 겪고 있거나 이에 취약한 환자에서 검출될 수 있는 독립적인 생물화학적 독립체로서 존재한다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 발견은 본 발명의 항체가 진단 도구로서, 뿐만 아니라 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 치료적 개입에서 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
따라서, 제5 측면에 따르면, 요법 또는 진단에서 사용하기 위한, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제4의 측면에 따른 항체-약물 접합체가 제공된다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체는 신경퇴행성 장애의 치료, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다.
따라서, 제6 측면에 따르면, 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선하는데 사용하기 위한, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제4 측면에 따른 항체-약물 접합체가 제공된다.
제7 측면에 따르면, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제4 측면에 따른 항체-약물 접합체의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선하는 방법이 제공된다.
용어 "유도체화된"은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 접합체가, 바람직하게는 이의 유도체 또는 변이체를 생산하는데 사용하기 전에 변형될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 유도체화의 예는 페길화된 항체 또는 페길화된 항체 단편, 또는 항체-사이토카인 융합 단백질을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 접합체는 유도체화되지 않을 수 있다.
바람직하게는, 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병; 파킨슨병; 헌팅턴병; 운동 뉴런 질환; 1형, 2형 및 3형 척수소뇌성(Spinocerebellar); 근위축성 측색 경화증(ALS); 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병이다.
본 발명에 따른 항체, 이의 단편, 및 접합체(본원에서 "제제"로 총칭됨)는 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 개선하거나 또는 예방하기 위해 단일요법(예컨대, 항체 또는 항원 결합 이의 단편 단독의 사용, 또는 항체-약물 접합체 단독의 사용)으로 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 제제는 다른 아세틸콜린에스테라제 억제제와 같이 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 개선하거나, 또는 예방하기 위한 공지된 요법에 대한 보조제로서, 또는 이와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제는, 특히, 조성물이 사용되는 방식에 따라, 많은 상이한 형태를 갖는 조성물로 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에게 투여될 수 있는 분말, 정제, 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 마이셀 용액(micellar solution), 경피 패치, 리포좀 현탁액 또는 임의의 다른 적합한 형태의 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약물의 비히클은 그것이 제공되는 대상이 잘 견디고, 바람직하게는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 제제를 전달할 수 있는 것이어야 한다.
본 발명의 제제를 포함하는 약물은 많은 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제가, 예를 들어, 정제, 캡슐 또는 액체의 형태로 경구로 섭취될 수 있는, 조성물 내에 함유될 수 있는 경우, 경구 투여가 필요할 수 있다. 본 발명의 제제 및 약물을 포함하는 조성물은 흡입에 의해(예컨대, 비강내로) 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소 사용을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 크림 또는 연고는 예를 들어 뇌에 인접한 피부에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제 및 약은 또한 지속 방출 또는 지연 방출 장치 내에 혼입될 수 있다. 이러한 장치는, 예를 들어, 피부에 또는 피부 아래에 삽입될 수 있고, 약물은 수주 또는 심지어 수개월 동안 방출될 수 있다. 상기 장치는 치료 부위, 즉, 뇌에 적어도 인접하여 위치할 수 있다. 이러한 장치는 본 발명에 따라 사용된 제제를 이용한 장기간 치료가 필요하고 일반적으로 빈번한 투여(예컨대, 적어도 1일 주사)가 필요할 때 특히 유리할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제제 및 약물은 주사에 의해 혈류 내로 또는 치료를 필요로 하는 부위 내로 직접 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 약물은 뇌에 적어도 인접하여 주사될 수 있다. 주사는 정맥내(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입), 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.
요구되는 항체, 단편, 및 접합체(즉, 제제)의 양은 그의 생물학적 활성 및 생체이용률에 의해 결정되며, 이는 결국 투여 방식, 제제의 생리화학적 특성, 및 그것이 단일요법으로서 또는 조합된 요법으로 사용되고 있는지 여부에 좌우되는 것으로 이해될 것이다. 투여 빈도는 또한 치료되는 대상 내에서의 제제의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다. 투여될 최적 투여량은 본 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있으며, 이는 사용 중인 특정 제제, 약제학적 조성물의 강도, 투여 방식, 및 박테리아 감염의 진행에 따라 달라질 것이다. 치료되고 있는 특정 대상에 좌우되는 부가적인 인자는 대상 연령, 체중, 성별, 식이, 및 투여 시간을 포함하는 투여량을 조절할 필요성을 초래할 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 0.001μg/kg 체중 내지 10mg/kg 체중의 1일 용량은 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 개선하거나, 또는 예방하는데 사용될 수 있으며, 이는 제제에 따라 다르다. 더욱 바람직하게는, 제제의 1일 용량은 0.01μg/kg 체중 내지 1mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1μg/kg 내지 100μg/kg 체중, 및 가장 바람직하게는 대략 0.1μg/kg 내지 10μg/kg 체중이다.
제제는 신경퇴행성 장애의 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 1일 용량은 단일 투여(예컨대, 단일 1일 주사)로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 제제는 하루 동안 2회 이상의 투여를 필요로 할 수 있다. 예로서, 제제는 하루 동안 2회 이상 투여를 필요로 할 수 있다. 예로서, 제제는 0.07 μg 내지 700 mg의 2회(치료되고 있는 신경퇴행성 장애의 중증도에 따라 그 이상)의 1일 용량(즉, 70 kg의 체중을 가정함)으로서 투여될 수 있다. 치료를 받고 있는 환자는 깨어날 때 첫 번째 용량을 복용한 다음, 저녁에 두 번째 용량을 복용하거나(2 용량 요법인 경우) 또는 이후에 3 또는 4시간 간격으로 복용할 수 있다. 대안적으로, 반복된 용량을 투여할 필요 없이 환자에게 본 발명에 따른 제제의 최적 용량을 제공하기 위해 서방형 장치가 사용될 수 있다. 공지된 절차, 예컨대 약제학적 산업에 의해 통상적으로 이용되는 절차(예컨대, 생체내 실험, 임상 시험 등)가 본 발명에 따른 제제의 특정 제형 및 정확한 치료 요법(예컨대 제제의 1일 용량 및 투여 빈도)을 형성하는데 사용될 수 있다.　
본 발명의 제8 측면에서, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제4 측면에 따른 항체-약물 접합체; 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 항-신경퇴행성 질환 조성물, 즉, 알츠하이머병과 같이, 대상에서 신경퇴행성 장애의 치료적 개선, 예방 또는 치료에 사용되는 약제학적 제형이다.
항체 또는 기능적 이의 단편, 펩타이드 또는 핵산은 유도체화되지 않을 수 있다.
본 발명은 또한 제9 측면에서, 제8 측면에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위한 공정, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에서 정의된 바와 같은 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제4 측면에서 정의된 바와 같은 항체-약물 접합체를 약제학적으로 허용가능한 비히클과 조합하는 단계를 포함하는 공정을 제공한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 측면과 관련하여 정의될 수 있다.
"대상"은 척추동물, 포유동물, 또는 가축일 수 있다.　따라서, 본 발명에 따른 약물은 임의의 포유동물, 예를 들어 가축(예컨대, 말), 애완동물을 치료하는데 사용될 수 있거나, 또는 다른 수의학 분야에서 사용될 수 있다.　 가장 바람직하게는, 대상은 인간이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "치료적 유효량"은 대상에게 투여될 때, 신경퇴행성 질환을 치료하는데 필요하거나, 또는 원하는 효과를 야기하는 제제의 양이다.
예를 들어, 사용된 항체 또는 이의 단편의 치료적 유효량은 약 0.001 ng 내지 약 1 mg, 및 바람직하게는 약 0.01 ng 내지 약 100 ng일 수 있다. 항체 또는 단편의 양은 약 0.1 ng 내지 약 10 ng, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 ng to 약 5 ng의 양인 것이 바람직하다. 　
본원에 언급된 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 비히클"은 약제학적 조성물을 제형화하는 유용한 것으로 본 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물의 조합이다.
일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 비히클은 고체일 수 있고, 조성물은 분말 또는 정제의 형태일 수 있다.　고체 약제학적으로 허용가능한 비히클은 또한 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제, 또는 정제-붕해제로서 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.　 비히클은 또한 캡슐화 물질일 수 있다.　분말에서, 비히클은 본 발명에 따른 미분된 활성 제제와 혼합된 미분된 고체이다.　 정제에서, 활성 제제는 적합한 비율로 필요한 압축 특성을 갖는 비히클과 혼합되고 원하는 모양 및 크기로 압축될 수 있다. 분말 및 정제는 바람직하게는 최대 99%의 활성 제제를 함유한다.　적합한 고체 비히클은, 예를 들어 인산칼슘, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저용융 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다.　또 다른 구현예에서, 약제학적 비히클은 겔일 수 있고, 조성물은 크림 등의 형태일 수 있다.
그러나, 약제학적 비히클은 액체일 수 있고, 약제학적 조성물은 용액의 형태이다.　 액체 비히클은 용액, 현탁액, 유화액, 시럽, 엘릭서 및 가압 조성물을 제조하는데 사용된다.　　본 발명에 따른 제제는 약제학적으로 허용가능한 액체 비히클, 예컨대 물, 유기 용매, 둘의 혼합물 또는 약제학적으로 허용가능한 오일 또는 지방에서 용해되거나 현탁될 수 있다.　액체 비히클은 다른 적합한 약제학적 첨가제, 예컨대 가용화제, 유화제, 완충액, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정제 또는 삽투압 조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예는 물(상기와 같은 첨가제, 예컨대, 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 부분적으로 함유), 알콜(1가 알콜 및 다가 알코올 포함, 예컨대, 글리콜) 및 이들의 유도체, 및 오일(예컨대, 분별화 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다.　 비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 유성 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다.　 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에서 유용하다.　 가압 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 추진체일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약제학적 조성물은, 예를 들어, 근육내, 척추강내, 경막외, 복강내, 정맥내 및 특히 피하 주사에 의해 이용될 수 있다.　 상기 제제는 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 멸균가능한 매질을 사용하여 투여시에 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.　
본 발명의 제제 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만드는데 충분한 식염수 또는 글루코스), 담즙산 염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80(에틸렌 옥사이드와 공중합된 소르비톨의 올레에이트 및 그의 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 제제는 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다.　 경구 투여에 적합한 조성물은 고체 형태, 예컨대 환제, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 및 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽, 엘릭서, 및 현탁액을 포함한다.　 비경구 투여에 적합한 형태는 멸균 용액, 유화액, 및 현탁액을 포함한다.　
본원에 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 T14 펩타이드(즉, 서열번호:3), 및 특히 에피토프로서 작용하는 C-말단 서열 -VHWK(즉, 서열번호:6)에 매우 특이적이거나 선택적이다. 상기 항체는 놀랍게도 생물학적 조직, 심지어 급속 동결된 생물학적 조직에서 생존가능하다. 또한, 데이터는 T14-유사 펩타이드가 독립적인 생화학적 독립체로서 존재한다는 것을 보여준다. 이러한 발견은 상기 검출가능한 서열(즉, -VHWK 에피토프)이 진단 도구로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
따라서, 제10 측면에서, 신경퇴행성 장애를 검출하거나 진단하기 위한 바이오마커로서 사용하기 위한, 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편이 제공된다.
바람직하게는, 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편은 항체 또는 항원-결합 단편, 바람직하게는 제1 측면 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 결합될 수 있는 에피토프로서 작용한다.
바람직하게는, 바이오마커로서 사용된 서열번호:3의 변이체 또는 단편은 서열번호:6을 포함하거나 구성된다.
본 발명은 또한 신경퇴행성 질환을 겪고 있는 환자를 진단하기 위한 키트를 제공한다.
따라서, 본 발명의 제11 측면에 따르면, 신경퇴행성 장애를 겪고 있는 대상, 또는 이에 대한 소인을 진단하기 위한, 또는 대상의 병태의 예후를 제공하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 시험 대상으로부터 샘플 내에 존재하는 항원의 농도를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하고, 여기서 검출 수단은 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 샘플 내의 항원의 존재는 대상이 신경퇴행성 장애를 겪는다는 것을 시사한다.
제12 측면에 따르면, 신경퇴행성 장애를 겪고 있는 대상, 또는 이에 대한 소인을 진단하기 위한, 또는 대상의 병태의 예후를 제공하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상으로부터 수득된 샘플 내에 존재하는 항원의 농도를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 검출은 선택적으로 유도체화된, 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 달성되며, 여기서 샘플 내의 항원의 존재는 대상이 신경퇴행성 장애를 겪는다는 것을 시사한다.
유리하게도, 본 발명의 항체는 개체가 현재 가능한 것보다 훨씬 조기에 신경퇴행성 장애(예컨대, 알츠하이머병 또는 파킨슨병)가 생길 가능성이 더 높은지 결정하는데 사용될 수 있으며, 이로써 조기 치료가 제공될 수 있거나, 또는 이들을 돕기 위해 제공된 정보가 생활방식 및 식이요법에 관한 정보에 입각한 더 많은 결정을 내릴 수 있게 한다. 또한, 신경퇴행성 장애의 조기 진단, 또는 대상이 신경퇴행성 장애가 생길 수 있는 위험성의 조기 검출은 의사가 약물을 처방하는데 큰 도움을 줄 것이다.
바람직하게는, 항원은 서열번호: 3, 더욱 바람직하게는 서열번호:5, 및 가장 바람직하게는 서열번호:6을 포함하거나 구성된다.
바람직하게는, 샘플은 생물학적 샘플을 포함한다. 샘플은 단백질이 수득될 수 있는 대상으로부터 수득될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 샘플은 뇌, 예를 들어 피질, 청색반점 또는 해마를 포함할 수 있다.
도 18-20은 상기 항체가 놀랍게도 CSF에서 T14에 결합한다는 것을 보여준다. 따라서, 바람직하게는, 샘플은 뇌척수액(CSF)을 포함한다.
샘플은 혈액, 소변, 조직 등을 포함할 수 있다.
도 23은 상기 항체가 놀랍게도 혈액 자체에서 T14에 결합한다는 것을 보여준다. 따라서, 가장 바람직하게는, 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 혈액은 정맥혈 또는 동맥혈일 수 있다.
키트는 추출된 샘플을 받기 위한 샘플 수집 용기를 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 즉시 T14 수준에 대해 분석될 수 있다. 대안적으로, 혈액 샘플은 T14 분석이 수행되기 전에 저온에서, 예를 들어 냉장고에서 보관될 수 있거나 심지어 동결될 수 있다. T14의 검출은 전혈에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 혈액 샘플은 혈청을 포함한다. 바람직하게는, 혈액 샘플은 혈장을 포함한다.
혈액은 T14 분석이 수행되기 전에 추가로 처리될 수 있다. 예를 들어, 항응고제, 예컨대 시트레이트(예컨대 구연산 나트륨), 히루딘, 헤파린, PPACK, 또는 불화나트륨이 첨가될 수 있다. 따라서, 샘플 수집 용기는 혈액 샘플이 응고되는 것을 방지하기 위해 항응고제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 혈액 샘플은 분석에 사용될 수 있는 혈장 또는 혈청을 제조하기 위해 원심분리되거나 여과될 수 있다. 따라서, T14가 혈장 또는 혈청 샘플에서 분석되는 것이 바람직하다. T14 농도는 대상으로부터 채취한 혈청 샘플 또는 혈장 샘플로부터 시험관내에서 측정되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 키트 또는 방법은 샘플 내에 T14-양성 세포(즉, 서열번호:3 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 세포)의 존재 또는 부존재를 확인하거나, 또는 샘플 내에 이의 농도를 결정하는데 사용된다. 검출 수단은 샘플 내의 T14-양성 세포의 존재 및/또는 부존재를 검출하기 위해 조정된 분석을 포함할 수 있다. 상기 키트 또는 방법은 분석이 비교될 수 있는 양성 대조군 및/또는 음성 대조군의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 신경퇴행성 장애를 겪고 있거나(즉, 양성 대조군) 겪지 않는 개체의 샘플에서 T14-양성 세포의 농도에 대한 참조를 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출될 수 있는 표지를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "표지"는 항체, 또는 이의 단편에 부착될 수 있는 모이어티를 의미할 수 있다. 모이어티는, 예를 들어, 치료 또는 진단 절차에 사용될 수 있다. 치료 표지는, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 부착되고 T14 펩타이드(즉, 서열번호:3) 또는 이의 단편, 예컨대 서열번호:5 또는 서열번호: 6에 대한 항체의 결합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 모이어티를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:3, 또는 이의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:2(즉, T30)에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4(즉, T15) 또는 베타-아밀로이드에 결합하지 않는다.
진단 표지는, 예를 들어, 분석 방법에 의해 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다. 분석 방법은, 예를 들어, 정성적 및 정량적 절차를 포함한다. 정성적 분석 방법은, 예를 들어, 면역조직화학 및 간접 면역형광을 포함한다. 정량적 분석 방법은, 예를 들어, 면역친화성 절차, 예컨대 방사성면역분석, ELISA 또는 FACS 분석을 포함한다. 분석 방법은 또한 시험관내 및 생체내 영상화 절차 모두를 포함한다. 분석 수단에 의해 검출될 수 있는 진단 표지의 특정 예는 효소, 방사성동위원소, 형광색소, 화학발광 마커, 및 바이오틴을 포함한다.
표지는 본 발명의 항체, 또는 이의 단편에 직접 부착될 수 있거나, 또는 본 발명의 분자에 특이적으로 결합하는 2차 결합 제제에 부착될 수 있다. 이러한 2차 결합 제제는, 예를 들어, 2차 항체일 수 있다. 2차 항체는 다클론 또는 단클론일 수 있고, 인간, 설치류 또는 키메라 기원일 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 약물 발견 공정에서 새로운 치료 화합물을 위한 스크리닝의 일부로서 사용될 수 있는다고 생각한다. 예를 들어, 독성 펩타이드 T14를 검출하기 위한 방법 및 분석은 후보 화합물 스크리닝(예컨대, HTS 및 선택적 라이브러리 스크리링, 및 구조 기반 디자인), 효과적인 치료를 제공할 수 있는 결과를 확인하는데, 뿐만 아니라 약제의 "선도물질 도출(hit to lead)"의 일부로서 2차 분석(예컨대, 시험관내 및 생체외 2차 분석)에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제13 측면에서, 장애의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한 치료 화합물을 확인하기 위한, 약물 발견 스크리닝에서의 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도가 제공된다.
제14 측면에서, T14 펩타이드(서열번호: 3) 합성 또는 활성을 억제하는 제제를 확인하기 위한, 비색적으로 또는 형광성으로 표지된 T14 펩타이드(서열번호: 3)의 생체외 용도가 제공된다.
제15 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한 후보 제제를 확인하기 위한 방법이 제공된다:
(i) 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재하에 세포를 시험 제제와 시험관내 또는 생체외에서 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 T14 펩타이드(서열번호: 3)의 존재, 농도 또는 활성을 검출하는 단계로서, 여기서 대조군과 비교하여 T14 펩타이드의 부존재, 또는 T14 펩타이드 합성, 농도 또는 활성의 감소는 상기 제제가 적절한 보체 활성을 특징으로 하는 질환의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 후보라는 지표이다.
제15 측면에서, 하기를 포함하는, T14 펩타이드(서열번호: 3) 합성 또는 활성을 억제하는 제제를 확인하기 위한 분석이 제공된다:
(i) 세포 기반 발현 시스템;
(ii) 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
(iii) 적어도 하나의 시험 제제를 상기 발현 시스템과 접촉시키도록 구성된 용기.
제16 측면에서, 하기를 포함하는, T14 펩타이드(서열번호: 3) 합성 또는 활성을 조절하는 제제를 확인하기 위한 방법이 제공된다:
(i) 제1 또는 제3 측면에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재하에 세포를 시험 제제와 시험관내 또는 생체외에서 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 T14 펩타이드(서열번호: 3)의 존재, 농도 또는 활성을 검출하는 단계로서, 여기서 대조군과 비교하여 T14 펩타이드의 부존재, 또는 T14 펩타이드 합성, 농도 또는 활성의 변경은 상기 시험 제제가 T14 펩타이드(서열번호: 3) 합성 또는 활성을 조절한다는 지표이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명의 분석 및 방법에서 독성 펩타이드 T14(서열번호:3)의 존재, 농도 또는 활성을 검출하는데 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 항체가 시험 화합물의 존재에 반응한 T14 또는 그의 농도 또는 활성의 증가를 검출하면, 시험 화합물이 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 요법으로서 유용한 후보가 아님을 나타낼 것이다. 반대로, 독성 T14가 항체에 의해 검출되지 않거나, 그것이 시험 화합물의 존재하에 그의 농도 또는 활성의 감소를 검출하면, 이것은 시험화합물이 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 유용한 치료제라는 것을 나타낼 것이다. 상기 방법 및 분석은 T14 펩타이드의 합성 활성을 감소시키거나 예방하는 제제를 확인하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 임의의 방법은 시험관내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 상기 접촉은 실질적으로 무세포 시스템에서 수행될 수 있다. 상기 방법 중 임의의 방법은 세포 기반 시스템에서 및/또는 비인간 포유동물에서 생체내에서 동일한 활성에 대한 양성 표시를 나타내는 제제를 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 이의 변이체 또는 단편을 포함하는, 본원에 언급된 임의의 서열의 실질적으로 아미노산 또는 핵산 서열을 포함하거나 이루어지는, 임의의 핵산 또는 펩타이드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열", "변이체" 및 "단편"은 본원에 언급된 서열 중 어느 하나의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열과 적어도 40% 서열 동일성, 예를 들어 서열번호: 3(즉, T14 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호:6(즉, VHWK 에피토프) 등으로 확인된 서열과 40% 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
언급된 서열 중 어느 것에 대해 50% 초과, 더욱 바람직하게는 65%, 70%, 75% 초과의 서열 동일성, 및 더욱더 바람직하게는 80% 초과 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열이 또한 구상된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열은 본원에 언급된 서열 중 어느 것과 적어도 85% 동일성, 더욱 바람직하게는 본원에 언급된 서열 중 어느 것과 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
숙련된 기술자는 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 방법을 이해할 것이다. 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하기 위해, 2개의 서열의 정렬을 먼저 준비한 다음, 서열 동일성 값을 계산해야 한다. 2개의 서열에 대한 백분율 동일성은 다음에 따라 상이한 값을 가질 수 있다: (i) 서열을 정렬하는데 사용된 방법, 예를 들어, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램에서 구현됨), 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ii) 정렬 방법에 의해 사용된 파라미터, 예를 들어, 국소 대 전역 정렬, 사용된 쌍-점수 행렬(pair-score matrix)(예컨대, blosum62, pam250, gonnet 등), 및 갭-페널티(gap-penalty), 예컨대, 기능적 형태 및 상수.
정렬 후, 2개의 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 많은 상이한 방법이 있다. 예를 들어, 동일성의 수를 하기로 나눌 수 있다: (i) 가장 짧은 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-갭 위치의 수; 또는 (iv) 오버행을 제외한 등가 위치의 수. 또한, 백분율 동일성은 또한 길이에 크게 의존한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 한 쌍의 서열이 짧을수록, 우연히 일어날 것으로 예상될 수 있는 서열 동일성은 높아진다.
따라서, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 과정임이 이해될 것이다. 대중적인 다중 정렬 프로그램 ClustalW(Thompson 등, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson 등, 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)는 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하기 위한 바람직한 방법이다. ClustalW를 위한 적합한 파라미터는 하기와 같을 수 있다: DNA 정렬의 경우: 갭 오픈 패널티(Gap Open Penalty) = 15.0, 갭 연장 패널티(Gap Extension Penalty) = 6.66, 및 매트릭스 = 동일성. 단백질 정렬의 경우: 갭 오픈 패널티 = 10.0, 갭 연장 패널티 = 0.2, 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬의 경우: ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 본 기술분야의 숙련가는 최적 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 파라미터를 변경할 필요가 있을 수 있음을 인지할 것이다.
바람직하게는, 이후 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 사이의 백분율의 계산은 (N/T)*100로서 상기 정렬로부터 계산될 수 있고, 여기서 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 개수이고, T는 오버행을 제외한 갭을 포함하는 비교된 위치의 총 개수이다. 따라서, 2개의 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하기 위한 가장 바람직한 방법은 (i) 적합한 파라미터의 세트, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 적합한 파라미터의 세트를 사용하여 clustalw 프로그램를 사용하여 서열 정렬을 준비하는 단계; 및 (ii) 하기 식 내로 n 및 t의 값을 삽입하는 단계를 포함한다: 서열 동일성 = (N/T)*100.
유사한 서열을 확인하기 위한 대안적인 방법은 본 기술분야의 숙련가에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 조건하에 본원에 나타난 임의의 핵산 서열, 또는 이들의 보체에 혼성화하는 서열에 의해 코딩될 것이다. 엄격 조건은 뉴클레오타이드가 대략 45℃에서 3x 염화나트륨/구연산 나트륨(SSC)에서 필터 결합된 DNA 또는 RNA에 혼성화한 후 대략 20-65℃에서 0.2x ssc/0.1% SDS에서의 적어도 1회 세척하는 것을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩타이드는 본원에 나타난 서열과 적어도 1, 그러나 5, 10, 20, 50 또는 100 미만의 아미노산이 상이할 수 있다.
유전 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 임의의 핵산 서열은 이에 의해 코딩된 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 변경 또는 변화되어 이의 기능적 변이체를 제공할 수 있음이 분명하다. 적합한 뉴클레오타이드 변이체는 서열 내의 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 가져 침묵 변화를 생성하는 것이다. 다른 적합한 변이체는 상동성 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 그것이 치환하는 아미노산에 유사한 생물물리학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존적 변화를 야기하는 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것이다. 예를 들어, 작은 비극성, 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 큰 비극성, 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 따라서 어떤 아미노산이 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는지 이해될 것이며, 숙련된 기술자는 이들 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 알 것이다.
본원(임의의 첨부된 청구범위, 요약 및 도면 포함)에 기재된 모든 특징, 및/또는 이와 같이 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는 상기 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 상기 측면 중 어느 것과 조합될 수 있다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 그리고 본 발명의 구현예가 어떻게 실시될 수 있는지 나타내기 위해, 예로서 첨부된 도면을 참조할 것이다:
도 1은 ELISA에 의한 Pep4(서열번호:7)의 표준 곡선이다;
도 2는 ELISA에 의한 T14(서열번호:3)의 표준 곡선이다;
도 3은 ELISA에 의한 T30(서열번호:2)의 표준 곡선이다;
도 4는 ELISA에 의한 T15(서열번호:4)의 표준 곡선이다;
도 5는 C-말단에 VHWK 모티프(서열번호:6)를 갖는 9, 10, 11, 12, 13 및 14 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 6은 C-말단에 VHWK 모티프가 없는 9, 10, 11, 12, 13 및 14 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 7은 11 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 8은 12 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 9는 13 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 10은 13 아미노산 펩타이드의 ELISA 검출을 나타낸다;
도 11은 본 발명에 따른 항체의 일 구현예를 사용한 ELISA에 의한 AChE 분자의 검출을 나타낸다;
도 12는 엘만 분석(Ellman assay)에 의해 결정된 AChE 단독 및 본 발명에 따른 항체의 일 구현예와 조합된 AChE의 활성을 나타낸다;
도 13은 엘만 분석에 의해 결정된 AChE 단독 및 본 발명에 따른 항체의 일 구현예와 조합된 AChE의 활성을 나타낸다;
도 14는 엘만 분석에 의해 결정된 AChE 단독 및 본 발명에 따른 항체의 일 구현예와 조합된 AChE의 활성을 나타낸다;
도 15는 랫트 균질액의 상이한 희석에서 T14-유사 펩타이드의 검출을 나타낸다;
도 16은 mg 총 단백질당 μg T-14 유사 펩타이드로서 표현된, 인간 뇌 대조군 및 AD을 나타낸다. AD 샘플은 P=0.03에서 유의하게 더 높은 농도를 나타낸다;
도 17은 T14에 대한 항체의 특이성의 확인을 나타낸다. 히스토그램은 최종 K 잔기가 첨가되지 않은 100 nM 외인성 T14, T30, T15, 아밀로이드 및 T14에 대한 반응을 나타낸다. 모든 경우에 n = 3이다. 항체에 대한 명확한 반응은 T14에서만 나타난다;
도 18은 10개의 연령이 일치한 대조군 및 AD 환자의 쌍에 대한 웨스턴 블롯(WB) 데이터를 나타내며, 이는 이들의 환자 코드, 성별, 연령, CERAD 상태 및 브라크(Braak) 병기를 나타낸다. CSF에서의 T14 수준은 본 발명의 항체의 구현예를 사용한 웨스턴 블롯팅을 사용하여 시험된 AD의 사례 대부분(80%)에서 증가하며, 따라서 가설을 입증하고 T14를 바이오마커로서 확인하였다;
도 19는 본 발명의 항체의 구현예를 사용하여 AD 환자의 CSF에서 증가된 T14 수준을 나타내지만, Aβ는 변하지 않은 상태를 유지한다. 도 19(A): 대표적인 웨스턴 블롯에서 대조군 및 AD 환자의 사후 CSF에서 T14 발현. 응집으로 인해, T14(Bond, Zimmerman 등 2009, Cottingham, Hollingshead 등 2002)는 더 느린 전기영동 이동도(50 KDa) 대조군: 남성, 80세, CERAD 정상, 브라크 I. AD: 남성, 81세, CERAD 확정, 브라크 V를 갖는 것으로 나타나며; 도 19(B): 대표적인 웨스턴 블롯에서 대조군 및 AD 환자의 사후 CSF에서 Aβ 발현. 대조군: 남성, 80세, CERAD 정상, 브라크 I. AD: 남성, 81세, CERAD 확정, 브라크 V. 좌측에서 우측으로: 대조군: 여성, 82세, CERAD 정상; AD: 여성, 81세, CERAD 확정, 브라크 VI; 대조군: 남성, 83세, CERAD 정상, 브라크 I/II; AD: 남성, 79세, CERAD 확정, 브라크 V/VI; 도 19(C): T14 발현의 정량화; 및 도 19(D): 대조군(n=10) 및 AD 환자(n=10)의 사후 CSF에서 Aβ 발현. T14 수준을 Blot-FaststainTM(Collins 등 2015)에 의해 검출된 총 단백질 발현에 대해 정규화하고 대조군의 평균 +/- SEM의 백분율로 나타내었다. P<0.0001에서의 유의한 수준 차이가 ****로 표시되어 있다;
도 20은 본 발명의 항체의 구현예를 사용하여 T14 수준이 3개의 뇌 영역과 비교하여 대조군 및 AD 환자의 CSF에서 일관되게 더 높다는 것을 보여준다. 그러나, 이것은 Aβ의 경우는 아니다. T14 수준은 CSF 및 3개의 뇌 영역(CC: 대뇌 피질, LC: 청색반점, HC: 해마)에서 측정되었다. 뇌 영역 및 CSF에서 T14의 양은 A) 대조군 및 B) AD 환자 모두의 CSF에서 T14 양의 %로서 표현되었다. C) 대조군 및 D) AD 환자에 대해 Aβ 수준이 상기와 동일한 방식으로 측정되고 표현된다. E) 이후, CSF에서 T14 및 Aβ의 상대적 양(검은색 막대)을 함께 플롯팅하였다;
도 21은 T14 단량체 집단은 변하지 않으면서 T14 응집이 기하급수적으로 증가한다는 것을 보여준다. 외인성 T14 스톡 용액(20mM) 용액은 증류수에서 재현탁에 의해 생성되었다. 이후, 스톡 용액을 PBS(pH 10.5)를 이용하여 작업 스톡 용액(400μM)으로 희석하였다. PBS(pH 5)를 첨가하여 200μM의 최종 농도를 만들어 응집을 개시하였고, 이를 25℃에서 0, 1, 2, 3, 4시간 동안 인큐베이션하였다. 또한, 상기 작업 스톡을 PBS(pH 10.5)로 200μM로 희석하고 25℃에서 4시간 동안 인큐베이션함으로써 T14 단량체 대조군을 생성하였다. pH 5 및 pH 10.5 PBS를 혼합하고 25℃에서 4시간 동안 인큐베이션함으로써 추가적인 비펩타이드 대조군을 생성하였다. 이후, WB(A) 및 ELISA(B)를 상기 T14 응집 샘플에 대해 수행하고 정량화하였다;
도 22는 임상 뇌 조직(피질 및 해마)에서의 T14 수준이 본 발명의 항체의 구현예를 사용하여 AD 뇌에서 유의하게 증가된다는 것을 보여준다;
도 23은 여과된 인간 혈청(30 kDa MWCO)이 본 발명의 항체의 구현예를 사용하여 T14 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 검출가능한 수준인 T14의 존재를 나타낸다는 것을 보여준다;
도 24는 항체를 사용한 면역조직화학 결과를 나타내며, 이는 진행된 알츠하이머 환자의 글로벌 뉴런에서 T14의 존재를 나타낸다;
도 25는 비신경학적 대조군 및 중증 AD 모두에서 항-T14 항체 절편을 이용한 인간 중뇌의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.
실시예
'테일드(tailed)' 아세틸콜린에스테라제(T-AChE)는 시냅스에서 발현되며, 본 발명자들은 그의 C-말단으로부터 절단될 수 있는 2개의 펩타이드, 즉 "T30"(30 아미노산 길이)로 알려진 다른 펩타이드 내에 있는 "T14"(14 아미노산 길이)로 불리는 펩타이드를 확인하였고, 이들 모두는 β-아밀로이드의 동등한 영역에 대해 강한 서열 상동성을 갖는다. "T15"로 지칭되는 추가의 펩타이드는 T30의 마지막 15 아미노산 잔기에 해당한다.
선형 펩타이드 T14의 아미노산 서열은 AEFHRWSSYMVHWK [서열번호: 3]이다.
선형 펩타이드 T30의 아미노산 서열은 KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL [서열번호: 2]이다. T30의 마지막 15 아미노산 잔기에 해당하는 선형 펩타이드 T15의 아미노산 서열은 NQFDHYSKQDRCSDL [서열번호: 5]이다.
AChE C-말단 펩타이드 "T14"는 그의 다양한 비가수분해 작용을 담당하는 AChE 분자의 중요한 부분인 것으로 확인되었다. 합성 14 아미노산 펩타이드 유사체(즉, "T14"), 및 그 뒤에 T14가 삽입된 더 크고 더 안정하며 더 강력한 아미노산 서열(즉, "T30")은 '비콜린성' AChE에 대해 보고된 것과 대등한 작용을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 T14의 아미노산 서열, 즉, AEFHRWSSYMVHWK [서열번호:3]에 기초하지만, 말단 알라닌(A) 및 라이신(K) 잔기를 통해 고리화된, 14 아미노산 길이의 사이클릭 T14 펩타이드(즉, "NBP-14")를 이전에 제조하였다. 고리화는 몇 가지 상이한 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, Genosphere Biotechnologies(France)는 상기 선형 펩타이드를 N-말단에서 C-말단 락탐으로 변형시킴으로써 T14의 고리화를 수행하였다. 사이클릭 NBP14를 생성하기 위한 T14의 고리화는 두 가지 말단, 즉, HWK-AEF를 결합시켰다. 본 발명자들은 이전에 사이클릭 NBP-14가 시험관내에서 AChE 및/또는 그의 말단 펩타이드의 비고전적 효과(즉, 그의 효소적 활성에 독립적인 AChE의 효과)를 선택적으로 억제하고, 신경퇴행성 장애를 치료하는데 사용될 수 있음을 보여왔다. NBP14는 α7 니코틴성-수용체에 작용하여 세포를 선형 T14, T30 및 β-아밀로이드 독성으로부터 보호한다. 그것은 또한 선형 T14 및 T30의 독성에 의해 유도된 보상성 AChE 방출을 차단한다. 또한, 단독 투여시, 사이클릭 NBP14는 랫트 뇌 슬라이스에서 Ca2 + 농도에 유의한 효과가 없지만, T30의 효과를 차단한다.
그들의 초기 연구에 기초하여, 본 발명자들은 AChE C-말단 펩타이드 "T14"에 매우 높은 특이성으로 결합하는 항체를 개발하였다. 본 발명자들은 상기 항체가 신경퇴행성 장애를 진단하기 위한 진단 도구로서 높은 신뢰도로 사용될 수 있다는 것을 보였다. 본 발명자들은 또한 상기 항체가 치료에 사용될 수 있다고 생각한다.
물질 및 방법
다클론 항체의 합성
항체를 Genosphere Biotechnologies(Paris, France)의 주문을 받아 합성하였다. 2마리의 뉴질랜드 토끼를 70일 동안 면역원으로서 KLH-펩타이드("Pep4":T14-합텐 CAEFHRWSSYMVHWK - 서열번호. 7)를 4회 면역화하여 사용하였다. 상기 동물을 4회 채혈하고 혈액을 모았다. 이후, 항혈청을 공유결합된 펩타이드-지지체를 갖는 중력 컬럼을 통과시킨 다음, 세척하고, 항체를 산성 완충액에서 용해시키고, 용액을 중화시켰다. PBS 완충액에 대한 추가 투석 및 동결건조로 상기 공정을 완료하였다.
Figure pct00006
T14 항체 조건의 최적화
항체에 대한 제조사의 보고서를 사용하여 최적 조건에서 ELISA 실험을 수행하였다. 상기 보고서에서, 제조사는 항체의 농도와 관련된 광학 밀도(하기 표 참고) 및 이 절차에 사용된 ELISA 프로토콜(하기 프로토콜 참고)을 명시한다.
제조사로부터의 프로토콜:
항원을 웰당 10ug로 EIA 스트립에 코팅하였다. 웰을 200ul PBS 완충액으로 세척하였다.
항혈청을 연속 희석하여, 개별 웰에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 세척하고, 항-토끼 IgG-HRP 접합체를 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 TMB 기질로 15분 동안 발색시켰다. 흡광도를 405nm(2.00AUFS)에서 판독하였다. 색 강도는 항체의 양에 정비례하였다. 흡광도가 면역전 혈청의 흡광도보다 >2배이면 항체는 양성이었다. 면역전 혈청에 대한 배경 흡광도는 0.1 내지 0.3에 도달할 수 있었다.
결론:
본원에 기재된 모든 실험의 경우, 1:1000이 선택된 항체의 희석이었다.
항체를 사용하여 샘플에서 펩타이드의 검출(ELISA)
ELISA 분석을 위한 절차는 하기와 같았다: 표준 곡선 및 샘플을 3반복하여 수행하였다. T14, Pep4, T15 및 아밀로이드의 검출을 위해, 각각 8 나노몰 농도를 ELISA에 사용하였다. 한편, 모티프 결정 실험의 경우, 100 nM의 각 펩타이드 변이체의 오직 하나의 농도만을 사용하였다. 랫트 뇌 샘플 상에서 T14의 검출을 위해, 단백질의 상이한 희석을 사용하였다. 인간 균질액 샘플의 가치로 인해, 이들은 1:160의 희석으로만 사용하였다. 뇌 조직 및 뇌 조직 샘플에서 T14 펩타이드의 결정을 위한 표준 곡선을 PBS 완충액에서 희석하였다. 표준 곡선은 8 내지 100 nM의 T14의 범위였다. 요약하면, 96-웰 면역플레이트(NUNC)를 100μl/웰의 샘플 또는 표준 T14로 코팅하고, 파라필름으로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 흐르는 물로 싱크대 위에서 가볍게 털어 샘플을 제거하고, Tris-완충 식염수 및 트윈 20(TBS-T) 중의 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 200 μl의 차단 용액을 첨가하고 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1μg/ml로 희석된 100 μl의 항체를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 1차 항체를 제거하고 웰을 200 μl의 TBS-T로 3회 세척하였다. 이후, 차단 용액에서 0.1μg/ml로 희석된 100μl의 2차 항체를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였으며; 플레이트를 모든 인큐베이션 동안 파라필름으로 덮었다. 2시간 후, 플레이트를 TBS-T로 4회 세척하였다. 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘의 첨가는 발색 반응을 시작하였다. 상기 반응을 2M H2SO4를 함유하는 정지 용액으로 15-30분 후 정지시키고, 흡광도를 Vmax 플레이트 판독기(Molecular devices, Wokingham, UK)에서 450 nm에서 측정하였다.
AChE 활성을 위한 엘만 분석
AChE 활성의 결과로서 티올 그룹의 존재를 측정하는 엘만 시약을 사용하여 AChE 활성을 측정하였다. G4 실험의 경우, AChE(G4)를 단독으로 또는 NBP-14과 조합하거나 또는 갈란타민과 조합하여 분석하였다. 세포를 세포 생존율 분석과 마찬가지로 실험 전날 도말하였다. 세포를 상이한 농도의 NBP-14(0.1-100 μM) 및 T30, T14 및 Aβ 10 μM 단독 또는 NBP-14(0.1 및 0.7 μM)과 조합하여 처리하였다. 처리 후, 각 처리의 상층액(perfusate)을 수집하고 각 조건의 25 μL를 새로운 평바닥 96 웰 플레이트에 첨가한 후 175 μl의 엘만 시약(용액 A: KH2PO4 139mM 및 K2HPO4 79.66mM, pH 7.0; 용액 B(기질): 요오드화 아세틸티오콜린 11.5mM; 용액 C(시약): 5, 5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 8mM 및 NaHCO3 15mM)을 첨가하였다. 엘만 시약은 비율 33(A):3(B):4(C)으로 3개의 용액의 혼합물로서 제조하였다. 흡광도는 405nm에서 실험 내내 일정한 간격(3, 10, 30 및 60분)으로 측정하였다.
뇌 균질액(랫트 및 인간)의 제조
샘플을 하기와 같이 제조하였다. 뇌 샘플을 칭량한 다음 다운스(dounce)에 넣고 1 mg의 뇌 물질당 1.5μL의 PBS를 첨가하였다. 다운스의 바닥에 있는 뇌 샘플을 "느슨한(loose)" 플런저를 사용하여 적어도 10회 다운스의 바닥까지 쭉 밀어넣음으로써 균질화하였다. "밀착된(tight)" 플런저를 사용하여 물질을 더 균질화하여, 최소 10회 완전 플런지를 확보하였다. 상기 균질화된 샘플을 2 mL 에펜도르프에서 수집하고 4℃에서 냉장된 원심분리기에서 13,000g에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면, 상층액을 준비된 0.5ml 30 KDa MWCO 필터 내로 수집하였다. 상기 샘플을 13,000g에서 30분간 원심분리하고 프로테아제 억제제 칵테일(Roche complete PIC 04693116001)을 여과액에 첨가하였다. 이것을 T14 펩타이드의 ELISA에 사용하였다. 필터를 별도의 마이크로원심분리 튜브 내로 뒤집어 여과되지 않은 샘플 보유물(>30kDa)을 수집하고, 이를 피어스(Pierce) 분석(하기에 기재된 바와 같음)을 사용하여 초기 샘플의 단백질의 농도를 결정하는데 사용하였다.
단백질 결정
Thermo Scientific Pierce 660 nm 단백질 분석은 소 혈청 알부민의 단백질 표준과 비교하여 총 단백질 농도를 신속하게 측정하는(A660 nm), 즉시 사용가능하고 세제 및 환원제와 양립가능한 분석 시약이다. 분석을 위해, PBS에서 1:10으로 희석된 10 마이크로리터의 각 인간 뇌 균질액 샘플을 미세적정 96 웰-플레이트에 첨가한 후 150 마이크로리터의 피어스(Pierce) 분석을 첨가하였다. 5분 인큐베이션 후, 흡광도를 Vmax 플레이트 판독기(Molecular devices, Wokingham, UK)에서 660 nm에서 측정하고 광학 밀도의 결과를 BSA의 표준 곡선에 대해 외삽하여 마이크로리터당 밀리그램을 수득하였다.
데이터의 분석
모든 실험에 대해, 다중 처리 그룹 및 동일한 대조군 간의 비교를 GraphPAD Instat(GraphPAD software, San Diego, CA)를 사용한 일원 분산 분석(ANOVA) 및 터키의 사후 시험(Tukey's post-hoc test)에 의해 수행하였다. 이들 시험은 모든 처리군의 평균을 모든 다른 처리군의 평균과 비교하며; 즉 모든 쌍별 비교 세트에 동시에 적용하고 두 개의 평균 사이의 차이가 허용될 것으로 예상되는 표준 오차를 초과하는지 확인한다. 통계적 유의성은 P 값 < 0.05에서 취하였다. 그래프를 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 플롯팅하였다.
인간 뇌 실험에 대해, 데이터의 분석이 5명의 대조군 및 7명의 알츠하이머 환자의 값의 평균, 및 베셀의 보정(n-1)을 적용한 평균의 표준 오차로서 도면에 나타나 있다. 광학 밀도 판독값을 각 샘플에서 T14의 마이크로그램으로 변환하기 위해, '지수 모델(exponential model)'을 사용하여 외인성 T14를 상이한 공지된 농도의 각각의 판독값에 대해 플롯팅한 보정 곡선을 사용하였다. 마지막으로, 값을 총 단백질과 관련된 T14의 함량(μg/mg)에 대해 표준화하였다.
뇌 샘플의 출처
랫트: 찰스 리버로부터의 35일령의 수컷 위스타(Wistar) 랫트로부터의 신선한 균질화된 전체 뇌.
인간: 토마스 윌리스 옥스퍼드 뇌 수집(Thomas Willis Oxford Brain Collection(c/o Professor Margaret Esiri))에 의해 공급된 급속 동결된 조직으로부터의 중뇌 절편. 윤리 신청서는 인체 조직법, 인체 조직당국 실행 규범 및 사후 조사 및 조직의 사용에 관한 다른 법을 준수한 옥스포드 래드클리프 병원(Oxford Radcliffe Hospital) NHS의 인체 조직 은행에 의해 승인받았다. 구체적으로, 상기 수도관주위 회색질(peri-aqueductal grey)을 갖는 약 5mm의 관상 슬라이스(coronal slice) 및 대뇌다리(cerebral peduncle) 및 등쪽 솔기(dorsal raphe), 적색 핵(red nucleus) 및 3번째 신경핵(third nerve nucleus)을 함유하는 하기 흑색질(substantia nigra).
웨스턴 블롯팅
뇌 샘플 제조
10명의 사후 AD 환자 및 이들의 연령과 일치하는 대조군으로부터의 대뇌 피질, 청색반점, 해마 및 CSF 절편을 존 래드클리프 병원 뇌 은행(Oxford)으로부터 마가레트 에시리(Margaret Esiri) 및 가브리엘 델루카(Gabriele　DeLuca)에 의해 기부받았다. 각 뇌 샘플을 칭량하고 다운스에 넣었다. 1 μg의 뇌 물질마다, 미니 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일(Roche complete PIC 04693116001)을 함유하는 2μl의 PBS(1X)를 다운스에 첨가하고 균질화를 먼저 "느슨한" 플런저를 사용한 후 "밀착된" 플런저를 사용하여 수행하였다. 이후, 샘플을 4℃에서 30분 동안 13,000g 에서 회전시키고 상층액을 취하였다. CSF 샘플의 경우 제조가 필요하지 않았다. 모든 샘플을 -80℃에 보관하였다.
단백질 샘플 농도의 측정
상기 샘플로부터의 단백질 농도를 피어스(Pierce)™ 660nm 단백질 분석(Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 소 혈청 알부민(BSA)의 10 mg/ml 스톡으로부터 연속 희석(0 내지 2 mg/ml)을 제조하였다. 10 μl의 단백질을 투명한 96 웰 플레이트(Greiner)로 옮겨 각 BSA 농도에 대해 3개의 복제물을 제조하였다. 그리고 나서, 샘플을 3개의 농도(1:1, 1:2, 1:10)로 희석하고 각 농도의 3개의 복제물(각 복제물은 10 μl의 샘플을 함유)을 동일한 96 웰 플레이트에 넣었다. 이후, 150 μl 의 피어스 시약을 표준 및 모든 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 서서히 흔들면서 5분간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 660 nm에서 분광광도계(Molecular Devices)에서 판독하였다. 샘플의 단백질 농도를 BSA 표준 곡선으로부터 기울기 및 y-절편을 사용하여 결정하였고, 이 둘은 마이크로소프트 엑셀을 통해 계산하였다.
단백질 샘플의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동
폴리아크릴아마이드 겔(mini-PROTEAN ® TGX stain freeTM 겔, BIO-RAD)을 전기영동 탱크(BIO-RAD, mini-PROTEAN tetra system)에 넣고, 러닝 완충액(25 mM TRIS-염기, pH 8.6, 192 mM 글리신, 0.1% SDS)을 겔 및 탱크 저장조(BioRad)에 첨가하였다. 단백질 샘플을 증류수 및 4x Laemmli 샘플 완충액(최종 농도: 69.5 mM TRIS-HCl pH 6.8, 1.1% LDS, 11.1%(w/v) 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루, BIO-RAD) 및 2.5% 머캅토에탄올(BIO-RAD)과 혼합하여 제조하였다. 샘플 등가 농도의 외인성 T14를 또한 제조하였고, 이는 내인성 T14 펩타이드를 측정하기 위한 양성 대조군으로서 작용하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분간 가열한 다음 얼음에서 냉각시켰다. 샘플 및 양성 대조군을 겔에 로딩하고, 35mV에서 90분 동안 분자량 마커(Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards, BIO-RAD)와 함께 전기영동하였다. 과열을 방지하기 위해 러닝 탱크 안에 얼음 블록을 넣었다.
단백질 샘플의 PVDF 막으로의 이동
스태킹(Stacking) 겔을 잘라내고, 분리 겔을 Mini Transblot Cell(BIO-RAD) 내의 PVDF 이동 막(Thermo Scientific)으로 옮겼다. 요약하면, PVDF 이동 막을 1분간 메탄올에 담군 다음, 2분간 증류수로 담구어 활성화시켰다. 이후, 모든 층을 이동 완충액(20 mM TRIS-염기 pH 8.6, 154 mM 글리신, 0.8% w/v SDS 및 20% 메탄올)로 포화시켰다. 아래에서 위의 순서로 이동 스폰지, 블롯팅 종이, 겔, PVDF 이동 막, 블롯팅 종이, 이동 스폰지로 구성된 이동 샌드위치를 이동 카세트 안에 넣고, 이를 이동 완충액이 채워진 Mini Transblot Cell 안에 삽입하였다. 마지막으로, 200mA에서 90분간 전기영동 이동을 수행하였다. 과열을 방지하기 위해 러닝 탱크 안에 얼음 블록을 넣었다.
PVDF 막의 염색
BLOT-FaststainTM(G-Biosciences, USA)을 사용하여 로딩 대조군으로서 작용하는 총 단백질을 염색하였다(Colins et al 2015). 전기영동 이동 직후, PVDF 이동 막을 부드럽게 흔들면서 희석된 BLOT-FaststainTM fixer 용액(10배)으로 2분 동안 염색하였다. 이후, 상기 막을 부드럽게 흔들면서 희석된 BLOT-FaststainTM 현상액(4배)과 함께 1분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 막을 현상액에 30분 동안 어두운 곳에서 4℃에서 보관하여 단백질 밴드가 최대 강도에 도달하게 하였다. 마지막으로, 상기 막을 냉수로 세척하여 배경을 제거하고 G 박스(Syngene)를 사용하여 영상화하였다. 이후, 상기 막을 따뜻한 탈이온수(40-45℃)를 사용하여 탈염색하고 차단 단계를 준비하였다.
단백질 밴드의 검출
PVDF 이동 막을 5% 탈지분유를 함유하는 TBS(TRIS-완충 식염수, 20 mM TRIS-염기 pH 7.5, 0.5 mM NaCl)에서 1시간 동안 차단한 다음, TTBS(0.05% v/v 트윈-20이 보충된 TBS)에서 각각 7분간 2회 세척하였다. 상기 막을 1% 탈지분유를 함유하는 TTBS에서 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다(표 1). 다음날, 1차 항체를 제거하였다. 상기 막을 TTBS에서 각각 5분 동안 3회 세척한 다음, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 선택된 2차 항체는 사용된 1차 항체의 유형에 좌우된다. 그것은 1% 탈지분유를 함유하는 TTBS에 희석된(작업 농도: 1:1000) HRP에 접합된 염소 항 마우스 2차 항체(a9309, Sigma) 또는 1% 탈지분유를 함유하는 TTBS에 희석된(작업 농도: 1:5000) HRP에 접합된 염소 항 토끼 2차 항체(ab6721, abcam)일 수 있다. 2차 항체 인큐베이션 후, 막을 TTBS에서 5분 동안 3회 세척한 후 TBS에서 최종 10분 세척하였다. 단백질 밴드를 G 박스(Syngene)를 사용하여 검출하였다.
Figure pct00007
단백질 밴드 영상화 및 데이터 분석
PVDF 막을 G 박스(Syngene)에 넣었다. 초점 및 줌 설정을 조정하여 막이 화면의 중앙에서 가장 큰지 확인하였다. ClarityTM Western ECL 기질(BIO-Rad)로부터의 루미놀 및 퍼옥사이드 용액을 동량 혼합하고 막에 적용하였다. 영상을 1분 간격으로 5분 동안 어두운 곳에서 촬영하여 단백질 분자에 대한 최적 신호를 수득하였다. 이후, 분자 사다리에 대한 영상을 얻기 위해 상기 막을 자동 설정을 사용하여 백색광에서 노출시켰다. 이후, 상기 블롯 영상을 image J를 사용하여 분석하였다. 동일한 크기의 박스를 각 레인의 단백질 밴드 주위에 두어, 단백질 강도를 측정하였다. 이후, 배경을 밴드 강도에서 빼고, 결과를 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 소프트웨어에서 분석하였다.
재프로빙(reprobing)을 위한 항체 스트리핑 (stripping)
PVDF 이동 막으로부터의 단백질 신호는 스트리핑될 수 있고 상이한 단백질에 대해 재프로빙될 수 있다. 요약하면, 상기 막을 약한 스트리핑 완충액(200mM 글리신, 3.5mM SDS, 1% v/v 트윈-20, pH 2.2)으로 각각 10분 동안 2회 세척하였다. 이후, 상기 막을 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한 다음, TTBS로 각각 5분간 2회 세척하였다. ClarityTM Western ECL 기질(BIO-Rad)을 상기 막에 첨가하고 잔류 단백질 신호를 확인하기 위해 G 박스(Syngene)를 사용하여 영상화하였다. 만약 잔류 신호가 너무 강하면, 전체 스트리핑 과정을 반복하였다. 이후, 막을 후속 차단 단계 및 1차 항체 프로빙에 대해 준비하였다(상기 참조).
인간 혈청(HS) 제조
HS를 리즈 대학교의 분자 및 세포 생물학 연구소(Institute of Molecular and Cellular Biology)의 나이젤 후퍼(Nigel Hooper) 교수에 의해 제공된 대조군 및 AD 환자의 집단으로부터 얻었다. 상기 샘플은 2008년에 옥스포드 대학의 약리학과의 수잔 그린필드(Susan Greenfield)의 팀의 일원으로서 근무한 전직 후-박사인 아미 할리데이(Amy Halliday)에 의해 분자량 컷오프 fi(MWCO) 필터에 의해 여과되었다. 상기 혈청을 >30 kDa, 30-10 kDa, 및 <10 kDa의 분획으로 여과분리하였다. 이 연구를 위해 30-10 kDa, 및 <10 kDa 부분을 동량으로 다시 합하여 <30 kDa HS에 존재하는 T14의 스펙트럼을 얻었다.
T14 펩타이드 항체에 대한 ELISA
표준 곡선 및 샘플을 3반복으로 수행하였다. 인간 뇌 균질액 샘플을 1:160, 인간 혈청으로 희석하였다. 조직 샘플에서 T14 펩타이드의 결정을 위한 표준 곡선을 PBS 완충액에서 희석하였다. 표준 곡선은 8 내지 100 nM의 T14 범위였다. 요약하면, 96-웰 면역플레이트(NUNC)를 100μl/웰의 샘플 또는 표준 T14로 코팅하고, 파라필름으로 덮고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 흐르는 물로 싱크대 위에서 가볍게 털어 샘플을 제거하고, Tris-완충 식염수 및 트윈 20(TBS-T) 중의 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 200 μl의 차단 용액을 첨가하고 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1μg/ml으로 희석된 100 μl의 항체를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 1차 항체를 제거하고 웰을 200 μl의 TBS-T로 3회 세척하였다. 차단 용액에서 0.1 μg/ml로 희석된 100 μl의 2차 효소-접합된 항체를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고; 상기 플레이트를 모든 인큐베이션 동안 파라필름으로 덮었다. 2시간 후, 플레이트를 TBS-T로 4회 세척하였다. 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘의 첨가는 착색 반응을 시작하였다. 상기 반응을 2 M H2SO4를 함유하는 정지 용액으로 30분 후에 정지시키고, 흡광도를 뇌 균질액의 경우 Vmax 플레이트 판독기(Molecular Devices, Wokingham, UK), 및 인간 혈청의 경우 VersaMax 플레이트 판독기(Molecular Devices, Wokingham, UK)에서 450 nm에서 측정하였다.
T14에 대한 항체를 이용한 인간 및 랫트 뇌 절편의 면역조직화학적 염색
1. 뇌 샘플을 10% 포르말린에서 고정시킨다.
2. 조직 블록을 탈수시키고 파라핀 왁스에 포매시킨다.
3. 각 파라핀-포매된 조직 블록으로부터 6μm 절편을 잘라낸다.
4. 20분 동안 60도에서 베이킹하여 조직을 각 슬라이드 위로 녹인다.
5. 슬라이드를 히스토클리어(histoclear)(3 x 5분)에서 배양하여 왁스를 녹인다.
6. 단계적인(graded) 에탄올 시리즈(10 x dips 100% EToH, 10 x dips 100% EToH, 10 x dips 100% EToH, 10 x dips 90% EToH, 10 x dips 70% EToH)를 사용하여 슬라이드를 수화한다.
7. 슬라이드를 3% 과산화수소에서 30분간 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 ?칭한다.
8. EDTA를 함유하는 pH9 완충액 용액에서 슬라이드를 오토클레이브한다(10분 동안 121도).
9. 슬라이드를 카세트에 올리고 세쿠엔자(sequenzas) 내로 고정시킨다.
10. 슬라이드를 0.05% 트윈 20(TBS/T)을 함유하는 Tris 완충 식염수로 세척한다(2 x 5분).
11. 1차 항-T14 항체를 1시간 동안 적용한다.
12. 슬라이드를 TBS/T로 세척한다(2 x 5분).
13. 호스-래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 2차 항체를 40분 동안 적용한다(Dako에 의해 제공됨, 카탈로그 번호 K5007). 2차 항체는 T14-1차 항체의 가변 영역을 인식한다. 2차 항체는 T14 1차 항체에 결합된 2차 항체에 부착된 색원체(chromogen)의 검출을 가능하게 하는 반응을 촉매하는 효소인 호스-래디쉬 퍼옥시다제에 접합된다. 따라서, 이것은 뇌 절편에서 면역표지된 T14의 검출을 가능하게 한다.
14. 슬라이드를 TBS/T로 세척한다(2 x 5분).
15. 15분 동안 제조사의 지침에 명시된 대로 평평한 상태의 슬라이드에 Impact VIP 퍼옥시다제 기질을 적용한다(Vector Laboratories에 의해 제공됨, 카탈로그 번호 SK-4605).
16. 슬라이드를 TBS/T로 세척한다(2 x 5분).
17. DPX mountant로 슬라이드를 올린다.
모든 인큐베이션은 달리 언급하지 않는 한 실온에서 수행하였다.
결과
실시예 1 - 펩타이드 인식
본 발명자들은 토끼로부터 다클론 항체를 단리하였다. 도 1-4는 1:1000 항체 및 특정 나노몰 농도의 상이한 펩타이드(즉, PEP4, T14, T30 및 T15)를 이용한 용량-반응을 나타낸다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 그의 합성에 사용된 항-펩타이드, 즉, PEP4(CAEFHRWSSYMVHWK - 서열번호:7)를 특이적으로 검출한다. 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 또한 T14(AEFHRWSSYMVHWK - 서열번호: 3)에 특이적으로 결합한다. 그러나, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 T30(KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL - 서열번호:2) 또는 T15(NQFDHYSKQDRCSDL - 서열번호: 5)에 결합하지 않는다. 이것은 검출을 위한 요구사항이, 노출된 특정 말단 아미노산 및 이들이 획득하는 가능한 3차 구조를 기반으로 한다는 것을 의미한다.
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 아밀로이드를 인식하지 못하였다. 이것은 앞서 언급된 바와 같이 항체에 의한 인식은 노출된 아미노산의 상이한 조합에 좌우된다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 다클론 항체의 높은 특이성을 입증하였다.
실시예 2 - 펩타이드 결합 영역
본 발명자들은 일련의 상이한 선형 펩타이드로 결합 실험을 수행함으로써 본 발명의 항체의 면역특이성을 조사한다. 항체의 면역특이성을 결정하는데 사용된 선형 펩타이드의 서열이 표 2 및 3에 나타나 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
도 5에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 펩타이드를 검출할 수 있도록 C-말단에 -VHWK 아미노산 모티프 또는 에피토프(즉, 서열번호:6)의 존재를 특이적으로 필요로 한다. 상기 모티프를 함유하지만, C-말단 K 아미노산이 없는 상기 펩타이드는 도 6에 나타난 바와 같이 상기 항체에 의해 인식되지 않는다. 또한,-VHWK 모티프를 함유하지만 그것이 서열의 말단에 없는 상기 펩타이드는 또한 도 6에 나타난 바와 같이 항체에 의해 인식되지 않는다.
도 7-10은 상이한 11, 12, 13, 및 14-머 선형 펩타이드에 대한 항체의 결합을 나타내며, 일부는 필요한 C-말단 -VHWK 모티프를 갖고, 일부는 이를 갖지 않는다. 명확하게 볼 수 있는 바와 같이, 각각의 펩타이드 1107, 1206, 1305 및 1404 모두는 항체가 강하게 결합하는 C-말단 -VHWK 모티프를 갖는다.
실시예 3 - AChE 인식
도 11에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 아세틸콜린에스테라제(AChE, 즉, "G4")를 검출하고, 도 12-14에 나타난 바와 같이 효소의 최종 활성에 영향을 미치지 않으면서, 그리고 AChE 활성이 항체의 높은 농도에 비해 낮을 때만 유의하게 아세틸콜린의 가수분해 속도를 변화시킨다. 뇌와 신체에서 AChE 활성이 매우 낮고 요법으로서의 임의의 항체가 더 낮은 용량 범위일 것이라는 점을 고려할 때, 효소적 활성을 손상시키는 것으로부터 초래되는 임의의 부작용은 최소화될 수 있다. 더욱이, 상기 항체는 임상적으로 사용되는 약물인 갈란타민과 비교하여 AChE를 대략 15%까지 최대로 차단하며, 이는 활성을 훨씬 더, 즉, 50%까지 억제한다(WO 2015/004430호 참고).
실시예 4 - 랫트 및 인간 조직에서의 검출
랫트 및 인간 샘플로 검출을 수행할 때, 샘플을 30 KDa MWCO 필터로 여과하여 효소의 검출을 방지하는 AChE, 및 샘플에서의 위양성을 제거하였다. 상기 결과는 항체가 두 샘플에서 펩타이드를 어떻게 검출하는지 보여준다. 도 15는 랫트 뇌 균질액에서의 결과를 나타내고, 도 16은 대조군 및 알츠하이머병(AD) 인간 뇌 균질액으로부터의 결과를 나타낸다.
논의
항체의 특이성
다클론 항체는 T14 펩타이드(결정적으로, C-말단 서열, -VHWK)에 매우 특이적으로 입증되었다. 전체 AChE 단백질의 그의 인식은 이 서열이 노출되고 3차 구조에서 접근가능하다는 것을 시사한다. 항체가 선형 T30 펩타이드 단편(내부에 T14가 존재함)을 인식하지 못한다는 사실은 T30 서열의 말단에 라이신(K)이 부존재하여 획득된 3차 구조에서 노출되지 않기 때문인 것으로 여겨진다.
랫트 및 인간 뇌와 같이 복잡한 샘플에서 검출하는 능력
이들 데이터는 항체가 놀랍게도 생물학적 조직, 심지어 급속 동결된 조직에서 생존가능하다는 것과, 단지 간접적 증거에 의해 이전에 제안된 바와 같이 T14-유사 펩타이드가 독립적인 생물화학적 독립체로서 존재한다는 것을 보여준다(Garcia-Ayllon, M. S. 등 Altered levels of acetylcholinesterase in Alzheimer plasma. PloS one 5, e8701, doi:10.1371/journal.pone.0008701(2010); Arendt, T., Bruckner, M. K., Lange, M. & Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development--a study of molecular forms. Neurochemistry international 21, 381-396 (1992)). 가장 주목할만한 것은 대조군 뇌와 비교하여 AD에서 유의한 차이가 검출될 수 있다는 것이다.
검출된 서열의 중요성
이러한 발견은 검출가능한 서열(즉, -VHWK 에피토프), 및 특히 C-말단의 노출된 K 잔기가, 만약 세포독성 모이어티에 결합되면, 항체 자체의 가능한 사용을 포함하여, 진단 도구로서뿐만 아니라 치료적 개입을 위한 표적으로서 사용될 수 있음을 시사한다. 후자의 적용은, 항체가 AChE 효소적 반응의 속도를 감소시킬 수 있지만 AchE에 대한 촉매 속도는 너무 높아서 역치를 초과할 수 있다는 발견에 의해 구속될 수 있으며, 실제로 갈란타민 및 아리셉트와 같은 약물이 그럼에도 불구하고 여전히 임상적으로 사용되고 있는 이유를 설명한다.
실시예 5 -웨스턴 블롯(WB)에 의해 입증된 바와 같이, CSF에서 T14의 검출
본 발명의 항체를 사용하여, 이후 본 발명자들은 뇌척수액(CSF)에서 T14 피브릴 및 Aβ를 비교하였다. 본 발명자들은 T14가 피브릴을 형성하기 때문에 웨스턴 블롯팅에 의해 50 KDa 밴드로서 검출된다는 것을 발견하였다. 이것은 T14 웨스턴 블롯 신호의 증가에 의해 입증된 바와 같이(도 21A 참고), 시간이 경과함에 따라 응집되는 외인성 T14에 의해 더 명확하다.
다음으로 도 18을 참고하면, CSF에서의 T14 피브릴은 웨스턴 블롯팅을 사용하여 지금까지 시험된 10개의 AD 사례 중 8개(80%)에서 증가한다. 10개의 사례를 모두 모았을 때, 이 증가는 대조군과 비교하여 AD 환자에서 약 24%이다(p<0.0001, 도 19C 참조). 흥미롭게도, 10개의 AD 사례 모두를 모았을 때, 대조군 및 AD 환자 사이에는 CSF의 Aβ 수준의 변화가 없었다(도 19D 참고). 볼 수 있는 바와 같이, T14 및 Aβ 수준은 대조군 환자의 CSF에서 대등하였다. 그러나, 놀랍게도, T14 수준은 AD 환자에서 증가하는 반면 Aβ 수준은 변하지 않은 상태를 유지한다(도 20D 참고). 따라서, 본 발명자들은 CSF에서 T14가 Aβ보다 더 우수하고 더 강력한 AD 진단 바이오마커이며, 상기 질환의 조기 검출에 사용될 수 있음을 명백히 보여주었다.
이후, 본 발명자들은 CSF 및 3개의 뇌 영역(피질, 청색반점, 및 해마) 사이에서 T14 피브릴 및 Aβ를 비교하였다. 본 발명자들은 T14 수준이 대조군 AD 환자 모두에 대해 시험된 3개의 뇌 영역과 비교하여 CSF에서 더 높다는 것을 보여주었으며, 이는 T14가 CSF 내로 방출되고 그 곳에서 응집된다는 것을 시사한다(도 20A 및 20B 참고). 대조적으로, 본 발명자들은 Aβ 수준이 대조군 환자에 대한 CSF와 비교하여 3개의 뇌 영역(피질, 청색반점, 해마)에서 더 높다는 것(도 20C 참고)과, 대조군 환자에 대해 피질, 청색반점 및 CSF 사이에 Aβ 수준의 유의한 차이가 없다는 것(도 20D 참고)을 관찰하였다. 또한, Aβ 수준은 AD 환자에 대해 CSF보다 해마에서 더 낮다(도 20D 참고).
따라서 CSF에서의 아밀로이드는 T14만큼 일관되게 AD를 반영하지 않음이 분명하다. T14 수준은 뇌 조직보다 CSF에서 훨씬 더 높으며, 이는 T14가 뇌 조직에서 아밀로이드처럼 응집되기보다는 주로 긴 범위 신호전달을 위해 유리 분자로서 방출된다는 것을 시사한다. 따라서, T14는 AD에서 아밀로이드보다 더 우수한 바이오마커이며, 파킨슨병, 뿐만 아니라 T14는 알츠하이머병에 대한 민감한 지표로서 명확한 잠재성이 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 T14 수준이 상승되고 검출하기 쉬운 시험된 뇌 영역에서뿐만 아니라 CSF에서 T14를 검출하는데 명확하게 사용될 수 있다.
실시예 6 - 뇌 샘플에서 T14 단량체에 대한 ELISA 데이터
실시예 5에 이어서, 본 발명자들은 다음으로 T14의 C-말단에 특이적인 다클론 항체를 사용하여 부가적인 뇌 샘플에서 T14 단량체를 검출하였다. 본 발명자들은 뇌 피질 및 해마에서 T14 수준을 비교하였다. 샘플을 30kDa MWCO 필터를 사용하여 여과하여 AChE 및 알부민과 같은 더 큰 단백질을 제거하고, 이에 의해 배경 신호를 감소시켰다.
도 22에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 이들은 대조군 및 AD 환자의 연령이 일치하는 4개의 쌍을 비교한 연구에서 T14 수준이 AD 뇌의 피질 및 해마 모두에서 유의하게 상승된다(단백질의 mg당)는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 T14가 알츠하이머병에서의 손상과 관련된 것으로 널리 알려진 뇌 영역에서 증가된다는 것을 보여주었다.
실시예 7 - 대조군 및 AD 인간 혈청에서 T14의 수준의 비교
실시예 5 및 6으로부터, T14가 본 발명의 항체를 사용하여 뇌 및 CSF에서 용이하게 검출될 수 있음이 분명하지만, 살아있는 환자로부터 뇌 및 CSF 샘플을 수득하는 것은 매우 침습적이며 위험한 일이다. 따라서, 본 발명자들은 장기간 -80℃에서 보관된 인간 혈청(HS) 샘플에서 상기 항체를 사용하여 T14를 검출하는 가능성을 조사하였다. 상기 연구의 목적은 처리될 수 있는 HS의 더 신선한 샘플을 사용하기 위한 ELISA를 최적화하기 위해 이 샘플을 사용하는 것이었다. 상기 샘플은 AChE 및 알부민과 같은 더 큰 단백질을 제거하여 배경 신호를 감소시키기 위해 30kDa MWCO 필터를 사용하여 여과되었다.
도 23을 참조하면, 대조군 및 AD 환자 HS의 연령이 일치한 12개의 쌍의 예비 연구는 놀랍게도 상기 항체를 사용하여 여과된 인간 혈청에서 T14를 검출할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 또한, T14는 대조군과 비교하여 AD에서 상승한다. 따라서, 데이터는 HS에서 T14를 검출할 수 있으며, 따라서 간단한 비침습적 진단 도구로서 사용될 수 있고, 신경퇴행성 장애를 갖거나 가지고 있을 것으로 의심되는 환자로부터 CSF(또는 뇌) 샘플을 수득하는 것이 바람직할 것임을 보여준다.
실시예 8 - 면역세포화학
도 24를 참고하면, 면역세포화학에 의해 진전된 알츠하이머병에서 글로벌 뉴런에 존재하는 T14의 첫 시각화가 나타나 있다. 이 나타난 특정 영역은 파킨슨병에 전형적으로 취약하므로, 그것은 2가지 퇴행성 질환이 독성 T14에 기초하여, 공통적인 기전을 공유한다는 이론을 뒷받침한다.
실시예 9 -항-T14 항체를 이용한 인간 중뇌 절편의 면역조직화학적 염색
도 25를 참조하면, 40x 및 200x 배율에서 대조군 및 중증 알츠하이머병(AD) 샘플의 흑색질의 T14 면역염색이 나타나 있다. 대조군 및 AD에서 전형적인 도파민성 뉴런 세포질　T14 면역염색 패턴(화살촉)과 같이, 중증 AD에서 세포외 T14 면역표지된 침착(화살표)이 나타나 있다. 　많은 T14 뉴런 세포질 염색 패턴이 시야에 포착된다. 도에서 볼 수 있는 바와 같이, T14는 AD 샘플의 세포로부터 방출되지만(화살표), 대조군에서는 방출되지 않는다. AD 세포로부터의 T14 방출 또는 분비는 죽어가는 뉴런으로부터의 누출 때문인 것으로 여겨진다. T14의 세포외 침착은 어두운 멜라민, 즉, 도파민과 합쳐지는 것으로 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> Neuro-Bio Ltd <120> ANTIBODY <130> AXH/75695PCT1 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Pro Gln Cys Leu Leu His Thr Pro Ser Leu Ala Ser Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Gly Gly Val Gly Ala Glu 20 25 30 Gly Arg Glu Asp Ala Glu Leu Leu Val Thr Val Arg Gly Gly Arg Leu 35 40 45 Arg Gly Ile Arg Leu Lys Thr Pro Gly Gly Pro Val Ser Ala Phe Leu 50 55 60 Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Met Gly Pro Arg Arg Phe Leu Pro 65 70 75 80 Pro Glu Pro Lys Gln Pro Trp Ser Gly Val Val Asp Ala Thr Thr Phe 85 90 95 Gln Ser Val Cys Tyr Gln Tyr Val Asp Thr Leu Tyr Pro Gly Phe Glu 100 105 110 Gly Thr Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Leu Ser Glu Asp Cys Leu 115 120 125 Tyr Leu Asn Val Trp Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Thr Ser Pro Thr Pro 130 135 140 Val Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ala Ser Ser 145 150 155 160 Leu Asp Val Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Val Gln Ala Glu Arg Thr Val 165 170 175 Leu Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu 180 185 190 Pro Gly Ser Arg Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Leu Leu Asp Gln Arg 195 200 205 Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Glu Asn Val Ala Ala Phe Gly Gly Asp 210 215 220 Pro Thr Ser Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val 225 230 235 240 Gly Met His Leu Leu Ser Pro Pro Ser Arg Gly Leu Phe His Arg Ala 245 250 255 Val Leu Gln Ser Gly Ala Pro Asn Gly Pro Trp Ala Thr Val Gly Met 260 265 270 Gly Glu Ala Arg Arg Arg Ala Thr Gln Leu Ala His Leu Val Gly Cys 275 280 285 Pro Pro Gly Gly Thr Gly Gly Asn Asp Thr Glu Leu Val Ala Cys Leu 290 295 300 Arg Thr Arg Pro Ala Gln Val Leu Val Asn His Glu Trp His Val Leu 305 310 315 320 Pro Gln Glu Ser Val Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Val Asp Gly 325 330 335 Asp Phe Leu Ser Asp Thr Pro Glu Ala Leu Ile Asn Ala Gly Asp Phe 340 345 350 His Gly Leu Gln Val Leu Val Gly Val Val Lys Asp Glu Gly Ser Tyr 355 360 365 Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Asn Glu Ser Leu 370 375 380 Ile Ser Arg Ala Glu Phe Leu Ala Gly Val Arg Val Gly Val Pro Gln 385 390 395 400 Val Ser Asp Leu Ala Ala Glu Ala Val Val Leu His Tyr Thr Asp Trp 405 410 415 Leu His Pro Glu Asp Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Leu Ser Asp Val 420 425 430 Val Gly Asp His Asn Val Val Cys Pro Val Ala Gln Leu Ala Gly Arg 435 440 445 Leu Ala Ala Gln Gly Ala Arg Val Tyr Ala Tyr Val Phe Glu His Arg 450 455 460 Ala Ser Thr Leu Ser Trp Pro Leu Trp Met Gly Val Pro His Gly Tyr 465 470 475 480 Glu Ile Glu Phe Ile Phe Gly Ile Pro Leu Asp Pro Ser Arg Asn Tyr 485 490 495 Thr Ala Glu Glu Lys Ile Phe Ala Gln Arg Leu Met Arg Tyr Trp Ala 500 505 510 Asn Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Glu Pro Arg Asp Pro Lys Ala 515 520 525 Pro Gln Trp Pro Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Gln Gln Tyr Val Ser Leu 530 535 540 Asp Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg Arg Gly Leu Arg Ala Gln Ala Cys 545 550 555 560 Ala Phe Trp Asn Arg Phe Leu Pro Lys Leu Leu Ser Ala Thr Asp Thr 565 570 575 Leu Asp Glu Ala Glu Arg Gln Trp Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser 580 585 590 Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln 595 600 605 Asp Arg Cys Ser Asp Leu 610 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn 1 5 10 15 Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu 20 25 30 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val His Trp Lys 1 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) protein cross-linked to the T14 protein (SEQ ID No:3) <400> 7 Cys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 9 <211> 0 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 000 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Ala Glu Phe 1 5 10

Claims (42)

  1. 서열번호 3, 또는 이의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2에 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 4에 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8에 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 토끼, 마우스 또는 랫트, 바람직하게는 토끼에서 생성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 서열번호 3에 특이적이거나 또는 서열번호 3 내의 에피토프에 대해 면역 특이적인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 3의 C-말단 내의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 5에서의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 에피토프 내의 C-말단 라이신(K) 잔기에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6에서의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6에서의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 하기를 포함하는 방법에 의해 수득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 숙주 유기체를 서열번호 3 또는 서열번호 7, 또는 이의 변이체 또는 단편으로 면역화시키는 단계; 및
    (ii) 상기 숙주로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수집하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 숙주는 포유동물인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호 6을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 숙주 동물을 번식시키는 단계. 및 이어서 혈청으로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수집하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혈청은 공유 결합된 펩타이드-지지체를 갖는 중력 컬럼을 통과하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 항원으로서 사용하기 위한, 서열번호 3 또는 서열번호 7, 또는 이의 변이체 또는 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항원은 항체가 결합하는 에피토프로서 작용하는, 서열번호 3 또는 서열번호 7, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호 6을 포함하거나 이로 구성되는, 서열번호 3 또는 서열번호 7, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 세포독성 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC).
  23. 요법 또는 진단에 사용하기 위한, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제21항의 항체-약물 접합체.
  24. 신경퇴행성 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선하는데 사용하기 위한, 각각 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제21항의 항체-약물 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병; 파킨슨병; 헌팅턴병; 운동 뉴런 질환; 1형, 2형 및 3형 척수소뇌성(Spinocerebellar); 근위축성 측색 경화증(ALS); 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 각각 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제21항의 항체-약물 접합체; 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 각각 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제21항의 항체-약물 접합체의 치료적 유효량을 약제학적으로 허용가능한 비히클과 조합하는 단계를 포함하는, 제27항에 따른 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 조성물은 신경퇴행성 장애 치료 조성물인, 조성물 또는 방법.
  30. 신경퇴행성 장애를 검출하거나 진단하기 위한 바이오마커로서 사용하기 위한, 서열번호 3, 또는 이의 변이체 또는 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이오마커로서 사용되는 상기 서열번호 3의 변이체 또는 단편은 서열번호 6을 포함하거나 이로 구성되는, 서열번호 3, 또는 이의 변이체 또는 단편.
  32. 신경퇴행성 장애를 앓고 있는 대상체, 또는 이에 대한 소인을 진단하기 위한, 또는 상기 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 키트로서,
    시험 대상체로부터의 샘플 내에 존재하는 항원의 농도를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하되, 상기 검출 수단은, 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 샘플 내의 항원의 존재는 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 앓는다는 것을 시사하는,키트.
  33. 신경퇴행성 장애를 앓고 있는 대상체, 또는 이에 대한 소인을 진단하기 위한, 또는 상기 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 방법으로서,
    시험 대상체로부터 수득된 샘플 내에 존재하는 항원의 농도를 검출하는 단계를 포함하되, 상기 검출은, 선택적으로 유도체화된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 달성되고, 상기 샘플 내의 항원의 존재는 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 앓는다는 것을 시사하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 샘플은 뇌척수액(CSF)을 포함하는, 키트 또는 방법.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 소변 또는 조직을 포함하는, 키트 또는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 샘플을 혈액을 포함하는 키트 또는 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병; 파킨슨병; 헌팅턴병; 운동 뉴런 질환; 1형, 2형 및 3형 척수소뇌성; 근위축성 측색 경화증(ALS); 및 전두측두엽 치매로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알츠하이머병인, 서열번호 3, 또는 이의 변이체 또는 단편, 또는 키트 또는 방법.
  38. 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한 치료 화합물을 확인하기 위한, 약물 발견 선별에서의, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도.
  39. T14 펩타이드(서열번호 3) 합성 또는 활성을 억제하는 제제를 확인하기 위한, 비색적으로 또는 형광성으로 표지된 T14 펩타이드(서열번호 3)의 생체외 용도.
  40. 하기 단계를 포함하는, 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한, 후보 제제를 확인하기 위한 방법:
    (i) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재하에 세포를 시험 제제와 시험관내 또는 생체외에서 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 T14 펩타이드(서열번호 3)의 존재, 농도 또는 활성을 검출하는 단계로서, 대조군과 비교하여 T14 펩타이드의 부재, 또는 T14 펩타이드 합성, 농도 또는 활성의 감소는 상기 제제가 부적절한 보체 활성을 특징으로 하는 질환의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 후보라는 지표인, 상기 검출하는 단계.
  41. 하기를 포함하는, T14 펩타이드(서열번호: 3) 합성 또는 활성을 억제하는 제제를 확인하기 위한 검정수단(assay):
    (i) 세포 기반 발현 시스템;
    (ii) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
    (iii) 적어도 하나의 시험 제제를 상기 발현 시스템과 접촉시키도록 구성된 용기.
  42. 하기를 포함하는, T14 펩타이드(서열번호 3) 합성 또는 활성을 조절하는 제제를 확인하기 위한 방법:
    (i) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재하에 세포를 시험 제제와 시험관내 또는 생체외에서 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 T14 펩타이드(서열번호 3)의 존재, 농도 또는 활성을 검출하는 단계로서, 대조군과 비교하여, T14 펩타이드 합성, 농도 또는 활성의 변경은 상기 시험 제제가 T14 펩타이드(서열번호 3) 합성 또는 활성을 조절한다는 지표인, 상기 검출하는 단계.
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