PT1915626E - Sensibilidade da apoptose a apo2l/trail por ensaio de expressão de galnac-t14 em células/tecidos - Google Patents

Sensibilidade da apoptose a apo2l/trail por ensaio de expressão de galnac-t14 em células/tecidos Download PDF

Info

Publication number
PT1915626E
PT1915626E PT06813477T PT06813477T PT1915626E PT 1915626 E PT1915626 E PT 1915626E PT 06813477 T PT06813477 T PT 06813477T PT 06813477 T PT06813477 T PT 06813477T PT 1915626 E PT1915626 E PT 1915626E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
antibody
cancer
quot
galnac
expression
Prior art date
Application number
PT06813477T
Other languages
English (en)
Inventor
Avi J Ashkenazi
Klaus W Wagner
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PT1915626E publication Critical patent/PT1915626E/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)
    • G01N2333/91097—Hexosyltransferases (general) (2.4.1)
    • G01N2333/91102—Hexosyltransferases (general) (2.4.1) with definite EC number (2.4.1.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Sensibilidade da apoptose a Apo2L/TRAIL por ensaio de expressão de GalNac-T14 em células/tecidos"
CAMPO DO INVENTO
Os inventos aqui descritos referem-se a métodos e ensaios para detectar biomarcadores de prognóstico de sensibilidade de células de mamífero a anticorpos agonistas de receptores de morte. Mais especificamente, os presentes inventos referem-se a métodos e ensaios que detectam moléculas associadas com a família de proteínas GalNac-T que são prognóstico de sensibilidade de células de cancro de mamífero a anticorpos agonistas DR4 ou DR5.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Foram identificados na especialidade vários ligandos e receptores pertencentes à superfamília de factor de necrose tumoral (TNF). Entre tais ligandos estão incluídos factor de necrose tumoral-alfa ("TNF-alfa"), factor de necrose tumoral-beta ("TNF-beta" ou "linfotoxina-alfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (também denominado ligando Fas ou ligando CD95), ligando Apo-2 (também denominado Apo2L ou TRAIL), ligando Apo-3 (também denominado TWEAK), APRIL, ligando OPG (também denominado ligando RANK, ODF ou TRANCE) e TALL-1 (também denominado BlyS, BAFF ou THANK) (consultar, e.g., Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., ]A:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature; 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicado a 16 de Janeiro de 1997; WO 97/25428 publicado a 17 de Julho de 1997; 2 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998);
Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997);
Hahne et al. , J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); W098/28426 publicado a 2 de Julho de 1998; W098/46751 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO/98/18921 publicado a 7 de Maiode 1998;
Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J.
Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp.
Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). A indução de várias respostas celulares mediadas por tal família de ligandos TNF é tipicamente iniciada pela sua ligação a receptores celulares específicos. Alguns, mas nem todos os ligandos da família TNF ligam-se a "receptores de morte" da superfície celular e consequentemente induzem várias actividades biológicas, para activar caspases ou enzimas que efectuam a via de morte celular ou apoptose (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). Entre os membros da superfamília de receptor TNF identificados até à data incluem-se TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (também denominado Apo-1 ou CD95), DR4 (também denominado TRAIL-R1), DR5 (também denominado Apo-2 ou TRAIL-R2), DcRl, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK e Apo-3 (também denominado DR3 ou TRAMP) (consultar, e.g., Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr. Opin. Cell
Biol., ]A:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001);
Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J.
Biol. Chem., 2 64:14927-14934 (1989); Brockhaus et al. , Proc.
Natl. Acad. Sei., 87_: 3127-3131 (1990); EP 417 563, publicado a 20 de Março de 1991; Loetscher et al., Cell, _61:351 (1990);
Schall et al., Cell, _6^:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 8_8:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 1_1:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997);
Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti 3 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)). A maioria destes membros da família de receptor TNF partilham a estrutura típica de receptores de superfície celular incluindo as regiões extracelular, transmembranar e intracelular, enquanto outros encontram-se naturalmente como proteínas solúveis sem domínio transmembranar e intracelular. A parte extracelular de TNFR típicos contém um padrão de sequência de aminoácidos repetitivo de vários domínios ricos em cisteína (CRD), com início no terminal NH2. O ligando denominado Apo-2L ou TRAIL foi identificado há vários anos atrás como um membro da família de citoquinas TNF. (consultar, e.g., Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; patente US 5 763 223 concedida a 9 de Junho de 1998; patente US 6 284 236 concedida a 4 de Setembro de 2001) . A sequência nativa completa do polipéptido Apo2L/TRAIL humano é uma proteína de 281 aminoácidos de comprimento, transmembranar do tipo II. Algumas células podem produzir uma forma natural solúvel do polipéptido, através de clivagem enzimática da região extracelular do polipéptido (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Os estudos cristalográficos das formas solúveis de Apo2L/TRAIL revelaram uma estrutura homotrimérica semelhante às estruturas de TNF e outras proteínas relacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry; 39:633-644 (2000)). No entanto, verificou-se que Apo2L/TRAIL, contrariamente a outros membros da família TNF, tem uma característica estrutural única pelo facto de três resíduos de cisteína (na posição 230 de cada subunidade no homotrímero) coordenarem conjuntamente um átomo de zinco e pelo facto da ligação com o zinco ser importante para a estabilidade do trímero e actividade biológica. (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000) ) . 4 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Foi relatado na literatura que Apo2L/TRAIL podem desempenhar um papel na modulação do sistema imunitário, incluindo doenças auto-imunes, tal como artrite reumatóide [consultar, e.g., Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J.
Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].
Também foram relatadas formas solúveis de Apo2L/TRAIL como indutoras de apoptose em várias células de cancro, incluindo tumores de cólon, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovários e cérebro, bem como em melanoma, leucemia e mieloma múltiplo (consultar, e.g., Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; patente US 6 030 945 concedida a 29 de
Fevereiro de 2000; patente US 6 746 668 concedida a 8 de
Junho de 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998) ; Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999) ; Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Câncer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al.,
Clin. Câncer. Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Câncer Res., 60:2384-2389 (2000) ; Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 97:1754- 1759 (2000)) . Estudos in vivo em modelos de tumor murinos sugerem adicionalmente que Apo2L/TRAIL, sozinho ou em combinação com quimioterapia ou radioterapia, pode exercer efeitos anti-tumor substanciais (consultar, e.g., Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Câncer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); pedido PCT US/00/15512; pedido PCT US/01/23691). Contrariamente a muitos tipos de células de cancro, a maioria dos tipos de células normais humanas parecem ser resistentes a indução de apoptose por determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Jo et al. relataram que uma forma solúvel de Apo2L/TRAIL marcada com poli-histidina induziu apoptose in vitro em hepatócitos humanos normais isolados, mas não em não humanos (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); consultar também, Nagata,
Nature Med., 6:502-503 (2000)). Pensa-se que determinadas normais preparações de Apo2L/TRAIL recombinante podem variar em termos de propriedades bioquímicas e actividades biológicas em células doentes relativamente a células 5 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ dependendo por exemplo da presença ou ausência de uma molécula marcadora, teor em zinco e % de teor em trímero (consultar , Lawrence et al., Nature Med., carta ao editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., carta ao editor, 7 : 385-386 (2001)) .
Verificou-se que Apo2L/TRAIL se liga a pelo menos cinco receptores diferentes. Pelo menos dois dos receptores que se ligam a Apo2L/TRAIL contêm um domínio citoplasmático de morte funcional. Um de tais receptores foi denominado "DR4" (e alternativamente TR4 ou TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); consultar também W098/32856 publicado a 30 de Julho de 1998; W099/37 684 publicado a 29 de Julho de 1999; WO 00/73349 publicado a 7 de Dezembro de 2000; US 2003/0036168 publicado a 20 de Fevereiro de 2003; US 6 433 147 concedida a 13 de Agosto de 2002; US 6 461 823 concedida a 8 de Outubro de 2002 e US 6 342 383 concedida a 29 de
Janeiro de 2002).
Outro de tais receptores para Apo2L/TRAIL foi denominado DR5 (foi denominado alternativamente Apo-2; TRAIL-R ou TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER) (consultar, e.g., Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997), Pan et al.,
Science, 277:815-818 (1997), W098/51793 publicado a 19 de
Novembro de 1998; W098/41629 publicado a 24 de Setembro de 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7_:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 1_6:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, JL7_: 141-143 (1997); W098/35986 publicado a 20 de
Agosto de 1998; EP870 827 publicado a 14 de Outubro de 1998; W098/46643 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO99/02653 publicado a 21 de Janeiro de 1999; WO99/09165 publicado a 25 de Fevereiro de 1999; W099/11791 publicado a 11 de Março de 1999; WO 03/042367 publicado a 22 de Maio de 2003; WO 02/097033 publicado a 5 de Dezembro de 2002; WO 03/038043 publicado a 8 de Maio de 2003;; US 2002/0072091 publicado a 13 de Agosto de 2002; US 2002/0098550 publicado a 7 de Dezembro de 2001; US 6 313 269 concedida a 6 de Dezembro de 2001; US 2001/0010924 publicado a 2 de Agosto de 2001; US 2003/01255540 publicado a 3 de Julho de 2003; US 2002/0160446 publicado a 31 de Outubro de 2002, US 2002/0048785 publicado a 25 de Abril de 2002; US 2004/0141952 publicado a 22 de Julho de 2004; US 2005/0129699 publicado a 16 de Junho de 6 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 2005; US 2005/0129616-publicado a 16 de Junho de 2005; US 6 342 369 concedida em Fevereiro de 2002; US 6 569 642 concedida a 27 de Maio de 2003, US 6 072 047 concedida a 6 de Junho de 2000, US 6 642 358 concedida a 4 de Novembro de 2003; US 6 743 625 concedida a 1 de Junho de 2004) . Tal como DR4, relatou-se que DR5 contém um domínio de morte citoplasmático e é capaz de sinalizar apoptose por ligação de ligando (ou por ligação de uma molécula, tal como um anticorpo agonista, que mimetize a actividade do ligando). A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 está descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).
Por ligação de ligando, tanto DR4 como DR5 podem desencadear apoptose independentemente por recruta e activação do iniciador de apoptose, caspase-8, através da molécula adaptadora contendo o domínio de morte denominada FADD/Mortl [Kischkel et al., Immunity, .12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, _12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].
Relatou-se que Apo2L/TRAIL também se liga aos receptores denominados DcRl, DcR2 e OPG, que se pensa que funcionam como inibidores e não como transdutores de sinalização (consultar, e.g., DCR1 (também denominado TRID, LIT ou TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); e Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (também denominado TRUNDD ou TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7_: 3.0()3-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7_:í313-820 (1997)] e OPG [Simonet et al., supra]. Contrariamente a DR4 e DR5, os receptores DcRl e DcR2 não sinalizam apoptose.
Foram relatados na literatura determinados anticorpos que se ligam aos receptores DR4 e/ou DR5. Por exemplo, descrevem-se anticorpos anti-DR4 dirigidos ao receptor DR4 e com actividade agonista ou apoptótica em determinadas células de mamífero em, e.g., WO 99/37684 publicado a 29 de Julho de 7 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
1999; WO 00/73349 publicado a 12 de Julho de 2000; WO 03/066661 publicado a 14 de Agosto de 2003. Consultar, também, e.g., Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2 605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898
(2001); WO 02/097033 publicado a 2 de Dezembro de 2002; WO 03/042367 publicado a 22 de Maio de 2003; Wo 03/038043 publicado a 8 de Maio de 2003; W0 03/037913 publicado a 8 de Maio de 2003; US 2003/0073187 publicado a 17 de Abril de 2003; US 2003/0108516 publicado a 12 de Junho de 2003. Foram igualmente descritos determinados anticorpos anti-DR5, consultar, e.g., WO 98/51793 publicado a 8 de Novembro de 1998; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2 605 (1999);
Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the
Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Resumo, 2o International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, 29 de Agosto a 1 de Setembro de 2002, Banff, Alberta, Canadá; W0 03/038043 publicado a 8 de Maio de 2003; WO 03/037913 publicado a 8 de Maio de 2003; US 2003/0180296 publicado a 25 de Setembro de 2003;. Adicionalmente foram descritos determinados anticorpos com reactividade cruzada com ambos os receptores DR4 e DR5 (consultar, e.g., patente US 6 252 050 concedida a 26 de
Junho de 2001).
SUMÁRIO DO INVENTO O invento aqui revelado proporciona métodos e ensaios que analisam a expressão de um ou mais biomarcadores numa amostra de tecido ou célula de mamífero, em que a expressão de um ou mais tais biomarcadores é prognóstico de a amostra de tecido ou célula ser sensível a agentes tal como anticorpos agonistas anti-DR5. Em várias concretizações do invento, os métodos e ensaios analisam em particular a expressão de moléculas da família de proteínas GalNac-T. GalNAc-T14 (consultar Wang H. et al 300, 738-744).
Tal como discutido anteriormente, a maioria dos tipos de células humanas normais parece ser resistente a indução de apoptose por determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra) . Também se verificou que algumas populações de tipos de células humanas 8 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ doentes (tal como determinadas populações de células de cancro) são resistentes a indução de apoptose por determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, supra; Walczak et al., Nature Med., 1999, supra). Consequentemente, analisando uma amostra de tecido ou célula de mamífero para expressão de biomarcadores seleccionados através de um ensaio pode obter-se, conveniente e eficazmente, informação útil para avaliar terapias adequadas ou eficazes para tratar doentes. Por exemplo, a informação obtida num ensaio para detectar expressão de GalNac-T14 numa amostra de tecido ou célula de mamífero pode proporcionar dados úteis em termos médicos que podem ser usados para determinar um regime de terapia óptimo (utilizando anticorpos agonistas de receptores de morte) para doentes que sofram de uma doença, tal como cancro. 0 invento proporciona métodos para prever a sensibilidade de uma amostra de tecido ou amostra de células de cancro de mamífero a um anticorpo de receptor de morte, em que o método compreende analisar a amostra de tecido ou amostra de células para detectar expressão de GalNac-T14, em que a expressão do referido GalNac-T14 é prognóstico da referida amostra de tecido ou amostra de células ser sensível a actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte, em que o referido anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 que é capaz de induzir apoptose. Os métodos podem ser efectuados numa variedade de formatos de ensaio, incluindo ensaios que detectam expressão de ARNm e/ou proteína, ensaios de actividade enzimática e outros aqui discutidos. A determinação de expressão de GalNac-T14 nos referidos tecidos ou células será prognóstico que tais tecidos ou células serão sensíveis à actividade de indução de apoptose de um anticorpo de receptor de morte. Em concretizações opcionais, os tecidos ou células podem também ser analisados para expressão de receptores DR4, DR5, DcRl ou DcR2.
Os métodos adicionais do invento incluem métodos para induzir apoptose numa amostra de tecido ou amostra de células de cancro de mamífero que compreendem: 9 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ analisar a amostra de tecido ou amostra de células para detectar expressão de GalNac-T14, e subsequentemente, para detectar expressão do referido GalNac-T14, expor a referida amostra de tecido ou amostra de células a uma quantidade eficaz de um anticorpo de receptor de morte, em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 que é capaz de induzir apoptose. As etapas nos métodos para analisar expressão de GalNac-T14 podem ser efectuadas em vários formatos de ensaio, incluindo ensaios que detectam expressão de ARNm e/ou proteína, actividade enzimática e outros aqui discutidos. Em concretizações opcionais, os métodos também compreendem analisar a amostra de tecido ou célula para expressão de receptores DR4, DR5, DcRl ou DcR2. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula compreende tecido ou células de cancro. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula compreende células de cancro de pulmão de não pequenas células, células de cancro pancreático, células de cancro de mama ou células de linfoma não hodgkin.
Num aspecto adicional, o presente invento proporciona a utilização de um anticorpo de receptor de morte no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro num indivíduo mamífero, em que se determinou que a amostra de tecido ou amostra de células do indivíduo expressa GalNac-Tl4 e a expressão de GalNac-T14 é prognóstico da referido amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte e em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
Num aspecto adicional, o presente invento proporciona um anticorpo de receptor de morte para utilização num método para tratar cancro num indivíduo mamífero, em que se determinou que a amostra de tecido ou amostra de células do indivíduo expressa GalNac-T14 e a expressão de GalNac-T14 é prognóstico da referido amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do 10 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ anticorpo de receptor de morte e em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
Na execução destas utilizações médicas, a análise da expressão de um ou mais biomarcadores pode ser efectuada em vários formatos de ensaio, incluindo ensaios que detectam expressão de ARNm e/ou proteína, actividade enzimática e outros aqui descritos. Em concretizações opcionais, os métodos também compreendem analisar a amostra de tecido ou célula para expressão de receptores DR4, DR5, DcRl ou DcR2. Opcionalmente, os métodos compreendem tratar cancro num mamífero. Opcionalmente, os métodos compreendem, além da administração de uma quantidade eficaz de anticorpo agonista de receptor de morte, a administração de agente (s) quimioterapêutico(s) ou radioterapia ao referido mamífero.
Em concretizações adicionais do invento, os métodos supramencionados podem compreender analisar tecido ou células de mamífero para expressão de outras moléculas GalNac-T, tal como GalNac-T3.
Num aspecto adicional, o presente invento proporciona a utilização de um anticorpo ou um polinucleótido para detectar expressão de GalNac-T14 numa amostra de tecido ou amostra de células de cancro de mamífero para prever a sensibilidade de uma amostra de tecido ou amostra de células de mamífero a um anticorpo de receptor de morte, em que a expressão do referido GalNac-T14 é prognóstico da referida amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura 1 apresenta a sequência de nucleótidos de ADNc de ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO.2) e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID No:l). O "N" na posição de nucleótido 447 é utilizado para indicar que a base de nucleótido pode ser "T" ou "G". 11 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
As figuras 2Α e 2B apresentam a sequência de nucleótidos de um ADNc (SEQ ID N° 4 e 30, respectivamente, por ordem de aparecimento) para DR4 completo humano e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:3). As respectivas sequências de nucleótidos e de aminoácidos para DR4 humano também se apresentam em Pan et al., Science, 276:111 (1997). A figura 3A apresenta a sequência de 411 aminoácidos (SEQ ID NO:5) de DR5 humano tal como publicado em WO 98/51793 a 19 de Novembro de 1998. Conhece-se na especialidade uma variante de splicing de transcrição de DR5 humano. Esta variante de splicing de DR5 codifica a sequência de 440 aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de DR5 humano apresentada nas figuras 3B e 3C tal como publicado em WO 98/35986 a 20 de Agosto de 1998.
As figuras 3D-1 a 3D-3 apresentam as sequências de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NOs 7 e 31, respectivamente, por ordem de aparecimento) de DcRl completo humano e a sequência de aminoácidos derivada a partir dos dois locais de inicio de tradução diferentes na molécula de ADNc de DcRl (duplicada) apresentada nas figuras 3D-1 a 3D-3 (SEQ ID N° 8 e 32, respectivamente, por ordem de aparecimento). As respectivas sequências de nucleótidos e de aminoácidos para DcRl humano (e seus domínios específicos) também se apresentam e descrevem em WO 98/58062. A figura 3E apresenta as sequências de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO:9) para DcR2 humano completo e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:10). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos respectivas para DcR2 humano (e seus domínios específicos) também se apresentam em WO 99/10484. A figura 4A apresenta a sequência de nucleótidos de GalNac-T14 humano (SEQ ID NO:11) e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:12). Estas sequências são também descritas em Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003). A figura 4B apresenta a sequência de nucleótidos de GalNac-T3 humano (SEQ ID NO:13) e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:14). Estas sequências são 12 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ também descritas em Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996). A figura 5 proporciona uma tabela sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro de pulmão de não pequenas células ("NSCLC") para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L, (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "DR5 ab", reticulado "XL" ou não reticulado, + soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) tal como medidos em ensaios de citotoxicidade MTT. A figura 6 proporciona uma tabela sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro pancreático para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L (+soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "DR5 ab", reticulado "XL" ou não reticulado, + soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) tal como medido em ensaios de citotoxicidade MTT. A figura 7 proporciona uma tabela sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro de linfoma não hodgkin ("NHL") para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L (+soro fetal bovino "FBS" a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "DR5 ab", reticulado "XL" ou não reticulado, (+soro fetal bovino "FBS" a 10%) tal como medido em ensaios de citotoxicidade MTT. A figura 8 proporciona uma comparação de sensibilidade ("sen") ou resistência ("RES") de linhas celulares seleccionadas de NSCLC, cancro pancreático e NHL a anticorpo DR5 e a correlação com expressão de GalNac-T14, tal como medida por expressão de ARNm de GalNac-T14. A figura 9 proporciona um gráfico em diagrama de barras de várias linhas celulares de NSCLC, pancreático e NHL ordenadas (em ordem decrescente) pelos níveis de padrões de expressão de ARNm de GalNac-T14. A figura 10A-D ilustra expressão diferencial de enzimas específicas de glicosilação em O linhas celulares de cancro sensíveis a Apo2L/TRAIL e resistentes a Apo2L/TRAIL: (A) 13 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Mediu-se a viabilidade celular após incubação com doses variáveis de Apo2L/TRAIL. Calculou-se IC50 para cada linha celular como a concentração de Apo2L/TRAIL que proporciona 50% de perda de viabilidade. Cada experiência de viabilidade celular foi repetida pelo menos três vezes na presença de soro fetal bovino baixo (0,5%) e elevado (10%). Os símbolos pretos, cinza ou abertos representam linhas celulares que são altamente sensíveis, moderadamente sensíveis ou resistentes a Apo2L/TRAIL, respectivamente. (B) Níveis de expressão de ARNm de ppGalNAcT-14 (conjunto de sondas 219271_at) em linhas celulares pancreática e de melanoma maligno. As linhas celulares estão organizadas por tipo de tecido e sensibilidade a Apo2L/TRAIL. As barras pretas, cinza ou abertas representam linhas celulares tal como em A. (C) Níveis de expressão de ARNm de Fut-6 (painel superior, conjunto de sondas 211885_x_at) e ppGalNAcT-3 (painel inferior, conjunto de sondas 203397_s_at) em linhas celulares de cancro colorrectal. As linhas celulares estão organizadas como em B. Os valores de P nos painéis B e C baseiam-se num teste de Fisher da correlação entre a sensibilidade de linha celular (incluindo elevada e moderada) e expressão de ARNm superior ao limiar. (D) Efeito de Apo2L/TRAIL no crescimento de xenoenxertos de tumor estabelecidos. Os ratinhos nus atímicos com tumores positivos para GalNAcT-3/Fut-6 (painel esquerdo) ou negativos para GalNAcT-3/Fut-6 (painel direito) receberam veículo ou Apo2L/TRAIL (60 mg/kg/dia i.p. nos dias 0-4) e monitorizou-se o volume de tumor (média+EP, N=10 ratinhos/grupo). A figura 11 ilustra que a modulação de determinadas enzimas de glicosilação em O altera a sensibilidade a Apo2L/TRAIL. (A) Pré-incubaram-se células Colo205 com o inibidor universal de enzima de glicosilação em O benzil-GalNAc (bGalNAc), trataram-se com Apo2L/TRAIL durante 24 h e determinou-se a viabilidade celular (DMSO=controlo de veículo). (B) Transfectaram-se células PSN-1 (carcinoma pancreático) e Hs294T (melanoma) com ARNsi de caspase-8 ou ppGalNACT-14 durante 48 h, incubaram-se com Apo2L/TRAIL durante mais 24 h e determinou-se a viabilidade celular. Utilizaram-se ARNsi em cadeia dupla contra uma sequência não alvo (Dharmacon) como um controlo (NTC). (C) Transfectaram-se células de carcinoma colorrectal DLD-1 com ARNsi ppGalNAcT-3 14 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ ou Fut-6 e ensaiaram-se como em B. (D) Co-transfectaram-se células HEK293 com plasmideos que codificam os genes indicados em combinação com ppGalNAcT-14 ou controlo de vector. Mediu-se a apoptose às 24 h por coloração com anexina V (painel esquerdo) . Transduziram-se células de melanoma H1569 com retrovirus que dirige a expressão de ppGalNAcT-24 ou retrovirus de controlo; os conjuntos de linhas celulares resultantes foram tratados com Apo2L/TRAIL durante 24 h e determinou-se a viabilidade celular (painel direito). Utilizou-se análise de transferência "western" utilizando anticorpos anti-FLAG para verificar a expressão de ppGalNAcT-14 marcado com epítopo. A figura 12 ilustra (A) Análise da cascada de caspase induzida por Apo2L/TRAIL. Transfectaram-se células PSN-1 e DLD-1 com ARNsi contra ppGalNAcT-14 ou Fut-6, respectivamente, durante 48 h. As células foram tratadas com Apo2L/TRAIL durante 4 ou 8 h e analisaram-se os lisados celulares por imuno-transferência com anticorpos específicos para caspase-8. Bid, caspase-9, caspase-3 ou actina como um controlo de carga. (B) Transfectaram-se células PSN-1 com ARNsi de ppGalNAcT-14 tal como em A, trataram-se com Apo2L/TRAIL durante 4 h e determinou-se a actividade enzimática de caspase-3/7 em lisados celulares. (C) Análise de Apo2L/TRAIL DISC. Transfectaram-se células PSN-1 com ARNsi de ppGalNAcT-14 tal como em A. Adicionou-se FLAG-Apo2L/TRAIL (1 mg/ml) durante 0-60 min, lisaram-se as células e sujeitaram-se a uma imunoprecipitação com um anticorpo anti-FLAG. Detectou-se FADD associado a DISC, caspase-8 e DR4 por imuno-transferência. (D) Transfectaram-se células PSN-1, trataram-se e sujeitaram-se a imunoprecipitação com DISC tal como em C e mediu-se a actividade enzimática de caspase-8 associada a DISC tal como descrito anteriormente (Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005). A figura 13 ilustra (A) Análise de monossacárido de DR5 humano recombinante (variante de splicing longa) produzida em células CHO, efectuada por HPAEC-PAD (cromatografia de permuta aniónica de alta eficiência com detecção por amperometria de impulsos). (B) Comparação de sequência de receptores Apo2L/TRAIL humanos (SEQ ID N° 22, 33, 23, 34, 24, 35, 25, 36, 26, 37, 27 e 38-44, respectivamente, por ordem de 15 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ aparecimento) (forma longa de DR5 humano 440 aa "hDR5L", forma curta de DR5 humano 411 aa "hDR5S" e hDR4), DR5 murino (mDR5), Fas humano (hFas) e TNFR1 humano (hTNFRl). As caixas indicam possíveis locais de glicosilação em O. (C) Análise de imuno-transferência de lisados celulares totais correspondentes a D. DR5L-5T e DR5S-5T são construções contendo 5 substituições de treonina por alanina e DR5L-5T3S e DR5S-5T3S são construções contendo 5 substituições de treonina por alanina e três substituições de serina por alanina, respectivamente, em resíduos que são potenciais locais de glicosilação em O. (D) Co-transfectaram-se células HEK293 com as construções DR5 indicadas conjuntamente com vector ou plasmídeo ppGalNAcT-14 durante 48 h e mediu-se a apoptose por coloração com anexina V. (E) Níveis de expressão de ARNm para ppGalNAcT-14 (chip Affymetrix, conjunto de sondas 219271_at) em amostras de tumor primário humano de cancros da pele (SCC= carcinoma de células escamosas), pulmão, pâncreas (Pane), mama, ovários (Ov), endométrio (Endo), bexiga (Bla, TCC= carcinoma de células transicionais) e NHL (FL= linfoma folicular, DLBCL=linfoma de células B grandes difusas). A mediana da expressão das amostras é indicada por uma barra horizontal cinzenta para cada classe. Apresenta-se um limiar de 500 e 200 (melanoma) correspondente aos dados de linha celular da figura 10B. A figura 14 ilustra (A) Redução da expressão de ARNm de ppGalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 em células PSN-1 ou DLD-1 após 4 8h de silenciamento com ARNsi por análise Taqman. (B) Reconstitui-se a expressão de GalNAcT-14 em células PSN-1 por transfecção com plasmídeo vazio (Empty), GalNAcT-14 de tipo selvagem (GalNAcT-14) ou GalNAcT-14 contendo mutações silenciosas de ARNsi (GalNAcT-14 si(l)Mut (SEQ ID N° 28)) subsequente a silenciamento de ppGalNAcT-14 mediado por siGalNAcT-14 (1) (SEQ ID N° 29) . (C) Regulação negativa de ppGalNAcT-3 ou Fut-6 por ARN de interferência inibe morte celular induzida por Apo2L/TRAIL em células C170 (cancro colorrectal). O procedimento experimental é tal como em 11C. (Tabela 1) A) Tabela sumário dos fenótipos de silenciamento com ARNsi. As linhas celulares, nas quais a regulação negativa de GalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 e Fut-6 resultou em protecção contra Apo2L/TRAIL estão marcadas indicando menos ( + ) ou mais do que 50% (++) de protecção com pelo menos um 16 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ oligonucleótido ARNsi ensaiado. (0) indica a ausência de protecção contra Apo2L/TRAIL. (D), (E) Após um silenciamento de 48 h com os ARNsi indicados, trataram-se as células com doses crescentes de etoposideo ou estaurosporina (STS) durante 24 h e sujeitaram-se a um ensaio de viabilidade celular. (F) Sujeitaram-se conjuntos de linhas celulares PA-TU-8902 e PL-45 que sobrexpressam ppGalNAcT-14 retrovirico a ensaios de viabilidade celular após tratamento com Apo2L/TRAIL. A análise de transferência "Western" utilizando anticorpos anti-FLAG indica que o retrovirus expressou ppGalNAcT-14 nestas células.
Figura 15 (A) Análise de transferência "Western" da cascata de activação de caspase induzida por Apo2L/TRAIL em linhas celulares de cancro colorrectal Colo205 sensíveis a Apo2L/TRAIL e resistentes a Apo2L/TRAIL, RKO e SW1417. As células foram tratadas com Apo2L/TRAIL a 1000 ng/ml durante 8 e 24 h e sujeitaram-se lisados celulares totais a uma análise de transferência "western" utilizando anticorpos específicos para caspase-8, Bid, caspase-9, caspase-3 e actina como um controlo de carga. (B) O silenciamento de Fut-6 reduziu a recruta e activação de caspase-8 ao Apo2L/TRAIL DISC em células DLD-1. O procedimento experimental é de acordo com 12D. (C) Mediu-se a expressão de superfície celular de DR4 e DR5 por análise FACS em células que foram sujeitas a um silenciamento com ARNsi com os genes indicados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
As técnicas e procedimentos aqui descritos ou referenciados são em geral bem percebidos e utilizados vulgarmente usando metodologia convencional pelos peritos na especialidade, tal como, por exemplo, as metodologias vastamente utilizadas de clonagem molecular descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Como adequado, os procedimentos que envolvem uma utilização de kits e reagentes disponíveis comercialmente são em geral efectuados de acordo com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo indicação em contrário. 17 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Antes da descrição dos presentes métodos e ensaios, deve entender-se que este invento não está limitado às metodologias, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais, construções e reagentes específicos descritos e portanto podem com certeza variar. Deve também entender-se que a terminologia aqui utilizada tem apenas como objectivo descrever concretizações específicas e não se pretende que limite o âmbito do presente invento que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
Deve salientar-se que, tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)", "o" e "a" incluem as referências no plural salvo quando o contexto indica claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma alteração genética" inclui várias de tais alterações e a referência a "uma sonda" inclui referência a uma ou mais sondas e seus equivalentes conhecidos dos peritos na especialidade, etc.
I. DEFINIÇÕES
As expressões "Apo2L/TRAIL", "Apo-2L", e "TRAIL" são aqui utilizadas para referir uma sequência de polipéptido que inclui os resíduos de aminoácidos 114-281, inclusive, 95-281, inclusive, resíduos 92-281, inclusive, resíduos 91-281, inclusive, resíduos 41-281, inclusive, resíduos 15-281, inclusive ou resíduos 1-281, inclusive, da sequência de aminoácidos apresentada na figura 1, bem como fragmentos, variantes de deleção, de inserção ou de substituição biologicamente activos das sequências anteriores. Numa concretização, a sequência de polipéptido compreende os resíduos 114-281 da figura 1 e opcionalmente consiste dos resíduos 114-281 da figura 1. Opcionalmente, a sequência de polipéptido compreende os resíduos 92-281 ou os resíduos 91-281 da figura 1. Os polipéptidos Apo-2L podem ser codificados pela sequência de nucleótidos nativa apresentada na figura 1. Opcionalmente, o codão que codifica o resíduo Proll9 (figura 1) pode ser "CCT" ou "CCG". Noutras concretizações, os fragmentos ou variantes são activos biologicamente e têm pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, com maior preferência pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência e, ainda com maior preferência, pelo menos 95%, 18 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências Apo2L/TRAIL citadas anteriormente. Opcionalmente, o polipéptido Apo2L/TRAIL é codificado por uma sequência de nucleótidos que híbrida em condições rigorosas com a sequência de polinucleótidos codificante apresentada na figura 1. A definição abrange variantes de substituição de Apo2L/TRAIL nas quais pelo menos um dos seus aminoácidos nativos é substituído por um resíduo de alanina. As variantes de substituição específicas de Apo2L/TRAIL incluem aquelas em que pelo menos um aminoácido é substituído por um resíduo de alanina. Estas variantes de substituição incluem as identificadas, por exemplo, como "D203A"; "D218A" e "D269A." Esta nomenclatura é utilizada para identificar variantes Apo2L/TRAIL em que os resíduos de ácido aspártico nas posições 203, 218 e/ou 269 (utilizando a numeração apresentada na figura 1) são substituídos por resíduos de alanina. Opcionalmente, as variantes Apo2L podem compreender uma ou mais das substituições por alanina que são apresentadas na tabela I da publicação de pedido PCT WO 01/00832. As variantes de substituição incluem uma ou mais das substituições de resíduos identificadas na tabela I de WO 01/00832 publicado a 4 de Janeiro de 2001. A definição também abrange uma sequência nativa de Apo2L/TRAIL isolada a partir de uma fonte de Apo2L/TRAIL ou preparada por métodos recombinantes ou sintéticos. O Apo2L/TRAIL do invento inclui o polipéptido denominado Apo2L/TRAIL ou TRAIL revelado em publicações PCT N° WO97/01633 e W097/25428. As expressões "Apo2L/TRAIL" ou "Apo2L" são utilizadas para referir geralmente formas de Apo2L/TRAIL que incluem formas monoméricas, diméricas ou triméricas do polipéptido. Toda a numeração de resíduos de aminoácidos referidos na sequência de Apo2L utiliza a numeração de acordo com a figura 1, salvo indicação específica em contrário. Por exemplo, "D203" ou "Asp203" referem-se ao resíduo de ácido aspártico na posição 203 na sequência apresentada na figura 1. A expressão "domínio extracelular de Apo2L/TRAIL" ou "ECD de Apo2L/TRAIL" refere-se a uma forma de Apo2L/TRAIL que está essencialmente isenta dos domínios transmembranar e citoplasmático. Usualmente, o ECD terá menos de 1% de tais domínios transmembranar e citoplasmático e, de preferência, terá menos de 0,5% de tais domínios. Considera-se que 19 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ quaisquer domínios transmembranares identificados nos polipéptidos do presente invento são identificados seguindo os critérios utilizados rotineiramente na especialidade para identificar esse tipo de domínio hidrofóbico. As fronteiras exactas de um domínio transmembranar podem variar mas mais provavelmente não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer das extremidades do domínio, tal como inicialmente identificadas. Em concretizações preferidas, o ECD consistirá de uma sequência de polipéptido do domínio extracelular solúvel que está isenta de domínios transmembranar e citoplasmático ou intracelular (e não se encontra ligado à membrana). Descrevem-se sequências específicas de domínio extracelular de Apo-2L/TRAIL em publicações PCT N° W097/01633 e W097/25428. A expressão "monómero Apo2L/TRAIL" ou "monómero Apo2L" refere-se a uma cadeia covalente de uma sequência de domínio extracelular de Apo2L. A expressão "dímero Apo2L/TRAIL" ou ''dímero Apo2L" refere-se a dois monómeros Apo-2L ligados por uma ligação covalente através de uma ligação dissulfureto. A expressão, tal como aqui utilizada, inclui dímeros de Apo2L livres e dímeros de Apo2L que se encontram em formas triméricas de Apo2L (i.e., associados com um outro terceiro monómero de Apo2L). A expressão "trímero Apo2L/TRAIL" ou "trímero Apo2L" refere-se a três monómeros Apo2L que não estão ligados covalentemente. A expressão "agregado Apo2L/TRAIL" é utilizada para referir formas oligoméricas superiores auto-associadas de Apo2L/TRAIL, tais como trímeros Apo2L/TRAIL que formam, por exemplo, formas hexaméricas e nanoméricas de Apo2L/TRAIL. A determinação da presença e quantidade de monómero, dímero ou trímero (ou outros agregados) de Apo2L/TRAIL pode ser efectuada utilizando métodos e ensaios conhecidos na especialidade (e utilizando materiais disponíveis comercialmente), tal como HPLC de exclusão de tamanho nativo ("SEC"), exclusão de tamanho desnaturante utilizando 20 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ dodecilsulfato de sódio ("SDS-SEC"), HPLC de fase reversa e electroforese capilar. "0 receptor de ligando Apo-2" inclui os receptores denominados na especialidade como "DR4" e "DR5", cujas sequências de polinucleótidos e polipéptidos se apresentam nas figuras 2 e 3, respectivamente. Pan et al. descreveram o membro da família de receptor TNF denominado "DR4" (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); consultar também W098/32856 publicado a 30 de Julho de 1998; WO 99/37 684 publicado a 29 de Julho de 1999; WO 00/73349 publicado a 7 de Dezembro de 2000; US 6 433 147 concedida a 13 de Agosto de 2002; US 6 461 823 concedida a 8 de Outubro de 2002 e US 6 342 383 concedida a 29 de Janeiro de 2002). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) descreveram outro receptor para Apo2L/TRAIL (consultar também W098/51793 publicado a 19 de Novembro de 1998; W098/41629 publicado a 24 de Setembro de 1998). Este receptor é denominado DR5 (o receptor também foi denominado alternativamente Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 1_: 693-696 (1997);
Walczak et al. , EMBO J. , JL_6:5386-5387 (1997); Wu et al.,
Nature Genetics, 1_7 :141-143 (1997); W098/35986 publicado a 20 de Agosto de 1998; EP870 827 publicado a 14 de Outubro de 1998; W098/46643 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO99/02653 publicado a 21 de Janeiro de 1999; WO99/09165 publicado a 25 de Fevereiro de 1999; W099/11791 publicado a
11 de Março de 1999; US 2002/0072091 publicado a 13 de Agosto de 2002; US 2002/0098550 publicado a 7 de Dezembro de 2001; US 6 313 269 concedida a 6 de Dezembro de 2001; US
2001/0010924 publicado a 2 de Agosto de 2001; US 2003/01255540 publicado a 3 de Julho de 2003; US 2002/0160446 publicado a 31 de Outubro de 2002, US 2002/0048785 publicado a 25 de Abril de 2002; US 6 569 642 concedida a 27 de Maio de 2003, US 6 072 047 concedida a 6 de Junho de 2000, US 6 642 358 concedida a 4 de Novembro de 2003) . Tal como anteriormente descrito, outros receptores para Apo-2L incluem DcRl, DcR2 e OPG (consultar, Sheridan et al., supra; Marsters et al., supra; e Simonet et al:, supra). A expressão "receptor de Apo-2L" quando aqui utilizada abrange receptor de sequência nativa e variantes de receptor. Estas expressões abrangem receptor de Apo-2L expresso em vários mamíferos, 21 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ incluindo humanos. Ο receptor de Apo-2L pode ser expresso endogenamente da forma como ocorre naturalmente em várias linhagens de tecido humano ou pode ser expresso por métodos recombinantes ou sintéticos. Uma "receptor Apo-2L de sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos de um receptor Apo-2L derivado da natureza. Assim, o receptor Apo-2L de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do receptor Apo-2L de ocorrência natural de qualquer mamífero. Tal receptor Apo-2L de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. A expressão "receptor Apo-2L de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas ou excretadas do receptor de ocorrência natural (e.g., uma forma solúvel contendo, por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (e.g., formas de splicing alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural. As variantes de receptor podem incluir fragmentos ou mutantes de deleção do receptor Apo-2L de sequência nativa. A figura 3A apresenta a sequência de 411 aminoácidos de DR5 humano, tal como publicado em WO 98/51793 a 19 de Novembro de 1998. Conhece-se na especialidade uma variante de splicing de transcrição de DR5 humano. Esta variante de splicing de DR5 codifica a sequência de 440 aminoácidos de DR5 humano apresentada nas figuras 3B e 3C, tal como publicado em WO 98/35986 em 20 de Agosto de 1998. "Anticorpo de receptor de morte" utiliza-se aqui para referir em geral anticorpo ou anticorpos dirigidos a um receptor na superfamília de receptor de factor de necrose tumoral e contendo um domínio de morte capaz de sinalizar apoptose e tais anticorpos incluem anticorpo DR5 e anticorpo DR4. "Anticorpo de receptor DR5", "anticorpo DR5", ou "anticorpo anti-DR5" utiliza-se num sentido lato para referir anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de um receptor DR5, tal como a sequência 1-411 apresentada na figura 3A ou a sequência 1-440 apresentada nas figuras 3B-3C ou o seu domínio extracelular. Opcionalmente, funde-se ou liga-se o anticorpo DR5 a uma molécula ou sequência heteróloga. De preferência, a sequência heteróloga permite ou auxilia o 22 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ anticorpo a formar complexo de maior ordem ou oligómeros. Opcionalmente, o anticorpo DR5 liga-se ao receptor DR5 mas não se liga nem sofre reacção cruzada com qualquer outros receptor Apo-2L adicionais (e.g. DR4, DcRl ou DcR2). Opcionalmente, o anticorpo é um agonista da actividade de sinalização de DR5.
Opcionalmente, o anticorpo DR5 do invento liga-se a um receptor DR5 numa gama de concentração de cerca de 0,1 nM a cerca de 2 0 mM, tal como medido num ensaio de ligação BIAcore. Opcionalmente, os anticorpos DR5 do invento apresentam um valor de Ic50 de cerca de 0,6 nM a cerca de 18 mM, tal como medido num ensaio de ligação BIAcore. "Anticorpo de receptor DR4", "anticorpo DR4" ou "anticorpo anti-DR4" utiliza-se num sentido lato para referir anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de um receptor DR4 ou seu domínio extracelular. Opcionalmente funde-se ou liga-se o anticorpo DR4 a uma molécula ou sequência heteróloga. De preferência, a sequência heteróloga permite ou auxilia o anticorpo a formar complexo de ordem superior ou oligómeros. Opcionalmente, o anticorpo DR4 liga-se ao receptor DR4 mas não se liga nem sofre reacção cruzada com qualquer outro receptor Apo-2L adicional (e.g. DR5, DcRl ou DcR2). Opcionalmente, o anticorpo é um agonista da actividade de sinalização de DR4.
Opcionalmente, o anticorpo DR4 do invento liga-se a um receptor DR4 numa gama de concentração de cerca de 0,1 nM a cerca de 20 mM, tal como medido num ensaio de ligação BIAcore. Opcionalmente, os anticorpos DR4 do invento apresentam um valor de Ic50 de cerca de 0,6 nM a cerca de 18 mM, tal como medido num ensaio de ligação BIAcore. A expressão "agonista" é usada num sentido lato e inclui qualquer molécula que melhora, estimula ou activa, parcial ou completamente, uma ou mais actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5, in vitro, in situ ou in vivo. São exemplos de tais actividades biológicas a ligação de Apo2L/TRAIL a DR4 ou DR5, incluindo apoptose, bem como as relatadas adicionalmente na literatura. Um agonista pode funcionar de uma forma directa ou indirecta. Por exemplo, o 23 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ agonista pode funcionar para melhorar, estimular ou activar, parcial ou completamente, uma ou mais actividades biológicas de DR4 ou DR5, in vitro, in situ ou in vivo em resultado da sua ligação directa a DR4 ou DR5, que causa activação de receptor ou transdução de sinal. 0 agonista pode também funcionar indirectamente para melhorar, estimular ou activar, parcial ou completamente uma ou mais actividades biológicas de DR4 ou DR5, in vitro, in situ ou in vivo em resultado de, e.g., estimular outra molécula efectora que então causa activação de DR4 ou DR5 ou transdução de sinal. Considera-se que um agonista pode actuar como uma molécula melhoradora que funciona indirectamente para melhorar ou aumentar a activação ou actividade de DR4 ou DR5. Por exemplo, o agonista pode melhorar a actividade de Apo-2L endógeno num mamífero. Tal pode conseguir-se, por exemplo, por pré-complexação de DR4 ou DR5 ou por estabilização de complexos do respectivo ligando com o receptor DR4 ou DR5 (tal como estabilização do complexo nativo formado entre Apo-2L e DR4 ou DR5). A expressão "biomarcador", tal como utilizada no presente pedido, refere-se em geral a uma molécula, incluindo um gene, proteína, estrutura de hidrato de carbono ou glicolípido, cuja expressão num tecido ou célula de mamífero pode ser detectada por métodos padrão (ou métodos aqui revelados) e é prognóstico de sensibilidade de uma célula ou tecido de mamífero a Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. Tais biomarcadores abrangidos pelo presente invento incluem, entre outros, moléculas da família de proteínas GalNac-T. Foram descritos membros da família de genes e proteínas de N-acetilgalactosaminiltransferase ("GalNac-T") humana (consultar, e.g, Hang et al., "The chemistry and biology of mucin-type O-linked glicosilation initiated by the polypeptide N-acetyl-galactosaminyltransferases", Bioorganic & Medicinal Chemistry (disponível em Maio de 2005 em www.sciencedirect.com) e referências aí citadas; Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003) e referências aí citadas) e pensa-se que funcionam na determinação do número e posição de cadeias de açúcar ligadas a O em proteínas. Opcionalmente, determina-se que a expressão de tal biomarcador é maior do que a verificada para uma amostra de tecido ou célula de controlo. Opcionalmente, por exemplo, a expressão de tal biomarcador será determinada utilizando um ensaio de micromatriz de 24 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ expressão génica, PCR quantitativo ou imuno-histoquímica (IHC). Opcionalmente, a expressão de um biomarcador GalNac-T, tal como GalNac-T14 ou GalNac-T3, será detectada a um nivel de pelo menos 750, tal como medido por análise de micromatriz Affymetrix U133P ou 500 vezes ou de preferência pelo menos 1000 vezes maior na amostra de tecido ou célula de ensaio do que o verificado numa amostra de tecido ou célula de controlo, quando se detecta expressão do biomarcador utilizando PCR quantitativa. "UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipéptido N-acetil-galactosaminiltransferase-T14", "pp-GalNac-T14", "GalNac-T14", "GALNT14" são aqui utilizados para referir uma proteína membranar de tipo II com propriedades características da família de moléculas GalNac-T, compreendendo um domínio citoplasmático N-terminal, domínio transmembranar, região de haste e domínio catalítico. Numa concretização opcional, a molécula GalNac-T14 humana contém 1659 pares de bases que codificam uma proteína de 552 aminoácidos, tal como apresentada na figura 4A. O ADNc humano completo foi depositado em GenBank com o n° de acesso AB078144. Tal como revelado em Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003), foram identificadas isoformas de splicing de GalNac-T14 que incluem (ou não incluem) determinados exões, tal como exões 2, 3 e/ou 4. O presente invento abrange analisar a expressão de qualquer de tais várias isoformas de GalNac-T14 e que essa expressão de quaisquer tais isoformas é prognóstico da sensibilidade da amostra de tecido ou célula de mamífero a Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. "UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferase-T3", "pp-GalNac-T3", "GalNac-T3", "GALNT3" são aqui utilizados para referir uma proteína membranar de tipo II com propriedades características da família de moléculas GalNac-T compreendendo um domínio citoplasmático N-terminal, domínio transmembranar, região de haste e domínio catalítico. Numa concretização opcional, o polipéptido GalNac-T3 humano compreende a sequência de aminoácidos apresentada na figura 4B. GalNac-T3 é descrito adicionalmente em Bennett et al., J. Biol. Chemistry, 271:17006-17012 (1996). 25 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ "Indivíduo" ou "doente" significa qualquer indivíduo singular para o qual se pretende terapia, incluindo humanos. Também se pretende incluir como um indivíduo quaisquer indivíduos envolvidos em ensaios de investigação clínica que não mostram qualquer sinal de doença ou indivíduos envolvidos em estudos epidemiológicos ou indivíduos utilizados como controlos. A expressão "mamífero" tal como aqui utilizada refere-se a qualquer mamífero classificado como um mamífero, incluindo humanos, vacas, cavalos, cães e gatos. Numa concretização preferida do invento, o mamífero é um humano. "Amostra de tecido ou célula" significa um conjunto de células semelhantes obtidas a partir de um tecido de um indivíduo ou doente. A fonte da amostra de tecido ou célula pode ser tecido sólido, tal como de um órgão fresco, congelado e/ou conservado ou amostra de tecido ou biópsia ou aspirado; sangue ou quaisquer constituintes de sangue; fluidos corporais tal como fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial; células com qualquer tempo de gestação ou desenvolvimento do indivíduo. A amostra de tecido pode também ser células ou linhas celulares primárias ou em cultura. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula é obtida de um tumor primário ou metastático. A amostra de tecido pode conter compostos que não se misturam naturalmente com o tecido na natureza, tal como conservantes, anticoagulantes, tampões, agentes de fixação, nutrientes, antibióticos ou semelhantes.
Para os presentes objectivos, uma "secção" de uma amostra de tecido significa uma única parte ou porção de uma amostra de tecido, e.g. uma fatia fina do tecido ou células cortadas de uma amostra de tecido. Entende-se que podem retirar-se várias secções das amostras de tecido e sujeitarem-se a análise de acordo com o presente invento, desde que se entenda que o presente invento compreende um método pelo qual a mesma secção de amostra de tecido é analisada a nível morfológico e molecular ou é analisada relativamente a proteína e ácido nucleico. 26 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ "Correlacionar" ou "correlação" significa comparar de algum modo o desempenho e/ou resultados de uma primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resultados de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, podem utilizar-se os resultados de uma primeira análise ou protocolo para efectuar um segundo protocolo e/ou podem utilizar-se os resultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se se deve efectuar uma segunda análise ou protocolo. Relativamente a várias das presentes concretizações, podem utilizar-se os resultados de um ensaio analítico, tal como expressão de ARNm ou IHC, para determinar se se deve efectuar um regime terapêutico especifico que utiliza Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte.
Pretende-se que "ácido nucleico" inclua qualquer ADN ou ARN. Por exemplo, ácido nucleico cromossómico, mitocondrial, vírico e/ou bacteriano presente na amostra de tecido. A expressão "ácido nucleico" abrange qualquer uma ou ambas as cadeias de uma molécula de ácido nucleico em cadeia dupla e inclui qualquer fragmento ou parte de uma molécula de ácido nucleico intacto. "Gene" significa qualquer sequência de ácido nucleico ou sua parte com um papel funcional na codificação ou transcrição de uma proteína ou na regulação da expressão de outro gene. 0 gene pode consistir de todos os ácido nucleicos responsáveis pela codificação de uma proteína funcional ou apenas uma parte dos ácidos nucleicos responsáveis pela codificação ou expressão de uma proteína. A sequência de ácido nucleico pode conter uma anomalia genética nos exões, intrões, regiões de início ou de terminação, sequências de promotor, outras sequências de regulação ou regiões únicas adjacentes ao gene. A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou composição que está conjugado ou fundido directa ou indirectamente a um reagente, tal como uma sonda de ácido nucleico ou um anticorpo e que facilita a detecção do reagente ao qual está conjugado ou fundido. 0 próprio marcador pode ser detectável (e.g., marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um 27 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. A expressão "anticorpo" é aqui utilizada no sentido mais lato e abranqe especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g. anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo desde que apresentem a actividade biológica pretendida.
Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anticorpo intacto, de preferência compreendendo a sua região de ligação a antigénio ou variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo em cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. "Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150000 dalton, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação covalente dissulfureto e o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfureto espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que determinados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. A expressão "variável" refere-se ao facto de determinadas partes da sequência dos domínios variáveis terem uma sequência que difere grandemente entre anticorpos e serem utilizadas na ligação e na especificidade de cada anticorpo em particular para o seu determinado antigénio. No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos 28 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis denominam-se regiões de esqueleto (FR). Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem quatro FR, que adoptam maioritariamente uma configuração em folha β, ligados por três regiões hipervariáveis, que formam ansas que se ligam à estrutura em folha β e, em alguns casos, fazem parte da estrutural em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas em grande proximidade pelas FR e, conjuntamente com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antigénio dos anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de anticorpo a um antigénio, mas apresentam várias funções efectoras, tal como participação do anticorpo em citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um dos quais com um único local de ligação de antigénio, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflecte a sua capacidade de cristalizar facilmente. 0 tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação de antigénio e ainda é capaz de ligação cruzada com antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antigénio e local de ligação de antigénio completos. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve associados fortemente, de forma não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interactuam para definir um local de ligação de antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único 29 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar antigénio, embora com uma menor afinidade do que o local de ligação completo. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobra do anticorpo. Fab'-SH é a presente denominação para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contem(êm) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobra entre eles. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser classificadas num de dois tipos claramente distintos, denominados kapa (κ) e lambda (λ) , com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser classificados em diferentes classes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser divididas adicionalmente em subclasses (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios contantes de cadeia pesada correspondem às diferentes classes de anticorpos e denominam-se α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
Os fragmentos de anticorpo "Fv em cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios de anticorpo VH e VL, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptido. De preferência, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante polipéptido entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura pretendida para 30 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ ligação de antigénio. Para uma revisão de scFv consultar Pliickthun em The Pharmacology of Monoclonal Antíbodies, vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994). A expressão "diacorpos" refere-se a fragmentos pequenos de anticorpo com dois locais de ligação de antigénio, fragmentos esses que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipéptido (VH - VL) . Através da utilização de um ligante demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois locais de ligação de antigénio. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993). A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minoritárias. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, contrariamente às preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque podem ser sintetizados por cultura de hibridoma não contaminados com outras imunoglobulinas. O adjectivo "monoclonal" é indicativo da característica do anticorpo de ser obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser interpretado como implicando um método especifico para a produção do anticorpo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com o presente invento podem ser preparados pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler. et al., Nature, 256:495 (1975) ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (consultar, e.g., 31 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ patente U.S. η° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et ai./ Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo; bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica pretendida (patente U.S. n° 4 816 567; Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse incluem aqui "anticorpos primatizados" compreendendo sequências de domínio variável de ligação de antigénio derivadas de um primata não humano (e.g. macaco do Velho Mundo, tal como babuíno, macaco-resos ou macaco cinamolgos) e sequências de região constante humanas (Patente US N° 5 693 780).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) nos quais se substituem resíduos de uma região hipervariável do recebedor por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primatas não humanos, com a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Em alguns casos, substituem-se resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana pelos resíduos correspondentes não humanos. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor ou no anticorpo dador. Estas modificações são efectuadas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, 32 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e
Presta, Curr. Op. Struct. Blol. 2:593-596 (1992). A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (e.g. resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (e.g. resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Blol. 196:901-917 (1987)). Os resíduos de "esqueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não são resíduos da região hipervariável, tal como aqui definida.
Um anticorpo "que liga" um antigénio de interesse é aquele que é capaz de ligação ao antigénio com afinidade e/ou avidez suficiente de modo ao anticorpo ser útil como um agente terapêutico ou de diagnóstico para ter como alvo uma célula que expressa o antigénio.
Para os presentes objectivos, "imunoterapia" refere-se a um método de tratar um mamífero (de preferência um doente humano) com um anticorpo, em que o anticorpo pode ser um anticorpo não conjugado ou "nu" ou o anticorpo pode ser conjugado ou fundido com molécula(s) ou agente(s) 33 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ heterólogos, tal como um ou mais agentes citotóxicos, gerando assim um "imunoconjugado".
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e, com a maior preferência, a mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna utilizando um sequenciador de copo rotativo ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras, utilizando coloração com azul de Coomassie ou, de preferência, com prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes dado que não estará presente pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo. Contudo usualmente o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação. A expressão "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente (e.g. Apo2L/TRAIL, anticorpo anti-DR4 ou DR5 etc.) que é eficaz para prevenir, melhorar ou tratar a doença em causa.
As expressões "tratar", "tratamento" e "terapia" tal como aqui utilizadas referem-se a terapia curativa, terapia profiláctica e terapia preventiva. Tratamento ou administração consecutivos refere-se a tratamento numa base pelo menos diária sem interrupção de tratamento durante um ou mais dias. Tratamento ou administração intermitentes ou tratamento ou administração de uma forma intermitente refere-se a tratamento que não é consecutivo, mas tem um natureza cíclica. A expressão "citoquina" é uma expressão genérica para proteínas libertadas por uma população celular que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Os 34 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ exemplos de tais citoquinas são linfoquinas, monoquinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Estão incluídas entre as citoquinas hormona de crescimento, tal como hormona de crescimento humana, N-metionil-hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas de qlicoproteínas tais como hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; pró-lactina; lactogénio placentário; factor de necrose tumoral-α e factor de necrose tumoral-β; substância de inibição mulleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento de nervos; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento por transformação (TGF) tal como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento-I e factor de crescimento-II tipo insulina; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tal como interferão-a, interferão-β e interferão-gama; factores de estimulação de colónias (CSF) tal como CSF de macrófago (M-CSF); CSF de granulócito-macrófago (GM-CSF); e CSF de granulócito (G-CSF); interleuquinas (IL) tal como IL-1, IL-2, IL—3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; e outros factores polipeptidicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui utilizada, a expressão citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes activos biologicamente de citoquinas de sequência nativa. A expressão "agente citotóxico" tal como aqui utilizada refere-se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causa destruição de células. Pretende-se que a expressão inclua isótopos radioactivos (e.g., I131, I125, Y90 e Re186) , agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tal 35 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (em particular criptoficina 1 e criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de azoto tal como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tal como os antibióticos enodiino (e.g. caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamall e caliqueamicina phill, consultar, e.g., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de antibiótico enodiino de cromoproteina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin™) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, 36 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reconstituinte de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosideo de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinóides tal como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofirana; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, e.g. paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar™) 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposideo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina (Navelbine™); novantrona; teniposideo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tal como ácido retinóico; capecitabina; e sais ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores. Também se incluem nesta definição agentes anti-hormonais que actuam para regular ou inibir a acção de hormonas em tumores, tais como anti-estrogénios e moduladores de receptor de estrogénio selectivo (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifena, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston™); inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas suprarrenais, tal como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, 37 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ acetato de fadrozola, anastrozola flutamida, goserelina; megestrol (Megace™ vorozola (Rivisor™) exemestano, letrozola formestano, ' Femara™) e (Arimidex™); e anti-androgénios tais como nilutamida, bicalutamida, leuprolideo e e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores.
Um "agente de inibição de crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente célula de cancro que sobrexpressa qualquer dos genes aqui identificados, in vitro ou in vivo. Assim, o agente de inibição de crescimento é aquele que reduz significativamente a percentagem de células que sobrexpressa tais genes em fase S. Os exemplos de agentes de inibição de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local diferente de fase S), tais como agentes que induzem paragem G1 e paragem em fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxol e inibidores de topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposideo e bleomicina. Os agentes de paragem G1 também se prolongam para paragem em fase S, por exemplo, agentes de alquilação de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode encontrar-se informação adicional em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, ed., Capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.
As expressões "apoptose" e "actividade apoptótica" são utilizadas num sentido lato e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte celular em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais alterações celulares características, incluindo condensação de citoplasma, perda de microvilos da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda de função mitocondrial. Esta actividade pode ser determinada e medida, por exemplo, por ensaios de viabilidade celular (tal como ensaios de azul de Alamar ou ensaios MTT), análise FACS, activação de caspase, fragmentação de ADN (consultar, por exemplo, Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 38 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ (1991) e ensaios de clivagem de poli-ADP ribose polimerase, "PARP", conhecidos na especialidade.
Tal como aqui utilizada, a expressão "doença" refere-se em geral a qualquer condição que beneficiaria de tratamento com as composições aqui descritas, incluindo qualquer doença que possa ser tratada por quantidades eficazes de Apo2L/TRAIL, um anticorpo anti-DR4 e/ou um anticorpo anti-DR5. Tal inclui doenças crónicas e agudas, bem como as condições patológicas que predispõem o mamífero à doença em causa. Os exemplos não limitativos de doenças a serem aqui tratadas incluem cancros benignos e malignos; doenças inflamatórias, angiogénicas e imunológicas, doenças auto-imunes, artrite (incluindo artrite reumatóide), esclerose múltipla e VIH/SIDA.
As expressões "cancro", "canceroso" ou "maligno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarcoma. Exemplos mais específicos de tais cancros incluem carcinoma das células escamosas, mieloma, cancro de pulmão de pequenas células, cancro de pulmão de não pequenas células, glioma, linfoma de hodgkin, linfoma não hodgkin, cancro gastrointestinal (tracto), cancro renal, cancro dos ovários, cancro do fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cancro colorrectal, cancro do endométrio, cancro do rim, cancro da próstata, cancro da tiróide, melanoma, condrossarcoma, neuroblastoma, cancro pancreático, glioblastoma multiforme, cancro cervical, cancro do cérebro, cancro do estômago, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, carcinoma do colon e cancro da cabeça e pescoço. A expressão "marcado" quando aqui utilizada refere-se a uma molécula quimérica compreendendo um anticorpo ou polipéptido fundido a um "polipéptido marcador". 0 polipéptido marcador tem resíduos suficientes para proporcionar um epítopo com o qual se pode preparar um anticorpo ou para proporcionar alguma outra função, tal como a capacidade de oligomerizar (e.g. tal como acontece com péptidos contendo domínios de cremalheira de leucina), no 39 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ entanto é suficientemente curto para em geral não interferir com a actividade do anticorpo ou polipéptido. De preferência o polipéptido marcador também é bastante único, de modo que o anticorpo especifico do marcador não tenha reacção cruzada substancial com outros epitopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm em geral pelo menos seis resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 a cerca de 20 resíduos). A expressão "ião metálico divalente" refere-se a um ião metálico com duas cargas positivas. Os exemplos de iões metálicos divalentes incluem, entre outros, zinco, cobalto, níquel, cádmio, magnésio e manganês. As formas específicas de tais metais que podem ser utilizadas incluem formas em sal (e.g., formas em sal farmaceuticamente aceitáveis), tal como formas de cloreto, acetato, carbonato, citrato e sulfato dos iões metálicos divalentes supramencionados. Opcionalmente, um ião metálico divalente para utilização no presente invento é zinco e, de preferência, a forma em sal sulfato de zinco ou cloreto de zinco. "Isolado" quando utilizado para descrever os vários péptidos ou proteínas aqui revelados, significa péptido ou proteína que foram identificados e separados e/ou recuperados de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o péptido ou proteína e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Em concretizações preferidas, o péptido ou proteína será purificado (1) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (2) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições não redutoras ou redutoras utilizando coloração de azul de Coomassie ou, de preferência, prata ou (3) até homogeneidade por técnicas de espectroscopia de massa ou de mapeamento de péptido. 0 material isolado inclui péptido ou proteína in situ dentro de células recombinantes, dado que não estará presente pelo menos um componente do seu ambiente natural. 40 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Contudo, usualmente, ο péptido ou proteína isolados serão preparados por pelo menos uma etapa de purificação. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" relativamente às sequências aqui identificadas define-se como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, após alinhamento das sequências e introdução de falhas, caso necessário, para atingir a percentagem de identidade de sequência máxima e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para objectivos de determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas conhecidas na especialidade que podem determinar parâmetros adequados para medição de alinhamento, incluindo atribuir os algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo das sequências completas em comparação. Para os presentes objectivos, os valores de percentagem de identidade de aminoácidos podem ser obtidos utilizando o programa de computador de comparação de sequências, ALIGN-2, da autoria de Genentech, Inc. e o código fonte que foi depositado conjuntamente com documentação do usuário no escritório de patentes US, Washington, DC, 20559, registado com o n° de registo de patente US TXU510087. 0 programa ALIGN-2 está disponível ao público através de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. O "rigor" de reacções de hibridação é fácil de determinar por um perito na especialidade e em geral é um cálculo empírico dependente do comprimento de sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, as sondas mais longas requerem temperaturas mais elevadas para hibridação adequada enquanto as sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação depende geralmente da capacidade do ADN desnaturado re-hibridar quando se encontram presentes no ambiente cadeias complementares, a temperaturas inferiores à sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de identidade pretendido entra a sonda e a sequência a hibridar, maior a temperatura relativa que pode 41 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ ser utilizada. Consequentemente, as temperaturas relativas mais elevadas tenderão a tornar as condições reaccionais mais rigorosas, enquanto as temperaturas mais baixas as tornam menos rigorosas. Para detalhes adicionais e explicação do rigor de reacções de hibridação, consultar Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
As "condições altamente rigorosas", tal como aqui definidas, são identificadas por: (1) utilização de força iónica baixa e elevada temperatura para lavagem; cloreto de sódio 0,015 M /citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato de sódio a 0,1% a 50 °C; (2) utilização de um agente desnaturante durante a hibridação; formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1%/ Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 °C; ou (3) utilização de formamida a 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0, 075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55 °C, seguido por lavagem altamente rigorosa consistindo de 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
As "condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadas tal como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e incluem incubação durante a noite a 37 °C numa solução compreendendo: formamida a 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trissódio 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão desnaturado cisalhado a 20 mg/ml, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50 °C. O perito na especialidade reconhecerá como ajustar a temperatura, força iónica, etc. tal como necessário para acomodar factores tal como comprimento da sonda e semelhantes. A expressão "iniciador" ou "iniciadores" refere-se a sequências de oligonucleótidos que hibridam com 42 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ polinucleótido alvo de ARN ou ADN complementar e servem como pontos de partida para a síntese em etapas de um polinucleótido a partir de mononucleótidos pela acção de uma nucleotidiltransferase, tal como ocorre por exemplo numa reacção de polimerização em cadeia. A expressão "sequências de controlo" refere-se às sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operacionalmente num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação a ribossoma. Sabe-se que as células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e facilitadores. 0 ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando se coloca numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de excreção está ligado operacionalmente a ADN para um polipéptido caso seja expresso como uma pré-proteína que participa na excreção do polipéptido; um promotor ou facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação caso afecte a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação caso esteja posicionado de modo a facilitar tradução. Em geral, "ligado operacionalmente" significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas e, no caso de um líder de excreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, não é necessário que os facilitadores sejam contíguos. A ligação é efectuada por ligação em locais de restrição convenientes. Caso não existam tais locais, utilizam-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos de acordo com a prática convencional. "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se a uma reacção mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (e.g. células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causam lise da célula alvo. As células principais para mediar ADCC, células 43 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ ΝΚ, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Resume-se na tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) a expressão de FcR em células hematopoiéticas. Para avaliar a actividade ADCC de uma molécula de interesse, pode efectuar-se um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito em patente US No. 5 500 362 ou 5 821 337. As células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK) . Alternativa ou adicionalmente, pode avaliar-se in vivo a actividade ADCC da molécula de interesse, e.g., num modelo animal tal como o revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos FcyRIII e efectuam função de efector de ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK) , monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidos PBMC e células NK.
As expressões "receptor Fc" ou "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é uma sequência FcR nativa humana. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas com splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de activação FcyRIIA contém um motivo de activação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (consultar Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. 44 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Clin. Med. 126:330-41 (1995). Abrangem-se aqui pela expressão "FcR" outros FcR, incluindo os que serão identificados no futuro. A expressão também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Aqui, os FcR incluem polimorfismos tal como o dimorfismo genético no gene que codifica FcYRIIIa resultando numa fenilalanina (F) ou numa valina (V) na posição de aminoácido 158, localizada na região do receptor que se liga a IgGl. Demonstrou-se que a valina homozigótica FcYRIIIa (FcYRIIIa-158V) tem uma afinidade mais elevada para IgGl humana e medeia ADCC aumentada in vitro relativamente a receptores com fenilalanina homozigótica FcYRIIIa (FcYRIIIa-158F) ou receptores heterozigóticos (FcYRIIIa-158F/V). "A citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula lisar um alvo na presença de complemento. A via de activação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Clq) a uma molécula (e.g. um anticorpo) complexada com um antigénio cognato. Para avaliar a activação de complemento pode efectuar-se um ensaio CDC, e.g. tal como descrito em Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202:163 (1996) .
II. EXEMPLOS DE MÉTODOS E MATERIAIS DO INVENTO
Os métodos e ensaios aqui revelados referem-se à análise de expressão de um ou mais biomarcadores numa amostra de tecido ou célula de mamífero, em que a determinação dessa expressão de um ou mais tais biomarcadores é prognóstico ou indicativa de a amostra de tecido ou célula ser sensível a agentes tal como Apo2L/TRAIL e/ou anticorpos de receptor de morte tal como anticorpos agonistas anti-DR5 ou anticorpos agonistas anti-DR4. Os métodos e ensaios incluem os que analisam expressão de membros da família de moléculas GalNac-T, incluindo GalNac-T14 e GalNac-T3.
Tal como discutido anteriormente, existem algumas populações de tipos de células humanas doentes (tal como determinadas populações de células de cancro) que são 45 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ resistentes aos efeitos de morte celular induzidos por Apo2L/TRAIL ou anticorpos de receptor de morte. Pensa-se portanto que os métodos e ensaios revelados podem proporcionar meios conveniente, eficazes e potencialmente eficazes em termos de custo para obter dados e informação útil para avaliar terapias adequadas ou eficazes para tratar doentes. Por exemplo, pode fazer-se uma biópsia a um doente que foi diaqnosticado com cancro ou com uma doença relacionada com os sistema imunitário para obter uma amostra de tecido ou célula e a amostra pode ser analisada através de vários ensaios in vitro para determinar se as células do doente seriam sensíveis a um agente terapêutico tal como Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. 0 invento proporciona métodos para prever a sensibilidade de uma amostra de tecido ou célula de mamífero (tal como uma célula de cancro) a Apo2L/TRAIL ou a um anticorpo agonista de receptor de morte. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula de mamífero é obtida e analisada para expressão de GalNac-T14. Os métodos podem ser efectuados em vários formatos de ensaio, incluindo ensaios que detectam expressão de ARNm, expressão de proteína (tal como ensaios imuno-histoquímicos) e ensaios bioquímicos que detectam actividade enzimática de UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferase. A determinação de expressão de tais biomarcadores GalNac-T14 nos referidos tecidos ou células será prognóstico de tais tecidos ou células serem sensíveis aos efeitos biológicos de Apo2L/TRAIL e/ou anticorpo de receptor de morte. Os requerentes verificaram surpreendentemente que a expressão de GalNac-T14 se correlaciona com a sensibilidade de tais tecidos e células a Apo2L/TRAIL e anticorpos agonistas de receptores de morte.
Tal como seguidamente discutido, a expressão de vários biomarcadores, tal como GalNac-T14, numa amostra pode ser analisada através de várias metodologias, muitas das quais são conhecidas na especialidade e percebidas pelo perito na especialidade, incluindo entre outros, análise imuno-histoquímica e/ou Western, ensaios quantitativos baseados em sangue (tal como por exemplo ELISA de soro) (para analisar, por exemplo, níveis de expressão de proteína), ensaios bioquímicos de actividade enzimática, hibridação in situ, 46 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ análise "Northern" e/ou análise de ARNm por PCR e análise genómica "Southern" (para analisar, por exemplo, deleção ou amplificação génica), bem como qualquer de uma vasta gama de ensaios que podem ser efectuados por análise de matriz de gene e/ou tecido. Os protocolos típicos para avaliar o estado de genes e produtos génicos encontram-se, por exemplo em Ausubel et al. ed., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferência "Northern"), 4 (transferência "Southern"), 15 (imuno-transferência) e 18 (análise por PCR).
Os protocolos em seguida relativos à detecção de GalNac-T14 numa amostra apresentam-se seguidamente a título ilustrativo.
Os métodos opcionais do invento incluem protocolos com análise ou teste da presença de GalNac-T14 numa amostra de tecido ou célula de mamífero. Podem utilizar-se vários métodos para detectar GalNac-T14 e incluem, por exemplo, análise imuno-histoquímica, imunoprecipitação, análise de transferência "Western", ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA, separação de células activada por fluorescência (FACS), e imunoprecipitação seguida de MS, análise de monossaccáridos. Por exemplo, um método opcional de detectar a expressão de GalNac-Tl4 num tecido ou amostra compreende pôr em contacto a amostra com um anticorpo anti-GalNac-T14 e seguidamente detectar a ligação do anticorpo a GalNac-T14 na amostra.
Em concretizações específicas do invento, analisa-se a expressão de GalNac-T14 numa amostra utilizando imuno-histoquímica e protocolos de coloração. Demonstrou-se que a coloração imuno-histoquímica de secções de tecido é um método fiável de avaliar ou detectar a presença de proteínas numa amostra. As técnicas de imuno-histoquímica ("IHC") utilizam um anticorpo para sondar e visualizar antigénios celulares in situ, em geral por métodos cromogénicos ou fluorescentes.
Para preparação da amostra, pode utilizar-se uma amostra de tecido ou células de um mamífero (tipicamente um doente 47 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ humano). Os exemplos de amostras incluem, entre outros, células de cancro tal como células de cancro do cólon, mama, próstata, ovários, pulmão, estômago, pâncreas, linfoma e leucemia. Opcionalmente, as amostras incluem células de cancro de pulmão de não pequenas células, células de cancro pancreático ou células de cancro de linfoma não hodgkin. A amostra pode ser obtida por vários procedimentos conhecidos na especialidade incluindo, entre outros, excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia. 0 tecido pode ser fresco ou congelado. Numa concretização, a amostra é fixada e embebida em parafina ou semelhante. A amostra de tecido pode ser fixada (i.e. conservada) por metodologia convencional (consultar e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 3a edição (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Lahoratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). O perito na especialidade considerará que a selecção de um agente de fixação é determinada pelo objectivo de a amostra ser corada histologicamente ou analisada de outra forma. Um perito na especialidade considerará também que a duração da fixação depende do tamanho da amostra de tecido e do agente de fixação utilizado. Como exemplo, pode utilizar-se formalina tamponada neutra, Bouin ou paraformaldeido para fixar uma amostra.
Em geral, a amostra é primeiramente fixada e é então desidratada através de uma série ascendente de álcoois, infiltrada e embebida em parafina ou outro meio de seccionação de modo que a amostra de tecido possa ser seccionada. Alternativamente, pode seccionar-se o tecido e fixar as secções obtidas. Como exemplo; a amostra de tecido pode ser embebida e processada em parafina para metodologia convencional (consultar e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Os exemplos de parafinas que se podem utilizar incluem, entre outros, Paraplast, Broloid e Tissuemay. Uma vez embebida a amostra de tecido, pode seccionar-se a amostra 48 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ com um micrótomo ou semelhante (consultar e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Como exemplo para este procedimento, as secções podem ter na gama de cerca de três micra a cerca de cinco micra de espessura. Uma vez seccionada, as secções podem ser ligadas a lâminas por vários métodos padrão. Os exemplos de adesivos para lâminas incluem, entre outros, silano, gelatina, poli-L-lisinA e semelhantes. Como exemplo, as secções embebidas em parafina podem ser ligadas a lâminas carregadas positivamente e/ou lâminas revestidas com poli-L-lisina.
Caso se tenha utilizado parafina como material para embeber, as secções de tecido são em geral desparafinadas e reidratadas com água. As secções de tecido podem ser desparafinadas por várias metodologias padrão convencionais. Por exemplo, podem utilizar-se xilenos e uma série gradualmente descendente de álcoois (consultar e.g., "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supracitado). Alternativamente, podem utilizar-se agentes não orgânicos de desparafinação disponíveis comercialmente tal como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).
Opcionalmente, subsequentemente à preparação da amostra, pode analisar-se uma secção de tecido utilizando IHC. Pode efectuar-se IHC em combinação com técnicas adicionais, tais como coloração morfológica e/ou hibridação in situ por fluorescência. Estão disponíveis dois métodos gerais de IHC; ensaios directos e indirectos. De acordo com o primeiro ensaio, determina-se directamente a ligação de anticorpo ao antigénio alvo (e.g., GalNac-T14). Este ensaio directo utiliza um reagente marcado, tal como um anticorpo primário com um marcador fluorescente ou marcado com enzima, que pode ser visualizado sem interacção com anticorpo adicional. Num ensaio indirecto típico, liga-se anticorpo primário não conjugado ao antigénio e seguidamente liga-se um anticorpo secundário marcado ao anticorpo primário. Quando se conjuga um anticorpo secundário a um marcador enzimático, adiciona-se um substrato cromogénico ou fluorogénico para proporcionar visualização do antigénio. Ocorre amplificação de sinal 49 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ porque vários anticorpos secundários podem reagir com diferentes epitopos no anticorpo primário. 0 anticorpo primário e/ou secundário utilizado para imuno-histoquimica será tipicamente marcado com uma parte detectável. Encontram-se disponíveis muitos marcadores que podem em geral ser agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tal como 35S, 14C, 125I, 3H e 1311. 0 anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al. , Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991) por exemplo e pode medir-se a radioactividade utilizando contagem de cintilações. (b) Partículas de ouro coloidal. (c) Marcadores fluorescentes incluindo, entre outros, quelatos de terras raras (quelatos de európio), vermelho do
Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lissamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina ou fluoróforos disponíveis comercialmente tais como SPECTRUM 0RANGE7 e SPECTRUM GREEN7 e/ou derivados de qualquer um ou mais dos anteriores. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo utilizando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (d) Estão disponíveis vários marcadores enzima-substrato e a patente U.S. n° 4 275 149 proporciona uma revisão de alguns destes. A enzima geralmente catalisa a alteração química do substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor de um substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiluminescência do substrato. Descrevem-se anteriormente técnicas para quantificar uma alteração de fluorescência. 0 substrato quimiluminescente fica excitado electronicamente através de uma reacção química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimiluminómetro, por exemplo) ou cede energia a um aceitador fluorescente. Os exemplos de 50 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ marcadores enzimáticos incluem luciferases (e.g., luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; patente U.S. n° 4 737 456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido oxidases (e.g., glucose oxidase, galactose oxidase e glucose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterociclicas (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhantes. Descrevem-se técnicas para conjugar enzimas a anticorpos em 0'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed. J. Langone e H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981).
Os exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano (HRPO) com peroxidase de hidrogénio como um substrato em que a peroxidase de hidrogénio oxida um corante precursor (e.g., ortofenilenodianina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) Fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; e (iii) (β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (e.g., p-nitrofenil-p-D-galactosidase) ou substrato fluorogénico (e.g., 4-metilumbeliferil-β-Ό-galactosidase).
Estão disponíveis aos peritos na especialidade várias outras combinações enzima-substrato. Para uma revisão geral destas consultar as patentes U.S. n° 4 275 149 e 4 318 980. Algumas vezes o marcador está conjugado indirectamente com o anticorpo. O perito na especialidade estará ciente das várias técnicas para atingir este objectivo. Por exemplo, pode conjugar-se o anticorpo com biotina e pode conjugar-se qualquer marcador pertencente às quatro categorias alargadas anteriormente mencionadas com avidina ou vice-versa. A biotina liga-se selectivamente a avidina e assim o marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta forma indirecta. Alternativamente, para obter conjugação indirecta do marcador 51 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ com ο anticorpo conjuga-se ο anticorpo com um hapteno pequeno e um dos diferentes tipos de marcadores anteriormente mencionados é conjugado com um anticorpo anti-hapteno. Assim, pode obter-se conjugação indirecta do marcador com o anticorpo.
Além dos procedimentos de preparação de amostra discutidos anteriormente, pode pretender-se adicionalmente tratar a secção de tecido antes, durante ou após IHC. Por exemplo, podem efectuar-se métodos de recuperação de epitopos tal como aquecer a amostra de tecido em tampão citrato (consultar, e.g., Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4 (3) :201 (1996) ) .
Após uma etapa de bloqueamento opcional, expõe-se a secção de tecido a anticorpo primário durante um período de tempo suficiente e sob condições adequadas de modo a que o anticorpo primário se ligue ao antigénio de proteína alvo na amostra de tecido. As condições adequadas para atingir este objectivo podem ser determinadas por experimentação rotineira. Determina-se a extensão de ligação do anticorpo à amostra utilizando qualquer um dos marcadores detectáveis discutidos anteriormente. Preferentemente, o marcador é um marcador enzimático (e.g. HRPO) que catalisa uma alteração química do substrato cromogénico tal como o cromogéneo 3,3'-diaminobenzidina. Preferentemente o marcador enzimático é conjugado a um anticorpo que se liga especificamente ao anticorpo primário (e.g. o anticorpo primário é anticorpo policlonal de coelho e o anticorpo secundário é anticorpo de cabra anti-coelho).
Opcionalmente, os anticorpos utilizados na análise IHC para detectar expressão de GalNac-T14 são anticorpos anti-GalNac-T14. Alternativamente pode utilizar-se anticorpos para outros antigénios GalNac-T que tenham reactividade cruzada com GalNac-T14. Opcionalmente, o anticorpo anti-GalNac-T14 é um anticorpo monoclonal.
Os espécimes assim preparados podem ser montados e cobertos com uma lamela. Efectua-se então a avaliação das lâminas, e.g. utilizando um microscópio e podem utilizar-se critérios de intensidade de coloração utilizados 52 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ rotineiramente na especialidade. Os critérios de intensidade de coloração podem ser avaliados do seguinte modo: TABELA 1
Padrão de coloração Pontuação Não se observa coloração nas células 0 Detecta-se uma coloração ténue e dificilmente perceptivel em mais de 10% das células 1+ Observa-se uma coloração fraca a moderada em mais de 10% das células 2+ Observa-se uma coloração moderada a forte em mais de 10% das células 3+
Tipicamente pensa-se que uma pontuação de padrão de coloração de cerca de 2+ ou superior em tal ensaio IHC é prognóstica ou indicativa de sensibilidade de uma célula de mamífero (tal como uma célula de cancro de mamífero) a Apo2L/TRAIL ou a um anticorpo agonista de receptor de morte.
Em métodos alternativos, pode pôr-se a amostra em contacto com um anticorpo específico para o referido biomarcador sob condições suficientes para se formar um complexo anticorpo-biomarcador; e seguidamente detectar o referido complexo. A presença do biomarcador pode conseguir-se de várias formas, tal como por hibridação "Western" (com ou sem imunoprecipitação) e procedimentos de ELISA para ensaiar uma grande variedade de tecidos e amostras incluindo plasma ou soro. Estão disponíveis uma grande variedade de técnicas de imunoensaio que utilizam tal formato de ensaio, consultar, e.g., patentes U.S. n° 4 016 043, 4 424 279 e 4 018 653. Estas incluem ensaios de local único ou de dois locais ou "sanduíche" dos tipos não competitivos, assim como os ensaios de ligação competitiva tradicionais. Estes ensaios também incluem ligação directa de um anticorpo marcado a um biomarcador alvo.
Os ensaios "sanduíche" contam-se entre os ensaios mais úteis e mais habitualmente utilizados. Existem várias variações da técnica de ensaio "sanduíche" e pretende-se que todas estejam abrangidas pelo invento. Sucintamente, num ensaio para a frente típico, imobiliza-se um anticorpo não 53 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ marcado num substrato sólido e a amostra a ser ensaiada é posta em contacto com a molécula ligada. Após um período de incubação adequado, durante um período de tempo suficiente para permitir formação de um complexo anticorpo-antigénio, adiciona-se um segundo anticorpo específico para o antigénio marcado com uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável e incuba-se, deixando tempo suficiente para a formação de outro complexo anticorpo-antigénio-anticorpo marcado. Lava-se qualquer material não reagido e determina-se a presença do antigénio por observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, por simples observação do sinal visível ou podem ser quantificados por comparação com uma amostra de controlo contendo quantidades conhecidas de biomarcador.
As variações do ensaio para a frente incluem um ensaio simultâneo no qual tanto a amostra como o anticorpo marcado são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem conhecidas dos peritos na especialidade, incluindo quaisquer pequenas variações tal como se tornará evidente. Num ensaio em sanduíche para a frente típico, um primeiro anticorpo com especificidade para o biomarcador é ligado de forma covalente ou passiva a uma superfície sólida. A superfície sólida é tipicamente vidro ou um polímero sendo os polímeros mais habitualmente utilizados celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser sob a forma de tubos, pérolas, discos de microplacas ou qualquer outra superfície adequada para efectuar um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos na especialidade e consistem geralmente de ligação cruzada covalente ou adsorção física, lavar o complexo polímero-anticorpo em preparação para a amostra de ensaio. Adiciona-se então uma alíquota da amostra a ensaiar ao complexo de fase sólida e incuba-se durante um período de tempo suficiente (e.g. 2-40 minutos ou durante a noite se for mais conveniente) e sob condições adequadas (e.g. desde temperatura ambiente a 40 °C tal como entre 25 °C e 32 °C inclusive) para permitir ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. Após o período de incubação, lava-se e seca-se a fase sólida com subunidade do anticorpo e incuba-se com um segundo anticorpo específico para uma parte de um biomarcador. Liga-se o segundo anticorpo 54 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ a uma molécula repórter que é utilizada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao marcador molecular.
Um método alternativo envolve imobilizar os biomarcadores alvo na amostra e seguidamente expor o alvo imobilizado a anticorpo especifico que pode estar ou não marcado com uma molécula repórter. Dependendo da quantidade de alvo e da intensidade do sinal da molécula repórter pode detectar-se um alvo ligado por marcação directa com o anticorpo. Alternativamente expõe-se um segundo anticorpo marcado especifico para o primeiro anticorpo, ao complexo entre o alvo e o primeiro anticorpo para formar um complexo terciário alvo-primeiro anticorpo-segundo anticorpo. Detecta-se o complexo pelo sinal emitido pela molécula repórter. "Molécula repórter" tal como utilizado no presente fascículo significa uma molécula que, devido à sua natureza química, proporciona um sinal analítico identificável que permite a detecção de anticorpo ligado a antigénio. As moléculas repórter mais habitualmente utilizadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclídeos (i.e. radioisótopos) e moléculas quimiluminescentes.
No caso de um immunoensaio enzimático conjuga-se uma enzima com o segundo anticorpo, geralmente através de glutaraldeído ou periodato. Tal com se tornará evidente, contudo, existe uma grande variedade de técnicas de conjugação diferentes que estão facilmente disponíveis aos peritos na especialidade. As enzimas habitualmente utilizadas incluem peroxidase de rábano; glucose oxidase, -galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a utilizar com as enzimas específicas são geralmente escolhidas para a produção de uma alteração de cor detectável por hidrólise pela enzima correspondente. Os exemplos de enzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e peroxidase. É também possível utilizar substratos fluorogénicos que produzem um produto fluorescente em vez dos substratos cromogénicos referidos anteriormente. Em todos os casos, adiciona-se enzima-anticorpo marcado ao complexo de primeiro anticorpo-marcador molecular, deixa-se ligar e seguidamente lava-se para retirar o reagente em excesso. Adiciona-se então solução contendo o substrato apropriado ao complexo anticorpo-antigénio-anticorpo. 0 substrato reagirá com a enzima ligada ao segundo 55 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ anticorpo, proporcionando um sinal visual qualitativo que pode ser adicionalmente quantificado, habitualmente espectrofotometricamente, para dar uma indicação da quantidade de biomarcador que estava presente na amostra. Alternativamente podem acoplar-se quimicamente compostos fluorescentes, tal como fluoresceina e rodamina, a anticorpos sem alterar a sua capacidade de ligação. Quando activados por iluminação com luz de determinado comprimento de onda, o anticorpo marcado com fluorocrómio absorve a energia luminosa induzindo um estado que leva à excitação da molécula, seguido de emissão da luz a uma cor caracteristica detectável visualmente com um microscópio óptico. Tal como em EIA, deixa-se que o anticorpo marcado com fluorescência se ligue ao complexo de primeiro anticorpo-marcador molecular. Após lavagem para remover reagente não ligado, o complexo terciário remanescente é então exposto a luz com o comprimento de onda adequado e a fluorescência observada indica a presença do marcador molecular de interesse. As técnicas de imunofluorescência e EIA estão ambas muito bem estabelecidas na especialidade. Contudo, podem também utilizar-se outras moléculas repórter tal como radioisótopos, moléculas quimiluminescentes ou bioluminescentes.
Considera-se que as técnicas anteriormente descritas podem também ser utilizadas para detectar expressão de GalNac-T14.
Os métodos do invento incluem adicionalmente protocolos que analisam a presença e/ou expressão de ARNm de GalNac-T14 numa amostra de tecido ou célula. Os métodos para a avaliação de ARNm em células são bem conhecidos e incluem, por exemplo, ensaios de hibridação utilizando sondas de ADN complementar (tal como hibridação in situ utilizando ribossondas GalNac-T14 marcadas, transferência "Northern" e técnicas relacionadas) e vários ensaios de amplificação de ácido nucleico (tal como RT-PCR utilizando iniciadores complementares específicos para GalNac-T14 e outros métodos de detecção do tipo amplificação tal como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA e semelhantes).
As amostras de tecidos ou células de mamíferos podem ser convenientemente ensaiadas para, e.g., ARNm de GalNac-T14 55 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ utilizando análise "Northern", transferência "dot" ou PCR. Por exemplo, os ensaios de RT-PCR tal como PCR quantitativa são bem conhecidos na especialidade. Numa concretização do invento ilustrativa, um método para detectar ARNm de GalNac-T14 numa amostra biológica compreende produzir ADNc da amostra por transcrição reversa utilizando pelo menos um iniciador; amplificar o ADNc assim produzido utilizando um polinucleótido GalNac-T14 como iniciador em sentido e em anti-sentido para assim amplificar ADNc de GalNac-T14; e detectar a presença do ADNc de GalNac-T14 amplificado. Além disso, tais métodos podem incluir uma ou mais etapas que permitem determinar os níveis de ARNm de GalNac-T14 numa amostra biológica (e.g. por análise simultânea dos níveis de uma sequência de controlo comparativa de ARNm de um gene de expressão basal tal como um membro da família da actina). Opcionalmente pode determinar-se a sequência do ADNc de GalNac-T14 amplificado.
As concretizações materiais deste aspecto do invento incluem iniciadores e pares de iniciadores GalNac-T14, que permitem a amplificação específica dos polinucleótidos do invento ou de quaisquer das suas partes e sondas específicas que hibridam selectiva ou especificamente com moléculas de ácido nucleico do invento ou com qualquer parte destas. As sondas podem ser marcadas com um marcador detectável tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimiluminescente, um quelante metálico ou enzima. Tais sondas e iniciadores podem ser utilizados para detectar a presença de polinucleótidos GalNac-T14 numa amostra e como um meio para detectar uma célula que expressa proteínas GalNac-T14. Tal como será evidente para o perito na especialidade, podem preparar-se muitos iniciadores e sondas diferentes com base nas sequências aqui proporcionadas e podem utilizar-se eficazmente para amplificar, clonar e/ou determinar a presença e/ou níveis de ARNm de GalNac-T14.
Os métodos opcionais do invento incluem protocolos que analisam ou detectam ARNm, tal como ARNm de GalNac-T14, numa amostra de tecido ou célula por tecnologias de micro-matriz. Efectua-se transcrição reversa de amostras de ensaio e de controlo de amostra de ARNm de ensaio e de controlo 57 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ utilizando micro-matriz de ácido nucleico e marcam-se para gerar sondas de ADNc. Hibridam-se então as sondas com uma matriz de ácidos nucleicos imobilizada num suporte sólido. Configura-se a matriz de modo a que a sequência e posição de cada membro da matriz sejam conhecidas. Por exemplo, uma selecção de genes que têm potencial para ser expressos em determinados estados de doença podem ser dispostos em matriz num suporte sólido. A hibridação de uma sonda marcada com um membro especifico da matriz indica que a amostra da qual a sonda foi derivada expressa esse gene. A análise de expressão diferencial de genes por tecidos doentes pode proporcionar informação valiosa. A tecnologia de micromatriz utiliza técnicas de hibridação de ácido nucleico e tecnologia computacional para avaliar o perfil de expressão de ARNm de milhares de genes com uma única experiência. (consultar, e.g., WO 01/75166 publicado a 11 de Outubro de 2001/ (consultar, por exemplo, U.S. 5 700 637, patente U.S. 5 445 934 e patente U.S. 5 807 522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(supl):15-19 (1999) para uma discussão sobre fabrico de matriz). As micro-matrizes de ADN são matrizes em miniatura contendo fragmentos de genes que são sintetizados directamente ou depositados em vidro e outros substratos. Milhares de genes são habitualmente representados numa única matriz. Uma experiência típica de micro-matriz envolve as seguintes etapas: 1. Preparação de alvo com marcação fluorescente a partir de ARN isolado da amostra, 2. hibridação do alvo marcado com a micro-matriz, 3. lavagem, coloração e digitalização da matriz, 4. análise da imagem digitalizada e 5. geração de perfis de expressão génica. Presentemente utilizam-se dois tipos principais de micro-matrizes de ADN: matrizes de oligonucleótido (habitualmente 25 a 70 meros) e matrizes de expressão génica contendo produtos de PCR preparados a partir de ADNc. Na formação de uma matriz, os oligonucleótidos pode ser pré-fabricados e depositados na superfície ou sintetizados directamente na superfície (in situ) . 0 sistema Affymetrix GeneChip® é um sistema de micromatriz disponível comercialmente que compreende matrizes fabricadas por síntese directa de oligonucleótidos numa superfície de vidro. Matrizes sonda/gene: os 58 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ oligonucleótidos, habitualmente 25 meros, são sintetizados directamente numa bolacha de vidro utilizando uma combinação de tecnologias de fotolitografia baseada em semicondutores e de síntese química de fase sólida. Cada matriz contém até 400 000 oligos diferentes e cada oligo está presente em milhões de cópias. Dado que as sondas de oligonucleótido são sintetizadas em locais conhecidos na matriz, os padrões de hibridação e as intensidades do sinal podem ser interpretados em termos de identidade do gene e níveis de expressão relativos pelo utilitário Affymetrix Microarray Suite. Cada gene está representado na matriz por uma série de sondas de oligonucleótido diferentes. Cada par de sondas consiste de um oligonucleótido com hibridação perfeita e um oligonucleótido com hibridação incorrecta. A sonda com hibridação perfeita tem uma sequência exactamente complementar ao gene específico e assim mede a expressão do gene. A sonda com hibridação incorrecta difere da sonda com hibridação perfeita por substituição de uma única base na posição de base central, perturbando a ligação do produto de transcrição de gene alvo. Este facto ajuda a determinar a hibridação de fundo e não específica que contribui para o sinal medido pelo oligo com hibridação perfeita. O utilitário Microarray Suite subtrai as intensidades de hibridação das sondas com hibridação incorrecta daquelas que provêm de sondas com hibridação perfeita para determinar o valor de intensidade absoluto ou específico para cada conjunto de sondas. As sondas são escolhidas com base em informação corrente de Genbank e outros repositórios de nucleótidos. Pensa-se que as sequências reconhecem regiões únicas da extremidade 3' do gene. Utiliza-se um forno de hibridação GeneChip (forno de "churrasco") para efectuar a hibridação de até 64 matrizes de cada vez. A estação de fluídica efectua lavagem e coloração das matrizes de sondas. É completamente automatizada e contém quatro módulos cada módulo contendo uma matriz de sonda. Cada módulo é controlado independentemente através do utilitário Microarray Suite utilizando protocolos de fluídica pré-programados. 0 digitalizador é um digitalizador de fluorescência com laser confocal que mede a intensidade de fluorescência emitida pelo ARNc ligado às matrizes de sonda. A estação de trabalho computacional com o utilitário Microarray Suite controla a estação de microfluídica e o digitalizador. 0 utilitário Microarray Suite pode controlar 59 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ até oito estações de fluidica utilizando protocolos pré-programados de hibridação, lavagem e coloração para a matriz de sonda. 0 utilitário também adquire e converte dados de intensidade de hibridação num registo de presença/ausência para cada gene utilizando algoritmos adequados. Finalmente, o utilitário detecta alterações na expressão génica entre experiências por análise de comparação e formata o resultado em ficheiros .txt, que podem ser utilizados com outros programas utilitários para análise de dados adicional.
Pode também utilizar-se ensaio de hibridação fluorescente in situ (FISH) para detectar expressão do biomarcador de ARNm utilizando sondas marcadas. Tais ensaios são conhecidos na especialidade (consultar, e.g., Kallioniemi et al., 1992/ patente US 6 358 682).
Pode também avaliar-se expressão de um biomarcador seleccionado por análise de deleção génica ou amplificação génica. Pode medir-se deleção ou amplificação génica por qualquer um de uma vasta variedade de protocolos conhecidos na especialidade por exemplo, por hibridação "Southern" convencional, hibridação "Northern" para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)), hibridação "dot" (análise de ADN) ou hibridação in situ (e.g., FISH) utilizando uma sonda adequadamente marcada, métodos citogenéticos ou hibridação genómica comparativa (CGH) utilizando uma sonda adequadamente marcada. Como exemplo, estes métodos podem ser utilizados para detectar deleção de amplificação de genes GalNac-T14.
Adicionalmente pode analisar-se o estado de metilação do biomarcador, tal como gene GalNac-T14, numa amostra de tecido ou célula. A desmetilação e/ou hipermetilação aberrantes de ilhas CpG em regiões regulatórias a 5' do gene ocorrem frequentemente em células imortalizadas e transformadas e podem resultar em expressão alterada de vários genes. São bem conhecidos na especialidade vários ensaios para analisar o estado de metilação de um gene. Por exemplo, pode utilizar-se em abordagens de hibridação "Southern" enzimas de restrição sensíveis a metilação que não podem clivar sequências que contêm locais CpG metilados para avaliar o estado de metilação de ilhas CpG. Além disso, a MSP (PCR específica de 60 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ metilação) pode efectuar rapidamente o perfil do estado de metilação de todos os locais CpG presentes numa ilha CpG de um dado gene. Este procedimento envolve modificação inicial de ADN por bissulfito de sódio (que converterá todas as citosinas não metiladas em uracilo) seguido por amplificação utilizando iniciadores específicos para ADN metilado contra ADN não metilado. Podem também encontrar-se protocolos envolvendo interferência de metilação em, por exemplo Current Protocols In Molecular Biology, unidade 12, Frederick M. Ausubel et al. ed., 1995/ De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks et al, Câncer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); e Lethe et al., Int. J. Câncer 76(6): 903-908 (1998). A expressão de GalNac-T14 numa amostra de tecido ou célula pode também analisar-se através de ensaios funcionais ou baseados em actividade. Por exemplo, podem conduzir-se ensaios conhecidos na especialidade para determinar ou detectar a presença de determinada actividade enzimática de N-acetilgalactosaminiltransferase na amostra de tecido ou célula. (consultar, e.g., Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996); Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003); Hang et al., anteriormente, disponível em Maio de 2005 em www.sciencedirect.com.
Nos métodos do presente invento, considera-se que a amostra de tecido ou célula pode também ser analisada para expressão de Apo2L/TRAIL ou receptores na amostra que liga anticorpo de receptor de morte. Tal como descrito anteriormente e na especialidade, acredita-se presentemente que Apo2L/TRAIL se liga a pelo menos cinco receptores diferentes: DR4, DR5, DcRl, DcR2 e OPG. Utilizando métodos conhecidos na especialidade incluindo aqueles aqui descritos, pode detectar-se a expressão de Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcRl, DcR2 e/ou OPG ao nível de ARNm e ao nível de proteína. Como exemplo, podem utilizar-se as técnicas IHC anteriormente descritas para detectar a presença de uma ou mais de tais moléculas na amostra. Considera-se que nos métodos nos quais se analisa um tecido ou amostra não apenas para a presença de marcador GalNac-T14 mas também para a presença de, e.g., DR4, DR5 ou DcRl, se podem preparar lâminas independentes a partir do mesmo tecido ou amostra e cada lâmina é ensaiada com um 61 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ reagente específico para cada biomarcador ou receptor. Alternativamente pode preparar-se uma única lâmina a partir da amostra de tecido ou célula e podem utilizar-se anticorpos dirigidos contra cada biomarcador ou receptor em ligação com um protocolo de coloração com várias cores para permitir visualização e detecção dos respectivos biomarcadores ou receptores.
Subsequentemente à determinação da expressão de GalNac-T14 na amostra de tecido ou célula, indicativa da amostra de tecido ou célula ser sensível a anticorpo de receptor de morte, considera-se que se pode administrar uma quantidade eficaz do anticorpo de receptor de morte ao mamífero para tratar a doença tal como cancro ou doença relacionada com imunidade que atinja o mamífero. 0 diagnóstico em mamíferos das diferentes condições patológicas aqui descritas pode ser efectuado pelo perito na especialidade. Estão disponíveis técnicas de diagnóstico na especialidade que permitem, e.g., o diagnóstico ou detecção de cancro ou doença relacionada com imunidade num mamífero. Por exemplo, podem identificar-se cancros através de técnicas incluindo entre outras palpação, análise ao sangue, raios-X, RMN e semelhantes. Podem também identificar-se facilmente doenças relacionadas com imunidade. 0 anticorpo de receptor de morte pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos tal como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. Opcionalmente pode efectuar-se administração através de infusão com minibomba utilizando vários dispositivos disponíveis comercialmente.
Podem determinar-se empiricamente dosagens e planos eficazes para administrar o anticorpo de receptor de morte e efectuar tais determinações está no âmbito da especialidade. Podem utilizar-se dosagens únicas ou múltiplas. Pensa-se actualmente que uma dose ou quantidade eficaz de Apo2L/TRAIL utilizada sozinha pode variar entre cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia. Pode efectuar-se o escalonamento de doses interespécies de um modo 62 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ conhecido na especialidade, e.g., tal como revelado em Mordenti et ai., Pharmaceut. Res., £:1351 (1991).
Considera-se que se podem utilizar ainda terapias adicionais nos métodos. A(s) outra(s) terapia(s) podem incluir entre outros administração de radioterapia, citoquina(s), agente(s) de inibição de crescimento, agente(s) quimioterapêutico(s), agente(s) citotóxico(s), inibidores de tirosina quinase, inibidores de ras farnesiltransferase, inibidores de angiogénese e inibidores de quinase dependentes de ciclina que são conhecidos na especialidade e adicionalmente definidos em pormenor anteriormente. Considera-se que se pode utilizar tais outras terapias como um agente independente do anticorpo de receptor de morte. Além disso, terapias baseadas em anticorpos terapêuticos que têm como alvo antigénios de tumor tal como Rituxan™ ou Herceptin™ assim como anticorpos anti-angiogénicos tal como anti-VEGF. A preparação e planos de dosagem para agentes quimioterapêuticos pode ser usada de acordo com as instruções do fabricante ou tal como determinado empiricamente pelo perito na especialidade. A preparação e planos de dosagem para tal quimioterapia são também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams e Wilkins, Baltimore, MD. (1992). 0 agente quimioterapêutico pode anteceder ou seguir administração do anticorpo de receptor de morte ou pode ser administrado simultaneamente com este.
Pode também pretender-se administrar anticorpos contra outros antigénios tal como anticorpos que ligam CD20, CDlla, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, factor endotelial vascular (VEGF) ou outros membros da família TNFR (tal como OPG, TNFRl, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3). Alternativa ou adicionalmente, podem co-administrar-se ao doente dois ou mais anticorpos que ligam o mesmo ou dois ou mais antigénios diferentes aqui revelados. Algumas vezes, pode ser também benéfico administrar uma ou mais citoquinas ao doente. Após administração podem analisar-se in vitro as células tratadas. Quando ocorre um tratamento in vivo, pode monitorizar-se um mamífero tratado de várias formas bem conhecidas do perito na especialidade. Por exemplo, podem analisar-se patologicamente 63 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ células de tumor para ensaiar necrose ou pode analisar-se soro para respostas do sistema imunitário.
Para utilização nas aplicações anteriormente descritas ou sugeridas, podem utilizar-se kits ou artigos de fabrico. Tais kits podem compreender um meio de transporte compartimentalizado para receber em meio fechado um ou mais meios de contenção tal como frasquinhos, tubos e semelhantes, compreendendo cada um dos meios de contenção um dos elementos independentes para ser utilizado no método. Por exemplo, um dos meios de contenção pode compreender uma sonda que está ou que pode ser marcada para detecção. Tal sonda pode ser um anticorpo ou polinucleótido específicos para proteína GalNac-T14 ou um gene ou mensagem GalNac-T14, respectivamente. No casos em que o kit utiliza hibridação de ácido nucleico para detectar o ácido nucleico alvo, o kit também poderá ter recipientes contendo nucleótido(s) para amplificação da sequência de ácido nucleico alvo e/ou um recipiente compreendendo um meio repórter tal como uma proteína de ligação a biotina tal como avidina ou estreptavidina ligada a uma molécula repórter, tal como um marcador enzimático, fluorescente ou radioisótopo. 0 kit compreenderá tipicamente o recipiente anteriormente descrito e um ou mais outros recipientes compreendendo materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos inseridos com instruções para utilização. Pode estar presente um marcador no recipiente para indicar que a composição é utilizada para uma terapia específica ou aplicação não terapêutica e pode também indicar instruções para utilização in vivo ou in vitro, tal como as anteriormente descritas.
Os kits têm várias concretizações. Uma concretização típica é um kit compreendendo um recipiente, um marcador no referido recipiente e uma composição contida no interior do referido recipiente; em que a composição inclui um anticorpo primário que liga uma sequência de polipéptido GalNac-T14, o marcador no referido recipiente indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de proteínas GalNac-T14 em pelo menos um tipo de célula de mamífero e instruções para 64 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ utilização do anticorpo GalNac-T14 para avaliar a presença de proteínas em pelo menos um tipo de célula de mamífero. 0 kit pode compreender adicionalmente um conjunto de instruções e materiais para preparar uma amostra de tecido e aplicar anticorpo e sonda à mesma secção de uma amostra de tecido. 0 kit pode incluir tanto um anticorpo primário como um anticorpo secundário em que o anticorpo secundário está conjugado com um marcador, e.g., um marcador enzimático.
Outra concretização é um kit compreendendo um recipiente, um marcador no referido recipiente e uma composição contida no interior do referido recipiente; em que a composição inclui um polinucleótido que híbrida com um complementar do polinucleótido GalNac-T14 sob condições rigorosas, o marcador no referido recipiente indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de GalNac-T14 em pelo menos um tipo de célula de mamífero e instruções para utilização do polinucleótido GalNac-T14 para avaliar a presença de ARN ou ADN de GalNac-T14 em pelo menos um tipo de célula de mamífero.
Outras componentes opcionais no kit incluem um ou mais tampões (e.g., tampão de bloqueamento, tampão de lavagem, tampão de substrato, etc.), outros reagentes tal como substrato (e.g., cromogéneo) que está alterado quimicamente por um marcador enzimático, solução de recuperação de epítopos, amostras de controlo (controlos positivos e/ou negativos), lâmina(s) de controlo, etc.
EXEMPLOS Vários aspectos do invento são adicionalmente descritos e ilustrados pelos exemplos que se seguem, não se pretendendo que nenhum deles limite o âmbito do invento. MÉTODOS E MATERIAIS:
Cultura de células e linhas celulares.
As seguintes linhas celulares humanas: linhas de cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC): H2122, A427, H647, SK-MES-1, H838, H358, H2126, H460, H1703, H2405, H650, H1568, 65 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Hl 666, Η322Τ, SW1573, Η292, Η1650, Η522, EKVX, Η661, Η23, LXFL 529, H22 6, A549, H1781, H1299, HOP 62, H2009, HOP 92, H1793, H1975, H1651, calu-1, H1435, HOP 18, H520,H441, H2030, H1155, H1838, H596, HLFa; linhas de cancro pancreático: Pane 05.04, BxPC3, HPAC, SU.86.86, HuP-T3, PSN1, Pane 08.13, MiaPaCa-2, PA-TU-8988T, Pane 03.27, Capan-1, SW 1990, CFPAC-1, PA-TU-8902, Pane 02.03, Pane 04.03, PL45, Aspc-1, Hs766T, Pane 10.05, Panei, Capan-2, HPAF-II e NHL: JEKO-1, SU-DHL-4, OCI-LY-19, SR, Farage, DOHH-2, Toledo, WSU-NHL, KARPAS-422, GRANTA-519, Pfeiffer, HT, SC-1, DB. As linhas celulares foram obtidas do depósito ATCC (Manassas, Virgínia), DSMZ (colecção alemã de microrganismos e culturas de células), JCRB (banco japonês de recursos celulares) ou ECACC (colecção europeia de culturas celulares) e cultivaram-se em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10%, L-glutamina 2 mM e HEPES 10 mM.
Ensaios de citotoxicidade
Utilizou-se o ensaio MTT (ensaio de proliferação de células não radioactivo CellTiter 96® de Promega), que é um ensaio colorimétrico baseado na capacidade das células viáveis reduzirem um sal de tetrazólio amarelo solúvel (MTT) a cristais de formazan azuis, para determinar a quantidade de células viáveis após tratamento com Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5. Efectuou-se o ensaio MTT por adição de uma solução corante optimizada pré-misturada a poços de cultura de uma placa de 96 poços contendo várias concentrações (0 a 1000 ng/ml) de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5. Durante uma incubação de 4 horas, as células vivas convertem a componente de tetrazólio da solução de corante num produto de formazan. Adicionou-se então a solução de solubilização/paragem aos poços de cultura para solubilizar o produto formazan e registou-se a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de placas de 96 poços (SpectraMax). A leitura da absorvância a 570 nm é directamente proporcional ao número de células normalmente utilizadas em ensaios de proliferação. Apesar do máximo de absorvância para o produto de formazan ser 570 nm e as soluções puras parecerem azuis, a cor no final do ensaio pode não ser azul e depende da quantidade de formazan presente relativamente às outras componentes (incluindo soro, 66 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ vermelho de fenol acidificado e MTT não reduzido) no meio de cultura.
Optimizaram-se os números de células efectuando uma titulação celular para produzir um sinal de ensaio perto do terminal mais elevado da gama linear do ensaio. Dado que diferentes tipos celulares têm diferentes níveis de actividade metabólica, tal efectuou-se independentemente para cada linha celular. Para a maioria das células de tumor analisadas utilizaram-se 5 000 células por poço a 20 000 células por poço.
Segue-se uma descrição passo a passo dos ensaios utilizados: 1. As células utilizadas para o bioensaio foram de culturas-mãe. 2. Determinação do número de células e viabilidade de azul de tripano e suspensão das células para um número final de 5 000 a 20 000 células por poço. 3. Adicionar 50 μΐ da suspensão de células a uma placa de 96 poços. 4. Incubação das placas a 37 °C numa atmosfera humidificada com CO2 a 5% durante a noite. 5. Adição de 50 μΐ de meio de cultura contendo várias concentrações variando entre 0 e 1000 ng/ml de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 a amostras da placa de 96 poços. Os controlos foram 50 μΐ de meio de cultura (sem Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5) e 100μ1 de meio de cultura (sem células).
Efectuou-se cada experiência num conjunto de poços em triplicado e em três dias independentes. 0 volume total dos poços foi ΙΟΟμΙ/ροςο. 6. Incubação das placas a 37 °C durante 72 horas numa atmosfera humidificada com CO2 a 5%. 7. Adição de 15 μΐ de solução corante a cada poço. 8. Incubação das placas a 37 °C durante até 4 horas numa atmosfera humidificada com CO2 a 5%. 9. Adição de 100 μΐ da solução de solubilização/paragem a cada poço. 10. Incubação das placas durante a noite a 37 °C. 11. Registo da absorvância ao comprimento de onda de 570 nm utilizando um leitor de placas de 96 poços. Utilizou- 67 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ se um comprimento de onda de referência de 750 nm para reduzir o ruído de fundo produzido pelos resíduos celulares, impressões digitais e outra absorvância não específica. 12. Usou-se a média dos valores de absorvância para o controlo negativo como valor de branco e subtraiu-se de todas as outras leituras. Dividiu-se a média dos valores de absorvância para cada concentração de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 pela média dos valores de absorvância do controlo positivo (100% de células viáveis - não tratadas) para calcular a quantidade de células viáveis (em %). 13. Representou-se a percentagem de células viáveis (eixo dos YY) em função da concentração de Apo2L/TRAIL ou anticorpo DR5 (eixo dos XX, escala logarítmica) e determinou-se o valor de IC50 por localização do valor do eixo dos XX (ng/ml) correspondente a 50% de células viáveis.
Protocolo de marcação Affymetrix
Efectuou-se uma leitura OD260/280 para todas as amostras e correram-se as amostras no BioAnalyzer. Utilizou-se 5 pg de ARN total de elevada qualidade. A. Síntese de ADNc de primeira cadeia: 1. Hibridação do iniciador DEPC-H20 x μΐ Misturar em vortex. Centrifugação rápida. ARN (5 ug) y μΐ Incubar a 70 °C durante 10 minutos. Impulso (diluição 1:4 da solução-mãe para 5 ug) 1 μΐ Centrifugação rápida e deixar em gelo Iniciador T7-(dT)24 1 μΐ Volume 12 μΐ 2. Ajuste de temperatura 5X-tampão de ADNc de Ia cadeia 4 μΐ 68 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Adicionar 7 μΐ (da mistura à esquerda) a cada amostra. DTT 0,1 M 2 μΐ Misturar em vortex. Centrifugação rápida.
Misturar dNTP 10 mM 1 μΐ Incubar a 42 °C durante 2 minutos.
Volume 7 μΐ 3. Síntese de primeira cadeia Adicionar 1 μΐ SSII RT a cada amostra. SSII RT 1 μΐ Misturar por pipetagem repetida -OU- aplicar vortex levemente.
Centrifugação rápida.
Volume total 20 μΐ Incubar a 42 °C durante 1 hora. B. Síntese de ADNc de segunda cadeia 1. Colocar as reacções de primeira cadeia em gelo. Centrifugar brevemente para remover condensação das paredes do tubo. 2. Efectuar a seguinte mistura-mãe de segunda cadeia. H20 tratada com DEPC 91 μΐ 5X-tampão de reacção de 2a cadeia 30 μΐ
Mistura dNTP 10 mM 3 μΐ ADN ligase 10 U/μΙ 1 μΐ ADN polimerase I 10 U/μΙ 4 μΐ ARNase H 2 U/μΙ 1 μΐ
Volume total 130 μΐ 3. Adicionar 130 μΐ de mistura-mãe de segunda cadeia a 20 μΐ de ADNc de primeira cadeia. (Volume final = 150μ1) 4. Misturar por pipetagem repetida -OU- aplicar vortex levemente. Centrifugação rápida. 5. Incubar a 16 °C durante 2 horas num banho de arrefecimento. 6. Adicionar 2 μΐ [10 U] de T4 ADN Polimerase. Misturar por pipetagem repetida -OU- aplicar vortex levemente. Centrifugação rápida. 69 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 7. Incubar durante 5 minutos a 16 °C. 8. Adicionar 10 μΐ de EDTA 0,5 M. Aplicar vortex levemente. Centrifugação rápida. 9. Efectuar o procedimento de limpeza de ADNc -OU-armazenar a -20 °C para utilização posterior.
Limpeza de ADNc em cadeia dupla (módulo de limpeza de amostras GeneChip) 1. Adicionar 600 μΐ de tampão de ligação de ADNc aos 162 μΐ de preparação de síntese final de ADNc em cadeia dupla.
Misturar em vortex durante 3 segundos. 2. Verificar se a cor da mistura é amarelo (semelhante ao tampão de ligação de ADNc sem a reacção de síntese de ADNc.)
Se a cor da mistura for cor-de-laranja ou violeta, adicionar 10 μΐ de acetato de sódio 3 M, pH 5,0 e misturar. A cor da mistura passa a amarelo. 3. Aplicar 500 μΐ da amostra à coluna de centrifugação de limpeza de ADNc que está encaixada num tubo de recolha de 2 ml e centrifugar durante 1 minuto a h 8 000 x g (>10 000 rpm). Rejeitar o eluído como desperdício perigoso. 4. Tornar a carregar a coluna de centrifugação com a restante mistura (262 μΐ) e centrifugar tal como anteriormente.
Rejeitar o eluído como desperdício perigoso e rejeitar o tubo de recolha. 5. Transferir a coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha de 2 ml (fornecido). Pipetar 750 μΐ de tampão de lavagem de ADNc para a coluna de centrifugação. Centrifugar durante 1 minuto a L8 000 x g (^10 000 rpm).
Rejeitar o eluído. 6. Abrir a tampa da coluna de centrifugação e centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima (^ 25 000 x g) . Colocar as colunas na centrífuga com uma posição de intervalo entre cada. Orientar as tampas para a posição do lado de modo a que estejam orientadas no sentido oposto ao da rotação, i.e., se a rotação for no sentido dos ponteiros do relógio, orientar as tampas no sentido oposto ao dos ponteiros do relógio. Tal evita que as tampas sofram danos. 70 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Rejeitar ο eluído e ο tubo de recolha. 7. Transferir a coluna de centrifugação para um tubo de recolha de 1,5 ml. Pipetar 10 μΐ de tampão de eluição de ADNc directamente para a membrana da coluna de centrifugação. Assegurar-se que o tampão de eluição de ADNc é adicionado directamente em cima da membrana.
Incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente e centrifugar 1 minuto à velocidade máxima (< 25 OOOx) para eluir.
Preparação e corrida da reacção IVT
Enzo: Kit de marcação de produto de transcrição de ARN Bioarray HighYield (N° de catálogo 900182) 1. Utilizar 10 μΐ do ADNc em cadeia dupla limpo. 2. Fazer a seguinte mistura-mãe IVT: H20 destilada ou desionizada 12 μΐ
Tampão de reacção HY 10X 4 μΐ
Ribonucleótidos marcados com biotina lOx 4 μΐ DTT 10X 4 μΐ
Mistura de inibidor de ARNase 10X 4 μΐ ARN polimerase T7 20X 2 μΐ
Volume total: 30 μΐ 3. Adicionar 30 μΐ da mistura-mãe IVT a 10 μΐ de ADNc em cadeia dupla. (Volume total = 40 μΐ) 4. Misturar por pipetagem repetida -OU- por aplicar vortex levemente. Centrifugação rápida. 5. Colocar imediatamente o tubo num banho de água a 37 °C. Incubar durante 5 horas. 6. Armazenar a -20 °C se não purificar o ARN imediatamente. 71 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Limpeza de ARNc marcado com biotina (módulo de limpeza de amostra GeneChip) 1. Adicionar 60 μΐ de H20 à reacção IVT e misturar em vortex durante 3 segundos. 2. Adicionar 350 μΐ de tampão de ligação de ARNc IVT à amostra, misturar em vortex durante 3 segundos. 3. Adicionar 250 μΐ de etanol (96-100%) ao lisado e misturar bem por pipetagem. Não centrifugar. 4. Aplicar amostra (700 μΐ) à coluna de centrifugação de limpeza de ARNc IVT encaixada num tubo de recolha de 2 ml.
Centrifugar durante 15 segundos a >8 OOOxg (>10 000 rpm) . 5. Passar o eluato através da coluna mais uma vez. Centrifugar durante 15 segundos a >8 OOOxg (>10 000 rpm) .
Rejeitar o eluido como desperdício perigoso e rejeitar o tubo de recolha. 6. Transferir a coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha de 2 ml (fornecido). 7. Adicionar 500 μΐ de tampão de lavagem ARNc IVT e centrifugar durante 15 segundos a >8 OOOxg (>10 000 rpm) para lavar.
Rejeitar o eluido. 8. Pipetar 500 μΐ de etanol a 80% (v/v) para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 15 segundos a ^8 OOOxg (^10 000 rpm). Rejeitar o eluido. 9. Abrir a tampa da coluna de centrifugação e centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima (^25 000 x g) ·
Rejeitar o eluido e tubo de recolha. 10. Transferir a coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha de 1,5 ml. 11. Pipetar 11 μΐ de água isenta de ARNase directamente para a membrana da coluna de centrifugação.
Deixar em repouso durante 1 minuto.
Centrifugar durante 1 minuto a velocidade máxima (<25 000 x g) para eluir. 12. Pipetar 10 μΐ de água isenta de ARNase directamente para a membrana da coluna de centrifugação.
Deixar em repouso durante 1 minuto. 72 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Centrifugar durante 1 minuto a velocidade máxima (^25 000 x g) para eluir.
Quantificação do ARNc (produto IVT)
Utilizar análise espectrofotométrica para determinar o rendimento de ARN. Aplicar a convenção que 1 DO a 2 60 nm equivale a ARN a 40 gg/ml.
Verificar a DO a 260 nm e 280 nm para determinar concentração e pureza da amostra.
Manter a razão A260/A280 perto de 2,0 para ARN puro (são aceitáveis razões entre 1,9 e 2,1).
Para quantificação de ARNc quando se utiliza ARN total como material de partida, deve calcular-se um rendimento de ARNc ajustado para reflectir transporte de ARN total não marcado. Utilizando uma estimativa de 100% de transporte, utilizar a fórmula seguinte para determinar o rendimento ajustado de ARNc:
Rendimento de ARNc ajustado = ARNm - (ARNi total)(y) ARNm = quantidade de ARNc medida após IVT (gg)
ARNi total = quantidade de partida de ARN total (gg) y = fracção de reacção de ADNc utilizada em IVT
Fragmentação de ARNc para preparação de alvo
Para fragmentação utilizar a concentração de ARNc aj ustada. 1. Adicionar 2 gl de tampão de fragmentação 5x para cada 8 gl de ARN mais H20. 20 gg ARNc 1 a 32 gl Tampão de fragmentação 5X 8 gl Água isenta de ARNase para 40 gl Volume total: 40 gl 2. Incubar a 94 °C durante 30 minutos. De imediato, deixar em gelo após a incubação. 73 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Preparação do alvo de hibridação 1. Aquecer os controlos de hibridação eucariótica 20X e o oligo B2 durante 5 minutos a 65 °C.
Kit de controlo de hibridação eucariótica Affymetrix GeneChip, n° de catálogo 900362 (para 150 reacções) 2. Agitar ligeiramente no vortex, centrifugar para depositar. 3. Mistura-mãe (assumindo fragmentado 0,5 pg/ul):
Matriz padrão (μΐ) ARNc fragmentado 15 pg 30 Oligo B2 (3 nM) 5 Impulso de controlo 20x 15 (Bio B, C, D, Cre) ADN de esperma de arenque 3 BSA acetilado 3 ADN Hu cot-1 (1 mg/ml) 30 Tampão MES hyb 2X 150 H20 64
Volume final 300 como concentração de ARNc
Concentração final 0,05 pg/μΐ 50 pM
1,5, 5, 25, 100 pM
0, 1 mg/ml 0, 5 mg/ml 0, 1 mg/ml IX 4. Aliquotar 270 μΐ de mistura-mãe em tubos e adicionar 3 0 μΐ de ARNc fragmentado a cada. Esta é a mistura de hibridação. 5. Equilibrar as matrizes de sonda à temperatura ambiente imediatamente antes de utilização. 6. Encher a matriz de sonda com tampão MES Hyb lx e incubar no forno de churrasco durante 10 minutos a 45 °C, 60 rpm. 7. Aquecer a mistura de hibridação num banho de água a 99 °C durante 5 minutos. 8. Transferir a mistura de hibridação para um banho-maria a 45 °C durante 5 minutos. 9. Centrifugar a mistura de hibridação durante 5 minutos a velocidade máxima. 10. Remover o tampão MES Hyb IX das matrizes de sonda. 11. Encher a matriz de sonda com os 200 μΐ superiores da mistura de hibridação. 12. Lacrar as rolhas com Tough-Spots. 74 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 13. Hibridar a matriz de sonda a 45 °C, 60 RPM durante 19 horas. 14. Lavar, corar e digitalizar a matriz de sonda de acordo com os protocolos Affymetrix.
Materiais Affymetrix
Item Vendedor N° de catálogo
Iniciador T7-(dT)24 Biosearch Technolgies feito por medida
Impulsos de controlo produzidos no nosso laboratório -
Superscript II/tampão de primeira cadeia 5X/DTT 0,1 M Invitrogen 18064-014
Tampão de segunda cadeia 5X Invitrogen 10812-014 dNTP 10 mM Invitrogen 18427-088 ADN Ligase de E. coli 10 U/ul Invitrogen 18052-019 ADN Polimerase I de E. coli 10 U/ul Invitrogen 18010- 025 ARNase H 2 U/ul Invitrogen 18021-071 ADN Polimerase T4 10 U/ul Invitrogen 18005-025 EDTA 0,5 M Sigma E-7889 kit de marcação de produto de transcrição de ARN de alto rendimento ENZO Affymetrix ou ENZO 900182 (ENZO) Módulo de limpeza de amostra GeneChip Affymetrix 900371
Albumina de soro bovino acetilada Invitrogen 15561- 020 1-5256
IgG de cabra-grau de reagente Sigma 75 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Anticorpo anti-estreptavidina (cabra), biotinilado Vector Labs BA-0500
Estraptavidina R-ficoeritrina Molecular Probes S-866 SSPE 20X BioWhittaker 51214
Kit de controlo eucariótico Affymetrix 900362 Água, grau de biologia molecular Ambion 9934 ADN Cot-1 humano Roche 1-581-074
NaCl 5 M isento de ARNase, isento de ADNase Ambion 9760
Antiespuma 0-30 Sigma A-8082
Tween-20 a 10% Pierce Chemical 28320 MES como ácido livre monoidrato Sigma M5287 MES como sal de sódio Sigma M3885 EDTA como sal dissódico, solução 0,5 M Sigma E7889
Tough Spots, pontos marcadores USA Scientific 9902
Forno de hibridação GeneChip 640 Affymetrix 800139
Digitalizador GeneChip 3000 com estação de trabalho Affymetrix 00-0074
Estação de fluidica Affymetrix 00-0081
Auto-carregador com leitor externo de código de barras Affymetrix 00-0129 76 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ PCR quantitativa Síntese de ADNc:
Componente Volume (uL) Tampão RT 10X 10 Mistura dNTP 25X 4 Iniciadores aleatórios 10X 10 MultiScribe RT 5 (50U/uL) H20 isenta de ARNase 21 ARN (100 ng) 50 Volume final 100
Condições de incubação: 25° durante 10 minutos 37° durante 2 horas
Reacção TaqMan utilizando o detector de sequenciação ABI Prism 7700
Componente Volume (uL) Mistura-mãe de PCR universal TaqMan (2X) 25 Sonda TaqMan (20X) (Assays-on-Demand™) 2,5 ADNc (100 ng) 2 H20 20,5 Volume final 50
Condições de ciclização térmica: 95° durante 10 minutos 40 ciclos: 95° durante 15 segundos 60° durante 1 minuto
Taqman® MGB • Sondas TaqMan: Assays-on-Demand™ (sondas FAM™ marcado com corante) 77 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ • Efectuou-se amplificação do controlo endógeno, GAPDH (concentração da sonda lOOnM, concentrações dos iniciadores directo e inverso 200nM) para padronizar a quantidade de ARN de amostra (ADNc) adicionada a cada reacção.
Efectuou-se quantificação relativa utilizando o método da recta padrão. Para quantificação normalizada para um controlo endógeno, prepararam-se rectas padrão para o alvo e para a referência endógena. Para cada amostra experimental, determinou-se a quantidade de alvo e de referência endógena a partir da recta padrão apropriada. Seguidamente dividiu-se a quantidade de alvo pela quantidade de referência endógena para obter um valor de alvo normalizado. Uma das amostras experimentais serviu como calibração ou amostra lx. Cada um dos valores de alvo normalizado foi então dividido pelo valor de alvo normalizado da calibração para gerar os níveis de expressão relativa.
Resultados experimentais:
Efectuaram-se experiências utilizando os métodos e materiais anteriormente descritos. Os resultados destas experiências são ilustrados nas figuras 5-9, tal como discutido seguidamente. A figura 5 proporciona um quadro sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro de pulmão de não pequenas células ("NSCLC") para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "mab", reticulado "XL" ou não reticulado (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) tal como medido em ensaios de toxicidade MTT. A figura 6 proporciona um quadro sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro pancreático para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "mab", reticulado "XL" ou não reticulado (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) tal como medido em ensaios de toxicidade MTT. 78 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ A figura 7 proporciona um quadro sumário de IC50 dos dados obtidos na análise de linhas celulares de cancro de linfoma não hodgkin ("NHL") para sensibilidade ou resistência a actividade apoptótica de Apo2L (+ soro fetal bovino a 10%) ou anticorpo monoclonal DR5 "mab", reticulado "XL" ou não reticulado (+ soro fetal bovino "FBS" a 0,5% ou FBS a 10%) tal como medido em ensaios de toxicidade MTT. A figura 8 proporciona uma comparação de sensibilidade ("sen") ou resistência ("RES") de linhas celulares de cancro NSCLC, pancreático e NHL seleccionadas para anticorpo DR5 e a correlação com expressão de GalNac-T14, tal como medido por expressão de ARNm de GalNac-T14. A figura 9 proporciona um gráfico de barras de várias linhas celulares de cancro NSCLC, pancreático e NHL classificadas (em ordem descendente) por níveis de padrões de expressão de ARNm de GalNac-T14.
A morte celular programada por apoptose desempenha papéis importantes no desenvolvimento e homeostasia dos organismos multicelulares (Danial et al., Cell, 116:205 (2004)). Os estímulos intracelulares podem desencadear apoptose através da via celular intrínseca, baseada em membros da superfamília do gene Bcl-2 para activar a maquinaria de caspase apoptótica (Cory et al., Nat. Rev. Câncer, 2:647 (2002)). Determinadas citoquinas pertencentes à superfamília do factor de necrose tumoral (TNF) podem activar apoptose através da via celular extrínseca por interacção com alguns receptores que contêm um "domínio de morte" (DD) indutor de apoptose funcional (Ashkenazi et al., Science, 281:1305 (1998)). O ligando Fas (FasL) estimula a apoptose através de Fas (Apol/CD95), enquanto o ligando indutor de apoptose relacionado com ligando Αρο-2/TNF (Apo2L/TRAIL) desencadeia apoptose através de DR4 (TRAIL-R1) e/ou DR5 (TRAIL-R2) (LeBlanc et al., Cell Death Differ., 10:66 (2003)). Por ligação ao seu ligando cognato estes receptores ligam a molécula adaptadora FADD (domínio de morte associado a Fas) que recruta o iniciador de apoptose caspase-8 para formar o complexo de sinalização indutor de morte (DISC) (consultar, eg, Kischkel et al., EMBO 79 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ J., 14:5579 (1995); Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)). A associação de DISC estimula caspase-8, que por sua vez cliva e activa proteases efectoras tal como caspase-3, 6 e 7 para executarem o programa de morte apoptótica. Em muitos tipos de células, a sinalização cruzada com a via celular intrínseca pode amplificar adicionalmente o sinal de morte extrínseco à célula (Scaffidi et al., J. Biol. Chem., 274:1541 (1999)) . Apo2L/TRAIL induz apoptose em vários tipos de tumor celular com pouco ou nenhum efeito nos tecidos normais sugerindo que pode ser útil para terapia de cancro (consultar, eg, Ashkenazi, Nat. Rev. Câncer, 2:420 (2002);
Kelley et al., Curr. Opin. Pharmacol., 4:333 (2004)). As alterações nas várias componentes das vias de apoptose podem reduzir a sensibilidade a Apo2L/TRAIL em linhas celulares de cancro específicas (Igney et al., Nat. Rev. Câncer, 2:277 (2002) ) .
Efectuaram-se várias experiências de acordo com os métodos e protocolos estabelecidos seguidamente e apresentam- se os dados nas figuras 10-15.
Para analisar a sensibilidade a activação de receptor, ensaiou-se a sobrevivência celular como uma função da concentração Apo2L/TRAIL num painel de linhas celulares de cancro humano, incluindo 23 adenocarcinomas pancreáticos, 18 melanomas malignos e 36 adenocarcinomas colorrectais (figura 10A e dados não apresentados). Esta análise classificou 29/77 (38%) das linhas celulares como alta ou moderadamente sensíveis a Apo2L/TRAIL. A concentração de Apo2L/TRAIL necessária para obter 50% de morte celular nessas 29 linhas celulares variou entre 3 e 800 ng/mL com uma média de 250 ng/mL. O painel de linha celular foi também analisado em termos de perfil de expressão génica, utilizando uma micro-matriz com 54 613 conjuntos gene-sonda. Apesar de ocorrerem algumas excepções, as linhas celulares de cancro pancreático e de melanoma que apresentaram sensibilidade forte ou intermédia a Apo2L/TRAIL expressaram níveis de ARNm significativamente superiores da enzima de glicosilação em O ppGalNAcT-14 do que as linhas celulares resistentes correspondentes (p=0,5xl0~4 pelo teste exacto de Fisher, limiar atribuído iterativamente 80 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ a 750 para carcinoma pancreático e 300 para melanoma) (figura 10B) . A maioria das linhas celulares de cancro colorrectal sensíveis a Apo2L/TRAIL apresentam expressão de ARNm elevada da enzima de glicosilação em O relacionada ppGalNAcT-3, apesar de várias linhas celulares resistentes também expressarem este gene resultando numa diferença menor mas significativa (p=0, 026, limiar atribuído a 2000) (figura 10C, em baixo) . As excepções de todo o painel foram: (a) 5/29 (17%) de linhas celulares que foram sensíveis mas que expressaram ppGalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 abaixo dos níveis limiar; (b) 16/48 (33%) linhas celulares resistentes que apesar disso apresentaram níveis ppGalNAcT-14 ou ppGalNAcT-3 acima do limiar. Por análise de expressão de ARNm de outras enzimas de glicosilação em O nas linhas celulares colorrectais, detectaram-se níveis mais elevados de Fut-6 em 10/12 (83%) linhas celulares sensíveis comparativamente com 6/24 (25%) resistentes (p=0,013; limiar atribuído a 200) (figura 10C, em cima). A expressão combinada de ppGalNAcT-14 em cancro pancreático e melanoma com Fut-6 em linhas celulares de cancro colorrectal correlacionou-se muito fortemente com sensibilidade a Apo2L/TRAIL (p=l, 83xl0“7, N=77). Este conjunto de genes previu correctamente sensibilidade ou resistência para 23/32 (72%) linhas celulares com marcador positivo e 39/45 (87%) com marcador negativo, respectivamente.
Foi também analisada a sensibilidade a Apo2L/TRAIL in vivo utilizando xenoenxertos de tumor. Um tratamento de 5 dias com Apo2L/TRAIL de ratinhos com tumores derivados de linhas celulares de cancro colorrectal Colo205 e DLD-1, positivas para Fut-6, provocou regressão de tumor seguido de uma progressão de tumor altamente atrasada (figura 10D). Contrariamente, os tumores derivados de linhas celulares de cancro colorrectal negativas para Fut-6, Colo320 e RKO, não responderam a este tratamento. A pré-incubação da linha celular Colo205 positiva para ppGalNAcT-3/Fut-6 com o inibidor universal de 0-glicosiltransferase benzil-GalNAc (Delannoy et al., Glycoconj., 13:717 (1996)) reduziu nitidamente a sensibilidade a Apo2L/TRAIL (figura 11A) sugerindo uma relação funcional entre glicosilação em O e sinalização 81 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Apo2L/TRAIL. Para analisar adicionalmente esta questão utilizaram-se oligonucleótidos de interferência pequenos ARN(si) que têm como alvo ARNm de ppGalNacT-14, ppGalNacT-3 ou Fut-6. Para excluir os efeitos fora do alvo, sintetizaram-se ARNsi múltiplos e sem sobreposição para cada gene e verificou-se a sua capacidade de reduzir expressão de alvo por RT-PCR quantitativo (figura 14A) . Confirmamos adicionalmente a especificidade de ARNsi com um plasmideo ppGalNacT-14 mutante contendo 6 alterações de nucleótido "silenciosas" no interior da região que tem com alvo ARNsi (Editorial, Nat. Cell. Biol., 5:489 (2003)) (figura 14B) . A transfecção das linhas celulares de carcinoma pancreático PSN-1 e melanoma Hs294T positivas para ppGalNAcT-14 com ARNsi de ppGalNAcT-14 reduziu substancialmente a sensibilidade a Apo2L/TRAIL, enquanto o ARNsi de caspase-8 tal como esperado, proporcionou protecção essencialmente completa (figura 11B) . De igual modo, a transfecção de células de cancro colorrectal DLD-1 ou C170 com ARNsi de GalNAcT-3 ou Fut-6 diminuiu significativamente a sensibilidade a Apo2L/TRAIL (figura 11C e figura 14C) . Em suma, o ARNsi de GalNAcT-14 reduziu a sensibilidade a Apo2L/TRAIL em 4/5 linhas celulares de cancro pancreático e 2/2 linhas celulares de melanoma, enquanto o ARNsi de ppGalNAcT-3 ou de Fut-6 reduziram ambos a sensibilidade em 2/3 linhas celulares de cancro colorrectal. Contrariamente, a transfecção de células PSN-1 ou Hs294T com ARNsi de GalNAcT-14 não alterou a sensibilidade ao etoposideo inibidor de topoisomerase II (figura 14D). De igual modo, a transfecção de células PSN-1 ou C170 com ARNsi de GalNAcT-14 ou GalNAcT-3 não afectou a sensibilidade a estaurosporina do inibidor de proteína quinase de largo espectro (figura 14E). Devido a etoposideo e estaurosporina estimularem apoptose através de via intrínseca da célula (Wei et al., Science, 292:727 (2001), estes estudos sugeriram que as enzimas de gi icosilação em O podem modular sinalização de apoptose através da via extrínseca à célula. A transfecção de células HEK293 com ppGalNAcT-14 revelou morte celular quando co-transfectadas com DR4 ou DR5, mas não com os receptores relacionados Fas e TNFR1 ou com o agonista da via intrínseca da célula Bax (figura 11D) . Além disso, a transfecção com ppGalNAcT-14 aumentou a sensibilidade a Apo2L/TRAIL das linhas celulares resistentes de melanoma 82 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ Η1568 (figura 11Ε) e de carcinoma pancreático PA-TU-8902 e PL-45 (figura 14F), mas não alterou a sensibilidade a etoposideo (dados não apresentados). No total a sobrexpressão de GalNAcT-14 sensibilizou 4/7 linhas celulares a Apo2L/TRAIL.
Analisou-se o efeito de silenciamento de ARNsi de ppGalNacT-14 ou Fut-6 sobre o processamento de caspase induzido por Apo2L/TRAIL. Em células PSN-1 e DLD-1 transfectadas com ARNsi de controlo, Apo2L/TRAIL induziu processamento essencialmente completo de caspase-8, levando a clivagem de Bid, caspase-9 e caspase-3 (figura 12A). A transfecção com ARNsi de caspase-8 evitou esses eventos. 0 silenciamento de ppGalNAcT-14 em células PSN-1 ou Fut-6 em células DLD-1 também atenuou acentuadamente o processamento induzido por Apo2L/TRAIL de caspase-8, Bid, caspase-9 e caspase-3 (figura 12A) e a estimulação da actividade caspase-3/7 (figura 12B) . As linhas celulares de cancro colorrectal resistentes a Apo2L/TRAIL, RKO e SW1417, que expressam níveis reduzidos de ppGalNAcT-3 e Fut-6, apresentaram um bloqueamento semelhante ao nível de processamento de caspase-8 (figura 15A) . Assim, as enzimas de glicosilação em 0 podem modular a via Apo2L/TRAIL a montante dos eventos que levam a activação de caspase-8. A activação de caspase-8 requer montagem de DISC (Ashkenazi et al., Science, 281:1305 (1998)). A análise de Apo2L/TRAIL DISC (Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)) em células PSN-1 e DLD-1 indicou que o silenciamento de ppGalNAcT-14 ou Fut-6 reduziu o recrutamento de FADD e caspase-8 para o DISC, o processamento de caspase-8 ligada a DISC e a estimulação da actividade enzimática de caspase-8 associada a DISC (Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005) ) (figura 12C, 12D e figura 15B) . Nem o ARNsi de ppGalNacT-14 nem de Fut-6 alteraram substancialmente a quantidade de DR4 e DR5 em DISC ou a ligação dependente da dose de Apo2L/TRAIL com células PSN-1 ou DLD-1 que expressam tanto DR4 como DR5 (figura 12C, figura 15B e dados não apresentados). Assim, ppGalNAcT-14 e Fut-6 não parecem modular apoptose afectando os níveis de receptores de superfície celular ou a ligação de Apo2L/TRAIL. Em coerência com este facto, a sensibilidade de Apo2L/TRAIL no painel de 83 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 77 linhas celulares não apresentou correlação significativa com expressão à superfície celular dos receptores de sinalização cognatos DR4 e DR5 ou dos receptores de armadilha DcRl e DcR2 (dados não apresentados) . Além disso, a maioria dos ARNsi contra ppGalNAcT-14, ppGalNacT-3 ou Fut-6 não alteraram os níveis de DR4 e DR5 em células PSN-1, C170 ou DLD-1 (figura 15C). Dois ARNsi não provocaram uma diminuição detectável em DR4 e DR5 em determinadas linhas celulares (figura 15C) . Contudo, outros ARNsi contra as mesmas enzimas inibiram apoptose induzida por Apo2L/TRAIL sem afectar os níveis de receptor. 0 domínio extracelular (ECD) de DR5 humana foi expresso em células de ovário de hamster chinês, purificou-se a proteína excretada, submeteu-se a hidrólise ácida e analisaram-se os monossacáridos associados (figura 13A) . Consistentemente com a ausência de locais de glicosilação em N previstos na ECD de DR5, não detectámos glicanos ligados a N. Contudo, duas amostras de 2 experiências independentes apresentaram 3 moles de GalNAc e 3 moles de Gal por mole de EDC de DR5 (figura 13A) , sugerindo modificação ligada a 0 dos três locais de DR5 com o glicano nuclear GalNAc-Gal. A glicosilação em 0 de proteínas modifica serinas ou treoninas. Utilizando uma ferramenta de bioinformática previamente estabelecida para previsão de locais potenciais de glicosilação em 0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc) (Julenius et al., Glycobiology, 15:153 (2005)), identificámos duas de tais regiões na sequência ECD comum das variantes de splicing longa (DR5-L) e curta (DR5-S) de DR5 humana e um terceiro local no interior da região com splicing alternativo (figura 13B) . O primeiro segmento de aminoácido (7 4-77) contém 3 serinas; o segundo (130-144) tem 5 treoninas, enquanto o terceiro tem 4 treoninas e 3 serinas. A DR5 murina tem sequências semelhantes aos primeiros 2 segmentos com 2 serinas e 4 treoninas, respectivamente, enquanto a DR4 humana também tem sequências semelhantes contendo 1 serina e 5 treoninas. Para ensaiar se esses locais poderiam ser importantes durante modificação pós-tradução de DR5, produziu-se um conjunto de mutantes DR5L e DR5S por substituição com alaninas das 5 treoninas do segmento 130-144 84 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ (DRSL-5T, DR5S-5T) ou essas mesmas 5 treoninas além das 3 serinas do segmento 74-77 (DR5L-5T3S, DR5S-5T3S). A imuno-transferência com o anticorpo DR5 de lisados de células HEK293 transfectadas com DR5L ou DR5S revelou a presença das bandas DR5L ou DR5S esperadas (figura 13C). O anticorpo também detectou bandas DR5 de peso molecular (MW) mais elevado que se tornam mais abundantes por co-transfecção de DR5L ou DR5S com ppGalNAcT-14 comparativamente com controlo (figura 13C, asteriscos). A abundância destas bandas de MW mais elevado e o seu aumento por ppGalNAcT-14 diminuíram significativamente com DR5L-5T ou DR5S-5T e praticamente desapareceram com DR5L-5T3S ou DR5S-5T3S comparativamente com as construções de tipo selvagem. Estes resultados sugerem que as bandas de MW mais elevada representam formas glicosiladas em 0 de DR5: ppGalNAcT-14 promove a sua formação e a eliminação progressiva dos locais previstos de glicosilação em 0 por substituição de alanina reverte gradualmente este efeito. A transfecção de células HEK293 com DR5 murino ou DR4, DR5L ou DR5S humano revelou morte celular (figura 13D)/ cada mutante DR5 apresentou menos actividade do que a sua construção de tipo selvagem correspondente com DR5S-5T3S (que não tem nenhum dos três locais) apresentando a menor actividade. A co-transfecção com ppGalNAcT-14 aumentou acentuadamente a morte celular pelas construções DR4 e DR5 excepto DR5S-5T3S, que mostrou significativamente menos actividade. A maioria das amostras de tecido normal de tumor de cancros de pele, pulmão, pâncreas, mama, ovário, endométrio e bexiga ou de linfoma não Hodgkin apresentaram expressão de ARNm de ppGalNAcT-14 inferior aos valores de limiar (determinado como 500 para a maioria dos cancros e 200 para cancros de pele, figura 13E). Contudo, um subconjunto significativo de amostras de tumor variando entre 10% em cancro de mama lobular e 30% em cancro de pulmão e linfoma de células B difusas grandes, mostrou sobrexpressão de ppGalNAcT-14. Algumas amostras de cancro tinham níveis de expressão de ARNm mais de 1000 vezes acima dos tecidos normais correspondentes. A expressão dinâmica de ppGalNAcT-14 em cancro sugere que este gene e possivelmente outras enzimas relacionadas podem proporcionar biomarcadores úteis para identificar tumores com maior sensibilidade a Apo2L/TRAIL. 85 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Os glicanos ligados por 0 apresentam uma vasta diversidade estrutural e modulam vários aspectos da biologia das proteínas da membrana plasmática incluindo conformação, agregação, tráfego, meia-vida, assim como adesão celular e actividade de sinalização (Hang et al., Bioorg. Med. Chem., 13:5021 (2005); Hanisch, Biol. Chem., 382:143 (2001)). As células de cancro muitas vezes apresentam alterações drásticas nos perfis de O-glicano, originando antigénios de hidratos de carbono associados a tumor únicos (Brockhausen, Biochim. Biophys. Acta, 1473:67 (1999); Dube et al., Nat.
Rev. Drug Discovery, 4:477 (2005); Fuster et al., Nat. Rev. Câncer, 5:526 (2005)). A glicosilação em O também desempenha um papel importante na orientação de células de tumor para locais específicos de metástase (Fuster et al., Câncer Res., 63:2775 (2003); Ohyama et al., EMBO J., 18:1516 (1999);
Takada et al., Câncer Res., 53:354 (1993)). Um subconjunto significativo de amostras de tumor primário de vários cancros humanos apresenta expressão elevada da enzima de glicosilação em O ppGalNAcT-14, incluindo amostras de células de cólon e colorrectais, amostras de célula de melanoma e amostras de célula de condrossarcoma.
MÉTODOS
Materiais.
Os reagentes de cultura de células foram adquiridos a Gibco (Invitrogen/Gibco, Carlsbad, CA), Apo2L/TRAIL solúvel, não marcada foi preparada tal como descrito anteriormente (Lawrence et al., Nat. Med., 7:383 (2001)), o inibidor de glicosilação ligado a O benzil-a-GalNAc, foi adquirido de Calbiochem e todos os outros produtos químicos (incluindo etoposídeo e estaurosporina) foram de Sigma Aldrich (St. Louis, MO).
Cultura de células e linhas celulares.
Todas as 119 linhas celulares de carcinoma humano (para nomes e números de catálogo consultar os dados suplementares) foram obtidos de ATCC ou DSMZ (Braunschweig, Alemanha) e foram cultivadas a 37 °C e CO2 a 5% em RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% inactivado pelo calor, L- 86 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ glutamina 2 mM e HEPES 10 mM sem antibióticos tais como penicilina/estreptomicina. Obtiveram-se células de rim embrionário humano 293 (número de catálogo CRL-1573) também de ATCC e cultivaram-se em meio de Eagle modificado da Dulbecco a 100% suplementado com FBS a 10%. A linha celular CHO mutante de glicosilação em O, ldlD CHO, foi utilizada com autorização do Dr. Monty Kreiger, MIT (Boston MA).
Ensaios de viabilidade celular e ensaios de apoptose.
Para determinar IC50 para Apo2L/TRAIL plaquearam-se células em triplicado em placas de 96 poços, deixou-se aderir durante 24 horas e seguidamente tratou-se com Apo2L/TRAIL recombinante humano em concentrações crescentes até 1000 ng/ml. Após 72h de incubação submeteram-se então as células a um ensaio de viabilidade - ensaio MTT (Pierce) ou ensaio de viabilidade de células luminescentes CellTiter-Glo (Promega) tal como no protocolo do fabricante. Repetiu-se cada experiência de viabilidade celular pelo menos três vezes a soro reduzido (FBS a 0,5%) e soro elevado (FBS a 10%) e definem-se linhas celulares sensíveis intermediárias por variação entre os IC50 de experiências independentes ou entre soro reduzido e elevado. Definimos uma linha celular como sensível com base na indução de apoptose de pelo menos 50% das células a uma concentração de Apo2L/TRAIL de 1 ug/ml e como sensibilidade intermediária com base na variabilidade da quantidade de apoptose induzida em experiências independentes ou na presença de soro reduzido (0,5%) contra elevado (10%) . Quantificou-se apoptose por análise de citometria de fluxo da percentagem média de células recolhidas (aderentes + flutuantes no meio) coradas com Anexina V (BD Pharmingen).
Hibridação de micro-matriz e análise de dados.
Preparou-se ARN celular total a partir de células não tratadas (3 x 106) utilizando o kit RNeasy (Quiagen). Preparou-se ARNc marcado e hibridou-se com micro-matrizes de oligonucleótido (U133P GeneChip; Affymetrix Incorporated, Santa Clara, CA) tal como anteriormente descrito (Hoffman et al., Nat. Rev. Genetics, 5:229 (2004); Yauch et al., Clin. Câncer Res., 11:8686 (2005)). Analisaram-se ficheiros de imagem digitalizada com GENECHIP 3.1 (Affymetrix), Spotfire, 87 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
GenePattern e Cluster/TreeView. Para identificar a maioria dos genes com expressão diferencial entre linhas celulares sensíveis e resistentes, submetemos os valores de expressão génica a um filtro de variação que excluiu genes com variação mínima ao longo das amostras a analisar por ensaio para o número de vezes de alteração e variação absoluta ao longo das amostras, comparando a razão de máx e min (max/min) e diferença entre máx e min (max-min) com valores pré-definidos e excluindo genes que não obedecem a ambas as condições.
Construções de expressão e transdução retrovirica.
Clonou-se um fragmento de ADN que codifica ppGalNAcT-14 a partir de ADNc recolhido conjuntamente de linhas celulares sensíveis a Apo2L/TRAIL e inserido no plasmídeo de expressão pcDNA3.1 (Invitrogen) com um marcador Flag no terminal N. Submeteu-se então esta construção a mutagénese dirigida ao local (Quikchange Mutagenesis kit, Stratagene) para gerar mutantes silenciados por ARNsi que tinham 4-6 alterações de pares de bases flutuantes na sequência homóloga do ARNsi sem alterar a sequência de proteína. As mutações abrangeram uma região de lOpb no centro da sequência de ligação de ARNsi de 19pb. Clonaram-se as sequências de ADN para DR5Long e DR5Short, DR4, receptor TRAIL murino, DR4, Fas (variante 1), TNFR1 e Bax (variante beta) a partir de conjuntos de ADNc e inseriram-se no vector de expressão pRK (Genentech). Geraram-se mutantes de glicosilação em 0 de DR5L e DR5S por mutação específica do local de quatro resíduos de treonina para alanina, Mut4xTA (ΊΊ30, T131, T132, T135) ou cinco resíduos de treonina para alanina MutõxTA (T130, ΊΊ31, T132, T135, T143) . Efectuou-se transfecção transitória para células HEK293 com construções de expressão de moléculas pró-apoptóticas em placas de 6 poços a uma concentração de 0,5 ug/poço da molécula pró-apoptótica e 2,0 ug de ppGalNAcT-14 ou um controlo de vector. Transfectaram-se células utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Após uma incubação de 48h, submeteram-se as células a análise de apoptose.
Para gerar construções retrovíricas, clonaram-se ppGalNAcT-14 e mutantes para o vector retrovírico pQCXIP (Clontech). Geraram-se sobrenadantes retrovíricos de título 88 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ elevado utilizando a linha celular auxiliadora ΦΝΧ-Ampho. Transfectaram-se células empacotadas utilizando fosfato de cálcio (Invitrogen). Isolaram-se sobrenadantes 48h após transfecção e adicionaram-se a células alvo conjuntamente com polibreno a 10 microg/ml, seguido por uma etapa de centrifugação de lh a 2700 rpm para melhorar a infecção. Após transdução submeteram-se células a selecção com 2microg/ml de puromicina.
Protocolos de concepção e transfecção de ARNsi.
Os ARNsi contra ppGalNAcT-14, ppGalNAcT-3, Caspase-8 e DR5 foram concebidos por Dharmacon (Lafayette, CO) utilizando os seus critérios de selecção registados. As sequências seleccionadas foram: siGalNAcT-14 (1) : 5' GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT 3' ( = 14-4) (SEQ ID NO:15) siGalNAcT-14 (2) : 5' ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT 3' ( = 14-6) (SEQ ID NO:16) =3-2) (=3-7) siGalNAcT-3 (1) : 5' CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT 3' (SEQ ID NO:17) siGalNAcT-3 (2) : 5' GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT 3' (SEQ ID NO:18)
siFut-6 (1) 5' GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT 3' (=6-1) (SEQ ID NO:19)
siFut-6 (2) 5' ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT 3' (=6-2) (SEQ ID NO:2 0)
siCaspase-8 : 5' GGACAAAGTTTACCAAATG-dTdT 3' (SEQ ID NO:21)
Os ARNsi foram adquiridos como oligonucleótidos de ARN em cadeia dupla e transfectados para as respectivas linhas celulares a uma concentração final de 25 nM para cada ARNsi. Utilizaram-se como controlo cadeias duplas de ARNsi contra uma sequência sem alvo (Dharmacon). Transfectaram-se células 89 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen) por transfecção reversa na qual se adicionaram células em suspensão aos complexos lipido-ARNsi pré-plaqueados. As concentrações de Lipofectamine2000 foram segundo o protocolo do fabricante. Após 48h de incubação recolheram-se células para análise de ARNm ou incubaram-se com Apo2L/TRAIL recombinante humano, etoposideo ou estaurosporina durante mais 24-72h para ensaios de viabilidade ou durante 4, 8 ou 24h para análise de transferência "Western".
Inibição de glicosilação em O com benzil-a-GalNAc.
Cultivaram-se células Colo205 na presença de benzil-a-GalNAc (2 mM ou 4 mM) durante 72 horas. Nesta altura tornou-se a plaquear as células em placas de 96 poços, deixou-se aderir durante 24 horas estando ainda na presença do inibidor. Foram então estimuladas com concentrações crescentes de Apo2L/TRAIL tal como indicado e sujeitas a ensaio de viabilidade. PCR quantitativa.
Avaliaram-se os niveis de expressão dos produtos de transcrição GalNacT-14 e GalNacT-3 por RT-PCR quantitativa utilizando técnicas Taqman padrão. Normalizaram-se os níveis de produto de transcrição relativamente ao gene de expressão basal, GAPDH e expressam-se os resultados como valores de expressão normalizados (=2“DCt) . Os conjuntos iniciador/sonda para o GalNacT-14 (n° cat: Hs00226180_ml_GT14), GalNacT-3 (n° cat:Hs00237084_ml_GT3) e GAPDH (n° cat: 402869) foram adquiridos de Applied Biosystems (Foster City, CA).
Imunoprecipitação, análise de transferência "Western" e anticorpos. IP: Geraram-se anticorpos monoclonais anti-Apo2L (2E11; n° de acesso ATCC HB-12256) , anti-DR4 (3G1 e 4G7, n° de acesso ATCC PTA-99) e anti-DR5 (3H3, n° de acesso ATCC 12534 e 5C7) em Genentech, Inc. utilizando proteínas de fusão receptor-Fc como antigénios. Conjugaram-se com agarose anticorpos monoclonais anti-DR4 (4G7) e anti-DR5 (5C7) utilizados para imunoprecipitar o Apo2L/TRAIL DISC utilizando 90 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ ο kit de orientação ImmunoPure Protein G IgG Plus (número de catálogo 44990) de Pierce. Os anticorpos monoclonais anti-DR4 (3G1) e anti-DR5 (3H3), utilizados para imunodetecção de DR4/5 em imunoprecipitações de DISC, foram biotinilados utilizando o kit de biotinilação EZ-link Sulfo-NHS-LC (número de catálogo 21217) de Pierce. Preparou-se Apo2L/TRAIL marcado com FLAG e reticulou-se com anticorpo M2 anti-FLAG (Sigma) tal com descrito (Kischkel, Immunity, 12:611 (2000)). Efectuaram-se estas experiências tal como anteriormente descrito para análise Apo2L/TRAIL-FLAG + anti-FLAG DISC (Kischkel, supra). Efectuaram-se também as experiências de imunoprecipitção DR4/5 DISC tal como descrito, excepto que se conjugaram directamente os anticorpos monoclonais anti-DR4 (4G7) e anti-DR5 (5C7) com agarose para a imunoprecipitação (Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)). WB: Inocularam-se 5xl05 células por poço em placas de 6 poços. Para experiências de silenciamento por ARNsi trataram-se células com diferentes ARNsi durante 48h seguido de Apo2L/TRAIL durante 4, 8 ou 24h. Após os períodos de tempo indicados, lavaram-se as células em PBS gelado e lisaram-se em Triton X-100 a 1% contendo tampão de lise hipotónico (HEPES 20 mM pH 7,5, KC1 10 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM e DTT 1 mM) . Para cada amostra separou-se 40 pg de proteína em condições redutoras em géis de SDS-poliacrilamida a 10% ou de gradiente 10-20%. Após transferência para membranas de nitrocelulose (Schleicher e Schuell) incubaram-se as membranas durante lh em leite em pó isento de gordura a 10% seguido por lh de incubação com os seguintes anticorpos primários: anticorpo de cabra anti-caspase-3 (1:1000, R&D) anticorpo de coelho anti-caspase-8 (1:1000, Pharmingen), anticorpo de ratinho anti-caspase-9 5B4 (1:1000, MBL) , anticorpo de coelho anti-Bid (1:1000, Pharmingen), anti-anticorpo DR5 de coelho (1:500, Cayman) ou anticorpo de cabra anti-actina (1:200, Santa Cruz Biotechnology). Lavaram-se as membranas cinco vezes com TBS / Tween a 0,05% e seguidamente incubaram-se com o respectivo anticorpo secundário purificado por afinidade e conjugado com peroxidase (1:5000, Biorad) durante 30 min. Lavaram-se novamente as membranas cinco vezes e revelaram-se utilizando quimiluminescência melhorada (ECL, Amersham) e expuseram-se a película Kodak Biomax. 91 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Análise de citometria de fluxo/FACS:
Determinou-se a expressão superficial dos receptores da família TNF DR4 e DR5 por separação celular activada por fluorescência (FACS) utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA) . Coraram-se células C170 e PSN-1 transfectada com os ARNsi indicados durante 48h, com anticorpo primário, 4G7 (anti-DR4) ou 3H3 (anti-DR5) a 10 pg/ml ou um anticorpo IgG de ratinho de controlo durante 1 h a 4 °C. Lavaram-se então as células com PBS e seguidamente incubaram-se com um anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com fluoresceína (FITC) (Jackson Laboratories) durante 30 min a 4 °C. Analisaram-se então as células por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur.
Ensaios de caspase.
Ensaiaram-se actividades de caspase-3/caspase-7 a 37 °C em 40 μΐ de tampão de caspase (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, sacarose a 10%, EDTA 1 mM, CHAPS a 0,1% e DTT 10 mM) contendo o péptido fluorogénico Ac-DEVD-AFC 100 μΜ. Mediu-se actividade continuamente ao longo do tempo indicado pela libertação de AFC a partir de DEVD-AFC utilizando um fluorímetro Molecular Devices no modo cinético e com o par de filtros 405-510. Para avaliação da actividade de caspase utilizou-se 20 pg de proteína celular total (extractos de
Triton X-100) em 40 μΐ de tampão caspase (contendo DEVD-AFC 100 μΜ).
Análise de hidrato de carbono de DR-5 derivado de CHO.
Obteve-se a composição de monossacáridos de DR5 derivado de células CHO após hidrólise com TFA 4 N. A análise dos monossacáridos libertados foi efectuada num sistema de HPLC Dionex BioLC utilizando cromatografia de permuta aniónica de elevado desempenho acoplada a um detector amperométrico de impulsos. 92 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ
Animais e estudos de xenoenxertos s.c.
Aclimataram-se ratinhos nus fêmea atimicos (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) às instalações do biotério Genentech durante uma semana no mínimo antes de os colocar num ambiente experimental. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comité de cuidado e utilização institucional de animais (IACAUC) da Genentech. Inocularam-se ratinhos s.c. com 5 x 106 células/ratinho de Colo205, DLD-1 e RKO ou 20 x 106 células/ratinho de Colo320HSR, células de carcinoma de cólon humano (American Type Culture Collection). Recolheram-se as medidas de tumor com uma craveira digital e calcularam-se os volumes de tumor utilizando a fórmula □ (A= comprimento) (B=largura)2.
Uma vez que os tumores atinjam um volume de ~150 - 200 mm3, agrupam-se aleatoriamente os ratinhos e administra-se o tratamento intraperitonealmente (i.p) com veículo ou Apo2L/TRAIL (60 mg/kg/dia) aos dias 0-4.
Lisboa, 2012-01-25

Claims (52)

  1. ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Método para prever a sensibilidade de uma amostra de tecido de cancro de mamífero ou de uma amostra de células de cancro de mamífero a um anticorpo de receptor de morte, em que o método compreende analisar a amostra de tecido ou amostra de células para detectar expressão de GalNac-T14, em que a expressão do referido GalNac-T14 é prognóstico da referida amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte, em que o referido anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 que é capaz de induzir apoptose.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada para detectar expressão de ARNm de GalNac-T14.
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por imuno-histoquímica.
  4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo adicionalmente a etapa de analisar expressão de receptores de DR4, DR5, DcRl ou DcR2 na referida amostra de tecido ou célula.
  5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as referidas células de cancro são células ou tecido de cancro pancreático, linfoma, cancro de pulmão de não pequenas células, cancro de colon, cancro colorrectal, melanoma ou condrossarcoma.
  6. 6. Método da reivindicação 5, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro são células de cancro ou tecido de cancro de cólon ou cancro colorrectal ou cancro de pulmão de não pequenas células.
  7. 7. Método para induzir apoptose numa amostra de tecido de cancro de mamífero ou numa amostra de células de cancro de mamífero que compreende: ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 2/7 analisar a amostra de tecido ou amostra de células para detectar expressão de GalNac-T14, e subsequentemente, para detectar expressão do referido GalNac-T14, expor a referida amostra de tecido ou amostra de células a uma quantidade eficaz de um anticorpo de receptor de morte, em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 que é capaz de induzir apoptose.
  8. 8. Método da reivindicação 7, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por ensaio de expressão de ARNm de GalNac-T14.
  9. 9. Método da reivindicação 7, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por imuno-histoquimica.
  10. 10. Método de qualquer uma das reivindicações 7 a 9, compreendendo adicionalmente a etapa de analisar expressão de receptores de DR4, DR5, DcRl ou DcR2 nas referidas amostras de tecido ou célula.
  11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações 7 a 10, em que as referidas células de cancro são células ou tecido de cancro pancreático, linfoma, cancro de pulmão de não pequenas células, cancro de colon, cancro colorrectal, melanoma ou condrossarcoma.
  12. 12. Método da reivindicação 11, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro são células de cancro ou tecido de cancro de colon ou cancro colorrectal ou cancro de pulmão de não pequenas células.
  13. 13. Método de qualquer uma das reivindicações 7 a 12, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR4.
  14. 14. Método da reivindicação 13, em que o referido anticorpo monoclonal DR4 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR4. ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 3/7
  15. 15. Método de qualquer uma das reivindicações 7 a 12, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR5.
  16. 16. Método da reivindicação 15, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR5.
  17. 17. Método de qualquer uma das reivindicações 7 a 12, 15 ou 16, em que o referido anticorpo DR5 liga uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 1-411 da figura 3A (SEQ ID NO:5).
  18. 18. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 não liga nem tem reacção cruzada com receptores de DR4, DcRl ou DcR2.
  19. 19. Utilização de um anticorpo de receptor de morte no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro num indivíduo mamífero, em que se determinou que a amostra de tecido ou amostra de células do indivíduo expressa GalNac-T14 e a expressão de GalNac-T14 é prognóstico da referida amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte e em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
  20. 20. Utilização da reivindicação 19, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada para detectar expressão de ARNm de GalNac-T14.
  21. 21. Utilização da reivindicação 18, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por imuno-histoquímica.
  22. 22. Utilização de qualquer uma das reivindicações 18 a 20, compreendendo adicionalmente a etapa de analisar expressão de receptores de DR4, DR5, DcRl ou DcR2 nos referidos tecidos ou células.
  23. 23. Utilização de qualquer uma das reivindicações 18 a 21, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro compreendem células ou tecido pancreático, linfoma, cancro de ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 4/7 pulmão de não pequenas células, cancro de cólon, cancro colorrectal, melanoma ou condrossarcoma.
  24. 24. Utilização da reivindicação 23, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro são células de cancro ou tecido de cancro cólon ou cancro colorrectal ou cancro de pulmão de não pequenas células.
  25. 25. Utilização de qualquer uma das reivindicações 19 a 24, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR4 .
  26. 26. Utilização da reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal DR4 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR4.
  27. 27. Utilização de qualquer uma das reivindicações 19 a 24, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR5.
  28. 28. Utilização da reivindicação 27, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR5.
  29. 29. Utilização de qualquer uma das reivindicações 19 a 24, 27 ou 28, em que o referido anticorpo DR5 liga uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 1-411 da figura 3A (SEQ ID NO:5).
  30. 30. Utilização de qualquer uma das reivindicações 27 a 29, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 não se liga nem tem reacção cruzada com receptores de DR4, DcRl ou DcR2.
  31. 31. Utilização de qualquer uma das reivindicações 19 a 30, em que o anticorpo de receptor de morte é para administração com agente(s) quimioterapêutico(s) ou radioterapia.
  32. 32. Utilização de qualquer uma das reivindicações 19 a 31, em que o anticorpo de receptor de morte é para administração com uma citoquina, agente citotóxico ou agente de inibição de crescimento. ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 5/7
  33. 33. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro num indivíduo mamífero, em que se determinou que uma amostra de tecido ou amostra de células do indivíduo expressa GalNac-T14 e a expressão de GalNac-T14 é prognóstico da referido amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte e em que o anticorpo de receptor de morte compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
  34. 34. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro da reivindicação 33, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por detecção de expressão de ARNm de GalNac-T14.
  35. 35. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro da reivindicação 33, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por imuno-histoquímica.
  36. 36. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 33 a 35, compreendendo adicionalmente a etapa de analisar expressão de receptores de DR4, DR5, DcRl ou DcR2 nos referidos tecidos ou células.
  37. 37. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 33 a 36, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro compreendem células ou tecido pancreático, linfoma, cancro de pulmão de não pequenas células, cancro de cólon, cancro colorrectal, melanoma ou condrossarcoma.
  38. 38. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro da reivindicação 37, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro são células de cancro ou tecido de cancro de colon ou cancro colorrectal ou cancro de pulmão não pequenas células.
  39. 39. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 33 ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 6/7 38, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR4 .
  40. 40. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro da reivindicação 39, em que o referido anticorpo monoclonal DR4 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR4.
  41. 41. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro das reivindicações 33 a 38, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal DR5.
  42. 42. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro da reivindicação 41, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 é um anticorpo quimérico ou humanizado que liga DR5.
  43. 43. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro das reivindicações 33 a 38, 41 ou 42, em que o referido anticorpo DR5 liga uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 1-411 da figura 3A (SEQ ID NO:5).
  44. 44. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 39 a 43, em que o referido anticorpo monoclonal DR5 não se liga nem reage cruzadamente com receptores de DR4, DcRl ou DcR2.
  45. 45. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 33 a 44, em que o anticorpo de receptor de morte é para administração com agente(s) quimioterapêutico(s) ou radioterapia.
  46. 46. Anticorpo de receptor de morte para utilização num método de tratar cancro de qualquer uma das reivindicações 33 a 45, em que o anticorpo de receptor de morte é para administração com uma citoquina, agente citotóxico ou agente de inibição de crescimento.
  47. 47. Utilização de um anticorpo ou de um polinucleótido para detectar expressão de GalNac-T14 numa amostra de tecido ΕΡ 1 915 626/ΡΤ 7/7 de cancro ou amostra de células de cancro de mamífero para prever a sensibilidade de uma amostra de tecido ou amostra de células de mamífero a um anticorpo de receptor de morte, em que a expressão do referido GalNac-T14 é prognóstico da referida amostra de tecido ou amostra de células ser sensível à actividade de indução de apoptose do anticorpo de receptor de morte, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo agonista DR4 ou um anticorpo agonista DR5 capaz de induzir apoptose.
  48. 48. Utilização da reivindicação 47, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por detecção de expressão de ARNm de GalNac-T14.
  49. 49. Utilização da reivindicação 47, em que a referida expressão de GalNac-T14 é analisada por imuno-histoquímica para detectar expressão de GalNac-T14.
  50. 50. Utilização de qualquer uma das reivindicações 47 a 49, em que a detecção compreende adicionalmente analisar a expressão de receptores de DR4, DR5, DcRl ou DcR2 na referida amostra de tecido ou células.
  51. 51. Utilização de qualquer uma das reivindicações 47 a 50, em que as referidas células de cancro ou tecido são células de cancro ou tecido de cancro de colon, cancro colorrectal, cancro pancreático, melanoma, linfoma, condrossarcoma ou cancro de pulmão de não pequenas células.
  52. 52. Utilização da reivindicação 51, em que as referidas células de cancro ou tecido de cancro são células de cancro ou tecido de cancro de colon ou cancro colorrectal ou cancro de pulmão de não pequenas células. Lisboa, 2012-01-25
PT06813477T 2005-08-16 2006-08-15 Sensibilidade da apoptose a apo2l/trail por ensaio de expressão de galnac-t14 em células/tecidos PT1915626E (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70867705P 2005-08-16 2005-08-16
US80807606P 2006-05-24 2006-05-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1915626E true PT1915626E (pt) 2012-02-03

Family

ID=37758302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT06813477T PT1915626E (pt) 2005-08-16 2006-08-15 Sensibilidade da apoptose a apo2l/trail por ensaio de expressão de galnac-t14 em células/tecidos

Country Status (18)

Country Link
US (3) US20090004204A1 (pt)
EP (4) EP1915625B1 (pt)
JP (7) JP5183474B2 (pt)
KR (2) KR100990266B1 (pt)
CN (2) CN101365951B (pt)
AT (2) ATE540318T1 (pt)
AU (3) AU2006279578A1 (pt)
BR (2) BRPI0615997A8 (pt)
CA (2) CA2619759A1 (pt)
DK (1) DK1915626T3 (pt)
ES (2) ES2376479T3 (pt)
HK (2) HK1115638A1 (pt)
IL (2) IL188874A (pt)
NO (2) NO20081374L (pt)
PT (1) PT1915626E (pt)
RU (3) RU2416097C2 (pt)
WO (2) WO2007022157A2 (pt)
ZA (2) ZA200800969B (pt)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007313818B2 (en) 2006-10-28 2013-02-14 Forum Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of histone deacetylase
US20100210545A1 (en) * 2007-10-15 2010-08-19 Shinsuke Araki Preventive/remedy for cancer
WO2011087778A1 (en) * 2009-12-22 2011-07-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Automated quantitative multidimensional volumetric analysis and visualization
PL391627A1 (pl) 2010-06-25 2012-01-02 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
ES2675847T3 (es) 2010-10-29 2018-07-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Nuevo anticuerpo anti-DR5
WO2012072815A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer fusion protein
PL219845B1 (pl) 2011-01-05 2015-07-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
PL394618A1 (pl) 2011-04-19 2012-10-22 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
PL397167A1 (pl) 2011-11-28 2013-06-10 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2016-10-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
CN104583757A (zh) * 2012-06-28 2015-04-29 弗洛雷森特里克公司 化学指示剂装置
RU2508542C1 (ru) * 2012-07-16 2014-02-27 Полина Михайловна Шварцбурд Экспресс-способ определения риска злокачественности клеток
EP2912445A4 (en) * 2012-10-26 2016-07-13 Fluidigm Canada Inc SAMPLE ANALYSIS BY MASS CYTOMETRY
GB201505239D0 (en) * 2015-03-27 2015-05-13 Neuro Bio Ltd Antibody
EP3341890B1 (en) * 2015-08-25 2021-04-28 Koninklijke Philips N.V. Tissue microarray analysis
RU2619214C1 (ru) * 2015-12-28 2017-05-12 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0 при размерах первичной опухоли в пределах 1 см
RU2735918C2 (ru) * 2018-06-07 2020-11-10 Общество с ограниченной ответственностью "ДЖЕЙВИС ДИАГНОСТИКС" Набор реагентов для выявления маркера эпителиальных карцином
CN109540859B (zh) * 2018-11-27 2021-02-09 上海交通大学 一种水体中抗生素的分析和含量预测方法
RU2688181C1 (ru) * 2019-01-10 2019-05-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") Способ прогнозирования сроков ответа на андроген-депривационную терапию у больных раком предстательной железы
CN109825579B (zh) * 2019-01-23 2020-01-14 山东大学齐鲁医院 Galnt2作为生物标志物在胶质瘤诊断和/或治疗中的应用
RU2715223C1 (ru) * 2019-12-02 2020-02-26 Общество с ограниченной ответственностью "Медбазис" Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии
WO2022154664A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut-Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018653A (en) 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4424279A (en) 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
ES2233936T3 (es) 1994-02-04 2005-06-16 Bio Merieux Virus msrv1 asociado a la esclerosis en placas, sus constituyentes nucleicos y sus aplicaciones.
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6284236B1 (en) 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
KR100510234B1 (ko) 1995-06-29 2005-11-25 임뮤넥스 코포레이션 세포소멸을 유도하는 시토킨
US6030945A (en) 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
US6998116B1 (en) 1996-01-09 2006-02-14 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
WO1998018921A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. NEUTROKINE $g(a)
EP2371962A3 (en) 1996-12-23 2011-12-21 Immunex Corporation Receptor activator of NF-KAPPA B, receptor is member of TNF receptor superfamily
US6433147B1 (en) 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
ES2284199T5 (es) 1997-01-28 2011-11-14 Human Genome Sciences, Inc. Receptor 4 que contiene dominio de muerte (dr4: receptor 4 de muerte), miembro de la superfamilia de receptores de tnf y unión a trail (apo-2l).
US6072047A (en) 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US20020160446A1 (en) 2000-11-14 2002-10-31 Holtzman Douglas A. Novel genes encoding proteins having prognostic diagnostic preventive therapeutic and other uses
US6313269B1 (en) 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
US20010010924A1 (en) 1997-03-14 2001-08-02 Keith Charles Deen Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides
PT970213E (pt) 1997-03-17 2007-04-30 Human Genome Sciences Inc Receptor 5 contendo um domínio de morte
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2001526532A (ja) 1997-04-16 2001-12-18 アムジエン・インコーポレーテツド オステオプロテゲリン結合性蛋白および受容体
WO1998046643A1 (en) 1997-04-16 1998-10-22 Millennium Biotherapeutics, Inc. TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR RELATED PROTEINS TANGO-63d AND TANGO-63e
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
JP2001511653A (ja) 1997-05-15 2001-08-14 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２レセプター
JP2002508663A (ja) 1997-06-18 2002-03-19 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２ＤｃＲ
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
CA2301202A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
DE69841176D1 (en) 1997-08-26 2009-11-05 Genentech Inc Rtd receptor
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
US6358682B1 (en) 1998-01-26 2002-03-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method and kit for the prognostication of breast cancer
AU2338299A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Genentech Inc. Antibodies to death receptor 4 (dr4) and uses thereof
US6252050B1 (en) 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
US6413826B2 (en) 1999-04-07 2002-07-02 Vantis Corporation Gate insulator process for nanometer MOSFETS
PT1181319E (pt) 1999-05-28 2009-07-14 Genentech Inc Anticorpos quiméricos contra dr4 e suas utilizações
MXPA01013236A (es) 1999-06-28 2002-06-21 Genentech Inc Metodos para hacer ligando apo-2 mediante el uso de iones metalicos divalentes.
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
JP2003529774A (ja) 2000-03-31 2003-10-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出し定量するための構成物及び方法
DE60136816D1 (de) * 2000-07-27 2009-01-15 Genentech Inc Sequentielle verabreichung von cpt-11 und apo-2l polypeptid
FR2828327B1 (fr) 2000-10-03 2003-12-12 France Telecom Procede et dispositif de reduction d'echo
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
WO2002097033A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US7348003B2 (en) 2001-05-25 2008-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20050129616A1 (en) 2001-05-25 2005-06-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
DK1409544T3 (da) * 2001-07-03 2009-10-26 Genentech Inc Humane DR4-antistoffer og anvendelser deraf
NZ568727A (en) 2001-11-01 2009-08-28 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
PT1450847E (pt) * 2001-11-13 2011-01-05 Genentech Inc Formulações de ligando de apo2/trail e suas utilizações
AU2002352676A1 (en) 2001-11-14 2003-05-26 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
JP2005516958A (ja) 2001-12-20 2005-06-09 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｔｒａｉｌレセプターに免疫特異的に結合する抗体
CN1189481C (zh) * 2002-03-28 2005-02-16 中国科学院动物研究所 人截短型重组可溶性trail－170蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用
KR20060031809A (ko) * 2003-06-09 2006-04-13 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간 암 치료 및 진단용 조성물 및 방법
US8067152B2 (en) * 2006-02-27 2011-11-29 The Fred Hutchinson Cancer Research Center Liver cancer biomarkers

Also Published As

Publication number Publication date
NO20081375L (no) 2008-05-16
ZA200800974B (en) 2009-11-25
RU2409817C2 (ru) 2011-01-20
ZA200800969B (en) 2009-08-26
HK1115638A1 (en) 2008-12-05
IL188874A (en) 2012-10-31
CN101287990B (zh) 2012-07-04
EP2306200A1 (en) 2011-04-06
HK1115448A1 (en) 2008-11-28
NO20081374L (no) 2008-05-16
EP1915625A2 (en) 2008-04-30
US20130072429A1 (en) 2013-03-21
JP2014237673A (ja) 2014-12-18
US20080182277A1 (en) 2008-07-31
JP2011244824A (ja) 2011-12-08
KR20080042087A (ko) 2008-05-14
RU2008110078A (ru) 2009-09-27
JP2011250788A (ja) 2011-12-15
EP1915626B1 (en) 2011-11-09
AU2006279618A1 (en) 2007-02-22
BRPI0615997A8 (pt) 2018-05-22
AU2010246471B9 (en) 2012-08-02
JP2009509500A (ja) 2009-03-12
DK1915626T3 (da) 2012-02-13
ATE533058T1 (de) 2011-11-15
US20090004204A1 (en) 2009-01-01
ATE540318T1 (de) 2012-01-15
KR20080029000A (ko) 2008-04-02
BRPI0615997A2 (pt) 2011-05-31
RU2416097C2 (ru) 2011-04-10
JP2017129589A (ja) 2017-07-27
AU2006279578A1 (en) 2007-02-22
AU2010246471A1 (en) 2010-12-16
WO2007022214A2 (en) 2007-02-22
IL188874A0 (en) 2008-04-13
KR100990266B1 (ko) 2010-10-26
WO2007022214A3 (en) 2007-08-23
IL188869A0 (en) 2008-04-13
CA2619759A1 (en) 2007-02-22
AU2010246471B2 (en) 2011-06-23
ES2380119T3 (es) 2012-05-08
RU2010144511A (ru) 2012-05-10
BRPI0616005A2 (pt) 2011-05-31
ES2376479T3 (es) 2012-03-14
CN101365951A (zh) 2009-02-11
CN101287990A (zh) 2008-10-15
JP2014237672A (ja) 2014-12-18
CN101365951B (zh) 2013-09-11
JP2009504186A (ja) 2009-02-05
RU2008110089A (ru) 2009-09-27
EP1915625B1 (en) 2012-01-04
IL188869A (en) 2012-10-31
EP2287615A1 (en) 2011-02-23
WO2007022157A3 (en) 2007-08-02
JP5186372B2 (ja) 2013-04-17
WO2007022157A2 (en) 2007-02-22
EP1915626A2 (en) 2008-04-30
CA2619842A1 (en) 2007-02-22
KR100990273B1 (ko) 2010-10-26
JP5183474B2 (ja) 2013-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010246471B2 (en) Apoptosis sensitivity to Apo2L/TRAIL by testing for GalNac-T14 expression in cells/tissues
EP2292794A2 (en) Death receptor (DR) antibody for pharmaceutical use and assays employing biomarkers for predicting sensitivity of cells to said antibody
EP2327791A2 (en) Assays and methods using biomarkers
AU2013263765A1 (en) Apoptosis sensitivity to Apo2L/TRAIL by testing for GalNac-T14 expression in cells/tissues