PL223487B1 - Przeciwnowotworowe białko fuzyjne - Google Patents

Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Info

Publication number
PL223487B1
PL223487B1 PL397595A PL39759511A PL223487B1 PL 223487 B1 PL223487 B1 PL 223487B1 PL 397595 A PL397595 A PL 397595A PL 39759511 A PL39759511 A PL 39759511A PL 223487 B1 PL223487 B1 PL 223487B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
fusion protein
domain
sequence
gly
Prior art date
Application number
PL397595A
Other languages
English (en)
Other versions
PL397595A1 (pl
Inventor
Jerzy Szczepan Pieczykolan
Sebastian Dominik Pawlak
Bartłomiej Żerek
Piotr Kamil Rózga
Original Assignee
Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością filed Critical Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority to PL397595A priority Critical patent/PL223487B1/pl
Priority to RS20180036A priority patent/RS56758B1/sr
Priority to SG11201403282QA priority patent/SG11201403282QA/en
Priority to NZ627445A priority patent/NZ627445B2/en
Priority to MX2014008028A priority patent/MX352796B/es
Priority to KR1020147021158A priority patent/KR20140110017A/ko
Priority to JP2014549601A priority patent/JP6324905B2/ja
Priority to NO12824731A priority patent/NO2797950T3/no
Priority to LTEP12824731.9T priority patent/LT2797950T/lt
Priority to CN201280060782.7A priority patent/CN103987728B/zh
Priority to US14/367,681 priority patent/US20140377216A1/en
Priority to UAA201408554A priority patent/UA115436C2/uk
Priority to SI201231178T priority patent/SI2797950T1/en
Priority to DK12824731.9T priority patent/DK2797950T3/en
Priority to CA2859494A priority patent/CA2859494A1/en
Priority to EA201491277A priority patent/EA201491277A1/ru
Priority to HUE12824731A priority patent/HUE035794T2/en
Priority to PT128247319T priority patent/PT2797950T/pt
Priority to BR112014015922-0A priority patent/BR112014015922A2/pt
Priority to AU2012360086A priority patent/AU2012360086B2/en
Priority to PCT/IB2012/057657 priority patent/WO2013098755A2/en
Priority to ES12824731.9T priority patent/ES2655828T3/es
Priority to PL12824731T priority patent/PL2797950T3/pl
Priority to EP12824731.9A priority patent/EP2797950B1/en
Publication of PL397595A1 publication Critical patent/PL397595A1/pl
Priority to IL232834A priority patent/IL232834A/en
Priority to PH12014501363A priority patent/PH12014501363A1/en
Priority to ZA2014/05460A priority patent/ZA201405460B/en
Priority to HK15102266.6A priority patent/HK1201848A1/xx
Publication of PL223487B1 publication Critical patent/PL223487B1/pl
Priority to HRP20180012TT priority patent/HRP20180012T1/hr
Priority to CY20181100048T priority patent/CY1120055T1/el

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedziny terapeutycznych białek fuzyjnych, zwłaszcza rekombinowanych białek fuzyjnych. Konkretnie, wynalazek dotyczy białek fuzyjnych zawierających fragment sekwencji rozpuszczalnego ludzkiego białka TRAIL w połączeniu z sekwencją krótkiego peptydu formującego pory w błonie komórkowej lub mitochondrialnej, ich zastosowania w terapii, zwłaszcza jako środków przeciwnowotworowych, oraz sekwencji polinukleotydowych kodujących te białka fuzyjne, wektorów ekspresyjnych zawierających te sekwencje polinukleotydowe i komórek gospodarza, zawierających te wektory ekspresyjne.
Należące do rodziny cytokin białko TRAIL (Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand), znane także pod nazwą Apo2L (Apo2-Ligand), jest silnym aktywatorem apoptozy w komórkach nowotworowych oraz komórkach zainfekowanych przez wirusy. TRAIL jest naturalnym ligandem występującym w organizmie. Białko TRAIL, jego sekwencję aminokwasową, kodujące sekwencje DNA oraz systemy ekspresji tego białka ujawniono po raz pierwszy w EP0835305A1.
Białko TRAIL działa przeciwnowotworowo poprzez wiązanie się z proapoptotycznymi receptorami powierzchniowymi TRAIL 1 i 2 (TRAIL-R1/R2) i aktywowanie tych receptorów. Receptory te, znane także jako DR4 i DR5 (receptor śmierci 4 i receptor śmierci 5), należą do rodziny receptorów TNF i są nadprodukowane przez różne typy komórek nowotworowych. Aktywowanie receptorów może indukować niezależny od genu supresorowego p53 zewnętrzny szlak sygnałowy apoptozy, który p oprzez aktywowaną kaspazę-8 prowadzi do aktywacji kaspaz wykonawczych. Uwalniana w wyniku aktywacji przez TRAIL kaspaza-8 może też powodować uwalnianie odciętego białka Bid, które jest translokowane do mitochondrium, gdzie pobudza uwalnianie cytochromu C, w ten sposób pośrednio amplifikując sygnał apoptotyczny z receptorów śmierci.
TRAIL działa selektywnie na komórki nowotworowe, nie wywołując zasadniczo apoptozy w komórkach zdrowych, które wykazują oporność na to białko. W związku z tym dostrzeżono ogromny potencjał białka TRAIL jako środka przeciwnowotworowego działającego na szeroką gamę nowotworów różnych typów, w tym na nowotwory hematologiczne i guzy lite, a przy tym oszczędzającego komórki zdrowe i o potencjalnie relatywnie niewielkich działaniach ubocznych.
Białko TRAIL jest białkiem błonowym typu II o długości 281 aminokwasów, a jego region pozakomórkowy obejmujący aminokwasy 114-281 po odcięciu przez proteazy tworzy rozpuszczalną cząsteczkę sTRAIL (ang. soluble TRAIL), o wielkości 20 kDa, która jest także biologicznie aktywna. Obie formy, TRAIL i sTRAIL, są zdolne do wyzwalania apoptozy poprzez oddziaływanie z receptorami TRAIL obecnymi w komórkach docelowych. Silne działanie przeciwnowotworowe i bardzo niską toksyczność ogólnoustrojową sTRAIL wykazały badania na liniach komórkowych. Również badania kliniczne na ludziach ludzkiego rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL (rhTRAIL, ang. recombinant human TRAIL) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej aminokwasom 114-281 hTRAIL, znanego pod nazwą INN dulanermin, wykazały jego dobrą tolerancję i brak toksyczności limitującej dawkę. Dotychczas opisywane toksyczne działania rekombinowanych białek TRAIL na komórki wątroby wydają się być związane z obecnością modyfikacji typu znacznika polihistydynowego - TRAIL nieznakowany nie wykazuje toksyczności ogólnoustrojowej.
Dalsze badania rozwojowe pokazały jednak, że w badaniach klinicznych na pacjentach rzeczywista efektywność TRAIL jako monoterapii jest niska. Problemem okazała się też pierwotna lub nabyta oporność na TRAIL, wykazywana przez wiele komórek nowotworowych (zobacz na przykład WO2007/022214). U podłoża oporności leżą różne mechanizmy i może być ona uwarunkowana rodzajem nowotworu i/lub zależna od pacjenta (Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptortargeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24). Oporność ta ogranicza możliwość stosowania TRAIL jako środka przeciwnow otworowego. Mechanizm oporności na TRAIL nie został dokładnie poznany, przypuszcza się jednak, że może ona przejawiać się na różnych poziomach szlaku apoptozy wywoływanej przez TRAIL, poczynając od poziomu receptorów na powierzchni komórki do kaspaz wykonawczych w obrębie szlaku sygnałowego.
Dla przezwyciężenia tej niskiej efektywności oraz oporności nowotworów na TRAIL zaprojektowano różne terapie kombinowane z radio- i chemioterapeutykami, skutkujące synergistycznym efektem apoptotycznym (WO2009/002947; A. Almasan, A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; R.K. Srivastava, Neoplasis, Vol. 3, No 6, 2001, 535-546; J.C. Soria i współpr., J. Clin. Oncology, vol. 28, nr 9 (2010), str. 1527-1533). Stosowanie rhTRAIL w leczeniu raka w komPL 223 487 B1 binacji z wybranymi konwencjonalnymi środkami chemioterapeutycznymi (paklitaksel, karboplatyna) i przeciwciałami monoklonalnymi anty-VEGF opisano w WO2009/140469. Jednakże kombinacja taka wiąże się nieuchronnie z dobrze znanymi wadami konwencjonalnej chemioterapii lub radioterapii. W stanie techniki brak jest jednak danych, które sugerowałyby zniesienie oporności komórek na TRAIL uzyskane poprzez łączenie białka TRAIL z innymi białkami lub ich fragmentami.
Ponadto, problemem przy terapii białkiem TRAIL okazała się jego niska trwałość i bardzo szybkie usuwanie z organizmu po podaniu.
Znany jest efekt niszczenia komórek nowotworowych i hamowania proliferacji guza na skutek dezintegracji (zaburzenia ciągłości) błony komórkowej lub błony mitochondrialnej. Podejmowane są też próby wykorzystania substancji o działaniu cytolitycznym zdolnych do dezintegracji błony zarówno jako terapii przeciwnowotworowej jak i uzupełniającej terapii przeciwnowotworowej.
Znane są naturalne i syntetyczne substancje peptydowe i białkowe o działaniu cytolitycznym. Peptydy cytolityczne określane są także jako peptydy formujące pory lub cytolizyny. Oddziaływania peptydów formujących pory z powierzchnią błony mogą być niespecyficznymi oddziaływaniami elektrostatycznymi dodatnio naładowanego peptydu z ujemnie naładowaną powierzchnią błony komórkowej Peptydy te generalnie mają charakter kationowy, dzięki czemu są zdolne do oddziaływań typu elektrostatycznego z powierzchniami posiadającymi przewagę cząsteczek naładowanych ujemnie. Na skutek kontaktu i oddziaływania peptydu cytolitycznego z lipidami na powierzchni błony komórkowej, a po wniknięciu do wnętrza komórki z lipidami na powierzchni błony mitochondrialnej, następuje przerwanie ciągłości błony komórkowej, utworzenie w błonie transbłonowych porów o niewielkich rozmiarach, przez które następuje wyciek zawartości cytoplazmy, w tym jonów, na zewnątrz komórki, skutkiem czego jest szybkie i nieodwracalne zaburzenie równowagi elektrolitowej w komórce, liza komórki i jej śmierć.
Oddziaływania peptydów formujących pory z powierzchnią błony mogą być także oddziaływaniami ze specyficznymi receptorami obecnymi na tej powierzchni.
Znane naturalnie występujące cytolityczne peptydy pochodzenia bakteryjnego, roślinnego lub ssaczego zdolne do formowania porów w błonie komórkowej często nazywane są hemolizynami, ponieważ powodują lizę czerwonych krwinek oraz innych komórek eukariotycznych. Toksyny te obejmują cekropiny A i B, aureinę 1.2, citropinę 1.1, defensynę (HNP-2), laktoferycynę B, tachyplezynę, PR-39, cytolizyny z Enterococcus foecalis, hemolizynę delta, toksynę błonicy, cytolizynę z przecinkowca cholery, toksynę z Actinia equina, granulizynę, peptydy lityczne Streptococcus intermedius, peptydy lityczne lentiwirusowe, leukotoksynę z Actinobacillus actinomycetemcomitans, magaininę, melittynę, limfotoksynę, enkefalinę, paradaksyny, perforynę (w szczególności jej N-końcowy fragment), perfringolizynę O (PFO/ toksyna teta) z Clostridium perfnngens, oraz streptolizyny. Ich użyteczność jako leków ograniczona jest zdolnością powodowania hemolizy.
Naturalne peptydy cytolityczne opisane są na przykład w R. Smolarczyk i in., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 360-368.
Znane są także syntetyczne peptydy cytolityczne formujące pory. Są one projektowane tak aby nie posiadały właściwości hemolitycznych, były mniej immunogenne, lub posiadały miejsca umożliwiające dużą swoistość wiązania z celami komórkowymi, takimi jak na przykład receptory z rodziny VEGFR (receptor naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu) i receptory z rodziny EGFR (receptor czynnika wzrostu naskórka). Często są one hybrydami fragmentów naturalnych peptydów cytolitycznych, tak jak hybryda fragmentu cekropiny A i fragmentu magaininy 2 CA(1-8)MA(1-12) czy hybryda fragmentu cekropiny A i fragmentu melittyny CAMEL (CA(1-7)MEL(2-9)). Znane są także syntetyczne peptydy cytolityczne D-K4-L2-R9 i D-K6-L9, składające się z aminokwasów lizyny, argininy i leucyny, z których część jest w postaci D-aminokwasów. Znane są także syntetyczne peptydy chimeryczne RGD-4Cd(KLAKLAK)2, zawierający motyw RGD wiązania z integryną avB3 i domenę efektorową zbudowaną z D-aminokwasów KLAKLAKKLAKLAK, oraz PTD-5d(KLAKLAK)2 zawierający motyw PTD-5 umożliwiający wnikanie do wnętrza komórki i domenę efektorową zbudowaną z D-aminokwasów KLAKLAKKLAKLAK, (patrz np. R. Smolarczyk i in., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 360-368). Inne znane syntetyczne peptydy cytolityczne są opisane na przykład w Regen i in., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 566-571, 1989.
Niszczenie błony po przywarciu peptydu do błony może odbywać się według mechanizmu typu „klepek beczki” (barrel-stave model), mechanizmu typu „pierścieniowego” (toroidal-pore model) albo mechanizmu typu dywanowego (patrz np. R. Smolarczyk i in., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63:
360-368).
PL 223 487 B1
Mechanizm „klepek beczki” występuje dla peptydów amfipatycznych o konformacji alfa-helikalnej i długości co najmniej 23 aminokwasów. Peptydami, które powodują niszczenie błony poprzez mechanizm „klepek beczki” są przykładowo: gramicydyna A, alametycyna, perforyny, pilosuliny, peptydy syntetyczne obejmujące powtórzone motywy KLAK, katelicydyny, peptydy izolowane z Entamoeba histolytica, parasporyny i cekropiny. Peptydami, które powodują niszczenie błony poprzez mechanizm „pierścieniowy” są przykładowo melittyna i magainina. Peptydami, które powodują niszczenie błony poprzez mechanizm dywanowy są przykładowo cekropiny A i B.
Dezintegracja błony komórkowej z wytworzeniem porów może być także skutkiem oddziaływania peptydów o silnym ładunku dodatnim z ujemnie naładowanymi składnikami błony. Właściwości takie wykazują m.in. granulizyny, analogi i pochodne melittyny, peptydy obejmujące motyw K(L)xR, tachyplezyna, bombezyna, magainina, czy wiskotoksyna.
Formowanie porów w błonie komórki docelowej może być także związane z aktywnością enzymatyczną peptydów. Aktywność enzymatyczną wykazują przykładowo fosfolipazy o specyficznej a ktywności fosfodiesterazy wobec fosfatydylocholiny i sfingomieliny, hemolizyny i cytolizyny o aktywności niespecyficznej lub hemolizyny i cytolizyny wykazujące aktywność cytolityczną wobec błon biologicznych zawierających przykładowo cholesterol. Tego typu aktywność enzymatyczną skutkującą formowaniem porów w błonie komórkowej lub mitochondrialnej wykazują listeriolizyna, equinatoksyna, fosfolipazy PC-PLC, oraz alfa toksyna z Clostridium perfringens.
Znane są także koniugaty oraz chimery peptydów formujących pory z domenami kierującymi do komórek nowotworowych. Do kierowania wykorzystywane są antygeny, ugrupowania węglowodanowe lub receptory czynników wzrostu, nadprodukowane na powierzchni komórek nowotworowych. Kierowane dostarczanie zapewnia niezbędne do działania cytolitycznego wysokie stężenie peptydu formującego pory na powierzchni komórki.
Zastosowanie kierowanych porotwórczych aktynoporyn opisano w Panchal RG. i wsp., Poreforming proteins and their application in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2002, 3:99-115; Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells. Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252 oraz w Hoskin DW, Ramamoorthy A: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778:357-375.
Znane jest także nadawanie porotwórczym peptydom i białkom zdolności kierowania się do związanych z nowotworem antygenów i receptorów na drodze odpowiednich modyfikacji genetycznych jak również na drodze ich chemicznego dołączania do odpowiednich ligandów lub przeciwciał. Tego typu modyfikacje opisano dla d-endotoksyny z bakterii Bacillus thuringiensis, equinatoksyny II z Actinia equina, sticholizyny i Stichodactyla helianthus i toksyny błonicy z Corynebacterium diphtheriae, (Soletti RC.: Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells. Anti-Cancer Drugs 2008, 19:517-525; Pederzolli C.: Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin-ll, a cytolysin from a sea anemone. Bioconjugate Chem 1995, 6:166-173, van der Spek JC.: Fusion protein toxins based on diphtheria toxin: Selective targeting of growth factor receptors of eukaryotic cells. Appl Chimeric Genes Hybrid Proteins Pt B 2000, 327:239-249).
Opisano także białko fuzyjne składające się z porotwórczej toksyny sticholizyny I i przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko nowotworowemu specyficznemu antygenowi C2 oraz jego użyteczność w leczeniu na modelu linii komórkowej raka okrężnicy. (Tejuca M. i wsp. Construction of an immunotoxin with the pore forming protein St1 and ior C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line, Int. Immunopharmacol. 2004, 4:731-744). Opisano także szereg białek fuzyjnych obejmujących toksynę błonicy i interleukinę 2 czy EGF i ich potencjał w niszczeniu komórek nadprodukujących docelowe receptory (Murphy JR, Vanderspek JC: Targeting diphtheria-toxin to growth-factor receptors, Semin Cancer Biol 1995, 6:259-267).
Znane jest także stosowanie w cząsteczkach białek fuzyjnych peptydów cytolitycznych miejsc cięcia rozpoznawanych przez specyficzne proteazy mające na celu uwolnienie białka efektorowego w środowisku nowotworu i w konsekwencji jego internalizację do komórki nowotworowej. Przykładowo, Panchal R. i współpr. (Nat Biotechnol 1996, 14:852-856) ujawnili alfa-hemolizyny obejmujące w swojej sekwencji miejsce cięcia rozpoznawane przez katepsynę B - aktywowane przez proteazę obecną w środowisku nowotworu.
Znane są także modyfikowane proaerolizyny (PA), nieaktywne prekursory bakteryjnych cytolitycznych białek porotwórczych, aktywowane po cięciu przez proteazy z komórek raka prostaty (PSA) (Williams S.A. i wsp. JNCI J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (5): 376-385. doi:10.1093/jnci/djk065).
PL 223 487 B1
Z opisu patentowego US5817771B1 znane są koniugaty, w tym białka fuzyjne, peptydów cytolitycznych formujących pory z przeciwciałem lub antygenem jako elementem selektywnie wiążącym się na komórce nowotworowej, oraz z linkerami umożliwiającymi selektywną aktywację peptydu cytolitycznego w środowisku nowotworu, takimi jak przykładowo miejsce cięcia przez enzymy takie jak proteazy, zwłaszcza proteazy nadprodukowane specyficznie w środowisku nowotworu.
Barua i wsp. (Cancer Letters 293 (2010) 240-253) podali, że linie komórkowe raka prostaty oporne na TRAIL i niewrażliwe na traktowanie przeciwciałami agonistycznymi receptorów śmierci DR4 i DR5 stają się wrażliwe na te przeciwciała po wcześniejszym traktowaniu tych komórek syntetycznym kationowym amfipatycznym peptydem litycznym KLA zawierającym sekwencje KLAK.
Niniejszy wynalazek dostarcza białka fuzyjne o właściwościach przeciwnowotworowych, które zawierają domenę pochodzącą z TRAIL oraz domenę cytolitycznego peptydu efektorowego o działaniu porotwórczym względem błon komórkowych i/lub mitochondrialnych komórek ssaczych.
Obie domeny składowe białka wg wynalazku mają różne funkcje. Domena pochodząca z TRAIL zapewnia wybiórcze kierowanie i wiązanie do powierzchni komórek nowotworowych, gdzie poszczególne elementy białka wywierają swoje działanie. W szczególności, po związaniu domena TRAIL może ponadto wywierać działanie wyzwalania apoptozy, zaś peptyd efektorowy działanie formowania porów w błonie komórkowej /lub mitochondrialnej i powodowania lizy komórki nowotworowej.
Dostarczenie białka wg wynalazku do środowiska guza umożliwi zminimalizowanie toksyczności względem zdrowych komórek organizmu oraz działań ubocznych, a także zmniejszenie częstości podawania leku. Ponadto, terapia celowana z zastosowaniem białek wg wynalazku pozwoli ominąć problem małej efektywności dotychczas znanych niespecyficznych terapii opartych na wytworzeniu porów w błonie komórkowej lub mitochondrialnej stosujących toksyny roślinne lub bakteryjne, spowodowany wysoką toksycznością i koniecznością stosowania wysokich dawek.
Okazało się, że białka fuzyjne według wynalazku wykazują w wielu przypadkach silniejsze działanie niż rozpuszczalny TRAIL i jego warianty obejmujące fragment sekwencji.
Peptydy efektorowe stosowane w białkach fuzyjnych według wynalazku, jako takie, ze względu na niekorzystną kinetykę, szybką degradację przez niespecyficzne proteazy i kumulację w organizmie spowodowaną brakiem odpowiedniej kolejności aktywacji szlaków, niezbędnej do umożliwienia działania peptydu efektorowego w miejscu docelowym, nie znalazły zastosowania w lecznictwie. Dzięki włączeniu do białka fuzyjnego możliwe jest ich selektywne dostarczenie do miejsca, gdzie ich działanie jest pożądane. Ponadto, dołączenie peptydu efektorowego powoduje zwiększenie masy białka, co skutkuje wydłużeniem okresu półtrwania oraz zwiększeniem retencji białka w nowotworze i podwyższeniem jego efektywności.
Nowe białka fuzyjne wykazują także co najmniej zmniejszoną lub ograniczoną, a nawet zasadniczo wyeliminowaną aktywność hemolityczną pojedynczych naturalnych peptydów cytolitycznych.
Dodatkowo, w wielu przypadkach nowe białka fuzyjne przełamują naturalną bądź wyindukowaną oporność na TRAIL. Najprawdopodobniej, przełamanie oporności jest skutkiem destabilizacji potencjału błonowego komórki w wyniku wiązania się białek fuzyjnych z lipidami błony komórkowej lub mitochondrialnej i tworzenia porów, co powoduje wyciek jonów dwuwartościowych na zewnątrz k omórki. Konsekwencją wiązania się z lipidami błony mitochondrialnej jest uwolnienie do cytoplazmy cytochromu C, białka SMAC/Diablo oraz czynnika, AIF które powodują aktywację kaspazy apoptotycznej w zaatakowanej komórce. Degradacja błon mitochondrialnych prowadzi także do aktywacji kaspazy 9, również powodującej indukcję apoptozy.
Opis Figur rysunku.
Fig. 1 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Cby.Cg-foxn1(nu)/J obarczonych nowotworem płuc A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 2 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Cby.Cgfoxn1(nu)/J obarczonych nowotworem płuc traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 3 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem płuc A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 4 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem płuc A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
PL 223 487 B1
Fig. 5 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscldHrhr na obarczonych nowotworem płuc NCI-H460-Luc2 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 6 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscIdHrhr obarczonych nowotworem płuc NCI-H460-Luc2 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 7 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Cby.Cg-foxn1(nu)/J obarczonych nowotworem prostaty PC3 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 8 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Cby.Cgfoxn1(nu)/J obarczonych nowotworem prostaty PC3 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 9 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem trzustki PANC-1 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 10 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem PANC-1 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 11 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem jelita grubego HCT116 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 12 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem jelita grubego HCT116 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 13 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem jelita grubego SW620 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 16 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 14 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem jelita grubego SW620 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 16 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 17 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem macicy MES-SA/Dx5 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Fig. 18 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem macicy MES-SA/Dx5 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 w porównaniu z rhTRAIL114-281.
Szczegółowy opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, zawierające:
- domenę (a) obejmującą funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego białka rhTRAIL rozpoczynający się aminokwasem w pozycji w zakresie od hTRAIL95 do hTRAIL121, włącznie, i kończący się aminokwasem 281, i
- domenę (b) stanowiącą sekwencję cytolitycznego peptydu efektorowego o konformacji amfipatycznej alfa-helisy formującego pory w błonie komórkowej, przy czym sekwencja domeny (b) jest przyłączona na C-końcu i/lub N-końcu domeny (a).
Przez peptyd zgodnie z wynalazkiem należy rozumieć cząsteczkę zbudowaną z wielu aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym.
Określenie peptyd zgodnie z wynalazkiem obejmuje zatem oligopeptydy, polipeptydy i białka.
Przez funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego hTRAIL należy rozumieć fragment zdolny do indukowania apoptozy w komórkach ssaczych, po uprzednim związaniu się z receptorami śmierci obecnymi na powierzchni komórki.
Białko fuzyjne według wynalazku może zawierać przynajmniej jedną domenę (b) peptydu efektorowego, przyłączoną do C-końca lub N-końca domeny (a).
Przez sekwencję hTRAIL rozumie się znaną sekwencję hTRAIL, opublikowaną w bazie danych GenBank pod numerem P50591, i przedstawioną w wykazie sekwencji niniejszego zgłoszenia jako Sekw. Nr 90.
PL 223 487 B1
Domeną (a) jest fragment sekwencji hTRAIL, rozpoczynający się aminokwasem w zakresie od hTRAIL95 do hTRAIL121 włącznie, i kończący się aminokwasem hTRAIL 281, lub homolog tego fragmentu hTRAIL o sekwencji aminokwasów przynajmniej w 85% identycznej z tym fragmentem.
Domena (a) w szczególności może być wybrana z grupy składającej się z sekwencji odpowiadających hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 i hTRAIL121-281. Dla specjalisty w dziedzinie, oczywistym jest, że hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 i hTRAIL121-281 oznaczają fragment ludzkiego białka TRAIL, rozpoczynający się od aminokwasu, odpowiednio, oznaczonego numerem 95, 114, 115, 119, i 121 w znanej sekwencji hTRAIL.
Domena (a), czyli fragment TRAIL, jest domeną odpowiedzialną za wiązanie konstruktu białka fuzyjnego z receptorami śmierci na powierzchni komórki. Ponadto, domena (a) po związaniu może wywierać znane działanie agonistyczne TRAIL, to jest aktywowania zewnętrznego szlaku apoptozy.
Domenę (b) białka fuzyjnego stanowi peptyd o działaniu cytolitycznym względem komórki eukariotycznej.
Przez peptyd o działaniu cytolitycznym należy rozumieć peptyd posiadający zdolność formowania porów w błonie komórkowej, a po wniknięciu do komórki także w błonie mitochondrialnej, i w ten sposób przerywania ciągłości błony. W wyniku przerwania ciągłości błony następuje wyciek zawartości cytoplazmy, w tym jonów, na zewnątrz komórki, skutkiem czego jest szybkie i nieodwracalne zaburzenie równowagi elektrolitowej w komórce i jej zniszczenie (liza komórki).
Zdolność danego peptydu do formowania porów w błonie komórkowej lub mitochondrialnej i powodowania w ten sposób lizy komórki może być określona znaną specjalistom metodą badania permeabilizacji błon komórkowych, np. poprzez pomiar uwalniania z wnętrza komórki zawartej w niej substancji, takiej jak ATP lub znacznik radioaktywny, którymi komórka została wcześniej obciążona, albo poprzez pomiar wychwytu barwnika, takiego jak np. błękit tryptofanowy, który nie ma miejsca w przypadku gdy komórki są nienaruszone.
Cytolitycznym peptydem efektorowym zgodnie z wynalazkiem może być zarówno peptyd naturalny jak i peptyd syntetyczny.
Naturalnym peptydem cytolitycznym formującym pory może być egzotoksyna pochodzenia bakteryjnego, jak parasporyna-2 z Bacillus thuringensis.
Naturalnym peptydem cytolitycznym formującym pory może być także peptyd pochodzenia eukariotycznego, taki jak rodzina pilosulin, w tym pilosulina 1 i pilosulina-5 z jadu australijskich mrówek Myrmecia Pilosila.
Syntetycznym peptydem cytolitycznym formującym pory mogą być syntetyczne peptydy cytolityczne składające się z dodatnio naładowanych aminokwasów lizyny, argininy i leucyny, z których część jest w postaci D-aminokwasów, takie jak D-K4-L2-R9 i D-K6-L9, oraz peptydy zawierające domenę zbudowaną z motywu D-aminokwasów KLAKLAK lub jego powtórzeń, np. (KLAKLAK)2.
Peptydem efektorowym domeny (b) białka fuzyjnego według wynalazku jest peptyd porotwórczy posiadający konformację amfipatycznych alfa-helis umożliwiających interakcję z błonami biologicznymi.
Przykładowe sekwencje peptydu efektorowego są przedstawione jako Sekw. Nr 36 (pilosulina-1), Sekw. Nr 37 (pilosulina-5), Sekw. Nr 41 (14-aminokwasowy syntetyczny peptyd lityczny, Sekw. Nr 43 (27-aminokwasowy peptyd FF/CAP-18). Sekw. Nr 44 (peptyd BAMP-28), Sekw. Nr 45 (analog izoformy C peptydu litycznego z Entamoeba histolytica) Sekw. Nr 46 (analog izoformy A peptydu litycznego z Entamoeba histolytica), Sekw. Nr 47 (analog izoformy B peptydu litycznego z Entamoeba histolytica), Sekw. Nr 48 (fragment domeny HA2 hemaglutyniny wirusa grypy), Sekw. Nr 54 (aktywny fragment ludzkiej perforyny) i Sekw. Nr 55 (parasporyna-2 z Bacillus thuringensis).
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym porotwórczo względem komórki eukariotycznej może być peptyd pilosutina-1, będący kationową cząsteczką pochodzącą z jadu australijskich mrówek Myrmecia Pilosula. Pilosulina 1 jest peptydem o wysokiej zawartości lizyny i argininy powtarzających się regularnie w sekwencji. Dzięki dużej zawartości tych aminokwasów uzyskany peptyd posiada silny ładunek dodatni umożliwiający mu selektywne oddziaływanie z błonami komórek nowotworowych i tworzenie porów na drodze mechanizmu „klepek beczki” (Kourie i wsp., Am J Physiol Cell Physiol, 278; 1063-1087, 2000).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 56-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 36.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym porotwórczo względem komórki eukariotycznej może być peptyd pilosulina-5, odpowiadający za oddziaływania jonowe z błoną komórko8
PL 223 487 B1 wą skutkujące utworzeniem w niej porów, i w konsekwencji zahamowaniem rozrostu nowotworu. Pilosulina 5 jest peptydem należącym do rodziny pilosulin pochodzących z jadu australijskich mrówek Myrmecia Pilosula. Peptyd ten posiada w swojej strukturze powtarzające się cyklicznie aminokwasy lizynę, alaninę i kwas asparaginowy nadające mu ładunek dodatni, co pozwala na wzmożenie oddziaływania z powierzchnią błon komórek nowotworowych.
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 100-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 37.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki euk ariotycznej może być syntetyczny peptyd lityczny. Syntetyczne peptydy o wzorze ogólnym (KLAKKLA)n (gdzie n oznacza dowolną ilość powtórzeń motywu) jako białka amfipatyczne i alfa-helikalne po wniknięciu do wnętrza komórki są selektywnie akumulowane w negatywnie naładowanej błonie mitochondrialnej, powodując powstawanie porów i destabilizację potencjału elektrostatycznego mitochondriów. dzięki czemu selektywnie eliminują komórki wybranych linii nowotworowych (Javadpour i wsp., J Med. Chem. 39:3107-13, 1996).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 14-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 41.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) o działaniu porotwórczym jest FF/CAP18, op isany przez Isogai E., Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira Vol. 4, No. 1.2004 The Journal of Applied Research, 180-185). FF/CAP18 jest analogiem 27-aminokwasowej C-końcowej sekwencji ludzkiej katelicydyny hCAP18109-135, którą zmodyfikowano przez zastąpienie 2 reszt amino-kwasowych fenyloalaninami. FF/CAP18 ma silnie kationowy charakter, zwiększony w stosunku do sekwencji natywnej dzięki wprowadzonej modyfikacji, i silnie wiąże się z błonami komórek eukariotycznych. Po związaniu się do powierzchni błon FF/CAP18 tworzy w nich kanały i pory jonowe skutkujące destabilizacją równowagi elektrostatycznej komórek. Dodatkowo, po wniknięciu do wnętrza komórki analog ten wbudowuje się w błonę mitochondriów tworząc w niej kanały jonowe destabilizujące potencjał elektrostatyczny mitochondriów skutkujące uwolnieniem z mitochondriów do cytoplazmy czynników takich jak cytochrom C, SMAC/DIABLO czy czynnik Alf, co zapoczątkowuje proces apoptozy.
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 27-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 43.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki euk ariotycznej może być peptyd BAMP-28, peptyd o silnym ładunku dodatnim należącym do rodziny katelicydyn. Jest on także analogiem strukturalnym ludzkich histatyn, grupy 12 peptydów o masie nie przekraczającej 4 kDa produkowanych przez komórki ślinianek o właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych (W., Kamysz i wsp., Histatyny - białka liniowe bogate w histydynę, Nowa Stomatologia 2004). Domena N-końcowa peptydu BAMP-28 jest silnie naładowana dodatnio i odpowiada za dokowanie do błony komórkowej, natomiast część C końcowa odpowiada za aktywność cytotoksyczną (Hugosson, M., D. i wsp, 1994. Antibacterial peptides and mitochondrial presequences affect mitochondrial coupling, respiration and protein import, Eur. J. Biochem. 223:1027-1033.). Mechanizm aktywności peptydu BMAP-28 polega przede wszystkim na formowaniu porów w błonach komórkowych i mitochondrialnych. (A., Risso i wsp., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926-1935).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 27-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 44.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki euk ariotycznej jest analog izoformy A peptydu litycznego z Entamoeba histolytica, odpowiadający za kumulację na powierzchni błony komórkowej skutkującej utworzeniem porów, co w konsekwencji prowadzi do w zahamowania rozrostu nowotworu. Zidentyfikowano trzy izoformy (A, B, C) peptydów z Entamoeba histolytica, zlokalizowane w ziarnistościach cytoplazmy pasożyta. Są to 77-aminokwasowe polipeptydy stabilizowane przez trzy mostki siarczkowe, zawierające w strukturze drugorzędowej cztery amfipatyczne helisy (Leippe, M i wsp. EMBO J. 11,3501-3506, 1992). Peptydy te mają właściwości lityczne względem komórek eukariotycznych (Leippe, M. i Muller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994). Helisa trzecia obecna w strukturze peptydów ma długość pozwalającą jej na penetrację błon y komórkowej i samodzielne formowanie porów. W oparciu o sekwencje aminokwasowe obejmujące tylko domenę helisy trzeciej z wszystkich trzech izoform skonstruowano serię synastetycznych peptyPL 223 487 B1 dów analogowych (A3, B3 i C3) o właściwościach porotwórczych i cytotoksycznych względem komórek ludzkich linii nowotworowych przy niskiej aktywności hemolitycznej. (Andra i wsp. FEB5 Letters 385: 96-100,1996).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 24-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 45.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki eukariotycznej jest analog izoformy B peptydu litycznego z Entamoeba histolytica.
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 24-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 46.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki euk ariotycznej może być analog izoformy C peptydu litycznego z Entamoeba histolytica.
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 24-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 47.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki euk ariotycznej może być peptyd będący homologiem N-końcowego fragmentu 20 aminokwasów (tzw. „peptydu fuzyjnego) domeny HA2 hemaglutyniny wirusa grypy, odpowiadającego za oddziaływanie kapsydu wirusowego z błoną komórkową gospodarza (interkalowanie) skutkujące utworzeniem porów w błonie komórkowej gospodarza. Hemaglutynina (HA) wirusa grypy jest homotrimeryczną glikoproteiną odpowiadającą za fuzję kapsydu wirusowego z błoną komórkową gospodarza. W strukturze białka można wyróżnić dwie domeny: HA1 - wiążącą receptor i HA2 - odpowiadającą za oddziaływanie z błoną komórkową. W strukturze domeny HA2 tylko jej N - końcowa część (20 aminokwasów) tzw. „peptyd fuzyjny” bezpośrednio interkaluje w strukturę błony komórkowej (Durrer P i wsp., J Biol Chem 271:13417-13421, 1996). Analizy strukturalne homologów peptydu fuzyjnego wykazały, że jego aktywność związana jest ze zmianami konformacyjnymi prowadzącymi do formowania amfipatycznych alfa helis, mających zdolność perforowania błon endosomów (Takahashi S Biochemistry 29: 6257-6264, 1990). Z tego powodu pochodne „peptydu fuzyjnego” można zastosować jako efektywne nośniki biologicznie czynnych substancji zapewniając im efektywną i szybką „ucieczkę” z endosomów.
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 12-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 48.
Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki eukariotycznej może być peptyd stanowiący aktywny fragment ludzkiej perforyny.
Użycie białek ludzkiego pochodzenia, które są „niewidoczne” dla układu odpornościowego, w tym ludzkiej perforyny, może rozwiązywać problem ograniczonej użyteczności klinicznej chimer białkowych zawierających toksyny pochodzenia bakteryjnego, zwierzęcego lub roślinnego z powodu generowanej przez nie silnej immunogenności (Frankel AE. Reducing the immune response to imm unotoxin. Clin Cancer Res. 2004 Jan 1; 10(1 Pt 1):13-5). N-końcowy 34-aminokwasowy fragment ludzkiej perforyny tworzący niespecyficznie pory w błonie komórkowej, zachowuje aktywność cytotoksyczną całego białka (Liu CC, Walsh CM, Young JD. Perforin: structure and function. Immunol Today, 1995 Apr; 16(4):194-201). Fragment perforyny w formie fuzji z przeciwciałem kierującym do komórek nowotworowych zachowuje wybiorczą aktywność cytotoksyczną (Wan L, Expression, purification, and refolding of a novel immunotoxin containing humanized single-chain fragment variable antibody against CTLA4 and the N-terminal fragment of human perforin. Protein Expr Purif, 2006 Aug; 48(2): 307-13. Epub 2006 Mar 9).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 33-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 54.
Innym peptydem efektorowym domeny (b) działającym toksycznie względem komórki eukariotycznej może być parasporyna-2 z Bacillus thuringensis. Rodzina parasporyn obejmuje 13 różnych toksyn należących do podgrup PS1, PS2-PS3, PS4 (Ohba M, Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res. 2009 Jan; 29(1):427-33). Parasporyna-2 wykazuje specyficzność wobec komórek nowotworowych (MOLT-4, Jurkat, HL60, HepG2, CACO-2) i występuje w postaci 37-kDa protoksyny aktywowanej poprzez odcięcie przez proteazę K fragmentu N i C-terminalnego o długościach odpowiednio 51 i 36 aminokwasów. Główne działanie parasporyny-2 polega na oligomeryzacji wewnątrz błony komórkowej z wytworzeniem porów o średnicy około 3 nm skutkujących zwiększaniem jej przepuszczalności. Efekty działania parasporyny-2 uzależnione są od rodzaju badanych linii komórkowych i obejmują tworzenie się tzw. „blebbs” czyli wypukłości spowodowanych wypływem cytoplazmy z wnętrza komórek i ich lizę (HepG2 i NIH-3T3) lub wytworzenie struktur waku10
PL 223 487 B1 olo-podobnych skutkujących rozerwaniem komórek (MOLT-4) (Kitada S. Cytocidal actions of parasporin-2,an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis. J Biol Chem. 2006 Sep 8; 281 (36):26350-60). Dodatkowo pod wpływem działania parasporyny-2 dochodzi do zniszczenia struktury mikrotubul, splątania filamentów aktynowych, fragmentacji mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego (Akiba T. Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells, J Mol Biol. 2009 Feb 13; 386(1):121-33).
W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 251-aminokwasowy peptyd przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 55.
Białko fuzyjne po związaniu się z receptorami TRAIL obecnymi na powierzchni komórki nowotworowej wywierać będzie dwojakie działanie. Domena (a), czyli fragment TRAU, będzie wywierać swoje znane działanie agonistyczne - wiązania się z receptorami śmierci na powierzchni komórki i aktywowania zewnętrznego szlaku apoptozy. Peptyd efektorowy białka fuzyjnego, to jest domena (b) o działaniu porotwórczym będzie w stanie potencjalnie wywierać swoje działanie zewnątrzkomórkowo lub wewnątrzkomórkowo równolegle do działania samego TRAIL. W przypadku, gdy sekwencja białka fuzyjnego obejmuje sekwencje cięcia rozpoznawane przez proteazy, peptyd efektorowy może uprze dnio zostać odcięty od fragmentu białka TRAIL przez furynę, urokinazę uPa lub metaloproteinazy MMP naprodukowane w środowisku nowotworu.
W białku fuzyjnym według wynalazku przeciwnowotworowe działanie TRAIL jest wzmożone przez wytworzenie porów w błonie komórkowej lub błonie mitochondrialnej skutkujące zaburzeniem ładunku elektrostatycznego komórki, wyciekiem jonów lub cytoplazmy z jej wnętrza lub destabilizacją potencjału elektrostatycznego mitochondriów i uwolnieniem do cytoplazmy czynników takich jak cytochrom C, SMAC/DIABLO czy czynnik AIF, co w konsekwencji aktywuje apoptozę indukowaną wewnętrznie, synergistyczną z sygnałem pochodzącym od przyłączenia TRAIL do funkcjonalnych receptorów komórkowych serii DR.
Nowe białka fuzyjne wykazują także co najmniej zmniejszoną lub ograniczoną, a nawet zasadniczo wyeliminowaną aktywność hemolityczną charakterystyczną dla pojedynczych naturalnych peptydów cytolitycznych.
W jednym z wykonań wynalazku, domena (a) i domena (b) są połączone ze sobą poprzez domenę (c) zawierającą miejsce cięcia proteazy, obecnej w środowisku komórki, zwłaszcza komórki nowotworowej, przykładowo takiej jak metaloproteaza MMP, urokinazę, czy furyna. Sekwencje rozpoznawane przez protezę mogą być wybrane spośród sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP) lub jej fragmentu, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy sekwencję rozpoznawaną przez metaloproteazę MMP, sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA (Arg Val Val Arg/RVVR) lub jej fragmentu, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy sekwencję rozpoznawaną przez urokinazę oraz ich kombinacji, albo sekwencji rozpoznawanej przez furynę (Arg Gln Pro Arg/RQPR), (Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG), (Arg Lys Lys Arg/RKKR) lub innych atypowych miejsc rozpoznawanych przez furynę ujawnionych przez M. Gordon i współpr. w Inf. and Immun. 1995, 63, Nr. 1, str. 82-87 lub ich fragmentów, które z końcowym aminokwasem sekwencji, do których są dołączone, tworzą sekwencję rozpoznawaną przez furynę.
W jednym z wykonań, miejsce cięcia proteazy może być kombinacją położonych obok siebie sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP i/lub sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA i/lub sekwencji rozpoznawanej przez furynę w dowolnej kolejności.
Korzystnie, w jednym z wykonań, domena (c) jest sekwencją rozpoznawaną przez proteazy nadprodukowane w środowisku nowotworu jest Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ RVVRPLGLAG lub sekwencją Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg/PLGLAGRVVR.
Metaloproteaza MMP, urokinaza i furyna są nadprodukowane w środowisku nowotworów. Obecność sekwencji rozpoznawanej przez proteazę pozwala na odcięcie domeny (a) od domeny (b) białka fuzyjnego wg wynalazku, to jest uwolnienie funkcjonalnej domeny (b), a tym samym przyspieszenie jej aktywacji.
Aktywacja funkcjonalnej domeny (b) może nastąpić także w sposób niespecyficzny poprzez odcięcie domeny (a) od domeny (b) białka fuzyjnego wg wynalazku przez enzymy lizosomalne.
Obecność miejsca cięcia proteazy, pozwalając na szybkie uwolnienie peptydu efektorowego, zwiększa tym samym szanse na dostarczenie peptydu do miejsca jego działania zanim nastąpi przebiegająca w sposób przypadkowy degradacja białka fuzyjnego przez niespecyficzne proteazy.
PL 223 487 B1
Dodatkowo, do domeny peptydu efektorowego (b) białka fuzyjnego według wynalazku może być dołączona domena transportowa (d), wybrana z grupy składającej się z:
(d1) polihistydynowej sekwencji transportującej przez błonę komórkową, zawierającej 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 reszt histydyny (His/H) i (d2) poliargininowej sekwencji transportującej przez błonę komórkową, zawierającej 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 reszt argininy (Arg/R), albo ich fragmentów, które z końcowym aminokwasem sekwencji, do których są dołączone, tworzą sekwencje domen transportujących (d1) lub (d2), oraz ich kombinacji.
Kombinacja domen (d1) i (d2) może obejmować w szczególności kombinacje (d1)/(d2) i (d2)/(d1).
Ponadto, kombinacja domen (d1) i (d2) może obejmować domeny położone obok siebie i połączone z jednym końcem domeny (b) i/lub domeny połączone z rożnymi końcami domeny (b).
Należy rozumieć, że w przypadku kiedy białko fuzyjne posiada zarówno domenę transportową (d) przyłączoną do domeny (b) jak i domenę (c) miejsca cięcia między domenami (a) i (b), to domena (c) jest umiejscowiona w ten sposób, że po rozszczepieniu konstruktu domena transportowa (d) pozostaje dołączona do domeny (b). Innymi słowy, jeśli białko fuzyjne zawiera zarówno domenę transportową (d) jak i domenę miejsca cięcia (c), to domena (d) jest umiejscowiona albo między domeną (b) i domeną (c), albo jest umiejscowiona na końcu domeny (b) przeciwległym do miejsca przyłączenia domeny (d).
Wynalazek obejmuje także wariant, w którym domena (d) byłaby umiejscowiona między dwiema domenami (c), to jest przypadku, kiedy po przecięciu konstruktu domena transportowa nie pozostawałaby przyłączona do domeny TRAIL ani do domeny peptydu efektorowego.
Wynalazek nie obejmuje natomiast takiego wariantu, w którym domena (d) byłaby umiejscowiona między domeną (c) a domeną (a), to jest przypadku, kiedy po przecięciu konstruktu domena transportowa pozostawałaby przyłączona do domeny TRAIL.
W innym wykonaniu pomiędzy domeną (a) i domeną (b) dodatkowo znajduje się domena (e) zawierająca sekwencję odpowiednią do przyłączenia do białka fuzyjnego cząsteczki PEG (linker do pegylacji). Taki linker może stanowić znana sekwencja (Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG) albo jej fragment, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których są dołączone tworzą sekwencję linkera do pegylacji. Linker do pegylacji może być także wybrany spośród Ala Ala Cys Ala Ala (AACAA) Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser (SGGCGGS) i Ser Gly Cys Gly Ser (SGCGS) albo ich fragmentów, które z końcowym aminokwasem z sekwencji, do których są dołączone tworzą sekwencję linkera do pegylacji. Korzystnie sekwencję linkera do pegylacji stanowi sekwencja (Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG).
Poza głównymi elementami funkcjonalnymi białka fuzyjnego i domenami miejsca cięcia, białka fuzyjne według wynalazku mogą zawierać obojętną sekwencję lub sekwencje giętkiego linkera sferycznego. Takie linkery są znane specjalistom, i są opisane w literaturze. Ich włączenie do sekwencji białka fuzyjnego służy ułatwieniu poprawnego fałdowania wytworzonego białka po procesie jego na dprodukcji w komórkach gospodarza. W szczególności giętki linker sferyczny może być linkerem glicynowym, glicynowo-serynowym lub glicynowo-cysteinowo-alaninowym.
W szczególności, linker może stanowić kombinację reszt glicyny i seryny, jak na przykład fragment Gly Gly Gly Gly Ser / GGGGS lub dowolny jej fragment, spełniający zadanie linkera sferycznego, na przykład fragment Gly Gly Gly Ser /GGGS lub Gly Gly Gly/GGG lub Gly Gly Gly Gly /GGGG, GGSGG/Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Ser Gly/GGSG, Gly Ser Gly/GSG lub ich kombinację. W innym wykonaniu linker może stanowić kombinację reszt glicyny, seryn y i alaniny, jak na przykład Ala Ser Gly Gly / ASGG lub dowolny jej fragment, spełniający zadanie linkera sterycznego, na przykład Ala Ser Gly/ASG. Możliwe jest także zastosowanie kombinacji linkerów wyrażonego przykładowo sekwencją Gly Gly Gly Ser Gly / GGGSG lub dowolnego jej fragmentu, spełniającego zadanie linkera sferyc znego, na przykład fragmentu Gly Gly Gly /GGG z innym fragmentem spełniającym zadanie linkera sterycznego. W takim przypadku linker steryczny może być wyrażony przez kombinację reszt glicyny, seryny i alaniny jak przykładowo Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly / GGGSASGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly /GGSGGGSGGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGSGGGGGS lub Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGGGGS. W jeszcze innym wykonaniu linker może stanowić kombinację reszt seryny i histydyny Ser His His Ser/SHHS lub Ser His His Ala Ser/SHHAS. W jeszcze innym wykonaniu linker steryczny mogą stanowić reszty glicyny lub cysteiny, w szczególności jedna lub dwie do czterech reszt glicyny lub cysteiny. W kolejnym wykonaniu linker steryczny może stanowić także frag12
PL 223 487 B1 ment wyżej opisanych linkerów sferycznych, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy sekwencję linkera sterycznego.
W innym wykonaniu linker steryczny może promować powstawanie i stabilizować strukturę trimeru białka fuzyjnego według wynalazku, zwiększając tym samym jego czas półtrwania w krwioobiegu oraz zapobiegając deasocjacji mogącej wpływać na obniżenie aktywności białka po podaniu do krwioobiegu. W takim przypadku linker stanowi kombinacje reszt cysteiny i alaniny, na przykład fragment Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys/CAAACAAC lub Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/CAACAAAC lub jej fragment, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy sekwencję linkera sterycznego stabilizującego strukturę trimeru.
W jeszcze innym wykonaniu linker steryczny stanowi kombinację linkerów promujących powstawanie i stabilizujących strukturę trimeru i linkerów glicynowo-serynowych, w szczególności wybraną spośród Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly/CAACAAACGGG; Gly Ser Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/GSGCAACAAAC lub Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly/CAACAAACGG lub ich fragmentu, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy kombinację sekwencji linkerów sterycznych stabilizujących strukturę trimeru.
Aktywacja funkcjonalnej domeny (b) może nastąpić także w sposób niespecyficzny poprzez odcięcie domeny (a) od domeny (b) białka fuzyjnego według wynalazku wskutek h ydrolizy linkera sterycznego zależnej od pH.
Szczególne wykonania białka fuzyjnego według wynalazku stanowią białka fuzyjne zawierające peptyd działający porotwórczo. wybrany z grupy peptydów przedstawionych przez:
Sekw. Nr 36, Sekw. Nr 37, Sekw. Nr 41, Sekw. Nr 43, Sekw. Nr 44, Sekw. Nr 45, Sekw. Nr 46, Sekw. Nr 47, Sekw. Nr 48, Sekw. Nr 54, Sekw. Nr 55 oraz Sekw. Nr 56.
Szczegółowy opis budowy wyżej wymienionych reprezentatywnych białek fuzyjnych przedstawiono w załączonych przykładach wykonania.
Przez białko fuzyjne zgodnie z wynalazkiem rozumie się pojedynczą cząsteczkę białka, zawierającego dwa lub więcej białek lub ich fragmentów, połączonych kowalencyjnym wiązaniem pe ptydowym w ramach ich własnych łańcuchów peptydowych, bez udziału dodatkowych łączników chemicznych.
Białko fuzyjne może być także alternatywnie określane jako konstrukt białkowy lub białko chimeryczne. Zgodnie z wynalazkiem, określenia konstrukt lub białko chimeryczne, jeśli są stosowane, należy rozumieć jako odnoszące się do białka fuzyjnego zdefiniowanego powyżej.
Dla specjalisty będzie oczywiste, że tak zdefiniowane białko fuzyjne może być zsyntetyzowane znanymi metodami syntezy peptydów i białek na drodze chemicznej.
Białko fuzyjne może być zsyntetyzowane metodami chemicznej syntezy peptydów, zwłaszcza przy użyciu technik syntezy peptydów w fazie stałej przy użyciu odpowiednich żywic jako nośników. Techniki takie są konwencjonalne i znane fachowcom, i opisane między innymi w monografiach, takich jak na przykład Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart ei at., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.
Białko fuzyjne może być zsyntetyzowane metodami chemicznej syntezy peptydów jako jedno białko ciągłe. Alternatywnie, poszczególne fragmenty (domeny) białka mogą być syntetyzowane oddzielnie i następnie łączone ze sobą w jeden ciągły peptyd za pomocą wiązania peptydowego, przez kondensację końca aminowego jednego fragmentu peptydowego z końcem karboksylowym drugiego peptydu. Techniki takie są konwencjonalne i znane.
Do weryfikacji struktury wytworzonego peptydu mogą być użyte znane metody analizy składu aminokwasowego peptydów, takie jak na przykład technika wysokorozdzielczej spektrometrii masowej w celu oznaczenia ciężaru cząsteczkowego peptydu. Do potwierdzenia sekwencji peptydu mogą być także użyte sekwencery białek, które kolejno degradują peptyd i identyfikują kolejność aminokwasów.
Korzystnie jednak, białko fuzyjne według wynalazku jest białkiem rekombinowanym, generowanym metodami genetycznej ekspresji sekwencji polinukleotydowej kodującej to białko fuzyjne w komórkach gospodarza.
W następnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest także sekwencja polinukleotydowa, w szczególności sekwencja DNA, kodująca białko fuzyjne takie jak określono powyżej.
Korzystnie, sekwencją polinukleotydową, w szczególności DNA, według wynalazku, kodującą białko fuzyjne takie jak określono powyżej, jest sekwencja zoptymalizowana do ekspresji w E. coli.
PL 223 487 B1
W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję polinukleotydową, w szczególności sekwencję DNA. według wynalazku określoną powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony tak jak powyżej, przy czym komórka nie jest komórką w ciele człowieka.
Korzystną komórką gospodarza do ekspresji białka fuzyjnego według wynalazku jest komórka
E.coli.
Metody generowania białek rekombinowanych, w tym białek fuzyjnych, są dobrze znane. W skrócie technika ta polega na generowaniu cząsteczki polinukleotydowej, na przykład cząsteczki DNA, kodującej sekwencję aminokwasów docelowego białka i kierującej ekspresją tego docelowego białka w organizmie gospodarza. Następnie kodująca docelowe białko cząsteczka polinukleotydowa jest inkorporowana do odpowiedniego wektora ekspresji, zapewniającego dobrą ekspresję polipeptydu. Rekombinacyjny wektor ekspresji jest następnie wprowadzany do komórek gospodarza, w celu transfekcji/transformacji, w wyniku czego wytwarzana jest transformowana komórka gospodarza. Następnie prowadzi się hodowlę transformowanych komórek w celu nadekspresji białka docelowego, oczyszcza otrzymane białko i ewentualnie odcina przez trawienie sekwencje pomocnicze, wykorzystywane do ekspresji lub oczyszczania białka.
Odpowiednie techniki ekspresji i oczyszczania opisane są na przykład w monografii Goeddel, Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oraz w A. Staroń i współpr., Postępy Mikrobiol., 2008, 47, 2, 83-95.
Jako wektory ekspresji do wprowadzania i powielania sekwencji DNA w komórkach gospodarza mogą być stosowane kosmidy, plazmidy lub modyfikowane wirusy. Typowo jako wektory ekspresji stosuje się plazmidy. Odpowiednie plazmidy są znane specjalistom i dostępne w handlu.
Wektor ekspresyjny według wynalazku zawiera cząsteczkę polinukleotydową kodującą białko fuzyjne według wynalazku oraz konieczne sekwencje regulacyjne do transkrypcji i translacji włączonej sekwencji kodującej w odpowiedniej komórce gospodarza. Dobór sekwencji regulacyjnych jest zależny od rodzaju komórki gospodarza i może być łatwo przeprowadzony przez fachowca w tej dziedzinie. Przykładami takich sekwencji regulacyjnych są: promotor i wzmacniacz transkrypcji lub sekwencja wiążąca polimerazę RNA, sekwencja wiązania rybosomu, zawierająca sygnał inicjacji transkrypcji, wstawione przed sekwencją kodującą, oraz sekwencję terminatora transkrypcji wstawioną za sekwencją kodującą. Ponadto, zależnie od komórki gospodarza i zastosowanego wektora, do wektora ekspresji mogą być włączone inne sekwencje, takie jak początek replikacji, dodatkowe miejsca restrykcyjne DNA, wzmacniacze i sekwencje umożliwiające indukcję transkrypcji.
Wektor ekspresyjny będzie także zawierać sekwencję genu markerowego, nadającej transformowanej komórce określony fenotyp i umożliwiający selekcję komórek transformowanych. Ponadto, wektor może także zawierać drugą sekwencję markerową pozwalającą odróżnić komórki transform owane plazmidem zrekombinowanym, zawierającym sekwencję kodującą białko docelowe, od takich, które pobrały plazmid bez wstawki. Najczęściej, typowo stosuje się markery oporności na antybiotyk, mogą być jednak użyte dowolne inne geny reporterowe znane w tej dziedzinie, których obecność można łatwo oznaczyć w komórce (in vivo) poprzez wykorzystanie technik autoradiograficznych, spektrofotometrycznych lub bio- i chemiluminescencyjnych. Przykładowo, w zależności od rodzaju komórki gospodarza, mogą być użyte geny reporterowe B-galaktozydazy, B-glukoronidazy, lucyferazy, acetolotransferazy chloramfenikolu lub białka zielonej fluorescencji.
Ponadto, wektor ekspresji może zawierać sekwencję sygnalną, transportującą białko do odpowiedniego przedziału komórkowego, np. periplazmy, gdzie ułatwione jest fałdowanie. Może być także obecna sekwencja kodująca etykietkę/znacznik, np. HisTag dołączoną do N-końca lub GST dołączoną do C-końca, która ułatwia późniejsze oczyszczenie wyprodukowanego białka na zasadzie powinowactwa, poprzez chromatografię powinowactwa na kolumnie niklowej. Mogą być także obecne dodatkowe sekwencje chroniące białko przed degradacją proteolityczną w komórkach gospodarza, a także zwiększające jego rozpuszczalność.
Element pomocniczy dołączony do sekwencji docelowego białka może blokować jego aktywność lub być szkodliwy z innego powodu, takiego jak na przykład toksyczność. Taki element musi zostać usunięty, co można przeprowadzić przez odtrawienie enzymatyczne lub chemiczne.
W szczególności, powinien zostać usunięty sześcio-histydynowy znacznik HisTag, dołączony dla umożliwienia oczyszczania białka przez chromatografię powinowactwa, ze względu na jego opisany wpływ na hepatotoksyczność rozpuszczalnego białka TRAIL, lub inny lego typu znacznik.
PL 223 487 B1
Mogą być stosowane systemy ekspresji heterologicznej oparte na różnych znanych komórkach gospodarza, w tym komórkach prokariotycznych: bakteryjnych, takich jak na przykład bakterie Escherichia coli lub Bacillus subtilis, komórkach drożdży, takich jak Saccharomyces cervisiae lub Pichia pastoris oraz liniach komórek eukariotycznych (owadzich, ssaczych, roślinnych).
Korzystnie, ze względu na łatwość hodowli i manipulacji genetycznych oraz dużą ilość powstającego produktu, stosuje się system ekspresji w E.coli. Zgodnie z tym, sekwencja polinukleotydowa zawierająca sekwencję kodującą docelowe białko fuzyjne według wynalazku będzie zoptymalizowana do ekspresji w E. coli, to jest będzie zawierać sekwencję nukleotydową wyselekcjonowaną z możliwych wariantów zgodnie z wiedzą znaną fachowcom. Ponadto, wektor ekspresyjny będzie zawierać dołączone do sekwencji kodującej wyżej opisane elementy odpowiednie dla E. coli.
Zgodnie z tym, w korzystnym wykonaniu, przedmiotem wynalazku jest sekwencja polinukleotydowa, obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne według wynalazku, zoptymalizowana do ekspresji w E. coli, wybraną z grupy sekwencji polinukleotydowych składającej się z:
Sekw. Nr 60; Sekw. Nr 61; Sekw, Nr 62; Sekw. Nr 67; Sekw. Nr 68; Sekw. Nr 69; Sekw. Nr 70; Sekw. Nr 71; Sekw. Nr 72; Sekw. Nr 74; Sekw. Nr 75; Sekw. Nr 76; Sekw. Nr 77; Sekw. Nr 78; Sekw. Nr 79; Sekw. Nr 86; Sekw. Nr 87; oraz Sekw. Nr 88, które kodują białko fuzyjne mające sekwencję aminokwasów odpowiadającą sekwencjom aminokwasowym wybranym z grupy sekwencji aminokwasowych składającej się z, odpowiednio:
Sekw. Nr 4; Sekw. Nr 5; Sekw. Nr 6; Sekw. Nr 11; Sekw. Nr 12; Sekw. Nr 13; Sekw. Nr 14; Sekw. Nr 15; Sekw. Nr 16; Sekw. Nr 18; Sekw. Nr 19; Sekw. Nr 20; Sekw. Nr 21; Sekw. Nr 22; Sekw. Nr 23; Sekw. Nr 30; Sekw. Nr 31; oraz Sekw. Nr 32.
W korzystnym wykonaniu, przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny odpowiedni do transformacji E. coli, zawierający sekwencję polinukleotydową wybraną z grupy sekwencji polinukleotydowych Sekw. Nr 60; Sekw. Nr 61; Sekw. Nr 62; Sekw. Nr 67; Sekw. Nr 68; Sekw. Nr 69; Sekw. Nr 70; Sekw. Nr 71; Sekw. Nr 72; Sekw. Nr 74; Sekw. Nr 75; Sekw. Nr 76; Sekw. Nr 77; Sekw. Nr 78; Sekw. Nr 79; Sekw. Nr 86; Sekw. Nr 87; oraz Sekw. Nr 88 wskazanej powyżej, oraz komórka E. coli transformowana takim wektorem ekspresji.
Transformacja, czyli wprowadzenie sekwencji DNA do komórek gospodarza bakteryjnego, w szczególności E. coli, zwykle przeprowadza się na w komórkach kompetentnych, przygotowanych na przyjęcie DNA na przykład przez potraktowanie jonami wapnia w niskiej temperaturze (4°C), a następnie poddanie szokowi cieplnemu (w temp, 37-42°C), albo przez elektroporację. Techniki takie są znane specjalistom i są zwykle określane przez producenta danego systemu ekspresji.
Procedura nadprodukcji białek fuzyjnych według wynalazku w systemie ekspresji E. coli zostanie bardziej szczegółowo opisana poniżej.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca białko fuzyjne według wynalazku zdefiniowane powyżej jako składnik czynny, oraz odpowiedni dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik oraz ewentualne konwencjonalne składniki pomocnicze.
Kompozycja farmaceutyczna będzie zawierać skuteczną ilość białka fuzyjnego według wynalazku, oraz ewentualne dopuszczalne farmaceutycznie składniki pomocnicze rozpuszczone lub zdyspergowane w nośniku lub rozcieńczalniku i korzystnie będzie mieć postać preparatu farmaceutycznego sformułowanego w jednostkowej postaci dawkowania lub preparatu zawierającego wiele dawek.
Zarówno postaci farmaceutyczne jak i sposoby ich formulacji i stosowane składniki pomocnicze, nośniki i rozcieńczalniki są znane fachowcom i opisane w literaturze. Przykładowo, są one opisane w monografii Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.
Terminy „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik i składnik pomocniczy” obejmują wszelkie rozpuszczalniki, media dyspergujące, surfaktanty, przeciwutleniacze, stabilizatory, konserwanty (np. środki przeciw-bakteryjne, środki przeciwgrzybicze), środki izotonizujące, znane fachowcom.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać różne rodzaje nośników, rozcieńczalników i składników pomocniczych, w zależności od wybranej drogi podawania i wymaganej postaci leku, takiej jak ciekłe, stałe i aerozolowe postacie do podawania doustnego, pozajelitowego, wziewnego, miejscowego, i od tego czy dana postać musi być postacią sterylną do podawania drogą taką jak wstrzyknięcia.
Korzystną drogą podawania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku będzie droga pozajelitowa, w tym przez wstrzyknięcia drogami dożylną, domięśniową, podskórną, dootrzewnową, doguzową, lub poprzez infuzje (wlewy) dożylne jednorazowe i ciągłe.
PL 223 487 B1
W jednym z wykonań, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana przez wstrzyknięcia bezpośrednio do miejsca guza. W innym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana dożylnie. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana podskórnie lub dootrzewnowo.
Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego może stanowić roztwór lub dyspersję w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku wodnym lub niewodnym, w razie potrzeby buforowanym do odpowiedniego pH, oraz izoosmotyczną z płynami fizjologicznymi, które mogą ponadto zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczalne, które nadają kompozycji zgodność z tkankami lub krwią odbiorcy. Inne składniki, które kompozycja może zawierać to na przykład woda; alkohole, takie jak etanol; poliole, takie jak gliceryna, glikol propylenowy, ciekły glikol polietylenowy; lipidy, takie jak triglicerydy, oleje roślinne, liposomy. Właściwą płynność oraz wielkość cząstek substancji mogą zapewniać substancje powlekające, takie jak np. lecytyna, oraz surfaktanty, takie jak np. hydroksypropyloceluloza, polisorbaty, i podobne. Odpowiednie środki izotonizujące do ciekłych kompozycji pozajelitowych stanowią na przykład cukry, jak glukoza, i chlorek sodu, oraz ich kombinacje.
Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna do podawania drogą wstrzyknięć lub wlewów może mieć postać proszku, takiego jak na przykład proszek liofilizowany, do rekonstytucji bezpośrednio przed użyciem w odpowiednim nośniku, takim jak na przykład jałowa woda wolna od pirogenów.
Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego według wynalazku może mieć także postać do podawania donosowego, w tym roztworów, sprejów lub aerozoli. Korzystnie, postać do podawania donosowego będzie stanowić roztwór wodny i będzie izotoniczna lub buforowana tak aby utrzymywać pH od około 5,5 do około 6,5, tak aby utrzymać charakter podobny do wydzielin nosowych. Ponadto, będzie zawierać konserwanty lub stabilizatory, takie jak w znanych preparatach donosowych.
Kompozycja może zawierać różne przeciwutleniacze, opóźniające utlenianie jednego lub więcej składników. Ponadto, w celu zapobiegania działaniu mikroorganizmów, kompozycja może zawierać różne środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, w tym przykładowo i nieograniczająco, parabeny, chlorobutanol, timerozal, kwas sorbowy, i podobne znane substancje tego typu.
Generalnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać na przykład co najmniej około 0,01% wagowych składnika czynnego. Bardziej szczegółowo, kompozycja może zawierać od 1% do 75% wagowych jednostki kompozycji, lub na przykład od 25% do 60% wagowych, bez ograniczenia do wskazanych wartości liczbowych.
Faktyczna ilość dawki kompozycji według wynalazku podawana pacjentowi, w tym człowiekowi, będzie zdeterminowana przez czynniki fizyczne i fizjologiczne, takie jak waga ciała, ciężkość stanu, rodzaj leczonej choroby, wcześniejsze lub jednoczesne interwencje terapeutyczne, stan pacjenta i droga podawania. Odpowiednią dawkę jednostkową i całkowitą oraz także stężenie składnika czynnego w kompozycji będzie w stanie określić lekarz prowadzący.
Kompozycja może być na przykład podawana w dawce od około 1 mikrograma/kg wagi ciała do około 1000 miligramów/kg wagi ciała pacjenta, przykładowo w zakresie od 5 mg/kg wagi ciała do 100 mg/kg wagi ciała lub w zakresie od 5 mg/kg wagi ciała do 500 mg/kg wagi ciała.
Białko fuzyjne i zawierająca je kompozycja wykazują działanie przeciwnowotworowe i mogą znaleźć zastosowanie do leczenia chorób nowotworowych.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku zdefiniowanego powyżej do leczenia chorób nowotworowych u ssaków, w tym ludzi.
Sposób leczenia chorób nowotworowych u ssaków, w tym ludzi, polega podawaniu podmiotowi potrzebującemu takiego leczenia skutecznej przeciwnowotworowo ilości białka fuzyjnego według wynalazku określonego powyżej, ewentualnie w postaci odpowiedniej kompozycji farmaceutycznej.
Białko fuzyjne według wynalazku może znaleźć zastosowanie do leczenia nowotworów hematologicznych, takich jak na przykład białaczki, ziarnica, szpiczaki i inne nowotwory układu krwiotwórczego. Białko fuzyjne może także znaleźć zastosowanie do leczenia nowotworów litych (guzów), takich jak na przykład rak piersi, rak płuc, w tym niedrobnokomórkowy rak płuc, rak okrężnicy, rak trzustki, rak jajnika, rak pęcherza, rak prostaty, rak nerek, rak mózgu, rak wątroby i podobne.
Odpowiednią drogą podawania białka fuzyjnego w leczeniu raka będzie w szczególności droga pozajelitowa, polegająca na podawaniu białka fuzyjnego według wynalazku w postaci wstrzyknięć lub wlewów, w odpowiedniego dla takiej drogi podawania kompozycji i postaci.
PL 223 487 B1
Wynalazek zostanie szczegółowo opisany w poniższych procedurach ogólnych i przykładach szczególnych białek fuzyjnych.
Procedura ogólna nadprodukcji białka fuzyjnego
Uzyskiwanie plazmidu
Sekwencja aminokwasowa docelowego białka fuzyjnego służyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA, zawierającej kodony optymalne dla wyrażania w Escherichia coli. Zabieg taki umożliwia na dalszym etapie zwiększenie wydajności biosyntezy docelowego białka w komórkach Escherichia coli. Otrzymana sekwencja nukleotydowa została następnie automatycznie zsyntetyzowana. Do otrzymanego genu kodującego białko docelowe dodatkowo dołączano miejsca dla enzymów restrykcyjnych Ndel (na końcu 5' nici wiodącej) i Xhol (na końcu 3' nici wiodącej). Posłużyły one do klonowania tego genu do wektora pET28a (Novagen). Mogą one być wykorzystane do klonowania genu kodującego białko również do innych wektorów. Białko docelowe wyrażane z tego konstruktu posiadało na końcu N znacznik polihistydynowy (6 histydyn) poprzedzony miejscem rozp oznawanym przez trombinę, który służył następnie do jego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa. Poprawność uzyskanego konstruktu potwierdzano najpierw przez analizę restrykcyjną wyizolowanych plazmidów za pomocą enzymów Ndel i Xhol, a następnie przez automatyczne sekwencjonowanie całej ramki odczytu białka docelowego. Startery wykorzystane do sekwencjonowania były komplementarne do obecnych w wektorze sekwencji promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') i terminatora T7 (5‘GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3').
Uzyskany plazmid służył do nadprodukcji docelowego białka fuzyjnego w handlowym szczepie E. coli, który transformowano zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskane na podłożu selekcjonującym (LB agar, kanamycyna 50 μ/ml, 1% glukoza) kolonie posłużyły do założenia nocnej kultury w podłożu płynnym LB uzupełnionym kanamycyną (50 μg/ml) i 1% glukozą. Po około 15 h hodowli z wytrząsaniem te kultury nocne posłużyły do zaszczepienia właściwej hodowli.
Nadprodukcja i oczyszczanie białka fuzyjnego - procedura ogólna A
Pożywkę LB z kanamycyną (30 μg/ml) i 100 μΜ siarczanem cynku inokulowano nocną kulturą. Hodowle inkubowano w 37°C aż gęstość optyczna (OD) przy 600 nm wyniosła 0,60-0,80. Następnie dodawano IPTG, tak by uzyskać końcowe stężenie w zakresie 0,25-1 mM. Po inkubacji (3,5-20 h) z wytrząsaniem w 25°C hodowle wirowano przez 25 min przy 6,000 g.
Pelet bakteryjny zawieszano w buforze zawierającym 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,4. Zawiesinę sonikowano na lodzie przez 8 minut (40% amplituda, 15 sekundowy impuls, 10 przerwy). Uzyskany ekstrakt klarowano przez wirowanie 40 minut przy 20000 g w 4C. Przygotowano złoże Ni-Sepharose (GE Healthcare), równoważone buforem, w którym przygotowano ekstrakt z komórek bakteryjnych. Złoże inkubowano z supernatantem po wirowaniu ekstraktu przez noc w 4°C. Następnie upakowano je do kolumny chromatograficznej i przemywano 15-50 objętościami buforu o składzie 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol pH 7,4. Wytworzone białko wymywano z kolumny gradientem imidazolu w buforze 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Uzyskane frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE. Odpowiednie frakcje połączono i dializowano całą noc w 4°C do buforu 50 mM Tris pH 7,2, 150 mM 10 NaCl, 500 mM L-arginina, 0,1 mM ZnSO4, 0,01% Tween 20 i jednocześnie odtrawiano znacznik Histag trombiną (1:50). Po trawieniu trombinę oddzielano od docelowego białka fuzyjnego za pomocą złoża Benzamidine Sepharose™. Czystość preparatu analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE (Maniatis i współpr., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Nadprodukcja i oczyszczanie białka fuzyjnego - procedura ogólna B
Podłoże LB zawierające kanamycynę (30 μg/ml) i 100 μΜ siarczan cynku inokulowano nocną hodowlą. Hodowle inkubowano w 37°C aż gęstość optyczna (OD) przy 600 nm wyniosła 0,6-0,8. Następnie dodawano IPTG, tak by ostateczne stężenie wyniosło 0,5-1 mM. Po 20 godzinie inkubacji z wytrząsaniem w 25°C hodowle wirowano przez 25 min przy 6,000 g.
Komórki po nadprodukcji rozbijano za pomocą prasy French'a w buforze o następującym składzie: 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 10 Mm imidazol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 0,5 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu), pH 7,8. Otrzymany ekstrakt klarowano przez wirowanie 50 min przy 8000 g. Supernatant inkubowano przez noc ze złożem Ni-Chelating Sepharose. Złoże ze związanym białkiem formowano w kolumnie chromatograficznej. W celu wymycia frakcji zawierających białka niewiążące się, kolumnę płukano 15-50 objętościami buforu o następującym składzie 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 10 Mm imidazol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 0,5 mM PMSF, pH 7,8. Następnie, aby wymyć jak największą ilość białek wiążących się niespecyficznie ze złożem, kolumnę przepłukiwano
PL 223 487 B1 buforem zawierającym 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, 10% glicerol, 0,5 mM PMSF pH 7,5. Zebrane frakcje analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE (Maniatis i współpr., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, N,Y., 1982).
Frakcje wykazujące obecność docelowego białka fuzyjnego pulowano i trawiono trombiną (w stosunku 1U na 4 mg białka przez 8 h w 16°C) w celu usunięcia metki polihistydynowej, a następnie dializowano do buforu formulacyjnego (500 mM L-arginina, 50 mM Tris, 2,5 mM ZnSO4, pH 7,4).
Charakteryzowanie białek fuzyjnych za pomocą elektroforezy 2-D
W celu dodatkowego scharakteryzowania otrzymanych białek oraz precyzyjnego dobrania warunków chromatografii wyznaczano dla nich punkty izoelektryczne. Wykorzystano do tego metodę elektroforezy dwuwymiarowej (2D). Przebiegała ona dwuetapowo według następującego schematu.
Etap 1. Izoelektroogniskowanie białek w gradiencie pH w warunkach denaturujących.
Preparaty białek o stężeniach 1-2 mg/ml byty wytrącane przez zmieszanie ich w stosunku 1:1 z roztworem do precypitacji zawierającym 10% kwas trichlorooctowy i 0,07% beta-merkaptoetanol w acetonie. Mieszaninę inkubowano 30 min w temperaturze -20°C, a następnie wirowano przy 15000 g w 4°C przez 25 min. Supernatant usuwano, a pelet płukano dwukrotnie zimnym acetonem z 0,07% beta-merkaptoetanolem. Następnie odparowywano pozostałości acetonu aż do braku wyczuwalnego zapachu. Pelet białkowy zawieszano w 250 pl buforu do rehydratacji o następującym składzie: 8 M mocznik, 1% CHAPS, 15 mM DTT, 0,5% amfolit (GE Healthcare) o profilu pH 3-11 lub 6-11 w zależności od użytego następnie paska. Roztwór białka umieszczano w ceramicznej komorze do izoelektroogniskowania, w której następnie umieszczano 13 cm pasek DryStrip (GE Healthcare) o odpowiednim profilu pH (3-11 lub 6-11). Całość pokrywano warstwą oleju mineralnego. Komory umieszczano w aparacie Ettan IPGphor III, w którym przeprowadzono izoelektroogniskowanie wg następującego programu przypisanego do wymiarów paska i profilu pH:
h dehydratacji w 20°C.
Ogniskowanie w polu elektrycznym w ustalonym gradiencie pH:
Czas Napięcie
1 h 500 V
1 h gradient 500-1000 V
2 h 30 min gradient 1000-8000 V
30 min 8000 V
Następnie pasek zawierający zogniskowane białko płukano przez 1 min w dejonizowanej wodzie, po czym zabarwiano go barwnikiem Coomassie Brillant i następnie odbarwiano i archiwizowano jego obraz aby oznaczyć położenie białek. Odbarwiony pasek równoważono 2 x 15 min buforem o następującym składzie: 50 mM Tris-HCl pH 8,8, 6 M mocznik, 1%, DTT, 2% SDS, 30% glicerol,
Etap 2. Rozdział w drugim kierunku za pomocą SDS-PAGE.
Pasek umieszczano nad 12,5% żelem poliakrylamidowym zawierającym pojedynczą studnię na standard wielkości, a następnie przeprowadzono rozdział w aparacie do SDS-PAGE, przy napięciu 200 V przez 3 h. Żel barwiono następnie barwnikiem Coomassie Brillant i archiwizowano wraz z przyłożoną skalą. Białko identyfikowano przez wyznaczenie jego masy na podstawie standardu wielkości, a jego PI odczytywano w przypadku skali 6-11 na podstawie dostarczonych przez producenta (GE Healthcare) krzywych (pH do% długości paska od końca oznaczonego jako anoda) lub w przypadku skali 3-11 na podstawie krzywej wyznaczonej eksperymentalnie za pomocą zestawu do kalibracji izoelektroogniskowania (GE Healthcare).
P r z y k ł a d y
Poniżej w Przykładach przedstawiono reprezentatywne przykłady białek fuzyjnych według wynalazku.
W przykładach sekwencje aminokwasowe białek fuzyjnych przedstawiane są w kolejności od N-końca do C-końca białka.
Zastosowano następujące oznaczenia składowych sekwencji aminokwasowych, przy czym obok oznaczenia w konwencji trzyliterowej podano odpowiadające oznaczenie w konwencji jednoliterowej.
LINKER1: sekwencja linkera sterycznego (Gly Gly /GG)
LINKER2: sekwencja linkera sterycznego (Gly Gly Gly / GGG)
PL 223 487 B1
LINKER3: sekwencja linkera sterycznego (Gly Ser Gly /GSG)
LINKER6: sekwencja linkera sterycznego (Gly Gly Ser Gly Gly/GGSGG)
LINKER8: sekwencja linkera sterycznego (Gly Gly Gly Gly Ser Gly /GGGGSG)
LINKER10: sekwencja linkera sterycznego (Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly/GGGGSGGGG)
UMKER11; sekwencja linkera sterycznego (Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/GSGGGSGGG)
LINKER12: sekwencja linkera sterycznego (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/CAACAAAC)
LINKER 14: linker steryczny Cys/C
LINKER 15: linker steryczny Gly/G
UROKIN: sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (Arg Val Val Arg / RVVR)
MMP: sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (Pro Leu Gly Leu Ala Gly/PLGLAG)
PEG2: sekwencja linkera do pegylacji (Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG)
TRANS1: sekwencja transportująca (His His His His His His /HHHHHH)
TRANS2: sekwencja transportująca (Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRR)
TRANS3: sekwencja transportująca (Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR)
P r z y k ł a d 4. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 4
Białko o Sekw. Nr 4 jest to białko fuzyjne o długości 227 aminokwasów i masie 25,7 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 56-aminokwasowa pilosutina-1 (Sekw. Nr 36), dołączony od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domenę (b) i domenę (a) włączone są kolejno sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) oraz sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(Sekw. Nr 36)-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 4 i Sekw. Nr 60, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 4 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 60. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz pro wadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 5. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 5
Białko o Sekw. Nr 5 jest to białko fuzyjne o długości 264 aminokwasów i masie 29,5 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL95-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 56-aminokwasowa pilosulina-1 (Sekw. Nr 36), dołączona od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (CAACAAC), sekwencja linkera sterycznego (GGG). sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) oraz sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL95-231)-LINKER12-LINKER2-MMP-UROKIN-(Sekw. Nr 36)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 5 i Sekw. Nr 61 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 5 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 61. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 6. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 6
Białko o Sekw. Nr 6 jest to białko fuzyjne o długości 299 aminokwasów i masie 33,2 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL95-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi
90-aminokwasowy peptyd pilosulina 5 (Sekw. Nr 37), dołączony od strony C-końca domeny (a).
PL 223 487 B1
Dodatkowo, pomiędzy domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GSG), sekwencja linkera sterycznego (CAACAAAC), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG), sekwencję miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i linker steryczny (G).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL95-281)-LINKER3-LINKER12-MMP-UROKIN-LINKER15-(Sekw. Nr 37)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 6 i Sekw. Nr 62 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 6 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 62. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 11. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 11
Białko o Sekw. Nr 11 jest to białko fuzyjne o długości 202 aminokwasów i masie 23 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego syntetyczny 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41) dołączona od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGGGSGGGG), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i 8-argininowa sekwencja transportowa (RRRRRRRR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL121-281)-LINKER10-UROKlN-MMP-TRANS3-(Sekw. Nr 41)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 11 i Sekw. Nr 67 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 11 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 67. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 12. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 12
Białko o Sekw. Nr 12 jest to białko fuzyjne o długości 205 aminokwasów i masie 23,2 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi syntetyczny 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41), dołączony od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GG), sekwencja linkera do pegylacji (ASGCGPEG), sekwencja linkera sterycznego (GGG), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i 7-argininowa sekwencja transportowa (RRRRRRR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 121-281)-LINKER1-PEG2-LINKER2-MMP-UROKIN-TRANS2-(Sekw. Nr 41)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 12 i Sekw. Nr 68 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 12 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 68. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 13. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 13
Białko o Sekw. Nr 13 jest to białko fuzyjne o długości 228 aminokwasów i masie 25,9 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 95-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41), dołączony od strony C-końca domeny (a).
PL 223 487 B1
Dodatkowo, pomiędzy domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGGGSGGGG), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i 8-argininowa sekwencja transportowa (RRRRRRRR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 95-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(Sekw. Nr 41)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 13 i Sekw. Nr 69 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 13 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 69. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 14. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 14
Białko o Sekw. Nr 14 jest to białko fuzyjne o długości 192 aminokwasów i masie 22,1 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi syntetyczny 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41), dołączony od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, między domenę (b) i domenę (a) włączone są kolejno linker steryczny (C), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG). Do N-końca peptydu efektorowego dołączono histydynową domenę transportową (HHHHHH)
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
TRANS1 (Sekw. Nr 41)-LINKER14-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 14 i Sekw. Nr 70 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 14 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 70. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 15. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 15
Białko o Sekw. Nr 15 jest to białko fuzyjne o długości 200 aminokwasów i masie 23,3 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41), dołączona od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (b) i domeną (a) włączone są kolejno linker steryczny (C), 8-argininowa sekwencja transportująca (RRRRRRRR), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG). Do N-końca peptydu efektorowego dołączono histydynową sekwencję transportującą (HHHHHH).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
TRANS1-(Sekw. Nr 41)-LINKER14-TRANS3-UR0KIN-MMP-(TRAIL 121-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 15 i Sekw. Nr 71 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 15 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 71. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 16. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 16
Białko o Sekw. Nr 16 jest to białko fuzyjne o długości 202 aminokwasów i masie 23,1 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego staPL 223 487 B1 nowi syntetyczny 14-aminokwasowy peptyd lityczny (Sekw. Nr 41), dołączony od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (a) i domeną (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGGGSGGGG), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i 8-arginimowa sekwencja transportująca (RRRRRRRR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN TRANS3-(Sekw. Nr 41)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 16 i Sekw. Nr 72 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 16 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 72. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując E. coli Tuner (DES) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 18. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 18
Białko o Sekw. Nr 18 jest to białko fuzyjne o długości 203 aminokwasów i masie 23,6 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 116-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 27-aminokwasowy peptyd hCAP-18/LL-37 (Sekw. Nr 43), dołączony od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo pomiędzy domeną (b) i domeną (a) włączone są kolejno sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(Sekw. Nr 43)-UROKIN-MMP-(TRAIL 116-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 18 i Sekw. Nr 74 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 18 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 74. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 19. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 19
Białko o Sekw. Nr 19 jest to białko fuzyjne o długości 203 aminokwasów i masie 23,3 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 116-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 27-aminokwasowy peptyd BAMP-28 (Sekw. Nr 44), dołączony od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (b) i domeną (a) włączone są kolejno sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(Sekw. Nr 44)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 19 i Sekw. Nr 75 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 19 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 75. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 20. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 20
Białko o Sekw. Nr 20 jest to białko fuzyjne o długości 200 aminokwasów i masie 22,8 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 24-aminokwasowy analog izoformy C peptydu litycznego z Entamoeba histolytica (Sekw. Nr 45), dołączony od strony C-końca domeny (a).
PL 223 487 B1
Dodatkowo, pomiędzy domeną (a) i domeną (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGSGG), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 121-281)-LINKER6-MMP-UROKlN-(Sekw. Nr 45)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 20 i Sekw. Nr 76 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 20 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 76. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 21. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 20
Białko o Sekw. Nr 20 jest to białko fuzyjne o długości 200 aminokwasów i masie 22,8 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121 -281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 24-aminokwasowy analog izoformy A peptydu litycznego z Entamoeba histolytica (Sekw. Nr 46), dołączony od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (a) i domeną (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGSGG), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 121-281)-LINKER6-MMP-UROKlN-(Sekw. Nr 46)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 21 i Sekw. Nr 77 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 21 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 77. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 22. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 22
Białko o Sekw. Nr 22 jest to białko fuzyjne o długości 200 aminokwasów i masie 22,8 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 24-aminokwasowy analog izoformy B peptydu litycznego z Entamoeba histolytica (Sekw. Nr 47), dołączony od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (a) i domeną (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGSGG), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(Sekw. Nr 47)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 22 i Sekw. Nr 78 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 22 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 78. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DES) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 23. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 23
Białko o Sekw. Nr 23 jest to białko fuzyjne o długości 190 aminokwasów i masie 22,1 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego staPL 223 487 B1 nowi 12-aminokwasowy fragment domeny HA2 hemaglutyniny wirusa grypy (Sekw. Nr 48), dołączony od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, pomiędzy domeną (a) i domeną (b) włączone są kolejno 7-argininowa sekwencja transportująca (RRRRRRR), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(Sekw. Nr 48)-TRANS2-UROKIN-MMP-(TRAIL121-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 23 i Sekw. Nr 79 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 23 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 79. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B opisaną w przykładzie 1, stosując szczep E. coli BL21 (DE3) lub Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 30. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 30
Białko o Sekw. Nr 30 jest to białko fuzyjne o długości 200 aminokwasów i masie 22,5 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 33-aminokwasowy aktywny fragment ludzkiej perforyny (Sekw. Nr 54), dołączone od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, między domenę (a) i domenę (b) włączona jest sekwencja linkera sterycznego (GGGGSG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL 121-281)-LINKER8-(Sekw. Nr 54)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą k odony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 30 i Sekw. Nr 86 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 30 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 86. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E. coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 31. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 31
Białko o Sekw. Nr 31 jest to białko fuzyjne o długości 210 aminokwasów i masie 23,5 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 121-281, a domenę (b) peptydu efektorowego stanowi 33-aminokwasowy aktywny fragment ludzkiej perforyny (Sekw. Nr 54), dołączone od strony C-końca domeny (a).
Dodatkowo, między domenę (a) i domenę (b) włączone są kolejno sekwencja linkera sterycznego (GGGGSG), sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR) i), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(TRAIL121-281)-LINKER8-UROKIN-MMP-(Sekw. Nr 54)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 31 i Sekw. Nr 87 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 31 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 87. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B opisaną w przykładzie 1. stosując szczep E. coli BL21 (DE3) lub Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 32. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 32
Białko o Sekw. Nr 32 jest to białko fuzyjne o długości 436 aminokwasów i masie 48 kDa, w którym domenę (a) stanowi sekwencja TRAIL 116-281, a domenę (b) peptydu efektorowego sta24
PL 223 487 B1 nowi 251-aminokwasowa parasporyna-2 z Bacillus thuringensis (Sekw. Nr 55), dołączona od strony N-końca domeny (a).
Dodatkowo, między domenę (b) i domenę (a) włączone są kolejno sekwencja miejsca cięcia przez urokinazę (RVVR), sekwencja miejsca cięcia przez metaloproteazę (PLGLAG) i sekwencja linkera sterycznego (GSGGGSGGG).
Zatem, budowa białka fuzyjnego według wynalazku jest następująca:
(Sekw. Nr 55)-UROKIN-MMP-LINKER11-(TRAIL116-281)
Sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E. coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 32 i Sekw. Nr 88 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.
Sekwencja aminokwasowa Nr 32 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją s ekwencji DNA Nr 88. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B opisaną w przykładzie 1, stosując szczep E. coli BL21 (DE3) lub Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.
P r z y k ł a d 34. Badanie czynności przeciwnowotworowej białek fuzyjnych
Badanie czynności przeciwnowotworowej białek fuzyjnych przeprowadzano in vitro w teście cytotoksyczności na liniach komórek nowotworowych oraz in vivo na myszach. Do celów porównawczych użyto placebo oraz białka rhTRAIL114-281.
1. Pomiar dichroizmu kołowego: oznaczenie składu struktur drugorzędowych otrzymanych białek
Aby potwierdzić jakość otrzymanych preparatów białkowych na poziomie ich struktury, wykonano pomiary widm dichroizmu kołowego CD dla preparatów białkowych z Prz. 23, Prz. 11 i Prz. 13.
Dializa
Próbki białek przeznaczone do analizy widma dichroizmu kołowego przeformułowano do buforu o następującym składzie: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerol, 0,1 mM ZnCl2, 80 mM sacharoza, 5 mM DTT. Były one dializowane w workach dializacyjnych (Sigma-Aldrich) o odcięciu równym 12 kDa. Dializę prowadzono wobec 100 krotnego nadmiaru (v/v) buforu względem preparatów białek, przez kilkanaście godzin w temp. 4°C z ciągłym mieszaniem. Każdy preparat po dializie wirowano (25 000 obr/min, 10 min., 4°C), a nadsącze przenoszono do czystych probówek typu eppendorf. Dla tak uzyskanych próbek oznaczano stężenia białek metodą Bradford, dla każdej wykonując trzykrotne powtórzenie.
Oznaczanie stężenia białek metodą Bradford
W oznaczeniach stężenia białek stosowano odczynnik wykonany przez rozpuszczenie 17,5 mg Coomassie G-250 w mieszaninie alkoholu etylowego (4,8% v/v), kwasu fosforowego (V) (5,95% v/v) i wody. Podczas oznaczania stężenia białka dodawano 1-10 pl próbki do 800 pl odczynnika Bradford. Referencją była próbka zawierająca odczynnik Bradford i odpowiednią objętość buforu, w którym rozpuszczone było oznaczane białko. Absorbancję odczytywano na spektrofotometrze Cary 300 dla światła o długości 595 nm po co najmniej 5 minutowej inkubacji próbki w temperaturze pokojowej. Stężenie białka obliczano na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej dla BSA w zakresie 10 stężeń od 1-10 pg/ml. Wyjściowe stężenie białka uzyskiwano po uwzględnieniu rozcieńczenia podczas sporządzania próbki pomiarowej.
Pomiar dichroizmu kołowego
Pomiar wykonano na spektropolarymetrze Jasco J-710, dla białek o zakresie stężeń 0,1-2,7 mg/ml w kuwecie kwarcowej o drodze optycznej 0,2 mm lub 1 mm. Podczas pomiaru stosowano przepływ azotu 7 l/min, co umożliwiło wykonanie pomiaru w zakresie długości fali od 195 do 250 nm. Parametry pomiaru to: rozdzielczość widma - 1 nm: szerokość połówkowa wiązki światła 1 nm; czułość 20 mdeg; czas uśredniania dla jednej długości fali - 8 s; szybkość skanowania 10 nm/min; uśrednianie 3 pomiarów. Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią 3 pomiarów.
Wyliczenie składowych struktury drugorzędowej
Uzyskane widma poddano analizie numerycznej z użyciem pakietu programów CDPro. Analizowano widma w zakresie 193-250 nm. Punkty, dla których napięcie na fotopowielaczu przekraczało 700 V, pominięto ze względu na zbyt niski stosunek sygnału do szumu w tym zakresie długości fali. Otrzymane dane posłużyły do obliczenia udziału poszczególnych struktur drugorzędowych w analizowanych białkach oraz znormalizowanej średniej kwadratowej odchylenia wyznaczającej jakość otrzymanych wyników przedstawionych w Tabeli 1.
PL 223 487 B1
T a b e l a 1. Zawartość procentowa struktur drugorzędowych w badanych białkach.
Białko NRMSD (Exp-Cal) a-helisa β-kartka Zwrot Nieuporządkowanie
Prz. 23 0,149 3,7% 42,0% 21,1% 33,2%
Prz. 11 0,079 25,1% 22,7% 21,2% 30,9%
Prz. 13 0,047 15,0% 32,2% 20,6% 32,2%
hTRAIL* 1,94% 50,97% 7,74% 39,35%
hTRAIL 0,389 4,9% 33,7% 23,1% 38,3%
* wartość uzyskana na podstawie struktury krystalicznej 1D4V ** wartości uzyskane na podstawie struktur krystalicznych 11KQ, 1R4Q, 1ABR, 3PX8
Kontrola, czyli cząsteczka rhTRAIL114-281, wykazywała widmo CD charakterystyczne dla białek o przewadze struktur typu β-kartka (wyraźne minimum eliptyczności właściwej przy długości fali 220 nm). Potwierdza to wyliczenie składowych struktury drugorzędowej, które sugeruje marginalną ilość elementów typu α-helisa. Otrzymany wynik jest również zgodny z danymi pochodzącymi ze struktury krystalicznej białka hTRAIL oraz charakterystyczny dla Prz. 23, gdzie elementy beta stanowią udział 42%. W przypadku białek z Prz. 11 i Prz. 13 obserwuje się wyższy składowy udział struktur alfa (dodatkowe minimum widma w okolicach 208 nm). Jest to spowodowane obecnością w tych konstruktach motywów KLAKLAK, które mają silny charakter amfipatyczny i tworzą struktury alfahelikalne. Niestety, z powodu zbyt niskiej stabilności białek z Prz. 23 i Prz. 11 i Prz. 13 w buforze do pomiaru CD i niskiego stężenia analizowanych preparatów ich widma charakteryzują się wysokim poziomem szumów i niską rozdzielczością. Dlatego mogą one nie do końca odzwierciedlać rzeczywistej sytuacji, a jedynie sugerować wynik.
2. Testy na liniach komórkowych in vitro
Linie komórkowe
Linie komórkowe pozyskano z ATCC oraz CLS, a następnie namnożono i zdeponowano w Banku linii Komórkowych Laboratorium Biologicznego ADAMED. W trakcie trwania eksperymentu czystość mikrobiologiczna linii komórkowych badano zestawem Venor Gem. Hodowle prowadzono w standardowych warunkach: 37°C, 5% CO2 (dla hodowli w DMEM - 10% CO2), 95% wilgotności. Poszczególne linie komórkowe hodowano w charakterystycznych dla nich pożywkach, zgodnie z zaleceniami ATTC.
T a b e l a 2. Komórki adherentce
Nazwa Rodzaj nowotworu Pożywka Ilość na dołek w tyś.
1 2 3 4
Colo 205 ATCC #CCL-222 ludzki nowotwór jelita gru-bego RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna, opcjonalnie 1:1 z Opti-MEM 5
HT-29 ATCC #CCL-2 ludzki nowotwór jelita grubego McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 5
DU-145 ATCC #HTB-81 ludzki nowotwór prostaty RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3
PC-3 ATCC #CRL-1435 ludzki nowotwór prostaty RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4
MDA-MB-231 ATCC #HTBL-26 ludzki nowotwór piersi DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4,5
UM-UC-3 ATCC #CLR-1749 ludzki nowotwór pęcherza moczowego MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3,5
SW780 ATCC #CRL-2169 ludzki nowotwór pęcherza moczowego DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3
SW620 ATCC #CCL-227 ludzki nowotwór jelita grubego DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 5
PL 223 487 B1 cd. tabeli 2
1 2 3 4
BxPC-3 ATCC #CRL-1687 ludzki nowotwór trzustki RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4,5
NIH: OVCAR-3 ATCC #HTB-161 ludzki nowotwór jajnika RPMI + 20% FBS + 0,01 mg/ml insulina + penicylina + streptomycyna 7
HepG2 ATCC # HB-8065 ludzki nowotwór wątroby MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 7
293 ATCC #CLR-1573 ludzkie embrionalne komórki nerek MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4
ACHN ATCC #CCL-222 ludzki nowotwór nerek MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4
CAKI 2 ATCC #HTB-47 ludzki nowotwór nerek McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3,5
HT144 ATCC #HTB-63 ludzki złośliwy nowotwór skóry McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 7
NCI-H460 ATCC #HTB-177 ludzki nowotwór płuc MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 2,5
A549 ATCC #CCL-185 ludzki nowotwór płuc RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 2,5
MES-SA ATCC #CRL-1976 ludzki nowotwór macicy McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3,5
MES-SA/Dx5 ATCC #CRL-1977 ludzki nowotwór macicy McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4
SK-MES-1 ATCC #HTB-58 ludzki nowotwór płuc MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 5
HCT-116 ATCC #CCL-247 ludzki nowotwór jelita grubego McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 3
MCF10A ATCC #CRL-10317 ludzkie komórki piersi DMEM:F12 + 5% końskiej surowicy + 0,5 pg/ml hydrokortyzonu + 10 pg/ml insuliny + 20 ng/ml czynnika wzrostu EGF 5
PANC-1 CLS 330228 ludzki nowotwór trzustki DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 5
PLC/PRF/5 CLS 330315 ludzki nowotwór wątroby DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 5
LNCaP ATCC #CRL-1740 ludzki nowotwór prostaty RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 4,5
T a b e l a 3. Komórki nieadherentne:
Nazwa Rodzaj nowotworu Pożywka Ilość na dołek w tyś.
Jurkat A3 ATCC #CRL-2570 ludzka białaczka RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna 10
Test cytotoksyczności MTT
Test MIT jest testem kolorymetrycznym stosowanym do pomiaru proliferacji, żywotności oraz cytotoksyczności komórek. Polega on na rozkładzie żółtej soli tetrazolowej MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu) do nierozpuszczalnego w wodzie purpurowego barwnika formazanu przez obecną w mitochondriach reduktazę bursztynylo-tetrazolową. Redukcja MTT zachodzi jedynie w żywych komórkach. Analiza danych polega na wyznaczeniu stężenia badanego białka IC50 (w ng/ml), przy którym następuje 50% obniżenie ilości komórek w populacji traktowanej związkiem w odniesieniu do komórek kontrolnych. Test wykonano zgodnie z opisami literaturowymi (Celis, J.E.,
PL 223 487 B1 (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, L.W., Tsai, J-H., (2004), Involvment of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34(4)176-183). Wyniki analizowano za pomocą programu GraphPad Prism 5.0.
Hodowlę komórkową rozcieńczono pożywką do określonej gęstości (10-10 komórek na 100 ąl). Następnie 100 ąl odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny komórkowej naniesiono na płytkę 96-dołkową w trzech powtórzeniach. Tak przygotowane komórki inkubowano przez 24 h w 37°C w 5% lub 10% CO2 w zależności od użytej pożywki, po czym do komórek (w 100 ąl pożywki) dodano kolejne 100 ąl pożywki zawierającej różne stężenia testowanego białka. Komórki inkubowano z testowanymi białkami przez kolejne 72 h, co odpowiada 3-4 czasom podziału komórkowego, po czym do pożywki z testowymi białkami dodawano 20 ąl roztworu roboczego MTT (5 mg/ml) i inkubowano przez 3 h w 37°C w 5% CO. Następnie pożywkę z roztworem MTT usunięto, a kryształy formazanu rozpuszczono, dodając 100 ąl DMSO. Po wymieszaniu mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (filtr referencyjny 690 nm).
Test cytotoksyczności EZ4U
Do badania działania cytotoksycznego białek na komórki linii nieadherentnych zastosowano test EZ4U (Biomedica). Test ten jest modyfikacją metody MTT, wykorzystującą fakt, że powstały w wyniku redukcji soli tetrazolowej formazan jest rozpuszczalny w wodzie. Badanie żywotności komórek przeprowadzono po ich ciągłej 72-godzinnej inkubacji z białkiem (siedem stężeń białka, każde w tryplikatach). Komórkom kontrolnym podawano sam rozpuszczalnik. Na tej podstawie wyznaczono wartość IC50 (jako średnią z dwóch niezależnych eksperymentów).
Wyniki testów cytotoksyczności in vitro dla wybranych białek fuzyjnych według wynalazku wobec panelu komórek nowotworowych pochodzących z różnych organów, odpowiadającego szerokiemu spektrum najczęściej występujących nowotworów przedstawiono w Tabeli 4 jako wartości IC50 (ng/ml), co odpowiada wartości stężenia białka, przy którym obserwuje się efekt cytotoksyczny białek fuzyjnych na poziomie 50% w stosunku do komórek kontrolnych.
Uzyskane wartości IC50 potwierdzają wysoką aktywność cytotoksyczną białek fuzyjnych i tym samym ich potencjalną użyteczność w leczeniu chorób nowotworowych. Każdy eksperyment przedstawia średnią wartość z przynajmniej dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w tryplikatach. Jako kryterium nieaktywności preparatów białkowych przyjęto wartość stężenia IC50 na poziomie 2000 ng/ml. Białka fuzyjne, które miały wartość IC50 powyżej 2000, uznawano za nieaktywne.
Komórki do tego testu zostały tak dobrane, aby obejmowały linie komórek nowotworowych naturalnie oporne na białko TRAIL (przyjęte kryterium naturalnej oporności na TRAIL: IC50 dla białka TRAIL >2000), linie komórek nowotworowych wrażliwe na białko TRAIL oraz oporną na doksorubicynę linię MES-SA/Dx5 jako linię nowotworową oporną na klasyczne leki przeciwnowotworowe.
Uzyskane wyniki potwierdzają możliwość przełamania oporności linii komórkowych na TRAIL przez podawanie niektórych białek fuzyjnych według wynalazku do komórek naturalnie opornych na TRAIL. Przy podawaniu białek fuzyjnych według wynalazku do komórek wrażliwych na TRAIL uzysk iwano w niektórych przypadkach wyraźnie obserwowalne, znaczne spotęgowanie siły działania TRAIL, wyrażające się zmniejszeniem wartości IC50 białka fuzyjnego w porównaniu z IC50 dla samego TRAIL. Ponadto, uzyskano działanie cytotoksyczne białka fuzyjnego według wynalazku na komórki oporne na klasyczny lek przeciwnowotworowy doksorubicynę, które w niektórych przypadkach było silniejsze od działania TRAIL.
Wartości IC50 powyżej 2000 dla linii komórek nienowotworowych pokazują brak efektu toksycznego związanego ze stosowaniem białek według wynalazku dla komórek zdrowych, co świadczy o potencjalnie niskiej toksyczności ogólnoustrojowej białka.
Analiza aktywności cytotoksyczne j wybranych preparatów białkowych wobec panelu linii nowotworowych
W Tabeli 4 zaprezentowano wyniki badania aktywności cytotoksycznej in vitro dla wybranych białek fuzyjnych według wynalazku na szerokim panelu komórek nowotworowych pochodzących z różnych organów, odpowiadających szerokiemu spektrum najczęściej występujących nowotworów. Uzyskane wartości IC50 potwierdzają wysoką aktywność cytotoksyczną białek fuzyjnych i tym samym ich potencjalną użyteczność w leczeniu chorób nowotworowych.
PL 223 487 B1
T a b e l a 4. Aktywność cytotoksyczna białek fuzyjnych według wynalazku
Białko Inkubacja ciągła preparatów białkowych z komórkami przez 72 h (test MTT, ng/ml)
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1
IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD
rhTRAIL95- -281 >10000 7557,5 3454,22 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Prz. 11 115,5 60,1 6,81 4,13 103,02 18,07 7,3 1,67 1,46 0,46 1,93 0,37
Prz. 13 909,35 169,21 112 750,5 156,27 110,85 9,69 29,04 0,65
Prz. 6 915,2 205,8 995,7 126,1
Prz. 23 1054,7 406,3 1054,7 406,3 245,45 25,67 48,06 1,75 22,1 0,18
NCI-H460
rhTRAIL95- -281 5889 111
Prz. 6 96,85
T a b e l a 4a. Aktywność cytotoksyczna białek fuzyjnych według wynalazku
Białko Inkubacja ciągła preparatów białkowych z komórkami przez 72 h (test MTT, ng/ml)
COLO 205 DU 145 MDA-MB-231 PC 3 SW 620 SW 780
IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD
rhTRAIL95- -281
Prz. 11 0,42 0,57 4,74 0,104 12,54 0,74 948 42,43 735,25 45,89 0,79 0,41
UM-UC-3 HT 29 293 ACHN CAKI 2 BxPC3
TRAIL95- -281 2242 1367 >10000 >10000 >10000 >10000 64,71 31,81
Prz. 11 0,64 0,04 4185,5 980,76 1152 77,78 4,86 1,06 25,42 3,22 0,43 0,114
HepG2 HT 144 NCI-H460 LNCaP OV-CAR-3 JURKAT A3
rhTRAIL95- -281 >10000 1730 218,5 5889 111 2052 466 963,00 144,25 >10000
Prz. 11 5,63 0,45 0,26 0,065 1,8 0,34 408,15 11,8 0,114 0,07 0,29 0,24
PLC/PRF/5 PAN-1 NCI-H460
rhTRAIL95- -281 >90000 >10000 5889 111
Prz. 11 436,8 142,25 56,78
3. Efektywność przeciwnowotworowa białek fuzyjnych in vivo na ksenoprzeszczepach
Aktywność przeciwnowotworowa preparatów białkowych badano na mysim modelu ludzkich nowotworów płuc A549 oraz NCI-H460-Luc2, ludzkiego raka prostaty PC-3, ludzkiego nowotworu jelita grubego HCT116, SW620 i Colo205, ludzkiego nowotworu trzustki PANC-1 oraz ludzkiego nowotworu mięsaka macicy z opornością wielolekową MES-SA/Dx5.
Komórki
Komórki ludzkiego nowotworu płuc A549 utrzymywano w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan,
UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki obklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
PL 223 487 B1
Komórki ludzkiego nowotworu płuc NCI-H460-Luc2 utrzymywano w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Komórki ludzkiego nowotworu prostaty PC3 utrzymywano w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie komórek trypsyną (Invitrogen), następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium),
Komórki ludzkiego nowotworu trzustki PANC-1 utrzymywano w pożywce DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Komórki ludzkiego nowotworu jelita grubego HCT116 utrzymywano w pożywce McCoy's (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Komórki ludzkiego nowotworu jelita grubego SW620 utrzymywano w pożywce DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Komórki ludzkiego nowotworu jelita grubego Colo205 utrzymywano w pożywce RPMI (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Komórki ludzkiego nowotworu mięsaka macicy z opornością wielolekową MES-SA/Dx5 utrzymywano w pożywce McCoy's (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).
Myszy
Badanie aktywności przeciwnowotworowej białek prowadzono na 4-6 tygodniowych (model nowotworu płuc) lub 9-10 tygodniowych (model nowotworu prostaty) myszach typu Cby.Cg-foxn1(nu)/J) otrzymanych z Centrum Medycyny Doświadczalnej w Białymstoku, oraz 4-5 tygodniowych samicach myszy szczepu Crl:SHO-PrkdcscidHrhr otrzymanych z hodowli Charles River Germany. Myszy utrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, z wolnym dostępem do karmy oraz demineralizowanej wody (ad libitum). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach prowadzono zgodnie z wytycznymi: „Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education” wydanym przez New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research, oraz zostały zaakceptowane przez IV Lokalną Komisję Etyczną do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Warszawie (Nr 71 /2009).
Przebieg i ocena eksperymentu
Wielkość guza mierzono przy pomocy suwmiarki elektronicznej, objętość guza liczono według wzoru: (a x b)/2, gdzie a = krótsza przekątna guza (mm) oraz b = dłuższa przekątna guza (mm). Zahamowanie wzrostu guza obliczano przy pomocy wzoru:
TGI (%) (tumour growth inhibition) = (WT/WC) x 100 - 100%, gdzie WT odnosi się do średniej objętości guza w grupie traktowanej, WC odpowiada średniej objętości guza w grupie kontrolnej.
Wyniki eksperymentów przedstawiono jako wielkość średnią ± +/- SD (SD). Wszystkie obliczenia oraz wykresy przygotowane zostały przy pomocy programu GraphPad Prism 5.0,
Model nowotworu płuc
Eksperyment A.
W dniu 0 myszy Cby.Cg-foxn1(nu)/J zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek A549 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS:Matrigel w stosunku 4:1 przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 19 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~75 mm i przypisano do grup tera30
PL 223 487 B1 peutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparat białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (15 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec wody do iniekcji jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 35 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 i porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 1 i 2, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza A549, z wartością TGl 28% względem kontroli w odpowiednio 35 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie 0%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Eksperyment B.
W dniu 0 myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 7x106 komórek A549 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS:Matrigel w stosunki 3:1 przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 17 dniu eksperymentu myszy zostały poddane randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~100-120 mm3 i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (40 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 34 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 3 i Fig. 4, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 i porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 3 i 4, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza A549, z wartością TGl 45% względem kontroli w odpowiednio 34 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie 21,8%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Eksperyment C.
W dniu 0 myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek NCI-H460-Luc2 zawieszonych w 0,1 ml buforu HBSS przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 11 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~100-120 mm i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (40 mg/kg i 30 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień (w przypadku białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 pierwsze podanie w dawce 40 mg/kg, a następne podania w dawce 30 mg/kg). W 29 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 5 i fig. 6, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 i porównawczo rhTRAIL114-281,
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 5 i 6, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza NCI-H460-Luc2, z wartością TGl 93% względem kontroli w odpowiednio 29 dniu eksperymentu.
Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowoPL 223 487 B1 tworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie 76%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Badane białko fuzyjne nie powodowało znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanego białka według wynalazku.
Model nowotworu prostaty
W dniu 0 myszy Cby.Cg-foxn1(nu)/J zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek PC3 zawieszonych w 0,18 ml buforu HBSS oraz 0,02 ml Matrigel przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 29 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, 3 aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~90 mm3 i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparat białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (15 mg/kg) oraz 0,9% NaCl jako kontrolę. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 codziennych podań. W 60 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 7 i Fig. 8, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 7 i 8, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza PC3, z wartością TGl 33%, względem kontroli w odpowiednio 60 dniu eksperymentu.
Badane białko fuzyjne nie powodowało znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanego białka według wynalazku.
Model nowotworu trzustki
W dniu 0 myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek PANC-1 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS:Matrigel w stosunki
3:1 przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 31 dniu eksperymentu myszy poddano 3 randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~110 mm3 i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparat białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (40 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaO, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 42 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 9 i Fig. 10, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 i porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 9 i 10, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza PANC-1, z wartością TGl 32,6% względem kontroli w odpowiednio 42 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie 26%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Badane białko fuzyjne nie powodowało znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanego białka według wynalazku.
Model nowotworu jelita grubego
Eksperyment A.
W dniu 0 myszy Crl:SHO-PrkdcscidHrhr zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek HCT116 zawieszonych w 0,1 ml buforu HBSS przy pomocy strzykawki z igłą
0,5 x 25 mm (Bogmark). W 18 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby średnia wiel3 kość guzów w grupie wyniosła ~400 mm3 i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparat białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (35 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (5 mM NaH2PO4, 95 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glycerol, 80 mM sacharoza, pH 8,0) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 32 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
PL 223 487 B1
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 11 i fig. 12, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy traktowanych białkami fuzyjnym i według wynalazku z Prz. 11 porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 11 i 12, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza HCT116, z wartością TGl 33,5% względem kontroli w odpowiednio 32 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie od 5,6%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Badane białko fuzyjne nie powodowało znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanego białka według wynalazku.
Eksperyment B.
W dniu 0 myszy zostały zaszczepione podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek SW620 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS:Matrigel w stosunki 3:1 przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark). W 17 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~320 mm i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 16 (20 mg/kg) oraz rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 31 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 13 i Fig. 14, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli, u myszy szczepu Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem SW620 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 16 i porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 13 i 14, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku Prz. 16 uzyskano zahamowanie wzrostu guza SW620 z wartością TGl równą 25% względem kontroli w 31 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 nie uzyskano efektu hamującego wzrostu guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie od -9%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
Badane białka fuzyjne nie powodowały znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanych białek według wynalazku.
Eksperyment C.
W dniu 0 myszy zaszczepiono podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek Colo205 zawieszonych w 0,1 ml buforu HBSS przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark).
W 13 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby śr. wielkość guzów w grupie wyniosła 3 ~115 mm i przypisano do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (30 mg/kg), oraz rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 33 dniu eksperymentu myszy poddawano uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 15 i Fig. 16, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli, u myszy szczepu Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem Colo205 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 15 i 16, przez podawanie białek fuzyjnych według wynalazku z wynalazku z Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza Colo205, z wartością TGl równą 80% względem kontroli w odpowiednio 33 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie od 18,8%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
PL 223 487 B1
Badane białka fuzyjne nie powodowały znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanych białek według wynalazku.
Model nowotworu macicy z opornością wielolekową
W dniu 0 myszy zaszczepione podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 7x106 komórek MES-SA/Dx5 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS:Matriget w stosunki 10:1 przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm 25 (Bogmark). W 19 dniu eksperymentu myszy zostały poddane rand o3 mizacji tak, aby śr. wielkość guzów w grupie wyniosła ~180 mm3 i przypisano je do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 11 (30 mg/kg) oraz rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) jako preparat porównawczy wobec buforu formulacyjnego (19 mM NaH2PO4, 81 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) jako kontroli. Preparaty podawane były drogą dożylną (i.v.) w schemacie 6 podań co drugi dzień. W 35 dniu eksperymentu myszy poddawane były uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.
Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 17 i Fig. 18, które pokazują, odpowiednio, zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli, u myszy szczepu Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obarczonych nowotworem MES-SA/Dx5 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 11 porównawczo rhTRAIL114-281.
Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 17 i 18, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z wynalazku z Prz. 11 uzyskano zahamowanie wzrostu guza MES-SA/Dx5, z wartością TGl równą 81% względem kontroli w odpowiednio 35 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGl na poziomie od 29%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.
PL 223 487 B1
WYKAZ SEKWENCJI <110> Adamed sp. z o.o.
Pieczykolan, Jerzy Szczepan Pawlak, Sebastian Dominik Źerek, Bartłomiej Maciej Rózga, Piotr Kamil <12θ> Przeciwnowotworowe białko fuzyjne <130> P070/02/PL <160> 90 <170> Patentln version 3.5 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220) <223> białko fuzyjne <400> 4
Gly Leu Gly 1 Ser Val Pbe Gly Arg 5 Leu Ala Arg Ile Leu Gly Arg Val
10 15
Ile Pro Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Pro Lys Val Ala Lys Val Leu
20 25 30
Pro Lys Val Met Lys Glu Ala ile Pro Met Ala Val Glu Met Ala Lys
35 40 45
Ser Gin Glu Glu Gin Gin Pro Gin Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn
65 70 75 80
Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys
85 90 95
Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn
100 105 110
Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr
115 120 125
Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu
130 135 14Θ
PL 223 487 B1
Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr
145 150 155 160
Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met tys Ser Ala Arg Asn Ser Cys
165 170 175
Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly
180 185 190
Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn
195 200 205
Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe
210 215 220
Leu Val Gly 225 <210> 5 <2ll> 264 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> białko fuzyjne
<400> i
Thr 1 Ser Glu Glu Thr 5 Ile Ser Thr Val Gin 10 Glu Lys Gin Gin Asn 15 Ile
Ser Pro Leu Val 20 Arg Glu Arg Gly Pro 25 Gin Arg Val Ala Ala 30 His Ile
Thr Gly Thr 35 Arg Gly Arg Ser Asn 40 Thr Leu Ser Ser Pro 45 Asn Ser Lys
Asn Glu 50 Lys Ala Leu Gly Arg 55 Lys Ile Asn Ser Trp 60 Glu Ser Ser Arg
Ser 65 Gly His Ser Phe Leu 70 Ser Asn Leu His Leu 75 Arg Asn Gly Glu Leu 80
Val Ile His Glu Lys 85 Gly Phe Tyr Tyr Ile 90 Tyr Ser Gin Thr Tyr 95 Phe
Arg Phe Gin Glu 100 Glu ile Lys Glu Asn 105 Thr Lys Asn Asp Lys 110 Gin Met
Val Gin Tyr 115 Ile Tyr Lys Tyr Thr 120 Ser Tyr Pro Asp Pro 125 Ile Leu Leu
PL 223 487 B1
Met Lys Ser 130 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Głn Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 155 160
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Cys Ala Ala Cys Ala
180 185 190
Ala Ala Cys Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg
195 200 205
Gly Leu Gly Ser Val Phe Gly Arg Leu Ala Arg Ile Leu Gly Arg val
210 215 220
Ile Pro Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Pro Lys Val Ala Lys Val Leu
225 230 235 240
Pro Lys val Met Lys Glu Ala Ile Pro Met Ala Val Glu Met Ala Lys
245 250 255
Ser Gin Glu Glu Gin Gin Pro Gin
260 <21θ> 6 <211> 299 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220) <223> białko fuzyjne
<400> 6
Thr 1 ser Glu Glu Thr Ile 5 Ser Thr Val Gin 10 Glu Lys Gin Gin Asn 15 Ile
Ser Pro Leu Val 20 Arg Glu Arg Gly Pro 25 Gin Arg Val Ala Ala 30 His Ile
Thr Gly Thr 35 Arg Gly Arg Ser Asn 4Θ Thr Leu Ser Ser Pro 45 Asn Ser Lys
Asn Glu 50 Lys Ala Leu Gly Arg 55 Lys Ile Asn Ser Trp 60 Glu Ser Ser Arg
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
70 75 80
PL 223 487 B1
Val Ile His Glu Lys 85 Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe
90 95
Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met
100 105 110
Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
115 120 125
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 155 160
Arg Ile Phe Vał Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Ser Gly Cys Ala
180 185 190
Ala Cys Ala Ala Ala Cys Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg
195 20Θ 205
Gly Lys Leu Ser Cys Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ile Ile Leu Ile Leu
210 215 220
Ala Ile Val His Ser Pro Asn Met Glu Val Lys Ala Leu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Ala Asp Ala Phe Gly Glu Ala Asn Ala Phe Gly Glu Ala Asp Ala
245 250 255
Phe Ala Glu Ala Asn Ala Asp Val Lys Gly Met Lys Lys Ala Ile Lys
260 265 270
Glu Ile Leu Asp cys Val Ile Glu Lys Gly Tyr Asp Lys Leu Ala Ala
275 280 285
Lys Leu Lys Lys val ile Gin Gin Leu Trp Glu
290 295
<210> 11
<211> 202
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> białko fuzyjne
<400> 11
PL 223 487 B1
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
1 5 10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 3Θ
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
100 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe
115 120 125
Głu Leu tys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Val Val Arg Pro Leu
165 170 175
Gly Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys
180 185 19Θ
Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
19S 2Θ0
<21θ> 12 <211> 20S <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 12
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 15 10 15
PL 223 487 B1
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 30
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu He Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 9Θ 95
Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
100 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile ASp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly Gly Gly Gly Pro Leu
16S 170 175
Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys
180 18S 190
Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
19S 2ΘΘ 2Θ5 <21θ> 13 <211> 228 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> fusion protein
<400> 13
Thr Ser Glu 1 Glu Thr Ile Ser Thr 5 Val Gin 10 Glu Lys Gin Gin Asn IS Ile
Ser Pro Leu Val 20 Arg Glu Arg Gly Pro 25 Gin Arg Val Ala Ala 30 His Ile
PL 223 487 B1
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
35 40 45
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
50 55 60
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
65 70 75 80
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe
85 90 95
Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met
100 105 110
Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
115 120 125
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 1SS 160
Arg Ile Phe val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser
180 18S 190
Gly Gly Gly Gly Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Arg
195 200 20S
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys leu Ala Lys Lys Leu Ala
210 215 22Θ
Lys Leu Ala Lys
22S
<210> 14
<211> 192
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> białko fuzyjne
<400> 14
His His His His His His Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala
1 5 10 15
PL 223 487 B1
Lys Leu Ala Lys Cys Arg Vał Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg
20 25 30
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
35 40 45
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu tys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
50 55 60
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
65 70 75 80
Arg Asn Gly Glu Leu val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
85 90 95
Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys
100 105 110
Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
115 120 12S
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys
130 135 140
ASp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu
145 15Θ 155 160
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
165 170 175
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185 190 <210> 15 <211> 20Θ <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 15
His His His HiS His His Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala
1 5 10 15
Lys Leu Ala Lys Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Val
20 25 30
Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
35 40 45
PL 223 487 B1
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
65 70 75 80
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
85 90 95
Glu tys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin
100 105 110
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr
115 120 125
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
130 135 140
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
145 15Θ 15S 160
Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu tys Glu Asn Asp Arg ile Phe
165 170 175
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile ASP Met Asp His Glu Ala Ser
180 185 190
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
195 20Θ <210> 16 <211> 202 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <4Θ0> 16
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
1 5 10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 30
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
PL 223 487 B1
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser cys Trp Ser
100 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ue Phe
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly
165 170 175
Arg V3l Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys
180 185 190
Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
195 200 <210> 18 <211> 203 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne
<400> 18
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Gin Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Arg Val Val Arg Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His ile
35 4Θ 45
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
50 55 6Θ
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
65 70 75 80
PL 223 487 B1
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
85 90 95
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe
100 105 110
Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met
115 120 125
Vał Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
130 135 140
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
165 170 175
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
180 185 190
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
195 200
<210> 19
<211> 203
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> białko fuzyjne
<400> 19
Gly Gly Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Ile Ile Val Pro Ile Ile Arg Ile Arg Val Val Arg Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His Ile
35 40 45
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
50 55 60
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu i Arg Asn Gly Glu Leu
85 90 95
PL 223 487 B1
Val Ile His Glu 100 Lys Gly Phe Tyr lyr 105 Ile Tyr Ser Gin Thr 110 Tyr Phe
Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met
115 120 125
Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
130 135 140
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys T rp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
165 170 175
Arg Ile Phe val Ser Vał Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
180 185 190
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
195 200 <210> 20 <211> 200 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne
<40θ> ; 20
Arg Val Ala Ala His I le Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
1 5 10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 30
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
5Θ 55 6Θ
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 8Θ
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys T rp Ser
100 105 110
PL 223 487 B1
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly He phe
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val
145 150 15S 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg
165 170 175
Gly Leu Val Glu Thr Leu Thr Lys Ile va.l Ser Tyr Gly Ile Asp Lys
180 185 190
Leu Ile Glu Lys ile Leu Glu Gly
195 200
<210> 21 <211> 200 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <40θ> 21
Arg val Ala Ala His He Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
1 5 10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 30
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro He Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
3 Θ0 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe
115 120 125
PL 223 487 B1
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu 145 Ile Asp Met Asp His Glu 150 Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro 165 Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg 170 175
Gly Phe Ile Ala Thr Leu Thr 130 Leu Ile Gin Leu Ile Glu Asp 195 <210> 22 <211> 200 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> białko fuzyjne <400> 22 Lys val Leu Asp Phe Gly Ile Asp Lys 185 190 Lys 200
Arg 1 val Ala Ala His Ile Thr 5 Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 10 15
Ser Ser Pro Asn 20 Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 25 30
Ser Trp Glu 35 Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His 40 45
Leu Arg Asn 50 Gly Glu Leu Val 55 Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile 60
Tyr 65 Ser Gin Thr Tyr Phe Arg 70 Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val 85 Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 90 95
Pro Asp Pro Ile 100 Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 105 110
Lys Asp Ala 115 Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe 120 125
Glu Leu Lys 130 Glu Asn Asp Arg 135 Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His 140
PL 223 487 B1
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg
165 170 17S
Gly Phe Leu Gly Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ser Phe Gly Val Asp Glu 180 185 190
Leu Val Lys Leu Ile Glu Asn His 195 200 <210> 23 <211> 190 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 23
Gly Leu 1 Leu Glu Ala Leu Ala Glu Leu Leu Glu Gly Arg Arg Arg Arg
5 10 15
Arg Arg Arg Arg Val val Arg Pro teu Gly Leu Ala Gly Arg Val Ala
20 25 30
Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro
35 40 45
Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asrt Ser Trp Glu
50 55 60
Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn
65 70 75 8Θ
Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin
85 90 95
Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp
100 105 110
Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro
115 120 125
Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala
130 135 14Θ
Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys
145 150 155 160
PL 223 487 B1
Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp
165 170 175
Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Vał Gly
180 185 190
<210> 3Θ
<211> 200
<212> i PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> 1 białko fuzyjne
<400> 30
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
1 5 10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
20 25 3Θ
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe leu Ser Asn Leu His
35 40 45
leu Arg Asn Gly Glu Leu Vał Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
1Θ0 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser
165 170 175
Glu Cys Lys Arg Ser His Lys Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly
180 185 19©
PL 223 487 B1
Glu Gly val Asp Val Thr Ser Leu 195 200 <210> 31 <211> 210 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 31
Arg Val 1 Ala Ala His 5 ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu
10 15
Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys ile Asn
20 25 3O
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His
35 40 45
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile
50 55 60
Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr
65 70 75 80
tyś Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr
85 90 95
Pro Asp Pro ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser cys Trp Ser
100 105 110
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe
115 120 125
Glu Leu Lys GlU Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
130 135 140
Leu Ile ASp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala
165 170 175
Gly Ala Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg Ser His
180 185 190
Lys Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp Val Thr
195 200 205
PL 223 487 B1
Ser Leu 210 <210> 32 <211> 436 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 32
Asp 1 Val Ile Arg Glu Tyr 5 Leu Met Phe Asn Glu Leu Ser Ala Leu Ser
10 15
Ser Ser Pro Glu Ser Val Arg Ser Arg Phe Ser Ser Ile Tyr Gly Thr
20 25 30
Asn Pro Asp Gly Ile Ala Leu Asn Asn Glu Thr Tyr Phe Asn Ala Va 1
35 40 45
Lys Pro Pro Ile Thr Ala Gin Tyr Gly Tyr Tyr Cys Tyr Lys Asn val
50 55 60
Gly Thr val Gin Tyr Val Asn Arg Pro Thr Asp Ile Asn Pro Asn Val
65 70 75 80
Ile Leu Ala Gin Asp Thr Leu Thr Asn Asn Thr Asn Glu Pro Phe Thr
85 90 95
Thr Thr Ile Thr Ile Thr Gly Ser Phe Thr Asn Thr Ser Thr Val Thr
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Thr Gly Phe Lys Phe Thr Ser Lys Leu Ser Ile Lys
115 120 125
Lys Val Phe Glu Ile Gly Gly Glu Val Ser Phe Ser Thr Thr Ile Gly
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Thr Thr Glu Thr Ile Thr Val Ser Lys Ser Val Thr
145 150 155 160
Val Thr Val Pro Ala Gin Ser Arg Arg Thr Ile Gin Leu Thr Ala Lys
165 170 175
Ile Ala Lys Glu Ser Ala Asp Phe Ser Ala Pro Ile Thr Val Asp Gly
180 185 190
Tyr Phe Gly Ala Asn Phe Pro tys Arg Val Gly Pro Gly Gly His Tyr
195 200 2Θ5
PL 223 487 B1
Phe Trp Phe Asn Pro Ala Arg Asp Val Leu Asn Thr Thr Ser Gly Thr
210 215 220
Leu Arg Gly Thr Val Thr Asn Val Ser Ser Phe Asp Phe Gin Thr ile
225 23Θ 235 240
Val Gin Pro Ala Arg Ser Leu Leu Asp Glu Gin Arg Val Val Arg Pro
245 250 255
Leu Gly Leu Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Arg
260 265 270
Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser
275 280 285
Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg
290 295 300
Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser
305 310 315 320
Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe
325 330 335
Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin GlU Glu Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr ile Tyr Lys Tyr
355 360 365
Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser
37Θ 375 380
Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gin Gly
385 390 39S 400
Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser val Thr
405 410 415
Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala
420 425 43Θ
Phe Leu Val Gly
435
<210> 36 <2ll> 56 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> efektor
PL 223 487 B1
<300>
<308> Swiss-Prot/Q07932.1
<309> 2011-01-11
<313> (57)..(112)
<400> 36
Gly Leu Gly Ser Val Phe Gly Arg Leu Ala Arg Ile Leu Gly Arg
1 5 10 15
ile Pro Lys Val 20 Ala Lys Lys Leu Gly 25 Pro Lys Val Ala Lys 3Θ val Leu
Pro Lys Val Met Lys Glu Ala Ile Pro Met Ala Val Glu Met Ala Lys
40 45
Ser Gin Glu Glu Gin Gin Pro Gin 50 55 <210> 37 <211> 90 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <3θ0>
<308> GenBank/BAF95069.1 <309> 2008-08-04 <313> (2)..(91) <400> 37
Lys Leu Ser Cys Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ile Ile Leu Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ile Val His Ser Pro Asn Met Glu Val Lys Ala Leu Ala Asp Pro Glu
2Θ 25 30
Ala Asp Ala Phe Gly Glu Ala Asn Ala Phe Gly Glu Ala Asp Ala Phe
35 40 45
Ala Glu Ala Asn Ala Asp Val Lys Gly Met Lys Lys Ala Ile Lys Glu
5Θ 55 60
Ile Leu Asp Cys Val He Glu Lys Gly Tyr Asp Lys Leu Ala Ala Lys
65 70 75 8Θ
Leu Lys Lys val Ile Gin Gin Leu Trp Glu
85 9Θ
PL 223 487 B1 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <300>
<301> avadpour MM, LJuban MM, Lo WC, Bishop SM, Alberty 3B, Cowełl SM, Becker CL, McLaughlln ml <302> De novo antimicrobial peptides with Iow mammalian cell toxicity <303> 3 Med Chem <304> 39 <305> 16 <306> 3107-13 <307> 1996-08-02 <400> 41
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
1Θ <210> 43 <211> 27 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <300>
<301> Isogai E.
<302> Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Blnding Actiwities of
C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira <303> The Journal of Applied Research <304> 4 <305> 1 <306> 180-185 <3Θ7> 2004-12-01 <400> 43
Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Phe Phe Lys Arg Ile Val 15 10 15
Gin Arg Ile Phe Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 2Θ 25 <210> 44 <211> 27
PL 223 487 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <300>
<301> Risso A, Braidot E, Sordano MC, Vianello A, Macr? F, $kerlavaj B, Zanettl M, Gennaro R, Bernard! P.
<302> MAP-28, an antibiotic peptide of innate immunity, induces cell death through opening of the mitochondrial permeability transition porę.
<303> Mol Cell Biol.
<304> 22 <305> 6 <306> 1926-35 <307> 2002-03 <400> 44
Gly Gly Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Ile Ile Val Pro Ile Ile Arg Ile 20 25 <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22β>
<223> efektor <3Θ0>
<301> AndrB 2, Beminghausen Oj Wulfken 2f Leippe M.
<302> shortened amoebapore analogswlth enhanced antibacterial and cytolytic activity.
<303> FEBS Lett.
<304> 385 <305> 12 <306> 96-100 <307> 1996-04-29 <400> 45
Gly Leu Val Glu Thr Leu Thr Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ile Asp Lys 15 Μ 15
Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Gly 20
PL 223 487 B1
<2ie> 46
<211> 24
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> efektor
<3Θ0>
<301> Andra 3j Berninghausen 0, Wiilfken 34 Leippe M.
<302> Shortened amoebapore analogswith enhanced antibacterlal and cytolytic actiuity.
<303> FEBS Lett.
<304> 385
<305> 1
<306> 96-100
<307> 1996-Θ4-29
<400> 46
Gly Phe Ile Ala Thr Leu Thr Lys Val Leu Asp Phe Gly Ile Asp Lys 15 10 15
Leu Ile Gin Leu Ile Glu Asp Lys 20 <210> 47 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <30©>
<301> Andra J, Berninghausen O, Wulfken 3, Leippe M.
<302> shortened amoebapore analogswith enhanced antibacterlal and cytolytic activity.
<303> FEBS Lett.
<304> 385 <305> 1 <306> 96-100 <3Θ7> 1996-04-29 <400> 47
Gly Phe Leu Gly Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ser Phe Gly Val Asp Glu 15 1Θ 15
Leu Val Lys Leu Ile Glu Asn His 20
PL 223 487 B1 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <3ΘΘ>
<301> Ines Neundorf, Robert Rennert, Jan Hoyer, Franziska Schramm, Kristin Lóbner Igor Kitanovic and Stefan Wólfl <302> Fusion of a Short HA2-Derived Peptide Sequence to
Cell-Penetrating Peptides Improves Cytosolic Uptake, but Enhances
Cytotoxic Actiuity.
<303> Pharmaceuticals
<304> 2
<305> 2
<306> 49-65
<307> 2009
<400> 48
Gly Leu i Leu Glu Ala Leu Ala Glu Leu Leu Glu Gly
1 5 10
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> efektor
<300>
<308> Gen8ank/CAA31612.1
<309> 2008-10-07 <313> (21)..(53) <400> 54
Ala Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg Ser His Lys 15 1Θ 15
Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp Val Thr Ser 20 25 30
Leu <210> 55
PL 223 487 B1 <211> 251 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> efektor <300>
<308> PD6/2ZTE3,A <309> 2009-03-27 <313> (2)..(251) <40Θ> 55
Asp Val Ile Arg Glu Tyr Leu Met Phe Asn Glu Leu Ser Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ser Pro Glu Ser Val Arg Ser Arg Phe Ser Ser Ile Tyr Gly Thr
20 25 30
Asn Pro Asp Gly Ile Ala Leu Asn Asn Glu Thr Tyr Phe Asn Ala Val
35 40 45
Lys Pro Pro Ile Thr Ala Gin T yr Gly Tyr Tyr Cys Tyr Lys Asn Val
50 55 60
Gly Thr Val Gin Tyr Val Asn Arg Pro Thr Asp Ile Asn Pro Asn Val
65 70 /5 80
Ile Leu Ala Gin Asp Thr Leu Thr Asn Asn Thr Asn Glu Pro Phe Thr
85 90 95
Thr Thr Ile Thr Ile Thr Gly Ser Phe Thr Asn Thr Ser Thr val Thr
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Thr Giy Phe Lys Phe Thr Ser Lys Leu Ser ile Lys
115 12Θ 125
Lys val Phe Glu Ile Gly Gly Glu Val Ser Phe Ser Thr Thr He Gly
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Thr Thr Glu Thr Ile Thr val Ser Lys Ser Val Thr
145 150 15S 160
val Thr Val Pro Ala Gin Ser Arg Arg Thr Ile Gin Leu Thr Ala Lys
165 170 175
Ile Ala Lys Glu Ser Ala Asp Phe Ser Ala Pro Ile Thr Val Asp Gly
180 185 190
Tyr Phe Gly Ala Asn Phe Pro Lys Arg Val Gly Pro Gly Gly His Tyr
195 200 205
PL 223 487 B1
Phe Trp Phe Asn Pro Ala Arg Asp Val Leu Asn Thr Thr Ser Gly Thr 210 21S 220
Leu Arg Gly Thr Val Thr Asn Val Ser Ser Phe Asp Phe Gin Thr ile 225 230 235 240
Vał Gin Pro Ala Arg Ser Leu Leu Asp Glu Gin 245 250 <210> 60 <211> 681 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <4ΘΘ> 60
ggtctgggta gcgtttttgg tcgtctggca cgtattctgg gtcgtgttat tccgaaagtt 60
gcaaaaaaac tgggtccgaa agtggccaaa gttctgccga aagttatgaa agaagcaatt 120
ccgatggcag ttgaaatggc aaaaagccaa gaagaacagc agccgcagcg tgttgttcgt 180
ccgctgggtc tggcaggtcg tgttgcagca catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat 240
accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa aaagcactgg gtcgcaaaat caatagctgg 300
gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg 360
gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt tatagccaga cctattttcg ctttcaagaa 420
gagattaaag aaaataccaa aaatgataaa caaatggtgc agtacattta caaatatacc 480
agctatccgg acccgattct gctgatgaaa agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat 540
gcagaatatg gtctgtatag catttatcag ggtggcatct ttgagctgaa agaaaatgat 600
cgcatctttg ttagcgtgac caacgaacat ctgatcgata tggatcatga agccagcttt 660
tttggtgcat ttctggtggg t 681
<210> 61 <211> 792 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 61
PL 223 487 B1 accagcgaag aaaccattag caccgttcaa gaaaaacagc agaatattag tccgctggtt 60 cgtgaacgtg gtccgcagcg tgttgcagca catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat 12Θ accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa aaagccctgg gtcgcaaaat taacagctgg 180 gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg 240 gtgattcacg agaaaggctt ctattatatc tatagccaga cctattttcg ctttcaagaa 300 gaaattaaag aaaacaccaa aaatgataaa caaatggtgc agtatattta caaatatacc 360 agctatccgg atccgattct gctgatgaaa agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat 420 gcagaatatg gcctgtatag catctatcag ggtggcattt ttgaactgaa agaaaacgat 480
cgcatctttg tgagcgtgac caatgaacat ctgat tgata tggatcacga agccagcttt 54Θ
tttggtgcat ttctggttgg ttgtgcagca tgtgcagccg catgtggtgg tggtccgctg 600
ggtctggcag gtcgtgttgt tcgtggtctg ggtagcgttt ttggtcgtct ggcacgtatt 66Θ
ctgggtcgtg ttattccgaa agttgcaaaa aaactgggtc cgaaagtggc caaagttctg 720
ccgaaagtta tgaaagaagc aattccgatg gccgttgaaa tggcaaaaag ccaagaagaa 780
cagcagccgc ag 792
<210> 62 <211> 897 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> białko fuzyjne
<400> 62 accagcgaag aaaccattag caccgttcaa gaaaaacagc agaatattag tccgctggtt 60
cgtgaacgtg gtccgcagcg tgttgcagca catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat 120
accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa aaagcactgg gtcgcaaaat caatagctgg 180
gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg 240
gtgattcatg aaaaaggctt ctactatatc tatagccaga cctatttccg cttccaagaa 300
gaaatcaaag aaaataccaa aaatgataaa caaatggtgc agtatattta caaatatacc 360
agctatccgg atccgattct gctgatgaaa agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat 420
gcagaatatg gtctgtatag catttatcag ggtggcatct ttgagctgaa agaaaatgat 480
PL 223 487 B1
cgcatctttg ttagcgtgac caacgaacat ctgatcgata tggatcatga agccagcttt 540
tttggtgcat ttctggttgg tggtagcggt tgtgcagcat gtgcagccgc atgtccgctg 600
ggtctggcag gtcgtgttgt tcgtggtaaa ctgagctgtc tgagcctggc actggcaatt 660
attctgattc tggcaattgt tcatagcccg aatatggaag ttaaagcact ggcagatccg 720
gaagcagatg catttggtga agcaaatgcc tttggcgaag ccgatgcgtt tgccgaagcc 780
aatgcagatg ttaaaggtat gaaaaaagcc attaaagaaa ttctggattg cgtgatcgag 840
aaaggctatg ataaactggc agccaaactg aaaaaagtta ttcagcagct gtgggaa 897
<210> 67 <211> 606 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białk ofuzyjne <400> 67
cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60
agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag CCgt3gCggt 120
catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 18Θ
ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcaag aagaaattaa agaaaacacc 240
aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatt tacaaatata ccagctatcc ggatccgatt 3Θ0
ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 360
agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420
accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480
ggtggtggtg gcggtagcgg tggtggtggt cgtgttgttc gtccgctggg tctggcaggt 540
cgtcgtcgtc gccgtcgtcg gcgtaaactg gcaaaactgg ccaaaaaact ggcgaaactg 600
gctaaa 606 <21θ> 68 <211> 615 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 223 487 B1 <220>
<223> białko fuzyjne <400> 68 cgtgttgeag cacatattac cggcacccgt agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt ttttattata tttatagcca gacctatttt aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatc ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt agcatttatc agggtggcat ttttgaactg accaatgaac atctgattga tatggatcat ggigitggtg caagcggttg tggtccggaa cgtgttgttc gtcgtcgtcg tcgccgtcgc gcgaaactgg ctaaa <210> 69 <211> 684 <212> DNA <2i3> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 69 accagcgaag aaaccattag caccgttcag cgtgaacgtg gtccgcagcg tgttgcagca accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt gaaattaaag aaaataccaa aaatgataaa agctatccgg atccgattct gctgatgaaa ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc cgctttcaag aagaaattaa agaaaacacc tacaaatata ccagctatcc ggatccgatt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg gaagccagct tttttggtgc atttctggtt ggtggtggtg gtccgctggg tctggcaggt cgtaaactgg caaaactggc caaaaaactg
12Θ
180
240
300
360
420
480
540
600
615 gaaaaacagc agaatattag tccgctggtt catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat aaagcactgg gtcgcaaaat taatagctgg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg tatagccaga cctattttcg ctttcaggaa caaatggtgc agtatatcta taaatacacc agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat
120
180
240
300
360
420
PL 223 487 B1 gcagaatatg gtctgtatag catttatcag ggtggcattt ttgaactgaa agaaaatgat 480 cgcatttttg tgagcgtgac caatgaacat ctgattgata tggatcatga agccagcttt 540 tttggtgcat ttctggttgg tggtggtggc ggtagcggtg gtggtggtcg tgttgttcgt 6ΘΘ ccgctgggtc tggcaggtcg tcgtcgtcgt agacgtcgtc gtaaactggc aaaactggcc 660 aaaaaactgg cgaaactggc taaa 684 <210> 70 <211> 576 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 70 catcatcatc accatcacaa actggcaaaa ctggccaaaa aactggcgaa actggctaaa 60 tgtcgtgttg ttcgtccgct gggtctggca ggtcgtgttg cagcacatat taccggcacc 12Θ cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 180 aaaatcaata gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 240 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttatt atatttatag ccagacctat 300 tttcgctttc aagaagagat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtat 360 atctataaat ataccagcta tccggacccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 420 tgttggagca aagatgcaga atatggtctg tatagcattt atcagggtgg catctttgag 48Θ ctgaaagaaa atgatcgcat ctttgttagc gtgaccaacg aacatctgat cgatatggat 54Θ catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gtgggt 576 <210> 71 <211> 6ΘΘ <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 71 catcatcatc accatcacaa actggcaaaa ctggccaaaa aactggcgaa actggctaaa 60
PL 223 487 B1
tgtcgtcgtc gtcgccgtcg RCgtCgtCgt gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggtcgl 120
gttgcagcac atattaccgg cacccgtggt cgtagcaata ccctgagcag cccgaatagc 180
aaaaatgaaa aagcactggg t cgcaaaatc aatagctggg aaagcagccg tagcggtcat 240
agctttctga gcaatctgca tctgcgtaat ggtgaactgg tgattcatga aaaaggcttt 300
tattatattt atagccagac ctattttcgc tttcaagaag agattaaaga aaataccaaa 360
aat gataaac aaatggtgca gtatatctat aaatacacca gctatccgga cccgattctg 420
ctgatgaaaa gcgcacgtaa tagctgttgg agcaaagatg cagaatatgg tctgtatagc 480
atttatcagg gtggcatctt tgagctgaaa gaaaatgatc gcatctttgt tagcgtgacc 540
aacgaacatc tgatcgatat ggatcatgaa gccagctttt ttggtgcatt tctggtgggt 600
<210> 72 <211> 606 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <40θ> 72
cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca atacrctgag cagcccgaat 60
agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgraaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120
catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 18Θ
ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 240
aaaaatgata aacaaatggt gcaglatatc tataaataca ccagc tatce ggatccgatt 300
ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggsgcaaag otgcagaata tggtctgtat 360
agcatttatc agggtggcot ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420
accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480
Egtggtggtg gcggtagcgg tggtggtggt cgtgttgttc gtccgctggg tctggcaggt 540
cgtcgtcgtc gtagacgtcg tcgtaaactg gcaaaactgg ccaaaaaact ggcgaaactg 600
gctaaa 606
PL 223 487 B1 <210> 74 <211> 609 <212:· DNA <213> Sekwencja sztuczna <22θ>
<223> białko fuzyjne <400> 74
tttcgcaaaa gcaaagaaaa aattggcaaa ttttttaaac gcattgtgca gcgcattttt 69
gattttctgc gtaatctggt tcgtgttgtt cgtccgctgg gtctggcagg cgaacgtggt 120
ccgcagcgtg ttgcagcaca tattaccggc acccgtggtc gtagcaatac cctgagcagc 180
ccgaatagca aaaatgaaaa agcactgggt cgcaaaatta atagctggga aagcagccgt 240
agcggtcata gctttctgag caatctgcat ctgcgtaatg gtgaactggt gattcatgaa 300
aaaggctttt attatatlta tagccagacc tattttcgct ttcaagagga aattaaagaa 360
aataccaaaa atgataaaca aatggtgcag tatatctata aatataccag ctatccggat 420
ccgattctgc tgatgaaaag cgcacgtaat agctgttgga gcaaagatgc agaatatggt 480
ctgtatagca tttatcaggg tggcattttt gaactgaaag aaaatgatcg catttttgtg 540
agcgtgacca atgaacatct gattgatatg gatcatgaag ccagcttttt tggtgcattt 600
Ctggttggt 609 <21θ> 75 <211> 609 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<?20> <223> białko fuzyjne
<400> 75
ggtggtctgc gtagcctggg tcgtaaaatt ctgcgtgcat ggaaaaaata tggtccgatt 60
attgtgccga ttattcgtat tcgtgttgtt cgtccgctgg gtctggcagg cgaacgtggt 120
ccgcagcgtg ttgcagcaca tattaccggc acccgtggtc gtdgcaatac cctgagcagc 180
ccgaatagca aaaatgaaaa agcactgggt cgcaaaatta atagctggga aagcagccgt 240
agcggtcata gctttctgag caatctgcat ctgcgtaatg gtgaactggt gattcatgaa 300
PL 223 487 B1 aaaggctttt attatattta tagccagacc aataccaaaa atgataaaca aatggtgcag ccgattctgc tgatgaaaag cgcacgtaat ctgtatagca tttatcaggg tggcattttt agcgtgacca atgaacatct gattgatatg ctggttggt <210> 76 <211> 6Θ0 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 76 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt ttttattata tttatagcca gacctatttt aaaaatgata agcagatggt gcagtatatc ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt agcatttatc agggtggcat ttttgaactg accaatgaac atctgattga tatggatcat Bgtggtggta gcggtggtcc gctgggtctg accctgacca aaattgttag ctatggtatt <210> 77 <211> 600 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 77 tattttcgct ttcaagagga aattaaagaa tatatctata aatataccag ctatccggat agctgttgga gcaaagatgc agaatatggt gaactgaaag aaaatgatcg catttttgtg gatcatgaag ccagcttttt tggtgcattt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg gaagccagct tttttggtgc atttctggtt gcaggtcgtg ttgttcgtgg tctggttgaa gataaactga ttgaaaaaat tctggaaggt
360
420
480
540
600
609
120
180
240
300
360
420
480
540
600
PL 223 487 B1
cgtgttgcag eacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60
agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120
catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180
ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 240
aaaaatgata agcagatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 3Θ0
ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 36Θ
agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420
accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480
ggtggtggta gcggtggtcc gctgggtctg gcaggtcgtg ttgttcgtgg ttttattgca 540
accctgacca aagttctgga ttttggtatt gataaactga ttcagctgat tgaagataaa 600
<210> 78 <211> 600 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22®> <223> białko fuzyjne <400> 78 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60
agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120
catagctttć tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180
ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 240
aaaaatgata agcagatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300
ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 360
agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420
accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480
ggtggtggta gcggtggtcc gctgggtctg gcaggtcgtg ttgttcgtgg ttttctgggc 540
accctggaaa aaattctgag ctttggtgtt gatgaactgg ttaaactgat tgaaaatcat 600
PL 223 487 B1 <21θ> 79 <211> S70 <212) DNA <213> Sekwencja sztuczna <22θ>
<223> białko fuzyjne <400> 79 ggtctgctgg aagcactggc agaactgctg gaaggtcggc gtcgtcgtcg tcggcgtcgt 60 gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggtcgt gttgcagcac atattaccgg cacccgtggt 120 cgtagcaata ccctgagcag cccgaatagc aaaaatgaaa aagcactggg tcgcaaaatt 180 aatagctggg aaagcagccg tagcggtcat agctttctga gcaatctgca tctgcgtaat 240 ggtgaactgg tgattcatga aaaaggcttt tattatattt atagccagac ctattttcgc 3ΘΘ tttcaggaag aaattaaaga aaacaccaaa aacgataaac aaatggtgca gtatatctat 360 aaatacacca gctatccgga tccgattctg ctgatgaaaa gcgcacgtaa tagctgttgg 420 agcaaagatg cagaatatgg tctgtatagc atttatcagg gtggcatttt tgaactgaaa 480 gaaaatgatc gcatttttgt gagcgtgacc aatgaacatc tgattgatat ggatcatgaa 540 gccagctttt ttggtgcatt tctggttggt 570 <210> 86 <211) 600 <212> ONA <213? Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 86 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 6Θ agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa atcaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcaag aagagattaa agaaaatacc 240 aaaaatgata aacaaatggt gcagtacatc tataaatata ccagctatcc ggacccgatt 30Θ ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 360
PL 223 487 B1 agcatttatc agggtggcat ctttgagctg aaagaaaatg atcgcatctt tgttagcgtg 420 accaacgaac atctgatcga tatggatrat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480 ggtggtggtg gcggtagcgg agcaccgtgt cataccgcag cacgtagcga atgtaaacgt 540 agccataaat ttgttccggg tgcatggctg gcaggcgaag gtgttgatgt taccagcctg 6ΘΘ <210> 87 <211> 630 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 87
cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaal 6Θ
agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa atcaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120
catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180
ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcaag aagagattaa agaaaatacc 240
aaaaatgata aacaaatggt gcagtacatc tataaatata ccagctatcc ggacccgatt 300
ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctglat 360
agcatttatc agggtggcat ctttgagctg aaagaaaatg atcgcatctt tgttagcgtg 42Θ
accaacgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480
ggtggtggtg gcggtagcgg tcgtgttgtt cgtccgctgg gtctggctgg cgcaccgtgt 540
cataccgcag cacgtagcga atgtaaacgt agccataaat ttgttccggg tgcatggctg 600
gcaggcgaag gtgttgatgt taccagcctg 630
<210> 88 <211> 1308 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> białko fuzyjne <400> 83 gatgtgattc gcgaatatct gatgtttaat gaactgagcg cactgagcag cagtccggaa 60
PL 223 487 B1
agcgttcgta gccgttttag cagcatttat ggcaccaatc cggatggtat tgcactgaat 120
aatgaaacct atttcaatgc cgtgaaacct ccgattaccg cacagtatgg ttattattgc 180
tacaaaaatg ttggcaccgt gcagtatgtt aattgtccga ccgatattaa tccgaatgtt 240
attctggcac aggataccct gaccaataat accaatgaac cgtttaccac caccattacc 30Θ
attaccggta gctttaccaa taccagcacc gttaccagca gcaccaccac cggtttcaaa 360
tttaccagca aactgagcat caaaaaagtg tttgaaattg gtggcgaagt gagctttagc 420
accaccattg gcaccagcga aaccaccacc gaaaccatta ccgtgagcaa aagcgttacc 480
gttaccgttc cggcacagag ccgtcgtacc attcagctga ccgcaaaaat tgcaaaagaa S40
agcgcagatt ttagcgcacc gattaccgtt gatggttatt ttggtgcaaa ttttccgaaa 600
cgtgttggtc cgggtggtca ttacttttgg tttaatccgg cacgtgatgt gctgaatacc 660
accagtggca ccctgcgtgg tacagttacc aatgtttcta gctttgattt tcagaccatt 720
gttcagectg cacgtagcct gctggatgaa cagcgtgttg ttcgtccgct gggtttggca 780
ggcggtagcg gtggtggttc aggtggtggt gaacgtggtc cgcagcgtgt tgcagcacat 840
attaccggca cccgtggtcg tagcaatacc ctgagcagcc cgaatagcaa aaatgaaaaa 900
gcactgggtc gcaaaatcaa tagctgggaa agcagccgta gcggtcatag ctttctgagc 960
aatctgcatc tgcgtaatgg tgaactggtg attcatgaaa aaggcttcta ctatatttac 1020
agccagacct atrttcgctt tcaggaagaa attaaagaaa ataccaaaaa tgataaacaa 1080
atggtgcagt atatctataa atacaccagc tatccggatc cgattctgct gatgaaaagc 1140
gcacgtaata gctgttggag caaagatgca gaatatggcc tgtatagcat ttatcagggt 1200
ggcatttttg aactgaaaga aaatgatcgc atttttgtga gcgtgaccaa tgaacatctg 1260
attgatatgg atcatgaagc aagtttcttt ggtgcatttc tggtgggc 1308
<21θ> 90 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <40θ> 90
Met Ala Met Met Glu Val Gin Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gin Thr Cys 15 10 15
PL 223 487 B1
Val Leu Ile Val ile Phe Thr Val Leu Leu Giń Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu uys Gin Met Gin Asp Lys 35 40 45 tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gin Val 65 70 75 80
Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val Arg lys Met Ile Leu Arg Thr ser 85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gin Glu Lys Gin Gin Asn Ile Ser Pro 100 105 110
Leu Val Arg Glu ArgGly ProGinArg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 13S 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Tle Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg ser* Gly 145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe 180 IBS 190
Gin Glu Glu Ile tys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys GinMetVal Gin 105 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro ile Leu Leu Met Lys 210 215 220
PL 223 487 B1
Ser 225 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
230 235 240
Ser ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Tle
245 250 255
Phe val Ser Vał Thr Asn Glu His Leu Tle Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val Gly
275 280

Claims (24)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Białko fuzyjne, zawierające:
    - domenę (a) obejmującą funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego białka hTRAIL rozpoczynający się aminokwasem w pozycji w zakresie od hTRAIL95 do hTRAIL121, włącznie, i kończący się aminokwasem 281; i
    - przynajmniej jedną domenę (b) stanowiącą sekwencję cytolitycznego peptydu efektorowego o konformacji amfipatycznej alfa-helisy formującego pory w błonie komórkowej, przy czym sekwencja domeny (b) jest przyłączona od strony C-końca i/lub N-końca domeny (a).
  2. 2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, w którym domena (a) jest wybrana z grupy składającej się z fragmentów sekwencji białka hTRAIL, rozpoczynających się aminokwasem w pozycji 95, 114, 115, 119 lub 121.
  3. 3. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę (b) stanowi peptyd wybrany z grupy składającej się z:
    - pilosuliny-1 o Sekw. Nr 36,
    - pilosuliny-5 o Sekw. Nr 37,
    - 14-aminokwasowego syntetycznego peptydu litycznego o Sekw. Nr 41,
    - 27-aminokwasowego peptydu hCAP-18/LL-37 o Sekw. Nr 43,
    - peptydu BAMP-28 o Sekw. Nr 44,
    - analogu izoformy C peptydu litycznego z Entamoeba histolytica o Sekw. Nr 45,
    - analogu izoformy A peptydu litycznego z Entamoeba histolytica Sekw. Nr 46,
    - analogu izoformy B peptydu litycznego z Entamoeba histolytica o Sekw. Nr 47,
    - fragmentu domeny HA2 hemaglutyniny wirusa grypy o Sekw. Nr 48,
    - aktywnego fragmentu ludzkiej perforyny o Sekw. Nr 54, i
    - parasporyny-2 z Bacillus thuringensis o Sekw. Nr 55.
  4. 4. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, które pomiędzy domeną (a) a domeną (b) lub pomiędzy domenami (b) zawiera domenę (c) zawierającą miejsce cięcia proteazy, wybrane spośród sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP, sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA, i sekwencji rozpoznawanej przez furynę.
  5. 5. Białko fuzyjne według zastrz. 4, w którym sekwencją rozpoznawaną przez metaloproteazę MMP jest sekwencja (Pro Leu Gly Leu Ala Gly /PLGLAG), sekwencją rozpoznawaną przez urokinazę uPA jest sekwencja (Arg Val Val Arg/RVVR), a sekwencją rozpoznawaną przez furynę jest sekwencja (Arg Lys Lys Arg/RKKR).
  6. 6. Białko fuzyjne według zastrz. 4 albo 5, w którym domena (c) jest kombinacją położonych obok siebie sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP i sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA.
    PL 223 487 B1
  7. 7. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. poprzedzających, w którym domena peptydu efektorowego (b) dodatkowo połączona jest z domeną transportową (d), wybraną z grupy składającej się z:
    - (d1) polihistydynowej sekwencji transportującej przez błonę komórkową, zawierającej 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 reszt histydyny (His/H), i
    - (d2) poliargininowej sekwencji transportującej przez błonę komórkową, zawierającej 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 reszt argininy (Arg/R);
    oraz ich kombinacji.
  8. 8. Białko fuzyjne według zastrz. 7, w którym domena transportowa (d) znajduje się na C-końcu lub N-końcu domeny peptydu efektorowego (b).
  9. 9. Białko fuzyjne według zastrz. 7, w którym sekwencja transportowa (d) znajduje się między domeną (b) a domeną (c).
  10. 10. Białko fuzyjne według zastrz. 7, w którym domena transportowa (d) znajduje się na C-końcu białka fuzyjnego.
  11. 11. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 4 do 10, które pomiędzy dwiema domenami (c) zawiera domenę (e) stanowiącą linker do przyłączenia cząsteczki PEG, wybraną z grupy składającej się z sekwencji Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG i Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE.
  12. 12. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 4 do 11, które pomiędzy domenami (a), (b) i/lub (c) zawiera dodatkowo giętki linker steryczny.
  13. 13. Białko fuzyjne według zastrz. 12, w którym linker steryczny jest wybrany z grupy składającej się sekwencji (Gly Gly /GG), (Gly Gly Gly/ GGG), (Gly Ser Gly /GSG), (Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS), (Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGS), (Gly Gly Ser Gly Gly /GGSGG), (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly /GGGSGGG), (Gly Gly Gly Gly Ser Gly /GGGGSG), (Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGSGGGGGS), (Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly/GGGGSGGGG), (Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/GSGGGSGGG), (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/CAACAAAC), (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys/ CAAACAAC), pojedynczej reszty glicyny Gly/G i pojedynczej reszty cysteiny Cys/C, lub ich kombinacji.
  14. 14. Białko fuzyjne według zastrz. 1, mające sekwencję aminokwasów odpowiadającą sekwencji wybranej z grupy składającej się z Sekw. Nr 4; Sekw. Nr 5; Sekw. Nr 6: Sekw. Nr 11; Sekw. Nr 12; Sekw. Nr 13; Sekw. Nr 14; Sekw. Nr 15; Sekw. Nr 16; Sekw. Nr 18; Sekw. Nr 19; Sekw. Nr 20; Sekw. Nr 21; Sekw. Nr 22; Sekw. Nr 23; Sekw. Nr 30; Sekw. Nr 31; oraz Sekw. Nr 32.
  15. 15. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. poprzedzających, będące białkiem rekombinowanym.
  16. 16. Sekwencja polinukleotydowa, kodująca białko fuzyjne zdefiniowane tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 14.
  17. 17. Sekwencja według zastrz. 16, zoptymalizowana do ekspresji genetycznej w E. coli.
  18. 18. Sekwencja według zastrz. 18, wybrana z grupy składającej się z Sekw. Nr 60; Sekw. Nr 61; Sekw. Nr 62 Sekw. Nr 67; Sekw. Nr 68; Sekw. Nr 69; Sekw. Nr 70; Sekw. Nr 71; Sekw. Nr 72; Sekw. Nr 74; Sekw. Nr 75; Sekw. Nr 76; Sekw. Nr 77; Sekw. Nr 78; Sekw. Nr 79; Sekw. Nr 86; Sekw. Nr 87; oraz Sekw. Nr 88.
  19. 19. Wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję polinukleotydową według któregokolwiek z zastrz. 16 do 18.
  20. 20. Komórka gospodarza, zawierająca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 19, przy czym komórka nie jest komórką w ciele człowieka.
  21. 21. Komórka gospodarza według zastrz. 20, którą jest komórka E. coli.
  22. 22. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik czynny białko fuzyjne zdefiniowane tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 15, w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem.
  23. 23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 22, w postaci do podawania pozajelitowego.
  24. 24. Zastosowanie białka fuzyjnego zdefiniowanego tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 15 do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych u ssaków, w tym ludzi.
PL397595A 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne PL223487B1 (pl)

Priority Applications (30)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL397595A PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
NZ627445A NZ627445B2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
PT128247319T PT2797950T (pt) 2011-12-28 2012-12-22 Proteína de fusão anticancerígena
EA201491277A EA201491277A1 (ru) 2011-12-28 2012-12-22 Противораковый слитый белок
MX2014008028A MX352796B (es) 2011-12-28 2012-12-22 Proteina de fusion anticancerigena.
KR1020147021158A KR20140110017A (ko) 2011-12-28 2012-12-22 항암 융합 단백질
JP2014549601A JP6324905B2 (ja) 2011-12-28 2012-12-22 抗がん融合タンパク質
NO12824731A NO2797950T3 (pl) 2011-12-28 2012-12-22
LTEP12824731.9T LT2797950T (lt) 2011-12-28 2012-12-22 Priešvėžinis sulietas baltymas
CN201280060782.7A CN103987728B (zh) 2011-12-28 2012-12-22 抗癌融合蛋白
US14/367,681 US20140377216A1 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
UAA201408554A UA115436C2 (uk) 2011-12-28 2012-12-22 Протираковий злитий протеїн
SI201231178T SI2797950T1 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Fusion protein against cancer
DK12824731.9T DK2797950T3 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer-fusionsprotein
CA2859494A CA2859494A1 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
RS20180036A RS56758B1 (sr) 2011-12-28 2012-12-22 Antikancer fuzioni protein
HUE12824731A HUE035794T2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Cancer fusion protein
EP12824731.9A EP2797950B1 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
BR112014015922-0A BR112014015922A2 (pt) 2011-12-28 2012-12-22 proteína de fusão anticâncer
AU2012360086A AU2012360086B2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
PCT/IB2012/057657 WO2013098755A2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
ES12824731.9T ES2655828T3 (es) 2011-12-28 2012-12-22 Proteína de fusión antineoplásica
PL12824731T PL2797950T3 (pl) 2011-12-28 2012-12-22 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
SG11201403282QA SG11201403282QA (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
IL232834A IL232834A (en) 2011-12-28 2014-05-27 Antisertic union protein
PH12014501363A PH12014501363A1 (en) 2011-12-28 2014-06-16 Anticancer fusion protein
ZA2014/05460A ZA201405460B (en) 2011-12-28 2014-07-24 Anticancer fusion protein
HK15102266.6A HK1201848A1 (en) 2011-12-28 2015-03-05 Anticancer fusion protein
HRP20180012TT HRP20180012T1 (hr) 2011-12-28 2018-01-04 Antikancerogeni fuzijski protein
CY20181100048T CY1120055T1 (el) 2011-12-28 2018-01-16 Αντικαρκινικη πρωτεϊνη συντηξης

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL397595A PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL397595A1 PL397595A1 (pl) 2013-07-08
PL223487B1 true PL223487B1 (pl) 2016-10-31

Family

ID=47716118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL397595A PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
PL12824731T PL2797950T3 (pl) 2011-12-28 2012-12-22 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL12824731T PL2797950T3 (pl) 2011-12-28 2012-12-22 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Country Status (28)

Country Link
US (1) US20140377216A1 (pl)
EP (1) EP2797950B1 (pl)
JP (1) JP6324905B2 (pl)
KR (1) KR20140110017A (pl)
CN (1) CN103987728B (pl)
AU (1) AU2012360086B2 (pl)
BR (1) BR112014015922A2 (pl)
CA (1) CA2859494A1 (pl)
CY (1) CY1120055T1 (pl)
DK (1) DK2797950T3 (pl)
EA (1) EA201491277A1 (pl)
ES (1) ES2655828T3 (pl)
HK (1) HK1201848A1 (pl)
HR (1) HRP20180012T1 (pl)
HU (1) HUE035794T2 (pl)
IL (1) IL232834A (pl)
LT (1) LT2797950T (pl)
MX (1) MX352796B (pl)
NO (1) NO2797950T3 (pl)
PH (1) PH12014501363A1 (pl)
PL (2) PL223487B1 (pl)
PT (1) PT2797950T (pl)
RS (1) RS56758B1 (pl)
SG (1) SG11201403282QA (pl)
SI (1) SI2797950T1 (pl)
UA (1) UA115436C2 (pl)
WO (1) WO2013098755A2 (pl)
ZA (1) ZA201405460B (pl)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
GB201406705D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Univ Liverpool Fusion proteins,polynucleotides,expression vectors, and their uses
US10428132B2 (en) 2015-02-11 2019-10-01 West China Hospital, Sichuan University Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variant, as well as a preparation method and use thereof
CN107216385A (zh) * 2017-05-19 2017-09-29 何向锋 肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途
CN109400711B (zh) * 2017-05-31 2022-02-08 四川大学华西医院 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
WO2019067740A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 Emory University FUSION PROTEINS COMPRISING CANCER TOXIN AND MARKER, NANOPARTICLES AND USES THEREOF
CN111909275A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 上海大学 延长多肽药物循环半衰期的靶向载药体系及其构建方法
CN110669146B (zh) * 2019-10-24 2023-05-23 常州大学 一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽
CN114031673B (zh) * 2021-12-22 2023-09-22 杭州长龄生物科技有限公司 一种多肽及其制备方法
CN114605517B (zh) * 2022-05-12 2022-09-27 广东海洋大学 一种具有广谱抗癌作用的多肽lxp-7及其应用
CN116063389B (zh) * 2022-08-23 2023-07-07 广州医科大学 递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0753071A1 (en) 1993-04-28 1997-01-15 Worcester Foundation For Experimental Biology Cell-targeted lytic pore-forming agents
IL122408A0 (en) 1995-06-29 1998-06-15 Immunex Corp Dna encoding a trail polypeptide and its preparation
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
AU2003280921B2 (en) 2003-11-03 2007-09-13 Beijing Sunbio Biotech Co., Ltd. A recombinant protein with cancer suppression action, its encoding gene and use
CN1256347C (zh) * 2003-12-10 2006-05-17 中国人民解放军第二军医大学 激肽原第五结构域－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
WO2007022157A2 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Genentech, Inc. Apoptosis sensitivity to ap02l/trail by testing for 'galnac-t14 expression in cells/tissues
US20090131317A1 (en) 2007-06-22 2009-05-21 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
GB0723059D0 (en) 2007-11-23 2008-01-02 Nat Univ Ireland Improved cytokine design
GB0724532D0 (en) 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
EP2252627B1 (en) * 2008-01-24 2017-04-19 Esperance Pharmaceuticals Lytic domain fusion constructs and methods of making and using same
CL2009001191A1 (es) 2008-05-14 2010-07-02 Genentech Inc Uso del peptido apo2l/trail porque sirve para preparar un medicamento para tratar el cancer de pulmon y el linfoma de hodkin.

Also Published As

Publication number Publication date
CN103987728A (zh) 2014-08-13
KR20140110017A (ko) 2014-09-16
JP2015504052A (ja) 2015-02-05
CA2859494A1 (en) 2013-07-04
HUE035794T2 (en) 2018-05-28
RS56758B1 (sr) 2018-04-30
LT2797950T (lt) 2018-02-12
ZA201405460B (en) 2015-04-29
IL232834A (en) 2017-09-28
EP2797950A2 (en) 2014-11-05
US20140377216A1 (en) 2014-12-25
PH12014501363A1 (en) 2014-09-22
WO2013098755A2 (en) 2013-07-04
SI2797950T1 (en) 2018-02-28
IL232834A0 (en) 2014-07-31
JP6324905B2 (ja) 2018-05-16
SG11201403282QA (en) 2014-07-30
AU2012360086B2 (en) 2016-12-22
EA201491277A1 (ru) 2014-09-30
BR112014015922A2 (pt) 2020-10-27
MX352796B (es) 2017-12-07
NZ627445A (en) 2016-01-29
PL2797950T3 (pl) 2018-03-30
CY1120055T1 (el) 2018-12-12
HRP20180012T1 (hr) 2018-02-09
EP2797950B1 (en) 2017-10-18
DK2797950T3 (en) 2018-01-22
NO2797950T3 (pl) 2018-03-17
UA115436C2 (uk) 2017-11-10
WO2013098755A3 (en) 2013-08-29
PL397595A1 (pl) 2013-07-08
ES2655828T3 (es) 2018-02-21
CN103987728B (zh) 2017-05-10
MX2014008028A (es) 2014-08-21
HK1201848A1 (en) 2015-09-11
PT2797950T (pt) 2018-01-24
AU2012360086A1 (en) 2014-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL223487B1 (pl) Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
KR101861872B1 (ko) 항암 융합 단백질
DK2661496T3 (en) FUSION PROTEIN AS ANTICANCING AGENT
KR20140019828A (ko) 항암 융합 단백질
NZ627445B2 (en) Anticancer fusion protein