CN110669146B - 一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽，提供了一种新型抗菌机制，即通过关闭宿主肠细胞的感染反应信号来保护肠细胞免受肠致病菌大肠杆菌的侵害。该活性肽(VPPPVPPRRX‑GSGK‑Cyclo(FfΦRrRrC))与Nck‑SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断了衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止了EPEC感染Caco‑2细胞。EPEC给药前口服此活性肽可保护小鼠肠细胞免受EPEC感染，并保护动物免受EPEC引起的腹泻。同时根据MTT法，该肽对Caco‑2细胞本身的细胞毒性小，生物安全性高。

Description

一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道 EPEC感染的活性肽

技术领域

本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽。

背景技术

1929年青霉素的发现开启了人类历史上抗菌运动的新纪元，人类第一次拥有自己的武器来抵御由细菌引起的恶意感染。自那以后，科学家们发现并发明了许多能够治疗或预防细菌感染的药物和治疗方法，包括杀菌剂、抑菌剂和疫苗。然而，长期大量使用抗生素已经引发了一系列的抗药性问题，再次开始危害人类健康。随着全球耐药性的增加，抗菌药物的开发受到了阻挠，特别是近年来缺乏新的机制或目标。因此，需要开发与上述机制显著不同的新机制来应对这场耐药危机。

大肠杆菌引起的腹泻是所有国家和地区的流行病或潜在流行病。更具体地说，肠道致病菌大肠杆菌(EPEC)引起水样腹泻，伴有发热和呕吐，主要是2岁以下儿童。目前，临床上治疗EPEC感染主要是抗生素，但随着头孢他啶、氨基糖苷类、喹诺酮类等β-内酰胺类抗生素耐药性的出现，多药耐药肠杆菌科对腹腔感染的控制是一个尚未解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽。

EPEC感染的标志是肠粘膜上形成附着和缺失(A/E)损伤，表现为微绒毛破坏。EPEC感染的机制包括三个主要步骤：1.细菌附着在肠细胞表面；2.细菌向肠细胞注射蛋白质Tir；3.肌动蛋白基座在肠细胞上形成附着和缺失损伤，腹泻开始。Nck在宿主细胞中充当细菌蛋白Tir与Arp2/3复合依赖性肌动蛋白聚合途径之间的衔接体。Nck蛋白(包含四个串联的结构域，一个SH2结构域和三个SH3结构域。已知Nck1-SH3.2对于吸收WIP/WASP复合物是必需的，敲除Nck-SH3.2结构域，可消除EPEC感染后肌动蛋白的重组。因此本发明设想一种阻断NCK-SH3.2结构域蛋白结合位点的肽将抑制EPEC介导的基座形成，进而阻断EPEC进入机制，保护细胞免受EPEC的感染。

本发明将Cyclo(FfΦRrRrC)细胞穿透肽，与肽序列VPPPVPPRRX(简称P1)结合后，形成的活性肽(VPPPVPPRRX-GSGK(是Gly-Ser-Gly-Lys(Alloc)多肽链，起连接作用)-Cyclo(FfΦRrRrC))(简称P6)能够有效进入Caco-2细胞，与Nck-SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止EPEC感染Caco-2细胞并能预防肠道EPEC导致的腹泻，这种保护持续时间长。且该活性肽对Caco-2细胞本身的细胞毒性小，生物安全性高，具有广泛的应用前景。

本发明的具体技术方案如下所述：

将Cyclo(FfΦRrRrC)与P1结合，形成的活性肽P6能够有效进入Caco-2细胞。其中，Cyclo(FfΦRrRrC)为细胞穿透肽，Cyclo(FfΦRrRrC)中，Φ：3-(1-Naphthyl)-L-alanine；r：D-Arg；f：D-Phe，与P1结合后能够有效进入Caco-2细胞，主要分布在细胞质中，破坏了细胞中硫醇分子的存在；肽序列VPPPVPPRRX(P1)中的X是一种非天然氨基酸，具体为二氨基丙酸，(2S)-2-氨基-3-[(α-氯乙酰基)氨基]-丙酸，在其侧链上含有亲电α-氯乙酰基。

携带轻度亲电试剂α-氯乙酰基的Nck结合肽将特异性结合Nck-SH3.2，将α-氯乙酰基定位于Cys 48的巯基附近，并自发地在Nck-SH3.2和肽之间形成硫醚键。这种共价反应将不可逆地阻断SH3.2结构域的肽结合位点，同时对Nck的其他SH3结构域产生最小影响。

本发明的活性肽用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链(P6)。具体合成步骤如下：

将合成的肽溶液注入配有C18柱(Vydac 218TP C18液相色谱柱5μm，内径250x4.6mm)的反相高效液相色谱纯化。

本发明方法所得活性肽P6与Nck-SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止EPEC感染Caco-2细胞，用于预防EPEC引起的腹泻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用了一种新型抗菌机制，即通过关闭宿主肠细胞的感染反应信号来保护肠细胞免受肠致病菌大肠杆菌(EPEC)的侵害。这种非疫苗预防机制，它使受体细胞对致病菌无反应。针对Nck-SH3.2结构域在EPEC感染发病机制中的关键作用，开发了一种结构域特异性位点选择性反应肽，可阻断细胞和动物的信号传导。已经证明在Caco-2细胞和小鼠中阻断EPEC感染并且不会引起毒性。

本发明公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。

附图说明

图1为抗菌机制图。

图2为Nck与Nck-P1的质谱图。

图3为活性肽P6的结构式图。

图4为活性肽P6进入Caco-2细胞的荧光图。

图5为EPEC感染Caco-2细胞。(A)EPEC感染性的测定流程示意图。(B)不同MOI值的EPEC感染显示出Caco-2细胞肌动蛋白结构破坏的明显迹象。

图6为活性肽P6对Caco-2的细胞毒性图。

图7为活性肽P6对EPEC感染的剂量依赖性阻断效应图。

图8为活性肽P6处理的Caco-2细胞与未处理的Caco-2细胞对EPEC感染反应的代表图。

图9为不同处理组小鼠的粪便形状图。

图10为不同处理组小鼠肠不同部位的菌落图。

图11为不同处理组小鼠全场不同部位的组织学染色图。

图12为体外合成的活性肽P1-P5及其与Nck的结合反应图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1

1、活性肽P1的合成与纯化

活性肽是基于人工Fmoc固相合成法合成的。所选用的Rink amide化学基质树脂是从PCAS BioMatrix(加拿大)购买的，规格为0.5mM/g。在每个偶联步骤中，将5倍当量中的受保护基保护的氨基酸(P1中的所有氨基酸)、HBTU、HOBt和DIPEA(比例为1∶1∶1∶2)加入树脂中35分钟并在室温下摇动。用DMF洗涤树脂5次后，在含20％哌啶的DMF(v/v)溶液中进行Fmoc基团的脱保护基反应。为了封住氨基端，将树脂悬浮在含有乙酸酐(基于树脂取代的50当量)和DIPEA(基于树脂取代的50当量)的DMF溶液中，并在室温下摇动30分钟。合成完成后，用DCM和DMF彻底洗涤树脂，然后用甲醇洗涤，并在真空下干燥。最后将合成的肽溶液注入配有C18柱(Vydac 218TP C18液相色谱柱5μm，内径250x4.6 mm)的反相高效液相色谱进行纯化。

2、活性肽P1与Nck蛋白结合

将肽P1与蛋白质混合以得到20μM的蛋白质和60μM的肽的最终浓度。结合反应在磷酸盐缓冲液(PH 7.4，182mM Na₂HPO₄，9mM柠檬酸)中进行。通过质谱表征结合情况(附图2)

如附图2所示，含有Nck-SH3.2结构域的Cys 48的肽片段(C*SDGWWR，理论值：966.4，测量值：966.3，C*表示在样品制备过程中被碘乙酸修饰的半胱氨酸残基)在结合反应后消失(峰1)。Nck-P1复合物中出现一个新峰(峰2)，其分子量与MALDI-TOF MS谱中的共轭片段C(X)SDGWWR相匹配。结果表明，该肽P1可以与Nck-SH3.2结构域特异结合。

2、Caco-2细胞内的共价反应

将Cyclo(FfΦRrRrC)细胞穿透肽与P1结合，形成活性肽P6(采用固相法在P1的后面继续接细胞穿透肽，形成活性肽P6)，其结构式如附图3所示。用一个连续的人类上皮大肠癌细胞Caco-2细胞，来模拟肠上皮细胞。荧光标记的活性肽有效进入Caco-2细胞，主要分布在细胞质中(附图4)。

3、活性肽P6保护Caco-2细胞免受EPEC感染

1)基于细胞的EPEC感染模型

通过对Caco-2细胞的感染测定来确定感染能力(附图5A)。在感染期间与Caco-2细胞相关的EPEC细胞可以分成两个亚群：一个亚群仅粘附/附着于Caco-2细胞的表面；另一个亚群已完全进入Caco-2细胞膜内，并且不受抗生素杀伤。为了量化已完成感染步骤的群体，使用庆大霉素去除仅粘附于Caco-2细胞表面的EPEC群体(庆大霉素不能渗透Caco-2细胞的质膜，因此这一步不会杀死Caco-2内的EPEC细胞)。在感染复数(MOI)为10时，每个琼脂平板在稀释系数为100的条件下形成132±22个菌落，使细菌溶液在MOI为10时的感染指数为1.3×10⁴cfu/ml(cfu，菌落形成单位)。在MOI为100时，每个琼脂平板以1000的稀释系数形成87±9个菌落。这使得相同的细菌溶液在MOI为100时的感染指数为8.7×10⁴cfu/ml(附图5B)。

如附图5B所示，不同MOI值的EPEC感染显示出Caco-2细胞肌动蛋白结构明显的破坏迹象。一张代表性图片显示了500MOI处Caco-2细胞上的EPEC附着(蓝色：细胞核的DAPI染色；红色：AF647用于肌动蛋白)。在高MOI条件下，细胞膜形成皱纹，推动肌动蛋白的重组。在高MOI下，在Caco-2细胞内外都清楚可见EPEC细胞。因此，该结果证实EPEC菌株对Caco-2细胞具有强烈的感染能力。

2)活性肽P6与Nck-3.2结构域特异结合

首先通过MTT法，检测活性肽P6对Caco-2细胞的细胞毒性小(附图6)。类似地，包括庆大霉素处理步骤，以量化在Caco-2膜边界内感染Caco-2细胞的EPEC细胞，不包括表面附着的EPEC细胞。庆大霉素治疗后，细胞裂解释放被细胞吞噬的EPEC细胞。稀释细胞裂解物，直到获得在琼脂平板上可计数得浓度(附图7)。如附图7所示，活性肽P6的治疗以剂量依赖的方式抑制EPEC对Caco-2细胞的感染，500nM的P6抑制了几乎50％的EPEC感染。

活性肽P6处理的Caco-2细胞能够抵抗EPEC感染，但不抵抗表面附着。EPEC细胞可以在未处理的Caco-2细胞的表面和内部发现，但是在相同的感染条件下(没有庆大霉素处理)，EPEC细胞仅在P6预处理的Caco-2细胞的表面发现，没有进入细胞的迹象(附图8)。

总之，活性肽对于Caco-2细胞内的抗EPEC效应是不可或缺的，且不对Caco-2细胞产生毒性，相反，它赋予Caco-2细胞抗EPEC效应，可以防止EPEC细胞感染。

4、活性肽P6保护小鼠免受EPEC感染

简而言之，小鼠被分成三组。对照组口服0.3mL PBS，1.5小时后给予0.5mL生理盐水。PBS组接受0.3mL PBS，1.5小时后，给予0.5mL EPEC细菌溶液(10⁷CFU)。肽组给予0.3mL肽溶液(3mgP6溶于PBS)，1.5小时后给予0.5mL EPEC细菌溶液(10⁷CFU)。如附图9所示，活性肽P6治疗的小鼠在EPEC灌胃后没有出现腹泻，而PBS组的小鼠出现了明显的腹泻迹象。

我们还在氨苄青霉素琼脂平板上培养来自肠的不同部分的提取物，发现仅在PBS组中有菌落，而在对照组和肽组中没有(附图10)。

苏木精和伊红染色的组织学分析也显示感染组有明显的感染迹象，但对照组或肽组没有(附图11)。感染的小肠染色切片显示严重的凋亡(红色箭头)，表明存在细菌。图中橙色箭头表示细胞坏死的迹象；黄色圆圈突出显示感染组小肠和结肠中细胞增殖的迹象；黄色圆圈清晰可见结肠轻度溃疡的迹象。感染组的盲肠也表现出轻微的炎症，窝增生(红色圆圈)和杯状细胞(蓝色箭头)减少。综上所述，活性肽P6处理可保护肠道免受EPEC感染。

对比实施例1

本发明还合成了一组基于WIP蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)的近膜结构域设计的含有α-氯乙酰基的肽P1-P5(见附图12)。当这组“活性肽”与纯化的Nck蛋白一起孵育时，共价连接的Nck-肽复合物自发形成，在变性SDS PAGE凝胶上显示出分子量高于Nck的新蛋白条带(附图12)。肽P1的反应效率最高，在相同条件下，Nck蛋白转化成肽结合物的比例大于80％，且只有一个肽与Nck蛋白结合。P2和P3肽几乎没有形成Nck-肽复合物的新条带，或形成的量较P1少很多，Nck蛋白与P4和P5肽的反应呈现多条带，表明这些肽与NCK蛋白上的多个半胱氨酸无选择性反应。

Claims (3)

1.一种活性肽在制备用于预防肠致病菌大肠杆菌（EPEC）感染的试剂中的用途，其特征在于，所述活性肽序列为VPPPVPPRRX-GSGK-Cyclo(FfΦRrRrC)，其中，X是一种非天然氨基酸 (2S)-2-氨基-3-[(α-氯乙酰基)氨基]-丙酸，该氨基酸在其侧链上含有亲电α-氯乙酰基；Φ为3-(1-Naphthyl)-L-alanine；r为D-Arg；f为D-Phe；

所述活性肽能够与Nck-SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止EPEC感染Caco-2细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，Cyclo(FfΦRrRrC)为细胞穿透肽，与VPPPVPPRRX连接后能够有效进入Caco-2细胞。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述活性肽用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。

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