JP2015504052A - 抗がん融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
TRAILは、このタンパク質に抵抗性を示す健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範ながんには作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、TRAILの極めて大きな可能性が認識された。
細胞膜またはミトコンドリア膜の崩壊(不連続)の結果としての、がん細胞の破壊および腫瘍増殖の阻害の効果が知られている。膜崩壊することができる細胞溶解作用を有する物質を、抗がん治療と補助抗がん治療の両方として用いる試みがなされている。
細胞溶解活性を有する多くの天然および合成のペプチドおよびタンパク質が知られている。細胞溶解性ペプチドは、小孔形成ペプチドまたは細胞溶解素として記載されている。小孔形成ペプチドの膜表面との相互作用は、正に荷電したペプチドと、負に荷電した細胞膜の表面との非特異的静電相互作用に基づき得る。
細胞膜に小孔を形成することができる、細菌、植物または哺乳動物由来の天然に存在する周知の細胞溶解性ペプチドは、それらが赤血球および他の真核細胞の溶解を引き起こすために、多くの場合溶血素とも呼ばれる。これらの毒素としては、セクロピンAおよびB、オーレイン(aurein)1.2、シトロピン(citropin)1.1、ディフェンシン(HNP−2)、ラクトフェリシンB、タキプレシン、PR−39、Enterococcus faecalisの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリア毒素、Vibrio choleraeの細胞溶解素、Actinia equinaからの毒素、Streptococcus intermediusからの溶解性ペプチド、レンチウイルス溶解性ペプチド、Actinobacillus actinomycetemcomitansの白血球毒素、マガイニン、メリチン、リンフォトキシン、エンケファリン、パラダキシン(paradaxin)、パーフォリン(特にそのN末端フラグメント)、Clostridium perfringensからのパーフリンゴリジンO(PFO/シータ毒素)、およびストレプトリジンが挙げられる。医薬としてのそれらの有用性は、溶血を引き起こすその能力によって制限される。
天然の細胞溶解性ペプチドは、例えばR. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368に記載されている。
「バレルステーブ」のメカニズムは、少なくとも23アミノ酸の長さを有するα−ヘリックスコンフォメーションの両親媒性ペプチドについて観察される。例えば、「バレルステーブ」のメカニズムにより膜の破壊を引き起こすペプチドは、グラミシジンA、アラメチシン(alameticin)、パーフォリン、ピロスリン(pilosulin)、反復KLAKモチーフを有する合成ペプチド、カセリシジン、Entamoeba histolyticaから単離されたペプチド、パラスポリン、およびセクロピンである。「トロイダル小孔モデル」のメカニズムにより膜の破壊を引き起こすペプチドには、例えばメリチンおよびマガイニンが含まれる。例えば、「カーペット」モデルにより膜の破壊を引き起こすペプチドは、セクロピンAおよびBである。
標的細胞の膜における小孔の形成はまた、ペプチドの酵素活性とも関連し得る。ホスホリパーゼAの酵素活性は、例えば、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンに対する特異的ホスホジエステラーゼ活性を有するホスホリパーゼ、非特異的な細胞溶解活性を有する溶血素および細胞溶解素、または例えばコレステロールなどを含有する生体膜に対する細胞溶解活性を有する溶血素および細胞溶解素により、示される。細胞またはミトコンドリア膜に小孔の形成をもたらすこ種類の酵素活性は、リステリオリシン、イクイナトキシン(equinatoxin)、ホスホリパーゼPC−PLCおよびClostridium perfringensからのα毒素によって示される。
標的化された小孔形成アクチノポリン(actinoporin)の使用は、Panchal RG. et al., Poreforming proteins and their application in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2002, 3:99-115;Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells. Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252、およびHoskin DW, Ramamoorthy A: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778:357-87に記載されている。
また、腫瘍環境におけるエフェクタータンパク質の放出と、その結果として、腫瘍細胞への内在化を可能にするために、細胞溶解性ペプチドを含む融合タンパク質分子内の特定のプロテアーゼによって認識される切断部位の使用も知られている。例えば、Panchal Rら(Nat Biotechnol 1996, 14:852-856)は、腫瘍環境中に存在するプロテアーゼによって活性化されるカテプシンBによって認識される切断部位をそれらの配列中に含む、α溶血素を開示した。
US5817771B1には、腫瘍細胞に選択的に結合する要素としての抗体または抗原を有する小孔形成細胞溶解性ペプチドと、腫瘍環境において細胞溶解性ペプチドの選択的活性化を可能にするリンカー、特に腫瘍環境において特異的に過剰発現される例えばプロテアーゼなどの酵素によって認識される切断部位とのコンジュゲート(融合タンパク質を含む)が開示されている。
Baruaら(Cancer Letters 293 (2010) 240-253)は、TRAILに対して抵抗性であり、デスレセプターアゴニスト抗体DR4とDR5を用いた処置に非感受性の前立腺がん細胞株が、KLAK配列を含む合成カチオン性両親媒溶解性ペプチドKLAによるこれらの細胞の処置後に、これらの抗体に対して感受性となることが報告されている。
本発明のタンパク質の2つのドメインのそれぞれは、異なる機能を有している。hTRAIL由来のドメインの存在により、本発明のタンパク質はがん細胞に選択的に指向され、ここでタンパク質の要素はそれらの効果を発揮する。特に、TRAILドメインは細胞と結合した後、アポトーシスを誘発するその活性を発揮することができ、およびエフェクターペプチドは、細胞および/またはミトコンドリア膜に小孔を形成し、がん細胞の溶解を引き起こす活性を発揮することができる。
新規な融合タンパク質は、それらの個々の天然細胞溶解性ペプチドと比較して、少なくとも低減されたか限定された、または実質的に排除された溶血活性を有する。
本発明は、融合タンパク質であって、
― フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まり、hTRAIL281の位置のアミノ酸で終わる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有する、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン(a)、および
― 細胞膜に小孔を形成する細胞溶解性エフェクターペプチドの配列である、少なくとも1つのドメイン(b)、
を含み、
ここでドメイン(b)の配列が、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着している、前記融合タンパク質に関する。
本発明に従う「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸から作られる分子として理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で採用されている従来の方式で、ペプチドのN末端(N末)からそのC末端(C末)へ向かう方向に提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にN末端を、右側にC末端を有する。
また当業者には、TRAIL配列の少なくとも70%または85%の相同性の存在が当技術分野で知られていることが、理解されるであろう。
本発明の融合タンパク質中のエフェクターペプチドのドメイン(b)は、hTRAILタンパク質でもhTRAILタンパク質の一部またはフラグメントでもないことを、理解すべきである。
本発明の融合タンパク質は、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着した、エフェクターペプチドの少なくとも1つのドメイン(b)を組み込んでいる。
配列hTRAILにより、GenBankデータベースのアクセッション番号P505591およびEP0835305A1に公開されたhTRAILの既知の配列および、本発明の配列表に配列番号90として提示されたものと理解される。
具体的には、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL115−281、hTRAIL119−281、およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択してもよい。当業者にとって、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL115−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、およびhTRAIL121−281は、TRAILの既知の配列においてそれぞれ95番、114番、115番、116番、119番、および121番で表されたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸281で終わるヒトTRAILタンパク質のフラグメントを表すことは、明白であろう。
他の具体的態様において、ドメイン(a)は、hTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸で始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わる可溶性TRAILタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであって、その配列は、少なくとも70%、好ましくは85%、オリジナル配列と一致する。
この態様の具体的な変形において、ドメイン(a)は、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL115−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、およびhTRAIL121−281に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
TRAILフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更/改変であると理解されるべきであり、ここで、1個のアミノ酸、2個のアミノ酸、3個のアミノ酸、4個のアミノ酸、5個のアミノ酸、6個のアミノ酸、およびアミノ酸の15%以下を含む、少なくとも1個のアミノ酸が変化しており、ここで、改変された配列のフラグメントは、TRAIL配列の機能性すなわち、哺乳動物細胞において細胞表面のデスレセプターに結合してアポトーシスを誘導する能力を保存している。アミノ酸配列の改変は、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または付加を含んでもよい。
好ましくは、改変された配列を有するTRAILフラグメントのホモログは、TRAILのネイティブな(native)フラグメントと比較して、デスレセプターDR4(TRAIL−R1)またはDR5(TRAIL−R2)との改変された親和性を示す。
好ましくは、改変された配列を有するTRAILフラグメントのホモログは、TRAILのネイティブなフラグメントと比較して、デスレセプターDR4およびDR5に対して上昇した親和性を示す。
特に好ましくは、改変された配列を有するTRAILフラグメントのホモログは、デスレセプターDR4と比較して、デスレセプターDR5に対して上昇した親和性を示し、すなわちDR5/DR4選択性の上昇を示す。
また好ましくは、改変された配列を有するTRAILフラグメントのホモログは、デスレセプターDR1(TRAIL−R3)および/またはDR2(TRAIL−R4)に対する親和性に関連して、該受容体DR4および/またはDR5に対する選択性の上昇も示す。
具体的な態様において、hTRAILのフラグメントのホモログであるドメイン(a)は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のD218H突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなTRAIL配列のY189N−R191K−Q193R−H264R−I266R−D269H突然変異体から選択される。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)は、真核細胞に対する細胞溶解活性を有するエフェクターペプチドのドメインである。
本発明の融合タンパク質の特定の態様において、融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、配列番号34、配列番号56、および配列番号125〜配列番号132からなる群から選択される、がん細胞に対する小孔形成活性を有するペプチドである。
細胞またはミトコンドリア膜に小孔を形成し、したがって細胞溶解を引き起こすペプチドの能力は、当業者に知られている細胞膜の透過化を試験する方法によって決定することができ、例えば、以前に細胞に適用された細胞内物質、例えばATPまたは放射性標識マーカーなどの、細胞からの放出を測定することにより、または、細胞が無傷であれば生じないトリパンブルーなどの色素の取り込みを測定することによって、決定することができる。
天然の細胞溶解性小孔形成ペプチドは、細菌外毒素であってよく、例えばα−HL、アエロリシン、パーフリンゴリシン、ニューモリシン、ストレプトリジンO、リステリオリシン、Bacillus thuringensis毒素、Bacillus thuringensisのパラスポリン、溶血素またはコリシンなどのE.coliからの溶菌分子などである。
天然の細胞溶解性小孔形成ペプチドは真核ペプチドであってもよく、例えば、ヒトグラニュライシン、オーストラリアのアリMyrmecia Pilosulaの毒液からのピロスリン1およびピロスリン5を含むピロスリンファミリー、アフリカのカエルXenopus laevisの皮膚からのマガイニン2などのマガイニン、アフリカのカエルLitoria raniformisの皮膚からのオーレイン1.2、アマガエルLitoria citropaの皮膚からのシトロピン1.1、ミツバチApis melliferaの毒液からメリチン、ヒト細胞から単離されたαディフェンシンおよびβディフェンシンなどのディフェンシン、牛乳からのラクトフェリンBなどのラクトフェリン、カニTachypleus tridentatusの白血球からのタキプレシン、セクロピンAおよびB、またはPleuronectes americanusから単離されたプレウロシジン(pleurocidin)である。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号34(ヒトグラニュライシンの活性型)、配列番号35(15アミノ酸合成溶解性ペプチド)、配列番号38(タキプレシンからのペプチド)、配列番号39(融合ペプチドボンベシン−マガイニン2)、配列番号40(マガイニン2)、配列番号42(26アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピン−メリチン)、配列番号53(ビスコトキシンA3(VtA3))、および配列番号56(EGFインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、融合ペプチド)、配列番号132(メリチン)、配列番号129および配列番号131(ボンベシンと、BMAP27(B27)またはBMAP28(B28)の切断型を含む、融合ペプチド)、配列番号130(17アミノ酸合成ペプチド)として指定される。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、生体膜との相互作用を可能にする両親媒性αヘリックスコンフォメーションを有する、小孔形成ペプチドであってもよい。
本発明の融合タンパク質のドメイン(b)のエフェクターペプチドは、ホスホリパーゼ、溶血素または細胞溶解素の群から選択される、酵素活性を有する小孔形成ペプチドであってもよい。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号49(ホスホリパーゼC活性を有するClostridium perfringensからのα毒素のN末端ドメイン)、配列番号50(リステリオリシンO)、配列番号51(ホスホリパーゼPC−PLC)、および配列番号52(イクイナトキシン(equinatoxin)EqTx−II)として指定される。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、ロイシン(L)およびリシン(K)からなる合成細胞溶解性ペプチド、およびハチ毒液からの天然の溶解性ペプチドまたはAmeba histoliticaからのペプチドに構造的に類似したものであってもよい(Makovitzki, A., Suppression of Human Solid Tumor Growth in Mice by Intratumor and Systemic Inoculation of Histidine-Rich and pH-Dependent Host Defense-like Lytic Peptides, cancer Research, 2009)。前記アミノ酸の含量が高いために、このペプチドは強い正電荷を有し、腫瘍形質転換細胞の膜との選択的相互作用と、「バレルステーブ」メカニズムによる小孔形成により、これら構造内への浸透が可能である。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、ペプチド・ピロスリン1であってよく、これは、オーストラリアのアリMyrmecia Pilosulaの毒液に由来するカチオン性分子である。ピロスリン1は、配列中に定期的に反復される高含量のリシンおよびアルギニンを有するペプチドである。これらのアミノ酸の含量が高いために、このペプチドは強い正電荷を有し、がん細胞の膜との選択的相互作用と、「バレルステーブ」メカニズムを介した小孔形成が可能である(Kourie et al., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063-1087, 2000)。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号36で示される、56アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号37で示される、100アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号38で示される、17アミノ酸ペプチドである。
マガイニンファミリーは、アフリカのカエルXenopus laevisの皮膚から単離された21−27アミノ酸ポリペプチドからなる。ペプチドの両親媒性αヘリックス構造は、「バレルステーブ」メカニズムを介してそれらが細胞膜に小孔を形成することを可能とする(Matsuzaki et al, Biochim Biophys Acta, 1327:119-130, 1997)。ボンベシンは、カエルの皮膚から単離された高い正電荷を有する14アミノ酸のペプチドであり、腫瘍ホーミングペプチドの群に属し、したがって、いくつかのタイプの固形腫瘍および血液がんの表面に高い親和性を示し、これは細胞膜の強い負電荷によって特徴付けられる(Moody et al, Peptides, 1983; volume 4: 683-686)。ボンベシンは、ニューロメジンBの細胞受容体に結合することができ、ニューロメジンBは人体内に存在するボンベシンの近接したホモログであって、腫瘍細胞の表面に高度に発現される。これはボンベシンの特異性と腫瘍に占領された組織における蓄積のレベルとを著しく増大させ、一方で全身毒性を最小化する。毒性ペプチドとボンベシンのコンジュゲートは、個々のタンパク質と比較して増強された抗腫瘍活性を示す(Huawei et al, Mol. Pharmaceutics, 2010; 2:586-596)。マガイニンは、腫瘍細胞の受容体への制限された結合特性を特徴とし、その結果、その細胞毒性は、高濃度でのみ現れる。マガイニンとボンベシンを含む融合ペプチドが、腫瘍細胞に対する特異性および細胞毒性の増強を可能とすることが示されている(Liu S. et al., Enhancement of cytotoxicity of antimicrobial peptide magainin II in tumor cells by bombesin-targeted delivery. Acta Pharmacol Sin. 2011 Jan;32(1):79-88)。
ドメイン(b)の別のエフェクターペプチドはまた、真核細胞に対する細胞溶解活性を有する、ボンベシンとBMAP27(B27)またはBMAP28(B28)の切断型バージョンとを含む融合ペプチドであってもよい。かかるキメラペプチドは、細胞毒性活性および低減された全身毒性を示す(Cai H. et al., Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides, Mol. Pharmaceutics, 2010, 7(2), pp. 586-596)。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号129で示される31アミノ酸ペプチド、および添付の配列表に配列番号131で示される29アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する活性を有するドメイン(b)の別の細胞溶解性エフェクターペプチドは、合成溶解性ペプチドであってもよい。両親媒性αヘリックスタンパク質としての、式(KLAKKLA)n(式中、nはモチーフの反復数である)の合成ペプチドは、細胞への侵入後に、負に荷電したミトコンドリア膜内に蓄積され、小孔の形成とミトコンドリアの静電位の不安定化を引き起こし、これにより選択されたがん細胞株の細胞を選択的に排除する(Javadpour et al, J Med Chem, 39:3107-13, 1996)。
真核細胞に対する細胞溶解活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、界面活性剤のような様式で細胞膜を崩壊させる、他の合成溶解性ペプチドであってもよい。(Papo N, Shai Y. New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry. 2003 Aug 12;42(31):9346-54)。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号128で示される、17アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号42で示される、26アミノ酸ペプチドである。
小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、カテリシジンファミリーに属する強い正の電荷を持つペプチドBAMP−28である。このペプチドはまた、唾液腺細胞によって産生された4kDa未満の質量の12個のペプチドの群であり、抗菌および抗真菌特性を発揮する、ヒトヒスタチンの構造的アナログである(W. Kamysz et al., Histatyny - bialka liniowe bogate w histydyne, Nowa Stomatologia 2004)。BAMP−28ペプチドのN末端ドメインは強く正に荷電し、細胞膜へのドッキングに関与し、一方C末端部分は、細胞毒性活性の原因である。(Hugosson, M., D. et al., 1994). Antibacterial peptides and mitochondrial presequences affect mitochondrial coupling, repiration and protein import. Eur. J. Biochem. 223:1027-1033)。BAMP−28ペプチド活性のメカニズムは、主に細胞およびミトコンドリア膜における小孔の形成に基づく(A. Risso et al., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926-1935)。
小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームAのアナログであり、これは細胞表面上の蓄積に関与して小孔形成がもたらされ、その結果腫瘍成長が阻害される。赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)のペプチドの3つのアイソフォームA、BおよびCが同定され、これらは寄生虫の顆粒状細胞質に位置していた。これらは、3つのスルフィド架橋によって安定化された、二次構造に4つの両親媒性ヘリックスを含む、77アミノ酸ポリペプチドである(Leippe, M et al EMBO J. 11, 3501-3506, 1992)。これらのペプチドは、真核細胞に対する溶解特性を有する(Leippe, M. and Muller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994)。これらのペプチドの構造の第3ヘリックスは、細胞膜の浸透と小孔の形成に適した長さを有する。3つ全てのアイソフォームの第3ヘリックスのみを含むアミノ酸配列に基づき、一連のアナログ合成ペプチド(A3、B3およびC3)が、ヒトのがん細胞株に対して小孔形成および細胞毒性活性を有するように構成され、低い溶血活性を特徴としている(Andra et al., FEBS Letters 385: 96-100,1996)。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームBのアナログである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号46で示される、24アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームCのアナログである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのHA2ドメインの、20アミノ酸N末端フラグメントのホモログ、いわゆる「融合ペプチド」であり、ウイルスキャプシドと宿主細胞膜との相互作用に関与し(挿入)、宿主の細胞膜における小孔形成をもたらす。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)は、ウイルスキャプシドと宿主細胞膜の融合に関与する、ホモ三量体糖タンパク質である。タンパク質の構造において、2つのドメインが識別され、HA1は受容体結合に関与し、およびH2は細胞膜との相互作用に関与する。HA2ドメインの構造において、「融合ペプチド」と呼ばれるN末端部分(20アミノ酸)のみが、細胞膜の構造に直接挿入される(Durrer P et al., J Biol Chem 271:13417-13421, 1996)。融合ペプチドホモログの構造解析は、その活性が、エンドソーム膜を穿孔可能な両親媒性αヘリックスの形成をもたらすコンフォメーションの変化に関連していることを示した(Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990)。したがって、「融合ペプチド」の誘導体は、エンドソームからの効率的かつ迅速な「エスケープ」を提供する生物学的に活性な物質の効果的な担体として、使用することができる。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、Clostridium perfringensからのα毒素のN末端ドメインであり、これは細胞膜からのホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンに対するホスホリパーゼC活性を有し、小孔の形成を可能にする。Clostridium perfringensのα毒素のN末端ドメインは、ホスホリパーゼCの活性中心を含んでいる。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号49で示される、247アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号50で示される、468アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号51で示される、288アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、イクイナトキシンタンパク質である。イクイナトキシンEqTxーIIは、Actinia equinaアネモネから単離された、小孔形成細胞溶解素であり、哺乳動物細胞に対する高い非特異的毒性を特徴とする。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号52で示される、179アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号53で示される、46アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号54で示される、33アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号55で示される、251アミノ酸ペプチドである。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号56で示される、32アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、KLLKモチーフを有する合成溶解性ペプチドと、細胞表面上のPDGF受容体のアンタゴニストであるペプチドとを含む融合タンパク質である。PDGFのインヒビターの細胞表面上の結合は、溶解性ペプチドの細胞表面への配置を可能にし、さらに結合は、細胞増殖および血管新生に影響を与える(Ostman A. et al., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment, Adv. Cancer Res., 2007;97:247-74)。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号125で示される、39アミノ酸ペプチドである。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、プレウロシジンのアナログであるタンパク質である。プレウロシジンは、細胞膜と相互作用するカチオン性αヘリックス構造のタンパク質である(Cole AM et al., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. J Biol Chem.1997 May 2;272(18):12008-13)。プレウロシジン様ペプチドは、薬剤耐性で成長の遅い乳がん細胞を含む、乳がん細胞に対して活性である。(Hilchie AL et al., Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. Breast Cancer Res. 2011 Oct 24;13(5):R102)。
真核細胞に対する小孔形成活性を有するドメイン(b)の別のエフェクターペプチドは、B27ペプチド、すなわちカテリシジンファミリーに属するウシ骨髄細胞から単離されたBMAP27タンパク質の切断型である。(Donati M. et al., Activity of Cathelicidin Peptides against Chlamydia spp., Antimicrob Agents Chemother. 2005 March; 49(3): 1201-1202)。
特に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表に配列番号130で示される、25アミノ酸ペプチドである。
本発明の融合タンパク質において、TRAILの抗腫瘍活性は以下により増強される:細胞またはミトコンドリア膜における小孔の形成が、細胞の静電荷の乱れ、細胞質からのイオンの漏出、またはミトコンドリアの静電ポテンシャルの不安定化、およびシトクロムC、SMAC/DIABLOおよびAIF因子などの因子の細胞質への放出を引き起こし、これは次に、TRAILのDR系の機能的受容体への付着からのシグナルと相乗的に、内因的に誘導されたアポトーシスを活性化する。
本発明の一態様においては、ドメイン(a)およびドメイン(b)は、細胞環境に、特に腫瘍細胞環境に存在する例えばメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼまたはフューリンなどのプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも1つのドメイン(c)によって連結されている。
プロテアーゼにより認識される配列は、以下から選択することができる:
− メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にメタロプロテアーゼMMPにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
およびそれらの組み合わせ、または
− フューリンにより認識される配列Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Lys Lys Arg/RKKR)、またはフューリンにより認識されるその他の非定型配列であって、M. Gordon et all. In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87により開示されたもの、またはフューリンにより認識されるネイティブ配列Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQLもしくはHisArgGlnProArgGlyTrpGluGln/HRQPRGWEQ)、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にフューリンにより認識される配列を形成するそのフラグメント。
好ましくは、一態様において、ドメイン(c)は、Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly/RVVRPLGLAGおよびPro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg/PLGLAGRVVRから選択される、フューリンにより認識される配列である。
プロテアーゼである、メタロプロテアーゼMMP、ウロキナーゼuPAおよびフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、ドメイン(a)のドメイン(b)からの切断を可能にし、すなわち、機能的ドメイン(b)の放出、したがって活性化の促進を可能とする。
プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドの迅速な放出を可能にすることによって、ペプチドをその作用場所に輸送する機会を増加させるが、これは、融合タンパク質の非特異的プロテアーゼによるランダムな分解が起こる前に腫瘍環境において過剰発現されるプロテアーゼによる、hTRAILフラグメントからの切断の結果である。
さらに、輸送ドメイン(d)は、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン(b)に付着してもよい。
(d1)細胞膜を通って輸送し、6、7、8、9、10または11個のヒスチジン残基(His/H)からなる、ポリヒスチジン配列;
(d2)細胞膜を通って輸送し、6、7、8、9、10または11個のアルギニン残基(Arg/R)からなる、ポリアルギニン配列、
(d3)PD4輸送配列(タンパク質形質導入ドメイン4)Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala/YARAAARQARA、
(d4)トランスフェリン受容体結合配列からなる輸送配列Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro/THRPPMWSPVWP、
(d5)PD5輸送配列(タンパク質形質導入ドメイン5、TATタンパク質)Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg/YGRKKRRQRRR、
または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に、輸送ドメインの配列(d1)または(d2)を形成するこれらのフラグメント、
および
−これらの組み合わせ。
さらに、例えば(d1)と(d2)などのドメインの組み合わせは、互いに隣接して位置し、ドメイン(b)の一端に接続されているドメイン、および/またはドメイン(b)の異なる末端に連結されたドメインを含んでよい。
融合タンパク質が、ドメイン(b)に付着したドメイン(d)と、ドメイン(a)と(b)の間の切断部位のドメイン(c)の両方を有する場合には、ドメイン(c)は、構築物の切断後に、輸送ドメイン(d)がドメイン(b)に付着したままであるように配置されることが、理解されるべきである。換言すれば、融合タンパク質が、輸送ドメイン(d)および切断部位ドメイン(c)の両方を有する場合、ドメイン(d)はドメイン(b)と(c)の間に配置されるか、またはドメイン(d)の付着場所の反対側となるドメイン(b)の端部に配置される。
本発明は、ドメイン(d)がドメイン(c)とドメイン(a)の間に位置する変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメインがTRAILドメインに付着したままである変異体は、含まない。
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA、
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS、および
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS、
または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に、PEG分子の付着に好適な配列を形成するそのフラグメント。
好ましくはPEG化リンカーの配列は、Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEGである。
具体的には、立体リンカーは、グリシンとセリン残基の組み合わせ、例えばGly Gly Gly Gly Ser/GGGGSまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えば、フラグメントGly Gly Gly Ser/GGGS、Gly Gly Gly/GGGまたはGly Gly Gly Gly/GGGG、Gly Gly Ser Gly Gly、Gly Gly Ser Gly/GGSG、Gly Ser Gly/GSGまたはSer Gly Gly/SGG、またはその組み合わせである。
別の態様において、リンカーは、上述の立体リンカーのフラグメントから形成してもよく、フラグメントは、付着している配列の末端アミノ酸と共に立体リンカー配列を形成する。
別の態様において、立体リンカーは、本発明の融合タンパク質の三量体構造の形成および安定化を促進することができ、従って血液循環系におけるその半減期を延長し、血液循環系への投与後のタンパク質の活性に影響を与え得る、脱会合(deasociation)を予防する。この場合、リンカーはシステインとアラニンの組み合わせであり、例えば、フラグメントのCys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/CAAACAACまたはCys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/CAACAAAC、または、それが付着した末端アミノ酸配列であり、かつ三量体構造を安定化する立体リンカーを形成する、それらのフラグメントである。
本発明の融合タンパク質の具体的な態様は、小孔形成ペプチドを含む融合タンパク質であって、次に指定されたペプチドの群から選択されるものである:
配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、および配列番号132。
本発明によると、融合タンパク質とは、2つもしくは3つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、化学的リンカーを追加せずに、それら各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドとタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント(ドメイン)を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して1つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするDNA配列である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするDNAは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
発現と精製に好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号77、配列番号88、配列番号89、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、および配列番号124、
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、
これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする:
形質転換、すなわち、細菌性宿主細胞、具体的にはE. coliへの、DNA配列の導入は、例えば、低温(4℃)でのカルシウムイオンによる処置の後、熱ショック(37−42℃で)に供するか、または電気穿孔によって、DNAを取り込ませるよう調製されたコンピテント細胞に対して通常実施される。かかる技術は周知であり、通常、発現系の製造業者によって決定されるか、または文献および実験室での作業のためのマニュアル、例えばManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などに記載されている。
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるかまたは分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体中に使用直前に再構成するための、凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約5.5から約6.5までのpHに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含む、DNA配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素NdeIの切断部位(リーディング鎖の5’末端において)およびXhoIの切断部位(リーディング鎖の3’末端において)を、標的タンパク質をコードする、得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターpET28a(Novagen)の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、N末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ(6ヒスチジン)を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、特にヒスチジンタグもなく発現され、続いてそれらをSPセファロースで精製した。
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、0.25−1mMの範囲の最終濃度まで添加した。25℃で振盪しながらのインキュベーション(3.5−20h)の後、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。細菌ペレットを、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾールを含むpH7.4の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で8分間超音波処理した(40%の振幅、15秒パルス、10sのインターバル)。得られた抽出物を、40分間、20000g、4℃における遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース(GE Healthcare)樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に4℃で終夜インキュベートした。
カナマイシン(30μg/ml)および100μMの硫酸亜鉛を有するLB培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、600nmでの光学密度(OD)が0.60−0.80に達するまで、37℃でインキュベートした。その後、IPTGを、最終濃度が0.5−1mMの範囲になるまで添加した。25℃で振盪しながらの20hのインキュベーション後に、培養物を25min、6,000gで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、50mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾール、5mMのβ−メルカプトエタノール、0.5mMのPMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)を含む緩衝液(pH7.8)中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、50分間、8000gでの遠心分離により清澄化した。Ni−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。
2−D電気泳動による融合タンパク質の特徴付け
得られたタンパク質をさらに特徴付けて、クロマトグラフィ条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、二次元電気泳動(2−D)方法を以下のスケジュールに従って二段階で使用した。
ステップ1.pH勾配におけるタンパク質の等電点電気泳動法および変性条件
固定されたpH勾配で電界にフォーカス
ストリップは、標準サイズ毎に単一のウェルを含有する12.5%ポリアクリルアミドゲル上に置き、次に分離を、200Vの電圧で3時間、SDS−PAGE用装置で実施した。ゲルはクーマシーブリリアントで染色し、適用されたスケールでアーカイブに保管した。タンパク質は、サイズの標準に基づいてその重量を決定することにより同定され、そのIPIは、製造業者(GE Healthcare)が提供する曲線に基づき6−11の尺度で(アノードとしてマークされた端からのストリップの長さの%に対するpHの比率)、または等電点電気泳動校正キット(GE Healthcare)により実験的に決定された曲線に基づいて3−11の尺度で、読み取った。
本発明の融合タンパク質の代表例を、以下の例に示す。
例において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質のN末端からC末端への順序で記述する。例において、TRAILは常にhTRAILを意味する。
以下のアミノ酸配列成分の記号を使用する;ここでは3文字の記号に続き、等価の1文字の記号を示す。
LINKER1:立体リンカーGly Gly/GG
LINKER2:立体リンカーGly Gly Gly/GGG
LINKER4:立体リンカーGly Gly Gly Gly Ser/GGGGS
LINKER5:立体リンカーGly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGS
LINKER6:立体リンカーGly Gly Ser Gly Gly/GGSGG
LINKER7:立体リンカーGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/GGGSGGG
LINKER8:立体リンカーGly Gly Gly Gly Ser Gly/GGGGSG
LINKER9:立体リンカーGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGSGGGGGS
LINKER10:立体リンカーGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly/GGGGSGGGG
LINKER11:立体リンカーGly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/GSGGGSGGG
LINKER12:立体リンカーCys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/CAACAAC
LINKER13:立体リンカーCys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/CAAACAAC
LINKER14:立体リンカーCys/C
LINKER15:立体リンカーGly/G
LINKER16:立体リンカーSer Gly Gly/SGG
FURIN.NAT:フューリンにより切断されるネイティブ配列His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln/HRQPRGWEQ
UROKIN:ウロキナーゼにより切断される配列Arg Val Val Arg/RVVR
MMP:メタロプロテアーゼにより切断される配列Pro Leu Gly Leu Ala Gly/PLGLAG
PEG1:PEG化リンカーAla Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE
PEG2:PEG化リンカーAla Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG
TRANS1:輸送配列His His His His His His/HHHHHH
TRANS2:輸送配列Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRR
TRANS3:輸送配列Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR
TRANS4:輸送配列Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala/YARAAARQARA
TRANS5:輸送配列Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro/THRPPMWSPVWP
TRANS6:輸送配列Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg/YGRKKRRQRRR
配列番号1のタンパク質は、258アミノ酸の長さおよび29.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、ヒトグラニュライシンの83アミノ酸活性型(配列番号34)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカーG、立体リンカー(GSG)、メタロプロテアーゼMMP切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER15−LINKER3−MMP−UROKIN−(配列番号34)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号1)を、そのコードDNA配列(配列番号57)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号2のタンパク質は、261アミノ酸の長さおよび30.09kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、ヒトグラニュライシンの83アミノ酸活性型(配列番号34)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、および立体リンカー(GGGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号34)−UROKIN−MMP−LINKER4−(TRAIL119−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号2)を、そのコードDNA配列(配列番号58)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例2a)およびヒスチジンタグなし(例2b)の両方で発現された。
配列番号3のタンパク質は、186アミノ酸の長さおよび21.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、合成15アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号35)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−MMP−UROKIN−(配列番号35)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号3)を、そのコードDNA配列(配列番号59)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号4のタンパク質は、227アミノ酸の長さおよび25.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、56アミノ酸ピロスリン1(配列番号36)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号36)−UROKIN−MMP−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号4)を、そのコードDNA配列(配列番号60)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号5のタンパク質は、264アミノ酸の長さおよび29.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は56アミノ酸ピロスリン1(配列番号36)であり、ドメイン(a)のC末端に付着している。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(CAACAAC)、立体リンカー(GGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER12−LINKER2−MMP−UROKIN−(配列番号36)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号5)を、そのコードDNA配列(配列番号61)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号6のタンパク質は、299アミノ酸の長さおよび33.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した90アミノ酸ペプチドピロスリン5(配列番号37)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GSG)、立体リンカー(CAACAAAC)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および立体リンカーGが組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER3−LINKER12−MMP−UROKIN−LINKER15−(配列番号37)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号6)を、そのコードDNA配列(配列番号62)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例6a)およびヒスチジンタグなし(例6b)の両方で発現された。
配列番号7のタンパク質は、224アミノ酸の長さおよび25.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、タキプレシンからの17アミノ酸活性ペプチド(配列番号38)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(CAACAAAC)、立体リンカー(GG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER12−LINKER1−MMP−UROKIN−(配列番号38)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号7)を、そのコードDNA配列(配列番号63)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例7a)およびヒスチジンタグなし(例7b)の両方で発現された。
配列番号8のタンパク質は、202アミノ酸の長さおよび23.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL114−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、タキプレシンからの17アミノ酸活性ペプチド(配列番号38)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および7つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL114−281)−MMP−UROKIN−TRANS2−(配列番号38)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号8)を、そのコードDNA配列(配列番号64)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例8a)およびヒスチジンタグなし(例8b)の両方で発現された。
配列番号9のタンパク質は、243アミノ酸の長さおよび27.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、38アミノ酸の融合ペプチドボンベシン−マガイニン(配列番号39)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、および立体リンカー(CAAACAAC)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号39)−UROKIN−MMP−LINKER13−(TRAIL95−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号9)を、そのコードDNA配列(配列番号65)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号10のタンパク質は、196アミノ酸の長さおよび22.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL119−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、23アミノ酸マガイニン2(配列番号40)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号40)−UROKIN−MMP−(TRAIL119−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号10)を、そのコードDNA配列(配列番号66)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号11のタンパク質は、202アミノ酸の長さおよび23kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、合成14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、および8つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−UROKIN−MMP−TRANS3−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号11)を、そのコードDNA配列(配列番号67)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例11a)およびヒスチジンタグなし(例11b)の両方で発現された。
配列番号12のタンパク質は、205アミノ酸の長さおよび23.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、合成14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GG)、PEG化リンカー配列(ASGCGPEG)、立体リンカー配列(GGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、およびポリアルギニン輸送配列(RRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER1−PEG2−LINKER2−MMP−UROKIN−TRANS2−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号12)を、そのコードDNA配列(配列番号68)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号13のタンパク質は、228アミノ酸の長さおよび25.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、および8つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL95−281)−LINKER10−UROKIN−MMP−TRANS3−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号13)を、そのコードDNA配列(配列番号69)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例13a)およびヒスチジンタグなし(例13b)の両方で発現された。
配列番号14のタンパク質は、192アミノ酸の長さおよび22.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(C)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。さらに、エフェクターペプチドのN末端には、ポリヒスチジン輸送配列(HHHHHH)が付着している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRANS1−(配列番号41)−LINKER14−UROKIN−MMP−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号14)を、そのコードDNA配列(配列番号70)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号15のタンパク質は、200アミノ酸の長さおよび23.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(C)、8つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRRR)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。さらに、ヒスチジン輸送配列(HHHHHH)が、エフェクターペプチドのN末端に付着している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
TRANS1−(配列番号41)−LINKER14−TRANS3−UROKIN−MMP−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号15)を、そのコードDNA配列(配列番号71)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号16のタンパク質は、202アミノ酸の長さおよび23.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、14アミノ酸溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および8つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS3−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号16)を、そのコードDNA配列(配列番号72)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例16a)およびヒスチジンタグなし(例16b)の両方で発現された。
配列番号17のタンパク質は、208アミノ酸の長さおよび23.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL116−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、26アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピンA−メリチン(配列番号42)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号42)−UROKIN−MMP−(TRAIL116−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号17)を、そのコードDNA配列(配列番号73)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号18のタンパク質は、203アミノ酸の長さおよび23.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL116−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、27アミノ酸ペプチドhCAP−18/LL−37(配列番号43)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号43)−UROKIN−MMP−(TRAIL116−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号18)を、そのコードDNA配列(配列番号74)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号19のタンパク質は、203アミノ酸の長さおよび23.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL116−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、27アミノ酸ペプチドBAMP−28(配列番号44)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号44)−UROKIN−MMP−(TRAIL116−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号19)を、そのコードDNA配列(配列番号75)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号20のタンパク質は、200アミノ酸の長さおよび22.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームCの24アミノ酸アナログ(配列番号45)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGSGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER6−MMP−UROKIN−(配列番号45)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号20)を、そのコードDNA配列(配列番号76)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号20のタンパク質は、200アミノ酸の長さおよび22.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームAの24アミノ酸アナログ(配列番号46)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGSGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER6−MMP−UROKIN−(配列番号46)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号21)を、そのコードDNA配列(配列番号77)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号22のタンパク質は、200アミノ酸の長さおよび22.8kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームBの24アミノ酸アナログ(配列番号47)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGSGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER6−MMP−UROKIN−(配列番号47)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号22)を、そのコードDNA配列(配列番号78)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号23のタンパク質は、190アミノ酸の長さおよび22.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのHA2ドメインの12アミノ酸フラグメント(配列番号48)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、7つのアルギニンの輸送配列(RRRRRRR)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号48)−TRANS2−UROKIN−MMP−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号23)を、そのコードDNA配列(配列番号79)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付き(例23a)およびヒスチジンタグなし(例23b)の両方で発現された。
配列番号24のタンパク質は、429アミノ酸の長さおよび48.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、ホスホリパーゼC活性を有するClostridium perfringensからのα毒素のN末端ドメインの247アミノ酸フラグメント(配列番号49)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(G)、立体リンカー(GGGGGS)、PEG化リンカー(ASGCGPE)、および立体リンカー(GGGGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号49)−LINKER15−LINKER5−PEG2−LINKER5−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号24)を、そのコードDNA配列(配列番号80)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号25のタンパク質は、658アミノ酸の長さおよび73kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、468アミノ酸ペプチドリステリオリシンO(配列番号50)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(G)、立体リンカー(GGGGSGGGGGS)、フューリン切断部位(RKKR)、PEG化リンカー(ASGCGPEG)、および立体リンカー(GGGGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号50)−LINKER15−LINKER9−FURIN−PEG2−LINKER5−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号25)を、そのコードDNA配列(配列番号81)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号26のタンパク質は、478アミノ酸の長さおよび54kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、289アミノ酸ホスホリパーゼPC−PLC(配列番号51)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(GGGSGGGGGS)、フューリン切断部位(RKKR)、PEG化リンカー(ASGCGPEG)、および立体リンカー(GGGGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号51)−LINKER9−FURIN−PEG2−LINKER5−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号26)を、そのコードDNA配列(配列番号82)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号27のタンパク質は、361アミノ酸の長さおよび40.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、179アミノ酸イクイナトキシンEqTx−II(配列番号52)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGS)、フューリン切断部位(RKKR)、PEG化リンカー(ASGCGPE)、および立体リンカー(GGGGS)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号52)−LINKER4−FURIN−PEG1−LINKER4−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号27)を、そのコードDNA配列(配列番号83)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号28のタンパク質は、227アミノ酸の長さおよび25.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL116−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、46アミノ酸ペプチドビスコトキシンA3(VtA3)(配列番号53)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および立体リンカー(GGSGG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号53)−MMP−UROKIN−LINKER6−(TRAIL116−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号28)を、そのコードDNA配列(配列番号84)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号29のタンパク質は、224アミノ酸の長さおよび24.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、46アミノ酸ペプチドビスコトキシンA3(VtA3)(配列番号53)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGSGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER7−MMP−UROKIN−(配列番号53)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号29)を、そのコードDNA配列(配列番号85)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号30のタンパク質は、200アミノ酸の長さおよび22.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、ヒトパーフォリンの33アミノ酸活性フラグメント(配列番号54)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、立体リンカー配列(GGGGSG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER8−(配列番号54)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号30)を、そのコードDNA配列(配列番号86)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号31のタンパク質は、210アミノ酸の長さおよび23.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、ヒトパーフォリンの33アミノ酸活性フラグメント(配列番号54)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER8−UROKIN−MMP−(配列番号54)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号31)を、そのコードDNA配列(配列番号87)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号32のタンパク質は、436アミノ酸の長さおよび48kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL116−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、Bacillus thuringensisからの251アミノ酸パラスポリン2(配列番号55)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、および立体リンカー(GSGGGSGGG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号55)−UROKIN−MMP−LINKER11−(TRAIL116−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号32)を、そのコードDNA配列(配列番号88)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Bに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号33のタンパク質は、215アミノ酸の長さおよび24.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、EGFインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、32アミノ酸融合ペプチド(配列番号56)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(G)、立体リンカー(CAACAAAC)、立体リンカー(GGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER15−LINKER12−LINKER2−MMP−UROKIN−(配列番号56)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号33)を、そのコードDNA配列(配列番号89)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
配列番号91のタンパク質は、223アミノ酸の長さおよび25.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、PDGFRインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む、39アミノ酸融合ペプチド(配列番号125)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)およびメタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、立体リンカー(GG)、立体リンカー(CAAACAAC)、および立体リンカー(SGG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号125)−UROKIN−MMP−LINKER1−LINKER13−LINKER16−(TRAIL121−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号91)を、そのコードDNA配列(配列番号108)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号92のタンパク質は、223アミノ酸の長さおよび25.6kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、14アミノ酸融合合成溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ポリアルギニン輸送ドメイン(RRRRRRR)、フューリン切断部位(RKKR)、立体リンカー(GGG)、および立体リンカー(CAAACAAC)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号41)−TRANS2−FURIN−LINKER2−LINKER13−(TRAIL95−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号92)を、そのコードDNA配列(配列番号109)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号93のタンパク質は、232アミノ酸の長さおよび26.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL95−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のN末端に付着した、14アミノ酸融合合成溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(b)とドメイン(a)の間には、順番に、ポリアルギニン輸送ドメイン(RRRRRRR)、フューリン切断部位(RKKR)、ネイティブフューリン切断部位(HRQPRGWEQ)、立体リンカー(GGG)、および立体リンカー(CAAACAAC)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(配列番号41)−TRANS2−FURIN−FURIN.NAT−LINKER2−LINKER13−(TRAIL95−281)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号93)を、そのコードDNA配列(配列番号110)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号94のタンパク質は、207アミノ酸の長さおよび23kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、14アミノ酸融合合成溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YARAAARQARA)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS4−LINKER1−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号94)を、そのコードDNA配列(配列番号111)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号95のタンパク質は、218アミノ酸の長さおよび24.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、25アミノ酸プレウロシジンアナログ(配列番号126)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YARAAARQARA)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS4−LINKER1−(配列番号126)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号95)を、そのコードDNA配列(配列番号112)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号96のタンパク質は、219アミノ酸の長さおよび24.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、26アミノ酸プレウロシジンアナログ(配列番号127)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YARAAARQARA)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS4−LINKER1−(配列番号127)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号96)を、そのコードDNA配列(配列番号113)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号97のタンパク質は、212アミノ酸の長さおよび23.9kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、17アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号128)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(THRPPMWSPVWP)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS5−LINKER2−(配列番号127)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号97)を、そのコードDNA配列(配列番号114)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号98のタンパク質は、207アミノ酸の長さおよび23.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、14アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YGRKKRRQRRR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS6−LINKER1−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号98)を、そのコードDNA配列(配列番号115)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号99のタンパク質は、207アミノ酸の長さおよび24kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、31アミノ酸合成ペプチド(配列番号129)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−(配列番号129)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号99)を、そのコードDNA配列(配列番号116)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号100のタンパク質は、210アミノ酸の長さおよび24.1kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、17アミノ酸合成ペプチド(配列番号130)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YGRKKRRQRRR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS6−LINKER1−(配列番号130)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号100)を、そのコードDNA配列(配列番号117)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号101のタンパク質は、211アミノ酸の長さおよび23.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、29アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号131)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−LINKER1−(配列番号131)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号101)を、そのコードDNA配列(配列番号118)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号102のタンパク質は、234アミノ酸の長さおよび26.2kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドの2つのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に順番に付着した、25アミノ酸メリチンペプチド(配列番号132)および14アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号41)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。さらに、立体リンカー(GGGGS)が2つのエフェクターペプチドのドメインの間に組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−LINKER1−(配列番号132)−LINKER4−(配列番号41)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号102)を、そのコードDNA配列(配列番号119)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号103のタンパク質は、205アミノ酸の長さおよび23kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、25アミノ酸メリチンペプチド(配列番号132)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、およびウロキナーゼ切断部位(RVVR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−(配列番号132)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号103)を、そのコードDNA配列(配列番号120)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号104のタンパク質は、214アミノ酸の長さおよび24.5kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、25アミノ酸メリチンペプチド(配列番号132)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、ポリアルギニン輸送ドメイン(RRRRRRR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS3−LINKER1−(配列番号132)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号104)を、そのコードDNA配列(配列番号121)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号105のタンパク質は、215アミノ酸の長さおよび24.4kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、25アミノ酸メリチンペプチド(配列番号132)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。さらに、ドメイン(b)のC末端にはポリアルギニン輸送ドメイン(RRRRRRRR)が付着されて、全構築物のC末端フラグメントを形成している。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−LINKER1−(配列番号132)−TRANS3
前記構造のアミノ酸配列(配列番号105)を、そのコードDNA配列(配列番号122)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号106のタンパク質は、203アミノ酸の長さおよび23.3kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、15アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号35)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、およびポリアルギニン輸送ドメイン(RRRRRRRR)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS3−(配列番号35)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号106)を、そのコードDNA配列(配列番号123)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
配列番号107のタンパク質は、208アミノ酸の長さおよび23.7kDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン(a)はTRAIL121−281の配列であり、エフェクターペプチドのドメイン(b)は、ドメイン(a)のC末端に付着した、15アミノ酸合成溶解性ペプチド(配列番号35)である。
さらに、ドメイン(a)とドメイン(b)の間には、順番に、立体リンカー(GGGGSGGGG)、メタロプロテアーゼ切断部位(PLGLAG)、ウロキナーゼ切断部位(RVVR)、輸送ドメイン(YGRKKRRQRRR)、および立体リンカー(GG)が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である:
(TRAIL121−281)−LINKER10−MMP−UROKIN−TRANS6−LINKER1−(配列番号35)
前記構造のアミノ酸配列(配列番号107)を、そのコードDNA配列(配列番号124)を生成するための鋳型として使用した。DNAのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験は、in vitroで腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにて、およびin vivoでマウスにおいて実施した。比較として、rhTRAIL114−281タンパク質およびプラセボを使用した。
1.円偏光二色性の測定:得られたタンパク質の二次構造組成の決定
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例23、例11、および例13の融合タンパク質について、円偏光二色性により決定した。
円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。CD法は、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現により示される、タンパク質構造の光学活性を利用する。遠紫外(UV)におけるタンパク質のCDスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
50mMのTris−HCl(pH8.0)、100mMのNaCl、10%のグリセロール、0.1mMのZnCl2、80mMのサッカロース、5mMのDTTからなる緩衝液へ処方した後の、分析されるタンパク質の試料は、12kDaカットオフの透析バッグ(Sigma-Aldrich)中で透析した。透析を、タンパク質調製物について100倍量(v/v)過剰の緩衝液中4℃で数時間撹拌しながら実施した。透析の完了後、各調製物を遠心分離し(25000rpm、10min、4℃)、上清を回収した。こうして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
得られたスペクトルを、CDProソフトウェアを使用して193−250nmの範囲で数値分析した。光電子倍増管での電圧が700Vを超える点を、この波長範囲でのシグナル対ノイズ比が小さすぎるために除外した。
表1.分析したタンパク質における二次構造の含量
**結晶構造1IKQ、1R4Q、1ABR、3PX8に基づいて得られた値
得られた結果はまた、hTRAILタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の融合タンパク質(例23)に特徴的であり、β要素は、それらの構造の42%を構成する。例11および例13のタンパク質について、高いαへリックス含量が観察された(波長208nmにて、追加の最小スペクトル)。これは、構築物における、強い両親媒性の性質を有しαへリックス様構造を形成するKLAKLAKモチーフの存在のためである。残念ながら、例23、例11および例13からのタンパク質のCD測定用の緩衝液中での低い安定性と、分析された調製物の低濃度のために、これらのスペクトルは高いノイズレベルと低い解像度が特徴的である。したがって、これらは実際の状況を完全に反映していない可能性があり、結果を示唆するのみである。
細胞株
細胞株はATCCとCLSから入手し、その後繁殖させてAdamed’s Laboratory of Biology Cell Line Bankに寄託した。実験の間、細胞は、マイコプラズマの存在についてPCR法によりキットVenorRGeM Mycoplasma PCR Detection Kit(Minerva Biolabs, Berlin, Germany)を用いて日常的にチェックした。培養物は標準条件下に維持した:37℃、5%CO2(DMEMの場合は10%CO2)、および85%の相対湿度。特定の細胞株は、ATCCの推奨に従って適切な培地中で培養した。
MTTアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。これは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ1による、黄色のテトラゾリウム塩MTT(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の、非水溶性紫染料ホルマザンへの分解にある。MTTの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の50%で還元が生じる濃度である、タンパク質のIC50濃度(単位ng/mL)の決定からなる。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載(Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183)に従って実施した。
EZ4U(Biomedica)テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、MTT法を改変したものである。細胞生存率試験は、タンパク質(タンパク質を7つの濃度で各3ウェルずつ)と共に細胞を連続72時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用してIC50値を(2回の独立した実験の平均値として)決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
このテストのために選択した細胞は、TRAILタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株(TRAILに対する自然抵抗性の基準:TRAILタンパク質のIC50>2000)のみならず、TRAILタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株MES−SA/DX5も含んだ。
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、TRAILに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のTRAILに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、TRAILに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、TRAILのみの場合のIC50値と比べて融合タンパク質のIC50値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、TRAILのみの活性よりも高かった。
非がん細胞株で得られた2000を超えるIC50値は、健常細胞に対して、本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
表4は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
実験結果を、平均値±標準偏差(SD)として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
得られたIC50値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんColo205およびHCT−116、ヒト肺がんA549およびNCI−H460−Luc、ヒト前立腺がんPC−3、ヒト膵臓がんPanc−1およびMIA PaCa−2、ヒト肝がんPCL/PRF/5およびHepG2、およびヒト多剤耐性子宮肉腫MES−SA.Dx5のマウスモデルにおいてテストした。
ヒト肺がんA549およびNCI−H460−Luc、ヒト前立腺がんPC−3の細胞は、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。
ヒト結腸がんColo205の細胞は、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したRPMI1640培地(Hyclone, Logan, UT, USA)(任意にOpto−MEM(Invitrogen, Cat.22600-134)と1:1の比率で混合)中に維持した。
ヒト膵臓がんPANC−1、ヒト肝がんPCL/PRF/5、膵臓がんMIA PaCa−2、およびヒト結腸がんSW−620の細胞は、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したDMEM培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。
ヒト結腸がんHCT−116の細胞は、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したMcCoy培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。
ヒト肝がんHepG2の細胞は、10%のウシ胎児血清および2mMのグルタミンを補充したMEM培地(Hyclone, Logan, UT, USA)中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン(Invitrogen)で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を1300rpm、4℃で8min遠心分離し、HBSS緩衝液(Hanks培地)に懸濁した。
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、Centrum Medycyny Doswiadczalnej in Bialystokから入手した4−6週齢(肺がんモデル)のCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスまたは9−10週齢(前立腺がんモデル)、Charles River Germanyから入手した4−5週齢の雌Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスを用いて実施した。マウスは、食糧および脱塩水を(適宜)自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン:「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」(New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行)に従って行い、実験はIV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
腫瘍サイズは電子キャリパーを用いて測定し、腫瘍体積は、式:(a2×b)/2を用いて算出した;式中、a=腫瘍の短い対角線(mm)およびb=腫瘍の長い対角線(mm)である。腫瘍成長阻害は、次の式を用いて算出した:
TGI[%](腫瘍成長阻害)=(WT/WC)×100−100%
式中、WTは、処置群の平均腫瘍体積であり、WCは対照群の平均腫瘍体積である。
実験結果は、平均値±標準偏差(SD)として表す。すべての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0プログラムを用いて作成した。
実験A.
0日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下(sc)に、HBSS:マトリゲル(4:1)の混合物0.1mlに懸濁した5×106のA549細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験19日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜75mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(15mg/kg)、比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)、および対照として注射用水を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験35日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図1および図2に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、TGI28%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが0%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
実験結果を図3および図4に、腫瘍体積の変化の図、ならびに、例11aの本発明の融合タンパク質および比較としてrhTRAIL114−281で処置したマウスにおける、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)として示す。
図3および図4に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験34日目において対照と比較して、TGI45%でA549腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが21.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、0.1mlのHBSS緩衝液に懸濁した5×106のNCI−H460−Luc2細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験11日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜100−120mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(40mg/kgおよび30mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)に対する比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)を投与した。調製物は、1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した(例11aの本発明の融合タンパク質の場合、最初の投与は40mg/kgで、続いて30mg/kgで)。実験29日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図5および図6に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験29日目において対照と比較して、TGI93%でNCI−H460−Luc2腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが76%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
0日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下(sc)に、0.18mlのHBSS培地と0.02mlのマトリゲルに懸濁した5×106のPC3細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験29日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜90mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(15mg/kg)、および対照として0.9%NaClを投与した。調製物は1日1回6日間、静脈内投与(i.v.)した。実験60日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図7および図8に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験60日目において対照と比較して、TGI33%でPC3腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
実験A:PANC−1細胞
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS:マトリゲル(3:1)の混合物0.1mlに懸濁した5×106のPANC−1細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験31日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜110mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(40mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)に対する比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験42日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図9および図10に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験42日目において対照と比較して、TGI32.6%でPANC−1腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが26%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下(sc)に、HBSS培地とマトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した5×106のMIA PaCa−2細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。腫瘍のサイズが60−398mm3になったとき(20日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜170mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例16bの本発明の融合タンパク質(50mg/kg)、および比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、ならびに参照化合物のゲムシタビン(Gemzar, Eli Lilly)(50mg/kg)を投与した。調製物は1日おきに6回静脈内投与し(i.v.)、ゲムシタビンは同一のスケジュールで腹腔内(i.p.)に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
MIA PaCa−2膵臓がんを負い、本発明の例16bの融合タンパク質および比較としてrhTRAIL114−281とゲムシタビンで処置されたCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスで得た実験結果を、図19に腫瘍体積の変化の図として、および図20に、対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害(%TGI)として示す。
図19および図20に示す実験結果は、例16bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験61日目において対照と比較して、TGI93%でMIA PaCa−2腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281およびゲムシタビンについては、対照と比較して、TGIがそれぞれ68%と42.6%レベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
実験A:HCT116細胞
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、0.1mlのHBSS培地に懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験18日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜400mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(35mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(5mMのNaH2PO4、95mMのNa2HPO4、200mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、80mMのサッカロース、pH8.0)に対する比較としてrhTRAIL114−281(20mg/kg)を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内(i.v.)投与した。実験32日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図11および図12に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験32日目において対照と比較して、TGI33.5%でHCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが5.6%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲル(3:1)の混合物0.1mlに懸濁した5×106のHCT116細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。腫瘍のサイズが71−432mm3になったとき(13日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例16bの本発明の融合タンパク質(90mg/kg)、および比較としてrhTRAIL114−281(65mg/kg)を投与した。調製物は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。対照群には処方緩衝液を与えた。
実験群の平均腫瘍サイズが〜1000mm3になったとき、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
図21および図22に示す実験結果は、例16bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験24日目において対照と比較して、TGI65.8%でHCT116腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが37.9%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS:マトリゲル(3:1)の混合物0.1mlに懸濁した5×106のSW620細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験17日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜320mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例16aの本発明の融合タンパク質(20mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)に対する比較としてrhTRAIL114−281(30mg/kg)を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験31日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図13および図14に示す実験結果は、例16aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験31日目において対照と比較して、25%のTGIでSW620腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが−9%のレベルで、腫瘍細胞成長に対する阻害効果は得られなかった。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、0.1mlのHBSS緩衝液に懸濁した5×106のColo205細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験13日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜115mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。
処置群には、次の調製物:例16aの本発明の融合タンパク質(30mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)に対する比較としてrhTRAIL114−281(30mg/kg)を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験33日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図15および図16に示す実験結果は、例16aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験33日目において対照と比較して、80%のTGIでColo205腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが18.8%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下(sc)に、HBSS:マトリゲルの10:1の混合物0.1mlに懸濁した7×106のMES−SA/Dx5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。実験19日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜180mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例11aの本発明の融合タンパク質(30mg/kg)、および対照としての処方緩衝液(19mMのNaH2PO4、81mMのNa2HPO4、50mMのNaCl、5mMのグルタチオン、0.1mMのZnCl2、10%のグリセロール、pH7.4)に対する比較としてrhTRAIL114−281(10mg/kg)を投与した。調製物は1日1回、1日おきに6回静脈内投与(i.v.)した。実験35日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
図17および図18に示す実験結果は、例11aの本発明の融合タンパク質の投与が、実験35日目において対照と比較して、81%のTGIでMES−SA/Dx5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが29%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独の場合と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった(すなわち、体重基準値の10%未満)。これは本発明のタンパク質の低い全身毒性を示す。
実験A:HepG2細胞
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した7×106のHepG2細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。腫瘍のサイズが64−529mm3になったとき(25日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜230mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例16bの本発明の融合タンパク質(80mg/kg)、および比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、ならびに参照化合物5−FU(5−フルオロウラシル、Sigma-Aldrich)(20mg/kg)を投与した。調製物は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、5−FUは腹腔内(i.p.)に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
処置群の平均腫瘍サイズが〜1000mm3となったときに、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
図23および図24に示す実験結果は、例16bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験42日目において対照と比較して、94.6%のTGIでHepG2腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281については、対照と比較して、TGIが23.2%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。参照化合物の5−FUは、HepG2腫瘍に対していかなる有効性も示さなかった。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
0日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側腹部の皮下(sc)に、HBSS緩衝液:マトリゲルの3:1の混合物0.1mlに懸濁した7×106のPLC/PRF/5細胞を、0.5×25mm針付きシリンジ(Bogmark)を用いて移植した。腫瘍のサイズが72−536mm3になったとき(29日目)、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜205mm3となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物:例16bの本発明の融合タンパク質(50mg/kg)、および比較としてrhTRAIL114−281(50mg/kg)、ならびに参照化合物5−FU(5−フルオロウラシル、Sigma-Aldrich)(30mg/kg)を投与した。調製物は1日おきに6回静脈内投与(i.v.)し、ただし5−FUは、(q1d×5)×2のスケジュールで腹腔内(i.p.)に適用した。対照群には処方緩衝液を与えた。
処置群の平均腫瘍サイズが〜1000mm3となったときに、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。
図25および図26に示す実験結果は、例16bの本発明の融合タンパク質の投与が、実験43日目において対照と比較して、53%のTGIでPLC/PRF/5腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したrhTRAIL114−281および5−FUについては、対照と比較して、それぞれTGIが25.2%と32.2%のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。このように、本発明の融合タンパク質は、TRAIL単独および標準化学療法と比較して、はるかに強力な効果を発揮した。
Claims (30)
- 融合タンパク質であって、
― フラグメントがhTRAIL95より小さくない位置のアミノ酸から始まり、hTRAIL281の位置のアミノ酸で終わる、可溶性hTRAILタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは85%の同一性を有する、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン(a)、および
― 細胞膜に小孔を形成する細胞溶解性エフェクターペプチドの配列である、少なくとも1つのドメイン(b)、
を含み、
ここでドメイン(b)の配列が、ドメイン(a)のC末端および/またはN末端に付着している、前記融合タンパク質。 - ドメイン(a)が、hTRAIL95からhTRAIL121までの範囲(両端を含む)のアミノ酸から始まり、アミノ酸hTRAIL281で終わる、可溶性hTRAIL(配列番号90)タンパク質配列のフラグメントを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(a)が、hTRAIL95−281、hTRAIL114−281、hTRAIL115−281、hTRAIL116−281、hTRAIL119−281、およびhTRAIL121−281からなる群から選択される、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(b)が、
― 配列番号34のヒトグラニュライシンの活性型、
― 配列番号35の15アミノ酸合成溶解性ペプチド、
― 配列番号36のピロスリン1、
― 配列番号37のピロスリン5、
― 配列番号38のタキプレシンからのペプチド、
― 配列番号39の融合ペプチドボンベシン−マガイニン2、
― 配列番号40のマガイニン2、
― 配列番号41の14アミノ酸合成溶解性ペプチド、
― 配列番号42の26アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピン−メリチン、
― 配列番号43の27アミノ酸ペプチドFFhCAP18、
― 配列番号44のBAMP−28ペプチド、
― 配列番号45の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームCのアナログ、
― 配列番号46の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームAのアナログ、
― 配列番号47の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームBのアナログ、
― 配列番号48の、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのHA2ドメインのフラグメント、
― 配列番号49の、ホスホリパーゼC活性を有する、Clostridium perfringensからのα毒素のN末端ドメイン、
― 配列番号50のリステリオリシンO、
― 配列番号51のホスホリパーゼPC−PLC、
― 配列番号52のイクイナトキシンEqTx−II、
― 配列番号53のビスコトキシンA3(VtA3)、
― 配列番号54のヒトパーフォリンの活性フラグメント、
― 配列番号55のBacillus thuringensisのパラスポリン2、
― 配列番号56の、EGFインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む融合ペプチド、
― 配列番号125の、KLLKモチーフを有する合成溶解性ペプチドとPDGF受容体のアンタゴニストであるペプチドを含む、融合タンパク質、
― 配列番号126のプレウロシジンアナログ、
― 配列番号127のプレウロシジンアナログ、
― 配列番号128の合成溶解性ペプチド、
― 配列番号129の、ボンベシンとB27ペプチドを含む融合ペプチド、
― 配列番号130の17アミノ酸合成B27ペプチド、
― 配列番号131の、ボンベシンとB28ペプチドを含む融合ペプチド、および
― 配列番号132のメリチンペプチド、
からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - ドメイン(b)が、
― 配列番号34のヒトグラニュライシンの活性型、
― 配列番号35の15アミノ酸合成溶解性ペプチド、
― 配列番号38のタキプレシンからのペプチド、
― 配列番号39の融合ペプチドボンベシン−マガイニン2、
― 配列番号40のマガイニン2、
― 配列番号42の26アミノ酸ハイブリッドペプチドセクロピン−メリチン、
― 配列番号53のビスコトキシンA3(VtA3)、
― 配列番号56の、EGFインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む融合ペプチド、
― 配列番号129の、ボンベシンとB27ペプチドを含む融合ペプチド、
― 配列番号130の17アミノ酸合成B27ペプチド、
― 配列番号131の、ボンベシンとB28ペプチドを含む融合ペプチド、および
― 配列番号132のメリチンペプチド、
からなる群から選択される強い正電荷を有するペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - ドメイン(b)が、
― 配列番号36のピロスリン1、
― 配列番号37のピロスリン5、
― 配列番号41の14アミノ酸合成溶解性ペプチド、
― 配列番号43の27アミノ酸ペプチドFFhCAP18、
― 配列番号44のBAMP−28ペプチド、
― 配列番号45の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームCのアナログ、
― 配列番号46の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームAのアナログ、
― 配列番号47の、Entamoeba histolyticaからの溶解性ペプチドのアイソフォームBのアナログ、
― 配列番号48の、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのHA2ドメインのフラグメント、
― 配列番号54のヒトパーフォリンの活性フラグメント、
― 配列番号55のBacillus thuringensisのパラスポリン2、
― 配列番号125の、KLLKモチーフを有する合成溶解性ペプチドとPDGF受容体のアンタゴニストであるペプチドを含む、融合タンパク質、
― 配列番号126のプレウロシジンアナログ、
― 配列番号127のプレウロシジンアナログ、および
― 配列番号128の合成溶解性ペプチド、
からなる群から選択される両親媒性αヘリックスを有するペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - ドメイン(b)が、ホスホリパーゼ、溶血素、および/または細胞溶解素の群から選択される酵素活性を有するペプチド、好ましくは、
― 配列番号49の、ホスホリパーゼC活性を有する、Clostridium perfringensからのα毒素のN末端ドメイン、
― 配列番号50のリステリオリシンO、
― 配列番号51のホスホリパーゼPC−PLC、および
― 配列番号52のイクイナトキシンEqTx−II、
からなる群から選択されるペプチドである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - ドメイン(a)とドメイン(b)の間、または複数のドメイン(b)の間に、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列、ウロキナーゼuPAにより認識される配列、およびフューリンにより認識される配列、およびネイティブフューリンにより認識される配列から選択される、プロテアーゼ切断部位を含有するドメイン(c)を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列が、Pro Leu Gly Leu Ala Glyであり、ウロキナーゼuPAにより認識される配列が、Arg Val Val Argであり、フューリンにより認識される配列が、Arg Lys Lys Argであり、およびネイティブフューリンにより認識される配列が、Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln LeuまたはHis Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Glnである、請求項8に記載の融合タンパク質。
- ドメイン(c)が、互いに隣接して位置する、メタロプロテアーゼMMPにより認識される配列と、ウロキナーゼuPAにより認識される配列の組み合わせである、請求項8または9に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、ドメイン(b)のエフェクターペプチドが、輸送ドメイン(d)にさらに結合されており、該輸送ドメイン(d)が、以下:
―(d1)6、7、8、9、10または11個のHis残基を含む、細胞膜を通って輸送するポリヒスチジン配列、および
―(d2)6、7、8、9、10または11個のArg残基からなる、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列、
―(d3)PD4輸送ドメイン(タンパク質形質導入ドメイン4)Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala、
―(d4)トランスフェリン受容体結合配列Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Proからなる輸送配列、および
―(d5)PD5輸送ドメイン(タンパク質形質導入ドメイン5、TATタンパク質)Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg、
およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、前記融合タンパク質。 - 配列(d)が、エフェクターペプチドドメイン(b)のC末端またはN末端に位置する、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 輸送ドメイン(d)が、ドメイン(b)とドメイン(c)の間、またはドメイン(a)とドメイン(c)の間、または2つのドメイン(c)の間に位置する、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 配列(d)が、融合タンパク質のC末端に位置する、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 2つの(c)ドメインの間に、Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu GlyおよびAla Ser Gly Cys Gly Pro Gluから選択される、PEG分子の付着のためのリンカーであるドメイン(d)を含む、請求項8〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- フレキシブルな立体リンカーをドメイン(a)、(b)、および/または(c)の間にさらに含む、請求項8〜15のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 立体リンカーが、Gly Gly、Gly Gly Gly、Gly Ser Gly、Gly Gly Gly Gly Ser、Gly Gly Gly Gly Gly Ser、Gly Gly Ser Gly Gly、Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly、Gly Gly Gly Gly Ser Gly、Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser、Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly、Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly、Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys、Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys、Ser Gly Gly、単一のグリシン残基Gly、および単一のシステイン残基Cys、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質:配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号91;配列番号92;配列番号93;配列番号94;配列番号95;配列番号96;配列番号97;配列番号98;配列番号99;配列番号100;配列番号101;配列番号102;配列番号103;配列番号104;配列番号105;配列番号106;および配列番号107。
- 組み換えタンパク質である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列。
- E. coliにおける遺伝子発現について最適化された、請求項20に記載のポリヌクレオチド配列。
- 以下からなる群から選択される、請求項21に記載の配列:配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;配列番号71;配列番号72;配列番号73;配列番号74;配列番号75;配列番号76;配列番号77;配列番号78;配列番号79;配列番号80;配列番号81;配列番号82;配列番号83;配列番号84;配列番号85;配列番号86;配列番号87;配列番号88;配列番号89;配列番号108;配列番号109;配列番号110;配列番号111;配列番号112;配列番号113;配列番号114;配列番号115;配列番号116;配列番号117;配列番号118;配列番号119;配列番号120;配列番号121;配列番号122;配列番号123;および配列番号124。
- 請求項20〜22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 請求項23に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- E. coli細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。
- 活性成分としての請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
- 非経口投与用の形態である、請求項26に記載の医薬組成物。
- ヒトを含む哺乳動物における腫瘍性疾患の処置に用いるための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置する方法であって、それが必要な対象に対して、請求項1〜19に記載の融合タンパク質、または請求項26もしくは27に記載の医薬組成物の、抗腫瘍有効量を投与することを含む、前記方法。
- 配列番号56の、EGFインヒビターと合成溶解性ペプチドを含む融合ペプチド、および配列番号125の、PDGFアンタゴニストと合成溶解性ペプチドの融合変異体、からなる群から選択される、ペプチド。
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