RS56758B1 - Antikancer fuzioni protein - Google Patents

Antikancer fuzioni protein

Info

Publication number
RS56758B1
RS56758B1 RS20180036A RSP20180036A RS56758B1 RS 56758 B1 RS56758 B1 RS 56758B1 RS 20180036 A RS20180036 A RS 20180036A RS P20180036 A RSP20180036 A RS P20180036A RS 56758 B1 RS56758 B1 RS 56758B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
domain
sequence
fusion protein
protein
Prior art date
Application number
RS20180036A
Other languages
English (en)
Inventor
Jerzy Szczepan Pieczykolan
Sebastian Dominik Pawlak
Bartlomiej Maciej Zerek
Piotr Kamil Rózga
Original Assignee
Adamed Sp Zoo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adamed Sp Zoo filed Critical Adamed Sp Zoo
Publication of RS56758B1 publication Critical patent/RS56758B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
[0001] Pronalazak se odnosi na polje terapeutskih fuzionih proteina, naročito rekombinantnih fuzionih proteina. Preciznije, pronalazak se odnosi na fuzione proteine koji sadrže fragment sekvence rastvorljivog ljudskog TRAIL proteina i sekvencu peptida koji formira pore u ćelijskoj ili mitohondrijalnoj membrani, farmaceutske sastave koje ih sadrže i njihove upotrebe u terapiji, naročito kao antikancer agensi.
[0002] TRAIL (ligand koji indukuje apoptozu povezan sa faktorom nekroze tumore) protein, pripadnik familije citoksina, takođe poznat kao Apo2L (Apo2-ligand), je potentni aktivator apoptoze u tumorskim ćelijama i ćelijama inficiranim virusima. TRAIL je ligand koji se prirodno javlja u telu. TRAIL protein, njegova aminokiselinska sekvenca, kodirajuća DNK sekvenca i sistemi eksprimiranja proteina su objavljeni prvi put u EP0835305A1.
[0003] TRAIL protein vrši svoju antikancer aktivnost vezujući se za pro-apoptotične površinske TRAIL receptore 1 i 2 (TRAIL-R1/R2) i kasnijom aktivacijom ovih receptora. Ovi receptori, takođe poznati kao DR4 i DR5 (receptor smrti 4 i receptor smrti 5), su članovi porodice TNF receptora i prekomerno su eksprimirani od strane različitih vrsta karcinoma. Aktivacija ovih receptora može izazvati spoljašnji signalni put supresorskog gena p53-nezavisne apoptoze, koja aktiviranom kaspazom-8 dovodi do aktivacije izvršnih kaspaza i time degradacije nukleinskih kiselina. Kaspaza-8, oslobođena nakon aktivacije TRAIL-a, takođe može prouzrokovati oslobađanje skraćenog proteina Bid, koji se prenosi na mitohondrije, gde stimuliše oslobađanje citohroma c, što indirektno pojačava apoptotički signal od receptora smrti.
[0004] TRAIL deluje selektivno na tumorske ćelije, u suštini bez indukovanja apoptoze u zdravim ćelijama koje pokazuju otpornost na ovaj protein. Zbog toga je ogroman potencijal TRAIL-a prepoznat kao antikancer agens koji deluje na širok spektar različitih tipova karcinoma, uključujući hematološke malignosti i čvrste tumore, uz zaštitu normalnih ćelija i potencijalno relativno malo neželjenih efekata.
[0005] TRAIL protein je membranski protein tipa II koji ima dužinu od 281 aminokiselina, i njegova ekstracelularna regija koja sadrži ostatke aminokiselina 114-281 nakon cepanja proteazama, formira rastvorljiv sTRAIL molekul veličine 20 kDa, koji je takođe biološki aktivan. Oba oblika, TRAIL i sTRAIL, mogu da izazovu apoptozu putem interakcije sa TRAIL receptorima prisutnim na ciljanim ćelijama. Jaka antitumorska aktivnost i veoma niska sistemska toksičnost rastvorljivog dela TRAIL molekula pokazali su se koristeći testove ćelijskih linija. Takođe, preliminarne ljudske kliničke studije sa rekombinantnim ljudskim rastvorljivim TRAIL (rhTRAIL) sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara aminokiselinama 114-281 hTRAIL, poznatim pod INN dulanerminom, pokazale su dobru toleranciju i odsustvo toksičnosti koja ograničava dozu. Toksični efekti rekombinantnog TRAIL proteina na ćelije jetre prijavljeni su do sada povezani sa prisustvom modifikacije, tj. polihistidinskih oznaka, dok neotkriveni TRAIL nije pokazao sistemsku toksičnost.
[0006] Fragmenti TRAIL-a kraći od 114-281 takođe se mogu vezati sa membranskim receptorima smrti i indukovati apoptozu preko ovih receptora, na primer, kao što je nedavno objavljeno u EP 1688 498 za rekombinantni kružno permutovani mutant 122-281 hTRAIL.
[0007] Međutim, u daljnjim kliničkim ispitivanjima kod pacijenata stvarna efikasnost TRAIL-a kao monoterapije pokazala se kao niska. Takođe je bila problematična primarna ili stečena otpornost na TRAIL koju pokazuju mnoge ćelije karcinoma (pogledati npr.
WO2007/022214). Otpor može biti posledica različitih mehanizama i može biti specifičan za tip kancera i/ili pacijenta (Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24). Ovaj otpor ograničava korisnost TRAIL-a kao antikancerogenog agensa. Iako mehanizam otpornosti na TRAIL nije potpuno shvaćen, veruje se da se može manifestovati na različitim nivoima TRAP-indukovanog puta aspopoze, koji se kreće od nivoa receptora ćelijske površine do izvršnih kasaza unutar signalnog puta.
[0008] kako bi se prevazišla ova mala efikasnost i otpornost tumora na TRAIL, projektovane su razne kombinovane terapije sa radio- i hemoterapeutskim agensima, što je rezultovalo sinergijskim apoptotskim efektom (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytoksine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, br.
6, 2001, 535-546, Soria JC i dr., J. Clin. Oncology, Vol 28, br.9 (2010), p.1527-1533). Upotreba rhTRAIL-a za lečenje karcinoma u kombinaciji sa odabranim konvencionalnim hemoterapeutskim agensima (paklitaksel, karboplatin) i monoklonskim anti-VEGF antitelima opisana je u VO2009/140469. Međutim, takva kombinacija nužno podrazumeva poznate nedostatke konvencionalne hemoterapije ili radioterapije. Međutim, stanje tehnike nema mnogo podataka koji ukazuju na ukidanje otpornosti ćelija na TRAIL dobijeno fiksiranjem TRAIL proteina sa drugim proteinima ili njihovim fragmentima.
[0009] Štaviše, problem povezan sa terapijom TRAIL-a su izgleda je njegova niska stabilnost i brzo eliminisanje iz tela posle primene.
[0010] Poznato je dejstvo uništavanja ćelija karcinoma i inhibicija tumorske proliferacije kao rezultat dezintegracije (diskontinuiteta) ćelijske membrane ili mitohondrijalne membrane. Takođe postoje pokušaji upotrebe supstanci sa citolitičkim efektom koji mogu da dezintegrišu membrane i kao antikancer terapija i dodatna antikancer terapija.
[0011] Poznati su mnogi prirodni i sintetički peptidi i proteini koji imaju citolitičku aktivnost. Citolitički peptidi su takođe opisani kao peptidi koji formiraju pore ili citolizine. Interakcije peptida koji formiraju pore sa površinom membrane mogu biti bazirane na nespecifičnim elektrostatičkim interakcijama pozitivno naelektrisanog peptida sa negativno naelektrisanom površinom ćelijske membrane.
[0012] Ovi peptidi su uglavnom katjonskog karaktera, tako da su sposobni za elektrostatičke interakcije sa površinama sa pretežno negativno naelektrisanim česticama. Nakon dodira i interakcije citolitičkog peptida sa lipidima na površini ćelije, i posle penetracije unutar ćelije sa lipidima na površini mitohondrijalne membrane, dolazi do prekida kontinuiteta ćelijske membrane, nakon čega sledi formiranje transmembranskih pora malih dimenzija, čime se javlja curenje sadržaja citoplazme, uključujući i jone, izvan ćelije, što dovodi do brzog i nepovratnog elektrolitskog disbalansa u ćeliji, lizi ćelije i smrti.
[0013] Interakcije peptida koji formiraju pore sa površinom membrane mogu takođe uključiti interakcije sa specifičnim receptorima prisutnim na površini.
[0014] Poznati prirodni citolitički peptidi bakterijskog, biljnog ili sisarskog porekla sposobni da formiraju pore u ćelijskoj membrani često se nazivaju hemolizini, jer izazivaju lizu crvenih krvnih zrnaca i drugih eukariotskih ćelija. Ovi toksini uključuju cecropin A i B, aurein 1.2, citropin 1.1, defensin (HNP-2), laktofericin B, tachiplesin, PR-39, citolizine od Enterococcus faecalis, delta hemolizin, toksin difterije, citolizin od Vibrio cholerae, toksin od Actinia equina, granulizin, litične peptide od Streptococcus intermedius, lentiviralne litčne peptide, leukotoksin od Actinobacillus actinomycetemcomitans, magainin, melittin, limfotoksin, enkefalin, paradaksin, perforin (naročito N-terminalni fragment), perfringolizin O (PFO/thta toksin) od Clostridium perfringens i streptolizine. Njihova korisnost kao lekovi ograničena je njihovom sposobnošću da izazovu hemolizu.
[0015] Prirodni citolitički peptidi su opisani, na primer, u R. Smolarczyk i dr., Postępy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368
Postoje takođe poznati sintetički citolitički peptidi koji formiraju pore. Oni su dizajnirani da budu lišeni hemolitičkih osobina, da bude manje imunogeni, ili da imaju površinu koja omogućava visoku specifičnost vezivanja za ćelijske mete kao na primer VEGFR (receptor vaskularnog endotelijalnog faktora rasta) porodicu receptora i receptore EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta) porodice. Oni su često hibridi od fragmenata prirodnih citolitičkih peptida, kao što je hibrid cekropin A fragment i magainin 2 CA (1-8) MA (1-12) fragment ili hibrid cekropin A fragmenta i melitin CAMEL (CA (1-7 ) MEL (2-9)) fragmenta. Postoje takođe poznati sintetički citolitički peptidi D-K4-L2-R9i D-K6-L9, koji se sastoje od aminokiselina lizina, arginina i leucina, čiji deo je u obliku D-aminokiselina. Tu su takođe poznati sintetičke himerni peptidi RGD-4CD(KLAKLAK)2, koji sadrže RGD motiv vezivanja sa integrinom αvβ3i efektorski domen koji se sastoji od D-aminokiselina KLAKLAKKLAKLAK i PTD-5D(KLAKLAK)2koji sadrži PTD-5 motiv koji omogućava penetraciju u ćelije i efektorski domen sastavljen od D-aminokiselina KLAKLAKKLAKLAK (pogledati, na primer, R. Smolarczyk i dr., Postępy Hig. Med.
Dosw., 2009, 63: 360-368). Drugi dobro poznati citolitički sintetički peptidi su opisani, na primer, u Regen i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 566-571, 1989.
[0016] Razaranje membrane koja se javlja nakon vezivanja peptida na membranu može se pojaviti mehanizmom „barel-štapova“ (model barel-štapova), mehanizmom „oblika krofne“ (model toroidalne pore) ili mehanizmom „tepiha“ (pogledati, na primer, R. Smolarczyk i dr., Postępy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368).
[0017] Mehanizam „barel-štapova“ je primećen za amfipatičke peptide sa alfa-heličnom konformacijom dužine od najmanje 23 aminokiseline. Na primer, peptidi koji prouzrokuju razaranje membrane mehanizmom „barel-štapova“ su gramicidin A, alameticin, perforin, pilosulin, sintetički peptidi sa ponovljenim KLAK motivima, katelicidin, peptidi su izolovani iz Entamoeba histolytica, parasporini i cecropini. Peptidi koji uzrokuju uništavanje membrane „modelom toroidnih pora“ uključuju, na primer, melitin i magainin. Na primer, peptidi koji uzrokuju uništavanje membrane pomoću modela „tepiha“ su cecropini A i B.
[0018] Dezintegracija ćelijske membrane sa formiranjem pora može se takođe uzrokovati interakcijom peptida visokog pozitivnog naelektrisanja sa negativno naelektrisanim membranskim komponentama. Takva svojstva pokazuju, između ostalog, granulizini, analozi i derivati melitina, peptidi koji sadrže K(L)xR motiv, takiplezin, bombezin, magainin i viskotoksin.
[0019] Formiranje pora u membrani ciljne ćelije takođe može biti povezano sa enzimskom aktivnošću peptida. Enzimska aktivnost fosfolipaze A prikazana je, na primer, fosfolipazama sa specifičnom aktivnošću fosfodiesteraze protiv fosfatidilholina i sfingomijelina, hemolizinima i citolizinima koji imaju nespecifičnu citolitičku aktivnost ili hemolizinima i citolizinima koji imaju citolitičku aktivnost protiv bioloških membrana koje sadrže, na primer, holesterol. Ova vrsta enzimske aktivnosti koja rezultuje stvaranjem pora u ćeliji ili mitohondrijskoj membrani je ispoljena od strane listeriolizina, ekinatoksina, PC-PLC fosfolipaze i alfa-toksina iz Clostridium perfringens.
[0020] Postoje takođe poznati konjugati i himere peptida koji formiraju pore sa domenima sposobnim da ciljaju na tumorske ćelije. Za ciljanje, koriste se antigeni, ugljeni hidrati ili receptori faktora rasta, prekomerno eksprimirani na površini tumorskih ćelija. Ciljana isporuka pruža visok nivo peptida koji formira pore na površini ćelije što je neophodno za citolitičku aktivnost.
[0021] Upotreba ciljanih aktinoporina koji formiraju pore je opisana u Panchal RG. i dr., Poreforming proteins and their application in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2002, 3:99-115; Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells. Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252 i u Hoskin DW, Ramamoorthy A: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778:357-87.
[0022] Takođe je poznato da peptidi koji formiraju pore i proteine mogu biti obogaćeni sa mogućnošću usmeravanja antigena i receptora povezanih sa tumorom pomoću odgovarajuće genetske modifikacije kao i hemijskog udruživanja sa odgovarajućim ligandima ili antitelima. Takve modifikacije su opisane za d-endotoksin Bacillus thuringiensis, ekuinatoksin II iz Actinia equina, siholizin I iz Stichodactyla helianthus i toksin difterije iz Corynebacterium diphtheriae (Soletti RC., Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone poreforming proteins in ljudsk glioblastoma cells. Anti-Cancer Drugs 2008, 19:517-525;
Pederzolli C,: Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin-II, a cytolysin from a sea anemone. Bioconjugate Chem 1995, 6:166-173, van der Spek JC.: Fusion protein toxins based on diphtheria toxin: Selective targeting of growth factor receptors of eukaryotic cells. Appl Chimeric Genes Hybrid Proteins Pt B 2000, 327:239-249).
[0023] Takođe je opisan fuzioni protein koji se sastoji od stiholizinskog toksina I koji formira pore i monoklonskog antitela usmereno protiv antigena specifičnogza tumor C2 i njegova korisnost u lečenju u modelu ćelijske linije raka debelog creva (Tejuca M. i dr., Construction of an immunotoxin with the pore forming protein St1 and/or C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line, Int. Immunopharmacol. 2004, 4:731-744). Takođe je opisan broj fuzionih proteina koji sadrže difterijski toksin i interleukin-2 ili EGF i njihov potencijal da uništi ćeliju koja prekomerno eksprimira ciljane receptore (Murphy JR, van der Spek JC, Targeting diphtheria-toxin to growth-factor receptors, Semin Cancer Biol 1995, 6:259-267).
[0024] Takođe je poznata upotreba mesta cepanja prepoznata od specifičnih proteazama u molekulima fuzionih proteina koji sadrže citolitičke peptide kako bi se omogućilo oslobađanje efektorskih proteina u tumorskom okruženju i, posledično, njihova internalizacija u tumorske ćelije. Na primer, Panchal R. i dr. (Nat Biotechnol 1996, 14:852-856) objavili su alfa-hemolizine koji u svom redosledu sadrže mesto cepanja koje prepoznaje katepsin B, koji se aktivira proteazom prisutnom u tumorskom okruženju.
[0025] Postoje takođe poznati modifikovani proaerolizini (PA), neaktivni prekursori bakterijskih citolitičkih proteina koji formiraju pore, aktivirani kada se cepaju od strane proteaza ćelija raka prostate (PSA) (Williams S.A. i dr., JNCI J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (5): 376-385).
[0026] US5817771B1 objavljuje konjugate, uključujući fuzione proteine, citolitičke peptide koji formiraju pore, sa antitelom ili antigenom kao elementom koji se selektivno vezuje za tumorsku ćeliju, i veznike koji omogućavaju selektivnu aktivaciju citolitičkog peptida u okruženju tumora, kao što su, na primer mesto cepanja, prepoznato od strane enzima kao što su proteaze, naročito proteaze prekomerno eksprimirane u tumorskom okruženju.
[0027] Barua i dr. (Cancer Letters 293 (2010) 240-253) su objavili da su ćelijske linije raka prostate koje su otporne na TRAIL i neosetljive na tretman sa antitelima agonista receptora smrti DR4 i DR5 postaju osetljive na ova antitela nakon pred-tretmana ovih ćelija sa sintetičkim katjonskim amfipatičkim litičkim peptidom KLA koji sadrži KLAK sekvence.
[0028] Predmetni pronalazak pruža fuzione proteine sa antikancer svojstvima koji sadrže domen izveden iz TRAIL-a i domen citolitičkog efektorskog peptida sa svojstvima formiranja pora na ćelijskim i/ili mitohondrijskim membranama ćelija sisara.
[0029] Svaki od dva domena proteina pronalaska ima različite funkcije. Zbog prisustva domena izvedenog iz hTRAIL-a, proteini prema pronalasku su selektivno usmereni na ćelije kancera, pri čemu elementi proteina vrše svoje efekte. Posebno, TRAIL domen nakon vezivanja sa ćelijom može vršiti aktivnost aktiviranja apoptoze, i efektorski peptida je aktivnost formiranja pora u ćelijskoj i/ili mitohondrijskoj membrani i izazivajući lizu ćelija raka.
[0030] Dostavljanje proteina pronalaska u tumorsko okruženje omogućava minimizovanje toksičnosti i neželjenih efekata na zdravim ćelijama u telu, kao i smanjenje učestalosti primene leka. Pored toga, ciljana terapija korišćenjem proteina prema pronalasku omogućava da se izbegne problem slabe efikasnosti prethodno poznatih nespecifičnih terapija zasnovanih na formiranju pora u ćeliji ili mitohondrijskoj membrani uz upotrebu biljnih ili bakterijskih toksina uzrokovanih visokom toksičnost i neophodnosti primene visokih doza.
[0031] Ispostavilo se da su u mnogim slučajevima fuzioni proteini pronalaska mnogo snažniji od rastvorljivog hTRAIL-a i njegovih varijanti uključujući fragment sekvence.
[0032] Do sada, efektorski peptidi koji se koriste u fuzionom proteinu prema pronalasku nisu korišćeni u medicini kao takvi zbog nepovoljne kinetike, brze degradacije nespecifičnim proteazama i akumulacije u telu uzrokovane nedostatkom odgovarajuće sekvence aktivacije puteva, što je neophodno kako bi se omogućilo pravilno delovanje efektorskog peptida na ciljanom mestu. Uvođenje efektorskih peptida u fuzioni protein dozvoljava njihovu selektivnu isporuku do mesta gde je njihova aktivnost poželjna. Osim toga, vezivanje efektorskog peptida povećava masu proteina, što rezultuje produženim poluživotom i povećanim zadržavanjem proteina u tumoru i povećanom efikasnošću.
[0033] Noviji fuzioni proteini takođe imaju najmanje redukovanu ili ograničenu, ili čak suštinski eliminisanu hemolitičku aktivnost u poređenju sa svojim pojedinačnim prirodnim citolitičkim peptidima.
[0034] Pored toga, u mnogim slučajevima, novi fuzioni proteini takođe prevazilaze prirodnu ili indukovanu otpornost na TRAIL. Najverovatnije, prevazilaženje otpornosti je usled destabilizacije potencijala ćelijske membrane kao rezultat fuzionog proteina koji se vezuju za lipide ćelije ili mitohondrijalne membrane i stvaranje pora, što uzrokuje curenje divalentnih jona izvan ćelije. Kao posledica vezivanja mitohondrijalne membrane za lipide, dolazi do otpuštanja citokroma C, SMAC/Diablo proteina i AIF faktora u citoplazmu, što uzrokuje proapoptotičnu aktivaciju kaspaze u pogođenoj ćeliju. Degradacija mitohondrijalnih membrana dovodi i do aktivacije kaspaze-9, što dovodi do indukcije apoptoze.
Opis slika.
[0035]
Slika 1 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Cby.Cgfoxn1(nu)/J miševa opterećenih karcinomom pluća A549 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 2 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Cby.Cg-foxn1(nu)/J miševa opterećenih karcinomom pluća A549 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 3 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pluća A549 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 4 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pluća A549 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 5 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pluća NCI-H460-Luc2 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 6 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pluća NCI-H460-Luc2 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 7 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Cby.Cgfoxn1(nu)/J miševa opterećenih karcinomom prostate PC3 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 8 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Cby.Cg-foxn1(nu)/J miševa opterećenih karcinomom prostate PC3 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
Slika 9 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pankreasa PANC-1 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 10 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pankreasa PANC-1 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 11 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva HCT116 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 12 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva HCT116 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 13 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva SV620 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 16<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 14 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva SV620 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 16<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 15 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva Colo205 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281;
1
Slika 16 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva Colo205 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 17 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih sarkomom uterusa MES-SA/Dk5 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 18 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih sarkomom uterusa MES-SA/Dk5 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 19 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pankreasa MIA Paca-2 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 20 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom pankreasa MIA Paca-2 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 21 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva HCT116 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 22 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih karcinomom debelog creva HCT116 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 23 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih hepatocelularnim karcinomom HepG2 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 24 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih hepatocelularnim karcinomom HepG2 tretiranih fuzionim proteinom iz pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; Slika 25 prikazuje promene zapremine tumora (% početne faze) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih hepatomom PLC/PRF/5 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281; i
Slika 26 prikazuje vrednosti inhibicije rasta tumora (% TGI) kod Crl:SHO-PrkdcscidHrhr miševa opterećenih hepatomom PLC/PRF/5 tretiranih fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>u poređenju sa rhTRAIL114-281.
Detaljan opis pronalaska
[0036] Pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji sadrži:
• domen (a) koja je funkcionalni fragment sekvence rastvorljivog hTRAIL proteina, pri čemu je hTRAIL proteinska sekvenca prikazana kao SEQ. br.90, čiji fragment počinje sa aminokiselinom na položaju iz opsega hTRAIL95 do hTRAIL121, inkluzivno, i završava se aminokiselinom hTRAIL281 ili homologom navedenog funkcionalnog fragmenta koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence, poželjno 85% identičnosti, pri čemu je pomenuti funkcionalni fragment ili njegov homolog sposoban da indukuje apoptotički signal u sisarskim ćelijama nakon vezivanja za svoje receptore na površini ćelija, i
• barem jedan domen (b) koji je sekvenca citolitičkog efektorskog peptida sa amfipatičkom alfa-spirala konformacijom koja formira pore u ćelijskoj membrani, gde je sekvenca domena (b) vezana na C-terminusu ili N-terminusu domena (a).
[0037] Izraz „peptid“ u skladu sa pronalaskom treba shvatiti kao molekul sagrađen od mnoštva aminokiselina povezanih zajedno putem peptidne veze. Prema tome, izraz „peptid“ prema pronalasku uključuje oligopeptide, polipeptide i proteine.
[0038] U ovom pronalasku, sekvence aminokiselina peptida biće prikazane na konvencionalan način usvojen u struci u pravcu N-terminusa (N-kraj) peptida ka njegovom C-terminusu (C-kraj). Svaka sekvenca će na taj način imati svoj N-terminus na levoj strani i C-terminus na desnoj strani svoje linearne prezentacije.
[0039] Izraz „funkcionalno rastvorljiv fragment sekvence rastvorljivog hTRAIL proteina“ treba shvatiti kao označavanje bilo kog takvog fragmenta rastvorljivog hTRAIL proteina koji je sposoban da indukuje apoptotički signal u sisarskim ćelijama nakon vezivanja za svoje receptore na površini ćelije.
[0040] Stručnjak će takođe ceniti da je postojanje najmanje 70% ili 85% homologije TRAIL sekvence poznato u struci.
[0041] Treba razumeti da domen (b) efektora peptida u fuzionom proteinu prema pronalasku nije ni protein hTRAIL niti deo ili fragment hTRAIL proteina.
[0042] Fuzioni protein iz ovog pronalaska sadrži bar jedan domen (b) efektorskog peptida, koji je pričvršćen na C-terminusu i/ili na N-terminusu domena (a).
[0043] Po sekvenci hTRAIL smatra se poznata sekvenca hTRAIL objavljena u bazi podataka GenBank pod pristupnim brojem P505591 kao i u EP0835305A1 i prikazana u Redosledu prikazivanja ovog pronalaska kao SEQ. br.90.
[0044] U određenoj realizaciji, domen (a) je fragment TRAIL sekvence, počevši od aminokiseline iz opsega hTRAIL95 do hTRAIL121, uključujući i završavajući sa aminokiselinom TRAIL 281.
[0045] Posebno, domen (a) može biti izabran iz grupe koju čine sekvence koje odgovaraju hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 i hTRAIL121-281. Biće očigledno stručnjacima u oblasti da hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 i hTRAIL121-281 predstavljaju fragment ljudskog TRAIL proteina koji počinje sa aminokiselinom sa brojem 95 , 114, 115, 116, 119 i 121, odnosno završava se sa poslednjom aminokiselinom 281, u poznatoj sekvenci TRAIL-a.
[0046] U drugoj posebnoj realizaciji, domen (a) je homolog funkcionalnog fragmenta rastvorljive TRAIL proteinske sekvence koja počinje na poziciji aminokiselina nižoj od hTRAIL95 i završava se na aminokiselini hTRAIL281, čija je sekvenca najmanje 70%, poželjno 85%, identična originalnoj sekvenci.
[0047] U specifičnim varijantama ovog domena (a) je homolog fragmenta izabran iz grupe koju čine sekvence koje odgovaraju hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 i hTRAIL121- 281.
[0048] Treba razumeti da je homolog TRAIL fragmenta varijacija/modifikacija aminokiselinske sekvence ovog fragmenta, gde je izmenjena najmanje jedna aminokiselina, uključujući 1 aminokiselinu, 2 aminokiseline, 3 aminokiseline, 4 aminokiseline, 5 aminokiselina, 6 aminokiselina i ne više od 15% aminokiselina, i gde fragment modifikovane sekvence ima očuvanu funkcionalnost TRAIL sekvence, tj. sposobnost da se veže na receptore smrti na površini ćelije i indukuje apoptozu u ćelijama sisara. Modifikacija
1
aminokiselinske sekvence može uključivati, na primer, supstituciju, brisanje i/ili dodavanje aminokiselina.
[0049] Poželjno, homolog TRAIL fragmenta sa modifikovanim sekvencom pokazuje modifikovan afinitet za receptore smrti DR4 (TRAIL-R1) ili DR5 (TRAIL-R2) u poređenju sa prirodnim fragmentom TRAIL-a.
[0050] Izraz „modifikovani afinitet“ odnosi se na povećan afinitet i/ili afinitet sa izmenjenom selektivnošću receptora.
[0051] Poželjno, homolog fragmenta TRAIL koji ima modifikovanu sekvencu pokazuje povećan afinitet za receptore smrti DR4 i DR5 u poređenju sa prirodnim fragmentom TRAIL-a.
[0052] Posebno poželjno, homolog fragmenta TRAIL koji ima modifikovanu sekvencu pokazuje povećan afinitet za receptor smrti DR5 u poređenju sa receptorom smrti DR4, tj. povećanu selektivnost DR5/DR4.
[0053] Takođe, poželjno je da homolog fragmenta TRAIL koji ima modifikovanu sekvencu pokazuje povećanu selektivnost prema receptorima smrti DR4 i/ili DR5 u odnosu na afinitet prema receptorima DR1 (TRAIL-R3) i/ili DR2 (TRAIL- R4).
[0054] Modifikacije TRAIL-a rezultuju povećanim afinitetom i/ili selektivnošću prema receptorima smrti DR4 i DR5 su poznati stručnjacima u oblasti. Na primer, Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selektivne varijante ligand koji indukuje apoptozu povezan sa faktorom nekroze tumore (TRAIL) dobijene strukturnim dizajnom. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8, opisuju mutaciju D218H uz povećanu selektivnost prema DR4, i Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generisanje novih TRAIL mutanata DR5-A i DR5-B sa poboljšanom selektivnošću na receptor smrti 5, Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87, opisuju mutaciju D269H koja ima smanjen afinitet prema DR4. hTRAIL mutanti koji rezultujeju povećanim afinitetom prema jednom receptoru odabranom od DR4 i DR5 u poređenju sa DR1 i DR2 receptorima i povećanim afinitetom prema DR5 receptoru u poređenju sa DR4 takođe su opisani u VO2009077857 i VO2009066174.
[0055] Odgovarajuće mutacije su jedna ili više mutacija u položajima prirodnog hTRAL izabranog iz grupe koju čine aminokiseline 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 i 251, posebno mutacije koje uključuju supstituciju aminokiseline sa bazičnom aminokiselinom kao što su lizin, histidin ili arginin, ili kiselu aminokiselinu kao što je glutaminska kiselina ili aspargična kiselina. Posebno se mogu navesti jedna ili više mutacija izabrane iz grupe koju čine G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E i K251Q, kako je opisano u VO2009066174.
[0056] Odgovarajuće mutacije su takođe jedna ili više mutacija u položajima prirodnog hTRAILa odabrane iz grupe koju čine aminokiseline 195, 269 i 214, posebno mutacije koje uključuju supstituciju aminokiseline sa baznom aminokiselinom, kao što su lizin, histidin ili arginin. Posebno se mogu navesti jedna ili više mutacija izabrane iz grupe koju čine D269H, E195R i T214R, kako je opisano u VO2009077857.
[0057] U određenoj realizaciji, domen (a) koji je homolog fragmenta hTRAIL, izabran je od D218H mutanta prirodne TRAIL sekvence, kako je opisano u VO2009066174, ili Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H mutant matične TRAIL sekvence, kako je opisano u Gasparian ME i dr. Generisanje novih TRAIL mutanata DR5-A i DR5-B sa poboljšanom selektivnošću na receptor smrti 5, Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87.
[0058] Domen (a), tj. fragment TRAIL, je domen koji je odgovoran za vezivanje konstrukcije fuzionog proteina na receptore smrti na površini ćelije. Osim toga, domen (a) će nakon vezivanja izvršiti svoju poznatu agonističku aktivnost, tj. aktivaciju eksteričkih puteva apoptoze.
[0059] Domen (b) fuzionog proteina prema pronalasku je domen efektorskog peptida sa citolitičkom aktivnošću prema eukariotskoj ćeliji.
1
[0060] U određenim aspektima fuzionog proteina pronalaska, efektorski peptid domena (b) fuzionog proteina je peptid koji ima aktivnost formiranje pora protiv ćelija karcinoma, izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ. br.34 do SEQ. br.56 i SEQ. br.125 do SEQ. br.
132.
[0061] Za peptid sa citolitičkom aktivnošću podrazumeva se peptid koji ima sposobnost formiranja pora u ćelijskoj membrani, i nakon penetracije u ćeliju, takođe u mitohondrijalnoj membrani, čime se narušava kontinuitet membrane. Kao rezultat poremećaja membrane, dolazi do curenja sadržaja citoplazme, uključujući i jone, izvan ćelije, što uzrokuje brzu i nepovratnu elektrolitsku neravnotežu u ćeliji i njegovo uništenje (lizu ćelija).
[0062] Sposobnost peptida da formira pore u ćelijskoj ili mitohondrijskoj membrani i time izaziva lizu ćelija može se odrediti postupkom ispitivanja permeabilizacije ćelijskih membrana poznatih stručnjacima u struci, na primer merenjem oslobađanja od ćelija intracelularnih supstanci koje su ranije bile primenjene na ćeliju, npr. ATP ili radioaktivno označenog markera ili merenjem uzimanja boje, kao što je tripan plava, koje se ne javlja kada su ćelije netaknute.
[0063] Citolitički efektorski peptid pronalaska može biti ili prirodni peptid ili sintetički peptid.
[0064] Efektorski peptid domena (b) fuzionog proteina prema pronalasku je peptid koji formira pore, koji poseduje amfipatičku alfa-spirala konformaciju koja omogućava interakcije sa biološkim membranama.
[0065] Primerne sekvence efektorskog peptida u ovom otelotvorenju su označene kao SEQ. br. 36 (pilosulin-1), SEQ. br.37 (pilosulin-5), SEQ. br.41 (14- aminokiselinski sintetički litički peptid), SEQ. br.43 (27-aminokiselinski peptid FF/CAP-18), SEQ. br.44 (BAMP-28 peptid), SEQ. br.45 (analog izoforma C litičkog peptida od Entamoeba histolytica), SEQ. br.
46 (analog izoforma A litičkog peptida od Entamoeba histolytica), SEQ. br.47 (analog izoforma B litičkog peptida od Entamoeba histolytica), SEQ. br.48 (fragment HA2 domena hemaglutinina virusa gripa), SEQ. br.54 (aktivni fragment ljudskog perforina), SEQ. br.55 (parasporin-2 od Bacillus thuringensis), SEQ. br.125 sintetički fuzioni peptid sa KLLK
1
motivom, SEQ. br.126 i SEQ. br.127 (pleurocidin analozi), SEQ. br.128 sintetički peptid sa motivom KLLK.
[0066] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću za formiranje pora protiv eukariotskih ćelije može biti peptidni pilosulin-1, koji je katjonski molekul izveden iz otrova australijskog mrava Myrmecia Pilosula. Pilosulin 1 je peptid sa visokim sadržajem lizina i arginina koji se redovno ponavlja u nizu. Zbog visokog sadržaja ovih aminokiselina, peptid ima jako pozitivno naelektrisanje koji dozvoljava njegovu selektivnu interakciju sa membranama ćelija karcinoma i formiranje pora kroz mehanizam „barel-šipka“ (Kourie i dr., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063 - 1087, 2000).
[0067] Posebno, takav efektorski peptid je peptid 56-aminokiselina prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.36.
[0068] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću za formiranje pora protiv eukariotskih ćelije može biti peptid pilosulin-5, odgovoran za jonske interakcije sa ćelijskom membranom koja dovodi do stvaranja pora, a kao posljedica inhibicije rasta tumora. Pilosulin 5 je peptid koji pripada familiji pilosulina koja je izvedena iz otrova australijskog mrava Myrmecia Pilosula. Ovaj peptid ima u svojoj strukturi ciklično ponovljen obrazac aminokiselinskog lizina, alanina i aspartinske kiseline, dajući pozitivno naelektrisanje, koje može potencirati interakcije sa površinama tumorskih ćelija.
[0069] Posebno, takav efektorski peptid je peptid 100-aminokiselina prikazan u priloženom listingu sekvenci ka oSEQ. br.37.
[0070] Drugi citolitički efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću protiv eukariotske ćelije može biti sintetički litički peptid. Sintetički peptidi formule (KLAKKLA)n(gde je n broj ponavljanja motiva) kao amfipatički i alfa-spirala proteini nakon penetracije u ćeliju selektivno se akumuliraju u negativno naelektrisanu mitohondrijsku membranu, uzrokujući stvaranje pora i destabilizaciju elektrostatičkog potencijala mitohondrija, čime se selektivno eliminišu ćelije izabranih ćelijskih linija karcinoma (Javadpour et al, J Med Chem, 39:3107-13, 1996).
1
[0071] Posebno, takav efektorski peptid je je 14-aminokiselinski peptid predstavljen u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.41.
[0072] Drugi efektorski peptid domena (b) sa citolitičkom aktivnošću protiv eukariotske ćelije može biti drugi sintetički litički peptid koji dezintegriše ćelijsku membranu na način nalik deterdžentu. (Papo N, Shai Y. Novi litički peptidi na osnovi D,L-amfipatičkog spirala motiva poželjno ubijaju tumorske ćelije u poređenju sa normalnim ćelijama.2003 Aug 12;42(31):9346-54).
[0073] Posebno, takav efektorski peptid je 17-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.128.
[0074] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora je peptid FF/CAP18 opisan od strane Isogai E. opisao u „Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of ljudsk CAP18 Peptides to Genus Leptospira“, The Journal of Applied Research, Vol.4, br.1, 2004, 180-185). FF/CAP18 je analog 27-aminokiselina C-terminalne sekvence ljudskog katelicidina hCAP18109-135, koji je modifikovan zamenom 2 aminokiselinskih ostataka sa fenilalaninom. FF/CAP18 ima snažan katjonski karakter, povećan u odnosu na prirodnu sekvencu zbog inkorporirane modifikacije i snažno se vezuje za eukariotske ćelijske membrane. Kada se vezuje na površinu membrane, FF/CAP18 oblikuje kanale i jonske pore, što dovodi do destabilizacije elektrostatičke ravnoteže ćelija. Osim toga, nakon penetracije unutar ćelije, analog se gradi u mitohondrijsku membranu kako bi formirao jonske kanale, čime se destabilizuje elektrostatički potencijal mitohondrija i dovodi do oslobađanja iz mitohondrija do citosolnih faktora kao što su citokrom C, SMAC/Diablo ili AIF faktor, što inicira proces apoptoze.
[0075] Posebno, takav efektorski peptid je 27-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.43.
[0076] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora je peptid BAMP-28 sa jakim pozitivnim naelektrisanjem koji pripada porodici katetilidina. Ovaj peptid je takođe strukturalni analog ljudskih histatina, grupa od 12 peptida mase ispod 4 kDa proizvedenih od strane ćelija pljuvačnih žlezda i koji pokazuju antibakterijske i antifungalne osobine (W. Kamysz i dr., Histatyny - biatka liniowe bogate w histydynę, Nowa Stomatologia 2004). N-
1
terminalni domen BAMP-28 peptida je snažno pozitivno naelektrisan i odgovoran je za priključivanje na ćelijsku membranu, dok je C-terminalni deo odgovoran za citotoksičnu aktivnost. (Hugosson, M., D. i dr., 1994). Antibakterijski peptidi i mitohondrijske predsekvence utiču na mitohondrijsko spajanje, respiraciju i uvoz proteina. Eur. J. Biochem.
223:1027-1033.). Mehanizam aktivnosti peptida BMAP-28 prvenstveno se zasniva na formiranju pora u ćelijskim i mitohondrijskim membranama (A. Risso i dr., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p.1926-1935).
[0077] Posebno, takav efektorski peptid je 27-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.44.
[0078] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora je analog izoforma A litičkog peptida od Entamoeba histolytica odgovornog za akumulaciju na površini ćelija, što dovodi do formiranja pora, što kao posledicu dovodi do inhibicije rasta tumora.
Identifikovane su tri izoforme A, B i C peptida od Entamoeba histolytica, locirane u granuloj citoplazmi parazita. Ovo su polipeptidi 77-aminokiselina stabilizovani sa tri sulfidna mosta, koji sadrže u sekundarnoj strukturi četiri amfipatička spiralaa (Leippe, M et al EMBO J.11, 3501-3506, 1992). Ovi peptidi imaju lična svojstva protiv eukariotskih ćelija (Leippe, M. and Müller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994). Treća spirala u strukturi ovih peptida ima dužinu pogodnu za penetraciju ćelijske membrane i stvaranje pora. Bazirano na aminokiselinskim sekvencama koje sadrže samo treća spirala domen sve tri izoforme, izgrađena je serija analognih sintetičkih peptida (A3, B3 i C3) koji imaju formiranje pora i citotoksičnu aktivnost protiv ćelijskih linija karcinoma čoveka i karakterisani su niskom hemolitičkom aktivnosti (Andrä i dr., FEBS Letters 385: 96-100,1996).
[0079] Posebno, takav efektorski peptid je 24-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.45.
[0080] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelije je analog izoforma B liitčkog peptida od Entamoeba histolytica.
1
[0081] Posebno, takav efektorski peptid je 24-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.46.
[0082] Još jedan efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelija je analog izoforma C litičkog peptida od Entamoeba histolytica.
[0083] Posebno, takav efektorski peptid je peptid 24-aminokiselina predstavljen u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.47.
[0084] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću za formiranje pora protiv eukariotskih ćelija je homolog 20-aminokiselinskog N-terminalnog fragmenta, tzv. „fuzioni peptid“, HA2 domen hemaglutinina virusa gripa, koji je odgovoran za interakciju virusnog kapsida sa ćelijskom membranom domaćina (interkalacija) što rezultuje stvaranjem pora u ćelijskoj membrani domaćina. Hemaglutinin (HA) virusa gripa je homotrimerni glikoprotein odgovoran za fuziju virusnog kapsida sa ćelijskom membranom domaćina. Dva domena mogu se razlikovati u strukturi proteina, HA1 odgovoran za vezivanje receptora i H2 odgovoran za interakcije sa ćelijskom membranom. U strukturi HA2 domena samo N-terminalni deo (20 aminokiselina), tzv. „fuzioni peptid“, direktno se interkalira u strukturu ćelijske membrane (Dürrer P i dr., J Biol Chem 271:13417-13421, 1996). Strukturna analiza homologa fuzionog peptida pokazala je da je njegova aktivnost povezana sa konformacijskim promenama koje dovode do formiranja amfipatičkih alfa spiralaa, koji su sposobni za perforaciju endozomske membrane (Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990). Zbog toga, derivati „fuzionog peptida“ mogu se koristiti kao efikasni nosači biološki aktivnih supstanci koji pružaju efikasan i brz „izlazak“ iz endosoma.
[0085] Posebno, takav efektorski peptid je 12-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.48.
[0086] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelija je peptid koji je aktivni fragment ljudskog perforina. Upotreba proteina ljudskog porekla koji su „nevidljivi“ imunom sistemu, uključujući i ljudski perforin, može rešiti problem ograničene kliničke korisnosti proteinskih himera koje sadrže toksine bakterijskog, životinjskog ili biljnog porekla zbog generisane jake imunogenosti (Frankel AE. Reducing the immune response to immunotoxin. Clin Cancer Res.2004 Jan 1;10(1 Pt 1):13-5). N-
2
terminalni 34-aminokiselinski fragment ljudskog perforina koji formira nespecifične pore u ćelijskoj membrani zadržava selektivnu citotoksičnu aktivnost celog proteina (Liu CC, Walsh CM, Young JD. Perforin: structure and function. Immunol Today.1995 Apr;16(4):194-201). Perforinski fragment koji je spojen sa antitelom koje cilja na ćelije karcinoma zadržava selektivnu citotoksičnu aktivnost celog proteina (Wan L. Eksprimiranje, pročišćavanje i ponovno savijanje novih imunotoksina koji sadrže humanizovan jednolančani fragment varijabilnog antitela protiv CTLA4 i N-terminalni fragment ljudskog perforina. Protein Expr. Purif. 2006 Aug;48(2):307-13. Epub 2006 Mar 9).
[0087] Posebno, takav efektorski peptid je 33-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.54.
[0088] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelija je parasporin-2 od Bacillus thuringensis. Porodica parasporina sastoji se od 13 različitih toksina koji pripadaju podgrupama PS1, PS2-PS3, PS4 (Ohba M. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res. 2009 Jan;29(1):427-33). Parasporin-2 pokazuje specifičnost protiv ćelija karcinoma (MOLT-4, Jurkat, HL60, HepG2, CACO-2) i postoji u obliku 37-kDa protokina aktiviranog prekidanjem proteinaze K dela N i C-terminalnih fragmenata odnosno 51 i 36 aminokiselina. Ključna dejstva parasporina-2 sastoje se od oligomerizacije unutar ćelijske membrane kako bi se formirale pore prečnika od oko 3 nm, što dovodi do povećanja njene propusnosti. Efekti aktivnosti parazporina-2 zavise od vrste testiranih ćelijskih linija i uključuju nastanak tzv. „mehura“ ili izbočina uzrokovanih odlivom citoplazme iz ćelija i njihovom lizom (HepG2 i NIH-3T3 ćelije) ili formiranjem (MOLT-4) (Kitada S. Cytocidal actions of parasporin-2,an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis. J. Biol. Chem.2006 Sep 8;281(36):26350-60). Pored toga, aktivnost parazporina-2 dovodi do uništenja strukture mikrotubula, zapaljenja aktinskih filamenta, fragmentacije mitohondrija i endoplazmičnog retikuluma (Akiba T. Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells. J. Mol. Biol.2009 Feb 13;386(1):121-33).
[0089] Posebno, takav efektorski peptid je 251-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.55.
[0090] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelija je fuzioni protein koji sadrži sintetički litički peptid sa KLLK motivom i peptid koji je antagonist PDGF receptora na površini ćelije. Vezivanje inhibitora PDGF na površini ćelije omogućava lokaciju ličnog peptida na površinu ćelija, a dodatno vezivanje utiče na proliferaciju ćelija i angiogenezu (Ostman A. i dr., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment, Adv. Cancer Res., 2007;97:247-74.)
[0091] Posebno, takav efektorski peptid je 39-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.125.
[0092] Fuzioni peptid predstavljen u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.125 i fuziona varijanta PDGF antagonista i sintetičkog litičkog peptida SEQ. br.125 je nova i nije ranije opisana.
[0093] Drugi efektorski peptid domena (b) sa aktivnošću formiranja pora protiv eukariotskih ćelija je protein koji je analog pleurocidina. Pleurocidini su katjonski α-spiralni proteini koji međusobno deluju sa ćelijskom membranom (Cole AM i dr., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. J Biol Chem.
1997 May 2;272(18):12008-13). Pleurocidin-slični peptidi su aktivni protiv ćelija karcinoma dojke, uključujući ćelije koje su otporne na lekove i sporo rastuće ćelije raka dojke. (Hilchie AL i dr., Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. Breast Cancer Res. 2011 Oct 24;13(5):R102).
[0094] Posebno, takvi efektorski peptidi su 25-aminokiselinski peptid prikazan u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.126 i 26 aminokiselinski peptid predstavljen u priloženom listingu sekvenci kao SEQ. br.127.
[0095] Nakon vezivanja za TRAIL receptore prisutne na površini ćelija karcinoma, fuzioni protein će imati dvostruki efekat. Domen (a), koji je funkcionalni fragment TRAIL-a ili njegovog homologa sa očuvanom funkcionalnošću, vršiće svoju poznatu agonističku aktivnost, tj. vezivanje za receptore smrti na površini ćelije i aktiviranje eksteričkih puteva apoptoze. Efektorski peptid domen (b) fuzionog proteina će moći potencijalno da izvrši svoju aktivnost ekstracelularno ili intracelularno paralelno sa aktivnošću TRAIL domena.
[0096] U fuzionom proteinu prema pronalasku, antitumorska TRAIL aktivnost se potencira formiranjem pora u ćeliji ili mitohondrijskoj membrani koja dovodi do poremećaja elektrostatičkog naelektrisanja ćelije, curenja jona iz citoplazme ili destabilizacije elektrostatičkog potencia mitohondrija i oslobađanja u citoplazmu faktora kao što su citokrom C, SMAC/DIABLO ili faktor AIF, što zauzvrat aktivira interno indukovanu apoptozu sinergističku sa signalom od dodavanja TRAIL-a do funkcionalnih receptora serije DR.
[0097] Novi fuzioni proteini takođe pokazuju najmanje redukovanu ili ograničenu, ili čak suštinski eliminisanu hemolitičku aktivnost karakterističnu za pojedine prirodne citolitičke peptide.
[0098] U jednoj od varijanti pronalaska, domen (a) i domen (b) su povezani sa najmanje jednim domenom (c) koji sadrži sekvencu mesta cepanja prepoznatog od strane proteaza prisutnih u ćelijskom okruženju, posebno u okruženju tumorskih ćelija, npr kao što su metaloproteaza, urokinaza ili furin.
[0099] Sekvence koje prepoznaje proteaza mogu se izabrati od:
• sekvence koju prepoznaje metaloproteaza MMP Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/ PLGLAGEP, ili njegov fragment koji sa poslednjom aminokiselinom sekvence za koju je vezan formira sekvencu koju prepoznaje metaloproteaza MMP,
• sekvence koju prepoznaje urokinaza uPA Arg Val Val Arg/RVVR ili njen fragment, koja sa poslednjom aminokiselinom sekvence za koju je vezan formira sekvencu koju prepoznaje urokinaza,
• i njihove kombinacije, ili
• sekvence koju prepoznaje furin Arg Gln Pro Arg/RQPR, Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG, Arg Lys Lys Arg/RKKR) ili druge atipične sekvence koje prepoznaje furin koji su objavili M. Gordon i dr., in Inf. and Immun, 1995, 63, br.1, p.82-87 ili matične sekvence koje prepoznaje furinArg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL ili HisArgGlnProArgGlyTrpGluGln/HRQPRGWEQ) ili njegov fragment, koji sa poslednjom aminokiselinom sekvence za koju je vezan formira sekvencu koju prepoznaje furin.
2
[0100] U jednoj od varijanti pronalaska, mesto proteznog cepanja je kombinacija sekvence koja se prepoznaje metaloproteazom MMP i/ili sekvence koju prepoznaje urokinaza uPA i/ili sekvence koju prepoznaje furin lociran, jedna pored druge u bilo kom redu.
[0101] Poželjno je da u jednom od otelotvorenja domen (c) predstavlja sekvencu koju prepoznaje furin odabran od Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ RVVRPLGLAG i Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg/PLGLAGRVVR.
[0102] Proteaze metaloproteaze MMP, urokinaza uPA i furin su prekomerno eksprimirani u tumorskom okruženju. Prisustvo sekvence koje prepozna proteaza omogućuje odvajanje domena (a) iz domena (b), tj. oslobađanje funkcionalnog domena (b) i time njeno ubrzanog aktiviranja.
[0103] Aktivacija efektorskog peptidno-funkcionalnog domena (b) nakon inkorporacije fuzionog proteina u ćeliju može se pojaviti nespecifično cepanje domena (a) iz domena (b) fuzionog proteina pronalaska pomoću lizozomalnih enzima (nespecifične proteaze).
[0104] Prisustvo mesta cepanja proteaza, omogućavajući brzo oslobađanje efektorskog peptida, povećava šanse za transport peptida do mesta njegovog dejstva, kao rezultat odsečenja od hTRAIL fragmenta pomoću proteaze koja je prekomerno eksprimirana u tumorskom okruženju pre slučajne degradacije fuzionog proteina nespecifičnim proteazama.
[0105] Pored toga, domen transporta (d) može biti povezan sa domenom (b) efektorskog peptida fuzionog proteina prema pronalasku.
[0106] Domen (d) može biti izabran iz grupe koju čine:
(d1) polihistidinska sekvenca koja se transportuje kroz ćelijsku membranu, koja se sastoji od 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 histidinskih ostataka (His/H);
i
(d2) poliargininska sekvenca koja se transportuje preko ćelijske membrane, koja se sastoji od 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 argininskih ostataka (Arg/R),
(d3) PD4 transportna sekvenca (oblast transdukcije proteina 4) Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /YARAAARQARA,
(d4) transportna sekvenca koja se sastoji od sekvence vezivanja receptora transferina Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /THRPPMWSPVWP,
(d5) transportna sekvenca (domen proteina za transdukciju 5, TAT protein) Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR,
ili njihovi fragmenti, koji sa poslednjom aminokiselinom sekvence kojoj pripadaju formiraju sekvence transportnih domena (d1) ili (d2);
i
• njihove kombinacije.
[0107] Kombinacija domena, npr. (d1) i (d2), mogu sadržati posebno kombinaciju (d1)/(d2) i (d2)/(d1).
[0108] Dalje, kombinacija domena, npr. (d1) i (d2), mogu sadržati domene locirane jedne pored drugih i povezane sa jednim krajem domena (b) i/ili domene povezanih sa različitim krajevima domena (b).
[0109] Treba shvatiti da u slučaju kada fuzioni protein ima transportni domen (d) koji je vezan za domen (b) i domen (c) mesta cepanja između domena (a) i (b), tada je domen (c) lociran na takav način da je nakon cepanja transportnog domena (d) ostaje vezan na domen (b). Drugim rečima, ako fuzioni protein sadrži i transportni domen (d) i mesto cepanja domena (c), onda se domen (d) nalazi između domena (b) i domena (c) ili se nalazi na kraju domena (b) suprotno mestu dodavanja domena (d).
[0110] Pronalazak sadrži i varijantu, u kojoj se domen (d) nalazi između dva (c) domena, to je varijanta u kojoj nakon cepanja konstrukta, transportni domen, poželjno translokacioni domen, nije vezan niti za TRAIL domen niti za domen efektora peptida.
[0111] Pronalazak ne obuhvata takvu varijantu u kojoj se domen (d) nalazi između domena (c) i domena (a), to je varijanta u kojoj se nakoncepanja konstrukta, transportni domen ostaje vezan za TRAIL domen.
[0112] U drugom otelotvorenju, između domena (a) i domena (b) postoji dodatni domen (e) koji sadrži sekvencu pogodnu za vezivanje PEG molekula na fuzioni protein (veznik pegilacije). Takav veznik može biti poznata sekvencua Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu
2
Gly/ASGCGPEG ili njeni fragmente, koja sa poslednjom aminokiselinom sekvence za koju je vezana formira sekvencu pogodnu za vezivanje PEG molekula. Veznik pegilacije može biti izabran iz grupe sledećeg:
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA,
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS, i
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS,
ili njihov fragment, koji sa poslednjom aminokiselinom sekvence za koju je vezan formira sekvencu pogodnu za vezivanje PEG molekula. Poželjno, sekvenca pegilacionog veznika je Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ ASGCGPEG.
[0113] Osim glavnih funkcionalnih elemenata fuzionog proteina i domena/mesta cepanja, fuzioni proteini pronalaska mogu sadržati neutralnu sekvencu/sekvence fleksibilnog steričkog veznika. Takvi sterički veznici su dobro poznati i opisani u literaturi. Njihovo uključivanje u sekvencu fuzionog proteina ima za cilj da pruži ispravno sklapanje proteina proizvedenih procesom njegove prekomernog eksprimiranja u ćelijama domaćina. Konkretno, sterički veznik može biti glicin, glicin-serin ili linkin-glicerin-cistein-alanin.
[0114] Posebno, sterički veznik može biti kombinacija glicina i serinskih ostataka kao što si Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS ili bilo koji njihov fragment koji deluje kao sterički veznik, na primer fragment Gly Gly Gly Ser/GGGS, Gly Gly Gly/GGG ili Gly Gly Gly Gly/GGGG, Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Ser Gly/GGSG, Gly Ser Gly/GSG ili Ser Gly Gly/SGG ili njihove kombinacije.
[0115] U drugom otelotvorenju, sterički veznik može biti bilo koja kombinacija ostataka glicina, serina i alanina kao što su Ala Ser Gly Gly/ASGG ili bilo koji njegov fragment koji deluje kao sterički veznik, na primer Ala Ser Gly/ASG. Takođe je moguće koristiti kombinaciju steričkih veznika, na primer sekvencu Gly Gly Gly Ser Gly/GGGGS ili bilo koji njen fragment koji deluje kao sterički veznik, na primer fragment Gly Gly Gly/GGG, sa drugim fragmentom koji deluje kao sterički veznik. U takvom slučaju sterički veznik može biti kombinacija ostataka glicina, serina i alanina kao što su Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG, Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly/GGSGGGSGGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGSGGGGGS ili Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGGS. U još jednoj realizaciji, sterički veznik može biti kombinacija serinskih i histidinskih ostataka Ser His His/SHHS ili Ser His His Ala Ser/SHHAS.
2
[0116] U još jednom otelotvorenju, sterički veznik može biti odabran i od pojedinačnih aminokiselinskih ostataka, kao što su ostatak jedinjenja glicina ili cisteina, posebno jedan ili dva do četiri ostatka glicina ili cisteina.
[0117] U drugom otelotvorenju, veznik takođe može biti formiran od strane fragmenta steričkih veznika opisanih iznad, koji sa terminalnom aminokiselinom sekvence za koju su vezani formiraju steričku veznik sekvencu.
[0118] U drugom otelotvorenju, sterički veznik može promovisati formiranje i stabilizaciju strukture trimera fuzionog proteina pronalaska, čime se povećava njegov poluživot u sistemu cirkulacije krvi i sprečava deasociacija koja može uticati na aktivnost protein nakon primene u sistem za cirkulaciju krvi. U ovom slučaju veznik je kombinacija cisteina i alanina, na primer, fragment Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/CAAACAAC ili Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/CAACAAAC ili njegovi fragmenti, što je terminalna aminokiselinska sekvenca na koje je vezan i formira steričku veznik sekvencu koja stabilizuje trimernu strukturu.
[0119] Pored toga, sterički veznik može takođe biti koristan za aktiviranje funkcionalnog domena (b), koji se javljaju na nespecifičan način. Aktivacija domena (b) na nespecifičan način se može izvršiti sečenjem domena (a) iz domena (b) fuzionog proteina prema pronalasku zbog pH-zavisne hidrolize steričkog povezivanja.
[0120] Posebna otelotvorenja fuzionog proteina prema pronalasku su fuzioni proteini koji sadrže peptid koji formira pore, izabran iz grupe peptida predstavljenih kao:
SEQ. br.36, SEQ. br.37, SEQ. br.41, SEQ. br.43, SEQ. br.44, SEQ. br.45, SEQ. br. 46, SEQ. br.47, SEQ. br.48, SEQ. br.54, SEQ. br.55, SEQ. br.125, SEQ. br.
126, SEQ. br.127, i SEQ. br.128.
[0121] Detaljan opis strukture reprezentativnih fuzionih proteina pomenutih gore prikazan je u Primerima prikazanim u nastavku.
[0122] U skladu sa ovim pronalaskom, pod fuzionim proteinom podrazumeva se jedinstveni proteinski molekul koji sadrži dva ili više proteina ili njihovih fragmenata, kovalentno vezan
2
preko peptidne veze unutar njihovih odgovarajućih peptidnih lanaca, bez dodatnih hemijskih veznika.
[0123] Fuzioni protein se takođe može alternativno opisati kao proteinski konstrukt ili himerni protein. Prema predmetnom pronalasku, termine „konstrukt“ ili „himerni protein“, kad se koriste, treba shvatiti kao da se odnose na fuzioni protein kao što je gore definisano.
[0124] Za stručnjaka u ovoj oblasti, biće očigledno da definisan fuzioni protein može biti sintetisan poznatim postupcima hemijske sinteze peptida i proteina.
[0125] Fuzioni protein se može sintetisati postupcima hemijske peptidne sinteze, posebno korišćenjem tehnike sinteze peptida u čvrstoj fazi koristeći pogodne smole kao nosače. Takve tehnike su konvencionalne i poznate u struci i opisane su, između ostalog, u monografijama, kao što su na primer Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York, Stewart i dr., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.
[0126] Fuzioni protein se može sintetisati postupcima hemijske sinteze peptida kao kontinuiranog proteina. Alternativno, pojedinačni fragmenti (domeni) proteina mogu se zasebno sintetisati i zatim kombinovati zajedno u jednom kontinuiranom peptidu putem peptidne veze, kondenzacijom amino terminusa jednog peptidnog fragmenta iz karboksil terminusa drugog peptida. Takve tehnike su konvencionalne i dobro poznate.
[0127] Poželjno, međutim, fuzioni protein iz pronalaska je rekombinantni protein, generisan postupkom eksprimiranja gena polinukleotidne sekvence koja kodira fuzioni protein u ćelijama domaćina.
[0128] Za verifikaciju strukture nastalih peptida poznati su postupci analize aminokiselinskog sastava peptida, kao što je tehnika masne spektrometrije visoke rezolucije za određivanje molekulske težine peptida. kako bi se potvrdila peptidna sekvenca, mogu se takođe koristiti proteinski sekvenceri, koji sekvencijalno degradiraju peptid i identifikuju sekvencu aminokiselina.
2
[0129] Pronalazak opisuje polinukleotidnu sekvencu, posebno DNK sekvencu, koja kodira fuzioni protein kao što je prethodno definisano.
[0130] Poželjno, polinukleotidna sekvenca, posebno DNK, prema pronalasku, koja kodira fuzioni protein kao što je definisano gore, je sekvenca optimizovana za eksprimiranje u E. coli.
[0131] Pronalazak objavljuje takođe vektor eksprimiranja koji sadrži polinukleotidnu sekvencu, naročito DNK sekvencu pronalaska, kao što je prethodno definisano.
[0132] Pronalazak objavljuje i ćeliju domaćina koja sadrži vektor eksprimiranja kao što je prethodno definisano.
[0133] Dobijeni su postupci za generisanje rekombinantnih proteina, uključujući fuzione proteine. Ukratko, ova tehnika se sastoji u stvaranju polinukleotidnog molekula, na primer molekul DNK koji kodira aminokiselinsku sekvencu ciljnog proteina i usmerava eksprimiranje ciljanog proteina u domaćinu. Tada se polinukleotidni molekul koji kodira ciljane proteine ugrađuje u odgovarajući vektor eksprimiranja, koji pruža efikasnu eksprimiranje polipeptida. Rekombinantni vektor eksprimiranja se zatim unosi u ćelije domaćina za transfekciju/transformaciju, a kao rezultat se proizvodi transformisana ćelija domaćin. Nakon toga sledi kultivisanje transformisanih ćelija za prekomerno eksprimiranje ciljnog proteina, prečišćavanje dobijenih proteina i opciono sečenje cepanjem sekvenci oznaka koje se koriste za eksprimiranje ili prečišćavanje proteina.
[0134] Primerne tehnike eksprimiranja i prečišćavanja su opisane, na primer u monografiji Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron i dr., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995.
[0135] Kosmidi, plazmidi ili modifikovani virusi mogu se koristiti kao vektori eksprimiranja za uvođenje i replikaciju sekvenci DNK u ćelijama domaćina. Uobičajeno se plazmidi koriste kao vektori eksprimiranja. Pogodni plazmidi su dobro poznati i komercijalno dostupni.
[0136] Vektor eksprimiranja sadrži polinukleotidni molekul koji kodira fuzioni protein pronalaska i potrebne regulatorne sekvence za transkripciju i translaciju kodirajuće sekvence
2
ugrađene u pogodnu ćeliju domaćina. Izbor regulatornih sekvenci zavisi od vrste ćelija domaćina i može se lako izvršiti od strane stručnjaka. Primeri takvih regulatornih sekvenci su transkripcijski promotor i pojačavač ili RNA polimeraza vezujuća sekvenca, sekvenca vezivanja ribozoma, koja sadrži signal za iniciranje transkripcije, umetnut pre sekvencijalnog kodiranja i sekvencu transkripcionog terminatora, umetnut nakon kodiranja sekvence.
Štaviše, u zavisnosti od ćelije domaćina i korišćenog vektora, druge sekvence mogu biti uvedene u vektor eksprimiranja, kao što je poreklo replikacije, dodatne lokacije za ograničavanje DNK, poboljšivači i sekvence koje omogućavaju indukciju transkripcije.
[0137] Vektor eksprimiranja će takođe sadržati markersku gensku sekvencu koja daje definisan fenotip transformisanoj ćeliji i omogućava specifičan izbor transformisanih ćelija. Osim toga, vektor može takođe sadržati drugu markersku sekvencu koja omogućava razlikovanje ćelije transformisane sa rekombinantnim plazmidom koji sadrži umetnutu kodirajuću sekvencu ciljnog proteina od onih koje su uzele plazmid bez umetanja. Najčešće se koriste tipični markeri otpornosti na antibiotike, međutim, mogu se koristiti bilo koji drugi reporter geni poznati u struci, čije se prisustvo u ćeliji (in vivo) može lako odrediti pomoću tehnike autoradiografije, spektrofotometrije ili bio- i hemi- luminescencije. Na primer, u zavisnosti od ćelije domaćina, mogu se koristiti reporterski geni kao što su ß-galaktozidaza, ß-glukuronidaza, luciferaza, hloramfenikol acetiltransferaza ili zeleni fluorescentni protein.
[0138] Nadalje, vektor eksprimiranja može sadržati signalnu sekvencu, transportujući proteine u odgovarajući odeljak ćelije, npr. periplazmu, gde je preklapanje olakšano. Pored toga, može biti prisutna sekvenca koja kodira oznaku/obeležje, kao što je HisTag vezan za N-terminus ili GST vezan za C-terminus, što olakšava naknadno prečišćavanje proteina proizvedenog koristeći princip afiniteta, putem afinitetne hromatografije na nikel koloni. Dodatne sekvence koje štite protein protiv proteolitičke degradacije u ćelijama domaćina, kao i sekvence koje povećavaju njegovu rastvorljivost takođe mogu biti prisutne.
[0139] Pomoćni element prikačen na sekvencu ciljanog proteina može blokirati njegovu aktivnost ili biti štetan iz nekog drugog razloga, kao na primer zbog toksičnosti. Takav element mora biti uklonjen, što se može postići enzimskim ili hemijskim cepanjem. Posebno treba ukloniti šest histidinsku oznaku HisTag ili druge markere ovog tipa koji omogućavaju prečišćavanje proteina pomoću afinitetne hromatografije zbog opisanog efekta na toksičnost jetre u rastvorljivom TRAIL proteinu. Mogu se koristiti hetereterozni sistemi eksprimianja na bazi različitih dobro poznatih ćelija domaćina, uključujući prokariotske ćelije: bakterijske, kao što su Escherichia coli ili Bacillus subtilis, kvasci kao što su Saccharomyces cervisiae ili Pichia pastoris i eukariotske ćelijske linije (insekata, sisara, biljaka).
[0140] Poželjno, zbog jednostavnosti kultivacije i genetske manipulacije i velike količine dobijenog proizvoda, koristi se sistem eksprimiranja E. coli. Shodno tome, polinukleotidna sekvenca koja sadrži ciljnu sekvencu koja kodira fuzioni protein iz pronalaska će biti optimizovana za eksprimiranje u E. coli, tj. ona će sadržati kodirajuću sekvencu optimalnu za eksprimiranje u E. coli, odabranim od mogućih varijanti sekvence u struci. Osim toga, vektor eksprimiranja će sadržati gore opisane elemente pogodne za E. coli vezane za kodirajuću sekvencu.
[0141] Shodno tome, u poželjnom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca koja sadrži sekvencu koja kodira fuzioni protein pronalaska, optimizovana za eksprimiranje u E. coli, bira se iz grupe polinukleotidnih sekvenci koja se sastoje od:
SEQ. br.60; SEQ. br.61; SEQ. br.62; SEQ. br.67; SEQ. br.68; SEQ. br.69; SEQ. br. 70; SEQ. br.71; SEQ. br.72; SEQ. br.74; SEQ. br.75; SEQ. br.76; SEQ. br.77; SEQ. br.78; SEQ. br.79; SEQ. br.86; SEQ. br.87; SEQ. br.88; SEQ. br.108; SEQ. br. 109; SEQ. br.110; SEQ. br.111; SEQ. br.112; SEQ. br.113; SEQ. br.114, SEQ. br. 115; i SEQ. br.119; koji kodiraju fuzione proteine sa aminokiselinskim sekvencama koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama odabranim iz grupe koja sadrži aminokiselinske sekvence, respektivno:
SEQ. br.4; SEQ. br.5; SEQ. br.6; SEQ. br.11; SEQ. br.12; SEQ. br.13; SEQ. br.
14; SEQ. br.15; SEQ. br.16; SEQ. br.18; SEQ. br.19; SEQ. br.20; SEQ. br.21; SEQ. br.22; SEQ. br.23; SEQ. br.30; SEQ. br.31; SEQ. br.32; SEQ. br.91; SEQ. br. 92; SEQ. br.93; SEQ. br.94; SEQ. br.95; SEQ. br.96; SEQ. br.97, SEQ. br.98; i SEQ. br.102.
[0142] U poželjnom otelotvorenju, pronalazak pruža i vektor eksprimiranja pogodan za transformaciju E. coli, koji sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe polinukleotidnih sekvenci SEQ. Nos.60-62, 67-72, 74-79, 86-88, 108-115 i 119_ navedene gore, kao i E. coli ćelija transformisana sa takvim vektorom eksprimiranja.
1
[0143] Transformacija, odnosno uvođenje sekvence DNK u bakterijsku ćeliju domaćina, posebno E. coli, se obično izvodi na odgovarajućim ćelijama, pripremljenim da uzmu DNK npr. tretiranjem kalcijum jona na niskoj temperaturi (4°C) , a zatim podvrgavaju toplotnom šoku (na 37-42°C) ili elektroporacijom. Takve tehnike su dobro poznate i obično ih određuju proizvođači sistema eksprimiranja ili su opisani u literaturi i priručnicima za laboratorijski rad, kao što je Maniatis i dr., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
[0144] Postupak prevelike eksprimiranja fuzionih proteina prema pronalasku u E. coli sistemu eksprimiranja biće dalje opisan u nastavku.
[0145] Pronalazak takođe pruža farmaceutski sastav koji sadrži fuzioni protein iz ovog pronalaska, kao što je gore definisano kao aktivni sastojak i pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač, razređivač i konvencionalne pomoćne komponente. Farmaceutski sastav sadrži efektivnu količinu fuzionog proteina pronalaska i farmaceutski prihvatljive pomoćne komponente rastvorene ili dispergovane u nosaču ili razblaživaču, a poželjno će biti u obliku farmaceutskog sastava formulisanog u jediničnom doznom obliku ili formulaciji koja sadrži pluralnost doza. Farmaceutski oblici i postupci njihove formulacije, kao i ostale komponente, nosači i razblaživači su poznati stručnjaku i opisani su u literaturi. Na primer, opisani su u monografiji Remington's Pharmaceutical Sciences, ed.20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.
[0146] Izrazi „farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i pomoćni sastojak“ obuhvata bilo koji rastvarač, disperzioni medij, surfaktant, antioksidant, stabilizator, konzervans (npr. antibakterijski agensi, antifungalni agensi), izotonizujući agens, poznate u stanju tehnike. Farmaceutski sastav prema pronalasku može sadržati različite vrste nosača, razblaživača i ekscipijenata, u zavisnosti od izabranog načina primene i željenog oblika doze, kao što su tečni, čvrsti i aerosolni oblici za oralnu, parenteralnu, inhalacionu, topikalnu i da li izabrano oblik mora biti sterilan za način primene, kao što je injekcija. Poželjni način primene farmaceutskog sastava prema pronalasku je parenteralni, uključujući injekcione puteve kao što su intravenozni, intramuskularni, potkožni, intraperitonealni, intratumoralni ili pojedinačne ili kontinuirane intravenske infuzije.
[0147] U jednoj realizaciji, farmaceutski sastav prema pronalasku može se davati injekcijom direktno u tumor. U drugom otelotvorenju, farmaceutski sastav prema pronalasku može se
2
primenjivati intravenozno. U još jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav prema pronalasku može se primeniti potkožno ili intraperitonealno. Farmaceutski sastav za parenteralnu primenu može biti rastvor ili disperzija u farmaceutski prihvatljivom vodenom ili nevodenom medijumu, puferiranom do odgovarajućeg pH i izoosmotičnog sa telesnim tečnostima, ako je potrebno, i može takođe sadržati antioksidante, pufere, bakteriostatska sredstva i rastvorljive supstance , što čini sastav kompatibilnim sa tkivima ili krvlju primaoca. Druge komponente, koje mogu biti uključene u sastav, su na primer voda, alkoholi kao što su etanol, polioli kao što su glicerol, propilen glikol, tečni polietilenglikol, lipidi kao što su trigliceridi, biljna ulja, lipozomi. Odgovarajuća tečnost i veličina čestica supstance mogu se pružiti supstancama za premazivanje, kao što su lecitin i surfaktanti, kao što su hidroksipropil-celuloza, polisorbati i slično.
[0148] Pogodni izotonični agensi za tečne parenteralne sastave su, na primer, šećeri kao što su glukoza i natrijum hlorid i njihove kombinacije.
[0149] Alternativno, farmaceutski sastav za primenu putem injekcije ili infuzije može biti u obliku praha, kao što je liofilizovani prah za rekonstituciju neposredno pre upotrebe u pogodnom nosaču kao što je, na primer, sterilna voda bez pirogena.
[0150] Farmaceutski sastav pronalaska za parenteralnu primenu može takođe imati oblik nazalne primene, uključujući rastvore, sprejeve ili aerosole. Poželjno, oblik za intranazalnu primenu biće vodeni rastvor i biće izotoničan ili puferiran o održati pH od oko 5,5 do oko 6,5, kako bi se održale osobine slične nazalnom sekretu. Štaviše, on će sadržati konzervanse ili stabilizatore, kao što su poznati intranazalni preparati.
[0151] Sastav može sadržati različite antioksidante koji odlažu oksidaciju jedne ili više komponenti. Pored toga, u cilju sprečavanja dejstva mikroorganizama, sastav može sadržati različite antibakterijske i antifungalne agense, uključujući, na primer, ali ne ograničavajući se na, parabene, hlorobutanol, timerozal, sorbinsku kiselinu i slične poznate supstance ovog tipa. Generalno, farmaceutski sastav ovog pronalaska može uključivati, na primer, najmanje oko 0,01% težine aktivnog sastojka. Konkretnije, sastav može sadržati aktivni sastojak u količini od 1% do 75% težine jedinjenja za sastavljanje, ili na primer od 25% do 60% težine, ali bez ograničavanja na navedene vrednosti. Tačna količina doze sastava prema predmetnom pronalasku dati pacijentima, uključujući i čoveka, biće određena fizičkim i fiziološkim faktorima, kao što su telesna težina, težina stanja, vrsta oboljenja koja se leči, prethodne ili istovremene terapijske intervencije, pacijent i način primene. Pogodnu jediničnu dozu, ukupnu dozu i koncentraciju aktivnog sastojka u sastavu treba da odredi lekar koji leči.
[0152] Sastav se, na primer, može davati u dozi od oko 1 mikrograma/kg telesne težine do oko 1000 mg/kg telesne težine pacijenta, na primer u opsegu od 5 mg/kg telesne težine do 100 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 5 mg/kg telesne težine do 500 mg/kg telesne težine. Fuzioni protein i sastava koji ga sadrže pokazuju antikancer ili antitumor i mogu se koristiti za lečenje bolesti kancera. Pronalazak takođe pruža upotrebu fuzionog proteina prema pronalasku kao što je prethodno definisano za lečenje bolesti kancera kod sisara, uključujući ljude. Pronalazak takođe pruža postupak za lečenje neoplastičnih/kancerogenih bolesti kod sisara, uključujući ljude, koji obuhvata davanje pacijentu kom je neophodno takvo lečenje anti-neoplastične/antikancer efikasne količina fuzionog proteina pronalaska, kao što je definisano gore, opciono u obliku odgovarajućeg farmaceutskog sastava.
[0153] Fuzioni protein pronalaska se može koristiti za lečenje hematoloških malignosti kao što su leukemija, granulomatoza, mijelom i druge hematološke malignosti. Fuzioni protein se takođe može koristiti za lečenje čvrstih tumora, kao što su rak dojke, rak pluća, uključujući rak ne-malih ćelija pluća, rak debelog creva, rak pankreasa, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak prostate, rak bubrega, i slično. Odgovarajući način primene fuzionog proteina u lečenju kancera biće naročito parenteralni put koji se sastoji od davanju fuzionog proteina pronalaska u obliku injekcija ili infuzije u sastavu i obliku pogodnom za ovaj način primene. Pronalazak će biti detaljnije opisan u sledećim opštim procedurama i primerima specifičnih fuzionih proteina.
Opšta procedura za prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina
Priprema plazmida
[0154] Aminokiselinska sekvenca ciljanog fuzionog proteina je korišćena kao šablon za generisanje DNK sekvence koja je kodira, što obuhvata kodone optimizovane za eksprimiranje kod Escherichia coli. Takva procedura omogućava povećanje efikasnosti daljeg koraka sinteze ciljanog proteina kod Escherichia coli. Rezultujuća nukleotidna sekvenca je zatim automatski sintezovana. Pored toga, mesta cepanja restrikcionih enzima NdeI (na 5'-kraju vodeće linije) i Xhol (na 3'-kraju vodeće linije) dodati su u rezultujućem genu koji kodira ciljani protein. Oni su korišćeni za kloniranje gena u vektor pET28a
4
(Novagen). Mogu se takođe koristiti za kloniranje gena koji kodira protein na druge vektore. Ciljani protein eksprimiran iz ovog konstrukta može opciono biti opremljen na N-terminusu sa polihistidinskom oznakom (šest histidina), što prethodi mesto koje prepoznaje trombin, koji naknadno služi njegovom pročišćavanju putem afinitetne hromatografije. Neke mete su eksprimirane bez ikakvih oznaka, posebno bez histidinskih oznaka, a one su naknadno prečišćene na SP Sepharose. Tačnost rezultujućeg konstrukta potvrđena je pre svega pomoću restrikcione analize izolovanih plazmida pomoću enzima NdeI i Xhol, praćeno automatskim sekvencioniranjem čitavog čitačkog okvira ciljnog proteina. Prajmeri koji se koriste za sekvenciranje su komplementarni sekvencama T7 promotera (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') i T7 terminator (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') prisutan u vektoru. Rezultujući plazmid je korišćen za preveliku eksprimiranje ciljanog fuzionog proteina u komercijalnoj liniji E. coli, koji je transformisan prema preporukama proizvođača. Kolonije dobijene na medijumu za selekciju (LB agar, kanamicin 50 µg/ml, 1% glukoze) korišćene su za pripremu kulture preko noći u tečnom medijumu LB uz dodatak kanamicina (50 µg/ml) i 1% glukoze. Posle oko 15 sati rasta u mešajućem inkubatoru, kulture su korišćene za inokulaciju odgovarajuće kulture.
Prekomerno eksprimiranje i pročišćavanje fuzionih proteina - opšta procedura A [0155] LB medijum sa kanamicinom (30 µg/ml) i 100 µM cink sulfat je inokuliran sa kulturom preko noći. Kultura je inkubirana na 37°C dok optička gustina (OD) na 600 nm nije dostigla 0,60-0,80. Zatim IPTG je dodat do konačne koncentracije u opsegu od 0,25 -1 mM. Nakon inkubacije (3,5 - 20 sati) uz mešanje na 25°C kultura je centrifugirana tokom 25 min na 6,000 g. Bakterijski peleti su resuspendovani u puferu koji sadrži 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,4. Suspenzija je sonifikovana na ledu tokom 8 minutea (40% amplituda, 15-sekundi puls, 10 s interval). Dobijeni ekstrakt se razblaži centrifugiranjem 40 minuta na 20000 g, 4°C. Ni-Sepharose (GE Healthcare) smola je prethodno tretirana sa puferom za uravnotežavanje, koji je korišćen za pripremu ekstrakta bakterijskih ćelija. Smola je zatim inkubirana preko noći na 4°C uz supernatant dobijen nakon centrifugiranja ekstrakta. Zatim je stavljena u kolonu za hromatografiju i isprana sa 15 do 50 zapremina pufera 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCI, 20 mM imidazola, pH 7,4. Dobijeni protein je eluiran iz kolone primenom gradijenta imidazola u 50 mM KH2PO4puferu sa 0,5 M NaCI, pH 7,4. Dobijene frakcije analizirane su sa SDS-PAGE. Odgovarajuće frakcije su kombinovane i dijalizovane preko noći na 4°C u odnosu na 50 mM Tris pufera, pH 7,2, 150 mM NaCI, 500 mM L-arginina, 0,1 mM ZnSO4, 0,01% Tveen 20 i istovremeno je Histag, ukoliko je prisutan, cepan sa trombinom (1:50). Nakon cepanja, trombin je odvojen od ciljnog fuzionog proteina eksprimiranog pomoću His oznake prečišćenjem Benzamidine SepharoseTM smole.
Prečišćavanje ciljanih fuzionih proteina izraženih bez Histaga izvršeno je na SP Sepharose. Čistoća proizvoda analizirana je SDS-PAGE elektroforezom (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982).
Prekomerno eksprimiranje i prečišćavanje fuzionih proteina - opća procedura B [0156] LB medijum sa kanamicinom (30 mg/ml) i 100 mM cink sulfata je inokuliran sa kulturom preko noći. Kulture su inkubirane na 37°C sve dok optička gustina (OD) na 600 nm ne dostigne 0,60-0,80. Zatim je IPTG dodat konačnoj koncentraciji u opsegu od 0,5 -1 mM. Posle 20 sati inkubacije uz mešanje na 25°C kultura je centrifugirana 25 min na 6000 g. Bakterijske ćelije nakon prekomernog eksprimiranja su poremećene u French Press u puferu koji sadrži 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazola, 5 mM beta-merkaptoetanola, 0,5 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluorid), pH 7,8. Rezultujući ekstrakt se razblaži centrifugiranjem 50 minuta na 8000 g. Smola Ni-Sepharose je inkubirana preko noći sa dobijenim supernatantom. Tada je smola sa vezanim proteinom postavljena u kolonu za hromatografiju. Za ispiranje frakcija koje sadrže ne-vezujuće proteine, kolona je isprana sa 15 do 50 zapremina pufera 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCI, 10 mM imidazola, 5 mM betamerkaptoetanola, 0.5 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluorid), pH 7,8. Zatim, kako bi se isprala većina proteina koji se specifično vezuju za krevet, kolona je isprana puferom koji sadrži 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCI, 500 mM imidazola, 10% glicerola, 0,5 mM PMSF, pH 7,5. Dobijene frakcije analizirane su sa SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Frakcije koje sadrže ciljani protein su kombinovane i, ako je protein izražen histidinskom oznakom, cepan je sa trombinom (1U po 4 mg proteina, 8 sati na 16°C) kako bi se uklonila polihistidinska oznaka. Tada su frakcije dijalizirane protiv pufera za formulaciju (500 mM L-arginin, 50 mM Tris, 2,5 mM ZnS04, pH 7,4).
[0157] U ovom opisu Primeri proteina koji su prvobitno eksprimirani sa histidinskom oznakom, koji su naknadno uklonjeni, označeni su superskriptom a) pored broja Primera. Proteini koji su prvobitno eksprimirani bez histidinske oznake označeni su superskriptom b) pored broja Primera.
Karakterizacija fuzionih proteina 2-D elektroforezom
[0158] U cilju daljeg karakterisranja dobijenih proteina i preciznog odabira hromatografskih stanja, utvrđene su izoelektrične tačke proteina. U tu svrhu korištena je postupak dvodimenzionalne elektroforeze (2-D) u dve faze prema sledećem rasporedu.
Korak 1. Izoelektrofokusiranje proteina u gradijentu pH i uslovima denaturacije.
[0159] Pripreme proteina u koncentracijama od 1 - 2 mg/ml su precipitovane mešanjem u odnosu 1:1 sa rastvorom za precipitaciju koji sadrži 10% trihlorsirćetne kiseline i 0,07% betamerkaptoetanola u acetonu. Smeša je inkubirana 30 min na -20°C i zatim centrifugirana 25 minuta na 15000 g i 4°C. Supernatant je uklonjen i pelet je ispran dva puta hladnim acetonom sa 0,07% beta-merkaptoetanola. Zatim su ostaci acetona ispareni sve dok se ne dobije primetan miris. Proteinski peleti su suspendovani u 250 ml pufera za rehidraciju 8M uree, 1% CHAPS, 15 mM DTT, 0,5% amfolita (GE Healthcare) sa profilom pH 3-11 ili 6-11, u zavisnosti od trake koja se kasnije koristi. Rastvor proteina je postavljen u keramičku komoru za izoelektrofokusiranje, nakon čega sledi 13 cm DriStrip (GE Healthcare) sa odgovarajućim pH profilom (3-11 ili 6-11). Cela je prekrivena slojem mineralnog ulja. Komore su postavljene u aparat Ettan IPGphor III, gde je izoelektrofokusiranje izvedeno prema sledećem programu koji je određen dimenzijama trake i pH-profila:
16 sati dehidratacija na 20°C
[0160] Fokusiranje u električnom polju na fiksiranom pH gradijentu
[0161] Zatim je traka koja sadrži fokusirane proteine oprana tokom 1 min u dejonizovanoj vodi, obojena sa Coomassie Brilliant, a zatim dekolorizovana i arhivirana kao slika koja označava lokaciju proteina. Razblažena traka je ujednačena 2 x 15 min sa puferom sledećeg sastava: 50mM Tris-HCl pH 8,8, 6M urea, 1% DTT, 2% SDS, 30% glicerol.
Korak 2. Odvajanje u drugom smeru od strane SDS-PAGE.
[0162] Traka je postavljena preko 12,5% poliakrilamidnog gela koji sadrži jednu komoricu po standardnoj veličini, a zatim je izvršena separacija u aparatu za SDS-PAGE, pri naponu od 200V tokom 3 sata. Gel je obojen sa Coomassie Brilliant a potom arhiviran sa primenjenom skalom. Proteini su identifikovani određivanjem svoje težine na osnovu standarda veličine, a njihov IPI je pročitan za skalu od 6-11 na osnovu krivih koje je pružio proizvođač (GE Healthcare) (odnos pH i % dužine trake od kraja označenog kao anod) ili skalu od 3-11 na osnovu krive koja je eksperimentalno utvrđena pomoću kompleta za kalibraciju izoelektrofokusiranja (GE Healthcare).
Primeri
[0163] Reprezentativni primeri fuzionih proteina pronalaska su prikazani u narednim primerima.
[0164] U primerima aminokiselinske sekvence fuzionih proteina su zapisane od N-terminusa do C-terminusa proteina. U primerima, pod TRAIL se uvek misli na hTRAIL.
[0165] Naredne oznake komponenti aminokiselinskih sekvenci su korišćene, gde je pored troslovne oznake data ekvivalentna jednoslovna oznaka.
LINKER1: sterički veznik Gly Gly /GG
LINKER2: sterički veznik Gly Gly Gly/GGG
LINKER3: sterički veznik Gly Ser Gly /GSG
LINKER4: sterički veznik Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS
LINKER5: sterički veznik Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGS
LINKER6: sterički veznik Gly Gly Ser Gly Gly/GGSGG
LINKER7: sterički veznik Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GGGSGGG LINKER8: sterički veznik Gly Gly Gly Gly Ser Gly /GGGGSG
LINKER9: sterički veznik Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGSGGGGGS LINKER10: sterički veznik Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly/GGGGSGGGG LINKER11: sterički veznik Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GSGGGSGGG LINKER12: sterički veznik Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/ CAACAAAC LINKER13: sterički veznik Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys/ CAAACAAC LINKER 14: sterički veznik Cys/C
LINKER 15: sterički veznik Gly/G
LINKER16: sterički veznik Ser Gly Gly/SGG
FURIN: sekvenca cepana furinom Arg Lys Lys Arg/RKKR
FURIN.NAT: prirodna sekvenca cepana furinom His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln/HRQPRGWEQ
UROKIN: sekvenca cepana urokinazom Arg Val Val Arg/RVVR
MMP: sekvenca cepana metaloproteazom Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ PLGLAG PEG1: veznik pegilacije Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE
PEG2: veznik pegilacije Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ ASGCGPEG TRANS1: transportna sekvenca His His His His His His /HHHHHH
TRANS2: transportna sekvenca Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRR TRANS3: transportna sekvenca Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR TRANS4: transportna sekvenca Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /YARAAARQARA
TRANS5: transportna sekvenca Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /THRPPMWSPVWP
TRANS6: transportna sekvenca Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR
Primer 4. Fuzioni protein od SEQ. br. 4
[0166] Protein od SEQ. br.4 je fuzioni protein koji ima dužinu od 227 aminokiselina i masu od 25,7 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 56-aminokiselinski pilosulin-1 (SEQ. br.36) vezan za N-terminus domena (a).
[0167] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno mesto cepanja urokinaze (RVVR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.36)-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
[0168] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.4 i SEQ. br.60, kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0169] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.4 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.60. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 5. Fuzioni protein od SEQ. br. 5
[0170] Protein od SEQ. br.5 je fuzioni protein koji ima dužinu od 264 aminokiselina i masu od 29,5kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL95-281, i domen (b) efektorskog peptida je 56-aminokiselinski pilosulin-1 (SEQ. br.36), i je vezan za C-terminus domena (a).
[0171] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (CAACAAC), sterički veznik (GGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i mesto cepanja urokinaze (RVVR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL95-281)-LINKER12-LINKER2-MMP-UROKIN-(SEQ. br. 36)
[0172] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.5 i SEQ. br.61 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0173] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.5 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.61. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 6. Fuzioni protein od SEQ. br. 6
[0174] Protein od SEQ. br.6 je fuzioni protein koji ima dužinu od 299 aminokiselina i masu od 33,2 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL95-281, i domen (b) efektorskog peptida je 90-aminokiselinski peptid pilosulin 5 (SEQ. br.37) vezan za C-terminus domena (a).
4
[0175] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GSG), sterički veznik (CAACAAAC), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RWR) i sterički veznik (G). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL95-281)-LINKER3-LINKER12-MMP-UROKIN-LINKER15-(SEQ. br. 37)
[0176] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.6 i SEQ. br.62 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0177] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.6 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.62. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran i sa histidinskom oznakom (Ex.6<a>) i bez histidinske oznake (Ex.6<b>).
Primer 11. Fuzioni protein od SEQ. br. 11
[0178] Protein od SEQ. br.11 je fuzioni protein koji ima dužinu od 202 aminokiselina i masu od 23 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je sintetički 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) vezan za C-terminus domena (a).
[0179] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja urokinaze (RWR), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i 8-arginin transportna sekvenca (RRRRRRRR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(SEQ. br. 41)
[0180] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.11 i SEQ. br.67 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0181] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.11 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.67. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran i sa histidinskom oznakom (Ex.11<a>) i bez histidinske oznake (Ex.11<b>).
Primer 12. Fuzioni protein od SEQ. br. 12
[0182] Protein od SEQ. br.12 je fuzioni protein koji ima dužinu od 205 aminokiselina i masu od 23,2 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je sintetički 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) vezan za C-terminus domena (a).
[0183] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GG), sekvenca veznika pegilacije (ASGCGPEG), sekvenca steričkog veznika (GGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RWR) i poliarginin transportna sekvenca (RRRRRRR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL 121-281)-LINKER1-PEG2-LINKER2-MMP-UROKIN-TRANS2-(SEQ. br.
41)
[0184] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.12 i SEQ. br.68 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0185] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.12 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.68. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 13. Fuzioni protein od SEQ. br. 13
[0186] Protein od SEQ. br.13 je fuzioni protein koji ima dužinu od 228 aminokiselina i masu od 25,9 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 95-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) vezan za C-terminus domena (a).
[0187] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja urokinaze (RVVR), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i 8-arginine transportna sekvenca (RRRRRRRR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL 95-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(SEQ. br.41)
[0188] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.13 i SEQ. br.69 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0189] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.13 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.69. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran i sa histidinskom oznakom (Ex.13<a>) i bez histidinske oznake (Ex.13<b>).
Primer 14. Fuzioni protein od SEQ. br. 14
[0190] Protein od SEQ. br.14 je fuzioni protein koji ima dužinu od 192 aminokiselina i masu od 22,1 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je sintetički 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) vezan za N-terminus domena (a).
[0191] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključen sterički veznik (C), mesto cepanja urokinaze (RWR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Dodatno na N-terminus efektorskog peptida je vezan polihistidinski transportni domen (HHHHHH). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
TRANS1-(SEQ. br.41)-LINKER14-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
4
[0192] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.14 i SEQ. br.70 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0193] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.14 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.70. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 15. Fuzioni protein od SEQ. br. 15
[0194] Protein od SEQ. br.15 je fuzioni protein koji ima dužinu od 200 aminokiselina i masu od 23,3 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) je vezan za N-terminus domena (a).
[0195] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključen sterički veznik (C), 8-arginine transportna sekvenca (RRRRRRRR), mesto cepanja urokinaze (RWR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Dodatno, histidine transportna sekvenca (HHHHHH) je vezan za N-terminus efektorskog peptida. Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
TRANS1-(SEQ. br.41)-LINKER14-TRANS3-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
[0196] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.15 i SEQ. br.71 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0197] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.15 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.71. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 16. Fuzioni protein od SEQ. br. 16
[0198] Protein od SEQ. br.16 je fuzioni protein koji ima dužinu od 202 aminokiselina i masu od 23,1 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je sintetički 14-aminokiselinski litički peptid (SEQ. br.41) vezan za C-terminus domena (a).
[0199] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RWR) i 8-arginine transportna sekvenca (RRRRRRRR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL 121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN TRANS3-(SEQ. br.41)
[0200] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.16 i SEQ. br.72 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0201] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.16 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.72. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran i sa histidinskom oznakom (Ex.16<a>) i bez histidinske oznake (Ex.16<b>).
Primer 18. Fuzioni protein od SEQ. br. 18
[0202] Protein od SEQ. br.18 je fuzioni protein koji ima dužinu od 203 aminokiselina i masu od 23,6 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 116-281, i domen (b) efektorskog peptida je 27-aminokiselinski peptid hCAP-18/LL-37 (SEQ. br.43) vezan za N-terminus domena (a).
[0203] Dodatno između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno mesto cepanja urokinaze (RWR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
4
(SEQ. br.43)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
[0204] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.18 i SEQ. br.74 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0205] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.18 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.74. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 19. Fuzioni protein od SEQ. br. 19
[0206] Protein od SEQ. br.19 je fuzioni protein koji ima dužinu od 203 aminokiselina i masu od 23,3 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 116-281, i domen (b) efektorskog peptida je 27-aminokiselinski peptid BAMP-28 (SEQ. br.44) vezan za N-terminus domena (a).
[0207] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno mesto cepanja urokinaze (RWR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.44)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
[0208] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.19 i SEQ. br.75 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0209] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.19 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.75. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein
4
je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 20. Fuzioni protein od SEQ. br. 20
[0210] Protein od SEQ. br.20 je fuzioni protein koji ima dužinu od 200 aminokiselina i masu od 22,8 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 24-aminokiselinski analog izoforma C litičkog peptida od Entamoeba histolytica (SEQ. br.
45) vezan za C-terminus domena (a).
[0211] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGSGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i mesto cepanja urokinaze (RWR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(SEQ. br. 45)
[0212] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.20 i SEQ. br.76 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0213] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.20 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.76. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 21. Fuzioni protein od SEQ. br. 20
[0214] Protein od SEQ. br.20 je fuzioni protein koji ima dužinu od 200 aminokiselina i masu od 22,8 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 24-aminokiselinski analog izoforma litičkog peptida od Entamoeba histolytica (SEQ. br.46) vezan za C-terminus domena (a).
4
[0215] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGSGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i mesto cepanja urokinaze (RVVR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(SEQ. br. 46)
[0216] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.21 i SEQ. br.77 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0217] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.21 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.77. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 22. Fuzioni protein od SEQ. br. 22
[0218] Protein od SEQ. br.22 je fuzioni protein koji ima dužinu od 200 aminokiselina i masu od 22,8 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 24-aminokiselinski analog izoforma B litičkog peptida od Entamoeba histolytica (SEQ. br.
47) vezan za C-terminus domena (a).
[0219] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGSGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i mesto cepanja urokinaze (RVVR). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(SEQ. br. 47)
[0220] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.22 i SEQ. br.78 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0221] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.22 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.78. Plazmid koji sadrži
4
kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 23. Fuzioni protein od SEQ. br. 23
[0222] Protein od SEQ. br.23 je fuzioni protein koji ima dužinu od 190 aminokiselina i masu od 22,1 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 12-aminokiselinski fragment HA2 domena hemaglutinina virusa gripa (SEQ. br.48) vezan za N-terminus domena (a).
[0223] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno 7-arginin transportna sekvenca (RRRRRRR), mesto cepanja urokinaze (RWR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.48)-TRANS2-UROKIN-MMP-(TRAIL121-281)
[0224] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.23 i SEQ. br.79 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0225] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.23 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.79. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri B, koristeći E. coli BL21 (DE3) or Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran i sa histidinskom oznakom (Ex.23<a>) i bez histidinske oznake (Ex. 23<b>).
Primer 30. Fuzioni protein od SEQ. br. 30
[0226] Protein od SEQ. br.30 je fuzioni protein koji ima dužinu od 200 aminokiselina i masu od 22,5 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je
4
33-aminokiselinski aktivni fragment ljudskog perforina (SEQ. br.54) vezan za C-terminus domena (a).
[0227] Dodatno, između domena (a) i domena (b) je uključena sterička veznik sekvenca (GGGGSG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER8-(SEQ. br.54)
[0228] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.30 i SEQ. br.86 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0229] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.30 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.86. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 31. Fuzioni protein od SEQ. br. 31
[0230] Protein od SEQ. br.31 je fuzioni protein koji ima dužinu od 210 aminokiselina i masu od 23,5 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 33-aminokiselinski aktivni fragment ljudskog perforina (SEQ. br.54) vezan za C-terminus domena (a).
[0231] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSG), mesto cepanja urokinaze (RVVR), i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER8-UROKIN-MMP-(SEQ. No,54)
[0232] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.31 i SEQ. br.87 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0233] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.31 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.87. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri B, koristeći E. coli BL21 (DE3) or Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 32. Fuzioni protein od SEQ. br. 32
[0234] Protein od SEQ. br.32 je fuzioni protein koji ima dužinu od 436 aminokiselina i masu od 48 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 116-281, i domen (b) efektorskog peptida je 251-aminokiselinski parasporin-2 od Bacillus thuringensis (SEQ. br.55) vezan za N-terminus domena (a).
[0235] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno mesto cepanja urokinaze (RVVR), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG) i sterički veznik (GSGGGSGGG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.55)-UROKIN-MMP-LINKER11-(TRAIL116-281)
[0236] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.32 i SEQ. br.88 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0237] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.32 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.88. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri B, koristeći E. coli BL21 (DE3) ili Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran sa histidinskom oznakom.
Primer 34. Fuzioni protein od SEQ. br. 91
[0238] Protein od SEQ. br.91 je fuzioni protein koji ima dužinu od 223 aminokiselina i masu od 25,2 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je
1
39-aminokiselinski fuzioni peptid koji sadrži PDGFR inhibitor i sintetički litički peptid (SEQ. br. 125), vezan za N-terminus domena (a).
[0239] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeno mesto cepanja urokinaze (RVVR) i mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), sterički veznik (GG), sterički veznik (CAAACAAC) i sterički veznik (SGG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.125)-UROKIN-MMP- LINKER1-LINKER13-LINKER16-(TRAIL121-281)
[0240] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.91 i SEQ. br.108 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0241] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.91 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.108. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 35. Fuzioni protein od SEQ. br. 92
[0242] Protein od SEQ. br.92 je fuzioni protein koji ima dužinu od 223 aminokiselina i masu od 25,6 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 95-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski fuzioni sintetički litički peptid (SEQ. br.41), vezan za N-terminus domena (a).
[0243] Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeni poliargininski transportni domen (RRRRRRR), mesto cepanja furina (RKKR), sterički veznik (GGG), i sterički veznik (CAAACAAC). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.41)-TRANS2-FURIN-LINKER2-LINKER13-(TRAIL95-281)
2
[0244] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.92 i SEQ. br.109 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0245] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.92 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.109. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad.
[0246] Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 36. Fuzioni protein od SEQ. br. 93
[0247] Protein od SEQ. br.93 je fuzioni protein koji ima dužinu od 232 aminokiselina i masu od 26,7 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 95-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski fuzioni sintetički litički peptid (SEQ. br.41), vezan za N-terminus domena (a). Dodatno, između domena (b) i domena (a) nalaze se sekvencijalno uključeni poliargininski transportni domen (RRRRRRR), mesto cepanja furina (RKKR), prirodna mesto cepanja furina (HRQPRGWEQ) sterički veznik (GGG), i sterički veznik (CAAACAAC). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(SEQ. br.41)-TRANS2-FURIN-FURN.NAT-LINKER2-LINKER13- (TRAIL95-281)
[0248] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.93 i SEQ. br.110 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0249] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.93 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.110. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 37. Fuzioni protein od SEQ. br. 94
[0250] Protein od SEQ. br.94 je fuzioni protein koji ima dužinu od 207 aminokiselina i masu od 23 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski fuzioni sintetički litički peptid (SEQ. br.41), vezan za C-terminus domena (a).
[0251] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RWR), transportni domen (YARAAARQARA) i sterički veznik (GG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(SEQ. br. 41)
[0252] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.94 i SEQ. br.111 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0253] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.94 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.111. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 38. Fuzioni protein od SEQ. br. 95
[0254] Protein od SEQ. br.95 je fuzioni protein koji ima dužinu od 218 aminokiselina i masu od 24,4 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 25-aminokiselinski analog pleurodicina (SEQ. br.126), vezan za C-terminus domena (a).
[0255] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja
4
urokinaze (RWR), transportni domen (YARAAARQARA) i sterički veznik (GG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(SEQ. br. 126)
[0256] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.95 i SEQ. br.112 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0257] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.95 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.112. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 39. Fuzioni protein od SEQ. br. 96
[0258] Protein od SEQ. br.96 je fuzioni protein koji ima dužinu od 219 aminokiselina i masu od 24,5 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 26-aminokiselinski analog pleurodicina (SEQ. br.127), vezan za C-terminus domena (a).
[0259] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RWR), transportni domen (YARAAARQARA) i sterički veznik (GG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(SEQ. br. 127)
[0260] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.96 i SEQ. br.113 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0261] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.96 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.113. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 40. Fuzioni protein od SEQ. br. 97
[0262] Protein od SEQ. br.97 je fuzioni protein koji ima dužinu od 212 aminokiselina i masu od 23,9 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 17-aminokiselinski sintetički litički peptid (SEQ. br.128), vezan za C-terminus domena (a).
[0263] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RVVR), transportni domen (THRPPMWSPVWP) i sterički veznik (GGG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS5-LINKER2-(SEQ. br. 127)
[0264] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.97 i SEQ. br.114 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0265] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.97 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.114. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 41. Fuzioni protein od SEQ. br. 98
[0266] Protein od SEQ. br.98 je fuzioni protein koji ima dužinu od 207 aminokiselina i masu od 23,3 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i domen (b) efektorskog peptida je 14-aminokiselinski sintetički litički peptid (SEQ. br.41), vezan za C-terminus domena (a).
[0267] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), mesto cepanja urokinaze (RVVR), transportni domen (YGRKKRRQRRR) i sterički veznik (GG). Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS6-LINKER1-(SEQ. br. 41)
[0268] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.98 i SEQ. br.115 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0269] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.98 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.115. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 45. Fuzioni protein od SEQ. br. 102
[0270] Protein od SEQ. br.102 je fuzioni protein koji ima dužinu od 234 aminokiselina i masu od 26,2 kDa, gde je domen (a) sekvenca TRAIL 121-281, i dva domena (b) efektorskog peptida su 25-aminokiselinski melitin peptid (SEQ. br.132) i 14-aminokiselinski sintetički litički peptid (SEQ. br.41), vezani sekvencijalno na C-terminus domena (a).
[0271] Dodatno, između domena (a) i domena (b) nalazi se sekvencijalno uključen sterički veznik (GGGGSGGGG), mesto cepanja metaloproteaze (PLGLAG), i mesto cepanja urokinaze (RVVR) i sterički veznik (GG). Dodatno sterički veznik (GGGGS) je uključen između dva efektorska domena.
[0272] Stoga, struktura fuzionog proteina pronalaska je kako sledi:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-LINKER1-(SEQ.No,132)-LINKER4-(SEQ.br. 41)
[0273] Aminokiselinska sekvenca i sekvenca koja kodira DNK, koje obuhvataju kodone optimizovane za eksprimiranje kod E. coli su, respektivno, SEQ. br.102 i SEQ. br.119 kako je prikazano u priloženom Listingu sekvenci.
[0274] Aminokiselinska sekvenca SEQ. br.102 strukture opisane iznad je korišćena kao šablon za generisanje svoje kodirajuće DNK sekvence SEQ. br.119. Plazmid koji sadrži kodirajuću sekvencu DNK je generisan i prekomerno eksprimiranje fuzionog proteina se sprovodi u skladu sa opštim procedurama opisanim iznad. Prekomerno eksprimiranje je izvršeno prema opštoj proceduri A, koristeći E. coli Tuner (DE3) liniju od Novagen. Protein je razdvojen elektroforezom u skladu sa opštom procedurom opisanom iznad. Protein je eksprimiran bez histidinske oznake.
Primer 51. Ispitivanje antitumorske aktivnosti fuzionih proteina
[0275] Ispitivanje anti-tumorske aktivnosti fuzionih proteina izvedeno je in vitro u testu citotoksičnosti na linijama tumorskih ćelija i in vivo kod miševa. Za potrebe poređenja korišćeni su rhTRAIL114-281 protein i placebo.
1. Merenje kružnog dihroizma: određivanje sastava sekundarnih struktura dobijenih proteina
[0276] Kvalitet priprema fuzionih proteina u smislu njihovih struktura određen je kružnim dihroizmom za fuzione proteine Primera 23, Primera 11 i Primera 13.
[0277] Kružni dihroizam se koristi za određivanje sekundarnih struktura i konformacije proteina. CD postupak koristi optičku aktivnost proteinskih struktura, koja se manifestuje u rotaciji ravni polarizacije svetlosti i pojave eliptičke polarizacije. CD spektar proteina u dalekoj ultraljubičastoj (UV) vodi precizan podatak o konformaciji glavnog polipeptidnog lanca.
Dijaliza
[0278] Uzorci proteina koji se analiziraju nakon formulacije u pufer koji se sastoji od 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerola, 0,1 mM ZnCl2, 80 mM saharoze, 5 mM DTT, dijalizuju se u vrećama za dijalizu (Sigma-Aldrich) sa prekidom 12 kDa. Dijaliza je izvršena u poređenju sa 100-strukim viškom (v/v) pufera u odnosu na proteinske preparate, uz mešanje nekoliko sati na 4°C. Nakon završetka dijalize, svaki preparat je centrifugiran (25 000 rpm/min, 10 min, 4°C) i supernatanti su sakupljeni. Koncentracija proteina u dobijenim uzorcima je određena Bradfordovim postupkom.
[0279] Merenje kružnog dihroizma za proteine u opsegu koncentracija 0,1-2,7 mg/ml je izvedeno na Jasco J-710 spektropolimetru, u kvarcnoj kiveti sa optičkim putem 0,2 mm ili 1 mm. Merenje je izvršeno pod protokom azota na 7 l/min, što je omogućilo merenje u talasnoj dužini od 195 do 250 nm. Parametri merenja: spektralna rezolucija od - 1 nm; polu širina svetlosnog zraka 1 nm; osetljivost 20 mdeg, vreme prosecanja za jednu talasnu duljinu - 8 s, brzina skeniranja 10 nm/min.
[0280] Dobijeni spektri su numerički analizirani u opsegu od 193-250 nm koristeći CDPro softver. Tačke za koje je napon na fotomultiplici prevazišao 700 V su izostavljeni, zbog previše niskog odnosa signala i šuma u ovom opsegu talasnih dužina.
[0281] Dobijeni podaci služili su za izračunavanje određenog sadržaja sekundarnih struktura u analiziranim proteinima uz korišćenje softvera CDPro (Tabela 1).
Tabela 1. Sadržaj sekundarnih struktura u analiziranim proteinima-
[0282] Kontrolni molekul (rhTRAIL114-281) pokazuje karakteristike CD spektra za proteine sa pretežno strukturama tipa β-lista (oštro predstavljeni minimum eliptičnosti na talasnoj dužini od 220 nm). Ovo potvrđuje izračunavanje komponenti sekundarne strukture, što ukazuje na marginalni broj α-spirala elemenata.
[0283] Dobijeni rezultat je takođe konzistentan sa podacima iz kristalne strukture hTRAIL proteina i karakterističan je za fuzioni protein iz pronalaska Primera 23, gde beta elementi čine 42% njihove strukture. Za proteine Primera 11 i Primera 13 veći sadržaj alfa-spirala je primećen (dodatni minimum spektra na talasnoj dužini 208 nm). Ovo je zbog prisustva u konstruktima motiva KLAKLAK koji imaju jak amfipatski karakter i oblikuju alfa-sprilane strukture. Nažalost, zbog male stabilnosti proteina iz Primera 23, Primera 11 i Primera 13 u puferu za CD merenja i niske koncentracije analiziranih preparata, njihove spektre karakterišu visoki nivoi šuma i imaju nisku rezoluciju. Zbog toga, možda ne odražavaju u potpunosti stvarnu situaciju, već samo sugerišu rezultat.
2. Testovi na ćelijskim linijama in vitro
Ćelijske linije
[0284] Ćelijske linije su dobijene od ATCC i CLS, a zatim se razmnožavaju i deponuju u Adamed's Laboratory of Biology Cell Line Bank. Tokom eksperimenta, ćelije su se rutinski proveravale za prisustvo mikoplazme pomoću PCR tehnike koristeći komplet Venor®GeM Mycoplasma PCR Detection Kit (Minerva Biolabs, Berlin, Germany). Kulture se održavaju u standardnim uslovima: 37°C, 5% CO2(u slučaju DMEM - 10% CO2) i 85% relativne vlažnosti. Posebne ćelijske linije su kultivisane u odgovarajućim medijima, kako preporučuje ATCC.
Tabela 2. Aderentne ćelije
1
2
Tabela 3. Neaderentne ćelije:
MTT test citotoksičnosti
[0285] MTT test je kolorimetrijski test koji se koristi za merenje proliferacije, održivosti i citotoksičnosti ćelija. Sastoji se od sastava žute tetrazolijumove soli MTT (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolium bromid) formazanu obojenom ljubičastom bojom nerastvorljivom u vodi, pomoću mešanja sa mitohondrijskim enzimom sukcinat-tetrazolium reduktazom. 1. MTT redukcija se dešava samo u živim ćelijama. Analiza podataka se sastoji u određivanju IC50koncentracije proteina (u ng/ml), pri čemu se 50% redukcija broja ćelija dešava u populaciji koja se tretira u poređenju sa kontrolnim ćelijama. Rezultati su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism 5.0. Ispitivanje je izvedeno prema opisima literature (Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).
[0286] Medijum ćelijske kulture je razređen do definisane gustine (10<4>- 10<5>ćelija po 100 µl). Tada je 100 ml adekvatno razblažene suspenzije ćelija naneseno na ploču sa 96 komorica u triplikatu. Tako pripremljene ćelije su inkubirane 24 časa na 37°C u 5% ili 10% CO2, u zavisnosti od korišćenog medijuma, a zatim je ćelijama (u 100 µl medijuma) dalje dodato 100 µl medijuma koji sadrži različite koncentracije testiranih proteina. Posle inkubacije ćelija sa testiranim proteinima tokom perioda od narednih 72 časa, što je ekvivalentno 3-4 razdvajanja ćelija, medijum sa test proteinom je dodat sa 20 ml MTT radnog rastvora [5 mg/ml], i inkubacija je nastavljena 3 časa na 37°C u 5% CO2. Tada je uklonjen medijum sa MTT rastvorom, a kristali formazana su rastvoreni dodavanjem 100 µl DMSO. Nakon mešanja, apsorbancija je merena na 570 nm (referentni filter 690 nm).
EZ4U test citotoksičnosti
[0287] EZ4U (Biomedica) test je korišćen za testiranje citotoksične aktivnosti proteina u neaderentnim ćelijskim linijama. Test je modifikacija MTT postupka, pri čemu je formazan formiran u redukciji soli tetrazoliuma rastvorljiv u vodi. Studija preživljavanja ćelija je sprovedena nakon kontinuirane 72-časovne inkubacije ćelija sa proteinima (sedam koncentracija proteina, svaki u triplikatu). Na osnovu toga su utvrđene IC50vrednosti (kao prosek dva nezavisna eksperimenta) pomoću softvera GraphPad Prism 5. Kontrolne ćelije su inkubirane samo sa rastvaračem.
4
[0288] Rezultati in vitro testova citotoksičnosti su rezimirani kao IC50vrednosti (ng/ml), što odgovara koncentraciji proteina na kojoj se posmatra citotoksično dejstvo fuzionih proteina na nivou od 50% u odnosu na kontrolne ćelije koje se tretiraju samo sa rastvaračem. Svaki eksperiment predstavlja prosečnu vrednost najmanje dva nezavisna eksperimenta izvedena u triplikatu. Kao kriterijum nedostatka aktivnosti proteinskih preparata usvojen je IC50limit od 2000 ng/ml. Fuzioni proteini sa IC50 vrednostima iznad 2000 smatrani su neaktivnim.
[0289] Selektovane ćelije za ovaj test uključuju linije tumorskih ćelija koje su prirodno otporne na TRAIL protein (kriterijum prirodne rezistencije na TRAIL:IC50za TRAIL protein > 2000), kao i linije tumorskih ćelija osetljive na TRAIL protein i otporne na doksorubicin liniju MES-SA/DX5 kao liniju kancera koja je otporna na konvencionalne lekove protiv kancera.
[0290] Nediferencirana HUVEC ćelijska linija je korišćena kao zdrava kontrolna ćelijska linija za procenu efekta/toksičnosti fuzionih proteina u ćelijama koje nisu kancer.
[0291] Dobijeni rezultati potvrđuju mogućnost prevazilaženja otpornosti ćelijskih linija na TRAIL primenom određenih fuzionih proteina pronalaska na ćelije prirodno otporne na TRAIL. Kada su fuzioni proteini iz pronalaska davani u ćelije osetljive na TRAIL, u nekim slučajevima je primećena jasna i snažna potencizacija potencije delovanja, što se manifestovalo u smanjenim IC50vrednostima fuzionog proteina u poređenju sa IC50samo za TRAIL. Pored toga, dobijena je citotoksična aktivnost fuzionog proteina prema pronalasku u ćelijama otpornim na klasični antioksidativni lek doksorubicin, a u nekim slučajevima bio je jači od aktivnosti samog TRAIL-a.
[0292] Vrednosti IC50iznad 2000 dobijene za ne-kancerske ćelijske linije pokazuju odsustvo toksičnih efekata povezanih sa upotrebom proteina pronalaska za zdrave ćelije, što ukazuje na potencijalnu nisku sistemsku toksičnost proteina.
Određivanje citotoksične aktivnosti odabranih proteinskih preparata na proširenoj liniji tumorskih ćelijskih linija
[0293] Tabela 4 prikazuje rezultate testova citotoksične aktivnosti in vitro za izabrane fuzione proteine pronalaska protiv širokog panela tumorskih ćelija iz različitih organa, što odgovara širokom spektru najčešćih kancera.
[0294] Rezultati eksperimenta su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD). Sve kalkulacije i grafici su pripremljeni pomoću softvera GraphPad Prism 5.0.
[0295] Dobijene vrednosti IC50potvrđuju visoku citotoksičnu aktivnost fuzionih proteina i time njihovu potencijalnu korist u lečenju kancera.
ka las napro natei
proih onzi fu
ost vntiak ačk ksito oit
4.C ael
Tab
skaala
pronina ote prh oniuzist f
vnoakti
čka ksi o otCit 4a.ela
Tab
ska nalapro einatpro nih uziost f vnoaktička oksiitot
4c. C laeTab
ka las onapratein pro
nihzio fu ost vn iakt
čka ksi oto Cit 4d.ela
Tab
3. Antitumorska efektivnost fuzionih proteina in vivo na ksenograftima
[0296] Antitumorska aktivnost priprema proteina je testirana u mišjem modelu ljudskog kancera debelog creva Colo 205 i HCT-116, ljudskog kancera pluća A549 i NCI-H460-Luc, ljudskog kancera prostate PC-3, ljudskog kancera pankreasa Panc-1 i MIA PaCa-2, ljudskog kancera jetre PCL/PRF/5 i HepG2, i ljudskog sarkoma materice MES-SA.Dx5 otpornog na više lekova.
Ćelije
[0297] Ćelije ljudskog kancera pluća A549 i NCI-H460-Luc2 i ljudskog kancera prostate PC3 održavane su u RPMI1640 medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom.
[0298] Ćelije ljudskog kancera debelog creva Colo 205 održavane su u RPMI1640 medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) (opciono pomešane u odnosu 1:1 sa Opto-MEM (Invitrogen, Cat. br.22600-134) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom.
[0299] Ćelije ljudskog kancera pankreasa PANC-1, ljudskog kancera jetre PLC/PRF/5, kancera pankreasa MIA PaCa-2 i ljudskog kancera debelog creva SW-620 održavane su u DMEM medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom.
[0300] Ćelije ljudskog kancera debelog creva HCT-116 održavane su u McCoy's medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom.
[0301] Ćelije ljudskog sarkoma materice MES-SA.Dx5 otpornog na više lekova održavane su u McCoy's medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom, i 1 IJM doksorubicin hidrohloridom (Sigma, Cat. br. D1515-10MG). Tri dana pre implantacije ćelija, ćelije su kultivisane u medijumu bez doksorubicina.
[0302] Ćelije ljudskog kancera jetre HepG2 održavane su u MEM medijumu (HyClone, Logan, UT, USA) obogaćenom sa 10% fetalnim telećim serumom i 2 mM glutaminom. Na dan graftovanja miševa, ćelije su odvojene od podrške pranjem ćelija sa tripisinom
2
(Invitrogen), zatim su ćelije centrifugirane na 1300 rpm, 4°C, 8 min., suspendovane u HBSS puferu (Hanks medijum).
[0303] Na dan graftovanja miševa, ćelije su odvojene od podrške pranjem ćelija sa tripisinom (Invitrogen), zatim su ćelije centrifugirane na 1300 rpm, 4°C, 8 min., suspendovane u HBSS puferu (Hanks medijum).
Miševi
[0304] Ispitivanje antitumorske aktivnosti proteina prema pronalasku sprovedeno je na 4-6 nedjelja starim (model kancera pluća) Cby.Cg-foxn1(nu)/J) miševima ili na 9-10 nedelja starim (model kancera prostate) dobijenim od Centrum Medycyny Doświadczalnej in Biatystok, na 4-5 nedelje starim ženkamaCrl:SHO-Prkdc<scid>Hr<h>miševA dobijenim od Charles River Germany. Miševi su držani pod specifičnim uslovima bez patogena sa slobodnim pristupom hrani i demineralizovanoj vodi (ad libitum). Svi eksperimenti na životinjama su sprovedeni u skladu sa smernicama: „Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education“ objavljenim od strane New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research i odobreni su od strane IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation u Varšavi (br.71/2009).
Tok i evaluacija eksperimenata
[0305] Veličina tumora je merena korišćenjem elektronskog kalupa, zapremina tumora izračunata je pomoću formule: (a<2>x b)/2, gde je a = kraća dijagonala tumora (mm) i b = duža dijagonala tumora (mm). Inhibicija rasta tumora izračunata je pomoću formule:
TGU [%] (inhibicija rasta tumora) = (WT/WC) x 100 – 100%
gde je WT prosečna zapremina tumora u grupi za lečenje, a WC je prosečna zapremina tumora u kontrolnoj grupi.
[0306] Rezultati eksperimenta su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD). Svi proračuni i grafici su pripremljeni pomoću programa GraphPad Prism 5.0.
Model c kancera pluća
Eksperiment A.
[0307] Na dan 0 Cby.Cg-foxn1(nu)/J miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>A549 ćelija suspendovanih u 0,1 ml smeši HBSS:Matrigel 4:1 koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 19 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~75 mm3 i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(15 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) kao poređenje i voda za injekcije kao kontrola.
Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 35 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0308] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 1 i Slici 2 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>i komparativno sa rhTRAIL114-281.
[0309] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 1 i 2 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva A549 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 28% relaitvno u odnosu na kontrolu na dan 35 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 0%. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0310] Eksperiment B. Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 7x10<6>A549 ćelija suspendovanih u 0,1 ml smeši HBSS:Matrigel 3:1 koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 17 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~100-120 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(40 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 34 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0311] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 3 i Slici 4 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>i komparativno rhTRAIL114-281.
4
[0312] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 3 i 4 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva A549 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 45% u odnosu na kontrolu na dan 34 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 21,8%. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
Eksperiment C.
[0313] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>NCI-H460-Luc2 ćelija suspendovanih u 0,1 ml HBSS puferu koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 11 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~100-120 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(40 mg/kg i 30 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana (u slučaju fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>prva primena pri dozi 40 mg/kg i kasnija pri 30 mg/kg. Na dan 29 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0314] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 5 i Slici 6 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>i komparativno sa rhTRAIL114-281.
[0315] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 5 i 6 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva inhibiciju rasta tumora NCI-H460-Luc2, uz TGI 93% u odnosu na kontrolu na dan 29 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 76%. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0316] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Model kancera prostate
[0317] Na dan 0 Cby.Cg-foxn1(nu)/J miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>PC3 ćelija suspendovanih u 0,18 ml HBSS pufera i 0,02 ml Matrigela koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 29 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~90 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(15 mg/kg) i 0,9% NaCl kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) jednom dnevno tokom 6 dana. Na dan 60 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0318] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 7 i Slici 8 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>.
[0319] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 7 i 8 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva PC3 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 33% u odnosu na kontrolu na dan 60 eksperimenta.
[0320] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Model kancera pankreasa
Eksperiment na PANC-1 ćelijama
[0321] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>PANC-1 ćelija suspendovanih u 0,1 ml smeši HBSS:Matrigel 3:1 koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 31 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~110 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(40 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 42 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0322] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 9 i Slici 10 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>i komparativno sa rhTRAIL114-281.
[0323] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 9 i 10 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva PANC-1 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 32,6% u odnosu na kontrolu na dan 42 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 26%. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0324] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Eksperiment B na MIA PaCa-2 ćelijama
[0325] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) u desnoj bočnoj regiji sa 5x10<6>MIA PaCa-2 ćelija suspendovanih u 0,1 ml 3:1 smeše HBSS pufer:Matrigel koristeći špric sa 0,5 x 25 mm iglom (Bogmark). Kada su tumori dostigli veličinu od 60-398 mm<3>(dan 20), miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~ 170 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>(50 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (50 mg/kg) kao uporedno i referentno jedinjenje gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly) (50 mg/kg). Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) šest puta svakog drugog dana, gemcitabin je primenjen intraperitonalno (i.p.) pri istom rasporedu. Kontrolne grupe su primile formulacioni pufer.
[0326] Kada je terapeutska grupa dostigla prosečnu veličinu tumora od ~ 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani dislokacijom cerviksa.
[0327] Rezultati eksperimenta dobijeni kod miševa Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>opterećenih sa MIA PaCa-2 karcinomom pankreasa koji su tretirani sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<b>i komparativno sa rhTRAIL114-281 i gemcitabinom su prikazani na Slici 19 kao dijagram promena zapremine tumora i na Slici 20 koja pokazuje inhibiciju rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0328] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 19 i 20 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>izaziva MIA PaCa-2 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 93% u odnosu na kontrolu na dan 61 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 i gemcitabin kao komparativne reference, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 68% i 42,6%, respektivno. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL i standardnom hemoterapijom.
Model kancera debelog creva
[0329] Eksperiment na HCT116 ćelijama Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>HCT116 ćelija suspendovanih u 0,1 ml HBSS puferu koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 18 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~400mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(35 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (5 mM NaH2PO4, 95 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, 80 mM saharoza, pH 8,0) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 32 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0330] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 11 i Slici 12 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole kod miševa tretiranih sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 11<a>i komparativno sa rhTRAIL114-281.
[0331] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 11 i 12 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva inhibiciju rasta tumora HCT116, uz TGI 33,5% u odnosu na kontrolu na dan 32 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 5,6%. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0332] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Eksperiment A1 na HCT116 ćelijama
[0333] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) u desnoj bočnoj regiji sa 5x10<6>HCT116 ćelija suspendovanih u 0,1 ml 3:1 smeše HBSS pufer:Matrigel koristeći špric sa 0,5 x 25 mm iglom (Bogmark). Kada su tumori dostigli veličinu od 71-432 mm<3>(dan 13), miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~ 180 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>(90 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (65 mg/kg) kao poređenje. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) šest puta svakog drugog dana. Kontrolne grupe su primile formulacioni pufer.
[0334] Kada je eksperimentalna grupa dostigla prosečnu veličinu tumora od ~ 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani dislokacijom cerviksa.
[0335] Rezultati eksperimenta dobijeni kod miševa CrLSHO-Prkdc<scid>Hr<hr>opterećenih sa HCT116 kancerom debelog creva koji su tretirani sa fuzionim proteinima pronalaska Primera 16<b>i komparativno sa rhTRAIL114-281 su prikazani na Slici 21 kao dijagram promena zapremine tumora i na Slici 22 koja pokazuje inhibiciju rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0336] Rezultati eksperimenata prikazani na Slikama 21 i 22 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>izaziva HCT116 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 65,8% u odnosu na kontrolu na dan 24 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 37,9%. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
Eksperiment B on SW620 ćelije
[0337] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>SW620 ćelija suspendovanih u 0,1 ml smeši HBSS:Matrigel 3:1 koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 17 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~320 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<a>(20 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 31 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0338] Rezultati eksperimenta kod miševa Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>opterećenih sa SW620 koji su tretirani sa fuzionim proteinom pronalaska Primera 16<a>i komparativno sa rhTRAIL114-281 su prikazani na Slici 13 i Slici 14 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0339] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 13 i 14 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<a>izaziva inhibiciju rasta tumora SW620, uz TGI jednak 25% u poređenju sa kontrolom na dan 31 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, nije dobijen inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od -9%. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0340] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
[0341] Eksperiment C na Colo205 ćelijama Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 5x10<6>Colo205 ćelija suspendovanih u 0,1 ml HBSS puferu koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 13 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~115 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama.
[0342] Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<a>(30 mg/kg), i rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 33 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
[0343] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 15 i Slici 16 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0344] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 15 i 16 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<a>izaziva inhibiciju rasta tumora Colo205, uz TGI jednak 80% u odnosu na kontrolu na dan 33 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 18,8%. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0345] Testirani fuzioni proteini nisu izazvali značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Model sarkoma materice otporan na više lekova
[0346] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) sa desne strane sa 7x10<6>MES-SA/Dx5 ćelija suspendovanih u 0,1 ml smeši HBSS:Matrigel 10:1 koristeći špric sa iglom 0,5 x 25 mm (Bogmark). Na dan 19 eksperimenta miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~180 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>(30 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) kao poređenje u odnosu na formulacioni pufer (19 mM NaH2PO481 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 5 mM glutation, 0,1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7,4) kao kontrola. Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) 6 puta jednom dnevno svakog drugog dana. Na dan 35 eksperimenta miševi su žrtvovani prekidanjem kičmene moždine.
1
[0347] Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 17 i Slici 18 kao dijagram promena zapremine tumora i inhibicija rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0348] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 17 i 18 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 11<a>izaziva MES-SA/Dx5 inhibiciju rasta tumora, uz TGI jednak 81% relaitvno u odnosu na kontrolu na dan 35 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 koji je korišćen kao komparativna referenca, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 29%. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL.
[0349] Testirani fuzioni protein nije izazvao značajne nuspojave manifestovane smanjenjem telesne težine miševa (tj. manje od 10% početne telesne težine). Ovo pokazuje nisku sistemsku toksičnost proteina pronalaska.
Model kancera jetre
Eksperiment na HepG2 ćelijama
[0350] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) u desnoj bočnoj regiji sa 7x10<6>of HepG2 ćelije suspendovanih u 0,1 ml 3:1 smeše HBSS pufer:Matrigel koristeći špric sa 0,5 x 25 mm iglom (Bogmark). Kada su tumori dostigli veličinu od 64-529 mm<3>(dan 25), miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~ 230 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>(80 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (50 mg/kg) kao uporedno i referentno jedinjenje 5-FU (5-Fluorouracil, Sigma-Aldrich) (20 mg/kg). Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) šest puta svakog drugog dana, 5-FU je primenjen intraperitonalno (i.p.). Kontrolne grupe su primile formulacioni pufer.
[0351] Kada je terapeutska grupa dostigla prosečnu veličinu tumora od ~ 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani dislokacijom cerviksa.
[0352] Rezultati eksperimenta obtained su prikazani na Slici 23 kao dijagram promena zapremine tumora i na Slici 24 koja pokazuje inhibiciju rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
2
[0353] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 23 i 24 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>izaziva HepG2 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 94,6% u odnosu na kontrolu na dan 42 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 kao komparativnu referencu, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 23,2%. Referentno jedinjenje, 5-FU, nije pokazalo efikasnost protiv HepG2 tumora. Stoga, fuzioni proteini pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL i standardnom hemoterapijom.
Eksperiment B na PLC/PRF/5 ćelijama
[0354] Na dan 0 Crl:SHO-Prkdc<scid>Hr<hr>miševi su graftovani potkožno (s.c.) u desnoj bočnoj regiji sa 7x10<6>PLC/PRF/5 ćelija suspendovanih u 0,1 ml 3:11 smeše HBSS pufer:Matrigel koristeći špric sa 0,5 x 25 mm iglom (Bogmark). Kada su tumori dostigli veličinu od 72-536 mm<3>(dan 29), miševi su nasumično raspoređeni kako bi se dobila prosečna veličina tumora u grupi od ~ 205 mm<3>i dodeljeni su tretman grupama. Tretman grupama su primenjene pripreme fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>(50 mg/kg) i rhTRAIL114-281 (50 mg/kg) kao uporedno i referentno jedinjenje 5-FU (5-Fluorouracil, Sigma-Aldrich) (30 mg/kg). Pripreme su primenjene intravenozno (i.v.) šest puta svakog drugog dana, except 5-FU, koji je primenjen intraperitonalno (i.p.) pri rasporedu (q1dx5)x2. Kontrolne grupe su primile formulacioni pufer.
[0355] Kada je eksperimentalna grupa dostigla prosečnu veličinu tumora od ~ 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani dislokacijom cerviksa.
[0356] Dobijeni rezultati eksperimenta prikazani su na Slici 25 kao dijagram promena zapremine tumora i na Slici 26 koja pokazuje inhibiciju rasta tumora (%TGI) kao procenat kontrole.
[0357] Rezultati eksperimenta prikazani na Slikama 25 i 26 pokazuju da primena fuzionog proteina pronalaska Primera 16<b>izaziva PLC/PRF/5 inhibiciju rasta tumora, uz TGI 53% u odnosu na kontrolu na dan 43 eksperimenta. Za rhTRAIL114-281 i 5-FU kao komparativne reference, blagi inhibitorni efekat na rast tumorskih ćelija dobijen je u odnosu na kontrolu, uz TGI na nivou od 25,2% i 32,2%, respektivno. Stoga, fuzioni protein pronalaska pokazali su mnogo jači efekat u poređenju sa samim TRAIL i standardnom hemoterapijom.
LISTA SEKVENCI [0358]
4
1
2
4
1
11
12
1
14
�
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Fuzioni protein koji obuhvata:
- domen (a) koji je funkcionalni fragment sekvence rastvorljivog hTRAIL proteina, gde je navedena hTRAIL protein sekvenca predstavljena kao SEQ. br.90, čiji fragment počinje sa aminokiselinom na položaju iz opsega hTRAIL95 do hTRAIL121, inkluzivno, i završava se sa aminokiselinom na položaju hTRAIL281, ili homolog navedenog funkcionalnog fragmenta koji ima barem 70% identičnosti sekvence, poželjno 85% identičnosti, gde su navedeni funkcionalni fragment ili njegov homolog sposobni da indukuju apoptotički signal kod sisarskih ćelija nakon vezivanja za svoje receptore na površini ćelija, i
- barem jedan domen (b) koji je sekvenca citolitičkog efektorskog peptida sa amfipatičkim alfa-spirala konformacijama koje formiraju pore u ćelijskoj membrani, gde je sekvenca domena (b) vezana na C-terminusu ili N-terminusu domena (a),
2. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, gde je domen (a) izabran iz grupe koja se sastoji od hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281, i hTRAIL121-281.
3. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je domen (b) izabran iz grupe koja se sastoji od:
- pilosulin-1 od SEQ. br.36,
- pilosulin-5 od SEQ. br.37,
- 14-aminokiselinski sintetički litički peptid od SEQ. br.41,
- 27-aminokiselinski peptid FFhCAP18 od SEQ. br.43,
- BAMP-28 peptid od SEQ. br.44,
- analog izoforma C litičkog peptida od Entamoeba histolytica od SEQ. br.45, - analog izoforma litičkog peptida od Entamoeba histolytica SEQ. br.46,
- analog izoforma B litičkog peptida od Entamoeba histolytica od SEQ. br.47, - fragment HA2 domena od hemaglutinina virusa gripa od SEQ. br.48,
- aktivni fragment ljudskog perforina od SEQ. br.54,
- parasporin-2 od Bacillus thuringensis od SEQ. br.55,
- fuzioni protein koji obuhvata sintetički litički peptid sa KLLK motivom i peptid koji je antagonist PDGF receptora od SEQ. br.125,
- pleurocidin analog od SEQ. br.126,
- pleurocidin analog od SEQ. br.127, i
- sintetički litički peptid od SEQ. br.128.
4. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji između domena (a) i domena (b) ili između domena (b) sadrži domen (c) koji sadrži mesto cepanja proteaze, izabrano od sekvence koju prepoznaje metaloproteaza MMP, sekvence koju prepoznaje urokinaza uPA, i sekvence koju prepoznaje furin i sekvence koju prepoznaje prirodni furin.
5. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 4, gde je sekvenca koju prepoznaje metaloproteaza MMP Pro Leu Gly Leu Ala Gly, sekvenca koju prepoznaje urokinaza uPA je Arg Val Val Arg, sekvenca koju prepoznaje furin je Arg Lys Lys Arg, i sekvenca koju prepoznaje prirodni furin je Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu ili His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln.
6. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 4 ili 5, gde je domen (c) kombinacija sekvence koju prepoznaje metaloproteaza MMP i sekvence koju prepoznaje urokinaza uPA koje se nalaze jedna do druge.
7. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je efektorski peptid domena (b) dodatno povezan sa transportnim domenom (d), izabranim od grupe koju čine:
- (d1) polihistidinska sekvenca koja se transportuje kroz ćelijsku membranu i obuhvata 6, 7 , 8, 9, 10 ili 11 His ostatke, i
(d2) poliargininska sekvenca koja se transportuje kroz ćelijsku membranu, i obuhvata 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 Arg ostatke,
(d3) PD4 transportna sekvenca (domen transdukcije proteina 4) Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala,
(d4) transportna sekvenca koja se sastoji od sekvence koja vezuje transferin receptor Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro, and
(d5) PD5 transportna sekvenca ( domen transdukcije proteina 5, TAT protein) Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg,
i njihove kombinacije.
8. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 7, gde se sekvenca (d) nalazi na C-terminusu ili N-terminusu efektorskog peptidnog domena (b).
9. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 7, gde se transportni domen (d) nalazi između domena (b) i domena (c), ili između domena (a) i domena (c), ili između dva domena (c).
10. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 7, gde se sekvenca (d) nalazi na C-terminusu fuzionog proteina.
11. Fuzioni protein prema bilo kom patentnom zahtevu 4 do 10, koji između dva (c) domena sadrži domen (e) koji je veznik za vezivanje PEG molekula, izabran od Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly i Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu.
12. Fuzioni protein prema bilo kom patentnom zahtevu od 4 do 11, koji dodatno obuhvata fleksibilni sterički veznik između domena (a), (b) i/ili (c).
13. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 12, gde je sterički veznik izabran od Gly Gly, Gly Gly Gly, Gly Ser Gly, Gly Gly Gly Gly Ser, Gly Gly Gly Gly Gly Ser, Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly, Gly Gly Gly Gly Ser Gly, Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser, Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly, Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly, Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys, Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys, Ser Gly Gly, pojedinačnog ostatka glicina Gly, i pojedinačnog ostatka cisteina Cys, i njihovih kombinacija.
14. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ. br.4; SEQ. br.5; SEQ. br.6; SEQ. br.11; SEQ. br.12; SEQ. br.13; SEQ. br.14; SEQ. br.15; SEQ. br.16; SEQ. br.18; SEQ. br.19; SEQ. br.20; SEQ. br.21; SEQ. br.22; SEQ. br.23; SEQ. br.30; SEQ. br.31; SEQ. br.32; SEQ. br.91; SEQ. br.92; SEQ. br.93; SEQ. br.94; SEQ. br.95; SEQ. br.96; SEQ. br.97, SEQ. br.98; i SEQ. br.102.
15. Fuzioni protein prema bilo komp od prethodnih patentnih zahteva, koji je rekombinantni protein.
16. Farmaceutski sastav koji kao aktivni sastojak obuhvata fuzioni protein kako je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
1
17. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 16 u obliku za parenteralnu primenu.
18. Fuzioni protein kako je definisano bilo kojim patentnim zahtevom 1 do 15 za primenu u tretmanu neoplastičnih bolesti kod sisara, uključujući ljude.
RS20180036A 2011-12-28 2012-12-22 Antikancer fuzioni protein RS56758B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL397595A PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
PCT/IB2012/057657 WO2013098755A2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein
EP12824731.9A EP2797950B1 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56758B1 true RS56758B1 (sr) 2018-04-30

Family

ID=47716118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180036A RS56758B1 (sr) 2011-12-28 2012-12-22 Antikancer fuzioni protein

Country Status (28)

Country Link
US (1) US20140377216A1 (sr)
EP (1) EP2797950B1 (sr)
JP (1) JP6324905B2 (sr)
KR (1) KR20140110017A (sr)
CN (1) CN103987728B (sr)
AU (1) AU2012360086B2 (sr)
BR (1) BR112014015922A2 (sr)
CA (1) CA2859494A1 (sr)
CY (1) CY1120055T1 (sr)
DK (1) DK2797950T3 (sr)
EA (1) EA201491277A1 (sr)
ES (1) ES2655828T3 (sr)
HR (1) HRP20180012T1 (sr)
HU (1) HUE035794T2 (sr)
IL (1) IL232834A (sr)
LT (1) LT2797950T (sr)
MX (1) MX352796B (sr)
NO (1) NO2797950T3 (sr)
PH (1) PH12014501363A1 (sr)
PL (2) PL223487B1 (sr)
PT (1) PT2797950T (sr)
RS (1) RS56758B1 (sr)
SG (1) SG11201403282QA (sr)
SI (1) SI2797950T1 (sr)
SM (1) SMT201800026T1 (sr)
UA (1) UA115436C2 (sr)
WO (1) WO2013098755A2 (sr)
ZA (1) ZA201405460B (sr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
GB201406705D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Univ Liverpool Fusion proteins,polynucleotides,expression vectors, and their uses
WO2016127346A1 (zh) * 2015-02-11 2016-08-18 四川大学华西医院 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
CN107216385A (zh) * 2017-05-19 2017-09-29 何向锋 肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途
CN109400711B (zh) * 2017-05-31 2022-02-08 四川大学华西医院 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
WO2019067740A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Emory University FUSION PROTEINS COMPRISING CANCER TOXIN AND MARKER, NANOPARTICLES AND USES THEREOF
CN111909275A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 上海大学 延长多肽药物循环半衰期的靶向载药体系及其构建方法
CN110669146B (zh) * 2019-10-24 2023-05-23 常州大学 一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽
KR102659285B1 (ko) * 2020-08-11 2024-04-22 경북대학교 산학협력단 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
CN114031673B (zh) * 2021-12-22 2023-09-22 杭州长龄生物科技有限公司 一种多肽及其制备方法
CN114605517B (zh) * 2022-05-12 2022-09-27 广东海洋大学 一种具有广谱抗癌作用的多肽lxp-7及其应用
CN116063389B (zh) * 2022-08-23 2023-07-07 广州医科大学 递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法
EP4631515A1 (en) * 2024-04-12 2025-10-15 Fundació Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Antitumor parasporin-2 derived toxins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0753071A1 (en) 1993-04-28 1997-01-15 Worcester Foundation For Experimental Biology Cell-targeted lytic pore-forming agents
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
ES2253753T3 (es) 1995-06-29 2006-06-01 Immunex Corporation Citocina que induce apoptosis.
ATE501256T1 (de) 2003-11-03 2011-03-15 Beijing Sunbio Biotech Co Ltd Rekombinantes protein mit krebsunterdrückender wirkung, sein codierendes gen und seine verwendung
CN1256347C (zh) * 2003-12-10 2006-05-17 中国人民解放军第二军医大学 激肽原第五结构域－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
RU2409817C2 (ru) 2005-08-16 2011-01-20 Дженентек, Инк. Анализы и способы применения биомаркеров
WO2009002947A2 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
GB0723059D0 (en) 2007-11-23 2008-01-02 Nat Univ Ireland Improved cytokine design
GB0724532D0 (en) 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
WO2009094634A1 (en) * 2008-01-24 2009-07-30 Esperance Pharmaceuticals Lytic domain fusion constructs and methods of making and using same
WO2009140469A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Genentech, Inc. Methods of using apo2l/trail to treat cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US20140377216A1 (en) 2014-12-25
PH12014501363A1 (en) 2014-09-22
HUE035794T2 (en) 2018-05-28
EP2797950B1 (en) 2017-10-18
LT2797950T (lt) 2018-02-12
AU2012360086B2 (en) 2016-12-22
CN103987728A (zh) 2014-08-13
ZA201405460B (en) 2015-04-29
AU2012360086A1 (en) 2014-08-07
EP2797950A2 (en) 2014-11-05
DK2797950T3 (en) 2018-01-22
KR20140110017A (ko) 2014-09-16
IL232834A (en) 2017-09-28
PL397595A1 (pl) 2013-07-08
PL2797950T3 (pl) 2018-03-30
UA115436C2 (uk) 2017-11-10
CY1120055T1 (el) 2018-12-12
WO2013098755A2 (en) 2013-07-04
NZ627445A (en) 2016-01-29
ES2655828T3 (es) 2018-02-21
SMT201800026T1 (it) 2018-03-08
SG11201403282QA (en) 2014-07-30
MX352796B (es) 2017-12-07
CN103987728B (zh) 2017-05-10
CA2859494A1 (en) 2013-07-04
JP6324905B2 (ja) 2018-05-16
SI2797950T1 (en) 2018-02-28
HRP20180012T1 (hr) 2018-02-09
HK1201848A1 (en) 2015-09-11
WO2013098755A3 (en) 2013-08-29
BR112014015922A2 (pt) 2020-10-27
IL232834A0 (en) 2014-07-31
MX2014008028A (es) 2014-08-21
PT2797950T (pt) 2018-01-24
NO2797950T3 (sr) 2018-03-17
JP2015504052A (ja) 2015-02-05
PL223487B1 (pl) 2016-10-31
EA201491277A1 (ru) 2014-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012360086B2 (en) Anticancer fusion protein
KR101861872B1 (ko) 항암 융합 단백질
CN103228788B (zh) 抗癌融合蛋白
JP2015500228A (ja) 抗がん融合タンパク質
RS54057B1 (sr) Antikancerski fuzioni protein
CA2832152A1 (en) Anticancer fusion protein
NZ627445B2 (en) Anticancer fusion protein
HK1201848B (en) Anticancer fusion protein
HK1186209B (en) Anticancer fusion protein
HK1186209A (en) Anticancer fusion protein