JP2015500228A - 抗がん融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

ドメイン（ａ）と少なくとも１つのドメイン（ｂ）を含む融合タンパク質であって、ドメイン（ａ）は、フラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる、ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８５％の同一性を有し、かつアミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる前記機能的フラグメントのホモログであり、ドメイン（ｂ）は、タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列であり、ここでドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に付着している、前記融合タンパク質。この融合タンパク質は、がん疾患の処置に用いることができる。

Description

本発明は、治療的な融合タンパク質、特に組み換え融合タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、可溶性ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の配列とタンパク質合成を阻害するペプチド毒素の配列のフラグメントを含む融合タンパク質、それらを含有する医薬組成物、治療における、特に抗がん剤としてのそれらの使用、ならびに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および、これらの発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
サイトカインファミリーのメンバーであるＴＲＡＩＬタンパク質（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand)）は、Ａｐｏ２Ｌ（Ａｐｏ２−リガンド）としても知られ、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの強力なアクチベーターである。ＴＲＡＩＬは、体内に天然に存在するリガンドである。ＴＲＡＩＬタンパク質、そのアミノ酸配列、コードするＤＮＡ配列、およびタンパク質発現系は、EP0835305A1に初めて開示された。
ＴＲＡＩＬタンパク質は、アポトーシス促進性の表面ＴＲＡＩＬ受容体１および２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｒ２）に結合し、続くこれらの受容体の活性化により、その抗がん活性を発揮する。これらの受容体は、ＤＲ４およびＤＲ５（死受容体(death receptor)４および死受容体５）としても知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、様々なタイプのがん細胞に過剰発現されている。これらの受容体の活性化は、サプレッサー遺伝子ｐ５３に非依存的なアポトーシスの外部シグナリング経路を誘導することができ、これは、活性化されたカスパーゼ８により、実行型(executive)カスパーゼの活性化と、それによる核酸の分解をもたらす。ＴＲＡＩＬの活性化の間に放出されるカスパーゼ８はまた、切断型Ｂｉｄタンパク質の放出を引き起こすこともでき、Ｂｉｄタンパク質はミトコンドリアへ移行されて、ここでチトクロムｃの放出を刺激し、よって死受容体からのアポトーシスのシグナルが間接的に増幅される。
ＴＲＡＩＬは、このタンパク質に抵抗性を示す健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範な腫瘍細胞には作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、ＴＲＡＩＬの極めて大きな可能性が認識された。
ＴＲＡＩＬタンパク質は、２８１アミノ酸の長さを有するＩＩ型膜タンパク質である。アミノ酸残基１１４−２８１を含むその細胞外領域は、プロテアーゼによる切断により２０ｋＤａサイズの可溶性ｓＴＲＡＩＬ分子を形成し、これも生物学的に活性である。ＴＲＡＩＬおよびｓＴＲＡＩＬの両方の形態は、標的細胞上に存在するＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介して、アポトーシスの引き金を引く能力がある。ＴＲＡＩＬ分子の可溶性部分の強い抗腫瘍性活性と、極めて低い全身毒性とが、細胞株テストを使用して実証された。また、ｈＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４−２８１に相当するアミノ酸配列を有し、ＩＮＮの下デュラナミン(dulanermin)で知られる、組み換えヒト可溶性ＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ）を用いた予備的なヒト臨床研究も、その良好な耐性と用量制限毒性がないことを示した。
例えばEP 1 688 498において、ｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１の組み換え円順列変異体に対して近年報告されたように、１１４−２８１より短いＴＲＡＩＬのフラグメントもまた、膜の死受容体と結合し、これらの受容体を介してアポトーシスを誘導することができる。
今までに報告された肝細胞に対する組み換えＴＲＡＩＬタンパク質の毒性効果は、修飾、すなわちポリヒスチジンタグの存在と関係しているように思われ、その上、タグがないＴＲＡＩＬは全身毒性がないことを示した。
しかしながら、患者に対する臨床試験において、単独療法としてのＴＲＡＩＬの実際の有効性は低いことが証明された。また問題となるのは、多くのがん細胞が示す、ＴＲＡＩＬに対する本来の抵抗性または獲得抵抗性であった（例えばWO2007/022214を参照）。抵抗性は様々な機序による可能性があり、がんのタイプに特異的であるか、または患者に依存性である（Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24）。この抵抗性が、ＴＲＡＩＬの抗がん剤としての有用性を制限する。ＴＲＡＩＬに対する抵抗性の機序は完全には理解されていないが、これは、細胞表面受容体レベルからシグナリング経路内の実行型カスパーゼに及ぶＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス経路の様々なレベルで現れ得ると考えられる。
この低効率性とＴＲＡＩＬに対する腫瘍の抵抗性とを克服するために、放射線治療剤および化学治療剤を用いた様々な併用療法が考案され、それによってアポトーシスの相乗効果が得られた（WO2009/002947；A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348；RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546、Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533）。選択された従来の化学治療剤（パクリタキセル、カルボプラチン）とモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体との組み合わせにおける、がん処置のためのｒｈＴＲＡＩＬの使用は、WO2009/140469に記載されている。しかしながら、かかる組み合わせは必然的に、従来の化学治療または放射線治療の周知の欠陥を暗示する。しかし従来の技術は、ＴＲＡＩＬタンパク質を他のタンパク質またはそのフラグメントと融合させることにより得た、ＴＲＡＩＬに対する細胞の抵抗性を消滅させることを示唆するいかなるデータについても沈黙している。
さらに、ＴＲＡＩＬ治療に関連する問題は、その低い安定性および投与後の体内からの急速な排出であるように見える。
抗がん療法はまた、腫瘍細胞のタンパク質合成の阻害に向けられてもよい。腫瘍細胞の増殖を、細胞内のタンパク質合成を阻害することによって阻害する有益な効果が知られている。がん療法としてまた補完的がん療法として、タンパク質合成のプロセスを阻害または調節する物質の臨床的使用の試みがなされている。
細胞タンパク質の合成を阻害する物質は、細菌、真菌または植物由来の触媒ペプチドまたはタンパク質毒素である。触媒ドメインのみを保有し、結合ドメインを欠いている一本鎖毒素（ヘミ毒素（hemitoxin）としても知られている）は、それらの天然の遊離形態において、細胞に対して実質的に非毒性である。２つ以上の鎖からなる毒素（ホロ毒素としても知られる）は、触媒ドメインに加えて結合ドメインを有するが、細胞の選択性を欠いているため、全身投与後に健常組織に対する望ましくない毒性および多くの副作用を示す。
より高い特異性を達成するために、毒素またはタンパク質毒素の触媒ドメインを、腫瘍細胞上に存在するマーカーに選択的に結合する担体−リガンドに結合（conjugate）させる。タンパク質を標的とするドメインまたはリガンドの使用は、タンパク質の毒性ドメインの、細胞への特異的送達を可能にする。免疫毒素は、毒素が、抗体、成長因子、インターロイキン、および腫瘍壊死因子などの免疫系タンパク質である結合リガンドに結合している、コンジュゲートまたは融合タンパク質である。成長因子ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦと、リボソーム活性化タンパク質（ＲＩＰ毒素）の群からの毒素のコンジュゲート、ＴＮＦとＲＩＰ毒素のコンジュゲート、ＩＬ−２とPsuedomonas外毒素のコンジュゲート、ＩＬ−１３とPsuedomonas外毒素のコンジュゲート、ならびにＩＬ２−ジフテリア毒素のコンジュゲートを含有する処置において使用される調製物Ontake（登録商標）などの、既知のコンジュゲートが存在する。別の例としては、ゲロニンおよびアブリンなどの毒素と、インテグリン、フィブロネクチン、Ｉ−ＣＡＭおよびグランザイムＢのコンジュゲートのほか、エブリン（ebulin）とトランスフェリンのコンジュゲートなどがある（Hall, W.A. Targeted toxin therapy for malignant astrocytoma. Neurosurgery 2000, 46, 544-551）。WO2002/069886およびUS2003176331には、毒素の標的化送達のための、ゲロニンのＲＩＰ毒素と第２のポリペプチドのコンジュゲートの可能性が言及されている。このような第２ポリペプチドの多くの可能なタイプの中でＴＲＡＩＬタンパク質も言及されているが、しかし、このタイプのキメラの構造と特性に関する任意の詳細は開示されている。
WO2008052322には、ＲＩＰ毒素の担体として細胞表面構造に結合する、非免疫グロブリンポリペプチドの使用の可能性が記載されている。WO2008080218には、多数挙げられたＴＲＡＩＬの１つを含むサイトカインが、改変された毒素の担体として作用し得ることが示されているが、説明は、ＴＲＡＩＬおよび毒素を含む治療的に有効な分子およびその特性を定義することができるであろう任意の情報を欠いている。
U.S. 6,627,197には、タンパク質合成を不活性化する毒素、ＨＩＶプロテアーゼにより切断可能なペプチド、細胞表面に結合する要素としてのレクチン、標的フラグメント、および疎水性物質を含む構築物が、抗ウイルス剤として適用されることが記載されている。
従来技術ではまた、キメラタンパク質における、特異的プロテアーゼによって認識される切断部位の使用が知られており、これは腫瘍環境内で毒素を放出させ、その結果、それらの腫瘍細胞への内部移行を可能にする。例えば、US7,252,993には、リシンの毒性フラグメントと、標的ペプチド―ＨＩＶプロテアーゼによって認識されるリンカーを介して結合したＤＰ１７８ケモカインとを含有する、キメラタンパク質を開示している。しかしこの記述は、ＴＲＡＩＬ−毒素キメラの構造、特性および適用に関する詳細な情報を提供しない。
本発明は、ペプチド毒素のエフェクターペプチドとしての毒性特性と、ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス促進特性およびがん細胞上に存在する構造を特異的に標的とすることを組み合わせた、新規な融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬに由来する結合ドメイン、および、タンパク質合成阻害特性を有するエフェクターペプチドとしての、ペプチド毒素ドメインを含む。
ｈＴＲＡＩＬ由来のドメインの存在のために、本発明のタンパク質はがん細胞に選択的に指向され、がん細胞において、タンパク質の要素はその効果を発揮する。
具体的には、エフェクターペプチドとしてのペプチド毒素は、がん細胞におけるタンパク質合成プロセスを阻害する。本発明のタンパク質の腫瘍環境への送達は、身体の健常細胞に対する毒性や副作用の最小化、ならびに投与頻度の低減を可能とする。さらに、本発明によるタンパク質を使用した標的化療法は、高い毒性と高用量を投与する必要性とに起因するタンパク質合成の阻害に基づく、以前から知られている非特異的療法の低効率の問題を回避することができる。
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性ｈＴＲＡＩＬおよびその配列のフラグメントを含むその変異体よりも効き目があることが判明した。これまで、本発明の融合タンパク質に使用されるエフェクターペプチドは、好ましくない動態、非特異的プロテアーゼによる急速な分解、または経路の活性化の正しい順序（標的部位におけるエフェクターペプチドの適切な作用を可能にするのに必要である）の欠如により引き起こされる体内への蓄積のために、医学の分野ではほとんど使用されていなかった。融合タンパク質へのエフェクターペプチドの取り込みは、それらの作用が所望される部位への、それらの選択的な送達を可能にする。さらに、エフェクターペプチドの付着は、タンパク質の質量を増やし、その結果半減期が延長し、腫瘍中のタンパク質貯留が増加し、その効率が増進する。加えて、新規の融合タンパク質はまた、多くの場合、ＴＲＡＩＬに対する自然の抵抗性または誘導抵抗性にも打ち勝つ。
図の説明
次に、本発明を、図面の図を参照して詳細に説明する。
図１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａ、例２５ａ、例３７ａおよび例４２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったHsdCpb:NMRI-Foxn1 ninマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａ、例２５ａ、例３７ａおよび例４２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったHsdCpb:NMRI-Foxn1 ninマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例３５ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例３５ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
図５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例５０ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例５０ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａ、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａ、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２０ａ、例２６ａ、例４３ａおよび例４７ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
図１０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２０ａ、例２６ａ、例４３ａおよび例４７ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図１１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２０ａ、例５１ａおよび例５２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図１２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２０ａ、例５１ａおよび例５２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図１３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図１４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質で処置された、膵臓がんＰＡＮＣ−１を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
図１５は、例１８ａの本発明の融合タンパク質で処置された、前立腺がんＰＣ３を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図１６は、例１８ａの本発明の融合タンパク質で処置された、前立腺がんＰＣ３を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図１７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例５１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肝臓がんＰＣＬ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図１８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例５１ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肝臓がんＰＣＬ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図１９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
図１９ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図２０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２０ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂ、例２ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
図２１ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図２２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂ、例２ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２２ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＴ−２９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
図２４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＴ−２９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝臓がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図２６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝臓がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
図２８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図２９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図２９ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂ、例２ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。 図３０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。 図３０ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例１８ｂ、例２ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
本発明の詳細な説明
本発明は、融合タンパク質であって、
― フラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる、可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８５％の同一性を有し、かつアミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン（ａ）、および
― タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列である少なくとも１つのドメイン（ｂ）であって、ここでドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着されている前記ドメイン（ｂ）、
を含み、ここで融合タンパク質が、細胞表面の炭水化物受容体に結合するドメインを含まない、前記融合タンパク質に関する。
「可溶性ｈＴＲＡＩＬの配列の機能的な可溶性フラグメント」という用語は、哺乳動物細胞において、該細胞の表面にあるその受容体に結合することで、アポトーシスシグナルを誘導する能力がある、可溶性ｈＴＲＡＩＬのかかるフラグメントのいずれをも意味するものと理解されるべきである。
ＴＲＡＩＬ配列の少なくとも７０％または８５％の相同性の存在が、当該技術分野において知られているということもまた、当業者に十分理解されるだろう。
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン(ｂ)は、ｈＴＲＡＩＬタンパク質でも、ｈＴＲＡＩＬタンパク質の一部またはフラグメントでもないことが理解されるべきである。
本発明に従う「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸から作られる分子として理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドのＮ末端（Ｎ末）からそのＣ末端（Ｃ末）へ向かう方向に、当該技術分野で採用されている従来の方式で、提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にＮ末端を、右側にＣ末端を有する。
数字番号の付いたＴＲＡＩＬの用語は、本明細書において、ｈＴＲＡＩＬの既知の配列中のこの番号のアミノ酸を示すために使用される。
本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着されたエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）を、少なくとも１つ組み込む。
特定の態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる、ｈＴＲＡＩＬ配列のフラグメントである。
具体的に、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択してもよい。ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１が、GenBankのアクセッションNo. P50591で公開され、本発明の配列表に配列番号１４１として示されているｈＴＲＡＩＬの既知の配列において、それぞれ９５番、１１４番、１１６番、１１９番、１２０番および１２１番でマークされたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸２８１で終わるヒトＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントを表すことは当業者にとって明白であろう。
他の具体的態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであって、その配列は、少なくとも７０％、好ましくは８５％、オリジナル配列と一致する。
この態様の具体的な変形において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更／改変であると理解されるべきであり、ここで、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、およびアミノ酸の１５％以下を含む、少なくとも１個のアミノ酸が変化しており、ここで、改変された配列のフラグメントは、ｈＴＲＡＩＬ配列の機能性、すなわち哺乳動物細胞において細胞表面の死受容体に結合してアポトーシスを誘導する能力を保存している。アミノ酸配列の改変は、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加を含んでもよい。
好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブな(native)ｈＴＲＡＩＬのフラグメントと比較して、死受容体のＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）との改変された親和性を示す。
「改変された親和性」という用語は、上昇された親和性および／または、受容体の選択性が変更された親和性を指す。
好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブなｈＴＲＡＩＬのフラグメントと比較して、死受容体のＤＲ４およびＤＲ５に対して上昇した親和性を示す。
特に好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、死受容体ＤＲ４と比較して、死受容体ＤＲ５に対して上昇した親和性を示し、すなわちＤＲ５／ＤＲ４選択性の上昇を示す。
また好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、死受容体ＤＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対する親和性に関連して、該受容体ＤＲ４および／またはＤＲ５に対する選択性が上昇したことも示す。
死受容体のＤＲ４およびＤＲ５対する親和性ならびに／または選択性の上昇をもたらすｈＴＲＡＩＬの改変は、例えば刊行物、Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8（ＤＲ４に対して上昇した選択性を有する、Ｄ２１８Ｈ突然変異を記載する）、または、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis.2009 Jun;14(6):778-87（ＤＲ４に対して低下した親和性を有する、Ｄ２６９Ｈ突然変異を記載する）から、当業者に知られている。ＤＲ１およびＤＲ２の受容体と比較した、ＤＲ４およびＤＲ５から選択された１つの受容体に対する親和性の上昇、およびＤＲ４と比較した受容体ＤＲ５に対する親和性の上昇をもたらすｈＴＲＡＩＬ突然変異体は、WO2009077857およびWO2009066174にも記載されている。
好適な突然変異は、ネイティブなｈＴＲＡＬの位置における１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異であり、特に、突然変異は、リジン、ヒスチジンもしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのアミノ酸の置換を含む。特に、WO2009066174に記載のように、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑからなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異を特定することができる。
好適な突然変異はまた、アミノ酸１９５、２６９および２１４からなる群から選択されるネイティブなｈＴＲＡＩＬの位置における１つまたは２つ以上の突然変異でもあり、特に突然変異は、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸のアミノ酸置換を含む。特に、WO2009077857に記載のように、Ｄ２６９Ｈ、Ｅ１９５ＲおよびＴ２１４Ｒからなる群から選択される、１つまたは２つ以上の突然変異を特定することができる。
具体的な態様において、ｈＴＲＡＩＬのフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＤ２１８Ｈ突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ突然変異体から選択される。
ドメイン（ａ）、すなわちＴＲＡＩＬのフラグメントは、融合タンパク質の構築物の、細胞表面上の死受容体への結合を担うドメインである。さらに、結合の際にドメイン（ａ）は、その既知のアゴニスト活性、すなわちアポトーシスの外因性経路の活性化を発揮するであろう。
本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の炭水化物受容体に結合可能なドメインの配列を含まない。細胞表面上の炭水化物受容体への結合は、非特異的結合である。
特に、本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメイン（糖タンパク質）の配列を含まない。細胞表面上の糖受容体に結合可能なレクチンドメインという用語は、特に、タンパク質毒素のサブユニット（鎖）Ａおよびそのフラグメント、ならびに、単独で生じ、酵素の機能性を含む異なる機能性のドメインを伴わないレクチンタンパク質の両方として、理解されるべきである。
別の態様において、ドメイン（ａ）以外の本発明の融合タンパク質は、細胞表面上の受容体に結合する他のいかなるドメインも含まない。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）は、エフェクターペプチド、すなわち、細胞内のタンパク質合成プロセスを阻害するペプチド毒素のドメインである。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの翻訳段階を阻害することにより、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、細胞におけるタンパク質合成プロセスの転写およびＲＮＡ産生の阻害により、タンパク質合成を阻害する毒素であってもよい。
一態様において、ペプチド毒素は、リボソームレベルでのタンパク質の酵素的な翻訳を阻害するペプチドである。本発明のこの態様において、１つの変形においてペプチド毒素は、Ｎ−グリコシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの活性から選択される酵素触媒活性を有する。
当業者には明らかであるように、ペプチド毒素は、エフェクターペプチドとしてのその主な活性に加えて、細胞におけるタンパク質合成の阻害をもたらし得る１または２以上の他の活性を有し得ることが理解されるべきであり、これは例えばW. J. Pneumans et al., The FASEB Journal, 2001, Vol. 15, str. 1493-1506に記載されている。
Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するエフェクターペプチドは、２８Ｓ ｒＲＮＡのサブユニット６０内の１つの特定のアデニン残基の切断によって、リボソームの改変（脱プリン）を行う。この改変は不可逆的であり、リボソームと翻訳因子ＥＦとの結合を防いで、翻訳を遮断する。
Ｎ−グリコシダーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチドは、１型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、２型ＲＩＰタンパク質の触媒サブユニット（鎖）Ａ、および、元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の保存Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変、からなるペプチド毒素の群から選択することができる。
Ｎ−グリコシダーゼ活性を有する１型ＲＩＰ毒素は、一本鎖タンパク質であり、触媒ドメインのみを有する。
植物由来の以下の既知の毒素を、一本鎖１型ＲＩＰ毒素の群からの具体的なエフェクターペプチドとして挙げることができる：ゲロニン（Gelonium multiflorumから）、モモルディン（Momordica属の植物から単離されたタンパク質）、サポリン（Saponaria Officinalisから）、ドデカンドリン（Phytolacca dodecandraから）、ボウガニン（bouganin）（Bougainvillea spectabilisから）、ヤマゴボウからのＰＡＰタンパク質（Phytolacca Americana）、トリコサンチン（Trichosanthes kirilowiiから）、トリコアングイン（trichoanguin）（Trichosanthes anguinaから）、アグロスチン（agrostin）（Agrostemma githagoから）、ジアントリン（diantrin）、ルフィンＰ１（Luffa cylindricaから）、モモルカリン（Momordica charantiaから）、およびトリチン。
本態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号５５（ボウガニン）、配列番号５８（ＰＡＰ毒素ホモログ）、配列番号５９（サポリンのフラグメント）、配列番号６０（トリコサンチン）、配列番号６１（トリコアングイン）、配列番号６５（ルフィンＰ１）、配列番号６７（モモルカリン）、および配列番号７８（ゲロニンの触媒ドメイン）として指定される。
本態様におけるエフェクターペプチドのさらなる例は、ゲロニン（配列番号１９８）のアナログおよび改変ネイティブ配列を有するトリコサンチンのアナログ（配列番号１９９および配列番号２００）である。
改変トリコサンチンの一例は配列番号１９９であり、ここでトリコサンチンの既知の配列は、毒素の免疫原性を低下させるように改変されている。すなわち、トリコサンチンの既知の配列において、「ＹＦＦ」８１−８３モチーフが「ＡＣＳ」により置き換えられ、同様に、「ＫＲ」１７３−１７４アミノ酸が、「ＣＧ」残基より置き換えられる（アミノ酸残基番号は、GenBank：AAB22585.1に公開された配列と一致している）（An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43)）。
改変トリコサンチンのさらなる例は配列番号２００であり、ここでトリコサンチンの既知の配列は、次のように改変された。すなわち、「ＹＦＦ」８１−８３モチーフが「ＡＣＳ」により置き換えられて毒素の免疫原性を低下させ、「ＫＲ」１７３−１７４アミノ酸が「ＣＧ」残基より置き換えられて（An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43）、ＶＬＳ（血管漏出症候群）問題を低減させ、バリン残基２および６６がアラニンに置換された；および、ロイシン１３２はグリシンに置きかえられた（アミノ酸残基番号は、GenBank：AAB22585.1に公開された配列と一致している）（Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES.. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 30;96(7):3957-62)）。配列番号１９８の変異Ｖ７０Ａを有するゲロニンアナログは知られており、文献に記載されている（Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 199）。
配列番号１９９として指定されたトリコサンチンアナログは知られており、文献に記載されている（An Q, et al. J Biomed Sci. 2006 Sep;13(5):637-43）。
配列番号２００として指定されたトリコサンチンアナログは新規であり、文献には記載されていなかった。
Ｎ−グリコシダーゼ活性を有する２型ＲＩＰ毒素は、２本鎖のタンパク質であり、触媒ドメイン（サブユニットＡ）および、細胞表面上に存在する炭水化物（糖）受容体に結合することができるレクチン結合ドメイン（サブユニットＢ）を有する。本発明によれば、レクチン結合ドメインを欠いている２型ＲＩＰ毒素の触媒サブユニットＡは、エフェクターペプチドとして使用することができる。
このタイプのエフェクターペプチドとして、以下の植物毒素の触媒サブユニットＡを挙げることができる：リシン（Ricinnus communisから）、アブリン（Abbrus precatriusから）、モデシン（Adenia digitataから）、ビスクミン（ヤドリギ（misletoe）Viscum albumからの毒素）、ボルケンシン（Adenia volkensiiから）、エブリン（ebulin）１（Sambucus ebulusから）、ニグリンｂ（Sambucus nigraから）および志賀細菌毒素（Shigella dysenteriaeから）、または元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の、保存Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、以下のように指定される：配列番号５６および配列番号５７（リシンのサブユニットＡ；およびリシンの変異サブユニットＡ）、配列番号１９５（リシンの改変サブユニットＡ）；配列番号６２（ヤドリギ毒素のサブユニットＡ）、配列番号６３（エブリン１のサブユニットＡ）、配列番号６４（ニグリンｂのサブユニットＡ）、配列番号６６（ボルケンシンのサブユニットＡ）、配列番号７０（志賀毒素サブユニットＡの変異体）、および配列番号８２（アブリンのサブユニットＡ）；配列番号１９４（Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに突然変異Ｖ７１Ａ、Ｇ１１５Ａ、およびＳ２３２Ｑを有する、アブリンの改変サブユニットＡ、アミノ酸残基番号はGenBank：CAA38655.1に公開された配列と一致）。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、以下のように指定される：配列番号５６および配列番号５７（リシンのサブユニットＡおよびリシンの変異サブユニットＡ）、配列番号１９５（Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに欠失７８ＬＤＶ８０を有する、リシンの改変サブユニットＡ、アミノ酸残基番号は、GenBank：ABG65738.1に公開された配列と一致）；配列番号６２（ヤドリギ毒素のサブユニットＡ）、配列番号６３（エブリン１のサブユニットＡ）、配列番号６４（ニグリンｂのサブユニットＡ）、配列番号６６（ボルケンシンのサブユニットＡ）、配列番号７０（志賀毒素サブユニットＡの変異体）、および配列番号８２（アブリンのサブユニットＡ）；配列番号１９４（Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999に記載のものに突然変異Ｖ７１Ａ、Ｇ１１５Ａ、およびＳ２３３Ｑを有する、アブリンの改変サブユニットＡ、アミノ酸残基番号は、GenBank：CAA38655.1に公開された配列と一致）。
リボヌクレアーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチド（リボ毒素とも呼ばれる）はエンドヌクレアーゼに属し、２８Ｓ ｒＲＮＡ中でホスホジエステル結合を切断し、これによりリボソームを阻害し、翻訳を停止させる。この群のエフェクターペプチドとしては、真菌毒素α−サクリン、ミトギリン、Aspergillus restrictusからのレストリクトシン（restrictocin）、およびヒルステリン（hirsutelin）（Hirsutella thompsoniiから）を挙げることができる。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号７１（レストリクトシン）および配列番号７２（ヒルステリン）として指定される。
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの触媒活性を有するエフェクターペプチドは、ＡＤＰ−リボシル化を引き起こし、したがって主に伸長／翻訳因子ＥＦ−２であるタンパク質合成機構の成分の不活性化、および翻訳の阻害を引き起こす。エフェクターペプチドのこの群は、Corynebacterium diphtheriaeからのジフテリア毒素、Pseudomonas aeruginosaからの外毒素Ａ、および元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の保存ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するこれらの改変の、触媒ドメインに属する。
Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａとジフテリア毒素の触媒ドメインの改変は、ペプチドの末端フラグメントの切断、ならびに触媒ドメインまたはそのフラグメント中の置換または欠失を含む。好適な置換および欠失のいくつかは、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800；Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に開示されている。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号６９で示される既知のPseudomonas aeruginosa外毒素触媒ドメインＡ（触媒ドメインＡのネイティブ配列）、および配列番号６８、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、および配列番号２０７として示されるその変異アナログである。
この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号６８で示される既知のPseudomonas aeruginosa外毒素Ａ、および配列番号６９、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、および配列番号２０７として示されるそのアナログである。配列番号６９、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２０３、および配列番号２０６として示されるPseudomonas aeruginosa外毒素Ａのアナログは知られており、文献に記載されている。
配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０５、および配列番号２０７として示されるPseudomonas aeruginosa外毒素Ａのアナログは新規であり、文献に記載されていない。
既知の配列番号２０３は、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素ＡのＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ変異体であり、免疫原性を減少させる８つの変異を有する。
既知の配列番号２０６は、Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載されたPseudomonas aeruginosa外毒素Ａの、欠失変異体ＨＡ２２−ＬＲである。
新規な配列番号２０１は、Pseudomonas aeruginosaの外毒素Ａの触媒ドメインのアナログであり、ここで３つの点変異Ｒ３１８Ｋ、Ｎ４４１ＱおよびＲ６０１Ｋが既知の配列に導入されて、免疫原性を減少させる（アミノ酸残基番号は、GenBank：AAB59097.1に公開された配列と一致する）。
新規な配列番号２０２は、Weldon JE et al., Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800に記載されたPseudomonas aeruginosaの外毒素Ａの触媒ドメインの欠失変異体Ａ２−ＬＲであり、さらに、Choe M, Webber KO, Pastan I. Cancer Res. 1994 Jul 1;54(13):3460-7に記載された免疫原性を低下させるさらなる突然変異および、WO 2007/016150に記載の別の突然変異が導入されている。
新規な配列番号２０４はPseudomonas aeruginosa外毒素Ａの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体ＨＡ２２ Ｍ３（欠失および突然変異Ｃ３１２Ｓ）と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7)に記載の免疫原性を低下させる８つの突然変異を有する変異体ＨＡ２２ ８Ｍとの組み合わせである。
新規な配列番号２０５はPseudomonas aeruginosa外毒素Ａの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体ＨＡ２２ Ｍ３（すなわち欠失および突然変異Ｃ３１２Ｓを有するもの）と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載の免疫原性を低下させる８つの突然変異に、さらにネイティブのPseudomonas aeruginosa毒素に存在するフューリンによって認識される切断部位の領域の欠失を有するものとの組み合わせである。
新規な配列番号２０７はPseudomonas aeruginosa外毒素Ａの触媒ドメインの変異体であり、これはWeldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800に記載の変異体ＨＡ２２ Ｍ３（欠失および突然変異Ｃ３１２Ｓ）と、Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7に記載の変異体ＨＡ２２ ８Ｍ（すなわち免疫原性を低下させる８つの突然変異）に追加の突然変異Ｒ６０１Ｋを有するものとの組み合わせである。
この態様におけるエフェクターペプチドの別の例示的な配列は、ジフテリア毒素の既知のサブユニットＡ（触媒ドメイン）、およびその既知の活性フラグメントであって、配列番号７９、配列番号８０、および配列番号８１、配列番号１９６で指定されたもの（２つの突然変異Ｖ７ＡおよびＶ２７Ａを導入することにより改変されたジフテリア毒素のサブユニットＡ。改変は、Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62により、ＶＬＳ（血管漏出症候群）を除去するように選択された）、および配列番号１９７で指定されたものである（ジフテリア毒素の改変は、３つのアミノ酸６ＶＤＳ９の欠失および突然変異Ｖ２９Ａを導入して、Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62により、ＶＬＳ（血管漏出症候群）を除去するようになされた）。
本発明の融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、例えば細菌において知られている毒素−抗毒素系に属する、タンパク質合成を阻害するペプチド毒素であってもよい。かかる毒素は、異なるメカニズムを介して作用して、タンパク質合成を遮断することができる：細胞膜と結合し、こうして膜電位の急速な崩壊と付随する呼吸の停止がもたらされる；トポイソメラーゼに結合することによる、ポリメラーゼ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の阻害；またはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）として作用すること。
ｍＲＮａｓｅ活性を有する毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、以下である：配列番号７７で示される、ＲＮａｓｅ活性を有するＳｔａＢタンパク質（Szymanik M., Doctoral thesis. 2006. Warsaw University, Warsaw）；Salmonella typhiからのＫｉｄ毒素（Bravo A, de Torrontegui G, Diaz R. Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet. 1987 Nov; 210(1):101-10）、およびE. coliからのＲｅｌＥ毒素（Gotfredsen M, Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a New toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 1998 Aug; 29(4): 1065-76）、これらは配列番号７３（Ｋｉｄタンパク質）および配列番号７４（ＲｅｌＥタンパク質）として示される。
トポイソメラーゼ毒素に結合することによってポリメラーゼを阻害する、毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、ＣｃｄＢファミリーE. coliタンパク質からの毒素、およびＤＮＡ分解およびＲＮＡポリメラーゼ阻害の保存された活性を有するそれらの変異体であり、例えばＣｃｄＢＥＴ２毒素である（E. Trovatti et al, Bioorg Med Chem Lett. 2008 Dec 1;18(23):6161-4）。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号７４（ＣｃｄＢタンパク質）および配列番号７５（ＣｃｄＢタンパク質変異体）として示される。
細胞膜と結合することにより膜電位の急速な崩壊と付随する呼吸の停止がもたらされる、毒素−抗毒素系の構成要素である毒素の例は、細胞質膜ＴｉｓＢおよびＨｏｋに挿入する疎水性残基の長いストレッチを含有する、小さな塩基性タンパク質である。ＨｏｋまたはＴｉｓＢの膜挿入は、電気化学ポテンシャルの喪失を引き起こし、これは細胞内ＡＴＰの減少の原因となる。したがって、ＴｉｓＢとＨｏｋの両方が、細菌膜を損傷することにより細胞を殺すことができる（Unoson C, Wagner EG. A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2008 Oct;70(1):258-70. Epub 2008 Aug 29）。この態様におけるエフェクターペプチドの例示的な配列は、配列番号２０８として示される。
上述のように、いくつかのエフェクターペプチドは新規であり、以前には記載されていなかった。
したがって本発明は、配列番号２００のトリコサンチンの突然変異体、配列番号２０１のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０２のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０４のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０５のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、および配列番号２０７のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、からなる群から選択される新規なペプチドに関する。
これらの新規なペプチドは、特に本発明の抗がん融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドとして、有用性を見出した。
これらの新規なペプチドは、親ペプチドの免疫原性を低下させるように特に設計されている。
したがって、これらの新規ペプチドの具体的な特徴は、低い免疫原性である。
有利なのは、配列番号２００のトリコサンチンの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号２０１のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号２０２のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
また有利なのは、配列番号２０４のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０５のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、および配列番号２０７のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体からなる群から選択されるペプチドである。
がん細胞の表面に存在するＴＲＡＩＬ受容体に結合すると、融合タンパク質は、二重の効果を発揮する。ドメイン（ａ）、すなわちＴＲＡＩＬの機能的フラグメントまたは保存された機能性を有するそのホモログは、その既知のアゴニスト活性を発揮する、すわなち、細胞表面の死受容体に結合して、アポトーシスの外因性経路を活性化するであろう。融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、腫瘍細胞においてタンパク質合成を阻害することにより、ＴＲＡＩＬドメインの活性と並行してその作用を細胞内で潜在的に発揮することができるであろう。
融合タンパク質の細胞内への内部移行後の、エフェクターペプチド−機能的ドメイン（ｂ）の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン（ａ）を、ドメイン（ｂ）からリソソーム（lisosomal）酵素（非特異的プロテアーゼ）で切断することにより、非特異的に生じ得る。
しかし、融合タンパク質は、細胞環境中に存在するプロテアーゼによって認識される切断部位のドメインを含むのが好ましい。
したがって、本発明の好ましい態様においては、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、細胞環境に、特に腫瘍細胞環境に存在する例えばメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼまたはフューリンなどのプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも１つのドメイン（ｃ）によって連結されている。
プロテアーゼにより認識される配列は、以下から選択することができる：
− メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ／ＰＬＧＬＡＧＥＰ、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
− ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ／ＲＶＶＲ、または、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共にウロキナーゼにより認識される配列を形成するそのフラグメント、
およびそれらの組み合わせ、または
− フューリンにより認識される配列Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ／ＲＱＰＲ、Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ／ＲＱＰＲＧ、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ／ＲＫＫＲ、またはフューリンにより認識されるその他の非定型配列であって、M. Gordon et all. In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87により開示されたもの、またはフューリンにより認識されるネイティブ配列Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ （ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）。
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断部位は、任意の順番で互いに隣接して位置している、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、および／またはウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列、および／またはフューリンにより認識される配列の組み合わせである。
好ましくは、一態様において、ドメイン（ｃ）は、Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ／ＲＱＰＲ、Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ／ＲＱＰＲＧ、Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｒｇ／ＲＶＫＲおよびＡｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ／ＲＫＫＲから選択される、フューリンによって認識される配列である。
プロテアーゼである、メタロプロテアーゼＭＭＰ、ウロキナーゼｕＰＡおよびフューリンは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼにより認識される配列の存在は、ドメイン（ａ）のドメイン（ｂ）からの切断を可能にし、すなわち、機能的ドメイン（ｂ）の放出、したがって活性化の促進を可能とする。
プロテアーゼ切断部位の存在は、融合タンパク質の非特異的プロテアーゼによるランダムな分解が起こる前に腫瘍環境において過剰発現されるプロテアーゼによる、ｈＴＲＡＩＬフラグメントからの切断の結果、エフェクターペプチドの迅速な放出を可能にすることによって、ペプチドをその作用場所に輸送する機会を増加させる。
この点に関して、好ましいエフェクターペプチドはジフテリア毒素およびPseudomonas外毒素であり、これらは、フューリンによって認識される切断部位の天然に存在する配列、Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ／ＲＶＲＲ（ジフテリア毒素）およびＡｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ／ＲＱＰＲＧ（Pseudomonas外毒素）を含有する。
さらに、輸送ドメイン（ｄ）が、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）に付着してもよい。
ドメイン（ｄ）は、以下からなる群から選択することができる：
−（ｄ１）Pseudomonas aeruginosa由来の細胞膜を通って輸送するドメイン、
−（ｄ２）膜を通って輸送し小胞体を標的化するドメイン、
−（ｄ３）細胞膜を通って輸送し、６、７、８、９、１０または１１個の（Ａｒｇ／Ｒ）残基からなる、ポリアルギニン配列、
またはそれらのフラグメントであって、それが付着した配列の最後のアミノ酸と共に輸送ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）または（ｄ３）を形成する前記フラグメント、および
−これらの組み合わせ。
ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）および（ｄ３）の組み合わせは、特に、（ｄ１）／（ｄ２）、（ｄ１）／（ｄ３）または（ｄ１）／（ｄ２）／（ｄ３）の組み合わせを含んでよい。
さらに、ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）および（ｄ３）の組み合わせは、互いに隣接して位置し、ドメイン（ｂ）の一端に接続されているドメイン、および／またはドメイン（ｂ）の異なる末端に連結されたドメインを含んでよい。
融合タンパク質が、ドメイン（ｂ）に付着したドメイン（ｄ）と、ドメイン（ａ）と（ｂ）の間の切断部位のドメイン（ｃ）の両方を有する場合には、ドメイン（ｃ）は、構築物の切断後に輸送ドメイン（ｄ）がドメイン（ｂ）に付着したままであるように配置されることが、理解されるべきである。換言すれば、融合タンパク質が輸送ドメイン（ｄ）および切断部位ドメイン（ｃ）の両方を有する場合、ドメイン（ｄ）はドメイン（ｂ）と（ｃ）の間に配置されるか、またはドメイン（ｄ）の付着場所の反対側となるドメイン（ｂ）の端部に配置される。
本発明はまた、ドメイン（ｄ）、好ましくはPseudomonas aeruginosa移行ドメインが、２つの（ｃ）ドメインの間に位置する変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメイン、好ましくはPseudomonas aeruginosa移行ドメインが、ＴＲＡＩＬドメインにもエフェクターペプチドドメインにも付着していない変異体も含む。
本発明は、ドメイン（ｄ）がドメイン（ｃ）とドメイン（ａ）の間に配置された変異体、すなわち、構築物の切断後に、輸送ドメインがＴＲＡＩＬドメインに付着したままである変異体は、含まない。
Pseudomonas aeruginosa毒素の移行ドメインである輸送ドメイン、またはPseudomonas aeruginosa毒素由来のリソソーム膜を通して輸送するドメインの別のフラグメントは、細胞膜を横切って移行する能力を有し、腫瘍細胞の区画にエフェクターペプチドを導入するために使用することができる。Pseudomonas aeruginosaの移行ドメインの配列は周知であり、配列番号１３９で示されている。
好ましくは、Pseudomonas aeruginosa移行ドメインは、ドメイン（ａ）と（ｂ）の間に配置され、さらに（ｃ）ドメインによって隔てられている。
また、好ましくは、小胞体に輸送するドメイン（ｄ２）は、エフェクターペプチドのＣ末端に付着し、本発明の融合タンパク質のＣ末端に位置する。
また好ましくは、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列は、エフェクターペプチドのＣ末端に付着し、エフェクタードペプチドとドメイン（ａ）の間に配置されている；好ましくは、これはさらにドメイン（ｃ）によりドメイン（ｄ）から隔てられている。
小胞体に向かう配列（ｄ２）は、当分野で知られている、小胞体に向かう任意のシグナル配列であってよく、例えば、限定はされないが以下である：Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＫＤＥＬ、Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＨＤＥＬ、Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＲＤＥＬ、Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＤＤＥＬ、Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＡＤＥＬ、Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＳＤＥＬ、およびＬｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ／ＫＥＤＬ。
ドメイン（ｄ２）は好ましくは、Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＫＤＥＬおよびＬｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ／ＫＥＤＬから選択される。
好ましくは、輸送配列（ｄ２）は、本発明の融合タンパク質のＣ末端に位置する。
別の態様において、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、さらに、ＰＥＧ分子の融合タンパク質への付着に適切な配列を含むドメイン（ｅ）が配置される（ＰＥＧ化リンカー）。かかるリンカーは、既知の配列Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ／ＡＳＧＣＧＰＥであってよい。ＰＥＧ化リンカーはまた、以下の群から選択することができる：
Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ／ＡＡＣＡＡ、
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＳＧＧＣＧＧＳ、および
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＳＧＣＧＳ。
好ましくはＰＥＧ化リンカーの配列は、Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ／ＡＳＧＣＧＰＥである。
融合タンパク質の主要な機能的要素および切断部位ドメイン（単数または複数）とは別に、本発明の融合タンパク質は、柔軟な立体リンカーの１または２以上の中性配列を含んでもよい。このような立体リンカーは周知であり、文献に記載されている。融合タンパク質配列へのこれらの組み込みは、宿主細胞においてその過剰発現のプロセスによって産生されるタンパク質の正しいフォールディングを提供することを目的とする。具体的には、立体リンカーは、グリシン、グリシン−セリン、またはグリシン−システイン−アラニンリンカーであってよい。
具体的には、立体リンカーは、グリシンとセリン残基の組み合わせ、例えばＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＳまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えば、フラグメントＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＳ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧまたはＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧＧである。別の態様において、立体リンカーはグリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わせ、例えばＡｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＡＳＧＧまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメントであってよく、例えばＡｌａＳｅｒＧｌｙ／ＡＳＧである。立体リンカーの組み合わせを用いることも可能であり、例えば配列Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ／ＧＧＧＧＳまたは立体リンカーに作用するそれらの任意のフラグメント、例えばフラグメントＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧと、立体リンカーに作用する別のフラグメントとの組み合わせである。このような場合において、立体リンカーは、グリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わせであってよく、例えばＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＡＳＧＧである。さらに別の態様において、立体リンカーはセリンおよびヒスチジン残基の組み合わせ、Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ／ＳＨＨＳまたはＳｅｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｓｅｒ／ＳＨＨＡＳであってよい。
別の態様において、立体リンカーはアラニンとシステイン残基の組み合わせであってよく、例えばＣＡＡＡＣＡＡＣ（Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ）、ＣＡＡＣＡＡＡＣ（Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ）またはこれらのフラグメントである。
別の態様において、適切な立体リンカーは、上記の立体リンカーの任意のタイプの組み合わせによって形成される。かかる組み合わせの例は、次により表される：Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ（ＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣ）、およびＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣ）。
一態様において、立体リンカーはまた、単一のシステイン残基などの単一のアミノ酸残基から選択してもよい。
さらに、立体リンカーはまた、非特異的な様式で起こる機能的ドメイン（ｂ）の活性化のために有用であり得る。非特異的な様式でのドメイン（ｂ）の活性化は、本発明の融合タンパク質のドメイン（ａ）をドメイン（ｂ）から、立体リンカーのｐＨ依存性加水分解によって切断することにより、行なうことができる。
さらに、本発明の融合タンパク質は、インテグリンと結合するモチーフを含有するリンカーを含んでもよい。かかるリンカーは、細胞表面へのさらなる結合を提供し、全身毒性を減少させることができる。
インテグリンは、多くの細胞型の表面に存在するα−βヘテロダイマーである。インテグリンのリガンドは、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、およびラミニンなどの細胞外マトリックス接着タンパク質である。フィブロネクチンおよびいくつかの他のリガンドの場合において、ＲＧＤモチーフはインテグリンとの相互作用に関与する。このモチーフを含有するペプチドは、インテグリンα５β１を特異的に認識し、転移を形成するそれらの能力を制限することによって、腫瘍細胞の侵襲性を抑制する効果を有する（Ghelsen et al., (1988) J. Cell Biol. 106, 925-930）。ファージディスプレイ法を使用して、６−アミノ酸ペプチドのライブラリーから、ＮＧＲモチーフを含む配列を単離し、これは、インテグリンα５β１に特異的に結合してこれを認識する（Koivunen et al.., J Biol Chem. 1993 Sep 25; 268(27): 20205-10）。また、２つのモチーフ（ＮＧＲおよびＲＧＤ）が、血管形成に関与する別の因子にアンタゴニストとして結合することも実証された。ＲＧＤはまた、血管新生の過程で特異的に過剰提示されるインテグリンとも相互作用し（Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995）、一方ＮＧＲは、がんの侵襲性に関与し、腫瘍および強い血管新生にさらされる他の細胞の血管内に特に強力に露出されるタンパク質である、アミノペプチダーゼＮと相互作用する（(Pasqualini et al., Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7）。
インテグリンと結合することができる本発明の融合タンパク質からのリンカーは、モチーフＡｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ（ＮＧＲ）、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ（ＤＧＲ）またはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む。
本発明のタンパク質の好ましい態様において、インテグリンと結合するモチーフを含むリンカーは、配列番号１４０によって指定される。
配列番号１４０（Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｌａ／ＣＦＣＤＧＲＣＤＣＡ）は、システイン配列によって安定化されるモチーフＡｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ（ＤＧＲ）を含み、これは周知であり、Wang H, Yan Z, Shi J, Han W, Zhang Y Protein Expr Purif. 2006 Jan; 45(1): 60-5に記載されている。
本発明の融合タンパク質の特定の態様は、翻訳プロセスの阻害によって細胞内で作用するペプチドを含む融合タンパク質であって、次に指定されたペプチドの群から選択されるものである：
配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８。
本発明の融合タンパク質におけるＴＲＡＩＬの抗がん活性は、他の成分の活性化により潜在的に増加させることができる―例えば、２８Ｓ ｒＲＮＡのアデニンの脱プリン化、因子ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化、２８ＳＲＮＡのアデニンのＮ−グリコシル化、２８Ｓ ＲＮＡの切断、ｍＲＮＡの切断またはＤＮＡ分解であり、これらはタンパク質合成の阻害をもたらし、したがってプロテオームレベルでの細胞の反応を遮断し、アポトーシス経路を遮断するタンパク質の過剰産生を低減し、最終的にアポトーシス経路を再確立する。さらに、細胞のタンパク質合成プロセスの遮断は、細胞サイクルの制御点により（例えば、サイクリン依存性キナーゼなど）、ＴＲＡＩＬの、ＤＲ系の機能的細胞受容体に対する付着から生じるシグナルと相乗して、内部誘導性アポトーシスを活性化することができる。
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性ＴＲＡＩＬおよび配列のフラグメントを含むその変異体よりも強力な活性を発揮することが見出された。これまで、本発明の融合タンパク質において使用される既知のエフェクターペプチドのうち、インターロイキン−２に融合したジフテリア毒素（Ontake（登録商標））のみが、医学で使用されてきた。本発明の融合タンパク質に使用される他のエフェクターペプチドは、医学においてそのように適用されておらず、その理由は、不利な反応速度、非特異的プロテアーゼによる迅速な分解、および標的部位でのエフェクターペプチドの機能を可能にするために必要な活性化経路の適切な配列の欠如に起因する、身体における蓄積などである。融合タンパク質の取り込みは、その作用が必要とされる場所へのその選択的送達を可能にする。
また、エフェクターペプチドの付着はタンパク質の重量を増加させ、これは腫瘍中のタンパク質の半減期の延長および貯留の増加をもたらし、その結果効率を増加させる。さらに、多くの場合、新たな融合タンパク質は、おそらくタンパク質合成に関与する細胞機構の不安定化を介して、ＴＲＡＩＬに対する天然または誘導性の抵抗性を克服する。がん細胞は、特にアポトーシス経路（Ｂｃｌ−２、ＩＡＰ、ＸＩＡＰまたはｃＦＬＩＰ）を遮断するタンパク質の過剰産生によって、ＴＲＡＩＬの細胞毒性活性に対する耐性を獲得する可能性があるため、タンパク質合成の細胞機構を遮断することは、プロテオームレベルでの細胞反応の遮断をもたらし、したがってアポトーシス経路を遮断しない。
上述した代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は以下に提示の実施例に示されている。
本発明によると、融合タンパク質とは、２つもしくは３つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、化学的リンカーを追加せずに、それら各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドとタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
融合タンパク質は、化学的ペプチド合成の方法、特に、好適な樹脂を担体として使用する固相におけるペプチド合成の技術を使用して、合成することができる。かかる技術は従来型であり、当技術分野において知られ、とりわけ、例えばBodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York、Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Companyのような単行本に記載されている。
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント（ドメイン）を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して１つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
結果として生じたペプチドの構造を検証するために、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析技術などの、ペプチドのアミノ酸組成を分析する既知の方法を使用してもよい。ペプチド配列を確認するために、ペプチドを連続的に分解してアミノ酸の配列を同定するタンパク質シーケンサーもまた使用することができる。
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
本発明の他の側面はまた、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義された本発明のＤＮＡ配列を含む発現ベクターでもある。
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
融合タンパク質などの、組み換えタンパク質の生成のための方法は、周知である。簡潔には、この技術は、ポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現に向かわせるＤＮＡ分子、の生成にある。ポリヌクレオチド分子をコードする標的タンパク質を、次に、該ポリペプチドの有効な発現を確保する適切な発現ベクターに取り込む。次に、組み換え発現ベクターを、形質移入／形質転換用の宿主細胞に導入し、結果として、形質転換された宿主細胞が産生される。この後に標的タンパク質を過剰発現させるために形質転換した細胞を培養し、得られたタンパク質を精製し、タンパク質の発現または精製に使用されたタグ配列を切断により任意に切り取る。
発現と精製に好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
コスミド、プラスミドまたは改変されたウイルスは、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の導入および複製のための発現ベクターとして使用することができる。典型的には、プラスミドが、発現ベクターとして使用される。好適なプラスミドは周知であり、市販されている。
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
発現ベクターはまた、マーカー遺伝子配列も含むことができ、それは、形質転換細胞に明確な表現型を与え、形質転換細胞の特異的な選択を可能にする。さらに、該ベクターはまた、挿入された標的タンパク質のコード配列を含む組み換えプラスミドにより形質転換された細胞と、挿入のないプラスミドを取り込んだ細胞を区別すること可能にする、第２のマーカー配列も含んでもよい。ほとんどの場合、典型的な抗生物質抵抗性マーカーを使用するが、当該分野で知られている任意の他のレポーター遺伝子を使用してもよく、細胞の中のその存在(in vivo)によって、オートラジオグラフィー技術、分光光度法または生物発光および化学発光を使用して容易に判定することができる。例えば、宿主細胞に依るが、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用してもよい。
さらに、発現ベクターは、適切な細胞区画、例えば折り畳みが促進される周辺質、にタンパク質を輸送するシグナル配列を含んでもよい。加えて、Ｎ末端に付着されるＨｉｓＴａｇまたはＣ末端に付着されるＧＳＴなどのラベル／タグをコードする配列が存在してもよく、それは、続く、ニッケルカラムでの親和性クロマトグラフィーによる、親和性の原理を使用して産生されるタンパク質の精製を促進する。その溶解性を増大させる配列だけでなく、宿主細胞におけるタンパク質分解からタンパク質を保護する追加の配列もまた、存在してもよい。
標的タンパク質の配列に付着された補助的な要素は、その活性を遮断するか、または、例えば毒性などにより、別の理由で有害となり得る。かかる要素は除去されなければならず、酵素的または化学的な切断によって達成され得る。具体的には、６−ヒスチジンタグのＨｉｓＴａｇまたは親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能にするために付着されたこのタイプの他のマーカーは、可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の肝毒性に対して記載されたその効果のために、除去されるべきである。原核細胞：Escherichia coliまたはBacillus subtilisなどの細菌性細胞、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母、および真核細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）を含む、様々な周知の宿主細胞に基づく異種発現系を使用してよい。
好ましくは、培養および遺伝子操作が容易であることと、得られる産生物が大量であることとのために、E. coli発現系を使用する。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現に最適化されるであろう。すなわち、それは、コード配列の中に、先端技術において知られている配列の可能な変異体から選択される、E. coliにおける発現に最適なコドンを含むであろう。さらに、発現ベクターは、コード配列に付着された、E. coliに好適な前記要素を含むであろう。
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含み、かつE. coliにおける発現に最適化されたポリヌクレオチド配列は、以下：
配列番号８５；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号８９；配列番号９０；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９５；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９８；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；配列番号１０２；配列番号１０３；配列番号１０４；配列番号１０５；配列番号１０６；配列番号１０７；配列番号１０８；配列番号１０９；配列番号１１０；配列番号１１１；配列番号１１１；配列番号１１３；配列番号１１４；配列番号１１５；配列番号１１６；配列番号１１７；配列番号１１８；配列番号１１９；配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；配列番号１２４；配列番号１２５；配列番号１２６；配列番号１２７；配列番号１２８；配列番号１２９；配列番号１３０；配列番号１３１；配列番号１３２；配列番号１３３；配列番号１３４；配列番号１３５；配列番号１３６；配列番号１３７；配列番号１３８；配列番号１６９；配列番号１７０；配列番号１７１；配列番号１７２；配列番号１７３；配列番号１７４；配列番号１７５；配列番号１７６；配列番号１７７；配列番号１７８；配列番号１７９；配列番号１８０；配列番号１８１；配列番号１８２；配列番号１８３；配列番号１８４；配列番号１８５；配列番号１８６；配列番号１８７；配列番号１８８；配列番号１８９；配列番号１９０；配列番号１９１；配列番号１９２；および配列番号１９３；
からなるポリヌクレオチド配列の群から選択され、これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８。
好ましい態様において、本発明はまた、上で示された配列番号８５から配列番号１３８および配列番号１６９から配列番号１９３のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターで形質転換されたE. coli細胞を提供する。
形質転換、すなわち、細菌性宿主細胞、具体的にはE. coliへのＤＮＡ配列の導入は、例えば、低温（４℃）でのカルシウムイオンによる処置の後、熱ショック（３７−４２℃で）に供するか、または電気穿孔によって、ＤＮＡを取り込ませるよう調製されたコンピテント細胞に対して通常実施される。かかる技術は周知であり、通常、発現系の製造業者によって決定されるか、または文献および実験室での作業のためのマニュアル、例えばManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などに記載されている。
E. coli発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順は、以下にさらに記載されるであろう。
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるかまたは分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
用語「薬学的に許容し得る担体、希釈剤および補助成分」は、当該技術分野で知られている、任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入、局所のための液状の、固形のおよびエアロゾルの形態などの、選択される投与経路および所望の剤形、ならびに、選択される形態が、注入によるように投与経路のために殺菌されたものである必要があるべきかどうかに依存して、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を含んでもよい。本発明に従い、医薬組成物の投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注入経路を含む非経口であるか、または、単発または連続的な静脈内点滴による。
一態様において、本発明の医薬組成物は、直接腫瘍に注入することによって投与してもよい。他の態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内に投与してもよい。さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物は、必要ならば、適切なｐＨに緩衝された体液と等浸透圧の、薬学的に許容し得る水性または非水性培地における水溶液または分散液であってよく、抗酸化剤、緩衝剤、静菌性剤、および該組成物をレシピエントの組織または血液に適合させる可溶性物質もまた含んでもよい。当該組成物に含まれてもよい他の成分は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。妥当な流動性および該物質の粒子サイズは、レシチンなどのコーティング物質、ならびに、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベートおよび同類のものなどの界面活性剤により提供されてよい。
液体非経口組成物に好適な等張化剤は、例えば、グルコースなどの糖および塩化ナトリウムならびにそれらの組み合わせである。
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体中に使用直前に再構成するための、凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約５．５から約６．５までのｐＨに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
本組成物は、１種または２種以上の成分の酸化を遅らせる、様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用を防止するために、本組成物は、例えば非限定的に、パラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の知られている物質を含む様々な抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の活性成分を含むことができる。より具体的に、本組成物は、活性成分を、本組成物単位の１重量％から７５重量％まで、または例えば２５重量％から６０重量％までの量において含んでもよいが、示された値に限定されるものではない。人間を含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、病気の重篤度、処置される疾患のタイプ、先のまたは同時の治療的介入、患者および投与経路などの、物理的および生理学的な要因により決定することができる。好適な単位用量、全用量および本組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。
本組成物は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約１マイクログラム〜約１０００ｍｇの用量において、例えば体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲において、または体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、投与してもよい。融合タンパク質およびそれを含む組成物は、抗がん性または抗腫瘍性を呈し、がん疾患の処置のために使用することができる。本発明はまた、上で定義される本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置するための使用をも提供する。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における新生物／がん疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の融合タンパク質の、抗新生物／抗がんに有効な量を、任意に適切な医薬組成物の形態において、投与することを含む。
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマなどの血液悪性腫瘍および他の血液悪性腫瘍の処置のために使用することができる。融合タンパク質はまた、乳がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍および同類のものなどの固形腫瘍の処置のためにも使用されことができる。がんの処置における融合タンパク質の適切な投与経路は、具体的に、本発明の融合タンパク質を注入または点滴の形態において、この投与経路に適切な組成および形態において、投与することからなる、非経口経路である。本発明は、以下の基本手順および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載されるであろう。
融合タンパク質の過剰発現のための基本手順
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素ＮｄｅＩの切断部位（リーディング鎖の５’末端において）およびＸｈｏＩの切断部位（リーディング鎖の３’末端において）を、生じた標的タンパク質をコードする得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、Ｎ末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ（６ヒスチジン）を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、特にヒスチジンタグもなく発現され、続いてそれらをＳＰセファロースで精製した。
得られた構築物の正確さを、先ず、酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用する単離プラスミドの制限分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームを自動シークエンシングすることにより確認した。シークエンシングのために使用したプライマーは、ベクター中に存在するＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）およびＴ７ターミネーター（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）の配列に相補的であった。得られたプラスミドを、製造業者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株において、標的融合タンパク質を過剰発現させるために使用した。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１％グルコース）上で得られたコロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および１％グルコースが補充されたＬＢ液体培地中で終夜培養物を調製するために使用した。振盪培養器における約１５ｈの成長の後、その培養物を、適切な培養に植菌するために使用した。
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、０．２５−１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪しながらのインキュベーション（３．５−２０ｈ）の後、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。細菌ペレットを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で８分間超音波処理した（４０％の振幅、１５秒パルス、１０ｓのインターバル）。得られた抽出物を、４０分間、２００００ｇ、４℃における遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース（GE Healthcare）樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に４℃で終夜インキュベートした。
その後、それをクロマトグラフィーカラム中にロードし、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中のイミダゾール勾配を使用してカラムから溶出させた。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を組み合わせて、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＬ−アルギニン、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０に対して、４℃で終夜透析し、同時に、Ｈｉｓｔａｇが存在している場合は、Ｈｉｓｔａｇをトロンビン（１：５０）で切断した。切断の後、トロンビンを、ベンズアミジンセファロース（登録商標）樹脂を使用する精製によりＨｉｓｔａｇを伴って発現した標的融合タンパク質から、分離した。Ｈｉｓｔａｇなしで発現した標的融合タンパク質の精製は、ＳＰセファロースで実施した。その産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度が０．５−１ｍＭの範囲になるまで添加した。２５℃で振盪しながらの２０ｈのインキュベーション後に、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、５０分間、８０００ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。
未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（ｐＨ７．８））で洗浄した。その後、ベッドに特異的に結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、タンパク質がヒスチジンタグを伴って発現された場合に、トロンビン（タンパク質４ｍｇあたり１Ｕ、８ｈ、１６℃で）で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いで、その画分を、処方緩衝液（５００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４（ｐＨ７．４））に対して透析した。
この説明において、ヒスチジンタグと共に当初発現され、続いて該タグを除去されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのａ）で表される。ヒスチジンタグなしで当初から発現されたタンパク質は、実施例番号に続いて上付きのｂ）で表される。
２−Ｄ電気泳動による融合タンパク質の特徴付け
得られたタンパク質をさらに特徴付け、クロマトグラフィー条件を正確に選択するために、タンパク質の等電点を決定した。この目的のために、二次元電気泳動（２−Ｄ）方法を以下のスケジュールに従って二段階で使用した。
ステップ１．ｐＨ勾配におけるタンパク質の等電点電気泳動法および変性条件
濃度１〜２ｍｇ／ｍｌのタンパク質調製物を、アセトン中に１０％のトリクロロ酢酸および０．０７％のβ−メルカプトエタノールを含有する沈殿溶液と１：１の割合で混合することにより、沈殿させた。混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、次いで１５，０００ｇおよび４℃で２５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを冷アセトンと０．０７％β−メルカプトエタノールで２回洗浄した。次にアセトンの残留物を、臭いが検出されなくなるまで蒸発させた。タンパク質ペレットを、２５０ｍｌの再水和緩衝液、８Ｍの尿素、１％のＣＨＡＰＳ、１５ｍＭのＤＴＴ、０．５％の両性電解質（GE Healthcare）に、その後に用いるストリップに依存して、３−１１または６−１１のｐＨのプロファイルで懸濁した。タンパク質溶液を等電点電気泳動用のセラミックチャンバーに入れ、次いで適切なｐＨプロファイル（３−１１または６−１１）で１３ｃｍのDrysStrip（GE Healthcare）に供した。全体を鉱油の層で覆った。チャンバーはEttan IPGphor III装置に入れ、ここで、等電点電気泳動を、ストリップの寸法およびｐＨプロファイルに割り当てられた次のプログラムに従って行った。
２０℃で１６時間脱水。
固定されたｐＨ勾配で電界にフォーカス
その後、焦点のタンパク質を含有するストリップを脱イオン水で１分間洗浄し、クーマシーブリリアントで染色し、ついで脱色し、タンパク質の位置をマークする画像としてアーカイブに保管した。脱色したストリップは、次の組成の緩衝液で１５分間、２回平衡化した：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍの尿素、１％ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール。
ステップ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる第２方向への分離。
ストリップは、標準サイズ毎に単一のウェルを含有する１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、次に分離を、２００Ｖの電圧で３時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置で実施した。ゲルはクーマシーブリリアントで染色し、適用されたスケールでアーカイブに保管した。タンパク質は、サイズの標準に基づいてその重量を決定することにより同定され、そのＩＰＩは、製造業者（GE Healthcare）が提供する曲線に基づき６−１１の尺度で（アノードとしてマークされた端からのストリップの長さの％に対するｐＨの比率）、または等電点電気泳動校正キット（GE Healthcare）により実験的に決定された曲線に基づいて３−１１の尺度で、読み取った。
例
本発明の融合タンパク質の代表例を、以下の例に示す。
以下のアミノ酸配列成分の記号を使用する。
ＬＩＮＫＥＲ１：立体リンカー配列（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＳ）
ＬＩＮＫＥＲ２：立体リンカー配列（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧＧ）
ＬＩＮＫＥＲ３：立体リンカー配列（Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＡＳＧＧ）
ＬＩＮＫＥＲ４：立体リンカー配列（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＳ）
ＬＩＮＫＥＲ５：立体リンカー配列（Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｓｅｒ／ＳＨＡＳ）
ＦＵＲＩＮ：フューリンにより切断される配列（Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ／ＲＫＫＲ）
ＵＲＯＫＩＮ：ウロキナーゼにより切断される配列（Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ／ＲＶＶＲ）
ＰＥＧ：ＰＥＧ化リンカー配列（Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ／ＡＳＧＣＧＰＥ）
ＴＲＡＮＳ１：輸送配列（Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＫＤＥＬ）
ＴＲＡＮＳ２：輸送配列（Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ／ＲＲＲＲＲＲＲＲ）
ＴＲＡＮＳ３：（Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ／ＫＥＤＬ）
ＬＩＮＫＥＲ６：（Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ ＡｌａＡｌａ Ｃｙｓ／ＣＡＡＡＣＡＡＣ）
ＬＩＮＫＥＲ７：（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧ）
ＭＭＰ：（Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ／ＰＬＧＬＡＧ）
ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ：（Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ／ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）
例１．配列番号１の融合タンパク質
配列番号１のタンパク質は、４３０アミノ酸の長さおよび４８．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１の配列により形成され、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は２４８アミノ酸のボウガニン（boguanin）ドメインＡ（配列番号５５）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号５５）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１および配列番号８５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２．配列番号２の融合タンパク質
配列番号２のタンパク質は、２６７アミノ酸の長さおよび５０．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はリシンＡの２６７アミノ酸ドメイン（配列番号５６）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）はドメイン（ｂ）から、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより認識される切断部位の配列（ＲＫＫＲ）によって隔てられている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号５６）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２および配列番号８６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２ａ）およびヒスチジンタグなし（例２ｂ）の両方で発現された。
例３．配列番号３の融合タンパク質
配列番号２のタンパク質は、３７８アミノ酸の長さおよび４２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はリシンＡドメインの２６７アミノ酸変異体（配列番号５７）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）はドメイン（ｂ）から、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより認識される切断部位の配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）によって隔てられている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号５７）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３および配列番号８７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例４．配列番号４の融合タンパク質
配列番号４のタンパク質は、４７３アミノ酸の長さおよび５３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はＰＡＰ毒素の２９０アミノ酸ホモログ（配列番号５８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）はドメイン（ｂ）から、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）によって隔てられている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号５８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４および配列番号８８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例５．配列番号５の融合タンパク質
配列番号５のタンパク質は、４３０アミノ酸の長さおよび４８．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はサポリンの２５２アミノ酸フラグメント（配列番号５９）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）はドメイン（ｂ）から、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）によって隔てられている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号５９）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５および配列番号８９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号８９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例６．配列番号６の融合タンパク質
配列番号６のタンパク質は、４４２アミノ酸の長さおよび４９．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はサポリンの２５２アミノ酸フラグメント（配列番号５９）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−（配列番号５９）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号６および配列番号９０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例７．配列番号７の融合タンパク質
配列番号７のタンパク質は、４２９アミノ酸の長さおよび４７．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は２４７アミノ酸ペプチドトリコサンチン（配列番号６０）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６０）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号７および配列番号９１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例８．配列番号８の融合タンパク質
配列番号８のタンパク質は、４２７アミノ酸の長さおよび４７．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は２４７アミノ酸ペプチドトリコサンチン（配列番号６１）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号８および配列番号９２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例９．配列番号９の融合タンパク質
配列番号９のタンパク質は、４２７アミノ酸の長さおよび４７．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はヤドリギ（mistletoe）レクチンＡの２４９アミノ酸鎖（配列番号６２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号９および配列番号９３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１０．配列番号１０の融合タンパク質
配列番号１０のタンパク質は、４６２アミノ酸の長さおよび５１．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はエブリンの２７３アミノ酸サブユニットＡ（配列番号６３）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６３）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫ２−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１０および配列番号９４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１１．配列番号１１の融合タンパク質
配列番号１１のタンパク質は、４５４アミノ酸の長さおよび５０．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はニグリンの２７２アミノ酸サブユニットＡ（配列番号６４）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６４）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１１および配列番号９５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１２．配列番号１２の融合タンパク質
配列番号１２のタンパク質は、２２１アミノ酸の長さおよび２５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は４７アミノ酸ルフィンＰ１ペプチド（配列番号６５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−（配列番号６５）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１２および配列番号９６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１３．配列番号１３の融合タンパク質
配列番号１３のタンパク質は、２２１アミノ酸の長さおよび２６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は４７アミノ酸ルフィンＰ１ペプチド（配列番号６５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）および（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６５）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１３および配列番号９７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１４．配列番号１４の融合タンパク質
配列番号１４のタンパク質は、２５４アミノ酸の長さおよび２９．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は４７アミノ酸ルフィンＰ１ペプチド（配列番号６５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号６５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４および配列番号９８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１４ａ）およびヒスチジンタグなし（例１４ｂ）の両方で発現された。
例１５．配列番号１５の融合タンパク質
配列番号１５のタンパク質は、４３８アミノ酸の長さおよび４９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はボルケンシンの２４４アミノ酸サブユニットＡ（配列番号６６）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６６）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５および配列番号９９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号９９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１５ａ）およびヒスチジンタグなし（例１５ｂ）の両方で発現された。
例１６．配列番号１６の融合タンパク質
配列番号１６のタンパク質は、４３１アミノ酸の長さおよび４８．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はボルケンシンの２４４アミノ酸サブユニットＡ（配列番号６６）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号６６）−ＴＲＡＮＳ１
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１００）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１７．配列番号１７の融合タンパク質
配列番号１７のタンパク質は、４２８アミノ酸の長さおよび４７．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はボルケンシンの２４６アミノ酸サブユニットＡ（配列番号６７）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６７）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１７および配列番号１０１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例１８．配列番号１８の融合タンパク質
配列番号１８のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、Pseudomonas aeruginosa外毒素の改変配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログ（配列番号６８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、構築物全体のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１８および配列番号１０２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例１８ａ）およびヒスチジンタグなし（例１８ｂ）の両方で発現された。
例１９．配列番号１９の融合タンパク質
配列番号１９のタンパク質は、５２６アミノ酸の長さおよび５７．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１９−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログＡ（配列番号６８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１１９−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１９および配列番号１０３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２０．配列番号２０の融合タンパク質
配列番号２０のタンパク質は、５２６アミノ酸の長さおよび５７．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３５４アミノ酸ホモログ（配列番号８４）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号８４）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２０および配列番号１０４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２０ａ）およびヒスチジンタグなし（例２０ｂ）の両方で発現された。
例２１．配列番号２１の融合タンパク質
配列番号２１のタンパク質は、５３４アミノ酸の長さおよび５８．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３５４アミノ酸ホモログ（配列番号６９）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６９）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２１および配列番号１０５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２２．配列番号２２の融合タンパク質
配列番号２２のタンパク質は、５３４アミノ酸の長さおよび５６．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の３４２アミノ酸フラグメント（配列番号８３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−（配列番号８３）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２２および配列番号１０６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２３．配列番号２３の融合タンパク質
配列番号２３のタンパク質は、５２６アミノ酸の長さおよび５７．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１９−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の３４２アミノ酸フラグメント（配列番号８３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１１９−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号８３）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２３および配列番号１０７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２４．配列番号２４の融合タンパク質
配列番号２４のタンパク質は、５２６アミノ酸の長さおよび５７．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の３４２アミノ酸フラグメント（配列番号８３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１１９−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号８３）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２４および配列番号１０８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２５．配列番号２５の融合タンパク質
配列番号２５のタンパク質は、４２３アミノ酸の長さおよび４７．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、志賀毒素ｓｔｘの２３９アミノ酸変異体（配列番号７０）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＳＨＨＡＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７０）−ＬＩＮＫＥＲ５−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２５および配列番号１０９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１０９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例２６．配列番号２６の融合タンパク質
配列番号２６のタンパク質は、４３２アミノ酸の長さおよび４７．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２０−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、志賀毒素ｓｔｘの２３９アミノ酸変異体（配列番号７０）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２０−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ４−（配列番号７０）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２６および配列番号１１０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２６ａ）およびヒスチジンタグなし（例２６ｂ）の両方で発現された。
例２７．配列番号２７の融合タンパク質
配列番号２７のタンパク質は、５２６アミノ酸の長さおよび３８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、１４９アミノ酸の制限ペプチド（配列番号７１）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、およびＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２７および配列番号１１１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２７ａ）およびヒスチジンタグなし（例２７ｂ）の両方で発現された。
例２８．配列番号２８の融合タンパク質
配列番号２８のタンパク質は、３３５アミノ酸の長さおよび３７．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、１４９アミノ酸の制限ペプチド（配列番号７１）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号７１）−ＴＲ２
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２８および配列番号１１２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２８ａ）およびヒスチジンタグなし（例２８ｂ）の両方で発現された。
例２９．配列番号２９の融合タンパク質
配列番号２９のタンパク質は、３１９アミノ酸の長さおよび３５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、１３０アミノ酸のヒルステリン（hirsutellin）ペプチド（配列番号７２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、およびＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号２９および配列番号１１３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Aに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例２９ａ）およびヒスチジンタグなし（例２９ｂ）の両方で発現された。
例３０．配列番号３０の融合タンパク質
配列番号３０のタンパク質は、２９０アミノ酸の長さおよび３２．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、１０９アミノ酸のＫｉｄタンパク質（配列番号７３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号７３）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３０および配列番号１１４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３１．配列番号３１の融合タンパク質
配列番号３１のタンパク質は、２７７アミノ酸の長さおよび３１．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、１０９アミノ酸のＣｃｄＢタンパク質（配列番号７４）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号７４）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３１および配列番号１１５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３２．配列番号３２の融合タンパク質
配列番号３２のタンパク質は、２２８アミノ酸の長さおよび２５．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ＣｃｄＢタンパク質の４７アミノ酸変異体（配列番号７５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号７５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３２および配列番号１１６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例３２ａ）およびヒスチジンタグなし（例３２ｂ）の両方で発現された。
例３３．配列番号３３の融合タンパク質
配列番号３３のタンパク質は、２７５アミノ酸の長さおよび３１．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、９４アミノ酸のＲｅｌＥタンパク質（配列番号７６）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号７６）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３３および配列番号１１７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３４．配列番号３４の融合タンパク質
配列番号３４のタンパク質は、２７１アミノ酸の長さおよび３０．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、９０アミノ酸のＳｔａＢタンパク質（配列番号７７）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、およびフューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−（配列番号７７）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３４および配列番号１１８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３５．配列番号３５の融合タンパク質
配列番号３５のタンパク質は、４２９アミノ酸の長さおよび４８．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、２５１アミノ酸ゲロニンペプチド（配列番号７８）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７８）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３５および配列番号１１９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１１９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３６．配列番号３６の融合タンパク質
配列番号３６のタンパク質は、４３４アミノ酸の長さおよび４８．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２０−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、２５１アミノ酸ゲロニンペプチド（配列番号７８）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７８）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２０−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３６および配列番号１２０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３７．配列番号３７の融合タンパク質
配列番号３７のタンパク質は、４２７アミノ酸の長さおよび４８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、２５１アミノ酸ゲロニンペプチド（配列番号７８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号７８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３７および配列番号１２１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３８．配列番号３８の融合タンパク質
配列番号３８のタンパク質は、４３３アミノ酸の長さおよび４８．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、２５１アミノ酸ゲロニンペプチド（配列番号７８）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７８）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３８および配列番号１２２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例３９．配列番号３９の融合タンパク質
配列番号３９のタンパク質は、５５８アミノ酸の長さおよび６１．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ジフテリア毒素の３８７アミノ酸サブユニットＡ（配列番号７９）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号７９）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号３９および配列番号１２３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例４０．配列番号４０の融合タンパク質
配列番号４０のタンパク質は、４８１アミノ酸の長さおよび５３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ジフテリア毒素の１９３アミノ酸触媒ドメイン（配列番号８０）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列（配列番号１３９）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−（配列番号１３９）−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号８０）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４０および配列番号１２４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４０ａ）およびヒスチジンタグなし（例４０ｂ）の両方で発現された。
例４１．配列番号４１の融合タンパク質
配列番号４１のタンパク質は、４８１アミノ酸の長さおよび５３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、ジフテリア毒素の１８９アミノ酸触媒ドメイン（配列番号８１）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、Pseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列（配列番号１３９）、フューリンにより切断される配列（ＲＫＫＲ）、および２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８１）−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１３９）−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４１および配列番号１２５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例４２．配列番号４２の融合タンパク質
配列番号４２のタンパク質は、４３２アミノ酸の長さおよび４８．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４２および配列番号１２６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４２ａ）およびヒスチジンタグなし（例４２ｂ）の両方で発現された。
例４３．配列番号４３の融合タンパク質
配列番号４３のタンパク質は、４４３アミノ酸の長さおよび４９．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、インテグリンリガンドの配列（配列番号１４０）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１４０）−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４３および配列番号１２７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４３ａ）およびヒスチジンタグなし（例４３ｂ）の両方で発現された。
例４４．配列番号４４の融合タンパク質
配列番号４４のタンパク質は、４３３アミノ酸の長さおよび４８．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）およびウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４４および配列番号１２８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４４ａ）およびヒスチジンタグなし（例４４ｂ）の両方で発現された。
例４５．配列番号４５の融合タンパク質
配列番号４５のタンパク質は、４４１アミノ酸の長さおよび５０ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、８つのアルギニン残基からなる輸送配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、および順番に２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＴＲＡＮＳ２−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４５および配列番号１２９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１２９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例４６．配列番号４６の融合タンパク質
配列番号４６のタンパク質は、５５０アミノ酸の長さおよび６１．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、Pseudomonas由来の輸送ドメイン配列（配列番号１３９）、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、およびウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号１３９）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−（配列番号８２）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４６および配列番号１３０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４６ａ）およびヒスチジンタグなし（例４６ｂ）の両方で発現された。
例４７．配列番号４７の融合タンパク質
配列番号４７のタンパク質は、４５９アミノ酸の長さおよび５１．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、およびＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−ＰＥＧ−（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４７および配列番号１３１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４７ａ）およびヒスチジンタグなし（例４７ｂ）の両方で発現された。
例４８．配列番号４８の融合タンパク質
配列番号４８のタンパク質は、４４３アミノ酸の長さおよび４９．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号８２）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４８および配列番号１３２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例４９．配列番号４９の融合タンパク質
配列番号４９のタンパク質は、４４７アミノ酸の長さおよび５０．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＵＲＯＫＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号８２）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号４９および配列番号１３３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例４９ａ）およびヒスチジンタグなし（例４９ｂ）の両方で発現された。
例５０．配列番号５０の融合タンパク質
配列番号５０のタンパク質は、４４１アミノ酸の長さおよび４９．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、アブリンの２５１アミノ酸ドメインＡ（配列番号８２）であり、ドメイン（ａ）のＮ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ウロキナーゼにより切断される配列（ＲＶＶＲ）、およびＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号８２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−ＰＥＧ−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５０および配列番号１３４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例５０ａ）およびヒスチジンタグなし（例５０ｂ）の両方で発現された。
例５１．配列番号５１の融合タンパク質
配列番号５１のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、Ｄ２１８Ｈ変異を含有するＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４２）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログ（配列番号６８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）および（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４２）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５１および配列番号１３５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例５１ａ）およびヒスチジンタグなし（例５１ｂ）の両方で発現された。
例５２．配列番号５２の融合タンパク質
配列番号５２のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、変異Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｒ／Ｄ２６９Ｈを含有するＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４３）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログ（配列番号６８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）および（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４３）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号６８）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５２および配列番号１３６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例５３．配列番号５３の融合タンパク質
配列番号５３のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、Ｄ２１８Ｈ変異を含有するＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４２）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログ（配列番号８３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）およびＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４２）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＰＥＧ−（配列番号８３）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５３および配列番号１３７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ａに従い、NovagenからのE. coli Tuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付きで発現された。
例５４．配列番号５４の融合タンパク質
配列番号５４のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、変異Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｒ／Ｄ２６９Ｈを含有するＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４３）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列のフラグメントの３４２アミノ酸ホモログ（配列番号８３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）および（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４３）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号８３）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号５４および配列番号１３８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１３８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例５４ａ）およびヒスチジンタグなし（例５４ｂ）の両方で発現された。
例５５．配列番号１４４の融合タンパク質
配列番号１４４のタンパク質は、４３３アミノ酸の長さおよび４８．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、ＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、アブリンＡドメインの２５１アミノ酸変異体（配列番号１９４）である。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、およびフューリンにより認識される切断部位（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１９４）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−（ＴＲＡＩＬ１１４−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４４および配列番号１６９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１６９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例５６．配列番号１４５の融合タンパク質
配列番号１４５のタンパク質は、４５０アミノ酸の長さおよび５０．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＣ末端に付着しており、リシンＡドメインの２６４アミノ酸欠失変異体（配列番号１９５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、ＰＥＧ化リンカー配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）、フューリンにより認識される配列および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号１９５）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４５および配列番号１７０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例５７．配列番号１４６の融合タンパク質
配列番号１４６のタンパク質は、４８１アミノ酸の長さおよび５３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は、ＴＲＡＩＬ１１４−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、ジフテリア毒素の１８９アミノ酸変異活性ドメイン（配列番号１９６）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列（配列番号１３９）、フューリンにより認識される別の切断部位配列（ＲＫＫＲ）、続いて２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１９６）−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−配列番号１３９−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４６および配列番号１７１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例５８．配列番号１４７の融合タンパク質
配列番号１４７のタンパク質は、４７８アミノ酸の長さおよび５２．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、ジフテリア毒素の１８６アミノ酸変異活性ドメイン（配列番号１９７）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、およびPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列（配列番号１３９）、フューリンにより認識される別の切断部位配列（ＲＫＫＲ）、続いて２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１９７）−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−配列番号１３９−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４７および配列番号１７２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例５９．配列番号１４８の融合タンパク質
配列番号１４８のタンパク質は、４３３アミノ酸の長さおよび４８．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、ゲロニンの２５１アミノ酸突然変異体（配列番号１９８）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、フューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）、ＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥ）、および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１９８）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４８および配列番号１７３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例５９ａ）およびヒスチジンタグなし（例５９ｂ）の両方で発現された。
例６０．配列番号１４９の融合タンパク質
配列番号１４９のタンパク質は、２５８アミノ酸の長さおよび２９．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＣ末端に付着しており、４７アミノ酸のＰ１ルフィンペプチド（配列番号６５）である。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、３つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、（ＧＧＧＧ）および（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）、続いてフューリンにより認識される切断部位の配列（ＲＤＤＲ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ７−ＬＩＮＫＥＲ６−ＦＵＲＩＮ−（配列番号６５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１４９および配列番号１７４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１４９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例６１．配列番号１５０の融合タンパク質
配列番号１５０のタンパク質は、２５３アミノ酸の長さおよび２９．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ９５−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、４７アミノ酸のＰ１ルフィンペプチド（配列番号６５）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）および立体リンカー配列（ＧＧＧ）と（ＣＡＡＡＣＡＡＣ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号６５）−ＴＲＡＮＳ１−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ７−ＬＩＮＫＥＲ６−（ＴＲＡＩＬ９５−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５０および配列番号１７５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例６２．配列番号１５１の融合タンパク質
配列番号１５１のタンパク質は、５３９アミノ酸の長さおよび５９．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、トリコサンチンの２４７アミノ酸突然変異体（配列番号１９９）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、フューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、続いてPseudomonas毒素由来の輸送ドメインの配列（配列番号１３９）、フューリンにより認識される別の切断部位（ＲＫＫＲ）および２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１９９）−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−配列番号１３９−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５１および配列番号１７６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例６３．配列番号１５２の融合タンパク質
配列番号１５２のタンパク質は、４２９アミノ酸の長さおよび４７．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）はドメイン（ａ）のＮ末端に付着しており、トリコサンチンの２４７アミノ酸突然変異体（配列番号２００）である。
さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）およびフューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）、続いてＰＥＧ化配列（ＡＳＧＣＧＰＥ）および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号２００）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＰＥＧ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５２および配列番号１７７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例６４．配列番号１５３の融合タンパク質
配列番号１５３のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、点変異Ｒ３１８Ｋ、Ｎ４４１Ｑ、およびＲ６０１Ｋを有する３４２アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列（配列番号２０１）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）と（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−配列番号２０１−（ＴＲＡＮＳ１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５３および配列番号１７８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例６５．配列番号１５４の融合タンパク質
配列番号１５４のタンパク質は、４０２アミノ酸の長さおよび４３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の２２５アミノ酸欠失変異体（配列番号２０２）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）と（ＧＧＧＧＧ）およびフューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ２−ＦＵＲＩＮ−（配列番号２０２）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５４および配列番号１７９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１７９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例６５ａ）およびヒスチジンタグなし（例６５ｂ）の両方で発現された。
例６６．配列番号１５５の融合タンパク質
配列番号１５５のタンパク質は、４０３アミノ酸の長さおよび４４．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２２６アミノ酸欠失変異体（配列番号２０３）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）と（ＧＧＧＧ）およびフューリンにより認識される切断部位配列（ＲＫＫＲ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
ＴＲＡＩＬ１２１−２８１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ２−ＦＵＲＩＮ−配列番号２０３−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５５および配列番号１８０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例６６ａ）およびヒスチジンタグなし（例６６ｂ）の両方で発現された。
例６７．配列番号１５６の融合タンパク質
配列番号１５６のタンパク質は、４７０アミノ酸の長さおよび５１．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸欠失変異体（配列番号２０４）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）およびＰＥＧ化リンカー（ＡＳＧＣＧＰＥ）、続いてフューリンにより認識される配列（ＲＫＫＲ）およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＰＥＧ−ＦＵＲＩＮ−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−（配列番号２０４）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５６および配列番号１８１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例６７ａ）およびヒスチジンタグなし（例６７ｂ）の両方で発現された。
例６８．配列番号１５７の融合タンパク質
配列番号１５７のタンパク質は、４７８アミノ酸の長さおよび５１．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位（ＲＫＫＲ）、フューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０５）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５７および配列番号１８２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例６８ａ）およびヒスチジンタグなし（例６８ｂ）の両方で発現された。
例６９．配列番号１５８の融合タンパク質
配列番号１５８のタンパク質は、４０２アミノ酸の長さおよび４４．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、Pseudomonas aeruginosa外毒素配列の２１４アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０６）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）、続いて立体リンカー配列（ＧＧＧＧ）、フューリンにより認識される切断部位（ＲＫＫＲ）およびフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ２−ＦＵＲＩＮ−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−（配列番号２０６）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５８および配列番号１８３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７０．配列番号１５９の融合タンパク質
配列番号１５９のタンパク質は、４６７アミノ酸の長さおよび５０．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識される切断部位（ＲＫＫＲ）およびさらなる立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０５）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１５９および配列番号１８４である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７１．配列番号１６０の融合タンパク質
配列番号１６０のタンパク質は、４７４アミノ酸の長さおよび５１．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）およびさらなる立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
ＴＲＡＩＬ１２１−２８１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−配列番号２０５−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６０および配列番号１８５である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例７１ａ）およびヒスチジンタグなし（例７１ｂ）の両方で発現された。
例７２．配列番号１６１の融合タンパク質
配列番号１６１のタンパク質は、４７４アミノ酸の長さおよび５１．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）およびさらなる立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６１および配列番号１８６である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７３．配列番号１６２の融合タンパク質
配列番号１６２のタンパク質は、４７４アミノ酸の長さおよび５１．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸欠失変異体（配列番号２０７）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。
さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）およびさらなる立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０７）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６２および配列番号１８７である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７４．配列番号１６３の融合タンパク質
配列番号１６３のタンパク質は、５１５アミノ酸の長さおよび５５．９ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は変異Ｄ２１８Ｈを含むＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４２）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、３つの点変異Ｒ３１８Ｋ、Ｎ４４１Ｑ、およびＲ６０１Ｋを有する３４２アミノ酸の改変Pseudomonas aeruginosa外毒素配列（配列番号２０１）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＳ）および（ＡＳＧＧ）が組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４２）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ３−（配列番号２０１）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６３および配列番号１８８である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７５．配列番号１６４の融合タンパク質
配列番号１６４のタンパク質は、４７５アミノ酸の長さおよび５１．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は変異Ｄ２１８Ｈを含むＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４２）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しに続いてフューリンにより認識されるネイティブの切断部位配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）およびさらなる立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）の繰り返しが組み込まれている。さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４２）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６４および配列番号１８９である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１８９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７６．配列番号１６５の融合タンパク質
配列番号１６５のタンパク質は、４６３アミノ酸の長さおよび５０．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は変異Ｄ２１８Ｈを含むＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４２）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸欠失変異体（配列番号２０４）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４２）−ＬＩＮＫＥＲ４−ＬＩＮＫＥＲ４−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−（配列番号２０４）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６５および配列番号１９０である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１９０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７７．配列番号１６６の融合タンパク質
配列番号１６６のタンパク質は、４７５アミノ酸の長さおよび５１．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）は変異Ｙ１８９Ｎ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｒ／Ｄ２６９Ｈを含むＴＲＡＩＬ１２１−２８１（配列番号１４３）であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、いくつかの点変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素配列の２７９アミノ酸変異欠失変異体（配列番号２０５）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）および２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＤＥＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号１４３）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０５）−ＴＲＡＮＳ１
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６６および配列番号１９１である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１９１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグなしで発現された。
例７８．配列番号１６７の融合タンパク質
配列番号１６７のタンパク質は、４７４アミノ酸の長さおよび５１．２４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、変異を有するPseudomonas aeruginosa外毒素Ａ配列の２７９アミノ酸欠失変異体（配列番号２０７）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間には、順番に、２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）に続いてフューリンにより認識される切断部位のネイティブ配列（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ）および２つの立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
さらに、ドメイン（ｂ）のＣ末端には輸送配列ＫＥＤＬが付着され、エフェクターペプチドを小胞体に指向させて、全融合タンパク質のＣ末端フラグメントを形成している。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−ＦＵＲＩＮ．ＮＡＴ−ＬＩＮＫＥＲ１−ＬＩＮＫＥＲ１−（配列番号２０７）−ＴＲＡＮＳ３
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６７および配列番号１９２である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１９２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
タンパク質は、ヒスチジンタグ付き（例７８ａ）およびヒスチジンタグなし（例７８ｂ）の両方で発現された。
例７９．配列番号１６８の融合タンパク質
配列番号１６８のタンパク質は、２３２アミノ酸の長さおよび２６．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ドメイン（ａ）はＴＲＡＩＬ１２１−２８１であり、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）は、５１アミノ酸のＨｏｋタンパク質配列（配列番号２０８）であり、ドメイン（ａ）のＣ末端に付着している。さらに、ドメイン（ｂ）とドメイン（ａ）の間には、順番に、立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）に続いてウロキナーゼにより認識される切断部位の配列（ＲＶＶＲ）およびメタロプロテアーゼＭＭＰ（ＰＬＧＬＡＧ）および立体リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）が組み込まれている。
したがって、本発明の融合タンパク質の構造は以下である：
（配列番号２０８）−ＬＩＮＫＥＲ１−ＵＲＯＫＩＮ−ＭＭＰ−ＬＩＮＫＥＲ１−（ＴＲＡＩＬ１２１−２８１）
アミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示した配列番号１６８および配列番号１９３である。
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号１９３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、基本手順Ｂに従い、NovagenからのE. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)株を用いて行った。当該タンパク質は、電気泳動により前記基本手順に従って分離した。
例８０．融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験は、in vitroで腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにて、およびin vivoでマウスにおいて実施した。比較として、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１タンパク質およびプラセボを使用した。
１．円偏光二色性の測定：得られたタンパク質の二次構造組成の決定
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例２ａ、例１１ａ、例１２ａ、例１３ａ、例１４ａ、例１５ａ、例１８ａ、例２０ａ、例２６ａ、例２９ａ、例４２ａ、例４３ａ、例４４ａ、例５０ａ、例５１ａ、および例５２ａの融合タンパク質について、円偏光二色性により決定した。円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。ＣＤ法は、タンパク質構造の光学活性を利用し、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現を明らかにする。遠紫外（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、８０ｍＭのサッカロース、５ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液へ処方した後の、分析されるタンパク質の試料は、１２ｋＤａカットオフの透析バッグ（Sigma-Aldrich）中で透析した。透析を、タンパク質調製物について１００倍量（ｖ／ｖ）過剰の緩衝液中で４℃で数時間撹拌しながら実施した。透析の完了後、各調製物を遠心分離し（２５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）、上清を回収した。
こうして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
濃度範囲が０．１−２．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質の円偏光二色性の測定を、光路長０．２ｍｍまたは１ｍｍの石英キュベット中、Jasco J-710分光偏光計で実施した。窒素を７ｌ／ｍｉｎで流しながら測定を行ったため、波長範囲１９５ｎｍから２５０ｎｍまでの測定が可能であった。測定のパラメーター：−１ｎｍのスペクトル分解能；光線の半値幅１ｎｍ；感度２０ｍｄｅｇ、１つの波長での平均時間−８ｓ、スキャン速度１０ｎｍ／ｍｉｎ。
得られたスペクトルを、CDProソフトウェアを使用して１９３−２５０ｎｍの範囲で数値分析した。光電子倍増管での電圧が７００Ｖを超える点を、この波長範囲でのシグナル対ノイズ比が小さすぎるために除外した。
得られたデータを使用して、分析したタンパク質における特定の二次構造含量を、CDProソフトウェアにより計算した（表１）。
＊結晶構造１Ｄ４Ｖに基づいて得られた値
＊＊結晶構造１ＩＫＱ、１Ｒ４Ｑ、１ＡＢＲ、３ＰＸ８に基づいて得られた値
対照分子（ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１）は、大多数がβシート構造型（波長２２０ｎｍでの楕円率が明らかに最小となる）であるタンパク質に特有のＣＤスペクトルを示す。これは二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極めて少ないことを示唆している。
得られた結果はまた、ｈＴＲＡＩＬタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の融合タンパク質（例１２ａ、例１３ａ、例１４ａおよび例２９ａ）に特徴的であり、ここでβ要素は、それらの構造の３２−４４％を構成する。全ての例において、二色性スペクトルは、波長２２０ｎｍにおける１つの極小値により特徴付けられる。ＴＲＡＩＬに付着する小さいペプチドは、タンパク質の小さな部分を構成するものであって、必ずしも明確な二次構造を生じるものではないため、分析されるタンパク質は、元のタンパク質から顕著に異なるべきではない。
例２ａ、例１１ａ、例１５ａ、例２０ａ、例２６ａ、例４２ａ、例４３、例４４ａ、例５０ａ、例５１ａ、および例５２ａの構築物の場合には、α／βの二次構造が混在する含量が観察され、これはエフェクターペプチドドメインの既知の結晶構造に基づく予想と一致する。これらの嵩高いドメインの場合の、α構造の５０％レベルの含量は、融合タンパク質の構造に大きな影響を有する。
例１８ａのタンパク質のみは、７０％を超えるαへリックス含量と低いβ構造含量を有する。
２．In vitroにおける細胞株テスト
細胞株
細胞株はＡＴＣＣとＣＬＳから入手し、その後繁殖させてLaboratory of Biology Adamed’s Cell Line Bankに寄託した。実験の間、細胞は、マイコプラズマの存在についてＰＣＲ法によりキットVenorRGeM Mycoplasma PCR Detection Kit（Minerva Biolabs, Berlin, Germany）を用いて日常的にチェックした。培養物は標準条件下で維持した：３７℃、５％ＣＯ２（ＤＭＥＭの場合は１０％ＣＯ２）、および８５％の相対湿度。特定の細胞株は、ＡＴＣＣの推奨に従って適切な培地中で培養した。
ＭＴＴ細胞毒性テスト
ＭＴＴアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。これは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ１による、黄色のテトラゾリウム塩のＭＴＴ（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、非水溶性紫染料のホルマザンへの分解にある。ＭＴＴの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の５０％で還元が生じる濃度である、タンパク質のＩＣ５０濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）の決定にある。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載（Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）に従って実施した。
細胞培養培地を、所定の密度（１００μＬあたり１０４−１０５細胞）に希釈した。その後、適切に希釈された１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに３ウェルずつ適用した。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて５％または１０％のＣＯ２中、３７℃で２４ｈインキュベートし、その後、細胞（１００μｌの培地中）に、様々な濃度のテストされるタンパク質を含む１００μｌの培地をさらに添加した。３−４回の細胞分裂に相当する次の７２時間にわたって、標的タンパク質と共に細胞をインキュベーションした後、標的タンパク質を有する培地に、２０ｍｌのＭＴＴ希釈標準溶液［５ｍｇ／ｍｌ］を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で３ｈインキュベーションを続けた。その後、ＭＴＴ溶液を有する培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。
ＥＺ４Ｕ細胞毒性テスト
ＥＺ４Ｕ（Biomedica）テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、ＭＴＴ法を改変したものである。細胞生存率の研究は、タンパク質（タンパク質を７つの濃度で各３ウェルずつ）と共に細胞を連続７２時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用し、ＩＣ５０値を（２回の独立した実験の平均値として）決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
in vitro細胞毒性テストの結果は、溶媒のみで処置した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞毒性効果が５０％のレベルで観察されたタンパク質濃度に相当するＩＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）としてまとめて示す。各実験は、３ウェルずつで実施した少なくとも２つの独立した実験の平均値を表す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、ＩＣ５０限度値２０００ｎｇ／ｍｌを採用した。ＩＣ５０値が２０００を超える融合タンパク質は不活性とみなした。
このテストのために選択した細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株（ＴＲＡＩＬに対する自然抵抗性の基準：ＴＲＡＩＬタンパク質のＩＣ５０＞２０００）のみならず、ＴＲＡＩＬタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５も含んだ。
未分化ＨＵＶＥＣ細胞株を、非がん細胞における融合タンパク質の効果／毒性の査定用の、健常な対照細胞株として使用した。
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のＴＲＡＩＬに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの場合のＩＣ５０値と比べて融合タンパク質のＩＣ５０値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの活性よりも高かった。
非がん細胞株で得られた２０００を超えるＩＣ５０値は、健常細胞に対して、本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
広範な腫瘍細胞株の一団に対する、選択されたタンパク質調製物の細胞毒性活性の決定
表４は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
実験結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
得られたＩＣ５０値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
３．異種移植におけるin vivoの融合タンパク質の抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんＣｏｌｏ２０５およびＨＣＴ−１１６、ＳＷ６２０、ヒト肺がんＡ５４９、ヒト前立腺がんＰＣ−３、ヒト膵臓がんＰａｎｃ−１、ヒト肝がんＰＣＬ／ＰＲＦ／５、ＨＴ−２９、ＨｅｐＧ２、およびヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５のマウスモデルにおいてテストした。
細胞
ヒト結腸がんＣｏｌｏ２０５の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）（任意にＯｐｔｏ−ＭＥＭ（Invitrogen, Cat.22600-134）と１：１の比率で混合）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト肺がんＡ５４９の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト前立腺がんＰＣ３の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト膵臓がんＰＡＮＣ−１の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト肝がんＰＲＦ／５（ＣＬＳ）およびヒト結腸がんＳＷ−６２０の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト結腸がんＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
ヒト肝がんＨｅｐＧ２の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭＥＭ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
多剤耐性のヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミン、および１μＭのドキソルビシン塩酸塩（Sigma, Cat. No. D1515-10MG）を補充したＭｃＣｏｙ’ｓ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中に維持した。細胞移植の３日前に、細胞をドキソルビシンなしの培地中で培養した。マウスへの移植の日に、細胞をトリプシン（Invitrogen）で洗浄することによりサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁した。
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した７−９週齢ＣＤヌードマウス（Crl:CD1-Foxn1nu 1)、Harlan UKから入手した７−８週齢Hsd:Athymic-Nude-Foxn1nuマウス（雌）、Harlan UKから入手した８−１０週齢HsdCpb:NMRI-Foxn1nu マウス、ビャウィストクのCentrum Medycyny Doswiadczalnejから入手した８−１０週齢の雌Cby.Cg-foxn1(nu)/J マウス、およびCharles River Germanyから入手した４−５週齢の雌Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスを用いて実施した。マウスは、食糧および脱塩水を（適宜）自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン：New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Researchにより発行された「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」に従って行い、IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
実験の過程および評価
腫瘍サイズは電子キャリパーを用いて測定し、腫瘍体積は、式：（ａ２×ｂ）／２を用いて算出した；式中、ａ＝腫瘍の短い対角線（ｍｍ）およびｂ＝腫瘍の長い対角線（ｍｍ）である。腫瘍成長阻害は、次の式を用いて算出した：
ＴＧＩ［％］（腫瘍成長阻害）＝（ＷＴ／ＷＣ）×１００−１００％
式中、ＷＴは、処置群の平均腫瘍体積であり、ＷＣは対照群の平均腫瘍体積である。
実験結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。すべての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0プログラムを用いて作成した。
ヒト結腸がんモデル
Ａ．Ｃｏｌｏ２０５
０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した５×１０６のＣｏｌｏ２０５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験１０日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１００ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ａ（３ｍｇ／ｋｇ）、例２５ａ（３ｍｇ／ｋｇ）、例３７ａ（５ｍｇ／ｋｇ）、および例４２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、および対照として注射用水。調製物は１日１回、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験２７日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図１および図２に、腫瘍体積の変化の図（図１）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図２）として示す。
図１および図２に示す実験結果は、例１８ａ、例２５ａ、例３７ａ、および例４２ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２７日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩが３０．５％、３７％、２９％、および６０．２％で、腫瘍Ｃｏｌｏ２０５成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較してＴＧＩが１２％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｂ．ＨＣＴ−１１６
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが７１−４３２ｍｍ３になったとき（１３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、例２ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（６５ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および例２ｂは１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、例１８ｂは実験の１３、１５、２１、２４日目に静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の２４日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図１９に腫瘍体積の変化の図として、および図２０に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図１９および２０に示す実験結果は、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２４日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩが８１％および６７％で、ＨＣＴ１１６腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが３８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
Ｂ１．ＨＣＴ１１６
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが６３−３７０ｍｍ３になったとき（１７日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１９０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（７０ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１は１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、例１８ｂは４日に一度、計６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の４７日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図１９ａに腫瘍体積の変化の図として、および図２０ａに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図１９ａおよび２０ａに示す実験結果は、例１８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４７日目において対照と比較して、ＴＧＩ８５％でＨＣＴ１１６腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが３７％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
Ｃ．ＳＷ６２０ＴＡＺＤ
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＳＷ６２０細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが９２−３４８ｍｍ３になったとき（１３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２０７ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）、例１８ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、および例５１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）。調製物は１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、対照群には処方緩衝液［ｆ２５］を与えた。
実験の２６日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２１に腫瘍体積の変化の図として、および図２２に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図２１および２２に示す実験結果は、例１８ｂ、例５１ｂ、および例２ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３４日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ６２．６％、３９％および５４％でＳＷ６２０腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２３％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
Ｃ１．ＳＷ６２０
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＳＷ６２０細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが１２６−３００ｍｍ３になったとき（１１日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２１０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）。調製物は、３日に一度、計５回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には処方緩衝液［ｆ２５］を与えた。
実験の３１日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２１ａに腫瘍体積の変化の図として、および図２２ａに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図２１ａおよび２２ａに示す実験結果は、例１８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３１日目において対照と比較して、ＴＧＩ７３％でＳＷ６２０腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２７．６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
Ｄ．ＨＴ−２９
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＨＴ−２９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが８０−３４８ｍｍ３になったとき（１２日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８８ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（４用量は３ｍｇ／ｋｇ、残りの２用量は６ｍｇ／ｋｇ）、および例５１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、処方緩衝液［ｆ２５］に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）。調製物は、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には、対照として処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）を与えた。実験の２６日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２３に腫瘍体積の変化の図として、および図２４に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図２３および２４に示す実験結果は、例１８ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２６日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ５３％および６７％でＨＴ−２９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１７．５％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
肺がんモデル
Ａ．０日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下（ｓｃ）に、０．１５ｍｌのＨＢＳＳ培地に懸濁した５×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験２０日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜４５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ａ（５ｍｇ／ｋｇ）および例３５ａ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１５ｍｇ／ｋｇ）、および対照として注射用水。調製物は、以下のように静脈内（ｉ．ｖ．）投与した：投与（１日目）、１日休止、３、４、５日目に毎日投与、１日休止、投与（７日目）、１日休止、投与（９日目）。実験３８日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図３および図４に、腫瘍体積の変化の図（図３）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図４）として示す。
図３および図４に示す実験結果は、例１８ａおよび例３５ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３８日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ７３．３％および２０．７％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｂ．０日目に、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲルの混合物（４：１）０．１０ｍｌに懸濁した５×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験１９日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜７５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ａ（５ｍｇ／ｋｇ）および例５０ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１５ｍｇ／ｋｇ）、および対照として注射用水。調製物は、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３５日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図５および図６に、腫瘍体積の変化の図（図５）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図６）として示す。
実験の結果は、例１８ａおよび例５０ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３５日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ２６％および４５％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが０％のレベルで、腫瘍細胞成長に対して阻害効果が得られなかった。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｃ．０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲルの混合物（３：１）０．１０ｍｌに懸濁した５×１０６個のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験１７日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１００−１２０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２ａ（５ｍｇ／ｋｇ）、例１８ａ（３ｍｇ／ｋｇ）および例４４ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、および対照として処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）。調製物は、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３４日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図７および図８に、腫瘍体積の変化の図（図７）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図８）として示す。
実験の結果は、例２ａ、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３４日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ８３．５％、８０％および４７％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２１．８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｄ．０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲルの混合物（３：１）０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験２１日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１６０−１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２０ａ（１５ｍｇ／ｋｇ）、例２６ａ（６ｍｇ／ｋｇ）、例４３ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）、および例４７ａ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（４０ｍｇ／ｋｇ）、および対照として処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ７．４）。調製物は、１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。実験３５日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図９および図１０に、腫瘍体積の変化の図（図９）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図１０）として示す。
実験の結果は、例２０ａ、例２６ａ、例４３ａおよび例４７ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３５日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ４９．５％、６４％、４０．２％および４９．５％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１５％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｅ．Ａ５４９−腫瘍の再成長
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルの３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６のＡ５４９細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが８５−３０２ｍｍ３になったとき（１７日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１７７ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）、例１８ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（９０ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１は１日おきに１２回静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、例２ｂは１日おきに７回静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、例１８ｂは実験の１７、２０、２５および２９日目に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。対照群には、処方緩衝液を与えた。実験の４５日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２７に腫瘍体積の変化の図として、図２８に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を示す。
図２７および図２８に示した実験結果は、例１８ｂおよび例２ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４５日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ７１％および４４％でＡ５４９腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１０．６％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
膵臓がんモデル
０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＰＡＮＣ−１細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験２７日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜９５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２０ａ（５ｍｇ／ｋｇ）、例５１ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）、および例５２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ７．４）。調製物は、１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。実験の４０日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図１１および図１２に、腫瘍体積の変化の図（図１１）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図１２）として示す。
実験の結果は、例２０ａ、例５１ａ、および例５２ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４０日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ１９％、３８％、および３４％でＰＡＮＣ−１腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１２％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
Ｂ．０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した５×１０６のＰＡＮＣ−１細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験３１日目に、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１１０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ａ（３ｍｇ／ｋｇ）、および例４４ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、および対照として処方緩衝液（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）。調製物は１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。実験の４２日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図１３および図１４に、腫瘍体積の変化の図（図１３）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図１４）として示す。
実験の結果は、例１８ａおよび例４４ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４２日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ５６％および４３％でＰＡＮＣ−１腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２７．５％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
前立腺がんモデル
０日目に、マウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲル（９：１）の混合物０．２０ｍｌに懸濁した５×１０６のＰＣ３細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験２９日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜９０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ａ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および対照として注射用水。調製物は１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。実験の６０日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図１５および図１６に、腫瘍体積の変化の図（図１５）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図１６）として示す。
実験の結果は、例１８ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験６０日目において対照と比較して、ＴＧＩ３０．８％でＰＣ３腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
肝がんモデル
Ａ．ＰＣＬ／ＰＲＦ／５
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ培地とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＰＣＬ／ＰＲＦ／５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。実験３１日目、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２００ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例５１ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、および対照としての処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ７．４）。調製物は１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。実験の４９日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を図１７および図１８に、腫瘍体積の変化の図（図１７）および対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）（図１８）として示す。
実験の結果は、例５１ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４９日目において対照と比較して、ＴＧＩ８８．５％でＰＣＬ／ＰＲＦ／５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが１８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
Ｂ．ＨｅｐＧ２
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＨｅｐＧ２細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが６４−５３０ｍｍ３になったとき（２５日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜２２８ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇのＨＳＡを補充）の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）、および参照化合物５ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１は１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、例１８ｂは、実験の２５、２７、２９、３７および４２日目に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。５ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）は１日おきに６回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の４９日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２５に腫瘍体積の変化の図として、および図２６に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）の図として示す。
図２５および図２６に示す実験結果は、例１８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験４９日目において対照と比較して、ＴＧＩ８２．５％でＨｅｐＧ２腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および５ＦＵについては、対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ３１％および−４．７％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少にみられる顕著な副作用を引き起こさなかった（すなわち、体重基準値の１０％未満）。これは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
多剤耐性子宮肉腫モデル
ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが６４−３２３ｍｍ３になったとき（１３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例１８ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（５０ｍｇ／ｋｇ）、および参照化合物ＣＰＴ−１１（カンプトテシン、Pfeizer）（３０ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および例１８ｂは、１日おきに６回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＣＰＴ−１１は、１日おきに６回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。対照群には処方緩衝液を与えた。実験の３４日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２９に腫瘍体積の変化の図として、および図３０に対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）の図として示す。
図２９および図３０に示す実験結果は、例１８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３４日目において対照と比較して、ＴＧＩ８５％でＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１およびＣＰＴ−１１については、対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ５１％および５７％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独および標準化学療法と比較して、より強力な効果を発揮する。
ＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側皮下（ｓｃ）に、ＨＢＳＳ緩衝液とマトリゲル（３：１）の混合物０．１０ｍｌに懸濁した７×１０６のＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により移植した。腫瘍のサイズが２６−６１１ｍｍ３になったとき（１９日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、次の調製物を投与した：例２ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、例１８ｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、および例５１ｂ（７．５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質、および、対照としての処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（６０ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、例２ｂおよび例５１ｂは１日おきに６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、例１８ｂは１日おきに４回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。対照群には処方緩衝液を与えた。
実験の３３日目に、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
実験結果を、図２９ａに腫瘍体積の変化の図として、および図３０ａに対照に対するパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）の図として示す。
図２９ａおよび図３０ａに示す実験結果は、例２ｂ、例１８ｂおよび例５１ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目において対照と比較して、それぞれＴＧＩ８４％、６７．５％および５８．６％でＭＥＳ−ＳＡ．Ｄｘ５腫瘍の成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用したｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、対照と比較して、ＴＧＩが２５．８％のレベルで、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独と比較して、より強力な効果を発揮する。

Claims (41)

  1. 融合タンパク質であって、
    ― フラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる、可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであるか、または、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８５％の同一性を有し、かつアミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる、前記機能的フラグメントのホモログである、ドメイン（ａ）、および
    ― タンパク質合成を阻害するエフェクターペプチドの配列である少なくとも１つのドメイン（ｂ）であって、ここでドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着されている前記ドメイン（ｂ）、
    を含み、ここで融合タンパク質が、細胞表面の炭水化物受容体に結合するドメインを含まない、前記融合タンパク質。
  2. ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸から始まり、アミノ酸２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列のフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. ドメイン（ａ）が、ＤＲ４および／またはＤＲ５受容体に対して改変された親和性を有するｈＴＲＡＩＬの機能的フラグメントのホモログである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. ホモログが、配列番号１４２および配列番号１４３からなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドが、リボソームのレベルで酵素的にタンパク質翻訳を阻害するペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. エフェクターペプチドが、Ｎ−グリコシダーゼの酵素活性を有するペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. エフェクターペプチドが、リボソームを不活性化するタンパク質毒素：１型ＲＩＰ、およびリボソームを不活性化するタンパク質毒素：２型ＲＩＰの触媒サブユニットＡ、または、元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の保存されたＮ−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. エフェクターペプチドが、ゲロニン（Gelonium multiflorumから）、変異ゲロニン、モモルディン、サポリン、ブリオジンＩ、ドデカンドリン、ボウガニン（Bougainvillea spectabilisから）、ヤマゴボウＰＡＰタンパク質（Phytolacca Americana）、を含む１型ＲＩＰ毒素の群から、または、リシン、リシン突然変異体、アブリン（Abbrus precatriusから）、アブリン突然変異体、モデシン（Adenia digitataから）、ビスクミン（Viscum albumからの毒素ＭＬＩ）、ボルケンシン（Adenia volkensiiから）、志賀毒素（Shigella dysenteriaeから）、トリコサンチン（trichosantin）、トリコサンチン突然変異体、のサブユニットＡを含む、２型ＲＩＰ毒素の触媒サブユニットＡの群から、または、元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の、保存されたＮ−グリコシダーゼ活性を有するそれらの改変から選択される、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. エフェクターペプチドが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８２、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号１９９、および配列番号２００からなる群から選択される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. エフェクターペプチドが、リボヌクレアーゼ酵素活性を有するペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
  12. エフェクターペプチドが、タンパク質毒素であるαサクリン（sacrin）、マイトギリン、ヒルステリン（hirsutellin）（Hirsutella thompsoniiから）、レストリクトシン（Aspergillus restrictusから）、および元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の保存されたリボヌクレアーゼ活性を有するそれらの改変から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. エフェクターペプチドが、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. エフェクターペプチドが、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの酵素活性を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。
  15. エフェクターペプチドが、Pseudomonas aeruginosaの触媒サブユニットＡ、または、Pseudomonas aeruginosa毒素およびCorynebacterium diphteriaeのジフテリア毒素、またはCorynebacterium diphteriaeの変異ジフテリア毒素の、変異触媒サブユニットＡ、および元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の保存されたＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. エフェクターペプチドが、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、および配列番号２０７からなる群から選択される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドが、毒素−抗毒素系に属するタンパク質合成を阻害する毒素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. エフェクターペプチドが、トポイソメラーゼ活性、ｍＲＮＡｓｅ活性、または細胞膜との結合、を有するペプチドである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. エフェクターペプチドが、配列番号７４のＣｃｄＢタンパク質、配列番号７５のＣｃｄＢタンパク質、配列番号７３のＫｉｄタンパク質、配列番号７６のＲｅｌＥタンパク質、配列番号７７のＳｔａＢタンパク質、および配列番号２０８のＨｏｋタンパク質、ならびに元の配列と少なくとも８５％の配列同一性の、保存されたトポイソメラーゼ活性、ｍＲＮＡｓｅ活性または細胞膜との結合活性を有するそれらの改変、からなる群から選択される、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間、または複数のドメイン（ｂ）の間に、プロテアーゼ切断部位を含むドメイン（ｃ）を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. ドメイン（ｃ）が、腫瘍環境中に存在するプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断部位を含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドが、輸送ドメイン（ｄ）にさらに結合されており、該輸送ドメイン（ｄ）が、以下：
    ―（ｄ１）配列番号１３９のPseudomonas由来の、細胞膜を通って輸送するドメイン；
    ―（ｄ２）膜を通り、Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＫＤＥＬ、Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＨＤＥＬ、Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＲＤＥＬ、Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＤＤＥＬ、Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＡＤＥＬ、Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ／ＳＤＥＬ、およびＧｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ／ＫＥＤＬから選択される小胞体に輸送するドメイン；
    ―（ｄ３）６、７、８、９、１０または１１個のＡｒｇ残基からなる、細胞膜を通って輸送するポリアルギニン配列；
    およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択され、
    ここで、輸送ドメイン（ｄ）が、エフェクターペプチドドメイン（ｂ）のＣ末端および／またはＮ末端に位置する、前記融合タンパク質。
  23. 輸送ドメイン（ｄ）が、ドメイン（ｂ）とドメイン（ｃ）の間、またはドメイン（ａ）とドメイン（ｃ）の間、または２つのドメイン（ｃ）の間に位置する、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  24. 配列（ｄ）が、融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  25. ドメイン（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ）の間に柔軟な立体リンカーをさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  26. 立体リンカーが、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＧＳ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＧＧＧＳまたはＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧＧ、Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＡＳＧＧ、Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ／ＡＳＧ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＧ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧ、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＡＳＧＧ、Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ／ＳＨＨＳ、ＣＡＡＡＣＡＡＣ（Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ）、ＣＡＡＣＡＡＡＣ（Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. ドメイン（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の間に、ＰＥＧ分子に付着するためのリンカーであるドメイン（ｅ）を、Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ／ＡＳＧＣＧＰＥ、Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ／ＡＡＣＡＡ、Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＳＧＧＣＧＧＳ、またはＳｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ／ＳＧＣＧＳから選択して含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  28. ドメイン（ｂ）とドメイン（ｃ）の間に、Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ／ＮＧＲ、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ／ＤＧＲ、またはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ／ＲＧＤからなる群から選択されるインテグリンと結合するモチーフをさらに含む、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  29. 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号１４４；配列番号１４５；配列番号１４６；配列番号１４７；配列番号１４８；配列番号１４９；配列番号１５０；配列番号１５１；配列番号１５２；配列番号１５３；配列番号１５４；配列番号１５５；配列番号１５６；配列番号１５７；配列番号１５８；配列番号１５９；配列番号１６０；配列番号１６１；配列番号１６２；配列番号１６３；配列番号１６４；配列番号１６５；配列番号１６６；配列番号１６７；および配列番号１６８。
  30. 組み換えタンパク質である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  31. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列。
  32. E. coliにおける遺伝子発現について最適化された、請求項３１に記載のポリヌクレオチド配列。
  33. 以下からなる群から選択される、請求項３２に記載の配列：配列番号８５；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号８９；配列番号９０；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９５；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９８；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；配列番号１０２；配列番号１０３；配列番号１０４；配列番号１０５；配列番号１０６；配列番号１０７；配列番号１０８；配列番号１０９；配列番号１１０；配列番号１１１；配列番号１１１；配列番号１１３；配列番号１１４；配列番号１１５；配列番号１１６；配列番号１１７；配列番号１１８；配列番号１１９；配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；配列番号１２４；配列番号１２５；配列番号１２６；配列番号１２７；配列番号１２８；配列番号１２９；配列番号１３０；配列番号１３１；配列番号１３２；配列番号１３３；配列番号１３４；配列番号１３５；配列番号１３６；配列番号１３７；配列番号１３８；配列番号１６９；配列番号１７０；配列番号１７１；配列番号１７２；配列番号１７３；配列番号１７４；配列番号１７５；配列番号１７６；配列番号１７７；配列番号１７８；配列番号１７９；配列番号１８０；配列番号１８１；配列番号１８２；配列番号１８３；配列番号１８４；配列番号１８５；配列番号１８６；配列番号１８７；配列番号１８８；配列番号１８９；配列番号１９０；配列番号１９１；配列番号１９２；および配列番号１９３。
  34. 請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  35. 請求項３４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  36. E. coli細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
  37. 活性成分としての請求項１〜３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
  38. 非経口投与用の形態である、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. ヒトを含む哺乳動物における腫瘍性疾患の処置に用いるための、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  40. ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置する方法であって、それが必要な対象に対して、請求項１〜３０に記載の融合タンパク質、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物の、抗腫瘍有効量を投与することを含む、前記方法。
  41. 配列番号２００のトリコサンチンの突然変異体、配列番号２０１のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０２のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０４のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、配列番号２０５のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体、および配列番号２０７のPseudomonas aeruginosa毒素の触媒サブユニットＡの突然変異体からなる群から選択される、ペプチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101732126B1 (ko) 2015-11-05 2017-05-02 한국생명공학연구원 췌장암 치료용 융합 단백질 및 이의 용도

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160068577A1 (en) 2013-03-12 2016-03-10 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
ES2749862T3 (es) 2014-01-27 2020-03-24 Molecular Templates Inc Polipéptidos efectores desinmunizados de subunidad A de toxina Shiga para aplicaciones en mamíferos
WO2015138435A1 (en) * 2014-03-11 2015-09-17 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising binding regions, shiga toxin a subunit effector regions, and carboxy-terminal, endoplasmic reticulum localization signal motifs
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
EP3514168B1 (en) 2014-06-11 2021-09-01 Molecular Templates, Inc. Protease-cleavage resistant cytotoxic cell-targeting molecules
WO2016126950A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Molecular Templates, Inc. Multivalent cd20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof
WO2016127346A1 (zh) * 2015-02-11 2016-08-18 四川大学华西医院 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
WO2016196344A1 (en) * 2015-05-30 2016-12-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
CN106380521B (zh) 2015-07-02 2020-12-29 博际生物医药科技(杭州)有限公司 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
PL233352B1 (pl) * 2016-09-15 2019-10-31 Adamed Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
EP3551645A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
CN106632680A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 上海交通大学 植物体系表达人源化抗agr2单克隆抗体18a4的质粒构建
JP7082424B2 (ja) 2017-01-25 2022-06-08 モレキュラー テンプレーツ，インク． 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子
US20220023395A1 (en) * 2018-03-06 2022-01-27 The Johns Hopkins University Methods of treating or preventing cancer with an agent that depletes tregs and a checkpoint inhibitor
CN110612117B (zh) 2018-04-17 2024-04-12 分子模板公司 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子
US20220211872A1 (en) * 2019-05-15 2022-07-07 Universidad De Granada Gene therapy with the genes hokd and ldrb for cancer treatments
CN113354738B (zh) * 2020-03-05 2022-09-09 绍兴德方华生物技术有限公司 融合毒素VEGF165b/mGEL及其编码基因与应用
WO2022038152A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Atb Therapeutics Recombinant immunotoxin comprising a ribotoxin or rnase
CN117384859B (zh) * 2023-12-13 2024-03-22 北京翊博生物集团有限公司 一种树突状细胞来源的外泌体的制备方法及应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69635480T2 (de) 1995-06-29 2006-08-17 Immunex Corp., Thousand Oaks Apoptosis induzierendes cytokin
WO2001060393A1 (en) 2000-02-16 2001-08-23 Bechtel Bwxt Idaho, Llc Selective destruction of cells infected with human immunodeficiency virus
ZA200305980B (en) 2001-02-12 2007-01-31 Res Dev Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
CN1257187C (zh) * 2003-10-22 2006-05-24 上海恰尔生物技术有限公司 钙网蛋白－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
EP1688498B1 (en) 2003-11-03 2011-03-09 Beijing Sunbio Biotech Co., Ltd. A recombinant protein with cancer suppression action, its encoding gene and use
US7252993B2 (en) 2004-03-12 2007-08-07 Battelle Energy Alliance, Llc Plasmids encoding therapeutic agents
EP3006457B1 (en) 2005-07-29 2017-11-22 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Health and Human Services Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity
EP1915626B1 (en) 2005-08-16 2011-11-09 Genentech, Inc. Apoptosis sensitivity to apo2l/trail by testing for galnac-t14 expression in cells/tissues
US20100215670A1 (en) 2006-10-30 2010-08-26 Jeannick Cizeau Immunotoxin Fusions Comprising An Antibody Fragment and a Plant Toxin Linked by Protease Cleavable Linkers
KR20090130849A (ko) 2006-12-29 2009-12-24 오스프리 파마슈티컬스 유에스에이 인코퍼레이티드 변형 독소의 선택 및 생산 방법, 변형 독소를 함유하는 접합체 및 이의 용도
WO2009002947A2 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
GB0723059D0 (en) 2007-11-23 2008-01-02 Nat Univ Ireland Improved cytokine design
GB0724532D0 (en) 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
DK2252627T3 (en) * 2008-01-24 2017-08-14 Esperance Pharmaceuticals MERGER CONSTRUCTION WITH LYTIC DOMAIN AND METHOD FOR PRODUCING AND USING SAME.
TW200950778A (en) 2008-05-14 2009-12-16 Genentech Inc Methods of using Apo2L/TRAIL to treat cancer
AU2009269141B2 (en) * 2008-06-30 2013-04-04 University Of Pennsylvania Fn14/TRAIL fusion proteins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101732126B1 (ko) 2015-11-05 2017-05-02 한국생명공학연구원 췌장암 치료용 융합 단백질 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2856480A1 (en) 2013-06-06
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IL232743A0 (en) 2014-07-31
US20150044162A1 (en) 2015-02-12
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