DE69635480T2 - Apoptosis induzierendes cytokin - Google Patents

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Description

  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Der als Apoptose bekannte programmierte Zelltod unterscheidet sich vom Zelltod aufgrund von Nekrose. Apoptose tritt auf bei Embryogenese, Metamorphose, endokrin-abhängiger Gewebeatrophie, normalem Gewebeumsatz und dem Tod immuner Thymozyten (induziert durch ihren Antigenrezeptor-Komplex oder durch Glucocorticoide) (Itoh et al., Cell 66:233, 1991). Während der Reifung von T-Zellen im Thymus werden T-Zellen, welche Selbstantigene erkennen, durch den apoptotischen Prozess zerstört, wohingegen andere positiv ausgewählt werden. Die Möglichkeit, dass einige T-Zellen, welche bestimmte Selbstepitope erkennen (z.B. ineffizient verarbeitete und dargestellte Antigendeterminanten eines gegebenen Selbstproteins), diesem Eliminierungsprozess entgehen und anschließend eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen spielen, wurde bereits erwähnt (Gammon et al., Immunology Today 12:193, 1991).
  • Ein als Fas bekanntes Zelloberflächenantigen mediiert nachweislich Apoptose, und man glaubt, dass es eine Rolle bei der klonalen Deletion selbstreaktiver T-Zellen spielt (Itoh et al., Cell 66:233, 1991; Watanabe-Fukunage et al., Nature 356:314, 1992). Das Vernetzen eines spezifischen monoklonalen Antikörpers mit Fas induziert nachweislich Apoptose bei verschiedenen Zelllinien (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169:1747, 1989; Trauth et al., Science 245:301, 1989). Jedoch kann unter bestimmten Umständen die Bindung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers an Fas eine kostimulierende Wirkung auf frisch isolierte T-Zellen haben (Alderson et al., J. Exp. Med. 178:2231, 1993).
  • DNAs, welche einen Ratten-Fas-Liganden (Suda et al., Cell 75:1169, 1993) und einen humanen Fas-Liganden (Takahashi et al., International Immunology 6:1567, 1994) kodieren, wurden isoliert. Die Bindung des Fas-Liganden an Zellen, welche das Fas-Antigen exprimieren, induziert nachweislich Apoptose (Suda et al., oben, und Takahashi et al., oben).
  • Untersuchungen der Existenz und Identität eines weiteren/weiterer Moleküls/e, welche/s eine Rolle in der Apoptose spielt/spielen, sind wünschenswert. Die Identifikation solcher Moleküle würde ein zusätzliches Mittel zur Regulierung der Apoptose bereitstellen, sowie weiteren Einblick in die Entwicklung von Selbsttoleranz durch das Immunsystem und die Äthiologie von Autoimmunerkrankungen gewähren.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Cytokinprotein sowie isolierte DNA, welche das Cytokin kodiert und Expressionsvektoren, welche die isolierte DNA aufweisen, bereit. Zu Eigenschaften des neuartigen Cytokins, welches ein Mitglied der Tumornekrosefaktor (TNF) -Ligandenfamilie ist, zählt die Fähigkeit, die Apoptose bestimmter Arten von Zielzellen zu induzieren. Dieses Protein wird daher als TNF-bezogener, Apoptose-induzierender Ligand [TNF Related Apoptosis Inducing Ligand] (TRAIL) bezeichnet. Zu den Arten von Zellen, welche durch Kontakt mit TRAIL getötet werden, zählen Krebszellen wie Leukämie-, Lymphom- und Melanomzellen sowie virusinfizierte Zellen.
  • Ein Herstellungsverfahren von TRAIL-Polypeptiden beinhaltet das Kultivieren von Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, welcher TRAIL-kodierende DNA enthält, transformiert sind, unter Bedingungen, welche die Expression von TRAIL begünstigen, sowie die anschließende Gewinnung des exprimierten TRAIL-Polypeptides aus der Kultur. Gegen TRAIL-Polypeptide gerichtete Antikörper werden ebenfalls bereitgestellt.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt die Ergebnisse einer in Beispiel 8 beschriebenen Untersuchung dar. Die Untersuchung veranschaulichte, dass ein lösliches humanes TRAIL-Polypeptid den Tod von Jurkat-Zellen induzierte, bei welchen es sich um eine Leukämiezelllinie handelt.
  • 2 stellt die Ergebnisse einer in Beispiel 11 beschriebenen Untersuchung dar. Der Kontakt mit einem löslichen humanen TRAIL-Polypeptid induzierte den Tod von Zytomegalovirus-infizierten humanen Fibroblasten, wohingegen nichtvirusinfizierte Fibroblasten nicht getötet wurden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Ein neuartiges Protein, das als TRAIL bezeichnet ist, wird hierin bereitgestellt, zusammen mit DNA, welche TRAIL kodiert, und rekombinanten Expressionsvektoren, welche die TRAIL-DNA aufweisen. Ein Herstellungsverfahren für rekombinante TRAIL-Polypeptide beinhaltet das Kultivieren von Wirtszellen, die mit den rekombinanten Expressionsvektoren transformiert sind, unter Bedingungen, welche für die Expression von TRAIL geeignet sind, sowie die Gewinnung des exprimierten TRAIL.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper, welche TRAIL-Proteine spezifisch binden bereit. In einer Ausführungsform sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
  • Das TRAIL-Protein induziert die Apoptose bestimmter Arten von Zielzellen wie transformierte Zellen, welche Krebszellen und virusinfizierte Zellen einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Wie in den Beispielen 5, 8, 9 und 10 unten veranschaulicht, induziert TRAIL die Apoptose humaner Leukämie-, Lymphom- und Melanomzelllinien. Zu den Verwendungen von TRAIL zählt das Abtöten von Krebszellen. TRAIL findet ferner Anwendung bei der Behandlung von Virusinfektionen. Die Infektion mit Zytomegalievirus (CMV) machte humane Fibroblasten anfällig für Apoptose, wenn sie mit TRAIL in Kontakt gebracht wurden, wohingegen nichtinfizierte Fibroblasten durch den Kontakt mit TRAIL nicht getötet wurden (siehe Beispiel 11).
  • Das Isolieren einer DNA, welche humanes TRAIL kodiert, ist in Beispiel 1 unten beschrieben. Die Nukleotidsequenz der in Beispiel 1 isolierten humanen TRAIL-DNA ist in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.: 2 dargestellt. Dieses humane TRAIL-Protein weist eine N-terminale-cytoplasmatische (Aminosäuren 1–18), eine Transmembranregion (Aminosäuren 19–38) sowie eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–281) auf. Die extrazelluläre Domäne enthält eine Rezeptorbindungsregion.
  • Zellen des E. coli-Stammes DH10B, die mit einem rekombinanten Vektor, welcher diese humane TRAIL-DNA enthält, transformiert sind, wurden am 14. Juni 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und sie erhielten die Zugangsnummer 69849. Die Hinterlegung erfolgte nach den Regeln des Budapester Vertrages. Der rekombinante Vektor in dem hinterlegten Stamm ist der Expressionsvektor pDC409 (beschrieben in Beispiel 5). Der Vektor wurde mit SalI und NotI verdaut, und humane TRAIL-DNA, welche die gesamte in SEQ ID Nr.: 1 gezeigte kodierende Region einschließt, wurde in den Vektor ligiert.
  • DNA, welche ein zweites humanes TRAIL-Protein kodiert, wurde wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert. Die Nukleotidsequenz dieser DNA ist in SEQ ID Nr.: 3 dargestellt, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.: 4 dargestellt. Das kodierte Protein weist eine N-terminalecytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 1–18), eine Transmembranregion (Aminosäuren 19–38) und eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–101) auf.
  • Der DNA der SEQ ID Nr.: 3 fehlt ein Abschnitt der DNA der SEQ ID Nr.: 1, und wird daher als Deletionsvariante des humanen TRAIL-Klons (huTRAILdv) bezeichnet. Die Nukleotide 18 bis 358 der SEQ ID Nr.: 1 sind identisch mit den Nukleotiden 8 bis 348 der huTRAILdv-DNA der SEQ ID Nr.: 3. Die Nukleotide 359 bis 506 der SEQ ID Nr.: 1 fehlen in der geklonten DNA von SEQ ID Nr.: 3. Die Deletion verursacht eine Verschiebung im Leserahmen, was in einem Rahmen-internen Stoppcodon nach Aminosäure 101 der SEQ ID Nr.: 4 resultiert. Die DNA der SEQ ID Nr.: 3 kodiert somit ein verkürztes Protein. Die Aminosäuren 1 bis 90 der SEQ ID Nr.: 2 sind identisch mit den Aminosäuren 1 bis 90 der SEQ ID Nr.: 4. Jedoch unterscheidet sich aufgrund der Deletion der C-Terminus-Abschnitt des huTRAILdv-Proteins (Aminosäure 91 bis 101 der SEQ ID Nr.: 4) von den Resten in den entsprechenden Positionen in SEQ ID Nr.: 2. Im Gegensatz zum kompletten huTRAIL-Protein fehlt dem verkürzten huTRAILdv-Protein die Fähigkeit, Apoptose der T-Zellen-Leukämiezellen der Jurkat-Zelllinie zu induzieren.
  • DNA, welche ein Maus-TRAIL-Protein kodiert, wurde außerdem isoliert, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Nukleotidsequenz dieser DNA ist in SEQ ID Nr.: 5 dargestellt, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.: 6 dargestellt. Das kodierte Protein weist eine N-terminalecytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 1–17), eine Transmembranregion (Aminosäuren 18–38) und eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–291) auf. Dieses Maus-TRAIL ist auf dem Aminosäureniveau zu 64 % identisch mit dem humanen TRAIL der SEQ ID Nr.: 2. Die kodierende Region der Maus-TRAIL-Nukleotidsequenz ist zu 75 % identisch mit der kodierenden Region der humanen Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betriff das humane TRAIL-Protein, welches durch die N-terminale-Aminosäuresequenz MetAlaMetMetGluValGlnGlyGlyProSerLeuGlyGlnThr (Aminosäuren 1–15 der SEQ ID Nr. 2 und 4) charakterisiert ist. Maus-TRAIL-Proteine, welche durch die N-terminale-Aminosäuresequenz MetProSerSerGlyAlaLeuLysAspLeuSerPheSerGlnHis (Aminosäuren 1–15 der SEQ ID Nr.: 6), charakterisiert sind, werden hierin ebenso bereitgestellt.
  • Der TRAIL der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem als Fas-Ligand bekannten Protein (Suda et al., Cell 75:1169, 1993; Takahashi et al., International Immunology 6:1567, 1994). Der Fas-Ligand induziert die Apoptose bestimmter Zelltypen über den als Fas bekannten Rezeptor. Wie in Beispiel 5 veranschaulicht ist, wird die TRAIL-induzierte Apoptose von Zielzellen nicht durch Fas mediiert. Die humane TRAIL-Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 ist zu etwa 20 % identisch mit der humanen Fas-Ligand-Aminosäuresequenz, welche in Takahashi et al., oben dargestellt ist. Die extrazelluläre Domäne des humanen TRAIL ist zu etwa 28,4 % identisch mit der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden.
  • Die hierin offenbarten Aminosäuresequenzen zeigen auf, dass TRAIL ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie ist (Smith et al., Cell 73:1349, 1993; Suda et al., Cell 75:1169, 1993; Smith et al., Cell 76:959, 1994). Die prozentuale Identitäten zwischen der Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des humanen TRAIL und der Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne anderer Proteine dieser Familie ist wie folgt: 28,4 % mit Fas-Ligand, 22,4 % mit Lymphotoxin-β, 22,9 % mit TNF-α, 23,1 % mit TNF-β, 22,1 % mit CD30-Ligand und 23,4 % mit CD40-Ligand.
  • TRAIL wurde auf die Fähigkeit getestet, Rezeptoren der TNF-R-Rezeptorfamilie zu binden. Die Bindungsanalyse wurde mittels des Objektträger-Autoradiographie-Verfahrens nach Gearing et al. (EMBO J. 8:3667, 1989) durchgeführt. Die Analyse zeigte keine nachweisbare Bindung von humanem TRAIL zu humanem CD30, CD40, 4-1BB, OX40, TNF-R (p80-Form), CD27 oder LTβR (auch bekannt als TNFR-RP). Die Ergebnisse in Beispiel 5 geben an, dass humanes TRAIL humanes Fas nicht bindet.
  • Zu den TRAIL-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zählen Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, welche sich von denen in SEQ ID Nr.: 2 und 6 unterscheiden, allerdings hochhomolog dazu sind. Zu Beispielen zählen, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Homologe abgeleitet von anderen Säugetierspezies, Varianten (sowohl natürlich auftretende Varianten als auch durch rekombinante DNA-Technologie erzeugte) und TRAIL-Fragmente, welche eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten. Solche Polypeptide zeigen eine biologische Aktivität der TRAIL-Proteine der SEQ ID Nr.: 2 und 6, und weisen bevorzugt eine Aminosäuresequenz, welche zumindest zu 80 % (am bevorzugtesten zumindest zu 90 %) mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 6 identisch ist. Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind im Folgenden detaillierter beschrieben.
  • Konservierte Sequenzen im C-terminalen-Abschnitt der Proteine in der TNF-Familie sind in Smith et al. (Cell 73:1349, 1993, siehe Seite 1353 und 6); Suda et al. (Cell 75:1169, 1993, siehe 7); Smith et al. (Cell 76:959, 1994, siehe 3) und Goodwin et al. (Eur. J. Immunol. 23:2631, 1993, siehe 7 und Seite 2638–39), hierin als Referenz eingeschlossen, identifiziert. Zu den Aminosäuren im humanen TRAIL-Protein, welche konserviert sind (bei zumindest einem Großteil der TNF-Familienmitglieder) zählen diejenigen an den Positionen 124–125 (AH), 136 (L), 154 (W), 169 (L), 174 (L), 180 (G), 182 (Y), 187 (Q), 190 (F), 193 (Q) und 275–276 (FG) der SEQ ID Nr.: 2. Ein weiteres strukturelles Merkmal von TRAIL ist eine Spacer-Region zwischen dem C-Terminus der Transmembranregion und dem Abschnitt der extrazellulären Domäne, von der angenommen wird, dass sie am wichtigsten für die biologische Aktivität ist. Diese Spacer-Region, welche sich am N-Terminus der extrazellulären Domäne befindet, besteht aus den Aminosäuren 39 bis 94 der SEQ ID Nr.: 2. Analoge Spacer werden auch in anderen Familienmitgliedern, z.B. dem CD40-Liganden gefunden. Die Aminosäuren 138 bis 153 entsprechen einer Schleife zwischen den β-Blättern des gefalteten (dreidimensionalen) humanen TRAIL-Proteins.
  • Ebenfalls hierin bereitgestellt sind membrangebundene TRAIL-Proteine (welche eine cytoplasmatische Domäne, eine Transmembranregion und eine extrazelluläre Domäne aufweisen), sowie TRAIL-Fragmente, welche die gewünschte biologische Eigenschaft, wie hierin beschrieben, des kompletten TRAIL-Proteins beibehalten. In einer Ausführungsform sind TRAIL-Fragmente lösliche TRAIL-Polypeptide, welche die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne aufweisen, denen jedoch die smembranregion fehlt, durch welche das Polypeptid auf einer Zellmembran verbleiben würde. Lösliche TRAIL-Proteine können von den Zellen, in denen sie exprimiert werden, sekretiert werden. Vorteilhaft ist das Fusionieren eines heterologen Signalpeptids an dem N-Terminus, so dass das lösliche TRAIL bei der Expression sekretiert wird.
  • Der lösliche TRAIL kann identifiziert (und von seinen nichtlöslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden) werden, indem intakte Zellen, welche das gewünschte Protein exprimieren, vom Kulturmedium getrennt werden, z.B. durch Zentrifugation, und das Medium (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Proteins untersucht wird. Die Gegenwart von TRAIL im Medium gibt an, dass das Protein von den Zellen sekretiert wurde, und es ist somit eine lösliche Form des TRAIL-Proteins. Natürlich vorkommende lösliche Formen des TRAIL sind in der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen.
  • Die Verwendung löslicher Formen von TRAIL ist für bestimmte Anwendungen von Vorteil. Die Reinigung der Proteine aus rekombinanten Wirtszellen wird vereinfacht, da die löslichen Proteine von den Zellen sekretiert werden. Ferner sind lösliche Proteine im Allgemeinen für die intravenöse Verabreichung besser geeignet.
  • Beispiele für lösliche TRAIL-Polypeptide sind diejenigen, welche die komplette extrazelluläre Domäne aufweisen (z.B. Aminosäuren 39 bis 281 der SEQ ID Nr.: 2 oder Aminosäuren 39 bis 291 der SEQ ID Nr.: 6). Fragmente der extrazellulären Domäne, welche eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten, werden ebenfalls bereitgestellt. Solche Fragmente enthalten vorteilhafterweise Regionen des TRAIL, welche in Proteinen der TNF-Ligandenfamilie konserviert sind, wie zuvor beschrieben ist.
  • Zusätzliche Beispiele von löslichen TRAIL-Polypeptiden sind diejenigen, welchen nicht nur die cytoplasmatische Domäne und die Transmembranregion fehlt, sondern auch die gesamte oder ein Teil der zuvor beschriebenen Spacer-Region. Zu löslichen humanen TRAIL-Polypeptiden zählen somit, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polypeptide, welche die Aminosäuren x bis 281 aufweisen, wobei x für eine beliebige der Aminosäuren an den Positionen 39 bis 95 der SEQ ID Nr.: 2 steht. In der Ausführungsform, in welcher der Rest 95 die N-terminale-Aminosäure ist, wurde die gesamte Spacer-Region gelöscht.
  • TRAIL-Fragmente, einschließlich löslicher Polypeptide können durch ein beliebiges einer Reihe herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Eine DNA-Sequenz, welche ein gewünschtes TRAIL-Fragment kodiert, kann zum Erzeugen des TRAIL-Fragmentes in einen Expressionsvektor subkloniert werden. Die TRAIL-kodierende DNA-Sequenz wird vorteilhafterweise mit einer Sequenz fusioniert, welche ein geeignetes Leit- oder Signalpeptid kodiert. Das gewünschte TRAIL-kodierende DNA-Fragment kann mittels bekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können außerdem durch Restriktionsendonukleaseverdauung einer kompletten geklonten DNA-Sequenz hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert werden. Falls nötig, können Oligonukleotide, welche den 5'- oder 3'-Terminus an einem gewünschten Punkt rekonstruieren, an ein DNA-Fragment ligiert werden, welches durch Restriktionsenzymverdauung erzeugt wurde. Solche Oligonukleotide können außerdem eine Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle stromaufwärts der gewünschten kodierenden Sequenz aufweisen, und sie positionieren ein Initiierungscodon (ATG) am N-Terminus der kodierenden Sequenz.
  • Auch das gut bekannte Polymerasekettenreaktions- (PCR) Verfahren kann eingesetzt werden, um eine DNA-Sequenz zu isolieren und zu amplifizieren, welche ein gewünschtes Proteinfragment kodiert. Oligonukleotide, welche die gewünschten Termini des DNA-Fragmentes definieren, werden als 5'- und 3'- Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können außerdem Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen beinhalten, um die Insertion des amplifizierten DNA-Fragmentes in einen Expressionsvektor zu vereinfachen. PCR-Techniken sind in Saiki et al., Science 239:487, 1988; Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Eds. Academic Press, Inc., San Diego (1989), S. 189–196; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press, Inc. (1990) beschrieben.
  • Der Fachmann dürfte verstehen, dass die Transmembranregion jedes zuvor diskutierten TRAIL-Proteins in Übereinstimmung mit konventionellen Kriterien zur Identifikation dieser Art von hydrophoben Domäne identifiziert wird. Die exakten Grenzen einer Transmembranregion können von den zuvor präsentierten leicht variieren (sehr wahrscheinlich um nicht mehr als fünf Aminosäuren an jedem Ende). Computerprogramme zur Identifikation solcher hydrophober Regionen in Proteinen stehen zur Verfügung.
  • Die TRAIL-DNA der vorliegenden Erfindung beinhaltet cDNA, chemisch synthetisierte DNA, DNA isoliert durch PCR, genomische-DNA sowie Kombinationen davon. Genomische-TRAIL-DNA kann durch Hybridisierung mit Hilfe von Standardverfahren zur hierin offenbarten TRAIL-cDNA isoliert werden. Aus der TRAIL-DNA transkribierte RNA wird auch durch die vorliegende Erfindung miteingeschlossen.
  • Eine Durchsuchung der NCBI-Datenbank identifizierte fünf exprimierte Sequenztags (ESTs), welche identische Regionen mit der TRAIL-DNA aufwiesen. Diese ESTs (NCBI-Zugangsnummer T90422, T82085, T10524, R31020 und Z36726) sind alle humane cDNA-Fragmente. Die NCBI-Aufzeichnungen offenbaren keine Polypeptide, welche durch die ESTs kodiert sind, und sie geben nicht an, welches, falls überhaupt vorhanden, der Leserahmen sein könnte. Selbst wenn die Kenntnis des hierin durch Offenbarung kompletter TRAIL-kodierender Regionen gezeigten Leserahmen verwendet wird, um die ESTs zu exprimieren, hätte jedoch keines der kodierten Polypeptide die Apoptose-induzierende Eigenschaft der hier beanspruchten TRAIL-Polypeptide. Mit anderen Worten, wenn jeder der fünf ESTs in Expressionsvektoren stromabwärts eines Initiator-Methionincodons eingefügt werden würde, und zwar in den hierin dargelegten Leserahmen, dann würde keines der resultierenden exprimierten Polypeptide einen ausreichenden Anteil der extrazellulären Domäne des TRAIL aufweisen, um die Apoptose von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  • Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bieten isolierte DNA, welche eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den: Nukleotiden 88 bis 933 der SEQ ID Nr.: 1 (humane TRAIL-kodierende Region); Nukleotiden 202 bis 933 der SEQ ID Nr.: 1 (welche die extrazelluläre Domäne des humanen TRAIL kodieren); Nukleotiden 47 bis 922 der SEQ ID Nr.: 5 (Maus-TRAIL-kodierende Region) und den Nukleotiden 261 bis 922 der SEQ ID Nr.: 5 (welche die extrazelluläre Domäne des Maus-TRAIL kodieren) aufweist. DNAs, welche biologisch aktive Fragmente der Proteine der SEQ ID Nr.: 2 und 6 kodieren, werden auch bereitgestellt. Zu weiteren Ausführungsformen zählen Sequenzen, welche die Nukleotide 370 bis 930 der SEQ ID Nr.: 1 und die Nukleotide 341 bis 919 der SEQ ID Nr.: 5 aufweisen, welche die bestimmten löslichen humanen bzw. murinen TRAIL-Polypeptide, beschrieben in Beispiel 7, kodieren.
  • Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes können sich zwei DNA-Sequenzen unterscheiden, jedoch können sie die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Die vorliegende Erfindung bietet somit isolierte DNA-Sequenzen, welche biologisch aktives TRAIL kodieren, ausgewählt aus DNA, welche die kodierende Region einer nativen humanen oder murinen TRAIL-cDNA oder Fragmente davon aufweist, sowie DNA, welche als ein Resultat des genetischen Codes zur nativen TRAIL-DNA-Sequenz degeneriert ist.
  • Außerdem hierin bereitgestellt sind gereinigte TRAIL-Polypeptide, sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinante. Varianten und Derivate nativer TRAIL-Proteine, welche eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten, liegen auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform ist die biologische Aktivität einer TRAIL-Variante im Wesentlichen äquivalent zur biologischen Aktivität eines nativen TRAIL-Proteins. Eine gewünschte biologische Aktivität von TRAIL ist die Fähigkeit, den Tod von Jurkat-Zellen zu induzieren. Untersuchungsverfahren zur Erkennung der Apoptose von Zielzellen sind gut bekannt. DNA-Laddering gehört zu den Eigenschaften des Zelltodes durch Apoptose und ist als eines der beobachtbaren Phänomene anerkannt, welche apoptotischen Zelltod von nekrotischem Zelltod unterscheiden. Beispiele für Untersuchungsverfahren die für die Erkennung von Tod oder Apoptose von Targetzellen geeignet sind, sind jene die in Beispiel 5 und 8 bis 11 beschrieben sind. Eine weitere Eigenschaft von TRAIL ist die Fähigkeit, sich an Jurkat-Zellen zu binden.
  • TRAIL-Varianten erhält man zum Beispiel durch Mutationen nativer TRAIL-Nukleotidsequenzen. Eine TRAIL-Variante, wie hierin verwendet wird, ist ein Polypeptid, welches im Wesentlichen homolog zu einem nativen TRAIL ist, welche sich jedoch aufgrund einer oder einer Vielzahl von Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Aminosäuresequenz von dem nativen TRAIL unterscheidet. TRAIL-kodierende DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung schließen Sequenzen ein, welche im Vergleich zu einer nativen TRAIL-DNA-Sequenz eine oder mehrere Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Nukleotiden aufweisen, welche jedoch ein TRAIL-Protein kodieren, welches im Wesentlichen biologisch äquivalent zu einem nativen TRAIL-Protein ist.
  • Die Variantenaminosäure- oder -DNA-Sequenz ist zumindest zu 80 % identisch mit einer nativen TRAIL-Sequenz, am bevorzugtesten zumindest 90 % identisch. Der Grad der Homologie (prozentuale Identität) zwischen einer nativen und einer Mutanten-Sequenz kann zum Beispiel durch Vergleich der beiden Sequenzen mit Hilfe von Computerprogrammen bestimmt werden, welche üblicherweise zu diesem Zweck eingesetzt werden. Ein geeignetes Programm ist das GAP-Computerprogramm, Version 6.0, beschrieben von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984), welches von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist. Das GAP-Programm verwendet die Anordnungs-Methode von Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), überarbeitet von Smith and Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Kurzgesagt, das GAP-Programm definiert die Identität als die Anzahl ausgerichteten Symbole (d.h. Nukleotide oder Aminosäuren), welche identisch sind, geteilt durch die Gesamtanzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Zu den bevorzugten Standardparametern für das GAP-Programm zählen: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (welche einen Wert von 1 für Identität und 0 für Nichtidentität aufweist) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz and Dayhoff, Eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, 1979 beschrieben wird; (2) einen Abzug von 3,0 für jede Lücke und einen weiteren Abzug von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keinen Abzug für Endlücken.
  • Änderungen der nativen Aminosäuresequenz können durch ein beliebiges einer ganzen Reihe bekannter Verfahren erreicht werden. Mutationen können an bestimmten Stellen (Loci) eingefügt werden, indem Oligonukleotide synthetisiert werden, welche eine Mutantensequenz aufweisen, flankiert von Restriktionsstellen, welche eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analogon mit der gewünschten Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion.
  • Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese-Verfahren eingesetzt werden, um eine verändertes Gen bereitzustellen, bei welchen bestimmte Codons gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Zu Verfahren zum Erzeugen solcher Veränderungen zählen die von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) und US-Patentschrift Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbarten, welche als Referenz hierin eingeschlossen sind.
  • Varianten können konservativ substituierte Sequenzen aufweisen, was bedeutet, dass ein oder mehrere Aminosäurereste eines nativen TRAIL-Polypeptides durch unterschiedliche Reste ersetzt werden, dass jedoch das konservativ substituierte TRAIL-Polypeptid eine gewünschte biologische Aktivität beibehält, welche im Wesentlichen äquivalent zu der eines nativen TRAIL-Polypeptides ist. Zu Beispielen konservativer Substitutionen zählt die Substitution von Aminosäuren, welche die sekundäre und/oder tertiäre Struktur des TRAIL nicht verändern. Zu weiteren Beispielen zählt die Substitution von Aminosäuren außerhalb der Rezeptorbindungsdomäne, wenn die gewünschte biologische Aktivität die Fähigkeit ist, sich an einen Rezeptor auf Zielzellen zu binden und die Apoptose der Zielzellen zu induzieren. Eine bestimmte Aminosäure kann durch einen Rest ersetzt werden, welcher ähnliche physiochemische Eigenschaften aufweist, z.B. die Substitution eines aliphatischen Restes mit einem anderen (wie Ile, Val, Leu oder Ala untereinander) oder die Substitution eines polaren Restes mit einem anderen (wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn). Weitere solcher konservativer Substitutionen, z.B. Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften, sind gut bekannt. TRAIL-Polypeptide, welche konservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen können mit einer der hierin beschriebenen Untersuchungen getestet werden, um zu bestätigen, dass eine gewünschte biologische Aktivität eines nativen TRAIL beibehalten wird. TRAIL-Polypeptide kodierende DNA-Sequenzen, welche solche konservativen Aminosäuresubstitutionen enthalten, sind durch die vorliegende Erfindung mit eingeschlossen.
  • Konservierte Aminosäuren im C-terminalen Abschnitt von Proteinen in der TNF-Familie, von denen man annimmt, dass sie wichtig für die biologische Aktivität sind, wurden identifiziert. Diese konservierten Sequenzen werden in Smith et al. (Cell 73:1349, 1993, siehe Seite 1353 und 6); Suda et al. (Cell 75:1169, 1993, siehe 7); Smith et al. (Cell 76:959, 1994, siehe 3); und Goodwin et al. (Eur. J. Immunol. 23:2631, 1993, siehe 7 und Seite 2638–39) diskutiert. Vorteilhafterweise werden die konservierten Aminosäuren nicht verändert, wenn konservativ substituierte Sequenzen erzeugt werden. Bei Veränderung werden Aminosäuren, welche sich an äquivalenten Positionen in anderen Mitgliedern der TNF-Familie befinden, substituiert.
  • Der TRAIL kann auch modifiziert werden, um TRAIL-Derivate zu erzeugen, indem kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Resten, wie z.B. Glycosylgruppen, Lipide, Phosphate, Acetylgruppen und degleichen gebildet werden. Kovalente Derivate von TRAIL können hergestellt werden, indem die chemischen Reste mit funktionellen Gruppen an TRAIL-Aminosäure-Seitenketten oder mit dem N-Terminus- oder C-Terminus eines TRAIL-Polypeptides oder der extrazellulären Domäne davon verbunden werden. Zu weiteren Derivaten von TRAIL innerhalb des Umfangs dieser Erfindung zählen kovalente oder aggregative Konjugate von TRAIL oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie durch die Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale- oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leit-Polypeptidsequenz (z.B. die α-Faktor-Leitsequenz von Saccharomyces) am N-Terminus eines TRAIL-Polypeptides aufweisen. Das Signal- oder Leit-Peptid steuert den Transfer des Konjugates co-translational oder post-translational von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand.
  • TRAIL-Polypeptidfusionen können Peptide aufweisen, welche hinzugefügt wurden, um die Reinigung und Identifikation des TRAIL zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen, zum Beispiel, Poly-His oder die Antigenidentifikationspeptide, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio Technology 6:1204, 1988 beschrieben sind. Ein solches Peptid ist das FLAG®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID Nr.: 7), welches hochantigen ist und ein Epitop bereitstellt, welches reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden ist, wodurch eine schnelle Untersuchung und leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins möglich ist. Diese Sequenz wird außerdem spezifisch durch Rinderschleimhautenterokinase an den Resten, welche unmittelbar auf die Asp-Lys-Paarung folgen, gespaltet. Mit diesem Peptid versehene Fusionsproteine können auch gegen die intrazelluläre Degradation in E. coli resistent sein.
  • Ein murines Hybridom mit der Bezeichnung 4E11 erzeugt einen monoklonalen Antikörper, welcher das Peptid DYKDDDDK (SEQ ID Nr.: 7) in Gegenwart bestimmter zweiwertiger Metallkationen bindet (wie in US-Patentschrift Nr. 5,011,912 beschrieben), und wurde bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer HB 9259 hinterlegt. Expressionssysteme geeignet zum Herstellen rekombinanter Proteine, die mit dem FLAG®-Peptid fusioniert sind, sowie monoklonale Antikörper, welche das Peptid binden und für die Reinigung der rekombinanten Proteine nützlich sind, sind von der Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut erhältlich.
  • Die vorliegende Erfindung weist ferner TRAIL-Polypeptide mit oder ohne assoziierte Nativmuster-Glykosylierung auf. TRAIL exprimiert in Hefe- oder Säugetierexpressionssystemen kann einem nativen TRAIL-Polypeptid in Molekulargewicht und Glykosylierungsmuster ähnlich sein oder sich signifikant davon unterscheiden, abhängig von der Wahl des Expressionssystems. Die Expression von TRAIL-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen wie E. coli liefert nicht-glykosylierte Moleküle.
  • Gylkosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne des TRAIL können so modifiziert werden, dass sie die Glykosylierung ausschließen, während die Expression eines homogenen, Kohlenhydratreduzierten Analogons mit Hilfe von Hefe- oder Säugetierexpressionssystemen zugelassen wird. N-Glykosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch ein Aminosäuretriplett Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Pro ist, und Y ist Ser oder Thr. Angemessene Modifikationen der dieses Triplett kodierenden Nukleotidsequenz resultieren in Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche die Anlagerung von Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette verhindern. Zu bekannten Verfahren zum Deaktivieren von N-Glykosylierungsstellen in Proteinen zählen die in US-Patentschrift Nr. 5,071,972 und EP 276,846 beschriebenen. Eine potentielle N-Glykosylierungsstelle befindet sich an Position 109–111 im humanen Protein der SEQ ID Nr.: 2 und an Position 52–54 im murinen Protein der SEQ ID Nr.: 6.
  • In einem weiteren Beispiel können Sequenzen, welche Cys-Reste kodieren, welche für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, verändert werden, um zu veranlassen, dass die Cys-Reste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, was die Bildung inkorrekter intramolekularer Disulfidbrücken bei der Renaturierung verhindert. Weitere Varianten werden durch Modifikation benachbarter zweibasischer Aminosäurereste hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu erhöhen, in welchen KEX2-Proteaseaktivität vorliegt. EP 212,914 offenbart die Verwendung ortsspezifischer Mutagenese zum Deaktivieren KEX2-Protease-verarbeitender Stellen in einem Protein. KEX2-Protease- verarbeitende Stellen werden durch Deletion, Addition oder Substitution von Resten zur Veränderung von Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg-Paaren zum Eliminieren des Auftretens dieser benachbarten basischen Reste deaktiviert. Lys-Lys-Paarungen sind erheblich weniger anfällig gegen KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz zum Deaktivieren von KEX2-Stellen dar. Potentielle KEX2-Protease-verarbeitende Stellen finden sich an Position 89–90 und 149–150 im Protein der SEQ ID Nr.: 2, sowie an Position 85–86, 135–136 und 162–163 im Protein der SEQ ID Nr.: 6.
  • Natürlich vorkommende TRAIL-Varianten sind auch durch die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Beispiele solcher Varianten sind Proteine, welche aus alternativen mRNA-Spleiß-Ereignissen resultieren (da TRAIL durch ein Multi-Exon-Gen kodiert wird), oder aus proteolytischer Spaltung des TRAIL-Proteins, wobei eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten wird. Alternatives Splicing von mRNA kann zu einem verkürzten, aber biologisch aktiven TRAIL-Protein führen, wie zum Beispiel einer natürlich vorkommenden löslichen Form des Proteins.
  • Zu Variationen, welche der Proteolyse zugeschrieben werden können, zählen zum Beispiel Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen aufgrund der proteolytischen Entfernung einer oder mehrerer terminalen Aminosäuren vom TRAIL-Protein. Zusätzlich kann die proteolytische Spaltung eine lösliche Form des TRAIL aus einer membrangebundenen Form des Proteins freisetzen. Allelische Varianten sind auch in die vorliegende Erfindung miteingeschlossen.
  • Oligomere
  • Die vorliegende Erfindung umschließt TRAIL-Polypeptide in der Form von Oligomeren wie Dimere, Trimere oder höhere Oligomere. Oligomere können durch Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten an unterschiedlichen TRAIL-Polypeptiden gebildet werden, oder zum Beispiel durch nichtkovalente Interaktionen zwischen TRAIL-Polypeptidketten. In anderen Ausführungsformen weisen die Oligomere zwischen zwei und vier TRAIL-Polypeptide verbunden über kovalente oder nichtkovalente Interaktionen zwischen Peptidresten, die mit den TRAIL-Polypeptiden fusioniert sind, auf. Solche Peptide können Peptidlinker (Spacer) sein, oder Peptide, welche die Eigenschaft besitzen, die Oligomerisation zu fördern. Leucin-Zipper und bestimmte Polypeptide, die von Antikörpern abgeleitet sind, gehören zu den Peptiden, welche die Oligomerisation daran angehefteter TRAIL-Polypeptide fördern können, wie unten detaillierter beschrieben wird. Die TRAIL-Polypeptide sind bevorzugt löslich.
  • Die Herstellung von Fusionsproteinen, welche heterologe Polypeptide, die mit verschiedenen Abschnitten von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind aufweisen, wurde bereits beschrieben, z.B. durch Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:667, 1990); und Hollenbaugh and Aruffo („Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Supplement 4, Seite 10.19.1–10.19.11, 1992), hierin als Referenz eingeschlossen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein TRAIL-Dimer erzeugt, indem TRAIL mit einem Fc-Region-Polypeptid, das von einem Antikörper abgeleitet ist, fusioniert wird. Der Begriff „Fc-Polypeptid" schließt native und Mutein-Formen sowie verkürzte Fc-Polypeptide, welche die Hinge-Region enthalten, welche die Dimerisation fördert, ein. Das Fc-Polypeptid wird bevorzugt mit einem löslichen TRAIL fusioniert (z.B. welches nur die extrazelluläre Domäne aufweist).
  • Eine Genfusion, welche das TRAIL/Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Die TRAIL/Fc-Fusionsproteine fügen sich ganz ähnlich wie Antikörpermoleküle aneinander, woraufhin sich Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Polypeptiden bilden, was zweiwertigen TRAIL ergibt. In anderen Ausführungsformen kann TRAIL mit dem variablen Abschnitt einer schweren oder leichten Antikörperkette substituiert werden. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers erzeugt werden, dann besteht die Möglichkeit, ein TRAIL-Oligomer mit bis zu vier extrazellulären Regionen des TRAIL zu bilden.
  • Ein geeignetes Fc-Polypeptid ist das native von humanem IgG1 abgeleitetes Fc-Region-Polypeptid, welches in der PCT-Anmeldung WO 93/10151, hierin als Referenz eingeschlossen, beschrieben ist. Ein weiteres nützliches Fc-Polypeptid ist das in US-Patentschrift Nr. 5,457,035 beschriebene Fc-Mutein. Die Aminosäuresequenz des Muteins ist identisch mit derjenigen der nativen Fc-Sequenz dargestellt in WO 93/10151, außer dass Aminosäure 19 von Leu zu Ala verändert wurde, Aminosäure 20 von Leu zu Glu und Aminosäure 22 von Gly zu Ala. Dieses Mutein-Fc zeigt verringerte Affinität für Immunglobulinrezeptoren.
  • Alternativ dazu kann oligomerer TRAIL zwei oder mehr lösliche TRAIL-Polypeptide verbunden durch Peptid-Linker aufweisen. Zu Beispielen zählen die in US-Patentschrift Nr. 5,073,627 (hierin als Referenz eingeschlossen) beschriebenen Peptid-Linker. Fusionsproteine, welche multiple TRAIL-Polypeptide getrennt durch Peptid-Linker aufweisen, können mittels herkömmlicher rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.
  • Ein weiteres Verfahren zum Herstellen oligomerer TRAIL-Polypeptide beinhaltet die Verwendung eines Leucin-Zippers. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, welche die Oligomerisation des Proteins fördern, in welchem sie sich befinden. Leucin-Zipper wurden ursprünglich in mehreren DNA-Bindungsproteinen identifiziert (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) und wurden seither in verschiedenen unterschiedlichen Proteinen gefunden. Zu den bekannten Leucin-Zippern zählen natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, welche dimerisieren oder trimerisieren. Beispiele von Leucin-Zipper-Domänen geeignet für die Herstellung löslicher oligomerer TRAIL-Proteine sind die in der PCT-Anmeldung WO 94/10308, hierin als Referenz eingeschlossen, beschriebenen. Rekombinante Fusionsproteine, welche ein lösliches TRAIL-Polypeptid fusioniert mit einem Peptid aufweisen, welches in Lösung dimerisiert oder trimerisiert, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert und das entstehende lösliche oligomere TRAIL wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
  • Bestimmte Mitglieder der TNF-Proteinfamilie existieren, so glaubt man, in trimerer Form (Beutler and Huffel, Science 264:667, 1994; Banner et al., Cell 73:431, 1993). Somit kann trimerer TRAIL den Vorteil verbesserter biologischer Aktivität bieten. Bevorzugte Leucin-Zipper-Reste sind diejenigen, welche bevorzugt Trimere bilden. Ein Beispiel ist ein Leucin-Zipper abgeleitet vom Lungen-Oberflächenaktiven Protein D (SPD), wie in Hoppe et al. (FEBS Leiters 344:191, 1994) und in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/446,922, hierin als Referenz eingeschlossen, beschrieben. Andere Peptide abgeleitet von natürlich vorkommenden trimeren Proteinen können bei der Herstellung von trimerem TRAIL eingesetzt werden.
  • Wie in Beispiel 7 beschrieben, bildete ein lösliches Flag®-TRAIL-Polypeptid exprimiert in CV-1/EBNA-Zellen spontan Oligomere, von denen man annimmt, dass es sich um eine Mischung von Dimeren und Trimeren handelt. Die cytotoxische Wirkung dieses löslichen Flag®-TRAIL in der Untersuchung in Beispiel 8 wurde durch Einschluss eines Anti-Flag®-Antikörpers verstärkt, möglicherweise weil der Antikörper die Vernetzung des TRAIL/Rezeptor-Komplexes erleichtert. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die biologische Aktivität des TRAIL durch Einsatz des TRAIL in Verbindung mit einem Antikörper verbessert, welcher zur Vernetzung des TRAIL in der Lage ist. Abzutötende Zellen können sowohl mit einem löslichen TRAIL-Polypeptid als auch mit einem solchen Antikörper in Kontakt gebracht werden.
  • Als ein Beispiel werden Krebszellen oder virusinfizierte Zellen mit einem Anti-Flag®-Antikörper und einem löslichen Flag®-TRAIL-Polypeptid in Kontakt gebracht. Bevorzugt wird ein Antikörperfragment eingesetzt, welchem die Fc-Region fehlt. Bivalente Formen des Antikörpers können die Flag®-Reste von zwei löslichen Flag®-TRAIL-Polypeptiden binden, welche sich in separaten Dimeren oder Trimeren befinden. Der Antikörper kann vor der Verabreichung in vivo mit einem Flag®-TRAIL-Polypeptid gemischt oder inkubiert werden.
  • Expressionssysteme
  • Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren zur Expression von TRAIL und Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert sind, bereit. Jedes geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden. Die Vektoren beinhalten eine DNA, welche ein TRAIL-Polypeptid kodiert, welche funktionsfähig mit geeigneten transkriptorische oder translatorische Regulationsnukleotidsequenzen, wie die von einem Säugetier-, Mikroben-, Viren- oder Insektengen abgeleiteten verbunden sind. Zu Beispielen von Regulationssequenzen zählen transkriptorische Promotoren, Operatoren oder Enhancer, eine mRNA-Ribosomenbindungsstelle und geeignete Sequenzen, welche die Transkriptions- und Translationsinitiierung und -terminierung steuern. Nukleotidsequenzen sind funktionsfähig verbunden, wenn die Regulationssequenz funktionell mit der TRAIL-DNA-Sequenz in Verbindung steht. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz funktionsfähig mit einer TRAIL-DNA-Sequenz verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der TRAIL-DNA-Sequenz steuert. Ein Replikationsursprung, welcher die Fähigkeit verleiht, in den gewünschten Wirtszellen zu replizieren, und ein Selektionsgen, anhand von welchem Transformanten identifiziert werden, werden im Allgemeinen in den Expressionsvektor eingebaut.
  • Zusätzlich kann eine Sequenz, welche ein entsprechendes Signalpeptid kodiert, in Expressionsvektoren eingebaut werden. Eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (Sekretions-Leader) kann im Rahmen mit der TRAIL-Sequenz fusioniert werden, so dass das TRAIL anfänglich als ein Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid aufweist. Ein Signalpeptid, welches in der beabsichtigten Wirtszelle funktioniell ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des TRAIL-Polypeptides. Das Signalpeptid wird bei der Sekretion des TRAIL durch die Zelle vom TRAIL-Polypeptid abgespalten.
  • Zu geeigneten Wirtszellen zur Expression von TRAIL-Polypeptiden zählen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Klon- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugetier-Zellwirten sind zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laborafory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Es können auch zellfreie Translationssysteme eingesetzt werden, um TRAIL-Polypeptide mit Hilfe von RNAs die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, zu erzeugen.
  • Zu Prokaryoten zählen gramnegative oder grampositive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen für die Transformation zählen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium sowie verschiedene weitere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie z.B. E. coli kann ein TRAIL-Polypeptid einen N-terminalen-Methioninrest beinhalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptides in der prokaryotischen Wirtszelle zu fördern. Das N-terminale-Met kann vom exprimierten rekombinanten TRAIL-Polypeptid abgespaltet werden.
  • Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Markergene auf. Ein phänotypisch selektierbares Markergen ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein kodiert, welches antibiotische Resistenz verleiht oder welches eine autotrophe Anforderung liefert. Zu Beispielen geeigneter Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen zählen diejenigen, welche von handelsüblichen Plasmiden abgeleitet sind, wie der Kloniervektor pBR322 (ATCC 37017). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet somit einfache Mittel zur Identifikation transformierter Zellen. Ein geeigneter Promotor und eine TRAIL-DNA-Sequenz werden in den pBR322-Vektor eingefügt. Zu weiteren handelsüblichen Vektoren zählen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
  • Zu üblicherweise für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendete Promotorsequenzen zählen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EP-A-36776) und tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellenexpressionssystem verwendet einen λ-Phagen-PL-Promotor und eine thermolabile cl857ts-Repressorsequenz. Zu Plasmidvektoren, welche von der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des λ-PL-Promotors einschließen, zählen das Plasmid pHUB2 (auftretend im E. coli-Stamm JMB9, ATCC 37092) und pPLc28 (auftretend in E. coli RR1, ATCC 53082).
  • TRAIL kann alternativ in Hefewirtszellen exprimiert werden, bevorzugt aus der Saccharomyces-Gattung (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können auch eingesetzt werden. Hefevektoren enthalten häufig eine Replikationsursprungssequenz aus einem 2μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen zur Polyadenylierung, Sequenzen zur Transkriptionsterminierung und ein selektierbares Markergen. Zu geeigneten Promotorsequenzen für Hefevektoren zählen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Weitere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind ferner in Hitzeman, EP-A-73,657 beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beer et al. (Nature 300:724, 1982) beschrieben wurde. Sowohl in Hefe als auch E. coli replizierbare Shuttle-Vektoren können hergestellt werden, indem DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) in die zuvor beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
  • Die Hefe-α-Faktor-Leitsequenz kann eingesetzt werden, um die Sekretion des TRAIL-Polypeptides zu steuern. Die α-Faktor-Leitsequenz wird häufig zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Weitere Leitsequenzen, welche zur Förderung der Sekretion rekombinanter Polypeptide aus Hefewirten geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. Eine Leitsequenz kann nahe ihrem 3'-Ende modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies erleichtert die Fusion der Leadersequenz mit dem Strukturgen.
  • Hefetransformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Protokoll aus Hinnen et al. selektiert für Trp+ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67 % Hefe-Stickstoff-Basis, 0,5 % Casaminosäuren, 2 % Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
  • Hefewirtszellen transformiert durch Vektoren, welche eine ADH2-Promotorsequenz aufweisen, können zum Induzieren der Expression in einem „reichen" Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist eines bestehend aus 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 1 % Glucose ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil. Die Derepression des ADH2-Promotors findet statt, wenn die Glucose aus dem Medium aufgebraucht ist.
  • Säugetier- oder Insekten-Wirtszellen-Kultursysteme können auch eingesetzt werden, um rekombinante TRAIL-Polypeptide zu exprimieren. Bacculovirussysteme zur Herstellung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) untersucht. Etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung können auch eingesetzt werden. Zu Beispielen geeigneter Säugetierwirtszelllinien zählen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10) -Zelllinien, sowie die CVI/EBNA-Zelllinie abgeleitet von der Nieren-Zelllinie des Afrikanischen Grünen Affen CVI (ATCC CCL 70) wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben.
  • skriptorische und translatorische Steuersequenzen für Säugetierwirtszellen-Expressionsvektoren können aus Virusgenomen herausgeschnitten werden. Üblicherweise verwendete Promotorsequenzen und Enhancersequenzen sind aus dem Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV 40) und dem humanen Cytomegalovirus abgeleitet. DNA-Sequenzen abgeleitet vom SV40-Virusgenom, zum Beispiel der SV40-Ursprung, früher und später Promotor, Enhancer, Spleiß und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression von Strukturgensequenzen in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders geeignet, da man beide leicht als ein Fragment aus einem Virengenom erhält, welches auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt die im SV40-Virenreplikationsursprung befindliche, etwa 250 bp Sequenz, welche sich von der Hind-III-Stelle in Richtung der Bgi-I-Stelle erstreckt, ist enthalten.
  • Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierwirtszellen können, wie zum Beispiel von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart, hergestellt werden. Ein geeignetes System für eine stabile Expression auf hohem Niveau von Säugetier-cDNAs in murinen C127-Brustepithelzellen kann im Wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) offenbart, hergestellt werden. Ein Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Weitere Säugetierexpressionsvektoren sind in EP-A-0367566 und in WO 91/18982 beschrieben. Als eine Alternative kann der Vektor von einem Retrovirus abgeleitet sein. Weitere geeignete Expressionssysteme sind in den Beispielen unten beschrieben.
  • Ein bevorzugtes Expressionssystem verwendet Chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO) und einen Expressionsvektor mit der Bezeichnung PG5.7. Dieser Expressionsvektor ist in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/586,509, eingereicht am 11. Januar 1996, hierin als Referenz eingefügt, beschrieben. Zu PG5.7-Komponenten zählen ein Fragment der CHO-Zellgenom-DNA, gefolgt von einem CMV-abgeleiteten Promotor, gefolgt von einer Sequenz, welche eine dreiteilige Adenovirus-Leitsequenz kodiert, wiederum gefolgt von einer Sequenz, welche Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert. Diese Komponenten wurden in den Plasmidvektor pGEM1 (Promega, Madison, WI) eingefügt. DNA, welche ein TRAIL-Polypeptid kodiert (oder ein Fusionsprotein, welches TRAIL enthält), kann zwischen die Sequenzen eingefügt werden, welche die dreiteilige Leitsequenz und DHFR kodieren. Dem Kulturmedium kann Methotrexat hinzugefügt werden, um das Expressionsniveau zu erhöhen, wie dies im Fachgebiet anerkannt ist.
  • Das Fragment der CHO-Zellgenom-DNA in Vektor PG5.7 fördert die Expression von TRAIL. Ein Phagenlysat, welches ein Fragment der genomischen-DNA isoliert aus CHO-Zellen enthält, wurde am 4. Januar 1996 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer ATCC 97411. Vektor PG5.7 enthält die Nukleotide 8671 bis 14507 der CHO-genomischen-DNA-Einschubs in Stammhinterlegung ATCC 97411.
  • Für die Expression von TRAIL können ein Typ-II-Protein, welchem eine native Signalfrequenz fehlt, eine heterologe Signalsequenz oder eine Leitsequenz funktionell in Säugetierwirtszellen hinzugefügt werden. Zu Beispielen zählen die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7) beschrieben in US-Patentschrift Nr. 4,965,195, die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor beschrieben in Cosman et al., Nature 312:768 (1984), das Interleukin-4-Rezeptor-Signalpeptid beschrieben in EP 367,566 , das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid beschrieben in US-Patentschrift Nr. 4,968,607 und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid beschrieben in EP 460,846 .
  • Ein bevorzugtes Expressionssystem verwendet eine Leitsequenz, die vom Cytomegalovirus (CMV) abgeleitet ist. Beispiel 7 illustriert die Verwendung einer solchen Leitsequenz. In Beispiel 7 wurden Säugetierwirtszellen mit einem Expressionsvektor transformiert, welcher das Peptid Met Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser (SEQ. ID NR.: 9) kodiert, das mit dem N-Terminus eines Octapeptides mit der Bezeichnung Flag® (SEQ ID Nr.: 7, zuvor beschrieben) fusioniert ist, welches wiederum mit dem N-Terminus eines löslichen TRAIL-Polypeptides fusioniert ist. Die Reste 1 bis 29 der SEQ. ID Nr.: 9 stehen für eine CMV-abgeleitete Leitsequenz, wohingegen die Reste 30 bis 32 durch Oligonukleotide kodiert werden, welche bei der Herstellung des in Beispiel 7 beschriebenen Expressionsvektors zum Einsatz kommen. In einer Ausführungsform wird DNA, welche ein Poly-His-Peptid (z.B. ein Peptid, welches sechs Histidinreste enthält) kodiert, zwischen den Sequenzen positioniert, welche die CMV-Leitsequenz und das FLAG®-Peptid kodieren.
  • Expressionssysteme, welche solche CMV-abgeleiteten Leitpeptide einsetzen, sind für die Expression anderer Proteine als TRAIL nützlich. Expressionsvektoren, welche eine DNA-Sequenz aufweisen, welche die Aminosäuren 1 bis 29 der SEQ ID Nr.: 9 kodieren, werden hierin bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform weist der Vektor eine Sequenz, welche die Aminosäuren 1 bis 28 der SEQ ID Nr.: 9 kodiert, auf. DNA, welche ein gewünschtes heterologes Protein kodiert, ist unterhalb der und im gleichen Leserahmen wie die DNA positioniert, welche die Leitsequenz kodiert. Weitere Reste (z.B. die durch Linker oder Primere kodierten) können durch DNA kodiert sein, welche zwischen den Sequenzen positioniert ist, welche den Leitsequenz und das gewünschte heterologe Protein kodieren, wie dies durch den in Beispiel 7 beschriebenen Vektor illustriert ist. Wie im Fachgebiet verständlich sein dürfte, weisen die Expressionsvektoren Promotoren und jegliche weiteren gewünschten Regulationssequenzen, welche funktionsmäßig mit den Sequenzen verbunden sind, welche die Leitsequenz und das heterologe Protein kodieren.
  • Das in SEQ ID Nr.: 9 dargestellte Leitpeptid kann nach dem Argininrest an Position 29 gespalten werden, um die reife sekretierte Form eines damit fusionierten Proteins zu erhalten. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Spaltung zwischen den Aminosäuren 20 und 21 erfolgen, oder zwischen den Aminosäuren 28 und 29 der SEQ. ID NR.: 9.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die Position(en), an der/denen das Signalpeptid gespalten wird aufgrund solcher Faktoren variieren kann, wie die Art der eingesetzten Wirtszelle, ob durch den Vektor humanes oder murines TRAIL exprimiert wird und ähnliches. Die Analyse durch ein Computerprogramm zeigt, dass die primäre Spaltstelle zwischen Rest 20 und 21 der SEQ ID Nr.: 9 liegen kann. Eine Spaltung zwischen Rest 22 und 23 und zwischen Rest 27 und 28 ist auch möglich. Zur Illustration: die Expression und Sekretion eines löslichen murinen TRAIL-Polypeptides resultierte in der Spaltung eines CMV-abgeleiteten Signalpeptides an mehreren Positionen. Die drei markantesten Spezies sekretierten Proteins resultierten aus (in abnehmender Reihenfolge) Spaltung zwischen Aminosäure 20 und 21 der SEQ ID Nr.: 9, Spaltung zwischen Aminosäure 22 und 23 und Spaltung zwischen Aminosäure 27 und 28.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins beinhaltet die Kultivierung von Säugetierwirtszellen, die mit einem solchen Expressionsvektor transformiert sind, unter Bedingungen, welche die Expression und Sekretion des heterologen Proteins fördern, sowie die Gewinnung des Proteins aus dem Kulturmedium. Expressionssysteme, welche CMV-Leitsequenzen einsetzen, können verwendet werden, um jegliches gewünschte Protein zu erzeugen; zu Beispielen davon zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Kolonie-stimulierende Faktoren, Interferone, Interleukine, andere Cytokine und Cytokinrezeptoren.
  • Gereinigtes TRAIL-Protein
  • Die vorliegende Erfindung bietet gereinigte TRAIL-Proteine, welche durch die zuvor beschriebenen rekombinanten Expressionssysteme hergestellt oder aus natürlich vorkommenden Zellen isoliert werden können. Der gewünschte Reinheitsgrad ist abhängig von der beabsichtigten Verwendung des Proteins. Ein relativ hoher Reinheitsgrad wird zum Beispiel gewünscht, wenn das Protein in vivo verabreicht werden soll. Vorteilhafterweise werden TRAIL-Polypeptide so gereinigt, dass keine Proteinbanden, welche mit anderen Proteinen übereinstimmen, durch die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) erkennbar sind. Ein Fachmann des Gebietes wird erkennen, dass durch SDS-PAGE mehrere Bänder erkannt werden können, welche mit dem TRAIL-Protein übereinstimmen, und zwar aufgrund von differentieller Glykosylierung, Variationen bei der post-translatorischen Verarbeitung und ähnlichem, wie zuvor diskutiert. Ein Präparat aus TRAIL-Protein gilt als gereinigt, solange keine Bänder visualisiert werden können, welche mit anderen (Nicht-TRAIL-) Proteinen übereinstimmen. TRAIL ist am bevorzugtesten zu wesentlicher Homogenität gereinigt, was bei der Analyse durch SDS-PAGE durch ein einzelnes Proteinband angezeigt wird. Das Proteinband kann durch Silberfärbung, Coomassie-Blaufärbung oder (falls das Protein radioaktiv markiert ist) durch Autoradiographie visualisiert werden.
  • Ein Verfahren zur Herstellung des TRAIL-Proteins weist die Kultivierung einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz aufweist, welche TRAIL kodiert transformiert ist, und zwar unter solchen Bedingungen, dass TRAIL exprimiert wird. Das TRAIL-Protein wird dann aus der Kultur gewonnen (aus dem Kulturmedium oder Zellextrakten). Der Fachmann wird erkennen, dass Verfahren zum Reinigen des rekombinanten TRAIL aufgrund solcher Faktoren variieren, wie die Art der eingesetzten Wirtszelle und ob der TRAIL in das Kulturmedium sekretiert wird oder nicht.
  • Wenn zum Beispiel Expressionssysteme, welche das rekombinante Protein sekretieren, eingesetzt werden, dann kann das Kulturmedium zuerst mittels eines handelsüblichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel eine Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrationsmedium aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit Diethylaminoethyl- (DEAE) Seitengruppen. Die Matrizen können aus Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder anderen Materialien bestehen, welche üblicherweise in der Proteinreinigung eingesetzt werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt angewandt werden. Zu geeigneten Kationenaustauschern zählen verschiedene unlösliche Matrizen, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) -Schritte angewandt werden, welche hydrophobe RP-HPLC-Medien (z.B. Silikagel mit Methyl- oder anderen aliphatischen Seitengruppen) einsetzen, um TRAIL weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorgenannten Reinigungsschritte können, in unterschiedlichen Kombinationen, eingesetzt werden, um ein gereinigtes TRAIL-Protein bereitzustellen.
  • In Bakterienkultur hergestelltes rekombinantes Protein kann durch folgende Schritte isoliert werden: anfängliche Zerstörung der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpellets, falls es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt, oder aus der Überstandsflüssigkeit, falls es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, gefolgt von einer oder mehreren Konzentrationen, Aussalzung, Ionenaustausch, Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie-Schritte. Schließlich kann RP-HPLC für die abschließenden Reinigungsschritte eingesetzt werden. Mikrobelle Zellen können durch jedes geeignete Verfahren aufgespaltet werden, einschließlich Gefrier-Tau-Zyklen, Sonication, mechanische Zerstörung oder die Verwendung von Zell-auflösenden Wirkstoffen.
  • sformierte Hefewirtszellen werden bevorzugt eingesetzt, um TRAIL als ein sekretiertes Polypeptid zu exprimieren. Dies vereinfacht die Reinigung. Sekretiertes rekombinantes Polpeptid aus einer Hefewirtszellenfermentation kann durch Verfahren gereinigt werden, welche analog zu denjenigen sind, welche durch Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) offenbart werden. Urdal et al. beschreiben zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
  • Alternativ dazu können TRAIL-Polypeptide durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt werden. Eine Affinitätssäule, welche einen Antikörper enthält, welcher TRAIL bindet, kann durch konventionelle Verfahren hergestellt und bei der Reinigung von TRAIL eingesetzt werden. Beispiel 4 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung monoklonaler, gegen TRAIL gerichteter Antikörper.
  • Eigenschaften und Verwendungen von TRAIL
  • Programmierter Zelltod (Apoptose) tritt während der Embryogenese, Metamorphose, endokrinabhängiger Gewebsatrophie, dem normalem Gewebeumsatz und dem Tod immuner Thymozyten auf. Die Regulierung des programmierten Zelltodes ist lebenswichtig für die normale Funktion des Immunsystems. Zur Illustration: T-Zellen, welche Selbstantigene erkennen, werden durch apoptotische Prozesse während der Reifung von T-Zellen im Thymus zerstört, wohingegen andere T-Zellen positiv ausgewählt werden. Die Möglichkeit, dass einige T-Zellen, welche bestimmte Selbstepitope (z.B. ineffizient verarbeitete und dargestellte Antigendeterminanten eines bestimmten Selbstproteins) erkennen, diesem Eliminierungsprozess entgehen und anschließend eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen spielen, wurde bereits in Betracht gezogen (Gammon et al., Immunology Today 12:193, 1991).
  • Unzureichende Apoptose wurde mit bestimmten Bedingungen impliziert, während erhöhte Niveaus am apoptotischen Zelltod mit anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Die wünschenswerte Identifizierung und Verwendung von Wirkstoffen, welche die Apoptose. in der Behandlung solcher Störungen reguliert, wurde bereits angesprochen (Kromer, Advances in Immunology 58:211, 1995; Groux et al., J. Exp. Med. 175:331, 1992; Sachs and Lotem, Blood 82:15, 1993).
  • Die anomale Resistenz von T-Zellen gegen das Durchlaufen der Apoptose wurde mit Lymphozytose, Lymphadenopathie, Splenomegalie, der Akkumulation von selbstreaktiven T-Zellen, Autoimmunerkrankungen, der Entwicklung von Leukämie und der Entwicklung eines Lymphoms in Verbindung gebracht (Kromer, oben; siehe besonders die Seiten 214–215). Im Gegensatz dazu nahm man an, dass eine übermäßige Apoptose von T-Zellen eine Rolle bei Lymphopenie, systemischer Immundefizienz und spezifischer Immundefizienz spielt, wobei spezifische Beispiele virusinduzierte Immundefizienzzustände in Verbindung mit infektiöser Mononukleose und Zytomegalovirusinfektion sowie Tumor-mediierte Immunsuppression wären (Kromer, oben; siehe besonders Seite 214). Die Erschöpfung von CD4+-T-Zellen in HIV-infizierten Personen kann möglicherweise dem unangemessenen aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) durch Apoptose zugeschrieben werden (Groux et al., J. Exp. Med. 175:331, 1992).
  • Wie in Beispiel 5 und 8 demonstriert, induziert TRAIL die Apoptose der akuten T-Zellen-Leukämie-Zelllinie, welche als Jurkat-Klon E6-1 bezeichnet wird. TRAIL ist daher ein Forschungsreagens geeignet für Studien der Apoptose, einschließlich der Regulierung des programmierten Zelltodes. Da Jurkat-Zellen eine Leukämiezelllinie darstellen, welche aus T-Zellen entsteht, findet der TRAIL der vorliegenden Erfindung Anwendung in Studien zur Untersuchung, welche Rolle TRAIL möglicherweise in der Apoptose anderer transformierter T-Zellen, wie andere maligne Zelltypen entstehend aus T-Zellen, spielt.
  • TRAIL bindet Jurkat-Zellen und induziert deren Apoptose. TRAIL verursachte nicht den Tod von frisch isolierten murinen Thymozyten oder T-Zellen peripheren Blutes (PBTs), die aus einem gesunden humanen Spender frisch extrahiert wurden. Eine Reihe von Verwendungen lässt sich aus diesen Eigenschaften von TRAIL ableiten.
  • TRAIL-Polypeptide können verwendet werden, um Leukämiezellen zu reinigen, oder jeden anderen Zelltyp, an den sich TRAIL bindet. Leukämiezellen können zum Beispiel aus dem Blut eines Patienten isoliert werden. In einer Ausführungsform werden die Zellen durch Affinitätschromatographie mittels einer Chromatographiematrix gereinigt, an der TRAIL gebunden ist. Das auf die Chromatographiematrix aufgebrachte TRAIL kann ein Protein mit voller Länge sein, ein TRAIL-Fragment, welches die extrazelluläre Domäne aufweist, ein TRAIL-enthaltendes Fusionsprotein oder ein anderes hierin beschriebenes geeignetes TRAIL-Polypeptid. In einer Ausführungsform ist ein lösliches TRAIL/Fc-Fusionsprotein an eine Protein-A- oder Protein-G-Säule gebunden, und zwar durch Interaktion des Fc-Restes mit dem Protein A oder Protein G. Alternativ kann TRAIL dazu verwendet werden, Leukämiezellen durch Durchflusszytometrie zu isolieren.
  • Die so gereinigten Leukämiezellen sterben erwartungsgemäß nach der Bindung des TRAIL, jedoch tragen die toten Zellen immer noch Zelloberflächen-Antigene und können als Immunogene bei der Ableitung von Anti-Leukämie-Antikörpern eingesetzt werden. Die Leukämiezellen, oder ein gewünschtes davon isoliertes Zelloberflächen-Antigen, finden weitere Verwendung in der Impfstoffentwicklung.
  • Da TRAIL Leukämiezellen (die Jurkat-Zelllinie) bindet und abtötet, könnte TRAIL außerdem für die Behandlung von Leukämie geeignet sein. Ein therapeutisches Verfahren beinhaltet das in Kontakt bringen von Leukämiezellen mit einer effektiven Menge an TRAIL. In einer Ausführungsform wird das Blut eines Leukämiepatienten ex vivo mit einem TRAIL-Polypeptid in Kontakt gebracht. Das TRAIL kann auf einer geeigneten Matrix immobilisiert werden. Der TRAIL bindet die Leukämiezellen und entfernt sie somit aus dem Blut des Patienten, bevor der Patient das Blut zurückerhält.
  • Alternativ oder zusätzlich dazu kann Knochenmark, das von einem Leukämiepatienten extrahiert wurde mit einer Menge an TRAIL in Kontakt gebracht werden, welche effektiv ist, um den Tod der Leukämiezellen im Knochenmark zu induzieren. Knochenmark kann zum Beispiel aus dem Brustbein- oder Darmbeinkamm gewonnen und mit TRAIL in Kontakt gebracht werden, um Leukämiezellen zu entfernen. Das so behandelte Mark wird dann an den Patienten zurückgegeben.
  • TRAIL bindet außerdem an, und induziert die Apoptose von Lymphom- und Melanomzellen (siehe Beispiele 5, 9 und 10). Somit sind der Gebrauch von TRAIL, welche analog zu den zuvor für Leukämiezellen beschriebenen sind, auch auf Lymphom- und Melanomzellen anwendbar. TRAIL-Polypeptide können bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Leukämie, Lymphom und Melanom. In einer Ausführungsform ist das Lymphom das Burkitt-Lymphom. Tabelle I in Beispiel 9 zeigt, dass TRAIL eine zytotoxische Wirkung auf mehrere Burkitt-Lymphom-Zelllinien hatte. Das Epstein-Barr-Virus ist ein ätiologischer Wirkstoff des Burkitt-Lymphoms.
  • TRAIL-Polypeptide finden außerdem Anwendung bei der Behandlung von viralen Infektionen. Der Kontakt mit TRAIL verursachte den Tod von Zellen, die mit dem Zytomegalievirus infiziert sind, jedoch nicht von Zellen desgleichen Typ, wenn diese nichtinfiziert waren, wie in Beispiel 11 beschrieben ist. Die Fähigkeit von TRAIL, Zellen abzutöten, welche mit anderen. Viren infiziert sind, kann mittels der in Beispiel 11 beschriebenen Untersuchung bestätigt werden. Zu solchen Viren zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, das Encephalomyocarditis-Virus, das Newcastle-Virus, das vesikuläre Stomatitis-Virus, das Herpes-Simplex-Virus, Adenovirus-2, das bovine virale Diarrhö-Virus, HIV und Epstein-Barr-Virus.
  • Eine effektive Menge an TRAIL wird einem Säugetier, einschließlich einem Menschen, verabreicht, welches/r von einer Virusinfektion betroffen ist. In einer Ausführungsform wird TRAIL in Verbindung mit Interferon eingesetzt, um eine Virusinfektion zu behandeln. In dem in Beispiel 11 beschriebenen Experiment erhöhte die Vorbehandlung von CMV-infizierten Zellen mit γ-Interferon das Abtötungsniveau der infizierten Zellen, welches durch TRAIL mediiert wurde. TRAIL kann in Verbindung mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden, welche eine zytotoxische Wirkung auf Krebszellen oder virusinfizierte Zellen haben.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird TRAIL verwendet, um virusinfizierte Zellen in Zellpräparaten, Geweben oder Organen abzutöten, welche transplantiert werden sollen. Zur Illustration: Knochenmark kann mit TRAIL in Kontakt gebracht werden, um virusinfizierte Zellen abzutöten, welche darin vorkommen können, bevor das Knochenmark in einen Empfänger transplantiert wird.
  • Das TRAIL der vorliegenden Erfindung kann bei der Entwicklung von Behandlungen für jede Störung verwendet werden, welche (direkt oder indirekt) durch mangelhafte oder unzureichende Mengen an TRAIL mediiert werden. Eine therapeutisch wirksame Menge an gereinigtem TRAIL-Protein wird einem Patienten mit einer solchen Störung verabreicht. Alternativ dazu können TRAIL-DNA-Sequenzen bei der Entwicklung eines Gentherapieansatzes zur Behandlung solcher Störungen eingesetzt werden. Die Offenbarung nativer TRAIL-Nukleotidsequenzen hierin ermöglicht die Erkennung defekter TRAIL-Gene und deren Austausch mit normalen TRAIL-kodierenden Genen. Defekte Gene können bei diagnostischen in vitro Untersuchungen erkannt werden, und durch Vergleich der hierin offenbarten nativen TRAIL-Nukleotidsequenz mit der eines TRAIL-Gens abgeleitet von einer Person, von der angenommen wird, dass sie einen Defekt in diesem Gen trägt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche gereinigtes TRAIL und ein physiologisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipient aufweist. Geeignete Träger, Verdünnungsmittel und Excipienten sind bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch für den Empfänger. Solche Zusammensetzungen können Puffer, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate einschließlich Glukose, Saccharose oder Dextrine, Chelatbildner wie EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Excipienten aufweisen, welche in pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise zum Einsatz kommen. Neutrale gepufferte Salzlösung oder Salzlösung gemischt mit konspezifischem Serumalbumin zählen zu geeigneten Verdünnungsmitteln. Die Zusammensetzung kann als ein Lyophilisat formuliert sein, welches geeignete Excipientlösungen (z.B. Saccharose) als Verdünnungsmittel verwendet.
  • Zur therapeutischen Verwendung werden einem Patienten, bevorzugt einem Menschen, gereinigte Proteine der vorliegenden Erfindung verabreicht, zur Behandlung in einer der Indikation entsprechenden Art und Weise. So kann die pharmazeutische Zusammensetzung zum Beispiel lokal verabreicht werden, durch intravenöse Injektion, kontinuierliche Infusion, nachhaltige Freisetzung aus Implantaten oder andere geeignete Techniken. Angemessene Dosierungen und die Häufigkeit der Verabreichung sind natürlich abhängig von solchen Faktoren wie der Art und Schwere der zu behandelnden Indikation, der gewünschten Reaktion, dem Zustand des Patienten usw.
  • Das in den pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzte TRAIL-Protein ist bevorzugt gereinigt, so dass das TRAIL-Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen natürlichen oder endogenen Ursprungs ist und wünschenswerterweise weniger als 1 Gew % Proteinkontaminanten enthält, welche durch die Produktionsprozesse zurückblieben. Solche Zusammensetzungen können jedoch andere Proteine enthalten, welche als Stabilisatoren, Träger, Excipienten oder Co-Therapeutika hinzugefügt wurden.
  • Die hierin offenbarten TRAIL-kodierenden DNAs finden Anwendung bei der Herstellung von TRAIL-Polypeptiden, wie zuvor diskutiert. Fragmente der TRAIL-Nukleotidsequenzen sind auch nützlich. In einer Ausführungsform weisen solche Fragmente zumindest etwa 17 aufeinanderfolgende Nukleotide, bevorzugter zumindest 30 aufeinanderfolgende Nukleotide der hierin offenbarten humanen oder murinen TRAIL-DNA auf. DNA- und RNA-Komplemente der Fragmente werden hierin bereitgestellt, zusammen mit sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrangformen der TRAIL-DNA der SEQ ID Nr.: 1, 3 und 5.
  • Zu den Verwendungen solcher TRAIL-Nukleinsäurefragmente zählen die Verwendung als eine Sonde oder als Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR). Als ein Beispiel kann eine Sonde, welche der extrazellulären Domäne des TRAIL entspricht, eingesetzt werden. Die Sonden finden Anwendung bei der Erkennung der Gegenwart von TRAIL-Nukleinsäuren bei in vitro Untersuchungen und bei solchen Verfahren wie Northern- und Southern-Blots. Zelltypen, welche TRAIL exprimieren, können ebenfalls identifiziert werden. Solche Verfahren sind gut bekannt, und der Fachmann kann eine Sonde geeigneter Länge, abhängig von der jeweils beabsichtigten Anwendung auswählen. Für die PCR werden 5'- und 3'-Primer entsprechend der Termini einer gewünschten TRAIL-DNA-Sequenz eingesetzt, um diese Sequenz mittels konventioneller Verfahren zu isolieren und zu amplifizieren.
  • Weitere nützliche Fragmente der TRAIL-Nukleinsäuren sind Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide, welche eine Einzelstrangnukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, welche in der Lage sind, sich an die Ziel-TRAIL-mRNA (Sinn) oder TRAIL-DNA (Gegensinn) -Sequenzen zu binden. Ein solches Fragment weist im Allgemeinen mindestens etwa 14 Nukleotide, bevorzugt von etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide auf. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz für ein gegebenes Protein zu erzeugen, ist zum Beispiel in Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 und von der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988 beschrieben.
  • Die Bindung von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen resultiert in der Bildung von Duplexen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln, einschließlich des verstärkten Abbaus der Duplexe, vorzeitige Termination von Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel, blockieren. Die Gegensinn-Oligonukleotide können daher verwendet werden, um die Expression von TRAIL-Proteinen zu blockieren.
  • Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder anderen Zuckerverbindungen, wie die in WO 91/06629 beschriebenen) auf, wobei solche Zuckerverbindungen resistent gegenüber endogenen Nukleasen sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d.h. in der Lage, enzymatischem Abbau zu widerstehen), behalten aber die Sequenzspezifität bei, um in der Lage zu sein, sich an Ziel-Nukleotidsequenzen zu binden. Zu weiteren Beispielen von Sinn- und Gegensinn-Oligonukleotiden zählen die Oligonukleotide, welche kovalent mit organischen Resten, wie die in WO 90/10448 beschriebenen, und mit anderen Resten, welche die Affinität des Oligonukleotides für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz wie z.B. Poly-(L-Lysin) erhöhen, verbunden sind. Ferner können interkalierende Wirkstoffe wie Ellipticin und Alkylanzien oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angelagert sein, um die Bindungsspezifitäten der Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide für die Ziel-Nukleotidsequenz zu modifizieren.
  • Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle eingefügt werden, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, und zwar durch jedes Gentransferverfahren, einschließlich, zum Beispiel, CaPO4-mediierte DNA-sfektion, Elektroporation oder anderer Gentransfervektoren wie z.B. dem Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden bevorzugt in eine Zelle eingefügt, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, indem das Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt und dann die Zelle entweder in vivo oder ex vivo mit dem die eingefügte Sequenz enthaltenden Retrovirusvektor in Kontakt gebracht wird. Zu geeigneten retroviralen Vektoren zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der murine Retrovirus M-MuLV, N2 (ein Retrovirus abgeleitet von M-MuLV) oder die Doppel-Kopie-Vektoren mit der Bezeichnung DCT5A, DCT5B und DCT5C (siehe PCT-Anmeldung WO 90/13641). Alternativ dazu können auch andere Promotorsequenzen verwendet werden, um das Oligonukleotid zu exprimieren.
  • Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können auch in eine Zelle eingefügt werden, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, indem ein Konjugat mit einem Ligand-bindenden Molekül gebildet wird, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Zu geeigneten Ligand-bindenden Molekülen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, welche sich an Zelloberflächenrezeptoren binden. Bevorzugt beeinträchtigt die Konjugation des Liganden-Bindemoleküls die Fähigkeit des Ligand-bindenden Moleküls nicht wesentlich, sich an sein/en entsprechendes/n Molekül oder Rezeptor zu binden, oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotides oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
  • Alternativ dazu kann ein Sinn- oder ein Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle eingefügt werden, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, indem ein Oligonukleotid-Lipid-Komplex gebildet wird, wie in WO 90/10448 beschrieben ist. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird bevorzugt durch eine endogene Lipase innerhalb der Zelle dissoziiert.
  • Mit TRAIL immunreaktive Antikörper
  • Die TRAIL-Proteine der vorliegenden Erfindung, oder immunogene Fragmente davon, können bei der Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung stellt somit Antikörper bereit, welche spezifisch TRAIL binden, d.h. die Antikörper binden sich an TRAIL über die Antigenbindungsstellen des Antikörpers (im Gegensatz zu nichtspezifischer Bindung).
  • Polyklonale und monoklonale Antikörper können mittels konventioneller Techniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York (1980), und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988). Die Herstellung monoklonaler Antikörper, welche immunreaktiv mit TRAIL sind, wird ferner in Beispiel 4 unten illustriert.
  • Antigen-bindende-Fragmente solcher Antikörper, welche mittels konventioneller Techniken hergestellt werden können, sind auch durch die vorliegende Erfindung miteingeschlossen. Zu Beispielen solcher Fragmente zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Fab-, F(ab')- und F(ab')2-Fragmente. Antikörperfragmente und Derivate hergestellt durch Gentechnologieverfahren werden auch bereitgestellt.
  • Zu den monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung zählen chimäre Antikörper, z.B. humanisierte Versionen muriner monoklonaler Antikörper. Solche humanisierten Antikörper können mittels bekannter Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer reduzierten Immunogenität, wenn die Antikörper an Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform weist ein humanisierter monoklonaler Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur die Antigenbindungsstelle davon) und eine konstante Region, die von einem humanen Antikörper abgeleitet ist, auf. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment die Antigenbindungsstelle eines murinen monoklonalen Antikörpers und ein Fragment einer variablen Region (welcher die Antigenbindungsstelle fehlt), welches von einem humanen Antikörper abgeleitet ist, aufweisen. Zu Verfahren zur Herstellung chimärer und weiterer konstruierter monoklonaler Antikörper zählen die in Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989) und Winter and Harris (TIPS 14:139, 1993) beschriebenen.
  • Zu den Verwendungen der Antikörper zählt die Verwendung in Untersuchungen, um die Gegenwart von TRAIL-Polypeptiden, entweder in vitro oder in vivo nachzuweisen. Die Antikörper finden ferner Verwendung bei der Reinigung von TRAIL durch Affinitätschromatographie.
  • Diese Antikörper, welche zusätzlich die Bindung von TRAIL an Zielzellen blockieren können, können verwendet werden, um eine biologische Aktivität von TRAIL zu hemmen. Ein therapeutisches Verfahren beinhaltet die in vivo Verabreichung eines solchen Antikörpers in einer Menge, welche eine TRAIL-mediierten biologischen Aktivität wirksam hemmt. Störungen, welche direkt oder indirekt durch TRAIL mediiert oder verschlimmert werden, werden so behandelt. Monoklonale Antikörper werden im Allgemeinen für die Verwendung in solchen therapeutischen Verfahren bevorzugt.
  • Gegen TRAIL gerichtete Antikörper können nützlich sein, um thrombotische Mikroangiopathie zu behandeln. Eine solche Störung ist die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) (Kwaan, H.C., Semin. Hematol. 24:71, 1987; Thompson et al., Blood 80:1890, 1992). Steigende TTP-assoziierte Mortalitätsraten wurden von den U.S. Centers for Disease Control verzeichnet (Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84, 1995).
  • Plasma von an TTP leidenden Patienten (einschließlich HIV+- und HIV–-Patienten) induziert die Apoptose humaner Endothelzellen dermalen mikrovaskulären Ursprungs, jedoch nicht bei aus größeren Gefäßen stammenden (Laurence et al., Blood 87:3245, 15. April 1996). Es ist gedacht, das Plasma von TTP-Patienten einen oder mehrere Faktoren enthält, welche direkt oder indirekt Apoptose induzieren. In der in Beispiel 13 unten beschriebenen Untersuchung hemmten polyklonale Antikörper, gegen TRAIL gezüchtet wurden, die TTP-Plasma-induzierte Apoptose dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen. Die in Beispiel 13 vorgestellten Daten lassen annehmen, dass TRAIL im Serum von TTP-Patienten vorkommt und eine Rolle bei der Induzierung der Apoptose mikrovaskulärer Endothelzellen spielen kann.
  • Eine weitere thrombotische Mikroangiopathie ist das hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS) (Moake, J.L., Lancet 343:393, 1994; Melnyk et al. (Arch. Intern. Med. 155:2077, 1995; Thompson et al., oben). Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines Anti-TRAIL-Antikörpers zur Behandlung des Zustandes, welcher häufig als „Erwachsenen-HUS" bezeichnet wird (obwohl es auch bei Kindern auftreten kann). Eine Störung bekannt als „Kindheits-/Diarrhö-assoziiertes HUS" unterscheidet sich in der Ätiologie vom Erwachsenen-HUS.
  • Weitere Zustände, welche durch den Verschluss kleiner Blutgefäße können mit Hilfe von Anti-TRAIL-Antikörpern behandelt werden. Zu solchen Zuständen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Folgenden. Herzprobleme, welche bei etwa 5–10 % der pädiatrischen AIDS-Patienten auftreten, beruhen auf, so glaubt man, dem Verschluss kleiner Blutgefäße. Der Zusammenbruch der Mikrovaskulatur des Herzens wurde bei Multiple-Sklerose-Patienten verzeichnet. Als ein weiteres Beispiel wird die Behandlung des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in Erwägung gezogen.
  • In einer Ausführungsform wird das Blut oder Plasma eines Patienten ex vivo mit einem Anti-TRAIL-Antikörper in Kontakt gebracht. Der Antikörper (bevorzugt ein monoklonaler Antikörper) kann durch herkömmliche Verfahren an eine geeignete Chromatographiematrix gebunden sein. Das Blut oder Plasma des Patienten fließt durch eine Chromatographiesäule, welche den an die Matrix gebundenen Antikörper enthält, bevor es an den Patienten zurückgegeben wird. Der immobilisierte Antikörper bindet TRAIL und entfernt so das TRAIL-Protein aus dem Blut des Patienten.
  • In einer alternativen Ausführungsform werden die Antikörper in vivo verabreicht, wobei in diesem Fall wünschenswerterweise blockierende Antikörper eingesetzt werden. Solche Antikörper können mittels jeglicher geeigneter Untersuchungsverfahren identifiziert werden, wie zum Beispiel durch Testen der Antikörper auf die Fähigkeit, die Bindung von TRAIL an Zielzellen zu hemmen. Alternativ können blockierende Antikörper in Untersuchungen auf die Fähigkeit identifiziert werden, eine biologische Wirkung der Bindung von TRAIL an Zielzellen zu hemmen. Beispiel 12 illustriert ein geeignetes Verfahren zum Identifizieren von blockierenden Antikörpern, wobei die Antikörper auf die Fähigkeit untersucht werden, die TRAIL-mediierte Lyse von Jurkat-Zellen zu hemmen.
  • Die vorliegende Erfindung bietet somit ein Verfahren zur Behandlung thrombotischer Mikroangiopathie, welches die Verwendung einer effektiven Menge eines gegen TRAIL gerichteten Antikörpers beinhaltet. Antikörper der vorliegenden Erfindung können für in vivo- oder ex vivo-Verfahren angewandt werden, um die TRAIL-mediierte Schädigung (z.B. Apoptose) mikrovaskulärer Endothelzellen zu hemmen.
  • Anti-TRAIL-Antikörper können in Verbindung mit anderen Wirkstoffen eingesetzt werden, welche für die Behandlung einer bestimmten Störung nützlich sind. In einem Bericht über eine in vitro-Studie von Laurence et al. (Blood 87:3245, 1996), wurde eine teilweise Verringerung der TTP-Plasma-mediierten Apoptose mikrovaskulärer Endothelzellen erreicht, indem ein blockierender Anti-Fas-Antikörper, Aurin-Tricarbonsäure oder normales Plasma, dem das Kryopräzipitat entzogen wurde, verwendet wurden.
  • So kann ein Patient mit einem Wirkstoff, welcher die Fas-Ligand-mediierte Apoptose von Endothelzellen hemmt, in Verbindung mit einem Wirkstoff behandelt werden, welcher die TRAIL-mediierte Apoptose von Endothelzellen hemmt. In einer Ausführungsform wird sowohl ein blockierender Anti-TRAIL-Antikörper als auch ein blockierender Anti-Fas-Antikörper an einen Patienten verabreicht, welcher an einer Störung leidet, welche durch thrombotische Mikroangiopathie, wie z.B. TTP oder HUS gekennzeichnet ist. Beispiele blockierender monoklonaler Antikörper, die gegen das Fas-Antigen (CD95) gerichtet sind, werden in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/10540, welche als Referenz hierin eingeschlossen ist, beschrieben.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche einen Antikörper aufweisen, welcher immunreaktiv mit TRAIL ist, und ein geeignetes(n) Verdünnungsmittel, Excipienten oder Träger werden hierin bereitgestellt. Geeignete Komponenten solcher Zusammensetzungen sind wie die oben für die Zusammensetzungen, welche TRAIL-Proteine enthalten, beschriebenen.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Illustrierung bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung betrachtet werden.
  • BEISPIEL 1: Isolierung einer humanen TRAIL-DNA
  • DNA, welche ein humanes TRAIL-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, wurde durch das folgende Verfahren isoliert. Eine TBLASTN-Suche der dbEST-Datenbank des National Center for Biological Information (NCBI) wurde durchgeführt, und zwar mit der Abfragesequenz LVVXXXGLYYVYXQVXF (SEQ ID Nr.: 8). Diese Sequenz basiert auf der am besten konservierten Region der TNF-Ligandenfamilie (Smith et al., Cell 73:1349, 1993). Ein exprimierter Sequenz-Tag; EST-Datei, GenBank-Zugangsnummer Z36726, wurde mittels diesen Suchparametern identifiziert. Die GenBank-Datei gab an, das dieser EST aus einer humanen Herzvorhof-cDNA-Bibliothek stammt.
  • Zwei 30-bp Oligonukleotide basierend auf Sequenzen vom 3'- und 5'-Ende dieser EST-Datei wurden synthetisiert. Die Oligonukleotide vom 3'-Ende wiesen folgende Sequenz auf: TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG (Komplement der Nukleotide 636 bis 665 der SEQ ID Nr.: 1), und die 5'-Oligonukleotide waren folgende: TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTG (Nukleotide 291 bis 320 der SEQ ID Nr.: 1). Die Oligonukleotide waren am 5'-Ende mit 32P γ-ATP und Polynukleotidkinase markiert. Zwei λgt10-cDNA-Bibliotheken wurden mittels konventioneller Verfahren mit einer äquimolaren Mischung dieser markierten Oligonukleotide als Sonde durchsucht. Die eine Bibliothek war einem humane Herz-5'-Stretch cDNA-Bibliothek (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Die andere war eine periphere Blutlymphozyten (PBL) -Bibliothek, welche wie Folgt hergestellt wurde: PBLs erhielt man aus normalen humanen freiwilligen Versuchspersonen, und sie wurden für sechs Tage mit 10 ng/ml OKT3 (einem Anti-CD3-Antikörper) und 10 ng/ml humanem IL-2 behandelt. Die PBL-Zellen wurden gewaschen und für 4 Stunden mit 500 ng/ml lonomycin (Calbiochem) und 10 ng/ml PMA stimuliert. Messenger-RNA wurde aus den stimulierten PBL-Zellen isoliert. cDNA synthetisiert auf der mRNA-Matrize wurde in λgt10-Phagenvektoren (Gigapak®, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) gepackt.
  • Rekombinante Phagen wurden auf E. coli-Stamm C600-HFL plattiert und mittels Standardplaque-Hybridisierungsverfahren gescreened. Nitrocellulosefilter, mit doppelter Ausführung wurden von diesen Platten abgehoben und bei 67°C über Nacht mit den 32P-markierten Oligonukleotiden in einer Lösung von 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, 5 × Denhardt's Lösung, 6 × SSC, 1 mg/ml N-Lauroylsarcosin, 0,5 % NP40 und 4 μg/ml SS Lachssperma-DNA hybridisiert. Die Filter wurden dann bei 67°C für 30 Minuten in 3 × SSC gewaschen.
  • Aus der Herz-5'-Stretch-cDNA-Bibliothek erhielt man einen positiven Plaque aus etwa einer Million Plaques. Dieser Klon enthielt nicht das 3'-Ende des Gens. Mit Hilfe der PBL-Bibliothek erhielt man etwa 50 positive Plaques aus 500.000 Plaques. Fünfzehn dieser ersten Runde positiver Plaques wurden ausgewählt, und die Einfügung aus den angereicherten Pools wurden mit Hilfe von Oligonukleotid-Primeren amplifiziert, welche für die Amplifizierung von Phageneinfügungen ausgelegt sind. Die entstandenden Produkte wurden durch 1,5 % Agarosegel-Elektrophorese aufgelöst, auf Nitrocellulose überfragen und durch das Standard-Southern-Blot-Verfahren mit Hilfe der 32P-markierten 30-mer Oligonukleotide als Sonden analysiert. Die beiden ausgewählten Plaques, welche anhand der Southern-Analyse die größten Banden erzeugten, wurden durch sekundäres Screening gereinigt, und isolierte Phagenplaques wurden durch diegleichen, oben beschriebenen Verfahren erhalten.
  • DNA aus den isolierten Phagen wurde durch das Platten-Lyse-Verfahren erzeugt, und die cDNA-Einfügungen wurden mit EcoR1 herausgeschnitten, durch Elektrophorese mittels 1,5 % Agarose in Tris-Borat-EDTA-Puffer gereinigt und in das pBluescript® SK(+)-Plasmid ligiert. Die Einfügungen wurden dann mittels konventioneller Verfahren sequenziert und die entstehenden Sequenzen wurden ausgerichtet.
  • Die Nukleotidsequenz einer humanen TRAIL-DNA ist in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr.: 2. Dieses humane TRAIL-Protein weist eine N-terminale-Cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 1–18), eine Transmembranregion (Aminosäuren 19–38) und eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–281) auf. Das berechnete Molekulargewicht dieses Proteins ist 32.508 Daltons.
  • Zellen des E. coli-Stammes DH10B, die mit einem rekombinanten Vektor, welcher diese TRAIL-DNA aufweist, transformiert sind, wurden am 14. Juni 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die Zugangsnummer 69849. Die Hinterlegung erfolgte zu den Bedingungen des Budapester Vertrages. Der rekombinante Vektor in dem hinterlegten Stamm ist der Expressionsvektor pDC409 (beschrieben in Beispiel 5). Der Vektor wurde mit SalI und NotI verdaut, und humane TRAIL-DNA, welche die komplette, in SEQ ID Nr.: 1 aufweist, gezeigten kodierenden Region wurde in den verdauten Vektor ligiert.
  • BEISPIEL 2: Isolierung von DNA, welche ein verkürztes TRAIL kodiert
  • DNA, welche ein zweites humanes TRAIL-Protein kodiert, wurde wie folgt isoliert. Dieses verkürzte TRAIL weist nicht die Fähigkeit auf, die Apoptose von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  • Die PCR-Analyse mittels der in Beispiel 1 beschriebenen 30-mere als die 5'- und 3'-Primer zeigte, dass 3 von 14 der in der ersten Runde ausgewählten Plaques in Beispiel 1 kürzere Formen der TRAIL-DNA aufwiesen. Eine der verkürzten Formen des Gens wurde isoliert, in den pBluescript® SK(+)-Klonierungsvektor (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ligiert und sequenziert.
  • Die Nukleotidsequenz dieser DNA ist in SEQ ID Nr.: 3 dargestellt. Die dadurch kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.: 4 dargestellt. Das kodierte Protein weist eine N-terminale Cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 1–18), eine Transmembranregion (Aminosäuren 19–38) und eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–101) auf.
  • Der DNA der SEQ ID Nr. 3 fehlen die Nukleotide 359 bis 506 der DNA der SEQ ID Nr.: 1, und wird daher als der humane TRAIL-Deletionsvarianten- (huTRAILdv) Klon bezeichnet. Die Deletion verursacht eine Verschiebung des Leserahmens, was in einem Rahmen-internen Stoppcodon nach Aminosäure 101 der SEQ ID Nr.: 4 resultiert. Die DNA der SEQ ID Nr.: 3 kodiert somit ein verkürztes Protein. Die Aminosäuren 1 bis 90 der SEQ ID Nr.: 2 sind identisch mit den Aminosäuren 1 bis 90 der SEQ ID Nr.: 4. Jedoch unterscheidet sich aufgrund der Deletion der C-terminale-Abschnitt des huTRAILdv-Proteins (Aminosäuren 91 bis 101 der SEQ ID Nr.: 4) von den Resten an den entsprechenden Positionen der SEQ ID Nr.: 2.
  • Dem huTRAILdv-Protein fehlen die oben beschriebenen konservierten Regionen, welche sich am C-Terminus von Mitgliedern der TNF-Proteinfamilie finden. Die Unfähigkeit dieses huTRAILdv-Proteins, den apoptotischen Tod von Jurkat-Zellen zu verursachen, bestätigt umso mehr die Bedeutung dieser konservierten Regionen für die biologische Aktivität.
  • BEISPIEL 3: DNA, welche ein murines TRAIL kodiert
  • DNA, welche ein murines TRAIL kodiert, wurde durch das folgende Verfahren isoliert. Eine cDNA-Bibliothek, welche cDNA die aus der Maus-T-Zelllinie 7B9 abgeleitet wurde, im Vektor λZAP aufweist, wurde wie in Mosley et al. (Cell 59:335, 1989) beschrieben hergestellt. DNA aus der Bibliothek wurde mittels konventioneller Verfahren auf Nitrocellulosefilter transferiert.
  • Humane TRAIL-DNA-Sonden wurden verwendet, um hybridisierende Maus-cDNAs auf den Filtern zu identifizieren. Zwei separate Sonden wurden in zwei Durchsuchungsrunden verwendet. PCR-Reaktionsprodukte mit einer Länge von etwa 400 bp, welche mittels der humanen TRAIL-DNA als Matrize isoliert und amplifiziert wurden, wurden als Sonde in der ersten Durchsuchungsrunde eingesetzt. Diese PCR-Produkte bestanden aus einem Fragment der humanen TRAIL-kodierenden Region. Die in der zweiten Durchsuchungsrunde verwendete Sonde bestand aus der gesamten kodierenden Region der humanen TRAIL-DNA der SEQ ID Nr.: 1. Ein random-primed DNA-Markierungssatz (Stratagene, La Jolla, CA) wurde verwendet, um die Sonden radioaktiv zu markieren.
  • Die Hybridisierung erfolgte bei 37°C in 50 % Formamid, gefolgt von einer Waschung mit 1 × SSC, 0,1 % SDS bei 50°C. Eine Maus-cDNA, welche in beiden Durchsuchungsrunden positiv war, wurde isoliert.
  • Die Nukleotidsequenz dieser DNA ist in SEQ ID Nr.: 5 dargestellt, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr.: 6. Das kodierte Protein weist eine N-terminale Cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 1–17), eine Transmembranregion (Aminosäuren 18–38) und eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 39–291) auf. Dieses Maus-TRAIL ist auf dem Aminosäureniveau zu 64 % identisch mit dem humanen TRAIL der SEQ ID Nr.: 2. Die kodierende Region der Maus-TRAIL-Nukleotidsequenz ist zu 75 % identisch mit der kodierenden Region der humanen Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1.
  • BEISPIEL 4: TRAIL-bindende Antikörper
  • Dieses Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, welche spezifisch TRAIL binden. Zu geeigneten Immunogenen, welche bei der Herstellung solcher Antikörper eingesetzt werden können, zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, gereinigtes TRAIL-Protein oder ein immunogenes Fragment davon (z.B. die extrazelluläre Domäne), Fusionsproteine, welche TRAIL-Polypeptide enthalten (z.B. lösliche TRAIL/Fc-Fusionsproteine) sowie Zellen, welche rekombinantes TRAIL auf der Zelloberfläche exprimieren.
  • Zu bekannten Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper zählen die in US-Patentschrift 4,411,993 beschriebenen. Kurz dargestellt: Mäuse werden mit TRAIL als ein Immunogen emulgiert in komplettem Freund's Adjuvans immunisiert und in Mengen zwischen 10–100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem TRAIL, welches in inkomplettem Freund's Adjuvans emulgiert ist, nochmals immunisiert. Danach werden Mäuse periodisch nach einem wöchentlichen bis zweiwöchentlichen Immunisierungszeitplan immunisiert. Serumproben werden periodisch durch retro-orbitale Blutung oder Schwanzspitzen-Exzision genommen, um auf TRAIL-Antikörper mittels Dot-Blot-Untersuchung oder ELISA (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay) zu testen.
  • Nach Feststellung eines angemessenen Antikörper-Titers erhalten positive Tiere eine letzte intravenöse Injektion von TRAIL in Salzlösung. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, Milzzellen werden entnommen und die Milzzellen werden mit einer murinen Myelomzelllinie wie NS1 oder, bevorzugt, P3 × 63Ag 8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Durch die Fusion entstehen Hybridomzellen, welche in mehrere Mikrotiter-Platten in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) -selektiven Medium plattiert werden, um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellenhybriden zu verhindern.
  • Die Hybridomzellen werden mittels ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes TRAIL durchsucht, und zwar durch Adaption der in Engvall et al. (Immunochem. 8:871, 1971) und in US-Patentschrift 4,703,004 offenbarten Verfahren. Positive Hybridomzelllinien können intraperitoneal in syngene BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites mit hohen Konzentrationen an monoklonalen Anti-TRAIL-Antikörpern zu erzeugen. Alternativ dazu können Hybridomzellen mittels verschiedener Verfahren in vitro in Kolben oder Rollerflaschen gezüchtet werden. In Mausaszites hergestellte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Präzipitation gefolgt von Gel-Ausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann die Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein G verwendet werden, wie auch die Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung an TRAIL.
  • BEISPIEL 5: DNA-Laddering-Apoptose-Untersuchung
  • Humanes TRAIL wurde exprimiert und auf die Fähigkeit getestet, Apoptose zu induzieren. Es wurden Oligonukleotide synthetisiert, welche dem 3'- und 5'-Ende der kodierenden Region des humanen TRAIL-Gens entsprechen, wobei SalI- und NotI-Restriktionsstellen an den Enden der Oligonukleotide eingebaut wurden. Die kodierende Region des humanen TRAIL-Gens wurde mit Standard-PCR-Verfahren amplifiziert, und zwar mittels dieser Oligonukleotide als Primer. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mit den Restriktionsendonukleasen SalI und NotI verdaut, und dann in den SalI/NotI-verdauten Vektor pDC409 eingefügt. pDC409 ist ein Expressionsvektor zur Verwendung in Säugetierzellen, er ist jedoch auch in E. coli-Zellen replizierbar.
  • pDC409 ist von einem Expressionsvektor mit der Bezeichnung pDC406 (beschrieben in McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991 und in PCT-Anmeldung WO 91/18982, hierin als Referenz eingeschlossen) abgeleitet. pCD406 enthält Replikationsursprünge welche von SV40, Epstein-Barr-Virus und pBR322 abgeleitet sind und ist ein Derivat von HAV-EO, wie in Dower et al., J. Immunol. 142:4314 (1989) beschrieben ist. pDC406 unterscheidet sich von HAV-EO durch die Deletion eines Introns, welches sich in der dreiteiligen Adenovirus-2-Leitsequenz in HAV-EO befindet. DNA welche in eine multiple Klonierungsstelle (welche eine Reihe von Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen enthält) eingefügt wurde, wird mit Hilfe von Regulationselementen, welche aus HIV und Adenovirus abgeleitet sind, transkribiert und translatiert. Der Vektor enthält außerdem ein Gen, welches Ampicillinresistenz verleiht.
  • pDC409 unterscheidet sich von pDC406 dadurch, dass eine BgI-II-Stelle außerhalb der mcs (multiple Klonierungsstelle) gelöscht wurde, so dass die mcs-Bgl-II-Stelle einmalig ist. Zwei Pme-1-Stellen und eine Srf-1-Stelle wurden zur mcs hinzugefügt, und drei Stoppcodons (TAG) wurden stromabwärts der mcs positioniert, damit sie in allen drei Leserahmen funktionieren. Ein T7-Primer/-Promotor wurde hinzugefügt, um den DNA-Sequenzierungsprozess zu unterstützen.
  • Die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie (ATCC CCL 70) mit einem Gen abgeleitet, welches das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) kodiert, welches konstitutiv, angetriebene vom humanen CMV intermediate-early Enhancer/Promotor, EBNA-1 exprimiert, wie in McMahan et al., oben beschrieben ist. Das EBNA-1-Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie pDC409, welche den EBV-Replikationsursprung enthalten.
  • In Falcon T175-Kolben gezüchtete CV1/EBNA-Zellen wurden mit 15 μg entweder „leerem" pDC409 oder pDC409, welcher die humane TRAIL-kodierende Region enthält, transfiziert. Die transformierten Zellen wurden für 3 Tage bei 37°C und 10 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, für 20 Minuten bei 37°C in 50 mM EDTA inkubier, mit einem Zellschaber vom Kolben gekratzt und einmal in PBS gewaschen. Als nächstes wurden die Zellen bei 4°C für 10 Minuten in 1 Paraformaldehyd PBS fixiert und 3 × in PBS gewaschen.
  • Jurkat-Zellen wurden als Ziel-Zellen in dieser Untersuchung verwendet, um zu bestimmen, ob die TRAIL-exprimierenden Zellen deren Apoptose induzieren können. Die Jurkat-Zelllinie, Klon E6-1, ist eine humane akute T-Zellen-Leukämie-Zelllinie, die von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC TIB 152 erhältlich und in Weiss et al. (J. Immunol. 133:123–128, 1984) beschrieben ist. Die Jurkat-Zellen wurden in RPMI-Medien das mit 10 % fötalem Rinderserum und 10 μg/ml Streptomycin und Penicillin ergänzt wurde, auf eine Dichte von 200.000 bis 500.000 Zellen pro ml kultiviert. Vier Millionen dieser Zellen pro Kammer wurden in einer 6-Kammer-Platte mit 2,5 ml Medium mit verschiedenen Kombinationen aus fixierten Zellen, Überständen von Zellen transfiziert mit Fas-Ligand, und verschiedenen Antikörpern, wie im Folgenden angegeben ist, co-kultiviert.
  • Nach vier Stunden wurden die Zellen einmal in PBS gewaschen und bei 1200 U/min für 5 Minuten in einer Tischzentrifuge pelletisiert. Die Pellets wurden resuspendiert und für zehn Minuten bei 4°C in 500 μl Puffer bestehend aus 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,5 und 0,2 % Triton X-100, welches die Zellen auflöst, aber deren Kerne intakt lässt, inkubiert. Das Lysat wurde dann bei 4°C für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und drei Mal mit 1 ml 25:24:1 Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von Präzipitation mit NaOAC und Ethanol in Gegenwart von 1 μg Glykogen-Träger (Sigma).
  • Die resultierenden Pellets wurden in 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,5 resuspendiert und bei 37°C für 20 Minuten mit 10 μg/ml RNase A inkubiert. Die DNA-Lösungen wurden dann durch 1,5 Agarosegel-Elektrophorese in Tris-Borat-EDTA-Puffer aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter sillumination mit UV-Licht fotografiert.
  • Die Ergebnisse waren folgende: Fixierte CV1/EBNA-Zellen, die entweder mit pDC409 oder pDC409-TRAIL transfiziert waren, erzeugten kein erkennbares DNA-Laddering (Fragmentierung der DNA in etwa gleich große Bruchstücke). Fixierte pDC409-TRAIL-Zellen, die mit Jurkat-Zellen co-kultiviert wurden erzeugten DNA-Laddering; fixierte pDC409-Zellen, die mit Jurkat-Zellen co-kultiviert wurden, jedoch nicht.
  • DNA-Laddering zeigte sich auch, wenn Jurkat-Zellen mit konzentrierten Überständen von COS-Zellen, die mit DNA, welche humanen Fas-Liganden in pDC409 kodiert, transfiziert sind, co-kultiviert wurden. Die Überstände, so glaubt man, enthalten löslichen Fas-Liganden, welcher proteolytisch von der Zelloberfläche freigesetzt wird. Die vom Fas-Ligand induzierte DNA-Laddering konnte durch Zugabe von 10 μg/ml eines löslichen gegen Fas gerichteten blockierenden monoklonalen Antikörpers blockiert werden. Dieser gleiche Antikörper konnte das Laddering der Jurkat-DNA durch die pDC409-TRAIL-Zellen nicht verhindern, was zeigt, dass TRAIL die Apoptose nicht durch Fas induziert.
  • Im gleichen Untersuchungsverfahren induzierten fixierte CV1/EBNA-Zellen, die mit pDC409-TRAIL transfiziert waren, eine DNA-Laddering in U937-Zellen. U937 (ATCC CRL 1593) ist eine humane histiozytäre Lymphomzelllinie. Das Verhältnis von Effektor- zu Zielzellen betrug 1:4 (das gleiche wie in der Untersuchung an Jurkat-Zielzellen).
  • Die Fragmentierung zellulärer DNA in ein Muster bekannt als DNA-Laddering ist ein Kennzeichen der Apoptose. In der vorangegangenen Untersuchung induzierte TRAIL die Apoptose einer Leukämiezelllinie und einer Lymphomzelllinie.
  • BEISPIEL 6: Northern-Blot-Analyse
  • Die Expression von TRAIL in einer Reihe unterschiedlicher Gewebsarten wurde in einem konventionellen Norfhern-Blot-Verfahren analysiert. Man erhielt Northern Blots, welche Poly-A+-RNA aus einer Vielzahl humaner Erwachsenengewebe enthalten (Northern Blots I und II multipler Gewebe) von Clonetech (Palo Alto, CA). Weitere Blots wurde durch das Auftrennen von RNA-Proben auf einem 1,1 Agarose-Formaldehyd-Gel, Überführen auf Hybond-N wie vom Hersteller (Amersham Corporation) empfohlen ist und Einfärbung mit Methylenblau zur Überwachung der RNA-Konzentrationen hergestellt. Die Blots wurden mit einer Gegensinn-RNA-Ribosonde entsprechend der gesamten kodierenden Region von humanem TRAIL getestet.
  • Humane TRAIL-mRNA wurde in peripheren Blutlymphozyten, Dickdarm, Dünndarm, Eierstock, Prostata, Thymus, Milz, Plazenta, Lunge, Niere, Herz, Bauchspeicheldrüse und Skelettmuskel entdeckt. TRAIL-skripte fand man reichlich in der anaplastischen großzelligen Lymphomzelllinie Karpas 299 (Fischer et al., Blood 72:234, 1988) und in Mandel-T-Zellen. Die TRAIL-Nachricht lag in einem geringeren Maß in der Burkitt-Lymphomzelllinie mit der Bezeichnung Raji vor.
  • TRAIL-mRNA wurde nicht in Testikeln, Gehirn oder Leber oder in mehreren T-Zelllinien gefunden. Wenige oder gar keine TRAIL-skripte fand man in frisch isolierten peripheren Blut-T-Zellen (PBT), entweder unstimuliert, oder für 20 Stunden mit PMA und Calciumionophor stimuliert.
  • BEISPIEL 7: Herstellung eines löslichen TRAIL-Polypeptids
  • Ein lösliches humanes TRAIL-Polypeptid, welches die Aminosäuren 95 bis 281 der SEQ ID Nr.: 2 aufweist, wurde wie Folgt hergestellt. Dieses Polypeptid ist ein Fragment der extrazellulären Domäne, dem die zuvor diskutierte Spacer-Region fehlt.
  • Ein Expressionsvektor, welcher löslichen humanen TRAIL kodiert, wurde durch die Fusionierung von Rahmen-interner DNA hergestellt, welche die folgenden Aminosäuresequenzen (aufgelistet vom N- zum C-Terminus) kodiert: eine Leitsequenz, welche vom humanen Cytomegalovirus (CMV) abgeleitet ist, ein synthetisches Epitop mit der Bezeichnung Flag® und die Aminosäuren 95–281 des humanen TRAIL. Das Flag®-Octapeptid (SEQ ID Nr.: 7) erleichtert die Reinigung damit fusionierter Proteine, wie zuvor und in Hopp et al. (Biotechnology 6:1204–1210, 1988) beschrieben ist.
  • Das TRAIL-kodierende DNA-Fragment wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Hilfe von Oligonukleotidprimeren, welche die Termini eines DNA-Fragmentes definieren, welches die Aminosäuren 95–281 der SEQ ID Nr.: 2 kodiert isoliert und amplifiziert. Der 3'-Primer war ein 31-mer, welcher zusätzlich eine NotI-Stelle stromabwärts der TRAIL-kodierenden Sequenz hinzufügte. Der 5'-Primer fügte eine SpeI-Stelle und eine Flag®-Epitop-kodierende Sequenz stromaufwärts der TRAIL-kodierenden Sequenz hinzu. Die PCR wurde mittels konventioneller Verfahren durchgeführt, mit Hilfe der zuvor beschriebenen humanen TRAIL-cDNA als Matrize.
  • Die Reaktionsprodukte wurden mit SpeI und NotI verdaut und in den Expressionsvektor pDC409 (beschrieben in Beispiel 5) eingefügt, welcher mit SalI und NotI gespaltet worden war. Aufgeschmolzene Oligonukleotide, welche ein SalI-SpeI-Fragment bilden, welches eine CMV offenen Leserahmen, Leitsequenz kodiert, wurden ebenfalls in den Vektor ligiert. Die Aminosäuresequenz der CMV-abgeleiteten Leitsequenz ist in SEQ ID Nr.: 9 dargestellt. Die Aminosäuren 1 bis 29 der SEQ ID Nr.: 9 werden durch CMV-DNA kodiert, wobei die Aminosäuren 30 bis 32 durch Oligonukleotide kodiert werden, welche bei der Herstellung des Vektors eingesetzt werden. E. coli-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transfiziert, und der gewünschte rekombinante Expressionsvektor wurde davon isoliert.
  • CV1-EBNA-Zellen (ATCC CRL 10478, beschrieben in Beispiel 5) wurden mit dem rekombinanten Vektor, welcher die Bezeichnung pDC409-Flag-shTRAIL trägt, transfiziert und kultiviert, um die Expression und Sekretion des löslichen Flag®-TRAIL-Polypeptides zuzulassen. 3 Tage nach der Transfektion wurden Kulturüberstände entnommen und auf eine Säule aufgebracht, welche auf einem festen Träger immobilisierten Anti-Flag®-Antikörper mit der Bezeichnung M2, enthielt. Die Säule wurde dann mit PBS gewaschen. Der monoklonale Antikörper M2 ist in Hopp et al., oben beschrieben und von Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut erhältlich. 800 μl Fraktionen wurden mit 50 mM Citrat aus der Säule eluiert und sofort in 0,45 ml 1 M Tris (pH 8) neutralisiert. Die Fraktionen wurden auf 10 % Glycerol eingestellt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
  • Dieser lösliche rekombinante Flag®/humane TRAIL exprimiert in CV1/EBNA-Zellen hat ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD, was die Analyse durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ergab. Der Flag®-Rest steuert geschätzte 880 Dalton zum gesamten Molekulargewicht bei. Die Gelfiltrationsanalyse von gereinigtem löslichem Flag®/TRAIL lässt vermuten, dass das Molekül in Lösung multimer mit einer Größe von ~80 kD ist. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, lässt die Gelfiltrationsanalyse den Schluss zu, dass das lösliche rekombinante Flag®/humane TRAIL natürlicherweise eine Kombination aus Dimeren und Trimeren gebildet hat, wobei Trimere überwiegen.
  • Ein Expressionsvektor mit der Bezeichnung pDC409-Flag-smTRAIL, welcher ein CMV-Leitsequenz-Flag®-lösliches murines TRAIL-Protein kodiert, wurde durch analoge Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, welches ein lösliches murines TRAIL-Polypeptid kodiert, wurde durch PCR isoliert und amplifiziert. Oligonukleotide, welche die Termini der DNA definieren, welche die Aminosäuren 99 bis 291 der murinen TRAIL-Sequenz der SEQ ID Nr.: 6 kodiert, wurden als die 5'- und 3'-Primer in der PCR eingesetzt.
  • BEISPIEL 8: Lyse von Leukämiezellen durch löslichen TRAIL
  • In Beispiel 5 induzierten Zellen, welche humanes TRAIL exprimieren, die Apoptose von Jurkat-Zellen (eine Leukämiezelllinie). In der folgenden Studie tötete ein lösliches humanes TRAIL-Polypeptid Jurkat-Zellen.
  • Jurkat-Zellen wurden auf eine Dichte von 200.000 bis 500.000 Zellen pro ml in RPMI-Medium, welches mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Penicillin ergänzt war, kultiviert. Die Zellen (in 96-Kammer-Platten mit 50.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl) wurden für zwanzig Stunden mit den in 1 angegebenen Reagenzien inkubiert. „TRAIL-Überst." [„TRAIL supe."] bezieht sich auf konditionierten Überstand (10 μl pro Kammer) von mit pDC409-Flag-shTRAIL transfizierten CV1/EBNA-Zellen (siehe Beispiel 7). „Konfroll-Überst." [„Control supe."] bezieht sich auf Überstand von mit leerem Vektor transfizierten CV1/EBNA-Zellen. Wo angegeben, wurde immobilisierter Anti-Flag®-Antikörper M2 („Imm M2") mit einer Konzentration von 10 μg/ml in einem Volumen von 100 μl pro Kammer hinzugegeben und bei 4°C über Nacht oder bei 37°C für 2 Stunden anhaften lassen, wonach die Kammern aspiriert und zweimal mit PBS gewaschen wurden, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Mit Fas-Ligand oder M3, einem gegen Fas gerichteten blockierenden monoklonalen Antikörper behandelte Jurkat-Zellen (Alderson et al., J. Exp. Med. 181:71, 1995; und PCT-Anmeldung WO 95/10540), wurden wie angegeben in die Untersuchung eingeschlossen.
  • Die Stoffwechselaktivität der so behandelten Zellen wurde in dem folgenden Verfahren durch die metabolische Umwandlung von Alamar-Blau-Farbstoff untersucht. Die Alamar-Blau-Umwandlung wurde gemessen durch Zugabe von 10 μl Alamar-Blau-Farbstoff (Biosource International, Camarillo, CA) pro Kammer und Subtraktion der optischen Dichte (OD) gemessen bei 550–600 nm zu dem Zeitpunkt, an dem der Farbstoff zugegeben wurde, von der OD 550–600 nm nach vier Stunden. Keine Umwandlung des Farbstoffes ist als 0 Prozent Viabilität dargestellt, und das Level der Farbstoffumwandlung in Abwesenheit von TRAIL ist als 100 Prozent Viabilität dargestellt. Die Viabilität in Prozent wurde berechnet, indem das Verhältnis der Färbung von Experimentkulturen und Kontrollkulturen mit 100 multipliziert wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Messungen von vier unabhängigen Kammern dar, und die Werte sind der Durchschnitt dieser Messungen.
  • Der TRAIL-enthaltende Überstand verursachte eine signifikante Verringerung der Viabilität von Jurkat-Zellen. Eine stärkere Verringerung der Zellviabilität resultierte aus dem Kontakt mit einer Kombination aus TRAIL-enthaltendem Überstand und immobilisiertem Anti-Flag®-Antikörper M2. Eine mögliche Erklärung ist, dass M2 die Vernetzung des Flag®/TRAIL-Rezeptor-Komplexes erleichtert, wodurch die Stärke der Signalisierung erhöht wird.
  • Fas-Ligand demonstrierte die Fähigkeit, Jurkat-Zellen zu töten. Der Anti-Fas-Antikörper M3 hemmte die Aktivität des Fas-Liganden, jedoch nicht die Aktivität des TRAIL.
  • Um zu bestätigen, dass die Änderungen der Farbstoffumwandlung bei der Alamar-Blau-Untersuchung aufgrund des Zelltodes zustande kamen, wurde die durch TRAIL induzierte Verringerung der Zellviabilität durch Färbung der Zellen mit Trypan-Blau bestätigt.
  • BEISPIEL 9: Lyse von Leukämie- und Lymphomzellen
  • In Beispiel 5 und 8 induzierte TRAIL die Apoptose einer Leukämiezelllinie (Jurkat) und einer Lymphomzelllinie (U937). Die folgende Studie demonstriert ferner die Fähigkeit von TRAIL, Leukämie- und Lymphomzellen abzutöten.
  • Die in Tabelle I angegebenen humanen Zelllinien wurden auf eine Dichte von 200.000 bis 500.000 Zellen pro ml in RPMI-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Penicillin ergänzt ist, kultiviert. Die Zellen (in 96-Kammern-Platten mit 50.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl) wurden für zwanzig Stunden mit konditionierten Überständen (10 μl pro Kammer) von pDC409-Flag-shTRAIL-transfizierten CV1/EBNA-Zellen inkubiert.
  • Die Stoffwechselaktivität wurde durch Umwandlung von Alamar-Blau-Farbstoff untersucht, mit dem in Beispiel 8 beschriebenen Untersuchungsverfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
  • Um zu bestätigen, dass die Änderungen der Farbstoffumwandlung in der Alamar-Blau-Untersuchung aufgrund des Zelltodes auftraten, wurde die durch TRAIL induzierte Verringerung der Zellviabilität durch Färbung mit Trypan-Blau bestätigt. Die Kristallviolett-Färbung, durchgeführt wie von Flick and Gifford (J. Immunol. Methods 68:167–175, 1984) beschrieben, bestätigte auch die in der Alamar-Blau-Untersuchung gezeigten Ergebnisse. Die apoptotische Natur des Zelltodes wurde durch die Trypan-Blau-Färbung und Visualisierung der apoptotischen Fragmentierung durch Mikroskopie bestätigt.
  • Wie in Tabelle I gezeigt, waren viele Krebszelllinien empfindlich gegen TRAIL-mediierte Tötung. Die Anfälligkeit weiterer Zelltypen gegen TRAIL-mediierte Apoptose kann mit Hilfe der in diesem Beispielabschnitt beschriebenen Untersuchungsverfahren bestimmt werden.
  • TRAIL zeigte keine signifikante zytotoxische Wirkung auf die Zelllinien THP-1, K562, Karpas 299 und MP-1. K299, auch bekannt als Karpas 299 (DSM-ACC31), wurde aus peripherem Blut einer mit hochgradigem, großzelligem anaplastischem Lymphom diagnostizierten männlichen Versuchsperson (Fischer et al., Blood 72:234, 1988) gewonnen. MP-1 ist eine spontan abgeleitete EBV-transformierte B-Zelllinie (Goodwin et al., Cell 73:447, 1993). Ohne an die Theorie gebunden zu sein, ist es möglich, dass diese vier Zelllinien keinen Rezeptor für TRAIL exprimieren, oder sind durch die Aufwärtsregulierung eines Genes gekennzeichnet, welches die Apoptose verhindert.
  • Figure 00400001
  • BEISPIEL 10: Arten-übergreifende Aktivität von TRAIL
  • Die arten-übergreifende Kreuzreaktivität von humanem und murinem TRAIL wurde wie Folgt getestet. Murines und humanes TRAIL wurden mit der humanen Melanomzelllinie A375 (ATCC CRL 1619) inkubiert. Da es sich hierbei um eine adhärente Zelllinie handelt, wurde eine Kristallviolett-Untersuchung anstelle von Alamar-Blau verwendet, um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. A375-Zellen wurden in DMEM, welches mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Penicillin ergänzt ist, kultiviert. Die Zellen (in 96-Kammer-Platten mit 10.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl) wurden für 72 Stunden mit dem in Beispiel 7 beschriebenen löslichen murinen TRAIL inkubiert. Die Kristallviolettfärbung erfolgte wie von Flick and Gifford (J. Immunol. Methods 68:167–175, 1984) beschrieben. Die Ergebnisse demonstrierten, dass sowohl humanes als auch murines TRAIL bei diesen humanen Zellen aktiv sind, wobei murines und humanes TRAIL A375-Zellen abtöteten.
  • Die Fähigkeit von humanem TRAIL, auf murine Zellen zu wirken, wurde mittels der immortalisierten murinen Fibroblastenzelllinie L929 getestet. Die Inkubation von L929-Zellen mit entweder humanem oder murinem TRAIL resultierte in einer Verringerung der Kristallviolettfärbung und zeigte somit, dass humanes wie auch murines TRAIL bei murinen Zellen aktiv ist (deren Apoptose induziert). Zusätzlich zur Kristallviolett-Untersuchung wurde der Zelltod auch durch Trypan-Blau-Färbung bestätigt.
  • BEISPIEL 11: Lyse von CMV-infizierten Zellen
  • Das folgende Experiment demonstriert, dass das in Beispiel 7 hergestellte lösliche Flag®-humane-TRAIL-Protein eine zytotoxische Wirkung auf virusinfizierte Zellen hat.
  • Normale humane Gingivafibroblasten wurden bis zur Konfluenz in 24-Kammer-Platten in 10 % CO2 und DMEM-Medium, welches mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Penicillin ergänzt ist, kultiviert. Proben der Fibroblasten wurden wie in 2 angegeben behandelt. Die Cytokinkonzentrationen lagen bei 10 ng/ml für γ-Interferon und 30 ng/ml für lösliche Flag®-humanes-TRAIL. Alle Proben, welche TRAIL erhielten, erhielten auch einen zweifachen gewichtsmäßigen Überschuss an Anti-Flag®-Antikörper M2 (zuvor beschrieben), was die TRAIL-Aktivität erhöhte (wahrscheinlich durch Vernetzung).
  • Die Vorbehandlung von Zellen mit den angegebenen Cytokinen dauerte 20 Stunden. Um Zellen mit dem Cytomegalovirus (CMV) zu infizieren, wurden Kulturmedien aspiriert, und die Zellen wurden mit CMV in DMEM mit einer annähernden MOI (Infektionsmultiplizität) von 5 infiziert. Nach zwei Stunden wurde das Virus-enthaltende Medium mit DMEM ersetzt, und die Cytokine wurden wie angegeben hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen wie beschrieben (Flick and Gifford, 1984, oben) mit Kristallviolett-Farbstoff gefärbt. Die gefärbte Zelle wurde zweimal mit Wasser gewaschen, in 200 μl 2 % Natrium-Deoxycholat zerstört, 5-Fach in Wasser verdünnt und die OD bei 570 nm gemessen. Die maximale prozentuale Färbung wurde durch Normalisierung der ODs auf die Probe berechnet, welche die größte Färbung zeigte. Ähnliche Ergebnisse wurden mit mehreren unabhängigen Experimenten erzielt.
  • Die in 2 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass TRAIL spezifisch CMV-infizierte Fibroblasten abtötete. Dieser Zelltod wurde durch die Vorbehandlung der Zellen mit γ-Interferon verstärkt. Kein signifikanter Tod von nichtvirusinfizierter Fibroblasten resultierte aus dem Kontakt mit TRAIL.
  • BEISPIEL 12: Untersuchung zur Identifikation blockierender Antikörper
  • Blockierende Antikörper die gegen TRAIL gerichtet sind, können durch Testen der Antikörper auf ihre Fähigkeit, eine bestimmte biologische Aktivität von TRAIL zu verhindern, identifiziert werden. In der folgenden Untersuchung wurde ein monoklonaler Antikörper auf die Fähigkeit getestet, die TRAIL-mediierte Apoptose von Jurkat-Zellen zu inhibieren. Die Jurkat-Zelllinie ist in Beispiel 5 beschrieben.
  • Eine Hybridomzelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein Flag®/lösliches humanes TRAIL-Fusionsprotein gezüchtet ist, wurde bei der Untersuchung eingesetzt. Die Überstände der Hybridomkulturen wurden mit 20 ng/ml Flag®/lösliches humanes TRAIL, welches mit 40 ng/ml monoklonalem Anti-Flag®-Antikörper M2 vernetzt ist, in komplettem RPMI-Medium in einer 96-Kammer-Mikrotiterplatte inkubiert. Eine äquivalente Menge frisches Hybridomkulturmedium wurde zu Kontrollkulturen hinzugegeben. Das Flag®/lösliche humane TRAIL-Fusionsprotein und der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung M2 sind in Beispiel 7 beschrieben.
  • Der Hybridomüberstand wurde mit einer 1:50 (v/v) Verdünnung (Anfangskonzentration) angewandt, und mit zweifachen seriellen Verdünnungen davon. Nach der Inkubation bei 37°C, 10 % CO2, für 30 Minuten, wurden 50.000 Jurkat-Zellen pro Kammer hinzugegeben, und die Inkubation wurde für 20 Stunden fortgesetzt.
  • Die Zelllebensfähigkeit wurde dann durch Messung der metabolischen Umwandlung von Alamar-Blau-Farbstoff bewertet. Ein Untersuchungsverfahren der Alamar-Blau-Umwandlung ist in Beispiel 8 beschrieben. Man fand heraus, dass der monoklonale Antikörper die durch Flag®/lösliches humanes TRAIL induzierte Apoptose der Jurkat-Zellen verhindert.
  • BEISPIEL 13: TRAIL-Blockierungsstudie
  • Humane mikrovaskuläre Endothelzellen dermalen Ursprungs wurden für 16–18 Stunden mit Plasma von Patienten mit thrombotischer thrombozytopenischer Purpura (TPP) oder mit Kontrollplasma behandelt, entweder allein oder in Gegenwart von polyklonalem Anti-TRAIL-Antiserum. Eine 1:2000 Verdünnung des Antiserums wurde eingesetzt. Das Plasma stammte von zwei Patienten, die unten mit Nr. 1 und Nr. 2 bezeichnet werden. Die für die Untersuchung verwendeten Zellen waren MVEC-1 (HMVEC 2753, erworben von Clonetics, San Diego, CA) und MVEC-2 (DHMVEC 30282, erworben von Cell Systems, Kirkland, WA). Kulturen dieser Zellen können wie in Laurence et al. (Blood 87:3245, 1996) beschrieben ist, aufrecht erhalten werden.
  • Die Ergebnisse waren folgende. Die gezeigten Daten stammen aus DNA-Histogrammen von Zellen, die mit Propidiumiodid gefärbt sind, und „A0 peak" [„A0-Spitze] steht für die apoptotische Spitze (siehe Oyaizu et al., Blood 82:3392, 1993; Nicoletti et al., J. Immunol. Methods 139:271, 1991; und Laurence et al., Blood 75:696, 1990).
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Die Daten zeigen, dass von TTP-Patienten abgeleitetes Plasma die Apoptose von mikrovaskulären Endothelzellen dermalen Ursprungs induziert. Diese Apoptose wurde durch gegen TRAIL gerichtete polyklonale Antikörper inhibiert.
  • Sequenzliste
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Deutsche Zeichnungsbeschriftung
  • FIGUR 1
    Figure 00560001
  • FIGUR 2
    Figure 00560002

Claims (36)

  1. Eine isolierte DNA, die ein TRAIL-Polypeptid kodiert, wobei genanntes TRAIL-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 80% mit einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe identisch ist, die aus den Aminosäuren 1 bis 281 der SEQ. ID-Nr.: 2 und den Aminosäuren 1 bis 291 der SEQ. ID-Nr.: 6 besteht, wobei genanntes TRAIL-Polypeptid in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  2. Eine isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei genanntes TRAIL-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe der Aminosäuren 1 bis 281 der SEQ. ID-Nr.: 2 und der Aminosäuren 1 bis 291 der SEQ. ID-Nr.: 6 aufweist.
  3. Eine isolierte DNA, die ein lösliches TRAIL-Polypeptid kodiert, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer Sequenz aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 2, b) der extrazellulären Domäne des murinen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 6, c) einem Fragment der extrazellulären Domäne von (a) oder (b), wobei das Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  4. Eine DNA nach Anspruch 3, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweist, die aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL (Aminosäuren 39 bis 281 der SEQ. 1 Nr.: 2) und b) einem Fragment der genannten extrazellulären Domäne besteht, wobei genanntes Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  5. Eine DNA nach Anspruch 4, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid die Sequenz der Aminosäuren x bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2 aufweist, wobei x eine ganze Zahl von 39 bis 95 darstellt.
  6. Eine DNA nach Anspruch 5, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid die Sequenz der Aminosäuren 95 bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2 aufweist.
  7. Eine DNA nach Anspruch 3, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid eine oder mehrere konservative Substitutionen in einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweist, die aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL (Aminosäuren 39 bis 281 von SEQ. ID Nr.: 2) besteht, wobei die extrazelluläre Domäne in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren, und b) einem Fragment der genannten extrazellulären Domäne besteht, wobei das Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren, wobei der konservativ substituierte TRAIL in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  8. Ein Expressionsvektor, der eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
  9. Ein Verfahren zur Bereitung eines TRAIL-Polypeptids, das die Kultivierung einer Wirtszelle, die mittels eines Vektors gemäß Anspruch 8 unter die Expression von TRAIL begünstigenden Bedingungen transformiert ist, und die Gewinnung des TRAIL-Polypeptids aufweist.
  10. Ein gereinigtes TRAIL-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 80% mit einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe identisch ist, die aus den Aminosäuren 1 bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2 und den Aminosäuren 1 bis 291 der SEQ. ID Nr.: 6 besteht, wobei genanntes TRAIL-Polypeptid in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  11. Ein gereinigtes TRAIL-Polypeptid nach Anspruch 10, das eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe der Aminosäuren 1 bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2 und der Aminosäuren 1 bis 291 der SEQ. ID Nr.: 6 aufweist.
  12. Ein menschliches TRAIL, das durch das DNA-Insert des rekombinanten Vektors, der im Stamm ATCC 69849 hinterlegt ist, kodiert wird.
  13. Ein gereinigtes lösliches TRAIL-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 80% mit einer Sequenz aus der Gruppe identisch ist, die aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL der SEQ. ID Nr.: 2, b) der extrazellulären Domäne des murinen TRAIL von SEQ. ID Nr.: 6, c) einem Fragment der extrazellulären Domäne von (a) oder (b) besteht, wobei das Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren; wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  14. Ein TRAIL-Polypeptid nach Anspruch 13, das eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweist, die aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL (Aminosäuren 39 bis 281 von SEQ. ID Nr.: 2) und b) einem Fragment der genannten extrazellulären Domäne besteht, wobei genanntes Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  15. Ein TRAIL-Polypeptid nach Anspruch 14, das die Sequenz der Aminosäuren x bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2 aufweist, wobei x eine ganze Zahl von 39 bis 95 darstellt.
  16. Ein TRAIL-Polypeptid nach Anspruch 15, das die Aminosäuren 95 bis 281 der SEQ ID Nr.: 2 aufweist.
  17. Ein TRAIL-Polypeptid nach Anspruch 13, wobei genanntes lösliches TRAIL-Polypeptid eine oder mehrere konservative Substitutionen in einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweist, die aus: a) der extrazellulären Domäne des menschlichen TRAIL (Aminosäuren 39 bis 281 der SEQ. ID Nr.: 2) besteht, wobei die extrazelluläre Domäne in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren, und b) einem Fragment der genannten extrazellulären Domäne, wobei das Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren; wobei das konservativ substituierte TRAIL in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  18. Ein Oligomer, das zwei bis drei lösliche TRAIL-Polypeptide nach einem der Ansprüche 13 bis 17 aufweist.
  19. Ein TRAIL-Trimer, das drei lösliche TRAIL-Polypeptide nach Anspruch 16 aufweist.
  20. Ein Antikörper, der mit einem TRAIL-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 17 immunreaktiv ist; oder ein antigen-bindendes Fragment des besagten Antikörpers.
  21. Ein Antikörper nach Anspruch 20, wobei besagter Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  22. Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 21, wobei der besagte Antikörper spezifisch für das menschliche TRAIL-Polypeptid der SEQ. ID Nr.: 2 oder das murine TRAIL-Polypeptid der SEQ. ID Nr.: 6 ist.
  23. Eine isolierte DNA, die ein TRAIL-Polypeptid kodiert, wobei genanntes TRAIL-Polypeptid ein Fragment des menschlichen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 2 oder ein Fragment des murinen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 6 ist; wobei genanntes Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  24. Ein gereinigtes TRAIL-Polypeptid, wobei genanntes TRAIL-Polypeptide ein Fragment des menschlichen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 2 oder ein Fragment des murinen TRAIL-Proteins der SEQ. ID Nr.: 6 ist; wobei genanntes Fragment in der Lage ist, eine Apoptosis von Jurkat-Zellen zu induzieren.
  25. Ein Fusionsprotein, das ein TRAIL-Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 17 bzw. 24 aufweist, das zu einem heterologen Polypeptid verschmolzen ist.
  26. Ein Fusionsprotein nach Anspruch 25, wobei genanntes heterologes Polypeptid Oligomerisation fördert.
  27. Ein Oligomer nach Anspruch 18, das drei lösliche TRAIL-Polypeptide aufweist.
  28. Eine Zusammensetzung, die ein TRAIL-Polypeptid, ein Oligomer oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 19 bzw. 24 bis 27 und ein physiologisch verträgliches Träger- oder Verdünnungsmittel aufweist.
  29. Eine Zusammensetzung, die ein Oligomer nach Anspruch 27 und ein physiologisch verträgliches Träger- oder Verdünnungsmittel aufweist.
  30. Ein TRAIL-Polypeptid, Oligomer oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 19 bzw. 24 bis 27 zur Anwendung in der Humanmedizin.
  31. Ein TRAIL-Polypeptid, Oligomer oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 19 bzw. 24 bis 27 zur Induktion einer Apoptosis von Targetzellen.
  32. Ein TRAIL-Polypeptid, Oligomer oder Fusionsprotein nach Anspruch 31, wobei die besagten Targetzellen Krebszellen sind.
  33. Ein TRAIL-Polypeptid, Oligomer oder Fusionsprotein nach Anspruch 31, wobei die besagten Targetzellen virusinfizierte Zellen sind.
  34. Ein TRAIL-Polypeptid, Oligomer oder Fusionsprotein nach Anspruch 32 bzw. 33, wobei genanntes Oligomer ein Trimer ist.
  35. Ein Antikörper nach Anspruch 20, 21 bzw. 22 zur Anwendung in der Humanmedizin.#
  36. Ein Antikörper nach Anspruch 20, 21 bzw. 22 zur Hemmung der biologischen Aktivität eines TRAIL-Polypeptids.
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