EA003636B1

EA003636B1 - Остеопротегеринсвязующие белки и рецепторы

Info

Publication number: EA003636B1
Application number: EA199900939A
Authority: EA
Inventors: Уильям Дж. Бойл
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2003-08-28
Also published as: JP5001758B2; AU2008202516A1; HK1022330A1; ES2284203T5; AU743257B2; PL190092B1; CA2285746A1; NO995044L; DE69837845T3; AU2005201799B2; PL336311A1; US7923008B2; BR9808545A; SK288559B6; SI0975754T2; EP0975754B2; US20060246064A1; HUP0001400A2; NZ500253A; CZ359899A3

Abstract

Описан новый полипептид, остеопротегеринсвязывающий белок, вовлеченный в созревание остеокластов. Белок идентифицирован на основе его аффинности к остеопротегерину. Также описаны последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид или его фрагмент, аналог или производное, векторы и клетки-хозяева для получения полипептида, способы получения остеопротегеринсвязывающего белка и исследования по связыванию. Изобретение также относится к композициям, способам лечения заболеваний костей, например остеопороза, потери костной массы при артритах и метастазисе, гиперкальциемии и болезни Педжета, и рецепторам остеопротегеринсвязывающего белка. Рецепторы, агонисты и антагонисты могут быть использованы для лечения заболеваний костей.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые вовлечены в дифференцировку остеокластов. Более точно, изобретение относится к остеопротегерин-связывающим белкам, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие белки, векторам экспрессии и клеткамхозяевам для получения белков, а также к методам исследования связывающей способности белков. В объём изобретения также включены композиции и способы лечения заболеваний костей, таких как остеопороз, утрата костной ткани при артритах, болезнь Педжета и гиперкальциемия.

Изобретение также относится к рецепторам остеопротегерин-связывающих белков и способам и композициям для лечения заболеваний костей при использовании рецепторов.

Предпосылки создания изобретения

В жизнеспособных костных тканях существует динамическое равновесие между их образованием и резорбцией. Указанные процессы, в первую очередь, опосредованы двумя типами клеток: остеобластами, которые секретируют молекулы, формирующие органический матрикс кости, и остеокластами, которые обеспечивают рассасывание костного матрикса и растворение солей, входящих в состав кости. У молодых индивидуумов с растущей костной тканью скорость образования костей превышает скорость их резорбции, в то время как у более взрослых индивидуумов скорость резорбции костей превышает скорость их образования. В последнем случае увеличенная частота разрушения костной ткани приводит к уменьшению костной массы и прочности костей, повышенному риску повреждений костей и более медленному и неполному восстановлению переломов костей.

Остеокласты представляют собой большие фагоцитарные многоядерные клетки, которые образуются из гематопоэтических клетокпредшественников в костном мозге. Несмотря на то, что процессы развития и формирования зрелых функционально активных остеокластов изучены недостаточно, считается, что остеокласты созревают в пределах моноцитарно/макрофагальной клеточной линии в ответ на воздействие различных факторов, усиливающих рост. Раннее развитие клеток-предшественников костного мозга с образованием преостеокластов, по-видимому, опосредовано растворимыми факторами, такими, например, как фактор некроза опухолей α (ΤΝΕ-α). фактор некроза опухолей β (ΤΝΡ-β), интерлейкин 1 (ИЛ-1), интерлейкин 4 (ИЛ-4), интерлейкин 6 (ИЛ-6) и фактор ингибирования лейкоза (ФИЛ). В культуре преостеокласты формируются при добавлении макрофагального колониестимулирующего фактора (МС8Р). Указанные факторы воздействуют в первую очередь на ранние этапы развития остеокластов. Практически отсутствуют публикации, посвященные вовлечению полипептидных факторов в конечные стадии образования остеокластов. Однако сообщалось о том, что паратиреоидный гормон стимулирует образование и активность остеокластов, а кальцитонин оказывает противоположный эффект, хотя и менее выраженный.

Недавно был описан новый полипептидный фактор, названный остеопротегерином (ОРС), который отрицательным образом регулирует образование остеокластов ίη νίίτο и ίη νίνο (см. заявки тех же авторов, одновременно рассматриваемые в Патентном ведомстве США, поданные под номерами 08/577,788 22.12.95. и 08/706,945 03.09.96., включенные в настоящее описание в качестве ссылок, а также заявку РСТ, опубликованную под номером XV О 96/26271). ОРС существенно увеличивает плотность костей, у трансгенных мышей и уменьшает потерю костной ткани при введении овариэктомированным крысам. Анализ эффективности воздействия ОРС на образование остеокластов ίη νίίτο выявил, что ОРС не задействован в процессах роста и дифференцировки предшественников моноцитов/макрофагов, но, скорее всего, блокируют дифференцировку остеокластов из предшественников моноцитов/макрофагов. Таким образом, ОРС, по-видимому, специфичен в регулировании интенсивности процессов формирования остеокластов.

ОРС содержит два полипептидных домена, имеющих различные структурные и функциональные особенности. Аминоконцевой домен содержит остатки 22-194 полноразмерного полипептида (Ν-концевой метионин обозначается, как остаток 1), обнаруживая гомологию с другими членами семейства рецептора фактора некроза опухолей (ΤΝΡΒ), в особенности, ΤΝΡΚ.-2, для которых характерна консервативность обогащённых цистеином доменов. Карбокси-концевой домен содержит остатки 194401, не обнаруживая существенной гомологии с какими-либо известными последовательностями. В отличие от других многочисленных членов семейства ΤΝΡΚ, ОРС, по-видимому, является исключительно секретируемым белком и, скорее всего, не синтезируется в мембраноассоциированной форме.

На основании отрицательного регуляторного воздействия ОРС на формирование остеокластов постулировано, что ОРС может связывать полипептидный фактор, вовлеченный в дифференцировку остеокластов и, таким образом, блокировать одну или более конечный стадий образования зрелых остеокластов.

Соответственно, предмет изобретения заключается в том, чтобы идентифицировать полипептиды, взаимодействующие с ОРС. Указанные полипептиды могут играть определенную роль в созревании остеокластов и быть полезными для терапии заболеваний костей.

Краткое описание изобретения

Новый член семейства фактора некроза опухолей был идентифицирован при использовании библиотеки кДНК мыши, экспрессированной в СО8-клетках, и скринингом образовавшихся продуктов с помощью белка слияния ОРС-Рс в качестве аффинной пробы. Новый полипептид представляет собой трансмембранный ОРС-связывающий белок предсказанной длины в 316 аминокислот, содержащий аминоконцевой цитоплазматический домен, трансмембранный домен и карбокси-концевой внеклеточный домен. Заявленные ОРС-связывающие белки могут находиться в мембраносвязанной или растворимой форме.

Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим ОРС-связывающий белок, векторам и клеткам-хозяевам, экспрессирующим полипептид, а также к способу получения рекомбинантного ОРС-связывающего белка.

ОРС-связывающие белки могут быть использованы для определения количества ОРС в биологических образцах, идентификации клеток и тканей, экспрессирующих ОРС-связывающий белок, и идентификации новых членов семейства ОРС и ОРС-связывающего белка. Способы идентификации соединений, которые взаимодействуют с ОРС-связывающим белком, также включены в объем настоящего изобретения. К таким соединениям относятся нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, углеводы, липиды или органические молекулы небольшой мол. массы. Они способны действовать как агонисты или антагонисты ОРС-связывающего белка.

ОРС-связывающие белки вовлечены в дифференцировку остеокластов, а уровень активности остеокластов, в свою очередь, модулирует резорбцию костей. Агонисты и антагонисты ОРС-связывающего белка модулируют формирование остеокластов и резорбцию кости и могут быть использованы для лечения заболевания костей, характеризующихся изменениями в процессах резорбции костей, таких как остеопороз, гиперкальциемия, утрата костной ткани в результате метастазного артрита, иммобилизация или заболевания периодонта, болезнь Педжета, остеопетроз, расшатывание протезов и т. д. В объем изобретения также включены фармацевтические композиции, содержащие ОРСсвязывающие белки и агонисты и антагонисты ОРС-связывающих белков.

При использовании библиотеки кДНК мыши, полученной из клеток костного мозга, были идентифицированы рецепторы ОРСсвязывающих белков, которые связывают флуоресцентно-меченный ОРС-связывающий белок. Рецепторы могут быть использованы для идентификации агонистов и антагонистов, взаимодействующих с ОРС-связывающим белком, что может оказаться полезным для лечения заболеваний костей.

Описание чертежей

Фиг. 1. Приведена структура и последовательность вставки 32Ό-Ρ3, кодирующей ОРСсвязывающий белок. Подчеркнуты трансмембранный домен и сайты аспарагин-связанного гликозилирования.

Фиг. 2. Экспрессия ОРС-связывающего белкав клетках СО8-7, трансфицированных рсДНК/32Э-Р3. Клетки были липофектированны ДНК рсДНК/32Э-Р3 и исследованы на связывание с конъюгатом алкалинфосфазы и антител козы к 1дС1 человека (только вторые антитела), с белком слияния ОРС человека [22-201]-Рс и вторыми антителами или химерным белком слияния внеклеточного домена АТАК, с Рс (кАТАК-Рс). АТАК представляет собой новый белок суперсемейства ТКРК и кАТАК-Рс белок слияния служит контролем для связывания Рсдомена 1дС1 человека и обычного белка, родственного ТДОК, взаимодействующего с маркером 32Ό на поверхности клеток.

Фиг. 3. Показана экспрессия ОРСсвязывающего белка в тканях человека. Приведены результаты Нозерн-блоттинга мРНК из тканей человека (С1ои1есй) при использовании радиоактивно меченной гибридизационной пробы на основе 32Э-Р3. Относительная мол. масса указана слева и выражена в кЬ. Клинообразные стрелки справа отмечают миграцию транскрипта мРНК с приблизительной мол. массой 2.5 кЬ в лимфатических узлах. Очень слабая полоса с той же самой мол. массой также выявляется в печени плода.

Фиг.4. Приведена структура и последовательность вставки рсДНК/1111 ОРС Ьр 1.1, кодирующей ОРС-связывающий белок человека. Подчеркнуты предсказанный трансмембранный домен и сайт аспарагин-связанного гликозилирования.

Рис. 5. Стимуляция развития остеокластов ίη νίΐΓΟ из совместно культивируемых макрофагов костного мозга и 8Т2-клеток, обработанных рекомбинантным ОРС-связывающим белком мыши [158-316]. В культуры вносили различные концентрации ОРС-связывающего белка мыши, составляющие от 1,6 до 500 нг/мг. Через 8-10 дней культуры лизировали и определяли ТКАРактивность. Кроме того, некоторые культуры одновременно обрабатывали рекомбинантным белком ОРС [22-401]-Рс мыши в концентрациях 1, 10, 100, 500 и 1000 нг/мл. ОРС-связывающий белок мыши индуцирует дозо-зависимую стимуляцию образования остеокластов, в то время как ОРС [22-401]-Рс ингибирует образование остеокластов.

Фиг. 6. Стимуляция развития остеокластов из предшественников костного мозга ίη νίίτο в присутствии М-С8Р и ОРС-связывающего белка мыши [158-316]. Костный мозг мыши собирают и культивируют в присутствии 250, 500, 1000 и 2000 Ед/мл М-С8Р. К указанным культурам добавляют различные концентрации ОРСсвязывающего белка [158-316], варьирующие от

1,6 до 500 нг/мл. Развитие остеокластов определят методом ТКАР-анализа в растворе.

Фиг. 7. Остеокласты, развившиеся из костного мозга в присутствии как М-С8Р, так и ОРО-связывающего белка [158-316], обеспечивают резорбцию кости ίη νίΐτο. Клетки костного мозга, обработанные М-С8Р, ОРОсвязывающим белком или обоими факторами вместе, помещали на срезы кости в лунки культуральных планшетов и оставляли для развития в зрелые остеокласты. Полученные культуры окрашивали толуидиновым голубым (левая колонка) или выявляли активность фермента ТКАР гистологическим путем (правая колонка). В культурах, обработанных обоими факторами, формировались остеокласты, способные вызвать эрозию кости, что подтверждалось обнаружением голубых пятен на поверхность кости. Указанное коррелировало с наличием многочисленных крупных многоядерных ТКАРпозитивных клеток.

Фиг. 8. Приведены графики общих уровней ионизированного кальция (Юа) в крови мышей, инъецированных ОРО-связывающим белком, через 51ч после первой инъекции и мышей, получавших конкурентный ОРО. ОРОсвязывающий белок в значительной степени и дозо-зависимым образом увеличивает уровень |Са. ОРО (1 мг/кг/день) полностью блокирует увеличение уровня |Са при введении ОРОсвязывающего белка в дозе 5 мкг/день и частично предотвращает увеличение уровня |Са при введении ОРО-связывающего белка в дозе 25 мкг/день. (*), различия с контрольной обработкой животных (р<0,05). (#), уровень |Са у мышей, получавших ОРО, существенно отличается от уровня ОРО у животных, получавших соответствующую дозу только ОРО-связывающего белка (Р<0,05).

Фиг. 9. Приведены данные радиографических исследований левых бедренной и большеберцовой костей мышей, которым вводили ОРО-связывающий белок в дозах 0,5, 25 или 100 мкг/день в течение 3,5 дней. Обнаруживается дозо-зависимое увеличение плотности кости, наиболее явным образом выявляемое в проксимальном метафизе большеберцовой кости. Эффект особенно заметен при дозе ОРОсвязывающего белка 100 мкг/день.

Фиг. 10. Приведена последовательность кДНК ОПАК и соответствующего белка мыши. Нуклеотидная последовательность имеет размер ~2,1 кЬ, выше неё отмечена транслируемая последовательность из 625 аминокислотных остатков длинной открытой рамки считывания. Подчеркнут гидрофобный сигнальный пептид, жирным шрифтом выделена гидрофобная последовательность (остатки 214-234). Жирным шрифтом также выделены цистеиновые остатки, формулирующие обогащенные цистеином повторяющиеся участки внеклеточного домена.

Фиг. 11. Иммунофлуоресцентное окрашивание связывания ОПАК-Ре с клетками, трансфицированными ОРО-связывающим белком. Клетки СО8-7 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей ОРО-связывающий белок, а затем инкубировали их с Рс1дО человека (верхняя панель), ОПАК-Рс (средняя панель) и ОРОРс (нижняя панель). В качестве вторых антител использовали меченные ФИТЦ антитела козы к Рс1дО человека. Положительно окрашенные клетки выявляли с помощью конфокальной микроскопии.

Фиг. 12. Эффекты ОПАК-Рс на развитие остеокластов из костного мозга мыши ίη νίΐτο. Культуры костного мозга мыши получали, как описано в примере 8, и обрабатывали ОРОсвязывающим белком (5 нг/мл) и С8Р-1 (30 нг/мл). Добавляли ОЭЛК-Рс в различных концентрациях, варьирующих от 65 до 1500 нг/мл. Образование остеокластов исследовали, определяя в культуре ТКАР гистохимическим методом и анализом в растворе через 5 дней.

Фиг. 13. Приведены результаты исследования минеральной плотности костей мыши после введения в течение 4 дней ОПАК-Рс в различных дозах. Мышам вводили ОПАК-Рс путем ежедневных подкожных инъекций в забуференном фосфатами физиологическом растворе. Минеральную плотность большеберцовой кости определяли при фиксации в 70%-ном этиловом спирте в области проксимального метафиза путем периферической количественной компьютерной томографии (РОСТ) (ХСТ-960М, ΝοιΊαηά МсФса1 8у§1ет, Р1 Лιк^η5οη. XVI). Анализировали два перекрестных среза толщиной 0,5 мм, сделанных на расстоянии 1,5 мм и 2,0 от проксимального конца большеберцовой кости (ХМ1СЕ 5.2, 81та1ес, Оегтапу) с целью определения общей минеральной плотности в метафизе. Для определения границы метафиза кости использовали порог отделения мягких тканей 1500. ОПАК-Рс вызывает значительное увеличение минеральной плотности в проксимальном метафизе большеберцовой кости дозозависимым образом. Число животных в группе равно четырем.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к полипептиду, обозначаемому как ОРО-связывающий белок, который специфическим образом связывает ОРО и вовлечен в дифференцировку остеокластов. Клон кДНК, кодирующий указанный полипептид мышиного происхождения, был выделен из библиотеки, полученной из линии 32-Ό миеломоноцитов мыши и введенной в клетки СО8. Затем трансфектанты скринировали на способность связываться с полипептидом слияния ОРО [22-201]-Рс (пример 1). Анализ последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ОРО-связывающий белок, показал, что данный белок является новым членом семейства Т№ и наиболее тесно связан с АОР-1, полипеп7 тидом, предварительно описанным в заявке тех же авторов, одновременно рассматриваемой в Патентном ведомстве США под номером 08/660, 562, которая была подана в указанное ведомство 7 июня 1996 г. (Полипептид, идентифицированный как АСР-1 и обозначаемый ΤΒΑαα. описан \УПсу е! а1., см. 1штиш1у, 3,673682 (1995)). Предполагается, что ОРСсвязывающий белок представляет собой трансмембранный белок типа II, имеющий цитоплазматический домен на амино-концевом участке, трансмембранный домен и карбокси-концевой внеклеточный домен (фиг. 1). Аминоконцевой цитоплазматический домен содержит примерно 1-48 аминокислотные остатки, трансмембранный домен включает примерно 49-69 остатки и внеклеточный домен содержит примерно 70-316 остатки, как показано на фиг. 1 (8ЕО ГО N0: 2). Мембрано-связанный белок специфическим образом связывает ОРС (фиг. 2). Таким образом, ОРС-связывающий белок и ОРС обладают многими свойствами пары лиганд-рецептор, несмотря на то, что, возможно, существуют другие природные рецепторы ОРС-связывающего белка.

Клон ДНК, кодирующий ОРСсвязывающий белок, был изолирован из кДНКовой библиотеки лимфатических узлов. Последовательность человеческого происхождения (фиг. 4) гомологична последовательности мыши. Очищенный растворимый ОРСсвязывающий белок мыши стимулирует образование остеокластов ίη νίίτο и индуцирует гиперкальциемию и резорбцию костей ίη νίνο.

ОРС-связывающий белок в контексте данного изобретения относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность ОРС-связывающего белка млекопитающих, или его фрагменту, аналогу или производному, обладающему, по крайней мере, активностью в отношении связывания ОРС. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения ОРС-связывающий белок имеет мышиное происхождение. В другом случае, ОРСсвязывающий белок представляет собой растворимый белок, имеющий изолированный внеклеточный домен, отдельный от цитоплазматического и трансмембранного доменов. ОРСсвязывающий белок вовлечен в дифференцировку остеокластов и влияет на скорость и интенсивность резорбции костей. Обнаружено, что он стимулирует образование остеокластов и резорбцию костей.

Нуклеиновые кислоты

Изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим ОРСсвязывающие белки. В контексте данного описания понятие нуклеиновая кислота включает кДНК, геномную ДНК, частично или полностью синтетическую ДНК и РНК. Заявленные нуклеиновые кислоты выбраны из группы, включающей:

а) нуклеиновые кислоты, структура которых приведена на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:1) и фиг. 4 (8ЕО ГО МО:3);

б) нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с участками, кодирующими полипептид, нуклеиновых кислот, структура которых приведена на фиг. 1 (8Е0 ГО NО: 1) и фиг. 4 (8Е0 ГО NО:3), и остаются гибридизованными в условиях высокой жесткости;

в) нуклеиновые кислоты, которые являются вырожденными по отношению к нуклеиновым кислотам, охарактеризованным в (а) или (б).

Гибридизация нуклеиновых кислот обычно представляет собой многоступенчатый процесс, который включает первую стадию гибридизации с образованием дуплексов из отдельных цепей, за которой следует вторая стадия, осуществляемая при более жестких условиях, с избирательным получением дуплексов нуклеиновых кислот, имеющих нужную гомологию. Условия проведения первой стадии гибридизации обычно не являются критическими и не такие жесткие, как условия осуществления второй стадии. В целом, вторая стадия гибридизации осуществляется в условиях высокой жесткости, причем указанные условия относятся к такой концентрации солей и температуре, которая примерно на 12-20°С ниже температуры плавления (Т_пл) совершенного гибрида, образованного частью или целыми комплементарными цепями последовательностей, приведенных на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:2) и Фиг. 4 (8Е0 ГО NО:4). Например, условия высокой жесткости могут составлять около 65°С и не более чем 1М Να'. Понятно, что концентрация солей, температура и/или продолжительность инкубирования могут варьировать на первой и второй стадиях гибридизации, так что возможно получение гибридизующихся молекул нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с изобретением. Условия гибридизации нуклеиновых кислот и расчеты Тпл для гибридов нуклеиновых кислот описаны в книге Сэмбрука и др. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, издательство Со1й 8рпп§ НатЬот ЬаЬогаФгу Ргекк, №\ν Уотк (1989).

Заявленные в соответствии с изобретением нуклеиновые кислоты могут гибридизоваться с частью или целыми участками, кодирующими ОРС-связывающий белок, нуклеиновых кислот, структура которых приведена на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:2) и фиг. 4 (8Е0 ГО NО :4), а также представлять собой усеченные или удлиненные аминокислотные последовательности по сравнению с приведенными на указанных рисунках. В объем изобретения включены усеченные или удлиненные аминокислоты, кодирующие белок, который, по крайней мере, обладает способностью связывать ОРС. В одном случае нуклеиновая кислота может кодировать полипептид, содержащий, по крайней мере, около 10 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий, по крайней мере, около 20 аминокислот. Согласно ещё одному варианту осуществления изобретения, нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий, по крайней мере, 50 аминокислот. Гибридизующиеся нуклеиновые кислоты могут также содержать некодирующие последовательности, локализованные на 5'- и/или З'-концевых участках кодирующих областей ОРС-связывающего белка. К некодирующим последовательностям относятся регуляторные участки, ответственные за экспрессию ОРС-связывающего белка, например, промоторы, энхансеры, сайты инициации трансляции, сайты терминациии транскрипции и т. д.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения заявленные нуклеиновые кислоты кодируют ОРС-связывающий белок мыши. Нуклеиновые кислоты кодируют мембрано-связанную форму ОРС-связывающего белка или растворимую форму, которая утратила функциональный трансмембранный домен. Трансмембранный домен ОРС-связывающего белка мыши предположительно содержит аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 1 (8ЕО ΙΌ N0: 1). Трансмембранный домен ОРС-связывающего белка человека предположительно содержит аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 4 (8ЕО ΙΌ N0:3). Замены гидрофобных аминокислотных остатков в указанном домене на нейтральные или гидрофильные аминокислотные остатки, повидимому, нарушит связь белка с мембраной и переведет его в растворимую форму. Кроме того, делеции части или всего трансмембранного домена, как ожидается, также приведут к образованию растворимой формы ОРСсвязывающего белка. Нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные остатки 70-316, как показано на фиг. 1 (8 ЕС ΙΌ N0: 1), или их фрагменты и аналоги соответствуют растворимым формам ОРС-связывающих белков.

В объем изобретения также включены нуклеиновые кислоты, кодирующие усеченные формы растворимых ОРС-связывающих белков. Растворимые формы содержат остатки 69-317, как показано на фиг. 4 (8Е0 ΙΌ N0:3), и соответствующим образом могут быть получены усеченные белки. В одном варианте осуществления изобретения усечения по №концевому участку приводят к получению полипептидов 70-317,71-317,72-317 и т. д. В другом варианте осуществления изобретения усечения нуклеиновых кислот, кодирующих растворимый ОРСсвязывающий белок, ОРСЬр содержащий остатки 69-317, по №концевому участку приводят к получению ОРСЬр [158-317] или, альтернативно, ОРСЬр [ 166-317]. Плазмида рйиОРсЬр 1.1 в клетках Е. со11 штамма ΌΗ10, определяющая синтез ОРС-связывающего белка человека, депонирована в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэриленд, 13 июня 1997 г.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть использованы для выявления в биологических образцах последовательностей, кодирующих ОРС-связывающий белок. В частности, последовательности могут быть использованы для скрининга кДНКовых и геномных библиотек с целью выявления последовательностей, кодирующих полипептиды, родственные ОРСсвязывающему белку, особенно других биологических видов. Нуклеиновые кислоты также могут использоваться для модулирования уровней ОРС-связывающего белка с применением технологии на основе антисмысловых последовательностей или при экспрессии ίη νίνο. Получение трансгенных животных, экспрессирующих ОРС-связывающий белок, может оказаться полезным для получения полипептида и тестирования ίη νίνο его биологической активности.

Векторы и клетки-хозяева

Заявленные в соответствии с изобретением нуклеиновые кислоты могут быть связаны с последовательностями ДНК таким образом, чтобы обеспечить экспрессию биологически активного ОРС-связывающего белка. Последовательности, необходимые для экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области исследований, и включают промоторные и энхансерные последовательности для инициации синтеза РНК, сайты терминации транскрипции, сайты связывания рибосом для инициации синтеза белка и лидерные последовательности, обеспечивающие секрецию. Последовательности, направляющие экспрессию и секрецию ОРС-связывающего белка, могут быть гомологичными, т.е. представлять собой последовательности, идентичные или сходные с геномными последовательностями, обеспечивающими экспрессию и секрецию ОРС-связывающего белка, или быть гетерологичными. Для экспрессии ОРСсвязывающего белка в клетках-хозяевах могут быть использованы различные плазмиды (см., например, Методы в энзимологии, ν. 185, Соеййе1, Ό. V. ей., Асайетю Рге§8 (1990)). Для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих предпочтительно использование плазмиды рО8Ка. описанной в заявке XVО 90/14363. Для экспрессии в бактериальных клетках-хозяевах предпочтительно использование плазмид, содержащих 1их-промотор (см. заявку тех же авторов, рассматриваемую одновременно в Патентном ведомстве США, поданную 22 декабря 1995 г.). Кроме того, известны векторы для тканеспецифической экспрессии ОРС-связывающего белка в организме трансгенных животных. Для экспрессии ОРС-связывающего белка в клетках человека в целях терапии ίη νίνο могут быть использованы векторы на основе ретровирусов и аденовирусов (см. заявку VО 86/00922).

В объем изобретения также включены эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие ОРС-связывающий белок. Клетки-хозяева включают клетки бактерий, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих. ОРСсвязывающий белок может быть получен с помощью трансгенных животных, например, мышей и коз. Плазмиды и векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, заявленные в соответствии с изобретением, встраивают в подходящие клетки-хозяева при использовании методик трансфекции или трансформации, известных специалисту в данной области исследований. Клетки-хозяева могут содержать ДНК-последовательности, кодирующие ОРС-связывающий белок, приведенные на фиг. 1, или их участки, например, кодирующие внеклеточный домен или цитоплазматический домен. Нуклеиновые кислоты, кодирующие ОРС-связывающие белки, могут быть модифицированы путем замещений кодонов, чтобы обеспечить оптимальную экспрессию в определенных клетках-хозяевах. По крайней мере, некоторые кодоны могут представлять собой так называемые предпочтительные кодоны, которые не изменяют аминокислотной последовательности и часто обнаруживаются в высоко экспрессируемых генах. Однако, понятно, что замены кодонов, оптимизируют экспрессию, и ограничиваются введением предпочтительных кодонов. Примеры предпочтительных клеток-хозяев млекопитающих для экспрессии ОРС-связывающего белка включают, но не ограничиваются указанными, СОЗ, СНОЙ-. 293 и 3Т3. Предпочтительными клетками-хозяевами бактерий являются клетки ЕхсйспсЫа сой.

Полипептиды

Изобретение также относится к ОРСсвязывающему белку, как продукту экспрессии экзогенной ДНК-последовательности в прокариотических или эукариотических клетках, т. е. ОРС-связывающий белок может рассматриваться как рекомбинантный ОРС-связывающий белок. К экзогенной ДНК-последовательности относятся кДНК, геномная ДНК и синтетическая ДНК-последовательность. ОРСсвязывающий белок может быть продуктом экспрессии в клетках бактерий, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих или в бесклеточной системе трансляции. ОРСсвязывающий белок, получаемый в бактериальных клетках, имеет Ν-концевой метионин. Изобретение также относится к способу получения ОРС-связывающего белка, включающему выращивание прокариотических или эукариотических клеток, трансформированных или трансфицированных нуклеиновыми клетками, кодирующими ОРС-связывающий белок, и выделение полипептидных продуктов экспрессии указанных нуклеиновых кислот.

Изобретение также относится к полипептидам, представляющим собой ОРС-связывающие белки млекопитающих, а также их фрагментам, аналогам или производным. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ОРС-связывающий белок является ОРС связывающим белком человека. Фрагмент ОРСсвязывающего белка относится к полипептиду, имеющему делению одной или более аминокислот, сохраняющему способность к связыванию ОРС. Указанные фрагменты могут иметь делеции, затрагивающие аминоконцевой, карбоксиконцевой или внутренние участки полипептида. Фрагменты ОРС-связывающего имеют, по меньшей мере, около 10 аминокислот, около 20 аминокислот или, по меньшей мере, около 50 аминокислот. В предпочтительных случаях ОРС-связывающий белок имеет делению одной или более аминокислот в трансмембранном домене (аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 1) или, альтернативно, одной или более аминокислот на амино-концевом участке и/или трансмембранном домене (аминокислотные остатки 1-49, как показано на фиг. 1). В другом случае ОРС-связывающий белок представляет собой растворимый белок, содержащий, например, аминокислотные остатки 69-316 или 70-316, или Ν-концевые, или С-концевые усеченные формы данного белка, сохраняющие ОРС-связывающую активность. ОРС-связывающий белок может быть растворимым белком человека, как показано на фиг. 4, содержащим аминокислотные остатки 69-317, приведенные на фиг. 4, а также его усеченными формами, например, 70-517, 71-517, 71-317, 72-317 и т.д. В предпочтительном случае растворимый ОРСсвязывающий белок человека включает остатки 69-317, а также представляет собой Ν-концевые усеченные формы ОРСЬр [158-317] и ОРС [166317].

Аналог ОРС-связывающего белка относится к полипептиду, имеющему замещения или добавления одной или более аминокислот, причем такой полипептид сохраняет ОРСсвязывающую активность. Такие аналоги могут иметь замещения или добавления аминокислот в любом участке полипептида. Предпочтительные аналоги относятся к аналогам растворимой формы ОРС-связывающих белков. Фрагменты или аналоги могут иметь природное происхождение, например, как продукты аллельных вариантов соответствующих генов или сплайсированных вариантов мРНК, или же быть сконструированными с помощью технологий манипулирования нуклеиновыми кислотами и синтезом нуклеиновых кислот, известных специалистам в данной области исследований. Полипептиды могут иметь аминоконцевой метиониновый остаток или не иметь такого остатка.

В обьем настоящего изобретения также включены производные ОРС-связывающего белка, которые представляют собой полипептиды, подвергшиеся посттрансляционным модификациям (например, добавлениям Ν-связанных или О-связанных углеводных цепей, процессингу Ν-концевых или С-концевых участков), прикреплению химических соединений к остову аминокислот, химическим изменениям Ν связанных или О-связанных углеводных цепей и добавлению Ν-концевого остатка метионина в результате экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах. В частности, химически модифицированные производные ОРС-связывающего белка, обладающие дополнительными преимуществами, например, повышенной стабильностью, большим временем циркуляции или повышенной иммуногенностью, также включены в объем изобретения. В частности, белки могут быть модифицированы с помощью водорастворимых полимеров, например, полиэтиленгликоля и его производных (см., например, патент И8 4 179 337). Химические соединения, используемые для модификации белков и получения их производных, могут быть выбраны из водорастворимых полимеров, например, полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы, декстрана, поливинилового спирта и т. д. Полипептиды могут быть модифицированы случайным образом или по определенным позициям в пределах молекулы и к ним могут быть присоединены одна, две, три или более химических групп. Полипептиды могут быть также модифицированы по определенным участкам, например, амино-концевым участкам, например, выбранному лизиновому или аргининовому остаткам. Другие модификации могут включать присоединение выявляемой метки, скажем, флуоресцентной, ферментной, изотопной или аффинной для обеспечения детекции или выделения белка.

К химерам ОРС-связывающего белка относятся полипептиды, включающие полную аминокислотную последовательность ОРСсвязывающего белка или её часть, слитую с гетерологичной аминокислотной последовательностью. Такие химеры также включены в объем изобретения. Гетерологичная последовательность может включать любую последовательность, которая обеспечивает способность белка слияния связывать ОРС. В предпочтительном случае карбокси-концевой внеклеточный домен ОРС-связывающего белка сливают с гетерологичной последовательностью. К таким последовательностям относятся гетерологичные цитоплазматические домены, генерирующие альтернативные внутриклеточные сигналы, последовательности, усиливающие олигомеризацию, например, Ре-участок 1дС, последовательности ферментов, представляющих собой полипептидные метки, последовательности аффинных зондов, например, обеспечивающие распознавание комплекса антиген-антитело.

Полипептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, выделяют и очищают из тканей и клеточных линий, экспрессирующих ОРС-связывающий белок, экстрагируют из лизатов или кондиционированной ростовой среды, или трансформированных клетокхозяев, экспрессирующих ОРС-связывающий белок. ОРС-связывающий белок может быть получен из миеломоноцитарной клеточной линии 32-Ό мыши (АТСС СКл-11346). ОРСсвязывающий белок человека или кодирующие его нуклеиновые кислоты могут быть выделены из лимфатического узла человека или ткани печени плода. Выделенный ОРС-связывающий белок свободен от сопутствующих белков человека или других компонентов клеток.

Изобретение также относится к способу очистки ОРС-связывающего белка из природных источников (например, тканей и клеточных линий, которые в норме экспрессируют ОРСсвязывающий белок), а также из трансфицированных клеток-хозяев. Способы очистки могут включать одну или более стандартных стадий, подходящих для получения белка определенной чистоты. Хроматографическая стадия может включать ионообменную хроматографию, гельфильтрацию, гидрофобные взаимодействия, обратнофазовую хроматографию, хроматофокусирование, аффинную хроматографию, хроматографию, основанную на антителах к ОРСсвязывающему белку или аффинном комплексе биотин-стрептавидин.

Антитела

В объем изобретения также включены антитела, специфически связывающиеся с заявленными полипептидами. Антитела могут быть получены иммунизацией животных полноразмерным ОРС-связывающим белком, растворимыми формами ОРС-связывающего белка или их фрагментами. Заявленные антитела могут быть моноклональными или поликлональными, рекомбинантными, например, химерными антителами, в которых константные участки легких и тяжелых цепей антител мыши замещены последовательностями антител человека, или СКО-привитыми антителами, в которых только области, определяющие комплементарность, имеют мышиное происхождение. Заявленные антитела могут быть антителами человека, полученными, например, иммунизацией трансгенных животных, способных продуцировать антитела человека (см., например, XVО 93/12227). Антитела могут оказаться полезными для выявления ОРС-связывающего белка в биологических образцах, обеспечивая идентификацию клеток или тканей, продуцирующих белок. Кроме того, антитела, взаимодействующие с ОРС-связывающим белком и блокирующие его соединение с другими веществами, могут иметь терапевтическое значение для модулирования дифференцировки остеокластов и резорбции кости.

Антитела к ОРС-связывающему белку могут быть полезны для лечения заболеваний костей, например, остеопороза и болезни Педжета. Антитела могут быть тестированы на взаимодействие с ОРС-связывающим белком в присутствии или в отсутствие ОРС и исследованы на их способность ингибировать лиганд (ОРС связывающий белок), опосредующий остеокластогенез и/или резорбцию кости. Показано, что пептиды сами по себе способны действовать как антагонисты взаимодействия лиганд-рецептор и ингибировать опосредованный лигандом остеокластогенез. Пептиды ОРС-связывающего белка, полученные в соответствии с изобретением, могут быть использованы в указанных целях.

Композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество ОРСсвязывающего белка, заявленного в соответствии с изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество агониста или антагониста ОРС-связывающего белка. Понятие терапевтически эффективное количество означает такое количество, которое обеспечивает терапевтический эффект в отношении определенного заболевания при данном способе применения препарата. Композиции могут быть в жидкой или лиофилизированной форме и включать разбавитель (Трис-буфер, ацетатный или фосфатный буфер), имеющий различные значения рН и ионной силы, растворитель, например, Твин или полисорбат, носители, например, сывороточный альбумин человека или желатин, консерванты, например, тимерозал или бензольный спирт, и антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту или метабисульфит натрия. Выбор определенной композиции будет зависеть от множества факторов, в том числе природы заболевания, пути введения препарата и необходимых фармакокинетических параметров. Более подробно компоненты, которые могут быть использованы для приготовления фармацевтических композиций, описаны в книге Ροιηίηβίοη'δ Рйагтасеибса1 8с1спес5, 18'¹' еб. А. К. Семпаго, еб. Магк, ΕαδΙοη, РА (1980).

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения заявлены композиции, включающие растворимые ОРС-связывающие белки. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим растворимые ОРСсвязывающие белки, модифицированные с помощью водорастворимых полимеров для увеличения растворимости, стабильности, периода полужизни в плазме крови и биодоступности. Композиции могут также представлять собой липосомы, содержащие ОРС-связывающий белок, микроэмульсии, мицеллы или везикулы, обеспечивающие контролируемую доставку действующего начала в течение определенного периода времени. Растворимый ОРС-связывающий белок может быть включен в микрочастицы, подходящие для способа введения через легкие.

Заявленные композиции могут быть введены путем инъекции, как подкожной, внутривенной или внутримышечной, а также оральным, назальным, легочным или ректальным путем. Выбор способа введения зависит от множества факторов и может быть легко осуществлен специалистом в данной области исследований.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество заявленных нуклеиновых кислот вместе с фармацевтически приемлемым адъювантом. Композиции на основе нуклеиновых кислот могут быть пригодны для доставки части или всего кодирующего ОРС-связывающий белок участка и/или фланкирующих участков в клетки и ткани при осуществлении терапевтических подходов при использовании антисмысловых нуклеиновых кислот.

Способы применения

ОРС-связывающие белки могут быть использованы в различных способах, предназначенных для выявления ОРС и описания взаимодействий с ОРС. В целом, исследования включают инкубирование ОРС-связывающего белка с биологическим образцом, содержащим ОРС, в условиях, обеспечивающих связывание ОРС с ОРС-связывающим белком, и измерение степени связывания. ОРС может быть в очищенной форме или входить в состав композиций, таких, так жидкости тела или культуральная среда. Исследования могут носить как качественный, так и количественный характер, в последнем случае определяются параметры связывания (кинетические и аффинные константы) ОРС и ОРС-связывающего белка, а также уровни биологически активного ОРС в композициях. Исследования могут быть полезны для оценки степени связывания ОРС с фрагментами, аналогами или производными ОРС-связывающего белка и для идентификации новых ОРС и ОРСсвязывающих белков, принадлежащих соответствующим семействам.

Взаимодействие ОРС с ОРС-связывающим белком может быть осуществлено различным образом, например при использовании клеток, клеточных мембран, методов исследования в растворе и методов иммуносвязывания. В целом, следовые количества меченного ОРС инкубируют с образцами ОРС-связывающего белка в течение определенного периода времени, затем измеряют количество связавшегося ОРС фильтрованием, электрохемилюминесценцией (ЕСа, система ОК1СЕ фирмы 1СЕЩ, методами, основанными на использовании клеток, или методами иммунологического связывания. Могут быть использованы технологии на основе гомогенных методов исследования, например, радиоактивных (8РА, Атетейат) и зависимой от времени флуоресценции (ΗΤΚΡ, Раскагб). Связывание определяется мечением ОРС или антитела к ОРС радиоактивными изотопами (¹²⁵1, ³⁵8, ³Н), флуоресцентными красителями (флуоресцеин), а также комплексами лантанида (Еи3⁺) с хелатами или криптатами или рутения (К.и2⁺) с орбипиридилом. Понятно, что выбор метки зависит от используемой системы определения. Альтернативно, ОРО может быть модифицирован с помощью невыявляемой эпитопной метки (например, биотина, пептидов, Ηίδ₆, тус) и связан с белками, такими как стептавидин, антитело к пептиду или антитело к белку, которые соединены с детектируемой меткой, как описано выше.

В альтернативном способе ОРО-связывающий белок может быть определен непосредственным образом с помощью поликлональных или моноклональных антител к ОРОсвязывающему белку при осуществлении методов иммунологического связывания. Дополнительные формы ОРО-связывающих белков, содержащих эпитопные метки, описанные выше, могут быть использованы при осуществлении жидкофазных методов и методов иммунологического связывания.

В объем изобретения также включены способы идентификации соединений, взаимодействующих с ОРО-связывающим белком. Способы включают инкубирование ОРО-связывающего белка с тестируемым соединением в условиях, обеспечивающих их связывание, и измерение интенсивности связывания. Соединение может быть, по существу, очищенным или присутствовать в исходной смеси. Соединения, взаимодействующие с ОРО-связывающим белком, могут представлять собой нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, углеводы, липиды или органические соединения небольшой мол. массы. Они могут быть дополнительно охарактеризованы по своей способности увеличивать или уменьшать активность ОРО-связывающего белка, что позволяет отнести их к агонистам или антагонистам указанного вещества.

ОРО-Связывающие белки также могут быть использованы для идентификации внутриклеточных белков, взаимодействующих с цитоплазматическим доменом при использовании способа скрининга на основе двойных дрожжевых гибридов. Гибридные конструкты, содержащие ДНК, кодирующую Ν-концевые 50 аминокислот ОРО-связывающего белка, сливают с ДНК ОАа4-связывающего домена дрожжей с получением двугибридной плазмиды. Положительные клоны, отобранные при скрининге, могут быть далее охарактеризованы для идентификации взаимодействующих белков. Полученная информация может оказаться полезной для оценки передающего сигналы внутриклеточного механизма, ассоциированного с ОРО-связывающим белком, и определения внутриклеточных мишеней для новых лекарственных препаратов, модулирующих резорбцию кости.

ОРО-связывающий белок может быть использован для лечения состояний, характери зующихся избыточной плотностью кости. Наиболее распространенным заболеванием такого рода является остеопетроз, при котором генетический дефект обуславливает увеличение костной массы и обычно приводит к смерти на первых нескольких месяцах жизни. Остеопетроз предпочтительно лечится путем введения растворимого ОРО-связывающего белка.

Изобретение также относится к модуляторам (агонистам и антагонистам) ОРОсвязывающего белка и способу их получения. Модулятор ОРО-связывающего белка способен увеличивать или уменьшать по крайней мере один вид активности, ассоциированной с ОРОсвязывающим белком, например, способность связывать ОРО или некоторые другие взаимодействующие молекулы, или же регулировать созревание остеокластов. Обычно, агонист или антагонист может быть кофактором, например, белком, пептидом, углеводом, липидом или веществом небольшой мол. массы, который взаимодействует с ОРО-связывающим белком и регулирует его активность. Возможные полипептидные антагонисты включают антитела, которые реагируют с растворимой или мембраносвязанной формами ОРО-связывающего белка, а также с растворимыми формами ОРОсвязывающего белка, которые содержат весь внеклеточный домен ОРО-связывающего белка или часть такого домена. К молекулам, которые регулируют экспрессию ОРО-связывающего белка, обычно относятся нуклеиновые кислоты, комплементарные нуклеиновым кислотам, кодирующим ОРО-связывающий белок, которые действуют как антисмысловые регуляторы экспрессии.

ОРО-связывающий белок вовлечен в контролирование формирования зрелых остеокластов, клеток, которые в первую очередь задействованы в резорбции кости. Увеличение скорости резорбции кости (превышающей скорость образования костной ткани) может привести к различным заболеваниям костей под общим названием остеопенические, к которым относятся остеопороз, остеомиелит, гиперкальциемия, остеопения, вызванная хирургическим вмешательством или введением стероидов, болезнь Педжета, остеонекроз, потеря костной массы, обусловленная ревматоидным артритом, периодонтоз, иммобилизация, расшатывание протезов или остеолитический метастаз. Наоборот, уменьшение скорости резорбции кости приводит к остеопетрозу, заболеванию, для которого характерно увеличение плотности кости. Агонисты и антагонисты ОРО-связывающего белка, используемые для лечения остеопений, могут вводиться по отдельности или в комбинации с терапевтически эффективным количеством агентов, усиливающего рост кости, например, морфогенетических факторов кости, обозначенных ВМР-1 - ВМР-12, трансформирующих ростовых факторов β и членов семейства транс формирующих ростовых факторов, факторов роста фибробластов ЕСЕ-1 - ЕСЕ-10, ингибиторов интерлейкина-1, ингибиторов ΤΝΕα, паратиреоидного гормона, простагландинов серии Е, бифосфонатов и минеральных соединений, увеличивающих плотность костей, скажем, фтора и кальция. Антагонисты ОРС-связывающих белков могут быть особенно полезны для лечения остеопений.

Рецепторы остеопротегерин-связывающих белков

Изобретение также относится к рецепторам, которые взаимодействуют с ОРСсвязывающими белками. Более точно, изобретение относится к рецепторам дифференцировки и активации остеокластов (ОБАН, от англ, оЧеос1аЧ бйГегепйайоп апб асйуайоп гесер!ог). ОБАН представляет собой трансмембранный полипептид, обнаруживающий наиболее высокую степень гомологии с СБ40, членом семейства рецепторов ΤΝΕ. Последовательность нуклеотидов, кодирующая ОБАК мыши, и соответствующий полипептид, приведены на фиг. 10. Человеческий гомолог ОБАК мыши может быть легко получен путем гибридизационного скрининга кДНК человека или геномной библиотеки с помощью последовательности нуклеотидов, приведенной на фиг. 10. Процедуры клонирования ОБАК человека сходны с таковыми, описанными в примере 5 в отношении клонирования ОРС-связывающих белков. Человеческий гомолог полипептида, приведенного на фиг. 1, описан Апбегкоп е! а1. (№11иге 390, 175-179 (1997)) и обозначен здесь как КАNΚ. КАNΚ охарактеризован как трансмембранный белок типа I, гомологичный членам семейства ΤΝΕрецептора и вовлеченный в функционирование дендритных клеток.

Доказательства взаимодействия ОБАК и ОРС-связывающего белка приведены в примере 13. Растворимая форма ОБАК (белок слияния ОБАК-Ес) предотвращает созревание остеокластов ш уйго (фиг. 12) и увеличивает плотность костей у нормальных мышей после подкожной инъекции препарата. Полученные результаты согласуются с обнаруженным взаимодействием ОРС-связывающего белка с ОБАК и его активацией для обеспечения созревания остеокластов.

Развитие остеокластов, а также скорость и интенсивность резорбции кости регулируются взаимодействием ОРС-связывающего белка и ОБАК. Соединения, которые уменьшают или блокируют взаимодействие ОРС-связывающего белка и ОБАК, являются потенциальными антагонистами активности ОРС-связывающего белка и могут прерывать развитие остеокластов, что приводит к уменьшению резорбции кости. Альтернативно, соединения, усиливающие взаимодействие ОРС-связывающего белка и ОБАК, являются потенциальными агонистами, которые обеспечивают развитие остеокластов и усиливают резорбцию кости.

Различные способы могут быть использованы для измерения степени взаимодействия ОРС-связывающего белка и ОБАК т уйго при использовании очищенных белков. Указанные способы могут применяться для скрининга соединений, способных увеличивать или уменьшать скорость или интенсивность связывания ОБАК ОРС-связывающим белком. В одном типе исследований белок ОБАК может быть иммобилизован путем прикрепления ко дну лунок планшеты для микротитрования. Радиоактивно меченный ОРС-связывающий белок (например, иодированный ОРС-связывающий белок) и тестируемое(ые) соединение(я) затем могут быть добавлены в лунки в определенном порядке или одновременно. После инкубирования лунки отмывают и обсчитывают с помощью сцинтилляционного счетчика радиоактивности для определения интенсивности связывания ОБАК ОРС-связывающим белком в присутствии тестируемого вещества. Обычно, вещество тестируется в различном диапазоне концентраций, и для адекватной оценки результатов тестирования используется набор контрольных лунок, не содержащих одного или более соединений, входящих в набор для тестирования. Альтернативный указанному способ подразумевает обратное расположение белков, т.е. иммобилизацию ОРС-связывающего белка в лунках планшета для микротитрования, инкубирование его с тестируемым соединением и радиоактивно меченным ОБАК и определение интенсивности связывания с ОБАК (см., например, Главу 18 Сиггеп! Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду. Аич1Ье1 е! а1., ейч, 1обп ^йеу & 8опз, Νονν Уогк, ΝΥ [1995]).

Как альтернатива радиоактивному мечению, ОРС-связывающий белок или ОБАК могут быть конъюгированы с биотином и наличие биотинилированного белка затем может быть определено при использовании стрептавидина, связанного с ферментом, например, пероксидазой хрена [НКР] или щелочной фосфатазой [АР] колорометрическим путем или флуоресцентным мечением стрептавидина. Антитела, направленные к ОРС-связывающему белку или ОБАК, конъюгированные с биотином, также могут быть использованы и затем выявлены после инкубирования с фермент-связанным стрептавидином, соединенным с АР или НКР.

ОРС-связывающий белок и ОБАК могут также быть иммобилизованы связыванием с агарозными или акриловыми шариками или другими типами такого рода инертных носителей. Комплекс субстрат-белок может быть помещен в раствор, содержащий комплементарный белок и тестируемое соединение, после инкубирования шарики могут быть преципитированы путем центрифугирования, и степень связывания между ОРС-связывающим белком и

ОЭАВ может быть определена с помощью методов, описанных выше. Альтернативно, комплекс субстрат-белок может быть иммобилизован на колонке, а тестируемое вещество и комплементарный белок затем пропущены через колонку. Образование комплекса между ОРСсвязывающим белком и ОЭАВ затем может быть определено с помощью описанных выше методов, например, радиоактивным мечением, связыванием с антителами и т. д.

Другой тип исследования ίη νίίΓο, полезного для идентификации соединения, усиливающего или ослабляющего образование комплекса ОИАК/ОРС-связывающий белок, использует детекторную систему на основе поверхностного плазмонового резонанса, например, системы В1асоге (Рйагтааа, Р|5са1а\\'ау, NΥ). Система В1асоге может быть использована в соответствии с рекомендациями производителя. Указанный метод подразумевает обязательное ковалентное связывание ОРС-связывающего белка или ОЭАВ с покрытым декстраном сенсорным чипом, который локализован в детекторе. Тестируемое соединение и другой комплементарный белок могут быть затем инъецированы в камеру, содержащую сенсорный чип, как одновременно так и последовательно, а количество связывающегося комплементарного белка может быть определено на основе изменения в мол. массе, которое физическим образом ассоциировано с покрытой декстраном стороной чипа; измерение мол. массы определяется с помощью детекторной системы.

В некоторых случаях необходима одновременная оценка двух или более тестируемых соединений на возможность использования для усиления или ослабления образования комплекса ОИАК/ОРС-связывающий белок. В таких ситуациях исследования, описанные выше, могут быть легко модифицированы добавлением указанного(ых) тестируемого(ых) соединения(ий) как одновременно, так и последовательно, к первому тестируемому веществу. Остальные этапы исследований осуществляют, как описано выше.

Исследования ίη νίΐΐΌ, такие как описано выше, могут быть успешно использованы для быстрого скрининга большого числа соединений, воздействующих на образование комплекса между ОИАВ и ОРС-связывающим белком. Исследования могут быть автоматизированы с целью выявления соединений, экспрессируемых в бактериофагах, синтетических пептидов и химическим путем синтезированных библиотек.

Соединения, которые усиливают или ослабляют образование комплекса ОИАЯ/ОРСсвязывающий белок, могут также быть скринированы в культуре клеток с помощью клеток и клеточных линий, экспрессирующих ОИАК. Клетки и клеточные линии могут быть получены из организма любого млекопитающего, но, предпочтительно, их получают из организма человека или других приматов, собак или грызунов. Клетки, экспрессирующие ОИАК, например остеокласты, могут быть выделены обогащением из клеточных популяций других типов путем аффинной хроматографии при использовании известных методик. Присоединение ОРС-связывающего белка к клеткам, экспрессирующим ОИАК, оценивают в отсутствие тестируемых соединений, а интенсивность связывания определяют, например, путем проточной цитометрии при использовании биотинилированных антител к ОРС-связывающему белку. Альтернативно, культура остеокластов человека или мыши может быть получена, как описано в примере 8, а тестируемые соединения могут быть оценены на их способность блокировать созревание остеокластов, стимулируемое СР8-1 и ОРС-связывающим белком. Исследования, проводимые в клеточной культуре, могут быть преимущественным образом использованы для дальнейшей оценки соединений, которые обнаружили положительный результат в описанных выше экспериментах по связыванию белка.

Соединения, которые усиливают или уменьшают взаимодействие между ОРСсвязывающим белком и ОИАК, также могут быть оценены на активность ίη νί\Ό путем их введения мышам с последующим измерением плотности костей при использовании сканирующей денситометрии или радиографии. Методики измерения плотности костей описаны в опубликованной заявке VО 97/23614 и примере 13.

Изобретение также относится к соединениям, которые уменьшают или блокируют взаимодействие между ОРС-связывающим белком и ОИАК, и относятся к антагонистам образования остеокластов. Такие соединения обычно подразделяются на две группы. В одну группу входят соединения, которые происходят из ОРС-связывающего белка или взаимодействуют с ОРС-связывающим белком. Такие соединения описаны выше. Во вторую группу включены соединения, которые происходят из ОИАК или взаимодействуют с ОИАК Примерами соединений, которые служат антагонистами ОИАК, могут служить нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, углеводы, липиды или органические вещества небольшой мол. массы.

Антагонистами ОИАК могут быть вещества, которые соединяются с одним или более сайтами связывания ОРС-связывающего белка во внеклеточном домене ОИАВ и уменьшают или полностью блокируют образование комплекса. Те участки ОИАК, которые могут быть вовлечены в образование комплекса с ОРСсвязывающим белком, могут быть идентифицированы по аналогии со структурой гомологичного комплекса ТМРв/ТИР-В55, описанного Ваннег е1 а1. (Се11 73, 431-445 (1993)). Например, структура комплекса ЮТв/ТМР-К.55 может быть использована для идентификации участков ОРС-связывающего белка и ОЭЛК. которые вовлечены в образование комплекса. Затем могут быть сконструированы соединения, которые преимущественным образом связываться с участками, вовлеченными в образование комплекса, и действуют как антагонисты. В одном случае, описанном далее в примере 11, конструируются пептидные антигены, которые используются для получения антител к ОРСсвязывающему белку, которые действуют как антагонисты. Ожидается, что указанные антитела будут связываться с ОРС-связывающим белком и блокировать образование комплекса с ОПАК. В аналогичном случае пептидные антигены, полученные на основе структуры ОПАК, могут быть использованы для генерации антител ОПАК, действующих как антагонисты.

Антагонисты ОПАК могут также связываться с ОПАК в участках, отстоящих на некотором расстоянии от сайта(ов) связывания ОРСсвязывающего белка, и вызывать конформационные изменения в ОПАК-полипептиде, что приводит к ослаблению образования комплекса с ОРС-связывающими белками или формированию непродуктивного комплекса.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, антагонист представляет собой растворимую форму ОПАК, утратившую функционально активный трансмембранный домен. Растворимые формы ОПАК могут иметь делецию одной или более аминокислот в трансмембранном домене (аминокислоты 214-234, показанные на фиг. 10). Растворимые полипептиды ОПАК могут содержать часть внеклеточного домена или весь домен и обладать способностью к связыванию ОРС-связывающего белка. Необязательно, растворимая форма ОПАК может быть частью химерного белка, когда часть внеклеточного домена ОПАК или весь домен сливают с гетерологичной аминокислотной последовательностью. В одном случае гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой Рс-участок 1дС человека.

Модуляторы (агонисты и антагонисты) ОПАК могут быть использованы для предотвращения или лечения остеопений, в том числе остеопороза, остеомиелита, гиперкальциемии при злокачественных опухолях, остеопений, вызванной хирургическим вмешательством или введением стероидов, болезни Педжета, остеонекроза, потери костной ткани, обусловленной ревматоидным артритом, парадонтоза, иммобилизации, расшатывания протезов и остеолитического метастаза. Агонисты и антагонисты ОПАК, используемые для лечения остеопений, могут вводиться как сами по себе, так и в сочетании с терапевтически эффективным количеством агента, усиливающего рост кости, в том числе, морфогенетических факторов кости, обозначенных ВМР-1-ВМР-12, трансформирующего ростового фактора в(ТСР-в) и членов семей ства ТСР-β, ростовых факторов фибробластов РСР-1-РСР-10, ингибиторов интерлейкина-1, ингибиторов ТЫР-а, паратиреоидного гормона, простагландинов серии Е, бифосфорнатов, эстрогенов, 8ЕКМ§ и минеральных веществ, увеличивающих плотность кости, например, фтора и кальция. Антагонисты ОПАК особенно полезны для лечения остеопений.

Приведенные ниже примеры предназначены для более полной иллюстрации изобретения и не ограничивают его объема.

Пример 1. Идентификация клеточной линии, которая является источником получения ОРС-связывающего белка.

Остеопротегерин (ОРС) отрицательным образом регулирует остеокластогенез ίη νίίτο и ίη νίνο. Поскольку ОРС представляет собой ТЫРК-родственный белок, скорее всего, он будет взаимодействовать с членом семейства ТЫРродственных белков, опосредуя его эффекты. За одним исключением, все известные члены суперсемейства ТЫР представляют собой трансмембранные белки типа II, экспрессируемые на клеточной поверхности. Для идентификации источника ОРС-связывающего белка используют рекомбинантные белки слияния ОРС-Рс в качестве иммунопроб для скрининга ОРСсвязывающих белков, локализованных на поверхности клеток различных линий и, в первую очередь, гематопоэтических клеток.

Клеточные линии, которые были выращены как адгезивные культуры ίη νίίτο, обрабатывали следующим образом. Клетки помещали в 24-луночные планшеты для культивирования тканей (Ра1сон) и затем выращивали до состояния монослоя, которое оценивалось как 80%-ная величина. Затем ростовую среду удаляли и прикрепившиеся культуры отмывали фосфатным буферным раствором (РВ8) (С1Ьсо), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки (РС8). Рекомбинантные белки слияния ОРС [22194]-Рс мыши и ОРС [22-201]-Рс человека (см. заявку И8 08/706, 945, поданную 3 сентября 1996 г) по отдельности разбавляли до концентрации 5 мкг/мл в РВ8, содержащем 1% РС8, добавляли к культурам и инкубировали в течение 45 мин при 0°С. Затем раствор белка слияния ОРС-Рс удаляли и клетки отмывали РВ8РС8, как описано выше. Затем культуры обрабатывали конъюгированными с фикоэритрином Р(аЬ')-фрагментами антител козы к 1дС человека в качестве вторых антител (8ои1йет Вю1ес1то1оду А88ос1а1е8 Са1. # 2043-09), разведенными в РВ8-РС8. Через 30-45 мин инкубирования при 0°С раствор удаляли и культуры отмывали, как указано выше. Затем клетки исследовали с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа для выявления клеточных линий, экспрессирующих на своей поверхности ОРСсвязывающий белок.

Суспензионные клеточные культуры анализировали сходным образом со следующими модификациями: разбавитель и отмывающий буфер представляли собой не содержащий кальция и магния фосфатный буферный раствор с добавлением 1% ЕСЗ. Клетки собирали на стадии экспоненциально реплицирующихся культур в ростовой среде, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в концентрации 1 х10⁷ кл/мл в 96-луночном микротитровальном планшете для культуры тканей (Еа1соп). Клетки последовательно инкубировали с рекомбинантными белками слияния ОРС-Ес и вторыми антителами, как описано выше, и затем клетки отмывали, центрифугируя их в промежутках между каждой стадией отмывания. Клетки исследовали с помощью флуоресцентно активированного клеточного сортера (ЕАСЗ) при использовании системы ВссЮп Э|ск|п5оп ЕАСксап.

Указанный подход позволил выявить миеломоноцитарную клеточную линию 32Ό мыши (АТСС СК а 11346), экспрессирующую поверхностные молекулы, которые детектируются с помощью белков слияния ОРС [22-194]-Ес мыши и ОРС [22-201]-Ес человека. Вторые антитела сами по себе не связываются с поверхностью клеток 32Ό так же, как и очищенные фрагменты Ес 1дС1, свидетельствуя о том, что связывание ОРС-Ес белков слияния обусловлено ОРС, причем рекомбинантный белок ОРС [22-401 ] мыши или человека дозо-зависимым образом конкурирует с ОРС за связывание ОРС-Ес белков. Таким образом, участок ОРС, необходимый для проявления его биологической активности, способен специфическим образом связываться с поверхностными молекулами клеток 32Ό.

Пример 2. Экспрессия клонированного ОРС-связывающего белка мыши.

Библиотеку кДНК получают из мРНК клеток 32Ό и лигируют в вектор экспрессии для клеток млекопитающих рсЭХА 3.1 (+) (Ιηνίΐτοдеп, Зап Э|едо, СА). Клетки 32Ό, поддерживаемые на экспоненциальной фазе роста в присутствии рекомбинантного интерлейкина-3, собирали и выделяли общую фракцию РНК экстрагированием кислым раствором, содержащим гуанидин, тиоцианат, фенол и хлороформ (Оюшс/ущку апй ЗассЫ. Апа1. Вюсйет. 162, 156-159, (1987)). Фракцию поли (А⁺) мРНК получали из общей фракции РНК путем адсорбции на бусах ЭупаЬеайк Ойдо ЙТ25 (Эупа1 Согр) и последующего элюирования с бус, как это рекомендовано производителем. Библиотеку кДНК, праймированную ойдо ЙТ, получали при использовании Зирегкспр! Р1а8Ш1й ЗуЫеш (С1Ь1о ΒΚα, СаййегкЬигд, Мй) согласно рекомендациям производителя. Полученную кДНК полностью переваривали рестрикционными эндонуклеазами За1 I и №1 I и затем фракционировали гельхроматографией с исключением по размеру. Отбирали фракцию с наибольшей мол. массой и лигировали в полилинкерный участок плазмидного вектора рсЭХА 3.1 (+) (Iиν^ΐ^οдеи, Зап Όίедо, СА). Указанный вектор содержит промотор СМУ выше сайта множественного клонирования и обеспечивает высокий уровень экспрессии продуктов в эукариотических клетках. Затем библиотеку вводили путем электропорации в компетентные клетки Е. Сой (Е1ес!гоМАХ ΌΗ10Β, С1Ь1о, ΝΥ) и титровали на агаре аВ, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Затем библиотеку разделяли на отдельные пулы, примерно 1000 клонов на пул, и 1,0 мл культуры каждого пула выращивали в течение 16-10 ч при 37°С. Плазмидную ДНК из каждой культуры выделяли с помощью набора О1адеп О1а\\'е11 96 ИЙга Р1а8Ш1й Κίΐ (каталожный номер #16191)в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Упорядоченные пулы экспрессионной библиотеки кДНК 32Ό были по отдельности с помощью липофекции введены в клетки СОЗ-7 и затем исследовали способность клеток захватывать ОРС-связывающий белок на своей поверхности. Для этого клетки помещали с плотностью 1х10⁶ кл/мл в щестилуночные планшеты для культуры тканей (Сойаг) и культивировали в течение ночи в среде ЭМЕМ (С1Ьсо) содержащей 10% ЕСЗ. Примерно 2 мкг плазмидной ДНК из каждого пула разбавляли в 0,5 мл свободной от сыворотки среды ЭМЕМ и стерилизовали центрифугированием на 0,2-мкг колонке Зрт-Х (Сойаг). Одновременно 10 мкл липофектамина (ЫроГесЕппте, ЫГе Тесйпо1од1е5, каталожный номер # 18324-012) добавляли в отдельную пробирку, содержащую 0,5 мл свободной от сыворотки среды ЭМЕМ. Смешивали растворы ДНК и липофектамина и проводили инкубирование при комнатной температуре в течение 30 мин. Культуры клеток СОЗ-7 затем отмывали в свободной от сыворотки среде ЭМЕМ, добавляли к культурам комплексы ДНК-липофектин и осуществляли инкубирование в течение 2-5 ч при 37°С. После указанного периода среду удаляли и замещали средой ЭМЕМ, содержащей 10% ЕСЗ. Затем клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С.

Чтобы выявить культуры, экспрессирующие ОРС-связывающий белок, ростовую среду удаляли и клетки отмывали раствором РВЗ-ЕСЗ. В каждую лунку добавляли 1,0 мл РВЗ-ЕСЗ, содержащего 5 мкг/мл белка слияния ОРС [22201]-Ес человека и осуществляли инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем клетки трижды отмывали раствором РВЗЕСЗ и затем фиксировали РВЗ, содержащем 2% параформальдегида и 0,2% глутаральдегида в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем культуры один раз отмывали РВЗ-ЕСЗ и затем инкубировали при 65°С в течение 1 ч погруженными в раствор РВЗ-ЕСЗ. Далее культуры охлаждали и отсасывали раствор РВЗ-ЕСЗ. Затем культуры инкубировали с антителами козы к 1дС человека (Ес-участкам), конъюгиро ванными с щелочной фосфатазой (81ОМА, каталожный номер # А-9544), при комнатной температуре в течение 3 мин и затем отмывали трижды 20 мМ Трис-С1 (рН 7,6) и 137 мМ №С1. Иммунные комплексы, которые формируются во время указанных стадий, выявляли путем исследования активности щелочной фосфатазы при использовании субстратного набора Рак! Кеб ТК/А8-МХ (Р|егсе, каталожный номер # 34034), как это рекомендовано производителем.

С помощью данного подхода скринировали в целом около 300, 000 независимых клонов кДНК 32Ό, соответствующих 300 трансфицированным пулам по 1000 клонов в каждом. Одну лунку идентифицировали как содержащую клетки, обладающие способностью специфически взаимодействовать с белком слияния ОРОРс. Этот пул подвергали двум последовательным этапам повторной селекции и выделяли определенный плазмидный клон 32Ό-Ε3 (фиг.

1) . Плазмидную ДНК 32Э-А3 затем вводили путем трансфекции в клетки СО8-7, которые окрашивали конъюгированными с ФИТЦ антителами козы к 1дО человека (только вторые антитела), белком слияния ОРО [22-201]-Рс человека и вторыми антителами или белком слияния АТАК-Рс (АТАК также известен как НУЕМ; Моп!дотегу е! а1., Се11 87,427-436 (1996)) (Рис.

2) . Только вторые антитела не связываются с клетками СО8-7/32О-Р3, так же, как и белок слияния АТАК-Рс. Только белок слияния ОРОРс связывается с клетками СО8-7/32О-Р3, свидетельствуя о том, что 32Ό-Ε3 кодирует ОРОсвязывающий белок, экспрессируемый на поверхности соответствующих клеток.

Пример 3. Последовательность ОРОсвязывающего белка.

Клон 32Ό-Ε3, выделенный, как описано выше, содержит кДНК-вставку около 2,3 кЬ, которую подвергали секвенированию в обоих направлениях с помощью автоматического секвенатора ДНК-последовательностей Арркеб В|О5У51ет5 373 А (рптег-бпуеп Тад буе 1егтша!ог геасбопк, АррНеб Вю8у81етк) согласно рекомендациям производителя. Расшифрованную аминокислотную последовательность сравнивали с последовательностями ДНК базы данных с помощью программы РА8ТА (ОСО, Висконсинский Университет) и анализировали на присутствие длинных открытых рамок считывания (ЬОКР'к) с помощью системы δίχ-^ау ореп геабтд Ггате (Ргате) (ОСО, Висконсинский Университет). Была идентифицирована ЬОКР размером в 316 аминокислотных остатков (ак), начинающаяся с метионина, в подходящей ориентации, которой предшествует 5'нетранслируемый участок размером около 150 п.о. 5'-нетранслируемый участок содержит в пределах рамки стоп-кодон, расположенный выше предсказанного стартового кодона. Это свидетельствует о том, что структура плазмиды 32Ό-Γ3 соответствует её способности использо вать промоторный участок СМУ для того, чтобы направлять экспрессию продукта, состоящего из 316 ак, в клетках млекопитающих.

Предсказанную последовательность ОРОсвязанного белка затем сравнивали с известными последовательностями существующей базы данных при использовании модифицированной версии программы РА8ТА (Реагкоп, Ме111. Епхуто1. 183, 63-98 (1990)). Затем аминокислотную последовательность анализировали на присутствие специфических структур, свойственных всем известным членам суперсемейства фактора некроза опухолей (ТОТ¹) при использовании метода сравнивая профилей последовательностей ОпЬккоу е1 а1. (Ргос. №И. Асаб 8сг И8А 83, 4355-4359 (1987)), модифицированного ЬиеШу е! а1. (Рго!ет 8ск 3,139-146 (1994)). Повидимому, существует значительная гомология между ОРО-связывающим белком и определенными членами суперсемейства ΊΝΓ. ОРОсвязывающий белок мыши, по-видимому, наиболее тесно связан с гомологичными лигандами ТКА1Ь и СЭ40 мыши и человека. Дальнейший анализ последовательности ОРО-связывающего белка выявил значительную степень соответствия суперсемейству ТNР с высоким Ζ-счетом 19.46.

Аминокислотная последовательность ОРО-связывающего белка содержит возможный гидрофобный трансмембранный домен, который начинается с М49 и простирается до Ь69. На основе такой конфигурации в отношении метионинового стартового кодона предсказано, что ОРО-связывающий белок является трансмембранным белком типа II с коротким Νконцевым внутриклеточным доменом и более длинным С-концевым внеклеточным доменом (фиг. 4). Это характерно для всех известных членов суперсемейства ТNР, за исключением лимфотоксина альфа (Ν ада 1а апб ОоШет, 8с1епсе 267,1449-1456 (1995)).

Пример 4. Экспрессия мРНК ОРО-связывающего белка.

Многочисленные Нозерн-блоты тканей человека (С1оп1есй, Ра1о А1!о, СА) обрабатывали пробой, представляющей собой 32Ό-Γ3 рестрикционный фрагмент, меченный ³²Р-бСТР, для определения размеров транскрипта в тканях человека и выявления характера экспрессии. Нозерн-блоты предгибридизовали в растворе, содержащем 5Х 88РЕ, 50% формамида, 5Х раствор Денхардта, 0,5%-ный δΌδ и денатурированную ДНК спермы лосося в концентрации 100 мкг/мл, в течение 2-4 ч при 42°С. Затем блоты гибридизовали в растворе, содержащем 5Х 88РЕ, 50% формамида, 2Х раствор Денхардта, 0,1%-ный δΌδ, денатурированную ДНК спермы лосося в концентрации 100 мкг/мл и меченую пробу в концентрации 5 нг/мл, в течение 18-24 ч при 42°С. Затем блоты отмывали в 2Х 85С в течение 10 мин при комнатной температуре, в

IX 88С в течение 10 мин при 50°С и далее в 0,5Х 88С в течение 10-15 мин.

Используя пробу, полученную на основе кДНК мыши, в результате гибридизации в жестких условиях в лимфатических узлах была обнаружена преобладающая фракция мРНК с относительной мол. массой около 2,5 кЬ (фиг. 3). Слабый сигнал, соответствующий МРНК с той же самой мол. массой, был обнаружен и в печени плода. В других исследованных тканях не было обнаружено транскриптов ОРСсвязывающего белка. Полученные данные подтверждают, что экспрессия мРНК ОРСсвязывающего белка строго ограничена тканями человека. Они также подтверждают, что выделенный клон кДНК по размеру очень близок к природному транскрипту и свидетельствуют о том, что клон 32Ό-Ρ3 является полноразмерным.

Пример 5. Молекулярное клонирование ОРС-связывающего белка человека.

Человеческий гомолог ОРС-связывающего белка экспрессируется в виде мРНК приблизительной мол. массы 2,5 кЬ в периферических лимфатических узлах человека и выявляется путем гибридизации с кДНКовой пробой мыши в строгих условиях. ДНК, кодирующую ОРСсвязывающий белок человека, получают скринингом библиотеки кДНК лимфатических узлов человека как в рекомбинантных бактериофаговых бляшках, так и в трансформированных бактериальных колониях с помощью гибридизационных методов (8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 Со1й 8рпп§ НагЬог Ргекк, №\ν Уогк (1989)). В указанных целях фаговую или плазмидную библиотеку кДНК скринировали с помощью радиоактивно меченных проб, полученных из клона 32Ό-Ρ3 ОРСсвязывающего белка мыши. Пробы использовали для скрининга нитроцеллюлозных фильтров, отпечатанных с рассеянных на чашки библиотечных клонов. Указанные фильтры предгибридизовали и затем гибридизовали в условиях, описанных в примере 4, и очищали кДНК ОРСсвязывающего белка человека. Вставки, полученные из клонов ОРС-связывающего белка человека, секвенировали и анализировали, как описано в примере 3.

Поли А⁺ РНК из лимфатических узлов человека (С1оп1ес11. 1пс., Ра1о А1!о, СА) анализировали на присутствии ОРС-Ьр транскриптов, как ранее описано в заявке США 08/577, 788, поданной 22 декабря 1995 г. Нозерн-блоты указанного образца РНК, обработанные пробой в жестких условиях гибридизации, в качестве которой служил меченный ³²Р ОРС-Ьр мыши, выявляли наличие транскриптов ОРС-Ьр человека. Затем на основе мРНК лимфатических узлов при использовании набора Зирегкспр! (С1ВСО Ь1£е Тесйпо1од1е8, СаййегкЬегд, ΜΌ) синтезировали праймированную олиго-йТ библиотеку кДНК, как описано в примере 2. Полученную кДНК отбирали по размеру и фракцию с высо кой мол. массой лигировали в плазмидный вектор рсДНК 3.1 (+) (1пу|1годеп, 8ап П1едо, СА). Электрокомпетентные клетки Е. сой ΌΗ 10 (С1ВСО Ы£е Тесйпо1од1е8, СаййегкЬегд, ΜΌ) трансформировали и 1 х 10⁶ устойчивых к ампициллину трансформантов скринировали гибридизацией колоний, используя в качестве пробы ОРС-связывающий белок мыши.

Был выделен плазмидный клон рйиОРСЬр1.1 кДНК возможного ОРС-связывающего белка человека, содержащий вставку размером 2,3 кЬ. Полученная последовательность нуклеотидов вставки рйиОРСЬр-1.1 обнаружила около 8085% гомологии с последовательностью кДНК ОРС-связывающего белка мыши. Трансляция последовательности кДНК-вставки выявила наличие длинной открытой рамки считывания, которая предположительно кодирует полипептид размером 317 ак (фиг. 4). Сравнение полипептидов ОРС-Ьр человека и мыши показывает, что они примерно на 87% идентичны. Это свидетельствует о высокой консервативности указанного белка в процессе эволюции. ДНК ОРСсвязывающего белка человека и аминокислотная последовательность ОРС-Ьр не обнаружены в банке генов, и не выявлено гомологии с Е8Тпоследовательностями. Как последовательность мышиного гомолога, последовательность ОРСсвязывающего белка человека обнаруживает высокое сходство со всеми членами суперсемейства цитокинов ΤΝΡα.

Пример 6. Клонирование и бактериальная экспрессия ОРС-связывающего белка.

Для получения различных форм ОРСсвязывающих белков мыши была использована РСВ-амплификация с парами праймеров и матрицами, описанными ниже. Один из праймеров каждой пары вводит ТАА стоп-кодон и уникальный Хйо I - или 8ас II - сайт за карбоксиконцевым участком гена. Другой праймер каждой пары вводит уникальный № I - сайт, Νконцевой метионин и оптимизированные кодоны для амино-концевого участка гена. РСВ и термосайклинг проводят с помощью стандартной технологии рекомбинантных ДНК. РСВпродукты очищают, расщепляют ферментами и встраивают в уникальные сайты № I и Хйо I или 8ас II вектора рАМС21 (АТСС № 98113), которым трансформируют фототрофные клетки Е. сой 393 или 2596. Другие обычно используемые векторы экспрессии для Е. сой и клеткихозяева также подходят для осуществления экспрессии. После трансформации клоны отбирают, выделяют плазмидную ДНК и определяют последовательность вставки ОРС-связывающего белка.

ОРС-связывающий белок мыши рАМС21 [75-316]

Указанный конструкт содержит 242 ак в длину и имеет следующие Ν-концевые и Сконцевые остатки: ΝΗ₂-ΜοΙ (75)-Л8р-Рго-Л8пАгд.....С1п-А8р-11е-А§р (316)-сОоН.

Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32В-А3, и в качестве пары праймеров для проведения РСК и клонирования указанного генного конструктора служат олигонуклеотиды # 1581-72 и # 1581-76.

1581-72: 5'-СТТСТССТСАТАТССАТССАААСССТАТТТСТСААСА САССАСТСАСТССТТ-3' (8Е0 ГО N0:5)

1581-76: 5'-ТАСССАСТССССССТТАСТСТАТСТССТСААСТТТСА-3' (8Е0 ГО N0:6)

ОРС-связывающий белок мыши рАМС21 [95-316]

Указанный конструкт содержит 223 ак в длину и имеет следующие Ν-концевые и Сконцевые остатки: NΗ₂-Меΐ-Η^8 (95)-С1и-А§пА1а-С1у.....С1п-А8р-11е-А§р (316)-СООН. Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32Э-Е3. и в качестве пары праймеров для РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды #1591-90 и #1591-95.

1591-90: 5'-АТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТССАТСАА ААСССАССТСТССАС-3' (8Е0 ГО №:7)

1591-95: 5'-ТАТССССССАТССТССАСТТАСТСТАТСТССТСААС ТТТСАА-3' (8Е0 ГО N0:8)

ОРС-связывающий белок мыши рАМС21 [107-316]

Указанный конструкт содержит 211 ак в длину и имеет следующие Ν-концевые и Сконцевые остатки: ИН₂-Ме1-8ег (107)-С1и-А§рТЬг-Ьеи.....С1п-А8р-11е-А§р (316)-СООН.

Матрицей для осуществления РКС служит рсДНК/320-Рс, и в качестве пары праймеров для проведения РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1591-93 и 1591-95.

1591-93: 5'-АТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТСТСТСАА САСАСТСТСССССАСТСС-3' (8Е0 ГО N0:9)

1591-95: 5'-ТАТССССССАТССТССАСТТАСТСТАТСТССТСААС ТТТСАА-3' <81:0 ГО N0:10)

ОРС-связывающий белок мыши рАМС21 [118-316]

Указанный конструкт содержит 199 ак в длину и имеет следующие И-концевые и Сконцевые остатки: NΗ₂-Меΐ (118)-Ьу§-С1п-А1аРНе-С1п.....СЫ-Акр-Пе-Акр (316)-С00Н.

Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32Э-Е3, и в качестве пары праймеров для проведения РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1591-94 и # 1591-95.

1591-94: 5'-АТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТСАААСА АССТТТТСАСССС-3' (8Е0 ГО N0:11)

1591-95: 5'-ТАТССССССАТССТССАСТТАСТСТАТСТССТСААСТ ТТСАА-3' (8Е0 ГО №: 12 )

ОРС-связывающий белок мыши рАМС 21 [128-316]

Указанный белок мыши содержит 190 ак в длину и имеет следующие ^концевые и Сконцевые остатки: НН₂-Ме1-Ру8 (128)-С1и-ЬеиС1п-Н18.....С1п-А8р-11е-А§р (316)-СООН.

Матрицей для осуществления РКС служит рсДНК/23Э-Е3, и в качестве пары праймеров для проведения РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1591-91 и # 1591-95.

1591-91: 5'-АТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТСА ААСААСТССАССАСАТТСТС-3' (8Е0 ГО N0:13)

1591-95: 5'-ТАТССССССАТССТССАСТТАСТСТАТСТСС ТСААСТТТСАА-3' (8Е0 ГО N0:14)

ОРС-связывающий белок мыши рАМС 21 [137-316]

Указанный конструкт содержит 181 ак в длину и имеет следующие ^концевые и Сконцевые остатки: NΗ₂-Меΐ-С1η (137)-Агд-Рйе8ег-С1и.....С1и-А8р-Пе-А8р (316)-СООН.

Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32Э-Е3, и в качестве пары праймеров для проведения РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1591-92 и 1591-95.

1591-92: 5'-АТТТСАТТСТАСААССАССААТААСАТАТСС АСССТТТСТСТССТССТССА-3' (8Е0 ГО N0:15)

1591-95: 5'-ТАТССССССАТССТССАСТТАСТСТАТСТСС ТСААСТТТСАА- 3' (8Е0 ГО N0:16)

0РС-связывающий белок мыши рАМС 21 [146-316]

Указанный конструкт содержит 171 ак в длину и имеет следующие ^концевые и Сконцевые остатки: NΗ₂-Меΐ (146)-С1и-С1у-8егТгр...С1п-А8р-11е-А§р (316)-СООН. Матрицей для осуществления РСК служит 0РСсвязывающий белок мыши рАМС 21 [75-316], описанный выше, и для проведения РСК и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1600-98 и # 1581-76.

1600-98: 5'-СТТСТССТСАТАТССААССТТСТТССТТССАТСТСС СССА-3' (8Е0 ГО №: 17 )

1581-76: 5'-ТАСССАСТССССССТТАСТСТАТСТССТСААСТТТ

СА-3' (8Е0 ГО N0:18)

0РС-связывающий белок мыши рАМС 21 [156-316]

Указанный конструкт содержит 162 ак в длину и имеет следующие ^концевые и Сконцевые остатки: НН₂-Ме1-Лгд (156)-С1у-Ьу§Рго О1п-А5р-Пе-А5р (316)-СООН.

Матрицей для осуществления РКС служит 0РС-связывающий белок мыши рАМС 21 [ 158316], описанный ниже, и для проведения РКС и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды # 1619-86 и # 1581-76.

1619-86: 5'-СТТСТССТСАТАТСССТССТАААССТСААССТСААС САТТТССА-3' (8Е0 ГО N0:19)

1581-76: 5'-ТАСССАСТССССССТТАСТСТАТСТССТСААСТТТС А-3' (8Е0 ГО N0:20)

0РС-связывающий белок мыши рАМС 21 [158-316]

Указанный конструкт содержит 160 ак в длину и имеет следующие Ν-концевые и Сконцевые остатки: НН₂-Ме1-Бу8 (158)-Рго-О1иА1а.....О1п-Акр-11е-Акр (316)-СООН. Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32Э-Б3. и для проведения РКС и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды #1581-73 и #1581-76.

1581-73: 5'-ОТТСТССТСАТАТОАААССТОААОСТСААССАТТТ

ОСАСАССТСАССАТСААТ- 3 ' (8Е0 ΙΌ ΝΘ:21)

1581-76: 5'-ТАСОСАСТССОСООТТАОТСТАТОТССТОААСТТТО А-3' (8Е0 ГО ΝΘ: 22)

ОРО-связывающий белок мыши рАМО 21 [166-316]

Указанный конструкт содержит 52 в длину и имеет следующие Ν-концевые и С-концевые остатки: НН₂-Ме1-Н18 (166)-Ьеи-Тйг-Пе.....О1пАкр-Не-Акр (316)-СООН. Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32Э-Б3. и для проведения РСК и клонирования указанного конструкта служат олигонуклеотиды # 1581-75 и # 1581-76.

1581-75: 5'-ОТТСТССТСАТАТОСАТТТААСТАТТААСОСТОСАТ

СТАТСССАТСОООТТСССАТАААОТСАСТ-3' (8Е0 ГО ΝΘ:23) 1581-76: 5'-ТАСОСАСТССОСООТТАОТСТАТОТССТОААСТТТО А- 3 ' (8Е0 ГО ΝΘ: 24)

ОРО-связывающий белок мыши рАМО 21 [168-316]

Указанный конструкт содержит 150 ак в длину и имеет следующие Ν-концевые и Сконцевые остатки: НН₂-Ме1-Т11г (168)-11е-АкпА1а.....О1п-Акр-11е-Акр (316)-СООН.

Матрицей для осуществления РСК служит рсДНК/32И-Е3, и для проведения РСК и клонирования указанного конструкта олигонуклеотиды # 1581-74 и # 1581-76.

1581-74: 5'-ОТТСТССТСАТАТОАСТАТТААСОСТОСАТСТАТСС

САТСОООТТСССАТАААОТСАСТ-3' (8Е0 ГО ΝΘ:25)

1581-76: 5'-ТАСОСАСТССОСООТТАОТСТАТОТССТОААСТТТО А-3' (8Е0 ГО ΝΘ:26)

Понятно, что охарактеризованные выше конструкты приведены здесь в качестве примеров, и специалист в данной области исследований может легко получить другие формы ОРОсвязывающего белка с помощью раскрытых в описании методологических подходов.

Рекомбинантные бактериальные конструкты ОРО-связывающего белка мыши рАМО 21 [75-316], [95-316], [107-316], [118-316], [128316], [137-316], [158-316] были клонированы, определены их ДНК-последовательности и после индукции были выявлены уровни экспрессии рекомбинантных генных продуктов. Все конструкты продуцировали такие уровни рекомбинантных генных продуктов, которые визуально определялись в результате электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8 (8И8-РАОЕ) и последующего окрашивания с помощью Кумасси грубых клеточных лизатов. Выращивание трансформированных клеток Е.

сой 393 или 2596, индукцию экспрессии ОРОсвязывающего белка и выделение телец включения осуществляли, как описано в заявке XV О 97/23614. Очистка ОРО-связывающих белков из телец включения требует их солюбилизации и ренатурации, которые могут быть осуществлены специалистом в данной области исследований с помощью известных методик. Обнаружено, что рекомбинантный ОРО-связывающий белок мыши [158-316] главным образом продуцируется в нерастворимой форме, однако, 40% выявляется в растворимой фракции. Рекомбинантный белок очищают из растворимой фракции, как описано ниже, и определяют его биологическую активность.

Пример 7. Очистка рекомбинантного ОРОсвязывающего белка мыши [158-316].

Замороженные бактериальные культуры, экспрессирующие ОРО-связывающий белок мыши [158-316] оттаивали и ресуспендировали в 20 мМ Трис-НС1, рН 7,0, 10мМ ЭДТА. Затем клеточные суспензии (20% вес/объем) гомогенизировали путем трехкратного пропускания через микрогомогенизатор. Суспензию лизированных клеток центрифугировали в роторе 1А14 при 10,000 об/мин в течение 45 мин. 8И8-РАОЕ выявил полосу с примерной мол. массой около 18 кДа в тельцах включения и супернатанте. Затем растворимую фракцию наносили на колонку Рйагтас1а 4РР с 8Р Сефарозой, уравновешенную 10 мМ МЕ8, рН 6,0. ОРОсвязывающий белок элюировали в градиенте 00,4 М №1С1 в МЕ8, рН 6,0, в 20 объемах колонки. Затем фракции, содержащие ОРОсвязывающий белок, наносили на колонку АВХ ВакегЬопб, уравновешенную 20 мМ МЕ8, рН 6,0. ОРО-связывающий белок элюировали в градиенте 15 СУ 0-0,5 М №1С1 в МЕ8, рН 6,0. Конечный продукт имел степень гомогенности более 95%, как было определено 8И8-РАОЕ. Νконцевое секвенирование выявило следующую последовательность: Ме1-Ьу8-Рго-О1и-А1а-О1пРго-Рйе-А1а-Н18, которая соответствовала предсказанной последовательности полипептида, начинающегося с остатка 158 (инициаторный метиониновый остаток).

Относительная мол. масса белка, определенная 808-РАСЕ. не изменялась в результате восстановления.

Пример 8. Биоактивность ίη νίΐτο рекомбинантного растворимого ОРО-связывающего белка.

Предварительно было показано, что рекомбинантный ОРО-белок блокирует зависимое от витамина Ό3 образование остеокластов из предшественников костного мозга и селезенки в исследовании формирования остеокластов, описанном в заявке США 08/577, 788. Поскольку ОРО-связывающий белок связывает ОРО и является новым членом ΊΝΡ-семейства лигандов, он может служить потенциальной мишенью тестирования биоактивности ОРО. Рекомби нантный растворимый ОРС-связывающий белок [158-316], соответствующий минимальному коровому ΤΝΡ-подобному домену, был исследован на способность модулировать дифференцировку остеокластов из предшественников остеокластов. Клетки костного мозга были выделены из бедренной кости взрослой мыши и обработаны М-С8Р. Неприкрепившуюся фракцию совместно культивировали с клетками 8Τ2 в присутствии и в отсутствие витамина Ό3 и дексаметазона. Как предварительно показано, остеокласты развиваются только из совместных культур, содержащих стромальные клетки (8Τ2), витамин Ό3 и дексаметазон. Рекомбинантный растворимый ОРС-связывающий белок добавляли в различных концентрациях, варьирующих от 0,16 до 500 нг/мл, и созревание остеокластов выявляли исследованием 'ГКАР в растворе и путем визуального наблюдения. ОРСсвязывающий белок эффективно стимулировал дифференцировку и созревание остеокластов дозо-зависимым образом с половинным максимальным эффектом при концентрации 1-2 нг/мл. Указанное позволяет предположить, что данный белок действует как потенциальный индуктор остеокластогенеза ίη νίίτο (фиг. 5). Действие ОРС-связывающего белка блокируется рекомбинантным ОРС (фиг. 6).

Для выяснения того факта, способен ли ОРС-связывающий белок замещать строму и добавленные стероиды, культуры устанавливали при использовании М-С8Р в различных концентрациях для усиления роста предшественников остеокластов, и к культурам добавляли различные количества ОРС-связывающего белка. Как показано на фиг. 6, ОРС-связывающий белок дозо-зависимым образом стимулирует ΤКАΡ-активность и интенсивность стимуляции зависит от уровня добавленного М-С8Р, позволяя предположить, что оба указанных фактора совместно необходимы для развития остеокластов. Для подтверждения последнего наблюдения с точки зрения биологической активности культуры помещали на срезы коры кости быка и тестировали действие М-С8Р и ОРСсвязывающего белка как вместе, так и по отдельности. Как показано на фиг. 7, ОРСсвязывающий белок в присутствии М-С8Р стимулирует образование крупных, положительных по ТОАР остеокластов, которые вызывают эрозию поверхности кости, приводя к появлению ямок. Таким образом, ОРС-связывающий белок действует как фактор стимуляции (дифференциации) остеокластогенеза. Это позволяет предположить, что ОРС блокирует развитие остеокластов, подавляя ОРС-связывающий белок.

Пример 9. Активность ίη νίνο рекомбинантного растворимого ОРС-связывающего белка.

На основе исследований ίη νίίτο был сделан вывод о том, что рекомбинантный ОРСсвязывающий белок мыши [158-316], продуци руемый в клетках Е. отН является эффективным индуктором развития остеокластов из миелоидных предшественников. Для подтверждения действия данного белка ίη νίνο самцов мышей ΒΌΡ1 в возрасте 4-5 недель (Сйат1е8 Жег ΕαΕοгаЮпех) подкожно инъецировали ОРСсвязывающим белком [158-316] дважды в день в течение 3 дней и утром четвертого дня (дни 0, 1, 2 и 3). Пять групп животных (η=4) получали один носитель или 1, 5, 25 или 100 мкг ОРСсвязывающего белка в день. Дополнительные 5 групп мышей (η=4) получали указанные выше дозы носителя или ОРС-связывающего белка [158-316] и, кроме того, Рс-ОРС-[22-194] человека в дозе 1 мг/кг/день (примерно 20 мкг/день) путем однократной ежедневной подкожной инъекции. Общее содержание в крови ионизированного кальция определяли до начала эксперимента в день 0 через 3-4 ч после первой ежедневной инъекции ОРС-связывающего белка [158-316] в дни 1, 2 и 3. Через 4 ч после последней инъекции в день 3 мышей умерщвляли и проводили радиографию.

Рекомбинантный ОРС-связывающий белок [158-316] вызывает существенное увеличение в крови ионизированного кальция через 2 дня после его введения в дозах 5 мкг/день и выше (фиг. 8). Тяжесть гиперкальциемии свидетельствует об эффективной индукции активности остеокластов, приводящей к усиленной резорбции кости. Конкурентное введение ОРС ограничивает гиперкальциемию при дозах ОРСсвязывающего белка [158-316] 5 и 25 мкг/день, но не 100 мкг/день. Животных также исследовали радиографией для того, чтобы определить влияние ОРС-связывающего белка на минеральную плотность костей, что видно в рентгеновских лучах (фиг. 9).

Рекомбинантный ОРС-связывающий белок [158-316], вводимый в течение 3 дней, уменьшал плотность в проксимальном участке большеберцовой кости мыши дозо-зависимым образом. Редукция плотности костей особенно явно выявлялась у мышей, получавших ОРСсвязывающий белок в дозе 100 мкг/день, подтверждая, что тяжелая гиперкальциемия у данных животных вызвана усиленной резорбцией костей, что приводит к высвобождению кальция из скелета. Приведенные данные четко показывают, что ОРС-связывающий белок [158-316] действует ίη νίνο как индуктор резорбции костей, вызывая системную гиперкальциемию, а рекомбинантный ОРС корригирует указанные эффекты.

Пример 10. Клонирование и экспрессия растворимого ОРС-связывающего белка в клетках млекопитающих.

Полноразмерный клон ОРС-связывающего белка мыши и человека может быть экспрессирован в клетках млекопитающих, как ранее описано в примере 2. Альтернативно, клоны кДНК могут быть модифицированы так, чтобы коди ровать секретируемые формы белка при экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого природный 5'-концевой участок кДНК, кодирующей кодон инициации и примерно первые 69 аминокислот белка, в том числе трансмембранный участок, замещают лидерной последовательностью сигнального пептида. Например, последовательности ДНК, кодирующие кодон инициации и сигнальный пептид известного гена, могут быть сплайсированы с последовательностью кДНК ОРС-связывающего белка в каком-либо участке после области, кодирующей аминокислоту в положении 68. Предсказывается, что полученные рекомбинантные клоны продуцируют секретируемые формы ОРСсвязывающего белка в клетках млекопитающих и будут подвергаться посттрансляционным модификациям, которые обычно происходят в пределах С-концевого внеклеточного домена ОРС-связывающего белка, например, гликозилированию. Используя указанную стратегию, получают секретируемую форму ОРСсвязывающего белка, которая имеет на своем 5'конце сигнальный пептид ОРС-мыши, а на своем 3'-конце Рс-домен 1дС1 человека. Плазмид ный вектор рСЕР4/ти ОРС [22-401]-Рс, описанный в заявке США 08/577, 788, поданной 22 декабря 1995 г., расщепляют Νοΐ I в участке между 3'-концом ОРС и Рс-геном. Затем линеаризованную ДНК частично расщепляют Хтп I только между остатками 23 и 24 ОРС с образованием тупого конца.

Рестриктированные перевары затем дефосфорилируют с помощью С1Р и соответствующие участки вектора (включая остатки 1-23 ОРС и Рс) очищают в геле.

Участок кДНК ОРС-связывающего белка мыши, кодирующий аминокислотные остатки 69-316, амплифицируют с помощью Р£цполимеразы (81та1адепе, 8ап Ωίοβο. СА) на основе плазмидной матрицы при использовании следующих олигонуклеотидов:

1602-61: ССТ СТА ССС СТС ТАС ТТТ СОЛ ОСО СЛО АТС (8ЕХ.) ГО NО:27)

1602-59: ССТ СТС ССС ССС ССТ СТА ТСТ ССТ САА СТТ ТС (81:.(,) ГО NО: 28)

Олигонуклеотид 1602-61 амплифицирует 5'-концевой участок гена и содержит искусственный 8ΐιι I - сайт. Праймер 1602-59 амплифицирует 3'-концевой участок гена и содержит искусственный Νοΐ I - сайт. Полученный в результате РСК продукт расщепляют Νοΐ I и 8ΐιι I и затем очищают в геле. Очищенный РСКпродукт лигируют в вектор и затем используют для трансформации электрокомпетентных клеток Е. ^1ί ЭН 10В. Полученный клон секвенируют для подтверждения интеграции амплифицированной последовательности и соединений рестрикционных сайтов. Эту плазмиду затем используют для трансфекции фибробластов 293 человека и белок слияния ОРС-связывающий белок-Рс собирают из культурной среды, как ранее описано в заявке США № 08/577, 788, поданной в декабре 1995 г.

При использовании сходной стратегии конструируют вектор экспрессии, который способен экспрессировать Ν-концевую усеченную форму, слитую с доменом Рс ^01 человека. Указанный конструкт содержит сигнальный пептид ОРС мыши (ак 1 -21), слитый в пределах рамки считывания с остатками 158-316 ОРСсвязывающего белка мыши, за которым следует домен Рс !дС1 человека, также слитый в пределах рамки считывания. Для этого плазмидный вектор рСЕР4/ОРС мыши [22-401] (Заявка США № 08/577, 788, поданная 22 декабря 1995 г.) расщепляют Ншб III и Νοΐ I для удаления полной рамки считывания ОРС. Остатки 158-316 ОРС-связывающего белка мыши амплифицируют с помощью РСК при использовании в качестве матрицы плазмиды рсДНК/32-Р3 и следующих праймеров:

1661-44: ССТ СТС ТСС АСТ ССА САА ССС АСА АСС СТС АСС ССС АСС САТ ТТС С (8Ер ГО NО:29)

1602-59: ССТ СТС ССС ССС ССТ СТА ТСТ ССТ САА СТТ ТС (8ЕР ГО NО:30)

Олигонуклеотид 1616-44 амплифицирует ОРС-связывающий белок, начиная с остатка 158 и содержит остатки 16-21 сигнального пептида тиОРС с искусственным сайтом Х1ю I. Олигонуклеотид 1602-59 амплифицирует 3'-конец гена и добавляет в пределах рамки Νοΐ I - сайт. РСК-продукт расщепляют Νοΐ I и Χίο I и затем очищают в геле.

Следующие комплементарные праймеры отжигают друг с другом с образованием адаптера, кодирующего сигнальный пептид ОРС мыши и последовательность Козака, окружающую сайт инициации трансляции:

1616-41: АСС ТТС САС САТ САА САА СТС ССТ СТС СТС ССС АСТ ССТ ССТ ССТ ССТ ССА САТ СА (8Е(.) ГО ^:31)

1616-42: ТСС АТС АТС ТСС АСС АСС АСС АСС АСТ ССС САС САС АСС САС ТТС ТТС АТС СТС СА (8Е(.) ГО NО:32)

Указанные праймеры отжигают с образованием 5-липких концов, совместимых с Ηίπά III на 5-конце и Χ1ιο I на 3'-конце. Расщепленный вектор, полученный, как указано выше, отожженные олигонуклеотиды и расщепленный РСК-фрагмент лигируют вместе и вводят электропорацией в клетки ΌΗ10Β. Полученный клон секвенируют для подтверждения аутентичной реконструкции соединения между сигнальным пептидом, фрагментом ОРСсвязывающего белка, кодирующим остатки 158316, и доменом Рс !дС1. Рекомбинантную плазмиду очищают, трансфицируют в фибробласты человека 293 и экспрессируют как продукт кондиционированной среды, как описано выше.

Полноразмерную кДНК человека и мыши клонируют в векторе экспрессии рСЕР4 (Ιπνί1годеп, 8ап Б1едо, СА) и затем трансфицируют в культуры клеток фибробластов человека 293, как описано в примере 1. Клеточные культуры отбирают на срезе с гигромицином, как описано выше, и получают свободную от сыворотки кондиционированную среду. Кондиционированную среду наносят на колонку с иммобилизованным рекомбинантным ОРС и с помощью аффинной хроматографии очищают слущивающиеся формы рекомбинантного ОРС Ьр человека и мыши. Ν-концевое секвенирование очищенных растворимых ОРС-связывающих белков показывает, что белок мыши предпочтительным образом расщепляется перед фенилаланином в положении 139, а белок человека предпочтительным образом расщепляется перед гомологичным остатком, а именно изолейцином 140. Кроме того, белок человека также преимущественно расщепляется перед остатком глицина 145. Указанное позволяет предположить, что природные растворимые формы ОРСсвязывающего белка человека имеют аминоконцевые остатки, представленные изолейцином в положении 140 или глицином в положении 145.

Пример 11. Пептиды ОРС-связывающего белка и получение поликлональных и моноклональных антител к белку.

Антитела к специфическим участкам ОРСсвязывающего белка могут быть получены иммунизацией пептидами ОРС-связывающего белка. Такие пептиды могут использоваться для иммунизации по отдельности или же в конъюгированной форме.

Кристаллическая структура зрелого ΤΝΤα описана ранее I. Е. Υ. 1опек, Ό. I. 8!иай, апб Ν. Р. С. \\'а1кег (1990) 1. Се11 8οΐ. 8ирр1. 13, [11-18] и мономер образует сэндвич из антипараллельных β-складчатых листов, имеющих топологию рулета с вареньем. В указанной кристаллической структуре обнаруживаются 10 антипараллельных β-цепей, которые формируют βсэндвич с одним β-листом, состоящим из цепей В'ВГОС, и другим, состоящим из цепей.

С'СНЕЕ [Ε.Υ. 1опек е! а1., см. там же]. В результате исследований по мутагенезу обнаружено, что две петли зрелого ΤΝΤα формируют контакты с рецептором, одна петля образуется между β-цепями В&В', другая - между β-цепями Е&Е [С. К. Сой, С-8. Ьой, апб А. С. Ройег (1991) Рго!еш Епдшеегшд 4,785-791]. Кристаллическая структура комплекса, образующегося между ΤΝΤβ и внеклеточным доменом 55-кб рецептора ΤΝΤ (ΤΝΕ-Ρ.55) расшифрована и описаны контакты рецептор-лиганд [Ό. V. Ваппег, А. Б'Агсу, V. 1апек, К. Сеп1х, Н-Т 8с1юепП1б, С. Вгодег, Н. Ьое!ксйег, апб V. ЬекЧаиег (1993) Се11 73,431 -445]. Обнаружено, что в соответствии с данными исследования по мутагенезу, приве денными выше [С. К. Сой е! а1., см. выше], определенные петли ВВ' и ЕЕ лиганда ΤΝΤβ образуют большую часть контактов с рецептором в расшифрованной кристаллической структуре комплекса ЮТЪ: ΤΝΕ-Ρ.55. Аминокислотную последовательность ОРС-связывающего белка мыши сравнили с аминокислотной последовательностью ΤΝΡα и ΤΝΡβ. Участки ОРСсвязывающего белка мыши, соответствующие ВВ' и ЕЕ петлям, были предсказаны на основе результатов указанного сравнения и были сконструированы пептиды, которые описаны ниже.

A. Антиген(ы): рекомбинантный ОРСсвязывающий белок мыши [158-316] использовали в качестве антигена (аг) для иммунизации животных, как описано ниже, и сыворотку животных исследовали с помощью методов, охарактеризованных далее. Пептиды, соответствующие возможным ВВ' и ЕЕ петлям ОРСсвязывающего белка мыши, были синтезированы и использованы для иммунизации. Этими пептидами являются следующие:

пептид ВВ' петли: NН₂-NАА8IР8Ο8НКVΤ^88VΥН^ηΟV АК18--СООН (8ЕР ГО ®О:33) пептид ВВ' петли Су§: NН2-NАА8IР8Ο8НКVΤ^88VΥН^ КС\\'ЛК18С--СООП (8ЕР ГО ®О:34) пептид ЕЕ петли:

(8ЕР ГО ®О:35) пептид ЕЕ петли Су§: NН₂--VΥVVКΤ8IКIР88НN^МС-СООН (8ЕР ГО ®О:36)

Пептиды с карбосиконцевым цистеиновым остатком использовались для конъюгации с помощью методов, описанных в разделе В ниже, и далее для иммунизации.

B. Конъюгация с гемоцианином моллюска фиссуреллы или бычьим сывороточным альбумином.

Выбранные пептиды или фрагменты белка могут быть конъюгированы с гемоцианином моллюска фиссурелы (КЬН) для увеличения их иммуногенности в организме животных. Кроме того, для осуществления методики Е1А могут применяться пептиды, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (В8А) или фрагментами белка. Активированный КЬН или В8А (йп)ес1 Ма1е1Ш1бе Асйуа!еб, Р1егсе Сйешй са1 Сотрапу, КоскГогб, 1Ь) восстанавливают в 6Н₂О до конечной концентрации 10 мг/мл. Пептидные или белковые фрагменты растворяют в фосфатном буфере и затем смешивают с эквивалентным количеством (г/г) КЬН или В 8А. Осуществляют реакцию конъюгирования в течение 2 ч при комнатной температуре (КГ) с легким перемешиванием. Затем раствор пропускают через обессоливающую колонку или диализуют против РВ8 в течение ночи. Пептидный конъюгат хранят при 20°С до иммунизации или проведения Е1Ак.

C. Иммунизация: мышей Ва1Ь/с (Сйаг1ек К1уегк ЬаЬога!ог1ек, ’№йттд!оп, МА), крыс Ьои или новозеландских белых кроликов подкожно го инъецируют антигеном (50 мкг, 150 мкг и 100 мкг соответственно), эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ, 50% об/об; ΩίΓοο ЬаЬогаШпек, ΩοΙγοιΙ. ΜΙ). Затем кроликам вводят бустерные дозы антигена два или три раза с 2-недельными интервалами, причем антиген был приготовлен, как описано выше, но в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ, ΩίΓοο БаЬогаЮпек. Ое(го11, ΜΙ). Мышей и крыс бустируют примерно каждые 4 недели. Через 7 дней после второго бустирования отбирают образцы крови и определяют титры антител в сыворотке. Когда в крови кроликов удавалось определить наличие антител, в течение 6 последующих недель каждую неделю отбирали образцы крови объемом 50 мл. Мышей и крыс отбирали для получения гибридом на основе титров антител в сыворотке; использовали животных, в крови которых половинные значения максимальных титров превышали 5000. Модификации указанной методики могут быть осуществлены специалистом в данной области исследований; например, в настоящее время доступны различные типы иммуномодуляторов, которые могут быть использованы.

Ό. Иммуносорбентный анализ со связанным ферментом (ΕΙΑ).

ΕΙΑ осуществляли для выявления титров сывороточных антител (ат) у индивидуальных животных, а позднее -для скрининга потенциальных гибридом. 96-луночные платы для микротитрования с плоским дном с высокой эффективностью связывания для ΕΙΑ/ΚΙΑ (Сок1аг Согрогабоп, СатЬпбде, ΜΑ) покрывали очищенным рекомбинантным белком или фрагментом белка (антиген, аг) в концентрации 5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,2 (0,015 М Иа₂С.’О₃. 0,035 М ИаНСО₃). Фрагменты белка могут быть конъюгированы с бычьим сывороточным альбумином (Β8Α), если это необходимо. 50 мкл аг добавляют в каждую лунку. Затем платы закрывают ацетатной пленкой (ГИС Вютебкак, Шс., Сок1а Мека, СΑ) и инкубируют при комнатной температуре на вращающейся платформе в течение 2 ч или в течение ночи при 4°С. Затем осуществляют блокирование в течение 30 мин при комнатной температуре добавлением в каждую лунку 250 мкл 5%-ного раствора Β8Α, приготовленного смешиванием 1 части концентрата блокирующего раствора/разбавителя Β8Α и части деионизированной воды (бН₂О). Блокирующий раствор удаляют и в каждую лунку вносят 50 мкл 2-кратных разведений сыворотки (от 1:100 до 1:12 800) или супернатантов гибридомных клеточных культур. Разбавлением сыворотки является 1%-ный Β8Α (10% концентрат блокирующего раствора/разбавитель Β8Α разводят в соотношении 1:10 в фосфатном буферном растворе Дульбекко, Ό-ΡΒ8; 61Ьсо ΒΚΕ, Сгапб [з1апб. ΝΥ), в то время как супернатанты гибридом тестируются неразбавленными. При скрининге гибридом одну лунку используют как контроль конъюгата, а вторую лунку - в качестве положительного контроля ат. Платы снова инкубируют при комнатной температуре, вращают в течение 1 ч и затем 4 раза отмывают 1 х раствором для отмывания, приготовленным из 20х концентрата (К1гкедаагб апб Репу Б-аЬогаЮпек. Шс., ОаййегкЬигд, ΜΌ) в бН₂О. Вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ЩоегШдег Μηηπίκίιη Β^οсйеткак, !пб1апоро118, ΙΝ) разводят в 1%-ном Β8Α и затем инкубируют в каждой лунке 30 мин. Платы отмывают, как описано ранее, высушивают и добавляют однокомпонентный субстрат ΑΒΤ8 для пероксидазы (Кпкедаагб апб Репу Б-аЬогаЮпек. Шс., ОаййегкЬигд, ΜΌ). В каждой лунке определяют величину поглощения при 405 нм с помощью ридера микроплат ΕΌ310 Щюкк бМгитепК Шс., ХУшооккг УТ). Величины, соответствующие половинным максимальным титрам антител в сыворотке, определяют, строя график зависимости 1од₁о разведения сыворотки от оптической плотности при 405 нм и затем экстраполируя величину 50%-ной максимальной оптической плотности, полученной для данной сыворотки. Гибридомы отбирают как положительные, если величины оптической плотности более чем в 5 раз превышают фоновые значения. Могут быть использованы модификации указанной методики, например, могут быть выбраны конъюгированные вторые антитела определенной специфичности или перекрестно не реагирующие.

Е. Слияние клеток.

Животному, отобранному для получения гибридом, внутривенно вводят 50-100 мкг аг в ΡΒ8. Через 4 дня животное умерщвляют с помощью СО2 и в стерильных условиях забирают селезенку в 35 мл модифицированной Дульбекко среды Игла, содержащей 200 Ед/мл пенициллина С, 200 мкг/мл стрептомицинсульфата и 4 мМ глутамина (2хР/8/С ΌΜΕΜ). Селезенку очищают от избытка жировой ткани и отмывают в чашках чистой средой 2хР/8/С ΌΜΕΜ. Затем селезенку переносят в стерильный мешочек (81отасйег) (Тектаг, Сшсшпаб, ОН), содержащий 100 мл 2хР/8/С ΌΜΕΜ и гомогенизируют до одноклеточной суспензии в блендере 81отасйег ЬаЬ 80 (8е\гагб БаЬогаЮгу υΑС Ноике; Ьопбоп, ΕπβΕπΗ). По мере того, как клетки высвобождаются из селезеночной капсулы в среду, их удаляют из мешочка и переносят в стерильную 50-мл коническую пробирку для центрифугирования Щес1оп Эккшкоп апб Сотрапу, Ыпсо1п Рагк, N1). Далее свежую среду добавляют в мешочек и процедуру повторяют до тех пор, пока из селезенки не высвободятся все клетки. Полученные спленоциты трижды отмывают центрифугированием при 225 д в течение 10 мин.

Одновременно культуры миеломных клеток 8р2/0-Лд 14 мыши или Υ3-Α§ 1.2.3 крысы на логарифмической стадии роста, предназначены для слияния со спленоцитами (Атепсап Туре СиЙиге Со11есбоп; КоскуШе, ΜΟ), выращенные в полной среде (ΌΜΕΜ, 10% инактивированной сыворотки плода коровы, 2 мМ глутамина, 0,1 мМ необходимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 10 мМ Нерек-буфера; С1Ьсо ЬаЬогаФпек. Сгапб 1к1апб, ΝΥ) отмывают сходным образом. Спленоциты объединяют с клетками миеломы и осаждают. Среду над клеточным осадком отсасывают и к клеткам при осторожном перемешивании добавляют 2 мл полиэтиленгликоля 1500 (РЕС 1500; Воейппдег Маппйеш ВюсйеткаН, 1пб1апаро118, ΙΝ) в течение 1 мин. Затем медленно добавляют эквивалентный объем 2хР/8/С ΌΜΕΜ. Клетки оставляют для слияния при 37°С в течение 2 мин и затем вносят дополнительное количество (6 мл) 2хР/8/С ΌΜΕΜ. Затем клетки выдерживают при 37°С в течение 3 мин. И, наконец, 35 мл 2хР/8/С ΌΜΕΜ добавляют к клеточной суспензии и клетки осаждают центрифугированием. Среду над осадком клеток отсасывают и клетки осторожно ресуспендируют в полной среде. Клетки распределяют в 96-луночные плоскодонные платы для культуры тканей (Вес!оп Эюкшкоп ЬаЬ^аге; Ьтсо1п Рагк, N1) одиночными каплями из 5-мл пипетки. Платы ингибируют в течение ночи в условиях влажности при 37°С в атмосфере 5%-ного СО₂. На следующий день в каждую лунку добавляют эквивалентный объем среды для селекции. Указанная среда содержит 0,1 мМ гипоксантина, 4х 10^-4 мМ аминоптерна и 1,6х 10^-2 мМ тимидина в полной среде. Платы со слившимися клетками инкубируют в течение 7 дней и далее в течение 3 дней дважды меняют среду. Среду же для селекции НАТ используют после каждой смены жидкости. Супернатанты тканевых культур отбирают через 3-4 дня после последней смены жидкости из каждой лунки, содержащей клеточные гибриды, и тестируют с помощью ΕΙΑ для выявления специфических антител. Указанная методика может быть модифицирована; см., например, Нибкоп апб Нау, Практическая иммунология, второе издание, В1аск\\с11 8с1епбПс РиЫюабопк.

Пример 12. Клонирование рецептора ОРСсвязывающего белка, который экспрессируется на гематопоэтических клетках-предшественниках.

Биологически активный рекомбинантный ОРС-связывающий белок мыши [158-316] конъюгируют с флуоресцеин-изотиоцианатом (РГТС) с получением флуоресцентной пробы. Флуоресцентное мечение осуществляют инкубированием рекомбинантного ОРС-связывающего белка мыши [158-316] с 6-флуоресцеин5- (и 6) сукцинимидиловым эфиром гексановой кислоты ^оксйат РгоЬек, Еидепе, ОК) при молярном соотношении 1:6 в течение 12 ч при 4°С. Меченный Р1ТС ОРС-связывающий белок [158316] затем очищают путем гель-фильтрационной хроматографией. Клетки костного мозга мыши выделяют и инкубируют в культуре в присутствии С8Р-1 и ОРС-связывающего белка [158-316], как описано в примере 10. Клетки костного мозга мыши культивируют в течение ночи при добавлении в С8Р-1 (30 нг/мл) и ОРСсвязывающего белка [158-316] (20 нг/мл). Неприкрепившиеся клетки удаляют и хранят на льду, а оставшиеся прикрепившиеся клетки удаляют путем инкубирования в буфере для диссоциации клеток (81§та Сйет1са1, 8ΐ. Ьошк, МО), объединяют с популяцией неприкрепившихся клеток и окрашивают Р1ТС-ОРС-связывающим белком, как описано выше. После отмывания и ресуспендирования в РВ8 с 0,5% В8А клетки обрабатывают Р1ТС-ОРС-связывающим белком, отмывают и сортируют при использовании РАС8. Популяцию клеток, которые положительны на окрашивание Р1ТС-ОРСсвязывающим белком, собирают и выделяют из них мРНК, как описано в примере 2. Полученный препарат мРНК использует для конструирования кДНКовой библиотеки, как описано в примере 2.

Библиотеку кДНК, полученную из указанного источника, используют для выборочного Е8Т-секвенирования, как предварительно описано в опубликованной заявке \¥О 97/23614 и в работе 8 ί топе! е! а1. (Се11-89, 309-319 (1997)). Используя указанный подход, выявляют кДНК размером около 2,1 кЬ, которая кодирует новый Т№К-родственный белок. Длинная открытая рамка считывания кДНК ООАК мыши кодирует белок размером в 625 ак и содержит структурные элементы, характерные для Т№Кродственных белков: на Ν-концевом участке гидрофобную последовательность сигнального пептида, четыре тандемные обогащенные цистеином повторяющиеся последовательности, гидрофобный трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен. Гомология указанного белка с другими членами семейства Т№-рецептора и его экспрессия в клетках костного мозга, связывающих Р1ТС-ОРСсвязывающий белок, позволяет предположить, что он является возможным рецепторам для родственного Т№ ОРС-связывающего белка. Этот белок обозначают ООАК или рецептор дифференцировки и активации остеокластов. Последовательность нуклеотидов и предсказанная аминокислотная последовательность ООАК мыши приведена на фиг. 10. Сравнение последовательностей с доступными базами данных свидетельствует о том, что полученный белок является мышиным гомологом ΪΝΕΚродственного белка человека, известного как КΑNΚ (Апбегкоп е! а1., №1Шге 390. 175-179 (1997)).

Пример 13. Получение рекомбинантного ООАК-белка в клетках млекопитающих.

Растворимый внеклеточный домен ООАК, слитый с Рс-участком 1дС1 человека, получают с помощью методик для конструирования и экс прессии Рс-слитых белков, как предварительно описано в заявке XVО 97/23614 и в работе 81шоне! е! а1., см. выше. Для получения растворимого ОПАК-белка в клетках млекопитающих кДНК, кодирующую внеклеточный домен ОПАК мыши (ак 27-211), амплифицируют с помощью РСК при использовании следующего набора олигонуклеотидных праймеров:

5' ТСТ ССА АСС ТТС ТСА СТС ТСС АСС ТСА СТС С -3' (81:.(,) ГО ЫО:37)

5' ТСТССС ССС ССС ССТ ААС ССТ ССС ССТ САТ ТСС ОТО - 3' (8Е(.) ГО ЫО:38)

РСК-реакции осуществляют в объеме 50 мкл с добавлением 1 Ед коммерческой ДНКполимеразы (Ые\у Ендк-шй Вю1аЬк) в растворе, содержащем 20 мМ Трис-НС1, рН 8,8, 10 мМ КС1, 10 мМ (ЫН₄)₂8О₄,0,1%-ный Тритон-Х100, 10 мкМ каждого из ЙЫТР, 1 мкМ каждого праймера и 10 нг кДНК-матрицы ОПАК. Реакции проводят при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, в общей сложности 16 циклов. РСК-фрагмент выделяют путем электрофореза. В РСК-фрагменте создается Ηίηά III -рестрикционный сайт на 5'-конце и Ыо! I - рестрикционный сайт на 3'-конце. Расщепленный Ηίηά III - Ыо! I РСК-фрагмент затем субклонируют в пределах рамки считывания в модифицированный вектор рСЕР4-Рс впереди последовательности тяжелой цепи !дС-у1 человека, как ранее описано в заявке VО 97/23614 и в работе Зипоне! е! а1., см. выше. В вектор также встраивают линкер, который кодирует две иррелевантные аминокислоты, перекрывающие соединение между внеклеточном доменом ОПАК и участком Рс ЦС.

Конструкт затем расщепляют Ы11е I и Ηίηά III и встраивают в пределах рамки следующую отожженную пару олигонуклеотидов, кодирующую сигнальный пептид ОРС (ак 1-21):

5' СТА ССА ССА ТСА АСА АСТ ССС ТСТ ССТ ССС САС ТСС ТСС ТСС ТСС ТСС АСА ТСА ТТС ААТ ССА САА ССС АСА - 3' (8Е(.) ГО ЫО:39)

5' АСС ТТС ТСС СТТ СТС САТТСА АТС АТС ТСС АСС АСС АСС АСС АСТ ССС САССАС АСС САС ТТС ТТС АТС СТС - 3' (8Е(.) ГО ЫО:40)

Линкер, кодирующий две иррелевантные аминокислоты, встраивают между последовательностями сигнального пептида ОРС и ОПАК. Конечный конструкт (ОПАК-Рс/рСЕР4) кодирует белок слияния, содержащий, начиная от амино-концевого участка в направлении карбокси-концевого участка следующие элементы: сигнальный пептид ОРС (ак 1-21)-линкер (Ьук Ьеи) - ОПАК (ак 27-211) - линкер (А1а А1а) - Рс ЦС человека.

Конструкт затем трансформируют в клетки 293-ЕВЫА-1 кальций-фосфатным методом, как описано в работе Аи8иЬе1 е! а1., Сигг. Рго!. Мо1. Вю1. 1, 9.1.1-9.1.3, (1994). Затем трансфицированные клетки отбирают в присутствии 200 мкг/мл гигромицина (С1ЬсоВКЬ) и полученные масс-культуры, устойчивые к гигромицину, объединяют и выращивают до состояния монослоя. Клетки отмывают один раз в РВ8 и культивируют в свободной от сыворотки среде в течение 72 ч. Кондиционированную среду собирают. Белок слияния ОПАК-Рс в среде выявляют Вестерн-блоттингом с антителами к Рс ЦС человека.

Белок слияния Рс был очищают путем хроматографии на колонке с протеином А (Р1егсе), согласно рекомендациям производителя. Затем 50 пкМ очищенного белка подвергают Ы-концевому секвенированию путем автоматической деградации по Эдману, как описано МаЫийайа е! а1., (I. Вю1. Сйет. 262, 10-35 (1987)). После 10 циклов устанавливают следующую аминокислотную последовательность:

\Н;-К1.СП.ОУТР-СС);11.

Связывающую активность ОПАК-Рс с ОРС-связывающим белком исследуют путем иммунофлуоресцентного окрашивания трансфицированных клеточных культур СО8-7, как описано в примере 2. Клетки СО8-7 липофектируют 1 мкг вектора экспрессии, содержащего ДНК, кодирующую ОРС-связывающий белок мыши. Через 48 ч инкубирования клетки вновь инкубируют в РВ8-РВ8-растворе, содержащем 10 мг/мкл Рс ЦС человека, ОПАК-Рс или ОРСРс-белок, при 4°С в течение 1 ч. Затем клетки дважды отмывают РВ8 и инкубируют в растворе РВ8-РВ8, содержащем 20 мкг/мл меченных РГГС антител козы к ЦС человека (8ои1йет Вю1:есй А88ос1а1ек) еще в течение часа. После отмывания РВ8 клетки исследуют под конфокальным микроскопом (АСА8, ИШта, ИМдИ! Вюте0юа1 Iтад^пд, Шс., Океток, МБ). Как ОПАК-Рс, так и ОРС-Рс связываются с трансфицированными ОРСЬ СО8-7 клетками (фиг. 11).

Пример 14. Биологическая активность рекомбинантного растворимого ОПАК ίη νίίΐΌ.

Способность ОПАК ингибировать стимуляцию образования остеокластов под действием ОРС-связывающего белка определяют в культуре клеток костного мозга мыши в присутствии С8Р-1 (30 нг/мл) и ОРС-связывающего белка (5 нг/мл). Методики использования культур костного мозга мыши для изучения созревания остеокластов описаны в заявке VО 97/23614 и примере 8. Белок слияния ОПАК-Рс, как описано в примере 12, добавляют в культуры в концентрациях 65-1500 нг/мл. Образование остеокластов исследуют цитохимическим анализом устойчивой к тартрату алкалинфосфатазы (ТКАР) и анализом ТКАР в растворе через 5 дней после добавления в культуры белка.

Дозозависимое ингибирование образования остеокластов под действием белка слияния ОПАК-Рс наблюдают как при цитохимическом исследовании ТКАР, так и при исследовании в растворе (фиг. 12). Белок слияния ОПАК-Рс ингибирует образование остеокластов, когда ЕД₅₀ составляет около 10-50 нг/мл.

Пример 15. Биологическая активность рекомбинантного растворимого ОЭАВ ίη νί\Ό.

Молодых, быстро растущих самцов мышей ВЭР1 в возрасте 3-4 недель подкожно инъецируют различными дозами белка слияния ОЭАВРс один раз в день в течение 4 дней (в качестве носителя использовали РВ8/0,1% В8А). Мышей исследовали рентгенографией на 5-ый день. Используемые дозы белка слияния ОЭАВ-Рс составляли 0,5, 1,5 и 5 мг/кг/день. В каждом случае всех мышей в данной группе и контрольной группе, получавшей РВ8/0,1% В8А, исследовали рентгенографией при использовании одной и той же пленки. Проксимальный метафизный участок большеберцовой кости сравнивали попарно у контрольных и обработанных животных и оценивали как +, если большеберцовая кость опытного животного при визуальной оценке была более плотной по сравнению с костью контрольного животного, дающей счет 8, как указано ниже. Счет 5/8 был необходим для оценки результата как положительный. (Дозу выражали в мк/кг/день). (η=4).

После умерщвления животных правую большеберцовую кость у каждого животного удаляли и определяли плотность кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости путем периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ) (81га1ес, Сегталу). Два 0,5-мм перекрестных среза кости, сделанных на расстоянии 1,5 мм и 2,0 мм от проксимального конца большеберцовой кости исследовали (ХМ1СЕ 5.2, 81га1ес, Сегтаиу) для определения общей минеральной плотности костей в метафизах. Для определения границы метафизной кости используют порог отделения мягких тканей 1500.

Введение ОЭАВ-Рс молодым растущим мышам ингибирует резорбцию кости в проксимальной ростовой пластинке большеберцовой кости с образованием участка повышенной костной плотности, который явным образом виден на радиографических снимках. Радиографические изменения проявляются при дозе 1,5 мг/кг/день и выше (табл. 1). Измерение плотности кости путем рОСТ в образцах, исследованных во втором эксперименте в сходном участке большеберцовой кости, подтверждает дозозависимое увеличение плотности кости у данных животных (фиг. 13).

Эксперимент #1

Фактор	Доза	1	2	3	4	5	6	7	8	Результат
ОЭАК-Рс	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Пол. 8/8
ОЭАК-Рс	1,5	-	+	+	-	+	+	+	+	Пол. 6/8
ОЭАК-Рс	0,5									Отр. 0/8
ОЭАК-Рс	0,15									Отр. 0/8

Эксперимент #2

Фактор	Доза	1	2	3	4	5	6	7	8	Результат
ОЭАК-Рс	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Пол. 8/8
ОЭАК-Рс	1,5	+	+	+	+	+	+	+	+	Пол. 8/8
ОЭАК-Рс	0,5	-	-	-	+	-	-	-	-	Отр.. 1/8

Несмотря на то, что в настоящем описании приведены предпочтительные варианты осуществления изобретения, специалисту в данной области исследований понятно, что могут быть сделаны его различные модификации. Таким образом, приведенная ниже формула охватывает все эквивалентные варианты изобретения в пределах его объема.

δΕΟϋΕΝΟΕ ызттс (1) ΟΕΝΕΗΑΕ ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ:

(1) АРРЫСАЭТ: Атдеп 1нс.

(И) ΤΙΤΕΕ ОР ΙΝΥΕΝΤΙΟΝ: 03ΤΕΟΡΗΟΤΕΟΕΗΙΝ ΒΙΝΟΙΝΟ ΡΗΟΤΕΙΝ3 ΑΝϋ НЕСЕРТОМЗ (ίϋ) ΝϋΜΒΕΚ ОР ЗЕОСЕЫСЕЗ: 40 (ίν) СОНЯЕЗРОЮЕМСЕ АОСКЕЗЗ:

(A) АОйНЕЗЗЕЕ: Атдеп 1пс.

(B) ЗТЯЕЕТ: Опе Атдеп СепЬег ϋΓΪνβ (C) ΟΙΤΥ: ТЬоизапЙ Оакз (O) ЗТАТЕ; СаИГогпха (Е) ΟΟϋΝΤΚΥ: иЗА (P) ΖΙΡ: 91320-1789 ' [V) СОМРЦТЕН НЖАОАВЬЕ ГОНИ:

(A) ΜΕΟΙΟΜ ΤΥΡΕ: Р1орру й1зк (B) СОМРОТЕВ: ΙΒΜ РС сотраЫЫе (C) ΟΡΕΗΑΤΙΝΟ 3Υ3ΤΕΜ: РС-ООЗ/МЗ-ООЗ (О) ЗОРТМАНЕ: РаеваЫп Ве1еазе #1.0, Уегэлоп #1.30 (νί) ΟϋΚΗΕΝΤ АРРЫСАТЮЫ ΏΑΤΑ:

(A) АРРЫСАТЮЫ ЯЦМВЕН:

(B) ΡΙΟΙΝΟ ОАТЕ:

(C) ΟΙΛ33ΙΡΙΟΑΤΙΟΝ:

(νίίί) ΑΤΤΟΗΝΕΥ/ΑΟΕΝΤ ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ:

(А) МАМЕ: МтпСег. ЯоЬегЬ В.

(С) НЕРЕКЕЫСЕ/ООСКЕТ ΝϋΜΒΕΗ: А-451В (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ ЗЕО ГО N0:1:

(ί) 3ΕΟΟΕΝΟΕ СНАВАСТЕН13Т1СЗ:

!А) ΟΕΝΟΤΗ: 2295 Базе рахгз [B) ΤΥΡΕ: пис1е1с ас14 (C) 5ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: З1пд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ϋ) МОЬЕСШЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (двПОКйс) (ίχ) РЕАТиКЕ:

(A) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СОЗ (B) ΟΟβΑΤΙΟΝ: 158..1105 (χί) 3Ε0ϋΕΝΟΕ ΟΕ3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:1:

САССТСССАТ ССАСТАСТСС АСССАССССТ ССССССАССА ССТСТСТСАА ССОСТССССС60

СОСССССССС СТСССССССА СТСТССТССС СССТСССТСС СССАССААСС САСАСААССА120

ТСССССАССА СССССССССА АСТССССССО ССОСССС АТС ССС ССС ОСС АСС СОА175

Мее Агд Агд А1а Зег Агд

ОАС ТАС ССС ААС ТАС СТС ССС АСС ТСС САС ОАО АТС ССС АСС ССС ССС223

Азр Туг О1у Ьуз Туг Ьеи Агд Зег Зег С1и С1и Мее С1у Зег О1у Рго

Таблица 1. Ингибирование резорбции кости белком слияния ОЭАК-Рс

10

15

20

ССС

СТС

ССА

САС

ОСТ

ССС

СТС

САС

ССС

ССТ

ТСТ

ССА

ССС

ОСТ

271

С1у

УаХ

Рго

Нхз

С1и

С1у

Рго

Ееи

Н13

Рго

АХа

Рго

Зег

А1а

Рго

АХа

25

30

35

ССС

ССА

ССС

ТСС

ССС

ТСС

АТС

ТТС

СТС

ССС

СТС

319

Рго

А1а

Рго

АХа

ах а

Зег

Агд

Зег

мее

РЬе

Ееи

АХа

Ьеи

Беи

40

45

50

ссс

СТС

ССА

СТС

ССС

САС

сТс

СТС

ТСС

АСС

АТС

ССТ

СТС

ТТС

СТС

ТАС

367

СХу

Ееи

С1 у

Ьеи

С1 у

О1П

Уа1

Суз

Зег

Т1е

А1а

Ьеи

РЬе

Ееи

Туг

55

60

65

70

ТТТ

ССА

ССС

САС

АТС

САТ

ССТ

ААС

АСА

АТА

ТСА

САА

САС

АСС

АСТ

САС

415

РЬе

Агд

А1а

С1п

МеС

Азр

Рго

Азп

Агд

Не

Зег

С1и

Азр

Зег

ТЬг

Н13

75

80

85

ТСС

ТТТ

ТАТ

АСА

АТС

СТС

АСА

СТС

САТ

САА

ААС

ССА

ССТ

ТТС

САС

463

Суз

РЬе

Туг

Агд

Не

Ьеи

Агд

Ееи

ΗΪ3

С1 и

Азп

А1а

СХу

Ьеи

01 п

Азр

90

95

100

ТСС

АСТ

СТС

САС

АСТ

САА

САС

АСА

СТА

ССТ

САС

ТСС

ТСС.

АСС

АТС

511

Зег

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1и

Азр

ТЬг

Ееи

Рго

Азр

Зег

Суз

Агд

Мее

105

но

115

(χί)

ЗЕОЦБЫСЕ

ОВ8СН1РТ10Ы

: ЗЕО ΙΠ

N0:'

2:

МеЬ

Агд

А1а

Зег

Агд

Азр

Туг

СХу

Ьуз

Туг

Ьеи

Агд

Зег

5ег

С1и

1

5

10

15

С1и

МеС

СХу

Зег

СХу

Рго

С1у

УаХ

РГО

ΗΪ3

СХи

СХу

Рго

Ьеи

Ηϊβ

Рго

20

25

30

А1а

Рго

Зег

АХ а

Рго

АХа

Рго

АХа

Рго

АХа

Зег

Агд

Зег

35

40

45

Мек

РЬе

Ьеи

АХ а

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у'

СХп

Уа1

УаХ

Суз

Зег

50

55

60

Не

АХа

Ьеи

РЬе

Ьеи

Туг.

РЬе

Агд

АХа

СХп

мег

Азр

Рго

АЗП

Агд

Не

АДА САА ССС ТТТ САС ССС ССС СТС САС ААС САА СТС САА САС АТТ СТС 559

Еуз СХп

А1а РЬе

О1п С1у

АХа УаХ О1п Еуз О1и Ееи

СХп ΗΪ3

Не УаХ

120

125

130

ССС

ССА

САС

ССС

ТТС

ТСА

ОСА

ост

ССА

ОСТ

АТС

САА

ССС

ТСА

ТСС

607

С1у

Рго

С1п

Агд

РЬе

Зег

О1у

А1а

Рго

АХа

Мее

мее

О1и

СХу

Зег

Тгр

135

140

145

150

ТТС

САТ

ОТО

ССС

САС

ССА

ссс

ААС

ССТ

САС

ССС

САС

ССА

ТТТ

ССА

САС

655

Беи

Азр

Уа1

А1а

С1п

Агд

СХу

Еув

Рго

О1и

А1а

СХп

Рго

РЬе

А1а

Нхз

155

160

165

СТС

АСС

АТС

ААТ

ОСТ

ССС

АСС

АТС

ССА

ТСО

сот

тсс

САТ

ААА

ОТС

АСТ

703

Ееи

ТЬг

Не

АЗП

АХа

А1а

Зег

Не

Рго

Зег

О1у

Зег

ΗΪ3

Еуз

Уа1

ТЬг

170

175

180

СТС

ТСС

ТСТ

ТСС

ТАС

САС

САТ

СОА

ССС

ТСС

ССС

ААС

АТС

ТСТ

ААС

АТС

751

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

Н13

Азр

Агд

С1у

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеС

185

190

195

АСС

ТТА

АСС

ААС

ОСА

ААА

СТА

АОС

СТТ

ААС

САА

ОАТ

ССС

ТТС

ТАТ

ТАС

799

ТЬг

Беи

Зег

Азп

С1у

Ьуз

Ееи

Агд

Уа1

Азп

С1п

Азр

СХу

РЬе

Туг

200

205

210

СТС

ТАС

ССС

ААС

АТТ

ТСС

ТТТ

ССС

САТ

САА

АСА

ТСС

ССА

АОС

СТА

847

Ееи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

ΗΪ3

СХи

ТЬг

Зег

С1у

Зег

Уа1

215

220

225

230

ССТ

АСА

САС

ТАТ

СТТ

САС

СТО

АТС

СТС

ТАТ

СТС

СТТ

ААА

АСС

АОС

АТС

895

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ееи

С1п

Ьеи

мее

Уа1

Тут

УаГ

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

235

240

245

ААА

АТС

ССА

АСТ

ТСТ

САТ

ААС

СТС

АТС

ААА

ССА

ОСС

АОС

АСС

ААА

ААС

943

Ьуз

Не

Рго

Зег

Κίβ

АЗП

Ееи

мее

Еуз

СХу

Зег

ТЬг

Еуз

Азп

250

255

260

ТСС

ССС

ААТ

ТСТ

САА

ТТС

САС

ТТТ

ТАТ

ТСС

АТА

ААТ

СТТ

ССС

ССА

991

Тгр

Зег

С1у

Азп

Зег

С1и

РЬе

Нхз

РЬе

Туг

Зег

Не

Азп

Уа1

С1у С1у

265 270 275

ТТТ

ТТС

ААС

СТС

ССА

ОСТ

ССТ

САА

АТТ

АСС

АТТ

САС

ОТС

тсс

ААС

1039

РЬе

Еуз

Ееи

Агд

АХа

С1 у

С1и

СХи

Не

Зег

Не

С1п

Уа1

Зег

Азп

280

285

290

ССТ

ТСС

СТС

САТ

ССС

САТ

САА

САТ

ССС

АСС

ТАС

ТТТ

ОСС

ССТ

ТТС

1087

(1)

Зег

СХи

Азр

Зег

ТЬг 85

ΗΪ3 Суз РЬе Туг Агд 90

Не

Ьеи Агд

Ьеи

ΗΪ3 95

С1и

АЗП

А1а

СХу

Ьеи

С1П

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1и

Азр

ТЬг

Ьеи

Рго

100

105

110

Азр

Зег

Суз

Агд

МеС

Ьуз

СХп

А1а

РЬе

(31 п

С1у

АХа

Уа1

СХп

Ьуз

115

120

125

С1и

Ьеи

СХп

ΗΪ3

Не

Уа1

С1у

Рго

С1п

Агд

РЬе

Зег

СХу

АХа

Рго

А1а

130

135

140

МеЬ

МеС

С1и

СХу

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

А1а

С1п

Агд

СХу

Ьуз

Рго

СХи

145

150

155

160

А1а

С1п

Рго

РЬе

А1а

ΗΪ3

Ьеи

ТЬг

Не

Азп

АХа

Зег

Не

Рго

Зег

зег κίβ

Ьуз УаХ 180

ТЬг Ьеи Зег Зег 185

Тгр

Туг

НХз

АЗр

Агд 190

СХу

Тгр

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеС

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

195

200

205

Азр

СХу

РЬе

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

Нгз

ΗΪ3

210

215

220

ТЬг

Зег

С1у

зег

УаХ

Рго

ТЫ

Азр

Туг

Ьеи

С1п

Ьеи

МеС

УаХ

Туг

230

235

240

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

Не

Рго

Зег

Ηίβ

Азп

Ьеи

Мес

Ьуз

Рго Зег Ееи Ееи Азр Рго Азр С1п Азр А1а ТЬг Туг РЬе С1у А1а РЬе

295 300 305310

ААА СТТ САС САС АТА САС ТСАСАСТСАТ ТТССТССААС АТТАССАТСС1135

Ьуз Уа1 С1п Азр Не Азр

315

АТСТССТАСА ТСТТТССААА СТТСТТАААА ААТССАТСАТ СТСТАТАСАТ СТСТААСАСТ1195

АСТААСАСАС АТСССССАСС СТСТАТСААА СТСАСАСССС ТСТСТСТТСА СССТСТАСАС1255

СТТСТСТАТА ТСТАААСТСС АТАССТСАТС ТТАСАТТСАТ ССТСАТТАСА СААСССТТТТ1315

АСААТТТТСТ ААТСАТТТСС ТАСААТТСАА ССАСАТТССС АСАССТАТТС ССАТССТТАТ1375

САААААСТТА САССГСАССТ АТССААСССС СТСАСАСТСТ СТСССТСТАА ССССТССАСА1435

ТСТСССАСТС АСААССТТСА ААТТААСАСС АТСССАТСТС АТТССАААСА ААТСАТАСТС1495

ТСААСССТТА АСТТСТТТТС ААТТСТТАСА ТТССССТССС АССТССАААТ ААСТТСТТТТ1555

ТТТСТААТСА ССАСАСАААА АТАТАТСТАТ ТТТТАТАТАА ТСТСТАААСТ ТАТАТТТСАС1615

СТСТААТСТТ ТТСТСТССАА АСТТТТСТАА АТТАТАТТТС ТССТАТАСТА ТТТСАТТСАА1675

ААТАТТТААА ААТСТСТСАС ТСТТСАСАТА ТТТААТСТТТ ТАААТСТАСА САТСТАТТТА1735

АСТССТССАС ТТТСТААТТС СССТСААССТ АСТССТАССТ ААССССССАС ААТАСТСТТТ1795

СТССТСАССА САТСТАСТТТ АТТТСТТТАТ ТСТТТТТААС ТТААТАСАСТ СТТСАСАСТТ1855

СТСААААСТА ТССААССААА АТАААТАААТ АААААТАААА ТСААТАССТТ СААТААТААС1915

ТАССАТСТТС СТСАССАССТ СССТТТСААА ТТТАСААССТ ААТТСАСТТТ АССАССТСАС1975

АТАСССАААА А6САТАСАТА АТАСССТАСТ САААТСТСТС АССАСТАТТТ АТССААТТАТ2035

ТСААСАССТС ТСТТТТТТТА СААСАССТАС АААТТСТААА ТТТТСТТТСТ ТТТТТТТССС2095

АТАСААААТС ТАСТАТАСТТ ТАТСАСССАА ААААСААТСС АСТТТТТААТ ТТАСТСАААС2155

ТТАТТТТАТТ АТАСТСТАСА АТААААССАТ ТСТСТСТСАА ТСТТААТТТТ ТТССТАСААА2215

АААТАААТТТ СТАССААААС СТСААААААА АААААААААА ААААААААСС ССССССССТС2275

ТАСАСССССС ТАТТСТАТАС2295

С1у <31у Зег ТЫ

Ьуз Азп Тгр Зег

С1у Азп Зег С1и РЬе Н13

260

265

270

Зег

Не

Азп

Уа1

С1у

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

АХа

С1у

С1и

275

280

285

Зег

11е

С1п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Азр

Рго

Азр

С1п

290

295

300

ТЬг

Туг

РЬе

С1у

А1а

РЬе

Ьуз

УаХ

31п

Азр

Не

Азр

305

310

315

(2)

ΙΝΡ0ΗΜΑΤΙ0Ν

РОК

5Е0

ΙΟ I

Ю:3:

3ΕρυΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) -------- ----- (B) (C) (О)

ΕΕΝΟΤΗ: 2274 Ьазе рахгз ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е тороеосу: Нпеаг (П>

(ίχ) (χί)

МОЬЕСиЕЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотхс!

ГЕАТиВЕ:

(Α) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СОЗ (В) ЕОСАТЮМ: 185..1135

3Ε0υΕΝΟΕ ОЕЗСН1РТ1ОЫ: ЗЕ<3 ΙΟ N0:3:

ААССТТССТА СССАС-СТССС АТССАСТАСТ ССАСССАССС СТСССССССС

АААССССССС ТССААСТССС ССССССАССТ ССАСССТССС ССССАСССТС

СССАСАСААС ААССССАССС АСССССАСАС ССАССАСАСС ТСССААСССА

СССАССАССС

СССАСТТССС

САССССССАС

СССС АТС ССС ССС ССС АСС АСА САС ТАС АСС ААС ТАС СТС ССТ ССС ТСС МеС Агд Агд А1а Зег Агд Азр Туг ТЬг Еуз Туг Ееи Агд С1у Зег 15 10 15

120

180

229 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЙ ЗЕО ΙΟ N0:2:

(ί) ЗЕООЕЫСЕ СНАНАСТЕЙ13Т1СЗ:

(Α) ΕΕΝΟΤΗ: 316 ашхпо асхбз (В) ΤΥΡΕ: атхпо ас1б (О) ТОРОЬОСУ: Ххпеаг (ϋ) МОЬЕСЦЕЕ ΤΥΡΕ: рГОСехп

САС

АТС

ССС

ССА

ССС

ссс

САС

ССС

СТС

САС

С1и

МеГ

С1у

С1у С1у

Рго

С1у

АХа

Рго

ΗΪ3

С1и

С1у

Рго

Ьеи

Нхз

20

25

30

ССС

ССТ

ссс

ССС

САС

ССС

ТСС

ССС

ТСС

А1а

Рго

А1а

Рго

Нхз

СХп

Рго

А1а

Зег

Агд

Зег

35

40

45

АТС

ТТС

СТС

ССС

СТС

ССС

СТС

ССС

СТС

ССС

САС

СТТ

СТС

ТСС

АСС

МеС

РЬе

Уа1

АХа

Ьеи

Ееи

С1у

Ееи

С1у

Ееи

С1у

С1П

Уа1

УаХ

Суз

Зег

50

55

60

СТС

ССС

СТС

ТТС

ТАТ

ТТС

АСА

ссс

САС

АТС

САТ

ССТ

ААТ

АСА

АТА

Уа1

А1а

Ьеи

РЬе

Туг

РЬе

Агд

А1а

С1п

МеЪ

Азр

Рго

Азп

Агд

Не

65

70

75

ТСА

САА

САТ

ССС

АСТ

САС

ТСС

АТТ'

ТАТ

АСА

АТТ

ТТС

АСА

СТС

САТ

САА

Зег

С1и

Азр

СХу

ТЬг

Нхз

Суз

Не

Туг

Агд

Не

Ееи

Агд

Ееи

Нхз

С1и

80

85

90

95

ААТ

ССА

САТ

ТТТ

САА

САС

АСА

АСТ

СТС

САС

АСТ

САА

САТ

АСА

ААА

ТТА

Азп

А1а

Азр

РЬе

С1п

Азр

ТЬг

Ееи

С1и

Зег

С1п

Азр

ТЬг

Еуз

Ьеи

100

105

110

АТА

ССТ

САТ

ТСА

ТСТ

АСС

АСА

АТТ

ААА

САС

ССС

ТТТ

САА

ССА

ССТ

СТС

Не

РГО

Азр

Зег

Суз

Агд

Не

Ьуз

С1п

А1а

РЬе

С1п

С1у

А1а

Уа1

115

120

125

САА

ААС

САА

ТТА

САА

САТ

АТС

СТТ

ССА

ТСА

САС

АТС

АСА

ССА

САС

С1п

Еуз

С1и

Ьеи

С1п

Ηί.3

11е

νβΐ

С1у

Зег

С1п‘

Нхз

Не

Агд

АХа

С1и

130

135

140

ААА

ССС

АТС

СТС

САТ

ССС

ТСА

ТСС

ТТА

САТ

СТС

ССС

ААС

АСС

ААС

Ьуз

А1а

Мег

Уа1

Азр

С1у

Зег

Тгр

Ееи

Азр

Ееи

А1а

Буз

Агд

Зег

Ьуз

145

150

155

СТТ

САА

ОСТ

САС

ССТ

ТТТ

ССТ

САТ

СТС

АСТ

АТТ

ААТ

ССС

АСС

САС

АТС

Ееи

С1и

А1а

СХп

РГО

РЬе

АХа

ΗΪ5

Ьеи

ТЬг

не

Азп

АХа

ТЬг

Азр

Не

277

325

373

421

469

517

565

613

661

709

160

165

170

175

ССА

ТСТ

СОТ

ТСС

САТ

ААА

СТС

АСТ

СТС

ТСС

ТСТ

ТСС

ТАС

САТ

ССС

757

Рго

Зег

С1у

Зег

Н1з

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

Ηίβ

Азр

Агд

180

185

190

ост

ТСС

ССС

ААС

АТС

ТСС

ААС

АТС

АСТ

ТТТ

АСС

ААТ

ССА

ААА

СТА

АТА

805

С1у

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

Мег

ТЬг

РЬе

Зег

АЗП

СХу

Ьуз

Ьеи

Не

195

200

205

СТТ

ААТ

САС

САТ

ССС

ТТТ

ТАТ

ТАС

СТС

ТАТ

ССС

ААС

АТТ

ТСС

ТТТ

ССА

853

Уа1

Азп

С1п

Азр

С1у

РЬе

Тух

Туг

Ьеи

Туг

АХа

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

210

215

220

САТ

САА

АСТ

ТСА

ССА

САС

СТА

ССТ

АСА

САС

ТАТ

СТТ

САА

СТА

АТС

901

ΗΪ3

С1и

ТЬг

Зег

С1у

Азр

Ьеи

АХа

ТЬг

С1и

Туг

Ьеи

С1п

Ьеи

МеС.

225

230

235

СТС

ТАС

СТС

АСТ

ААА

АСС

АТС

ААА

АТС

ССА

АСТ

ТСТ

САТ

АСС

СТС

949

УаХ

Туг

Уа1

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

Ьуз

11·

Рго

Зег

ΗΪ3

ТЬг

Ьеи

240

245

250

255

АТС

ААА

ССА

АСС

ААС

ТАТ

ТСС

ТСА

ССС

ААТ

ТСТ

САА

ТТС

САТ

997

МеС

Ьуз

С1у

СХу

Зег

ТЬг

Ьуз

Туг

Тгр

Зег

С1у

АЗП

Зег

С1и

РЬе

Ηίβ

260 265 270

ТТТ ТАТ ТСС АТА ААС СТТ ОСТ ОСА ТТТ ТТТ ААС ТТЛ ССС ТСТ ОСА САС1045

РЬе Туг Зег Не Азп Уа1 С1у СХу РЬе РЬе Ьуз Ьеи Агд Зег С1уС1и

275 200285

САА АТС АСС АТС САС СТС ТСС ААС ССС ТСС ТТА СТС САТ ССС САТ САС1093

С1и Не Зег Не С1и иа1 зег азп рго Зет ьеи Ьеи Азр Рго АзрС1п

290 295300

САТ ССА АСА ТАС ТТТ ССС ССТ ТТТ ААА СТТ ССА САТ АТА САТ1135

Азр А1а ТЬг Туг РЬе С1у А1а РЬе Ьуз Уа1 Агд Азр 11е Азр

305 310315

ТСАСССССАС ТТТТТССАСТ СТТАТСТАТТ ТССТССАТСТ ТТССАААСАТ ТТТТТААААС1195

ААСССААСАА АСАТСТАТАТ АССТСТСТСА САСТАСТААС АСССАТСССС ССААСССТАС1255

АССАСТСАСТ АТССАТССТС ТТСАССТТСТ АСАСААСАСС ССТАТТТАСА СССАСТСССА1315

САТСТТАСАС ТСАТССТСТС ТТАСАСААТС СТТТТТАААТ ТТТСТААТСА АТТССТАСАА1375

ТТАААССАСА ТТССАССААТ ТАССССТТСА ССТТАТСАСА ААСТССАТСТ ССССТАТССС1435

АССССТТССТ СССТССТСАТ СТСССССТТС ССАССТСААС ТССАСАСССТ СТСАТСТАСС1495

ССААТТСААС САТСАТСТСА АСССССАААТ ТСТТТТСААТ ТСТТАСАТСА ТССТССААСС1555

ТССААААААТ АСТТТТТСТА АТСАССАСАС ААААТАТАТС ТАТТТТТАТА ТААТАТСТАА1615

АСТТАТАТТТ САСАТСТААТ СТТТТСТТТС САААСТАТТС ТАААТТАТАТ ТТСТССТАТА1675

СТАТТТСАТТ СААААТАТТТ АААААТСТСТ ТССТСТТСАС АТАТТТААТС ТТТТАААТСТ1735

АСАСАСАТАТ ТТААСТССТС САСТТТСТАА АТТСССТССС СААААСТТСС АССТААССАС1795

СССААААААА ТСТТСТТТСС ТААТАТСААА ТССАСТАТАТ ТТСТТССТТС ТТТТТААСТТ1855

ААТАСАТТТТ ТТСАСАСТТС ТСААСССТСТ ССАААААААТ ТААААТССАТ СССТТСААТА1915

АТААССАССА ТСТТССССАС САССТСССТТ ТСАААТТТАС АААСТААТТС АСТТТАСААА 1975 ССТСАСАТТС ССАААААССА ТАСАТААТСС СССАСТСААА ТСТСТСААСА СТАСТТАТАТ 2035 ААТТСТТСАА САССТСТТТТ ТССАСААСТС ССССАААТТС ТАССТТТТТТ ТТТТТТТСАА 2095 ААТАСААААС ТТАТТАСТСС ТТТАТСАССА АААААСТССА АТТТТААТТТ АСТАААТСТТ 2155 АТСТТАТАСТ СТАСААТААА ААСАТТСССТ ТТСААТСТТА АТТТТТТССТ АСАААААТАА 2215 АТТТАТАТСА АААААААААА ААААСССССС ССССТСТАСА ССССССТАТТ СТАТАСССТ 2274 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ЕОЯ ЗЕО ΙΟ N0:4:

(ί) ЗЕОиЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 317 апйпо ас.йз (B) ΤΥΡΕ: ΑΠίίηο ас1й (В) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (И) МОЬЕСЕЬЕ ΤΥΡΕ: ргОСегп (χί) ЗЕОЦЕЯСЕ ВЕЗСК1РТ1ОЫ: ЗЕО Ю N0:4

Мее

Агд

АХа

Зег

Агд

Азр

Туг

ТЬг

Ьуз

Туг

Ьеи

Агд

С1у

Зег

С1и

1

5

10

15

С1и

Мее

С1у

Рго

СХу

А1а

Рго

Ηί3

С1и

С1у

Рго

Ьеи

ΗΪ3

А1а

20

25

30

Рго

АХа

Рго

ΗΪ3

СХп

Рго

А1а

АХа

Зег

Агд

Зег

Мее

35

40

45

РЬе

Уах

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Ьеи

61у

С1п

Уа1

Суз

Зег

Уа1

50

55

60

А1а

Ьеи

РЬе

Туг

РЬе

Агд

АХа

С1п

Мес

Азр

Рго

Азп

Агд

Не

Зег

65

70

75

80

01 и

Азр

СХу

ТЬг

Ηίβ

Суз

Не

Туг

Агд

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

Ηίβ

С1 и

АЗП

85

90

95

АХа

Азр

РЬе

СХп

Азр

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

Азр

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Не

100

105

но

Рго

Азр

Зег

Суз

Агд

Не

Ьуз

С1п

А1а

РЬе

СХп

С1у

АХа

УаХ

С1п

115

120

125

Ьуз

СХи

Ьеи

31 η

Ηίβ

Не

Уа1

С1у

Зег

С1п

Ηίβ

Не

Агд

А1а

С1и

Ьуз

130

135

140

А1а

Мес

Уа1

Азр

С1у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Ьеи

АХа

Ьуз

Агд

Зег

Ьуз

Ьеи

145

150

155

160

СХи

АХа

С1п

Рго

РЬе

А1а

ΗΪ3

Ьеи

ТЬг

Не

Азп

А1а

ТЬг

Азр

Не

Рго

165

170

175

Зег

СХу

Зег

Ηίβ

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

Ηίβ

Азр

Агд

С1у

180

185

190

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

Мее

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

СХу

Ьуз

Ьеи

Не

Уа1

195

200

205

Азп

СХп

Азр

СХу

РЬе

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

НХз

210 215 220

Н13 225

С1и

ТЬг Зег

С1у

Азр Ьеи А1а ТЬг С1и Туг Ьеи С1п Ьеи МеС УаХ

230

235

240

Туг

Уа1

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Зег

IX·

Ьуз

1Хе

Рго

Зег

Н1з

ТЬг

Ьеи

Мег

245

250

255

Ьуз

С1у

Зег

ТЬг

Ьуз

Туг

Тгр

Зег

СХу

Азп

Зег

СХи

РЬе

Нхз

РЬе

260

265

270

Туг

зег

Не

Азп

УаХ

СХу

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

СХу

С1и

275

280

285

Не

Зег

Не

С1и

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Азр

Рго

Азр

СХп

Азр

290

295

300

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

С1у

АХа

РЬе

Ьуз

Уа1

Агд

Азр

1Хе

Азр

305 310 315 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕ(2 ΙΒ N0:5:

(1) ЗЕОЦЕЫСВ СНАНАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 52 Ьазе ра1гз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с ас1<1 (C) 5ΤΚΑΝΒΕΒΝΕ35: 81пд1е (В) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (И) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΕΝΑ (депотгс) (χί) ЗЕОУЕЫСЕ ЕЕЗСЯ1РТ1ОЫ: ЗЕО ΙΕ N0:5:

СТТСТССТСА ТАТССАТССА ААСССТАТТТ СТСААСАСАС САСТСАСТСС ТТ 52 [2} ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО Ю N0:6:

(ί) ЗЕОЕВЫСЕ СНАЯАСТЕН13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 37 Ьазе раггз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с асгй (C) 3ΤΒΑΝΕΕΕΝΕ33: 31пд1е (В) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ΕΝΑ (депопйс) (χί) ЗЕОВЕЫСВ ВЕЗСН1РТ1ОЫ: ЗЕО ΙΕ N0:6:

ТАСССАСТСС ССССТТАСТС ТАТСТССТСА АСТТТСА 37 (2) ΙΝΡΌΚΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕО ΙΟ N0:7:

(ί) ЗЕОиЕИСЕ СНАЯАСТЕЯ15Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 51 Ьазе ра1гз (B) ΤΥΡΕ: пис1егс асгй (С> 3ΤΗΑΝΒΕΒΝΕ33: з1пд1е (о) тороьосУ: Ипеаг (И) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депопис) (χί) ΒΕΟΕΕΝΟΕ ВЕЗСВ1РТЮЫ: ЗЕО ΙΟ N0:7:

АТТТСАТТСТ АСААССАССА АТААСАТАТС САТСААААСС САССТСТССА С 51 (2) ΙΝΡΟΒΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕО П) N0:8:

(ί) 3Ε0ϋΕΝ0Ε СНАВАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН:. 42 Ьазе раХгз (B) ΤΥΡΕ: пис1еЬс асхй (C) 3ΤΒΑΝΕΕΕΝΞ33: зХпдХе (В) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ΒΝΑ (депотЬс) (χί) ЗЕОЕЕЫСЕ ВЕЗСН1РТ10Ы: ЗЕО ΙΟ N0:8:

ТАТССССССА ТССТССАСТТ АСТСТАТСТС СТСААСТТТС АА 42 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО Ю N0:9:

(ί) ЗЕОЕЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 54 Ьазе ра!гз (B) ΤΥΡΕ: писЬегс асхй (C) 3ΤΗΑΝΒΕΒΝΕ33: З1пд1е (Ό) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΒΝΑ (депопНс) (Χί) ЗЕОиЕЫСЕ ВЕЗСЯ1РТ1ОЫ: ЗЕО Ю N0:9:

АТТТСАТТСТ АСААССАССА АТААСАТАТС ТСТСААСАСА СТСТСССССА СТСС 54 (2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО Ю N0:10:

(ί) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАЯАСТЕК15Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 42 Ьазе раХгз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с асхй (C) ЗТЯАЫВЕОЫЕЗЗ: Э1пд1е (в) тороьосу: Ипеаг (ίί) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (деповйс) (Χί) ЗЕОВЕЫСЕ ВЕ5СЯ1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:10*

ТАТССССССА ТССТССАСТТ АСТСТАТСТС СТСААСТТТС АА 42 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ΙΒ N0:11:

(ί) ЗЕОиЕЫСЕ СНАЯАСТЕК13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 43 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с асгй (C) 3ΤΒΑΝΒΕΒΝΕ35: з1пд!е (0} ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ϋ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (χΐ) ΕΕΟϋΕΝΟΕ ОЕЗСЯХРТГОЫ: ЗЕО ΙΟ N0:11:

АТТТСАТТСТ АСААССАССА АТААСАТАТС АААСААССТТ ТТСАСССС 48 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК 3Ε0 ΙΟ N0:12:

(ΐ) δΕΟΟΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1С8:

(Α} ЬЕЫСТН: 42 Ьазе рахгз (В) ΤΥΡΕ: писХехс асхб (Ο 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ35: з!пд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ϋ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депопйс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО ГО N0:12:

ТАТССССССА ТССТССАСТТ АСТСТАТСТС СТСААСТТТС ΑΑ 42 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОЙ ЗЕО ΙΟ N0:13:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕН13Т1С5:

(Α) ΟΕΝΟΤΗ: 31 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1еха асхй (C) 5ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ53: з!пд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ϋ) моьесцье τυρέ: ϋΝΑ (депотхс) (Χΐ) 5Ε0ΟΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО ΙΟ N0:13:

АТТТСАТТСТ АСААССАССА АТААСАТАТС АААСААСТСС АССАСАТТСТ С 51 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕО 10 N0:14:

(ΐ) 3Ε0υΕΝΟΕ СНАНАСТЕЯ13Т1СЗ:

(Α) 1ΕΝ0ΤΗ: 42 Ьазе рахгз (B) ТУ1?Е: пис1ехс асхб (C) 3ΤΚΑΝΕΕ0ΝΕ53: З1пд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ϋ) моьесхтье τυρέ: ονα (депопйс) (Χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ΙΟ N0:14:

ТАТССССССА ТССТССАСТТ АСТСТАТСТС СТСААСТТТС АА 42 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО ГО N0:15:

(ΐ) ЗЕОСТЕИСЕ СНАЯАСТЕЙ13Т1СЗ:

(A) ЬЕИСТЕ: 51 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд!е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (хх) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (Χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО ΙΟ N0:15:

АТТТСАТТСТ АСААССАССА АТААСАТАТС САСССТТТСТ СТССТССТСС А 51 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО Ю N0:16:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 42 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: 8хпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ОЕЗСН1РТ1ОМ: ЗЕО ГО N0:16:

ТАТССССССА ТССТССАСТТ АСТСТАТСТС СТСААСТТТС АА 42 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО ГО N0:17:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(Α) ΣΕΝΟΤΗ: 40 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб (C) δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: Зхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО Ю N0:17:

СТТСТССТСА ТАТССААССТ ТСТТССТТСС АТСТСССССА 40 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО И N0:18:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК13Т1С5:

(Α) ΏΕΝΟΤΗ: 37 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб (C) 5ΤΚΑΝ0Ε0ΝΕ53: эхпдХе (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депот!с) (Χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:18

ТАСССАСТСС ССССТТАСТС ТАТСТССТСА АСТТТСА 37 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО ГО N0:19:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(Α) ΟΕΝΟΤΗ: 44 Ьазе рахгз (B) ТУРЕ: пис1ехс асх<1 (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: эхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:19:

СТТСТССТСА ТАТСССТССТ АААССТСААС СТСААССАТТ ТССА 44 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО ГО N0:20:

(ΐ) ЗЕОиВМСЕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:

(A) ϋΕΝΟΤΗ: 37 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с асЬб (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ53: зхпд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ΙΟ N0:20:

ТАСССАСТСС ССССТТАСТС ТАТСТССТСА АСТТТСА 37 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО Γϋ N0:21:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СКАКАСТЕК13Т1СЗ:

(A) ЬЕМСТН: 53 Ьазе рахгз (B) ТУРЕ: пис1ехс асхб (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (хх) δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:21:

СТТСТССТСА ТАТСАААССТ СААССТСААС САТТТССАСА ССТСАССАТС ААТ 53 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО 10 N0:22:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:

(Α) 6ΕΝ0ΤΗ: 37 Ьазе рахгз (B) ТУРЕ: пис1е1с ас1б (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: 31пд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (хх) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΕΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:22: ''

ТАСССАСТСС ССССТТАСТС ТАТСТССТСА АСТТТСА37 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:23:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:· (Α) ϋΕΝΟΤΗ: 65 Ьазе ра1гз (B) ΤΥΡΕ: писХехс асх<1 (C) δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: зхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (хх) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:23:

СТТСТССТСА ТАТССАТТТА АСТАТТААСС СТССАТСТАТ СССАТССССТ ТСССАТАААС 60

ТСАСТ 65 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО 10 N0:24:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:

(Α) ΟΕΝΟΤΗ: 37 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс ас!<1 (C) δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ЗхпдХе (О) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ΠΝΑ (депотхс) (χΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:24:

ТАСССАСТСС ССССТТАСТС ТАТСТССТСА АСТТТСА 37 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОЙ ЗЕО Ю N0:25:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ:

(A) ЬЕКСТН: 59 Ьазе рахгз (B) ТУРЕ: пис1ехс асхй (C) δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ЗХПд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ΐΐ) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: 0ΝΑ (депотхс) (χΐ) 3ΕΟΟΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО Ю N0:25.’:

СТТСТССТСА ТАТСАСТАТТ ААСССТССАТ СТАТСССАТС СССТТСССАТ АААСТСАСТ 59 (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:26:

(ΐ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК13Т1СЗ:

(Α) ϋΕΝΟΤΗ: 37 Ьазе рахгз (В) ТУРЕ: пис!ехс асхб (С) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: 8апд1е (О) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас)

Азп А1а А1а Зег Не Рго Зег С1у Зег 1 5

Наз Ьуз Уа1 ТЬг Беи Зег Зег ' 15

Тгр Тут Наз Азр Агд С1у Тгр А1а Ьуз

- 20 25

Не Зег (χί) δΕΟϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб ГО N0:26:

ТАСССАСТСС ОСООТТАСТС ТАТОТССТСА АСТТТС-А 37 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ δΕς Ю N0:27:

(ί) 3Ε0ϋΕΝΟΕ СНАНАСТЕН13Т1С5:

(A) ЬЕЫСТН: 30 Ьаэе раагз (B) ΤΥΡΕ: пис1еас асай (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ53: запд1е

Ю) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас) (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОВ ЗЕб Ю N0:34:

(а) (ίί) (χί) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАНАСТЕВ13Т1СЗ:

(A) ------- ’ · · (B) (C) (О)

ЬЕЫСТН: 28 'атапо асайз ΤΥΡΕ: ат1по ас1й 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: запд1е ТОРОБОСУ: Ипеаг

МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ргоЬе1п

3Ε6ϋΕΝ0Ε ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:34:

(χί) 3Ε6ϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΒΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб ΙΟ N0:27:

ССТСТАСССС ТСТАСТТТСС АССССАОАТС 30 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ ЗЕб 10 N0:28:

(ί) δΕβΟΕΝΟΕ СНАКАСТЕВ13Т1СЗ:

(A) ΕΞΝΟΤΗ: 32 Ьазе раагз (B) ΤΥΡΕ: пис1еас асай (C) δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: βίηςίβ (О) ΤΟΡΟΙιΟΟΥ: ΙίηββΓ (ίί) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотас)

Азп

Тгр

А1а А1а Зег Не Рго Зег С1у Зег Наз Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи Зег Зег 5 10 15

Тут Над Азр Агд О1у Тгр А1а Ьуз Не Зег Суз 20 25 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕб 10 N0:35:

(а) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАНАСТЕН13Т1СЗ:

(A) -------- -- · ' (B) (C) (О)

ЬЕЫСТН: 17 аш!по асайз ΤΥΡΕ: этапе асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: З1пд1е ТОРОБОСУ: Ипеаг (И)

МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ргоЬейп (χί) ЗЕОиЕЫСЕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб ΙΟ N0:28:

ССТСТССССС СССОТСТАТО ТССТСААСТТ ТС 32 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕб 10 N0:29:

(ί) ЗЕбиЕЫСЕ СНАВАСТЕН13Т1СЗ:

(A) ΟΕΝΟΤΗ: 46 Ьазе раагз (B) ΤΥΡΕ: пис1еас асай (C) δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е (О ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас) (ха)

Уа1

МеЬ δΕΟΕΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб ГО N0:35:

Туг Уа1 νβΐ Ьуз ТЬг Зег Не Ьуз Не Рго Зег Зег Наз Азп

10 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕб 10 N0:36:

(ί)

Беи (χί) ЗЕбОЕЫСЕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб 10 N0:29:

ССТСТСТССА СТСОАСААСС САСААСССТС АСССССАССС АТТТСС 46 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОВ ЗЕб 10 N0:30:

(ί) 3Ε6ϋΕΝ0Ε СНАВАСТЕВ13Т1СЗ:

(А) ЬЕМСТН: 32 Ьазе раагз (в) ΤΥΡΕ: пис1еас ас!й (С) δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е (О) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депопйс)

ЗЕбиЕЫСЕ СНАВАСТЕНГЗТ1СЗ:

(A) ........... ’ (B) (C) (О)

ЬЕКСТН: 31 Ьазе раагз ΤΥΡΕ: пис1еас асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е ТОРОБОСУ: Ипеаг (ίί)

МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас) δΕΟυΕΝΟΕ ϋΕδΟΒΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:36:

ТСТССААССТ ТСТСАСТСТС САССТСАСТС С (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕб 10 N0:37:

(а) (χί) δΕΟΟΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:30:

сстстссссс ССССТСТАТС ТССТСААСТТ ТО 32 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕб 10 N0:31:

(ί) 3Ε0ϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕВ15Т1СЗ:

(Α) ЪЕКСТН: 56 Ьазе раагз (B) ΤΥΡΕ: пис1е1с асай (C) δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: з1пд1е (О) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депопйс)

ЗЕбЦЕЫСЕ СНАВАСТЕК13Т1СЗ:

(A) -------- ' ' ' ' (B) (C) (О)

ΙιΕΝΟΤΗ: 36 Ьазе раагз ΤΥΡΕ: пис1еас асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: з1пд!е ТОРОЬОСУ: Ипеаг

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотас) (ха)

ΒΕΟϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб 10 N0:37:

ТСТССССССС СбСОТААССС ТСССССТСАТ ТСООТО (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОВ ЗЕб 10 N0:38:

(а) (Χί) ЗЕбиЕИСЕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:31:

АОСТТССАСС АТСААСААСТ ОССТОТОСТО СССАСТССТО ОТССТССТСС АСАТСА 56 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕб И N0:32:

(ί) 3Ε0ΟΕΝΟΕ СНАЯАСТЕН13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 56 Ьазе раагз (B) ΤΥΡΕ; пис1еас асай (C) δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: 8апд1е (О) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ϋΝΑ (депотас) δΕΟΊΕΝΟΕ СНАВАСТЕВ13Т1СЗ:

(A) -------- — ' ' (B) (C) (О

ЬЕ№ТН: 72 Ьазе раагз ΤΥΡΕ: пис1еас асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е ТОРОЬОСУ: Ипеаг (И) (ха)

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас) δΕΟΝΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: 5Е0 ΙΟ N0:38:

СТАССАССАТ ОААСААСТСО СТСТССТОСС САСТССТССТ ССТССТССАС АТСАТТСААТ

ОСАСААСССА СА (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОВ ЗЕб Ю N0:39:

(ί) (χί) 3Ε0ϋΕΝ0Ε ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: δΕΟ Ю N0:32:

ТСОАТСАТОТ ССАССАССАС САОСАСТОСб САССАСАССС АСТТОТТСАТ ССТСОА 56 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОВ ЗЕб Ю N0:33:

(ί) 3Ε6ϋΕΝ0Ε СНАНАСТЕВ13Т1СЗ:

(A) БЕИСТН: 27 алйпо асЬйз (B) ΤΥΡΕ: атапо асай (C) δΤΗΑΝΟΒΟΝΕ33: запд1е (ϋ) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (ίί) МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ргоЬеап

ЗЕбЦЕИСЕ СНАНАСТЕВ13Т1СЗ:

(A) -------- -- ' ' (B) (C) (О

ЪЕИСТН: 72 Ьазе раагз ΤΥΡΕ: пис1еас асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е ТОРОЬОСУ: Ипеаг (аа)

МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ΟΝΑ (депотас) δΕΰϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:39:

АССТТСТССС ТТСТССАТТС ААТСАТСТСС АССАССАССА С-ОАСТССССА ССАСАСССАС

ТТСТТСАТСС ТО (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕб Ю N0:40:

(χί) δΕΰϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΒΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб ΙΕ N0:33 (ί) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАВАСТЕВ13Т1СЗ: БЕЫСТН: 9 атапо асайз ΤΥΡΕ: атапо асай δΤΒΑΝΟΕΟΝΕδδ: запд1е ТОРОБОСУ: Ипеаг (A) (B) (C) (О) (аа)

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргокеап (ха) ЗЕбЦЕЫСЕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕб Ю N0:40:

Ьуз Ьеи Уа1 ΤΙιτ Ьеи С1п Уа1 ТЬг Рго

5 .

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая остеопротегеринсвязывающий белок, выбранная из группы, включающей:

а) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:1) и фиг. 4 (8ЕО ГО ^:3);

б) нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с участками последовательности, приведенной в а), причем последовательность, приведенная в а), кодирует остеопротегеринсвязывающий белок, показанный на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:2) и фиг. 4 (8ЕО ГО ^:4);

в) нуклеиновые кислоты, которые являются вырожденными по отношению к нуклеиновым кислотам (а) или (б).
2. Нуклеиновая кислота по п.1, представляющая собой кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК или РНК.
3. Нуклеиновая кислота по п.1, включающая один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в ЕксйепсЫа сой.
4. Нуклеиновая кислота по п.1, имеющая прикрепленную к ней детектируемую метку.
5. Нуклеиновая кислота по п.1, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 1-316, как показано на фиг. 1 (8Е0 ГО NО:1).
6. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 70-316, как показано на фиг. 1 (8ЕО ГО ΝΘ:1).
7. Нуклеиновая кислота по п.1, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 1-317, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО NО:3).
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 69-317, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО ^:3).
9. Нуклеиновая кислота, кодирующая растворимый остеопротегеринсвязывающий белок, содержащий остатки 69-317, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО NО:3), и его усеченные на N и С концах формы, которые стимулируют образование остеокластов или резорбцию костей.
10. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-9.
11. Вектор экспрессии по п.10, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота содержит участок, кодирующий полипептид, как показано на фиг.1 (8ЕО ГО ^:2) и фиг. 4 (8ЕО ГО ^:4).
12. Штамм культуры прокариотической и эукариотической клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии по п.10.
13. Штамм по п.12, представляющий собой штамм культуры клеток ЕксйепсЫа Сой.
14. Способ получения остеопротегеринсвязывающего белка, включающий культивирова ние штамма клеток-хозяев по п.12 в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, и выделение полипептидного продукта экспрессии.
15. Полипептид, полученный способом по п.14.
16. Выделенный остеопротегеринсвязывающий белок, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, или его фрагмент, аналог или производное, которые стимулируют образование остеокластов или резорбцию костей.
17. Белок по п.16, который ковалентно модифицирован с помощью водорастворимого полимера.
18. Белок по п.17, отличающийся тем, что полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
19. Белок по п.16, представляющий собой растворимый остеопротегеринсвязывающий белок.
20. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 70-316, как показано на фиг. 1 (8ЕО ГО NО:2), или его фрагмент, аналог или производное.
21. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 69-317, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО NО:4), и его усеченные формы.
22. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 140316, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО NО:4), или фрагмент, аналог или производное данного белка.
23. Белок по п.19, содержащий амино кислотную последовательность из остатков 145316, как показано на фиг. 4 (8ЕО ГО NО:4), или его фрагмент, аналог или производное.
24. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с остеопротегеринсвязывающим белком по п.16.
25. Способ выявления наличия остеопротегеринсвязывающего белка в биологическом образце, включающий инкубирование образца с антителом по п.24 в условиях, обеспечивающих связывание антитела с остеопротегеринсвязывающим белком, и выявление связанного антитела.
26. Способ выявления наличия остеопротегерина в биологическом образце, включающий инкубирование образца с остеопротегеринсвязывающим белком по п.16 в условиях, обеспечивающих связывание белка с остеопротегерином, и определение связанного остеопротегеринсвязывающего белка.
27. Способ определения способности тестируемого соединения связываться с остеопротегеринсвязывающим белком, включающий инкубирование остеопротегеринсвязывающего белка по п.16 с тестируемым соединением в условиях, обеспечивающих связывание, и выявление связанного соединения.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что соединение представляет собой агонист или антагонист остеопротегеринсвязывающего белка.
29. Способ регулирования экспрессии остеопротегеринсвязывающего белка в организме животного, включающий введение животному эффективного количества нуклеиновой кислоты по п.1б).
30. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество остеопротегеринсвязывающего белка по п.16 в фармацевтически приемлемом носителе, адъюванте, солюбилизаторе, стабилизаторе и/или антиоксиданте.
31. Композиция по п.30, отличающаяся тем, что остеопротегеринсвязывающий белок представляет собой остеопротегеринсвязывающий белок человека.
32. Способ предотвращения или лечения заболеваний костей у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора остеопротегеринсвязывающего белка, причем указанный модулятор является антителом по п.24, которое ингибирует образование остеокластов или резорбцию костей.
33. Способ оценки способности тестируемого соединения усиливать или ослаблять связывание остеопротегеринсвязывающего белка с рецептором дифференцировки и активации остеокластов, включающий инкубирование остеопротегеринсвязывающего белка, указанного рецептора и, необязательно, тестируемого соединения в условиях, обеспечивающих связывание остеопротегеринсвязывающего белка и указанного фактора, и выявление связывания остеопротегеринсвязывающего белка с указанным рецептором в отсутствие или в присутствии тестируемого соединения.