HU230547B1 - Osteoprotegerin-kötő fehérjék és receptorok - Google Patents

Description

Osteoprotegerin-kötö fehérjék és receptorok

A jelen találmány tárgyat az ostéoclast (csontlebontó) sejtek differenciálódásában szerepet játszó polipeptídek képezik. Pontosabban, a találmány tárgyát az osteoprotegerínt kötő fehérjék, a fehérjéket kodoló nukleinsavak, expresszíós vektorok, és a fehérjéket termelő gazdasejtek, valamint a kötési vizsgálatok képezik. A csontbetegségek, azaz például az oszteoporózis, az arthritis miatti csontvesztés, a Paget kór és a hiperkalcémía kezelésére szol-

A találmány tárgyát képezik továbbá az osteoprotegerínt kötő fehérjék receptorai, valamint a csontbetegségeknek a receptorok felhasználásával végzett kezelésében használt módszerek és zitménvek

Az élő csontszövetben dinamikus egyensúly van a csonibeépúlés és a csontfelszívódás között. Ezek a folyamatok elsődlegesen két sejttípus közreműködésével játszódnak le: az osteoblastok, amik a. csont szerves hordozóanyagát képező anyagot szekretálják; és az osteoclastok, amik a csont-mátrix feloíódását és a csont-sók oldatba vitelét segítik elő. A növekedésben levő csontokkal rendelkező fiatalokban a csontlerakódás sebessége meghaladja a csontfeloldódásét, míg az idősebbekben a feloldódás sebessége haladhatja meg a lerakódásét. Az utóbbi helyzetben a csont fokozott lebomlása a csont tömegének és erősségének csökkenéséhez vezet, ami növeli a törések 1 iát, és lelassít ja, vagy tökéletlenig a törött csontok gyógyulását.

csontvelőben keletkeznek a hematopoietikus őssejtekből. Bár az érett, funkcionális osteodastok. növekedését és képződéséi még nem értjük egészen, azt gondoljuk, hogy az osteoclastok a monocita/makrofág sejtcsaláddal együtt érnek meg, a különböző növekedést elősegítő fáktorokra adott válaszként, A csontvelő prekurzor sejteknek pro-osteoclastokká való karai fejlődéséről azt gondolják, hogy oldható faktorok, azaz például a tumor nekrózis faktor-» (TNF~a), a tumor nekrózis faktor-β (TNF-β), az interleukin-1 az interleukin~4 (IL-41, az interleukm-ú (IL-6), valamint a leukémiát gátlő faktor <ILF) közvetítik. Tenyészetben pro-osteodastok képződnek hozzáadott makrofág: telepserkentő faktor (MCSF) jelenlétében. Ezek a faktorok elsődlegesen az osteoclast fejlődésének korai lépéseiben hatnak. A polipeptid faktoroknak az osteoclast képződésének végső stádiumában, való részvételét még nem írták le részletesen, Azt azonban leírták, hogy a parathyroid hormon serkenti az osteoclastok képződését és aktivitását, és a kalciton ínnak ezzel ellentétes a hatása, bár kisebb mértékben.

Újabban egy új polipeptid faktort írtak le, az osteoprotegerínt (O.PG|, ami negatívan szabályozza az osteoclastok képződését ín Mtm és ín mao (lásd az 1.995, december 22-én benyújtott 08/577,788 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, az 1996. szeptember 3-án benyújtott számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk, valamint a WO96/2627I számú !Q :erint és csökkenti a csontveszteséget, ha ovariectomiás (petefészekirtott) patkányoknak adjuk be. Az OPG aktivitásának az elemzése az in ritro osteoclast képződésben kiderítette, hogy az osteoprotegerin nem zavarja a monorita/makrofág prekurzorok növekedését és differenciálódását, de sokkal valószínűbb, hogy blokkolja az asteoclastok differenciálódását a monocita/makrofág prekurzorokból. Tehát úgy tűnik, hogy az csteoprotegerin specifikusan szabályozza az osteoclast képződését.

Az osteoprotegerin két, különböző strukturális és funkcionális tulajdonságokkal rendelkező polipeptíd domént tartalmaz. Az N-terminális dómén a teljes hosszúságú polipeptídnek a. 2294~es amínosavaira terjed ki (az N-terminális metíonint tekintjük az 1-es csoportnak), és homológiát mutat a tumor nekrózis faktor receptor (TNFR) család más tagjaival, főleg a TNFR-2-vel, bár a risztemben gazdag d ómenek konzerválódása jellemző a TNFR család tagjaira. A 194-401-es csoportokra, terjedő C-terminális dómén nem mutat szignifikáns homológiát semmilyen ismert szekvenciával. A TNFR család többi tagjától eltérően úgy tűnik, hogy az osteoprotegerin kizárólag szekretált fehérje, és nem úgy tűnik, hogy membránhoz asszociálódott formában színtetizálódik.

Az aktivi tása alapján (az osteoclast képződés negatív szabályozőia) azt állítják, hogy az osteoprotegerin kötődhet egy olyan pohpeptid. faktorhoz, ami szerepet játszik az osteoclast differenciálódásában, és ennek következtében az érett osteoclast képződéséhez vezető terminális lépések közül egyet vagy többet blokkolhat.

Ennek, következtében a jelen találmány célkitűzése olyan polipeptidek azonosítása, amik kölcsönhatásba lépnek az osteoprotegerinnel. Az említett polipeptidek szerepet játszhatnak az.

osteoclast érésében, és jól használhatók lehetnek a. csontbeteg ségek kezelésében.

A tumor nekrózis faktor családnak egy űj tagját azonosí tottuk egy rágcsáló COS sejtekben expresszált cDNS könyvtárból, a szűrővizsgálathoz affinitás! próbaként egy rekombináns osteo protegerin-Fc fúziós fehérjét használva. Az új polipepüd egy transzmembrán osieoprotegerin-köto fehérje, aminek a hosszát 316 aminosavra becsüljük, és rendelkezik egy H-terminális cito plázmátikús doménnet egy transzmenibrán doménnel és egy C terminális extracelluláris doménnel. A találmány szerinti, osteoprotegerint kötő fehérjék kötődhetnek a membránhoz, de lehet nek oldható formáinak is.

A találmány tárgyát olyan ellenanyagok, illetve azok fragmensei, képezik, amelyek specifikusan kötődnek az osteoprote ge.rmt kötő fehérjéhez (OPGbp), ahol az ellenanyag vagy annak fragmense gátolja az osteoclast képződést. Szintén a talámány tárgyát képezik az ezeket az ellenanyagokat illetve íragmenseíket tartalmazó gyógyászati készítmények,.

Szintén a találmány tárgyát képezik az említett ellenanyagok, vagy fragmenseik csontfelszívödás és osteoclastgenezis gátlásánál történő alkalmazásra.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy az OPGbp aktivitását csökkentő vegyület azonosítására szolgáló eljárás is.

Az osteoprotegerint kötő fehérjéket használhatjuk a külön böző vizsgálatokban, amikkel mennyiségileg határozzuk meg az osteoprotegerin szinteket a biológiai mintákban, azonosítjuk azokat a sejteket és szöveteket, amik az osteoprotegerint kötő fehér jét tartalmazzák, és azonosítjuk az osteoprotegerin és osteoprntegerin-k.őtő fehérjecsalád új tagjait. A találmány tárgyát képezik <rt továbbá azok az eljárások, amikkel. azokat a vegyületeket lehet azonosítani, amik kölcsönhatásba lépnek az osteoprotegerint kötő fehérjével. Ilyen vegyületek lehetnek a nukleinsavak, peptidek, fehérjék, szénhidrátok, lipidek vagy kis molekulasülyű szerves molekulák, és az osteoprotegerint kötő fehérje aktivitásának agoPistájaként vagy aniagonistájaként hathatnak.

Az osteoprotegerint kötő fehérjék szerepet játszanak az osteoclastok differenciálódásában, az osteoclast: aktivitás szintje viszont befolyásolja a csontfelszívódást. Az osteoprotegerint kötő fehérje agonistái és antagonístái befolyásolják az osteoclast képződését és a csontfel szívódási, és arra, használhatók, hogy olyan gségeket kezeljünk velük, amiket a csontfelszívódás változásai jellemeznek, mint például az oszteoporózis, a hiperkalcémía, az arthritis áttétel miatt bekövetkező csontfelszívődás, a Paget kor, az osteopetrosis, a. profetikus lazulás és hasonlók. Az osteoprotegerint kötő fehérjéket és az osteoprotegerint kötő fehérjék antagonistáit tartalmazó gyógyászati készítményekre is kiterjed a jelen találmány oltalmi köre.

Az osteoprotegerint kötő fehérjék receptorait is azonosítottuk-egy rágcsáló cDNS könyvtárból, amit olyan csontvelő sejtekből készítettünk, amik kötődnek egy fluoreszcenciásan jelzett osteoprotegermt kötő fehérjéhez·. A receptorok használhatók arra, hogy azonosítsuk az osteoprotegerint kötő fehérjének a receptoraival való kölcsönhatása szempontjából agonista és antagomsta anyagokat, amik viszont csontbetegség kezelésére használhatók.

domént és az aszparaginhoz kötött szénhidrát láncok helyeit aláhúztuk.

2. ábra: Az osteopTotegermt kötő fehérje expressziöja pcDNA/32D-F3 vektorral transzfektált COS-7 sejtekben. A sejteket pcDNA/32D-F3 DNS-se! lípofektáljuk, amit arra vizsgáltunk, hogy kötődik-e a kecske anti-humán IgGl alkalikus foszfátáz konjugátumhoz (csak szekunder), a humán OPG [22-201 hFc plusz szekunder (OFG-Fc)-hez, vagy egy kim éra ATAR extracelluláris domén-Fc fúziós fehérjéhez (sATAR-Fc). Az ATAR a YNFR g’ szupercsalád egy' új tagja, és a sATAR-Fc fúziós fehérje szolgál kontrollként mind a humán IgGl Fe dómén kötéséhez, mind a ;eneríkus THFRrhez kapcsolódó fehérjéhez, ami a 32D sejtfel színi molekulákhoz kapcsolódik.

3. ábra: Az osteopmtegennt kötő fehérjék expressziója humán szövetekben. A humán szöveti mRNS (Clontech) Nörthern biot elemzése, radfeaktívan jelzett 32D-F3 eredetű hibridizációs próbával. A relatív molekulasúlyt a. bal oldalon mutatjuk be, kilobázispárokban (kb). A jobb oldalon a nyílhegy egy körülbelül 2,5 kilobázis méretű átiratnak a vándorlását mutatja, amit nyirok csomó mRNS-ben lehetett kimutatni.

4. ábra: A pcDNA/hu OPGbp L1 inszert struktúrája és szekvenciája, ami a humán osteoprotegerint kőtő fehérjét kódolja. A megjósolt transzmembrán domént és az aszparaginhoz kötött szénhidrát láncok helyeit aláhúztuk.

5. ábra: Az osteoclast fejlődésének serkentése in felró csontvelő makrofágokből és ST2 sejt ko-tenyészetekből, amiket rekombináns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérjével (158-316): kezeltünk. A tenyészeteket különböző koncentrációjú rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérjével kezeljük, a koncentráció 1,6-500

X ng/ml között változik. 8-10 nap elteltével a tenyészeteket, lizáltatjük, majd a TRAP aktivitást oldatban való vizsgálattal mérjük. Emellett néhány tenyészetet, egyidejűleg kezelünk 1, 10, 100, 500 és 1000 ng/ml rekombináns rágcsáló OPG [22-401]~Fc fehérjével. A rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje az osteoclast képződés dózisfüggő képződését indukálja, míg az OPG [22-401 ΙΓο gátolja az osteoelast képződését.

5. ábra: Az osteoelast csontvelő prekurzo-rokból való m

lünk, majd tenyésztjük 250. 500, 1000 és 2000 E/ml M-CSF jelenlétében. Az osteoelast fejlődését TRAP oldat vizsgálattal mér-

7. ábra: A csontvelő sejtekből mind M-CSF mind osteo protegerint kötő fehérje (158-316] jelenlétében származó osteo elastok ín aíteo reszorbeálják a csontot. Az M-CSF-M, vagy osteoprotegerint kötő fehérjével, vagy mindkét, faktorral kombinálva kezelt csontvelő sejteket tenyésztő Inkákban csontszeletekre szélesztjük, majd hagyjuk, hogy érett osteoclastokká fejlődjenek. A kapott tenyészeteket azután Toluidine Blue-val (baloldali oszlop), vagy hisztokémiailag: festjük, hogy kimutassuk a TRAP enzim, aktivitását (jobboldali oszlop). A mindkét faktort kapott tenyészetekben érett osteoclastok képződnek, amik képesek erodálni a csontot, amit a csont felszínén a kékre festett gödröcskék jelenléte alapján lehet megítélni. Ezek összhangban vannak a többszörös, nagy, több sejtmagot tartalmazó TRAP pozitív sejtek jelenlétével.

8. ábra: A teljes vér ionizált kalcium (iCa) szinteket mu tató grafikon, olyan egerekben, amiket osteoprotegerint kötő héxjével injekcióztunk. 51 órával az első injekció után, valamint olyan egerekben, amik egyidejűleg osteoprotegerint kaptak. Az osteoprotegerint kötő fehérje szignifikánsan és dózisfüggő módon nőveü az iCa szinteket. Az osteoprotegerin (1 mg/kg/nap) teljesen blokkolja, az iCa mennyiségének növekedését, 5 pg/nap dózisban adott osteoprotegerint kötő fehérje, és részlegesen blokkolja a növekedést 25 pg/nap dózisban beadott osteoprotegerint kötő fehérje. (*) eltér a hordozóval kezelt kontrolitól (p<0,05). # osteoprotegerinnel kezelt iCa szint szignifikánsan eltér attól a szinttől, amit olyan egerekben kaptunk, amik csak az osteoprotegerint kötő fehérje dózisát kapták (p<0,05)<

9. ábra: 3,5 napig 0, 5_f 25 vagy 100 |ig:/nap osteoprotegerín fehérjével kezelt egerek bal combcsontjának és sípcsontjának radiográfiás felvétele. Megfigyelhető dózisfüggő csökkenés a. csont sűrűségében, ami ezekben az egerekben legtisztábban a. proximális sípcsont metafizíshen figyelhető meg, és ez a fegerő-

szekvenciáját mutatjuk be, valamint bemutatjuk a jelzett, 625 csoportra terjedő nyílt leolvasási keret, transzlációját. A hidrofób szignálpeptidet aláhúztuk, és a hidrofób transzmembrán szekvenciát (214-234-es csoportok) vasíagítottuk. /Íz extraceiluláris doménben a ciszteinben gazdag ismétlődő motívum cisztein--csoportjaít is vasíagítottuk.

11. ábra: Az ODAR-Fc-nek az osteoprotegerint kőtő fehérjével transzfektált sejthez való kötődésének immun fluoreszcens festése. Az osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló expressziós plazmáddal transzfektált. COS-7 sejteket humán IgG-vel (felső panel).

ODAR-Fc-vel (középső panel), vagy OPG-Fc-vel (alsó panel) inkubáljuk. Egy FITC-vel jelzett kecske anti-humán IgG Fc ellenanyagot használunk szekunder ellenanyagként.· A pozitív kötődést mutató sejteket konfokális mikroszkópiával vizsgáljuk.

12. ábra: Az ODAR-Fc hatasa az osteoclastok egér csontvelőből való m vítro keletkezésére. A rágcsáló csontvelő tenyésze teket. a S. példában ismertetett módon hozzuk. létre, majd 5 ng/ml osteoprotegerint kötő fehérjével és 30 ng/ml CSF-l-gyel hozzuk érintkezésbe. Különböző (1500 ng/ml - 65 ng/ml) koncentrációjú ODAR-Fc-t adunk hozzá. Az osteoclast képződést TRAP cítokémíával, és TRAP oldat vizsgálattal becsüljük- meg 5 napos tenyésztés után.

13. ábra: A csont ásványi anyag sűrűsége egerekben négynapos, különböző dózisa ODAR-Fc-vel való kezelés után. Az egerek az ODAR-Fc-t napi szubkután injekcióban kapták, foszfáttal puffereit sóoldat hordozóban. Az ásványi anyag sűrűségét

malis sípcsont metaűzisénéí, perifériális kvantitatív számítógépes tomográfiával (pQCT) (XCT-960M, Norland Medical Systems, Ft Atkinson, WI). A csontból két 0,5 mm-es metszetet, a sipcsont elemzőnk (XMCE 5,2, Stratec, Németország) annak meghatáro zására, hogy' a metafízísben mennyi az össz-csont ásványi anyag sűrűség. Egy 1500-as küszöbértékú lágyszövet készítményt használunk annak meghatározására, hogy hol van a metafízíses csont okozott a csont ásványi anyag sűrűségében a proximális sípcsont metafízísben. Csoport. n~4.

A találmányban ismertetett osteoprotegerint kötő fehérje néven ismert polipeptid specifikusan köti az O.PG-t, és szerepet játszik az osteoclast difierencíálódásában. A polipeptid rágcsáló formáját kődolő cDNS kiónt egy egér míelomunocita 32-D sejtvenaiból készített könyvtárból azonosítjuk, majd COS sejtekbe transzfektáljuk. A. transzfektánsoknak vizsgáljuk, azt a képességét, hogy megkötnek-e egy OPG[22-201]-Fe fúziós polipeptidet (1. példa). A nukleinsav szekvenciából kiderült, hogy az osteoprote gerint kötő fehérje a TNF családnak egy új

és szoros rokonságban van az AGP-l-gyel, egy olyan polipeptiddel, amit az 1996. június 7-en bejelentett, 08/660,562 sorozatszámú Amerikái Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban írtak le. .Az AGP-l gyel azonos, TRAIL néven nevezett polipeptidet írtak le a szakirodalomban [Wiley és mtsai: Immunity 3, 673682 (1995)]. Az osteoprotegerint kötő fehérjéről azt gondoljuk, hogy egy 11-es típusú transzmembrán fehérje, aminek van egy citoplazmatikus doménje az ^-terminálison, egy t.ranszmembrán doménje és egy

C-terminális extracelluláris doménje (1. ábra). Az N-termináiis citoplazmatikus dómén körülbelül az 1-48-as csoportokra teljed ki, a. transzmembrán dómén körülbelül a 49-69-es csoportokra terjed ki, és az extraoeiluláris dómén körülbelül a 70-31.6-os csoportokra terjed ki, amint az az 1. ábrán látható (2. számú szekvencia). A membránhoz kapcsolódó· fehérje specifikusan kötődik az osteoprotegerínhez (2. ábra). Tehát az osteoprotegerint kötő fehérje és az osteoprotegerin számos közös, egy receptor-l.igan.dum. párra jellemző tulajdonságokkal rendelkezik, bár lehetséges, hogy az osteoprotegerintGkötő fehérjének más, a természetben előforduló receptorai is léteznek.

Egy humán. osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló DNS kiónt egy nyirokcsomó cDNS könyvtárból izoláltunk. A humán szekvencia (4, ábrái homológ a rágcsáló szekvenciával. A tisztított oldható rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje serkenti az osíeoclast képződését in. mtro, és hiperkalcémiát valamint csont feloldódást indukál m. vfeo.

Az osteoprotegerint kötő fehérje egy⁷ olyan polipeptid, aminek az aminosav szekvenciája azonos az emlős osteoprotegerint kötő fehérje aminosav szekvenciájával, vagy annak egy fragmensével, analógjával vagy származékával, és legalább az osteoprotegerint kötő aktivitásával rendelkezik. Az előnyős megvalósítási módok szerint az osteoprotegerint kötő fehérje rágcsáló vagy humán eredetű. Egy másik megvalósítási mód szerint az osteoprotegerint kötő fehérje egy oldható fehérje, ami egy formájában egy izolált extracelluláris dómén, elkülönítve a citoplazmatíkus és transzmembrán döméntol Az osteoprotegerint kötő fehérje szerepet játszik az osteoclast képződésében és a csont-felszívódás sebességének és mértékének meghatározásában, és kiderült, hogy serkenti az osteoclast képződését és serkenti a csontfelszívódást.

A. leírásban ismertetjük továbbá az osteoprotegerint. kötő fehérjék izolált nukleinsavait is. A továbbiakban a nukleinsav szakkifejezés jelentése lehet cDN'S, genomíálts DNS, részben vagy teljesen szintetikus DNS és RNS. Ezeket az alábbi csoportból választhatjuk ki:

a) az 1. ábrán (1. számú szekvencia) és a. 4. ábrán (3. számú szekvencia} bemutatott nukleinsavak;

b) : nukleinsavak, amik hibridizálódnak az L ábrán (1.

'3. számú szekvencia) bemuta tett polipeptídet kódoló régióhoz; és erős hibrídizálási körülmények között is hibridizálódva maradnak a nukleínsavakhoz; és

c) nukleinsavak, amik degeneráltak az (a) és (b) nukleinsavakhoz vi szonyítva.

A nukleinsav hibridizációk általában többlépéses eljárások, amiknek van egy első hibridizációs lépése, aminek során nukleinsav duplexek keletkeznek az egyszálú nukleinsavakból, ezt követi egy második hibridizációs lépés, amit sokkal szigorúbb körülmények között hajtunk végre, bog}· szelektíven megtartsuk azokat a nukleinsav duplexeket* amik a kívánt homológiával rendelkeznek. Az első hibridizációs lépés körülményei általában nem lényegesek, feltéve, hogy nem szigorúbbak mint a második hibridizációs lépés. A második hibridizációt általában szigorú hibridizációs körülmények között, hajtjuk végre, ahol a „szigorú” körülmények olyan hőmérséklet- és só paramétereket jelentenek, amik körülbelül 12-20 °C-szal vannak az 1. ábrán (2. számú szekvencia^ és a 4. ábrán (4, számú szekvencia^ bemutatott komplementer szálak, vagy azok egy része által képezett tökéletes hibrid olvadáspontja (Tm) alatt. Az egyik megvalósítási mód szerint a „szigorú” körülmények szakkifejezés jelentése körülbelül 65 ^CC és nem több mint 1 mol/1 Nan Az nyilvánvaló, hogy a sókoncentráció, a hőmérséklet és/vagy az irikubálás hossza változhat, vagy az első, vagy a második hibridizációs lépésben, oly módon., hogy’ megkapjuk a találmány szerinti hibridizálódó nukleinsav molekulákat. A nukleinsavak hibridizálódásának körül ?

ményeit és a nukleínsav-hibridek. Tm: értékének a kiszámítása megtalálható a szakirodalomban [Sambrook és mtsai: Molecular Cloningi A Laboratory Marmai; Cold Sprmg Harbor Press, Coki Spríng Hárbor, NX (19890A nukleínsavak hibridizálódhatnak az osteoprotegerint kötő fehérjének az 1. ábrán (2. számú szekvencia) és a 4. ábrán (4. számú szekvencia) látható, polipeptidet kódoló régiójához, vagy annak egy részéhez; ennek, következtében lehetnek az itt ismertetett nukleinsav szekvenciák csonkított vagy meghosszabbított változatai. Előfordulhat, hogy⁷ a nukleinsav egy legalább 10 aminosavböl álló polipeptidet kódol Egy másik esetben a nukleinsav egy legalább 20 aminosavból álló pepiidet kódol. Egy- további esetben, a núkleinsav egy legalább 50 aminosavból álló pepiidet kódol A hibridizálódó nukleínsavak tartalmazhatnak nem-kódoló szekvenciákat is, amik az osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló régióhoz viszonyítva 5' és/vagy 3' irányban helyezkednek el A nem-kódoló szekvenciák közé tartoznak az osteoprotegerint kötő fehérje expressziójában szerepet játszó szabályozó régiók, azaz például a promoterek, fokozó régiók, transzlációs inieiáciős helyek, transzkripciós terminációs helyek és hasonlók.

A nukleínsavak előnyösen egér vagy humán osteoprotegerint kötő fehérjéket kódolnak, A nukleínsavak az osteoprotegerint kötő fehérjének kódolhatják egy membránhoz kötött formáját vagy oldható formáit, amikről hiányzik egy funkcionális transzmembrán régió. A rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje megjósolt transzmembrán régiójához tartoznak a 46-69-es aminosav csoportok, amint az az 1. ábrán látható (1. számú szekvenciaj. A humán osteoprotegerint .kötő fehérje megjósolt transzmembrán régiójához tartoznak a 49-69-es aminosavak, amint az a 4. ábrán látható p. számú szekvencia). Azoktól a helyettesítésektől, amik ebben a régióban a hidroföb amínosavakat semleges vagy hidrofil aminosavakkal helyettesítik, az várható, hogy elrontják a membránhoz való kapcsolódást és oldható osteoprotegerint kötő fehér jét eredményeznek. Emellett a teljes transzmembrán régió, vagy annak egy része delécíóitól is az várható, hogy az osteoprotege rint kötő fehérje oldható formáinak termelődését eredményezik.

A 70-316-os amínusavakat kódoló nukleinsavak, amint az az 1 ábrán látható (1. számú szekvencia), vagy annak feagmensei és analógjai oldható osteoprotegerim kötő fehérjéket kódolnak.

Az oldható humán osteoprotegerínt kötő fehérjék csonkított formáit kódoló nukleinsavak is ide tartoznak. Az oldható formák közé tartoznak a 69-317-es csoportokat tartalmazó fehérjék, amint az a 4. ábrán (3. számú szekvencia) látható, valamint ezek csonkított formái. Az egyik megvalósítási mód szerint az H-terminálís csonkítások az alábbi csoportokkal kezdődő polipeptideket hozzák létre: 70-317, 71-317,72-317, és így tovább. Egy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsavak olyan oldható osteo protegerínt kötő fehérjét (OPGbp) kódolnak, amik a 69-317-es csoportokat tartalmazzák, valamint ezek ^-terminálison csonkított változatait, egészen a 158-317-es osteoprotegerínt kötő fehérjéig vagy egy másik változat szerint a 166-317 osteoprotegerint kötő fehérjéig.

A phuOPGbp 1.1 plazmidot humán osteoprotegerínt kötő

fására. Pontosabban, a szekvenciák arra használhatók, hogy cDNS és genomiálís könyvtárakat vizsgáljunk át, rokon osteoprotegerint kötő fehérje szekvenciákat keresve, különösen más fajokban. A nukleinsavak emellett jól használhatók arra, hogy⁷ az

IS osteoprotegerint kötő fehérje szintjét antíszensz technológiával vagy m uivo génexpresszióval moduláljuk. Az osteoprctegerínt kötő fehérjét expresszálö transzgenikus állatok kifejlesztése jól aktivitás tanulmányozására.

A nuklein savak DNS szekvenciákhoz kapcsolódnak, hogy biológiailag aktív osteoprotegerint kötő fehérjét expresszáljanak. Az expresszlőhoz szükséges szekvenciák a szakterületen jártas szakember számára ismertek, ide tartoznak az RNS szintézishez ló expresszálásához FMethods in Enzymology, 185, let D.V>_S Aoademic Press (1990)]. Az emlős gazda16 .ο

Az ost.eoprotegerint kötő fehérje lehet egy exogén DNS szekvencia prokarióta vagy eukarióta expressziójának a terméke, azaz

nomiális DNS és szintetikus DNS

ríni kötő fehérje lehet bakteriális, élesztő, növény, rovar vagy emlőssejt expresszié terméke, vagy származhat sejtmentes transz lációs rendszerekből. A bakteriális sejtekben előállított osteoprotegerint kötő fehérje N-terminális metioninnal rendelkezik. A találmány tárgyát, képezi tovább egy osteoprotegerint kötő fehérje előállítására szolgáló eljárás, ami abban áll, hogy az osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló nukleinsawal transzformált vagy transzfektált prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket szaporítjuk, majd izoláljuk a nukleinsavak polipeptid expressziós termékeit.

A találmányban ismertetett polipeptidek közé tartoznak azok a polipeptidek, amik, osteoprotegerint kötő fehérjék vagy azok .fragmensei, analógjai vagy származékai. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az osteoprotegerint kötő fehérje humán osteoprotegerint kötő fehérje. Az osteoprotegerint kötő fehérje fragmense szakkifejezés olyan polipeptidet jelent, amiből egy vagy’ több aminosavat kivágtunk, oly módon, hogy a keletkező polipeptid legalább azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy megköti az osteoprotegerint. Az említett fragmensekhen a deleciók az N-terminálison, a C-termmálison valamint a polipeptid belsejében történtek meg. Az osteoprotegerint kötő fehérjék fragmenseí leg alább körülbelül 10 aminosavat, legalább körülbelül 20 aminosavat, vagy legalább körülbelül 50 aminosavat tartalmaznak. Az előnyös megvalósítási módok szerint az osteoprotegerint: kötő fehérje egy vagy több ammosavas deléciőt tartalmaz a transz membrán régióban (49-69-es aminosav csoportok, amint az az 1. ábrán látható), vagy, egy másik változat szerint egy vagy több ami.nosa.vas deléeiőt tartalmaz az N-terminális régióban a transzmembrán régióig; és/vagy beleértve a transzmembrán régiói (149-es aminosav csoportok, amint azaz 1. ábrán látható). Egy másik megvalósítási mód szerint az osteoprotegerint kötő fehérje egy oldható fehérje, ami tartalmazza például a 69-316-os amino savakat vagy a 70-316-os aminosavakat, illetve ennek a C-termi~ nálisán vagy N-terminálisán csonkított formáját, ami megtartja az osteoprotegerint kötő aktivitását. Az osteoprotegerint kötő fehérje emellett lehet egy humán oldható fehérje, amint az a 4. áb rán látható, és tartalmazza a 69-317-es csoportjait, amint az a.4. ábrán látható, és ezeknek az N~terminális csonkított formái, azaz például a 70-517, 71-517, 71-317, 72-317, stb. Egy előnyös megvalósítási. mód szerint az oldható humán osteoprotegerint kötő fehérje tartalmazza a 69-317~es csoportokat, valamint ennek N terminálison csonkított formáit, egészen a 158-317~es osteoprotegerint kötő fehérjéig, vagy egy másik változat szerint a 166317-es osteoprotegerint kötő fehérjéig.

Az osteoprotegerint kötő fehérje analógja szakkifejezés egy olyan polipeptidet jelent, ami egy vagy több aminosavas helyettesítést vagy addíciót tartalmaz, oly módon, hogy' a kapott polipeptíd legalább azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy megköti az osteoprotegerint. Az említett analógokban a helyettesítés vagy addíció a. polipeptidben bárhol megtörténhet. Az előnyben részesített analógok azok, amik oldható osteoprotegerint kötő fehérjék.

A fragmensek vágj' analógok előfordulhatnak a természetben, azaz lehetnek például egy all élvariáns polípeptid termékei, vagy egy’· mRNS illesztési variáns termékei, vagy' előállíthatok a szakterületen jártas szakember számára hozzáférhető, a nukleinsavak ma nipulálására és szintetizálására szolgáló technikákkal· A polipep tidek vagy tartalmaznak N~terminális metionint vagy nem.

A találmányban ismerteit csteoprotegerint kötő fehérjék származékai, olyan polipeptidek, amik poszt-transzlációs módosításokon estek át (azaz például N-kapcsolt vagy O-kapcsolt szénhidrát láncok, az N~fermmális vagy C-terminális végek processzálásai, kémiai csoportok kapcsolása az aminosav gerinchez, az N-kapcsolt vágj' O-kapcsolt szénhidrát láncok kémiai módosítása és egy N-terminális metionin hozzáadása egy prokarióta gazdasejt expressziójának eredményeképpen. Pontosabban, az osteoprotegerint 'kőtó fehérje kémiailag módosított származékait.

amik további előnyöket biztosítanak, azaz például megnövekedett stabilitást, hosszabb keringési időt, vagy csökkent immunogenitást, szintén megfontolás tárgyává tettük. Különösen al azaz például pölietilénglikollal és annak származékaival történő módosítás (lásd például a 4,179,337 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). A származékképzéshez a kémiai csoportokat a vízoldható polimerek közül választhatjuk meg, azaz például lehet políetilénglikol, etílénglikol/propiléngHkol kopolímer, karboxi hatnak egy, kettő, három vágj·’ még több kapcsolt kémiai, egysé get. A polipep tideket előre meghatározott pozíciókban is módosíthatjuk, azaz például az N-terminálison, vagy kiválasztott lizin vagy arginin csoportoknál. Más kémiai módosítás lehet például egy kimutatható jelzés, azaz például enzimatikus, fluoreszcens, izotópos vagy affinitás jelzés, ami lehetővé teszi a fehérje kimutatását és izolálását.

Az osteoprotegerint kötő fehérje kimérák tartalmazzák az osteoprotegerint kötő fehérjét, vagy, annak egy részét, egy heterológ aminosav szekvenciához fúzionaltatva. A heterológ szekvencia lehet bármilyen szekvencia, ami lehetővé teszi, hogy a keletkező fúziós fehérje megtartsa, legalább az osteoprotegerint kötő aktivitását. Bgy előnyös megvalósítási mód szerint az osteoprotegerínt kötő fehérjének a C-terminális extraceliuláris doménje fúziónál egy heterológ szekvenciához. Ilyen szekvenciák lehetnek például a heterológ citoplazmatíkus domének, amik lehetővé teszik az alternatív intracelluláris jeladási eseményeket, az olyan szekvenciák, amik elősegítik az oligomerizációi, azaz például az IgG Fc régiója, az olyan enzim, szekvenciák, amik egy jelölést biz tosítanak a polipeptid számára, valamint az olyan szekvenciák, amik affinitás! próbákat biztosítanak, azaz például egy antigénellenanyag felismerést.

A polípeptideket az osteoprotegerint kötő fehérjét expresszáló szövetekből és sejtvonalakból izoláljuk és tisztítjuk, vagy lizátumokből illetve kondicionált szaporító táptalajból, vagy az os-

sejtekből extrahálva. Az osteoprotegerint kötő fehérjét megkaphatjuk a. 32-D rágcsáló mielomonocita sejtvonalból (ATCC letéti szám CRL-11346). A humán osteoprotegerint kötő fehérjét, vagy az ezt kódoló nukleinsavat humán nyirokcsomóból vagy magzati máj szövetből izolálhatjuk. Az izolált osteoprotegerint kötő fehérje mentes minden más humán fehérjétől és más sejtalkotótőL

Az osteoprotegerint kötő fehérjét természetes forrásokból, (azaz például normális körülmények között osteoprotegerint kötő fehérjét expresszáló szövetekből és sejtvonalakból) izoláljuk. A tisztítási lépés tartalmazhat, egy vagy több standard fehérje-tisztítási lépést, megfelelő sorrendben, amivel meg lehet kapni a tisztított fehérjét. A kromatográfiás lépés lehet ioncsere, gél szűrés, hidrofób kölcsönhatás, fordított fázis, kromatofókuszálás, affinitáskromatográfia, amit egy anti-osteoprotegerint kötő fehérje ellenanyagra vagy biotín-sztreptavidin affinitás-komplexre alkalmazunk, és hasonlók.

A po.li.pep fid eket specifikusan megkötő ellenanyagok szintén. a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Az ellenanyagokat előállíthatjuk a teljes hosszűságű osteoprotegerint kötő fehérjével, az osteoprotegerint kötő fehérje oldható formáival, vagy annak egy fragmensével végzett immunizálással. A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek poliklonálís- vagy monoklonális ellenanyagok, vagy tehetnek rekombináns ellenanyagok, azaz például kiméra eltenanyagok. ahmis a könnyű- és nehéz láncokon a rágcsáló konstans régiókat humán szekvenciákkal helyettesítjük, vagy CDR-graftolt ellenanyagok, aholis csak a komplementaritást meghatározó régiók rágcsáló eredetűek. A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek humán ellenanyagok, amiket például, olyan

sek humán ellenanyag előállítására (lásd például a WO93/12227 számú PCT bejelentést). Az ellenanyagok jól használhatók az osteoprotegerint kötő [e kimutatására b;

ai. mintákból, ezzel lehetővé teszik az olyan sejtek vagy szövetek azonosítását, amik a fehérjét termelik. Emellett azokat az ellenanyagokat.

amik kötődnek az osteoprotegerint kötő fehérjéhez, és ezzel gátolják más, kötődésre szintén képes fehérjékkel való kölcsönhatást, terápiásán alkalmazhatjuk az osteoclast differenciálódásának és a csont felszívódásának befolyásolásában.

Az osteoprotegermt kötő fehérjék elleni ellenanyagok jól használhatók lehetnek a csontbetegségek, azaz például az oszteoporózis és Paget-kór kezelésében. Az ellenanyagokat vizs osteoprotegerin jelenlétében és távollétében, és vizsgálhatjuk azt is, hogy képesek-e gátolni a lígandum (osteoprotegerint kötő fe hérje) által, befolyásolt. osteoclastogenezist és/vagy csontfelszívő· dást. Az is várható, hogy a peptidek .maguk hatnak antagonistaként a ligandunureceptor kölcsönhatásban, és gátol ják a ligandum által befolyásolt osteoclastogenezist, és az üsténprotegerint kötő fehérje peptidjeit is megvizsgáljuk ebből a szempontból.

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan gyógyászati készítmények, amik az említett ellenanyagot, vagy annak fragmensét és egy gyógyászatilag elfogadható hígítószert, hordozót, szolubilízálő szert, emülgeálő szert, tartósító szert és/vagy adjutánst tartalmaznak. A gyógyászati készítmények ahatóanyagból jellemzően terápiásán hatásos mennyiséget tartalmaznák. A „terápiásán hatásos mennyiség” szakkifejezés jelentése az a mennyiség, ami terápiás hatást biztosít egy specifikus állapot és beadási mód esetében. A készítmény lehet folyékony vagy liofilezett formájú, és tartalmazhat higítőszert (TRIS-, acélát- vagy foszfát pufferek), aminek más és más lehet a p.H~ja és ionerössége, szolubilizálőszert. azaz például Tween-t. vagy Polysorbate-ot, hordozókat, azaz például humán szérumalbumint Vágy zselatint, konzerválószereket, azaz például thimerosalt vagy benzi.lalkoh.olt, és antioxidánsokat, azaz például aszkorbinsavat vagy nátrium-metabiszulhtot. Egy adott komponensnek a .megválasztása számos faktortól függ, beleértve a kezelt állapotot, a beadás módját és a kívánt farmakokinetikai pa ramétereket. A gyógyászati készítményekben való alkalmazáshoz megfeleld komponensek részletes összefoglalása megtalálható a szakirodalomban (Remíngton’s Pharmaceutical Seiences, 18. ki adás.,. szerk.: A.R. Gennaro, Mack, Boston. PA (1980)1.

A találmány szerinti készítményeket beadhatjuk injekcióval, szubkután, intravénásán vagy int vagy orálisan, nazálisán, pulmonárisan vagy rektálisan. A végül kiválasztott beadási mód számos faktortól függ, és a szakterületen jártas szakember határozhatja meg.

Az osteoprotegerint kötő fehérjék számos különböző vizsgálati módszerben alkalmazhatók, az osteoprotegerin kimutatására és az osteoprotegerinnel való kölcsönhatás jellemzésére. A vizsgálat általában abból áll, hogy az osteoprotegerint kötő fehérjét egy osteoprotegerint tartalmazó biológiai mintával inkubáljuk, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy az osteo protegerin kötődjön az osteoprotegerint kötő fehérjéhez, majd mérjük a kötődés mértékét. Az osteoprotegerin lehet tisztított, vagy a keverék formában jelenlevő, mint például a. testfblyadékokban vagy tenyésztő táptalajban. Olyan vizsgálati módszerek fejleszthetők ki, amik lehetnek mennyiségi vagy minőségi megha tározási módszerek, és az utóbbi arra használható, hogy mégha tározzuk az osteoprotegerinnek az osteoprotegerint kötő fehérjéhez való kötési paramétereit (az affinitása konstansokat és a kinetikát), és mennyiségileg meghatározzuk a biológiailag aktív osteoprotegerin szintjét keverékekben. A vizsgálatok arra is használhatók, hogy kiértékeljük az osteoprotegerinnek az osteoprote gerint kötő fehérje ft-agmenseihez, analógjaihoz és származékaihoz való kötődését, valamint arra, hogy azonosítsuk az os~ teoprotegerín- és az osteoprotegerint kötő fehérje család új tagjait.

Az osteoprotegerinnek az osteoprotegerint kötő fehérjéhez való kötését számos különböző formában elvégezhetjük, beleértve a sejtalapú kötési vizsgálatokat, a membrán-kötési vizsgálatokat, az oldatfázísü vizsgálatokat és az immunesszéket. Általában a jelzett osteoprotegerinnek nyomnyi szintjeit osteoprotegerint kötő fehérje mintákkal inkubáljuk egy megadott ideig, ezt követi a megkötött osteoprotegerin mérése szűréssel, elektrokemilumineszcenciával (ECL, ORIGEN rendszer az IGEN-től), sejtalapú vagy immun.esszévek Alkalmazhatjuk a homogén vizsgálati, technológiákat a radioaktivitás mérésére (SPA; Amersbam.) és az idő íeloldásos fluoreszcenciát is (HTRF, Packázd). A kötődést úgy mutatjuk ki, hogy az osteoprotegerint vagy egy antí-osteoprotegerm ellenanyagot radioaktív izotópokkal (^i2Sl, ³⁵S, ³H), fluoreszcens festékekkel (fluoreszcein), lantanída (Eu³⁴) kelátokkal vagy kriptátokkal, orbípiridil-ruténium (Ru²⁺) komplexekkel, jelezzük. Az nyilvánvaló, hogy egy jelzett próbának a kiválasztása függ a használt kimutatási rendszertől. Egy másik változat szerint az osteóprotegerint módosíthatjuk egy jelzetlen epítop jelzéssel (azaz például biotinnal, peptidekkel, Hisc-tal, myc-eel), és hozzáköthetjük sztreptavidinhez, anti-peptid vagy antí-fehérje ellenanyagokhoz, amiknek az előzőkben ismertetett módon kimutatható a szintjük.

Egy alternatív módszer szerint az osteoprotegerint kötő fehérjét közvetlenül vizsgálhatjuk, az osteoprotegerint kötő fehérje elleni poHklonális- vagy monoklonális ellenanyagokat használva egy immunesszében·.. Az eljárás abban áll, hogy az osteoprotegerint kötő fehérjét egy vegyületfel olyan körülmények között ínkubáljuk, amik lehetővé teszik, hogy a vegyület az osteoprotegerint kötő fehérjéhez kötődjön,; majd mérjük a kötődés mértékét. A ve gynlet lehet lényegében tisztított, vagy lehet nyers keverék formájában. A kötő vegyületek tehetnek nukleinsavak. fehérjék, peptidek, szénhidrátok lipídek vagy kismolekulasűlyú szerves vegyü1Z gerint kötő fehérje aktivitását, azzal a céllal, hogy meghatá rozzuk, miszerint agonistaként vagy antagonistaként hatnak-e.

Az osteoprotegerint kötő fehérjék jól használhatók arra is, hogy egy élesztő két-hibrid szűrővizsgálati eljárással azonosítsunk. olyan íntracelluláris fehérjéket, amik kölcsönhatásba, lépnek a cnoplazmatikus doménnel. Példaként megemlítjük, hogy hogy olyan hibrid konstrukció használható egy két-hibrid csalíplazmídként, ami egy osteoprotegerint kötő fehérje N-termínális 50 arninosavát kódoló DNS-t. tartalmaz, egy élesztő GAL4-DxNS· kötő doménhez fúziónál tatva. A szűrővizsgálatból származó pozitív klánok tovább jellemezhetők, hogy azonosítsuk a kölcsönhatásba lépő fehérjéket. Ez az információ segíthet egy, az osteoprotegerint kötő fehérjéhez, kapcsolódó íntracelluláris jelképzö mechanizmus felderítésében, és íntracelluláris célpontokat szolgáltathat a csont felszívódását befolyásoló új gyógyszerekhez.

Az osteoprotegerint kötő fehérje használható a túlzott csont-sűrűséggel jellemezhető körülmények kezelésére. A legálta-

iektus megnőtt csonttömeget eredményez, és általában halálos az élet első néhány évében. Az oszteopetrőzist előnyösen oldható osteoprotegerint kötő fehérje beadásával kezelik.

A találmány tárgyát képezik továbbá az osteoprotegerint kötő fehérje modulátorai (agonistái és antagonistái), valamint az ezek előállítására szolgáló módszerek.. Egy osteoprotegerint kötő p·/¹ je modulátor vagy fokoz vagy' csökkent legalább egy, az os“otegerint kötő fehérjéhez kapcsolódó aktivitást, azaz például azt, hogy' megköti az osteoprotegerint vagy néhány más kölcsönhatásba lépő molekulát, vagy·' szabályozza az osteoclast érését. Tipikus esetben egv agonísta vagy egy antagonista lehet egy kofaktor, azaz például egv fehérje, peptid, szénhidrát, lipid vagy kis molekulasúlyű .molekula, ami kölcsönhatásba lép az osteoprotegerint kötő fehérjével, hogy· szabályozza az aktivitását. A potenciális polipeptid antagonísták közé tartoznak azok, az ellenanyagok, amik reagálnak az osteoprotegerint kötő fehérje oldható, vagy? membránhoz kapcsolódó formáival, és az osteoprotegerint kötő fehérje azon oldható formáival» amik az osteoprotegerint kötő fehérje extracelluláris doménjét, vagy annak egy részét képezik. Az osteoprotegerint kötő fehérje expresszióját szabályozó molekulákhoz tartoznak tipikusan azok a nukleinsavak, amik komple menterek az osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló nukleinsavakkal, és amik az expresszié antiszensz szabályozójaként hatnak.

Az osteőprötegerint kötő fehérje szerepet játszik a csont felszívódásában elsődlegesen szerepet játszó érett osteodastok szabályozozott képződésében, k csontfelszivódás sebességének növekedése (ami meghaladja a csontképződés sebességét) különböző csont-rendellenességekhez vezethet, amit összefoglaló néven osteopeniáknak neveznek, és ide tartozik az oszteoporózis, osteomyelitis, a hiperkalcémia, a. műtét vagy? szteruid-beadás következtében létrejövő osteopenia, a. Paget-kór, az osteonecrosís, a. reumás arthritis következtében, kialakuló csontvesztés, a.

periodontálís (fog körüli) csontvesztés, az immobilizáció, a profetikus lazulás és az osteolitíkus metasztazis. Ezzel ellentétben a csontfelszívódás sebességének csökkenése vezethet oste©petrosis~hoz, ami egy olyan állapot, amit a. túlzott csontsúrúség jellemez. Az osteoprotegerínt kötő fehérje agonistái és antagonistái befolyásolják az osteoclast képződését, és beadhatjuk. a csont-rendellenességben szenvedő betegeknek. Az osteopeniák kezelésére használt osteoprotegerínt kötő fehérje agonisiáit és antagomstáit bedhatjuk önmagukban, vagy egy csontnövekedést elősegítő ágens hatékony mennyiségével kombinálva, amely csontnövekedést gátló ágensek lehetnek a BMP-1 BMP-.1.2 csont morfogenetikai faktorok, a β-faktor és TGF-β családba tartozó transzformáló növekedési faktorok, az FGF-1 FGF-10 fibroblaszt növekedési faktorok, az interleukin-1 inhibi torok, a Wá inhibitorok, a paratiroid hormon, az E sorozatba tartozó prosztaglandinok, a biszfoszfonátok és a csonterősítő ásványi anyagok, azaz például a fluorid és a kalcium. Az osteoprotegerint kötő fehérjék, antagonistái különösen hasznosak lehetnek az osteopenia kezelésében.

Bizonyos receptorok kölcsönhatásba léphetnek az osteopro tegerint kötő fehérjékkel. Pontosabban, az egyik ilyen receptor az osteoclast differenciálódási és aktiválási receptor (ODAR). Az ODAR egy transzmembrán polipeptid, ami. a legmagasabb mértékű homológiát mutatja a CD40-neI, a TNF receptorcsalád egyik tagjával, A rágcsáló ODAR nukleinsav szekvenciát és az általa kódolt polipeptid-szekvenciát a 10. ábrán mutatjuk be. A rágcsáló ODAR humán homológját könnyen izolálhatjuk, ha egy humán. cDNS vagy genomiális könyvtárat hibridizációs szűrővizsgálattal vizsgálunk át. A humán ODAR klónozási eljárásai hasonlóak

2£ azokhoz, amiket az 5. példában ismertetünk a humán osteoprotegerint kötő fehérjék klónozására. A 10. ábrán bemutatott polipeptid humán homológja megjelent Andersen és munkatársai cikkében [Anderson és mtsai: Natúré 390, 175-179 (1997)|, és a továbbiakban RÁNK néven hivatkozunk rá. A RANK-ot l es tí pusú transzmembrán fehérjének lehet jellemezni, ami homológiát. mutat a TNF receptorcsalád tagjaival, és a dendrites sejtfunkcióban játszik szerepet.

Az ODAR és az osteopro tegerint kötő fehérje kölcsönhatásának bizonyítékait a 13. ábrán mutatjuk be. Az ODAR egy oldható formája (ODAR-Fc fúziós fehérje) megakadályozza az osteoclast érését ín tátro (IX ábra),, és normális egerekben szubkután injekció után fokozza a csont sűrűségét (13. ábra). Az eredmények összhangban vannak azzal, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje kölcsönhatásba lép és aktiválja az ODAR-t, amivel elősegíti az osteoclast érését.

Az osteoclast érését és a csont felszívódásának sebességét valamint mértékét az osteoprotegerint kötő fehérjének és az ÖDAR-nák a kölcsönhatása szabályozza,. Azok a. vegyületek, amik csökkentik vagy blokkolják az osteoprotegerint kötő fehérje és az

ODAR közötti kölcsönhatást, potenciális antagonistái az osteoprotegerint kötő fehérje aktivitásának, és tönkretehetik az osteoclast fejlődését, ami fokozott csontfelszívődást eredményez.

Számos különböző vizsgálat használható az osteoprotege rint kötő fehérje és az ODAR közötti kölcsönhatás ín ritm móré arra használhatjuk, hogy' a vegyuleteket átvizsgáljuk, képesek-e fokozni vagy csökkenteni az QDAR-nak. az osteoprotegerint kötő fehérjéhez való kötődésének sebességét vagy mértékét. Az egyik típusú vizsgálatban, az ODAR fehérje immobilizálható egy mikro·· titer lemez lukainak aljához való kapcsolással· A radioaktív izo tóppal jelzett osteoprotegerint kötő fehérjét (például, jódozott osteoprotegerint kötő fehérje) és a vizsgált vegyülete(ke)t vagy egyenként (akármilyen sorrendben) vagy egyszerre adhatjuk a Inkákhoz. Az mkubálás után a lukakat moshatjuk és szóin tillád-

az ODAR-nak az osteoprotegerint kötő fehérjéhez való kötődése

gyűl etet egy koncentráció-tartományban, vizsgálhatjuk, majd egy sorozat kontroll lukat, amikből a vizsgáló eljárás egy vagy több eleme hiányzik, használhatjuk az eredmény kiértékelésénél a pontossághoz. Ennek a módszernek egy alternatívája magában foglalja a fehérjék „pozícióinak” visszafordításának, azaz az osteo protegerint kötő fehérjét a mikrotíter lemez tubáihoz immobilizáljuk, a vizsgált vegyülettel és radioaktív ODAR-ral i.nkubálva, és meghatározva az ODAR kötődésének mértékét [lásd például:

Current Protocols ín Molecular Biology, 18. fejezet, szerk.; Ausubel és mtsai, John Wiley & Sons, New York (1995)].

A. radioaktív jelölés egyik alternatívájaként az osteoprotege rínt kötő fehérjét vagy az ODAR-t biotírmal koryágálhatjuk, és a biotinilezett fehérje jelenlétét azután egy enzimhez, azaz például tormaperoxidázhoz (HRP) vagy alkalikus foszfatázhoz (AP) kap csolt sztreptavídinnel mutathatjuk ki, amit azután kalorimetriásan. vagy a sztreptavidin fluoreszcens jelölésével lehet kimutatni. Olyan, osteoprotegerint kötő fehérje vagy ODAR elleni ellenanyagot is használhatunk, ami biotinnal van konjugálva, és alkalikus foszfatázhoz vagy tormaperoxidázhoz kapcsolt sztreptavidinnel végzett inkubálással lehet kimutatni.

ptisü inért szubsztráthoz való kapcsolással immobilízálva, A szubsztrát.··fehérje komplex egy olyan. oldatba tehető, ami a komplementer fehérjét és a vizsgált vegyületet tartalmazza; az ínkubálás után a gyöngyöket centrifugálással kicsaphatjuk, majd az osteoprotegerint kötő fehérje és az ODAR közötti kötődés mennyiségének mennyiségét meghatározhatjuk az előzőkben ismertetett módszerekkel Egy másik változat szerint a szubsztrát fehérje komplex egy oszlopra immobiüzálható, és a vizsgált molekulát valamint a komplementer fehérjét átengedhetjük az oszlopon, Az osteoprotegerint kötő fehérje és az ODAR közötti komplex képződését megbecsülhetjük az előzőkben ismertetett bármelyik technika alkalmazásával, azaz például radioaktív jelöléssel, ellenanyag-kötődéssel vagy hasonlókkal.

Az ODAR/osteoprotegerint. kötő fehérje komplex képződését növelő vagy csökkentő vegyület azonosítására alkalmas ín Kítro módszer egy felszíni plazma-rezonancia detektor rendszer, azaz például a Biacore vizsgálati rendszer (Pharmacia, Piscataway, NJ). A Biacore rendszert a gyártó előírásai szerint használhatjuk. Ez a vizsgálat lényegében abból áll, hogy vagy az osteoprotegerint kötő fehérjét vagy az ODAR-t kovalens kötéssel kapcsoljuk egy dextránnal borított érzékelő chiphez, ami egy detektorban található. A vizsgált vegyületet és a másik komplementer fehérjét azután egvidőben vagy egymás után az érzékelő chípet tartalmazó kamrába injekciózhatjuk, és a kötő komplementer fehérje menynyiségét azon az alapon határozhatjuk, meg, hogy miképpen változott meg az érzékelő chip dextránnal borított oldalához fizi

-Óta· kailag kapcsolódó molekulatömeg; a molekulatömeg változását a detektor - rend szerrel mérhe tjük.

Néhány esetben kívánatos lehet* hogy két vagy több tesztvegyületet egyszerre értékeljünk ki, hogy használhatók-e az ODAR,/osteoprotegerínt. kötő fehérje komplex képződésének növelésére vagy csökkentésére. Ezekben az esetekben az előzőkben ismertetett vizsgálati eljárásokat könnyen módosíthatjuk, ha ilyen további vizsgálati vegyület(ek)et adunk, vagy’· egyidőben, vagy egymás után az első teszt-vegyülethez. A vizsgálati eljárás többi. lépése ugyanazok mint amiket az előzőkben ismertettünk.

Az előzőkben ismertetett ín rttro vizsgálatok előnyösen arra használhatók, hogy gyorsan átvizsgáljunk nagyszámú vegyületet, Hogy van-e hatásuk az ODAR és az osteoprotegerínt kötő fehérje közötti komplex kialakulására. A vizsgálatokat automatizálni lehet, hegy olyan vegyületeket vizsgáljunk át, amik fág display, szintetikus pepiid és .kémiai szintézis könyvtárakban találhatók.

Azok a vegy öletek, amik növelik vagy csökkentik az osteoprotegerint kötő fehérje és az ODAR közötti komplex képződését, szintén használhatók sejttenyészetben végzett szűrővizsgálatra, ODAR-t hordozó sejtek és sejtvonalak felhasználásával. A sejteket és sejtvonalakat bármilyen emlősállatból kinyerhetjük, de előnyösen humán vagy más főemlős, kutya vagy rágcsáló is lehet a forrás. Az ODAR-t tartalmazó sejteket, azaz például az osteoclastokat affinitáskromatográfíával dúsíthatjuk más sejttípusokból, publikált eljárások alkalmazásával. Az osteoprotegerínt kötő fehérjének ODAR-t hordozó sejtekhez való kötődését a vizsgálati vegyületek jelenlétében vagy távollétében értékelhetjük ki, és a kötődés mértekét például áramlási citometriával határozhatjuk meg, az osteoprotegerínt kötő fehérje ellen készített, biotinilezett ellenanyag felhasználásával. Egy másik változat szerint egér vagy humán osteoclast tenyészetet hozhatunk létre a 8. példában leírt módon, és a vizsgált vegyűleteket azon, az e értékelhetjük M, hogy képesek-e blokkolni az osteoclastoknak CSF-l és osteoprotegerint kötő fehérje hozzáadásával serkentett érését. A sejttenyésztési módszerek előnyösen arra használhatók, hogy tovább értékeljük azokat a vegyűleteket, amik pozitívnak bizonyultak az előzőkben ismertetett fehérje-kötési vizsgálatokban.

Azoknak a vegyületeknek, amik növelik vagy csökkentik az osteoprotegerint kötő fehérjének az ODAR-ral való .kölcsönhatását, szintén kiértékelhetjük az m fotro aktivitását, ha a vegyülete ket egereknek adjuk be, majd utána letapogató denzitometriával vagy radiográfiával mérjük a csont sűrűségét.

A csont sűrüFCT publikációban és a 13. példában található meg.

Bizonyos vegyületek csökkentik vagy blokkolják az osteoprotegerint kötő fehérje és az ODAR közötti kölcsönhatást, és az osteoclast képződés antagomstái. Az ilyen vegyületek .általában, két csoportra oszthatók. Az egyik csoportba tartoznak azok a ve gyületek, amik az osteoprotegerint kötő fehérjéből származnak, vagy amik kölcsönhatásba lépnek az osteoprotegerint kötő fehérjével. Ezeket az előzőkben ismertettük. Egy második csoportba tartoznak azok a vegyületek, amik az ODAR-ból származnak, vagy amik kölcsönhatásba lépnek az ODAR-ral... Azok a vegyületek, amik az ODAR antagonistái, lehetnek például nukleinsavak, fehérjék, peptidek, szénhidrátok, lipidek vagy' kis moleku lasúlyü szerves vegyületek.

Az ODAR antagonistái olyan vegyületek lehetnek, amik az osteoprotegerint. kötő fehérje egy vagy több kötőhelyéhez, vagy ahhoz közel kötődnek az ODAR extracelluláris doménjében, és csökkentik vagy teljesen, blokkolják a komplex képződését. Az ODAR-ok azok a_: régiók, amik szerepet játszanak az osteoprotege az azonosítására, amik a komplex kialakulásában játszanak szerepet. Ezután olyan vegyöletek tervezhetők, amik előnyösen kötődnek a komplex kialakulásában szerepet játszó régiókhoz, és ennek következtében antagonístaként hatnak.

Az ODAR antagonistái is kötődhetnek az QDAR-hoz az osteoprotegerint kötő fehérje kötési pontjaitól távoli pontokhoz, és konformációs változásokat indukálnak az ODAR polipeptidben, ami az osteoprotegerint kötő fehérjével csökkenő mennyiségű komplex, vagy nonprodukriv komplex kialakulását eredményezi.

Lehetséges olyan eset, amikor az egyik antagonista egy oldható formája az ODAR-nak, amiről hiányzik a funkcióképes transzmembrán dómén. Az ODAR oldható formáiban lehet egy vagy több aminosavas deléciő a transzmembrán doménben (a 214-234-es aminosavak, amint az a 10. ábrán látható). Az oldható ODAR polipeptídek tartalmazhatják az extracelluláris domént vagy annak egy részét, és képesek megkötni az osteoprotegerint kötő fehérjét. Adott esetben az oldható ODAR lehet, egy kíméra fehérje része, aholis az ODAR extracelluláris doménje vagy annak egy része fuzionálva van egy heterolőg aminosav szekvenciához. Az egyik megvalósítási mód szerint a heterolőg aminosav szekvencia a humán IgG Fc régiója.

Az ODAR modulátorait (agonistáit és anragomstáit) arra használhatjuk, hogy' megelőzzük vagy .kezeljük az osteopeniát, beleértve az osteoporosist, osteomyelitist, a xnahgnus hiperkalcémlát, a műtét vagy szteroid adagolás következtében beálló osteopeniát, a Paget-kórt, az osteonecrosist, a reumás arthritis következtében létrejövő csontvesztést, a periodontális c-sontvesztést, immobilizációt, profetikus lazulást és az osteoütíkus métasztázist. Az osteopéniák kezelésére használt ODAR agonístákat és antagoni stákat önmagukban vagy terápiásán hatékony mennyiségű, csontnövekedést elősegítő ágenssel kombinálva, ide értve a BMP-1. - BMP-1.2 csont morfogenetikai faktorokat, a β-faktort és TGF-β családba tartozó transzformáló növekedési faktorokat, az FGF-1 - FGF-10 fíbroblaszt növekedési faktorokat, az interleukin-1 inhibitorokat, a TNFa inhibitorokat, a parati.roíd hormont, az E sorozatba tartozó prosztaglandinokat, a biszfbszfbnátokat és a csonterősítő ásványi anyagokat, azaz például a. dumádat és a kalciumot. Az ODAR antagonlstáí különösen jól használhatók az osteopenia kezelésére.

Az alábbi példákat azzal a céllal adjuk meg, hogy részletesebben illusztráljuk a találmányt, de célunk nem az, hogy ezzel korlátozzuk a találmány oltalmi korét.

1. Példa

Egy osteoprotegerint kötő fehérje forrásaként szolgáló se j tvon al azonosítása.

clastogenesist in aitro és ín vivő. Mivel az osteoprotegerín egy TNFR-rel rokon fehérje, ezért valószínű, hogy kölcsönhatásba lép .i. L porító táptalajt eltávolítjuk, majd a tapadó tenyészeteket foszfáttal puffereit sóoldattal. mossuk (PBS) (Gibco). ami 1% borjúmagzat szérumot tartalmaz. A rekombináns egér osteoprotegerin [22194]-Fc és humán osteoprotegerin [22-20 1]-Fc fúziós fehérjéket [1996, szeptember 3-án benyújtott, 08/705,945 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás] egyenként hígítjuk 5 μ g/m.l koncentrációra foszfáttal puffereit sóoldattal, majd 45 percig 0 ®C-ori in kubaijuk. Az osteoprotegerin-Fc fúziós fehérj e oldatot elöntjük, majd a sejteket PBS-FCS oldatban mossuk az előzőkben ismertetett módon. A tenyészeteket azután nkoeritrinnel

hozzuk érintkezésbe (Southern

Assocíates

Cat.#2043-09), amit PBS-FCS-ben hígítottunk. Miután. 30-45 percig 0 °C~on inkubáltuk, az oldatot elöntjük, majd a tenyésze teket az előzőkben ismertetett módon mossuk. A sejteket azután immunfluoreszcencia mikroszkópiával elemezzük, hogy olyan sejtvonalakat detektáljunk, amik egy sejtfelszíni osteoprotegerint

A szuszpenziós sejttenyészeteket hasonló módon elemezzük, az alábbi módosításokat alkalmazva: a higítószer és a mosópuffer kalcium- és magnézium-mentes foszfáttal puffereit sóoldatból áll, ami 1% FCS-t tartalmaz. A sejteket exponenciálisan osztódó tenyészetekből nyerjük ki a táptalajból, centrifugálással ülepítjük, majd 1 * 1.0⁷ sejt/ml sűrűségben szuszpendáljuk egy 96 lukas mikrotiter szövettenyésztő lemezen (Falcon).· A sejteket azután egymás után hozzuk érintkezésbe rekombináns osteoprotegerin-Fc fúziós fehérjékkel, majd szekunder az előzőkben ismertetett módon, és a sejteket az egyes lépések között centrifugálással mossuk. A sejteket azután fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozóval (FACS) elemezzük, egy Becton Dickinson FACscan-t használva erre a célra.

..1 :al,

Egy rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje expressziós klónozása cDNS könyvtárat készítünk 32D m.RNS-ből, majd a pcDNA3.1(A) emlős expressziős vektorba (Invítrogen, San Diego, CA) ligáljuk. A rekombináns mte.rleukin-3 jelenlétében exponenciálisan növekedő 32D sejteket összegyűjtjük, majd az összmRNS-t savas guanidium-tiocianát-fenol-kloroformos extrakcióval tisztítjuk [Chomczynski és Sacchi: Analytical Biochemistry 162, 156-159 (1987)]. A polí(Ad mRNS frakciót az őssz-RNS kévaló adszorpcióval és arról történő elűcióval, a gy

solt eljárást alkalmazva. Egy irányított, oligo-dT vei indított cDNS könyvtárat készítünk a Superscript Plasmid System (Gibco BRL_? Gaithersburg, MD) felhasználásával, a gyártó által javasolt eljárást alkalmazva.: A kapott cDNS-t teljesen megemésztjük Sáli és

NotI restrikciós endonukleázzal, majd méretkizárásos gélkromatográliával frakcionáltatjuk. A legmagasabb molekulasűlyű frakciót választjuk ki, és a pcDNA3.1Bj plazmid vektor (Invítrogen, San Diego, CA) pcfffinker régiójába ligáljuk. Ez a vektor a CMV promotert tartalmazza a többszörös klónozó hely előtt (upstream), és ez Irányítja a magasszintű expressziót az eukarió ta sejtekben. A könyvtárat azután elektroporáciőval bejuttatjuk

Escherichm coíí-ba (ElectroMAX D-H10B, Gibco, NY], majd 109 μ g/rnl ampicillin t tartalmazó ,LB agáron meghatározzuk a titerét, A könyvtárat azután különálló pool-okba rendezzük, amik poolonként körülbelül 1000 kiónt tartalmaznak, és az egyes poci nkból 1,0 ml-es tenyészetet szaporítunk 16-20 óra hosszat 37 °Con. Az egyes tenyészetekből plazmid DNS-t izolálunk, a Qiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid Kit (katalógusszám 16191) felhasználásával, a gyártó által javasolt eljárást követve.

A 32D cDNS expressziós könyvtár tömbbe rendezett pooljait COS-7 tenyészetekbe lipofektáljuk, majd vizsgáljuk, hogy rendelkeznek-e a sejtfelszíni osteoprotegerint kötő fehérjével

Ahhoz, hogy ezt megtegyük, a COS-7 sejteket 1 χ 10⁶ per ml sűrűségben szélesztjük hatlukas szövettenyésztő lemezekre(Costar), majd éjszakán át 10% FCS-t tartalmazó DMEM tápta lajban (Gíbco) tenyésztjük. Mindegyik pool-ból körülbelül 2 pg plazmid DNS~t hígítunk 0,5 ml szérummentes DMEM-ben, majd centrifugálással sterilezzük egy 0,2 gm-es Spín-X oszlopon (Costar) keresztül. Ezzel egyidőben 10 μΐ Lipofectamine-t (Lile Téchnolqgies, katalógusszám 18324-012) adunk a kulön-külön 0,5 ml szérummentes DMEM-et tartalmazó csövekhez. A DNS-t és a Lípofectamine oldatot összekeverjük, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percig. A COS-7 sejttenyészeteket azután szérummentes DMEM-mel mossuk, és a DNS-lipofectamíne komplexeket 2-5 óra hosszat 37 °C--on érintkeztetjük a tenyészetekkel. Ezután a periódus után a közegeket eltávolítjuk és 1053 FCS-t tartalmazó DMEM-mel helyettesítjük. A sejteket azután 48 óra hosszat tenyésztjük 37 ^aC-on.

Ahhoz, hogy kimutassuk azokat a tenyészeteket, amik expresszálják az osteoprotegerint kötő fehérjét, a szaporító táptalajt eltávolítjuk, és a sejteket PBS-FCS oldattal mossuk. Az egyes Inkákhoz 1,0 ml térfogatú, 5 gg/ml humán. OPG[22-20ll-fúziós fehérjét tartalmazó PBS-FCS-t adunk és szobahőmérsékleten 1 óra hosszat inkubáljuk. A sejteket háromszor mossuk PBS-FCS oldattal, glutáraldehídet tartalmazó merítjük. A tenyészeteket hagyjuk lehűlni, majd leszívjuk a FOS oldatot. A tenyészeteket azután szobahőmérsékleten 30 per-

humán IgG ellenanyaggal inkubáljuk (S1GMA. Product # A-9S44), majd háromszor mossuk 20 mmol/l TRIS-HCl-t (pH-7,6) és 137 mmol/1 nátríum-kloridot. tartalmazó oldattak Az ezen lépések so rán keletkezett immunkomplexeket úgy mutatjuk ki, hogy a Fást Red TR/AS-MX Súbstrate kittel vizsgáljuk az alkalikus foszfatáz aktivitást (Pierce, katalógusszám 34034), a gyártó által javasolt eljárási követve.

független 32 cDNS kiónt vizsgáltunk át, ami 300, egyenként 1000 kiónt tartalmazó transzfektált pool-t jelent. Egyetlen olyan lukat azonosítottunk, ami rendelkezett azzal a képességgel, hogy specifikusan hordozta az osteoprotegerin-Fc fúziós fehérjét Ezt a pool-t sib szelekció egymást követő meneteivel felosztottuk, ígykaptunk egyetlen plazmid kiónt, aminek a jelzése 32D-F3 (1. ábra), A 32D-F3 plazmid DNS-t azután COS-7 sejtekbe transzfek22-2011-Fc fúziós fehérjével plusz szekunder ellenanyaggal, vagy ATAR-Fe fúziós fehérjével [az ATAR HVEM néven is ismert; Montgomery és mtsaí: Cell 87. 427-436 (1996)] immunfestettünk (2. ábra). A szekunder ellenanyag önmagában nem kötődött a COS-7/32D-F3 sejtekhez,, és ugyanígy nem kötődött a.z ATAR-Fc fúziós fehérje sem. Csak az osteoprotegerin-Fc fúziós fehérje kötődött a COS-7/32D-F3 sejtekhez, jelezve ezzel, hogy a. 32D-F3 egy olyan osteoprotegerint kötő fehérjét kodol, ami az expresszáló sejtek felszínére kerül.

3. Példa

Az előzőek szerint izolált 32D-F3 klón egy körülbelül 2,3 ki lobázis méretű cDNS inszertet tartalmaz (1. ábra), amit mindkét irányból szekvenáltunk egy Applied Biosvstems 373A automata DNS szekvenálóval, príménél vezérelt Taq festék-terminátor reakciókat alkalmazva (Applied Biosvstems), a gyártó által javasolt eljárást követve. A kapott nukleotíd szekvenciát a FASTA prog ;asaval (GCG, University of Wisconsin) összehason lítjuk a DNS szekvencia adatbázissal, majd elemezzük a hosszú, nyílt leolvasási keretek (LORF) jelenlétét, a ,.Six~way open reading frame” (Hat-utas nyílt leolvasási keret) alkalmazást használva (Fra.mes) (GCG, University of Wisconsin). Egy 316 aminosavból álló, metí.oninnal kezdődő LORF~ot mutattunk ki a megfelelő ori entációvaL amit egy körülbelül 150 bázispár méretű, 5' nemtranszlálódó régió előz meg. Az 5' nem-transzlálódó régió egy leolvasási keretben levő stopkodont tartalmaz, a megjósolt startkodon előtt. Ez azt mutatja, bogy a 32D-F3 plazmíd struktúrája összhangban van azzal a képességével, hogy a CMV promoter régiót használja egy 316 aminosavból álló géntermék expressziójának vezérlésére emlős sejtekben.

A megjósolt, osteoprotegerínt kötő fehérjeszekvenciát azután összehasonlítjuk az ismert fehérjeszekvencíákból készített, létező adatbázissal, a FASTA program módosított verzióját használva erre a célra. [Pearson: Methods in Enzymology 138, 63-98 (1990)]. Az aminosav szekvenciában vizsgáljuk még azoknak a specifikus motívumoknak a jelenlétét, amik a tumor nekrózis faktor (TNF) szupercsalád összes ismert tagjában konzerválódtak, a szekvencia-profil módszer alkalmazásával. (Gribskov és mtsai:

szupercsaládhoz, nagyon szignifikáns, 19,46-os Z értékkel.

Az osteoprotegerint kötő fehérje amínosav szekvenciája egy valószínűleg .hidrofob- transzmembrán domént tartalmaz, ami az M49~néi kezdődik és az L69-ig tart. Ennek, a metionin startkodánhoz viszonyított konfigurációnak az alapján azt gondoljuk, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje egy Il-es típusú transzmembrán fehérje, ami rendelkezik egy rövid N-terminális intracelluláris doménnel. és egy hosszabb C-terminálís extracelluláhs doménnel (4. ábra). Ez hasonló lehet a TNF család összes ismert tagjához, a limfotoxin alfa kivételével [Nagat és Golstein: Science 267, 1449-1456 (1995)].

A és 100 pg/ml denaturált laz· szetételú oldatban, 2-4 óra hosszat, 42 °C-on. A biottokat azután 5X SSPE, 50% formamid, 2X Denhardt oldat, 0J% SDS, 100 μ g/'mi denaturált lazacsperma DNS és 5 ng/ml jelzett próba oldattal hibridizáljuk 18-24 óra hosszat, 42 °C-on. A bioitokat azután 2X SSC-vel mossuk 10 percig szobahőmérsékleten, majd IX mossuk 10-15 percig.

Az egér cDNS-ből származó próba felhasználásával, szigorú körülmények között végzett hibridizációval a nyirokcsomókban egy körülbelül 2,5 kilobázis méretű, túlsúlyban levő mRNS-t lehetett kimutatni (3. ábra). Egy ugyanilyen relatív molekulasúlyú, gyenge jelet a magzati máj mRNS-ből is ki lehetett mutatni. Más vizsgád szövetekből nem lehetett osteoprotegerint kötő fehérje transzkriptumokat kimutatni. Az adatok azt sugallják, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje mRNS nagyon szigorúan a humán szövetekre korlátozódik. Az adatok azt is mutatják, hogy az izolált cDNS klón mérete nagyon közel áll a természetes transzkrip-

A humán osteoprotegerint kötő fehérje molekuláris klónozása

Az osteoprotegerint kötő fehérje humán homológja a humán perifériális nyirokcsomókban egy körülbelül 2,5 kilobázis méretű mRNS-ként expresszálódik, és egy egér cDNS próbával lehet kimutatni, szigorú hibridizációs körülmények között. A humán osteoprotegermt kötő fehérjét kódoló DNS-t ügy kapjuk meg, hogy egy humán nyirokcsomó cDNS könyvtárat vagy rekombináns bakteriofág tarfolttal, vagy transzformált baktérium teleppel vizsgálunk át, hibridizációs módszerekkel [Sambrook és mtsai: Molecular Cloníng: A Laboratory Manuál; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)1. Ehhez a fog- vagy plazmád cDNS könyvtárat a rágcsáló eredetű 32D -F3 osteoprotegerint kötő fehérje kiónból származó radioaktív izotóppal jelzett próbákkal vizsgáljuk át. A próbákat arra használjuk, hogy egy szélesztett könyvtárról lenyomatolt nitrocellulóz szórólapot vizsgáljunk át. Ezeket a szűröket előhibridizáljuk, majd hibridizáljuk, a 4. példában ismertetett körülmények között, a végén így kapjuk a. humán osteoprotegerint kötő fehérje cDNS tisztított kiónjait. A bármelyik humán osteoprotegerint kötő fehérje klánból származó inszerteket szekvenáljuk, és a 3. példában leirt. módon elemezzük.

Egy humán nwökcsomo pali A-f RNS-t (Clontech., Inc.. Faló Alw, CA) elemiünk az osteoprotegerint kötő fehérje transzkriptumok jelenlétére, amint azt korábban az 1995. december 22-én benyújtott, 08/577,788 számú Amerikai Egyesült Államok-beli bejelentésben leírták. Ebből az RNS mintából készített Northern biottot vizsgáltunk szigorú körülmények között ³²P-vel jelzett egér osteoprotegerint kötő fehérje próbával, és ez a humán osteoprotegerint kötő fehérje transzkriptumok jelenlétét jelezte. Oligo-dT vei vezérelt cDN'S-t szintetizálunk a nyirokcsomó mRNS-ről, a SuperScript kit felhasználásával (G1BCO Li.fe Technologi.es, Gaithersburg, MD), amint azt a 2. példában ismertettük. A kapott cDNS-t méret alapján szelektáljuk, majd a nagy molekulasúlyú frakciót a pcDN.A 3.1 (*) plazmid vektorba ligáljuk (Invitrogen, San Diego, CA). Elektrokompetens Bschenc^a coli DH10 sejteket (GIBCO Life Technoiogies, Gaithersburg, MD) transzformálunk, és l*10⁶ ampícillin rezisztens transzformánst vizsgálunk át tetephíbrídizácíóval, ³²P-vel jelzett egér osteoprote gerint kötő fehérje próba felhasználásával.

A feltételezett humán osteoprotegerint kötő fehérje cDNS plazmid-kiónját, a phuO'PGbp-1.1-et. izoláltuk, ez tartalmaz egy 2,3 kilobázis méretű inszertet. A phuOPGbp- Ll inszert nukleotid szekvenciája körülbelül 80-85%-ban homológ az egér osteoprotegerint kötő fehérje cDNS szekvenciájával. Az inszert DNS szekvenciának' a transzlációja egy hosszú, nyílt leolvasási keret jelenlétét mutatja, ami a feltételezések szerint egy 317 aminosavból álló polipeptidet kódol (4. ábra), kz egér és a humán osteoprotegerint kötő fehérjék összehasonlítása azt mutatja, hogy·

azonosak,

a fehérje erősen megőrződött az evolúció során

A humán osteoprotegerint kötő fehérje DNS- és fehérjeszekvenciák nem voltak megtalálhatók a Genbank-ban, és homo lóg EST szekvenciát sem lehetett találni. Ugyanúgy, mint a rágcsáló homológ esetében, a humán osteoprotegerint kötő fehérje erős szekvencia-hasonlóságot mutat a citokínek TNFa szupercsaφΖΟ resszíoía

Az alábbiakban ismertetett primer-párokat és terápiátokat alkalmazó PCR amplifíkációt használjuk a rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje különböző formáinak a létrehozására. Az egyes pároknak az egyik primőré egy TAA stopkodont, valamint egy-egy Xhol vagy Saclí hasítási helyet visz be a gén C-termináh’sa után. Az egyes primer-páróknák a másik prímere egyetlen Ndel hasítási helyet, egy N~terminális metíonint és optimalizált kodonokat visz be a gén N-terminális részébe. A polimeráz láncreakciót standard rekombináns DNS módszerekkel végezzük el. A PCR termékeket tisztítjuk, restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pAMG21 vektor (ATCC letéti szám 98113) egyedi Ndel és Xhol vagy SaclI hasítási helyeibe szúrjuk be, majd a prototróf Escherichm eök 393 vagy 2596 törzsbe juttatjuk be. Az expressziőhoz más, általánosan használt Escterichfo coli expressziós vektorok és gazdasejtek is megfelelnek. A transzformáció után a klánokat szelektáljuk, plazmid DNS-t izolálunk és az osteoprotegerint kötő fehérje inszert szekvenciáját igazoljuk.

.121-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [75-3161

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 242 aminosav legyen és az alábbi. N-terminális és Cterminális csoportokat tartalmazza: NHa-Met (75)-Asp-Pro-AsnArg-----------—Gln-Asp-He-Asp (316)~COOH. A PCR-hez használt, templát a pcD.NA/32D~F3_? és a #1581-72 és #1581-76 oligonukleotidokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

1581-72:

S'-GTTCTCCTCATATGGATCCAAACCGTAITTCTGAAGACAGG

ACTCACTGCTT-3' (5. számú szekvencia)

1531-76:

5*-TACGCACTCCGCGGTTAGl€TATGTCCTGAACTTTGA-3' (6. számú szekvencia) pAMG2l·-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [95-316]

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, .hogy hossza 223 aminosav legyen és az alábbi N-terminális és

C-terminális csoportokat tartalmazza: NHa-Met-His (95)--Glu~AsnAla-Gly---------------Gln-Asp-Ile-Asp (316J-COOH. A PCR-hez használt templát a pcDNA/32D-F3, és a #1591-90 és #1591-95 oligonukleotidokat 'használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

5'-ATTrGATTCTAGAAGGAGG.AATAACA.TATGCATGAAAACG

CAGGTCTGCAG-3 (7. számú szekvencia)

1591-95:

5'-TATCCGCGGATCC'rCÖAGTTAGTCTATGTCCTGAACnTGAA3

Ezt a. konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza. .211 aminosav fegyen és az alábbi N -terminális és Cterminális csoportokat tartalmazza: NHs-Met-Ser (107)-Gl.u-AspThr-beu---------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. A PCR-hez használt templát a pcDNA/32D-F3, és a #1591-93 és #1591-95 oligonukleotidokat használjuk pdmer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

5'-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTGAAGACAG

1591-95:

számú szekvencia)

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük él, hogy hossza 1.99 aminosav legyen és az alábbi N-terminális és Ctermináiis csoportokat tartalmazza: HHa-Met (1.18)-lys-GIn-AlaPhe-Gln.....................Gln-Asp-He-Asp (316)-ΟΟΟΗ. A PCR-hez használt templát a péDN.A/'32D-F3, és a #1591-94 és ^1591-95 oligonukr leotidokat használjuk prímer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

S'-A'H'TGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGxAAACAAGdTF

TCAGGGG-3 (II. számú szekvencia)

1591-95:

5*-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA3' (12,. számú szekvencia) pAMG21-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [128--316]

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 19Ö aminosav tegyen és az alábbi H-terminális és Ctermmális 'Csoportokat tartalmazza: Nfís-Met-Lys (128)-Glu-LeuGln-His----------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH, A PCR-hez használt templát a pcDNA/32D-F3, és a #1591-91 és #1591-95 ohgonukleotidokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

1591-91:

5'-ATTTGATTCTAGAAGG AGGAATAAC ATATGAAAG A ACTGC AGCACATTGTG-3·· (13. számú szekvencia)

1591-95:

5'-TATCCGCGGATCCTCG.AGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA3' (14. számú szekvencia) pAMG21-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [137-316]

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 181 aminosav legyen és az alábbi R-terminális és C «9 terminális csoportokat tartalmazza; NH^-Met-Gln (137j-Arg-PheSer-Gly--------—Gln-Asp-Ile-Asp (316)-0000. A PCR-hez használt terápiát a pcDNA/32D-F3, és a #1591-92 és #1591-95 oligonukleotídokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukcíonak a klónozásához.

1591-92:

S'-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCAGCGTTTCTG

TGGTGCTCCA-3' :(15.. számú szekvencia.)

1591.-95:

5'-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTn^xGAA3· (16. számú szekvencia)

Ezt a. konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 171 aminosav legyen és az alábbi N-terminális és Cterminális csoportokat tartalmazza: NHs-Met (1.46)-Glu-Gly-SerTrp-----------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. A PGR-hez használt templát a pAMG21-rágcsáló osteoprotegerínt kötő fehérje [753161. és a #1600-98 és #1581-96 oligonukleotídokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

S'-GTTCTCCTCATATGGAAGGTTCTTGGTTGGATGTGGCCCA3' (17. számú szekvencia) .1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA3^ (18. számú szekvencia) pAMG21-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje (156-316

a. konstrukciót ügy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 162 aminosav legyen és az alábbi N-terminális és Cterminális csoportokat tartalmazza: NHa-Met-Arg (156)-Gly-LysPro------—-Gln-Asp-Ile-Asp (316J-CÖOH, A PCR-hez használt

Γ£ templát a pAMG:21 -rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje |158316], és a #1619-86 és #1581-76 oligonukleotidokat használjuk primer-párkéni a PCR-hez és ennek a génkonstrukciónak a klónozásához.

TGCA-3 (19. számú szekvencia]

1581-76:

(20. számú szekvencia] &AMG21-rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]

Ezt a konstrukciót úgy terveztük meg és készítettük el, hogy hossza 160 aminosav legyen és az alábbi N-termínális és Ctermináhs csoportokat tartalmazza: NHz-Met-Lys (158)-Pro-GluAla.................--Gto-Asp-Ile-Asp (316]-COOH< A PCR-hez használt templát a pcDNA/32~F3 plszmid, és a #1581-73 és #1581-76 öli gonukleotídokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a. gén konstrukciónak a klónozásához.

1581-73:

S'~GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCAC/

CTCACCÁTCAAT-3' (21. számú szekvencia^

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTrTGA-3' (22. számú szekvencia) •ptegerint kötő fehérje (166-3161

Ezt a konstrukciót úgy terveztük, meg és készítettük el, hogy hossza 152 aminosav legyen és az alábbi N-terminális és Ctermmális csoportokat tartalmazza: NHa-Met-Hís (166)-Leu-ThrIle......—GIn-Asp-IIe-Asp (316J-COOK. A PCR-hez használt tompját a peDNA/32-F3 plazmid, és a #1581-75 és #1581-76 oligpnukleotidokat használjuk primer-párként a PCR-hez és ennek a génkpnstrukcíónak' a klónozásához.

5'-GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCATCTATCG (23. számú szekvencia)

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTA.GTCTATGTCCTGAACTTTGA3' (24. számú szekvencia)

terminális csoportokat tartalmazza: NHa-Met-Thr (I66)-Ile-AsnAlá-—--........Gln-Asp-IIe-Asp (316)~COOH. A PCR-hez használt templát a pcDNA/32~F3 plazmid, és a #1581-74 és #1581-76 öligonukleotidokat használjuk prímer-párként a PCR-hez és ennek a génkon strukoiőnak a klónozásához.

S'-GTTCTCCTCATATGACTATTAACGC'TGCATCTATCCCATCG (25. számú szekvencia)

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (26. számú szekvencia)

Az nyilvánvaló, hogy a fenti konstrukciók csak példák, és a szakterületen jártas szakember könnyen előállíthatja az osteoprotegermt kötő fehérje más formáit is, az itt. bemutatott általános módszerekkel

A pAMG21-rágcsáló ostecprotegerint kötő fehérje (75-316) 95-3 lőj rekcmbináns bakteriális konstrukcióit klónoztuk, DNS szekvenciájukat igazoltuk, és a rekcmbináns géntermék expressziójának indukció utáni szintjét vizsgáltuk. Az összes konstrukció olyan szinten termelte a génterméket, ami könnyen látható volt a nyers lizátumok SDS-poiíakrllamid gélen végzett gélelektrofbrézíse és

Coomassie-val való festése után. A transzformált .Escheríchm coá i bejelentésben leírtaknak

Az osteo53 protegerint kötő fehérjének a zárványtestből való tisztításához az osteoprotegerint kötő fehérje szolubilizálására és renaturálására van szükség, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerek alkalmazásával. A rekombmáns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]-ról kiderült, hogy leginkább oldhatatlan formában keletkezik,, de körülbelül 40%-át az oldott frakcióban lehet megtalálni. A rekombináns fehérjét az oldott frakcióból tisztítjuk, az alábbiakban ismertetett mádon, majd biológiai aktivitását vizsgáljuk.

7. Példa.

A rekombináns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158-316] tisztítása

Az -expresszált. rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158316]-ot hordozó, lefagyasztott bakteriális sejteket megolvasztjuk, majd újra szuszpendáljuk 20 mmol/1 TRIS-HCl (pH~7,0), 10 mmol/1 EDTA összetételű pufferben. A 20 tömeg/térfoga.t%-os sejtszuszpenziőt: azután homogenizáljuk, egy mikroüuidizátón háromszor átbocsátva. A lizált sejtszuszpenziőt 45 percig JÁ14 rotorban centrifugáljuk, 10000 per perc fordulatszámmáL Az SDSPAGE elemzés egy körülbelül 18 kDa molekulasúlyú csík jelenlétét mutatja, mind a zárványtestekben. mind a felülúszóban. Az oldható frakciót azután Pharmacia SP Sepharose 4FF oszlopra visszük, amit 10 mmol/1 MES (ρΗ^ό,Ο) oldattal hoztunk egyensúlyba. Az osteoprotegerint kötő fehérjét azután 20 oszloptérfogatnyi nátrium-klorid gradienssel eluáljuk [0-0,4 mol/1 nátriumklorid MBS-ben (pH~6,ü)j

t. tartalmaző frakciókat azután egy ABX Bakerbond oszlopra visszük, amit 20 mmol/1 MES (pH=6,0) oldattal hoztunk egyensúlyba. Az osteoprotegerint kötő fehérjét 1SCV nátrium-klorid gradienssel oldjuk le (0-0,5 mol/l nátrium-klorid, Mes pH~6,0). A végtermék SDS-PAGE alapján körülbelül 95%-ban homogén. Az N-terminá-

csoportnál kezdődő pepiidével (egy miciátor metioninnal). Az: SDS-PAGE során a fehérje relatív molekulasúlya nem változik a redukálással.

8. Példa

A rekombináns osteoprotegerint kötő fehérjéről korábban kimutatták, hogy blokkolja a D3 vitamin függő osteoclast képződést csontvelő és lép prekurzorokból, a 08/577,788 számú Amerikai Egyesült Államök-beli szabadalmi leírásban ismertetett osteoclast·-képződési vizsgálatban. Mivel az osteoprotegerint kötő fehérje kötődik az osteoprotegerinhez, és a liganduniok TNF családjának egy új tagja, ezért ez egy potenciális célpontja az osteoprotegerin biológiai aktivitásának. A rekombináns oldható osteo protegerini kötő fehérje [ 158-316|-at, ami a TNF-a-szerű dómén minimális magját reprezentálja, vizsgáltuk., hogy képes-e befolyásolni az osteoclast differenciálódását osteoclast prekurzorokból. A csontvelő sejteket felnőtt egér combcsontokból izoláljuk, és M sejtekkel mind D3 vitamin mind dexamelhason jelenlétében és távollétében. Amint azt korábban bemutattuk, az osteoclastok csak vegyes tenyészetekből fejlődnek ki, amik sztrómasejteket (ST2), D3 vitamint és dexamethasont tartalmaznak. A rekombi náns oldható osteoprotegerint kötő fehérjét különböző koncentrációban adjuk hozzá, a koncentráció a 0,1.6-500 ng/ml tartomány bán változik, és az osteoclast érését ’ mint vizuális megfigyeléssel határozzuk meg. Az osteoprotegerint kőtő fehérje erősen, dózisfűggő módon serkentette az osteoclast

koncentrációnál van, ami azt sugallja., hogy ín niiro hatékony indukál ószerként hat az osteoclastogenezisre. Az osteoprotegerint kötő fehérje hatását a rekombináns osteoprotegerin blokkolja (6. ábra).

Annak vizsgálatára, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje helyettesíteni, tudja-e a ostromát és a hozzáadott szteroidokat, különböző koncentrációjú M-CSF-et tartalmazó tenyészeteket hozunk létre, amivel, elősegítjük az osteoclast prekurzorok növekedését, és emellett különböző mennyiségű osteoprotegerint kötő fehérjét is adunk hozzá. Amint az a 6. ábrán látható, az osteoprotegerint kötő fehérje dózisfűggő módon serkenti a TRAP aktivitá sát, és a serkentés nagyságrendje függ a hozzáadott M-CSF szintjétől, ami azt sugallja, hogy ez a két faktor együtt döntő jelentőségű az osteoclast fejlődése szempontjából. Ahhoz, hogy igazoljuk ennek az utolsó megfigyelésnek a biológiai jelentőségét, tenyészeteket hoztunk létre szarvasmarha kortikális csontszeleteken, és az M-CSF és az osteoprotegerint kötő fehérje hatását mind önmagában, mind együtt vizsgáltuk. Amint az a 7. ábrán, látható, az osteoprotegerint kötő fehérje M-CSF jelenlétében serkenti nagy TRAP-pozitív osteoclastok képződését, ami erodálja a csont felszínét, kis lukakat eredményezve. Tehát az osteoprotegerint kötő fehérje osteoclastogenezist serkentő (dífferencíálódtató) faktorként hat. Ez azt sugallja, hogy az osteoprotegerin blokkolja az: osteoclast fejlődését, az osteoprotegerint kötő fehérjét lekötve.

9. Példa

A rekombináns oldható osteoprotegerint kötő fehérje in vivő aktivitása

Az ín fetro vizsgálatok alapján az Eschericlm coh-ban termelt rekombináns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158 316] egy hatékony indukálószere az osteoclast míeloid prekurzárokból való fejlődésének. Ahhoz, hogy' meghatározzuk az m m hatásait, 4-5· hetes hím BDF1 egerek (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) három napig naponta kétszer, majd a negyedik nap reggelén (0.. 1., 2. és 3. nap) szubkután osteoprotegerint kötő fehérjei 158-316] injekciókat kaptak. Az ege rek öt csoportja (n=4) csak hordozót, vagy 1, 5, 25 vagy 100 pg osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]-ot kapott naponta. Az egerek további öt csoportja (n-4) a fenti dózisa hordozót vagy osteoprotegerint kötő fehérje (.158-316]-ot kapott, plusz humán Fcosteoprotegerint kötő fehérje [22-194]-et kapott, egyetlen, 1 mg/kg/nap (körülbelül 20 pg/nap) szubkután injekcióban. A teljes vér ionizált kalcium-tartalmát a kezelés előtt, a 0. napon határozzuk meg, valamint 3-4 órával az osteoprotegerint kötő fehérje [158-316] napi első injekciója után az 1., 2. és 3. napon. A 3.

lentős növekedést okoz a vér ionizált kalcium-tartalmában, az 5 μ g/nap és magasabb dózissal végzett kétnapi. kezelés után. (8. ábra). A híperkalcémia súlyossága az osteoclast aktivitás hatékony índukálására utal, ami a fokozott csontfelszívódásból származik. .Az egyidejűleg végzett osteoprotegerin. beadás korlátozza a hiperkalcémiát, az osteoprotegerint kötő fehérje [158-316] 5 és adiograíraval is elemezzük, hogy meg éri változás a csent ásványi anyag súhérje [158-316] dózisfüggö módon csökkenti a csont sűrűségét az egerek proximális sípcsontjában. A csontsűrűség csökkenése különösen nyilvánvaló azoknál az egereknél, amik: 100 pg/nap dózist kapnak, igazolva., hogy az erős hiperkalcémta ezekben az állatokban a m egnő tt esőn dél vívódásból származik, valamin t a kalciumnak a csontvázból való felszabadulásából Ezek az ada tok világosan mutatják, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje [158-316] ín fenő elősegíti a esontfelszívódást, ami szisztémás hiperkalcémiát okoz, és az osteoprotegeriu megszünteti ezeket a hatásokat.

10. Példa

Az oldható osteoprotegerint kötő fehérje klónozása és expressziói a emlős sejtekben

A rágcsáló és humán osteoprotegerint kötő fehérje teljes hosszúságú kiónja expresszálható emlős sejtekben, amint azt az előzőkben, a 2. példában ismertettük. Egy másik változat szerint a cDNS kiónok módosíthatók, hogy a fehérje szekretált tonnáit kódolják, ha emlős sejtekben expresszáljuk. Ennek az elvégzéséhez a cDNS-nek az. iniciációs kodont kódoló természetes 5' végét, körülbelül a fehérje első 69 aminosavára terjedő szakaszon, bele értve a transzmembrán régiét is, helyettesíthetjük egy szignálpepiid vezérszekvenciával. Például egy ismert, az iniciációs Radonját és szignálpeptidjét kódoló DNS szekvenciák illeszthetők az osteoprotegerint kötő fehérje cDNS szekvenciához, ami bárhol kezdődhet a 68-as aminosavat kódoló régió után. A kapott rekombínáns klönokról azt gondoljuk, hogy az osteoprotegerint kötő fehérje szekretálódó formáit termelik emlős sejtekben, és poszt-transzlációs módosulásokon kell átesniük, amik normális körülmények között az osteoprotegerint kőtó fehérje C-terminális extracelluláris doménjében fordulnak elő, ilyen például glikozilexődés. Ezt a. stratégiát használva, az osteoprotegerint kötő fehérjének egy szekretált formáját készítettük el,, aminek az 5' végén a rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje szignálpeptid található, a 3' végén pedig a humán IgGl Fc dómén. A pCEF4/muOPG[22

401]-Fc plazmid vektort (08/577,788 sszamú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, 1995. december 22.) NotI restrikciós enzimmel emésztjük, hogy' az osteoprotegerin 3' vége és az Fc gén között elhasítsuk. A linearizált DNS-t azután részlegesen, emésztjük Xmnl restrikciós enzimmel, hogy az osteoprotegerint csak a 23-as és 24-es csoportjainál hasítsuk el, tompa véget e~ redményezve. A restrikciós emésztményeket azután CIP-pel defoszforílezzük. majd az ebben az emésztésben kapott vek tor részt (beleértve az osteoprotegerin 1-23-as csoportjait és az Fc-t) gélen tisztítjuk.

A rágcsáló osteoprotegerint kőtő fehérje 69-316~os aminosav csoportjait kódoló cDNS régióját polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk a plazmid templátról, ebhez Pfu polímerázt (Stratagene, San Díego, CA) és az alábbi ohgonukleotidokat használva primőrként:

egy vektorba kgáljuk,. majd elektrokompetens JSschmehfe coi a plazmidot használjuk humán 293 fíbroblasztok transzfek bejelentés, benyújtva 1995. december 22-én).

Hasonló stratégia felhasználásával egy expressziós vektort terveztünk, amely képes a humán IgG 1 Fc doménhez fuzionált N terminálisán csonkított fehérje expresszálására. Ez a konstrukció tartalmazza a rágcsáló osteoprotegerin

NotI restrikciós enzimmel emésztjük, hogy eltávolítsuk a teljes osteoprotegerint kötő fehérje leolvasási keretet. A rágcsáló osteo protegerint kötő fehérjét (158-316~os csoportok) PCR-rel amplifikáljuk, terápiáiként a pcDNA/2D-F3 pl.azmidot és az alábbi, primereket használva:

1616-44: CCT CTG TCG AGT GGA CAA CCC AGA AGG CTG AGG CCC ÁGC CAT TTG C (29. számú szekvencia)

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CT A TGT CCT GAA CTT TG

A 1602-59 a gén 3' végét amplífikálja, és egy leolvasási keretben levő NotI hasítási helyet ad hozzá. A PCR terméket NotI és Xhol restrikciós enzimmel emésztjük, majd gélen tisztítjuk.

Az alábbi komplementer primereket illesztjük egymáshoz, hogy így egy olyan adaptert hozzunk létre, ami a rágcsáló osteoprotegerin szignálpeptidet és egy Kozák szekvenciát kódolja.

amely utóbbi a transzlációs inícíációs helyet veszi körül:

Ezeket a primereket egymáshoz illesztjük, így az 5' végen 5' túlnyúló végeket kapunk, amik kompatibilisek a Hindii! restrikciós enzimmel, és a 3' végen az Ahol restrikciós enzimmel. Az előzőek szerint kapott, emésztett vektort, az illesztett oligonukleotidokat és az emésztett PCR fragmenst összeligáljul DOMB sejtekbe dektroporáljuk. A kapott kiónt szekví ·:>

» hogy igazoljuk a szignálpeptid, a 158-316os csoportokat kódoló osteoprotegerínt kötő fehérje fragmens és az IgGl Fc dómén kapcsolódásának autentikus rekonstrukcióját. A rekombináns plazmidot tisztítjuk, humán. 293 fíbroblasztokba transzfektáljuk, majd az- előzőkben ismertetett módon, kondicionált közeg tér-

Teljes hosszúságú rágcsáló és humán cDNS-eket klónozunk a pCEP4 expressziós vektorba (invitrogen. San Díego, CA), majd humán 293 fibroblasztok tenyészeteibe transzfektáljuk, az L példában leírt módon. A sejttenyészeteket higromicínnel szelektáljuk, az előzőkben ismertetett módon, majd szérummentes kondicionált táptalajt készítünk. A kondicionált táptalajt immobi lizáir rekombináns osteoprotegerin oszloppal hozzuk érintkezésbe, majd a rágcsáló és humán rekombináns osteoprotegerin „shed* formáit affimtás-tisztitjuk. A tisztított oldható ost.eop.rotegerint kötő fehérjék N-terminális szekvenciáinak: elemzése azt mutatja, hogy a rágcsáló fehérje előszeretettel hasad a 139-es fe~ nilalanin előtt, és a humán fehérje előszeretettel hasad a homológ csoport, a leucín előtt. Emellett a humán fehérje szintén előszeretettel hasad a 145-ös ghcin előtt Ez azt sugallja, hogy a humán osteoprotegerínt kötő fehérje oldható formái vagy a 140-es pozícióban levő izoleucinnál vagy a 145-ös pozícióban levő glicinnél rendelkeznek. N-terminális csoportokkal

Az osteoprotegerínt kötő fehérje peptidjei, és a fehérje klonális és monoklonális ellenanyagok készítése ι ρο.

Az- osteoprotegerínt kötő fehérje specifikus régiói elleni ellenanyagokat az osteoprotegerínt kötő fehérjéből származó peptidekkel való immunizációval kaphatjuk meg. Ezeket a péptideket használhatjuk önmagukban, vágj/ a pepti.d konjugált formáit használhatjuk immunizáláshoz.

Az érett TNFa kristályszerkezetét a szakirodalomban ismertették ÍE. ¥. Jones. D.I. Stuart és bLP.C. Walkerr J. Cell Sci.

i B'BIDG szálakból áll, és egy má-

111 |E. Y. Jones, DJ. Stuart és N.P. 13, 11-18 (1990)]. A mutagenezis VFu két hurkáról derült ki, hogy il, és ezek azok a hurkok, amik a

O.R. Goh, C-S. Loh és (1991)] a TríFp ligán dum megfelelő BB' és EF hurkairól kiderült, hogy a TNFp:TNFR.55 komplex megfejtett kristály-struktúrájában a receptorral való kontaktusok legnagyobb részét ezek hozzák létre. A rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje aminosav szekvenciáját összehasonlítjuk a TNFa és a ΤΝΡβ arnínosav szekvenciáival. A rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje BB' és EF hurkainak megfelelő régiókat ennek az összehasonlításnak az alapján jósoltuk meg, és az alábbiakban ismertetett peptideket terveztünk.

A.. Antigéníek); A rekombínáns osteoprotegerint kötő e [ 158-316]-ot használjuk antigénként az állatok alábbiakban ismertetett módon való immunizálására, és a szérumot az alábbiakban ismertetett megközelítés alapján vizsgáljuk. A rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje feltételezett BB' és EF hurkainak a peptidjeit megszintetizáltuk, és ezeket használjuk immuni-

BB' hurok pepiid

BB' hyrok-Cvs pepiid:

(35. számú szekvencia)

EF hurok-Cys pepiid:

(36. számú szekvencia]

NHa-NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC-COOH

NH2-VYWKTSIKIPSSHNLM-COOH

NH2-VYWKTSIKIPSSHNLMC-COOH

használjuk a konjugációhoz, az alábbi, B szekcióban ismertetett módszereket alkalmazva, és ezekkel végezzük az immunizálást.

B. Fúrócsiga hemodaninnal vagy szarvasmarha szérumalbum innal való konjugáció

A kiválasztott peptídeket vagy fehérje fragmenseket füröcsiga hemoeianinhoz (KLH) konjugáltathatjuk, azzal a céllal, hogy növeljük az immunogenitásukat állatokban. Emellett a szérum-

Company, Rockford, IL) vízben oldjuk, 10 mg/ml végkoncentrá dóban. A. pepiidet vagy a fehérje fragmenst foszfát pufferben oldjuk, majd azonos tömegű (g/g) KLH-val vagy' BSA-val keverjük össze. A konjugációs reakciót szobahőmérsékleten, két óra hoszszat hagyjuk lejátszódni, enyhe kevertetés közben. Az oldatot azután egy sómentesítő oszlopon bocsátjuk át, vagy foszfáttal puffereit sőoldattal szemben dializáljuk, éjszakán át. A peptid konju gátumot -20 °C“0n tároljuk, ameddig az immunizálásokban. vagy az EIA-kban felhasználjuk.

C. Immunizálás:

Balb/c egereket (Charles Rivers Laboratori.es, Wilmington, MA], Lou patkányokat vagy New Zealand White nyulakat szubkután injekciózunk (SQI) Freund féle Komplett adjutánsban (CFA, 50% térf/térf; Difco Laboratories, Detroit, MI) emulgeált vizes oldattal (50 pg, 150 pg és 100 pg). A nyulak azután kéthetenként kétszer vagy háromszor erősítő injekciókat kapnak, olyan antigénnel, amit az előzőekhez hasonló módon., Freund féle Inkomplett adjuvánsban készítettünk (ICFA; Difco Laboratories, Detroit,

Ml). Az egereket és a patkány okát körülbelül négyhetente erősítő injekcióval injekciózzuk. A második erősítő injekció után hét

teszt-véreztetéseket végzünk, és meghatározzuk a szérum ellenanyag literét. Amikor a liter kifejlődött a nyulakban, hat egymást követő héten hetente SO ml vért veszünk. Az egereket és patkányokat a szérum titer szintek alapján választjuk ki a híbridőma termeléshez; azokat az állatokat használjuk, amelyekben a maximális literek fele nagyobb mint 5000. Ennek a protokollnak

dául különböző típusú immunmodulátorok szerezhetők be és be1 efoglalh átok a p rotokollba.

D. Enzimhez kötött i aszorbens álat (ElA)

Az EIA-kat azzal a céllal hajtjuk végre, hogy az egyes állatokban meghatározzuk a szérum ellenanyag (ab) szintjét, a későbbiekben pedig a potenciális hibridómák szűrővizsgálatára. Laposfenekű, magas kötőképességű, 96--lukas mik.roti.ter EIA/RIA lemezeket (Costar Corporation, Cambridge, MA) borítunk tisztított rekombináns fehérjével vagy fehérje fragmenssel (antigén, ag) 5 pg/ml koncentrációban, karbonát-bikarbonát puf~ ferben (pH-9,2, 0,015 mol/1 Na.._?CO₃, 0,035 mol/1 NaHCOs). A fehérje fra.gmenseket szükség esetén szarvasmarha szérum albuminhoz (BSA) konjugáltathatjuk. Az egyes Inkákhoz 50 pl antigént adunk. A lemezeket azután acélát filmmel borítjuk be (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA)., majd szobahőmérsék letem 2 óra. hosszat, vagy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk rázógépen. A lemezeket 30 percig szobahőmérsékleten blokkoljuk In kánként 250 pl 5% BSA oldattal, amit úgy állítottunk elő, hogy 1 rész BSA higítószer/blokkoló oldat koncentrátumot (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) keverünk össze rész ionmentesített vízzel. Miután a blokkoló oldatot leöntöttük, a szérum kétszeres hígításaiból (1:100-től 1:12800-ig), vagy a hibridóma szövettenyésztő felülűszókböl 50 μ,Ι-t adunk az egyes Inkákhoz.. A szérum higítöszer 1% BSA (10% BSA higítószer/blokkoló oldat, koncentrátum 1:10 arányban hígítva Dulbeccc féle foszfáttal puSerelt sóoldattal, azaz B-PBS-sel;: Gibco BRL, Grand Island, NY), míg a hibridóma felülúszókat hatatlanul alkalmazzuk. A hibridóma szűrővizsgálat esetében az egyik lukat meghagyjuk konjugátum kontrollként, és egy⁷ má nként. A leme zeket ismét szobahőmérsékleten 1 óra hosszat rázógépen inku báljuk, majd négyszer mossuk egy hússzoros töménységű koncentrátum egyszeres, desztillált vízben készített hígításával (Kírkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersbuig,: MD). A tormaperoxidázzal konjugált szekunder ellenanyagot (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indtanapolis, IN) 1% BSA-ba hígítjuk, majd minden egyes lukban 30 percig ínkubáljuk. A lemezeket ugyanúgy mcssük mint az előzőkben, szárazra Mattoljuk, majd ABTS peroxidáz egykomponensű szubsztrátot (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) adunk hozzá. Az abszorbanciát. minden egyes lukban 405 nm-en mérjük, egy Microplate EL310 leolvasóval (Bic-tek Instruments, Inc., Winooski, VT). A szérum maximális titerének a felét úgy számítjuk ki, hogy a szérum hígításának tizes alapú logaritmusát ábrázoljuk. a 405 nm-en mért optikai sűrűséggel szemben, majd az adott szárammal kapott maximális optikai sűrűség 50%-os pontját extrapoláljuk. A. hibridómákat akkor tekintjük pozitívnak, ha az optikai sűrűség értéke nagyobb mint. a. háttér ötszöröse. Ezt a protokollt adaptálhatjuk; például konjugált szekunder ellena nyagot választhatunk a specificítás miatt, vagy azért, hogy ne kapjunk kereszt-reaktivitást

E. Sejtfúzió:

A hibridóma termeléshez választott állatot intravénásán ín jekciózzuk 50-100 gg foszfáttal puffereit sóold atban oldott antigénnel Négy nappal később az állatot széndioxiddal elpusztítjuk, majd a lépét steril körülmények között 35 ml Dulbecco fele Eagle Minimális Esszenciális Táptalajba gyűjtjük össze, ami. 200 E/ml penicillin G-t, 200 mg/ml sztreptonúcin-szulfátot. és 4 mmol/1 glutamint tartalmaz (2x P/S/G DMEM). A lépről eltávolítjuk a fölösleges zsírszövetet, majd 4 egymást követő edényben leöblítjük tiszta 2x P/S/G DMEM-meL Ezután steril mellkendő zacskóba tesszük (Tekmar, Cincinnati, OH), ami 10 ml 2x P/S/G DMEM-et. tartalmaz, majd, egysejt szuszpenziót készítünk belőle a Stomacher bab Blender 80-nal (Seward Laboratory UAC House; London, Nágy-Britannia). Ahogy a sejtek felszabadulnak a lépkapszulából a közegbe, ezeket eltávolítjuk a zacskóból, majd steril 50 ml-es kónuszos centrifugacsőbe tesszük (Becton Diekinson and Company, Lincoln Park, MJ|. Friss táptalajt teszünk a csomagba, majd az eljárást addig folytatjuk, amíg a lép összes sejtje felszabadul. Ezeket a szplenocitákat háromszor mossuk centrífügátassal (225*g, 10 perc).

Ezzel egvidőben az egér vagy patkány szplenocita. fúzióhoz Sp2/0-Agl4 vagy Y3-Agl.2.3 mielóma sejtek (American Type Culture Collection; Rockville, MD) komplett táptalajban (DMEM, 10% inaktivált borjúmagzat szérum, 2 mmol/1 glutamin, 0,1 mmol/1 nem-esszenciális aminosavak, .1 mmol/1 nátrium.-piruvát és 10 mmol/1 hepes puffét: Gíbco Laboratori.es, Grandi Island, N¥i növesztett logfázisü tenyészeteit hasonlóképpen mossuk. A szplenocitákat egyesítjük a mielóma sejtekkel, majd újra ülepítjük. A táptalajt leszívjuk a sej tűled ékről, majd 2 ml 1500-as polieúlénglikolt (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochetnicals, Indianapoüs, IN) óvatosan elkeverünk a sejtekkel, körülbelül 1 perc alatt. Ezután lassan azonos térfogatú 2* P/S/G DMEM-et adunk hozzá. Hagyjuk, hogy a sejtek 37 ^cC-on 2 percig fuzionáljanak, majd újabb 6 ml 2* P/S/G DMEM-et. adunk hozzá. A sejteket ismét állni hagyjuk 37 °C-on 3 percig. Végezetül 35 ml 2* P/S/G DMEM-et adunk a sejtszuszpenzióhoz, és a sejteket centri&tgálással ülepítjük. A közeget leszívjuk az üledékről, majd a sejteket óvatosan újra szuszpendáljuk komplett táptalajban.. A sejteket 96-lukas, laposfenekü szövettenyésztő lemezekre osztjuk szét (Becton Dickinson and Cnmpany, Lincoln Park, NJ), egyetlen cseppet ejtve egy 5 ml-es pipettából, A lemezeket éjszakán át nedvesített körülmények között 37 °C-on. inkubáliuk, 5% CCh-t tartalmazó atmoszférában. A következő napon azonos térfogatú szelekciós közeget adunk, az egyes Inkákhoz. A szelekciós közeg 0.1 mmol/1 hipoxantínt, 4 * 1CM mmol/1 aminopterint és 1,6 * 1.0'² mmol/1 timídint tartalmaz komplett táptalajban. A fúziós lemezeket 7 napig inkubáljuk. majd a következő három, napban a közeget kétszer cseréljük; a folyadék minden egyes cseréje után HAT szelekciós táptalajt használunk. A szővettenyészetek felülúszóit az utolsó folyadékcsere után 3-4 nappal szívjuk le az egyes hibrid-tartalmú lukakról, majd EIA-val vizsgáljuk, hogy adnak-e specifikus ellenanyag reakciót. Ezt a protokollt a szakirodalomban ismertetett, módon módosítottuk [Hudson and Hay: „Practical Immunology, Second Edition”, Blackwell Scíentific Publications).

jpoietikus prekurzor

5dő osteoprategerint kötő fehérje receptor klónozása

Biológiailag aktív rekombináns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]-ot konjugálunk fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC), így állítunk elő egy fluoreszcens próbát. A. fluoreszcens jelölést úgy hajtjuk végre, hogy rekombináns rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]-ot 6-fluoreszcein-5-(és 6) karboxamido hexánsav szukcínimídil-észterrei inkubálunk (Molecular

Probes, Eugene, OR) 1:6 mólarányban, 12 óra hosszat, 4 °C-on.

A FITC-jelzett osteoprotegerint kötő fehérje [158-316]-ot tovább tisztítjuk gélszűrés·· kromatográfiávah Egér csontvelő sejteket izolálunk és inkubálunk tenyészetben, CS'F-1 és osteoprotegerint kötő fehérje (158-316] jelenlétében, a 10. példában leírt módon.

Egér csontvelő sejteket tenyésztünk 130 ng/ml CSF-1 és 20 ng/ml osteoprotegerint kötő fehérje [158-316] jelenlétében. A nem tapadó sejteket távolítjuk el először, majd jégen tároljuk, és a visszamaradt tapadó sejteket sejt-disszoeiáló pufferrel való in módon. Mosás és 0,5% BSA-t tartalmazó PBS-ben való újra szuszpendálás után a sejteket FITC-osteoprotegerint kötő fehérjével hozzuk érintkezésbe, mossuk, majd FACS-szal szétválogatjuk. Azokat a sejteket gyűjtjük össze, amik a F1TC-osteoprotege rint kötő fehérjével való festésre pozitívnak bizonyultak, összegyűjtjük, majd a mRNS-üket a 2. példában leírt módon izoláljuk. Ezt a mRNS készítményt használjuk egy cDNS könyvtár elkészí tésére, a 2. példában leírt módon.

?0

Az ebből a forrásból készített cDNS könyvtárat használjuk a véletlenszerű EST szekvencia-elemzésre, amint azt korábban a •m·

WO97/23614 számú PCT publikációban, valamint Simonét és munkatársai cikkében leírták [Simonét és mtsai: Cell 89, 309319 (1997)]. Ennek a módszernek az alkalmazásával egy körülbelül 2,1 kilo bázis méretű cDNS-t lehetett kimutatni, ami egy új. TNFR-rel rokon vegyületet kódol. A rágcsáló ODAR cDNS hosszú nyílt leolvasási kerete egy 625 aminosavból álló fehérjét kódol, és a tartalmazza a TNFR-rel rokon fehérjék jellegzetes egységeit: egy hidrofób szignálpeptidet az N-terminálisán, négy egymás után álló, lisztemben gazdag ismétlődő szekvenciát, egy hidrofób transzmembrán domént és egy citoplazmatikus szignál domént. Ennek a fehérjének a TNF receptor-család más tagjaival való homológiája, valamint a FITC-jelzett osteoprotegerint kötő fehérjéhez kapcsolódó csontvelő sejtekben való expressziója azt. sugallja, hogy ez a TNF-fel roon osteoprotegerint kötő fehérjének egy potenciális receptora. Ennek a. fehérjének a jelzése ODAR, azaz osteoclast differenciálódási és aktiválási receptor. A rágcsáló ODAR műclemsav szekvenciáját és az abból következő ammosav szekvenciát a 10. ábrán mutatjuk be.

A nyilvános adatbázisokban levő szekvenciák legfrissebb elemzése az mutatja, hogy ez a fehérje egy RÁNK néven ismert humán TNFR-rel rokon fehérje rágcsáló homológja [Andersen és mtsai: Natúré 390. 175-179(1997)].

13. Példa

A rekombináns ODAR fehérje előállítása emlős sejtekben

A humán IgCn Fc régiójához fúzionáltatott oldható ODAR extracelluláris domént az Fc fúziós fehérjék konstrukciójára és expressziójára korábban publikált eljárásokkal állítjuk elő [WO97/23614 számú PCT publikáció; Simonét és mtsai: Cell 89, 309-319 (1997)]. Ahhoz, hogy oldható ODAR fehérjét állítsunk elő emlős sejtekben, a rágcsáló ODAR (27-11.1-es aminosavak) extracelluláris doménjét polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk, az alábbi olígon ukleo tid primer- párok felhasználásával:

5' TCT CCA AGC TTG TGA CTG TCC AGG TCA CTG C-3' (37. számú szekvencia)

5' TCT CCG CGG CCG CGI AAG GOT GGG GOT CAT TGG GTG (38. számú szekvencia).

A polimeráz láncreakciókat 50 pl térfogatban hajtjuk végre egység kereskedelmi forgalomban levő DNS polimerázzal (New Ehglaúd Biolabs), az alábbi összetételű oldatban: 20 mmol/I TRIS-HCl pH^S.S, 10 m.m.ol/l. kálium-klorid, 10 mmöl/1 (NH4hSO4,. 0,1% Triton X-100, 10 μχηοΐ/l az egyes dNTP-kből, 1 μ mol/I az egyes prímerekból és 10 ng ODAR. cDNS templát. A reaciókat 94 °C-on hajtjuk végre 30 másodpercig, 55 ®C-on 3Ö másodpercig, és 72 °C-on 1 percig, összesen 16 ciklusban. A POR fragmenst elektroforézissel ízolálj'uk. A PCR fragmens egy Hindin, restrikciós hasítási helyet hoz létre az 5' végen és egy Notl restrikciós hasítási helyet hoz létre a 3' végen. A HindlII-NotI enzimekkel emésztett PCR fragmenst azután, leolvasási keretben egy módosított pCEP4~Fc vektorba szubklónozzuk, a humán IgG-yl nehéz lánc szekvencia elé, a korábban publikáltak szerint. [WO97/23614 számú PCT publikáció; Simonét és mtsai: Cell 89, 309-319 (1997)]. Egy linkért építünk be, ami két irreleváns ami nosavat kódol, amik az ODAR extracelluláris dómén és az IgG Fc régió között hoznak létre kapcsolatot.

A konstrukciót azután az Nhel és Hindik restrikciós enzimekkel emésztjük, és az alábbi, az osteoprotegerin szignálpeptidet: (1-21-es aminosavak) kódoló oligonukleotid párt szúrjuk be leolvasási fázisban:

TGG TGC TCC TGG AGA TCA TTG AAT GGA CAA CCC AGA-.-3' (39. számú szekvencia)

5' AGG TTC TGG GTT GTC GAT TCA ATG TTG TCC AGG AGC

ACC AGG AGT GCG CAG GAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG-3' (40. számú szekvencia).

Az osteoprotegerin szignálpeptid és az ODAR szekvenciák közé két irreleváns aminosavat kódoló linkért szúrtunk be. A végeredményként létrehozott konstrukció (ODA.R-Fc/pC.EP4) egy fúziós fehérjét kódol, ami az N-terminálistól kezdődően a C-termi nálisig az alábbi részeket tartalmazza: osteoprotegerin szignálpepiid (1-21-es aminosavakj-linker (LysLeuj-ODAR (27-2 l l es aminosavakj-linker (AlaAla)-humán IgG Fc.

A konstrukciót 293-EBNA-í sejtekbe transzfektáljuk a már publikált kalcium-foszfát módszer módszerrel [Current Protocols in Molecular Biology, 1, 9.1-9.1.3, szerk.; Ausubel és mtsai,

Greene Publishíng és Wiley-Intersciericer New York (1994)]. A transziéktált sejteket azután 200 pg/ml hlgromicinen (GibcoBRL) szelektáljuk, és a kapott gyógyszer-rezisztens tömegtenyészeteket egyesítjük és egybenövésig szaporítjuk. A sejteket egyszer mos lajban 72 óra hosszat szaporítjuk. A kondicionált táptalajt össze

X gyűjtjük. A. táptalajban levő ODAR-Fc fúziós fehérjét Western felet elemzéssel mutatjuk ki, anti-humán IgG-Fc ellenanyag felhasználásával.

Az Fc fúziós fehérjét proteín-A oszlopkromatográfíával (Pierce) tisztítjuk, a gyártó által javasolt eljárásokat használva. A tisztított fehérjéből 50 pmól-í H-termínális szekvencia elemzésnek vetünk alá, automatizált Edman degradációt használva erre a célra, lényegében Matsu dalra és munkatársai leírását követve (Matsudaira és mtsai: Journal of Biological Chemistry 262, 10-35 (1987)]. 10 ciklus után az alábbi aminosav szekvenciát lehetett leolvasni:

NH₂-K L V T L Q V T P-CQOH

Az ODAR-Fc-nek az osteoprotegerint kötő fehérjéhez való kötődési aktivitását a. transzfektált COS-7 sejtek immunfluoreszcenciás festésével vizsgáljuk, a 2. példában leírt módon, COS-7 sejteket üpofektálunk 1 cg expressziés vektorral, ami a rágcsáló osteoprotegerint kötő fehérjét kódoló DNS-t tartalmazza. 48 órás inkubálás után a sejteket 1 óráig 4 °C~on inkubáljuk. 10 pg/ml humán IgG Fe-t, ODAR-Fc-1 vagy osteoprotegerin-Fc-t tartalmazó PBS-FBS oldatban. A sejteket azután kétszer mossuk foszfáttal puffereit sőoldatban, majd újabb egy óra hosszat 20 pg/ml FITCjelzett kecske anti-humán IgG-t (Southern Biotech Assocíates) tartalmazó PBS-FBS oldatban inkubáljuk. A PBS-sel való mosás után a sejteket kordoká.Hs mikroszkópiával (.ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, Iné., Okemos, Ml) vizsgáljuk. Mind az ODAR-Fc mind az osteoprotegerin-Fc kötődik az OPGL lel transzfektált COS-7 sejtekkel (11. ábra)

A rekombínáns oldható ODAR ín vitro biológiai aktivitása

Az ODAR-nak azt a képességét, hogy gátolja az osteoclast osteoprotegerint kötő fehérje serkentésével való képződéséi, egér csontvelő tenyészetben becsüljük meg 30 ng/ml CSF-1 és 5 ng/ml osteoprotegerint kóló fehérje jelenlétében. Az egér csontvelő tenyészeteknek az osteodast érésének vizsgálatára való fel használása eljárás a WO97/23614 sszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben és a 8. példában ismertetjük. A 12. példában leirt módon előállított ODAR-Fc fúziós fehérjét 65-1500 ng/ml koncentrációban adjuk hozzá. Az osteoclast képződését tartarát rezisztens alkallkus foszfatáz (TRAP) citokémiával becsüljük, majd TRAP oldat vizsgálattal, ötnapos tenyésztés után.

Az osteodast képződés ODAR-Fc fúzióval való dóri sfüggő gátlását mind citokémiával mind TRAP aktivitással meg lehet fi-

képződését, aminek EDgo értéke körülbelül 10-50 ng/ml.

Fiatal, gyorsan növő, 3-4 hetes hím BD'Fl egerek négyszer különböző dózisú ODAR-Fc fúziós fehérjét kapnak napi egyszeri szubkután injekcióval, amit PBS/0,1% BSA hordozóban készítettünk el. Az egereket az 5. napon Röntgen-sugárzással vizsgáljuk.

“:A.J és a kezelt sípcsontok között, és ,,+”~ra értékeljük, ha a kezelt sípcsont vizuális becslés alapján sűrűbb mint a kontroll, és az. alábbiakban bemutatott 8 értéket kaptuk. Egv „pozitív” eredményhez egy tetszőlegesen megválasztott 5/8 értékre van szükség. (A dózist mg/kg/nap-ban adjuk meg, n=4).

Az elpusztítás után a jobb sípcsontot eltávolítjuk, az. egyes állatokból, és a sípcsont proximális metafízísben mérjük a csont sűrűségét, perifériális számítógépes tomográfiát (pQCT) használva erre a célra (Stratec, Németország). A csont két 0,5 mm-es keresztmetszeti metszetét, a sípcsont proximális végének 1.5 mm-es és 2,0 mm-es metszetét elemezzük (XMICE 5.2, Stratec, Németország), hogy meghatározzuk az össz-csont ásványi anyag sűrűségét a metafízísben. A lágyszővet elválasztásnak 1500-as határértékét használjuk annak meghatározására, hogy hol van a metafízis csont határa.

Ha fiatal, növésben levő egereknek ODAR-Fc-t adunk be, akkor ez gátolja a csont felszívódását a sípcsont proximális növekedési lemezénél, ezzel a megnőtt csontsűrűségnek egy olyan, régióját hozva létre, ami radiográfia alapján vizuálisan evidens, A radiográfiás változások nyilvánvalóak 1,5 mg/kg/nap dózisban és afölött, két. kísérletben (1. táblázat). A csontsűrűség pCQT-vel való mérése egy második kísérletben a sípcsont egy hasonló régiójában igazolta ezeket a dózisfűggő csontsűrűség növekedéseket ezekben az egerekben (13. ábra).

Claims (10)

1. Táblázat

A csontfelszívódás gátlása ODAR-Fc fúziós fehérjével

1. kísérlet

Faktor Dózis | 1 | 2 | 3 [ 4 5 6 [7 [8 | Eredmény

ODAR-Fc 5,0 4 5 ··]» } 4“ u ZJ J Z jö- U Pozitív 8/8 ODAR-Fc 1,5 - 4 Í + : ‘V t 4“ Pozitív 6/8 ODAR-Fc 0,5 - “j- J - Negatív 0/8 ODAR-Fc 0,15 - - Negatív 0/8

2. kísérlet

Faktor 11 i 2 |3 4 5 ö | 7 8 | Eredmény ODAR-Fc 1 5,0 »4*· <»: 4“ * |4 4· : 4 1 Pozitív 8/8 ODAR-Fc | 1,5 i; Z 4- í 4- 4- | 4- 4- | Pozitív 6/8 ODAR-Fc | 0,5 : - i - 4* 1 — i... - j Negatív 1/8

Bár a jelen találmányt az előnyben részesített megvalósítási módoknak megfelelően írtuk le, az nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártas szakember különböző variációkat és módosításokat tehet benne. Ennek következtében az a szándékunk, hogy a mellékelt igénypontok az összes ilyen ekvivalens variációra vonatkoz-

SZABADALMI IGLM PONTOK

1. Egy aiititest alkalmazása os2teoprotegerín kötő fehérje (ÖPGbp) modulátorként, csontbetegség .kcA'le^crv szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az antitest -egy olyan antagonístn, ameh kotodik a 4. ábra szerinti (3. sz. szekvencia) OPGbp-hez és amely gátolja az OPGbp által közvetített osmoclast-germzisi cs/vagy csontfelszívódást

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest egy tnonokionális antitest.

3. Az 1. igénypont Szennti aikahnazás, ahol az antitest egy reknmbináns antitest.

4. Az l; igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest egy kiméra antitest vagy egy CDR-graftolt antitest.

5. Az l. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest humán antitest.

6. Az 5. igénvpont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet egy humán antitestek előálhtásaia képes tmnsm,emktis alku immunizálásának árián állítjuk elő,

7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest az OPGbp egy membránasszociált formájához kötődik.

8 . Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest az OPGbp egy oldható formájához kötődik.

9, A h. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az OPGbp oldható formája a 4. sz. szekvencia 0^-07 ammosavait taitalmazza

10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet egy vagy több, az alábbi csoportból választott csont, ntorfogénfaktorral együtt adjuk BMTM - BMIM2, transzformáló növekedési faktor-béta, egy transzformáló növekedési faktor-bet a családtag. egy az alábbiak közül választott fíbroblaszt növekedési faktor. FCIF-1 - FGF-IO, egy tnierlenkm-l inhibitor, egy TNF-alfa inhibitor, paratiroid hormon, É-szériás prosziagianditt, egy bifoszfonát vagy egy csontjavító ásványi anyag.