ES2284203T5 - Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores - Google Patents
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cos de los ácidos nucleicos.
Los polipéptidos que son proteínas de unión de OPG de mamíferos o son sus fragmentos, análogos o derivados están compredidos según la invención. En una realización preferida, la proteína de unión a OPG es la proteína de unión a OPG humana. Un fragmento de la proteína de unión a OPG se refiere a un polipéptido que tiene una deleción de uno o varios aminoácidos tal que el polipéptido resultante tiene al menos la propiedad de unirse a OPG. Dichos fragmentos tendrán deleciones que provienen del extremo amino terminal, el extremo carboxi terminal, y las regiones internas del polipéptido. Los fragmentos de la proteína de unión a OPG son de al menos aproximadamente diez aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas, la proteína de unión a OPG tendrá una deleción de uno o varios aminoácidos de la región transmembrana (restos de aminoácidos 49-69 como se muestra en las Figuras 1A-F), o, de forma alternativa, uno o varios aminoácidos del extremo amino hasta y/o incluyendo la región transmembrana (restos de aminoácidos 1-49 como se muestra en las Figuras 1A-F). En otra realización, la proteína de unión a OPG es una proteína soluble que comprende, por ejemplo, los restos de aminoácidos 69-316, o 70-316, o sus formas truncadas del extremo N-terminal o C-terminal, que conserva la actividad de unión de OPG. La proteína de unión a OPG también es una proteína soluble humana como se muestra en las Figuras 4A-F que comprende los restos 69-317 como se muestra en las Figuras 4A-F y sus formas truncadas del extremo N-terminal, por ejemplo, 70-517, 71-517, 71-317, 72-317 etcétera. En una realización preferida, la proteína de unión a OPG soluble humana comprende los restos 69317 y sus truncamiento del extremo N-terminal hasta OPGbp [158-317], o de forma alternativa hasta OPG [166-317].
Un análogo de una proteína de unión a OPG se refiere a un polipéptido que tiene una sustitución o adición de uno o varios aminoácidos tal que el polipéptido resultante tiene al menos la propiedad de unirse a OPG. Dichos análogos tendrán sustituciones o adiciones en cualquier sitio a lo largo del polipéptido. Los análogos preferidos incluyen los de las proteínas de unión de OPG solubles. Los fragmentos o análogos pueden ser naturales, tales como un producto de polipéptido de una variante alélica o una variante de empalme de mARN, o pueden ser construidos usando técnicas disponibles para un experto en la técnica para manipular y sintetizar ácidos nucleicos. Los polipéptidos pueden o no tener un resto de metionina del amino terminal.
También están incluidos en la invención los derivados de la proteína de unión a OPG que sean polipéptidos que hayan sufrido modificaciones de post-translación (por ejemplo, la adición de cadenas de carbohidrato N-unidas u Ounidas, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal), la adición de restos químicos a la estructura del aminoácido, las modificaciones químicas de cadenas de carbohidrato N-unidas u O-unidas, y la adición de un resto de metionina del extremo N-terminal como consecuencia de la expresión de células huésped procariotas. En particular, son contemplados los derivados químicamente modificados de la proteína de unión a OPG que proporcionan ventajas adicionales tales como una mayor estabilidad, tiempo circulante más largo, o menor inmunogenicidad. De uso particular es la modificación con polímeros solubles en agua, tales como el polietilenglicol y sus derivados (véase por ejemplo la Patente de EE.UU. Nº 4.179.337). Los restos químicos para la derivatización pueden ser seleccionados a partir de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol de vinilo) y otros similares. Los polipéptidos pueden ser modificados en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos. Los polipéptidos también pueden ser modificados en posiciones predeterminadas en el polipéptido, tal como en el extremo amino, o en un resto lisina o arginina seleccionado dentro del polipéptido. Otras modificaciones química proporcionadas incluyen un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.
Las quimeras de la proteína de unión a OPG que comprenden parte o toda la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a OPG fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga también están incluidas. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia que permita a la proteína de fusión resultante conservar al menos la actividad de unión a OPG. En una realización preferida, el dominio extracelular del extremo carboxi terminal de la proteína de unión a OPG se fusiona a una secuencia heteróloga. Tales secuencias incluyen dominios citoplásmicos heterólogos que proporcionan acontecimientos de señalizacion intracelular alternativos, secuencias que promueven la oligomerización tal como la región Fc de IgG, las secuencias enzimáticas que proporcionan un marcador para el polipéptido, y las secuencias que proporcionan sondas de afinidad, tales como un reconocimiento antígenoanticuerpo.
Los polipéptidos de la invención son aislados y purificados a partir de tejidos y líneas celulares que expresan la proteína de unión a OPG, extraídos a partir de lisados o a partir de medio de crecimiento acondicionado, y a partir de células huésped transformadas que expresan la proteína de unión a OPG. La proteína de unión a OPG puede ser obtenida a partir de la línea celular mielomonocítica 32-D murina (Nº del catálogo ATCC CRL-11346). La proteína de unión a OPG humana, o los ácidos nucleicos que codifican la misma, pueden ser aislados a partir del nodo de linfa humano o de tejido de hígado fetal. La proteína de unión a OPG aislada está libre de asociación con proteínas humanas y otros constituyentes de la célula.
Un método para la purificación de la proteína de unión a OPG a partir de fuentes naturales (por ejemplo, tejidos y líneas celulares que normalmente expresan la proteína de unión a OPG) y a partir de células huésped transfectadas también está comprendido según la invención. El procedimiento de purificación puede emplear una o varias etapas
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de purificación de proteínas estándar en un orden apropiado para obtener la proteína purificada. Las etapas de cromatografía pueden incluir intercambio iónico, filtración de gel, interacción hidrófoba, fase inversa, cromatoenfoque, cromatografía de afinidad que emplea un anticuerpo de la proteína de unión anti-OPG o el complejo de afinidad biotina-estreptavidina y otros similares.
Anticuerpos
Los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención también están compredidos según la invención. Los anticuerpos pueden ser producidos por la inmunización con la proteína de unión a OPG de cadena entera, las formas solubles de la proteína de unión a OPG, o sus fragmentos. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, o pueden ser recombinantes, tales como los anticuerpos quiméricos en los que las regiones constantes murinas en las cadenas ligeras y pesadas son sustituidas por secuencias humanas, o anticuerpos injertados en las CDR en los que sólo las regiones determinantes complementarias son de origen murino. Los anticuerpos de la invención también pueden ser anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, por la inmunización de animales transgénicos capaces de producir anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, la Solicitud PCT Nº WO93/12227). Los anticuerpos son útiles para detectar la proteína de unión a OPG en muestras biológicas, permitiendo así la identificación de células o tejidos que producen la proteína. Además, los anticuerpos que se unen a la proteína de unión a OPG y la interacción de bloque con otros compuestos de unión pueden tener uso terapéutico en modular la diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea.
Los anticuerpos contra la proteína de unión a OPG pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades óseas, tales como, osteoporosis y enfermedad de Paget. Los anticuerpos pueden ser analizados al unirse a la proteína de unión a OPG en ausencia o presencia de OPG y ser examinados por su capacidad de inhibir la resorción ósea y/o la osteoclastogenesis mediada por ligando (proteína de unión a OPG). También se espera que los mismos péptidos puedan actuar como un antagonista de la interacción ligando:receptor e inhibir la osteoclastogenesis mediada por ligando, y los péptidos de la proteína de unión a OPG serán explorados para este propósito también.
Composiciones
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a OPG de la invención junto con un diluyente farmacéuticamente aceptable, vehículo, solubilizador, emulsionante, conservante y/o adyuvante. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista o antagonista de la proteína de unión a OPG. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una condición especifica y una ruta de administración. La composición puede estar en una forma líquida o liofilizada y comprende un diluyente (tampones de Tris, acetato o fosfato) que tiene varios valores de pH y fuerzas iónicas, solubilizadores tales como Tween o Polisorbato, vehículos tales como albúmina de suero humana o gelatina, conservantes tales como timerosal o alcohol bencílico, y antioxidantes tales como ácido ascórbico o metabisulfito de sodio. La selección de una composición particular dependerá de un número de factores, incluyendo la condición que se trate, la ruta de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Una revisión más extensa del componente adecuado para composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed. A.R. Gennaro, editor. Mack, Easton, PA (1980).
En una realización preferida, también se proporcionan composiciones que comprenden proteínas de unión de OPG solubles. También están comprendidas composiciones que comprenden la proteína de unión a OPG soluble modificada con polímeros solubles en agua para aumentar la solubilidad, estabilidad, semivida en plasma y biodisponibilidad. Las composiciones también pueden comprender la incorporación de la proteína de unión a OPG soluble en liposomas, microemulsiones, micelas o vesículas para la administración controlada durante un período ampliado de tiempo. La proteína de unión a OPG soluble puede ser formulada en micropartículas adecuadas para la administración pulmonar.
Las composiciones de la invención pueden ser administradas por inyección, subcutánea, intravenosa o intramuscular, o administración oral, nasal, pulmonar o rectal. La ruta de administración eventualmente escogida dependerá de un número de factores y puede ser averiguada por un experto en la técnica.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los ácidos nucleicos de la invención junto con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de ácidos nucleicos serán adecuadas para la administración de parte o toda la región de codificación de la proteína de unión a OPG y/o regiones flanqueantes de células y tejidos como parte de un régimen de terapia antisentido.
Métodos de uso
Las proteínas de unión de OPG pueden ser usadas en una variedad de ensayos para detectar OPG y caracterizar las interacciones con OPG. En general, el ensayo comprende incubar la proteína de unión a OPG con una muestra biológica que contenga OPG en condiciones que permitan la unión de OPG a la proteína de unión a OPG, y medir el grado de unión. Puede ser purificado OPG o puede estar presente en mezclas, tales como en fluidos corporales o medios de cultivo. Los ensayos que pueden ser desarrollados son cualitativos o cuantitativos, siendo éste útil para
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determinar los parámetros de unión (constantes de afinidad y cinéticas) de OPG a la proteína de unión a OPG y para cuantificar los niveles de OPG biológicamente activos en mezclas. Los ensayos también pueden ser usados para evaluar la unión de OPG a fragmentos, análogos y derivados de la proteína de unión a OPG e identificar el nuevo OPG y los miembros de la familia de la proteína de unión a OPG.
La unión de OPG a la proteína de unión a OPG puede ser llevada a cabo en varios formatos, incluyendo ensayos de unión basados en células, ensayos de unión de membrana, ensayos en fase de disolución e inmunoensayos. En general, los niveles traza de OPG marcados son incubados con muestras de la proteína de unión a OPG durante un período de tiempo especificado seguido de la medida de OPG unido por filtración, electroquimioluminiscente inmunoensayos o ensayos basados en células (ECL, ORIGEN system por IGEN). También pueden ser puestas en práctica tecnologías de ensayo homogéneas con radiactividad (SPA; Amersham) y fluorescencia con resolución temporal (HTRF, Packard). La unión es detectada marcando OPG o un anticuerpo anti-OPG con isótopos radiactivos (125I,35S, 3H), tintes fluorescentes (fluoresceina), quelatos o criptatos de lantánido (Eu3+), o complejos de bipiridil-rutenio (Ru2+). Se entiende que la opción de una sonda marcada dependerá del sistema de detección usado. De forma alternativa, el OPG puede ser modificado con un marcador de epítopo no marcado (por ejemplo, biotina, péptidos, His6, myc) y unirse a proteínas tales como la estreptavidina, anticuerpos antipéptido o antiproteína que tienen un marcador detectable como se describe anteriormente.
En un método alternativo, la proteína de unión a OPG puede ser analizada directamente usando anticuerpos policlonales o monoclonales respecto a las proteínas de unión de OPG en un inmunoensayo. Las formas adicionales de proteínas de unión de OPG que contienen marcadores de epítopo como se describe anteriormente pueden ser usadas en solución y en inmunoensayos.
Los métodos para identificar los compuestos que interactuan con la proteína de unión a OPG también están compredidos según la invención. El método comprende incubar la proteína de unión a OPG con un compuesto en condiciones que permitan la unión del compuesto a la proteína de unión a OPG, y medir el grado de unión. El compuesto puede ser purificado sustancialmente o estar presente en una mezcla a granel. Los compuestos de unión pueden ser ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos o compuestos orgánicos de pequeño peso molecular. Los compuestos además pueden ser caracterizados por su capacidad de aumentar o disminuir la actividad de la proteína de unión a OPG para determinar si actúan como un agonista o un antagonista.
Las proteínas de unión de OPG son también útiles para identificar las proteínas intracelulares que interactuan con el dominio citoplásmico mediante un procedimiento de rastreo de dos híbridos de levadura. Como ejemplo, pueden usarse construcciones de híbrido que comprendan ADN que codifica los 50 aminoácidos del extremo N-terminal de una proteína de unión a OPG fusionada a un dominio de unión GAL4-ADN de levadura como un plásmido de cebo de dos híbridos. Los clones positivos que surgen del rastreo pueden ser caracterizados además para identificar a las proteínas que interactuan. Esta información puede ayudar a aclarar el mecanismo de señalización intracelular asociado con la proteína de unión a OPG y proporcionar objetivos intracelulares para nuevos fármacos que modulen la resorción ósea.
La proteína de unión a OPG puede ser usada para tratar condiciones caracterizadas por una excesiva densidad ósea. La condición más común es la osteopetrosis en la que un defecto genético causa una masa ósea elevada y es por lo general fatal en los pocos primeros años de vida. La osteopetrosis es tratada preferiblemente por la administración de la proteína de unión a OPG soluble.
La invención también comprende moduladores (agonistas y antagonistas) de la proteína de unión a OPG y los métodos para obtenerlos. Un modulador de la proteína de unión a OPG puede o aumentar o disminuir al menos una actividad asociada con la proteína de unión a OPG, tal como la capacidad de unirse a OPG o a alguna otra molécula que interactue o puede regular la maduración de osteoclastos. Típicamente, un agonista o antagonista puede ser un cofactor, tal como una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de pequeño peso molecular, que interactue con la proteína de unión a OPG para regular su actividad. Los potenciales antagonistas de polipéptido incluyen los anticuerpos que reaccionan con formas solubles o asociadas a membrana de la proteína de unión a OPG, y las formas solubles de la proteína de unión a OPG que comprenden parte o todo el dominio extracelular de la proteína de unión a OPG. Las moléculas que regulan la expresión de la proteína de unión a OPG incluyen típicamente los ácidos nucleicos que son complementarios a los ácidos nucleicos que codifican la proteína de unión a OPG y que actúan como reguladores antisentido de la expresión.
La proteína de unión a OPG está implicada en el control de la formación de osteoclastos maduros, el tipo de célula primaria implicada en la resorción ósea. Un aumento de la velocidad de resorción ósea (sobre la de formación de hueso) puede conducir a varios trastornos óseos denominados en conjunto osteopenias, e incluir la osteoporosis, osteomielitis, hipercalcemia, osteopenia producida por cirugía o administración de esteroides, enfermedad de Paget, osteonecrosis, pérdida ósea debida a artritis reumatoide, pérdida ósea periodontal, inmovilización, aflojamiento protésico y metástasis osteolítica. A la inversa, una disminución en la velocidad de resorción ósea puede conducir a osteopetrosis, una condición marcada por una excesiva densidad ósea. Los agonistas y los antagonistas de la proteína de unión a OPG modulan la formación de osteoclastos y pueden ser administrados a pacientes que sufran de trastornos óseos. Los agonistas y los antagonistas de la proteína de unión a OPG usada para el tratamiento de osteopenias pueden ser administrados solos o en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente
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que promueva el crecimiento óseo incluyendo factores morfogénicos óseos denominados de BMP-1 a BMP-12, factor β de crecimiento transformante y miembros de la familia TGF-β, factores de crecimiento de fibroblasto de FGF-1 a FGF-10, inhibidores de interleuquina-1, inhibidores de TNFα, hormona paratiroidea, prostaglandinas de la serie E, bisfosfonatos y minerales potenciadores óseos tales como fluoruro y calcio. Los antagonistas de las proteínas de unión de OPG pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de la osteopenia.
Receptores para proteínas de unión de osteoprotegerina
La invención también proporciona receptores que interactuan con las proteínas de unión de OPG. Más particularmente, la invención proporciona una diferenciación de osteoclastos y el receptor de activación (ODAR). El ODAR es un polipéptido transmembrana que muestra el grado más alto de homología respecto a CD40, un miembro de la familia del receptor de TNF. Se muestra la secuencia de ácidos nucleicos de ODAR murino y el polipéptido codificado en las Figuras 10A-F. El homólogo humano de ODAR murino puede ser aislado fácilmente por rastreo por hibridación de una genoteca de cADN humano o genómica con la secuencia de ácidos nucleicos de las Figuras 10A-F. Los procedimientos para clonar el ODAR humano son similares a los descritos en el Ejemplo 5 para clonar proteínas de unión de OPG humanas. El homólogo humano del polipéptido mostrado en las Figuras 10A-F ha aparecido en Anderson et al. (Nature 390, 175-179 (1997)) y se denomina en este documento RANK. El RANK se caracteriza como una proteína transmembrana tipo I que tiene homología respecto a miembros de la familia del receptor de TNF y que está implicado en la función de células dendríticas.
Se muestran pruebas de la interacción de ODAR y la proteína de unión a OPG en el Ejemplo 13. Una forma soluble de ODAR (la proteína de fusión ODAR-Fc) previene la maduración de osteoclastos in vitro (Figuras 12A-H) y aumenta la densidad ósea en ratones normales después de la inyección subcutánea (Figura 13). Los resultados son compatibles con la proteína de unión a OPG que interactua y que activa ODAR para promover la maduración de osteoclastos.
El desarrollo de osteoclastos y la tasa y el grado de resorción ósea son regulados por la interacción de la proteína de unión a OPG y ODAR. Los compuestos que disminuyen o bloquean la interacción de la proteína de unión a OPG y ODAR son potenciales antagonistas de la actividad de la proteína de unión a OPG y pueden interrumpir el desarrollo de osteoclastos lo que conduce a una menor resorción ósea. De forma alternativa, los compuestos que aumentan la interacción de la proteína de unión a OPG y ODAR son agonistas potenciales que promueven el desarrollo de osteoclastos y realzan la resorción ósea.
Una variedad de ensayos puede ser usada para medir la interacción de la proteína de unión a OPG y ODAR in vitro usando proteínas purificadas. Estos ensayos pueden ser usados para seleccionar compuestos por su capacidad de aumentar o disminuir la tasa o el grado de unión a ODAR por la proteína de unión a OPG. En un tipo de ensayo, la proteína de ODAR puede ser inmovilizada por la adhesión al fondo de los pocillos de una placa de microtítulo. La proteína de unión a OPG radiomarcada (por ejemplo, la proteína de unión a OPG yodada) y el(los) compuesto(s) de ensayo puede(n) ser añadido(s) después tanto uno por uno (en un orden u otro) o simultáneamente a los pocillos. Después de la incubación, los pocillos pueden ser lavados y sometidos a recuento usando un contador de centelleo en función de la radiactividad para determinar el grado de unión de ODAR por la proteína de unión a OPG en presencia del compuesto de ensayo. Típicamente el compuesto será analizado en un intervalo de concentraciones, y puede ser usada una serie de pocillos de control que carezcan de uno o varios elementos de los ensayos de prueba por su exactitud en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método implica invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, la acción de inmovilizar la proteína de unión a OPG a los pocillos de la placa de microtítulo, incubar con el compuesto de ensayo y ODAR radiomarcado, y determinar el grado de unión de ODAR (véase, por ejemplo, el capítulo 18 de "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, Nueva York [1995]).
Como una alternativa al radiomarcaje, la proteína de unión a OPG u ODAR puede se conjugada a biotina y entonces la presencia de la proteína biotinilada puede ser detectada usando estreptavidina unida a una enzima, tal como la peroxidasa de rábano picante [HRP] o la fosfatasa alcalina [AP], que pueden ser detectadas colorimétricamente, o por marcación fluorescente con estreptavidina. También puede ser usado un anticuerpo dirigido a la proteína de unión a OPG u ODAR que esté conjugado a biotina y puede ser detectado después de la incubación con estreptavidina unida con la enzima unida a AP o HRP.
La proteína de unión a OPG y ODAR también pueden ser inmovilizados por la adhesión a perlas de agarosa, perlas acrílicas u otros tipos de tales sustratos inertes. El complejo de sustrato-proteína puede ser colocado en una solución que contenga la proteína complementaria y el compuesto de ensayo; después de la incubación, las perlas pueden ser precipitadas por centrifugación, y la cantidad de unión entre la proteína de unión a OPG y ODAR puede ser evaluada usando los métodos descritos anteriormente. De forma alternativa, el complejo sustrato-proteína puede ser inmovilizado en una columna y puede pasarse en la columna la molécula de ensayo y la proteína complementaria. La formación de un complejo entre la proteína de unión a OPG y ODAR puede ser evaluada entonces usando cualquiera de las técnicas expuestas anteriormente, es decir, radiomarcaje, unión de anticuerpo, o similares.
Otro tipo de ensayo in vitro que es útil para identificar un compuesto que aumente o disminuya la formación de un complejo de ODAR/proteína de unión a OPG es un sistema detector de resonancia superficial de plasmón tal como
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el sistema de ensayo de Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema Biacore puede llevarse a cabo usando el protocolo del fabricante. Este ensayo implica esencialmente la unión covalente de la proteína de unión a OPG o de ODAR a un chip sensor revestido con dextrano que está localizado en un detector. El compuesto de ensayo y la otra proteína complementaria entonces pueden ser inyectados en la cámara que contiene el chip sensor simultáneamente o secuencialmente y la cantidad de proteína complementaria que se une puede ser evaluada basado en el cambio de la masa molecular que está físicamente asociada con el lado revestido por el dextrano del chip sensor; el cambio de la masa molecular puede ser medido por el sistema detector.
En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de ensayo juntos para usar en aumentar o disminuir la formación del complejo de proteína de unión ODAR/OPG. En estos casos, los ensayos expuestos anteriormente pueden ser modificados fácilmente añadiendo tal(es) compuesto(s) de ensayo adicional(es) simultáneamente, o posteriormente al primer compuesto de ensayo. El resto de las etapas en el ensayo son como se exponen anteriormente.
Ensayos in vitro como los descritos anteriormente pueden ser usados ventajosamente para rastrear rápidamente grandes números de compuestos para efectos en la formación del complejo por la proteína de unión a OPG y ODAR. Los ensayos pueden ser automatizados para seleccionar los compuestos generados en la demostración de bacteriófagos, péptido sintético y genotecas de síntesis químicas.
Los compuestos que aumentan o disminuyen la formación del complejo de la proteína de unión a OPG y ODAR también pueden ser seleccionados en un cultivo celular usando células que llevan ODAR y líneas celulares. Las células y líneas celulares pueden ser obtenidas a partir de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de fuentes humanas u otros primates, caninos, o roedores. Las células que contienen ODAR tales como los osteoclastos pueden ser enriquecidas a partir de otros tipos de células por cromatografía de afinidad usando procedimientos públicamente disponibles. La adhesión de la proteína de unión a OPG a células que llevan ODAR se evalua en presencia o ausencia de compuestos de ensayo y el grado de unión puede ser determinado, por ejemplo, por citometría de flujo utilizando un anticuerpo biotinilado a la proteína de unión a OPG. De forma alternativa, un cultivo de osteoclastos de ratón o humano puede ser establecido como se describe en el Ejemplo 8 y los compuestos de ensayo pueden ser evaluados por su capacidad de bloquear la maduración de osteoclastos estimulada por la adición de la proteína de unión a OPG y CSF-1. Pueden ser usados ensayos del cultivo celular ventajosamente para evaluar además los compuestos que cuentan en positivo en los ensayos de unión de proteína descritos anteriormente.
Los compuestos que aumentan o disminuyen la interacción de la proteína de unión a OPG con ODAR también pueden ser evaluados respecto a la actividad in vivo por la administración de los compuestos a ratones seguido de las medidas de la densidad ósea usando densitometría de exploración ósea o radiografías. Los procedimientos para medir la densidad ósea se describen en la publicación PCT WO97/23614 y en el Ejemplo 13.
La invención proporciona compuestos que disminuyen o bloquean la interacción de la proteína de unión a OPG y ODAR y que son antagonistas de la formación de osteoclastos. Tales compuestos generalmente se dividen en dos grupos. Un grupo incluye los compuestos que son derivados de la proteína de unión a OPG o que interactuan con la proteína de unión a OPG. Éstos se han descrito anteriormente. Un segundo grupo incluye los compuestos que son derivados de ODAR o que interactuan con ODAR. Los ejemplos de los compuestos que son anatagonistas de ODAR incluyen ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos o compuestos orgánicos de pequeño peso molecular.
Los antagonistas de ODAR pueden ser compuestos que se unen en o cerca de uno o varios sitios de unión para OPG bp en el dominio extracelular de ODAR y que disminuyen o bloquean completamente la formación del complejo. Aquellas regiones sobre el ODAR que están implicadas en la formación del complejo con la proteína de unión a OPG pueden ser identificadas por analogía con la estructura del complejo homólogo TNFβ/TNF-R55 que se ha descrito en Banner et al. (Cell 73, 431-445 (1993)). Por ejemplo, la estructura del complejo TNFβ/TNF-R55 puede ser usada para identificar las regiones de la proteína de unión a OPG y ODAR que están implicadas en la formación del complejo. Pueden ser diseñados compuestos entonces que se unan preferencialmente a las regiones implicadas en la formación del complejo y que actuen como antagonistas. En un enfoque expuesto en adelante en el Ejemplo 11, fueron diseñados antígenos de péptido para uso en la generación de anticuerpos frente a la proteína de unión a OPG que actúan como antagonistas. Se espera que estos anticuerpos se unan a la proteína de unión a OPG y bloqueen la formación del complejo con ODAR. En un enfoque similar, pueden ser usados antígenos de péptido basados en la estructura de ODAR para generar anticuerpos anti-ODAR que actuen como antagonistas.
También pueden unirse antagonistas de ODAR a ODAR en posiciones distintas del(de los) sitio(s) de unión para OPG bp e inducir cambios conformacionales del polipéptido de ODAR que causen una formación del complejo disminuida o no productiva con proteínas de unión de OPG.
En una realización, un antagonista es una forma soluble de ODAR que carece de un dominio de transmembrana funcional. Las formas solubles de ODAR pueden tener una deleción de uno o varios aminoácidos en el dominio de transmembrana (aminoácidos 214-234 como se muestra en las Figuras 10A-F). Los polipéptidos de ODAR solubles pueden tener parte o todo el dominio extracelular y son capaces de unirse a la proteína de unión a OPG. Opcionalmente, el ODAR soluble puede ser parte de una proteína quimérica, en la que parte o todo el dominio extracelular de
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La secuencia de la proteína de unión a OPG predicha fue comparada entonces con la base de datos existente de secuencias de proteínas conocidas usando una versión modificada del programa FASTA (Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63-98 (1990)). La secuencia de aminoácidos también fue analizada respecto a la presencia de motivos específicos conservados en todos los miembros conocidos de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) usando el método del perfil de secuencia de (Gribskov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), según se modifica por Lüethy et al. Protein Sci. 3, 139-146 (1994)). Parecía que había una homología significativa en todas partes de la proteína de unión a OPG con varios miembros de la superfamilia de TNF. La proteína de unión a OPG de ratón parece ser la más estrechamente emparentada con los homólogos de ratón y humano tanto del ligando de TRAIL como de CD40. Otros análisis de la secuencia de la proteína de unión a OPG indicaron una fuerte coincidencia con la superfamilia de TNF, con un valor Z altamente significativa de 19,46.
La secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a OPG contiene un dominio transmembrana hidrófobo probable que comienza en un M49 y se extiende a L69. Basado en esta configuración relativa al codon de inicio de metionina, la proteína de unión a OPG se predice que es de una proteína transmembrana tipo II, con un dominio intracelular del extremo N-terminal corto, y un dominio extracelular del extremo C-terminal más largo (Figuras 4A-F). Esto sería similar a todos los miembros de la familia de TNF conocidos, a excepción de la linfotoxina alfa (Nagata y Golstein, Science 267, 1449-1456 (1995)).
Ejemplo 4
Expresión del mARN de la proteína de unión a OPG humana
Fueron sondadas transferencias de Northern de tejido humano múltiple (Clontech, Palo Alto, CA) con un fragmento de restricción de 32D-F3 marcado con 32P-dCTP para detectar el tamaño de la transcripción humana y determinar los modelos de expresión. Los transferencias de Northern fueron prehibridadas en 5X SSPE, 50% de formamida, solución de Denhardt 5X, 0,5% de SDS, y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado durante 2-4 h a 42ºC. Las transferencias entonces fueron hibridadas en 5X SSPE, 50% de formamida, solución de Denhardt 2X, 0,1% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y 5 ng/ml de sonda marcada durante 1824 h a 42ºC. Las transferencias entonces fueron lavadas en 2X SSC durante 10 minutos a TA, 1X SSC durante 10 minutos a 50ºC, luego en 0,5X SSC durante 10-15 minutos.
Usando una sonda derivada del cADN de ratón y la hibridación bajo condiciones rigurosas, fue detectada una especie de mARN predominante con una masa molecular relativa de aproximadamente 2,5 kb en nodos de linfa (Figura 3). Una señal débil también fue detectada en la misma masa molecular relativa en mARN de hígado fetal. No fueron detectadas transcripciones de la proteína de unión a OPG en los otros tejidos examinados. Los datos sugieren que la expresión de mARN de proteína de unión a OPG fue restringida extremadamente en tejidos humanos. Los datos también indican que el clón de cADN aislado está muy cerca del tamaño de la transcripción natal, sugiriendo que 32D-F3 es un clon de longitud completa.
Ejemplo 5
Clonación molecular de la proteína de unión a OPG humana
El homólogo humano de la proteína de unión a OPG se expresa como un mARN de aproximadamente 2,5 kb en nodos de linfa periféricos humanos y se detecta por la hibridación con una sonda de cADN de ratón en condiciones de hibridación rigurosas. El ADN que codifica la proteína de unión a OPG humana es obtenido seleccionando una genoteca de cADN de nodo de linfa humano mediante placa de bacteriófago recombinante, o colonia bacteriana transformada, métodos de hibridación (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1989)). A esto se rastrea la genoteca de cADN del bacteriófago o del plásmido usando sondas radiactivamente marcadas derivadas del clon de la proteína de unión a OPG 32D-F3 murina. Las sondas son usadas para rastrear el filtro de nitrocelulosa generado a partir de una genoteca en placa. Estos filtros son prehibridados y luego hibridados usando las condiciones especificadas en el Ejemplo 4, dando lugar en última instancia a los clones purificados del cADN de la proteína de unión a OPG humana. Los insertos obtenidos a partir de cualquier clón de la proteína de unión a OPG humana serían secuenciados y analizados como se describe en el Ejemplo 3.
Un ARN de Poli A+ de nodo de linfa humano (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) fue analizado respecto a la presencia de transcripciones de OPG-bp como anteriormente en el documento de EE.UU. Nº 08/577.788, presentado el 22 de Diciembre de 1995. Una transferencia Northern de esta muestra de ARN sondada en condiciones rigurosas con una sonda de OPG-bp de ratón 32P-marcada indicó la presencia de transcripciones de OPG-bp humano. Una genoteca de cADN dT-cebada de oligo entonces fue sintetizada a partir del mARN de nodo de linfa usando el kit de SuperScript (GIBCO Life Technologies, Gaithersberg, MD) como se describe en el Ejemplo 2. El cADN resultante fue seleccionado por tamaños, y la fracción molecular alta ligada al vector del plásmido pcADN 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). Fueron transformadas DH10 de E. coli electrocompetentes (GIBCO Life Technologies, Gaithersberg, MD), y fueron seleccionados 1 x 106 transformantes resistentes a ampicilina por la hibridación de colonias usando una sonda de la proteína de unión a OPG de ratón 32P-marcada.
Un clón de plásmido de cADN de la supuesta proteína de unión a OPG humana fue aislado, phuOPGbp-1.1, y contenía un inserto de 2,3 kb. La secuencia del nucleótido resultante del inserto de phuOPGbp-1.1 fue aproximadamen
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te 80-85% homólogo con la secuencia de cADN de la proteína de unión a OPG de ratón. La traducción de la secuencia de ADN de inserto indicó la presencia de un marco de lectura abierto largo predicho para codificar un polipéptido de 317 aa (Figuras 4A-F). La comparación de los polipéptidos de OPG-bp de ratón y humano muestra que son ~87% idéntico, indicando que esta proteína está altamente conservada durante la evolución.
El ADN de la proteína de unión a OPG humano y las secuencias de proteína no estaban presentes en la el Genbank, y no había ninguna secuencia de EST homóloga. Como con el homólogo murino, la proteína de unión a OPG humana muestra una fuerte semejanza de secuencia para todos los miembros de la superfamilia de TNFα de citoquinas.
Ejemplo 6
Clonación y expresión bacteriana de la proteína de unión a OPG
La amplificación por PCR empleando los pares de cebador y plantillas descritas más abajo son usadas para generar varias formas de proteínas de unión de OPG murinas. Un cebador de cada par introduce un codon de terminación TAA y un sitio único XhoI o SacII después del término carboxi del gen. El otro cebador de cada par introduce un sitio único NdeI, una metionina del extremo N-terminal, y codones optimizados para la parte del extremo amino terminal del gen. La PCR y el termociclado se realizan usando la metodología del ADN estándar recombinante. Los productos de la PCR se purifican, se digieren por restricción, y se insertan en los sitios únicos NdeI y XhoI o SacII del vector pAMG21 (Nº del catálogo ATCC 98113) y se transforman en 393 o 2596 de E. Coli prototrófico. Otros vectores de expresión de E. coli y células huésped comúnmente usadas son también adecuados para la expresión. Después de la transformación, los clones son seleccionados, el ADN del plásmido es aislado y se confirma la secuencia del inserto de la proteína de unión a OPG.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [75-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 242 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met (75)-Asp-Pro-Asn-Arg-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1581-72 y Nº 1581-76 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [95-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 223 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-His (95)-Glu-Asn-Ala-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1591-90 y Nº 1591-95 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [107-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 211 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Ser (107)-Glu-Asp-Thr-Leu-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1591-93 y Nº 1591-95 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [118-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 199 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met (118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1591-94 y Nº 1591-95 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [128-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 190 aminoácidos de longitud y tener los siguientes res
10 tos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Lys (128)-Glu-Leu-Gln-His-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1591-91 y Nº 1591-95 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
15 Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [137-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 181 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Gln (137)-Arg-Phe-Ser-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1591-92 y Nº 1591-95 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [146-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 171 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met (146)-Glu-Gly-Ser-Trp-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR es la proteína de unión a OPG pAMG21-murina [75-316] descrita anteriormente y los oligonu
25 cleotidos Nº 1600-98 y Nº 1581-76 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [156-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 162 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Arg (156)-Gly-Lys-Pro-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR es la proteína de unión a OPG pAMG21-murina [158-316] más abajo y los oligonucleotidos Nº 1619-86 y Nº 1581-76 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [158-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 160 aminoácidos de longitud y tener los siguientes res
10 tos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Lys (158)-Pro-Glu-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR fue pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1581-73 y Nº 1581-76 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [166-316]
15 Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 152 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-His (166)-Leu-Thr-Ile-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR es pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1581-75 y Nº 1581-76 fueron el par de cebador usado para la PCR y la clonación de esta construcción génica.
20 Proteína de unión a OPG pAMG21-murina [168-316]
Esta construcción fue modificada genéticamente para tener 150 aminoácidos de longitud y tener los siguientes restos del extremo N-terminal y C-terminal, NH2-Met-Thr (168)-Ile-Asn-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. La plantilla usada para la PCR es pcADN/32D-F3 y los oligonucleotidos Nº 1581-74 y Nº 1581-76 serán el par de cebador que se use para la PCR y la clonación.
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Se entiende que las construcciones anteriores son ejemplos y que un experto en la técnica puede obtener fácilmente otras formas de la proteína de unión a OPG usando la metodología general presentada en este documento.
Las construcciones bacterianas recombinantes pAMG21-proteína de unión a OPG murina [75-316], [95-316], [107316], [118-316], [128-316], [137-316], y [158-316] han sido clonadas, la secuencia de ADN confirmada, y se han examinado los niveles de expresión del producto génico recombinante después de la inducción. Todas las construcciones produjeron niveles del producto génico recombinante que fueron fácilmente visibles siguiendo la electroforesis de gel de poliacrilamida SDS y tinción de coomassie de lisados a granel. El crecimiento de 393 o 2596 de E. coli transformado, la inducción de la expresión de la proteína de unión a OPG y el aislamiento de cuerpos de inclusión que contenían la proteína de unión a OPG se hace de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento PCT WO97/23614. La purificación de las proteínas de unión de OPG de cuerpos de inclusión requiere la solubilización y la renaturalización de la proteína de unión a OPG usando procedimientos disponibles para un experto en la técnica. La proteína de unión a OPG recombinante murina [158-316] fue encontrada que era producida sobre todo insolublemente, pero fue encontrada aproximadamente el 40% en la fracción soluble. La proteína recombinante fue purificada a partir de la fracción soluble como se describe más abajo y fue examinada su bioactividad.
Ejemplo 7
Purificación de la proteína de unión a OPG recombinante murina [158-316]
Fueron descongeladas células bacterianas congeladas que contenían la proteína de unión a OPG murina (158-316) expresada y fueron resuspendidas en tris-HCl 20 mM, pH 7,0, EDTA 10 mM. La suspensión celular (20% p/v) entonces fue homogeneizada por tres pasos a través de un microfluidizador. La suspensión celular lisada fue centrifugada en un rotor JA14 a 10.000 revoluciones por minuto durante 45 minutos. El análisis de SDS-PAGE mostró una banda de aproximadamente 18 kd de peso molecular presente tanto en cuerpos de inclusión como en el sobrenadante. La fracción soluble fue aplicada después a una columna Sepharose 4FF SP de Pharmacia equilibrada con MES 10 mM pH 6,0. La proteína de unión a OPG fue eluida con un gradiente de volumen de columna 20 de NaCl 0-0,4M en MES pH 6,0. Las fracciones que contenían la proteína de unión a OPG entonces fueron aplicadas a una columna Bakerbond de ABX equilibrada con MES 20 mM, pH 6,0. La proteína de unión a OPG fue eluida con un gradiente 15CV de NaCl 0-0,5M en MES, pH 6,0. El producto final era más del 95% homogéneo en SDS-PAGE. La secuenciación del extremo N-terminal dio la secuencia siguiente: Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His que fue identificada con la predicha para un polipéptido que comienza en el resto 158 (con una metionina iniciador). El peso molecular relativo de la proteína durante la SDS-PAGE no cambia en la reducción.
Ejemplo 8
Bioactividad de la proteína de unión a OPG recombinante soluble in vitro
La proteína de OPG recombinante se ha mostrado previamente que bloquea la formación de osteoclastos dependiente de la vitamina D3 a partir de precursores de la médula ósea y del bazo en un ensayo formador de osteoclastos como se describe en el documento de EE.UU. Nº 08/577.788. Ya que la proteína de unión a OPG se une a OPG, y es un nuevo miembro de la familia de TNF de ligandos, es un objetivo potencial de la bioactividad de OPG. La proteína de unión a OPG soluble recombinante (158-316), que representa el mínimo dominio tipo TNFα principal, fue analizada por su capacidad de modular la diferenciación de osteoclastos a partir de precursores de osteoclastos. Las células de la médula ósea fueron aisladas a partir de fémures de ratón adulto, y fueron tratadas con M-CSF. La fracción no adherente fue co-cultivada con células ST2 en presencia y ausencia tanto de vitamina D3 como de dexametasona. Como se muestra antes, los osteoclastos se desarrollan sólo a partir de co-cultivos que contenían células estromales (ST2), vitamina D3 y dexametasona. La proteína de unión a OPG recombinante soluble fue añadida en concentraciones variables en el intervalo de 0,16 a 500 ng/ml y la maduración de osteoclastos fue determinada por un ensayo de solución de TRAP y por observación visual. La proteína de unión a OPG estimuló fuertemente la diferenciación de osteoclastos y la maduración de una manera dependiente de la dosis, con efectos semi-máximos en el intervalo de 1-2 ng/ml, sugiriendo que esto actua como un inductor potente de la osteoclastogenesis in vitro (Figura 5). El efecto de la proteína de unión a OPG es bloqueado por el OPG recombinante (Figura 6).
Para analizar si la proteína de unión a OPG podía sustituir el estroma y los esteroides añadidos, fueron hechos cultivos usando M-CSF a concentraciones variables para promover el crecimiento de precursores de osteoclastos y fueron añadidas varias cantidades de la proteína de unión a OPG también. Como se muestra en la Figura 6, la dosis de la proteína de unión a OPG estimuló dependientemente la actividad de TRAP, y la magnitud de la estimulación fue dependiente del nivel de M-CSF añadido sugiriendo que estos dos factores juntos son críticos para el desarrollo
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de osteoclastos. Para confirmar la importancia biológica de esta última observación, fueron hechos cultivos en cortes óseos corticales bovinos y fueron analizados los efectos de M-CSF y la proteína de unión a OPG solos o juntos. Como se muestra en las Figuras 7A-C, la proteína de unión a OPG en presencia de M-CSF estimulaba la formación de grandes osteoclastos positivos TRAP que erosionaban la superficie ósea causando hoyos. Así, la proteína de unión a OPG actua como un factor estimulante de la osteoclastogenesis (diferenciación). Esto sugiere que el OPG bloquee el desarrollo de osteoclastos secuestrando la proteína de unión a OPG.
Ejemplo 9
Actividad in vivo de la proteína de unión a OPG soluble recombinante
Basado en estudios in vitro, la proteína de unión a OPG recombinante murina [158-316] producida en E.coli es un potente inductor del desarrollo de osteoclastos a partir de precursores mieloides. Para determinar sus efectos in vivo, ratones macho BDF1 de 4-5 semanas (Laboratorios Charles River) recibieron inyecciones subcutáneas de la proteína de unión a OPG [158-316] dos veces al día durante tres días y en la mañana del cuarto día (días 0, 1, 2, y 3). Cinco grupos de ratones (n = 4) recibieron solo vehículo, o 1, 5, 25 ó 100 μg/día de la proteína de unión a OPG [158316]. 5 grupos adicionales de ratones (n = 4) recibieron las dosis anteriores de vehículo o de la proteína de unión a OPG [158-316] y además recibieron 1 mg/Kg/día (aproximadamente 20 μg/día) de Fc-OPG [22-194] humano mediante una sola inyección subcutánea diaria. Fue determinado el calcio ionizado de sangre entera antes del tratamiento el día 0 y 3-4 horas después de la primera inyección diaria de la proteína de unión a OPG [158-316] los días 1, 2, y 3. Cuatro horas después de la última inyección el día 3 los ratones fueron sacrificados y fueron tomadas radiografías.
El recombinante de la proteína de unión a OPG [158-316] produjo un aumento significativo del calcio ionizado en sangre después de dos días de tratamiento con una dosis de 5 μg/día y más alta (Figura 8). La severidad de la hipercalcemia indica una potente inducción de la actividad de osteoclastos lo que causa un aumento de la resorción ósea. La administración de OPG simultánea limitó la hipercalcemia a una dosis de la proteína de unión a OPG [158316] de 5 y 25 μg/día, pero no a 100 μg/día. Estos mismos animales fueron analizados por radiografía para determinar si había algún efecto sobre la densidad del mineral óseo visible por rayos X (Figuras 9A-D). El recombinante de la proteína de unión a OPG [158-316] inyectado durante 3 días disminuyó la densidad ósea en la tibia proximal de ratones en una manera dependiente de la dosis. La reducción de la densidad ósea fue particularmente evidente en ratones que recibieron 100 μg/d confirmando que la hipercalcemia profunda en estos animales fue producida a partir de una mayor resorción ósea y dando lugar a una liberación del calcio del esqueleto. Estos datos indican claramente que la proteína de unión a OPG [158-316] actúa in vivo para promover la resorción ósea, conduciendo a una hipercalcemia sistémica, y que el OPG recombinante anula estos efectos.
Ejemplo 10
Clonación y expresión de la proteína de unión a OPG soluble en células de mamífero
El clon de longitud completa de la proteína de unión a OPG murina y humana puede ser expresado en células de mamífero como se describe antes en el Ejemplo 2. De forma alternativa, los clones de cADN pueden ser modificados para codificar las formas secretadas de la proteína cuando se expresan en células de mamífero. Para hacer esto, el extremo 5' natural del cADN que codifica el codon de iniciación, y que se extiende aproximadamente por los 69 primeros aminoácidos de la proteína, incluyendo la región que atraviesa la transmembrana, podría ser sustituido por una secuencia líder del péptido señal. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican el codon de iniciación y el péptido señal de un gen conocido pueden ser empalmadas a la secuencia de cADN de la proteína de unión a OPG comenzando en cualquier parte después de la región que codifica el resto del aminoácido 68. Se predice que los clones recombinantes resultantes producen formas secretadas de la proteína de unión OPB en células de mamífero, y que deberían sufrir modificaciones post-translacionales que normalmente ocurren en el dominio extracelular del extremo C-terminal de la proteína de unión a OPG, tal como la glicosilación. Usando esta estrategia, fue construida una forma secretada de la proteína de unión a OPG que tenía en su extremo 5’ el péptido señal de OPG murino, y en su extremo 3' el dominio de IgG1 Fc humano. El vector del plásmido pCEP4/muOPG [22-401]-Fc como se describe en el documento de EE.UU. Nº 08/577.788, presentado el 22 de Diciembre de 1995, fue digerido con NotI para dividir entre el extremo 3’ de OPG y el gen de Fc. El ADN linealizado entonces fue digerido parcialmente con XmnI para dividirse sólo entre los restos 23 y 24 de OPG dejando el extremo ciego. Las digestiones de restricción fueron entonces desfosforiladas con CIP y la parte de vector de esta digestión (incluyendo los restos 1-23 de OPG y Fc) fue purificada por gel.
La región de cADN de la proteína de unión a OPG murina que codifica los restos de los aminoácido 69-316 fue amplificada por PCR usando la Polimerasa Pfu (Stratagene, San Diego, CA) a partir de la plantilla del plásmido usando los cebadores de los oligonucleotidos siguientes:
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Ejemplo 12
Clonación de un receptor de la proteína de unión a OPG expresada en células precursoras hematopoyéticas
La proteína de unión a OPG recombinante murina biológicamente activa [158-316] fue conjugada con fluoresceinaisotiocianato (FITC) para generar una sonda fluorescente. El marcaje fluorescente fue realizado por la incubación de la proteína de unión a OPG recombinante murina [158-316] con succinimidil-éster del ácido 6-fluorescein-5-(y 6) carboxiamido-hexanoico (Molecular Probes, Eugene, O) en una relación molar 1:6 durante 12 horas a 4ºC. La proteína de unión a OPG FITC-marcada [158-316] además fue purificada por cromatografía de filtración de gel. Fueron aisladas e incubadas células de médula ósea de ratón en un cultivo en presencia de CSF-1 y la proteína de unión a OPG [158-316] como se describe en el Ejemplo 10. Fueron cultivadas células de médula ósea de ratón de la noche a la mañana en CSF-1 (30 ng/ml) y la proteína de unión a OPG [158-316] (20 ng/ml). Fueron eliminadas primero células no adherentes y almacenadas en hielo y fueron eliminadas las células adherentes restantes incubando con tampón de disociación celular (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), fueron reunidas con la población no adherente, y luego fueron teñidas con la proteína de unión FITC-OPG como se describe anteriormente. Después del lavado y la resuspensión en PBS con 0,5% de BSA, las células fueron expuestas a la proteína de unión FITC-OPG, fueron lavadas, y después fueron clasificados por FACS. La población de células que fueron positivas por teñirse con la proteína de unión FITC-OPG fue recogida y el mARN fue aislado como se describe en el Ejemplo 2. Esta preparación de mARN fue usada para hacer una genoteca de cADN siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 2.
La genoteca de cADN producida a partir de esta fuente fue usada para el análisis de secuencia de EST aleatorio como se ha descrito anteriormente en la publicación PCT Nº WO97/23614 y en Simonet et al. (Cell 89, 309-319 (1997)). Usando este método, fue detectado un cADN de ~2,1 kb que codificaba una nueva proteína TNFRrelacionada. El largo marco de lectura abierto del cADN de ODAR murino codifica una proteína de 625 restos de aminoácidos y contiene las propiedades contradictorias de proteínas TNFR-relacionadas: un péptido en señal hidrófobo en sus extremos N, cuatro secuencias de repetición ricas cisteína tándem, un dominio transmembrana hidrófobo, y un dominio de señalización citoplásmico. La homología de esta proteína con otros miembros de la familia del receptor de TNF y su expresión en las células de médula ósea que se unen a la proteína de unión a OPG FITCmarcada sugiere que es un receptor potencial para la proteína de unión a OPG TNF-relacionada. Esta proteína se denomina ODAR, o receptor de diferenciación y activación de osteoclastos. Se muestra la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos predicha de ODAR murino en las Figuras 10A-F.
El análisis reciente de secuencias en bases de datos públicamente disponibles indica que esta proteína es el homólogo murino de una proteína TNFR-relacionada humana conocida como RANK (Anderson et al., Nature 390, 175179 (1997)).
Ejemplo 13
Producción de la proteína de ODAR recombinante en células de mamífero
Un dominio extracelular de ODAR soluble fusionado a la región Fc de IgG1 humano fue producido usando procedimientos para la construcción y la expresión de proteínas de fusión Fc como se ha descrito previamente en el documento WO97/23614 y en Simonet et al., supra. Para generar la proteína de ODAR soluble en células de mamífero, el cADN que codifica el dominio extracelular de ODAR murino (aminoácidos 27-211) fue amplificado por PCR con el grupo siguiente de cebadores de oligonucleotido:
Las reacciones PCR fueron llevadas a un volumen de 50 μl con 1 unidad de polimerasa de ADN Vent (Nueva Inglaterra, Biolabs) en Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, 0,1% de Triton-X100, 10 μM de cada dNTP, 1 μM de cada cebador y 10 ng de plantilla de cADN de ODAR. Las reacciones fueron realizadas a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, y 72ºC durante 1 minuto, para un total de 16 ciclos. El fragmento de la PCR fue aislado por electroforesis. El fragmento de la PCR crea un sitio de restricción Hind III en el extremo 5' y un sitio de restricción Not I en el extremo 3’. El fragmento digerido de la PCR Hind III-Not I entonces fue subclonado en marco en un vector pCEP4-Fc modificado delante de la secuencia de cadena pesada de IgG-γ1 humana como se ha descrito anteriormente en el documento WO97/23614 y en Simonet. supra). Un enlazador fue introducido que codifica dos aminoácidos no pertinentes que atraviesan la unión entre el dominio extracelular ODAR y la región IgG Fc.
La construcción entonces fue digerida con Nhe I y Hind III y el par de oligonucleotido hibridado siguiente que codifica el péptido señal de OPG (aminoácidos 1-21) fue insertado en marco:
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Un enlazador que codificaba dos aminoácidos no pertinentes fue introducido entre el péptido señal de OPG y las secuencias de ODAR. La construcción final modificada genéticamente (ODAR-Fc/pCEP4) codifica una proteína de fusión que contiene del extremo amino al término carboxi: péptido señal de OPG (aminoácidos 1-21)-enlazador (LysLeu)-ODAR (aminoácidos 27-211)-enlazador (AlaAla)-IgG Fc humano.
La construcción fue transfectada en células 293-EBNA-1 por el método del fosfato de calcio como se describe (Ausubel et al., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3, (1994). Las células transfectadas entonces fueron seleccionadas en 200 μg/ml de higromicina (GibcoBRL) y los cultivos de masa resistentes al fármaco resultantes fueron reunidos y cultivados hasta confluencia. Las células fueron lavadas en PBS una vez y luego fueron cultivadas en medio sin suero durante 72 h. El medio acondicionado fue recogido. La proteína de fusión ODAR-Fc en el medio fue detectada por análisis de transferencia Western con anticuerpo de IgG Fc antihumano.
La proteína de fusión Fc fue purificada por cromatografía de columna de proteína-A (Perforan) usando los procedimientos recomendados por el fabricante. Cincuenta pmoles de la proteína purificada entonces fueron sometidos a análisis de la secuencia del extremo N-terminal por degradación Edman automatizada como se describe esencialmente en Matsudaira et al. (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). La secuencia de aminoácidos siguiente fue leída después de 10 ciclos:
La actividad de unión de ODAR-Fc con la proteína de unión a OPG fue examinada por tinción inmunofluorescente de cultivos celulares de COS 7 transfectados como se describe en el Ejemplo 2. Las células COS-7 fueron lipofectadas con 1 μg de un vector de expresión que contenía el ADN que codificaba la proteína de unión a OPG murina. Después de 48 h de incubación, las células entonces fueron incubadas en solución PBS-FBS que contenía 10 mg/μl de IgG Fc humano, ODAR-Fc, o proteína OPG-Fc a 4ºC durante 1 h. Las células entonces fueron lavadas con PBS dos veces y luego fueron incubadas en solución de PBS-FBS que contenía 20 μg/ml de IgG antihumano de cabra FITCmarcado (Southern Biotech Associates) durante otra hora. Después del lavado con PBS, las células fueron examinadas por microscopía confocal (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, Inc., Okemos, MI). Tanto ODAR-Fc como OPG-Fc se unen a células COS-7 OPGL transfectadas (Figuras 11A-C).
Ejemplo 14
Actividad biológica in vitro de ODAR soluble recombinante
La capacidad de ODAR para inhibir la estimulación de la formación de osteoclastos por la proteína de unión a OPG fue evaluada en un cultivo de médula ósea de ratón en presencia de CSF-1 (30 ng/ml) y la proteína de unión a OPG (5 ng/ml). Los procedimientos para el uso de cultivos de médula ósea de ratón para estudiar la maduración de osteoclastos se describen en el documento WO97/23614 y en el Ejemplo 8. La proteína de fusión ODAR-Fc producida como se describe en el Ejemplo 12 fue añadida a concentraciones de 65 a 1500 ng/ml. La formación de osteoclastos fue evaluada por citoquímica de fosfotasa alcalina resistente a tartrato (TRAP) y el ensayo de solución de TRAP después de cinco días en cultivo.
Una inhibición dependiente de la dosis de la formación de osteoclastos por la fusión ODAR-Fc fue observada tanto por citoquímica como por la actividad de TRAP (Figuras 12A-H). La proteína de fusión ODAR-Fc inhibió la formación de osteoclastos con un ED50 de aproximadamente 10-50 ng/ml.
Ejemplo 15
Actividad biológica de ODAR recombinante soluble in vivo
Ratones macho BDF1 jóvenes de crecimiento rápido de 3-4 semanas de edad recibieron dosis variables de la proteína de fusión ODAR-Fc por una sola inyección diaria subcutánea en un vehículo (PBS/BSA del 0,1%) durante cuatro días. Los ratones fueron sometidos a rayos x el día 5. Las dosis de la proteína de fusión ODAR-Fc usadas fueron 0,5, 1,5 y 5 mg/kg/día. Para cada tratamiento, todos los ratones en aquel grupo y en el grupo de control que recibió PBS/BSA 0,1% fueron sometidos a rayos x en una película sola. La región metafisaria tibial proximal fue comparada entre pares de tibias control y tratadas y fue anotado como un "+" si la tibia tratada era más densa según
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