PT726952E

PT726952E - Receptor na superfície de células t activadas: act-4

Info

Publication number: PT726952E
Application number: PT94931650T
Authority: PT
Inventors: Wayne Godfrey; David William Buck; Edgar George Engleman
Original assignee: Becton Dickinson Co; Univ Leland Stanford Junior
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2007-04-30
Also published as: US20040265866A1; AU2009248426A1; AU2005202316A1; JP2007089585A; JP2009240311A; AU8065294A; US7364733B2; AU2005202316B2; US20010044522A1; EP0726952B1; US5821332A; AU781998B2; HK1001464A1; WO1995012673A1; US6277962B1; AU9413898A; JPH09504693A; CA2175577A1; DE69434908D1; DK0726952T3

Description

ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Receptor na superfície de células T activadas: ACT-4"

CAMPO TÉCNICO O presente invento refere-se de um modo geral ao isolamento e caracterização de um receptor de superfície celular, denominado ACT-4, e anticorpos contra este e à utilização do antigénio e anticorpos para monitorizar e/ou modular respostas imunitárias.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As respostas imunitárias são largamente mediadas por um conjunto variado de células sanguíneas periféricas denominadas leucócitos. Os leucócitos incluem linfócitos, granulócitos e monócitos. Os granulócitos subdividem-se adicionalmente em neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Os linfócitos subdividem-se adicionalmente em linfócitos T e B. Os linfócitos T são originários das células estaminais dedicadas aos linfócitos do embrião. A diferenciação ocorre no timo e processa-se através dos estádios intermediários pró-timócito, timócito cortical e timócito medular, para produzir diferentes tipos de células T maduras. Estes subtipos incluem células T CD8+ (também conhecidas como células T citotóxicas/ supressoras), que quando activadas têm a capacidade de lisar células alvo e células T CD4+ (também conhecidas como células T auxiliadoras e células T indutoras), que quando activadas têm a capacidade de estimular outros tipos de células do sistema imunitário.

As respostas do sistema imunitário são desencadeadas em várias situações diferentes. A resposta mais frequente é a de uma protecção pretendida contra microrganismos infecciosos. Contudo, pode ocorrer resposta imunitária indesejável após transplante de um tecido exógeno ou numa doença auto-imune na qual um dos antigénios do próprio corpo é o alvo para a resposta imunitária. As respostas imunitárias podem também ser iniciadas in vitro por mitogénios ou anticorpos contra determinados receptores. Em cada uma destas situações, uma resposta imunitária é transduzida de um evento estimulante 2 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ através de uma interacção complexa de tipos de células leucocíticas. Contudo, os tipos de células participantes e a natureza da interacção entre tipos de células pode variar para eventos estimulantes diferentes. Por exemplo, as respostas imunitárias contra bactérias invasoras são muitas vezes transduzidas por formação de complexos entre um receptor MHC de classe II e um antigénio bacteriano, que seguidamente activa células T CD4+. Contrariamente, as respostas imunitárias contra infecções virais são principalmente transduzidas por formação de complexos de MHC de classe 1/ antigénio virai e subsequente activação de células CD8+.

Em anos recentes, identificaram-se muitos antigénios de superfície celular de leucócitos tendo-se demonstrado que alguns desses desempenham um papel em transdução de sinal. Verificou-se que os sinais podem ser transduzidos entre um receptor de superfície celular e quer um ligando solúvel quer um ligando ligado à superfície celular. As sequências de aminoácidos de moléculas da superfície de leucócitos incluem várias sequências ou motivos recorrentes característicos. Prevê-se que estes motivos estão relacionados em termos evolutivos, têm padrões de enrolamento semelhantes e medeiam tipos de interacções semelhantes. Descreveram-se várias superfamílias incluindo as superfamílias de imunoglobulinas e de receptor de factor de crescimento de nervos. Constituem membros da família de receptor de factor de crescimento de nervos, entre outros, ngfr, presente em células neuronais; o antigénio CD40 de células B; o antigénio OX-40 de rato, presente em células CD4+ activadas (Mallet et al., EMBO J. 9:1063-1068 (1990) (aqui incorporada por referência para todos os objectivos); dois receptores para factor de necrose tumoral (TNF), LTNFR-1 e TNFR-II, presente em vários tipos de células; 4-1BB, presente em células T; SFV-T2, um quadro de leitura aberta do vírus do fibroma de Shope; e possivelmente fas, CD27 e CD30. Consultar, de um modo geral, Mallet e Barclay, Immunology Today 12:220-222 (1990) (aqui incorporada por referência para todos os objectivos).

Godfrey et al., Tissue Antigen, resumo n° AA057, descreve o processo de clonagem molecular de um ADNc que codifica um homólogo humano do antigénio 0X40 de rato. O resumo não proporciona a sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos 3 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ deste homólogo humano. A identificação de receptores de superfície celular sugeriu novos agentes para suprimir respostas imunitárias indesejáveis tais como rejeição de transplante, doença auto-imune e inflamação. Os agentes, nomeadamente anticorpos, que bloqueiam receptores de células imunitárias relativamente a ligação de moléculas solúveis ou receptores ligados à célula, podem prejudicar respostas imunitárias, idealmente, um agente deve bloquear apenas respostas imunitárias indesejáveis (por exemplo, rejeição de transplante) proporcionando simultaneamente uma capacidade residual para efectuar respostas pretendidas (por exemplo, que responde a microrganismos patogénicos). A acção imunossupressora de alguns agentes, por exemplo, anticorpos contra o receptor CD3 e o receptor de IL-2, já foi ensaiada em ensaios clínicos. Apesar de alguns ensaios terem apresentado resultados encorajadores, mantêm-se problemas significativos. Primeiramente, um doente pode desenvolver uma resposta imunitária contra o agente de bloqueio evitando efeitos imunossupressores continuados a não ser que estejam presentes agentes diferentes. Em segundo lugar, as células que expressam o antigénio alvo podem ser capazes de se adaptar à presença do agente de bloqueio por paragem de expressão do antigénio, apesar de reterem funções imunitárias. Nesta situação, é ineficaz tratamento continuado com um agente imunossupressor único. Em terceiro lugar, muitos alvos de agentes terapêuticos localizam-se em mais do que um subtipo de leucócito, o que resulta em que não seja geralmente possivel bloquear ou eliminar selectivamente a resposta apenas de subtipos celulares específicos e deixar assim intacta uma capacidade imunitária residual para combater microrganismos infecciosos.

Com base no descrito supra é aparente a existência de uma necessidade de agentes adicionais e melhorados capazes de suprimir respostas imunitárias, nomeadamente agentes capazes de supressão selectiva. 0 presente invento vem parcialmente ao encontro desta e de outras necessidades, proporcionando um receptor celular localizado em linfócitos T CD4+ humanos activados. 4 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

RESUMO DO INVENTO

Numa concretização do invento, proporcionam-se polipéptidos receptores ACT-4 isolados tal como estabelecido na reivindicação 1. Apresenta-se na figura 5 a sequência de aminoácidos de um de tais polipéptidos, denominado ACT-4-h-l. Os polipéptidos receptores ACT-4 apresentam tipicamente pelo menos 8 0% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos ACT-4-h-l. Os polipéptidos incluem habitualmente pelo menos um e muitas vezes todos os seguintes domínios: uma sequência de sinalização, um domínio intracelular, um domínio transmembranar e um domínio extracelular. Muitos polipéptidos caracterizam-se pela sua presença em células T CD4+ activadas e pela sua substancial ausência em células T em repouso. Alguns polipéptidos completos têm um peso molecular de cerca de 50 kDa antes de desglicosilação e cerca de 27 kDa após aquele processo.

Os domínios extracelulares de polipéptidos receptores ACT-4 incluem tipicamente pelo menos uma ansa ligada por dissulfureto e algumas vezes três de tais ansas. Os domínios extracelulares são habitualmente solúveis e capazes de ligação específica a um ligando ACT-4. Muitas vezes um domínio extracelular encontra-se fundido a um segundo polipéptido tal como uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Alguns domínios extracelulares consistem essencialmente de um epítopo especificamente ligado a um anticorpo designado por L106 .

Noutro aspecto do invento, proporcionam-se anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l. Os anticorpos são habitualmente anticorpos monoclonais. Um exemplo de tal anticorpo designa-se por L106. Alguns anticorpos inibem activação de células T CD4+, enquanto que outros anticorpos estimulam activação destas células. Alguns anticorpos competem com o anticorpo L106 pela ligação específica a um polipéptido receptor ACT-4-h-l e a maioria destes anticorpos também competem com L106 pela ligação específica a células T CD4+ activadas. Outros anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo diferente do epítopo ligado ao anticorpo L106. Também se proporcionam fragmentos do 5 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ anticorpo L106 que se ligam especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l.

Também se proporcionam anticorpos humanizados incluindo uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. A cadeia leve humanizada inclui três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) apresentando sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade correspondentes da cadeia leve de um anticorpo L106 e apresentando uma sequência de esqueleto de região variável substancialmente idêntica à sequência de esqueleto de região variável de uma cadeia leve humana. A cadeia pesada humanizada inclui três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) apresentando sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade correspondentes da cadeia pesada de um anticorpo L106 e apresentando uma sequência de esqueleto de região variável substancialmente idêntica à sequência de esqueleto de região variável de uma cadeia pesada humana. Os anticorpos humanizados ligam-se especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l com uma afinidade de ligação com valor próximo do triplo da afinidade de ligação do anticorpo L106.

Noutro aspecto, o invento proporciona fragmentos de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos receptores ACT-4 discutidos supra. Constitui um exemplo de tal fragmento de ácidos nucleicos, entre outros, a sequência de nucleótidos que codifica o receptor ACT-4-h-l apresentada na figura 5. Os fragmentos de ácidos nucleicos apresentam tipicamente pelo menos oitenta porcento de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos da figura 5.

Linhas celulares isoladas podem conter os fragmentos de ácidos nucleicos discutidos supra. As linhas celulares expressam habitualmente um polipéptido receptor ACT-4 à sua superfície celular. Algumas das linhas celulares são estáveis, tal como quando o fragmento de ácidos nucleicos é incorporado no genoma da linha celular.

Em métodos de rastreio de agentes imunossupressores, põe-se em contacto um polipéptido receptor ACT-4-h-l com um agente imunossupressor potencial. É então detectada ligação 6 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ específica entre ο polipéptido ou fragmento receptor ACT-4-h-l e o agente. A existência de ligação específica é indicativa de actividade imunossupressora.

Em métodos de rastreio para um ligando ACT-4, põe-se em contacto uma amostra biológica contendo o ligando ACT-4 com um polipéptido receptor ACT-4-h-l. Forma-se um complexo entre o ligando e o polipéptido receptor ACT-4-h-l. 0 complexo é então dissociado para se obter o ligando.

Em métodos de suprimir uma resposta imunitária num doente que sofre de uma doença ou condição imunitária, administra-se ao doente uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica inclui um transportador farmaceuticamente activo e um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l.

Também se proporcionam métodos de detecção de células T CD4+ activadas. Põe-se em contacto uma amostra de tecido de um doente com um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l. Detecta-se a ligação específica entre o anticorpo monoclonal e a amostra de tecido. A existência de ligação específica revela a presença de células T CD4+ activadas. A presença de células T CD4+ activadas é muitas vezes o diagnóstico de uma doença ou condição do sistema imunitário.

Também se proporcionam métodos para induzir uma resposta imunitária a um antigénio seleccionado. Administra-se a um doente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l e que estimula a activação de células T CD4+. 0 doente é exposto ao antigénio seleccionado.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS

Figura 1: Coloração a duas cores de linfócitos de sangue periférico para analisar a expressão de ACT-4-h-l em diferentes tipos de células. 7 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Figura 2: Cinética de expressão de ACT-4-h-l em células T CD4+ activadas por aloantigénio. MCF = fluorescência de canal média.

Figura 3: Cinética de expressão de ACT-4-h-l em células T CD4+ activadas por toxóide de tétano.

Figura 4: Cinética de expressão de ACT-4-h-l em células T CD4+ activadas por pha.

Figura 5: Sequência de ADNc (em cima) e sequência de aminoácidos deduzida (em baixo) de ACT-4-h-l. A figura indica as localizações de uma sequência de sinalização do terminal N, dois possíveis locais de sinal de clivagem (setas verticais), dois locais de glicosilação (gly), um domínio transmembranar (TM), um codão de terminação e uma sequência de sinalização poli-A.

Figura 6: Construção do vector de expressão para produção de produtos de transfecção estáveis que expressam ACT-4-h-l.

Figura 7: Análise de FACS™ apresentando expressão de ACT-4-h-l em produtos de transfecção estáveis de linhas celulares COS-7, Jurkat e SP2/0.

Figura 8: Fusão de um domínio extracelular ACT-4-h-l com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina para formar uma globulina recombinante.

Figura 9: Representação topográfica esquemática de globulina recombinante formada a partir de fusão de um domínio extracelular ACT-4-h-l com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina para formar uma globulina recombinante.

DEFINIÇÕES

Abreviaturas para os vinte aminoácidos de ocorrência natural segundo utilização convencional (Immunology - A Synthesis, (E.S. Golub e D.R. Gren, ed., Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 2a ed., 1991) (aqui incorporada por referência para todos os fins). Podem também constituir 8 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ componentes adequadas para polipéptidos do presente invento estereoisómeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a,a-dissubstituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais. Constituem exemplos de aminoácidos não convencionais, entre outros: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, ω-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação de polipéptido aqui utilizada, o sentido para o lado esquerdo corresponde ao sentido do terminal amino e o sentido para o lado direito corresponde ao sentido do terminal carboxilo, de acordo com a convenção e a utilização padrão. De igual modo, excepto indicação em contrário, a extremidade esquerda das sequências polinucleotidicas em cadeia simples é a extremidade 5'; o sentido para a esquerda das sequências polinucleotidicas em cadeia dupla é referido como o sentido 5'. A adição de produtos de transcrição de ARN nascentes no sentido de 5' para 3' é referido como o sentido de transcrição; as regiões de sequência da cadeia de ADN apresentando a mesma sequência que o ARN e que se encontram a 5' da extremidade 5' do produto de transcrição de ARN são referidas como "sequências a montante"; as regiões de sequência da cadeia de ADN apresentando a mesma sequência que o ARN e que se encontram a 3' da extremidade 3' do produto de transcrição de ARN são referidas como "sequências a jusante". A frase "sequência polinucleotidica" refere-se a um polimero em cadeia simples ou em cadeia dupla de bases de desoxirribonucleótidos ou de ribonucleótidos lidas da extremidade 5' para a extremidade 3'. Inclui plasmideos auto-replicativos, polímeros infecciosos de ADN ou ARN e ADN ou ARN não funcionais.

As seguintes expressões utilizam-se para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleótidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como base para uma comparação de

sequência; uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de uma sequência completa de ADNc ou gene apresentada numa listagem de sequências, tal como uma sequência polinucleotidica apresentada na figura 5, ou pode incluir uma sequência completa de ADNc ou gene. De um modo geral, uma sequência de referência tem um comprimento de pelo menos 20 nucleótidos, frequentemente um comprimento de pelo menos 25 nucleótidos e muitas vezes um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos. Dado que dois polinucleótidos podem, cada um deles, (1) incluir uma sequência (ou seja, uma parte da sequência polinucleotidica completa) que é semelhante entre os dois polinucleótidos e (2) pode incluir adicionalmente uma sequência que é divergente entre os dois polinucleótidos, as comparações de sequências entre dois (ou mais) polinucleótidos são tipicamente efectuadas por comparação de sequências dos dois polinucleótidos ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequência. Uma "janela de comparação", tal como aqui utilizada, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 20 posições de nucleótido contíguas em que uma sequência polinucleotidica pode ser comparada com uma sequência de referência com pelo menos 20 nucleótidos contíguos e em que a parte da sequência polinucleotidica na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (ou seja, falhas) de 20 porcento ou menos comparativamente com a sequência de referência (que não inclui adições ou deleções) para alinhamento óptimo das duas sequências. O alinhamento óptimo de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser efectuado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por semelhança de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information) ou GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin)), ou por inspecção e selecção do melhor alinhamento (ou seja, o que resulta na percentagem mais elevada de semelhança de sequência ao longo da janela de comparação) gerado pelos diferentes métodos. A 10 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ expressão "identidade de sequência" significa que duas sequências polinucleotidicas são idênticas (ou seja, numa base nucleótido-a-nucleótido) ao longo da janela de comparação. A expressão "percentagem de identidade de sequência" calcula-se por comparação de duas sequências com alinhamento óptimo ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais ocorrem as bases de ácido nucleico idênticas (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) em ambas as sequências para proporcionar o número de posições equivalentes, dividindo o número de posições equivalentes pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para obter a percentagem de identidade de sequência. A expressão "identidade substancial" tal como aqui utilizada denota uma caracteristica de uma sequência polinucleotidica, em que o polinucleótido inclui uma sequência que tem pelo menos 70, 80 ou 85 porcento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 porcento de identidade de sequência, mais habitualmente pelo menos 99 porcento de identidade de sequência, comparativamente com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleótido, frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 25-50 nucleótidos, em que a percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação da sequência de referência com a sequência polinucleotidica que pode incluir deleções ou adições que totalizam 20 porcento ou menos da sequência de referência ao longo da janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento da sequência ACT-4-h-l completa apresentada na figura 5.

Tal como se aplica a polipéptidos, a expressão "identidade substancial" significa que duas sequências de péptidos, quando optimamente alinhadas tal como pelos programas BLAZE (Intelligenetics), GAP ou BESTFIT utilizando pesos para falhas por defeito, partilham pelo menos 70 porcento ou 80 porcento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 porcento de identidade de sequência, com maior preferência pelo menos 95 porcento de identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99 porcento de identidade de sequência). De preferência, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. 11 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Substituições conservativas de aminoácidos refere-se à capacidade de permuta entre resíduos apresentando cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é serina e treonina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Constituem grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. A expressão "substancialmente puro" significa que uma espécie de objectos é a espécie predominante presente (ou seja, numa base molar, é mais abundante que qualquer outra espécie individual na composição) e de preferência uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie de objecto inclui pelo menos cerca de 50 porcento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. De um modo geral, uma composição substancialmente pura incluirá mais do que cerca de 80 a 90 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Com a maior preferência, a espécie de objecto é purificada essencialmente até à homogeneidade (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular. A expressão "de ocorrência natural" tal como aqui utilizada e tal como aplicada a um objecto refere-se ao facto de um objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptido ou de polinucleótido que está presente num organismo (incluindo virus) que pode ser isolada de um fonte da natureza e que não foi modificada intencionalmente pelo Homem no laboratório, é de ocorrência natural. 12 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ A expressão "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Ocorre ligação específica quando a constante de dissociação para ligação de anticorpo a um antigénio é ^1 μΜ, de preferência ^100 nM e com maior preferência dl nM. Os determinantes epitópicos consistem habitualmente de agrupamentos de moléculas quimicamente activas à superfície tais como cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcar e habitualmente apresentam características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. A expressão "variantes cognatos superiores" tal como aqui utilizada, refere-se a uma sequência génica relacionada de modo evolutivo e funcional entre humanos e espécies de mamíferos superiores, tais como primatas, porcinos e bovinos. A expressão não inclui sequências génicas de roedores, tais como ratos. Assim, o gene de primata cognato do gene ACT-4-h-l é o gene de primata que codifica uma proteína expressa que tem o maior grau de identidade de sequência com a proteína receptora ACT-4-h-l e que apresenta um padrão de expressão semelhante ao da proteína ACT-4-h-l (ou seja, expressa em células CD4+ activadas). A expressão "doente" inclui indivíduos humanos e animais. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Polipéptidos receptores ACT-4

Proporcionam-se receptores à superfície de células T CD4+ activadas (referidas como receptores ACT-4) e seus fragmentos. A expressão "polipéptido receptor ACT-4" é utilizada genericamente para abranger receptores completos e seus fragmentos. A sequência de aminoácidos do primeiro receptor ACT-4 a ser caracterizado [doravante aqui denominado ACT-4-h-l] é apresentada na figura 5. O sufixo -h designa origem humana e o sufixo -1 indica que ACT-4-h-l é o primeiro receptor ACT-4 a ser caracterizado. A expressão receptor ACT-4 refere-se não apenas à proteína com a sequência apresentada na figura 5, mas também a outras proteínas que representam variantes alélicas, não alélicas e cognatas superiores de 13 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ ACT-4-h-l e mutantes naturais ou induzidos de qualquer destes. Habitualmente, os polipéptidos receptores ACT-4 apresentarão igualmente identidade de sequência substancial com a sequência ACT-4-h-l. Tipicamente, um polipéptido receptor ACT-4 conterá pelo menos 4 e mais habitualmente 5, 6, 7, 10 ou 20, 50 ou mais aminoácidos contíguos da sequência ACT-4-h-l. É bem conhecido na arte que se podem formar domínios funcionais, tais como dominios de ligação ou epitopos a partir de apenas quatro residuos de aminoácidos.

Os polipéptidos receptores ACT-4 apresentarão tipicamente identidade substancial de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de ACT-4-h-l e serão codificados por sequências de nucleótidos que apresentam identidade de sequência substancial com a sequência de nucleótidos que codifica ACT-4-h-l apresentada na figura 5. Os nucleótidos que codificam proteínas receptoras ACT-4 hibridarão também tipicamente com a sequência ACT-4-h-l sob condições rigorosas. Contudo, estes nucleótidos não hibridarão habitualmente sob condições rigorosas com os ácidos nucleicos que codificam o receptor OX-40, tal como descrito por Mallet et al., EMBO J. 9:1063-68' (1990) (consultar nomeadamente a figura 2A da referência Mallet et al.). As condições rigorosas dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. De um modo geral, seleccionam-se condições rigorosas para serem cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) da sequência específica a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob condições definidas de força iónica e pH) à qual 50% da sequência alvo híbrida com uma sonda perfeitamente complementar. Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas às quais a concentração de sal é de pelo menos cerca de 0,02 molar a pH 7 e a temperatura é de pelo menos cerca de 60°C. Como outros factores podem também afectar significativamente o rigor da hibridação, incluindo, entre outros, composição de bases e tamanho das cadeias complementares, a presença de solventes orgânicos e a extensão de não emparelhamento de bases, a combinação de parâmetros é mais importante que a medida absoluta de qualquer um deles individualmente.

Usualmente, os polipéptidos receptores ACT-4 apresentarão pelo menos um determinante antigénico em comum com ACT-4-h-l 14 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ mas não serão especificamente reactivos com anticorpos contra o polipéptido OX-40 de rato. A existência de um determinante antigénico comum constitui evidência de reactividade cruzada da proteína variante com qualquer anticorpo preparado contra ACT-4-h-l (consultar secção IV). A reactividade cruzada é muitas vezes ensaiada utilizando soros policlonais contra ACT-4-h-l, mas pode também ser ensaiada utilizando um ou mais anticorpos monoclonais contra ACT-4-h-l, tal como o anticorpo designado L106.

Muitas vezes os polipéptidos receptores ACT-4 conterão esqueletos de polipéptido modificados. As modificações incluem derivatizações químicas de polipéptidos, tal como acetilações, carboxilações e semelhantes. Incluirão igualmente modificações de glicosilação (ligadas em N e ligadas em 0) e variantes de processamento de um polipéptido típico. Estas etapas de processamento incluem especificamente modificações enzimáticas, tais como ubiquitinação e fosforilação. Consultar, por exemplo, Hershko e Ciechanover, Ann. Rev. Bioch. 51:335-364 (1982). A proteína ACT-4-h-l, por exemplo, é altamente modificada de modo que o peso molecular observado é cerca de 50 kDa, enquanto que o peso molecular previsto com base na sequência de aminoácidos é de apenas 27 kDa. Foram identificados dois possíveis locais de glicosilação no seu domínio extracelular.

Provavelmente os receptores ACT-4 partilham algumas ou todas as características topológicas verificadas para ACT-4-h-l. A sequência de aminoácidos de ACT-4-h-l contém uma possível sequência de sinalização de 22 ou 24 aminoácidos no terminal N. A sequência de 24 aminoácidos baseia-se mais provavelmente em critérios de von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986) (incorporada por referência para todos os objectivos). 0 receptor ACT-4-h-l contém uma parte hidrófoba adicional única de 27 aminoácidos que abrange os resíduos 213-240. A parte hidrófoba corresponde provavelmente a um domínio transmembranar e a sua existência é consistente com o facto de ACT-4-h-l ser uma proteína integral de membrana do tipo I (ou seja, apresenta um único domínio transmembranar com o domínio do terminal N incluindo a região extracelular e terminal C incluindo a região intracelular). Os 189 ou 191 aminoácidos (dependendo da localização exacta do local de clivagem de 15 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ sinalização) de ACT-4-h-l com amino proximal ao segmento transmembranar designam-se domínio extracelular, enquanto que os 37 aminoácidos com carboxilo proximal ao segmento transmembranar designam-se como domínio intracelular. A partir do terminal amino, o domínio extracelular apresenta uma possível sequência de sinalização hidrófoba no terminal NH2 e três ansas intracadeia formadas por ligação dissulfureto entre resíduos de cisteína emparelhados. 0 arranjo topológico de polipéptidos receptores ACT-4 é semelhante ao de outros membros da família do receptor de factor de crescimento de nervos, nomeadamente ao receptor OX-40 de rato. Contudo, os outros membros apresentam alguma divergência no número de ansas dissulfureto extracelulares e locais de glicosilação e no tamanho do domínio intracelular. Consultar Mallet e Barclay, supra.

Apesar de nem todos os domínios discutidos supra estarem necessariamente presentes em todos os polipéptidos receptores ACT-4, espera-se que na maioria deles esteja presente um domínio extracelular. De facto, nalguns polipéptidos receptores ACT-4 é possível que esteja presente apenas um domínio extracelular e o estado natural de tais proteínas não seja 0 de proteínas ligadas à superfície celular, mas o de proteínas solúveis, por exemplo, dispersas num fluido corporal extracelular. A existência de formas variantes solúveis tem sido observada para outros receptores de superfície celular, incluindo um membro da família dos receptores de factor de crescimento de nervos, SFV-T2. Consultar Mallet e Barclay, supra.

Além de polipéptidos substancialmente completos, o presente invento proporciona fragmentos biologicamente activos dos polipéptidos. Constituem actividades biológicas significativas, entre outras, ligação de receptor, ligação de anticorpo (por exemplo, o fragmento competir com um receptor ACT-4 intacto relativamente a ligação específica a um anticorpo), imunogenicidade (ou seja, possuir epítopos que estimulam respostas de células B ou T contra o fragmento) e agonismo ou antagonismo de ligação de um polipéptido receptor ACT-4 ao seu ligando. Um segmento de uma proteína receptora ACT-4 ou um seu domínio incluirão habitualmente pelo menos 16 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ cerca de 5, 7, 9, 11, 13, 16, 20, 40 ou 100 aminoácidos contíguos.

Os segmentos de polipéptidos receptores act-4 terminam muitas vezes perto de fronteiras de domínios funcionais ou estruturais. Os domínios funcionais e estruturais identificam-se por comparação de dados de sequências de nucleótidos e/ou aminoácidos tal como é apresentando na figura 5, com bases de dados de sequências públicas ou privadas. De preferência, utilizam-se métodos de comparação computadorizados para identificar motivos de sequência ou domínios previstos de conformação de proteína que ocorrem noutras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. Os domínios estruturais incluem um domínio intracelular, domínio transmembranar e domínio extracelular, que por sua vez contém três ansas com ligações dissulfureto. Os domínios funcionais incluem um domínio de ligação extracelular através do qual o polipéptido receptor ACT-4 interage com moléculas solúveis externas ou outros ligandos ligados à célula e um domínio de transdução de sinal intracelular.

Alguns fragmentos conterão apenas domínios extracelulares, tal como um ou mais ansas com ligações dissulfureto. Tais fragmentos reterão muitas vezes a especificidade de ligação de um polipéptido receptor ACT-4 intacto, mas encontrar-se-ão na forma solúvel em vez de estarem ligados à membrana. Tais fragmentos são úteis como inibidores competitivos de ligação de receptor ACT-4.

Os receptores ACT-4 são adicionalmente identificados pelo seu estatuto de membros da família de receptores de factor de crescimento de nervos. A sequência de aminoácidos de ACT-4-h-l é pelo menos 20% idêntica a NGF-R, TNF-R, CD40, 4-1BB e fas/APOl. ACT-4-h-l apresenta 62% de identidade de sequência de aminoácidos com o gene OX-40 de rato, que é também caracterizado por expressão selectiva em células CD4+ activadas.

Os receptores ACT-4 são também identificados por uma distribuição celular característica. Principalmente, os receptores ACT-4 são habitualmente facilmente detectados em células T CD4+ activadas (a percentagem de células que o 17 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ expressam é habitualmente superior a cerca de 25% ou 50% e muitas vezes cerca de 80%; a fluorescência de canal média é habitualmente superior a cerca de 10 e muitas vezes cerca de 20-25, num citómetro de fluxo Coulter Profile após coloração por imunofluorescência). Os receptores ACT-4 estão habitualmente substancialmente ausentes de células T em repouso, células B (excepto se activadas com PMA), células NK e monócitos (excepto se activados com PMA). Substancialmente ausentes significa que a percentagem de células que expressam ACT-4 é habitualmente menor que cerca de 5% e mais habitualmente menor que cerca de 2% e que o canal médio é habitualmente menor que cerca de 4 e mais habitualmente menor que cerca de 2, medido num citómetro de fluxo Coulter Profile, após coloração das células por imunofluorescência. (Consultar exemplo 2) . Os receptores ACT-4 são habitualmente expressos a niveis reduzidos em células CD8+ activadas (percentagem de células que expressam cerca de 4-10%; fluorescência de canal média cerca de 2-4, num citómetro de fluxo Coulter Profile após coloração por imunofluorescência). O nivel reduzido de expressão observado em células CD8+ sugere que a expressão está confinada a uma subpopulação de células CD8+. A expressão de receptores ACT-4 à superfície de células CD4+ activadas foi observada para vários mecanismos de activação diferentes,

incluindo os estímulos aloantigénico, por toxóide de tétano ou mitogénico (por exemplo, por PHA). A expressão atinge o seu máximo após cerca de 7 dias de estimulação aloantigénica ou por toxóide de tétano e após cerca de três dias de estimulação por PHA. Estes dados indicam que os receptores ACT-4 devem ser classificados como antigénios de activação precoce que se encontram substancialmente ausentes de células em repouso. A observação de que os receptores ACT-4 são de preferência expressos em células CD4+ activadas e que são expressos numa extensão muito menor em células CD8+ activadas, mas estão substancialmente ausentes na maioria ou em todos os subtipos de células linfóides (excepto em resposta a estímulos altamente não fisiológicos tais como PMA) contrasta com a especificidade de tipo de célula de outros antigénios de activação presentes em leucócitos humanos. A expressão de receptores ACT-4 à superfície de células T CD4+ activadas sugere que o receptor tem um papel na activação destas células. Tal papel é consistente com o de alguns outros 18 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ membros da família de receptores de factor de crescimento de nervos. Por exemplo, CD40 estimula a transição de fase Gl-S em linfócitos B e o receptor de factor de crescimento de nervos transduz um sinal da citoquina factor de crescimento de nervos, que resulta em diferenciação e sobrevivência neuronal (Barde, Y-A. Neuron 2: 1525-1534 (1989)) (incorporado por referência para todos os objectivos). Contudo, podem também prever-se outros papéis para receptores ACT-4, por exemplo, interacção com outros tipos de células linfóides. A existência de tais papéis é consistente com as diferentes funções de outros membros da família de receptores de factor de crescimento de nervos, tal como factor de necrose tumoral, cuja interacção com o receptor de factor de necrose tumoral pode resultar em inflamação ou morte de células tumorais.

Podem fundir-se fragmentos ou análogos incluindo substancialmente um ou mais domínios funcionais (por exemplo, um domínio extracelular) de receptores ACT-4 com sequências de polipéptidos heterólogas, de modo que a proteína de fusão resultante apresente a(s) propriedade(s) funcional(ais) conferidas pelo fragmento de receptor ACT-4 e/ou pelo parceiro de fusão. A orientação do fragmento de receptor ACT-4 relativamente ao parceiro de fusão dependerá de considerações experimentais tais como facilidade de construção, estabilidade à proteólise, estabilidade térmica, reactividade imunológica, modificação de resíduos do terminal amino ou carboxilo e outras. Constituem parceiros de fusão potenciais, entre outros, enzimas cromogénicas tais como β-galactosidase, proteína A ou G, uma proteína FLAG tal como descrito por

Blanar e Rutter, Science 256:1014-1018 (1992), toxinas (por exemplo, toxina de difteria, ectotoxina A de Pseudomonas, toxina de ricina ou fosfolipase C) e componentes de imunoglobulina.

Globulinas recombinantes (Rg) formadas por fusão de fragmentos de receptor ACT-4 e componentes de imunoglobulina muitas vezes apresentam a maioria ou todas as propriedades fisiológicas associadas com a região constante da classe específica de imunoglobulina utilizada. Por exemplo, as globulinas recombinantes podem ser capazes de fixar o complemento, mediar toxicidade celular dependente de anticorpo, estimular células B ou atravessar as paredes dos 19 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ vasos sanguíneos e entrar no espaço intersticial. As globulinas recombinantes formam-se habitualmente por fusão do terminal C de um domínio extracelular de receptor ACT-4 com o terminal N do domínio de região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina, estimulando assim a conformação de uma cadeia de imunoglobulina autêntica. A cadeia de imunoglobulina é de preferência de origem humana, nomeadamente se a globulina recombinante é pretendida para utilização terapêutica. As globulinas recombinantes são habitualmente solúveis e apresentam várias propriedades vantajosas relativamente aos receptores ACT-4 não modificados. Estas propriedades incluem semivida prolongada no soro, a capacidade de lisar células alvo para as quais um receptor ACT-4 tem afinidade, através de funções de efector e a capacidade de ligar moléculas tais como proteína A e G que podem ser utilizadas para imobilizar a globulina recombinante em análises de ligação. II. Métodos de produzir polipéptidos A. Tecnologias recombinantes

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de ACT-4-h-l apresentadas na figura 5 e as sequências correspondentes para outros variantes de receptor ACT-4 obtidos tal como descrito na secção III, infra, permitem a produção de polipéptidos de sequências de polipéptidos receptores ACT-4 completas e seus fragmentos. Tais polipéptidos podem ser produzidos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas por expressão de polinucleótidos que codificam receptor ACT-4, ou seus fragmentos e análogos. As sequências de ADN clonadas são expressas em hospedeiros após as sequências terem sido ligadas operacionalmente (ou seja, posicionadas para assegurar o seu funcionamento) a uma sequência de controlo de expressão num vector de expressão. Os vectores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros quer como epissomas quer como uma parte integral do ADN cromossómico do hospedeiro. Habitualmente, os vectores de expressão conterão marcadores de selecção, por exemplo, resistência a tetraciclina ou resistência à higromicina, para permitir detecção e/ou selecção das células transformadas com as sequências de ADN pretendidas (consultar, por exemplo, patente U.S. 4 704 362). 20 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ A Ε. coli constitui um hospedeiro procariótico útil para clonagem das sequências de ADN do presente invento. Outros hospedeiros microbianos adequados para utilização incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis e outras Enterobacteriaceae, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos podem também produzir-se vectores de expressão que conterão tipicamente sequências de controlo de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Adicionalmente, estarão presentes quaisquer de entre vários promotores bem conhecidos tais como o sistema de promotor de lactose, um sistema de promotor de triptofano (trp), um sistema de promotor de beta-lactamase ou um sistema de promotor de fago lambda. Os promotores controlarão tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência de operador e apresentarão sequências de local de ligação de ribossoma e semelhantes para iniciação e finalização de transcrição e tradução.

Outros micróbios, tais como levedura, podem também ser utilizados para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro preferido apresentando os vectores adequados sequências de controlo de expressão tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas e uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes tal como pretendido. São também adequadas células de insecto (por exemplo, SF9) com vectores apropriados, habitualmente derivados de baculovirus para expressão de polipéptidos de receptor ACT-4 ou de ligando. Consultar Luckow, et al. Bio/Technology 6:47-55 (1988) (incorporada por referência para todos os objectivos).

Podem também utilizar-se culturas de células de tecidos de mamífero eucariótico superior para expressar e produzir os polipéptidos do presente invento (consultar Winnacker, From

Genes to Clones (VCH Publishers, New York, New York, 1987)) (incorporada por referência para todos os objectivos) . As células eucarióticas são de facto preferidas porque foram desenvolvidas na arte várias linhas celulares hospedeiras adequadas capazes de excretar e modificar de modo autêntico proteínas humanas e incluem as linhas celulares CHO, diferentes linhas celulares COS, células HeLa, linhas 21 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ celulares de mieloma, células Jurkat, etc. Os vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor (por exemplo, um promotor HSV tk ou promotor pgk (fosfoglicerato-quinase)), um facilitador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) locais de processamento de informação necessários, tais como locais de ligação de ribossomas, locais de splicing de ARN, locais de poliadenilação (por exemplo, um local de adição SV40 grande τ Ag poli A) e sequências de terminação de transcrição. Constituem sequências de controlo de expressão preferidas promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino e semelhantes. Os vectores contendo os segmentos de ADN de interesse (por exemplo, polipéptidos que codificam um receptor ACT-4) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos que podem variar dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção com CaCl2 é habitualmente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com CaP04 ou a electroporação podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares. Os vectores podem existir como epissomas ou integrados no cromossoma do hospedeiro. B. Proteínas receptoras ACT-4 de ocorrência natural

Isolam-se polipéptidos receptores ACT-4 naturais por técnicas convencionais tais como cromatografia de afinidade. Por exemplo, desenvolvem-se anticorpos policlonais ou monoclonais contra ACT-4-h-l previamente purificado e ligado a uma coluna de afinidade adequada por técnicas bem conhecidas. Consultar, por exemplo, Hudson e Hay, Practical Immunology (Blackwell Scientific Publications, Oxford, R.U., 1980), capítulo 8 (incorporada por referência para todos os objectivos). Por exemplo, pode imobilizar-se anti-ACT-4-h-l numa coluna de proteína-A-Sepharose através de reticulação do domínio Fc com um agente de reticulação homobifuncional, tal como dimetilpimelimidato. Passam-se então os extractos celulares através da coluna e elui-se a proteína receptora ACT-4 especificamente ligada pela coluna com, por exemplo, ácido pirogénico 0,5 M, pH 2,5. Habitualmente, obtém-se uma forma intacta de receptor ACT-4 por tais técnicas de isolamento. Geram-se fragmentos de péptido a partir dos 22 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ receptores ACT-4 intactos por clivagem química (por exemplo, brometo de cianogénio) ou enzimática (por exemplo, protease V8 ou tripsina) da molécula intacta. C. Outros métodos

Alternativamente, podem sintetizar-se polipéptidos receptores ACT-4 por métodos químicos ou produzidos por sistemas de tradução in vitro utilizando um molde de polinucleótido para tradução directa. São bem conhecidos na arte métodos para síntese química de polipéptidos e tradução in vitro e são descritos adicionalmente por Berger e Kimmel, Methods in Enzymology, volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia, 1987). III. Ácidos nucleicos A. Clonagem de ácidos nucleicos de receptor ACT-4 0 exemplo 5 apresenta dados de sequência de ácidos nucleicos para um clone de ADNc de um receptor ACT-4 designado ACT-4-h-l. A sequência inclui tanto uma região traduzida como as regiões flanqueadoras 3' e 5'. Estes dados de sequência podem ser utilizados para conceber sondas com as quais se isolam outros genes de receptor ACT-4. Estes genes incluem o gene genómico humano que codifica ACT-4-h-l e ADNc e clones genómicos para espécies de mamíferos superiores e variantes alélicos e não alélicos e mutantes naturais e induzidos de todos estes genes. Especificamente, proporcionam-se todos os fragmentos de ácidos nucleicos que codificam todos os polipéptidos receptores ACT-4 revelados no presente pedido. Encontram-se comercialmente disponíveis bibliotecas genómicas de muitas espécies (por exemplo, Clontech, Paio Alto, Califórnia) ou podem isolar-se de novo por procedimentos convencionais. As bibliotecas de ADNc são de preferência preparadas a partir de células CD4+ activadas que expressam ACT-4-h-l em grandes quantidades.

As sondas utilizadas para isolar clones incluem tipicamente uma sequência de cerca de pelo menos 24 nucleótidos contíguos (ou o seu complementar) da sequência de ADNc apresentada na figura 5. Por exemplo, pode marcar-se 23 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ um polinucleótido completo correspondente à sequência apresentada na figura 5 e utilizar-se como uma sonda de hibridação para isolar clones genómicos de uma biblioteca de clones genómicos humana em, por exemplo, ÀEMBL4 ou XGEMll (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); as condições de hibridação típicas para rastrear levantamentos de placa (Benton e Davis, Science 196:180 (1978)) pode ser: formamida a 50%, 5x SSC ou SSPE, l-5x solução de Denhardt, SDS a 0,1-1%, 100-200 pg de ADN ou ARNt heterólogos partidos, sulfato de dextrano a 0-10%, 1 x 105 a 1 x 107 cpm/ml de sonda desnaturada com uma actividade específica de cerca de 1 x 108 cpm/pg e incubação a 42°C durante cerca de 6-36 horas. As condições de pré-hibridação são essencialmente idênticas excepto que a sonda não é incluída e o tempo de incubação é tipicamente reduzido. As condições de lavagem são tipicamente l-3x SSC, SDS a 0,1-1%, 50-70°C com mudança de solução de lavagem a cerca de 5-30 minutos. As condições de hibridação e lavagem são tipicamente menos rigorosas para isolamento de variantes de cognato superior ou não alélicas do que para, por exemplo, o clone genómico humano de ACT-4-h-l.

Alternativamente, podem ser utilizadas sondas para clonar genes de receptor ACT-4 por métodos utilizando a reacção de polimerização em cadeia (PCR). Descrevem-se métodos para amplificação por PCR em, por exemplo, PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, New York, New York, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (ed. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Califórnia, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:4967 (1991); Eckert, K.A. e Kunkel, T.A., PCR Methods and Applications 1:17 (1991); PCR (ed. McPherson et al., IRL Press, Oxford); e patente U.S. 4 683 202.

Alternativamente, podem construir-se sequências polinucleotídicas sintéticas correspondentes à totalidade ou a partes das sequências apresentadas na figura 5 por síntese química de oligonucleótidos.

Podem incorporar-se substituições, deleções e adições de nucleótidos nos polinucleótidos do invento. A variação de sequências de nucleótidos pode resultar de degenerescência do 24 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ código genético, de polimorfismos de sequência de diferentes alelos de receptor ACT-4, de pequenos erros de sequenciação, ou pode ser introduzida por mutagénese aleatória dos ácidos nucleicos de codificação utilizando irradiação ou exposição a EMS, ou por alterações concebidas racionalmente por mutagénese dirigida ao local ou outras técnicas de biologia molecular moderna. Consultar Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, New York, 2a ed., 1989). Para sequências de nucleótidos que são capazes de ser transcritas e traduzidas para produzir um polipéptido funcional, a degenerescência do código genético resulta em várias sequências de nucleótidos que codificam o mesmo polipéptido. 0 invento inclui todas essas sequências. De um modo geral, substituições, deleções e adições de nucleótidos não devem, de modo substancial, destruir a capacidade de um polinucleótido de receptor ACT-4 hibridar com a sequência de ACT-4-h-l apresentada na figura 5 em condições rigorosas. Tipicamente, os polinucleótidos de receptor ACT-4 incluem pelo menos 25 nucleótidos consecutivos que são substancialmente idênticos a uma sequência de receptor ACT-4 de ocorrência natural (por exemplo, figura 5), mais habitualmente os polinucleótidos de receptor ACT-4 incluem pelo menos 50 a 100 nucleótidos consecutivos, que são substancialmente idênticos a uma sequência de receptor ACT-4 de ocorrência natural.

Os polinucleótidos de receptor ACT-4 podem ser oligonucleótidos curtos (por exemplo, cerca de 10, 15, 25, 50 ou 100 bases contíguas da sequência ACT-h-1 apresentada na figura 5), tal como para utilização como sondas de hibridação e iniciadores de PCR (ou LCR). A sequência polinucleotídicas de receptor ACT-4 pode também incluir parte de um polinucleótido maior que inclui sequências que facilitam transcrição (sequências de expressão) e tradução das sequências codificadoras, tal que seja produzido o produto de polipéptido codificado. A construção de tais polinucleótidos é bem conhecida na arte e é descrita adicionalmente em Sambrook et al., supra (C.S.H.P. Press, New York, 2a ed. 1989). O polinucleótido de receptor ACT-4 pode ser fundido em quadro com outra sequências polinucleotídicas que codifica uma proteína diferente (por exemplo, glutationa-S-transferase, β-galactosidase ou um domínio Fc de imunoglobulina) para 25 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ codificação de expressão de uma proteína de fusão (consultar, por exemplo, Byrn et al., Naturer 344:667-670 (1990)). IV. Anticorpos e hibridomas

Proporcionam-se anticorpos contra receptores ACT-4 e seus ligandos (consultar secção V). A. Características gerais dos anticorpos

Os anticorpos ou imunoglobulinas são compostos tipicamente por quarto cadeias de péptido ligadas covalentemente. Por exemplo, um anticorpo IgG tem duas cadeia leves e duas cadeias pesadas. Cada cadeia leve está ligada covalentemente a uma cadeia pesada. Por outro lado cada cadeia pesada está ligada covalentemente à outra para formar uma configuração "Y", também conhecida como uma conformação de imunoglobulina. Fragmentos destas moléculas, ou mesmos cadeias pesadas ou leves individuais, podem ligar antigénio. Anticorpos, fragmentos de anticorpos e cadeias individuais são também aqui referidas como imunoglobulinas.

Uma cadeia pesada ou leve de anticorpo normal tem uma região variável (V) no terminal N (NH2) e uma região constante (C) no terminal C (-COOH). A região variável de cadeia pesada refere-se como VH (incluindo, por exemplo, Vy) e a região variável de cadeia leve refere-se como vL (incluindo vK ou νλ) . A região variável é a parte da molécula que se liga ao antigénio cognato do anticorpo, enquanto que a região Fc (o segundo e terceiro domínios da região C) determina a função de efector do anticorpo (por exemplo, fixação de complemento, opsonização). As "cadeias leves" completas de imunoglobulina ou de anticorpo (geralmente cerca de 25 kDa, cerca de 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável no terminal N (geralmente cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante κ (capa) ou λ (lambda) no terminal COOH. As "cadeias pesadas" completas de imunoglobulina ou de anticorpo (geralmente cerca de 50 Kd, cerca de 446 aminoácidos), são igualmente codificadas por um gene de região variável (que geralmente codifica cerca de 116 aminoácidos) e um dos genes de região constante, por exemplo, gama (que codifica cerca de 330 aminoácidos). 26 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Tipicamente, a "VL" incluirá a parte da cadeia leve codificada pelos segmentos génicos VL e/ou JL (J ou região de junção) e a "VH" incluirá a parte da cadeia pesada codificada pelos segmentos génicos vH e/ou dh (D ou região de diversidade) e JH. Consultar, de um modo geral, Roitt et al., Immunology (2a ed. 1989), capitulo 6 e Paul, Fundamental Immunology (Raven Press, 2a ed., 1989).

Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste em uma região de "esqueleto" interrompida por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As extensões da região de esqueleto e das CDR têm sido definidas (consultar Kabat et al. (1987), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). As sequências das regiões de esqueleto das diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de esqueleto de um anticorpo, ou seja, a combinação das regiões de esqueleto das cadeias leve e pesada que o constituem, serve para posicionar e alinhar as CDR no espaço tridimensional. As CDR são principalmente responsáveis por ligação a um epitopo de um antigénio. As CDR são tipicamente referidas como CDRl, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente com inicio no terminal N. A região constante da molécula de cadeia pesada, também conhecida como CH, determina o isotipo do anticorpo. Os anticorpos são referidos como igM, IgD, igG, igA e IgE dependendo do isotipo da cadeia pesada. Os isotipos são codificados nos segmentos miu (μ), delta (Δ), gama (γ), alfa (a) e epsilon (ε) da região constante de cadeia pesada, respectivamente. Adicionalmente, existem vários subtipos γ. Existem dois tipos de cadeia leves, κ e λ. Os determinantes destes subtipos residem tipicamente na região constante da cadeia leve, também referida como a CL em geral e CK ou CÀ em particular.

Os isotipos de cadeia pesada determinam diferentes funções de efector do anticorpo, tais como opsonização ou fixação de complemento. Adicionalmente, o isotipo de cadeia pesada determina a forma excretada do anticorpo. Os isotipos 27 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ excretados IgG, IgD e IgE encontram-se tipicamente em forma de unidade simples ou monomérica. O isotipo excretado igM encontra-se na forma pentamérica; pode encontrar-se IgA excretado tanto na forma monomérica como dimérica. B. Produção de anticorpos

Podem produzir-se anticorpos que ligam um receptor ACT-4, um seu ligando, ou fragmentos de ligação de qualquer um deles, por vários meios. A produção de anticorpos monoclonais não humanos, por exemplo, murino, de rato e outros, é bem conhecida e pode ser obtida por, por exemplo, imunização do animal com uma preparação contendo um receptor ACT-4 ou seus ligandos, ou um fragmento imunogénico de qualquer um destes. Nomeadamente, são úteis como imunogénios células transfectadas de modo estável com genes de receptor ACT-4 recombinante e que expressam receptores ACT-4 nas suas superfícies celulares. Imortalizam-se células produtoras de anticorpo obtidas dos animais imunizados e rastreiam-se relativamente a produção de um anticorpo que se liga aos receptores ACT-4 ou aos seus ligandos. Consultar Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P. New York, 1988).

Foram também descritas várias técnicas para geração de anticorpos monoclonais humanos mas são geralmente mais onerosas do que as técnicas murinas e não são aplicáveis a todos os antigénios. Consultar, por exemplo, Larrick et al., patente U.S. n° 5 001 065, para uma revisão. Constitui uma técnica que tem sido utilizada com sucesso para gerar anticorpos monoclonais humanos contra vários antigénios, a metodologia de trioma de Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, patente U.S. n° 4 634 664 e Engleman et al., patente US 4 634 666. As linhas celulares produtoras de anticorpo obtidas por este método denominam-se triomas, porque descendem de três células - duas humanas e uma de ratinho. Verificou-se que os triomas produzem anticorpo de modo mais estável do que hibridomas normais obtidos de células humanas.

Constitui uma abordagem alternativa a geração de imunoglobulinas humanizadas por ligação de regiões CDR de anticorpos não humanos a regiões constantes humanas por 28 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ técnicas de ADN recombinante. Consultar Queen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989) e WO 90/07861.

As imunoglobulinas humanizadas apresentam residuos de esqueleto de região variável substancialmente de uma imunoglobulina humana (denominada uma imunoglobulina aceitadora) e regiões determinantes de complementaridade substancialmente de uma imunoglobulina de ratinho, por exemplo, o anticorpo L106 (referido como a imunoglobulina dadora). A(s) região(ões) constante(s), caso presentes, são também substancialmente de uma imunoglobulina humana. Os domínios variáveis humanos são habitualmente escolhidos de anticorpos humanos cujas sequências de esqueleto apresentam um elevado grau de identidade de sequência com os domínios de região variável murina dos quais derivam as CDR. Os resíduos de esqueleto de região variável de cadeia pesada e leve podem ser derivados das mesmas sequências de anticorpo humano ou de sequências diferentes. As sequências de anticorpo humano podem ser sequências de anticorpos humanos de ocorrência natural ou podem ser sequências consensuais de diferentes anticorpos humanos. Consultar Cárter et al., WO 92/22653. Determinados aminoácidos dos resíduos de esqueleto da região variável humana são seleccionados para substituição com base na sua possível influência sobre a conformação da CDR e/ou sobre a ligação a antigénio. A investigação de tais possíveis influências faz-se por modelação, análise das características dos aminoácidos em localizações específicas, ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagénese de aminoácidos específicos.

Por exemplo, quando um aminoácido apresenta um resíduo de esqueleto de região variável de L106 murino diferente de um resíduo de esqueleto de região variável humano seleccionado, o aminoácido de esqueleto humano deve ser habitualmente substituído pelo aminoácido de esqueleto equivalente do anticorpo de ratinho quando for razoavelmente expectável que o aminoácido: (1) ligue directamente o antigénio de modo não covalente, (2) esteja numa posição adjacente a uma região CDR, 29 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ (3) interactue de outro modo com uma região CDR (por exemplo, esteja à distância de cerca de 3A de uma região CDR), ou (4) participe na interface VL-VH.

Constituem outros candidatos para substituição os aminoácidos de esqueleto humanos aceitadores que são não usuais para uma imunoglobulina humana nessa posição. Esses aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo L106 ou das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas.

Uma abordagem adicional para isolar sequências de ADN que codificam um anticorpo monoclonal humano ou um seu fragmento de ligação consiste em rastrear uma biblioteca de ADN de células B humanas de acordo com o protocolo geral descrito por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) e seguidamente clonar e amplificar as sequências que codificam o anticorpo (ou o fragmento de ligação) da especificidade pretendida. 0 protocolo descrito por Huse torna-se mais eficaz em combinação com tecnologia de disposição de fagos. Consultar, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047. A tecnologia de disposição de fagos também pode ser utilizada para efectuar mutagénese de regiões CDR de anticorpos que se mostrou previamente que apresentavam afinidade para receptores ACT-4 ou seus ligandos. Seleccionam-se anticorpos apresentando afinidade de ligação melhorada.

Identificam-se habitualmente anticorpos anti-receptor ACT-4 que se ligam especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo L106 através de um ensaio de ligação competitiva. O ensaio tem três componentes, um polipéptido ACT-4 (por exemplo, ACT-4-h-l), anticorpo L106, que é habitualmente marcado e o anticorpo em ensaio. Frequentemente o polipéptido receptor ACT-4 é imobilizado num suporte sólido. O anticorpo de ensaio liga-se ao mesmo epitopo que o anticorpo L106 caso reduza a quantidade de anticorpo L106 que se liga especificamente ao polipéptido receptor ACT-4. A extensão de rastreio necessária para obter tais anticorpos pode ser reduzida por geração de anticorpos com um protocolo no qual o epitopo especifico ligado por L106 seja utilizado como um imunogénio. Os anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que 30 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ L106 podem ter uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica mas não completamente idêntica ao anticorpo L106, ou podem ter uma estrutura primária não relacionada com o anticorpo L106.

Identificam-se anticorpos anti-receptor ACT-4 apresentando uma especificidade de ligação diferente de L106 (ou seja, que se ligam a um epitopo diferente) por uma abordagem complementar. Rastreiam-se os anticorpos de ensaio relativamente a falha de competição com anticorpo L106 pela ligação a um polipéptido receptor ACT-4. A extensão de rastreio pode ser reduzida por geração de anticorpos com um protocolo no qual se utiliza como imunogénio um fragmento sem um epitopo especifico que seja ligado por L106.

Podem identificar-se anticorpos apresentando a capacidade de estimular ou inibir activação de células CD4+ pelos procedimentos de rastreio discutidos na secção VI, infra. Alguns anticorpos podem inibir selectivamente activação em resposta a alguns estímulos (por exemplo, aloantigénico mas não mitogénico, ou vice versa) e não a outros. Alguma da capacidade de inibição de anticorpos pode depender do intervalo de tempo após activação ao fim do qual se adiciona o anticorpo. Alguns anticorpos podem ter a capacidade de activar células CD4+ independentemente de outros estímulos, enquanto que outros anticorpos anti-receptor ACT-4 podem ter apenas a capacidade de aumentar a eficácia de outros estímulos tal como os proporcionados por PHA.

Os anticorpos isolados pelos procedimentos supra podem ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotípicos por, por exemplo, imunização de um animal com o anticorpo primário. Para anticorpos anti-receptor ACT-4, seleccionam-se anticorpos anti-idiotípicos cuja ligação ao anticorpo primário é inibida por receptores ACT-4 ou seus fragmentos. Dado que tanto o anticorpo anti-idiotípico como os receptores ACT-4 ou seus fragmentos se ligam à imunoglobulina primária, a imunoglobulina anti-idiotípica pode representar a "imagem interna" de um epitopo e assim pode substituir o ligando ACT-4. 31 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ C. Mapeamento de epítopos Ο epítopo ligado pelo L106 ou qualquer outro anticorpo anti-receptor ACT-4 é determinado proporcionando uma família de fragmentos contendo diferentes segmentos de aminoácido de um polipéptido receptor ACT-4, tal como ACT-4-h-l. Cada fragmento inclui tipicamente pelo menos 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 aminoácidos contíguos. Colectivamente, a família de polipéptidos abrange a maioria ou a totalidade da sequência de aminoácidos de um polipéptido receptor ACT-4 completo. Os membros da família são ensaiados individualmente quanto a ligação a, por exemplo, o anticorpo L106. O fragmento mais pequeno que se pode ligar especificamente ao anticorpo em ensaio define a sequência de aminoácidos do epítopo reconhecido pelo anticorpo. D. Fragmentos de anticorpos e imunotoxinas

Os fragmentos de anticorpos contra receptores ACT-4 ou seus ligandos apresentam tipicamente ligação específica ao receptor ACT-4 com uma afinidade de pelo menos 107 M e mais tipicamente 108 ou 109 M. Os fragmentos de anticorpos incluem cadeia pesadas e leves individuais de Fab, Fab', F(ab')2, Fabc e Fv. Os fragmentos são produzidos por técnicas de ADN recombinante ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.

Noutra concretização, proporcionam-se imunotoxinas. Uma imunotoxina é um composto quimérico que consiste em uma toxina ligada a uma anticorpo apresentando uma especificidade pretendida. O anticorpo serve como um agente alvo para a toxina. Consultar, de um modo geral, Pastan et ai., Cell 47:641-648 (1986). Acopla-se uma parte de toxina a um anticorpo intacto ou a um seu fragmento por técnicas químicas ou de ADN recombinante. De preferência, a toxina está ligada a uma cadeia de imunoglobulina sob a forma de uma proteína contígua. Consultar, por exemplo Chovnick et al., Câncer Res. 51:465; Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989). Apresentam-se exemplos de componentes de toxina adequadas na secção I, supra e são revistas em, por exemplo, The Specificity and Action of Animal, Bacterial and Plant Toxins (ed. P. Cuatrecasas,

Chapman Hall, London, 1976). 32 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ Ε. Hibridomas e outras linhas celulares

Os hibridomas, triomas e outras linhas celulares que produzem os anticorpos e seus fragmentos discutidos supra, incluem a linha de hibridoma HBL106, depositada como ATCC HB 11483 que produz o anticorpo de ratinho L106. F. Utilizações de anticorpos

Os anticorpos anti-receptor ACT-4 e seus fragmentos de ligação são úteis para rastrear bibliotecas de expressão de ADNc, de preferência contendo ADNc humanos ou de primata derivados de diferentes tecidos e para identificar clones contendo inserções de ADNc, que codificam proteínas estruturalmente relacionadas e que apresentam imunorreactividade cruzada. Consultar Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987) (incorporada por referência para todos os objectivos). Os anticorpos são também úteis para identificar e/ou purificar proteínas com imunorreactividade cruzada que estão relacionadas do ponto de vista estrutural ou evolutivo com polipéptidos receptores ACT-4 nativos ou com os seus fragmentos utilizados para gerar o anticorpo. Os anticorpos contra ligandos ACT-4 são úteis de modo análogo para isolar ligandos adicionais e seus variantes. Descrevem-se na secção VII, infra, utilizações diagnósticas e terapêuticas de anticorpos, seus fragmentos de ligação, imunotoxinas e anticorpos idiotípicos. V. Ligandos ACT-4 A expressão ligando ACT-4 é utilizada para denominar uma proteína que se liga especificamente a um polipéptido receptor ACT-4 e que é capaz de formar um complexo com tal polipéptido, pelo menos em parte, por ligação não covalente. Os ligandos podem ser de ocorrência natural ou moléculas sintéticas e podem encontrar-se sob forma solúvel ou ancorados à superfície de uma célula. Podem ligar-se múltiplos ligandos diferentes ao mesmo receptor ACT-4. Contrariamente, um ligando pode ligar-se a mais do que um receptor ACT-4. A expressão "ligando ACT-4" não inclui usualmente anticorpos contra polipéptidos receptores ACT-4. Usualmente, a ligação de um ligando a um receptor ACT-4 iniciará um sinal que altera o fenótipo físico 33 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ e/ou funcional de uma célula que contém o receptor ACT-4 e/ou uma célula que contém o ligando ACT-4. Os anticorpos contra quer ACT-4, quer os seus ligandos podem ter a capacidade de bloquear ou estimular transdução de sinal. Será obviamente reconhecido que a designação de ACT-4 como um receptor e o seu parceiro de ligação especifico como um ligando é algo arbitrária e pode, em alguns casos, ser revertida.

Espera-se que os ligandos ACT-4 partilhem algumas das propriedades de outros ligandos que se ligam a membros da superfamilia de receptores de factor de crescimento de nervos. Estes ligandos incluem as citoquinas TNF-a, TNF-β, CD40-L, CD-27-L e CD30-L. Com a excepção de TNF-β, estes ligandos existem tanto sob a forma de proteínas de superfície celular membranares integrais do tipo II, como sob a forma de proteínas solúveis. Os dominios extracelulares destes ligandos consistem em cerca de 150 aminoácidos e formam várias folhas β, que se agregam numa estrutura cilíndrica com fenda (denominada uma "torta recheada" por Bazan et al., Current Biology 3:603-606 (1993)).

Identificam-se matérias-primas para obtenção de ligandos ACT-4 por rastreio de diferentes tipos de célula, nomeadamente células linfóides e hematopoiéticas, fluidos corporais e extractos de tecidos, com receptor ACT-4 marcado, de preferência sob forma solúvel, como uma sonda. Frequentemente, o receptor ACT-4 ou um seu fragmento de ligação é fundido a uma segunda proteína para propósitos de rastreio. São particularmente adequadas as globulinas recombinantes formadas por fusão da parte extracelular de ACT-4 com a região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina.

Os ligandos ACT-4 são purificados a partir de células ou outros materiais biológicos identificados por este método de rastreio utilizando técnicas de química de proteínas clássica. Tais técnicas incluem precipitação selectiva com substâncias tais como sulfato de amónio, cromatografia em coluna, métodos de imunopurificação e outros. Consultar, por exemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982). Usualmente, os procedimentos de purificação incluirão uma etapa de cromatografia de afinidade na qual se utiliza um polipéptido 34 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ ACT-4, ou um seu fragmento de ligação, como o reagente imobilizado. As regiões constantes de ACT-4 podem ser imobilizadas convenientemente por ligação da parte de região constante a proteína A ou G. Os ligandos ACT-4 podem também ser purificados utilizando anticorpos anti-idiotípicos contra os receptores ACT-4 como reagente de afinidade.

Para determinar a sequência de aminoácidos ou para obter fragmentos de polipéptido do receptor, o receptor pode ser digerido com tripsina. Os fragmentos de péptido podem ser separados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa e analisados por sequenciação em fase gasosa. Podem também ser utilizados outros métodos de sequenciação conhecidos na arte. Os dados de sequência podem ser utilizados para conceber sondas degeneradas para isolamento de ADNc ou clones genómicos que codificam ligandos ACT-4.

Alternativamente, os clones de ADNc que codificam ligandos ACT-4 podem ser obtidos por clonagem de expressão. Nesta abordagem, prepara-se uma biblioteca de ADNc a partir de células que expressam um ligando ACT-4 (identificado como discutido, supra). Expressa-se a biblioteca em células adequadas (por exemplo COS-7) e identificam-se os clones que apresentam o ligando ACT-4 por rastreio com ACT-4 marcado ou com um seu fragmento de ligação marcado, opcionalmente fundido a um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina.

Os ligandos ACT-4 ou os seus domínios de ligação podem ser utilizados para purificar por afinidade os receptores ACT-4 respectivos. Os ligandos ACT-4 e os seus fragmentos de ligação são também úteis como agonistas ou antagonistas de ligação de ligando ACT-4 e podem ser utilizados nos métodos terapêuticos discutidos na secção VII, infra. Para ligandos ACT-4 ligados à membrana, os fragmentos de ligação incluirão parte do domínio extracelular de um receptor ACT-4. Os ligandos ACT-4 e seus fragmentos são também úteis em ensaios de rastreio para identificar agonistas e antagonistas de ACT-4 e/ou do seu ligando. Os ligandos ACT-4 podem ser fundidos com outra proteína, tais como toxinas e domínios constantes de imunoglobulina, tal como discutido supra, para receptores ACT-4. 35 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ VI. Rastreio de agonistas e antagonistas

Rastreiam-se receptor ACT-4 e fragmentos de ligando ACT-4, seus análogos, anticorpos e seus anticorpos anti-idiotipicos, bem como outros agentes químicos ou biológicos, relativamente à sua capacidade de bloquear ou aumentar a ligação de um ligando ACT-4 ao seu receptor. Além disso, são ensaiados relativamente à sua capacidade para estimular ou inibir processos metabólicos, tais como síntese de ADN ou fosforilação de proteínas em células apresentando um receptor ACT-4 ou um ligando ACT-4 ancorado à sua superfície.

Em alguns métodos, o composto a ser ensaiado é rastreado relativamente à sua capacidade de bloquear ou aumentar a ligação de um fragmento de ligação purificado de um receptor ACT-4 (ou sua proteína de fusão) a um fragmento de ligação purificado de um ligando ACT-4 (ou sua proteína de fusão). Em tais experiências, o receptor ou o fragmento de ligando está usualmente imobilizado num suporte sólido. 0 composto de ensaio compete então com um ligando ACT-4 ou fragmento de receptor (o que não estiver ligado ao suporte) pela ligação ao suporte. Usualmente, o composto de ensaio ou ligando ou receptor de competição está marcado.

Em outros métodos, o receptor ACT-4 ou o ligando ACT-4 ou ambos, ou fragmentos de ligação destas moléculas, são expressos numa superfície celular. Por exemplo, o antigénio ACT-4-h-l é expresso de ADN recombinante em, por exemplo, células COS-7 (consultar exemplo 6) . Nestes métodos, determina-se a existência de agonismo ou antagonismo a partir do grau de ligação entre um receptor ACT-4 e o seu ligando que ocorre na presença do composto de ensaio. Alternativamente, ensaia-se a actividade do composto de ensaio por medição da incorporação de 3H-timidina em ADN ou incorporação de 32P em proteínas em células que apresentam um receptor ACT-4 e/ou células apresentando um ligando ACT-4.

Os compostos que bloqueiam a síntese de ADN ou fosforilação de proteína induzida por ACT-4 são antagonistas. Os compostos que activam a síntese de ADN ou fosforilação através de interacção com um receptor ACT-4 ou o seu ligando são agonistas. A actividade agonística ou antagonística pode 36 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ também ser determinada a partir de outros pontos finais físicos ou funcionais de activação de leucócitos ou a partir de resultados clínicos desejáveis ou indesejáveis, tais como actividade citolítica ou extravasamento de leucócitos para tecidos de vasos sanguíneos. A capacidade de agentes para funcionar como agonistas ou antagonistas de proliferação de células T in vitro pode ser correlacionada com a capacidade de afectar a resposta imunitária in vivo. A actividade in vivo é tipicamente ensaiada utilizando modelos animais adequados tais como ratinhos ou ratos. Para ensaiar o efeito de agentes em rejeição de aloenxerto, por exemplo, podem ser administrados potenciais agentes terapêuticos aos animais em vários pontos temporais antes de introdução do tecido alogénico; e os animais podem ser monitorizados relativamente a rejeição de enxerto. Foram descritos métodos adequados para efectuar o transplante e monitorizar a rejeição de enxerto (consultar, por exemplo, Hislop et al., J. Thorac. Cardiovasc. 100:360-370 (1990)) VII. Métodos e composições terapêuticas e de diagnóstico A. Métodos de diagnóstico

As doenças e condições do sistema imunitário associadas a uma abundância alterada ou mutação funcional de um receptor ACT-4 ou do seu ARNm, ou um ligando ACT-4 ou o seu ARNm podem ser diagnosticadas utilizando as sondas e/ou anticorpos. A provisão de anticorpos contra o receptor ACT-4 e as sondas de ácido nucleico complementares aos seus ARNm permite distinguir as células T CD4+ activadas de outros subtipos de leucócitos. A presença de tais células é indicativa de uma resposta imunitária induzida MHC de classe II contra, por exemplo, bactérias invasoras. A comparação dos números de células CD4+ e células CD8+ activadas pode permitir diagnóstico diferencial entre infecções bacterianas e virais, que induzem predominantemente estes tipos de células activadas respectivas. A presença de células CD4+ activadas é também indicativa de doenças e condições indesejáveis do sistema imunitário, tais como rejeição de aloenxerto, doença enxerto versus hospedeiro, doenças auto-imunes, alergias e inflamação. 37 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ A eficácia dos agentes terapêuticos no tratamento de tais doenças e condições pode ser monitorizada. O diagnóstico pode ser conseguido por remoção de uma amostra celular (por exemplo, amostra de sangue, biopsia ou tecido de nódulo linfático) de um doente. Sujeita-se então a amostra a análise para determinar: (1) a quantidade de receptor ACT-4 ou ligando expresso em células individuais da amostra (por exemplo, por coloração imuno-histoquímica de células fixadas com um anticorpo ou análise FACS™), (2) a quantidade de ARNm de receptor ACT-4 ou ligando em células individuais (por hibridação in situ com uma sonda de polinucleótido complementar marcada), (3) a quantidade de ARNm de receptor ACT-4 ou ligando na amostra celular por extracção de ARN seguida por hibridação com uma sonda de polinucleótido complementar marcada (por exemplo, por "Northern blotting", "dot blotting", hibridação em solução ou PCR quantitativo) ou (4) a quantidade de receptor ACT-4 ou ligando na amostra celular (por exemplo, por ruptura celular seguida por imunoensaio ou "Western blotting" do extracto celular resultante).

Também se pode conseguir diagnóstico por administração in vivo de um reagente de diagnóstico (por exemplo, um anticorpo anti-receptor ACT-4 marcado para diagnóstico de células T CD4+ activadas) e detecção por imagem in vivo. A concentração do agente de diagnóstico administrado deve ser suficiente para que a ligação das células que apresentam o antigénio alvo seja detectável comparativamente ao sinal de base. Além disso, é desejável que o reagente de diagnóstico possa ser depurado rapidamente do sistema circulatório de modo a obter a melhor razão sinal do alvo-ruido. 0 reagente de diagnóstico pode ser marcado com um radioisótopo para imagem fotográfica ou um isótopo paramagnético para imagem por ressonância magnética ou ressonância de spin electrónico.

Uma mudança (tipicamente um aumento) do nível de proteína ou ARNm de um receptor ACT-4 ou ligando numa amostra celular de um indivíduo, que se encontra fora da gama dos níveis normais estabelecidos clinicamente, pode indicar a presença de uma reacção imunitária indesejável no indivíduo do qual se obteve a amostra e/ou indicar uma predisposição do indivíduo 38 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ para desenvolver (ou progredir para) tal reacção. Os níveis de proteína ou ARNm podem ser utilizados como um marcador de diferenciação para identificar e tipificar as células de determinadas linhagens (ou seja, células CD4+ activadas para o receptor ACT-4) e origens de desenvolvimento. Tal detecção de tipo celular específico pode ser utilizada para diagnóstico histopatológico de respostas imunitárias indesejáveis. B. Kits de diagnóstico

Num outro aspecto do invento, proporcionam-se kits de diagnóstico para os métodos de diagnóstico descritos supra. Os kits incluem recipiente(s) incluindo os reagentes de diagnóstico, tais como anticorpos marcados contra receptores ACT-4 e reagentes e/ou dispositivos para detectar o marcador. Podem também ser incluídos outros componentes encontrados rotineiramente em tais kits conjuntamente com instruções para efectuar o ensaio. C. Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas utilizadas para tratamento profilático ou terapêutico incluem um agente terapeuticamente activo, por exemplo, um receptor ACT-4, ligando, seus fragmentos e anticorpos e anticorpos idiotípicos para estes e uma variedade de outros componentes. A forma preferida depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. As composições podem também incluir, dependendo da formulação pretendida, transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos, que são definidos como veículos utilizados usualmente para formular composições farmacêuticas para administração a animais ou humanos. 0 diluente é seleccionado de modo a não afectar a actividade biológica da combinação. Constituem exemplos de tais diluentes água destilada, solução salina fisiológica, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição ou formulação farmacêutica pode também incluir outros transportadores, adjuvantes ou estabilizantes não tóxicos, não terapêuticos, não imunogénicos e semelhantes. 39 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ D. Métodos terapêuticos

Os métodos terapêuticos utilizam os agentes terapêuticos discutidos supra para o tratamento de várias doenças em humanos ou animais, nomeadamente mamíferos vertebrados. Os agentes terapêuticos incluem receptores ACT-4, seus fragmentos de ligação, ligandos ACT-4, seus fragmentos de ligação, anticorpos anti-receptor ACT-4 e de ligando e anticorpos anti-idiotípicos para estes, fragmentos de ligação destes anticorpos, versões humanizadas destes anticorpos, imunotoxinas e outros agentes discutidos supra. Alguns agentes terapêuticos funcionam por bloqueio ou outro tipo de antagonismo da acção de um receptor ACT-4 com o seu ligando. Outros agentes terapêuticos funcionam matando as células que apresentam um polipéptido contra o qual se dirige ao alvo o agente. Por exemplo, os anticorpos anti-receptor ACT-4 com funções de efector ou que estão conjugados com toxinas, radioisótopos ou fármacos são capazes de matar selectivamente as células T CD4+ activadas. A eliminação selectiva de tais células é particularmente vantajosa porque se pode reduzir ou eliminar uma resposta imunitária indesejável, preservando uma capacidade imunitária residual sob a forma de células CD4+ e células CD8+ inactivadas para combater microrganismos invasores aos quais o doente pode ser exposto subsequentemente. Outros agentes terapêuticos funcionam como agonistas da interacção entre o receptor ACT-4 e o ligando. 1. Dosagens e métodos de administração

Em aplicações terapêuticas, administra-se uma composição farmacêutica (por exemplo, incluindo um anticorpo anti-receptor ACT-4), in vivo ou ex vivo, a um doente que já sofra de uma resposta imunitária indesejável (por exemplo, rejeição de transplante), numa quantidade suficiente para curar, parar parcialmente ou atrasar detectavelmente a progressão da condição e das suas complicações. Define-se uma quantidade adequada para conseguir tal como uma "dose eficaz terapeuticamente" ou "dose eficaz". As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da doença, do estado geral do doente e da via de administração e combinação com outros fármacos imunossupressores, caso existam, mas usualmente estará na gama desde cerca de 10 ng a cerca de 1 g 40 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ de agente activo por dose, sendo normalmente utilizadas unidades de dosagem unitárias desde 10 mg a 100 mg por doente. As composições farmacêuticas podem ser administradas sistemicamente por infusão intravenosa ou localmente por injecção. Esta última é particularmente útil para respostas imunitárias indesejáveis localizadas tais como rejeição hospedeiro versus enxerto. Para uma revisão sucinta dos métodos para entrega de fármacos consultar Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas são administradas a doentes em risco mas que ainda não sofram uma reacção imunitária indesejável (por exemplo, um doente que vá ser sujeito a uma cirurgia de transplante). A quantidade de anticorpo a ser administrada é uma "dose profilacticamente eficaz" e as quantidades exactas dependerão do estado de saúde do doente e do nivel geral de imunidade, mas em geral estão na gama de 10 ng a 1 g por dose, especialmente 10 mg a 100 mg por doente.

Dado que os agentes terapêuticos do invento são provavelmente mais selectivos e em geral menos tóxicos do que os agentes imunomoduladores convencionais, é também menos provável que causem os efeitos secundários frequentemente verificados com os agentes convencionais. Além disso, dado que alguns dos agentes terapêuticos são sequências de proteína humana (por exemplo, fragmentos de ligação de um receptor ACT-4 ou ligando ou anticorpos humanos), é menos provável que causem respostas imunitárias tais como as verificadas com anticorpos anti-CD3 murinos. Os agentes terapêuticos do presente invento podem também ser combinados com terapêutica tradicional e podem ser utilizados para diminuir a dose de tais agentes para níveis inferiores aos associados com efeitos secundários. Por exemplo; podem ser utilizados conjuntamente com os agentes terapêuticos do presente invento outros agentes imunossupressores tais como anticorpos para o domínio a3, antigénios de células τ (por exemplo, OKT4 e OKT3), globulina antitimócito, bem como agentes quimioterapêuticos tais como ciclosporina, glucocorticóides, azatioprina, prednisona.

Para a destruição de uma população específica de células alvo, pode ser vantajoso conjugar os agentes terapêuticos do 41 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ presente invento com outra molécula. Por exemplo, os agentes podem ser ligados a lipossomas contendo agentes imunossupressores determinados, para um anticorpo monoclonal especifico ou a uma citotoxina ou outro modulador de actividade celular, em que a ligação do conjugado para uma população de células alvo resultará em alteração dessa população. Discutiram-se supra várias toxinas de proteína. Os agentes quimioterapêuticos incluem, por exemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, metotrexato, citotoxina e ARN anti-sentido. Podem também ser utilizados antibióticos. Além disso, podem ser utilizados radioisótopos tais como itrio-90, fósforo-32, chumbo-212, iodo-131 ou paládio-109. A radiação emitida destrói as células alvo. 2. Doenças e condições passíveis de tratamento

As composições farmacêuticas discutidas supra são adequadas para o tratamento de várias doenças e condições do sistema imunitário. a. Rejeição de transplante

Ao longo dos últimos anos houve uma melhoria considerável da eficácia das técnicas cirúrgicas para transplante de tecidos e órgãos tais como pele, rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas e medula óssea. Constitui provavelmente o principal problema por resolver a falta de agentes satisfatórios para induzir imunotolerância no recebedor do aloenxerto ou órgão transplantado. Quando se transplantam células ou órgãos alogénicos para um hospedeiro (ou seja, o dador e o recebedor são indivíduos diferentes da mesma espécie), é provável que o sistema imunitário do hospedeiro desenvolva uma resposta imunitária a antigénios heterólogos no transplante (doença hospedeiro versus enxerto) levando à destruição do tecido transplantado. As células CD8+, células CD4+ e monócitos estão todos envolvidos na rejeição dos tecidos transplantados. Os agentes terapêuticos do presente invento são úteis para bloquear as respostas imunitárias induzidas por aloantigénio no recebedor (por exemplo, bloqueio ou eliminação de activação por alogénio de células T CD4+ por anticorpos anti-receptor ACT-4) evitando assim que tais células participem na destruição do tecido ou órgão transplantado. 42 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ b. Doenças enxerto-versus-hospedeiro

Constitui uma utilização relacionada dos agentes terapêuticos do presente invento a modulação da resposta imunitária envolvida em doenças "enxerto versus hospedeiro" (GVHD). GVHD é uma doença potencialmente fatal que ocorre quando se transferem células competentes imunologicamente para um recebedor alogénico. Nesta situação, as células imunocompetentes do dador podem atacar tecidos no recebedor. Os tecidos da pele, epiteliais intestinais e fígado são alvos frequentes e podem ser destruídos durante o decurso de GVHD. A doença apresenta um problema especialmente grave quando se transplanta tecido imunitário, tal como em transplante de medula óssea; mas foi também relatada GVHD menos grave em outros casos, incluindo transplantes de coração e fígado. Os agentes terapêuticos do presente invento são utilizados para bloquear ou eliminar a activação de células T do dador (particularmente células T CD4+ activadas, para agentes terapêuticos que têm como alvo o receptor ACT-4 ), inibindo assim a sua capacidade de lisar células alvo no hospedeiro. c. Doenças auto-imunes

Uma outra situação em que é desejável supressão imunitária é no tratamento de doenças auto-imunes tais como diabetes mellitus dependente de insulina, esclerose múltipla, síndrome do homem rigido, artrite reumatóide, miastenia grave e lúpus eritematoso. Nesta doença, o corpo desenvolve uma resposta imunitária celular e/ou humoral contra um dos seus próprios antigénios levando à destruição desse antigénio e com consequências potenciais de invalidez e/ou fatais. Pensa-se que as células T CD4+ activadas desempenham um papel principal em muitas doenças auto-imunes. As doenças auto-imunes são tratadas por administração de um dos agentes terapêuticos do invento, especialmente agentes que têm como alvo um receptor ACT-4. Opcionalmente, pode administrar-se o auto-antigénio ou um seu fragmento, contra o qual a doença auto-imune actua, imediatamente antes, concomitantemente ou imediatamente após o agente imunossupressor. Desta forma, pode induzir-se tolerância ao auto-antigénio ao abrigo do tratamento supressor, evitando assim a necessidade de imunossupressão 43 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ continuada. Consultar, por exemplo, Cobbold et al., WO 90/15152 (1990) . d. Inflamação A inflamação representa a consequência de dilatação capilar com acumulação de fluido e migração de leucócitos fagociticos, tais como granulócitos e monócitos. A inflamação é importante para defender um hospedeiro contra várias infecções mas também pode ter consequências indesejáveis em doenças inflamatórias, tais como choque anafiláctico, artrite e gota. As células T activadas desempenham um papel de modulação importante em inflamação, libertando interferão γ e factores de estimulação de colónias que por seu lado activam leucócitos fagociticos. Os leucócitos fagociticos activados são induzidos para expressar várias moléculas de superfície celular especificas denominadas receptores de residências, que servem para ligar os fagócitos às células endoteliais alvo. As respostas inflamatórias podem ser reduzidas ou eliminadas por tratamento com os agentes terapêuticos do presente invento. Por exemplo, os agentes terapêuticos que têm como alvo o receptor ACT-4 funcionam por bloqueio de activação de células CD4+ ou por eliminação de células CD4+ activadas, evitando assim que estas células libertem moléculas necessárias para a activação de tipos celulares fagociticos. e. Agentes infecciosos O invento também proporciona métodos de aumentar a eficácia de vacinas na prevenção ou tratamento de doenças e condições resultantes de agentes infecciosos. Os agentes terapêuticos que têm a capacidade de activar células T CD4+ (por exemplo, determinados anticorpos monoclonais contra um polipéptido receptor ACT-4-h-l) são administrados imediatamente antes, concomitantemente ou imediatamente após a vacina contendo um antigénio seleccionado. O agente terapêutico serve para aumentar a resposta imunitária contra o antigénio seleccionado. Estes métodos podem ser particularmente vantajosos em doentes que sofrem de doenças de deficiência imunitária. 44 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Os seguintes exemplos apresentam-se para ilustrar, mas não limitar, o invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Um anticorpo monoclonal contra ACT-4-h-l

Imunizaram-se ratinhos com linfoblastos T transformados com PHA. Fundiram-se esplenócitos de ratinhos imunizados com células de mieloma SP2/0 e seleccionaram-se hibridomas que excretam anticorpos específicos para o clone de célula T. Clonaram-se os hibridomas por diluição limitativa. Seleccionou-se para caracterização adicional um anticorpo monoclonal, denominado L106, produzido por um dos hibridomas resultantes. Verificou-se que o anticorpo L106 apresenta um isotipo IgGl. Depositou-se um hibridoma que produz o anticorpo, denominado HBL106, em American Type Culture Collection, Rockville; Maryland, a 3 de Novembro de 1993 e foi-lhe atribuído o número de acesso ATCC hb 11483.

Exemplo 2: Distribuição celular de polipéptido reconhecido por anticorpo L106

Disponibilizaram-se amostras contendo o anticorpo L106 a determinados participantes do "Fourth International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens" (Viena 1989) com o objectivo de identificar os tipos de tecidos e células que se ligam ao anticorpo L106. Os dados do workshop foram apresentados em Leukocyte Typing IV (ed. W, Knapp, Oxford U. Press, 1989) e uma base de dados de computador que o acompanha disponível de Walter R. Gilks, MRC Biostatistics Unit, Cambridge University, Inglaterra. Esta referência relata que o anticorpo L106 liga um polipéptido de cerca de 50 kDa. Relatou-se que este polipéptido está presente em células HUT-102 (uma linha de células T transformadas), linfócitos de sangue periférico activados por PHA, uma linha celular linfóide B transformada com EBV e linha de células T transformadas com HTLV-II, células de amígdalas activadas com PMA, PBL activados com ConA ou com PHA e monócitos activados com PMA. Relatou-se que o polipéptido se encontra substancialmente ausente em, entre outros, basófilos em repouso, células endoteliais, fibroblastos, monócitos 45 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ activados por interferão γ, células não T periféricas, granulócitos periféricos, monócitos periféricos, células mononucleares periféricas, células T periféricas e hematócitos periféricos.

Os presentes inventores obtiveram dados indicativos de que o polipéptido de 50 kDa (doravante aqui designado "receptor ACT-4-h-l") é expresso de preferência em subespécies CD4+ de células T activadas. Numa série de experiências, a expressão de ACT-4-h-l específicos de células foi analisada em PBL não fraccionados por um método de coloração de duas cores. Activaram-se os PBL com PHA durante cerca de dois dias (utilizando as condições de cultura descritas no exemplo 3) e analisaram-se para expressão à superfície celular de ACT-4-h-l em diferentes subtipos celulares por coloração com dois anticorpos marcados de modo diferente (marcadores FITC e PE) . Detectaram-se os marcadores por análise FACS™ essencialmente como descrito por Picker et al., J. Immunol. 150:1105-1121 (1993). Um anticorpo, L106, foi específico para ACT-4-h-l, o outro anticorpo foi específico para um determinado subtipo de leucócitos. A figura 1 apresenta três gráficos em que se apresenta a coloração de L106 no eixo dos Y de cada gráfico e coloração anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD19 como eixo dos X dos gráficos respectivos. Para o gráfico corado com anti-CD4, aparecem muitas células como duplos positivos (ou seja, expressam tanto CD4, como ACT-4-h-l). Para o gráfico corado com anti-CD8, aparecem muito menos células como duplos positivos. Para o gráfico corado com anti-CD19 (um marcador de células B) encontram-se substancialmente ausentes células com duplos positivos.

Noutra série de experiências, analisou-se a expressão de ACT-4-h-l por coloração com uma única cor de tipos celulares isolados. As células foram coradas com anticorpo L106 marcado com fluorescência e o marcador foi detectado por análise FACS™. Consultar Engleman et al., J. Immunol. 127:2124-2129 (1981). Em algumas das experiências, activaram-se as células por estimulação com PHA durante cerca de dois dias (uma vez mais utilizando as condições de cultura descritas no exemplo 3) . Os resultados desta experiência, conjuntamente com os da experiência de coloração com duas cores descrita supra, encontram-se resumidos na tabela 1. A tabela 1 demonstra que 46 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ cerca de 80% das células CD4+ activadas expressaram ACT-4-h-l com uma fluorescência de canal média >20, independentemente de as células CD4+ estarem isoladas (coloração com uma cor) ou em PBL não fraccionados (coloração com duas cores) . O nível de expressão de ACT-4-h-l em células CD8+ activadas é muito menor dos que em células T CD4+ activadas na experiência de coloração com duas cores e muitíssimo menor na coloração com uma cor. Assim, a extensão de expressão em células CD8+ activadas parece depender do facto das células C8+ terem sido fraccionadas de outros PBL antes de activação. Em células CDB+ não fraccionadas (coloração com duas cores), cerca de 10% das células expressam ACT-4-h-l, com uma fluorescência de canal média de cerca de 4. Nas células fraccionadas, apenas cerca de 4% das células expressam ACT-4-h-l com uma fluorescência de canal média de cerca de 2. Estes dados sugerem que ACT-4-h-l é expresso somente num pequeno subtipo de células CD8+ activadas e que este subtipo é algo mais prevalente quando as células CD8+ são activadas na presença de outros PBL. A tabela 1 também indica que ACT-4-h-l estava substancialmente ausente em todos os subtipos de leucócitos em repouso ensaiados (ou seja, células T CD4+, células T CD8+, células B CD19+, monócitos CD14+, granulócitos e plaquetas) e também estava substancialmente ausente em células B activadas e monócitos. Também se verificou que ACT-4-h-l se encontrava substancialmente ausente na maioria das linhas celulares tumorais ensaiadas. No entanto, as linhas celulares Molt3, Raji e NC37 não apresentaram um nível baixo de expressão. 47 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ TABELA 1 ESPECIFICIDADE CELULAR DE EXPRESSÃO DE ACT-4-h-l

Expressão de ACT-4-h-l % células MCF1 Coloração com duas cores Células T CD4+ (em repouso) <2 <2 Células T CD4+ (activadas)2 80 25 Células T CD8+ (em repouso) <2 <2 Células T CD8+ (activadas) 10 4 Células B CD19+ (em repouso) <2 <2 Células B CD19+ (activadas) <2 <2 Monócitos CD14+ (em repouso) <2 <2 Monócitos CD14+ (activados) <2 <2 Coloração com uma cor PBL (em repouso) <2 3 PBL (activados) 50 27 CD4+ (em repouso) <2 <2 CD4+ (activadas) 80 22 CD8+ (em repouso) <2 <2 CD8+ (activadas) 4 2 Granulócitos <2 <2 Plaquetas Linhas tumorais <2 <2 Molt-4, CEM, Hut 78, H9, Jurkat <2 <2 HPB-ALL, Sezary, T-AU <2 <2 Molt-3 20 3 B-LCL, Arent, RML, JY, KHY, PGf <2 <2 MSAB, CESS, 9037, 9062 <2 <2 Dandi, Ramos, Namalwa <2 <2 Raji, NC37 30 4 U937, THP-1, HL-60 <2 <2 Kgla, K562, HEL <2 <2 1 MCF = Fluorescência de canal média 2 Células indicadas como "activadas" foram estimuladas com PHA durante cerca de três dias. Exemplo 3: Decorrer da expressão de ACT-4-h-l que responde a activação de células T CD4+

Ensaiaram-se células T CD4+ para expressão de receptores ACT-4-h-l em resposta a vários estímulos de activação. 48 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Purificaram-se células Τ CD4+ de células mononucleares de sangue periférico por imunoadsorção em fase sólida ("panning") . Cultivaram-se 5 x 104 células T CD4+ com um agente de activação em poços de microtitulação contendo meio RPMI suplementado com soro humano a 10%. Utilizaram-se três agentes de activação diferentes: (1) 5 x 104 monócitos irradiados (3000 rads), (2) PHA (1 pg/ml) e (3) toxóide de tétano (5 pg/ml). Adicionou-se 3H-timidina às culturas 12-16 h antes de recolha. Após recolha, ensaiaram-se as células para a expressão de antigénios de superfície celular por incubação com diferentes anticorpos marcados (L106, anti-CD4 e anti-CD8), tal como descrito por Engleman et ai, J. Immunol. 127:2124-2129 (1981). A figura 2 apresenta o aparecimento de ACT-4-h-l em reposta a activação com aloantigénio. Antes de activação, não se verificou qualquer expressão. A percentagem de células expressam o receptor ACT-4-h-l aumenta ao longo do tempo, com um máximo de cerca de 30% após cerca de sete dias de activação com aloantigénio. Os resultados também demonstram que essencialmente todas as células que expressam ACT-4-h-l também expressam o receptor CD4 e que essencialmente nenhuma destas células expressa o receptor CD8. A figura 3 apresenta dados semelhantes para o aparecimento de ACT-4-h-l em resposta a activação com toxóide de tétano. Uma vez mais, a percentagem de células que expressa ACT-4-h-l apresentou um máximo a cerca de sete dias. Contudo, nesta altura uma maior percentagem de células (cerca de 60%) expressavam o receptor. A figura 4 apresenta dados semelhantes para o aparecimento de ACT-4-h-l em células T CD4+ em resposta a activação com PHA. Neste caso, a percentagem de células T CD4+ que expressam o receptor apresenta um máximo de cerca de 65% após três dias de activação.

Conclui-se que ACT-4-h-l é um antigénio de activação de células T CD4+ que é expresso em resposta a diferentes estímulos de activação.

Exemplo 4: Clonagem de ADNc de ACT-4-h-l

Isolou-se o clone de ADNc para o receptor ACT-4-h-l utilizando um sistema de expressão de células COS ligeiramente 49 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ modificado, desenvolvido primeiramente por Aruffo e Seed, supra. Isolou-se ARN de linfócitos e sangue periférico humano activados com PHA durante 72 horas. Extraiu-se o ARN total com reagentes tri (Molecular Research Center) e isolou-se ARN de poli(A)+ por purificação com oligo dT-pérolas magnéticas (Promega). Sintetizou-se ADNc pelo método de Gubler e Hoffman, Gene 25:263-369 (1982) utilizando transcritase inversa

Superscript (Gibco/BRL) e um iniciador oligo dT. 0 ADNc com extremidades planas foi ligado a adaptadores Bstxi não auto-complementares e passaram-se sobre uma coluna de rotação Sephacryl S-400 para remover adaptador não ligado e fragmentos pequenos (<300 pares de bases) . O ADNc ligado foi então ligado para um vector de expressão eucariótico cortado com BstXI, pADNc-IRL, uma versão resistente a ampicilina de pADNc-l (Invitrogen). Os produtos precipitados e lavados da reacção de ligação foram sujeitos a electroporação para E. coli estirpe WM1100 (BioRad). O plaqueamento e contagem de uma aliquota das bactérias transformadas revelou uma contagem total de 2 milhões de clones independentes na biblioteca não amplificada. Determinou-se um tamanho de inserção médio de 1,2 kb. Amplificou-se o lote da biblioteca em cultura liquida, 250 ml de meio LB padrão. Recuperou-se o plasmideo por lise alcalina e purificou-se numa coluna de permuta iónica (Qiagen).

Transfectaram-se por electroporação células COS-7 sub-confluentes com o plasmideo de ADN purificado. Plaquearam-se as células em placas de 100 mm e deixaram-se crescer durante 48 horas. Recuperaram-se as células das placas com solução de PBS-EDTA, incubaram-se com anticorpo monoclonal L106 e sujeitaram-se a "panning" de acordo com procedimentos padrão. Um segundo ciclo de "panning" revelou enriquecimento, dado que adsorveram às placas numerosas células COS. Recuperou-se ADN epissómico das células imunosseleccionadas pelo método de Hirt e electroporaram-se para bactérias para amplificação.

As bactérias transformadas com plasmideo do segundo ciclo de preparação Hirt foram diluídas para pequenos conjuntos de cerca de 100 colónias. Amplificaram-se os conjuntos e o seu ADN foi purificado e ensaiado para a capacidade de conferir expressão do antigénio L106 em células COS-7 por imunofluorescência. Utilizou-se anticorpo L106 conjugado a ficoeritrina para corar monocamadas de células COS-7 e as 50 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ células foram então examinadas por microscopia de imunofluorescência manual. As minipreparações de ADN de quatro dos oito conjuntos foram positivas quando ensaiadas para expressão. O conjunto com a melhor expressão, conjunto E, foi dividido em conjuntos mais pequenos de “ 12 colónias. Três dos oito subconjuntos foram positivos e plaqueou-se o subconjunto Ei para permitir a análise de colónias simples. Verificou-se que o clone El-27 confere um alto nível de expressão de receptor ACT-4-h-l à superfície das células COS transfectadas.

Exemplo 5: Análise de sequência de ADNc A inserção do clone denominado El-27 foi subclonada para pBluescript e sequenciada pelo método de terminação de cadeia didesoxi, utilizando o kit de sequenciação de auto-leitura de polimerase T7 (Pharmacia) num sequenciador ALF (Pharmacia). O mapeamento de restrição revelou vários locais convenientes para subclonagem. Geraram-se cinco subclones em pBluescript e foram sequenciados em ambas as cadeias com iniciadores sentido M13 e universal.

As sequências de ADNc e de aminoácidos deduzidas de ACT-4-h-l apresentam-se na figura 5. A sequência de ADNc de ACT-4-h-l de 1 137 pares de bases contém uma região não traduzida a 5' de 14 pb e uma região não traduzida a 3' de 209 pb. Encontra-se presente um sinal de poliadenilação AATAAA na posição 1 041 seguido por uma cauda poli-A de 80 pb com início na posição 1 057. O quadro de leitura aberta mais longo inicia com o primeiro ATG na posição 15 e termina com um TGA na posição 846. A sequência de aminoácidos prevista é a de uma proteína membranar integral do tipo 1 típica. A análise de hidrofobicidade revela uma suposta sequência de sinalização após o ATG de iniciação, com uma pequena parte de resíduos básicos seguida por uma parte mais comprida de resíduos hidrófobos. Encontra-se presente um local de clivagem do péptido de sinalização no resíduo 22 ou 24 (sendo este último mais provável segundo os critérios de von Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690 (1986)), deixando uma proteína madura de 253 resíduos de aminoácidos (ou 255 aminoácidos, caso a clivagem ocorra no local menos provável). A análise de hidrofobicidade revela também uma parte grande única de 27 resíduos hidrófobos que se prevê ser o domínio 51 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ transmembranar, que prevê um domínio extracelular de 189 (ou 191) aminoácidos e um domínio intracelular de 37 aminoácidos. 0 domínio extracelular é rico em cisteína, em que se encontram 18 cisteínas na parte de 135 aminoácidos. A massa molecular (Mr) prevista para a proteína madura é de 27 400 e existem dois locais de glicosilação em N potenciais nos resíduos de aminoácidos 146 e 160. A comparação da sequência de aminoácidos de ACT-4-h-l com sequências conhecidas da base de dados Swiss-prot utilizando o programa BLAZE revela uma similaridade de sequência com membros da superfamília de receptores de factor de crescimento de nervos. As sequências de aminoácidos são pelo menos 20% idênticas para NGF-R, TNF-R, CD40, 41-BB e fas/APO-1 e 62% para OX-40, permitindo falhas e deleções. Os alinhamentos das diferentes várias proteínas revelaram a conservação de múltiplos motivos ricos em cisteína. Três destes motivos encontram-se presentes em ACT-4-h-l e OX-40, comparativamente com quatro destes motivos em NGF-R e CD40.

A comparação da sequência de nucleótidos de ACT-4-h-l com sequências conhecidas das bases de dados Genbank e EMBL utilizando os programas BLAST e FASTDB revelou um elevado grau de similaridade de sequência com apenas um membro da família de receptores de factor de crescimento de nervos, OX-40. Permitindo falhas e inserções, a identidade de sequência é de 66%. A comparação das sequências de nucleótidos de ACT-4-h-l e OX-40 revela que ambas contêm uma região não traduzida a 5' de 14 pb e ambas contêm caudas de poli A de aproximadamente 80 pb. Contudo, em ACT-4-h-l há uma ligeira extensão da região não traduzida a 3' de 187 pb para 209 pb e há uma extensão da região de codificação de 816 pb para 834 pb, uma diferença de 18 pb ou inserções de 6 aminoácidos. O alinhamento das duas sequências de aminoácidos revela que quatro das inserções de aminoácidos ocorrem antes do local de clivagem da sequência de sinalização. Assim, a proteína de receptor ACT-4-h-l madura contém mais um resíduo de aminoácido do que OX-40 (ou seja 253 contra 252 aminoácidos). Notoriamente, a sequência de nucleótidos de ACT-4-h-l é muito mais rica em GC do que a sequência de OX-40 (70% contra 55%) indicando que as duas sequências não hibridarão em condições rigorosas. 52 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Exemplo 6: Produção de produtos de transfecção de ACT-4-h-l estáveis

Excisou-se um fragmento Xbal-Hindlll da construção descrita no exemplo 4 e inseriu-se em pADNc-I-neo (Invitrogen) digerido com Xbal/Hindlll para gerar um vector de expressão denominado ACT-4-h-l-neo (figura 6) . Este vector foi linearizado com Sfl e electroporado para três linhas celulares eucarióticas. Estas linhas celulares foram SP2/0 (um mieloma de ratinho derivado da estirpe Balb/c), Jurkat (uma linha de células T humanas transformada) e COS-7 (uma linha celular de aderente macaco). Após um período de recuperação de 48 h, seleccionaram-se células transformadas em G418 (Gibco) a 1 mg/ml. Após três semanas de selecção, incubaram-se linhas celulares resistentes a neo com uma concentração de anticorpo L106 saturante, lavaram-se e sobrepuseram-se em placas de Petri de 100 mm revestidas com IgG de cabra anti-ratinho para seleccionar células que expressam ACT-4-h-l. Após lavagem para remover células não ligadas, recuperaram-se as células aderentes e expandiram-se em cultura de tecidos. Sujeitaram-se as linhas celulares a dois ciclos adicionais de "panning" e expressão. Demonstrou-se por coloração de imunofluorescência directa que as linhas celulares resultantes expressam STAN-4-h-l abundantemente (figura 7).

Exemplo 7: Produção de uma proteína de fusão ACT-4-h-l-imunoglobulina

Construiu-se uma proteína de fusão solúvel na qual o domínio extracelular de ACT-4-h-l se encontra ligado através do seu terminal C ao terminal N do domínio constante de uma imunoglobulina humana. Clivou-se o vector que codifica ACT-4-h-l descrito no exemplo 4 com Smal e Notl para excisar todas as sequências ACT-4-h-l a jusante do local Smal, incluindo as regiões transmembranar, citoplasmática e não traduzida a 3'. A região remanescente codifica a parte solúvel extracelular de ACT-4-h-l (figura 8). A fonte da região constante de imunoglobulina a ser ligada ao domínio extracelular de ACT-4-h-l foi um plasmídeo denominado 5K-4lBB-Egl (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89: 10360-10364). Este plasmídeo contém um fragmento genómico de 1,3 kb de BamHl/Eagl que codifica os domínios de dobra, CH2 e CH3 53 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ terminal de Ig humana, isotipo gama 1. O fragmento necessitou de modificação para inserção nas extremidades Smal/Notl do vector ACT-4-h-l, embora preservando o quadro de leitura do péptido ao longo da junção Smai a ser formada por ligação de extremidades planas. 0 vector 5k-41BB-Egl foi cortado com BamHl e as extensões 5' resultantes foram preenchidas com fragmento de Klenow. 0 vector foi então cortado com Eagl libertando o fragmento de 1,3 kb com extremidades plana e Notl compatíveis. Este fragmento foi ligado a vector ACT-4-h-l digerido com Smal/Notl. A mistura de ligação foi electroporada para E. coli e rastrearam-se vários clones produtos de transformação por PCR, utilizando fragmentos de nucleótidos de ACT-4-h-l e IgGl como iniciadores.

Os plasmídeos contendo a codificação de ACT-4-h-l-IgGl foram electroporados para células COS. Deixaram-se as células crescer durante cinco dias, altura em que se recolheram os seus sobrenadantes e esterilizaram-se por filtração através de uma membrana de 0,2 micra. Ensaiaram-se os sobrenadantes quanto a expressão de ACT-4-h-l-IgGl por "dot blotting". Transferiram-se os sobrenadantes para nitrocelulose e bloquearam-se com leite em pó magro a 5%. Sondaram-se transferências réplica com anticorpo L106 ou imunoglobulina IgG de cabra anti-humano marcada com fosfatase alcalina (American Qualex). Detectou-se anticorpo L106 com uma IgG de cabra anti-ratinho marcada com fosfatase alcalina. Utilizou-se NBT/BCIP (Pierce) como um substrato colorimétrico.

Sequenciaram-se clones positivos com elevada produção no local de junção para confirmar a construção correcta do vector. O gene de fusão resultante apresenta-se na figura 9.

Com o objectivo de clarificar e melhor compreensão, o invento foi descrito nestes exemplos e na revelação supra com algum detalhe. No entanto, será óbvio que podem ser praticadas determinadas alterações e modificações dentro do âmbito das reivindicações anexas. No contexto deste fascículo e das reivindicações anexas, quando o contexto assim o admitir, um material "isolado" significa um material apresentando qualquer uma ou várias das seguintes características, que (a) tenha sido purificado e/ou (b) se encontre suficientemente isento de impureza contaminante para permitir que seja utilizado para pelo menos um objectivo dentro do âmbito de qualquer um ou mais dos objectivos aqui mencionados e/ou (c) seja um material 54 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ de origem natural ou um material de estrutura idêntica a um material de origem natural, que se encontra substancialmente isento ou foi tornado isento de pelo menos um dos principais componentes naturais que o acompanham na sua forma natural ou com o qual se encontra naturalmente associado ou misturado, por exemplo isento ou tornado isento de todas ou substancialmente todas tais componentes acompanhantes naturais e/ou (d) se encontra na forma de uma composição incluindo um material de qualquer das caracteristicas anteriores conjuntamente com material(is) adicional(is) da natureza de um excipiente, diluente, veiculo química ou biológica ou farmaceuticamente definidos ou outro material de carácter aceitável para pelo menos um objectivo dentro do âmbito de um ou mais dos objectivos aqui mencionados. A presente revelação de materiais inclui revelação de tais materiais em forma isolada e a presente revelação inclui o teor da descrição anterior, esquemas e reivindicações anexas e modificações e variações e combinações e subcombinações das caracteristicas aqui mencionadas como será aparente aos peritos na arte.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: The Board of Trustees of The Leland Stanford Júnior University (B) RUA: 900 Welch Road, Suite 350 (C) CIDADE: Paio Alto (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94304-1850 (A) NOME: Becton Dickinson & Company (B) RUA: One Becton Drive (C) CIDADE: Franklin Lakes (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 07417-1880 (A) NOME: Wayne Godfrey (B) RUA: 18000 Skyline Boulevard (C) CIDADE: Woodside (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94062 55 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ (A) NOME: David Buck (B) RUA: 1 Johnston Píer, Box (C) CIDADE: Half Moon Bay (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 94019 (A) NOME: Edgar G. Engleman (B) RUA: 60 Lane Place (C) CIDADE: Atherton (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94027

DE CÉLULAS T

(ii) TÍTULO DO INVENTO: RECEPTOR NA SUPERFÍCIE CD4+ ACTIVADAS: ACT-4 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMATO LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete, 3,5 polegadas

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC de IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) UTILITÁRIO: Patentln (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/147 784 (B) DATA DE SUBMISSÃO: 03-NOV-1993 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1057 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 15..845 CDNA " (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /standard_name= "ACT-4 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mise_signal (B) LOCALIZAÇÃO: 15.. 86 56 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: CAGCAGAGAC GAGO ATG ICC CTG GGG GCT CGG CGC CTG GGC CGC GGG CCG 50

Met Cye Vai Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro 1 5 10 TGT GCG GCT CTG CTC CTC CTG GGC CTG GGG CTG AGC ACC GTG ACC GGG 98

Cys Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Vai Thr Gly 15 20 25 CTC CAC TGT GTC GGG GAC ACC TAC CCC AGC AAC GAC CGG TGC TGC CAC 146 Leu Hls Cys Vai Gly Aep Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 30 35 40 GAG TGC AGG CCA GGC AAC GGG ATG GTG AGC CGC TGC AGC CGC TCC CAG 194 Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Het Vai Ser Arg Cys Ser Arg Ser cln 45 50 55 60 AAC ACG GTG TGC CGT CCG TGC GGG CCG GGC TTC TAC AAC GAC GTG GTC 242 Asn Thr Vai Cys Arg Pro Cye Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Aep Vai Vai 65 70 75 AGC TCC AAG CCG TGC AAG CCC TGC ACG TGG TGT AAC CTC AGA AGT GGG 290 Ser Ser Lye Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly 80 85 90 AGT GAG CGG AAG CAG CTG TGC ACG GCC ACA CAG GAC ACA GTC TGC CGC 338 Ser Glu Arg Lys Gin Leu Cye Thr Ala Thr Gin Asp Thr Vai Cys Arg 95 100 105 TGC CGG GCG GGC ACC CAG CCC CTC GAC AGC TAC AAG CCT GGA GTT GAC 386 Cys Arg Ala Gly Thr Gin Pro Leu Asp ser Tyr Lys Pro Gly Vai Asp 110 115 120 TGT GCC CCC TGC CCT CCA GGG CAC TTC TCC CCA GGC GAC AAC CAG GCC 434 Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gin Ala 125 130 135 140 TGC AAG CCC TGG ACC AAC TGC ACC TTG GCT GGG AAG CAC ACC CTG CAG 482 Cys Lye Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gin 145 150 155 CCG GCC AGC AAT AGC TCG GAC GCA ATC TGT GAG GAC AGG GAC CCC CCA 530 Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro 160 165 170 GCC ACG CAG CCC CAG GAG ACC CAG GGC CCC CCG GCC AGG CCC ATC ACT 578 Ala Thr Gin Pro Gin Glu Thr Gin Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr 175 180 185 GTC CAG CCC ACT GAA GCC TGG CCC AGA ACC TCA CAG GGA CCC TCC ACC 626 Vai Gin Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gin Gly Pro Ser Thr 190 195 200 57 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ CGG ccc GTG GAG GTC CCC GGG GGC CGT GCG GTT GCC GCC ATC CTG GGC 674 Arg Pro val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly 205 210 215 220 CTG GGC CTG GTG CTG GGG CTG CTG GGC CCC CTG GCC ATC CTG CTG GCC 722 Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala 225 230 235 CTG TAC CTG CTC CGG AGG GAC CAG AGG CTG CCC CCC GAT GCC CAC AAG 770 Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Aep Gin Arg Leu Pro Pro Aep Ala Kie Lye 240 245 250 CCC CCT GGG GGA GGC AGT TTC CGG ACC CCC ATC CAA GAG GAG CAG GCC 818 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gin Glu Glu Gin Ala 255 260 265 GAC CCC ’.AC TCC ACC CTG GCC AAO ATC TGACCTGGGC CCACCAAGGT 865 Aep KL· .a ser *7 ·» Leu Ala Lye Ile 2' 275 GGACGÍ»GGG CCCCG.-ÍAGG CTGGAGCCCG GAGGGTCTCC ' /3GCGAGCA GGGCAGGTSC 925 AGGCCGCCTG CCCCGCCACG CTCCTGGGCC AACTCTGCAC CGTTCTAGGT GCCGATGGCT 985 GCCTCCGGCT CTCTGCTTAC GTATGCCATG CATACCTCCT GCCCCGCGGG ACCACAATAA 1045 AAACCTTGGC AG 1057 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 277 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Cye Vai Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cye Ala Ala Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Vai Thr Gly Leu Kle Cye Vai 20 25 30 58 ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ

Gly Aep Thr Tyr Pro Ser Aen Aep Arg Cys Cya Hie Glu Cye Arg Pro 35 40 45

Gly Aen Gly Met Vai Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gin Aen Thr Vai Cye 50 55 60

Arg Pro Cye Gly Pro Gly Phe Tyr Aen Aep Vai Vai Ser Ser Lye Pro 65 70 75 80

Cye Lye Pro Cye Thr Trp Cye Aen Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lye 85 90 95

Gin Leu Cye Thr Ala Thr Gin Aep Thr Vai Cye Arg Cye Arg Ala Gly 100 105 110

Thr Gin Pro Leu Aep Ser Tyr Lye Pro Gly Vai Aep Cye Ala Pro Cye 115 120 125

Pro Pro Gly Hie Phe Ser Pro Gly Aep Aen Gin Ala Cye Lye Pro Trp 130 135 140

Thr Aen Cye Thr Leu Ala Gly Lye Hie Thr Leu Gin Pro Ala Ser Aen 145 ISO 155 160

Ser Ser Aep Ala Ile Cye Glu Aep Arg Aep Pro Pro Ala Thr Gin Pro 165 170 175

Gin Glu Thr Gin Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Vai Gin Pro Thr 180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gin Gly Pro Ser Thr Arg Pro Vai Glu 195 200 205

Vai Pro Gly Gly Arg Ala Vai Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Vai 210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240

Arg Arg Aep Gin Arg Leu Pro Pro Aep Ala Hie Lye Pro Pro Gly Gly 245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gin Glu Glu Gin Ala Aep Ala Hie Ser 260 265 270

Thr Leu Ala Lye Ile 275

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido receptor ACT-4 isolado, que inclui ou consiste em (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) uma variante relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 desde que essa variante apresente pelo menos setenta porcento de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e compita com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 pela ligação específica a um anticorpo; ou (c) um fragmento de um polipéptido tal como definido em (a) ou (b) supra, que tenha pelo menos cinco aminoácidos contíguos de comprimento e compita com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 pela ligação específica a um anticorpo.
2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, que inclui ou consiste em (a) a sequência de aminoácidos do dominio extracelular de SEQ ID NO: 2; (b) uma variante relativamente à sequência de aminoácidos do domínio extracelular de SEQ ID NO:2 desde que essa variante apresente pelo menos setenta porcento de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do dominio extracelular de SEQ ID NO: 2 e compita com o domínio extracelular de SEQ ID NO: 2 pela ligação especifica a um anticorpo, ou (c) um fragmento de um polipéptido tal como definido em (a) ou (b) supra, que tenha pelo menos cinco aminoácidos contíguos de comprimento e compita com o dominio extracelular de SEQ ID NO:2 pela ligação especifica a um anticorpo.
3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o referido polipéptido apresenta pelo menos uma das seguintes características, que (a) inclua ou consista num domínio seleccionado de um ou mais dos domínios seguintes: consistindo numa sequência de ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 2/7 sinalização, um dominio intracelular, um dominio transmembranar ou um dominio extracelular; (b) apresente um dominio extracelular com uma ou mais ansas intracadeia formadas por ligação de dissulfureto de dois residuos de cisteína; (c) seja um polipéptido de ocorrência natural de origem humana; (d) seja um polipéptido de ocorrência natural de um tipo presente à superfície de células T CD4+ activadas e esteja substancialmente ausente em células T CD8+ activadas e células T em repouso; (e) seja um polipéptido com um peso molecular de cerca de 50 kDa antes de desglicosilação e cerca de 27 kDa após desglicosilação; (f) seja um polipéptido que é solúvel; (g) seja um polipéptido que é capaz de se ligar especificamente a um ligando ACT-4; (h) faça parte de um produto de globulina recombinante; e/ou (i) faça parte de um produto de polipéptido de fusão.
4. Polipéptido de acordo com a reivindicação 2, em que o referido polipéptido faz parte de um polipéptido de fusão e está fundido a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina para formar um produto de fusão de globulina recombinante.
5. Utilização do polipéptido da reivindicação 1 ou 2, num processo seleccionado de: (a) rastreio de um anticorpo quanto a ligação especifica ao mesmo epitopo que é ligado por um anticorpo L106, incluindo as etapas de: proporcionar uma solução incluindo um anticorpo a rastrear, o referido anticorpo L106 e um polipéptido receptor ACT-4-h-l, em que o referido polipéptido se liga especificamente ao referido anticorpo L106; e medir a ligação especifica entre o referido polipéptido e o referido anticorpo L106, ou entre o referido polipéptido e o referido anticorpo a rastrear, para indicar se o referido anticorpo a rastrear reage com o mesmo epitopo que o referido anticorpo L106, ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 3/7 e em que ο anticorpo L106 é produzido pelo hibridoma a que foi atribuído o n° de acesso ATCC HB 11483 em American Type Tissue Culture Collection depositado em Rockville, Maryland, EUA; (b) localização de um epítopo ligado especificamente por um anticorpo anti-polipéptido receptor ACT-4, incluindo as etapas de: proporcionar uma família de fragmentos contendo diferentes segmentos de aminoácidos de uma sequência de polipéptido receptor ACT-4, em que cada um dos referidos fragmentos inclui pelo menos quatro aminoácidos contíguos e em que colectivamente a referida família de fragmentos abrange a maior parte ou toda a sequência de aminoácidos do polipéptido receptor ACT-4; e medir a ligação específica entre o referido fragmento e o anticorpo para delinear a sequência de aminoácidos do epítopo reconhecido pelo anticorpo; (c) rastreio de agentes imunossupressores, incluindo as etapas de: pôr em contacto um polipéptido receptor ACT-4-h-l [ (por exemplo, imobilizado numa superfície sólida)] com um potencial agente imunossupressor; e detectar a ligação específica entre o referido polipéptido receptor ACT-4-h-l e o referido agente, em que a referida ligação específica é indicativa de actividade imunossupressora; (d) rastreio de um ligando de ACT-4, incluindo as etapas de: pôr em contacto uma amostra biológica a rastrear quanto ao ligando de ACT-4 com um polipéptido receptor ACT-4; seguidamente purificar o ligando de ACT-4 por isolamento de um complexo formado entre o referido ligando e o referido polipéptido receptor ACT-4; e dissociar o referido complexo para obter o referido ligando; e (e) ensaio de uma amostra com o objectivo de detectar um parceiro de ligação específica do polipéptido receptor ACT-4-h-l, processo esse que inclui pôr em contacto uma amostra a ensaiar com polipéptido receptor ACT-4-h-l marcado directa ou indirectamente e detectar a ligação específica entre o parceiro de ligação específica e o polipéptido receptor ACT-4-h-l, caso se encontre presente na amostra a ensaiar, revelando assim a presença de tal substância na amostra. ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 4/7
6. Anticorpo isolado ou seu fragmento que se liga especificamente a um polipéptido receptor ACT-4 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
7. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 6, que se liga especificamente ao polipéptido receptor ACT-4-h-l da reivindicação 1 ou 2.
8. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, em que o referido anticorpo é monoclonal ou humanizado.
9. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 8, em que o referido anticorpo ou seu fragmento pode (i) competir com anticorpo L106 pela ligação específica ao polipéptido receptor ACT-4-h-l da reivindicação 1 ou 2; e/ou (ii) ligar-se especificamente a células T CD4+ activadas e/ou (iii) ligar-se especificamente a um epítopo diferente no polipéptido receptor ACT-4-h-l da reivindicação 1 ou 2, do que é ligado especificamente pelo anticorpo L106, e em que o anticorpo L106 é produzido pelo hibridoma a que foi atribuído o n° de acesso ATCC HB 11483 em American Type Tissue Culture Collection depositado em Rockville, Maryland, EUA.
10. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7, 8 ou 9, em que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo está acoplado a uma toxina.
11. Anticorpo humanizado ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7, 8, 9 ou 10, em que o referido anticorpo ou seu fragmento inclui uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada.
12. Anticorpo humanizado ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 11, em que (i) a cadeia leve humanizada inclui três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) com sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade correspondentes de uma cadeia leve ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 5/7 de anticorpo L106, e com uma sequência de esqueleto de região variável substancialmente idêntica a uma sequência de esqueleto de região variável de cadeia leve humana; ou (ii) a cadeia pesada humanizada inclui três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) com sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade correspondentes de uma cadeia pesada de anticorpo L106, e com uma sequência de esqueleto de região variável substancialmente idêntica a uma sequência de esqueleto de região variável de cadeia pesada humana; e/ou (iii) o anticorpo humanizado liga-se especificamente a um polipéptido receptor ACT-4-h-l com uma afinidade de ligação que é cerca de três vezes a afinidade de ligação do anticorpo L106, e em que o anticorpo L106 é produzido pelo hibridoma ao qual foi atribuído o n° de acesso ATCC. HB 11483 em American Type Tissue Culture Collection depositado em Rockville, Maryland, EUA.
13. Composição farmacêutica incluindo (i) um polipéptido receptor ACT-4, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4; ou (ii) um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, conjuntamente com um veículo, excipiente e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
14. Utilização de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, para detectar e/ou quantificar, numa amostra obtida de um doente, a presença de células T CD4+ activadas, em que a presença ou quantidade de expressão de polipéptido receptor ACT-4 em células T CD4+ presentes na referida amostra é indicativa de células T CD4+ no referido doente, o que representa o diagnóstico de uma doença ou condição do sistema imunitário.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a detecção ou quantificação de células T CD4+ é efectuada numa amostra celular obtida do referido doente através das seguintes etapas: (i) marcar directa ou indirectamente o referido anticorpo; ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 6/7 (ii) expor a amostra ao referido anticorpo da etapa (i); e (iii) determinar a quantidade de ligação especifica do referido anticorpo marcado aos polipéptidos receptores ACT-4 presentes nas células T CD4+ na referida amostra.
16. Polipéptido receptor ACT-4, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4, para utilização em medicina.
17. Utilização de (i) um polipéptido receptor ACT-4 de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4; ou (ii) um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, na preparação de um medicamento para utilização na profilaxia e/ou tratamento de doenças e condições do sistema imunitário.
18. Utilização de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, na preparação de um medicamento para utilização na supressão de uma resposta imunitária num doente que necessite de tal.
19. Utilização de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, na preparação de um medicamento para utilização no aumento de uma resposta imunitária contra um antigénio seleccionado num doente que necessite de tal.
20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 ou 19, em que as doenças e condições do sistema imunitário são seleccionadas entre rejeição de transplante, doença do enxerto-versus-hospedeiro, uma doença auto-imune, uma doença inflamatória e doenças e condições resultantes de agentes infecciosos.
21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que a doença auto-imune é seleccionada entre: esclerose múltipla, artrite reumatóide e lúpus eritematoso.
22. Fragmento de ácido nucleico que inclui ou consiste em uma sequência que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2. ΕΡ Ο 726 952 /ΡΤ 7/7
23. Fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22, em que o referido fragmento de ácido nucleico é (a) a sequência de ADN de SEQ ID N0:1 ou o seu equivalente de ARN; (b) uma sequência que apresenta pelo menos setenta porcento de identidade de sequência com a de (a); ou (c) é uma sequência que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 4.
24. Vector de expressão incluindo um fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22.
25. Linha celular que é transformada ou transfectada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 24. Lisboa,