ES2281072T3 - Receptor de superficie de celulas t activadas: acts-4. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA POLIPEPTIDOS PURIFICADOS DEL RECEPTOR ACT-4, ANTICUERPOS CONTRA ESTOS POLIPEPTIDOS Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS RECEPTORES ACT-4. TAMBIEN SE SUMINISTRAN METODOS DE DIAGNOSIS Y DE TRATAMIENTO QUE UTILIZAN LOS MISMOS. LOS RECEPTORES ACT-4 SE EXPRESAN PREFERENCIALMENTE SOBRE LA SUPERFICIE DE CELULAS T CD4{SUP,+} ACTIVADAS. LOS RECEPTORES ACT-4 SON HABITUALMENTE EXPRESADOS A BAJOS NIVELES SOBRE LA SUPERFICIE DE CELULAS CD8{SUP,+} ACTIVADAS, Y ESTAN SUBSTANCIALMENTE AUSENTES SOBRE LAS CELULAS T RESTANTES Y SOBRE LOS MONOCITOS Y LAS CELULAS B. UN RECEPTOR ACT-4 EJEMPLAR, DENOMINADO ACT-4-H-1, TIENE UNA SECUENCIA DE SEÑAL, UN DOMINIO EXTRACELULAR QUE COMPRENDE TRES BUCLES INTRACADENA UNIDOS POR DISULFURO, UN DOMINIO DE TRANSMEMBRANA Y UN DOMINIO INTRACELULAR.
Description
Receptor de superficie de células T activadas:
ACTS-4.
Esta invención se refiere de manera general al
aislamiento y caracterización de receptores de superficie celular,
denominado ACT-4, y a anticuerpos para los mismos,
y el uso del antígeno y anticuerpos para el seguimiento y/o
modulación de respuestas inmunes.
Las respuestas inmunes están principalmente
mediadas por una colección diversa de células sanguíneas
periféricas denominadas leucocitos. Los leucocitos incluyen
linfocitos, granulocitos y monocitos. Los granulocitos se
subdividen, además, en neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Los
linfocitos se subdividen además en linfocitos T y B. Los linfocitos
T se originan a partir de células madre linfocíticas comprometidas
del embrión. La diferenciación tiene lugar en el timo y procede a
través de los estados intermedios de protimocito, timocito
corticoide y de timocitos medular, para producir diversos tipos de
células T maduras. Estos subtipos incluyen células T CD8^{+}
(también conocidas como células T citotóxicas/supresoras), las
cuales, cuando se activan, tienen la capacidad de lisar células
diana y las células T CD4^{+} (también conocidas como células T
auxiliares y células T inductoras), las cuales cuando se activan
tienen la capacidad de estimular otros tipos celulares del sistema
inmune.
Las respuestas del sistema inmune están
provocadas en varias situaciones diferenciadas. La respuesta más
frecuente es como protección deseable contra microorganismos
infecciosos. Sin embargo, la respuesta inmune indeseada puede tener
lugar después del transplante de un tejido extraño o en una
enfermedad autoinmune en la que uno de los antígenos propios del
cuerpo es diana de la respuesta inmune. Las respuestas inmunes
también se pueden iniciar in vitro mediante mitógenos o
anticuerpos contra determinados receptores. En cada una de estas
situaciones, se transduce una respuesta inmune a partir de un
acontecimiento de estimulación mediante interacción compleja de
tipos de células leucocitarias. Sin embargo, los tipos y naturaleza
de las células que participan en la interacción entre tipos
celulares pueden variar en diferentes acontecimientos de
estimulación. Por ejemplo, se transducen a menudo respuestas inmunes
contra la invasión de bacterias mediante la formación de complejos
entre un receptor de clase MHC II y un antígeno antibacteriano el
cual activa a continuación células T CD4+. Al contrario, respuestas
inmunes contra infecciones víricas se transducen principalmente
mediante la formación de complejos MHC clase I/antígeno vírico y la
subsiguiente activación de células CD8+.
Durante los últimos años, se han identificado
muchos antígenos de superficie celular para leucocitos, algunos de
los cuales han mostrado tener una función en la transducción de
señal. Se ha encontrado que las señales se pueden transducir entre
un receptor de superficie celular y cualquier ligando soluble o un
ligando unido a superficie celular. Las secuencias de aminoácidos
de moléculas de superficie de leucocitos comprenden una serie de
secuencias o motivos recurrentes característicos. Estos motivos se
ha predicho que están relacionados en evolución, tienen patrones de
plegamiento similares y median tipos similares de interacciones. Se
han descrito una serie de superfamilias, incluyendo las
superfamilias de receptores de inmunoglobulina y factor de
crecimiento neuronal. Miembros de la familia de receptores de
factores de crecimiento neuronal incluyen NGFR, encontrado en
células neuronales; el antígeno de célula B CD40; el antígeno de
rata OX-40, encontrado en células CD4+ activadas
(Mallet et al., EMBO J. 9: 1063-1068 (1990)
(incorporado en el presente documento por referencia a todos los
propósitos); dos receptores del factor de necrosis tumoral (TNF),
LTNFR-1 y TNFR-II, encontrados en
una variedad de tipos celulares; 4-1 BB encontrado
en células T; SFV-T2, un marco de lectura abierto en
el virus del fibroma de Shope; y posiblemente fas, CD27 y CD30.
Véase de manera general Mallet y Barclay, Immunology Today
12:220-222 (1990) (incorporado en el presente
documento por referencia para todos los propósitos).
Godfrey et al., Tissue Antigen, Resumen
nº AA057, describe un procedimiento de clonación molecular de un
ADNc que codifica un homólogo humano del antígeno de rata OX40. El
resumen no proporciona la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos
de este homólogo humano.
La identificación de receptores de superficie
celular ha sugerido nuevos agentes para la supresión de respuestas
inmunes indeseables tales como el rechazo a un transplante,
enfermedades autoinmunes e inflamación. Agentes, en particular
anticuerpos, que bloquean receptores de células inmunes de la unión
a moléculas solubles o receptores unidos a células pueden conferir
respuestas inmunes. Idealmente, un agente debería bloquear sólo las
respuestas inmunes indeseadas (p.e., el rechazo a transplante)
mientras deje una capacidad residual para provocar respuestas
deseables (p.e., que responden a microorganismos patogénicos). La
acción inmunosupresora de algunos agentes, por ejemplo, anticuerpos
contra el receptor de CD3 y el receptor de IL-2 ya
han sido probados en ensayos clínicos. A pesar de que algunos
ensayos han mostrado resultados esperanzadores, quedan problemas
significativos. Primero, un paciente puede desarrollar una
respuesta inmune hacia el agente bloqueante, previniendo los
efectos inmunosupresores continuados a no ser que se dispongan de
otros agentes. En segundo lugar, las células que expresan el
antígeno diana pueden ser capaces de adaptarse a la presencia del
agente bloqueante cesando la expresión del antígeno mientras se
retengan las funciones inmunes. En esta situación, el tratamiento
continuado con un único agente inmunosupresor es insuficiente.
Tercero, muchas dianas de agentes terapéuticos están localizadas en
más de un subtipo de leucocito, con el resultado de que
generalmente no es posible bloquear o eliminar de manera selectiva
la respuesta de solo subtipos celulares específicos y, por lo tanto,
dejando inalterada la capacidad inmune residual para combatir
microorganismos infecciosos.
En base a lo anterior, es evidente que existe la
necesidad de agentes adicionales y mejores capaces de suprimir
respuestas inmunes, en particular, agentes capaces de la supresión
selectiva. La presente invención satisface estas y otras
necesidades, en parte, proporcionando un receptor celular
localizado en linfocitos T CD4+ humanos activados.
En una realización de la invención, se
proporcionan los polipéptidos del receptor ACT-4
aislados según se indican en la reivindicación 1. La secuencia de
aminoácidos de dicho polipéptido, denominado
ACT-4-h-1, se
muestra en Fig. 5. Los polipéptidos del receptor
ACT-4 exhiben, típicamente, al menos un 80% de
identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia de aminoácidos
de ACT-4-h-1. Los
polipéptidos comprenden habitualmente al menos uno y algunas veces
todos los dominios siguientes: una secuencia señal, un dominio
intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular.
Muchos polipéptidos se caracterizan por su presencia en células T
CD4+ activadas y su ausencia sustancial en células T en reposo.
Algunos polipéptidos de longitud completa tienen un peso molecular
de aproximadamente 50 kDa antes de la desglicosilación y
aproximadamente 27 kDa después de esta.
Los dominios extracelulares de los polipéptidos
del receptor ACT-4 comprenden típicamente al menos
un bucle de disulfuro unido y algunas veces tres de dichos bucles.
Los dominios extracelulares son habitualmente solubles y capaces de
unirse específicamente a un ligando de ACT-4.
Algunas veces, se fusiona un dominio extracelular a un segundo
polipéptido tal como una región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina. Algunos dominios extracelulares consisten
esencialmente en un epítopo unido de manera específica por un
anticuerpo designado como L106.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
anticuerpos que se unen de manera específica a un polipéptido del
receptor ACT-4-h-1.
Los anticuerpos son habitualmente anticuerpos monoclonales. Un
ejemplo de dicho anticuerpo se designa como L106. Algunos
anticuerpos inhiben la activación de células T CD4+, mientras que
otros anticuerpos estimulan la activación de estas células. Algunos
anticuerpos compiten con el anticuerpo L106 para la unión
específica aun polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 y la
mayoría de estos anticuerpos también compiten con L106 para la unión
específica a células T CD4+ activadas. Otros anticuerpos se unen
específicamente a un epítopo diferente que el unido mediante el
anticuerpo L106. También se proporcionan fragmentos del anticuerpo
L106 que se une específicamente a un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1.
También se proporcionan anticuerpos humanizados
que comprenden una cadena pesada humanizada y una cadena ligera
humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones de
determinación de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen
secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones de
determinación de complementariedad de una cadena ligera del
anticuerpo L106 y que tienen una secuencia del esqueleto de una
región variable sustancialmente idéntica a una secuencia del
esqueleto de una región variable de la cadena ligera humana. La
cadena pesada humanizada comprende tres regiones de determinación
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos de las correspondientes regiones de determinación de
complementariedad de una cadena pesada del anticuerpo L106 y que
tiene una secuencia en el esqueleto de la región variable
sustancialmente idéntica a una secuencia del esqueleto de la región
variable de la cadena pesada humana. Los anticuerpos humanizados se
unen específicamente a un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 con una
afinidad de unión que es de tres veces la afinidad de unión del
anticuerpo L106.
En otro aspecto, la invención proporciona
fragmentos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del
receptor ACT-4 discutidos supra. Un ejemplo
de dicho fragmento de ácido nucleico comprende la secuencia
nucleotídica que codifica el receptor
ACT-4-h-1 mostrada
en Fig. 5. Los fragmentos de ácido nucleico exhiben típicamente al
menos un ochenta por ciento de identidad de secuencia con la
secuencia de ácido nucleico de Fig. 5.
Las líneas de células aisladas pueden contener
los fragmentos de ácido nucleico discutidos supra. Las
líneas celulares habitualmente expresan un polipéptido del receptor
ACT-4 en su superficie celular. Algunas de las
líneas celulares son estables cuando el fragmento de ácido nucleico
se incorpora en el genoma de la línea celular.
En procedimientos de cribado de agentes
inmunosupresores, se pone en contacto un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 con un
agente inmunosupresor en potencia. Se detecta a continuación la
unión específica entre el polipéptido o fragmento del receptor
ACT-4-h-1 y el
agente. La existencia de unión específica es indicativa de
actividad inmunosupresora.
En procedimientos de cribado de un ligando de
ACT-4-h-1, se pone
en contacto una muestra biológica que contiene el ligando de
ACT-4 con un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1. Se forma
un complejo entre el ligando y el polipéptido del receptor
ACT-4-h-1. El
complejo se disocia a continuación para obtener el ligando.
En procedimientos de supresión de una respuesta
inmune en un paciente que sufre de una enfermedad o trastorno
inmune, se administra al paciente una dosis terapéuticamente
efectiva de una composición farmacéutica. La composición
farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente activo y un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido
del receptor
ACT-4-h-1.
También se proporcionan procedimientos de
detección de células T CD4+ activadas. Se pone en contacto una
muestra de tejido procedente de un paciente con un anticuerpo
monoclonal que se une específicamente a un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1. Se
detecta la unión específica entre el anticuerpo monoclonal y la
muestra de tejido. La existencia de unión específica revela la
presencia de células T CD4+ activadas. La presencia de células T
CD4+ activadas es a menudo diagnóstica de una enfermedad o
trastorno del sistema inmune.
También se proporcionan procedimientos de
inducción de una respuesta inmune a un antígeno seleccionado. Se
administra un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un
polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 y que
estimula la activación de CD4+. Células T se administra a un
paciente. El paciente se expone al antígeno seleccionado.
Fig. 1: tinción en dos colores de linfocitos de
sangre periférica para analizar la expresión de
ACT-4-h-1 en
diferentes tipos celulares.
Fig. 2: cinética de la expresión de
ACT-4-h-1 en células
T CD4+ activadas con aloantígeno. MCF= Canal medio de
fluorescencia.
Fig. 3: cinética de la expresión de
ACT-4-h-1 en células
T CD4+ activadas por el toxoide del tétanos.
Fig. 4: Cinética de la expresión de
ACT-4-h-1 en células
T CD4+ activadas con PHA.
Fig. 5: secuencia de ADNc (superior) y de
aminoácidos deducida (inferior) de
ACT-4-h-1. La Figura
indica las localizaciones de una secuencia señal
N-terminal, dos posibles puntos de escisión de
señal, (flechas verticales), dos sitios de glicosilación (gly), un
dominio transmembrana (TM), un codón de parada y una secuencia
señal de poli-A.
Fig. 6: construcción de un vector de expresión
para la producción de transfectantes estables que expresan
ACT-4-h-1.
Fig. 7: Análisis FACS^{TM} que muestra la
expresión de
ACT-4-h-1 en
transfectantes estables de líneas celulares COS-7,
Jurkart y SP2/O.
Fig. 8: fusión de un dominio extracelular de
ACT-4-h-1 con una
región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina para formar
una globulina recombinante.
Fig. 9: representación topográfica esquemática
de una globulina recombinante formada a partir de la fusión de un
dominio extracelular de
ACT-4-h-1 con una
región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina para formar
una globulina recombinante.
Las abreviaciones para los veinte aminoácidos
que se encuentran de manera natural siguen el lenguaje convencional
(Immunology- A Synthesis, (E. S. Golub & D. R. Grem
eds., Sinauer Associates, Sunderland, 2ª edición, 1991)
(incorporada en el presente documento por referencia para todos los
propósitos). Esteroisómeros (p.e. D-aminoácidos) de
los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales
como los aminoácidos a,a-disustituídos,
N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros
aminoácidos no convencionales pueden también ser componentes
adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos
de aminoácidos no convencionales incluyen:
4-hidroxiprolina,
\gamma-carboxiglutamato,
\varepsilon-N,N,N-trimetil
lisina, \varepsilon-N-acetil
lisina, O-fosfoserina,
N-acetilserina, N-formilmetionina,
3-metilhistidina, 5-hidroxil lisina,
\omega-N-metil arginina y otros
aminoácidos e iminoácidos similares (p.e.
4-hidroxiprolina). En la nomenclautura de
polipéptidos utilizada en el presente documento, la dirección a mano
izquierda es la dirección amino terminal y la dirección a mano
derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el
lenguaje y convención estándar. De manera similar, a menos que se
indique de otra manera, el extremo a mano izquierda de las
secuencias polinucleotídicas de cadena sencilla es el extremo 5';
la dirección a mano izquierda de las secuencias polinucleotídicas
de cadena doble se refieren en la dirección 5'. La dirección de la
adición de 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se refiere como
dirección de transcripción; regiones de la secuencia en la cadena
de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 5' al
extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias
upstream", regiones de la secuencia en la cadena de ADN
que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3' al
extremo 3' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias
downstream".
La frase "secuencia polinucleotídica" se
refiere a un polímero de bases de desoxiribonucleótidos o
ribonucleótidos de cadena única o doble leída del extremo 5' al 3'.
Esto incluye plásmidos autoreplicativos, polímeros infecciosos de
ADN o ARN y ADN o ARN no funcional.
Los siguientes términos se utilizan para
describir las relaciones de secuencia entre dos o más
polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de
comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de
identidad de secuencia" y "identidad sustancial". Una
"secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada
como base para una comparación de secuencias; una secuencia de
referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por
ejemplo, un segmento de un ADNc de longitud completa o una
secuencia de un gen dada en un listado de secuencias, tal como la
secuencia polinucleotídica mostrada en Fig. 5 o puede comprender un
ADNc o secuencia del gen completo. Generalmente, una secuencia de
referencia es al menos de 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente
de al menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo al menos 50
nucleótidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos pueden cada
uno (1) comprender una secuencia (i.e., una porción de la secuencia
de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos
polinucleótidos, y (2) puede comprender además una secuencia que es
divergente entre los dos polinucleótidos, comparaciones de
secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se llevan a cabo
normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos
respecto una "ventana de comparación" para identificar y
comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana
de comparación", tal y como se utiliza en el presente documento,
se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones
nucleotídicas contiguas en donde la secuencia polinucleotídica se
puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 20
nucleótidos contiguos y en donde la porción de la secuencia de
polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (i.e., huecos) del 20 por ciento o menos
comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprende
adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos
secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una
ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo
de homología local de Smith & Waterman, Appl. Math. 2:
482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de
Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970),
mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson &
Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 24444 (1988),
mediante implementaciones computacionales de estos algoritmos
(FASTDB (Intelligenetics), BLAST (Nacional Center for Biomedical
Information) o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics
Software Package Realease 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science
Dr., Madison, WI)) o mediante inspección, y la mejor alineación
(i.e., resultando en el porcentaje más alto de similitud de
secuencia respecto la ventana de comparación) generada por diversos
métodos. El término "identidad de secuencia" significa que dos
secuencias polinucleotídicas son idénticas (i.e., en base a
nucleótido a nucleótido) respecto la ventana de comparación. El
término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula
comparando dos secuencias óptimamente alineadas con la ventana de
comparación, determinando el número de posiciones a la que se
encuentra la base de ácido nucleico idéntica (p.e. A, T, C, G, U o
I) en ambas secuencias para conseguir el número de posiciones
coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por
el número total de posiciones en la ventana de comparación (i.e.,
el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para
conseguir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos
"identidad sustancial" tal y como se utilizan aquí indica una
característica de una secuencia polinucleotídica, en donde el
polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 70, 80
ó 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos
de un 90 a un 95 por ciento de identidad de secuencia, más
habitualmente al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia
cuando se compara con una secuencia de referencia respecto dina
ventana de comparación de al menos 20 posiciones nucleotídicas,
frecuentemente respecto una ventana de al menos
25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de
identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de
referencia con la ventana de comparación. La secuencia de
referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por
ejemplo, como un segmento de la secuencia de longitud completa de
ACT-4-h-1 mostrada
en Fig. 5.
Cuando se aplica a polipéptidos, el término
"identidad sustancial" significa que dos secuencias
peptídicas, donde la alineación es óptima, tal como mediante el
programa BLAZE (Intelligenetics) GAP o BESTFIT utilizando
"default gap weights", comparten al menos el 70 por
ciento u 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente
al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, más
preferiblemente al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia
o más (p.e., 99 por ciento de identidad de secuencia).
Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas
difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos.
Sustituciones conservativas de aminoácidos se refiere a la
intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales
similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas
laterales alifáticas es la glicina, la alanina, la valina, la leuina
y la isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas
alifáticas laterales con un grupo hidroxilo es la serina, y la
treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que
contienen un grupo amido es la asparagina y la glutamina; un grupo
de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es la
fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos
que tienen cadenas laterales básicas es la lisina, la arginina y la
histidina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que
contienen un grupo sulfuro es la cisteína y la metionina. Los
grupos de aminoácidos de sustitución conservativa preferidos son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina y
asparagina-glutamina.
El término "sustancialmente puro" significa
que una especie objeto es la especie predominante presente (i.e.,
en base molar es más abundante que cualquier otra especie
individual en la composición), y preferiblemente una fracción
sustancialmente purificada es una composición en la que la especie
objeto comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (en base
molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más
de aproximadamente un 80 a 90 por ciento de todas las especies
macromoleculares presentes en la composición. Más preferiblemente,
la especie objeto se purifica a homogeneidad esencial (las especies
contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante
procedimientos de detección convencionales) en donde la composición
consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
El término "que se encuentra de manera
natural" tal y como se utiliza aquí cuando se aplica a un objeto
se refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la
naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o
polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo
virus) que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no
ha sido modificado de manera intencionada por el hombre en el
laboratorio, es una que se encuentra de manera natural.
El término "epítopo" incluye cualquier
determinante proteico capaz de unirse de manera específica a un
receptor de inmunoglobulina o célula T. La unión específica existe
cuando la constante de disociación para la unión de anticuerpo a un
antígeno es \leq 1 \muM, preferiblemente \leq 100 mM y más
preferiblemente \leq 1 nM. Los determinantes epitópicos consisten
habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activas de
moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y
habitualmente tienen características estructurales tridimensionales
específicas, así como características de carga específicas.
El término "variantes mayores relacionadas"
tal y como se utiliza aquí se refiere a una secuencia de un gen que
está funcionalmente y evolutivamente relacionada entre humanos y
especies de mamíferos superiores, tales como primates, cerdos o
bovinos. El término no incluye las secuencias del gen de roedores,
tal como ratas. De esta manera, el gen de primate relacionado con
el gen ACT-4-h-1 es
el gen de primate que codifica una proteína expresada que tiene el
mayor grado de identidad de secuencia con la proteína del receptor
ACT-4-h-1 y que
exhibe un patrón de expresión similar al de la proteína
ACT-4-h-1 (i.e.,
expresada sobre la actividad de células CD4+).
El término "paciente" incluye sujetos
humanos y veterinarios.
Se proporcionan receptores sobre la superficie
de células T CD4+ activadas (referidas como receptores
ACT-4) y fragmentos de los mismos. El término
polipéptido del receptor ACT-4 se utiliza de manera
general para englobar receptores de longitud completa y fragmentos
de los mismos. La secuencia aminoacídica del primer receptor
ACT-4 a ser caracterizado (de aquí en adelante
ACT-4-h-1) se
muestra en la Fig. 5. El sufijo -h designa el origen humano y el
sufijo -1 indica que
ACT-4-h-1 es el
primer receptor ACT-4 a ser caracterizado. El
término receptor ACT-4 se refiere no solo a la
proteína que tiene la secuencia mostrada en Fig. 5, sino también a
otras proteínas que representan variantes alélicas, no alélicas y
relacionadas superiores de
ACT-4-h-1 y mutantes
naturales o inducidos de cualquiera de estas. Habitualmente, los
polipéptidos del receptor ACT-4 contendrán al menos
4 y más comúnmente 5, 6, 7, 10 ó 20, 50 o más aminoácidos contiguos
de la secuencia de
ACT-4-h-1. Es bien
conocido en la materia que dominios funcionales, tales como los
dominios de unión o epítopos se pueden formar a partir tan poco
como cuatro residuos aminoacídicos.
Los polipéptidos del receptor
ACT-4 exhibirán típicamente una identidad de
secuencia de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos
de ACT-4-h-1 y será
codificada por una secuencia de nucleótidos que exhibe una
identidad de secuencia sustancial con la secuencia de nucleótidos
codificante de
ACT-4-h-1 mostrada
en la Fig. 5. Los nucleótidos codificantes de proteínas del receptor
ACT-4 también hibridarán típicamente con la
secuencia de
ACT-4-h-1 en
condiciones rigurosas. Sin embargo, estos nucleótidos no hibridarán
habitualmente en condiciones rigurosas con el ácido nucleico
codificante del receptor OX-40, según describe
Mallet et al., EMBO J. 9:1063-68' (1990)
(véase en particular la Figura 2A de la referencia de Mallet et
al.). Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y
serán diferentes en circunstancias diferentes. Generalmente, las
condiciones rigurosas se seleccionan para que sean de
aproximadamente 5ºC inferior al punto de fusión térmico (Tm) de la
secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la
temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la que el 50% de
la secuencia diana hibrida con una sonda emparejada perfectamente.
Típicamente, condiciones rigurosas serán aquellas en las que la
concentración de sal es al menos aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y
la temperatura es al menos aproximadamente 60ºC. Como otros
factores pueden afectar de manera significativa la rigurosidad de
hibridación, incluyendo, entre otros, la composición base y el
tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de disolventes
orgánicos y la extensión de desemparejamiento de bases, la
combinación de parámetros es más importante que la medición
absoluta de cualquiera de ellas.
Habitualmente, los polipéptidos del receptor
ACT-4 compartirán al menos un determinante
antigénico en común con
ACT-4-h-1 pero no
será específicamente reactivo con anticuerpos contra el polipéptido
de rata OX-40. La existencia de un determinante
antigénico común se evidencia mediante reactividad cruzada de la
proteína variante con cualquier anticuerpo preparado contra
ACT-4-h-1 (véase
Sección IV). La reactividad cruzada a menudo se determina
utilizando sueros policlonales pero también se puede determinar
usando uno o más anticuerpos monoclonales contra
ACT-4-h-1, tal como
el anticuerpo designado como L106.
A menudo, los polipéptidos del receptor
ACT-4 contendrán esqueletos polipeptídicos
modificados. Las modificaciones incluyen derivatizaciones químicas
de polipéptidos, tales como acetilaciones, carboxilaciones y
similares. Estas también incluyen modificaciones por glicosilación
(N- y O- unidas) y procesamiento de variantes de un polipéptido
típico. Estas etapas de procesamiento incluyen específicamente
modificaciones enzimáticas, tales como ubiquitinización y
fosforilación. Véase, p.e., Hershko y Ciechanover, Ann. Rev. Bioch.
51: 335-364 (1982). La proteína
ACT-4-h-1, por
ejemplo, se modifica con dificultad de manera que el peso molecular
observado es aproximadamente de 50 kDa, mientras que el peso
molecular predicho en base a la secuencia de aminoácidos es sólo de
27 kDa. Se han identificado en su dominio extracelular dos sitios
de glicosilación putativos.
Los receptores de ACT-4
probablemente compartan alguna o todas las características
topológicas encontradas para
ACT-4-h-1. La
secuencia de aminoácidos de
ACT-4-h-1 contiene
una secuencia señal N-terminal putativa de 22 ó 24
aminoácidos. La secuencia de 24 aminoácidos más probablemente está
basada en el criterio de von Heijne, Nucleic Acid Res. 14:
4683-4690 (1986) (incorporado por referencia para
todos los propósitos). El receptor
ACT-4-h-1 contiene
una única extensión hidrofóbica adicional de 27 aminoácidos,
abarcando 213-240 residuos. La extensión hidrofóbica
probablemente corresponde a un dominio transmembrana y su
existencia es consistente con que
ACT-4-h-1 sea una
proteína de membrana integral tipo 1 (i.e., teniendo un único
dominio transmembrana con el dominio N-terminal que
comprende la región extracelular y el C-terminal que
comprende la región intracelular). Los 189 ó 191 aminoácidos
(dependiendo de la localización exacta del sitio de la señal de
corte) del amino-proximal de
ACT-4-h-1 al
segmento transmembrana están designados al dominio extracelular,
mientras que los 37 aminoácidos carboxi-proximales
al segmento transmembrana están designados al dominio intracelular.
Del amino-terminal, el dominio extracelular tiene
una secuencia señal putativa hidrofóbica
NH_{2}-terminal y tres bucles intracatenarios
formados por uniones disulfuro entre residuos de cisteína
emparejados.
El ajuste topológico de polipéptidos del
receptor ACT-4 es similar al de otros miembros de
la familia de receptores del factor de crecimiento neuronal, en
particular al receptor de rata OX-40. Sin embargo,
los otros miembros muestran alguna divergencia en el número de
bucles disulfuro extracelulares y sitios de glicosilación y en el
tamaño del dominio intracelular. Véase Mallet y Barclay,
supra.
A pesar de que no sea necesario que estén
presentes todos los dominios discutidos más arriba en todos los
polipéptidos del receptor ACT-4, se espera que haya
presente en la mayoría un único dominio extracelular. De hecho, en
algunos polipéptidos del receptor ACT-4, es posible
que sólo esté presente un dominio extracelular, y el estado natural
de dichas proteínas no es como proteínas unidas a la superficie de
células, sino como proteínas solubles, por ejemplo, dispersas en un
fluido corporal extracelular. La existencia de formas solubles de la
variante ha sido observada para otros receptores de superficie
celular, incluyendo un miembro de la familia de receptor de factor
de crecimiento neuronal, SFV-T2. Véase Mallet y
Barclay, supra.
A pesar de los polipéptidos sustancialmente de
longitud completa, la presente invención proporciona fragmentos
biológicamente activos de los polipéptidos. Las actividades
biológicas significativas incluyen la unión a receptor, unión de
anticuerpo (p.e., el fragmento compite con un receptor
ACT-4 intacto por la unión específica a anticuerpo),
inmunogenicidad (i.e., posesión de epítopos que estimulan
respuestas de células B o T contra el fragmento) y agonismo o
antagonismo de la unión de un polipéptido del receptor
ACT-4 a su ligando. Un segmento de una proteína del
receptor ACT-4 o un dominio de la misma comprenderá
ordinariamente al menos aproximadamente 5, 7, 9, 11, 13, 16, 20, 40
ó 100 aminoácidos contiguos.
Los segmentos de polipéptidos del receptor
ACT-4 a menudo terminan cerca de los extremos con
dominios estructurales o funcionales. Los dominios estructurales o
funcionales se identifican mediante comparación de datos de la
secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos tal como se muestra en
Fig. 5 con bases de datos de secuencias públicas o de pago.
Preferiblemente, los métodos de comparación computerizados se
utilizan para identificar motivos de secuencias o predecir dominios
de la conformación de la proteína que se encuentran en otras
proteínas de estructura y/o función conocida. Los dominios
estructurales incluyen un dominio intracelular, un dominio
transmembrana y un dominio extracelular el cual, a su vez, contiene
tres bucles de disulfuro unidos. Los dominios funcionales incluyen
un dominio de unión extracelular a través del cual el polipéptido
del receptor ACT-4 interacciona con moléculas
externas solubles u otros ligandos unidos a células y un dominio de
transducción de señal intracelular.
Algunos de los fragmentos contendrán únicamente
dominios extracelulares, tales como uno o más bucles de disulfuro
unidos. Dichos fragmentos retendrán, a menudo, la especificidad de
unión de un polipéptido del receptor ACT-4 intacto
pero estarán solubles más que unidos a membrana. Dichos fragmentos
son útiles como inhibidores competitivos de la unión de receptor
ACT-4.
Los receptores de ACT-4 se
identifican además por su status como miembros de la familia de
receptores del factor de crecimiento neuronal. La secuencia de
aminoácidos de
ACT-4-h-1 es al
menos un 20% idéntica a NGF-R,
TNF-R, CD40, 4-1 BB y fas/APO1.
ACT-4-h-1 exhibe un
62% de identidad de secuencia de aminoácidos con el gen
OX-40 de rata, el cual se caracteriza también por
la expresión selectiva en células CD4+ activadas.
Los receptores de ACT-4 también
se identifican mediante una distribución celular característica.
Más notablemente, los receptores de ACT-4 se
detectan habitualmente fácilmente en células T CD4+ activadas
(porcentaje de células que expresan habitualmente más de
aproximadamente un 25 ó 50% y a menudo aproximadamente un 80%;
fluorescencia de canal medio habitualmente superior a
aproximadamente un 10 y a menudo aproximadamente un
20-25, en un citómetro de Flujo Coulter Profile
después de la tinción por inmunofluorescencia). Los receptores de
ACT-4 habitualmente están sustancialmente ausentes
en células T en reposo, células B (menos las activadas con PMA),
células NK, y monocitos (menos las activadas con PMA).
Sustancialmente ausente significa que el porcentaje de células que
expresan ACT-4 es habitualmente inferior a
aproximadamente un 5% y más habitualmente inferior a
aproximadamente un 2% y el canal medio es habitualmente inferior a
aproximadamente 4 y más habitualmente inferior a aproximadamente 2,
medido con un citómetro de flujo Coulter Profile, después de la
tinción por inmunofluorescencia de las células. (Véase Ejemplo 2)
Los receptores de ACT-4 se expresan habitualmente a
bajos niveles en células CD8+ activadas (porcentaje de células que
expresan aproximadamente 4-10%; fluorescencia de
canal medio aproximadamente de 2-4 en un citómetro
de flujo de Coulter Profile después de la tinción con
inmunofluorescencia). El bajo nivel de expresión observado en
células CD8+ sugiere que la expresión está confinada a una
subpoblación de células CD8+. La expresión de receptores de
ACT-4 sobre la superficie de células CD4+ activadas
ha sido observada mediante varios mecanismos diferentes de
activación, incluyendo estímulos aloantigénicos, toxoide del tétanos
o mitogénicos (p.e. PHA). La expresión alcanza un máximo después de
aproximadamente 7 días de estimulación aloantigénica o con toxodide
del tétanos y después de aproximadamente tres días de estimulación
con PHA. Estos datos indican que los receptores de
ACT-4 se deberían de clasificar como de activación
temprana por antígeno que están sustancialmente ausentes en células
en reposo. La observación de que los receptores de
ACT-4 se expresan preferencialmente en células CD4+
activadas y se expresan a un nivel mucho menor en células CD8+
activadas, pero están sustancialmente ausentes en la mayoría o todos
los otros subtipos de células linfoides (excepto en respuesta a
estímulos altamente no fisiológicos como PMA) contrasta con la
especificidad de tipo celular de otros antígenos de activación
encontrados en leucocitos humanos.
La expresión de receptores de
ACT-4 en la superficie de células T CD4+ activadas
sugiere que el receptor tiene un papel en la activación de estas
células. Dicho papel es consistente con el de algunos otros miembros
de la familia de receptores del factor de crecimiento neuronal. Por
ejemplo, CD40 estimula la transición de fase G1-S
en linfocitos B y el factor de crecimiento neurona) transduce una
señal del factor de crecimiento neurona) citoquina, que resulta en
una diferenciación y supervivencia neuronal (Barde,
Y-A. Neuron 2: 1525-1534
(1989)) (incorporado por referencia para todos los propósitos). Sin
embargo, se pueden prever también otros papeles para los receptores
de ACT-4, por ejemplo, la interacción con otros
tipos celulares linfoides. La existencia de dichas funciones es
consistente con las diversas funciones de otros miembros de la
familia de receptores del factor de crecimiento neuronal, tales
como el factor de necrosis tumoral, cuya interacción con el
receptor del factor de necrosis puede resultar en inflamación o
muerte de la célula tumoral.
Los fragmentos o análogos que comprenden
sustancialmente uno o más dominios funcionales (p.e. un dominio
extracelular) de receptores de ACT-4 se pueden
fusionar a secuencias polipeptídicas heterólogas, de manera que la
proteína de fusión resultante exhibe la(s)
propiedad(es) funcional(es) conferidas por el
fragmento del receptor ACT-4 y/o el patrón de
fusión. La orientación del fragmento del receptor
ACT-4 respecto al patrón de fusión dependerá de las
consideraciones experimentales tales como la facilidad de la
construcción, estabilidad a proteólisis, estabilidad térmica,
reactividad inmunológica, modificación del residuo amino- o
carboxi-terminal. Patrones de fusión potenciales
incluyen enzimas cromogénicos tales como la
\beta-galactosidasa, proteína A o G, una proteína
FLAG tal como la descrita por Blanar & Rutter, Science
256:1014-1018 (1992), toxinas (p.e. la toxina de la
difteria, ectotoxina A de Pseudomonas, toxina del ricino o
fosfolipasa C) y componentes de la inmunoglobulina.
Las globulinas recombinantes (Rg) formadas por
fusión de fragmentos del receptor ACT-4 y
componentes de la inmunoglobulina a menudo tienen la mayoría o
todas las propiedades fisiológicas asociadas a la región constante
de la clase de inmunoglobulina concreta usada. Por ejemplo, las
globulinas recombinantes pueden ser capaces de fijar complemento,
mediar en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo, estimular
células B o trasverter las paredes de los vasos sanguíneos y entrar
en el espacio intersticial. Las globulinas recombinantes se forman
habitualmente fusionando el C-terminal de un
dominio extracelular del receptor ACT-4 al
N-terminal del dominio de la región constante de
una cadena pesada de inmunoglobulina, estimulando de esta manera la
conformación de una cadena de inmunoglobulina auténtica. La cadena
de inmunoglobulina es preferiblemente de origen humano, en
particular si la globulina recombinante está dirigida al uso
terapéutico. Las globulinas recombinantes son habitualmente
solubles y tienen un número de propiedades ventajosas respecto a
los receptores de ACT-4 sin modificar. Estas
propiedades incluyen la vida media prolongada en suero, la capacidad
de lisar células diana por las que tiene afinidad un receptor
ACT-4, mediante funciones efectoras, y la capacidad
de unir moléculas tales como la proteína A y G, las cuales se
pueden usar para inmovilizar la globulina recombinante en análisis
de unión.
Las secuencias nucleotídica y aminoacídica de
ACT-4-h-1 mostradas
en la Fig. 5, y las secuencias correspondientes a otras variantes
del receptor ACT-4 obtenidas según se describe en
la Sección III, infra, permiten la producción de
polipéptidos de longitud completa de secuencias polipeptídicas del
receptor ACT-4 y de fragmentos de los mismos. Dichos
polipéptidos se pueden producir en células hospedadoras procariotas
o eucariotas mediante expresión de polinucleótidos que codifican el
receptor ACT-4 o fragmentos y análogos del mismo.
Las secuencias de ADN donadas se expresan en hospedadores después
de que las secuencias se hayan unido operativamente a (i.e.,
posicionadas para asegurar el funcionamiento de) una secuencia de
control de la expresión en un vector de expresión. Los vectores de
expresión son típicamente replicables en organismos hospedadores ya
sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del
hospedador. De manera común, los vectores de expresión contendrán
marcadores de selección, p.e., resistencia a tetraciclina o
resistencia a higromicina, para permitir la detección y/o selección
de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas
(véase, p.e., la patente US 4.704.362).
E. coli es un hospedador procariota útil
en la clonación de secuencias de ADN de la presente invención.
Otros hospedadores microbianos adecuados para usar incluyen los
bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otros
Enterobacteriaceae, tal como Salmonella, Serratia y
varias especias de Pseudomonas. En estos hospedadores
procariotas, uno puede también preparar vectores de expresión, los
cuales contendrán típicamente secuencias de control de la expresión
compatibles con la célula hospedadora (p.e. origen de replicación).
Además, cualquier número de la diversidad de promotores bien
conocidos estará presente, tal como el sistema promotor de lactosa,
un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de
beta- lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los
promotores controlarán, típicamente, la expresión, opcionalmente
con una secuencia operadora y tienen secuencias de unión a sitio
para ribosoma y similares, para iniciar y completar la
transcripción y traducción.
Otros microbios, tales como la levadura, se
pueden utilizar para la expresión. Saccharomyces es un
hospedador preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias
de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la
3-fosfoglicerato quinasa u otros enzimas
glicolíticos, y un origen de replicación, secuencias de finalización
y similares, según se desee. Las células de insectos (p.e. SF9) con
vectores apropiados, habitualmente derivados de baculovirus,
también son adecuados para expresar polipéptidos del receptor
ACT-4 o del ligando. Véase Luckow, et al.,
Biol Technology 6: 47-55 (1988) (incorporado
por referencia para todos los propósitos).
Se pueden utilizar también cultivos de células
de tejido de mamíferos eucariotas superiores para expresar y
producir polipéptidos de la presente invención (véase Winnacker,
From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, NY, 1987) (incorporado
por referencia para todos los propósitos). Las células eucariotas
son habitualmente preferidas ya que se han desarrollado en el campo
de la técnica una serie de líneas de células hospedadoras adecuadas
capaces de secretar y modificar de manera auténtica proteínas
humanas e incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células
COS, células HeLa, líneas de células de mieloma, células de Jurkat,
etc. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir
secuencias de control de la expresión, tales como un origen de
replicación, un promotor (p.e., un promotor tk de HSV o un promotor
pgk (fosfoglicerato quinasa)), un intensificador (Queen
et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información
de procesamiento necesario, tales como sitios de unión a ribosoma,
sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación (p.e., un sitio
de adición de poliA para el antígeno T grande de SV40) y secuencias
de finalización de la transcripción. Las secuencias de control de
la expresión preferidas son los promotores derivados de genes de
inmunoglobulinas, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y
similares. Los vectores que contienen los segmentos de ADN de
interés (p.e. polipéptidos que codifican un receptor
ACT-4) pueden ser transferidas a la célula
hospedadora mediante métodos bien conocidos, los cuales pueden
variar dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la
transfección con CaCl_{2} se utiliza comúnmente en células
procariotas mientras que el tratamiento con CaPO_{4} o la
electroporación se pueden utilizar para otros hospedadores
celulares. Los vectores pueden existir como episomas o integrados
en el cromosoma del hospedador.
Los polipéptidos del receptor
ACT-4 naturales se aíslan mediante técnicas
convencionales tales como la cromatografía de afinidad. Por
ejemplo, se provocan los anticuerpos monoclonales o policlonales
contra un ACT-4-h-1
previamente purificado y se une a una columna de afinidad adecuada
mediante técnicas bien conocidas. Véase, p.e., Hudosn y Hay,
Practical Immunology (Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK
1980), Capítulo 8 (incorporado por referencia para todos los
propósitos). Por ejemplo, un
anti-ACT-4-h-1
se puede inmovilizar en una columna de Sepharosa
proteína-A mediante reticulación del dominio Fc con
un agente de reticulación homobifuncional, tal como dimetil
pimelimidato. Los extractos celulares se pasan a continuación a
través de la columna y la proteína del receptor
ACT-4 específicamente unido a la columna, eluido
con, por ejemplo, ácido pirogénico 0,5 M, pH 2,5. Habitualmente, se
obtiene una forma intacta del receptor ACT-4
mediante dichas técnicas de aislamiento. Los fragmentos peptídicos
se generan a partir de receptores de ACT-4 intactos
mediante escisión química (p. e. bromuro de cianógeno) o enzimática
(p.e. proteasa V8 o tripsina) de la molécula intacta.
Alternativamente, los polipéptidos del receptor
ACT-4 se pueden sintetizar mediante procedimientos
químicos o producidos mediante sistemas de traducción in
vitro utilizando una plantilla polinucleotídica para la
traducción directa. Procedimientos para la síntesis química de
polipéptidos y la traducción in vitro son bien conocidos en
el estado de la técnica y se describen adicionalmente en Berger y
Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to
Molecular Cloning Techniques Academia Press, Inc., San Diego,
CA 1987).
El Ejemplo 5 presenta datos de la secuencia de
ácido nucleico para un clon de ADNc de un receptor
ACT-4 designado
ACT-4-h-1. La
secuencia incluye tanto una región traducida como regiones
flanqueantes en 3' y 5'. Estos datos de secuencia se pueden usar
para diseñar sondas con las que se aíslen otros genes del receptor
ACT-4. Estos genes incluyen el gen genómico humano
que codifica
ACT-4-h-1, y los
ADNc y clones genómicos de especies de mamíferos superiores y
variantes alélicas y no alélicas y mutantes naturales e inducidos
de todos estos genes. Específicamente, se proporcionan todos los
fragmentos de ácido nucleico que codifican todos los polipéptidos
del receptor ACT-4 descritos en esta solicitud. Hay
disponibles librerías genómicas de muchas especies (p.e.
Clontech, Palo Alto, CA) o se pueden aislar de novo mediante
procedimientos convencionales. Las librerías de ADNc se preparan
mejor a partir de células CD4+ activadas las cuales expresan
ACT-4-h-1 en grandes
cantidades.
Las sondas utilizadas para aislar clones
comprenden típicamente una secuencia de aproximadamente al menos 24
nucleótidos contiguos (o sus complementarios) de la secuencia de
ADNc mostrada en Fig. 5. Por ejemplo, un polinucleótido de longitud
completa que corresponde a la secuencia mostrada en Fig. 5 se puede
marcar y utilizar como sonda de hibridación para aislar clones
genómicos de la librería de clones genómicos humanos en p.e.,
\lambdaEMBL4 o \lambdaGEM11 (Promega Corporation, Madison, W);
las condiciones de hibridación típicas para estímulos en placas de
cribado (Benton y Davis, Science 196: 180 (1978)) pueden ser:
formamida al 50%, 5x SSC o SSPE, 1-5 x solución de
Denhardt, 0,1-1% de SDS, 100-200
\mug de ADN o ARNt heterólogo cortado, 0-10% de
sulfato de dextrano, 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7} cpm/ml de sonda
desnaturalizada con una actividad específica de aproximadamente 1 x
10^{8} cpm/\mug, e incubación a 42ºC durante aproximadamente
6-36 horas. Las condiciones de prehibridación son
esencialmente idénticas, excepto en que la sonda no está incluida y
que el tiempo de incubación se reduce típicamente. Las condiciones
de lavado son típicamente 1-3 x SSC,
0,1-1% de SDS, 50-70ºC con cambio
de solución de lavado a aproximadamente 5-30
minutos. Las condiciones de hibridación y lavado son típicamente
menos rigurosas para el aislamiento de variantes altamente
relacionadas o de variantes no alélicas que, p.e., el clon
genómico de
ACT-4-h-1.
Alternativamente, se pueden usar sondas para
clonar los genes del receptor ACT-4 mediante
procedimientos que utilizan la reacción de la polimerasa en cadena
(PCR). Procedimientos para la amplificación por PCR se describen
en, p.e., PCR Technology: Principies and Applications for
DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY,
1992); PCR Procotols: A Guide to Methods and Applications
(eds. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA,
1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967
(1991); Eckert, K. A. y Kunkel, T. A., PCR Methods and
Applications 1:17 (1991); PCR (eds. McPherson et al.,
IRL Press, Oxford); y patente U.S. 4.683.202.
Alternativamente, las secuencias
polinucleotídicas sintéticas correspondientes a toda o parte de las
secuencias mostradas en Fig. 5 se pueden construir mediante
síntesis química de oligonucleótidos.
Las sustituciones, deleciones y adiciones de
oligonucleótidos se pueden incorporar en los polinucleótidos de la
invención. La variación en secuencia de nucleótidos puede resultar
de la generación del código genético, de polimorfismos de la
secuencia de varios alelos del receptor ACT-4, de
errores menores de secuenciación o se pueden introducir mediante
mutagénesis aleatoria de los ácidos nucleicos codificantes
utilizando irradiación o exposición a EMS, o mediante cambios
manipulados por mutagénesis específica de lugar u otras técnicas de
biología molecular mordena. Véase Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. PRess, NY 2d ed., 1989).
Para secuencias nucleotídicas que sean capaces de ser transcritas y
traducidas para producir un polípéptido funcional, la degeneración
del código genético resulta en una serie de secuencias nucleotídicas
que codifican el mismo polipéptido. La invención incluye todas esas
secuencias. Generalmente, las sustituciones, deleciones y adiciones
de nucleótidos no deberían perturbar sustancialmente la capacidad
de un polinucleótido del receptor ACT-4 de hibridar
con la secuencia de
ACT-4-h-1 mostrada
en Fig. 5 en condiciones rigurosas. Típicamente, los polinucleótidos
del receptor ACT-4 comprenden al menos 25
nucleótidos consecutivos que son sustancialmente idénticos a una
secuencia del receptor
ACT-4-h-1 que se
encuentra de manera natural (p.e. Fig. 5), más habitualmente los
polinucleótidos del receptor ACT-4 comprenden al
menos de 50 a 100 nucleótidos consecutivos, los cuales son
sustancialmente idénticos a una secuencia del receptor
ACT-4 que se encuentra de manera natural.
Los polinucleótidos del receptor
ACT-4 pueden ser polinucleótidos cortos (p.e.,
aproximadamente 10, 15, 25, 50 ó 100 bases contiguas de la
secuencia de ACT-h-1 mostrada en
Fig. 5), para usar como sondas de hibridación y cebadores de PCR (o
LCR). Las secuencias polinucleotídicas del receptor
ACT-4 pueden comprender también parte de un
polinucleótido mayor que incluye secuencias que facilitan la
transcripción (secuencias de expresión) y traducción de las
secuencias codificantes, de manera que se produce el producto
polipeptídico codificado. La construcción de dichos polinucleótidos
es bien conocida en el campo de la técnica y se describe con más
detalle en Sambrook et al., supra (C.S.H.P. Press, NY
2d ed. 1989). El polinucleótido del receptor ACT-4
se puede fusionar en marco con otra secuencia polinucleotídica que
codifica una proteína diferente (p.e., glutatión
S-transferasa, \beta-galactosidasa
o un dominio Fc de inmunoglobulina) para la expresión codificante
de una proteína de fusión (véase, p.e., Byrn et al.,
Nature, 344:667-670 (1990)).
Se proporcionan anticuerpos contra receptores de
ACT-4 y a sus ligandos (véase Sección V).
Los anticuerpos o inmunoglobulinas están
compuestos típicamente de cuatro cadenas peptídicas unidas de
manera covalente. Por ejemplo, un anticuerpo de IgG tiene dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Cada cadena ligera se une
covalentemente a una cadena pesada. A su vez, cada cadena pesada se
une covalentemente a la otra para formar una configuración
"Y", también conocida como conformación de inmunoglobulina.
Los fragmentos de estas moléculas, o incluso las cadenas pesadas o
ligeras solas, pueden unir antígeno. Los anticuerpos, fragmentos de
anticuerpos y cadenas individuales también son referidas en el
presente documento como inmunoglobulinas.
Una cadena pesada o ligera de un anticuerpo
normal tiene una región variable (V) N-terminal
(NH_{2}) y una región constante (C) C-terminal
(-COOH). La región variable de la cadena pesada es referida como
V_{H} (incluyendo, por ejemplo, V\gamma) y la región variable
de la cadena ligera es referida como V_{L} (incluyendo V\kappa o
V\lambda). La región variable es la parte de la molécula que se
une al antígeno relacionado del anticuerpo, mientras que la región
Fc (segundo y tercer dominios de la región C) determina la función
efectora del anticuerpo (p.e. fijación de complemento,
opsonización). Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina o de
anticuerpo de longitud completa (generalmente de aproximadamente 25
kDa, aproximadamente 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de
la región variable en el N-terminal (generalmente
aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante
\kappa (kappa) o \lambda (lambda) en el
COOH-terminal. Las "cadenas pesadas" de
inmunoglobulina o de anticuerpo de longitud completa (generalmente
aproximadamente 50 kDa, aproximadamente 446 aminoácidos) están
codificados, similarmente, por un gen de la región variable
(generalmente codifica aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de
los genes de la región constante, p.e., gamma (que codifica
aproximadamente 330 aminoácidos). Típicamente, la "V_{L}"
incluirá la región de la cadena ligera codificada por los segmentos
de los genes V_{L} y/o J_{L} (J o región de unión), y la
"V_{H}" incluirá la porción de la cadena pesada codificada
por los segmentos de los genes V_{H} y/o D_{H} (D o región de
diversidad) y del gen J_{H}. Véase, de manera general, Roitt
et al., Immunology (2d ed. 1989), Capítulo 6 y Paul,
Fundamental Immunology (Rayen Press, 2d, ed. 1989).
La región variable de la cadena ligera o pesada
de inmunoglobulina consisten en una región de "armazón"
interrumpida con tres regiones hipervariables, también denominadas
regiones de determinación de complementariedad o CDR. Ha sido
definida la extensión de la región de armazón y los CDR (véase
Rabat et al., (1987), "Sequences of Proteins of
Immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios de los
Hombres; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:
901-917 (1987). Las secuencias de las regiones del
armazón de las diferentes cadenas pesadas y ligeras están
relativamente conservadas dentro de una especie. La región del
armazón de un anticuerpo, es decir las regiones del armazón
combinadas con las cadenas pesadas y ligeras constituyentes, sirven
para posicionar y alinear los CDR en el espacio tridimensional. Los
CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un
antígeno. Los CDR son referidos típicamente como CDR1, CDR2 y CDR3,
enumerados secuencialmente a partir del
N-terminal.
La región constante de la molécula de la cadena
pesada, también conocida como C_{H}, determina el isotipo del
anticuerpo. Los anticuerpos son referidos como IgM, IgD, IgG, IgA e
IgE, dependiendo del isotipo de cadena pesada. Los isotipos están
codificados en los segmentos mu (\mu), delta (\Delta), gamma
(\gamma), alfa (\alpha) y epsilon (\varepsilon) de la región
constante de la cadena pesada, respectivamente. Además, existen una
serie de subtipos \gamma. Existen dos tipos de cadenas ligeras,
\kappa y \lambda. Los determinantes de estos subtipos
típicamente residen en la región constante de la cadena ligera,
también referida como C_{L} en general, y C_{\kappa} o
C_{\lambda} en particular.
Los isotipos de cadena pesada determinan
diferentes funciones efectoras del anticuerpo, tales como la
opsonización o fijación de complemento. Además, el isotipo de
cadena pesada determina la forma secretada del anticuerpo. Los
isotipos de IgG, IgD e IgE secretados se encuentran típicamente en
forma monomérica o de una sola unidad. El isotipo de IgM secretado
se encuentra en forma pentamérica; la IgA secretada se puede
encontrar tanto en forma monomérica como dimérica.
Los anticuerpos que se unen a un receptor
ACT-4, a un ligando del mismo, o fragmentos de
unión de cualquiera, se pueden producir mediante varios medios. La
producción de anticuerpos monoclonales no humanos, p.e., de murina,
rata y demás, es bien conocida y se puede llevar a cabo mediante,
por ejemplo, inmunización del animal con una preparación que
contenga un receptor ACT-4 o sus ligandos, o un
fragmento inmunogénico de cualquiera de estos. En particular, son
útiles como inmunógenos células transfectadas de manera estable con
genes del receptor ACT-4 recombinantes y que
expresan receptores de ACT-4 en sus superficies
celulares. Las células productoras de anticuerpos obtenidas a partir
de animales inmunizados se inmortalizan y se criban por la
producción de un anticuerpo que se une a receptores de
ACT-4 o sus ligandos. Véase Harlow y Lane,
Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY,
1988).
1988).
Se han descrito diversas técnicas para la
generación de anticuerpos monoclonales humanos pero son en general
más complicadas que las técnicas con murina y no son aplicables a
todos los antígenos. Véase, p.e., Larrick et al., patente US
Nº 5.001.065 para revisión. Una técnica que ha sido usada de manera
exitosa para generar anticuerpos monoclonales humanos contra una
variedad de antígenos es la metodología del trioma de Otsberg et
al., (1983), Hybrodima 2:361-367,
Otsberg, patente US Nº 4.634.664 y Engleman et al., patente
US Nº 4.634.666. Las líneas celulares productoras de anticuerpos
obtenidas mediante este procedimiento se llaman triomas ya que son
descendientes de tres células -dos humanas y una de ratón-. Los
triomas se han encontrado que producen anticuerpos más estable que
los hibridomas habituales hechos a partir de células humanas.
Una aproximación alternativa es la generación de
inmunoglobulinas humanizadas mediante unión de las regiones CDR de
anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante
técnicas de ADN recombinantes. Véase Queen et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) y WO
90/07861.
Las inmunoglobulinas humanizadas tienen
sustancialmente residuos en el armazón de la región variable de una
inmunoglobulina humana (denominada una inmunoglobulina aceptora) y
regiones de determinación de complementariedad sustancialmente de
una inmunoglobulina de ratón, p.e., el anticuerpo L106 (referido
como inmunoglobulina donante). La(s) región(es)
constante(s), si está(n) presente(s), son
sustancialmente de una inmunoglobulina humana. Los dominios
variables humanos se seleccionan habitualmente de anticuerpos
humanos cuyas secuencias del armazón exhiben un grado elevado de
identidad de secuencia con los dominios de la región variable de la
murina de la que se derivan los CDR. Los residuos del armazón de la
región variable de la cadena pesada y ligera se pueden derivar de
secuencias de anticuerpo humanas iguales o diferentes. Las
secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de
anticuerpos humanos que se encuentren de manera natural o pueden
ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Véase Carter
et al., WO 92/22653. Se seleccionan ciertos aminoácidos
procedentes del armazón de la región variable humana para la
sustitución en base a su posible influencia sobre la conformación
de los CDR y/o la unión a antígeno. La investigación de tales
posibles influencias se realiza mediante modelación, examen de las
características de los aminoácidos en localizaciones concretas o la
observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis
de aminoácidos concretos.
Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre
un residuo del armazón de la región variable de L106 de murina y un
residuo seleccionado del armazón de la región variable humana, el
aminoácido humano del armazón debería estar habitualmente
sustituido por el aminoácido equivalente del armazón a partir de un
anticuerpo de ratón cuando se espera de manera razonable que el
aminoácido:
- (1)
- se una de manera no covalente a antígeno directamente;
- (2)
- sea adyacente a una región CDR;
- (3)
- interaccione de otra manera con una región CDR (p.e. dentro de aproximadamente 3A de una región CDR), o
- (4)
- participe en la interfase VL-VH.
Otros candidatos para la sustitución son los
aminoácidos del armazón humano aceptor que son inusuales para una
inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos se pueden
sustituir con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo
L106 o de las posiciones equivalentes de más inmunoglobulinas
humanas típicas.
Una aproximación más para el aislamiento de
secuencias de ADN que codifican un anticuerpo humano monoclonal o
un fragmento de unión del mismo es mediante cribado de una librería
de ADN a partir de células B humanas de acuerdo con el protocolo
general descrito por Huse et al., Science 246:
1275-1281 (1989) y a continuación la clonación y
amplificación de las secuencias que codifican el anticuerpo (o
fragmento de unión) de la especificidad deseada. El protocolo
descrito por Huse se hace más eficaz en combinación con la
tecnología de exhibición de fago. Véase, e.g., Dower et al.,
WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047. La tecnología
de exhibición de fago se puede utilizar también para mutar regiones
CDR de anticuerpos han mostrado previamente tener afinidad por
receptores ACT-4 o sus ligandos. Se seleccionan los
anticuerpos que tienen afinidad de unión mejorada.
Los anticuerpos del receptor
anti-ACT-4 que se unen de manera
específica al mismo epítopo como el anticuerpo L106 se identifican
habitualmente mediante ensayo de unión competitivo. El ensayo tiene
tres componentes, un polipéptido ACT-4 (p.e.
ACT-4-h-1), un
anticuerpo L106, que habitualmente está marcado, y el anticuerpo en
estudio. A menudo el polipéptido del receptor ACT-4
se inmoviliza en un soporte sólido. El anticuerpo de prueba se une
al mismo epítopo que el anticuerpo L106 si este reduce la cantidad
de anticuerpo L106 que se une específicamente al polipéptido del
receptor ACT-4. La extensión del cribado necesario
para obtener dichos anticuerpos se puede reducir generando
anticuerpos con un protocolo en el que el epítopo específico unido
mediante L106 se utiliza como inmunógeno. Los anticuerpos que se
unen al mismo epítopo que L106 pueden exhibir una secuencia de
aminoácidos sustancialmente, pero no completamente idéntica al
anticuerpo L106, o puede tener una estructura primaria no
relacionada al anticuerpo L106.
Los anticuerpos anti-receptor
ACT-4 que tienen una especificidad de unión
diferente a la de L106 (i.e., que se une a un epítopo diferente) se
identifican mediante una aproximación de complementariedad. Los
anticuerpos de ensayo se criban por fallar al competir con el
anticuerpo L106 por la unión a un polipéptido del receptor
ACT-4. La extensión del cribado se puede reducir
generando anticuerpos con un protocolo en el que se utiliza como
inmunógeno un fragmento que carece de un epítopo específico unido
por L106.
Los anticuerpos que tienen la capacidad de
estimular o inhibir la activación de células CD4+ se pueden
identificar mediante procedimientos de cribado discutidos en la
Sección VI, infra. Algunos anticuerpos pueden inhibir
selectivamente la activación en respuesta a algunos estímulos (p.e.,
aloantigénico pero no inmunogénico, o viceversa), y no otras. La
capacidad inhibidora de algunos anticuerpos puede depender del
tiempo después de la activación en el que se añade el anticuerpo.
Algunos anticuerpos pueden tener la capacidad de activar células
CD4+ independientemente de otros estímulos, mientras que otros
anticuerpos anti-receptor ACT-4
pueden tener únicamente la capacidad de aumentar la eficacia de
otro estímulo tal como el proporcionado por PHA.
Los anticuerpos aislados mediante los
procedimientos anteriores se pueden utilizar para generar
anticuerpos anti-idiotípicos mediante, por ejemplo,
inmunización de un animal con el anticuerpo primario. Para los
anticuerpos anti-receptor ACT-4, se
seleccionan los anticuerpos anti-idiotípicos cuya
unión al anticuerpo primario es inhibida por receptores de
ACT-4 o fragmentos de los mismos. Puesto que tanto
el anticuerpo anti-idiotípico como los receptores de
ACT-4 o fragmentos de los mismos unen la
inmunoglobulina primaria, la inmunoglobulina
anti-idiotípica puede representar la "imagen
integral" de un epítopo y de esta manera puede sustituirse el
ligando de ACT-4.
El epítopo unido por L106 o cualquier otro
anticuerpo anti-receptor ACT-4 se
determina proporcionando una familia de fragmentos que contienen
diferentes segmentos de aminoácidos procedente de un polipéptido del
receptor ACT-4, tal como
ACT-4-h-1. Cada
fragmento comprende típicamente al menos 4, 6, 8, 10, 20, 50 ó 100
aminoácidos contiguos. Colectivamente, la familia de polipéptidos
cubre mucha o toda la secuencia aminoacídica de un polipéptido del
receptor ACT-4 de longitud completa. Se prueban
individualmente miembros de la familia por la unión a , p.e., el
anticuerpo L106. El fragmento más pequeño que se puede unir de
manera específica al anticuerpo en estudio desalinea la secuencia
aminoacídica del epítopo reconocido por el anticuerpo.
Los fragmentos de anticuerpos contra receptores
de ACT-4 o sus ligandos exhiben típicamente unión
específica al receptor ACT-4 con una afinidad de al
menos 10^{7} M, y más típicamente 10^{8} ó 10^{9} M. Los
fragmentos de anticuerpo incluyen cadenas pesadas, cadenas ligeras,
Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fabc y Fv separados. Los fragmentos
se producen por técnicas de ADN recombinantes o mediante separación
química o enzimática de inmunoglobulinas intactas.
En otra realización, se proporcionan
inmunotoxinas. Una inmunotoxina es un compuesto quimérico que
consiste en una toxina unida a un anticuerpo que tiene una
especificidad deseada. El anticuerpo sirve como agente de
direccionamiento para la toxina. Véase de manera general Pastan
et al., Cell 47:641-648 (1986). Una
porción de la toxina se acopla a un anticuerpo intacto o un
fragmento del mismo mediante técnicas químicas o de ADN
recombinantes. Preferiblemente, la toxina se une a una cadena de
inmunoglobulina en la forma de una proteína contigua. Véase, p.e.,
Chovnick et al., Cancer Res, 51:465; Chaudhary et
al., Nature 339:394 (1989). Ejemplos de componentes
adecuados de la toxina se indican en la Sección 1, supra, y
se revisan en, p.e., The Specificity and Action of Animal,
Bacterial and Plant Toxins (ed. P. Cuatrecasas, Chapman Hall,
London, 1976).
Los hibridomas, triomas y otras líneas celulares
productoras de anticuerpos y sus fragmentos discutido,
supra, incluyen la línea de hibridoma HBL 106, depositada
como ATCC HB 11483, que produce el anticuerpo de ratón L106.
Los anticuerpos anti-receptor
ACT-4 y sus fragmentos de unión son útiles en el
cribado de librerías de expresión de ADNc, que contienen
preferiblemente ADNc humano o de primate derivado de varios tejidos
y en la identificación de clones que contienen insertos de ADNc,
los cuales codifican proteínas inmunoreactivas cruzadas,
estructuralmente relacionadas. Véase, Aruffo y Seed, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987) (incorporado por
referencia para todos los propósitos). Los anticuerpos también son
útiles para identificar y/o purificar proteínas inmunoreactivas
cruzadas que están estructuralmente o evolutivamente relacionadas
con los polipéptidos nativos del receptor ACT-4 o
con fragmentos de los mismos usados para generar el anticuerpo. Los
anticuerpos contra ligandos de ACT-4 son
análogamente útiles en el aislamiento de más ligandos y variantes
de los mismos. Se describen usos diagnósticos y terapéuticos de
anticuerpos, de fragmentos de unión de los mismos, inmunotoxinas y
de anticuerpos anti-idiotípicos en la Sección VII,
infra.
El término ligando de ACT-4 se
utiliza para indicar una proteína que se une específicamente a un
polipéptido del receptor ACT-4 y que es capaz de
formar un complejo con dicho polipéptido, al menos en parte,
mediante unión no covalente. Los ligandos pueden ser moléculas que
se encuentran de manera natural o bien sintéticos y pueden estar en
una forma insoluble o ancladas a la superficie de una célula. Se
pueden unir múltiples ligandos diferentes al mismo receptor
ACT-4. A la inversa, un ligando se puede unir a más
de un receptor ACT-4. El término "ligando de
ACT-4" no incluye habitualmente anticuerpos para
polipéptidos del receptor ACT-4. Habitualmente, la
unión de un ligando a un receptor ACT-4 iniciará una
señal que altera el fenotipo físico y/o funcional de una célula que
lleva el receptor ACT-4 y/o una célula que lleva el
ligando de ACT-4. Los anticuerpos contra ya sea
ACT-4 o sus ligandos pueden tener la capacidad de
bloquear o estimular la transducción de señal. Por supuesto, será
reconocida la designación de ACT-4 como re-
ceptor y su patrón de unión específica como ligando es algo arbitrario y puede, en algunas circunstancias, ser revertido.
ceptor y su patrón de unión específica como ligando es algo arbitrario y puede, en algunas circunstancias, ser revertido.
Se espera que los ligandos de
ACT-4 compartan algunas de las propiedades de otros
ligandos que se unen a miembros de la superfamilia de receptores
del factor de crecimiento tisular. Estos ligandos incluyen
citoquinas TNF-\alpha,
TNF-\beta, CD40-L,
CD-27-L y CD30-L.
Con la excepción de TNF-\beta, estos ligandos
existen tanto como proteínas de superficie celular de membrana
integral tipo II así como proteínas solubles. Los dominios
extracelulares de estos ligandos consisten en aproximadamente 150
aminoácidos y forman varias láminas \beta plegadas, que se
ensamblan en una estructura cilíndrica abierta (denominada
"jelly hole" por Bazan et al., Current
Biology 3: 603-606 (1993)).
Se identifican materiales fuente para el
suministro de ligandos de ACT-4 mediante cribado de
diferentes tipos celulares, en particular células linfoides y
hematopoyéticas, fluidos corporales y extratos de tejidos, con el
receptor ACT-4 marcado, preferiblemente en una forma
soluble, como sonda. A menudo, el receptor ACT-4 o
un fragmento de unión del mismo se fusiona a una segunda proteína
con propósitos de cribado. Particularmente adecuadas son globulinas
recombinantes formadas por fusión de la porción extracelular de
ACT-4 a la región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina.
Los ligandos de ACT-4 se
purifican a partir de células u otros materiales biológicos
identificados mediante métodos de cribado utilizando técnicas
clásicas de química de proteínas. Dichas técnicas incluyen la
precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio,
cromatografía en columna, métodos de inmunoprecipitación, y otros.
Véase, p.e., R. Scopes, Protein Purification: Principies and
Practice (Springer-Verlag, NY, 1982).
Habitualmente, los procedimientos de purificación incluirán una
etapa de cromatografía de afinidad en la que un polipéptido de
ACT-4 o se utiliza un fragmento de unión del mismo
como el reactivo inmovilizado. Las regiones constantes de
ACT-4 se pueden inmovilizar de manera conveniente
mediante unión de la porción de la región constante a proteína A o
G. Los ligandos de ACT-4 se pueden purificar
utilizando anticuerpos anti-idiotipo a receptores
de ACT-4 como reactivo de afinidad.
Para determinar la secuencia de aminoácidos u
obtener fragmentos del polipéptido del receptor, el receptor se
puede digerir con tripsina. Los fragmentos peptídicos se pueden
separar por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y
analizar mediante secuenciación en fase gas. Otros métodos de
secuenciación conocidos en la materia también se pueden utilizar.
Los datos de secuencia se pueden usar para diseñar sondas
degenerativas para el aislamiento de clones de ADNc o genómicos que
codifican ligandos de ACT-4.
Alternativamente, se pueden obtener los clones
de ADNc que codifican ligandos de ACT-4 mediante
clonación por expresión. En esta aproximación, se prepara una
librería de ADNc a partir de células que expresan un ligando de
ACT-4 (identificado como se discute, supra).
La librería se expresa en células adecuadas (p.e.
COS-7) y los clones que llevan el ligando de
ACT-4 se identifican mediante cribado con
ACT-4 marcado o un fragmento de unión del mismo,
opcionalmente fusionado a un dominio constante de una cadena pesada
de inmunoglobulina.
Los ligandos de ACT-4 o sus
dominios de unión se pueden utilizar para purificar por afinidad
los respectivos receptores de ACT-4. Los ligandos
de ACT-4 y fragmentos de unión de los mismos también
son útiles como agonistas o antagonistas de la unión de ligandos de
ACT-4, y se pueden utilizar en los métodos
terapéuticos discutidos en la Sección VII, infra. Para
ligandos de ACT-4 unidos a membrana, los fragmentos
de unión comprenderán parte del dominio extracelular de un receptor
ACT-4. Los ligandos de ACT-4 y
fragmentos de los mismos también son útiles en ensayos de cribado
para identificar agonistas y antagonistas de ACT-4
y/o su ligando. Los ligandos de ACT-4 se pueden
fusionar a otra proteína, tal como toxinas y dominios constantes de
inmunoglobulinas, como se discute, supra, para receptores de
ACT-4.
Los fragmentos de receptor ACT-4
y ligando de ACT-4, análogos de los mismos,
anticuerpos y anticuerpos anti-idiotipo para los
mismos, así como otros agentes químicos o biológicos, son cribados
por su capacidad para bloquear o potenciar la unión de un ligando
de ACT-4 a su receptor. Además, se ensayan por su
capacidad a estimular o inhibir procesos metabólicos, tales como
síntesis de ADN o fosforilación de proteínas en células que llevan
ya sea un receptor ACT-4 o un ligando de
ACT-4 anclado a su superficie.
En algunos procedimientos, el compuesto en
ensayo se criba por su capacidad para bloquear o potenciar la unión
de un fragmento de unión purificado de un receptor
ACT-4 (o proteína de fusión del mismo) a un
fragmento de unión purificado de un ligando de ACT-4
(o proteína de fusión del mismo). En dichos experimentos, el
fragmento del receptor o del ligando se inmoviliza en un soporte
sólido. El compuesto en ensayo entonces compite con un fragmento
del ligando o del receptor ACT-4 (el que se quiera
no está inmovilizado en el soporte) por la unión al soporte.
Habitualmente, bien el compuesto en estudio o el ligando o receptor
que compite está marcado.
En otros procedimientos, cualquiera o tanto el
receptor como el ligando de ACT-4, o fragmentos de
unión de estas moléculas, se expresan en una superficie celular.
Por ejemplo, el antígeno de
ACT-4-h-1 se expresa
a partir de ADN recombinante en p.e., células COS-7
(véase Ejemplo 6). En estos procedimientos, la existencia de
agonismo o antagonismo se determina a partir del grado de unión
entre un receptor ACT-4 y su ligando que ocurre en
presencia del compuesto en estudio. Alternativamente, la actividad
del compuesto en estudio se ensaya midiendo la incorporación de
timidina-H^{3} en ADN o la incorporación de
P^{32} en proteínas de células que llevan un receptor
ACT-4 y/o células que llevan un ligando de
ACT-4.
Son antagonistas los compuestos que bloquean la
síntesis de ADN inducida por ACT-4 o la
fosforilación de proteínas. Son agonistas los compuestos que
activan la síntesis de ADN o la fosforilación mediante la
interacción con un receptor ACT-4 o su ligando. La
actividad agonista o antagonista se puede determinar a partir de
otros aspectos funcionales o físicos de la activación de leucocitos
o a partir de efectos deseables o indeseables, tales como la
actividad citolítica o la extravasación de leucocitos en tejidos
procedentes de vasos sanguíneos.
La capacidad de los agentes para agonizar o
antagonizar la proliferación de células T in vitro se puede
correlacionar con la capacidad a afectar la respuesta inmune in
vivo. La actividad in vivo se ensaya, típicamente,
utilizando modelos animales adecuados tales como ratones o ratas.
Para determinar el efecto de agentes en el rechazo a aloinjertos,
por ejemplo, se pueden administrar agentes terapéuticos potenciales
a los animales a varios tiempos antes de la introducción del tejido
alogénico; y los animales se pueden seguir por el rechazo a
transplante. Se han descrito métodos adecuados para llevar a cabo
el transplante y seguimiento del rechazo a transplante (véase,
p.e., Hislop et al., J. Thorac. Cardiovasc.
100:360-370 (1990)).
Las enfermedades y trastornos del sistema inmune
asociados con una abundancia alterada, o una mutación funcional, de
un receptor ACT-4 o su ARNm, o un ligando de
ACT-4 o su ARNm se pueden diagnosticar usando
sondas y/o anticuerpos. La provisión de anticuerpos contra el
receptor ACT-4 y sondas de ácido nucleico
complementarias a su ARNm permiten a las células T CD4+ ser
distinguidas de otros subtipos leucocitarios. La presencia de
dichas células es indicativa de una respuesta inmune inducida de MHC
de clase II contra, p.e., bacterias invasoras. La comparación de
los números da células CD4+ y células CD8+ activadas puede permitir
el diagnóstico diferencial entre infecciones bacterianas y víricas,
las cuales inducen predominantemente estos tipos de células
activadas, respectivamente. La presencia de células CD4+ es también
indicativa de enfermedades y trastornos no deseables del sistema
inmune, tal como el rechazo a aloinjerto, injerto versus enfermedad
del hospedador, enfermedades autoinmunes, alergias e inflamación.
Se puede seguir la eficacia de los agentes terapéuticos en el
tratamiento de dichas enfermedades y trastornos.
El diagnóstico se puede llevar a cabo extrayendo
una muestra celular (p.e. una muestra de sangre, una biopsia del
nódulo linfoide o tejido) de un paciente. La muestra se somete, a
continuación, a análisis para determinar: (a) la cantidad de
receptor ACT-4 expresado o ligando en células
individuales de la muestra (p.e. mediante tinción
inmunohistoquímica de células fijadas con un anticuerpo o análisis
FACS^{TM}), (2) la cantidad de ARNm del receptor
ACT-4 o ligando en células individuales (mediante
hibridación in situ con una sonda polinucleotídica
complementaria marcada), (3) la cantidad de ARNm del receptor
ACT-4 o ligando en la muestra celular mediante
extracción de ARN seguida de la hibridación a una sonda
polinucleotídica marcada (p.e. mediante transferencia Northern,
"dot blotting", hibridación en solución o PCR cuantitativa), o
(4) la cantidad de receptor ACT-4 o ligando en la
muestra celular (p.e. mediante interrupción celular seguida del
inmunoensayo o transferencia Western del extracto celular
resultante).
El diagnóstico también se puede conseguir
mediante administración in vivo de un reactivo de
diagnóstico (p.e. un anticuerpo anti-receptor
ACT-4 marcado para el diagnóstico de células T CD4+
activadas) y la detección por imagen in vivo. La
concentración del agente de diagnóstico administrado debería ser
suficiente para que la unión de aquellas células que tengan el
antígeno diana sea detectable comparado con la señal de fondo.
Además, es deseable que el reactivo de diagnóstico se pueda
eliminar rápidamente del sistema circulatorio con el fin de dar la
mejor proporción de señal diana-fondo. El reactivo
diagnóstico se puede marcar con un radioisótopo para la imagen por
cámara o un isótopo paramagnético para resonancia magnética o
imagen de resonancia por spin electrónico.
Un cambio (típicamente un incremento) en el
nivel de proteína o ARNm de receptor ACT-4 o
ligando en una muestra celular de un individuo, que se encuentre
fuera del rango de los niveles normales establecidos clínicamente,
pueden indicar la presencia de una reacción inmune indeseable en el
individuo del que procede la muestra, y/o indicar una predisposición
del individuo al desarrollo (o progreso a través de) dicha
reacción. Los niveles de proteína o ARNm se pueden utilizar como
marcadores diferenciales para identificar y tipificar células de
ciertos linajes (i.e., células CD4+ activadas por el receptor
ACT-4) y orígenes del desarrollo. Dicha detección
específica de tipo celular se puede utilizar para el diagnóstico
histopatológico de respuestas inmunes indeseadas.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
kits de diagnóstico para métodos de diagnóstico descritos
supra. Los kits comprenden envases(s) que incluyen
los reactivos diagnósticos, tales como anticuerpos marcados contra
receptores de ACT-4 y/o aparatos para la detección
de la señal. Otros componentes encontrados de manera rutinaria en
dichos kits también pueden estar incluidos junto con instrucciones
para llevar a cabo la prueba.
Las composiciones farmacéuticas utilizadas para
el tratamiento profiláctico o terapéutico comprenden un agente
terapéutico activo, por ejemplo, un receptor ACT-4,
un ligando, fragmentos de los mismos, y anticuerpos y anticuerpos
idiotípicos a los mismos, y una variedad de otros componentes. La
forma preferida depende del modo deseado de administración y de la
aplicación terapéutica. Las composiciones pueden incluir también,
dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no
tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos
comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para la
administración animal o humana. El diluyente se selecciona de
manera que no afecte la actividad biológica de la combinación.
Ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, salino
fisiológico, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución
de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también
puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizandtes no
tóxicos no terapéuticos y similares.
Los métodos terapéuticos utilizan agentes
terapéuticos discutidos más arriba para el tratamiento de varias
enfermedades en humanos o animales, particularmente mamíferos
vertebrados. Los agentes terapéuticos incluyen receptores de
ACT-4, fragmentos de unión a los mismos, ligandos de
ACT-4, fragmentos de unión a los mismos,
anticuerpos anti-receptor ACT-4 y de
ligandos y anticuerpos anti-idiotípicos a los
mismos, fragmentos de unión de estos, versiones humanizadas de
estos anticuerpos, inmunotoxinas y otros agentes discutidos,
supra. Algunos agentes terapéuticos funcionan bloqueando o
antagonizando de otra manera la acción de un receptor
ACT-4 con su ligando. Otros agentes terapéuticos
funcionan destruyendo células que llevan un polipéptido contra el
cual se dirige el agente. Por ejemplo, los anticuerpos
anti-receptor ACT-4 con funciones
efectoras o que se conjugarte a toxinas, radioisótopos o fármacos,
son capaces de destruir selectivamente células T CD4+ activadas. La
eliminación selectiva de dichas células es particularmente
ventajosa debido a que se puede reducir o eliminar una respuesta
inmune indeseable mientras se mantiene una capacidad inmune
residual en la forma de células CD4+ y células CD8+ inactivadas para
combatir la invasión de microorganismos a los que un paciente puede
subsiguientemente ser expuesto. Otros agentes terapéuticos
funcionan corno agonistas de la interacción entre el receptor
ACT-4 y el ligando.
En las aplicaciones terapéuticas, se administra
una composición farmacéutica (p.e. que comprende un anticuerpo
anti-receptor ACT-4), in
vitro o ex vivo, a un paciente que ya sufre de una
respuesta inmune indeseada (p.e. rechazo a un transplante), en una
cantidad suficiente para curar, detener parcialmente o disminuir de
manera detectable la progresión de la condición y sus
complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se
define como una "dosis terapéuticamente efectiva" o "dosis
eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la
severidad de la condición, el estado general del paciente y la ruta
de administración y combinación con otros fármacos
inmunosupresores, si hay, pero oscilan generalmente en el rango de
aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 g de agente activo por
dosis, siendo comúnmente usadas unidades de dosificación únicas de
10 mg a 100 mg por paciente. Las composiciones farmacéuticas se
pueden administrar sistemáticamente por infusión intravenosa, o
localmente mediante inyección. La última es particularmente útil
para una respuesta inmune no deseada localizada tal como hospedados
versus rechazo a injerto. Para una breve revisión de métodos de
liberación de fármacos, ver Langer, Science
249:1527-1533 (1990).
En aplicaciones profilácticas se administran las
composiciones farmacéuticas a pacientes con riesgo de, pero que no
estén sufriendo de urda reacción inmune no deseada (p.e., un
paciente a punto de experimentar cirugía de transplante). La
cantidad de anticuerpo a ser administrado es una "dosis
profilácticamente efectiva", las cantidades precisas de las que
dependerá el estado de salud del paciente y el nivel de inmunidad
general, pero generalmente está en el rango de 10 ng a 1 g por
dosis, especialmente de 10 mg a 100 mg por paciente.
Debido a que los agentes terapéuticos de la
invención son probablemente más selectivos y generalmente menos
tóxicos que los agentes de inmunomodulación convencionales, será
menos probable que causen los efectos secundarios observados
frecuentemente con los agentes convencionales. Además, debido a que
algunos de los agentes terapéuticos son secuencias de proteínas
humanas (p.e. fragmentos de unión de receptor ACT-4
o ligando o anticuerpos humanizados), es menos probable que causen
respuestas inmunológicas tales como las observadas con anticuerpos
anti- CD3 de murina. Los agentes terapéuticos de la presente
invención se pueden combinar con agentes terapéuticos tradicionales
y se pueden usar para disminuir la dosis de dichos agentes a
niveles por debajo de los asociados con los efectos secundarios.
Por ejemplo, se pueden usar junto con los agentes terapéuticos de
la presente invención otros agentes inmunosupresores tales como
anticuerpos al dominio \alpha3, antígenos de células T (p.e. OKT4
y OKT3), globulina anti-timitocito así como agentes
quimioterapéuticos tales como ciclosporina, glucocorticoides,
azatioprina, prednisona.
Para la destrucción de una población específica
de células diana, puede ser ventajoso conjugar los agentes
terapéuticos de la presente invención a otra molécula. Por ejemplo,
los agentes se pueden unir a liposomas que contienen agentes
inmunosupresores concretos, a un anticuerpo monoclonal específico o
a una citotoxina u otro modulador de la actividad celular, por lo
cual la unión del conjugado a una población celular diana resultará
en la alteración de la población. Se han discutido una serie de
toxinas proteicas, supra. Agentes quimioterapéuticos
incluyen, por ejemplo, doxorubicina, daunorubicina, metotrexato,
citotoxina y ARN anti-sentido. También se pueden
usar antibióticos. Además, se pueden usar radioisótopos tales como
el itrio-90, fósforo-32,
plomo-212, yodo-131 o
paladio-109. La radiación emitida destruye las
células diana.
Las composiciones farmacéuticas discutidas más
arriba son adecuadas para el tratamiento de varias enfermedades y
trastornos del sistema inmune.
Durante los últimos años, se ha mejorado
considerablemente la eficacia en las técnicas de cirugía para el
transplante de tejidos y órganos tales como piel, riñón, corazón,
pulmón, páncreas y médula ósea. Quizás el problema pendiente es la
falta de agentes satisfactorios para inducir inmunotolerancia en el
receptor del aloinjerto u órgano transplantado. Cuando se
transplantan órganos o células alogénicas en un hospedador (i.e.,
el donante y donador son individuos diferentes de la misma especie),
el sistema inmune del hospedador es probable que monte una
respuesta inmune a antígenos extraños en el transplante (patología
hospedador-versus-injerto) llevando a la destrucción del
tejido transplantado. Las células CD8+, células CD4+ y monocitos
están implicados en el rechazo de transplantes de tejidos. Los
agentes terapéuticos de la presente invención son útiles en el
bloqueo de respuestas inmunes inducidas por aloantígeno en el
donador (p.e. bloqueo o eliminación de la activación de alógeno de
células T CD4+ mediante anticuerpos anti-receptor
ACT-4), previniendo de esta manera que estas
células participen en la destrucción del tejido u órgano
transplantado.
Un uso relacionado para los agentes terapéuticos
de la presente invención es la modulación de la respuesta inmune
implicada en la enfermedad de "injerto versus
hospedador" (GVHD). GVHD es una enfermedad potencialmente fatal
que tiene lugar cuando células competentes inmunológicamente son
transferidas a un receptor alogénico. En esta situación, las
células inmunocompetentes del donante pueden atacar tejidos en el
receptor. Los tejidos de la piel, epitelio del intestino e hígado
son dianas frecuentes y pueden ser destrozados durante el curso de
la GVHD. La enfermedad presenta un problema especialmente severo
cuando el tejido inmune está siendo transplantado, tal como en el
transplante de médula ósea; pero también se ha indicado una GHVD
menos severa en otros casos, incluyendo transplantes de corazón e
hígado. Los agentes terapéuticos de la presente invención se usan
para bloquear la activación de, o eliminar, las células T del
donante (en particular células T CD4+ activadas, para agentes
terapéuticos dirigidos contra el receptor ACT-4),
inhibiendo de esta manera su capacidad de lisar células diana en un
hospedador.
Una situación adicional en la que se desea la
supresión inmune es en el tratamiento de enfermedades autoinmunes
tales como la diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis
múltiple, síndrome del hombre rígido, artritis reumatoide,
miastenia gravis y lupus eritematosos. En estas enfermedades, el
cuerpo desarrolla una respuesta celular y/o humoral contra uno de
sus propios antígenos llevando a la destrucción del antígeno y
potencialmente a consecuencias atroces y/o fatales. Las células T
CD4+ activadas se cree que juegan un papel principal en muchas
enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes se tratan
mediante la administración de uno de los agentes terapéuticos de la
invención, en particular agentes dirigidos contra un receptor
ACT-4. Opcionalmente, el autoantígeno, o un
fragmento del mismo, contra el que la enfermedad autoinmune se
dirige se puede administrar poco después, de manera concurrente
con, o poco después del agente inmunosupresor. De esta manera, se
puede inducir tolerancia al autoantígeno bajo del tratamiento
supresor, obviando de esta manera la necesidad de inmunosupresión
continuada. Véase, p.e., Cobbold et al., WO 90/15152
(1990).
La inflamación representa la consecuencia de la
dilatación capilar con acumulación de fluido y migración de
leucocitos fagocíticos, tales como granulocitos y monocitos. La
inflamación es importante en la defensa de un hospedador contra una
diversidad de infecciones pero también puede tener consecuencias
indeseables en alteraciones inflamatorias, tales como el choque
anafiláctico, artritis y gota. Las células T activadas tienen un
papel inmunodolador importante en la inflamación, liberando el
interferón \gamma y factores de estimulación de colonias que a su
vez activan leucocitos fagocíticos. Los leucocitos fagocíticos son
inducidos para que expresen una serie de moléculas de superficie
celular específicas denominadas receptores buscadores
("homing") que sirven para atacar los fagocitos para
dirigir células endoteliales. Las respuestas inflamatorias se
pueden reducir o eliminar mediante tratamiento con los agentes
terapéuticos de la presente invención. Por ejemplo, los agentes
terapéuticos dirigidos contra el receptor ACT-4
funcionan bloqueando la activación de, o eliminando, células CD4+
activadas, previniendo de esta manera que estas células liberen
moléculas requeridas en la activación de tipos celulares
fagocíticos.
La invención también proporciona procedimientos
para aumentar la eficacia de vacunas en la prevención o tratamiento
de enfermedades y trastornos que resultan de agentes infecciosos.
Los agentes terapéuticos que tiene la capacidad de activar células
T CD4+ (p.e., determinados anticuerpos monoclonales contra un
polipéptido del receptor ACT-4) se administran poco
antes, de manera concurrente con, o poco después de la vacuna que
contiene el antígeno seleccionado. El agente terapéutico sirve para
aumentar la respuesta inmune contra el antígeno seleccionado. Estos
procedimientos pueden ser particularmente ventajosos en pacientes
que sufren de enfermedades de inmunodeficientes.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos para
ilustrar, pero no para limitar, la invención.
Se inmunizaron ratones con linfoblastos T
transformados con PHA. Se fusionaron los esplenocitos de ratones
inmunizados con células de mieloma SP2/O y se seleccionaron los
hibridomas que secretaron anticuerpos específicos para el clon de
células T. Los hibridomas se clonaron mediante dilución limitante.
Se seleccionó un anticuerpo monoclonal, designado L106, producido
por uno de los hibridomas resultantes, para una caracterización
adicional. Se encontró que el anticuerpo L106 tenía un isotipo IgG1.
Se ha depositado un hibridoma productor del anticuerpo, designado
HBL106, en la American Type Culture Collection de Rockville;
Maryland, el 3 de Noviembre de 1993, y asignado con el número de
acceso ATCC Nº ATCC HB 11483.
Las muestras que contenían el anticuerpo L106 se
hicieron accesibles a determinados participantes del Fourth
Internacional Workshop and Conferences on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (Viena 1989) con el propósito de
identificar tipos titulares y celulares a los que se une el
anticuerpo L106. Los datos del trabajo se presenta en Leukocyte
Typing IV (ed. W, Knapp, Oxford U. Press, 1989) y que acompaña
una base de dato computacional disponible de Walter R. Gilks, MRC
Biostatistics Unit, Universidad de Cambridge, Inglaterra. Esta
referencia indica que el anticuerpo L106 se une a un polipéptido de
aproximadamente 50 kDa. El polipéptido se indicó que estaba
presente en células HUT-102 (una línea de células T
transformadas), linfocitos de sangre periférica activados con PHA,
una línea linfoide de células B transformadas con EBV, línea de
células T transformadas con HTLV-II, células de
amígdalas activadas con PMA, PBL activados con ConA o PMA y
monocitos activados con PMA. Se indicó que el polipéptido estaba
sustancialmente ausente de inter alia restos de basófilos,
monocitos periféricos, células mononucleares periféricas, células T
periféricas y células sanguíneas rojas periféricas.
Los presente inventores han obtenido datos que
indican que el polipéptido de 50 kDa (de aquí en adelante
"receptor
ACT-4-h-1") se
expresa preferencialmente en subespecies de CD4+ de células T
activadas. En un serie de experimentos, se analizó la expresión de
ACT-4-h-1 específica
celular en PBL no fraccionados mediante un método de tinción de dos
colores. Los PBL se activaron con PHA durante aproximadamente dos
díal (utilizando condiciones de cultivo descritas en el Ejemplo 3)
y analizadas por la expresión de superficie celular de
ACT-4-h-1 en
diferentes subtipos celulares mediante tinción con dos anticuerpos
marcados de manera diferente (marcadores FITC y PE). Se detectaron
los marcadores mediante análisis FACS^{TM} según se describe
esencialmente en Picker et al., J. Immunol. 150:
1105-1121 (1993). Un anticuerpo, L106, era
específico de
ACT-4-h-1, el otro
anticuerpo era específico de un subtipo de leucocitos concreto. La
Fig. 1 muestra tres gráficos en los que la tinción de L106 se
muestra en el eje de las Y en cada gráfico y la tinción
anti-CD4, anti-CD8 y
anti-CD19 como ejes X de cada uno de los respectivos
gráficos. Para el gráfico teñido con anti-CD4,
aparecen muchas células como dobles postivos (es decir, expresan
tanto CD4 como
ACT-4-h-1). Para el
gráfico teñido con anti-CD8, poquísimas células
aparecen como doble positivas. Para el gráfico teñido con
anti-CD19 (un marcador de células B), las células
doble positivas están sustancialmente ausentes.
En otra serie de experimentos, se analizó la
expresión de
ACT-4-h-1 mediante
tinción con un solo color en tipos celulares aislados. Se tiñeron
las células con anticuerpo L106 marcado fluorescentemente y se
detectó el marcaje mediante análisis FACS^{TM}. Véase Engleman
et al., J. Immunol. 127:2124-2129
(1981). En algunos experimentos, se activaron células mediante
estimulación con PHA durante aproximadamente dos días (otra Vez
usando las condiciones de cultivo descritas en el Ejemplo 3). Los
resultados de este experimento, junto con los obtenidos de los
experimentos de tincióh con dos colores descrito supra, se
resumen en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra que aproximadamente el
80% de células CD4+ activadas expresaban
ACT-4-h-1 con una
fluorescencia de canal medio de >20, sin tener en cuenta si las
células CD4+ están aisladas (tinción de un color) o eh PBL no
fraccionado (tinción de dos colores). El nivel de expresión de
ACT-4-h-1 en células
CD8+ activadas es mucho menor que en células T CD4+ activadas en el
experimento de tinción de dos colores, y mucho menor quejen la
tinción con un color. De esta manera, la extensión de la expresión
en células CD8+ activadas parece depender de si las células CD8+
están fraccionadas de otras PBL antes de la activación. En células
CD8+ no fraccionadas (tinción de dos colores), aproximadamente un
10% de las células expresa
ACT-4-h-1, con una
fluorescencia de canal medio de aproximadamente 4. En las células
fraccionadas, sólo aproximadamente un 4% de células expresa
ACT-4-h-1 con una
fluorescencia de canal medio del aproximadamente 2. Estos datos
sugieren que
ACT-4-h-1 se expresa
solo en un pequeño subtipo de células CD8+ activadas y que este
subtipo es algo más prevalerte cuando las células CD8+ se activan
en presencia de otros PBL.
La Tabla 1 también indica que
ACT-4-h-1 estaba
sustancialmente ausente de subtipos de leucocitos en reposo
ensayados (i.e., células T CD4+, células T CD8+, células B CD19+,
monocitos CD14+, granulocitos y plaquetas) y también se encontró
sustancialmente ausente de células B activadas y monocitos. También
se encontró que
ACT-4-h-1 estaba
sustancialmente ausente en la mayoría de líneas de células tumorales
ensayadas. Sin embargo, las líneas celulares Molt3, Raji y NC37
mostraron un nivel bajo de expresión.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se probó en células T CD4+ la expresión de
receptores de
ACT-4-h-1 en
respuesta a varios estímulos de activación. Se purificaron las
células T CD4+ de células mononucleares de sangre periférica
mediante inmunoadsorción en fase sólida ("panning"). Se
cultivaron 5 x 10^{4} células T CD4+ con un agente de activación
en pocillos de microtitulación que contenían medio RPMI
suplementado con suero humano al 10%. Se usaren tres agentes de
activación diferentes: (1) 5 x 10^{4} de monocitos irradiados
(3000 rads), (2) PHA (1 \mug/ml) y (3) toxoide del tétano (5
\mug/ml). Se añadió timidina-H^{3} a los
cultivos 12-16 h antes de la recogida. Después de la
recogida, se probó en las células la expresión de antígenos de
superficie celular con varios anticuerpos marcados (L106,
anti-CD4 y anti-CD8), según se
describe en Engleman et al., J. Immunol.
127:2124-2129 (1981).
La Figura 2 muestra la aparición de
ACT-4-h-1 en
respuesta a la activación por aloantígeno. Antes de la activación,
no se observó expresión. El porcentaje de células que expresan el
receptor ACT-4-h-1
aumenta con el tiempo, alcanzando su nivel más alto a
aproximadamente el 30% después de aproximadamente siete días de la
activación por aloantígeno. Los resultadds también muestran que
esencialmente todas las células que expresan
ACT-14-h-1 también
expresaban el receptor de CD4 y que esencialmente ninguna de dichas
células expresaba el receptor de CD8. La Figura 3 presenta datos
similares para la aparición de
ACT-4-h-1 en
respuesta a la activación del toxoide del tétano. Otra vez, el
porcentaje de células que expresan
ACT-4-h-1 alcanzó
un máximo a aproximadamente los siete días. Sin embargo, en ese
momento un porcentaje superior de células (aproximadamente el 60%)
expresaron el receptor. La Figura 4 presenta datos similares para la
aparición de
ACT-4-h-1 en células
T CD4+ en respuesta a la activación por PHA. En esta situación, el
porcentaje de células T CD4+ que expresan el receptor alcanza el
máximo de aproximadamente el 65% después de tres días de
activación.
Se concluye que
ACT-4-h-1 es un
antígeno de la activación de células T CD4+ que se expresa en
respuesta a estímulos de activación diversos.
El clon de ADNc para el receptor
ACT-4-h-1 se aisló
utilizando un sistema de expresión de células COS ligeramente
modificado, desarrollado primero por Aruffo y Seed, supra.
Se aisló el ARN de linfocitos de sangre periférica humana activados
con PHA durante 72 horas. El ARN total se extrajo con reactivo TRI
(Molecular Research Center) y poli(A)+ARN se aisló mediante
purificación en perlas oligo-dT magnéticas
(Promega). Se sintetizó el ADNc mediante el método de Gubler y
Hoffman, Gene: 25-263-269
(192) usando transcriptasa inversa superscript (Gibco/BRL) y un
cebador oligo dT. El ADNc despuntado se ligó a adaptadores BstXI no
autocomplementarios y se pasaron a través de una columna de spin de
sefacril S-400 para eliminar los adaptadores no
ligados y los pequeños fragmentos
(< 300 pares de bases). El ADNc engarzado se ligó a continuación en un vector de expresión eucariota cortado BstXI, pcDNA-IRL, una versión resistente a ampicilina de pcDNA.I (Invitrogen). Los productos precipitados y lavados de la reacción de ligación se sometieron a electroforesis en la cepa de E. coli WM1100 (BioRad). Se plaqueó y contó una alícuota de las bacterias transformadas, revelando una cuenta total de 2 millones de clones independientes en la librería sin amplificar. El tamaño medio del inserto se determinó que era de 1,2 kb. El volumen de la librería se amplificó en cultivo líquido, 250 mI de medio LB estándar. El plásmido se recuperó mediante lisis alcalina y se purificó en una columna de intercambio iónico (Qiagen).
(< 300 pares de bases). El ADNc engarzado se ligó a continuación en un vector de expresión eucariota cortado BstXI, pcDNA-IRL, una versión resistente a ampicilina de pcDNA.I (Invitrogen). Los productos precipitados y lavados de la reacción de ligación se sometieron a electroforesis en la cepa de E. coli WM1100 (BioRad). Se plaqueó y contó una alícuota de las bacterias transformadas, revelando una cuenta total de 2 millones de clones independientes en la librería sin amplificar. El tamaño medio del inserto se determinó que era de 1,2 kb. El volumen de la librería se amplificó en cultivo líquido, 250 mI de medio LB estándar. El plásmido se recuperó mediante lisis alcalina y se purificó en una columna de intercambio iónico (Qiagen).
Se tranfectaron células COS-7
sub-confluentes con el plásmido de ADN purificado
mediante electroporación. Las células se plaquearon en discos de
100 mm y se dejaron crecer durante 48 horas. Se recuperaron las
células de las placas con una solución PBS-EDTA, se
incubaron con anticuerpo monoclonal L106 y se lavaron
("panned") de acuerdo con procedimientos estándar. Una segunda
ronda de panning reveló enriquecimiento ya que habían
quedado adsorbidas numerosas células COS en las placas. El ADN
episómico se recuperó de las células inmunoseleccionadas mediante
el método de Hirt y se sometieron a electroporación en bacterias
para la amplificación.
Las bacterias transformadas con el plásmido de
la preparación con Hirt de la segunda ronda se diluyeron en
pequeños pools de aproximadamente 100 colonias. Los
pools se amplificaron y su ADN se purificó y se determinó su
capacidad para conferir expresión de antígeno de L106 en células
COS-7 mediante inmunofluorescencia. El anticuerpo
L106 conjugado a ficoeritrina se usó para teñir monocapas de
células COS-7 y las células se examinaron a
continuación mediante microscopía de inmunofluorescencia manual. El
ADN miniprep de 4 de los ocho pools fue positivo cuando se
determinó la expresión. El pool con la mejor expresión,
pool E, se dividió en pools más pequeños de 12
colonias. Tres de los ocho sub-pools fueron positivos y el
sub-pool E1 se colocó en una placa para llevar a cabo el
análisis de las colonias individuales. El clon E1-27
se encontró que confería un nivel de expresión elevado del receptor
ACT-4-h-1 en la
superficie de células COS transfectadas.
El inserto del clon designado
El-27 se subclonó en pBluescript y sel secuenció
mediante el método de terminación de cadena didesoxi, utilizando el
kit de secuenciación de autolectura de la polimerasa T7 (Pharmacia)
en un secuenciador ALF (Pharmacia). El mapa de restricción reveló
varios sitios convenientes para la subclonación. Se generaron cinco
subclones en pBluescript y se secuenciaron en ambas cadenas con
cebadores de M13 forward y universales.
Las secuencias de ADNc y de aminoácidos deducida
se ACT-4-h-1 de
muestran en Fig. 5. La secuencia de ADNc de
ACT-4-h-1 de 1.137
pares de bases contiene una región en 5' no traducida de 14 pb y
una región en 3' no traducida de 209 pb. Está presente una señal de
poliadenilación AATAAA en la posición 1.041 seguida de una cola de
poli A de 80 pb que empieza en lo posición 1.057. El marco de
lectura abierto más largo empieza con el primer ATG en la posición
15 y finaliza con un TGA en la posición 846. La secuencia de
aminoácidos predicha es la de una proteína de membrana integral de
tipo I típica. El análisis de hidrofobicidad revela una secuencia
señal putativa a continuación del ATG de inicio, con una extensión
corta de residuos básicos seguida de una extensión más larga de
residuos hidrofóbicos. Un sitio de escisión del péptido señal
predicho está presente en el residuo 22 ó 24 (el último siendo más
probable por los criterios de von Hejne, Nucleic Acids. Res. 14,
4683-4690 (1986)), dejando una proteína madura de
253 residuos aminoacídicos (ó 255 aminoácidos, si el corte sucede
en el sitio menos probable). El análisis de hidrofobicidad también
revela una única extensión larga de 27 residuos hidrofóbicos que se
predice que es el dominio transmembrana, lo cual predice un dominio
extracelular de 189 (ó 191) aminoácidos y un dominio intracelular
de 37 aminoácidos. El dominio extracelular es rico en cisteína,
donde se encuentran 18 cisteínas dentro do una extensión de 135
aminoácidos. La masa molecular predicha (Mr) para Na proteína
madura es de 27.400, y existen dos sitios de
N-glicosilación en los residuos aminoacídicos 146 y
160.
La comparación de la secuencia de aminoácidos de
ACT-4-h-1 con
secuencias conocidas en la base de datos swiss-prot
utilizando el programa BLAZE revela una similitud de secuencia con
miembros de la superfamilia de receptores del factor de crecimiento
neuronal. Las secuencias de aminoácidos son al menos un 20%
idénticas a NGF-R, TNF-R, CD40,
41-BB y fas/APO-1 y un 62% para
OX-40, dejando huecos y deleciones. Las
alineaciones de las diversas proteínas revelan la conservación de
los múltiples motivos ricos en cisteína. Tres de estos motivos
están presentes en
ACT-4-h-1 y
OX-40, comparado con dichos cuatro motivos en
NGF-R y CD40.
La comparación de la secuencia nucleótida de
ACT-4-h-1 con las
secuencias conocidas en las bases de datos de Genbank y EMBL
utilizando los programas BLAST y FASTDB revelaron un grado elevado
de similitud de secuencia con un único miembro de la familia de
receptores del factor de crecimiento neuronal,
OX-40. Dejando los huecos e inserciones, la
identidad de secuencia es del 66%. La comparación de las secuencias
de nucleótidos de
ACT-4-h-1 y
OX-40 revela que ambas contienen una región en 5' no
traducida de 14 pb y ambas contienen colas de poli A de
aproximadamente 80 pb. En
ACT-4-h-1, sin
embargo, existe una ligera prolongación de la región 3' no
traducida desde 187 pb a 209 pb, y existe una prolongación de la
región codificante de 816 pb a 834 pb, una diferencia de 18 pb o de
6 aminoácidos insertadas. La alineación de las dos secuencias de
aminoácidos revela que cuatro de las inserciones de aminoácidos
ocurren antes del sitio de corte de la secuencia señal. De esta
manera, la proteína madura del receptor
ACT-4-h-1 contiene
uno o más residuos aminoacídicos que OX-40 (i.e.,
253 vs. 252 aminoácidos). Extraordinariamente, la secuencia
nucleotídica de
ACT-4-h-1 es mucho
más rica en GC que la secuencia de OX-40 (70% vs.
55%) indicando que las dos secuencias no hibridarán en condiciones
rigurosas.
Se cortó un fragmento
XbaI-HindIII de la construcción descrita en el
Ejemplo 4, y se insertó en
pcDNA-I-neo digerido con
XbaI/HindIII (Invitrogen) para generar un vector de expresión
denominado
ACT-4-h-1-neo
(Fig. 6). Este vector se linealizó con Sf1 y se sometió a
electroforesis en tres líneas de células eucariotas. Estas líneas
de células fueron SP2/O (mieloma de ratón derivado de la cepa
Balb/c), Jrkat (una línea de células T humanas transformadas) y
COS-7 (una línea de células adherentes de mono).
Después de un periodo de recuperación de 48 h, se seleccionaron las
células transformadas en 1 mg/ml de G418 (Gibco). Después de tres
semanas de selección, las líneas celulares resistentes a neo se
incubaron con una concentración saturada de anticuerpo L106, se
lavaron y se sobrecubrieron en placas de petri de 100 mm cubiertas
con IgG de cabra anti-ratón para seleccionar las
células que expresaban
ACT-4-h-1. Después
de lavar las células no unidas, se recuperaron las células
adherentes y se expandieron en un cultivo celular. Las líneas
celulares se sometieron a dos rondas más de panning y
expresión. Las líneas celulares resultantes se mostraron mediante
tinción por inmunofluorescencia por la expresión de
STAN-4-h-1 (Fig.
7).
Ha sido construida una proteína de fusión
soluble en la que el dominio extracelular de
ACT-4-h-1 se une a
través de su C-terminal al
N-terminal dél dominio constante de una
inmunoglobulina humana. El vector que codifica
ACT-4-h-1 descrito
en el Ejemplo 4 se cortó con SmaI y NotI para cortar todas las
secuencias de
ACT-4-h-1
downstream del sitio SmaI, incluyéndolas regiones
transmembrana, citoplasmática y la 3' no traducida. La región
restante codifica la porción extracelular soluble de
ACT-4-h-1 (Fig. 8).
La fuente de la región constante de la inmunoglobulina a ser unida
al dominio) extracelular de
ACT-4-h-1 era un
plásmido denominado 5K-41BB-Eg1
(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
89:10360-10364). Este plásmido contiene un
fragmento genómico de 1,3 kb BamHI/EagI que codifica los dominios
bisara, CH2 y CH3 terminal de la Ig humana, isotipo gamma 1. El
fragmento requirió la modificación para la inserción en los
extremos SmaI/NotI del vector de
ACT-4-h-1, mientras
se conserva el marco de lectura peptídico a través 0 la unión de
SmaI a ser formada mediante ligación de extremos despuntados. El
vector 5k-41BB-Eg1 se cortó con
BamH1 y las extensiones en 5' resultantes se rellenaron con
fragmento klenow. El vector se cortó a continuación con EagI
liberando el fragmento de 1,3 kb con extremos despuntados y
compatibles con NotI. Este fragmento se ligó con el vector
ACT-4-h-1 digerido
con SmaI/NotI. La mezcla de ligación se sometió a electroforesis en
E. coli y los múltiples clones transformantes se cribaron
por PCR usando como cebadores fragmentos de nucleótidos de
ACT-4-h-1 e
IgG1.
Los plásmidos que contenían el
ACT-4-h-1-IgG1
codificante se sometieron a electroporación en células COS. Las
células se dejaron crecer durante cinco días en cuyo punto se
recogieron sus sobrenadantes y se filtraron de manera estéril a
través de una membrana de 2 micras. Se determinó en los
sobrenadantes la expresión de
ACT-4-h-1-IgG1
mediante dot blotting. Los sobrenadantes se transfirieron a
nitrocelulosa y se bloques con un 5% de leche desnatada en polvo.
Las transferencias de réplica se sondearon con anticuerpo L106 o
inmunoglobulina IgG de cabra anti-humana marcada
con fosfatasa alcalina (American Qualex). Se detectó el anticuerpo
L106 con IgG de cabra anti-ratón marcada con
fosfatasa alcalina. Se usó NBT/BCIP (Pierce) como sustrato
colorimétrico. Se secuenciaron los clones de elevada producción en
el sitio de unión para confirmar la construcción adecuada del
vector. La fusión resultante de genes se describe en Fig. 9.
Con el fin de claridad y comprensión, la
invención ha sido descrita en estos ejemplos y la descripción de
más arriba con algún detalle. Será evidente, sin embargo, que se
pueden realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del ámbito
de las reivindicaciones adjuntas. Con el fin de esta memoria y las
reivindicaciones adjuntas, cuando lo admita el contexto, un
material "aislado" significa un material que tiene una o más de
las siguientes características, que (a) ha sido purificado y/o (b)
está suficientemente libre de las impurezas contaminantes para
permitir su uso en al menos uno de los objetivos que caen dentro
del ámbito de cualquiera de uno o más propósitos mencionados en el
presente documento, y/o c) es un material de origen natural o un
material de estructura idéntica a un material de origen natural, el
cual está sustancialmente libre o ha sido liberado de al menos unos
de los componentes naturales principales que lo acompañan en su
forma natural o con al que se encuentra asociado de manera natural o
en mezcla, p.e. libre o liberada de todo o sustancialmente todo de
dichos componentes que acompañan de manera natural, y/o (d) está en
la forma de una composición que comprende un material de cualquiera
de las características precedentes junto con material(es)
adicional(es) de la naturaleza de un excipiente, diluyente,
vehículo u otro material definido químicamente o biológicamente o
farmacéuticamente de carácter aceptable para al menos uno de los
propósitos que caen dentro del ámbito de uno o más de los
propósitos mencionados en el presente documento.
La presente descripción de materiales incluye la
descripción de dichos materiales en forma aislada y la presente
descripción incluye el contenido de la descripción precedente,
dibujos y reivindicaciones adjuntas y modificaciones y variaciones
y combinaciones y subcombinaciones de las características
mencionadas aquí como será evidente para aquellos expertos en la
materia.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 900 Welch Road, Suite 350
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94304-1850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Becton Dickinson & Company
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: One Becton Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Franklin Lakes
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 07417-1880
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Godfrey, Wayne
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 18000 Skyline Boulevard
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Woodside
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94062
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Buck, David
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 1 Johnston Pier, Box 37
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Half Moon Bay
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94019
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Engleman, Edgar G.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 60 Lane Place
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Atherton
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94027
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR SOBRE LA SUPERFICIE DE CÉLULAS T CD4+ ACTIVADAS: ACT-4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE PARA ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO: Diskette, 3,5 pulgadas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/147,784
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-NOV-1993
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1057 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 15..845
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name= "ADNc de ACT-4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mise_signal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 15..86
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 277 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (25)
1. Polipéptido de un receptor
ACT-4 aislado que comprende o consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:
2;
(b) una variante relativa a la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 2, con la condición de que dicha variante
exhiba al menos un setenta por ciento de identidad de secuencia con
la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 y compita con la
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 por la unión específica de
un anticuerpo;
(c) un fragmento de un polipéptido según se
define en (a) o (b) anterior, el cual al menos es cinco aminoácidos
contiguos de longitud y compite con la secuencia de aminoácidos de
SEC ID NO: 2 por la unión específica de un anticuerpo.
2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
1, el cual comprende o consiste en
(a) la secuencia de aminoácidos del dominio
extracelular de SEC IC NO: 2;
(b) una variante relativa a la secuencia de
aminoácidos del dominio extracelular de SEC ID NO: 2 con la
condición de que dicha variante exhibo al menos un setenta por
ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos
del dominio extracelular de SEC ID NO: 2 y compita con el dominio
extracelular de SEC ID NO: 2 por la unión específica de un
anticuerpo, o
(c) un fragmento de un polipéptido según se
define en (a) o (b) anterior, el cual es al menos cinco aminoácidos
contiguos de longitud y compite con el dominio extracelular de SEC
ID NO: 2 por la unión específica de un anticuerpo.
3. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido tiene al menos
una de las siguientes características que
(a) comprende o consiste en un dominio
seleccionado de uno o más de los siguientes dominios: que consiste
en una secuencia señal, un dominio intracelular, un dominio
transmembrana o un dominio extracelular;
(b) tiene un dominio extracelular con uno o más
bucles intracatenaribs formados por enlaces disulfuro de dos
residuos de cisteína;
(c) es un polipéptido que se encuentra de manera
natural de origen humano;
(d) es un polipéptido que se encuentra de manera
natural de un tipa presente en la superficie de células T CD4+
activadas y sustancialmente ausente en células T CD8+ activadas y
células T en reposo;
(e) es un polipéptido que tiene un peso
molecular de aproximadamente 50 kDa antes de la desglicosilación y
aproximadamente de 27 kDa después;
(f) es un polipéptido que es soluble;
(g) es un polipéptido que es capaz de unirse
específicamente a un ligando de ACT-4;
(h) forma parte de un producto de globulina
recombinante; y/o
(i) forma parte de un producto de polipéptido de
fusión.
4. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
2, en donde dicho polipéptido forma parte de un polipéptido de
fusión y se fusiona a una región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina para formar un producto de fusión de globulina
recombinante.
5. Uso del polipéptido de la reivindicación 1 ó
2, en un procedimiento seleccionado de:
(a) cribado de un anticuerpo por la unión
específica al mismo epítopo al que se une un anticuerpo L106, que
comprende las etapas de: proporcionar una solución que comprende un
anticuerpo a ser cribado, dicho anticuerpo L106 y un polipéptido
del receptor
ACT-4-h-1, dicho
polipéptido uniéndose de manera específica a dicho anticuerpo L106;
y medir la unión específica entre dicho polipéptido y dicho
anticuerpo L106, o entre dicho polipéptido y dicho anticuerpo a ser
cribado, para indicar si dicho anticuerpo a ser cribado reacciona
con el mismo epítopo que dicho anticuerpo L106, y en donde el
anticuerpo L106 es producido por el hibridoma asignado con el Nº de
acceso ATCC HB 11483 en la American Type Tissue Culture Collection
depositado en Rockville, Maryland, USA;
(b) localizar un epítopo específicamente unido
mediante un anticuerpo polipeptídico anti-receptor
ACT-4, que comprende las etapas de: proporcionar
una familia de fragmentos que contienen diferentes segmentos de
aminoácidos procedentes de una secuencia del polipéptido del
receptor ACT-4, en donde cada uno de dichos
fragmentos comprende al menos cuatro aminoácidos contiguos y en
donde dicha familia de fragmentos cubre colectivamente mucho o toda
la secuencia de aminoácidos del polipéptido del receptor
ACT-4; y medir la unión específica entre dicho
fragmento y anticuerpo para perfilar la secuencia de aminoácidos
del epítopo reconocido por el anticuerpo;
(c) cribar agentes inmunosupresores, que
comprende las etapas de: poner en contacto un polipéptido del
receptor ACT-4-h-1
[(p.e. inmobilizado en una superficie sólida)] con un agente
inmunosupresor potencial; y detectar la unión específica entre
dicho polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 y dicho
agente, dicha unión específica indicativa de actividad
inmunosupresora;
(d) cribar un ligando de ACT-4,
que comprende las etapas de: poner en contacto una muestra
biológica a ser cribada por el ligando de ACT-4 con
el polipéptido del receptor ACT-4; a continuación
purificar el ligando de ACT-4 aislando un complejo
formado entre dicho ligando y dicho polipéptido del receptor
ACT-4; y disociar dicho complejo para obtener dicho
ligando; y
(e) ensayar una muestra con el propósito de
detectar una pareja de unión específica del polipéptido del
receptor ACT-4-h-1,
comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra a ser
ensayada directamente o indirectamente marcada con el polipéptido
del receptor
ACT-4-h-1 y detectar
la unión específica entre la pareja de unión específica y el
polipéptido del receptor
ACT-4-h-1, si está
presente en la muestra a ser ensayada, revelando de esta manera la
presencia de dicha sustancia en la muestra.
6. Anticuerpo aislado o un fragmento del mismo
que se une específicamente a un polipéptido del receptor
ACT-4 de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3.
7. Anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo
con la reivindicación 6, que específicamente se une al polipéptido
del receptor
ACT-4-h-1 de la
reivindicación 1 ó 2.
8. Anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo
con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde dicho
anticuerpo es monoclonal o humanizado.
9. Anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, en donde dicho
anticuerpo o fragmento del mismo puede
(i) competir con el anticuerpo L106 por la unión
específica al polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 de la
reivindicación 1 ó 2; y/o
(ii) puede unirse de manera específica a células
T CD4+ activadas, y/o
(iii) se une específicamente a un epítopo
diferente en el polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 de la
reivindicación 1 ó 2, del que es unido específicamente por el
anticuerpo L106;
y en donde el anticuerpo L106 es
producido por el hibridoma asignado con el Nº de acceso ATCC HB
11483 en la American Type Tissue Culture Collection depositado en
Rockville, Maryland,
USA.
10. Anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 8 ó 9, en donde dicho
anticuerpo o fragmento de anticuerpo está acoplado a una
toxina.
11. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 8, 9 ó 10,
en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende una
cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada.
12. Anticuerpo humanizado o fragmento del mismo
de acuerdo con la reivindicación 11, en donde
(i) la cadena ligera humanizada comprende tres
regiones de determinación de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3)
que tiene secuencias de aminoácidos de las correspondientes
regiones de determinación de complementariedad de una cadena ligera
del anticuerpo L106 y tiene una secuencia de estructura de la
región variable sustancialmente idéntica a una secuencia de
estructura de la región variable de la cadena ligera; o
(ii) la cadena pesada humanizada comprende tres
regiones de determinación de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3)
que tiene secuencias de aminoácidos de las correspondientes
regiones de determinación de complementariedad de una cadena pesada
de anticuerpo L106, y tiene una secuencia de estructura de región
variable sustancialmente idéntica a una secuencia de estructura de
la región variable de la cadena pesada; y/o
(iii) el anticuerpo humanizado se une
específicamente a un polipéptido del receptor
ACT-4-h-1 con una
afinidad de unión que es de tres veces la afinidad de unión del
anticuerpo L106, yen donde el anticuerpo L106 es producido por el
hibridoma asignado con el Nº de acceso ATCC HB 11483 en la American
Type Tissue Culture Collection depositado en Rockville, Maryland,
USA.
13. Composición farmacéutica que comprende
(i) un polipéptido del receptor
ACT-4, de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 ó
4; o
(ii) un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 12, junto con un vehículo, excipiente y/o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, para
detectar y/o cuantificar en una muestra obtenida de un paciente, la
presencia de células T CD4+ activadas, en donde la presencia o
cantidad de expresión del polipéptido del receptor
ACT-4 en células T CD4+ presentes en dicha muestra
es indicativo de las células T CD4+ activadas en dicho paciente, lo
cual es diagnóstico de una enfermedad o condición del sistema
inmune.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en
donde la detección o cuantificación de células T CD4+ se lleva a
cabo en una muestra de células obtenidas de un paciente siguiendo
las siguientes etapas:
(i) marcar dicho anticuerpo directamente o
indirectamente;
(ii) exponer la muestra a dicho anticuerpo de la
etapa (i); y
(iii) determinar la cantidad de unión específica
de dicho anticuerpo marcado a los polipéptidos del receptor
ACT-4 presentes en las células T CD4+ en dicha
muestra.
16. Polipéptido del receptor
ACT-4, de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4
para uso en medicina.
17. Uso de
(i) un polipéptido del receptor
ACT-4 de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4;
o
(ii) un anticuerpo o fragmento del mismo de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la
preparación de un medicamento para usar en la profilaxis y/o
tratamiento de enfermedades y condiciones del sistema inmune.
18. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la
preparación de un medicamento para usar en la supresión de
respuesta inmune en un paciente que lo necesite.
19. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la
preparación de un medicamento para usar en el incremento de
respuesta inmune contra un antígeno seleccionado en un paciente que
lo necesite.
20. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17, 18 ó 19, en donde las enfermedades y
condiciones del sistema inmune se seleccionan de rechazo a
transplante, injerto versus enfermedad del hospedador, una
enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria y enfermedades y
condiciones que resulten de agentes infecciosos.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en
donde la enfermedad autoinmune se selecciona de: esclerosis
múltiple, artritis reumatoide y lupas eritematoso.
22. Fragmento de ácido nucleico que comprende o
consiste en una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo
con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
23. Fragmento de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 22, en donde dicho fragmento de ácido nucleico
es
(a) la secuencia de ADN de SEC ID NO: 1, o su
ARN equivalente;
(b) una secuencia que exhibe al menos un setenta
por ciento de identidad de secuencia con la de (a); o
(c) es una secuencia que codifica un polipéptido
de acuerdo con la reivindicación 4.
24. Vector de expresión que comprende un
fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
22.
25. Línea celular que se transforma o transfecta
con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 24.
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