JP7034066B2 - 共刺激ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、新規な二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、これらの分子を産生する方法及びその使用方法に関する。
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するための初期Ｔ細胞活性化後に機能し、従って免疫系の構成及び機能において中心的役割を果たす。ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲは、Ｔ細胞に対して共刺激効果を有することができ、それらは初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を維持することを意味する（Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68）。これらの共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの効果は、しばしば機能的に、時間的に、又は空間的にＣＤ２８のものから、及び互いに分離することができる。異なる共刺激因子によるＴ細胞活性化／生存シグナルの逐次的及び一時的な調節は、Ｔ細胞の生存の厳密な制御を維持しながら応答の長寿命を可能にするように機能し得る。疾患状態に応じて、共刺激ＴＮＦファミリーメンバーを介した刺激は、疾患を悪化させるか、又は改善する可能性がある。これらの複雑さにもかかわらず、ＴＮＦＲファミリー共刺激剤の刺激又は遮断は、がん、感染症、移植、及び自己免疫を含む幾つかの治療的適用に有望である。
幾つかの共刺激分子の中で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及び記憶Ｔ細胞の生存及び恒常性において重要な役割を果たしている（Croft M. et al. (2009), Immunological Reviews 229, 173-191）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、幾つかのタイプの細胞で発現され、感染、腫瘍、及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞並びに好中球の表面上でその発現が実証されており（Baumann R. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 2268-2275）、種々の刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能であるか、又は強力にアップレギュレートされることが示されている。分子の機能的活性は、あらゆるＯＸ４０発現細胞型において実証されており、ｉｎ ｖｉｖｏでのＯＸ４０媒介活性の複雑な制御を示唆している。Ｔ細胞受容体トリガー（T-cell receptor triggering）と組み合わせると、その天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞に対するＯＸ４０の関与は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらしている（Song J. et al. (2008) J. Immunology 180(11), 7240-7248）。次に、これは増殖の亢進、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生の増加、及び活性化Ｔ細胞のより良好な生存をもたらす。エフェクターＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるその共刺激活性に加えて、ＯＸ４０トリガーは、最近、Ｔ調節細胞の発達及び免疫抑制機能を阻害することが示されている。この効果は、少なくとも部分的に、抗腫瘍又は抗菌免疫応答に対するＯＸ４０の活性を増強することに関与する可能性が高い。ＯＸ４０の関与がＴ細胞集団を拡大し、サイトカイン分泌を促進し、Ｔ細胞記憶を支援し得ることを考えると、リガンドＯＸ４０Ｌの抗体及び可溶性形態を含むアゴニストは、様々な前臨床腫瘍モデルにおいて首尾よく使用されている（Weinberg et al. (2000), J. Immunol. 164, 2160-2169）。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon Y.H. and Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217 or Zhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795）、ＮＫ細胞（Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707）、ＮＫＴ細胞（Kim D.H. et al. (2008), J. Immunol. 180, 2062-2068）、単球（Kienzle G. and von Kempis J. (2000), Int. Immunol. 12, 73-82, or Schwarz H. et al. (1995), Blood 85, 1043-1052）、好中球（Heinisch I.V. et al. (2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446)、肥満細胞(Nishimoto H. et al. (2005), Blood 106, 4241-4248）、及び樹状細胞、並びに非造血起源の細胞、例えば内皮細胞及び平滑筋細胞（Broll K. et al. (2001), Am. J. Clin. Pathol. 115, 543-549又はOlofsson P.S. et al. (2008), Circulation 117, 1292-1301）におけるにおける４－１ＢＢの発現を実証した。異なる細胞型における４－１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガー、並びに炎症誘発性サイトカインの共刺激分子又は受容体を介して誘導されるシグナル伝達などの様々な刺激シグナルによって駆動される（Diehl L. et al. (2002), J. Immunol. 168, 3755-3762; von Kempis J. et al. (1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406; Zhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795）。
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele C. et al. (2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748; Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707; Melero I. et al. (1998), Cell Immunol. 190, 167-172）、それらの生存の増加及びを分泌する能力及び共刺激分子のアップレギュレーションによって示されるＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi B. K. et al. (2009), J. Immunol. 182, 4107-4115; Futagawa T. et al. (2002), Int. Immunol. 14, 275-286; Wilcox R. A. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4262-4267）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４－１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞に対する４－１ＢＢ抗体のこれらの共刺激効果に沿って、腫瘍担持マウスへのそれらの投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero I. et al. (1997), Nat. Med. 3, 682-685; Narazaki H. et al. (2010), Blood 115, 1941-1948）。Ｉｎ ｖｉｖｏ枯渇実験は、４－１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍効果において、ＣＤ８＋Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことを実証した。しかし、腫瘍モデル又は抗４－１ＢＢを含む併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞などの他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 2009; Murillo et al., -2436; Narazaki et al., 2011; Stagg et al., 108）。
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的な効果に加えて、４－１ＢＢアゴニストはまた、腫瘍血管内皮上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４－１ＢＢ媒介性アップレギュレーションを介して、腫瘍における活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することもできる（Palazon A. et al. (2011), Cancer Res. 71, 801-811）。４－１ＢＢトリガーはまた、腫瘍微小環境又は慢性感染の際の免疫寛容の破壊に寄与し得る可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る（Wilcox R.A. et al. (2004), Blood 103, 177-184）。
これは、ＴＮＦＲ－スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、ｉｎ ｖｉｖｏでの４－１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、そのような試薬の薬理学的活性に必要な重要な事象としてのＦｃ受容体結合を示唆していると思われる（Li F. and Ravetch J.V. (2011), Science 333, 1030-1034; Teng M.W. et al. (2009), J. Immunol. 183, 1911-1920）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４－１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体が存在しない場合に、減少されるか又は有意に改善される肝臓毒性に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導し得る（Dubrot J. et al. (2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233）。ヒト臨床試験（ClinicalTrials.gov, NCT00309023）では、３週間に１回１２週間投与されたＦｃ－コンピテント４－１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ－６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣癌、又は腎細胞癌の患者の疾患の安定化を誘導した。しかし、別の試験（ＮＣＴ００６１２６６４）で与えられた同じ抗体は、試験の終了につながるグレード４の肝炎を引き起こした（Simeone E. and Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247）。よって、４－１ＢＢを造血細胞及び内皮細胞の表面に効果的に結合させるだけでなく、制御不能な副作用を回避するためにＦｃ受容体への結合以外の機構によっても達成することができる新世代アゴニストが必要とされている。
利用可能な前臨床及び臨床データは、がんに対する効果的な内因性免疫応答を誘導し、増強することができるＯｘ４０及び４－１ＢＢのような共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの有効なアゴニストに対する高い臨床的必要性が存在することを明らかに実証している。しかし、その影響は単一の細胞型に限定されることはほとんどなく、また単一の機構を介して作用することはほとんどなく、細胞間及び細胞内のシグナル伝達機構を解明するために設計された研究は、複雑さのレベルの増加を明らかにしている。従って、好ましくは単一細胞型に作用する「標的化」アゴニストの必要性が存在する。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的又は腫瘍関連標的への好ましい結合が可能な部分を、共刺激ＴＮＦ受容体へのアゴニスト結合が可能な部分と組み合わせる。本発明の抗原結合分子は、効果的にだけでなく、所望の部位で極めて選択的にＴＮＦ受容体をトリガーすることができ、それによって望ましくない副作用を低減することができる。
本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、すなわち共刺激ＴＮＦ受容体を標的とする少なくとも１つの抗原結合部位を、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、すなわち標的細胞抗原を標的とする少なくとも１つの抗原結合部位と組み合わせる二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する結合能力のために、標的細胞抗原が発現される部位で共刺激ＴＮＦ受容体を好ましくは活性化するので、有利である。本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる新規な抗体も提供する。共刺激ＴＮＦ受容体に対する既知の抗体と比較して、これらの抗体は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分と組み合わせて二重特異性抗原結合分子にそれらを組み込むのに有利な特性を有する。
一態様において、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分（ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０及び４－１ＢＢからなる群から選択される）、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーはＯＸ４０である。従って、特定の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
及び、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
別の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは４－１ＢＢである。従って、特定の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
更に、４－１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号５１及び配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、及び配列番号６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
特定の態様において、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分はＦａｂ断片である。一態様では、二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つ以上の部分を含む場合、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる全ての部分はＦａｂ断片である。
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分（ここで、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される）、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。より具体的には、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７０及び配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号７６及び配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号７８及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む。
従って、更なる態様において、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４又は配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
一態様では、二重特異性抗原結合分子はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。特に、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
更なる態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への抗体の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
更なる態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本発明は、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
特に、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
従って、二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー及び標的細胞抗原の両方に対して二価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、２つの追加のＦａｂ断片を含む。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されたクロスＦａｂ断片であり、かつ、ＶＬ－ＣＨ鎖はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片は、ＯＸ４０又は４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であり、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片は、ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスＦａｂ断片である。
別の態様では、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
従って、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結され、かつ、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
更に別の態様では、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体が提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。幾つかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
別の態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体を製造する方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生される、二重特異性抗原結合分子、又はＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は４－１ＢＢに特異的に結合する抗体を包含する。
本発明は更に、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
また、本発明によって包含されるのは、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体、又は医薬としての使用のための、二重特異性抗原結合分子、又はＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は４－１ＢＢに特異的に結合する抗体を含む、薬学的組成物である。
一態様では、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
別の特定の態様では、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体が提供され、ここで、二重特異性抗原結合分子は、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される。
更なる態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
また、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特に、がんの治療のための医薬の製造のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本明細書で前に記載されるＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は本明細書で前に記載される４－１ＢＢに特異的に結合する抗体の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の態様では、疾患はがんである。上記の態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
図１Ａは、ＴＮＦ受容体抗体の調製に使用されたＦｃ結合ＴＮＦ受容体抗原の単量体形態を示す。図１Ｂは、ＴＮＦリガンドの存在下でのＴＮＦ受容体抗体の結合の試験（リガンドブロッキング特性）のために使用されたＣ末端のＨａタグを有する二量体ヒトＴＮＦ受容体抗原Ｆｃ融合分子を示す。実施例２．４に記載された実験の模式的な設定を図１Ｃに示す。 図２は、活性化ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＰＢＭＣ上に発現しない（図２Ａ及び２Ｃ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図２Ｂ及び２Ｄ）。ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりも低い。示されたクローンは、ＯＸ４０陽性細胞に対する結合強度（ＥＣ５０値並びにシグナル強度）が異なった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。全てのＯＸ４０クローンは、活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合する。 図３は、活性化マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。ＯＸ４０は休止マウス脾細胞では検出されなかった（図３Ａ及び３Ｃ）。活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図３Ｂ及び３Ｄ）。マウス脾細胞を、６－８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた機械的にホモジナイズした脾臓のＡＣＫ溶解緩衝液による赤血球溶解によって単離した。抗ＯＸ４０抗体の細胞表面タンパク質への結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的二次抗体を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。クローン２０Ｂ７のみが、活性化されたＯＸ４０発現マウスＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に結合するが、休止Ｔ細胞には結合しない。 図４は、カニクイザルの活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。示されたクローンは、ＯＸ４０陽性活性化カニクイザルＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合強度（ＥＣ５０値並びにシグナル強度）が異なった（図４Ａ）。活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＯＸ４０発現はこの条件下では低く、選択されたクローンの任意の結合はほとんど見出されなかった（図４Ｂ）。抗ＯＸ４０抗体の細胞表面タンパク質への結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的二次抗体を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。全てのＯＸ４０クローンは、活性化ＯＸ４０発現カニクイザルＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化カニクイザルＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合する。 図５は、ＯＸ４０陰性腫瘍細胞への結合の欠如を示す。示されたクローンは、ＯＸ４０陰性Ｕ－７８ ＭＧ（図５Ａ）及びＷＭ２６６－４腫瘍細胞（図５Ｂ）への結合を示さなかった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。ＩｇＧフォーマットの全てのクローンは、ＯＸ４０陰性腫瘍細胞に結合しない。結合は、活性化された白血球上のＯＸ４０に特異的である。 図６Ａ～６Ｆは、表面プラズモン共鳴によって測定した、抗Ｏｘ４０抗体８Ｈ９（図６Ａ）、２０Ｂ７（図６Ｂ）、１Ｇ４（図６Ｃ）、４９Ｂ４（図６Ｄ）、ＣＬＣ－５６３（図６Ｅ）、及びＣＬＣ－５６４（図６Ｆ）と、予め形成された複合体ｈｕＯｘ４０リガンド／ｈｕＯｘ４０－Ｆｃとの間の相互作用を示す。 図７は、ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞に対する本発明の抗ヒトＯＸ４０抗体の効果を示す。示されているのは、二次抗体による架橋あり（図７Ｂ）又は架橋なし（図７Ｂ）のＰ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける種々の抗ＯＸ４０バインダーを用いた、レポーター細胞株におけるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化である。レポーター細胞を、架橋二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２断片を１：２の比で含む又は含まない、示された濃度の抗ＯＸ４０構築物の存在下で６時間培養した。活性は、試験した抗Ｏｘ４０構築物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。全てのクローンは、ＯＸ４０軸がヒトＯＸ４０＋レポーター細胞株において誘発される場合にＮＦκＢ活性化を誘導することができる。従って、全てのクローンはアゴニスト的であり、用量依存的に活性化する。二次Ｆｃ部分特異的抗体（Ａｂ）による架橋は、このアゴニズムを強く増加させる。 図８Ａ－８Ｆは、事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞における抗ヒトＯＸ４０抗体の生物活性を示す。プレート固定化抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）による共刺激は、最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞の細胞増殖及び成熟を促進し、増強された活性化表現型を誘導した。ＰＨＡ－Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体、ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）、マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）、及び滴定抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。示されるのは、４日目での、事象数（図８Ａ）、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合（図８Ｂ）、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低／ＣＤ４５ＲＡ低）の割合（図８Ｃ）、及びＣＤ６２Ｌ低（図８Ｄ）、ＯＸ４０陽性（図８Ｆ）又はＴｉｍ－３陽性細胞（図８Ｅ）の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は目に見えない。全てのクローンは、プレートにコーティングされたときに、ＯＸ４０陽性の事前活性化ＣＤ４ Ｔ細胞において最適以下のＴＣＲ刺激を支持することができる。細胞はより生き残り、より多く増殖する。腫瘍の微小環境において、これはＴ細胞の抗腫瘍活性の増加につながり得る。 図９は、各クローンのアゴニスト能力のマーカーとしてのＥＣ５０値（全てのバイオマーカーについて）をまとめたものである（値は図８に示す曲線から計算された）。効力は左から右に向かって増加する。４日目の事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４５ＲＡ低又はＴｉｍ－３陽性細胞の割合を抗Ｏｘ４０抗体濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）における組み込みシグモイド用量応答引用を用いてＥＣ５０値を計算した。 図１０Ａ－１０Ｆは、溶液中の事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞における抗ヒトＯＸ４０抗体の生物活性を示す。最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞の細胞増殖、成熟又は活性化状態に対する効果は、抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕ ＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）のプレート固定化の非存在下では検出されなかった。ＰＨＡ－Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）及びマウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。滴定した抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕ ＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）を培地に添加し、実験を通して溶液中に存在させた。示されるのは、４日目での、事象数（図１０Ａ）、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合（図１０Ｂ）、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低 ＣＤ４５ＲＡ低）の割合（図１０Ｃ）、及びＣＤ６２Ｌ低（図１０Ｅ）、ＯＸ４０陽性（図１０Ｆ）又はＴｉｍ－３陽性細胞（図１０Ｅ）の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は目に見えない。強い架橋がない場合、改善されたＴＣＲ刺激はない（溶液中のＰ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）。従って、架橋は、二価のａＯｘ４０フォーマットがＴ細胞に対してアゴニスト的であるために不可欠である。この架橋は、腫瘍又は腫瘍間質細胞の細胞表面上に発現されるＦＡＰによって、標的化フォーマットで提供されるであろう。 図１１は、異なる抗ＯＸ４０クローンの結合強度とアゴニスト能力との間の相関を示す。活性化ＣＤ４ Ｔ細胞上の抗Ｏｘ４０クローン（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の結合を、実施例２．１．２に記載のように実施した。プラトー値は、クローン８Ｈ９（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）で得られた値に正規化した。抗Ｏｘ４０クローン（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の生物活性試験を実施例３．２に記載のように行い、ＰＤ－１発現のプラトー値をクローン８Ｈ９（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）について得られた値に正規化した。正規化された結合を正規化された生物活性に対してプロットして、結合強度とアゴニスト能力との間の相関を試験した。ほとんどのクローンについて、直接相関があった（線形回帰が示され、ｐ値０．９６；勾配０．９１）。しかし、２つのクローン（４９Ｂ４，１Ｇ４）は、それらの結合強度から予測できる、より強い生物活性を示した。低い結合能の面で予想外に高いアゴニスト効力を示すこのサブグループのクローンは、本発明の二重特異性抗原結合分子にとって特に重要である。 図１２Ａでは、ＯＸ４０に結合する２つのＦａｂ断片及びＦＡＰに結合する２つのクロスＦａｂ断片（２＋２フォーマット）を含む、本発明の例示的な二重特異性二価抗原結合分子の概略図が示される。図１２Ｂは、ＯＸ４０に結合する１つのＦａｂ断片及びＦＡＰに結合する１つのクロスＦａｂ断片を含む、本発明の例示的な二重特異性一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）の概略図を示す。図１２Ｃには、固定化ヒトＯＸ４０又はヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに対する同時結合を示すＳＰＲ実験のための設定が示されている。図１２Ｄには、ＯＸ４０への結合に対して二価であり、ＦＡＰへの結合に対して一価である二重特異性抗原結合分子の模式図が示されている。それは、ＯＸ４０に結合する２つのＦａｂ断片、並びにＦＡＰに結合するＶＨ及びＶＬドメインを含む。黒い点は、重鎖におけるノブ－イントゥ－ホール修飾を象徴する。図１２Ｅには、実施例５．４．１に記載されているようなＦＡＰへの結合を実証するＳＰＲ実験のための設定が示される。図１２Ｆは、固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰへの同時結合がどのように測定されるかを示す（実施例５．４．１）。 図１３Ａ－１３Ｄは、二重特異性二価２＋２構築物（分析物１）の固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合のＳＰＲ図を示す。図１３Ｅ－１３Ｈには、固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）に対する二重特異性一価１＋１構築物（分析物１）の同時結合が示される。図１３Ｊ－１３Ｌには、二重特異性２＋１構築物（分析物１）の固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合が示される。図１３Ｍは、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）（実施例５．４．２）における二重特異性２＋１構築物のｈｕ ＯＸ４０への結合を示す。このデータは、２＋１構築物中の２つの抗ＯＸ４０ Ｆａｂドメインが、共通のＩｇＧ抗体と同等の様式でｈｕ ＯＸ４０に結合することを示している。 図１４Ａ－１４Ｄ及び１４Ｅ－１４Ｈは、それぞれ、休止及び活性化ヒトＰＢＭＣに対するＦＡＰ標的化一価又は二価フォーマットの選択された抗ＯＸ４０バインダー（クローン８Ｈ９，１Ｇ４）の結合を示す。ＯＸ４０陽性Ｔ細胞（図１４Ｂ及び１４Ｄ）に対する結合特性は、従来の二価ｈｕ ＩｇＧフォーマット（白四角）及びＦＡＰ標的化二価フォーマット（黒四角）のクローンに匹敵した。ＦＡＰ標的化一価フォーマット（黒三角）の同じクローンの結合は、アビディティー結合の喪失に起因して明らかに弱かった。ヒトＯｘ４０発現細胞の非存在下では、結合を観察することはできない（休止細胞、左のグラフ）。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した（実施例４．３．２．１を参照）。ＤＰ８８ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡはコントロールとして使用されるアイソタイプ抗体である。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。図１４Ａ－１４Ｄでは、クローンＩＧ４は活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４ Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８ Ｔ細胞に結合することが分かる。二価構築物は、一価構築物よりも強く結合する。構築物は、ＯＸ４０陰性休止Ｔ細胞に結合しない。図１４Ｅ－１４Ｈは、クローン８Ｈ９は活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４ Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８ Ｔ細胞に結合することを示す。二価構築物は、一価構築物よりも強く結合する。構築物は、ＯＸ４０陰性休止Ｔ細胞に結合しない。図１４Ｊ－１４Ｍには、二価ＦＡＰ標的化ＯＸ４０構築物が、一価抗体フォーマットのそれぞれのクローンとして、ＯＸ４０陽性細胞に対してより強い結合特性を示したことも示されている。図１４Ｎ－１４Ｑは、第２の結合部分とは独立して、ＯＸ４０陽性Ｔ細胞と同様の強度で結合した異なる２＋１構築物を示す。 図１５Ａ及び１５Ｂは、ＦＡＰ標的化一価又は二価フォーマットの選択された抗ＯＸ４０バインダー（クローン８Ｈ９，１Ｇ４）のＦＡＰ陽性腫瘍細胞に対する結合を示す。トランスジェニック改変マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６－４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの同じクローン（白四角）ではなく、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０構築物（黒四角形及び三角形）のみが、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（図１５Ａ）及びＷＭ２６６－４細胞（図１５Ｂ）のそれぞれに結合する。示されるのは、二次検出抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。二価ＦＡＰ構築物は、一価構築物よりも強く結合する。ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合も図１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ、及び１５Ｆに示されている（詳細は実施例４．５．４．２を参照）。 図１６Ａ－１６Ｇは、過架橋の存在下又は非存在下での一価又は二価ＦＡＰ標的化フォーマットの選択されたバインダー（８Ｈ９，１Ｇ４）によるＮＦκＢ活性化を示す。示されるのは、一価（黒三角）又は二価（黒四角）ＦＡＰ標的化フォーマットの、又は非標的化ｈｕ ＩｇＧ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（白四角）としての、選択されたバインダー１Ｇ４（図１６Ａ－１６Ｄ）及び８Ｈ９（図１６Ｅ－１６Ｇ）による、レポーター細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化である。過架橋は、抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的二次抗体（１次抗体と２次抗体との比は１：２）又はＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９及びＷＭ２６６－４腫瘍細胞（ＦＡＰ＋腫瘍細胞とレポーター細胞との比２：１）を介するかの何れかにより提供された。ＮＦ－κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した化合物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることによって特徴づけられた。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランクコントロールのＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。図１６Ａでは、クローン１Ｇ４を含む全ての構築物は、Ｏｘ４０＋ ＨｅＬａレポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導することができたことが分かる。二次抗ＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体による架橋は、ＮＦκＢ活性化を強く増加させた。しかし、ＦＡＰ陽性細胞（ＮＩＨ又はＷＭ２６６－４）の添加は、ＦＡＰ標的化分子のアゴニスト潜在能力のみを増加させたが、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧフォーマットのアゴニスト能力は増加させなかった。二価構築物は、一価構築物よりも明らかに良好に機能した。図１６Ｅ－１６Ｇでは、クローン８Ｈ９を含む全ての構築物は、ＯＸ４０＋ ＨｅＬａレポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導することができたことが示される。二次抗ＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体による架橋は、ＮＦκＢ活性化を強く増加させた。しかし、ＦＡＰ陽性細胞（ＮＩＨ）の添加は、ＦＡＰ標的化分子のアゴニスト潜在能力のみを増加させたが、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧフォーマットのアゴニスト能力は増加させなかった。二価構築物は、一価構築物よりもわずかに良好に機能した。図１６Ｈ、１６Ｊ及び１６Ｋでは、ＯＸ４０（１＋１）への一価結合を有する構築物は、ＯＸ４０（２＋１及び２＋２構築物）への二価結合を有する構築物よりも効率が低いことも見てとれる。更なるデータは、図１６Ｌ、１６Ｍ、及び１６Ｎ、並びに実施例５．１に示されている。 プレート固定化ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０（１Ｇ４及び８Ｈ９）構築物による事前活性化ＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激のレスキューを、図１７Ａ及び１７Ｂ並びに図１８Ａ－１８Ｄに示す。プレート固定化抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）による共刺激は、最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞の細胞増殖及び成熟を促進し、増強された活性化表現型を誘導した。ＰＨＡ－Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体、ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）、マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）、及び滴定抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。示されるのは、４日目での、事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低 ＣＤ４５ＲＡ低）の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＯＸ４０陽性又はＴｉｍ－３陽性細胞の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は目に見えない。図１７では、クローン８Ｈ９を含む全ての構築物は、プレートにコーティングされた場合、事前活性化されたＯｘ４０＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができたことが分かる。細胞は、より活性化された（Ｔｉｍ３＋ ＦＳＣ＋）表現型を示した。二価構築物は、一価構築物よりもわずかに良好に機能した。図１８では、クローン１Ｇ４を含む全ての構築物は、プレートにコーティングされた場合、事前活性化されたＯｘ４０＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができたことが観察できる。細胞はより多く増殖し、活性化された（Ｔｉｍ３＋ Ｏｘ４０＋）表現型を示す。二価構築物は、一価構築物よりも良好に機能する。両方の二価構築物は、プレートにコーティングした場合に同等に機能した。 図１９では、プレート固定化ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０（クローン１Ｇ４）構築物により最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューして計算したＥＣ５０値が示される。４日目の増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、並びにＣＤ１２７Ｌ低、Ｔｉｍ－３陽性、及びＯＸ４０陽性細胞の割合を抗ＯＸ４０抗体濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）における組み込みシグモイド用量応答引用を用いてＥＣ５０値を計算した。クローン１Ｇ４を含む全ての構築物は、プレートにコーティングされた場合、事前活性化されたＯｘ４０＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができた。しかしながら、二価（２＋２）構築物は、一価（１＋１）構築物よりも良好に機能した。 図２０Ａ－２０Ｈは、最適以下にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介共刺激及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋に関する。ＦＡＰ結合部分を含む構築物のみが、架橋がＦＡＰ陽性細胞（ＮＩＨ）によって提供された場合、事前活性化されたＯｘ４０＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができた。示されるのは、事象数（図２０Ｂ及び２０Ｄ）、低増殖（ＣＦＳＥ高）細胞の割合（図２０Ａ及び２０Ｃ）又はＣＤ６２Ｌ（図２０Ｆ及び２０Ｈ）、ＣＤ１２７（図２０Ｅ）又はＧｒａｎｚｙｍｅＢバイタルＣＤ４＋（図２０Ｇ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞のＭＦＩの何れかである。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０共刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は示されていない。細胞はより生き延び、より多く増殖し、より強い活性化（ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７低）表現型を示した。標的化二価構築物は、一価構築物よりもほんのわずかに良好に機能した。非標的化ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのクローン８Ｈ９は、更なる架橋がない場合に最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができなかった。ＦＡＰ陽性腫瘍の微小環境では、これはＴ細胞の抗腫瘍活性の増加をもたらすことができ、それにより全身のＯＸ４０活性化が回避される。 図２１Ａ－２１Ｃは、表面固定化ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０（１Ｇ４）構築物を使用する休止ヒトＣＤ４細胞の活性化に関する。非標的化抗Ｏｘ４０（１Ｇ４）ｈｕＩｇＧ１を用いた共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８（データは示さず）Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０構築物の過架橋は、増殖、生存を強く促進し（データは示さず）、ヒトＣＤ４細胞において亢進された活性化表現型を誘導した。ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ２５発現のＭＦＩ及びＣＤ２５＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を示す。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。化合物のアゴニスト効果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの組み込み関数を用いて曲線下の面積として定量化し、３つの異なる抗Ｏｘ４０（１Ｇ４）構築物について示す。標的化二価（２＋２）構築物は、一価（１＋１）構築物よりも良好に機能した。第２の実験で得られたデータを図２１Ｄ－２１Ｈ及び２１Ｊ－２１Ｎのそれぞれに示す。一価抗ＯＸ４０構築物（１＋１；黒三角）は、二価抗ＯＸ４０標的構築物（半黒丸、黒四角）よりもＴＣＲ刺激をレスキューする能力が低かった。ＦＡＰに対して二価的な結合の２＋２構築物は、ＦＡＰに対して一価的な結合の２＋１構築物と比較して、既に低濃度で最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることが可能であった。２＋１フォーマットにおいて、高親和性ＦＡＰ結合クローン４Ｂ９は、低親和性クローン２８Ｈ１より明らかに優れていた（図２１Ｊ－２１Ｎ）。これは、観察された生物活性のＥＣ５０値がＦＡＰへの結合によって決定されることを示唆している（２＋２＞２＋１（４Ｂ９）＞２＋１（２８Ｈ１）。図２１Ｐでは、各構築物のアゴニスト能力を、解析されたマーカーについて曲線下の面積として定量化し、互いに対比してプロットした．観察された生物活性はＦＡＰ（２８Ｈ１）（２＋２）構築物で最も良好であり、続いてＦＡＰ（４Ｂ９）（２＋１）構築物、次いでＦＡＰ（２８Ｈ１）（２＋１）構築物であった。 図２２Ａ及び２２Ｂでは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗Ｏｘ４０抗体がＯＸ４０陽性細胞の誘導を誘導し得ることが示されている。ＰｋＨ２６標識されたＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１と新たに単離したＮＫ細胞を、ＯＸ４０抗体（ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の存在下で、Ｅ対Ｔ比３：１で２４時間共培養した。ＬＤＨ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６４４７９３００１）を用いて４時間後にＬＤＨ含有量を分析した。２４時間後、細胞をＤａｐｉで染色し、フローサイトメトリーで分析した。Ｄａｐｉ陽性死細胞の割合を用いて特異的溶解を計算した。ヒトＩｇＧフォーマットの抗ＯＸ４０バインダーは、ＮＫ細胞上のＦｃ受容体に結合し、ＯＸ４０陽性標的細胞のＡＤＣＣを誘導する。代わりに、ｈｕ ＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットを使用することにより、ＯＸ４０陽性細胞（例えば、直近に活性化されたＴ細胞）のＡＤＣＣが防止される。 図２３Ａ－２３Ｄは、ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡフォーマットに移された４つの抗ヒト４－１ＢＢ特異的クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）、及びｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡフォーマットに移された１つの抗マウス４－１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２（下向き三角）の休止及び活性化ヒトＴ細胞への結合を示す。陰性コントロールとして、非４－１ＢＢ特異的クローンＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色白抜きの丸）。上のパネルは休止ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２３Ａ）及び活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２３Ｂ）への結合を示し、下のパネルは休止ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２３Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞 ２３Ｄ）を示す。結合は、試験された一次抗４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識又はＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光の中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。 図２４Ａ－２４Ｄは、４－１ＢＢ発現マウスＴ細胞への結合を示す。４つの抗ヒト４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）、及び１つの抗マウス４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体クローン２０Ｇ２（下向き三角）の休止及び活性化マウスＴ細胞への結合が示される。陰性コントロールとして、非４－１ＢＢ結合性ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色白抜きの丸）。上のパネルは休止マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２４Ａ）及び活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２４Ｂ）への結合を示し、下のパネルは休止マウスＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２４Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２４Ｄ）を示す。結合は、試験された一次抗４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片のＭＦＩをプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。 図２５Ａ－２５Ｄは、４－１ＢＢ発現マウスＴ細胞へのマウスＩｇＧの結合を示す。マウスＩｇＧ１ ＤＡＰＧ及びマウスＩｇＧ１野生型（ｗｔ）のフォーマットに移された抗マウス４－１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２の休止及び活性化マウスＴ細胞への結合を示す。陰性コントロールとして、市販の非４－１ＢＢ結合マウスＩｇＧ１ ｗｔアイソタイプコントロールを用いた（灰色白抜きの丸、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５３）。上のパネルでは、休止ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２５Ａ）及び活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２５Ｂ）への結合が示され、下のパネルでは、休止ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２５Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２５Ｄ）への結合が示される。結合は、試験された一次抗４－１ＢＢ結合ｍｏＩｇＧ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。 図２６Ａ及び２６Ｂは、４－１ＢＢ発現カニクイザルＴ細胞への結合を示す。４つの抗ヒト４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）の活性化カニクイザルＴ細胞への結合が示される。陰性コントロールとして、非４－１ＢＢ結合性ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色白抜きの丸）。示されているのは、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２６Ａ）及び活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２６Ｂ）のそれぞれへの結合である。結合は、試験された一次抗４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。 図２７Ａ－２７Ｅは、表面プラズモン共鳴によって決定される本発明の抗４－１ＢＢ抗体のリガンド結合特性を示す。ヒト抗４－１ＢＢ ＩｇＧ ２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１、及び１２Ｂ３と予め形成された複合体ｈｕ４－１ＢＢリガンド／ｈｕ４－１ＢＢとの間の相互作用、並びにマウス抗４－１ＢＢクローン２０Ｇ２と予め形成された複合体ｍｕ４－１ＢＢリガンド／ｍｕ４－１ＢＢとの相互作用が示されている。 図２８Ａ－２８Ｃ及び２８Ｄ－２８Ｆは、競合結合実験に関する。図２８Ａ－２８Ｃは、抗４－１ＢＢ ＩｇＧクローン１２Ｂ３、１１Ｄ５、及び２５Ｇ７と、クローン９Ｂ１１及びｈｕ４－１ＢＢの予め形成された複合体との間の相互作用を示す。図２８Ｄ－２８Ｆは、抗４－１ＢＢ ＩｇＧクローン１２Ｂ３、９Ｂ１１、及び２５Ｇ７と、クローン１１Ｄ５及びｈｕ４－１ＢＢの予め形成された複合体との間の相互作用を示す。２つの抗体がヒト４－１ＢＢに同時に結合することができるので、抗４－１ＢＢクローン１２Ｂ３、１１Ｄ５、及び９Ｂ１１は２５Ｇ７と異なる空間エピトープを共有すると結論づけることができる。 図２９Ａ－２９Ｄは、抗４－１ＢＢ抗体へのハイブリッド４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）変異体の結合、すなわち、ｈｕ４－１ＢＢＤ１／ｍｕ４－１ＢＢＤ２－Ｆｃ（ｋｉｈ）及びｍｕ４－１ＢＢＤ１／ｈｕ４－１ＢＢＤ２－Ｆｃ（ｋｉｈ）変異体の抗４－１ＢＢ抗体への結合を示す。下線は、抗体によって認識される４－１ＢＢドメインである。 図３０Ａ－３０Ｄでは、抗ヒト４－１ＢＢ抗体１１Ｄ５、１２Ｂ３、２５Ｇ７、及び９Ｂ１１のヒト４－１ＢＢドメイン１への結合が示されている。抗ヒト４－１ＢＢ抗体１１Ｄ５、１２Ｂ３、及び９Ｂ１１は、４－１ＢＢ構築物を含むヒトドメイン１に結合する。 図３１Ａ－３１Ｄは、異なる抗ヒト４－１ＢＢクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能特性を示す。事前に活性化されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体の非存在下で（図３１Ａ及び３１Ｃ）又は表面固定化抗ヒトＣＤ３抗体の最適以下の濃度の存在下で（図３１Ｂ及び３１Ｄ）、異なる濃度の表面固定化抗ヒト４－１ＢＢ特異的ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体で活性化した。表面固定化４－１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡのｐＭ濃度に対する、ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団全体におけるＩＦＮγ＋（Ａ及びＢ）及びＴＮＦα＋（Ｃ及びＤ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度が示されている。ＣＤ３刺激の存在下では、４－１ＢＢ共刺激はＩＦＮγ（図３１Ｂ）及びＴＮＦα（図３１Ｄ）の分泌を濃度依存的に増加させることができた。ＣＤ３刺激の非存在下では、４－１ＢＢの活性化はＩＦＮγ（図３１Ａ）及びＴＮＦα（図３１Ｃ）の分泌に影響を及ぼさなかった。 図３２Ａ及び３２Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２の機能特性を示す。溶液中で、マウス脾細胞を０．５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ１ ＣＤ３ハムスターＩｇＧ（クローン１４５－２Ｃ１１）及び異なる濃度の抗マウス４－１ＢＢ抗体（黒菱形：マウスＩｇＧ、黒の白抜き菱形：マウスＩｇＧ ＤＡＰＧ）又は適合するアイソタイプコントロール（灰色の丸：マウスＩｇＧ１、灰色白抜きの丸：マウスＩｇＧ１ＤＡＰＧ）の存在下でインキュベートした。濃度は、ｎＭでｘ軸上に示される。抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１（黒菱形）がＦｃＲ発現細胞を介して架橋され得る場合にのみ、グランザイムＢ（図３２Ａ）及びＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（図３２Ｂ）の活性化は、濃度依存的に増加させることができた。 図３３は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２の機能特性を示す。１群あたり３匹のマウスの結果を示す。抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１（灰色の棒）で処置した後、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は総数で肝臓に蓄積している（ａ）。更なる増殖マーカーＫｉ６７は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞において頻度（ｂ）及び総数（ｃ）においてアップレギュレートされた。また、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度（ｄ）及び総数（ｅ）において４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のアップレギュレーションによって正のフィードバックループを誘導した。３回目の注射の１日後に最も強い効果が見られた。マウスを抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１ＤＡＰＧ（黒色棒）で処置すると、抗体の架橋が防止され、４－１ＢＢ活性化は起こらなかった。従って、肝臓におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＰＢＳ処置マウス（白い棒）と数及び表現型において類似であった。 図３４Ａでは、４－１ＢＢに結合する２つのＦａｂ断片及びＦＡＰに結合する２つのクロスＦａｂ断片（２＋２フォーマット）を含む、本発明の例示的な二重特異性二価抗原結合分子の概略図が示される。図３４Ｂには、固定化ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに対する同時結合を示すＳＰＲ実験のための設定が示されている。図３４Ｃは、４－１ＢＢに結合する１つのＦａｂ断片及びＦＡＰに結合する１つのクロスＦａｂ断片を含む、本発明の例示的な二重特異性一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）の概略図を示す。 二重特異性二価抗４－１ＢＢ／抗ＦＡＰ構築物の同時結合を図３５Ａ－３５Ｄに示す。二重特異性構築物を固定化ヒト４－１ＢＢに対する分析物１として使用し、ヒトＦＡＰを分析物２として使用した。全ての二重特異性構築物は、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた。 図３６Ａ及び３６Ｂは、２＋１フォーマットとも呼ばれる、二価抗４－１ＢＢ及び一価抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡである例示的な二重特異性抗原結合分子を示す。二重特異性抗原結合分子は、４－１ＢＢに結合する２つのＦａｂ断片、並びにＦＡＰに結合するＶＨ及びＶＬドメインを含む。 図３７Ａ－３７Ｃは、二重特異性２＋１抗４－１ＢＢ及び抗ＦＡＰ構築物の同時結合に関する。図３７Ａは、アッセイ設定のピクトグラムである。図３７Ｂ及び３７Ｃは、固定化ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに対する２＋１フォーマットの二重特異性抗原結合分子（分析物１）の検出された同時結合を示す。 図３８Ａ－３８Ｆは、ヒト４－１ＢＢ特異的クローン１１Ｄ５（図３８Ａ及びＣ）、１２Ｂ３（図３８Ｂ及びＤ）並びに２５Ｇ７（図３８Ｅ及びＦ）の休止ＣＤ４＋（上パネル）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（下パネル）への結合を示す。結合は、一次４－１ＢＢ結合抗体の濃度に対する二次検出抗体ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ２’）断片の蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏ ｍｅａｎ）として示される。全てのブロットで、陰性コントロールＤＰ４７非標的ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを用いた（黒の白抜きの丸、点線）。構築物の何れも、休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞（図３８Ａ、Ｂ、及びＥ）又は休止ＣＤ８+ Ｔ細胞（図３８Ｃ、Ｄ、及びＦ）に対する特異的結合を示さなかった。 図３９Ａ－３９Ｆは、ヒト４－１ＢＢ特異的クローン１１Ｄ５（図３８Ａ及びＣ）、１２Ｂ３（図３９Ｂ及びＤ）並びに２５Ｇ７（図３９Ｅ及びＦ）の活性化ＣＤ４＋（上パネル）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（下パネル）への結合を示す。結合は、一次４－１ＢＢ結合抗体の濃度に対する二次検出抗体ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ２’）断片の蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏ ｍｅａｎ）として示される。全てのブロットで、陰性コントロールＤＰ４７非標的ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを用いた（黒の白抜きの丸、点線）。全ての構築物は、活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞（図４０Ａ、Ｂ、及びＥ）より高い４－１ＢＢ発現を示す活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞（図３９Ｃ、Ｄ、及びＦ）に主に結合した。 図４０は、結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）と異なるクローン及びフォーマットの活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合をまとめたものである。異なるフォーマット及び使用された抗ＦＡＰ結合クローンは、グラフの下にピクトグラムとして示され、４－１ＢＢ結合クローンは列のパターン：ＤＰ４７コントロール分子を白色、２５Ｇ７含有分子を黒色、ＤＰ４７非標的化の場合には白のストライプの入った黒色、クローン１１Ｄ５を灰色、クローン１２Ｂ３を白／黒のチェックによって示される。 図４１Ａ－４１Ｆは、ヒトＦＡＰ発現メラノーマ細胞株ＷＭ－２６６－４（図４２Ａ、Ｂｍ及びＥ）並びにＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（図４２Ｃ、Ｄ、及びＦ）に対する結合を示す。結合は、一次４－１ＢＢ結合抗体の濃度に対する二次検出抗体ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ２’）断片の蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏ ｍｅａｎ）として示される。４－１ＢＢ結合クローン１１Ｄ５を含む構築物を用いた結合曲線を図４１Ａ及び４１Ｃに示し、クローン１２Ｂ３については図４１Ｂ及び４１Ｄに、クローン２５Ｇ７については図４１Ｅ及び４１Ｆに示す。全てのブロットで、陰性コントロールＤＰ４７非標的ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを用いた（黒の白抜きの丸、点線）。ＦＡＰ標的化フォーマットのみがＦＡＰ発現細胞に結合し、その親の抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体に結合しない。従って全てのフォーマットとは無関係に、全ての示されたＦＡＰ標的化分子はＦＡＰ特異的標的化特性を特徴とする。フォーマット、ＦＡＰ結合性クローン、及び標的化部分に依存して、幾つかの分子は他の分子よりも良好なＦＡＰ標的化特性を有する。 図４２は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞への結合をまとめたものである。結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。使用された抗体フォーマットは、グラフの下にピクトグラムとして示され、４－１ＢＢ結合クローンは列の色：ＤＰ４７コントロール分子を白色、２５Ｇ７含有分子を黒色、ＤＰ４７非標的化の場合には白のストライプの入った黒色、クローン１１Ｄ５を灰色、クローン１２Ｂ３を白／黒のチェックによって示される。グラフは、ＦＡＰ標的化分子のみがＦＡＰ発現細胞に結合することができるが、その４－１ＢＢ結合の親のｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡもＤＰ４７標的化４－１ＢＢ（２５Ｇ７）結合分子もＦＡＰ発現細胞に結合することができないことを示している。 図４３Ａ－４３Ｉは、４－１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃにおけるＮＦ－κＢ媒介ルシフェラーゼ活性を示す。ルシフェラーゼ活性は、６時間のインキュベーション後のアゴニスト性ヒト４－１ＢＢ結合分子の添加濃度に対する放出光の単位（ＵＲＬ）としてｙ軸に示される。図４３Ａ、Ｄ、及びＧでは、ＦＡＰ発現腫瘍細胞は添加されなかった。図４３Ｂ、Ｅ、及びＨでは、ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ－２６６－４を、及び図４３Ｃ、Ｆ、及びＩでは、ヒトＦＡＰ－トランスフェクトＮＩＨ／３Ｔ３細胞をレポーター細胞株に５：１の比率で添加し、６時間インキュベートした。４－１ＢＢ結合クローン１１Ｄ５を含む構築物を用いた活性化曲線を図４３Ａ、４３Ｂ、及び４３Ｃに示し、クローン１２Ｂ３については図４３Ｄ、４３Ｅ、及び４３Ｆに、クローン２５Ｇ７については図４３Ｇ、４３Ｈ、及び４３Ｉに示す。ＦＡＰ標的化フォーマットのみが、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下でルシフェラーゼ活性を誘導する。活性化レベルは、クローン、フォーマット、及びＦＡＰ発現腫瘍細胞株に依存する。 図４４Ａ及び４４Ｂは、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞の存在下での４－１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃにおけるＮＦ－κＢ媒介ルシフェラーゼ活性をまとめたものである。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞の存在下での活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。使用された抗体フォーマット及び抗ＦＡＰクローンは、グラフの下にピクトグラムとして示され、異なるアゴニスト４－１ＢＢクローンは、異なる列のパターン：ＤＰ４７コントロール分子を白、２５Ｇ７含有分子を黒色、クローン１１Ｄ５を灰色、クローン１２Ｂ３を白／黒のチェックで示される。このグラフは、ＦＡＰ標的化分子のみがバックグラウンドを超えて強い活性化を誘導し得ることを示している。活性化レベルは、クローン、ＦＡＰ標的化、及びフォーマットに依存する。
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。
抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な部分は、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。特定の態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。
用語「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを介してシグナル伝達を活性化することができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。特に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。特定の態様では、「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本出願において使用される「価数」という用語は、１つの異なる（区別できる）抗原決定基に特異的である抗原結合分子中の１つの異なる（区別できる）抗原決定基に特異的な特定の数の結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中に特定の抗原決定基に特異的であるそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、それらが前記抗原決定基に対してただ１つの結合部位を有することを意味し、又は特定の抗原決定基に対して２価であることができ、それらが前記抗原決定基に対して２つの結合部位を有することを意味する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産する。本明細書で使用される場合、従って、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明によれば、用語「Ｆａｂ断片」は、以下に定義される「クロスＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含む。
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの１つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、約１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、又はその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96）に記載される。更に抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で周知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えばGebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及びStumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ－ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ－４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように改変することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。更なる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように改変することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのらせん状の束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及び欧州特許第１６４１８１８Ａ１号を参照。アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然のバリエーションをシャッフルすることによって生成される。更なる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照。トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。改変されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙ）が含まれる。更なる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、第１のαヘリックス及び各リピートのβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。β－サンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが関心のある治療標的を特異的に認識することを可能にするように改変することができる。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照。ペプチドアプタマーは、定常性の足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照。ミクロボディーは、３～４個のシステイン架橋を含む長さが２５～５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように改変することができるループを有する。改変されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の変化があり、かかる変化が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号８４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８５及び８６に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号８７）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号８８及び８９は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号９０及び９１は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
特に断りのない限り、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号９２）に示されている。特に断りのない限り、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号９３）に示されている。特に断りのない限り、プロトオンコジーンｃ－ＥｒｂＢ－１又は受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－１とも呼ばれる用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号９４）に示されている。特に断りのない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号９５）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ２０」は、膜貫通型４ドメインサブファミリーメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ－１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号９６）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号９７）に示されている。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４－３４、Ｌ２の５０－５６、Ｌ３の８９－９７、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－６５、及びＨ３の９５－１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
Figure 0007034066000001
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１－３４、Ｌ２の５０－５５、Ｌ３の８９－９６、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－５８、及びＨ３の９５－１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾されるか又は変更されているものである。
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端の残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）のストレッチを含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖の対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するもの；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る．一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書において他に特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞（「ホール」）をそれぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、かつホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変えることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、従って二量体を更に安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むように意図されている。例えば、一又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対して最小の影響を有するように、当該技術分野で周知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照）。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、対応する抗体で被覆された赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載される。
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエーターの放出、並びに免疫複合体クリアランス及び抗体産生の調節を含む広範囲のエフェクター機能を誘発する。ヒトでは、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴づけられており、
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は単量体ＩｇＧと高親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける、ＩｇＧのＦｃ領域における改変は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された位置２３３－２３６のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩとの結合を千分の一に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で複合体化したＩｇＧに結合し、広く発現される。この受容体は、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、死滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、死滅プロセスを活性化するようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞では、更なる免疫グロブリン産生及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するように機能するようである。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞において、Ｂ型は、その別個の受容体へのＩｇＥ結合を介してこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４の少なくとも１つに突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見出される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、及び幾つかの単球及びＴ細胞上に見出され、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６の少なくとも１つに突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見出される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記突然変異部位、及びＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載される。
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における本明細書中に報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力を、ＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などの、Ｆｃγ受容体を発現する細胞に対するそれらの結合を測定することによって調べる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合を測定する。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は、現在、２７の受容体からなる。これは、細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらの偽リピートは、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは典型的なＴＮＦアルファに相同である。それらの活性型では、大部分のＴＮＦ受容体は、血漿膜中に三量体複合体を形成する。従って、ほとんどのＴＮＦ受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。これらの受容体の幾つかはまた、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を補充してカスパーゼ活性化の外因性経路を開始させる細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む。デスドメインを欠いている他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化を引き起こし得る細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体はまた、アポトーシスを開始することもできるが、間接的な機構を介してアポトーシスを開始する。アポトーシスを調節することに加えて、幾つかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞恒常性及び活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、及びＴ細胞同時刺激などの免疫細胞機能の調節に関与する。幾つかの他のものは、毛包発達及び破骨細胞発達などの細胞型特異的応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには、以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンパ毒素ベータ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ－１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ－１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ－２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテゲリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルスエントリメディエーター（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ－３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ－１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するための初期Ｔ細胞活性化後に機能する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲからなる群から選択され、それらの全てがＴ細胞に対して共刺激効果を有することができる。より具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０及び４－１ＢＢからなる群から選択される。
ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーの更なる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの公的に入手可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒト共刺激ＴＮＦ受容体は、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトＯＸ４０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４３４８９、配列番号９８）、ヒト４－１ＢＢ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１、配列番号９９）、ヒトＣＤ２７（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２６８４２、配列番号１００）、ヒトＨＶＥＭ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２９５６、配列番号１０１）、ヒトＣＤ３０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８、配列番号１０２）、及びヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５、配列番号１０３）。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＯＸ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＯＸ４０を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＯＸ４０、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＯＸ４０を含む。その用語はまた、ＯＸ４０の天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒトＯＸ４０のアミノ酸配列を配列番号９８（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４３４８９、バージョン１１２）に示し、例示的なマウスＯＸ４０のアミノ酸配列を配列番号１０４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４７７４１、バージョン１０１）に示す。
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」及び「ＯＸ４０に特異的に結合する抗体」は、ＯＸ４０を標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＯＸ４０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＯＸ４０抗体の、無関係な、非ＯＸ４０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＯＸ４０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＯＸ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－６Ｍ以下、例えば１０－６８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「４－１ＢＢ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型４－１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」で未処理の４－１ＢＢ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４－１ＢＢを含む。その用語はまた、４－１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号９９（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）に示され、例示的なマウス４－１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号１０５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０３３４）に示され、例示的なカニクイザル４－１ＢＢ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ由来）のアミノ酸配列は配列番号１０６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示される。
用語「抗４－１ＢＢ抗体」、「抗４－１ＢＢ」、「４－１ＢＢ抗体」及び「４－１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４－１ＢＢを標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４－１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４－１ＢＢ抗体の、無関係な、非４－１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４－１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４－１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－６Ｍ以下、例えば１０－６８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
用語「ペプチドリンカー」は、１つ以上のアミノ酸、典型的には約２～２０アミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において周知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１～１０の数、典型的には２～４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドはＧＧＧＧＳ（配列番号１０７）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０９）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１０）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１１１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１１２）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１１５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１１６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１１７）、ＧＧＳＧ（配列番号１１８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１１９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１２０）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１２１）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１０７）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０８）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１１１）である。
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が、直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ． ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ－２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は表Ｂの「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照して以下で更に説明する。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
Figure 0007034066000002
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要があろう。
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作成することができる。簡潔には、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、一又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定するために使用される。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
特定の実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳類細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。幾つかの実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子におけるオリゴ糖の修飾が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。別の態様では、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairetら）；米国特許第６６０２６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）を参照。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体もまた提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン改変変異体（cysteine engineered variants）、例えば分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作ることが望ましい場合がある。特定の態様では、置換される残基は抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分にコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作るために使用することができる。特定の態様では、以下の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖形式及びマイナス鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において散在して生じ得る。特定の事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
「発現カセット」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え技術又は合成技術により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞性転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。
本発明の二重特異性抗体
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、及び低減された毒性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
例示的な二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
特定の態様では、これらの二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーへのアゴニスト結合によって特徴づけられる。特に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０及び４－１ＢＢからなる群から選択される。
ＯＸ４０に結合する二重特異性抗原結合分子
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーはＯＸ４０である。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
及び、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、前記部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
特定の態様では二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
４－１ＢＢに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは４－１ＢＢである。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号５１及び配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
特に、４－１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４６から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、及び配列番号６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含むことによって更に特徴づけられる。従って、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる従来の抗体に対する優位性を有し、典型的にはがん細胞である標的細胞において共刺激Ｔ細胞応答を選択的に誘導する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
標的細胞抗原がＦＡＰである二重特異性抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に興味のあるＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７０及び配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号７６及び配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号７８及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメインを含む。
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
ＯＸ４０及びＦＡＰに結合する二重特異性抗原結合分子
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｃ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｄ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｅ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｆ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｇ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｈ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｊ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｋ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｌ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｍ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｎ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか、又はここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
４－１ＢＢ及びＦＡＰに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４又は配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｂ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｄ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｅ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｆ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｇ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｈ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｊ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
二価特異的一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一態様では、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる１つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）配列番号３０３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号２３１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号２３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号２３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｅ）配列番号２３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｆ）配列番号２３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）配列番号２９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号２９７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号２９９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号３０１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
二重特異性、二価抗原結合分子（２＋２フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー及び標的細胞抗原の両方に対して二価である。
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている２つの追加のＦａｂ断片
を含む。
特定の態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されたクロスオーバーＦａｂ断片であり、かつ、ＶＬ－ＣＨ鎖はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。
特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片は、ＯＸ４０又は４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であり、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片は、ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ断片である。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの部分、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）それぞれが配列番号２１６のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号２１９のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号２２１のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号２２３のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｅ）それぞれが配列番号２２５のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｆ）それぞれが配列番号２２７のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つの部分、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）それぞれが配列番号２８７のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号２８９のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号２９１のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号２９３のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーへの結合に対して二価であり、標的細胞抗原（２＋１フォーマット）への結合に対して一価である二重特異性抗原結合分子
別の態様では、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
従って、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結され、かつ、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介してＦｃノブ重鎖のＣ末端に連結され、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介してＦｃホール重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む。
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介してＦｃホール重鎖のＣ末端に連結され、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介してＦｃノブ重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメインを含む。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片は、ＯＸ４０又は４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であり、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインは、ＦＡＰに特異的に結合することができる。
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）それぞれが配列番号１８６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３０６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３０７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号１８６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３１０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３１１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）それぞれが配列番号２６１のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号２６５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号２６９のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｄ）それぞれが配列番号２７３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３３０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｅ）それぞれが配列番号２６１のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｆ）それぞれが配列番号２６５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３３８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３３９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｇ）それぞれが配列番号２６９のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３４２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、又は
（ｈ）それぞれが配列番号２７３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３４６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む。
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
特定の態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
Ｆｃドメインは、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び望ましい組織－血液分布比を含む、本発明の二重特異性抗体に望ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりはむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対しての、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。従って、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
１つのそのような態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示し、かつ／又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの一又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を超える、具体的には約８０％を超える、より具体的には約９０％を超えるＦｃＲｎへの結合親和性を示すときに達成される。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して低減した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ一又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。別の態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。一態様では、改変されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。幾つかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈し得る。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように改変される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体についての記載がある。（米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（「ＬＡＬＡ」）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より特定の態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。前記文献はまた、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法を記載する。かかる抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか又は突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)参照）。
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を用いて、容易に決定することができる。適切なそのような結合アッセイが本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。
以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、抗体の、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合親和性を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインがエフェクター機能を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる抗原結合部位を含み、従ってＦｃドメインの２つのサブユニットは２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体形成は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するためには、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインに導入することが有利であろう。
従って、本発明の特定の態様は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。従って、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、該Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、該Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
従って、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体を更に安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
別の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。１つの好ましい態様において、重鎖のＣ末端は短縮されたＣ末端のＰＧである。本明細書中に報告された全ての態様のうちの一態様において、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書中に報告された全ての態様のうちの一実施態様において、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬの何れかが交換されている二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
１つの結合アームにおけるドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer、W.et al、PNAS、108(2011)11187-1191に詳細に記載されている。それらは明らかに、第２の抗原に対する間違った重鎖との第１の抗原に対する軽鎖のミスマッチに起因する副産物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）減少させる。
一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている。
特定の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。そのような分子は、一価の二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、該分子は
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、２つの追加のＦａｂ断片を含む。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。
従って、特定の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる前記２つの追加のＦａｂ断片はクロスオーバーＦａｂ断片であり、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、ＶＬ－ＣＨ鎖はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。
別の態様において、正しい対形成を更に改善するために、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び（ｃ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＣＬドメインの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
より具体的には、本発明はＦａｂを含む二重特異性結合分子に関し、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
本発明の例示的な抗体
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合する新規抗体及び抗体断片を提供する。これらの抗体は、既知のＯＸ４０抗体と比較して、標的細胞抗原に特異的に結合することができる別の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子への取り込みに特に適したものにする優れた特性を有する。
特に、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体と、結合を競合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体と、結合を競合する抗体が提供され、前記抗体は配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。特に、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体が提供され、前記抗体は配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合し、ヒト及びマウスＯＸ４０に対して交差反応性である抗体が提供され、前記抗体は配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
別の態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合する新規抗体及び抗体断片を提供する。これらの抗体は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる別の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子への取り込みに特に適しているように、既知の４－１ＢＢ抗体と比較して優れた特性を有する。
特に、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４６から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
一態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体を提供し、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
更なる態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体と、結合を競合する抗体が提供され、ここで、前記抗体は、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
幾つかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
別の態様では、本発明は、（ａ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
更なる態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又は抗体断片をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
更なる態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体又は抗体断片をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
組換え法
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は融合タンパク質を標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
本発明の更なる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供され、ここで該方法は、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
本明細書で記載のように調製される本発明の二重特異性分子は、当該技術分野で周知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子が、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体断片の、その対応するＴＮＦ受容体に対する親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。二重特異性抗原結合分子の、その標的細胞抗原に対する親和性も、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例２で説明される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、その対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の、その対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。更なる態様では、健常なＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのヘパリン処置血液から単離したＰＢＭＣを使用して、対応するカニクイザルＴＮＦ受容体発現細胞に対する二重特異性抗原結合分子又は抗体を示した。
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰを発現するがん細胞株を用いて、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
別の態様では、競合アッセイを使用して、標的又はＴＮＦ受容体にそれぞれ結合する特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、特異的抗標的抗体又は特異的抗ＴＮＦ受容体抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。
３．活性のアッセイ
一態様では、特定の標的細胞抗原及び生物学的活性を有する特定のＴＮＦ受容体に結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を介したアゴニストシグナル伝達を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような生物学的活性を有するものとして本アッセイによって同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。
特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、そのような生物学的活性について試験される。更に、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いる）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又は抗体の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの追加的な治療剤とを、例えば後述するように含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に溶解又は分散された一又は複数の二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つの本発明による二重特異性抗原結合分子又は抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示に照らして当業者には周知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者には周知であるように、任意の及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。あるいは、二重特異性抗原結合分子又は抗体は、使用前は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の抗原結合分子を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された液体媒質からの活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝剤を含む。
前に記載した組成物に加えて、抗原結合分子はデポー製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、水性及び他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
治療的方法及び組成物
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又は抗体の何れかが、治療方法において使用され得る。
治療法における使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与され得る。これに関連して考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。
更なる態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強することに使用のため、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することに使用のため、（ｉｉｉ）感染症の治療における使用のため、（ｉｖ）がんの治療における使用のため、（ｖ）がんの進行を遅延させることに使用のため、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。特定の態様では、疾患の治療、特にがんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は抗体が提供される。
特定の態様では、治療方法における使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。一態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又は抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子又は抗体の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性抗原結合分子又は抗体を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
一態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強する、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持する、（ｉｉｉ）感染症を治療する、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長するための方法が提供され、ここで、該方法は、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を、それを必要とする個体に投与することを含む。
更なる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの例には、限定されないが、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。がんの他の例には、カルシノーマ、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、恩恵を提供し得ることを容易に認識する。幾つかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの態様では、生理的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の適切な用量は（単独で使用されるか、あるいは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、特定の分子、疾患の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。何れの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、患者に対して、単回で、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１μｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ、体重１ｋｇあたり約５０μｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ、体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり約３５０μｇ、体重１ｋｇあたり約５００μｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含み得る。本明細書に列挙した数値からの誘導可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ～体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ～体重１ｋｇあたり約５００ｍｇなどを投与することができる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が融合タンパク質の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくは抗体又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の血漿レベルを提供するために個々に調整されてもよい。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
その他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、治療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与され得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１つの追加的治療剤と同時投与され得る。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加的治療剤は、別の抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。特定の態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体である。
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含んでもよい。
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
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全てのヌクレオチド配列は、それぞれの終止コドン配列なしで提示される。
以下において、本発明の特定の実施態様が列挙される：
１．（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子。
２．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが、ＯＸ４０及び４－１ＢＢからなる群から選択される、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーがＯＸ４０である、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
５．ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分が、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
８．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが４－１ＢＢである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
９．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１、２又は８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．４－１ＢＢに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分が、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号５１及び配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１、２、８又は９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分が、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、及び配列番号６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１、２、８、９又は１０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項１、２、及び８から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７０及び配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号７６及び配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号７８及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．（ｉ）４－１ＢＢに特異的に結合することができる部分が、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４又は配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５又は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１、２、又は８から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．前記分子が、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１から１８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２０．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への抗体の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２１．Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１から２０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２２．Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２３．ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２４．Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から２３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
２５．（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２６．二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー及び標的細胞抗原の両方に対して二価である、請求項２５に記載の二重特異性抗原結合分子。
２７．（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている２つの追加のＦａｂ断片
を含む、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２８．標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されたクロスオーバーＦａｂ断片であり、かつ、ＶＬ－ＣＨ鎖がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、請求項２７に記載の二重特異性抗原結合分子。
２９．共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、ＯＸ４０又は４－１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であり、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ断片である、請求項２７又は２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
３０．（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、請求項１から２９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
３１．二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して二価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である、請求項３０に記載の二重特異性抗原結合分子。
３２．（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結され、かつ、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
を含む、請求項１から３１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
３３．請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
３４．（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体。
３５．（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体。
３６．請求項３４又は３５に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
３７．請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
３８．医薬としての使用のための、請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体、又は請求項３７に記載の薬学的組成物。
３９．（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体、又は請求項３７に記載の薬学的組成物。
４０．がんの治療における使用のための、請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体、又は請求項３７に記載の薬学的組成物。
４１．二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための、請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体、又は請求項３７に記載の薬学的組成物。
４２．腫瘍細胞の増殖を阻害するために、請求項１から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３４若しくは３５に記載の抗体又は請求項３７に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いたＰＣＲによって生成されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
タンパク質の精製
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質をＰＢＳ又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し（必要に応じて）、－２０℃又は－８０℃で凍結保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄゲルろ過スタンダード１５１－１９０１が標準の役割を果たした。
質量分析
このセクションでは、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）の特徴づけについて、それらの正確な組み立てに重点を置いて記載する。期待される一次構造は、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化ＣｒｏｓｓＭａｂ又は代わりに脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析された。
ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７℃で最大１７時間、リン酸又はトリス緩衝液中でＮ－グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化は、脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂ１００μｇを用いて、トリス緩衝液ｐＨ８中で室温で１２０時間、３７℃で４０分間、それぞれ行った。質量分析に先立ち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ－ＭＳによって全質量を測定した。
実施例１
ＯＸ４０抗体及びツールのバインダーの生成
１．１ 抗原の調製、精製及び特徴づけ、並びにファージディスプレイによる新規ＯＸ４０バインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザルＯＸ４０のエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表１）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原－ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原－Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、ＯＸ４０エクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図１Ａ）。表１は、様々なＯＸ４０エクトドメインのアミノ酸配列を示す。表２は、図１に示される単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
Figure 0007034066000024
Figure 0007034066000025
Figure 0007034066000026
Figure 0007034066000027
Figure 0007034066000028
ＯＸ４０－Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ－ＡｃＴＥＶ－Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０～５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０で洗浄した。
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
１．２ 一般的なＦａｂ及び共通軽鎖ライブラリーからのＯｘ４０特異的８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ－５６３、ＣＬＣ－５６４及び１７Ａ９抗体の選択
抗ＯＸ４０抗体を、３つの異なる一般的なファージディスプレイライブラリー：ＤＰ８８－４（クローン２０Ｂ７、８Ｈ９ １Ｇ４及び４９Ｂ４）、共通軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３（クローンＣＬＣ－５６３及びＣＬＣ－５６４）及びラムダ－ＤＰ４７（クローン１７Ａ９）から選択した。
ＤＰ８８－４ライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８－４ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ８８－ｖ４－４又はＤＰ８８－ｖ４－６又はＤＰ８８－ｖ４－８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。これらのライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを得た。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
共通軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３は、定常非無作為化共通軽鎖Ｖｋ３＿２０及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖ－ドメイン対合Ｖｋ３＿２０（κ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する２つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は、Ｌ３からＨ３にわたる定常断片であり、断片２は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３共通軽鎖ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ．）と組み合わせたフォワードプライマーＭＳ６４）及び断片２（フォワードプライマーＤＰ４７－ｖ４－４、ＤＰ４７－ｖ４－６、ＤＰ４７－ｖ４－８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＭＳ６４及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に１８サイクルを行った。十分な量の全長無作為化ＶＨ構築物を集めた後、それらをＭｕｎＩ／ＮｏｔＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。３．７５×１０９の最終ライブラリーサイズが得られた。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９８．９％、重鎖については８９．５％であった。
ラムダ－ＤＰ４７ライブラリーは、以下のＶ－ドメイン対合を使用してヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築された：Ｖ１３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖。ライブラリーは軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３において無作為化され、「オーバーラップ伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片から構築された。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３の末端からＨ３の開始点にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は無作為化されたＨ３及びＦａｂ断片の３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを用いて、ライブラリー用のライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３ －Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０ － ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ））及び断片３（ＤＰ４７－ｖ４－４／ＤＰ４７－ｖ４－６／ＤＰ４７－ｖ４－８ － ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で６０秒、及び７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比の３つの断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性、及び９４℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で１２０秒の５サイクルであった。この段階で、外側プライマーを添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ断片を集めた後、それらを同様に処理されたアクセプターファージミドベクターとともにＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。Ｆａｂライブラリーインサートの１５ｕｇが、ファージミドベクターの１３．３ｕｇと連結された。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、１．５×１０９個の形質転換体が得られた。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）を、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合体として一時的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの同時発現を介してｉｎ ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化した。
選択ラウンド（バイオパニング）を以下のパターンに従って溶液中で行った：
１． 抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０ｕｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上において約１０１２個のファージミド粒子を事前清澄化する。
２． 全容量１ｍｌ中のＦｃバインダーの更なる枯渇のために、非結合ファージミド粒子を、１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥー・ホール構築物の存在下で、１００ｎＭのビオチン化ヒトＯＸ４０と０．５時間インキュベートする。
３． ビオチン化ｈｕ ＯＸ４０及び付着した特異的に結合するファージをニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって捕捉する。
４． ５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する。
５． １ウェルあたり１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０ｕｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｕｌを４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する。
６． Ｆｃバインダーを最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｃノブ・イントゥー・ホール構築物を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後清澄化する。
７． 溶出されたファージ粒子の上清により対数期大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、振盪機で３０℃で一晩インキュベートし、続いて次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。
選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド又は４ラウンドにわたって実施した。カニクイザルＯＸ４０だけでなくマウスＯＸ４０に対しても交差反応性であるバインダーの可能性を高めるために、幾つかの選択ラウンドでは、ヒトＯＸ４０の代わりにマウス標的が使用された。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的バインダーが同定された。１００ｕｌの２５ｎＭのビオチン化ヒトＯＸ４０及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを、それぞれニュートラアビジンプレート及びｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒトＯＸ４０に対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、カニクイザル及びマウスＯＸ４０に対して同様の方法で試験された。それらは、０．５リットルの培養体積で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析によって特徴づけられた。
表３は、一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８－４）の配列を示し、表４は、ライブラリーＤＰ８８－４生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表５は、ＤＰ８８－４生殖細胞系列テンプレートの生成に使用されるプライマー配列を示す。
Figure 0007034066000029
Figure 0007034066000030
Figure 0007034066000031
Figure 0007034066000032
表６は、一般的なファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の配列を示す。表７は、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表８は、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
Figure 0007034066000033
Figure 0007034066000034
Figure 0007034066000035
Figure 0007034066000036
表９は、ＰＣＲに使用される一般的なファージディスプレイラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表１０はラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表１１はラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
Figure 0007034066000037
Figure 0007034066000038
Figure 0007034066000039
クローン８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ－５６３、ＣＬＣ－５６４及び１７Ａ９は、上記の手順によりヒトＯｘ４０特異的バインダーとして同定された。それらの可変領域のｃＤＮＡ配列は以下の表１２に示され、対応するアミノ酸配列を表Ｃに見出すことができる。
Figure 0007034066000040
Figure 0007034066000041
Figure 0007034066000042
１．３ 抗Ｏｘ４０ ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴づけ
選択された抗Ｏｘ４０バインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとフレーム内にサブクローニングした。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
抗Ｏｘ４０クローンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を表１３に示す。抗Ｏｘ４０－Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。加えて、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
Figure 0007034066000043
Figure 0007034066000044
Figure 0007034066000045
Figure 0007034066000046
Figure 0007034066000047
Figure 0007034066000048
Figure 0007034066000049
Figure 0007034066000050
Figure 0007034066000051
抗Ｏｘ４０抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表１４は、抗Ｏｘ４０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１抗体の収率及び最終含有量をまとめたものである。
Figure 0007034066000052
実施例２
抗ＯＸ４０抗体の特徴づけ
２．１ ヒトＯＸ４０への結合
２．１．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体の組換えＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０クローン８Ｈ９、４９Ｂ４、１Ｇ４、２０Ｂ７、ＣＬＣ－５６３、ＣＬＣ－５６４及び１７Ａ９（全てヒトのＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＯＸ４０（ヒト、カニクイザル及びマウス）の間の種選択性並びに相互作用のアビディティーが決定された。ビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大６００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２～５００ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。複合体の解離を２１０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表１６）。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体８Ｈ９，４９Ｂ４，１Ｇ４，２０Ｂ７、ＣＬＣ－５６３及びＣＬＣ－５６４（ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＯＸ４０との間の相互作用の親和性を決定した。この目的のために、ヒト又はマウスＯｘ４０のエクトドメインもまた、ａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）及びヘキサヒスチジンタグ（これらの配列については表１５を参照のこと）とフレーム内でサブクローニングされ、又はＡｃＴＥＶプロテアーゼによる切断及びクロマトグラフィー法によるＦｃの除去によって得られた。
Figure 0007034066000053
タンパク質の産生を、Ｆｃ融合タンパク質について上記のように行った。分泌されたタンパク質は、キレートクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。
最初のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で行った。溶出は、５％～４５％の溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）からの１２カラム容量に対する勾配を適用することによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
親和性の決定は、２つの設定を用いて行った。
設定１）抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。ＯＸ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５～５０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒトＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）を４～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。
設定２）抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。Ｏｘ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒトＯｘ４０ ａｖｉ Ｈｉｓを２．３～６００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
クローン４９Ｂ４、１Ｇ４及びＣＬＣ－５６４は、クローン８Ｈ９、２０Ｂ７及びＣＬＣ－５６３よりも低い親和性でヒトＯｘ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。
抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧ１とヒトＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性定数を、１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した。
Figure 0007034066000054
２．１．２ ヒトＯｘ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に重ねた。試験管を４００×ｇ、室温で、低加速度でブレーキ無しで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００－０４４、Ｌｏｔ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１－０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
ＰＢＭＣは単離直後に使用され（ナイーブなヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌを供給したＴ細胞培地で５日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
Ｏｘ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、休止細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８４０－８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。
標識のために、細胞を収集し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８４０－８５）を最終濃度２．５ｍＭ及びＤＰＢＳ中の最終細胞密度０．５×１０７細胞／ｍＬでナイーブなヒトＰＢＭＣの懸濁液に添加した。次いで、細胞を暗所で室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、２ｍＬのＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）。
プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を、４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）２００μＬで１回洗浄した。細胞を、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェル中で、４℃で１２０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して結合していない構築物を除去した。
細胞を暗所で４℃で３０分間、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ－Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、抗ヒトＣＤ４５（クローンＨＩ３０、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０２８）、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ ０９６ ０９８）を含有する２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。
プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
図２Ａ－２Ｄに示すように、ＯＸ４０に特異的な抗体構築物は、ＯＸ４０を発現しない休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての構築物は、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上に検出されたＯＸ４０レベルのほんの一部のみを発現する。違いは、ドナーと時間に依存する。分析した抗ＯＸ４０クローンはその結合強度において様々であった。ＥＣ５０値を表１７に示す。二価及び一価ＦＡＰ標的化構築物の更なる評価のために、高い（８Ｈ９）及び低い（４９Ｂ４／１Ｇ４）結合能力を有するクローンを選択した。
Figure 0007034066000055
２．２ マウスＯＸ４０への結合
２．２．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体２０Ｂ７の組換えマウスＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒトＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴によって評価した（実施例２．１．１を参照）。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表１８）。
親和性決定のために、Ｆｃ融合タンパク質と基準フローセルとの非特異的相互作用のために、ＡｃＴＥＶプロテアーゼで切断されたマウスＯｘ４０ Ｈｉｓ（実施例２．１．２参照）又はＯｘ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）を使用した。抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。ＯＸ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えマウスＯＸ４０（配布者の指示に従ってＡｃＴＥＶ消化により切断された）を、４．１～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。クローン２０Ｂ７がマウスＯＸ４０に結合することが示された（表１８）。
抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１分子とマウスＯＸ４０との間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Figure 0007034066000056
２．２．２ マウスＯＸ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化マウス脾細胞（選択されたクローン）
マウス脾臓を３ｍＬのＰＢＳに集め、ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ カタログ番号１３０－０９６－３３４）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単一細胞懸濁液を生成した。その後、脾細胞を３０μｍの前分離（ｐｒｅ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）フィルター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ カタログ番号１３０－０４１－４０７）に通して濾過し、４℃、３５０ｘｇで７分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μＭのβ－メルカプトエタノール及び１０％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｐ４３３３）を供給したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。１０６細胞／ｍＬを、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３εアルメニアハムスターＩｇＧ（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３３１）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８シリアンハムスターＩｇＧ（クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０２１０２）をコーティングした６ウェル組織培養プレート中で３日間培養した。活性化又は新鮮なマウス脾細胞を収集し、ＤＰＢＳで洗浄し、計数し、０．１×１０６個の細胞を９６個のＵ底非組織培養処理ウェルプレートの各ウェルに移した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、異なる濃度の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（選択されたバインダーのみ）を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗マウスＣＤ８ｂラットＩｇＧ２ｂκ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４、クローン５３－６．７）、抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ｂκ－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２、クローンＧＫ１．５）及びＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）を含有するＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で４℃で３０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
図３Ａ－３Ｄに示すように、クローン２０Ｂ７及び良く特徴づけられたマウス特異的ベンチマーク抗体ＯＸ８６のみが、活性化マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合を示した。休止マウス脾細胞においては結合は観察されなかった。
２．３ カニクイザルＯＸ４０への結合
選択された抗ＯＸ４０バインダーのカニクイザル細胞との反応性を試験するために、健常なＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＢＭＣを、ヒト細胞について記載したような密度勾配遠心分離を軽微な修正を加えて用いてヘパリン処置血液から単離した。ＤＰＢＳで希釈したリンパ球プレパラート培地（９０％ｖ／ｖ、Ａｘｏｎ Ｌａｂ、カタログ番号１１１４５４５）を用いて、ヘパリン処理した新鮮な血液から密度勾配遠心分離を用いてカニクイザルＰＢＭＣを単離した。遠心分離は、５２０ｘｇで、室温で３０分間ブレーキ無しで行った。血小板数を減少させるために、１５０ｘｇで室温で１５分間の隣接した遠心分離を行った後、無菌ＤＰＢＳでＰＢＭＣを洗浄するために室温で１０分間４００ｘｇで数回遠心分離を行った。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞の細胞表面上で強いＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化されたカニクイザルＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、プレコートした１２ウェル組織培養プレート［１０μｇ／ｍＬのカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ３（クローンＳＰ３４）及び２μｇ／ｍＬのカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で７２時間培養した。
次いで、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに０．５×１０５個の活性化カニクイザルＰＢＭＣを添加した。細胞を２００μＬの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＦＡＣＳの５０μＬ／ウェル中で４℃で１２０分間インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。細胞を、蛍光標識したカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ－４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号３１７４２８）、抗ヒトＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号５５５３６９）及びＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
図４Ａ及び４Ｂに示すように、ほとんどの構築物が活性化ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に結合した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。ＯＸ４０の発現レベルは、動力学及び刺激の強さに依存しており、ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されたが、ＣＤ８＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されなかったので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞ではほとんどＯＸ４０発現が誘導されなかった。分析した抗ＯＸ４０クローンはその結合強度において様々であった。ＥＣ５０値を表１９に示す。非典型的な曲線適合のため、クローン８Ｈ９、４９Ｂ４、２１Ｈ４についてはＥＣ５０値は計算できなかった。
Figure 0007034066000057
２．３．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体（全てヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の組換えカニクイザルＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
ビオチン化カニクイザルＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大８００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２～５００ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。複合体の解離を２１０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表２０）。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えカニクイザルＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。Ｏｘ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５～５０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えカニクイザルＯｘ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）を４～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた（表２０）。
クローン４９Ｂ４、１Ｇ４及びＣＬＣ－５６４は、クローン８Ｈ９、２０Ｂ７及びＣＬＣ－５６３よりも低い親和性でカニクイザルＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。
抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１とカニクイザルＯＸ４０との間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Figure 0007034066000058
２．３．２ カニクイザルＯＸ４０発現細胞への結合：活性化されたカニクイザル末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ＯＸ４０陰性腫瘍細胞への結合
ＯＸ４０陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、ＷＭ２６６－４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６７６）及びＵ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）腫瘍細胞を用いて試験した。両方の腫瘍細胞の分離を可能にするために、ＷＭ２６６－４細胞をＰＫＨ－２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）で予め標識した。細胞を収集し、ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄した。ペレットを、新たに調製したＰＫＨ２６－赤色染色溶液（提供された希釈液Ｃ中で最終濃度［１ｎＭ］）中、１×１０７個の細胞の最終細胞密度で、暗所で室温で５分間染色した。過剰のＦＢＳを添加して標識反応を停止させ、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを補充したＲＰＭＩ １６４０培地で４回洗浄して過剰の色素を除去した。
ＤＰＢＳ中の５×１０４個のＰＫＨ２６標識ＷＭ２６６－４細胞と非標識Ｕ－８７ ＭＧ細胞の混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。全ての試料を、滴定濃度の抗Ｏｘ４０ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体構築物を含有する４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに４℃で１２０分間再懸濁した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。細胞を、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＯＸ４０に特異的な抗体構築物は、ＯＸ４０陰性ヒト腫瘍細胞ＷＭ２６６－４及びＵ－７８ＭＧに結合しなかった。
２．４ リガンドブロッキング特性
ＯＸ４０／ＯＸ４０－リガンド相互作用を妨げるＯＸ４０特異的ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体分子の能力を決定するために、ヒトＯＸ４０リガンド（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの間の相互作用の親和性が低いため、Ｃ末端のＨａタグを有する二量体ヒトＯＸ４０ Ｆｃ融合体を調製した（図１Ｂ）。この二量体ヒトＯｘ４０ Ｆｃ融合分子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２１に示す。産生及び精製を、実施例１．１の単量体ＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）について記載したように実施した。
Figure 0007034066000059
ヒトＯＸ４０リガンド（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０で、ＣＭ５チップの２つのフローセルに約２５００ＲＵで直接連結させた。組換えヒトＯｘ４０ Ｆｃを、第２のフローセル上で２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を省略し、ファージ由来の抗Ｏｘ４０ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９ＬＡＬＡを、両方のフローセル上で５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を６０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗体を固定化ヒトＯＸ４０リガンドを有する表面上に流したが、その上には組換えヒトＯＸ４０ Ｆｃの代わりにＨＢＳ－ＳＰが注入された。
図１Ｃは実験の設計を示す。
ファージ由来クローン２０Ｂ７は、ヒトＯＸ４０とそのＯＸ４０リガンドとの複合体に結合した（表２２、図６Ｂ）。従って、この抗体は、ヒトＯＸ４０への結合についてリガンドと競合せず、従って、「非リガンドブロッキング」と呼ばれる。対照的に、クローン８Ｈ９，１Ｇ４，４９Ｂ４、ＣＬＣ－５６３及びＣＬＣ－５６４は、そのリガンドと複合体を形成したヒトＯＸ４０に結合せず、従って「リガンドブロッキング」と呼ばれる。
Figure 0007034066000060
実施例３
抗ヒトＯＸ４０結合クローンの機能特性
３．１ ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
ＯＸ４０のそのリガンドへのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介した下流シグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を作成し、その表面にヒトＯｘ４０を発現させた。更に、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを保持している。Ｏｘ４０トリガーは、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、これは核内に移行し、レポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させるルシフェラーゼはルシフェリン酸化を触媒し、光を放出するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターで定量することができる。１つの実験の範囲は、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導するためのＰ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける様々な抗Ｏｘ４０バインダーの能力を試験することであった。
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１－０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１－０２１）、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中で２×１０５の細胞密度に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．３×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。
翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１フォーマットの様々な滴定抗ＯＸ４０バインダーを含有するアッセイ培地を添加して６時間刺激した。抗ＯＸ４０抗体に対する過架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－００６－０９８）を含む培地５０μＬ／ウェルを１：２の比（一次の単一抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１よりも２倍多い二次抗体）で添加した。インキュベーション後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１０００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａであり、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を製造者の指示に従って使用して、発光の定量化を行った。簡単には、ウェル当たり３０μＬの１×溶解緩衝液を添加することにより、細胞を－２０℃で１０分間溶解させた。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェル当たり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するためのフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて発光を直ちに定量した。放出された相対光単位（ＵＲＬ）を、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて対数一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、組み込みのＳ字状線量応答を用いて適合させた。
図７Ａ及び７Ｂに示されるように、限定された用量依存性のＮＦκＢ活性化は、抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１抗体（左側）をレポーター細胞株に添加することによって既に誘導された。抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体による抗ＯＸ４０抗体の過架橋は、濃度依存的にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた（右側）。活性化のＥＣ５０値を表２３にまとめる。
Figure 0007034066000061
３．２ 最適以下にＴＣＲトリガーされた事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＯＸ４０媒介共刺激
ＯＸ４０のライゲーションは、最適以下のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にＴ細胞の分裂及び生存を促進する相乗的な共刺激シグナルを提供する（M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191）。更に、幾つかのサイトカインの産生及びＴ細胞活性化マーカーの表面発現が増加する（I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532）。
種々の抗ＯＸ４０結合剤のアゴニスト特性を試験するために、事前に活性化されたＯｘ４０陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を、溶液中又はプレート表面上に固定化されている抗ＯＸ４０抗体の存在下で、プレート固定された抗ＣＤ３抗体の最適以下の濃度で７２時間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化及び分化マーカー、例えばＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、Ｔｉｍ－３、ＣＤ６２Ｌ及びＯＸ４０それ自体に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
ヒトＰＢＭＣをフィコール密度遠心分離により単離し、実施例２．１．２に記載したように、ＰＨＡ－Ｌ［２μｇ／ｍＬ］及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ［２００Ｕ／ｍＬ］で３日間刺激した。次いで細胞を、最終濃度［５０ｎＭ］のＣＦＤＡ－ＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８）を用いて１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度でＣＦＳＥにより染色した。その後、細胞をＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を含む過剰のＤＰＢＳで２回洗浄した。標識された細胞を、３７℃で３０分間Ｔ細胞培地中で休ませた。その後、ＤＰＢＳを用いた２回の更なる洗浄工程によって、非変換ＣＦＤＡ－ＳＥを除去した。事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣからのＣＤ４ Ｔ細胞の単離を、ＭＡＣＳ陰性ＣＤ４ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造者の指示に従って行った。
Ｍｏｒｒｉｓらは、従来の抗Ｏｘ４０抗体によるアゴニスト共刺激が表面固定化に依存することを示した（N. P. Morris et al., Mol. Immunol. 2007, 44(12), 3112-3121）。従って、ヤギ抗マウスＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１－５００－５００８）を、ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００６－０９８）の存在下（表面固定化抗ＯＸ４０）又は非存在下（溶液中の抗ＯＸ４０）で、４℃で一晩ＰＢＳ中で［２μｇ／ｍＬ］の濃度で９６ウェルＵ底細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）の表面にコーティングした。その後、ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（１％ｖ／ｗ）でプレート表面をブロックした。以下の全てのＴ細胞のインキュベーション工程は、ＢＳＡ（１％ｖ／ｗ）を含有するＰＢＳ中で３７℃で９０分間行われた。インキュベーション工程の間に、プレートをＤＰＢＳで洗浄した。
マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５、固定濃度［３ｎｇ／ｍＬ］）を、表面被覆抗マウスＦｃγ特異的抗体を介して、次のインキュベーション工程で捕捉した。１つの実験において、滴定したヒト抗ＯＸ４０抗体（ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を、ＤＰＢＳ中における更なるインキュベーション工程によってプレート上に固定化した。第２の実験では、抗ＯＸ４０抗体を、活性化アッセイの間に、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体でプレコートされていないプレートの培地に直接添加した。
ＣＦＳＥ標識事前活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞を２００μＬのＴ細胞培地中０．６×１０５細胞／ウェルの細胞密度でプレコートプレートに添加し、９６時間培養した。細胞を、蛍光色素標識マウス抗ヒトＯｘ４０（クローンＢｅｒＡＣＴ３５、Ｂｉｏｌｅｄｇｅｎｄ、カタログ番号３５００８）、ＴＩＭ－３（クローンＦ３８－２Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５００８）、ＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１２３４）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４８３４）及びＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５４８９）の組み合わせで４℃、暗所で２０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
ＤＡＰＩ陰性生細胞を、増殖のマーカーとしてＣＦＳＥ蛍光の中央値の減少について分析した。ＯＸ４０陽性、ＣＤ６２Ｌ低及びＴＩＭ－３陽性Ｔ細胞の割合をＴ細胞活性化のマーカーとしてモニターした。ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７の発現を分析してＴ細胞の成熟状態における変化を決定し、それによってＣＤ４５ＲＡ低ＣＤ１２７低細胞をエフェクターＴ細胞として分類した。
プレート固定化抗体による共刺激は、プレート固定化抗ヒトＣＤ３による事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下の刺激を用量依存的に強く亢進した（図８Ａ－８Ｆ）。Ｔ細胞はより強く増殖し、より高い割合のエフェクターＴ細胞を有するより成熟した表現型を示し、ＣＤ６２Ｌ低、Ｔｉｍ－３陽性及びＯＸ４０陽性活性化細胞のより高い割合を有していた。幾つかのクローン（８Ｈ９，２０Ｂ７）は、市販の検出抗体を細胞ＯＸ４０への結合において打ち負かした。それらについてはＥＣ５０値の計算は不可能であり、従ってＯＸ４０誘導についての全てのＥＣ５０値は、全般的なＥＣ５０値の計算から除外された。Ｔ細胞活性化の他の全てのパラメーターにおける最大半量の変化は、３～７００ｐＭの範囲の濃度で達成され、図９及び表２４にまとめられる。抗Ｏｘ４０抗体を表面固定化の非存在下で溶液中に添加した場合、最適以下のＴＣＲ刺激の増強は見られなかった（図１０Ａ－１０Ｆ）。これは、ＯＸ４０受容体の過架橋に対するＯｘ４０軸活性化の強い依存性を再び実証した。
抗ＯＸ４０抗体（ｈｕ ＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の結合強度とアゴニスト活性（生物活性）との相関を図１１に示す。ほとんどのクローンについて、直接相関があったが、驚くべきことに、２つのクローン（４９Ｂ４，１Ｇ４）は、それらの結合強度から予測されたより強い生物活性を示した。
Figure 0007034066000062
実施例４
Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性構築物の生成
４．１ Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性二価抗原結合分子の生成（２＋２フォーマット）
Ｏｘ４０及びＦＡＰに対する二価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体を調製した。誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願第ＷＯ２０１０／１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ（ｃｒｏｓｓｍａｂ）技術が適用された。
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を（Ｇ４Ｓ）４コネクタ配列を用いて抗ＯＸ４０ ｈｕＩｇＧ１の重鎖にＣ末端融合させた。この重鎖融合体を、抗ＯＸ４０の軽鎖及び対応するＦＡＰ交差軽鎖（ＶＬＣＨ１）と同時発現させた。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。得られた二重特異性二価構築物を図１２Ａに示す。
表２５は、成熟二重特異性二価抗ＯＸ４０／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007034066000063
Figure 0007034066000064
Figure 0007034066000065
Figure 0007034066000066
Figure 0007034066000067
Figure 0007034066000068
Figure 0007034066000069
Figure 0007034066000070
Figure 0007034066000071
Figure 0007034066000072
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表２６）。
Figure 0007034066000073
４．２ Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性一価抗原結合分子の生成（１＋１フォーマット）
Ｏｘ４０及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体は、誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願ＷＯ２０１０１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ技術を適用することによって調製された。
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）をｈｕＩｇＧ１のホール重鎖に融合させた。抗Ｏｘ４０に対するＦａｂをノブ重鎖に融合させた。標的化抗ＦＡＰ－Ｆｃホールと抗Ｏｘ４０－Ｆｃノブ鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合Ｆａｂ及びＯｘ４０結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１２Ｂ）。
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。
得られた二重特異性一価構築物は図１２Ｂに示され、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は表２７に見出すことができる。
Figure 0007034066000074
Figure 0007034066000075
Figure 0007034066000076
Figure 0007034066000077
Figure 0007034066000078
Figure 0007034066000079
Figure 0007034066000080
Figure 0007034066000081
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクター重鎖ホール」：「ベクター重鎖ノブ」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの二重特異性抗原結合分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表２８は、二価特異的一価抗Ｏｘ４０／抗ＦＡＰ ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ｋｉｈ抗原結合分子の生化学分析をまとめたものである。
Figure 0007034066000082
４．３ Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性構築物の特徴づけ
４．３．１ 表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒトＯｘ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ビオチン化ヒトＯｘ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性構築物を、２５０ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した（図１２Ｃ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
図１３Ａ－１３Ｈのグラフに見られるように、二重特異性構築物は全て、ヒトＯｘ４０とヒトＦＡＰとを同時に結合することができた。
４．３．２細胞への結合
４．３．２．１ ＦＡＰ標的化抗ヒトＯｘ４０抗体のヒトＰＢＭＣへの結合；ナイーブ対活性化ヒトＰＢＭＣ
ヒトＰＢＭＣを、実施例２．１．２に記載のフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌを供給したＴ細胞培地で４～７日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［１０ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
Ｏｘ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、ナイーブ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８４０－８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイを実施例２．１．２に記載のように実施した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイをセクション２．１．２に記載のように実施した。
一次抗体は、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物であり、４℃で１２０分間インキュベートされた。二次抗体溶液は、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ－Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）の混合物であり、暗所で４℃で３０分間インキュベートされた。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
図１４Ａ－１４Ｑに示すように、Ｏｘ４０に特異的な抗原結合分子は、休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての抗原結合分子は活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞への結合は、実施例２．１．２において既に記載したものと同様に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。図１４Ａ－１４Ｑに示すように、二価ＦＡＰ標的化Ｏｘ４０構築物は、従来のＩｇＧ抗体フォーマットのそれぞれのクローンと類似した、Ｏｘ４０陽性細胞及び陰性細胞への結合特性を示したが、一価抗体は、アビディティーの減少のためＯｘ４０陽性細胞に結合する能力が明らかに低下していた。
４．３．２．２ ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６－４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６７６）を使用して試験した。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９は、マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）を、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下で、ｈｕＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクションすることによって生成された。幾つかのアッセイでは、実施例２．３．２に記載のように、ＷＭ２６６－４細胞をＰＫＨ－２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）で予め標識し、これらの腫瘍細胞を、存在する他の細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣ）からの分離を可能にした。
０．５×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６－４細胞を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイを実施例２．３．２に記載したのと同様の方法で実施した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。示された濃度範囲（滴定）で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに全ての試料を再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、短いボルテックスにより再懸濁した。細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷二次抗体溶液で更に染色し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
図１５Ａ及び１５Ｂに示されるように、ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの同一のクローンではなく、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合した。従って、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０抗原結合分子のみが、直接腫瘍標的化特性を示す。二価構築物（黒四角）は、一価フォーマットに比べて二価のアビディティーの増加によって説明される、一価構築物よりも強いＦＡＰへの結合を示した。これは、低ＦＡＰ発現ＷＭ２６６－４細胞（図１５Ｂ）よりも、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（図１５Ａ）においてより顕著であった。ＷＭ２６６－４細胞上のより低い密度の表面ＦＡＰは、抗ＯＸ４０構築物の二価結合を常に可能にするＦＡＰ分子の近接性を提供しないかもしれない。活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表２９にまとめる。
Figure 0007034066000083
４．４ ＯＸ４０に対して二価であり、ＦＡＰに対して一価であるＯＸ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成（２＋１フォーマット）
２つの異なる重鎖の組み立てを可能にするノブ・イントゥー・ホール技術を適用することによって、Ｏｘ４０に対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体を調製した。
この実施例では、第１の重鎖（ＨＣ１）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の１つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＨドメインに融合されたＦｃノブ鎖を含んでいた。構築物の第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の１つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＬドメインに融合されたＦｃホール鎖を含んでいた。
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。重鎖融合タンパク質を抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の軽鎖（ＣＬＶＬ）と同時発現させた。ＯＸ４０への結合について二価である得られた二重特異性構築物は、図１２Ｄに示されており、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は表３０に見出すことができる。
更に、抗ＦＡＰバインダーのＶＨ及びＶＬドメインが、抗原に結合しないＤＰ４７と呼ばれる生殖細胞系列コントロールによって置換された、「非標的化」２＋１構築物を調製した。
Figure 0007034066000084
Figure 0007034066000085
Figure 0007034066000086
Figure 0007034066000087
Figure 0007034066000088
Figure 0007034066000089
Figure 0007034066000090
Figure 0007034066000091
Figure 0007034066000092
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
二重特異性抗Ｏｘ４０／抗ＦＡＰ ２＋１構築物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：２の比（「ベクターＨＣ１」：「ベクターＨＣ２」：「ベクターＬＣ」）でトランスフェクトした。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での２００ｍＬの産生のために、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地（Ｓｉｇｍａ）中でトランスフェクションの２４時間前に２億５，０００万個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間、１６５ｒｐｍで振盪させてインキュベートした。インキュベーション後、サプリメント（１ｍＭバルプロ酸、５ｇ／ｌのＰｅｐＳｏｙ、６ｍＭのＬ－グルタミン）を含むＥｘｃｅｌｌ培地１６０ｍＬを添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの２４時間後、１２％最終容量（２４ｍＬ）及び３ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌストックから１．２ｍＬ）でアミノ酸及びグルコース供給物を細胞に補充した。７日間培養した後、２０００－３０００×ｇで４５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、３０ｍＬの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。非結合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有する６－１０カラム容量の緩衝液で洗浄することにより、除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０の２０ＣＶ（０～１００％）の段階又は線形ｐＨ勾配の何れかを用いて溶出させた。次いで、カラムを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０を含む１０カラム容量の溶液で洗浄し、その後再平衡化工程を行った。
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表３１）。
Figure 0007034066000093
４．５ Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性２＋１構築物の特徴づけ
４．５．１ ＦＡＰへの結合（表面プラズモン共鳴）
ヒト、マウス及びカニクイザルＦＡＰに結合する二重特異性構築物の能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ （Ｂｉａｃｏｒｅ）において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて２５℃で行った。
Ｈｉｓタグ付きヒト、マウス又はカニクイザル二量体ＦＡＰを、５００ｎＭのｈｕＦＡＰを１０μＬ／分の流速で６０秒間、１０ｎＭのマウスＦＡＰを２０μＬ／分の流速で２０秒間、及び１０ｎＭのｃｙｎｏＦＡＰを２０μＬ／分の流速で２０秒間注入することにより、抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号３４６６０）で固定したＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉した。最大１８０００の共鳴単位（ＲＵ）までの抗Ｈｉｓ抗体の固定化レベルを使用した。アッセイの設定を図１２Ｅに示す。
捕捉工程の後、二重特異性構築物及びコントロール分子を、３０μＬ／分の流速で２８０ｓ及び１８０ｓの解離相で、０．７８－１００ｎＭの範囲の濃度でチップ表面上を直ちに通過させた。バルク屈折率の差は、ＦＡＰが固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。親和性は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１曲線適合を用いて決定した。二価結合については、同じ１：１適合を使用して、見掛けのＫＤ値を導いた。
Figure 0007034066000094
４．５．２ ヒトＯＸ４０への結合－二価Ｏｘ４０結合の競合結合
２つの抗ＯＸ４０のＦａｂドメインの全ての、ＩｇＧに匹敵する、ｈｕＯＸ４０に結合する能力を確認するために、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）を適用した。従って、ｈｕＯＸ４０－ＳＮＡＰ融合体でトランスフェクトされ、ＦＲＥＴドナーであるテルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した１００００ Ｈｅｋ２９３ ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、ＦＲＥＴアクセプターｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した０．２ｎＭ（４９Ｂ４）のＩｇＧと混合した。更に、（４９Ｂ４）ＩｇＧ又は二重特異性構築物４９Ｂ４／２８Ｈ１（２＋１）の何れかからの０．００４－７５０ｎＭの範囲の濃度希釈液を加えて、室温で２－４時間インキュベートした。蛍光シグナルは、蛍光ドナー（Ｔｅｒｂｉｕｍ）については６２０ｎｍで、蛍光アクセプター色素（Ｍ１００ Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）については６６５ｎｍで測定した。６６５／６２０＊１０００の比を計算し、基準（細胞のみ）を差し引いた（図１３Ｍ）。ＥＣ５０の決定のために、結果をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５で分析した。観察されたＥＣ５０値を表３３に示す。全ての２＋１構築物は、これらの実験条件下で二価ＩｇＧよりも同様のＥＣ５０を示した。
Figure 0007034066000095
４．５．３ ＯＸ４０とＦＡＰへの同時結合
ヒトＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ （Ｂｉａｃｏｒｅ）において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて２５℃で行った。
ビオチン化ヒトＯＸ４０ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
ＯＸ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２５０ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速でチップ表面を９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した（図１２Ｆを参照）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
全ての二重特異性構築物は、ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図１３Ｊ－１３Ｌ）。
４．５．４ 細胞への結合
４．５．４．１ ＯＸ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体のヒトＰＢＭＣへの結合；ナイーブ対活性化ヒトＰＢＭＣ
ヒトＰＢＭＣを、実施例２．１．２に記載のフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌを供給したＴ細胞培地で４日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［４μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
ＯＸ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、ナイーブ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８４０－８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイを実施例２．１．２に記載のように実施した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイをセクション２．１．２に記載のように実施した。
一次抗体は、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物であり、４℃で１２０分間インキュベートされた。二次抗体溶液は、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ－Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）の混合物であり、暗所で４℃で６０分間インキュベートされた。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
図１４Ｊ及び１４Ｑに示すように、Ｏｘ４０に特異的な抗原結合分子は、休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての抗原結合分子は活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞への結合は、実施例４．３．２．１において既に記載したものと同様に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。図１４Ｋ及び１４Ｍに示されるように、二価のＦＡＰ標的化ＯＸ４０構築物は、アビディティーの増加のために、一価抗体フォーマットにおけるそれぞれのクローンとして、ＯＸ４０陽性細胞に対してより強い結合特性を示した。２＋１様式の全てのフォーマットは、第２の特異性の結合部分とは独立して、ＯＸ４０陽性細胞に対して同様の強度で結合した（図１４Ｏ及び１４Ｑ）。
４．５．４．２ ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現ＷＭ２６６－４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６７６）を使用して試験した。ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、標識されていないヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６－４細胞からの分離を可能にするために、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ蛍光タンパク質を発現するＡ５４９ ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４９１）を用いて試験した。親のＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）は、標準的なＥｓｓｅｎプロトコルに従って、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、ＭＯＩを３（ＴＵ／細胞）で、Ｅｓｓｅｎ ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）を形質導入した。これは、≧７０％の形質導入効率をもたらした。
ＦＡＣＳ緩衝液中の５×１０４個の非標識ＷＭ２６６－４細胞と非標識Ａ５４９ ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓとの混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に添加し、結合アッセイを実施例４．３．２．２に記載したのと同様の方法で実施した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。示された濃度範囲（滴定）で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに全ての試料を再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、短いボルテックスにより再懸濁した。細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０９６－０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷二次抗体溶液で更に染色し、暗所で４℃で６０分間インキュベートした。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
図１５Ｃ及び１５Ｅに示されるように、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合する。従って、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０抗原結合分子のみが、直接腫瘍標的化特性を示す。高親和性ＦＡＰ結合クローン４Ｂ９は、一価構築物において、同じ一価のフォーマットの各ＦＡＰ結合クローン２８Ｈ１よりもヒトＦＡＰへのより強い結合を示した（図１５Ｅ）。ＦＡＰ結合ドメインを欠く２＋１構築物については、ＦＡＰは検出されなかった（白丸、図１５Ｆ）。活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表３４にまとめる。
Figure 0007034066000096
実施例５
二重特異性抗ヒトＯＸ４０結合分子の機能特性
５．１ ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
実施例３．１に示されるように、限定された用量依存性のＮＦκＢ活性化は、抗ＯＸ４０ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕＩｇＧ１抗体をＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞株に添加することによって誘導された。抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体による抗ＯＸ４０抗体の過架橋は、濃度依存的にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた。結果的に、発明者らは、一価及び二価のＦＡＰ標的フォーマットの選択された抗ＯＸ４０バインダー（８Ｈ９、１Ｇ４、４９Ｂ９）のＮＦκＢ活性化能力を、単独で、及び二次抗体又はＦＡＰ＋腫瘍細胞株の何れかによる構築物の過架橋を伴うもので試験した。
実施例３．１に記載されているように、接着性ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を１ウェルあたり０．３×１０５細胞の細胞密度で一晩培養し、ＦＡＰ標的化一価（ＦＡＰ １＋１）及び二価（ＦＡＰ ２＋２）フォーマットの、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕ ＩｇＧ１構築物として滴定された抗ＯＸ４０バインダー（クローン８Ｈ９及び１Ｇ４）を含有するアッセイ培地で５～６時間刺激した。二次抗体による過架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－００６－０９８）を含む培地２５μＬ／ウェルを１：２の比（一次対二次抗体）で添加した。細胞表面ＦＡＰ結合による過架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞（ＷＭ２６６－４及び／又はＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９）を含む培地２５μＬを２：１の比（ウェルあたりレポーター細胞よりも２倍のＦＡＰ＋腫瘍細胞）で共培養した。活性化ＮＦκＢを、実施例３．１に記載したように、ルシフェラーゼ１０００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を用いて発光を測定することによって定量した。
図１６Ａ－１６Ｇに示すように、全ての抗ＯＸ４０構築物の存在は、制限されたＮＦκＢ活性化を誘導した。二次抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体を介した過架橋は、ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ並びにＦＡＰ標的一価／二価フォーマットの両方のバインダーについて、このＮＦκＢ活性化を増加させた。よって、ＯＸ４０への一価結合は、ＯＸ４０への二価結合よりも効率が低く、これはＯＸ４０シグナル伝達軸を完全に活性化するためにＯＸ４０受容体オリゴマー化の必要性を示した。ＦＡＰ標的化分子（黒四角形及び三角形）を用いた場合、ＦＡＰ発現腫瘍細胞は濃度依存的様式でＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた。構築物はＦＡＰ＋腫瘍細胞によって更に過架橋され得ないので、非標的化ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの同じクローンが使用された場合、そのような作用は見られなかった。ここでも、二価の分子は一価の分子よりも優れていた。ＦＡＰの高発現は、より高度な架橋を確実にし、従って、ＦＡＰ標的化構築物のより良好なアゴニスト効果を確実にした（ＦＡＰ高ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９及びＦＡＰ陽性ＷＭ２６６－４細胞の黒の菱形を比較）。二価のＦＡＰ標的化構築物は、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の存在下で約０．１～１ｎＭの濃度でピーク活性を示した。化合物濃度の更なる増加は、ＮＦκＢを誘導する能力を実際に低下させた。おそらく、１つの標的（ＦＡＰ又はＯＸ４０）にのみ結合する二価構築物が、より高い濃度で存在しており、ＦＡＰ及びＯＸ４０に同時に結合する構築物を打ち負かした。この架橋の喪失は、アゴニストＯＸ４０シグナル伝達を減少させた。
更なる実験において、接着性ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を１ウェルあたり０．２×１０５細胞の細胞密度で一晩培養し、ＦＡＰ標的化一価（ＦＡＰ１＋１）及び二価（ＦＡＰ ２＋１及びＦＡＰ ２＋２）フォーマットの、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｈｕ ＩｇＧ１構築物として滴定された抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ９）を含有するアッセイ培地で５時間刺激した。ＦＡＰは、２つの異なるＦＡＰ結合クローン、すなわちＦＡＰに対する低い親和性を有する２８Ｈ１及びＦＡＰに対する高い親和性を有する４Ｂ９を用いて２＋１で標的化された。二次抗体による過架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－００６－０９８）を含む培地２５μＬ／ウェルを１：２の比（一次対二次抗体）で添加した。細胞表面ＦＡＰ結合による過架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９）を含む培地２５μＬを４：１の比（ウェルあたりレポーター細胞よりも４倍のＦＡＰ＋腫瘍細胞）で共培養した。活性化ＮＦκＢを、実施例３．１に記載したように、ルシフェラーゼ１０００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を用いて発光を測定することによって定量した。
図１６Ｈ－１６Ｎに示すように、この実験においても、全ての抗ＯＸ４０構築物の存在は、限定されたＮＦκＢ活性化を誘導した。二次抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体を介した過架橋は、ＦＡＰ標的化一価／二価フォーマットの全てのバインダーについて、このＮＦκＢ活性化を増加させた。よって、ＯＸ４０への一価結合は、ＯＸ４０への二価結合よりも効率が低く、これはＯＸ４０シグナル伝達軸を完全に活性化するためにＯＸ４０受容体オリゴマー化の必要性を示した（図１６Ｊ、ＥＣ５０値を比較）。ＦＡＰ標的化分子（黒四角、三角形、半黒丸）を用いた場合、ＦＡＰ発現腫瘍細胞は濃度依存的様式でＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた。構築物はＦＡＰ＋腫瘍細胞によって更に過架橋され得ないので、このような作用は、２＋１フォーマットではＦＡＰ結合部分が非結合ＤＰ４７ユニット（白丸）で置換されたときには見られなかった。ここでも、二価の分子は一価の分子よりも優れていた（ＥＣ５０値を比較）。一価ＦＡＰ標的化及び二価ＯＸ４０標的化構築物（２＋１）は、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の存在下で最高のプラトー活性を示した。一価ＯＸ４０結合１＋１構築物とは対照的に、２＋１フォーマットのＯＸ４０への二価結合は、ＯＸ４０のオリゴマー化によりアゴニスト能力を増加させた（ＥＣ５０値への影響）。しかし、ＦＡＰに対する２＋１構築物の一価結合のために、より高いプラトーＯＸ４０活性化を説明することができる二価ＦＡＰ結合２＋２フォーマットと比較して、２倍の分子が架橋され得るようである（図１６Ｋ、より高いプラトー）。
５．２ 最適以下にＴＣＲトリガーされた事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＯＸ４０媒介共刺激
ＦＡＰ標的化一価又は二価フォーマットの選択されたバインダー（クローン８Ｈ９及び１Ｇ４）もまた、それらが表面固定化されたときにＴ細胞を共活性化する能力について試験された。
実施例３．２に記載されているように、事前に活性化されたＣＦＳＥ標識ＯＸ４０陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を、プレート表面に固定化した滴定抗Ｏｘ４０抗体の存在下で、プレート固定化抗ＣＤ３抗体の最適以下の濃度で７２時間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化及び分化マーカー、例えばＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、Ｔｉｍ－３、ＣＤ６２Ｌ及びＯＸ４０それ自体に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
プレート固定化二重特異性抗ＯＸ４０抗原結合分子による共刺激は、プレート固定化抗ヒトＣＤ３による事前活性化ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の最適以下の刺激を用量依存的に強く亢進した（図１７Ａ及び１７Ｂ）。Ｔ細胞はより強く増殖し、より高い割合のＣＤ１２７低Ｔ細胞、Ｔｉｍ－３陽性及びＯＸ４０陽性活性化細胞を有するより成熟した表現型を示した（クローン８Ｈ９については粒状度（ＳＳＣ）の増加のみが示されている）。よって、ＯＸ４０への一価結合（三角記号）は、ＯＸ４０への二価結合（四角記号）よりも効率が低く、これはＯＸ４０シグナル伝達軸を完全に活性化するためにＯＸ４０受容体オリゴマー化の必要性を示した。Ｔ細胞活性化の全ての解析されたパラメーターにおける最大半量の変化は、３～２３００ｐＭの範囲の濃度で達成され、クローン１Ｇ４について図１８Ａ－１８Ｄ及び表３５にまとめられる。
Figure 0007034066000097
５．３ 最適以下にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯｘ４０媒介共刺激及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋
実施例５．１において、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の添加は、ＯＸ４０受容体の強力なオリゴマー化を提供することによって、ヒトＯＸ４０陽性レポーター細胞株におけるＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０構築物によって誘導されるＮＦκＢ活性を強く増加させることができると示された。同様に、発明者らは、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞の存在下において、ＦＡＰ標的化一価（１＋１）及び二価（２＋１、２＋２）抗ＯＸ４０構築物を、休止ヒトＰＢＭＣ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューする能力について試験した。
ヒトＰＢＭＣ調製物は、（１）休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、並びに（２）細胞表面上に種々のＦｃγ受容体分子を有する抗原提示細胞、例えばＢ細胞及び単球を含む。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分がこれらのＦｃγ受容体分子に結合し、休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上において遷延性ＴＣＲ活性化を媒介することができる。これらの細胞は、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナル伝達し、ＴＣＲ媒介刺激を支持し得る。
休止ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、照射ＦＡＰ＋ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞及び滴定した抗Ｏｘ４０構築物の存在下で、最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体で４～５日間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化及び成熟マーカー、ＣＤ２５、グランザイムＢ、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。第２の実験では、Ｔ細胞活性化及び成熟マーカー、ＣＤ２５、及びＴｉｍ－３に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（実施例４．３．２．２を参照）を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１－０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩、無菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）中のＴ細胞培地中で０．２×１０５細胞／ウェルの密度で培養した。翌日、それらは、腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの後の過剰増殖を防ぐために、４５００ｒａｄの線量を用いてｘＲａｙ照射器中で照射された。
ヒトＰＢＭＣを、実施例２．１．２に記載されるように、フィコール密度勾配遠心分離によって単離し、ＣＦＳＥで標識した。細胞を、ウェル当たり０．７５×１０５細胞（第１実験）又はウェル当たり０．５×１０５細胞（第２実験）の密度で各ウェルに添加した。［１０ｎＭ］の最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）及びＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０抗原結合分子を指示濃度で添加した。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で４～５日間活性化した。次いで、細胞を、蛍光色素結合抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、ＣＤ２５（クローンＭ－Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）、ＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１２３４）及びＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４８３４）又はＴｉｍ－３（クローンＦ３８－Ｅ２Ｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５０１２）で４℃で３０分間、表面染色した。細胞膜を透過性にするために、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５１２３及び００－５２２３）に暗所で室温で４５分間再懸濁した。Ｐｅｒｍ－Ｗａｓｈ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－８３３３－５６）で３回洗浄した後、細胞を、抗ヒトグランザイムＢ抗体（クローンＧＢ－１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６１１４２）を含有する２５μＬ／ウェルのＰｅｒｍ－Ｗａｓｈ緩衝液で暗所で室温で１時間細胞内染色した。細胞を８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
図２０Ａ－２０Ｈに示されるように、非標的化抗Ｏｘ４０（８Ｈ９）ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（白四角）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化一価（黒三角）及び二価（黒四角）抗ＯＸ４０構築物の過架橋は、増殖、生存を強く促進し、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞において亢進された活性化表現型を誘導した。高親和性クローン８Ｈ９（図２０Ａ－２０Ｈ）では、一価及び二価の二重特異性抗原結合分子は、最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューする同等の能力を有していた。どちらの構築物も、約０．１－１ｎＭでピーク活性を示し、高濃度で応答が減少した。ＮＦκＢレポーター細胞株（図１６Ａ－１６Ｍ）における知見と同様に、これは、ＦＡＰ又はＯＸ４０にのみ結合する構築物と、両方の標的に同時に結合し、従って必要な架橋を提供する構築物間との標的結合の競合の結果であり得る。この効果は、低親和性クローン１Ｇ４をＦＡＰ標的化一価抗体対二価抗ＯＸ４０構築物で試験した場合、あまり顕著ではなかった（図２１Ａ－２１Ｃ）。ここで、一価抗体は二価構築物より明らかに劣っていた。このことは、各構築物のアゴニスト能力を曲線下の面積として定量し、お互いに対してプロットした場合に最も良く理解できる（図２１Ａ－２１Ｃ）。
第２の実験で得られたデータを図２１Ｄ－２１Ｈ及び図２１Ｊ－２１Ｎにそれぞれ示す。図２１Ｄ－２１Ｈに示されるように、非標的化抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）２＋１ ＤＰ４７フォーマット（白丸）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化一価（黒三角、半黒丸）及び二価（黒四角）抗ＯＸ４０構築物の過架橋は生存を強く促進し、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞において亢進された活性化表現型を誘導した。一価抗ＯＸ４０構築物（１＋１；黒三角）は、二価抗ＯＸ４０標的構築物（半黒丸、黒四角）よりもＴＣＲ刺激をレスキューする能力が低かった。ＦＡＰに対して二価的な結合の２＋２構築物は、ＦＡＰに対して一価的な結合の２＋１構築物と比較して、既に低濃度で最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることが可能であった。２＋１フォーマットにおいて、高親和性ＦＡＰ結合クローン４Ｂ９は、低親和性クローン２８Ｈ１より明らかに優れていた（図２１Ｊ－２１Ｎ）。これは、観察された生物活性のＥＣ５０値がＦＡＰへの結合によって決定されることを示唆している（２＋２＞２＋１（４Ｂ９）＞２＋１（２８Ｈ１）。このことは、各構築物のアゴニスト能力を、分析されるマーカーについて曲線下の面積として定量し、お互いに対してプロットした場合に最も良く理解できる（図２１Ｐ）。
５．４ ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットによるＡＤＣＣの防止
ヒトＩｇＧ１クラスの抗体は、ＡＤＣＣコンピテント細胞、例えばＮＫ細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合することにより、抗原陽性標的細胞の抗体依存性細胞死（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。従って、ＡＤＣＣコンピテントＯｘ４０抗体は、直近に活性化されたＯｘ４０＋ Ｔ細胞の溶解を媒介し、腫瘍反応性Ｔ細胞のプールを減少させることができた。抗体のＦｃ部分へのＩｇＧ１Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ突然変異の導入は、ＦｃγＲ（国際特許出願公開番号ＷＯ２００１／１３０８３１Ａ１）への結合を妨げ、従ってＮＫ細胞の存在下でのＡＤＣＣを妨げる。しかしながら、ＦｃＮ受容体への結合は変化せず、抗体のＩｇＧ様の薬物動態を確実にする。
選択されたクローンを、従来のヒトＩｇＧ１フォーマットに変換して、ＡＤＣＣを誘導する能力を試験した。ＡＤＣＣ応答能を試験するために、ＰＫｈ２６標識ＯＸ４０陽性腫瘍細胞（ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞株）及び新たに単離されたＮＫ細胞を、Ｅ対Ｔ比３：１で、抗ＯＸ４０抗体（ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ１－Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の連続希釈系列の存在下で共培養した。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出及びＤＡＰＩ陽性腫瘍細胞の量を用いて、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを定量した。
簡潔には、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞（実施例３．１）を、実施例２．３．２に記載のように、ＰＫＨ－２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）を用いて標識した。ＰＫＨ－２６標識ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿ｌｕｃ１細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩、無菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）中のＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２０５５－０９）中に０．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、ヒトＰＢＭＣを実施例２．１．２に記載のフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＮＫ細胞単離は、ＭＡＣＳネガティブＮＫ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９２－６５７）を使用して、製造者の指示に従って行った。ＮＫ細胞をＡＩＭ Ｖ培地に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で添加し、３対１のＥ対Ｔ比を得た。示された濃度で抗ＯＸ４０抗体（ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）を添加し、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）中でプレートを一晩３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。４時間後、１００μｌの上清をＬＤＨ分析のために採取し、培地を新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地と交換した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートリーダー（フィルター４９０ｎｍ－６５０ｎＭ、１ｍｓ積分時間）で製造者の指示に従って、細胞毒性検出キット－ＬＨＨ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６４４７９３００１）を用いてＬＤＨ活性を定量した。
２４時間後、トリプシンを用いて細胞を分離した。細胞を蛍光標識抗ヒトＣＤ５６（クローンＮＣＡＭ１６．２、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５６２７５１）、抗ヒトＣＤ２５（クローンＭＡ２５１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１６）及び抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１６）で暗所で４℃で２０分間染色した。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
ＡＤＣＣコンピテントヒトＩｇＧ１フォーマット中の全てのＯｘ４０抗体は、Ｏｘ４０陽性細胞の溶解をＥＧＦＲに対するＡＤＣＣコンピテント参照抗体（ＧＡ２０１）と同程度に誘導することができた。ＩｇＧＰ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットのクローンはＡＤＣＣを媒介しなかった（図２２Ａ及び２２Ｂ参照）。
発明者らの標的化フォーマットのＦｃ部分へのＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ突然変異の導入は、ＦｃγＲ（国際特許出願公開番号ＷＯ２００１／１３０８３１（Ａ１）号）への結合を妨げ、従ってＮＫ細胞の存在下でのＡＤＣＣを妨げる。しかしながら、ＦｃＮ受容体への結合は変化せず、抗体のＩｇＧ様の薬物動態を確実にする。既存のＯＸ４０抗体とは対照的に、ＦＡＰ陽性腫瘍細胞又は線維芽細胞に結合することによって、本発明の二重特異性抗体において、最適なアゴニストＯＸ４０シグナル伝達に必要な過架橋が提供された。腫瘍関連線維芽細胞又は腫瘍細胞自体の何れかにおけるＦＡＰ陽性は、多くの腫瘍適応症について報告されている。従って、二重特異性フォーマットは、全身活性化の非存在下における腫瘍微小環境における強力なＯＸ４０媒介アゴニズムの可能性を有し、これは免疫関連毒性を防止し得る。従来の抗ＯＸ４０抗体とは対照的に、本発明の二重特異性抗原結合分子は、直近に活性化されたＯＸ４０陽性エフェクターＴ細胞のＡＤＣＣを誘導しない。従って、二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対する既存の、しかし抑制された適応免疫応答を再活性化する可能性を有し、がん患者の治療に効果的に使用することができる。
実施例６
４－１ＢＢ抗体及びツールのバインダーの生成
６．１ 抗原の調製、精製及び特徴づけ、並びにファージディスプレイによる新規４－１ＢＢバインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザル４－１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表３６）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原－ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原－Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、４－１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図１Ａ）。表３７は、抗原Ｆｃ融合構築物のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
Figure 0007034066000098
Figure 0007034066000099
Figure 0007034066000100
Figure 0007034066000101
４－１ＢＢ－Ｆｃ融合分子をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ－ＡｃＴＥＶ－Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置換した。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。生産培地に５μＭキフネンシンを補充した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０～５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
６．２ 一般的なＦ（ａｂ）ライブラリーからの４－１ＢＢ特異的１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び２０Ｇ２抗体の選択
ヒト及びカニクイザル４－１ＢＢに対して特異性を有する抗体１１Ｄ５、９Ｂ１１、及び１２Ｂ３は、Ｆａｂフォーマットの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８－４）から選択された。同じライブラリーから、マウス４－１ＢＢに対する反応性を有する付加的な抗体、クローン２０Ｇ２も同様に選択した。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８－４ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ８８－ｖ４－４又はＤＰ８８－ｖ４－６又はＤＰ８８－ｖ４－８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。これらのライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを得た。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
ヒト及びカニクイザル４－１ＢＢに対して特異性を有する抗体２５Ｇ７は、Ｆａｂフォーマットの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（λ－ＤＰ４７）から選択された。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｌ３＿１９（ラムダ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、λ－ＤＰ４７ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＭＳ６３と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ８０）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ４７－ｖ４－４又はＤＰ４７－ｖ４－６又はＤＰ４７－ｖ４－８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。９．５×１０９の最終ライブラリーサイズが得られた。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については８１．１％、重鎖については８３．２％であった。
表３８は、一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８－４）の配列を示し、表３９は、ライブラリーＤＰ８８－４生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表４０は、ＤＰ８８－４生殖細胞系列テンプレートの生成に使用されるプライマー配列を示す。
Figure 0007034066000102
Figure 0007034066000103
Figure 0007034066000104
Figure 0007034066000105
表４１は、ＰＣＲに使用される一般的なファージディスプレイラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表４２はラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表４３はラムダ－ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
Figure 0007034066000106
Figure 0007034066000107
Figure 0007034066000108
ファージディスプレイ選択並びにＥＬＩＳＡ及びＳＰＲに基づくスクリーニングのための抗原としてのヒト、マウス及びカニクイザル４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合体として一過性に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉ－タグ認識配列におけるＢｉｒＡビオチンリガーゼの同時発現を介してｉｎ ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化した。
選択ラウンド（バイオパニング）を以下の手順に従って溶液中で行った。第１工程、抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０ｕｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上において約１０１２個のファージミド粒子を事前清澄化する；第２工程、全容量１ｍｌ中のＦｃバインダーの更なる枯渇のために、非結合ファージミド粒子を、１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥー・ホール構築物の存在下で、１００ｎＭのビオチン化ヒト又はマウス４－１ＢＢと０．５時間インキュベートする；第３工程、ビオチン化ｈｕ ４－１ＢＢ及び付着した特異的に結合するファージをニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって捕捉する；第４工程、５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する；第５工程、１ウェルあたり１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０ｕｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｕｌを４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する；第６工程、Ｆｃバインダーを最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｃノブ・イントゥー・ホール構築物を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後清澄化する；第７工程、溶出されたファージ粒子の上清により対数期大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、振盪機で３０℃で一晩インキュベートし、続いて次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド又は４ラウンドにわたって行った。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対する結合体の濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的バインダーが同定された。１００ｕｌの２５ｎＭのビオチン化ヒト又はマウス４－１ＢＢ及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを、それぞれニュートラアビジンプレート及びｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒト又はマウス４－１ＢＢに対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、４－１ＢＢの残りの２種に対して同様に試験された。それらは、０．５リットルの培養体積で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析によって特徴づけられた。
クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、上記の手順によりヒト４－１ＢＢ特異的バインダーとして同定された。クローン２０Ｇ２は、上記の手順によりマウス４－１ＢＢ特異的バインダーとして同定された。それらの可変領域のｃＤＮＡ配列は以下の表４４に示され、対応するアミノ酸配列を表Ｃに見出すことができる。
Figure 0007034066000109
Figure 0007034066000110
６．３ 抗４－１ＢＢ ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴づけ
選択された抗４－１ＢＢバインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとフレーム内にサブクローニングした。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
抗４－１ＢＢクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表４５に示す。抗４－１ＢＢ－Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
Figure 0007034066000111
Figure 0007034066000112
Figure 0007034066000113
Figure 0007034066000114
Figure 0007034066000115
Figure 0007034066000116
抗４－ＢＢ抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表４６は、抗４－ＢＢ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１抗体の収率及び最終含有量をまとめたものである。
Figure 0007034066000117
実施例７
抗４－ＢＢ抗体の特徴づけ
７．１ ヒト４－１ＢＢへの結合
７．１．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４－１ＢＢ特異的抗体の組換え４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５°Ｃで行った。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来の抗４－ＢＢクローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び２０Ｇ２（全てヒトのＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換え４－ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）の間の種選択性並びに相互作用のアビディティーが決定された。ビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウス４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。ファージディスプレイ由来抗４－１ＢＢヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、３０μＬ／分の流速で４～４５０ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で１２０秒間にわたってフローセルを通過させた。複合体の解離を２２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表４７）。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換え４－１ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約７５００ＲＵであった。４－１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭからの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）を４．１～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
クローン２５Ｇ７及び９Ｂ１１は、クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５よりも低い親和性でヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。クローン２０Ｇ２はヒト４－１ＢＢに結合しない。抗４－１ＢＢ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧ１とヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性定数を、１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した。
Figure 0007034066000118
７．１．２ ヒト４－１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒト４－１ＢＢの発現は、休止及びナイーブヒトＴ細胞には存在しない（Kienzle G. and von Kempis J (2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82, Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906）。固定化抗ヒトＣＤ３アゴニスト抗体による活性化後、４－１ＢＢはＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上でアップレギュレートされる。４－１ＢＢの発現は、活性化ヒトＮＫ細胞（Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058-3069）、活性化ヒトＮＫＴ細胞（Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907）、活性化ヒトＢ細胞（Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795）、活性化ヒト好酸球（Heinisch et al. 2001）、恒常的にヒト好中球（Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28）、活性化ヒト単球（Langstein J.et al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494, Kwajah M. and Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949）、恒常的にヒト制御性Ｔ細胞（Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928）、ヒト濾胞性樹状細胞（Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42）、活性化ヒト樹状細胞（Zhang L. et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76）及び悪性ヒト腫瘍の血管（Broll K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549）についても報告されている。
本発明者らの抗４－１ＢＢクローンの自然に細胞発現したヒト４－１ＢＢへの結合を試験するために、新鮮な単離された休止末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＰＨＡ－Ｌ／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化ＰＢＭＣ及びＣＤ３／ＣＤ２８再活性化ＰＢＭＣを使用した。チューリッヒ献血センターから得られたバフィコートからのＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を用いたフィコール密度遠心分離によって単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１－０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止細胞）、又は６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ、ＣＨＣＬＢ－Ｐ－４７６－７００－１０３４０）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）を補充したＴ細胞培地中で３～５日間培養し、次いで２日間、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート中、３７℃、５％ＣＯ２でＴ細胞培地中において培養することによって、Ｔ細胞の細胞表面で４－１ＢＢ発現を誘導するように刺激された。
ヒトＰＢＭＣによって発現されるヒト４－１ＢＢへの結合を決定するために、０．１－０．２×１０６個の新たに単離又は活性化されたＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の丸底懸濁細胞の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６４－０８６３－１８）又はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６４－１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を、２００μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、滴定した抗ヒト４－１ＢＢバインダーを含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）又は３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）、抗ヒトＣＤ４５ ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０１９）、０．６７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ３ ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４２６）又は０．１２５μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＳＫ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４８０６）又は０．６７μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４３０）、０．１２５μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４ ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）又は０．２３μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ２ｂκ（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）又は０．０８μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１κ（クローンＳＫ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４６１２）、０．１７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８（マウスＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１６）又は０．１２５μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８ａ（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１２）又は０．３３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８ ＢＶ５１０（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７３２）及び０．２５μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ５６（マウスＩｇＧ１κ、クローンＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８３１０）又は１μＬのＡＦ４８８結合抗ヒトＣＤ５６（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＢ１５９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７６９９）及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ／Ｃｙ７（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＨＩＢ１９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２１６）を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液とともに更にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。
細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０－９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁することにより固定した。３レーザーＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、細胞を同日又は翌日に取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）又は蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏ ｍｅａｎ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
ヒトＴ細胞は休止状態では４－１ＢＢ発現を欠くが、活性化後は４－１ＢＢをアップレギュレートする。ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔよりも強力なアップレギュレーションを示す。生成された抗ヒト４－１ＢＢ特異的抗体は、図２３Ａ－２３Ｄに示すように、活性化ヒトＴ細胞によって発現されたヒト４－１ＢＢに結合することができる。示された抗ヒト４－１ＢＢクローンは、強い結合（クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５）及び弱い結合体（クローン２５Ｇ７及び９Ｂ１１）に分類することができる。ＥＣ５０値だけでなく、ＭＦＩでも差が見られる。活性化ＣＤ８ Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値を表４８に示す。抗マウス４－１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２はヒト４－１ＢＢに結合せず、従ってヒト交差反応性ではない。
Figure 0007034066000119
７．２ マウス４－１ＢＢへの結合
７．２．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４－１ＢＢ特異的抗体２０Ｇ２の組換えマウス４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴によって評価した（実施例７．１．１を参照）。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表４４）。
親和性決定のために、Ｆｃ融合タンパク質と基準フローセルとの非特異的相互作用のために、マウス４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をＡｃＴＥＶプロテアーゼで切断し、Ｆｃ部分をクロマトグラフィー法により除去した。抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約７５００ＲＵであった。４－１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭからの濃度で６０秒間捕捉した。組換えマウス４－１ＢＢ ＡｃＴＥＶを４．１～１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦｃ抗体を有するが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された表面上を流された。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。クローン２０Ｇ２がマウス４－１ＢＢに結合することが示された（表４９）。
抗４－１ＢＢ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１分子とマウス４－１ＢＢとの間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Figure 0007034066000120
７．２．２ マウス４－１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化マウス脾細胞（選択されたクローン）
ヒトと同様に、新たに単離された休止マウスＴ細胞は４－１ＢＢを発現しないが、ペプチドパルスＡＰＣ（Cannons J.et al. (2001) J. Immunol. 167(3): 1313-1324）又は固定化抗マウスＣＤ３又は抗マウスＣＤ３と抗マウスＣＤ２８抗体との組み合わせ（Pollok K. et al. (1995), European J. Immunol. 25(2), 488-494）を介したＴＣＲ活性化によって発現を誘導することができる。表面固定化抗ＣＤ３抗体による活性化の後、４－１ＢＢ発現はＣＤ８＋ Ｔ細胞上でより高いと報告されているが（Shuford W, et al. (1997) J. of Experimental Med. 186(1), 47-55）、これは活性化プロトコールに依存し得る。更なる４－１ＢＢ発現は、活性化マウスＮＫ細胞（Melero et al. (1998) Cell Immunol. 190(2), 167-172）、活性化マウスＮＫＴ細胞（Vinay D, et al. (2004) J Immunol. 173(6), 4218-4229）、活性化マウスＢ細胞（Vinay, Kwon (2011) Cell Mol Immunol. 8(4), 281-284）、恒常的にマウス好中球に（Lee S. et al. (2005) Infect Immun. 73(8), 5144-5151）、並びにマウス調節性Ｔ細胞（Gavin et al. (2002) Nat Immunol. 3(1), 33-41）、マウスＩｇＥ刺激肥満細胞（Nishimoto et al. (2005) Blood 106(13): 4241-4248）、マウス骨髄系統細胞（Lee et al. (2008) Nat Immunol. 9(8), 917-926）、マウス濾胞性樹状細胞（Middendorp et al. (2009) Blood 114(11), 2280-2289）及び活性化マウス樹状細胞（Wilcox, Chapoval et al. (2002) J Immunol. 168(9),4262-4267）についても報告されている。
抗４－１ＢＢ特異的抗体結合を、健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞の単離の後、並びに表面固定化アゴニスト抗マウスＣＤ３及び抗マウスＣＤ２８抗体での７２時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化の後に直接試験した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（７－９週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅで購入した。動物は到着後１週間、新しい環境に慣れるため及び観察のために維持された。マウスは、特定の病原体を含まない条件下で、関係したガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って随意的な餌と水の摂取及び１２時間明／１２時間暗の毎日のサイクルで維持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。マウスを頚椎脱臼により屠殺した。脾臓を解剖し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを補充したＲＰＭＩ １６４０中で氷上で保存した。単一細胞溶液を得るために、脾臓を７０μｍ細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ；Ｇｅｒｍａｎｙ）でホモジナイズし、ＡＣＫ溶解緩衝液（ｄｄＨ２Ｏ中で０．１５ＭのＮＨ４ＣＬ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中で３７℃で１０分間赤血球溶解させた。滅菌ＤＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ細胞培地で脾細胞を再構成した。細胞は新たに使用されたか（休止）、又は１０６細胞／ｍＬの脾細胞が、１μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３抗体（ラットＩｇＧ２ｂ、クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００２２３）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８抗体（シリアンハムスター、クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０２１１２）でコーティングした６ウェル細胞培養プレート上で、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭメルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地中で更に７２時間刺激された。
マウス４－１ＢＢへの結合を試験するために、新たに単離又は活性化されたマウス脾細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、０．１×１０６／ウェルの脾細胞を、丸底９６－懸濁細胞プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に移した。細胞を４℃、４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去した。１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６３－１８）又はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６４－１８）を含む１００μ／ウェルＤＰＢＳ中での再懸濁後、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液、及びｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ又はマウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１ ＤＡＰＧとして、抗ヒト４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体－クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び抗マウス４－１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２の滴定された濃度を含有する５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を４回洗浄して過剰な抗体を除去した。マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ１ ＤＡＰＧフォーマットとしての抗マウス２０Ｇ２の結合が試験される場合、細胞を、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギＦ（ａｂ’）γ断片を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェル中で４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｆｃ断片を含む抗４－１ＢＢバインダーの結合を試験した場合、この工程はスキップされた。その後、細胞を、０．６７μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗マウスＣＤ３（ラットＩｇＧ２ｂκ、クローン１７Ａ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５２７５）又はＡＰＣ－Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ３（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７０８）、０．６７μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ４（ラットＩｇＧ２ｂκ、クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２）、０．６７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ８（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４１）又はＰＥ結合抗マウスＣＤ８（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７０８）、２μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗マウスＮＫ１．１（マウスＩｇＧ２ａκ、クローンＰＫ１３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７１０）又はＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗マウスＮＫ１．１（マウスＩｇＧ２ａκ、クローンＰＫ１３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７２８）及び１０μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（マウスＦｃ－Ｂｌｏｃｋ、ラットＩｇＧ２ｂκ、クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３１４２）を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェル中でインキュベートした。ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｆｃ断片を含む抗４－１ＢＢバインダーの結合を試験した場合、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）も添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定するために再懸濁した。翌日、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、２－レーザーＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
図２４Ｂ及び２４Ｄに示すように、抗マウス４－１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２のみが活性化マウスＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合したが、抗ヒト４－１ＢＢ結合クローン９Ｂ１１、１１Ｄ５、１２Ｂ３及び２５Ｇ７はマウス４－１ＢＢに結合せず、従ってマウス交差反応性ではない。試験したクローンからはクローン２０Ｇ２のみがマウス代用物として使用することができる。予想通り、抗４－１ＢＢ結合クローンの何れも、新しく単離された休止マウスＴ細胞への結合を示さなかった（図２４Ａ及び２４Ｃ）。活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞と同様に、活性化マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞も、活性化マウスＣＤ８＋Ｔ細胞よりも少ない４－１ＢＢを発現する。しかしながら、違いはヒトＴ細胞ほど強くないが、これは異なる活性化プロトコルに関連している可能性もある。ＥＣ５０値を表５０に示す。
Figure 0007034066000121
図２５Ｂ及び２５Ｄに示すように、抗マウス４－１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２は、同様の方法で、活性化マウスＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にｍｏＩｇＧ１野生型（ｗｔ）又はｍｏＩｇＧ１ ＤＡＰＧフォーマットとして結合する。結合は、図２４Ｂ及び２４Ｄに示される結合と類似している。従ってフォーマットの変更は結合特性に影響しない。発明者らは、免疫コンピテントマウスにおける抗薬物抗体（ＡＤＡ）のトリガーを防ぐために、クローン２０Ｇ２をｍｏＩｇＧに移した。ＤＡＰＧ突然変異は、ヒトＩｇＧ１構築物中のＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ突然変異と同等であり、例えばそれはＦｃＲ＋免疫細胞による架橋を防止する。ＥＣ５０値を表５１に示す。
Figure 0007034066000122
７．３ カニクイザル４－１ＢＢへの結合
７．３．１ 表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４－１ＢＢ特異的抗体１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１の組換えカニクイザル４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した（実施例７．１．１を参照）。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表５２）。
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えカニクイザル４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。４－１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５～１００ｎＭの濃度を使用して捕捉した。実験は、ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ（実施例７．１．１））について記載したように行った。
クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、類似の親和性（表５２）でカニクイザル４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合したが、１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、カニクイザル４－１ＢＢを発現する細胞により高いアビディティーで結合した。抗４－１ＢＢ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１とカニクイザル４－１ＢＢとの間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Figure 0007034066000123
７．３．２ カニクイザル４－１ＢＢ発現細胞への結合：活性化されたカニクイザル末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
抗ヒト４－１ＢＢ結合クローンのカニクイザル細胞への交差反応性を試験するために、健常なカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＢＭＣをヒトＰＢＭＣ（７．１．２）について記載したような密度勾配遠心分離（軽微な違いを含む）を用いてヘパリン処置血液から単離した。単離したＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍＬの抗カニクイザル交差反応性ＣＤ３（抗ＩｇＧ３λ、抗ヒトＣＤ３、クローンＳＰ３４、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６６１０）及び２μｇ／ｍＬの抗カニクイザル交差反応性ＣＤ２８（ｍｏＩｇＧ１κ、抗ヒトＣＤ２８、クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１４０７８６）抗体をコーティングした６ウェル細胞培養プレート上で、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβメルカプトエタノール（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地中で、１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で７２時間培養した。７２時間の刺激の後、細胞を収集し、０．１×１０６細胞／ウェルの濃度で丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に播種した。細胞を、異なる濃度の一次抗ヒト４－１ＢＢ特異的ｈｕＩｇＧ Ｐ３２Ｇ ＬＡＬＡ抗体を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、２μＬのＰＥ結合抗カニクイザル交差反応性ＣＤ４（ｍｏＩｇＧ２ａκ、抗ヒトＣＤ４、クローンＭ－Ｔ４７７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６６１６）、１μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗カニクイザル反応性ＣＤ８（ｍｏＩｇＧ１κ、抗ヒトＣＤ８、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０３２）及び３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ ０９６ ０９８）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間更にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを供給した１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生存細胞から死滅したことを識別した。細胞は、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて直ちに取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
図２６Ａ及び２６Ｂに示されるように、少なくとも３つの抗ヒト４－１ＢＢクローン、すなわち１２Ｂ３、１１Ｄ５及び２５Ｇ７はまた、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上に発現されるカニクイザル４－１ＢＢに対して交差反応性である。興味深いことに、結合曲線はヒト４－１ＢＢと同様に見え、例えば１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、試験した全ての構築物の最高ＭＦＩ値及び最低ＥＣ５０値を示すが、２５Ｇ７は、より低いＭＦＩ値及びより高いＥＣ５０値を有するより弱いバインダーである（表５３）。クローン９Ｂ１１は、１００ｎＭの最高濃度でのみ結合する。これは、クローン９Ｂ１１がクローン２５Ｇ７と比較して優れているヒト４－１ＢＢへの結合に反している。活性化されたカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における４－１ＢＢ発現レベルの更なる差異は活性化ヒトＴ細胞に類似しており、例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもはるかに少ない４－１ＢＢを発現する。
Figure 0007034066000124
７．４ リガンドブロッキング特性
４－１ＢＢ／４－１ＢＢ－リガンド相互作用を妨げる４－１ＢＢ特異的ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体分子の能力を決定するために、ヒト４－１ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。同様に、マウス４－１ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、抗マウス４－１ＢＢ特異的ＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体２０Ｇ２のリガンドブロッキング特性を評価した。
ヒト又はマウス４－１ＢＢリガンドを、標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０で、ＣＭ５チップの２つのフローセルに約１５００ＲＵで直接連結させた。組換えヒト又はマウス４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）を、第２のフローセル上で５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を省略し、ファージ由来の抗４－１ＢＢヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを、両方のフローセル上で２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を６０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗体を固定化されたヒト又はマウス４－１ＢＢリガンドを有する表面上に流したが、その上には組換えヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）の代わりにＨＢＳ－ＥＰが注入された。
ファージ由来クローン２５Ｇ７は、ヒト４－１ＢＢとその４－１ＢＢリガンドとの複合体に結合した（表５４、図２７Ａ）。従って、この抗体は、ヒト４－１ＢＢへの結合についてリガンドと競合せず、従って、「非リガンドブロッキング」と呼ばれる。対照的に、クローン１２Ｂ３、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、リガンドと会合したヒト４－１ＢＢに結合せず、従って「リガンドブロッキング」と呼ばれる。マウス代用物２０Ｇ２は、そのリガンドと会合したマウス４－１ＢＢに結合せず、「リガンドブロッキング」とも呼ばれる。
Figure 0007034066000125
７．５ エピトープの特徴づけ
ファージ由来抗４－１ＢＢ抗体によって認識されるエピトープは、表面プラズモン共鳴によって特徴づけられた。最初に、ヒト４－１ＢＢへの結合を競合する抗体の能力を表面プラズモン共鳴によって評価した。第２に、抗４－１ＢＢ抗体のヒト４－１ＢＢとマウス４－１ＢＢの２つの異なるドメインへの結合を、以前に本明細書に記載したようにＳＰＲによって評価した。この目的のために、ハイブリッド４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）融合タンパク質が設計されている。それらは、ヒトドメイン又はマウスドメインの何れかの４－１ＢＢのエクトドメインを含む。ファージディスプレイ選択のために使用された、上記の抗原Ｆｃ融合体と同様に、ハイブリッド４－１ＢＢ変異体をＦｃ（ｋｉｈ）のノブ鎖に融合させた。これらの実験の目的は、「エピトープビン（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎ）」を定義することであった。類似又は重複エピトープについて競合する抗体は、４－１ＢＢに同時に結合することができず、「エピトープビン」に属する。４－１ＢＢに同時に結合することができる抗４－１ＢＢ抗体は、エピトープ又はその一部を共有しないので、異なるエピトープビンに分類される。
７．５．１ 競合結合（ＳＰＲ）
抗４－１ＢＢヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（図２８Ａ－２８Ｆ）のヒト又はマウス受容体に対する競合的結合を分析するために、標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ファージ由来抗４－１ＢＢクローン９Ｂ１１及び１１Ｄ５をそれぞれＣＭ５チップに１４００及び２２００ＲＵでｐＨ５．５で直接連結させた。組換えヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）を、２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で１８０秒間注入させた。解離を省略し、第２の抗４－１ＢＢヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を１００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。
ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。競合結合実験は、ファージ由来抗４－１ＢＢクローン１２Ｂ３、１１Ｄ５及び９Ｂ１１が、ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）に同時に結合することができるので、２５Ｇ７と異なる空間エピトープを共有することを示した（表５５）。
Figure 0007034066000126
７．５．２ 受容体変異体への結合（ＳＰＲ）
ファージ由来の抗４－１ＢＢクローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び２０Ｇ２によって認識されるエピトープは、ヒト及びマウスドメインの組み合わせ、又は単一ドメインを含む４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のハイブリッド変異体を用いて特徴づけられている（表５６）。ハイブリッド４－１ＢＢを４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）抗原について実施例６．１に記載のようにＦｃ（ｋｉｈ）に融合させた。表５２は、ハイブリッド４－１ＢＢ変異体の調製に使用される４－１ＢＢドメインの配列を含む。
構築物１は、ヒト４－１ＢＢのＣ末端部分（ドメイン２と称される）に融合されたマウス４－１ＢＢのＮ末端部分（ドメイン１と呼ばれる）によって構成される（表５６）。構築物２は、マウス４－１ＢＢのＣ末端部分（ドメイン２と称される）に融合されたヒト４－１ＢＢのＮ末端部分（ドメイン１と呼ばれる）によって構成される（表５７）。これらのハイブリッド分子は、ドメイン２の発現が機能的分子に至らなかったために調製された。ヒト４－１ＢＢのＮ末端部分（ドメイン１）もＦｃ（ｋｉｈ）融合分子（構築物３）として発現された。ハイブリッド４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）変異体の発現及び精製は、実施例６．１に記載のように行った。
Figure 0007034066000127

Figure 0007034066000128
Figure 0007034066000129
ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約８，０００ＲＵであった。ファージディスプレイ由来の抗４－１ＢＢ抗体を１００ｎＭで６０秒間捕捉した。組換えハイブリッドヒト／マウス４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）変異体を２００ｎＭで流速３０μＬ／分で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした（図２９Ａ－２９Ｄ）。
ヒト４－１ＢＢ－Ｄ１（構築物３）を約１０００ＲＵでＣＭ５チップに直接結合させた。２００ｎＭの抗４－１ＢＢ抗体を３０μＬ／分で１８０秒間通過させ、解離を６０秒間モニターした（図３０Ａ－３０Ｄ）。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ－ＥＰが注入された。
ファージ由来クローン１２Ｂ３、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、ヒトドメイン１－含有４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）分子の両方に結合する。ファージ由来クローン２５Ｇ７は、ヒトドメイン２含有ハイブリッド４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）分子に結合する。ファージ由来クローン２０Ｇ２は、マウスドメイン１－含有ハイブリッド４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）分子に結合する。概要は表５８に見出すことができる。
Figure 0007034066000130
実施例８
抗４－１ＢＢ結合クローンの機能特性
８．１ 抗ヒト４－１ＢＢ結合クローンの機能特性
４－１ＢＢは共刺激受容体として働き、ＴＣＲ依存的にＴ細胞の増殖、サイトカイン産生及び機能的特性を改善する。表面固定化抗ＣＤ３抗体又はペプチドパルス化抗原提示細胞によるＴＣＲ活性化は、Ｔ細胞上の４－１ＢＢのアップレギュレーションを誘導し（Pollok et al. (1993) J. Immunol. 150(3): 771-781）、結合後に増殖及びサイトカイン放出を促進することにより免疫応答を支持する（Hurtado et al. (1995) J Immunology 155(7), 3360-3367）。生成した抗ヒト４－１ＢＢ抗体のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）能力を試験するために、丸底懸濁９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）を、２μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００６－００８）及び２μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－００５－００８）を含むＤＰＢＳで一晩にわたってコーティングした。プレートをＤＰＢＳで洗浄して余分な分子を除去し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３０５９－１００Ｇ）で３７℃で９０分間ブロックした。上清を除去し、プレートを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含み、１０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５、クローンＯＫＴ３）を含むか又は含まないＤＰＢＳと共に３７℃で９０分間インキュベートした。プレートをＤＰＢＳで洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び異なる濃度の滴定抗ヒト４－１ＢＢ ＩｇＧ１ Ｐ３２９ Ｇ ＬＡＬＡ抗体を供給したＤＰＢＳと共にインキュベートした。プレートをＤＰＢＳで洗浄し、上清を吸引した。
前に記載されているように（７．１．２）、ヒトＰＢＭＣを単離し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌ及び２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０中で５日間活性化した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１及び２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０中で更に２１日間、１－２×１０６細胞／ｍＬの密度で更に培養した。長時間培養したＰＢＭＣを収集し、洗浄し、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－４９５）を用いて製造者のプロトコルに従って単離した。事前活性化されて選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβメルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地２００μＬ／ウェルに、７×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を７２時間、最後の４時間はＧｏｌｇｉ－Ｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４７２４）の存在下でインキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：５０００希釈 ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－２３１０１）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、０．５μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ８（マウスＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０３２）、０．５μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ２５（マウスＩｇＧ１κ、クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１２）及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＰＤ－１（マウスＩｇＧ１κ、クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９２２）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、新たに調製した固定／透過化溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）中に５０μＬ／ウェルで再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を新たに調製した透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）で洗浄し、２μｇ／ｍＬのＡＰＣ標識抗ヒトＩＦＮγ（ｍｏ ＩｇＧ１κ、クローンＢ２７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４７０２）及び２μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗ヒトＴＮＦα（ｍｏ ＩｇＧ１κ、クローンＭＡｂ１１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４５１３）を含む５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ緩衝液と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含むＤＰＢＳで固定した。翌日、２レーザーＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ、ＤＩＶＡソフトウェア）を用いて細胞を取得した。ゲートをＣＤ８＋Ｔ細胞にセットし、ＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を決定した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用してデータをブロットし、曲線を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
前に記述したように、ＴＣＲ又はＣＤ３刺激の非存在下では、４－１ＢＢの関与はＣＤ８＋ Ｔ細胞機能に影響を及ぼさないが（Ｐｏｌｌｏｋ １９９５）一方で、４－１ＢＢの最適以下のＣＤ３活性化共刺激の存在下ではサイトカイン分泌を増加させる（図３１Ａ又は３１Ｃ）。ＣＤ３抗体を介した最適以下の活性化は、全ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団のうちの３０％のＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＩＦＮγ分泌を誘導する。４－１ＢＢ共刺激の添加は、濃度依存的に最大５５％までＩＦＮγ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞集団を増加させる（図３１Ｂ）。表５９は、対応するＥＣ５０値を示す。ＴＮＦα分泌は、全ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の２３％から３９％へと増加させることができた（図３１Ｄ）。それらの結合特性と同様に、クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、頻度及びＥＣ５０において２５Ｇ７及び９Ｂ１１よりも優れたＩＮＦγ発現を増加させる。従って、我々の生成クローンは機能的であり、ＴＣＲ媒介性Ｔ細胞活性化及び機能を改善することができる。抗４－１ＢＢ特異的抗体が表面固定化されていない場合、それらはＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を改善しなかった（示さず）。
Figure 0007034066000131
８．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗マウス４－１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２の機能特性
Ｆｃ受容体によるアゴニスト抗４－１ＢＢ抗体の架橋を防止するために、抗体のＦｃ部分に変異を導入した．ヒトＩｇＧ１抗体のＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ突然変異と同様に、ＤＡＰＧ突然変異をマウスＩｇＧ１分子のＦｃ部分に導入した。これがＦｃＲ架橋及びそれによる活性化能力を妨げるかどうかを試験するために、マウス脾細胞を、最適以下の濃度の抗マウスＣＤ３抗体と、マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ１ ＤＡＰＧとしての異なる濃度のクローン２０Ｇ２とで活性化した。
健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７～９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）から脾臓を得て、Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－３３４）及びｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－９３７）を用いて３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液中でホモジナイズした。遠心分離（４００×ｇ、８分、ＲＴ）後、細胞ペレットを７ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁し、赤血球分離を３７℃で１０分間行った。１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβメルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地を添加することにより赤血球溶解を停止させた。脾細胞をＤＰＢＳで洗浄し、７０μｍ細胞ストレーナ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１７５１）で濾過した。脾細胞を３７℃のＤＰＢＳ中で２×１０７細胞／ｍＬに再懸濁し、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８４０－９０）を２．５ｍＭの最終濃度まで添加した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、標識工程をＦＢＳを添加することによって停止させ、細胞を洗浄した。０．５μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３特異的ハムスターＩｇＧ（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３０５７）、０．０１－５０ｎＭの滴定抗マウス４－１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１ＤＡＰＧ又はアイソタイプコントロールＭＯＰＣ－２１マウスＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４１２１）又はアイソタイプコントロールＤＰ４７ ｍｏＩｇＧ１ ＤＡＰＧ及び１×１０５個の脾細胞を含む２００μＬ／ウェルのＴ細胞培地を、９６ウェル丸底組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）のウェルに移した。プレートを４８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１μｇ／ｍＬのＢＶ７１１結合抗マウス－ＣＤ８ラットＩｇＧ２ａ（クローン５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７４８）及び２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ａ（クローンＲＭ４－５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００５４４）を含む２５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、新たに調製した固定／透過化溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）１００μＬ／ウェルに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗マウスＥｏｍｅｓラットＩｇＧ２ａ（クローンＤＡＮ１１ＭＡＧ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５３－４８７５－８２）及び２μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗マウスグランザイムＢラットＩｇＧ２ａ（クローンＮＧＺＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２－８８９８－８２）を含む１００μＬ／ウェルの新たに調製した透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）中に再懸濁した。細胞を暗所で室温で１時間インキュベートし、透過化緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を用いて取得した。ゲートをＣＤ８＋Ｔ細胞にセットし、Ｅｏｍｅｓ及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を決定した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用してデータをブロットし、曲線を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の最適な活性化は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞溶解性エフェクター機構を調節するＴボックス転写因子であるＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）の発現（Glimcher et al. 2004）、及びグランザイムＢのような細胞溶解酵素を誘導する。図３２Ａ及び３２Ｂに示すように、使用した０．５μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３抗体濃度は最適以下であり、グランザイムＢを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度は３０％を超えず、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ｅｏｍｅｓ）を発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度は１８％を超えなかった。十分な量の抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１を添加した場合にのみ、より多くのＣＤ８＋ Ｔ細胞がグランザイムＢ（図３２Ａ）及びｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（図３２Ｂ）を発現し始めた。このことは、クローン２０Ｇ２がアゴニストバインダーであり、マウス４－１ＢＢを結合させることによってＴ細胞を活性化することができるという証拠である。ＤＡＰＧ突然変異のためにクローン２０Ｇ２の架橋が損なわれた場合、４－１ＢＢの下流シグナル伝達を誘導するために抗４－１ＢＢ抗体の架橋がマウス細胞でも必要であることが示された。従って、ＤＡＰＧ突然変異は、Ｆｃ結合受容体を介した抗体の十分な架橋及び提示を妨げる。非マウス４－１ＢＢ特異的アイソタイプコントロールは、Ｔ細胞活性化に影響を及ぼさなかった。
８．３ ｉｎ ｖｉｖｏでの抗マウス４－１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２の機能特性
アゴニスト抗マウス４－１ＢＢラットＩｇＧ２ａでマウスを処理すると、無腫瘍マウス（Dubrot et al. (2010) Cancer Immunol Immunother. 59(8), 1223-33; Niu et al. (2007) J Immunol. 178(7):4194-213）及び担がんマウス（Wang et al. (2010) J Immunol. 185(12):7654-62; Kocak et al. (2006) Cancer Res. 66(14):7276-84）において肝臓に活性化Ｔ細胞が蓄積し、肝臓の炎症を誘発する。ステージＩＶのメラノーマ患者における抗４－１ＢＢ抗体ウレルマブ（ｈｕＩｇＧ４）を用いた同様の臨床第ＩＩ相試験は、異常に高いグレード４の肝炎の発生率のために終了しなければならなかった（Ascierto P.et al. (2010) Semin Oncol. 37(5), 508-16）。試験するために、抗マウス４－１ＢＢマウスＩｇＧ１が、報告されたアゴニスト抗マウス４－１ＢＢラットＩｇＧ２ａ抗体と同様のＴ細胞蓄積を肝臓に誘導することができ、更にＤＡＰＧ突然変異がこれを防ぐことができれば、ナイーブな健常メスＣ５７ＢＬ／６マウス（７－９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を、抗マウス４－１ＢＢ ＩｇＧ１及びＩｇＧ ＤＡＰＧクローン２０Ｇ２で処置した。マウスは、以前に本明細書に記載されているように室内に保管された。１５０μｇの抗体を３週間週１回尾静脈に静脈注射した。２回目の注射の１日後及び３回目の注射の１日後及び８日後に、マウスを頸部脱臼によって屠殺した。脾臓と肝臓を解剖し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを添加したＲＰＭＩ １６４０中で氷上で保存した。脾細胞は、以前に記載されたように（８．２）単離された。肝臓からの白血球を以下のように単離した：各肝臓を、０．３ｍｇ／ｍＬのＤｉｓｐａｓｅ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号０４９４２０７８００１）、１μｇ／ｍＬのＤｎａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１１２８４９３２００１）及び２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１１０８８８８２００１）を供給した５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を含むＣチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－３３４）に移し、プログラム「ｍ＿ｌｉｖｅｒ＿０１」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９５－９３７）を用いてｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて組織を破壊し、肝臓を３７℃で３０分間インキュベートした。消化された肝臓は、プログラム「ｍ＿ｌｉｖｅｒ＿０２」を用いてＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて２回目に破壊された。遠心分離（４００×ｇ、８分、ＲＴ）後、細胞ペレットを７ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁し、赤血球溶解を３７℃で１０分間行った。１０％ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを供給したＲＰＭＩ １６４０培地を添加することにより、赤血球溶解を停止させた。肝臓からの１０６細胞／ウェルの脾細胞又は白血球を、丸底９６ウェル懸濁細胞プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に移し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、１：５０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＦｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－２３１０１）を含む１００μＬ／ウェルに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、６μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗マウスＣＤ１３７シリアンハムスターＩｇＧ（クローン１７Ｂ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０６１０６）又はシリアンハムスターアイソタイプコントロール（クローンＳＨＧ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０２００８）、２μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗マウスＴＣＲ－βアルメニアハムスターＩｇＧ（クローンＨ５７－５９７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０９２２８）、５μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ２５ラットＩｇＧ１（クローンＰＣ６１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５２８８０）又はラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール（クローンＡ１１０－１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５２８６９）、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００標識抗マウスＣＤ８ａラットＩｇＧ２ａ（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５７９５９）、０．２５μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗マウスＣＤ４ラットｉｇＧ２ｂ（クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４３８）、４μｇ／ｍＬのＢＶ６０５結合抗マウスＣＤ１１ｃアルメニアハムスターＩｇＧ（クローンＮ４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１７３３３）又はアルメニアハムスターアイソタイプコントロール（クローンＨＴＫ８８８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００９４３）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、新たに調製した固定／透過化溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）１００μＬ／ウェルに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を新たに調製した透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）で洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのｅＦ６６０結合抗マウスＫｉ６７ラットＩｇＧ２ａκ（クローンＳｏｌＡ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０－５６９８－８２）を含む５０μＬ／ウェルの透過性緩衝液に再懸濁した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、透過性緩衝液で２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定した。翌日、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を用いて細胞を取得した。ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いてデータを分析し、ゲートをＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞にセットし、ＣＤ１３７＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１１ｃ＋及びＫｉ６７＋ Ｔ細胞の頻度を決定した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用してデータをブロットした。
図３３に示すように、抗マウス４－１ＢＢクローン２０Ｇ２マウスＩｇＧ１を用いたマウスの処置のみが、肝臓における蓄積、増殖、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現の増加を誘導し、一方、ＤＡＰＧ突然変異によるＦｃＲ結合による架橋の防止は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化をバイパスする。両方の分子が、Ｔ細胞上に発現されたマウスＣＤ１３７と類似の結合特性を示し（図２５Ｂ及び２５Ｄ）、従って同じ潜在的な活性化特性を特徴とするものの、ＤＡＰＧ突然変異によるＦｃＲ架橋の防止は、肝臓におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を妨げる（図３３）。
実施例９
４－１ＢＢ及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする二重特異性二価抗体の調製、精製及び特徴づけ
９．１ ４－１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性二価抗体の生成（２＋２フォーマット）
４－１ＢＢ及びＦＡＰに対する二価結合を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢ抗体を調製した。クロスマブ技術は、国際特許出願番号ＷＯ２００／１４５７９２Ａ１に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を（Ｇ４Ｓ）４コネクタ配列を用いて抗４－１ＢＢ ｈｕ ＩｇＧ１の重鎖にＣ末端融合させた。この重鎖融合体を、抗４－１ＢＢの軽鎖及び対応するＦＡＰ交差軽鎖（ＶＬＣＨ１）と同時発現させた。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。得られた二重特異性二価構築物は、図３４Ａに示されるものと類似している。
表６０は、成熟二重特異性二価抗４－１ＢＢ／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ 抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007034066000132
Figure 0007034066000133
Figure 0007034066000134
Figure 0007034066000135
Figure 0007034066000136
Figure 0007034066000137
Figure 0007034066000138
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
二重特異性抗４－１ＢＢ／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表６１）。
Figure 0007034066000139
９．２ ４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性二価抗体の結合
９．２．１ 表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
ビオチン化ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２５０ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した（図３４Ｂ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。全ての二重特異性構築物は、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図３５Ａ－３５Ｄ）。
９．２．２ 細胞への結合
９．２．２．１ ヒト４－１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒトＰＢＭＣを単離し、活性化して４－１ＢＢを誘導し、実施例７．１．２で既に記載したように、ヒト４－１ＢＢに対する抗体の結合特性を試験するために使用した。
Ｆｃ融合ＦＡＰ標的化が抗４－１ＢＢ特異的クローンの結合又はＰＥ結合ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）を介する検出に影響しないことを示すために、我々は、親ｈｕＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡフォーマットと比較して、休止ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（図３８Ａ－３８Ｆ）並びに活性化ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（図３９Ａ－３９Ｆ）へのＦＡＰ標的化又はＤＰ４７非標的化２＋２構築物の結合能力を試験した。また図２３と同様に、ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７標的化２＋２ヒト４－１ＢＢ特異的分子は、休止Ｔ細胞には結合しなかったが（図３８Ａ－３８Ｆ）、大部分が活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合した（図３９Ｄ、Ｅ及びＦ）。ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７非標的化２＋２フォーマットへの変換は、４－１ＢＢ発現Ｔ細胞への結合挙動を劇的には変化させなかった。相違は、Ｆｃ特異的ポリクローナル二次抗体による検出によって説明することができる（例えば、Ｆｃ融合体は、エピトープをマスクし、検出を減少させ得る）。ＥＣ５０値は、活性化後に発現された４－１ＢＢの量に依存して、ドナーによって異なっていた。これは、表４８に示される親抗体のものと比較して、表６２に列挙されるＥＣ５０値の差異を説明する。活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合の曲線下面積が図４０に示される。
Figure 0007034066000140
９．２．２．２ ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面発現線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合アッセイのために、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞株又はヒトメラノーマ細胞株ＷＭ－２６６－４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６７６）を使用した。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９は、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）を、ＣＭＶプロモーター下でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドでトランスフェクションすることによって生成した。１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ－ｐｒ－５）の存在下で細胞を維持した。丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに２×１０５個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５ ０８６３ １８）又はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６４－１８）を含む１００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、４－１ＢＢ特異的ＦＡＰ標的化抗体及び非標的化抗体の異なる滴定濃度を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて４℃で１時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）又は３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ ０９６ ０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を固定のために１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日又は翌日、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて取得した。
図４１Ａ－４１Ｆに示すように、４－１ＢＢ結合クローン２５Ｇ７、１１Ｄ５及び１２Ｂ３クローンを含むＤＰ４７標的化フォーマット又は親ｈｕＩｇＧ１ Ｐ２９３Ｇ ＬＡＬＡフォーマットではなく、試験した全ての２＋２ＦＡＰ標的分子は、効率的にヒトＦＡＰ発現細胞に結合する。従って、試験したＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化２＋２構築物は、ＦＡＰ発現細胞に特異的に結合することができる。図４２に、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ結合曲線の曲線下（ＡＵＣ）の面積の要約を示す。試験されたフォーマット及びＦＡＰ結合クローンは、グラフの下にピクトグラムとして示される。これは、試験した全てのＦＡＰ標的化２＋２フォーマットが同様のＡＵＣを示すことを示している。
Figure 0007034066000141
９．２．３ ＮＦκＢの活性化
９．２．３．１ ヒト４－１ＢＢ及びＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）に、ＣＭＶ－プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４－１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
４－１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーによる４－１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４－１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩを含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。限界希釈を行って、記載される単一のクローンを生成した：ヒト４－１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一のクローンを収集し、増やし、上記のように４－１ＢＢ発現について試験した。ＮＦκＢ－ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢでのその後のトランスフェクションのために、４－１ＢＢ（クローン５）の最高発現を有するクローンを選択した。このベクターは、ＮＦ－ｋＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を有するトランスフェクトされた細胞を与える。トランスフェクションのために、ヒト４－１ＢＢ ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化した（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ｃｍ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５－２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４－１ＢＢ ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に加え、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５ ２６６０）を用いて以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一のクローンを生成した。
クローンを上記のように４－１ＢＢ発現及び以下のようにＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地で収集し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉ－ｃｅｌｌ ｘｒ ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を用いて計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋の付いた滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。細胞を細胞培養器（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを－２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、プレートを可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦαを添加していない）より上の５００ｍｓ／ウェルの放出光の測定単位（ＵＲＬ）をルシフェラーゼ活性とした。ＨｅＬａ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦ－κＢ－ｌｕｃクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４－１ＢＢ発現を示し、更なる使用のために選択された。
９．２．３．２ ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したヒト４－１ＢＢレポーター細胞を発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦ－κＢ－ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定したＦＡＰ標的化抗ヒト４－１ＢＢ構築物又はそれらの親ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体を含む培地５０μＬを添加した。ＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９又はＷＭ－２６６－４を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。
ＦＡＰ発現腫瘍細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロール（ＦＡＰ＋腫瘍細胞なし）としての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを－２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化クローン２５Ｇ７、１１Ｄ５又は１２Ｂ３ ２＋２構築物は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞の存在下でレポーター細胞株中のＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を濃度依存的な様式でトリガーした（図４３Ｃ、Ｆ及びＩ）。対照的に、非標的化コントロール分子（４－１ＢＢ（２５Ｇ７）×ＤＰ４７ ２＋２）又は親ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体は、試験した何れの濃度においてもそのような効果を引き起こさなかった。ＦＡＰ発現腫瘍細胞の非存在下で（図４３Ａ、Ｄ及びＧ）、又はより少ないＦＡＰを発現する腫瘍細胞株（ＷＭ－２６６－４）の存在下で（図４３Ｂ、Ｅ及びＨ）、ＮＦ－κＢ活性化が検出できなかったので、試験したＦＡＰ標的化抗ヒト４－１ＢＢ ２＋２抗体のこの活性は、添加した架橋細胞の細胞表面でのＦＡＰの高発現に厳密に依存していた。従って、２５Ｇ７×ＦＡＰ ２＋２、１１Ｄ５×ＦＡＰ ２＋２、及び１２Ｂ３×ＦＡＰ ２＋２の間の活性化効力はそれらの４－１ＢＢ結合親和性とは相関しないので、活性化はＦＡＰ発現強度に依存し、抗４－１ＢＢバインダーの親和性強度には依存しない（図４４Ａ及び４４Ｂ及び表６４）（図４２）。
Figure 0007034066000142
実施例１０
４－１ＢＢ及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする二重特異性一価抗体の調製、精製及び特徴づけ
１０．１ 一価フォーマットの４－１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗体の生成（１＋１フォーマット）
４－１ＢＢ及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢ抗体を調製した。クロスマブ技術は、国際特許出願番号ＷＯ２００／１４５７９２（Ａ１）号に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
二重特異性構築物は、４－１ＢＢ及びＦＡＰに一価的に結合する（図３４Ｃ）。これは、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む）のノブ重鎖に融合したＦＡＰバインダーの交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を含む。Ｆｃホール重鎖（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む）は抗４－１ＢＢに対するＦａｂに融合される。標的化抗ＦＡＰ－Ｆｃノブと抗４－１ＢＢ－Ｆｃホール鎖との組み合わせは、ＦＡＰに特異的に結合するＦａｂと４－１ＢＢに特異的に結合するＦａｂとを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
二重特異性一価抗４－１ＢＢ及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡは、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
得られた二重特異性一価構築物は、二重特異性の二価抗４－１ＢＢ及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例９．１を参照のこと）。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表６５に見出すことができる。
Figure 0007034066000143
Figure 0007034066000144
Figure 0007034066000145
Figure 0007034066000146
Figure 0007034066000147
Figure 0007034066000148
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
二重特異性抗４－１ＢＢ／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクター重ノブ鎖」：「ベクター重ホール鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原／Ｆｃ融合分子又は抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
Figure 0007034066000149
１０．２ スクリーニングツールとしてのＦＡＰ抗原の調製、精製及び特徴づけ
ＦＡＰへの結合を試験するために、Ｃ末端Ｈｉｓタグに融合したヒト、マウス又はカニクイザルＦＡＰのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８５及び８６に示す。配列番号８８及び８９は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号９０及び９１は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
ＦＡＰ抗原は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。
５００ｍＬの振盪フラスコ中での２００ｍＬの産生のために、１００％のＦ１７＋６ｍＭグルタミン中でトランスフェクションの２４時間前に３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、４億個の細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）２０ｍＬと交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後、再懸濁した細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間、１６５ｒｐｍで振盪させてインキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地及びサプリメント（１ｍＭバルプロ酸、５ｇ／ｌのＰｅｐｓｏｙ及び６ｍＭのＬ－グルタミン）を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞に最終量１２％（２４ｍＬ）のアミノ酸及びグルコース飼料を補充した。７日間培養した後、２０００－３０００×ｇで４５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
細胞培養上清からの抗原の精製を、最初に５ｍｌのＩＭＡＣカラム（Ｒｏｃｈｅ）又は５ｍｌのＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）の何れかを使用するアフィニティークロマトグラフィー工程、続いて２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０又は２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３のそれぞれで平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いた２工程の精製で行った。
ＩＭＡＣカラム（Ｒｏｃｈｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を用いて８ＣＶで平衡化を行った。上清をロードし、１０ＣＶの２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄することにより未結合タンパク質を洗い流した。結合したタンパク質を２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０の２０ＣＶの線形勾配（０～１００％）を用いて溶出し、続いて８ＣＶで１００％の工程を行った。
ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０を用いて８ＣＶで平衡化を行った。上清をロードし、１０カラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で洗浄することにより未結合タンパク質を除去した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の２０ＣＶの直線勾配（０～１００％）を用いて結合したタンパク質を溶出し、続いて５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の５ＣＶの工程を行った。次いで、カラムを８ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で再平衡化した。
次に、収集した画分に１／１０（ｖ／ｖ）の０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を補充した。タンパク質をＶｉｖａｓｐｉｎカラム（３０ｋＤカットオフ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３、又は２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製された抗原のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗原の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。抗原の凝集物含有量を、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
１０．３ ４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性一価抗体の結合
１０．３．１ 表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
ビオチン化ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２５０ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。全ての二重特異性構築物は、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた。
１０．３．２ 細胞への結合
１０．３．２．１ ヒト４－１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒトＰＢＭＣを単離し、新たに使用し（例えば休止Ｔ細胞）、又は活性化して４－１ＢＢを誘導し、実施例７．１．２で既に記載したように、ヒト４－１ＢＢに対する抗体の結合特性を試験するために使用した。
４－１ＢＢ ＦＡＰ標的化１＋１構築物の一価４－１ＢＢ結合を、親抗４－１ＢＢ特異的ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡクローンの二価４－１ＢＢ結合と比較するために、構築物を休止又は活性化ヒト４－１ＢＢ発現ＰＢＭＣとインキュベートし、前に記載したように、ＰＥ結合ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）で検出した。図３９Ｄ及び３９Ｆに示すように、一価４－１ＢＢ ＦＡＰ標的化１＋１フォーマットへの変換は、親のｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ構築物と比較して、４－１ＢＢ結合のＥＣ５０値を増加させ（表６７）、ＭＦＩ値を減少させた（図３９Ｂ／Ｅ及び３９Ｃ／Ｆ）。このＥＣ５０の増加及びＭＦＩの減少は、図４０に示す結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）のほぼ二等分をもたらす。
Figure 0007034066000150
１０．３．２．２ ヒトＦＡＰ発現細胞への結合
ＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合は、既に９．２．２．２に記載されている。
図４１に示すように、クローン２５Ｇ７及び１２Ｂ３のＤＰ４７標的化１＋１抗体又は親ｈｕＩｇＧ１ Ｐ２９３Ｇ ＬＡＬＡ抗体ではなく、ＦＡＰ標的化１＋１分子は、ヒトＦＡＰ発現細胞に効率的に結合する（図４１Ｂ／Ｄ ４１Ｅ／Ｆ）。従って、１＋１構築物もＦＡＰ発現細胞に特異的に結合することができるが、一価ＦＡＰ標的化に起因して、ＦＡＰ標的化２＋２フォーマットよりもわずかに高いＥＣ５０を有する（表６８及び図４１Ｂ／Ｄ及び４１Ｅ／Ｆ）。しかしながら、これは、結合曲線のＡＵＣにごく僅かな影響しか与えない（図４２）。
Figure 0007034066000151
１０．３．３．ＮＦκＢの活性化
ヒト４－１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃを用いた機能的能力を分析するためのプロトコルは、実施例９．２．３．２に既に記載されている。
ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化クローン２５Ｇ７又は１２Ｂ３ １＋１構築物は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞の存在下でレポーター細胞株中のＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化をトリガーした（図４３Ｆ及びＩ）。対照的に、非標的化コントロール分子（４－１ＢＢ（２５Ｇ７）×ＤＰ４７ １＋１）又は親ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体は、試験した何れの濃度においてもそのような効果を引き起こさなかった。ＦＡＰ発現腫瘍細胞の非存在下で（図４３Ｄ及びＧ）、又はより少ないＦＡＰを発現する腫瘍細胞株（ＷＭ－２６６－４）の存在下で（図４３Ｅ及びＨ）、ＮＦ－κＢ活性化が検出できなかったので、ＦＡＰ標的化抗ヒト１ＢＢ １＋１抗体のこの活性は、添加したＦＡＰ＋細胞の細胞表面でのＦＡＰの高発現に厳密に依存していた。ＦＡＰ標的化１＋１をＦＡＰ標的化２＋２分子と比較すると、クローン１２Ｂ３及び２５Ｇ７は異なる挙動を示す。１２Ｂ３ ＦＡＰ標的化１＋１構築物は、１２Ｂ３ ＦＡＰ標的化２＋２構築物より高いＥＣ５０を有するが、より高い活性化プラトーも有し（図４３Ｆ）、従って両方の構築物は同様のＡＵＣを有し（図４４Ａ）、一方、２５Ｇ７ ＦＡＰ標的化１＋１構築物は、２５Ｇ７ ＦＡＰ標的化２＋２構築物と同じ高い活性化プラトー及びより高いＥＣ５０値を有し（図４４Ｉ）、従ってより小さいＡＵＣを有し（図４４Ａ）、例えば２５Ｇ７ ＦＡＰ標的化１＋１は、２５Ｇ７ ＦＡＰ標的化２＋２よりも明らかに悪く機能する。理由は、一価の４－１ＢＢ結合でより顕著になり得る強い（例えば１２Ｂ３）及び弱い（例えば２５Ｇ７）４－１ＢＢバインダー間の違いとすることができる。
Figure 0007034066000152
実施例１１
４－１ＢＢへの二価結合及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への一価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特徴づけ
１１．１．４－１ＢＢへの二価結合及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への一価結合を有する二重特異性抗体の生成（２＋１フォーマット）
４－１ＢＢに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢ抗体は、図３６に示すように調製されている。
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分：抗４－１ＢＢバインダーのＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダーのＣ末端ＶＬ又はＶＨが融合されたＦｃノブで構成された。第２の重鎖ＨＣ２は、抗４－１ＢＢのＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＣ末端のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合したＦｃホールで構成された。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。４－１ＢＢ（１２Ｂ３、９Ｂ１１、１１Ｄ５及び２５Ｇ７）に対するバインダーを実施例６に記載のように生成した。標的化抗ＦＡＰ－Ｆｃノブと抗４－１ＢＢ－Ｆｃホール鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び２つの４－１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３６Ａ及び３６Ｂ）。
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
二重特異性２＋１抗４－１ＢＢ 抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）でトランスフェクトした。構築物は、二重特異性の二価抗４－１ＢＢ及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載したように産生及び精製された（実施例９．１を参照のこと）。
ノブに融合したａ－ＦＡＰ ＶＨ及びホール鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４－１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表７０に見出すことができる。
Figure 0007034066000153
Figure 0007034066000154
Figure 0007034066000155
Figure 0007034066000156
Figure 0007034066000157
Figure 0007034066000158
Figure 0007034066000159
Figure 0007034066000160
Figure 0007034066000161
Figure 0007034066000162
Figure 0007034066000163
Figure 0007034066000164
ノブに融合したａ－ＦＡＰ ＶＬ及びホール鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４－１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表７１に見出すことができる。
Figure 0007034066000165
Figure 0007034066000166
Figure 0007034066000167
Figure 0007034066000168
Figure 0007034066000169
Figure 0007034066000170
Figure 0007034066000171
Figure 0007034066000172
Figure 0007034066000173
Figure 0007034066000174
Figure 0007034066000175
１１．２．４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性一価抗体の結合
１１．２．１．表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰへ同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
ビオチン化ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大４００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４－１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
図３７Ｂ及び３７Ｃに示すように、全ての二重特異性構築物は、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた。
１１．２．２ ＮＦκＢの活性化
ＮＦκＢ－レポーター細胞株ＨｅＬａ－ｈｕＣＤ１３７－ＮＦκＢ－ｌｕｃクローン２６の生成並びに活性化アッセイの設定は、９．２．３に記載されている。
クローン１１Ｄ５（図４４Ａ－Ｃ）又はクローン２５Ｇ７（図Ｇ－Ｉ）を含む試験したＦＡＰ（４Ｂ９）標的２＋１構築物は、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下でレポーター細胞株におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を引き起こした。この活性は、ＮＦ－κＢ活性化がＦＡＰ発現腫瘍細胞の非存在下では検出されなかったので、腫瘍細胞の細胞表面でのＦＡＰの発現に厳密に依存していた（図４３Ｄ及びＧ）。他の試験されたフォーマット（例えば、２＋２、１＋１）とは異なり、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化２＋１もまた、より低いＦＡＰ発現ＷＭ－２６６－４細胞の存在下で活性化を誘導することができた（図４４Ｅ及びＨ）。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９バインダーの存在下では、２＋１フォーマットもまたＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化２＋２又は１＋１構築物と比較して優れている（図４３Ｆ及びＩ、図４４Ｂ）。このことは、より強いＦＡＰバインダー（４Ｂ９＞２８Ｈ１）及びＦＡＰ結合側と４－１ＢＢ結合側との間の異なる比（１：２対１：１）で説明することができる。
Figure 0007034066000176

Claims (29)

  1. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、
    （ｂ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
    （ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を含む、二重特異性抗原結合分子であって、
    ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分が、
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；
    （ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；
    （ｖ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；
    （ｖｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
    （ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
    を含む、二重特異性抗原結合分子。
  2. ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  3. ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
    （ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
    （ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
    （ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
    （ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
    （ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
    （ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
    （ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
    を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  4. ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分がＦａｂ断片である、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  5. ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
    （ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
    （ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
    を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  6. （ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含み、かつ、
    （ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  7. （ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、
    （ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  8. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、
    （ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片、及び
    （ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  9. ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  10. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への抗体の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１から１０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの部分、
    （ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分、及び
    （ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. 二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０及びＦＡＰの両方に対して二価である、請求項１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
    （ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている２つの追加のＦａｂ断片
    を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されたクロスオーバーＦａｂ断片であり、かつ、ＶＬ－ＣＨ鎖がそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、請求項１７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であり、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ断片である、請求項１７又は１８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの部分、
    （ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの部分、及び
    （ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. 二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０に対して二価であり、かつ、ＦＡＰに対して一価である、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  22. （ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び
    （ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインであって、ここで、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介して重鎖の１つのＣ末端に連結され、かつ、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に連結される、ＶＨ及びＶＬドメイン
    を含む、請求項１から１４、又は２０又は２１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  23. 請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
  24. 請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  25. 医薬としての使用のための、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
  26. （ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
    （ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
    （ｉｉｉ）感染症の治療における、
    （ｉｖ）がんの治療における、
    （ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
    （ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
    使用のための医薬であって、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
  27. がんの治療における使用のための医薬であって、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
  28. 化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための医薬であって、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
  29. 個体における腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬であって、請求項１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２４に記載の薬学的組成物の有効量を含む、医薬。
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