BR112014015018A2 - moléculas de anticorpo biespecífico e seu método de produção, bem como composição farmacêutica e molécula de ácido nucleico - Google Patents

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Abstract

moléculas de anticorpo biespecífico e seu método de produção, bem como composição farmacêutica e molécula de ácido nucleico. a presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo biespecífico consistindo em fragmento fab que compreende primeiro sítio de ligação para primeiro antígeno, fragmento fv de cadeia única que compreende segundo sítio de ligação para segundo antígeno e domínio ch2 de imunoglobulina, em que o fragmento fab e o fragmento fv de cadeia única são ligados através do domínio ch2, em que no mínimo um resíduo aminoácido do domínio ch2 que é capaz de mediar a ligação a receptores de fc está ausente ou mutado, e em que adicionalmente um ou mais resíduo(s) aminoácido(s) de posições de sequência 226, 228 e 229, está(ão) ausente(s) ou mutado(s), bem como ao método de produção das referidas moléculas de anticorpo biespecífico. as referidas moléculas de anticorpo biespecífico podem ser utilizadas no tratamento de doenças proliferativas, tais como tumores. a presente invenção refere-se ainda a molécula de anticorpo tetramérica, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico e ao método de produção de uma molécula de anticorpo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉ- CULAS DE ANTICORPO BIESPECÍFICO E SEU MÉTODO DE PRO- DUÇÃO, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MOLÉCU- LA DE ÁCIDO NUCLEICO".
MOLÉCULA DE ANTICORPO BIESPECÍFICO REFERÊNCIA CRUZADA COM REQUERIMENTOS RELACIONADOS
[001] O presente requerimento reivindica o direito de prioridade do requerimento provisório de patente dos Estados Unidos No. 61/577.327 arquivado junto ao US Patent and Trademark Office em 19 de dezembro de 2011, cujo conteúdo integral é incorporado aqui, a este requerimento de patente, para todos os fins. ÁREA DA INVENÇÃO!
[002] A presente invenção refere-se a uma molécula de anticor- po biespecífico, bem como um método para produção da mesma, sua utilização e uma molécula de ácido nucleico codificando a molécula de anticorpo biespecífico. A invenção em particular proporciona uma mo- lécula de anticorpo que é capaz de mediar a ativação de células imu- nes restrita às células alvo.
ANTECEDENTES
[003] Anticorpos monoclonais contra o complexo de receptor de células T (TOCR/CD3 antígeno-específico têm a capacidade de ativar de modo eficaz células T. No entanto, esta ativação requer que o anti- corpo seja - através de sua porção Fc - multimerizado sobre a superfí- cie de células expressando receptor de Fc, o que frequentemente também proporciona sinais acessórios para ativação de células T (Da- vis, L., Vida, R. and Lipsky, P.E., Regulation of human T Iymphocyte mitogenesis by antibodies to CD3, J. Immunol. [1986] 137: 3758-3767).
[004] Anticorpos biespecíficos, os quais reconhecem tanto um antí- geno sobre células alvo (por exemplo, FLT3 ou CD19 sobre células de leucemia, o antígeno de CSPGA4 sobre células de melanoma ou EGFR
1a/90 sobre células de glioblastoma) e o complexo de receptor de células T (TCR)/CD3 antígeno-específico, são igualmente capazes de ativar cé-
lulas T (Jung, G., Ledbetter, J. A., and Muller-Eberhard, H. J., Induction of cytotoxicity in resting human T Iymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A [1987] 84: 4611-4615; Jung, G., & Eberhard, H. J., An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today
[1988] 9: 257-260; Jung, G., Brandl, M., Eisner, W., Fraunberger, P., Reifenberger, G., Schlegel, U., Wiestler, O. D., Reulen, H. J., Wil- manns, W. Local immunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibody fragments and resting autologous Iymphocytes: evidence for in situ T-cell activation and therapeutic efficacy, Int J Can- cer. [2001] 91: 225-30), e além disso de focalizar as células ativadas sobre a célula alvo (Staerz, U. D., Kanagawa, O., and Bevan, M. J., Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells, Nature [1985] 314: 628-631; Perez, P., Hoffman, R. W., Shaw, S., Bluestone, J. A., and Segal, D. M. Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cell antibody, Nature [1985] 316: 354-356; Jung, G., Hon- sik, C. J., Reisfeld, R. A. and Muller-Eberhard, H. J. Activation of hu- man peripheral blood mononuclear cells by anti-T3: killing of tumor tar- get cells coated with anti-target-anti-T3 conjugates, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 83: 4479-4483, 1986). Em consequência, ocorre lise de células tumorais mediada por células T. Anticorpos agonistas para mo- lécula coestimuladora de células T tal como CD28, reforçam a ativação de células T mediada por anti-CD3. Os anticorpos coestimuladores referidos são particularmente eficazes se também forem proporciona- dos em um formato biespecífico (Grosse-Hovest, L., Hartlapp, |., Mar- wan, W., Brem, G., Rammensee, H. G., and Jung, G., A recombinant bispecific o single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing, Eur. J. Immunol. [2003] 33: 1334-1340). Em qualquer caso, nós consideramos isto como um re- quisito absoluto para aplicações terapêuticas de anticorpos biespecífi-
cos que têm especificidade de CD3 que possa ser excluída a ligação a receptors de Fc (Jung, G., and Eberhard, H. J., An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today
[1988] 9: 257-260; Jung, G., Freimann, U., Von Marshall, Z., Reisfeld, R. A., and Wilmanns, W., Target cell-induced T cell activation with bi- and trispecific antibody fragments, Eur. J. Immunol. [1991] 21: 2431- 2435). A ligação a receptors de Fc referida resultaria em ativação de células T in vivo, a qual ocorre, independente da ligação a um antíge- no alvo, em qualquer localização onde podem ser encontradas células expressando receptor de Fc, por exemplo, dentro de todo o sistema hematopoiético, linfático e retículo-endotelial. De acordo com a experi- ência, a ativação de células T referida resulta em ativação sistêmica de células T, acompanhada por uma síndrome de liberação de citoci- na, uma reação adversa temida durante a utilização terapêutica de an- ticorpos ou células T ativando citocinas (Rosenberg, S. A., Lotze, M. T., Yang, J. C., Aebersold, P. M., Linehan, W. M., Seipp, C. A., and White, D. E., Experience with the use of high-dose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients, Ann. Surg. [1989] 210: 474-484; Tib- ben, J. G., Boerman, O. C., Massuger, L. F., Schijf, C. P., Claessens, R. A., and Corstens, F. H., Pharmacokinetics, biodistribution and bio- logical effects of intravenously administered bispecific monoclonal anti- body OC/TR F(ab')2 in ovarian carcinoma patients, Int. J. Cancer
[1996] 66: 477-483; Kroesen, B. J., Buter, J., Sleijfer, D. T., Janssen, R. A., van der Graaf, W. T., The, T.H., de, L.L. and Mulder, N. H., Phase | study of intravenously applied bispecific antibody in renal cell cancer patients receiving subcutaneous interleukin 2, Br. J. Cancer
[1994] 70: 652-661). Portanto, o objetivo na formatação de anticorpos contra CD3 biespecíficos precisa ser evitar uma ativação de células T sistêmica mediada por Fc, e deste modo possibilitando ativação restri- ta às células alvo, a qual é exclusivamente dependente de ligação da porção alvo do anticorpo biespecífico ao antígeno alvo correspondente (Jung, G., & Eberhard, H. J., An in-vitro model for tumor immunothe- rapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today [1988] 9: 257- 260; Jung, G., Freimann, U., Von Marshall, Z., Reisfeld, R. A., and Wilmanns, W. Target cell-induced T cell activation with bi- and trispeci- fic antibody fragments, Eur. J. Inmunol. [1991] 21: 2431-2435). A partir do acima exposto, verifica-se que ao selecionar o antígeno alvo, deve- se cuidar de expressão tão restrita a células malignas quanto possível. Deste modo a ativação por células não-malignas e uma liberação de citocinas acompanhando pode ser mantida tão baixa quanto possível.
[005] Considerações similares se aplicam se anticorpos biespecíficos forem construídos que contêm ligação de anticorpos efetores agonis- tas para acionar receptores sobre células imunes diferentes de células T, tais como CD16 expressados sobre células NK. Em qualquer caso, a ligação, mediada por Fc, dos anticorpos para receptores de Fc deve ser evitada de acordo com o raciocínio delineado acima para células T.
[006] O anticorpo biespecífico o qual prosseguiu mais longe em de- senvolvimento clínico atualmente é Blinatumomab (Micromet, Inc., Rockville, MD), um anticorpo de cadeia única biespecífico com especi- ficidade para CD19xCD3 e uma notável atividade terapêutica contra células de leucemia e linfoma (Bargou, R., e outros ., Tumor regres- sion in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science [2008] 321: 974-977; Topp, M. S., e outros ., Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy- refractory minimal residual disease in B-lineage acute Iymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemi- a-free survival, J. Clin. Oncol. [2011] 29: 2493-2498).
[007] Como o formato de cadeia única não contém qualquer domínio da parte de Fc, este anticorpo é restrito a células alvo dentro do signi- ficado explicado acima, isto é, somente ativa células T na presença de células alvo expressando CD19 (Brischwein, K., e outros ., Strictly tar- get cell-dependent activation of T cells by bispecific single-chain anti- body constructs of the BIiTE class, J. Inmunother. [2007] 30: 798-807).
[008] No entanto, CD19 também é expresso sobre células B normais de modo que, apesar de restrição às células alvo, depois de aplicação terapêutica, ocorre uma liberação sistêmica de citocinas, provocando significativa citotoxicidade já em doses diárias em torno de 100 ug (Bargou, R., e outros ., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science [2008] 321: 974-977; Topp, M. S., e outros ., Targeted therapy with the T-cell-engaging anti- body blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual dise- ase in B-lineage acute Iymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival, J. Clin. Oncol.
[2011] 29: 2493-2498).
[009] Além disso, o formato de cadeia única tem as seguintes desvan- tagens: (i) o peso molecular de cerca de 50 kDa é relativamente baixo e é associado com uma meia vida sérica curta, (ii) anticorpos deste formato agregam facilmente e (iii) são difíceis de produzir em proces- sos de fermentação convencionais (Grosse-Hovest, L., Hartlapp, |. Marwan, W., Brem, G., Rammensee, H. G., and Jung, G., A recombi- nant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing, Eur. J. Immunol. [2003] 33: 1334-1340; Grosse-Hovest, L., e outros ., Cloned transgenic farm ani- mals produce a bispecific antibody for T cell-mediated tumor cell killing, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A [2004] 101: 6858-6863).
[0010] É, portanto um objeto da presente invenção proporcionar uma molécula de anticorpo biespecífico que supera no mínimo algumas dfas dificuldades acima e que pode ser geralmente usada em terapia, entre outros para ativação de células imunes estritamente restrita às células alvo conforme descrito acima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona uma molécula de anticorpo biespecífico recombinante. A molécula de anti- corpo biespecífico recombinante consiste de um fragmento Fab, um fragmento Fv de cadeia única e um domínio CH2 de imunoglobulina. O fragmento Fab inclui um primeiro sítio de ligação para um primeiro an- tígeno. O fragmento Fv de cadeia única inclui um segundo sítio de li- gação para um segundo antígeno. O fragmento Fab e o fragmento Fv de cadeia única são ligados um ao outro através do domínio CH2. Em modalidades típicas os resíduos cisteína formando ligações de dissul- feto inter-cadeias pesadas (C226 e C229 em imunoglobulinas - IgG humana) são permutados.
[0012] Em um segundo aspecto a invenção proporciona uma molécula de anticorpo tetramérica. A molécula de anticorpo tetramérica inclui um dímero da molécula de anticorpo de acordo com o primeiro aspecto. O dímero é geralmente definido por uma ligação entre resíduos cisteína de duas moléculas de anticorpo do primeiro aspecto, a saber, entre cisteínas na região de articulação. Os resíduos cisteína referidos são tipicamente aminoácidos preservados (C226 e C229 em imunoglobuli- nas - IgG humana).
[0013] Em um terceiro aspecto a invenção proporciona uma molécula de anticorpo biespecífico recombinante. A molécula de anticorpo bies- pecífico recombinante inclui um fragmento Fab que inclui um primeiro sítio de ligação para um primeiro antígeno, um fragmento Fv de cadeia única que inclui um segundo sítio de ligação para um segundo antíge- no, um domínio CH2 de imunoglobulina, e um domínio CH3 de imuno- globulina. O fragmento Fab e o fragmento Fv de cadeia única são liga- dos através do domínio CH2 / domínio CH3. No mínimo um resíduo aminoácido do domínio CH2 que tem a capacidade de mediar ligação a receptores de Fc está faltando ou é mutado. Em modalidades típicas deste aspecto no mínimo um dos resíduos cisteína formando ligações de dissulfeto inter-cadeias (C226 e C229 em anticorpos - IgG humana) são permutados. Em algumas modalidades as moléculas referidas po- dem conter modificações adicionais na região CH3 que previnem di- merização com domínios CH3 homotípicos.
[0014] Em um quarto aspecto a invenção proporciona uma molécula de anticorpo tetramérica. A molécula de anticorpo tetramérica consiste de um dímero da molécula de anticorpo biespecífico recombinante de acordo com o terceiro aspecto. O dímero é geralmente definido por uma ligação entre cisteínas preservadas na região de articulação (C226 e C229 em anticorpos - IgG humana).
[0015] Em um quinto aspecto a invenção proporciona uma molécula de anticorpo biespecífico recombinante adicional. Esta molécula de anti- corpo inclui um fragmento Fab incluindo um primeiro sítio de ligação para um primeiro antígeno, um fragmento Fv de cadeia única incluindo um segundo sítio de ligação para um segundo antígeno, um domínio CH2 de imunoglobulina, e um domínio CH3 de imunoglobulina. O fragmento Fab e o fragmento Fv de cadeia única são ligados um ao outro através do domínio CH2 e do domínio CH3. No mínimo um resí- duo cisteína desta molécula de anticorpo que é capaz de formar uma ponte de dissulfeto para dimerização está faltando ou é mutado.
[0016] Em um sexto aspecto a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico codifica uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer um do primeiro, do segundo, do ter- ceiro, do quarto ou do quinto aspecto.
[0017] Em um sétimo aspecto a invenção proporciona uma composi- ção farmacêutica. A composição farmacêutica inclui uma molécula de anticorpo de acordo com um do primeiro, do segundo, do terceiro, do quarto ou do quinto aspecto.
[0018] Em um oitavo aspecto a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença. O método inclui usar uma molécula de an- ticorpo de acordo com um do primeiro, do segundo, do terceiro, do quarto ou do quinto aspectos. Geralmente a molécula de anticorpo é administrada a um paciente que necessite do mesmo.
[0019] Em um nono aspecto a invenção proporciona uma célula hos- pedeira que inclui uma molécula de ácido nucleico de acordo com o sexto aspecto.
[0020] Em um décimo aspecto a invenção proporciona um método de produção de uma molécula de anticorpo de acordo com um do primei- ro, do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto aspectos. O método inclui expressão de um ácido nucleico codificando a molécula de anti- corpo sob condições que permitem expressão da molécula de ácido nucleico.
[0021] Estes aspectos da invenção serão mais plenamente entendidos em vista da descrição, dos desenhos e dos exemplos não-limitantes que se seguem.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A Fig. 1 representa esquematicamente modalidades de molécu- las de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.
[0023] A Fig. 1A representa uma molécula bivalente com um fragmen- to Fab, um domínio CH2 e um fragmento Fv de cadeia única. A molé- cula de anticorpo tem uma cadeia principal na qual o domínio CH2 é ligado através de seu N-término aos domínios CH1 e VH de cadeia pesada de um fragmento Fab e através de seu C-término a um frag- mento Fv de cadeia única (formato bsFc-1/2).
[0024] A Fig. 1B representa uma molécula de anticorpo bivalente com uma cadeia principal na qual o domínio CH2 é ligado à cadeia leve de um fragmento Fab, isto é, na qual a cadeia principal inclui um domínio VL e um domínio CL, uma região de articulação, um domínio CH2 e um fragmento Fv de cadeia única.
[0025] A Fig. 1C mostra uma molécula de anticorpo bivalente na qual a cadeia principal inclui um domínio VL e um domínio CH1, uma região de articulação, um domínio CH2 e um fragmento Fv de cadeia única. Uma segunda cadeia de menor peso inclui um domínio VH e um do- mínio CL. Na molécula de anticorpo da Fig. 1C o fragmento Fab por- tanto não é um fragmento Fab “clássico (que ocorre naturalmente)" no qual o domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada são fundi- dos a seu domínio constante respectivo (CL ou CH1, respectivamente) mas um fragmento Fab “híbrido” no qual o domínio variável é fundido ao domínio constante da “cadeia oposta”, isto é, o domínio VH é fundi- do ao domínio CL e o domínio VL é fundido ao domínio CH1.
[0026] A Fig. 1D representa uma molécula de anticorpo bivalente com uma cadeia principal na qual o domínio CH2 é ligado a um domínio CL e um domínio VH. Uma segunda cadeia de menor peso inclui um do- mínio VL e um domínio CH1. A molécula de anticorpo da Fig. 1D por- tanto inclui um “fragmento Fab híbrido” (que inclui o primeiro sítio de ligação) uma vez que também está presente na molécula da Fig.1C.
[0027] A Fig. 1E representa uma molécula de anticorpo bivalente com um desenvolvimento como na Fig. 1A, na qual aminoácidos no domí- nio CH2 e/ou na região de articulação tenham sido modificados (indi- cados por “X” conforme representado na Fig. 10, formato bsFc“º-1/2). Do mesmo modo, as modificações referidas podem ser inseridas nas moléculas representadas em 1B a 1D. Nas moléculas representadas nas Figs. 1A a 1E os resíduos cisteína que formam ligações de dissul- feto inter-cadeias (C226 e C229 em anticorpos de IgG humana) são permutados para prevenir a formação de dímeros (e).
[0028] A Fig. 1F representa como uma modalidade ilustrativa uma mo- lécula tetravalente que é um dímero da unidade representada na Fig. 1A. Uma molécula semelhante também pode ser construída nas confi- gurações de Fab representadas nas Figs. 18 a 1D com e sem as mo-
dificações de Fc representadas na Fig. 1E. Estas modificações estão listadas na Figura 1P.
[0029] A Fig. 1G representa como uma modalidade ilustrativa uma mo- lécula tetravalente que é um dímero de uma unidade que inclui um fragmento Fab, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única. Aminoácidos no domínio CH2 e na região de articula- ção foram modificados (X); resumido na Fig. 1P. As duas cadeias prin- cipais do anticorpo incluem um domínio VH e um domínio CH1, uma região de articulação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um frag- mento Fv de cadeia única (formato bsFc“*-1). Moléculas similares tam- bém podem ser construídas nas configurações de Fab representadas nas Figs. 1A a 1E. Em todas estas moléculas, dímeros são definidos por meio de cisteínas preservadas na região de articulação (C226 e C229 em anticorpos de IgG humana).
[0030] A Fig. 1H representa uma molécula tetravalente, que é um dí- mero der uma unidade que inclui com um fragmento Fab, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única. Dentro do fragmento Fab as duas cadeias principais do anticorpo incluem um domínio VH e um domínio CL.
[0031] A Fig. 11 mostra um anticorpo tetravalente com um desenvolvi- mento geral conforme representado na Fig. 1G. Em contraste com a modalidade da Fig. 1G somente uma das duas cadeias principais des- te anticorpo inclui aminoácidos no domínio CH2 e na região de articu- lação que tenham sido modificados (indicados por “X”).
[0032] A Fig. 1J representa uma molécula tetravalente na qual as duas cadeias principais incluem um domínio VL e um domínio CL, uma regi- ão de articulação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única.
[0033] A Fig. 1K representa uma molécula tetravalente com dois frag- mentos Fab estruturalmente diferentes. A primeira cadeia principal do anticorpo inclui um domínio VL e um domínio CL, uma região de articu- lação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de ca- deia única. A segunda cadeia principal do anticorpo inclui um domínio VH e um domínio CH1, uma região de articulação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única.
[0034] A Fig. 1L representa uma molécula tetravalente, que é um dí- mero de uma unidade que inclui um fragmento Fab, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única. Dentro do frag- mento Fab as duas cadeias principais do anticorpo incluem um domí- nio VL e um domínio CH1.
[0035] A Fig. 1M representa uma molécula tetravalente adicional com dois fragmentos Fab estruturalmente diferentes. A primeira cadeia principal do anticorpo inclui um domínio VL e um domínio CH1, uma região de articulação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um frag- mento Fv de cadeia única. A segunda cadeia principal do anticorpo inclui um domínio VH e um domínio CL, uma região de articulação, um domínio CH2, um domínio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única.
[0036] A Fig. 1N representa como uma modalidade ilustrativa uma mo- lécula bivalente com um fragmento Fab, um domínio CH2 e um domí- nio CH3 e um fragmento Fv de cadeia única. A molécula de anticorpo tem uma cadeia principal na qual o domínio CH2 é ligado através de seu N-término aos domínios CH1 e VH de cadeia pesada de um frag- mento Fab e através de seu C-término a um domínio CH3 o qual é li- gado através de seu C-término a um fragmento Fv de cadeia única. Uma molécula semelhante também pode ser construída nas configu- rações de Fab representadas nas Figs. 1A a 1D e pode conter modifi- cações de Fc na região de articulação e de CH2 (“X”) conforme repre- sentado nas Figs. 1EÉ e 10. Além disso, podem conter modificações no domínio CH3 que previnem dimerização deste domínio e podem influ- enciar a ligação ao receptor de Fc neonatal (FCcRn). Exemplos de resí-
duos que estão envolvidos na dimerização e, portanto podem ser mo- dificados por eliminação ou mutação incluem T366, L368, F405, Y407, e K409 (cf. Dall'Aqua e outros . “Contribution of domain interface resi- dues to the stability of antibody CH3 domain homodimers” Biochemis- try (1998) Volume: 37, Issue: 26, Pages: 9266-9273. Outros resíduos de contao na interface do domínio CH3, que podem ser modificados, incluem Q347, Y349, T350, L351, L368, K370, K392, T394, P395, V397, L398, D399, F405, Y407, e K409. Vide S. Miller Protein-Protein Recognition and the Association of Immunoglobulin Constant Domains. J. Mol. Biol. (1990) Volume 216 pp 965-973, and J. Deisenhofer Crys- tallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution. Biochemistry (1981) Volume 20 pp 2361-2370, e, no que diz respeito à ligação do receptor de Fc neona- tal, por exemplo, os seguintes aminoácidos resíduos do domínio CH2: T250, M252, S254, T256, T307 H310 e do domínio CH3: ES380 M428, H433, N434, H435 (vide a revisão de Roopenian & Akilesh; FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age. Nature Reviews Immunology (2007) Volume 7 pp: 715-725. Em todas estas moléculas da invenção os resíduos cisteína que formam ligações de dissulfeto inter-cadeias (C226 e C229 em anticorpos de IgG humana) são permutados para prevenir a formação de dímeros (e).
[0037] Modalidades ilustrativas adicionais não representadas nas Figs. 1A à 1N incluem moléculas onde, em relação às modalidades repre- sentadas, a parte de Fv de cadeia única C-terminal pode estar em uma orientação VL-VH ao invés da orientação VH-VL representada, signifi- cando que o domínio VL é fundido ao domínio constante respectivo.
[0038] A Fig. 10 lista modificações ilustrativas que podem ser introdu- zidas nas variantes de anticorpos bivalentes representadas nas Figs.1A a 1D e na Fig. 1N de modo a obter derivados deficientes de Fc conforme exemplificado na Fig. 1E. Modificações são idênticas às mostradas na Fig. 1P com a exceção das cisteínas preservadas (C226 e C229 em anticorpos de IgG humana). A numeração de aminoácidos está em conformidade com a numeração Kabat [índice da União Euro- péia (EU-Index)]. wt = sequência selvagem humana de IgG1; [1 = no- caute; Glycan = nocaute de 1 com eliminação de porções de sacarí- deos [) 1297; [12-5 variantes de nocaute adicionais em continuação de [D1; - = o aminoácido foi eliminado.
[0039] A Fig. 1P lista modificações ilustrativas que podem ser usadas para obter uma molécula tetravalente conforme representado na Fig. 1F a IM. A numeração de aminoácidos erstá em conformidade com a numeração Kabat [índice da União Européia]. wt = sequência selva- gem humana de IgG1;/[11 = nocaute; Glycan = nocaute del) 1 com eliminação de porções de sacarídeos [)[ 297; 12-5 variantes de no- caute adicionais em continuação de [)1; - = o aminoácido foi elimina- do.
[0040] As Figs. 2A a 2C representam uma representação esquemática do procedimento de clonagem para a produção de uma cadeia pesada otimizada (cadeia principal) para os anticorpos representados na Fig. 1, ou como anticorpos biespecíficos bivalentes ou tetravalentes com partes Fc atenuadas por ADCC modificada. i) O vetor original, baseado na espinha dorsal de plasmídeo de pcDNA3 (Invitrogen; são eliminados promotor de CMV e sinal de terminação do hormônio de crescimento bovino), é representado. Este plasmídeo contém a cadeia pesada de Ig do isotipo El humano com elementos reguladores do lócus da cadeia pesada de imunoglobulina. ii) A permuta de um elemento VDJ (domínio variável da ca- deia pesada) ou VJ (domínio variável da cadeia leve) através do sítio de endonuclease de restrição Aatll e Clal é indicada. iii) É mostrada a simples permuta (através dos sítios de restri-
ção Mlul e Spel) da cadeia pesada de lg do isotipo E1 humano comple- to contra a sequência codificante para um fragmento scFv, um elemen- to de DNA com CH3 eliminado e articulação e CH2 modificados resul- tando em uma cadeia pesada de anticorpo biespecífico bivalente. Para algumas variantes de anticorpos, por exemplo, aquelas representadas na Fig. 1D, o domínio CH1 pode ser substituído por um domínio CL. iv) Permutando o fragmento CH1-H-CH2 modificado (através dos sítios de restrição Mlul e BspEl) contra um elemento CH1-H-CH2- CH3 com articulação e CH2 modificados resulta em uma cadeia pesa- da de anticorpo biespecífico tetravalente ou conforme mostrado em v). Se, além disso, ou somente como tal as cisteínas na posição C226 e C229 são permutadas, as moléculas resultantes são moléculas de an- ticorpo biespecífico bivalente conforme representado na Fig. 1N. v) Permutando o fragmento scFv (através dos sítios de restri- ção BspEl e Spel) contra um fragmento scFv de qualquer outra especi- ficidade antigênica ou de orientação de VH e VL diferente. As substi- tuições iv) e v) podem ser combinadas.
[0041] Nas Fig. 2B e 2C) as regiões adjacentes aos elementos VDJ — CH1 e scFv inseridos, respectivamente, são mostradas em detalhes.
[0042] As Figs. 2D-F representa uma representação esquemática do procedimento de clonagem para a produção da cadeia leve de anticor- pos monoespecíficos humanos. i) O vetor parental, baseado na espinha dorsal de plasmídeo de pCR-Script (Stratagene; são eliminados promotor lacZ e sinal de terminação) contém a região VJ e a região C do I-gene humano bem como elementos reguladores do lócus de cadeia leve de imunoglobuli- na. ii) Permuta de um elemento VJ (domínio variável da cadeia leve) ou de um elemento VDJ (domínio variável da cadeia pesada) a- través das endonucleases de restrição Xho! e Spel.
iii) Permuta de elemento CL (cadeia leve constante) através das endonucleases de restrição Pmll e BsmBlI.
[0043] Nas Figs. 2E e 2F as regiões adjacentes aos elementos VJ e CL inseridos são mostradas em detalhes.
[0044] Boxes representam éxons; círculos representam elementos re- forçadores e linhas finas representam regiões de UT e sequências de íntrons. L, e L», sequências lider codificadas por dois éxons diferents (também mostradas nas Figuras 2B e 2E); V, regiões variáveis; D, re- gião de diversidade; J, regiões de união; CH1, CH2, CH3, CL, éxons de cadeias constantes pesadas e leve, respectivamente, H, região de articulação, scFv, fragmento Fv de cadeia única; X = modificações de aminoácido. Notl, Aatll, Clal, Mlul, BspEl, Spel, Xhol, Kpnl, Xhol, Spel, Pmil, BsmBI, Sall, endonucleases de restrição usadas para clonagem; Amp"? e Neo" representam as regiões codificantes para resistência a Ampicilina e Neomicina respectivamente.
[0045] Os sítios de clivagem para peptídeos de sinais secretores são indicados por |; e limites éxon-íntron por [, 1.|
[0046] A Fig. 3A ilustra ativação de células T restrita às células alvo (incorporação de *H-timidina) por dois anticorpos biespecíficos de for- mato diferente de acordo com a invenção, tendo especificidade para FLT3 X CD3. Os anticorpos são usados sobre células que não incluem (símbolos vazios) e que incluem (símbolos preenchidos) células REH positivas para FLT3/CD19. 0,e: molécula de anticorpo bivalente con- forme representado na Fig. 1A com a sequência “Glycan” conforme representado nas Figs. 1E e Fig. 10 fragmento Fab (formato bsFc*º- 1/2) com sítio de ligação de FLT3, fragmento scFv com sítio de ligação de CD3. 5, =: molécula de anticorpo tetravalente conforme representa- do na Fig. 1G com a sequência [1 conforme representado na Fig. 1P, (formato bsFc“º-1). Fragmento Fab, com sítio de ligação de FLT3, fragmento scFv com sítio de ligação de CD3. *: anticorpo anti-CD3 monoespecífico intacto sem células alvo. Na ausência de células alvo, anticorpos anti-CD3 monoespeciíficos intactos ativam de modo eficaz células T em uma maneira dependente de Fc/FcR ao passo que os anticorpos biespecíficos são ineficazes. Isto demonstra que o formato biespecífico da invenção carece de ligação de Fc/FcR tão boa quanto inteiramente. A Fig. 3B ilustra a ativação de células T restrita às célu- las alvo (liberação de TNF) por diferentes anticorpos biespecíficos bi- valentes de acordo com a invenção, usaos sobre células que não in- cluem (símbolos vazios) e que incluem (símbolos preenchidos) células REH positivas para FLT3/CD19. 0,e: molécula de anticorpo bivalente conforme representado na Fig. 1A com a sequência “Glycan” conforme representado na Fig. 1E e Fig 10, fragmento Fab com sítio de ligação de FLT3, fragmento scFv com sítio de ligação de CD3; 0,4: molécula de anticorpo bivalente conforme representado em 1E com a sequência “Glycan” conforme representado na Fig 10, fragmento Fab com sítio de ligação de CD19, fragmento scFv com sítio de ligação de TCR; V,YV: molécula de anticorpo bivalente conforme representado na Fig. 1E com a sequência “Glycan” conforme representado na Fig 10, frag- mento Fab com sítio de ligação de CSPGA, fragmento scFv com sítio de ligação de CD3. O proteoglicano de sulfato de condroitina CSPG4 é um antígeno alvo de células de melanoma e não é expressado sobre células REH.
[0047] A Fig. 4 representa a lise específica de células REH expres- sando FLT3/CD19 (A) e células SKMel63 expressando CSPG (B), respectivamente, por meio de anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção e por células killer T positivas para CD8 ativadas em um teste de liberação de “cromo de 4 horas. e: FLT3 X CD3, formato bsFc“º-1/2 conforme representado na Fig. 1E; =: FLT3 X CD3, formato bsFc“º*-1 conforme representado na Fig. 1G; V: CSPG4 X CD3, forma- to bsFc“-1/2 conforme representado na Fig. 1E; +: CD19 X TCR, for-
mato bsFcҼ-1/2 conforme representado na Fig. 1E.
[0048] A Fig. 5 mostra uma comparação de anticorpos FLT3 X CD3 de especificidade idêntica em três diferentes formatos: formato de cadeia única biespecífica (bs-scFv), formato bsFc“º-1/2 conforme representa- do na Fig. 1E, e formato bsFc“*-1 conforme representado na Fig. 1G. A: determinação de agregação (valores em percentagem) por meio de filtração por gel. Agregados estão migrando próximos ao volume vazio e são 43%, 0%, 2% para bs-scFv, bsFcko-1/2, bsFcko-1, respectiva- mente. Conclui-se que a formação de agregados é consideravelmente mais pronunciada se o anticorpo for expressado como bs-scFv ao in- vés de bsFcko-1/2 ou bsFcko-1. B: taxa de produção depois de trans- fecção de genes de anticorpo em células de produção e purificação através de cromatografia por afinidade. Conforme pode ser visto, a formação de agregados é significativamente reduzida para os dois formatos de Fc“º de acordo com a invenção, e as taxas de produção são substancialmente maiores do que com o formato de cadeia única biespecífica (bs-scFv).
[0049] A Fig. 6A mostra as sequências de cadeias leves ilustrativas que podem ser incluídas em um anticorpo da invenção. As cadeias de peptídeo respectivas correspondem à proteína madura sem a sequên- cia de peptídeo lider correspondente. As sequências contêm um domí- nio variável N-terminal representado em negrito e um domínio constan- te C-terminal representado em itálico. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do domínio variável estão sublinhadas.
[0050] A Fig. 6B representa as sequências de cadeias principais ilus- trativas, as quais podem no presente caso também ser tratadas como cadeias pesadas que podem ser incluídas eêâm um anticorpo da inven- ção. Esta cadeia principal em particular para o formato bsFc-1/2 (Figs 1E) inclui um domínio VH, um domínio CH1, uma região de articula- ção, um domínio CH2 modificado, um domínio VL e um domínio VH de um fragmento scFv. No exemplo de sequência 21) (SEQ ID NO: 26) a cadeia principal contém um domínio CH3 conforme representado na Fig. 1G a 1M de exemplo (formato bsFc“º-1).
[0051] Os domínios VH são representados em negrito, o domínio CH1 em texto regular, e as regiões de articulação, CH2 e CH3 em texto re- gular, sublinhado. A cadeia principal inclui adicionalmente um domínio VL, o qual é representado em texto em negrito e itálico, e um domínio VH (negrito) de um fragmento scFv. Os domínios VH e VL são ligados um ao outro através de um encadeador, o qual é representado em tex- to em itálico e sublinhado. Os resíduos determinantes de complemen- taridade (CDRs) das regiões VL e VH respectivas são sublinhados. O domínio CH2 e o fragmento scFv são ligados um ao outro através de um pequeno encadeador (GQPSG), o qual é representado em itálico.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0052] A presente invenção se refere a uma molécula de anticorpo bi- específico recombinante. Esta molécula de anticorpo é composta de elementos que também são encontrados em imunoglobulinas nativas, isto é, que ocorrem naturalmente, a saber, domínios de cadeias pesa- das e cadeias leves de imunoglobulinas.
[0053] O termo "anticorpo" geralmente se refere a uma molécula de ligação proteinácea com funções semelhantes às imunoglobulina. E- xemplos típicos de um anticorpo são imunoglobulinas, bem como deri- vados ou fragmentos funcionais das mesmas os quais ainda conser- vam a especificidade de ligação. Técnicas para a produção de anticor- pos são de conhecimento geral na arte. O termo "anticorpo" também inclui imunoglobulinas (Ig's) de diferentes classes (isto é, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) e subclasses (tais como IgG1, IgG2 etc.). Exemplos ilustrativos de um anticorpo são fragmentos Fab, F(ab'),, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia única (scFy), diabodies ou anticorpos de domínio (Holt LJ e outros ., Trends Biotechnol. 21(11), 2003, 484-490).
Anticorpos de domínio podem ser anticorpos de domínio único, anti- corpos de único domínio variável ou único domínio variável de imuno- globulina tendo somente um domínio variável, o qual pode ser VH ou VL, que liga especificamente um antígeno ou epitope de modo inde- pendente de outras regiões V ou domínios V. Um único domínio variá- vel de imunoglobulina seme3lhante pode não somente englobar um polipeptídeo de domínio variável único de anticorpo isolado, mas tam- bém um polipeptídeo maior que inclui ou consiste de um ou mais mo- nômeros de uma sequência de polipeptídeo de domínio variável único de anticorpo. A definição do termo "anticorpo", portanto também inclui modalidades tais como anticorpos quiméricos, de cadeia única e hu- manizados.
[0054] Uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção pode carregar um ou mais domínios que têm uma sequência com no mínimo cerca de 60 %, no mínimo cerca de 70 %, no mínimo cerca de 75 %, no mínimo cerca de 80 %, no mínimo cerca de 85 %, no mínimo cerca de 90 %, no mínimo cerca de 92 %, no mínimo cerca de 95 %, no mi- nimo cerca de 96 %, no mínimo cerca de 97 %, no mínimo cerca de 98 % ou no mínimo cerca de 99 % de identidade de sequências com um domínio que ocorre naturalmente correspondente de uma imunoglobu- lina M, de uma imunoglobulina G, de uma imunoglobulina A, de uma imunoglobulina D ou de uma imunoglobulina E. Observa-se a este respeito, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa dentro de um desvio de 20%, tal como dentro de um desvio de 10% ou dentro de 5% de um dado valor ou alcance.
[0055] Por conseguinte, a cadeia principal (cadeia de polipeptídeo maisd longa) de uma molécula de anticorpo da invenção pode incluir, incluindo consistir de domínios com a identidade de sequências acima com um domínio correspondente de uma cadeia pesada mu de imu-
noglobulina, de uma cadeia pesada gama de imunoglobulina, de uma cadeia pesada alfa de imunoglobulina, de uma cadeia pesada delta de imunoglobulina ou de uma cadeia pesada épsilon de imunoglobulina. Além disso, uma molécula de anticorpo da invenção pode incluir, inclu- indo consistir de, domínios com a identidade de sequências acima com um domínio correspondente de uma cadeia leve lâmbda de imunoglo- bulina ou de uma cadeia leve cápa de imunoglobulina. Em algumas modalidades os domínios de cadeia pesada inteiros de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção têm no mínimo cerca de 60 %, no mínimo cerca de 70 %, no mínimo cerca de 75 %, no mínimo cerca de 80 %, no mínimo cerca de 85 %, no mínimo cerca de 90 %, no mi- nimo cerca de 92 %, no mínimo cerca de 95 %, no mínimo cerca de 97 %, no mínimo cerca de 98 % ou no mínimo cerca de 99 % de identida- de de sequências com as regiões correspondentes de uma cadeia pe- sada mu de imunoglobulina, de uma cadeia pesada gama de imuno- globulina (tais como cadeias pesadas gama 1, gama 2, gama 3 ou gama 4), de uma cadeia pesada alfa de imunoglobulina (tais como ca- deias pesadas alfa 1 ou alfa 2), de uma cadeia pesada delta de imu- noglobulina ou de uma cadeia pesada épsilon de imunoglobulina. Em algumas modalidades todos os domínios de cadeia leve presentes em uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção têm no mínimo cerca de 60 %, no mínimo cerca de 70 %, no mínimo cerca de 75 %, no mínimo cerca de 80 %, no mínimo cerca de 85 %, no mínimo cerca de 90 %, no mínimo cerca de 92 %, no mínimo cerca de 95 %, no mi- nimo cerca de 97 %, no mínimo cerca de 98 % ou no mínimo cerca de 99 % de identidade de sequências com as regiões correspondentes de uma cadeia leve lâmbda de imunoglobulina (tais como cadeias leves lâmbda 1, lâmbda 2, lâmbda 3 ou lâmbda 4) ou de uma cadeia leve cápa de imunoglobulina.
[0056] “Percentagem (%) de identidade de sequências" com respeito às sequências de aminoácidos reveladas aqui, neste requerimento de patente, é definido como a percentagem de resíduos aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos de modo pareado com os resíduos aminoácido em uma sequência de referência, isto é, uma mo- lécula de anticorpo da presente revelação, depois de alinhar as se- quências e introduzir intervalos (gaps), caso necessário, de modo a obter a máxima percentagem de identidade de sequências, e não con- siderindo quaisquer substituições conservadoras como parte da identi- dade de sequências. Alinhamento para fins de determinação da per- centagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obti- do de vários modos que estão dentro do conhecimento da arte, por exemplo, usando software de computação disponível publicamente tais como software BLAST, ALIGN, ou Megalign (DNASTAR). As pes- Soas versadas na arte podem determinar parâmetros apropriadois pa- ra medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter máximo alinhamento sobre toda a extensão das sequências sendo comparadas. O mesmo é verdade para sequências de nucleotí- deos reveladas aqui, neste requerimento de patente.
[0057] O termo "variáveis" se refere às porções dos domínios de imu- noglobulina que apresentam variabilidade em sua sequência e que es- tão envolvidos na determinação da especificidade e da afinidade de ligação de um anticorpo em particular (isto é, o um ou mais "domínios variáveis"). A variabilidade não é distribuída homogeneamente por to- dos os domínios variáveis de anticorpos; é concentrada em sub- domínios de cada uma das regiões variáveis de cadeias pesada e le- ve. Estes sub-domínios são denominados "regiões hipervariáveis”, "H- VR," ou "HV," ou "regiões determinantes de complementaridade" (C- DRs). As porções mais conservadas (isto é, não-hipervariáveis) dos domínios variáveis são denominadas as regiões de "framework" (FR) (regiões de “estrutura”). Cada um dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve que ocorrem naturalmente incluem quatro regiões FR, largamente adotando uma configuração de B-sheet, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam loops conectando, e em al- guns casos formando parte, da estrutura de B -sheet. As regiões hiper- variáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximitade pela FR e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação antigênica (vide Kabat e outros ., vide abaixo). Geralmente, imunoglobulinas que ocorrem naturalmente incluem seis CDRs (vide abaixo); três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em imunoglobulinas que ocorrem naturalmente, H3 e L3 apresentam a maior diversidade das seis CDRs, e acredita-se que H3 em particular desempenhe um papel único por conferir especificidade fina às imunoglobulinas. Os domínios constantes não estão diretamen- te envolvidos em ligação de antígeno, mas apresentam várias funções efetoras, tais como, por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpo e ativação do complemento.
[0058] As correspondentes cadeia pesada mu, cadeia pesada gama, cadeia pesada alfa, cadeia pesada delta, cadeia pesada épsilon, ca- deia leve lâmbda ou cadeia leve cápa de imunoglobulina podem ser de qualquer espécie, tal como uma espécie de mamífero, incluindo uma espécie de roedor, um anfíbio, por exemplo, da subclasse Lissamphi- bia que inclui por exemplo, sapos, rãs, salamandras ou tritões ou uma espécie de invertebrado. Exemplos de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, um rato, um camundongo, um coelho, um porquinho da índia, um esquilo, um hamster, um ouriço, um ornitorrinco, um pika americano, um tatu, um cão, um lemur, uma cabra, um porco, uma va- ca, um gambá, um cavalo, um morcego, uma marmota, um orangotan- go, um macaco rhesus, um macaco barrigudo, um macaco, um chim- panzé, um mico (saguinus oedipus), um sagui ou um humano.
[0059] O termo "imunoglobulina" se refere a uma glicoproteína que in-
clui no mínimo duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) li- gadas por ligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação antigênica da mesma. Cada cadeia pesada tem uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui, neste requerimento de patente, como Vy4) e uma região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades a região constante de cadeia pesada inclui três domínios, Cy, Chu2 e Cha. Cada cadeia leve tem uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui, neste requerimento de patente, como V,) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve inclui um domínio, Cr. As regiões V"y e V, pdoem ser adicionalmente subdivididas em re- giões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). As CDRs con- têm a maior parte dos resíduos responsáveis por interações especiífi- cas do anticorpo com o antígeno. Cada V, e V, tem três CDRs e qua- tro FRs, arranjadas do término amino para o término carbóxi na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesdas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um epitope de um antígeno.
[0060] Cada cadeia leve de uma imunoglobulina inclui um domínio va- riável (V) (VL) N-terminal e um domínio constante (C) (CL). Cada ca- deia pesada inclui um domínio V N-terminal (VH), três ou quatro domí- nios C (CHs), e uma região de articulação. Uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção do mesmo modo contém estes domínios e regiões (muito embora um sítio de ligação da molécula de anticorpo biespecífico seja formado somente por um fragmento Fv de cadeia ú- nica).
[0061] Uma imunoglobulina, quando usado aqui, neste requerimento de patente, é tipicamente uma proteína glicosilada tetramérica com- posta de duas cadeias leves (L) de aproximadamente 25 kDa cada e duas cadeias pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada. Dois tipos de cadeia leve, denominados lâmbda e cápa, podem ser encon- trados em imunoglobulinas. Dependendo da sequência de aminoáci- dos do domínio constante de cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas para cinco classes principais: A, D / E GeM,e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (iso- tipos), por exemplo, I9G1, IgG2, I9G3, IgG4, IgA1, e I9gA2. Uma imu- noglobulina IgM consiste de 5 da unidade de heterotetrâmero básica junto com um polipeptídeo adicional denominado uma cadia J, e con- tém 10 sítios de ligação antigênica, ao passo que imunoglobulinas IgA contêm de 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas as quais podem polimerizar para formar montagens polivalentes em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150.000 daltons.
[0062] O termo "aminoácido" ou "resíduo aminoácido" se refere a um ácido o- ou B-amino carboxílico.
[0063] Quando usado em conexão com uma proteína ou com um pep- tídeo, o termo "aminoácido" ou "resíduo aminoácido" tipicamente se refere a um ácido a-amino carboxílico tendo sua definição reconehcida na arte tal como um aminoácido selecionado entre o grupo que consis- te de: L-alanina (Ala ou A); L-arginina (Arg ou R); L-asparagina (Asn ou N); L-aspártico ácido (Asp ou D); L-cisteína (Cys ou C); L-glutamina (GEm ou OQ); ácido L-glutâmico (Glu ou E); glicina (Gly ou G); L- histidina (His ou H); L-isoleucina (ILE ou |): L-leucina (Leu ou L); L- lisina (Lys ou K); L-metionina (Met ou M); L-fenilalanina (Phe ou F); L- prolina (Pro ou P); L-serina (Ser ou S); L-treonina (Thr ou T); L- triptofano (Trp ou W); L-tirosina (Tyr ou Y); e L-valina (Val ou V), em- bora aminoácidos modificados, sintéticos, ou raros tais como por e- xemplo, taurina, ornitina, selenocisteína, homocistina, hidroxiprolina, tioprolina, iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, ornitina, citrullina, canavanina,
5-hidroxitriptofano, carnosina, cicloleucina, 3,4-dihidróxi fenilalanina, N- acetilcisteína, prolinol, alilglicina ou ácido acetidina-2-carboxílico tam- bém possam ser usados conforme desejado. Geralmente, os aminoá- cidos podem ser agrupados como tendo uma cadeia lateral não polar (por exemplo, Ala, Cys, ILE, Leu, Met, Phe, Pro, Val); uma cadeia late- ral negativamente carregada (por exemplo, Asp, Glu); uma cadeia late- ral positivamente carregada (por exemplo, Arg, His, Lys); ou uma ca- deia lateral polar não carregada (por exemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, e Tyr).
[0064] O termo "epitope", também conhecido como o “determinante antigênico”, se refere à porção de um antígeno à qual um anticorpo ou receptor de células T especificamente liga, deste modo formando um complexo. Portanto, o termo "epitope" inclui qualquer molécula ou pro- teína determinante capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou a um receptor de células T. O um ou mais sítios de ligação (paráto- pe) de uma molécula de anticorpo descrita aqui, neste requerimento de patente, pode especificamente ligar a / interagir com epitopes con- formacionais ou contínuos, os quais são únicos para a estrutura alvo. Determinantes epitópicos geralmente consistem de agrupamentos su- perficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm três características estru- turais dimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Em algumas modalidades, determinantes epitópicos in- cluem agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil, ou sulfonil, e, em determinadas modalidades, podem ter três características estru- turais dimensionais específicas, e/ou características de carga especiífi- cas. Com respeito a antígenos polipeptídicos um epitope conformacio- nal ou descontínuo é caracterizado pela presença de dois ou mais re- síduos aminoácido distintos, separados na sequência primária, mas unindo a uma estrutura consistente sobre a superfície da molécula quando o polipeptídeo dobra na proteína nativa / no antígeno native (Sela, M., Science (1969) 166, 1365-1374; Laver, W.G., e outros . Cell (1990) 61, 553-556). Os dois ou mais resíduos aminoácido distindo que contribuem para o epitope podem estar presentes sobre seções separadas de uma ou mais cadeias de polipeptídeo.
Estes resíduos se juntam sobre a superfície da molécula quando a uma ou mais cadeias de polipeptídeo dobram em uma estrutura tridimensional de modo a constituir o epitope.
Em contraste, um epitope contínuo ou linear con- siste de dois ou mais resíduos aminoácido distintos, os quais estão presentes em um único segmento linear de uma cadeia de polipeptí- deo.
Como um exemplo ilustrativo, um epitope CD3 "contexto- dependente" se refere à conformação do referido epitope.
Um epitope contexto-dependente semelhante, localizado sobre a cadeia épsilon de CD3, pode somente desenvolver sua conformação correta se for em- butido dentro do resto da cadeia épsilon e mantido na posição correta por heterodimerização da cadeia épsilon com ou cadeia gama ou delta de CD3. Em contraste com isto, um epitope CD3 contexto- independente pode ser um polipeptídeo de 1 a 27 resíduos aminoácido N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo de CD3 épsilon.
Ge- ralmente, os epitopes podem ser lineares na natureza ou podem ser um epitope descontínuo.
Portanto, conforme usado aqui, neste reque- rimento de patente, o termo "epitope conformacional" se refere a um epitope descontínuo formado por uma relação espacial entre aminoá- cidos de um antígeno diferente de uma série não quebrada de amino- ácidos.
O termo “epitope” também inclui um determinante antigênico de um hapteno, o qual é conhecido como uma molécula pequena que pode servir como um antígeno apresentando um ou mais epitopes re- conehcidos imunologicamente depois de ligação a matéria maior tal como uma molécula maior, por exemplo, uma proteína.
[0065] Diz-se que um anticorpo ou uma molécula de anticorpo / um fragmento de anticorpo liga especificamente a um antígeno quando reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Diz-se que anticorpos "ligam ao mesmo epitope" se os anticorpos efetuarem competição cruzada de modo que somente um anticorpo pode ser ligar ao epitope em um dado ponto do tempo, isto é, um anticorpo evita a ligação ou o efeito de modulação do outro.
[0066] O termo “específico” neste contexto, ou "reconhecendo especi- ficamente", também usado como “direcionado para”, significa de acor- do com esta invenção que a molécula de anticorpo é capaz de especi- ficamente interagir com e/ou ligar a no mínimo dois, por exemplo, no mínimo três ou no mínimo quatro aminoácidos de um epitope mas não liga essencialmente a outro epitope ou a outro antígeno. A ligação re- ferida pode ser exemplificada pela especificidade de um "princípio de chave e fechadura ". Acredita-se que a ligação específica seja efetua- da por motivos específicos na sequência de aminoácidos da região de ligação do anticorpo, e o anticorpo e o epitope ou o antígeno ligam um ao outro em consequência de sua estrutura primária, secundária ou terciária bem como em consequência de modificações secundárias da referida estrutura. A interação específica do sítio de interação com epi- tope / antígeno com seu epitope / antígeno específico pode resultar também em uma ligação simples do referido sítio ao antígeno. Além do mais, a interação específica do sítio de interação antigênica com seu epitope / antígeno específico pode resultar alternativamente na inicia- ção de um sinal, tal como por exemplo, devido à indução de uma mo- dificação da conformação do antígeno ou a uma oligomerização do antígeno.
[0067] Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a afini- dade de aligação é maior do que 10º M. Em particular, a ligação é considerada específica quando a afinidade de aligação é de cerca de
10º a 10º M (Kp), ou de cerca de 10º a 10º M ou mesmo maior. Portanto, moléculas de anticorpo com uma afinidade do primeiro sítio de ligação e/ou do segundo sítio de ligação na faixa picomolar (com um Kp de 10? M) também são englobadas na presente invenção. Ca- so necessário, a ligação inespecífica de um sítio de ligação pode ser reduzida sem substancialmente afetar a ligação específica mas vari- ando as condições de ligação.
[0068] Em algumas modalidades um antígeno ao qual um anticorpo de acordo com a invenção liga é um antígeno que é incluído na matriz extracelular ou é um antígeno de superfície celular. Em algumas mo- dalidades um antígeno ao qual um anticorpo de acordo com a inven- ção liga é um antígeno associado a tumor. Entende-se que um antíge- no associado a tumor semelhante pode ser incluído na matriz extrace- lular ou pode ser um antígeno de superfície celular.
[0069] O termo “matriz extracelular” se refere à região tecidual de um animal multicelular, incluindo um humano que é encontrado no espaço intercelular, isto é, entre as células do tecido respectivo. A matriz ex- tracelular é em grande parte uma rede de proteínas tais como coláge- nos fibrilares e não fibrilares ou elastina, de glicoproteínas tais como laminina ou fibronectina, de proteoglicanos, tais como sulfato de con- droitina ou sulfato de ceratano e de polissacarídeos tais como ácido hialurônico. A matriz extracelular serve entre outros na segregação de diferentes tecidos uns dos outros ou na regulação da comunicação in- tercelular. Em algumas modalidades um antígeno associado a tumor pode ser expresso parcialmente ou exclusivamente na matriz extrace- lular de um tumor.
[0070] O termo "antígeno de superfície celular" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma molécula que é apre- sentada sobre a superfície de uma célula. Tipicamente uma molécula semelhante está localizada em ou sobre a membrana plasmática da célula de tal modo que no mínimo parte desta molécula permanece acessível a partir do ambiente, isto é, do exterior da célula.
Uma molé- cula respectiva consiste de ou inclui tipicamente porções de sacarídeo e/ou aminoácido.
Um exemplo ilustrativo de uma molécula da superfí- cie celular, as qual está localizada na membrana plasmática, é uma proteína transmembrana que, em sua conformação tridimensional, tem regiões de hidrofilicidade e de hidrofobicidade.
Uma ou mais regiões hidrofóbicas possibilitam que a molécula da superfície celular seja em- butida, ou inserida na membrana plasmática hidrofóbica da célula ao passo que regiões hidrofílicas da proteína se estendem sobre um ou outro lado da membrana plasmática para dentro do citoplasma e do espaço extracelular, respectivamente.
Exemplos de uma molécula da superfície celular localizada sobre a membrana plasmática incluem, mas não estão limitadas a, uma proteína com um resíduo cisteína mo- dificado pós-translacionalmente carregando um grupamento palmitoíla, uma proteína modificada em um resíduo cisteína C-terminal carregan- do um grupamento farnesil ou uma proteína modificada no C-término carregando uma âncora de glicosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estes gru- pamentos possibilitam a fixação covalente de proteínas à superfície externa da membrana plasmática, onde permanecem acessíveis para reconhecimento por moléculas extracelulares tais como anticorpos.
Exemplos de antígenos de superfície celular incluem uma molécula de receptor da superfície celular tal como um receptor acoplado à proteí- na G (por exemplo, o receptor” B adrenérgico), um receptor de tirosina quinase (tais como EGFR, EGFRvIlli Her2/neu, HER2/c-neu, PDGFRao, ILR-1, TNFR, CD30, CD33 ou GMCSFR), um receptor de membrana com atividade de tirosina quinase associada (tais como IL6R ou LIFR) ou um receptor de membrana com atividade de Ser/Thr quinase (tal como TGF B R), para nomear somente uns poucos exem- plos.
[0071] Exemplos de um antígeno associado a tumor que é incluído na matriz extracelular incluem, mas não estão limitados a, um proteogli- cano tal como Proteoglicano 4 de Sulfato de Condroitina associado a Melanoma (CSPG4) ou CD44v6, incluindo uma mucina tal como Muc- 1 ou uma enzima ligada à membrana tal como anidrase carbônica IX (CAIX). Exemplos para semelhantes antígenos são Tenascina e a pro- teína de ativação de fibroblastos (FAP).
[0072] O termo "molécula de anticorpo isolada" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma molécula de anticorpo que foi identificada e separada e/ou recuperada a partir de um compo- nente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural é matéria que interferiria com utilizações de diagnós- tico ou terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormô- nios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas modalidades a molécula de anticorpo é purificada até mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, tal como mais de 99% em peso. Em algumas modalidades a molécula de anticorpo é purificada até um grau suficiente para obter no mínimo 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por uso de um sequenciador de copo de rotação. Em algumas modalidades o anticorpo é purificado até a homogeneidade tal como avaliado por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, de modo preferencial, tintura de prata. Uma molécula de anticorpo isolada em algumas modalidades pode estar presente dentro de células recombinantes com um ou mais componentes do ambiente natural do anticorpo não estando presentes. Tipicamente um anticorpo isolado é preparado por no mínimo uma etapa de purifica- ção.
[0073] Os termos "V4" e "V," são usados aqui, neste requerimento de patente, para se referir ao domínio variável de cadeia pesada e ao domínio variável de cadeia leve respectivamente de uma imunoglobu- lina. Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste de uma região de "framework" interrompida por três regiões hipervariáveis. Deste modo, o termo "região hipervariável" se refere aos resíduos aminoácido de um anticorpo os quais são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável inclui resíduos aminoá- cido de uma "Região Determinante de Complementaridade" ou "CDR". Existem três CDRs de cadeias pesadas e três de cadeia leve (ou regi- ões CDR) na porção variável de uma imunoglobulina. Deste modo, "CDRs" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refe- re a todas as três CDRs de cadeia pesada (CDRH1, CDRH2 e CD- RH3), ou a todas as três CDRs de cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e C- DRL3) ou tanto a todas as CDRs de cadeia pesada e todas de cadeia leve, caso apropriado. Três CDRs compõem o caráter de ligação de uma região variável de cadeia leve e três compõem o caráter de liga- ção de uma região variável de cadeia pesada. As CDRs determinam a especificidade antigênica de uma molécula de imunoglobulina e são separadas por sequências de aminoácidos que incluem regiões de framework ou de andaimes (scaffolding). Os exatos limites e exten- sões de CDR relativos à definição estão sujeitos a diferentes sistemas de classificação e de numeração. A estrutura e dobra de proteína do anticorpo pode significar que outros resíduos são considerados parte da região de ligação antigênica e seria entendido como tal por uma pessoa versada. As CDRs proporcionam a maioria dos resíduos de contato para a ligação da imunoglobulina ao antígeno ou epitope.
[0074] CDR3 é tipicamente a maior fonte de diversidade molecular dentro do sítio de ligação do anticorpo. H3, por exemplo, pode ser tão curto quanto dois resíduo aminoácido ou maior do que 26 aminoáci- dos. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são de conhecimento geral na arte. Para uma revisão da estrutura de anticorpos, vide Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow e outros ., 1988. Uma pessoa versada na arte reconhecerá que cada estrutura de subunidade, por exemplo, uma estrutura de CH, VH, CL, VL, CDR, FR, inclui fragmentos ativos, por exemplo, a porção da su- bunidade VH, VL, ou CDR liga ao antígeno, isto é, o fragmento de |li- gação antigênica, ou, por exemplo, a porção da subunidade CH que liga a e/ou ativa, por exemplo, um receptor de Fc e/ou complemento. As CDRs tipicamente se referem às CDRs de Kabat, conforme de- scrito em Sequences of Proteins of immunological Interest, US De- partment of Health and Human Services (1991), eds. Kabat e outros . Outro padrão para caracterização do sítio de ligação antigênica é se referir aos loops hipervariáveis conforme descrito por Chothia. Vide, por exemplo, Chothia, e outros . (1992; J. Mol. Biol. 227:799-817; and Tomlinson e outros . (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Ainda outro pa- drão é a definição da ADM usada pelo software de modelagem de anti- corpo da Oxford Molecular's ADM. Vide, de modo geral, por exemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Do- mains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kon- termann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Modalidades descritas com respeito às CDRs de Kabat podem ser implementadas alternativamen- te usando relações descritas similares com respeito a loops hipervari- áveis de Chothia ou aos loops definidos pela ADM.
[0075] Resíduos da "Região de Framework" ou "FR" são os resíduos de domínio variável diferente da região hipervariável. As sequências das regiões de framework de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. Deste modo, uma "região de framework humana" é uma região de framework que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, geralmente 90 a 95% ou mais) à região de framework de uma imunoglobulina humana que ocorre naturalmente. A região de framework de um anticorpo, isto é as regiões de framework combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDR's. As CDR's são essencialmente responsáveis por ligação a um epitope de um antíge- no.
[0076] Os termos "Fab", "região Fab", "porção Fab" ou “fragmento Fab" são entendidos como definindo um polipeptídeo que inclui um domínio de imunoglobulina Vy, um Cy1, um Vi, e um C,. Fab pode se referir a esta região em isolamento, ou a esta região no contexto de uma molé- cula de anticorpo de acordo com a invenção, bem como uma imuno- globulina de extensão total ou um fragmento de imunoglobulina. Tipi- camente uma região Fab contém uma cadeia leve inteira de um anti- corpo. Uma região Fab pode ser tomada para definir “um braço” de uma molécula de imunoglobulina. Contém a porção de ligação de epi- tope daquela Ig. A região Fab de uma imunoglobulina que ocorre natu- ralmente pode ser obtida como um fragmento proteolítico por uma di- gestão por papaína. Uma "porção F(ab');" é o fragmento proteolítico de uma imunoglobulina digerida por pepsina. Uma " porção Fab' "é o produto resultante de redução das ligações de dissulfeto de uma por- ção F(ab').. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "Fab", "região Fab", "porção Fab" ou “fragmento Fab" podem incluir adicionalmente uma região de articulação que define a extremi- dade C-terminal do braço de anticorpo (cf. acima). Esta região de arti- culação corresponde à região de articulação encontrada C- terminalmente do domínio CH1 dentro de uma imunoglobulina de ex- tensão total na qual os braços da molécula de anticorpo podem ser tomados para definir um Y. O termo região de articulação é usado na arte porque uma imunoglobulina tem alguma flexibilidade nesta região.
[0077] Um “Fv” ou fragmento Fv” consiste de somente os domínios V, e V4y de um “único braço” de uma imunoglobulina. Deste modo um "Fv"
é o mínimo fragmento de anticorpo o qual contém um sítio de reco- nhecimento e de ligação antigênica completo. Um fragmento Fv “de duas cadeias” consiste de um dímero de um domínio variável de ca- deia pesada e um domínio variável de cadeia leve em firme associa- ção não-covalente. Uma espécie Fv de cadeia única (scFv) inclui um domínio V, e um domínio VL de uma imunoglobulina, com estes domí- nios estando presentes em uma única cadeia de polipeptídeo na qual são ligados de modo covalente um ao outro por um encadeador de peptídeo flexível. Tipicamente, em um fragmento scFv os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada se associam em uma es- trutura dimérica análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. Em fragmentos Fv de cadeia única, é possível ou ter o domínio variá- vel da cadeia leve arranjado no N-término da cadeia de polipeptídeo única, seguido pelo encadeador e o domínio variável da cadeia pesada arranjado no C-término da cadeia de polipeptídeo ou vice versa, tendo o domínio variável da cadeia pesada arranjado no N-término e o domí- nio variável da cadeia leve no C-término com o encadeador de peptí- deo arranjado no meio. O encadeador de peptídeo pode ser qualquer encadeador flexível conhecido na arte, por exemplo, produzido a partir de resíduos glicina e serina. Também é possível adicionalmente esta- bilizar a associação dos domínios entre o domínio V, e o domínio VL introduzindo ligações de dissulfeto em regiões de framework conser- vadas (vide Reiter e outros . Stabilization of the Fv fragments in re- combinant immunotoxins by disulfide bonds engineered into conserved framework regions, Biochemistry 1994, 33, 6551-5459). Os fragmentos scFv referidos também são conhecidos como fragmentos scFv estabi- lizados com dissulfeto (ds-scFv).
[0078] O termo "região Fc" ou “fragmento Fc” é usado aqui, neste re- querimento de patente, para definir uma região de uma cadeia pesada de imunoglobulina C-terminal, incluindo regiões Fc de sequência nati-
va e regiões Fc variantes. A parte Fc media a função efetora de anti- corpos, por exemplo, a ativação do sistema do complemento e de cé- lulas imunes efetoras trazendo receptores de Fc, tais como células NK. Em IgG humana moléculas, a região Fc é produzida por clivagem por papaína N-terminal para Cys226. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender de um resíduo aminoácido na posição Cys226, ou a partir de Pro230, até o término carboxila da mesma. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração da União Européia) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante produção ou purificação da molécula de anticorpo, ou por manipulação de modo recombinante do ácido nucleico codificando uma cadeia pesada do anticorpo molécula de anticorpo. Por conseguinte, uma composição de anticorpos intactos pode incluir populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos com nenhum resíduo K447 re- movido, e populações de anticorpos tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Regiões Fc de sequência nativa adequa- das para uso nos anticorpos da invenção incluem IgG1, IgG2 (I9G2A, I9gG2B), IgG3 e I9gG4 de mamífero, por exemplo, humana ou murina. A região Fc contém dois ou três domínios constantes, dependendo da classe do anticorpo. Em modalidades onde a imunoglobulina é uma IgG a região Fc tem um domínio CH2 e um domínio CH3.
[0079] Uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção tem du- as cadeias, uma cadeia mais curta, a qual pode em algumas modali- dades ser uma cadeia leve, e uma cadeia principal, a qual pode em algumas modalidades também ser tratada como a cadeia pesada. À molécula de anticorpo é geralmente um dímero destas duas cadeias. Com base nos domínios incluídos em uma molécula de anticorpo da invenção, a molécula de anticorpo pode ser tomada para ter um frag-
mento Fab, o qual geralmente inclui uma região de articulação, um domínio CH2 e um fragmento Fv de cadeia única. Em algumas moda- lidades a molécula de anticorpo também tem um domínio CH3, geral- mente arranjado C-terminalmente do domínio CH2. Em algumas mo- dalidades a disposição dos domínios de um anticorpo da invenção cor- responde à disposição de domínios em uma imunoglobulina. Como dois exemplos, a cadeia mais curta de uma molécula de anticorpo da invenção pode ser um domínio VL no N-término e um domínio CL no C-término da cadeia mais curta, e a cadeia principal pode ter um do- mínio VH no N-término e um domínio CH1 C-terminalmente a esta. Em algumas modalidades a cadeia mais curta pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CH1 no C-término da cadeia mais curta. Em algumas modalidades a cadeia mais curta pode ter um domínio VH no N-término e um domínio CH1 no C-término da cadeia mais curta. Em algumas modalidades a cadeia mais curta pode ter um domínio VH no N-término e um domínio CL no C-término da cadeia mais curta. Em algumas modalidades a cadeia principal pode ter um domínio VL no N- término e um domínio CH1 C-terminalmente a esta. Em algumas mo- dalidades a cadeia principal pode ter um domínio VH no N-término e um domínio CL C-terminalmente a esta. Em algumas modalidades a cadeia principal pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CL C-terminalmente a esta.
[0080] A cadeia mais curta do anticorpo pode ser ligada à cadeia prin- cipal do anticorpo por meio de uma ou mais, incluindo duas ou três, ligações de dissulfeto. Uma ligação de dissulfeto respectiva pode defi- nir uma ponte entre um resíduo cisteína C-terminal da cadeia mais cur- ta e um resíduo cisteína dentro da região de articulação da cadeia principal do anticorpo.
[0081] Em uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção a re- gião C-terminal da cadeia principal pode ser definida por um fragmento
Fv de cadeia única. o C-término da cadeia principal pode em algumas modalidades ser definido pelo domínio VH do fragmento scFv. Em al- gumas modalidades o C-término da cadeia principal pode ser definido pelo domínio VL do fragmento scFv. Por conseguinte, o fragmento scFv pode em algumas modalidades ser acoplado ao domínio CH2 ou ao domínio CH3, caso presente, da cadeia principal através do domí- nio VH, por exemplo, a extremidade N-terminal do domínio VH. Em algumas modalidades o fragmento scFv pode ser acoplado ao domínio CH2 ou ao domínio CH3, caso presente, da cadeia principal através do domínio VL, por exemplo, a extremidade N-terminal do domínio VL. Em algumas modalidades o domínio CH2 da molécula de anticorpo ou o domínio CH3, caso presente, é ligado ao fragmento scFv através do domínio variável da cadeia leve (domínio VL) do fragmento scFv. Em algumas modalidades o domínio CH2 é ligado ao fragmento scFv atra- vés do domínio variável da cadeia pesada (domínio VH) do fragmento scFv.
[0082] O fragmento Fab de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção é em algumas modalidades ligado ao domínio CH2 através de um domínio de cadeia pesada do fragmento Fab. Por conseguinte, a cadeia principal do anticorpo pode ter um domínio de cadeia pesada tal como um domínio CH1 (acima), o qual é acoplado ao domínio CH2. Conforme explicado acima, um domínio CH1 respectivo pode ser aco- plado ao domínio CH2 através de uma região de articulação. O domí- nio de cadeia pesada do fragmento Fab respectivo pode em algumas modalidades ser arranjado no N-término da cadeia de polipeptídeo da cadeia principal do anticorpo. Em algumas modalidades o fragmento Fab de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção é ligado ao domínio CH2 através de um domínio de cadeia leve do fragmento Fab. Por conseguinte, a cadeia principal da molécula de anticorpo po- de ter um domínio de cadeia leve tal como um domínio CL, o qual é acoplado ao domínio CH2. Novamente, um domínio CL respectivo po- de ser acoplado ao domínio CH2 através de uma região de articula- ção. O domínio de cadeia leve do fragmento Fab respectivo pode em algumas modalidades ser arranjado no N-término da cadeia de poli- peptídeo da cadeia principal da molécula de anticorpo. De modo a evi- tar dimerização das moléculas em modalidades bivalentes (Fig. 1h a 1E e 1N) os resíduos cisteína na região de articulação proporcionando ligações de dissulfeto inter-cadeias podem ser permutados. Em moda- lidades tetravalentes (Figs. 1F a 1M) estes resíduos cisteína são pre- servados. Nestas modalidades a molécula de anticorpo pode ser, por conseguinte tomado para definir um dímero de uma molécula de anti- corpo bivalente, dimérico conforme descrito acima e cada cadeia prin- cipal e cada cadeia mais curta pode ser selecionada individualmente. Como um exemplo, a primeira das cadeias mais curtas pode ter um domínio VH no N-término e um domínio CL no C-término. A primeira cadeia principal pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CH1 C-terminalmente a esta. Além disso, a primeira cadeia principal pode ter um domínio CH2 e um domínio CH3, bem como um fragmen- to scFv C-terminal. O fragmento scFv pode ser acoplado ao domínio CH3 através do domínio VL. A segundas das cadeias mais curtas po- de ter um domínio VH no N-término e um domínio CH1 no C-término. A segunda cadeia principal pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CL C-terminalmente a esta. A segunda cadeia principal tam- bém pode ter um domínio CH2 e um domínio CH3, bem como um fragmento scFv C-terminal. O fragmento scFv pode ser acoplado ao domínio CH3 através do domínio VL.
[0083] Uma molécula de anticorpo tetramérica respectiva pode ser composta de duas moléculas de anticorpo diméricas que são ligadas uma à outra através de uma ou mais, tal como duas, ligações de dis- sulfeto. Uma ligação de dissulfeto semelhante pode definir uma ponte entre um resíduo cisteína da cadeia principal de uma primeira molécu- la de anticorpo dimérica e um resíduo cisteína da cadeia principal de uma segunda molécula de anticorpo dimérica. Tipicamente, os resí- duos cisteína respectivos são posicionados dentro da região de articu- lação da cadeia principal correspondente de cada molécula de anticor- po dimérica. Em algumas modalidades uma ou ambas as duas cadei- as principais, isto é, a cadeia principal da primeira molécula dimérica e a cadeia principal da segunda molécula dimérica de uma molécula de anticorpo tetramérica, têm um resíduo cisteína na posição de sequên- cia 226 e/ou na posição de sequência 229 de um domínio de articula- ção respectivo, em linha com a numeração Kabat [índice da União Eu- ropéia]. Em uma modalidade uma ligação de dissulfeto entre o domínio de articulação da primeira cadeia principal e um domínio de articulação da segunda cadeia principal é definido por no mínimo um de um resí- duo cisteína na posição de sequência 226 e um resíduo cisteína na posição de sequência 229 de um dos domínios de articulação, de a- cordo com a numeração Kabat [Índice da União Européia]. Em algu- mas modalidades uma molécula de anticorpo tetramérica pode ter uma ou mais ligações de dissulfeto ligando as regiões de articulação das duas cadeias principais das moléculas de anticorpo diméricas e uma ligação de dissulfeto ligando as regiões de articulação das duas cadei- as principais das moléculas de anticorpo diméricas. Em algumas mo- dalidades duas moléculas de anticorpo diméricas de uma molécula de anticorpo tetramérica de acordo com a invenção podem ser ligadas por meio de uma ligação de dissulfeto que é definida por um resíduo ciste- ína que é incluído no domínio CH2 da cadeia principal de uma primeira molécula de anticorpo dimérica e um resíduo cisteína que é incluído no domínio CH2 da cadeia principal de uma segunda molécula de anti- corpo dimérica.
[0084] Como um exemplo adicional, a primeira das cadeias mais cur-
tas pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CH1 no C- término. A primeira cadeia principal pode ter um domínio VH no N- término e C-terminalmente ligado a esta um domínio CL. Além disso, a primeira cadeia principal pode ter um domínio CH2 e um domínio CH3, bem como um fragmento scFv C-terminal. O fragmento scFv pode ser acoplado ao domínio CH3 através do domínio VH. A segunda das ca- deias mais curtas pode ter um domínio VL no N-término e um domínio CL no C-término. A segunda cadeia principal pode ter um domínio VH no N-término e um domínio CH1 C-terminalmente a esta. A segunda cadeia principal também pode ter um domínio CH2 e um domínio CH3, bem como um fragmento scFv C-terminal. O fragmento scFv pode ser acoplado ao domínio CH3 através do domínio VH.
[0085] Uma molécula de anticorpo "biespecífica" ou "bifuncional" é uma molécula de anticorpo que tem dois diferentes sítios de ligação de epitope / de antígeno, e, por conseguinte tem especificidades de liga- ção para dois epitopes alvo diferentes. Estes dois epitopes podem ser epitopes do mesmo antígeno ou de diferentes antígenos. Em contraste com isto um "anticorpo bivalente" pode ter sítios de ligação de especi- ficidade antigênica idêntica.
[0086] Um "anticorpo biespecífico" pode ser uma molécula de anticor- po que liga um antígeno ou um epitope sobre um de dois ou mais bra- ços de ligação, definido por um primeiro par de cadeia pesada e leve ou de cadeia principal e mais curta / menor (acima), e liga um diferente antígeno ou epitope sobre um segundo braço, definido por um segun- do par de cadeia pesada e leve ou de cadeia principal e menor. Uma modalidade semelhante de um anticorpo biespecífico tem dois braços de ligação de antígeno distintos, tanto em especificidade quanto se- quências de CDR. Tipicamente, um anticorpo biespecífico é monova- lente para cada antígeno ao qual liga. Um anticorpo biespecífico é uma molécula de anticorpo híbrido, a qual pode ter uma primeira região de ligação que é definida por uma primeira região variável de cadeia leve e uma primeira região variável de cadeia pesada, e uma segunda regi- ão de ligação que é definida por uma segunda região variável de ca- deia leve e uma segunda região variável de cadeia pesada. Em algu- mas modalidades uma destas regiões de ligação pode ser definida por um par de cadeia pesada / leve. Conforme explicado acima, no contex- to da presente invenção a molécula de anticorpo biespecífico tem um primeiro sítio de ligação, definido por regiões variáveis de uma cadeia principal e uma cadeia menor, e um segundo sítio de ligação diferente definido por uma região variável de um fragmento scFv que é incluído na cadeia principal da molécula de anticorpo.
[0087] Métodos de produzir uma molécula de anticorpo biespecífico são conhecidos na arte, por exemplo, conjugação química de dois an- ticorpos monoclionais diferentes ou, por exemplo, também conjugação química de dois fragmentos de anticorpo, por exemplo, de dois frag- mentos Fab. Alternativamente, moléculas de anticorpo biespecífico são produzidas de modo recombinante. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos se baseia na coexpressão de dois pares de cadeia H — cadeia L de imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm diferentes especificidades de ligação. Devido à seleção aleatória de cadeias H e L, uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes são produzidas das quais somente uma tem a es- pecificidade de ligação desejada. Uma abordagem alternativa envolve a fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação de- sejadas para região constante de cadeia pesada incluindo no mínimo parte da região de articulação, regiões CH2 e CH3. Em uma modali- dade a região CH1 contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve está presente em no mínimo uma das fusões. DNA codificando estas fusões, e caso desejado à cadeia L são inseridos em vetores de expressão separados e são em seguida cotransfectados em um orga-
nismo hospedeiro adequado. Contudo é possível inserir as sequências codificantes para duas ou todas as três cadeias em um vetor de ex- pressão.
[0088] A molécula de anticorpo biespecífico da invenção pode agir como um anticorpo monoclonal (MAb) com respeito a cada alvo. Em algumas modalidades o anticorpo é quimérico, humanizado ou total- mente humano.
[0089] Um "anticorpo duplo-especiífico", o qual pode ser, por exemplo, uma imunoglobulina de extensão total ou um constructo com proprie- dades de ligação semelhantes à imunoglobulina, é geralmente enten- dido como tendo dois braços de ligação, em particular braços definidos por um par de HC/LC, que podem ligar dois diferentes antígenos ou epitopes em cada um dos seus (vide a publicação do requerimento de patente internacional No. WO 02/02773). Por conseguinte uma proteí- na de ligação duplo-especiífica tem dois braços de ligação de antígeno idênticos, com especificidade idêntica e sequências de CDR idênticas, e é bivalente para cada antígeno ao qual liga.
[0090] O receptor de células T (TCR) é um receptor particular que está presente sobre a superfície celular de células T, isto é, linfócitos T. /n vivo o receptor de células T existe como um complexo de várias prote- íÍnas. O receptor de células T geralmente tem duas cadeias de peptí- deos separadas, tipicamente cadeias de receptores de células T alfa e beta (TOCRa e TCRB), sobre alguns receptores de células T gama e delta de células T (TORE e TORI). As outras proteínas no complexo são as proteínas CD3: heterodímeros CD3ey e CD3eô e, o mais impor- tante, um homodímero CD37, o qual tem um total de seis motivos |- TAM. Os motivos ITAM sobre o CD36 podem ser fosforilados por Lck e por sua vez recrutar ZAP-70. Lck e/ou ZAP-70 também podem fosfori- lar as tirosinas sobre muitas outras moléculas, sobretudo CD28, LAT e SLP-76, o que permite a agregação de complexos de sinalização em torno destas proteínas.
[0091] Uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção inclui uma cadeia leve com um domínio VL e um domínio CL. A molécula de anticorpo adicionalmente inclui uma cadeia principal que inclui um do- mínio VH, um domínio CH1 e uma região de articulação. O domínio VH é arranjado no N-término da cadeia principal, e o domínio VH é li- gado ao domínio CH1, ou diretamente ligado a este ou acoplado atra- vés de um peptídeo de ligação dee tipicamente 20 ou menos, incluindo ou menos resíduos aminoácido. A região de articulação é ligada à extremidade C-terminal do domínio CH1. Por conseguinte, a porção da molécula de anticorpo que é definida pela disposição adjacente do domínio VL, do domínio CL, do domínio VH e do domínio CH1 bem como da região de articulação, pode ser tomada para definir um frag- mento Fab e por conseguinte também é referida como tal aqui, neste requerimento de patente. Como em uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, o pareamento do domínio VH e do domínio VL juntos define um único sítio de ligação antigênica. Deste modo, o fragmento Fab de um anticorpo da invenção inclui o sítio de ligação para um pri- meiro antígeno. Em uma molécula de anticorpo respectiva a cadeia leve é ligada à cadeia principal por uma ligação de dissulfeto. Em al- gumas modalidades uma molécula de anticorpo de acordo com a in- venção é um dímero que inclui duas cadeias principais e duas cadeias leves conforme descrito acima (cf. também abaixo).
[0092] Em algumas modalidades a sequência de uma molécula de an- ticorpo biespecífico recombinante de acordo com a invenção pode ser comparada contra a sequência de IgG1, uma vez que a sequência da molécula de anticorpo de acordo com a invenção tem um certo grau de similaridade com a sequência de IgG1, conforme ilustrado adicional- mente abaixo. Em comparção com a sequência de aminoácidos de IgG1 de acordo com Kabat e outros . (1991, Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) uma cadeia principal de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção em algumas modali- dades inclui um domínio VH nas posições de aminoácido 1 a 117, um domínio CH1 nas posições 118 a 215, uma região de articulação nas posições 216 a 230 e um domínio CH2 nas posições 231 a 340.
[0093] De acordo com a sequência de aminoácidos da cadeia principal de um anticorpo da invenção, o fragmento Fab, que consiste do domí- nio VH, do domínio CH1 e da região de articulação, nestas modalida- des tipicamente abrange os aminoácidos 1 a 230. Dentro deste frag- mento Fab o domínio VH é tipicamente definido pelos aminoácidos 1 a 118, o domínio CH1 é definido pelos aminoácidos 119 a 216, e a regi- ão de articulação é definida pelos aminoácidos 217 a 231, de acordo com a numeração Kabat. A cadeia de anticorpos com a sequência de SEQ ID NO: 6 pode servir como um exemplo de uma modalidade res- pectiva. Em algumas modalidades a molécula de anticorpo de acordo com a invenção tem, nas posições 342 e seguintes da cadeia principal, uma sequência quimérica composta de um domínio VH e um domínio VL. Em algumas modalidades o domínio VL é arranjado para definir o domínio C-terminal desta sequência quimérica. Em algumas modali- dades o anticorpo de acordo com a invenção tem, em comparação com a sequência de aminoácidos de IgG1 de acordo com Kabat e ou- tros ., um domínio CH3 nas posições 342 a 447, seguido por uma se- quência quimérica composta de um domínio VH e um domínio VL C- terminal. Em semelhantes modalidades onde um domínio CH3 é inclu- ido no anticorpo de acordo com a invenção, este domínio CH3 é defi- nido pelos aminoácidos 342 a 448 de acordo com a sequência de ami- noácidos da cadeia principal da molécula de anticorpo. A sequência quimérica composta de um domínio VH e um domínio VL, que pode ser em algumas modalidades C-terminal (acima), nestas modalidades está localizada nas posições 449 e seguintes da sequência de amino- ácidos da cadeia principal da molécula de anticorpo.
[0094] Uma molécula de anticorpo biespecífico de acordo com a in- venção pode ter dois sítios de ligação de qualquer especificidade de- sejada. Em algumas modalidades um dos sítios de ligação é capaz de ligar um antígeno associado com tumor. Em algumas modalidades o sítio de ligação incluído no fragmento Fab é um sítio de ligação especií- fico para um antígeno de superfície associado a tumor. Em algumas modalidades o sítio de ligação incluído no fragmento Fv de cadeia úni- ca é um sítio de ligação específico para um antígeno associado com tumor tal como um antígeno de superfície associado a tumor.
[0095] O termo “antígeno de superfície associado a tumor” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um antígeno que é ou pode ser apresentado sobre uma superfície que está locali- zada sobre ou dentro de células tumorais. Estes antígenos podem ser apresentados sobre a superfície celular com uma parte extracelular, a qual é frequentemente combinada com uma parte transmembrana e citoplasmática da molécula. Estes antígenos em algumas modalidades podem ser apresentados somente por células tumorais e não por célu- las normais, isto é, não tumorais. Antígenos tumorais podem ser ex- clusivamente expressados sobre células tumorais ou podem represen- tar uma mutação tumoral específica comparadas com células não tu- morais. Em uma modalidade semelhante um antígeno respectivo pode ser referido como um antígeno tumor-específico. Alguns antígenos são apresentados tanto por células tumorais quanto por células não tumo- rais, os quais podem ser referidos como antígenos associados com tumor. Estes antígenos associados com tumor podem ser superex- pressados sobre células tumorais quando comparados com células não tumorais ou são acessíveis para ligação de anticorpo em células tumorais devido à estrutura menos compacta do tecido tumoral compa-
rado com tecido não tumoralo. Em algumas modalidades o antígeno de superfície associado a tumor está localizado sobre a vasculatura de um tumour.
[0096] Exemplos ilustrativos de um antígeno de superfície associado a tumor são CD10, CD19, CD20, CD22, CD33, tirosina quinase seme- lhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), proteoglicano 4 de sulfato de condroi- tina (CSPGA, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina associado com melanoma), Receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, CD133, IL3R, proteína de ativação de fibroblas- tos (FAP), CDCP1, Derlin1, Tenascina, frizzled 1-10, os antígenos vasculares VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-a (CD140a), PDGFR- B (CD140b) Endoglin, CLEC14, Tem1-8, e Tie2. Exemplos adicionais podem incluir A383, CAMPATH-1 (CDw52), Antí- geno carcinoembrionário (CEA), Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvIll, EBDCAM, Ep-CAM, Proteína de ligação de folato, G250, tiro- sina quinase semelhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1IR (CD115), HLA-DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (pro- teoglicano de sulfato de condroitina da superfície celular associado a melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), Antígeno prostático específico (PSA), e TAG-72. Exemplos de antígenos ex- pressados sobre a matriz extracelular de tumores são Tenascina e a proteína de ativação de fibroblastos (FAP).
[0097] Em algumas modalidades um dos sítios de ligação de uma mo- lécula de anticorpo de acordo com a invenção é capaz de ligar uma molécula de receptor específico para células T e/ou uma molécula de receptor específico para células natural killer (células NK). Um receptor específico para células T é o chamado “receptor de células T" (TCRs), o qual permite que uma célula T ligue a e, caso sinais adicionais este-
jam presentes, seja ativada por e responda a um epitope / antígeno apresentado por outra célula denominada a célula de apresentação de antígenos ou APC.
O receptor de células T é conhecido por se asse- melhar a um fragmento Fab de uma imunoglobulina que ocorre natu- ralmente.
Geralmente é monovalente, englobando cadeias a e É, em algumas modalidades engloba cadeias y e cadeias |) (acima). Por conseguinte, em algumas modalidades o TCR é TCR (alfa/beta) e em algumas modalidades é TCR (gama/delta). O receptor de células T forma um complexo com o coreceptor de células T CD3. CD3 é um complexo de proteína e é composto de quatro cadeias distintas.
Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3ô, e duas cadeias CD3£. Estas cadeias se associam com uma molécula conhecida como o receptor de células T (TCR) e a cadeia 6 gera um sinal de ativação em linfócitos T.
Deste modo, em algumas modalida- des um receptor específico para células T é o coreceptor de células T CD3. Em algumas modalidades um receptor específico para células T é CD28, uma proteína que também é expressa sobre células T.
CD28 pode proporcionar sinais coestimuladores, os quais são requeridos pa- ra ativação de células T.
CD28 tem funções importantes na prolifera- ção e na sobrevida de células T, na produção de citocinas, e no de- senvolvimento de células T helper tipo 2. Ainda um exemplo adicional de um receptor específico para células T é CD134, também denomi- nado Ox40. CD134/OX40 está sendo expressado depois de 24 a 72 horas após ativação e pode ser tomado para definir uma molécula co- estimuladora secundária.
Outro exemplo de um receptor de células T é 4-1BB capaz de ligação ao ligante 4-1BB-Ligand sobre células apre- sentando antígeno (APCs), por meio da qual é gerado um sinal coes- timulador para as células T.
Outro exemplo de um receptor encontrado predominantemente sobre células T é CD5, o qual também é encon- trado sobre células B em baixos níveis.
Um exemplo adicional de um receptor modificando funções de células T é CD95, também conhecido como o receptor Fas, o qual media sinalização apoptótica por ligante Fas expressado sobre a superfície de outras células. CD95 tem sido reportado para modular caminhos de sinalização direiconada por T- CR/CD3 em linfócitos T em repouso.
[0098] Um exemplo de uma molécula de receptor específico para célu- las NK é CD16, um receptor de Fc de baixa afinidade e NKG2D. Um exemplo de uma molécula de receptor que está presente sobre a su- perfície tanto de células T quanto de células natural killer (NK) é CD2 e membros adicionais da superfamília CD2. CD2 tem a capacidade de agir como uma molécula coestimuladora sobre células T e NK.
[0099] Em algumas modalidades o primeiro sítio de ligação da molécu- la de anticorpo liga um antígeno de superfície associado a tumor e o segundo sítio de ligação liga uma molécula de receptor específico para células T e/ou uma molécula de receptor específico para células natu- ral killer (NK). Em algumas modalidades o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga um entre A33, CAMPATH-1 (CDw52), Antí- geno carcinoembrionário (CEA), Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPGA, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina associ- ado com melanoma), CLEC14, Derlin1, Receptor do fator de cresci- mento epidermal (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIIl, EBCAM, Endodglin, Ep-CAM, Proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Proteína de liga- ção de folato, G250, tirosina quinase semelhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSFIR (CD115), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA- DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina da superfície celular associado a melanoma), Muc-1, antí- geno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno de célu- las-tronco da próstata (PSCA), Antígeno prostático específico (PSA),
TAG-72, Tenascina, Tem1-8, Tie2 e VEGFR2 (KDR/FLK1I), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-a (CD140a), PDGFR- B (CD140b), e o se- gundo sítio de ligação liga uma molécula de receptor específico para células T e/ou uma molécula de receptor específico para células natu- ral killer (NK). Em algumas modalidades o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga um antígeno de superfície associado a tu- mor e o segundo sítio de ligação liga um entre CD3, o receptor de cé- lulas T (TOR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95.
[00100] Em algumas modalidades o primeiro sítio de ligação da molé- cula de anticorpo liga uma molécula de receptor específico para célu- las T e/ou uma molécula de receptor específico para células natural killer (NK) e o segundo sítio de ligação liga um antígeno de superfície associado a tumor. Em algumas modalidades o primeiro sítio de liga- ção do anticorpo liga uma molécula de receptor específico para células T e/ou uma molécula de receptor específico para células natural killer (NK) e o segundo sítio de ligação liga um entre A33, CAMPATH-1 (CDw52), Antígeno carcinoembrionário (CEA), Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPGA, proteoglicano 4 de sulfato de con- droitina associado com melanoma), CLEC14, Derlin1, Receptor do fa- tor de crescimento epidermal (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIIl, Ep- CAM, Endoglin, Ep-CAM, Proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Proteína de ligação de folato, G250, tirosina quinase semelhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, recep- tor de I1L-2, IL83R, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina da superfície celular associado a melanoma), Muc-1, antígeno de mem- brana específico da próstata (PSMA), Antígeno prostático específico (PSA), TAG-72, Tenascina, Tem1-8, Tie2 e VEGFR. Em algumas mo- dalidades o primeiro sítio de ligação do anticorpo liga um entre CD3, o receptor de células T (TOR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95, e o segundo sítio de ligação liga um antígeno de superfície associado a tumor.
[00101] O termo "glicosilação" significa a fixação de oligossacarídeos (carboidratos contendo doias ou mais açúcares simples ligados juntos, por exemplo, a partir de dois até cerca de doze açúcares simples liga- dos juntos) a uma glicoproteína. As cadeias laterais de oligossacarídeo são tipicamente ligadas à espinha dorsal da glicoproteína através de ou ligação de N ou de O. Os oligossacarídeos de anticorpos revelados aqui, neste requerimento de patente, ocorrem geralmente são anexa- dos a um domínio CH2 de uma região Fc como oligossacarídeos liga- dos por N. "Glicosilação N-ligada" se refere à anexação da porção de carboidrato a um resíduo asparagina em uma cadeia de glicoproteína. O técnico versado reconhecerá que, por exemplo, cada um de domí- nios CH2 de IgG1, IgG2a, IgG2b e I9gG3 murinas bem como de IgG1, I9G2, I9G3, IgG4, IgA e IgD humanas têm um único sítio para glicosi- lação N-ligada no resíduo 297.
[00102] Sequências de domínios ou regiões incluídas em uma molécu- la de anticorpo de acordo com a invenção podem ser sequências de qualquer espécie desejada. Dependendo do uso subsequente da mo- lécula de anticorpo, não obstane, pode ser desejável em algumas mo- dalidades, introduzir alterações que previnem efeitos colaterais indese- jáveis causados pelo anticorpo. A utilização de anticorpos não huma- nos intactos no tratamento de doenças ou distúrbios humanos acarreta conjuntamente o potencial dos problemas de imunogenicidade atual- mente bem estabelecidos, o que significa que o sistema imune do pa- ciente pode reconhecer o anticorpo intacto não humano como não próprio e montar uma resposta neutralizante. Isto é particularmente evidente depois de múltipla administração do anticorpo não humano a um paciente humano. Várias técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para superar estes problemas e geralmente envolvem a re- dução da composição de sequências de aminoácidos não humanos no anticorpo intacto ao mesmo tempo que conservando a relativa facilida- de de obteção de anticorpos não-humanos a partir de um animal imu- nizado por exemplo, camundongo, rato ou coelho. Em geral duas a- bordagens têm sido usados para obter isto. A primeira são anticorpos quiméricos, 09s quais geralmente têm um domínio variável não huma- no (por exemplo, de roedor tal como camundongo) fundido a uma re- gião constante humana. Como o sítio de ligação antigênica de um an- ticorpo é definido por resíduos dentro dos domínios variáveis, o anti- corpo quimérico conserva sua afinidade de ligação para o antígeno mas adquire as funções efetoras da região constante humana e por- tanto são capazes de realizar funções efetoras tal como descrito aci- ma. Anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando méto- dos de DNA recombinante. DNA codificando os anticorpos (por exem- plo, cDNA) é isolado e sequenciado usando procedimentos conven- cionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são ca- pazes de ligar especificamente a genes codificando as cadeias H e L do anticorpo da invenção. Células de hibridoma servem como uma fonte típica de semelhante DNA. Uma ve3z isolado, o DNA é colocado em vetores de expressão os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS, células CHO ou células de mieloma que não produzem de modo diverso proteína imu- noglobulina para obter a síntese do anticorpo. O DNA pode ser modifi- cado substituindo a sequência codificante para cadeias L e H humanas pelas correspondente regiões constantes H e L não-humanas, por e- xemplo, murinas (vide por exemplo, Morrison; PNAS [1984] 81, 6851).
[00103] A segunda abordagem envolve a geração de anticorpos hu- manizados em que o conteúdo não humano do anticorpo é reduzido por humanização dos domínios variáveis. Duas técnicas para humani-
zação têm ganhado popularidade.
A primeiro é humanização por en- xertação de CDR.
CDRs definem loops (acima) e a especificidade de ligação de antígeno de um anticorpo é essencialmente definida pela topografia e pelas características químicas da superfície de sua CDR.
Estas características por sua vez são determinadas pela conformação das CDRs individuais, pela disposição relativa das CDRs, e pela natu- reza e pela disposição das cadeias laterais dos resíduos incluindo as CDRs.
Uma grande diminuição na imunogenicidade pode ser obtida por enxertação somente das CDRs de anticorpos um não humano, por exemplo, murino, (anticorpos do "doador") sobre regiões humanas de framework ("framework do aceitador") e constantes (vide Jones e ou- tros (1986) Nature 321, 522-525 e Verhoeyen M e outros (1988) Sci- ence 239, 1534-1536). No entanto, a enxertação de CDR per se pode não resultar na completa retenção das propriedades de ligação de an- tígeno e frequentemente é visto que alguns resíduos de framework (algumas vezes referidos como "retro mutações") do anticorpo doador precisam ser preservados na molécula humanizada caso se deseje recuperar importante afinidade de ligação de antígeno (vide Queen C e outros (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M e outros (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, domínios variáveis humanos apresentando a maior homologia de sequência com o anticorpo doador não humano são escolhidos entre um banco de dados de modo a proporcionar a estrutura humana (FR). A seleção de FRs humanas pode ser feita ou a partir de anticorpos de consenso humanos ou de anticorpos humanos individuais.
Caso necessário resíduos chave do anticorpo doador são substituídos na estrutura aceitadora humana de modo a preservar as conformações de CDR, modelagem computacional do anticorpo pode ser usada para ajudar a identificar os resíduos estruturalmente impor- tantes referidos.
Vide o requerimento de patente internacional No.
WO99/48523, por exemplo.
[00104] Alternativamente, humanização pode ser obtida por um pro- cesso de "veneering" (revestimento). Uma análise estatística de domí- nios variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina única huma- na e murina revelaram que os precisos pafrões de resíduos expostos são diferentes em anticorpos humanos e murinos, e a maioria das po- sições de superfície individuais têm uma forte preferência por um pe- queno número de diferentes resíduos (vide Padlan E. A. e outros ; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 and Pedersen J. T. e outros (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Portanto é possível reduzir a imunogenici- dade de um Fv não humano substituindo resíduos expostos em suas regiões de framework que diferem daqueles geralmente encontrados em anticorpos humanos. Como a antigenicidade de proteína pode ser correlacionada com a acessibilidade superficial, a substituição dos re- síduos de superfície pode ser suficiente para tornar o domínio variável de camundongo "invisível" para o sistema imune humano (vide tam- bém Mark G. E. e outros (1994) em Handbook of Experimental Phar- macology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134). Este procedimento de humanização é referido como "veneering" porque somente a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suporte permanecem intocados.
[00105] Uma molécula de anticorpo da invenção pode ser produzida usando qualquer sistema de expressão conhecido e bem estabelecido e tecnologia de cultura de células recombinantes, por exemplo, por expressão em hospedeiros bacterianos (sistemas procarióticos), ou sistemas eucarióticos tais como leveduras, fungos, células de inseto ou células de mamífero. Uma molécula de anticorpo da presente in- venção pode ser produzida em organismos transgênicos tais como uma cabra, uma planta ou um camundongo transgênico XENOMOU- SE, uma cepa de camundongo manipulada que tem grandes fragmen- tos dos loci de imunoglobulina humana e é deficiente em produção de anticorpos de camundongo. Um anticorpo também pode ser produzido por síntese química.
[00106] Para produção recombinante de uma molécula de anticorpo da invenção tipicamente um polinucleotídeo codificando o anticorpo é iso- lado e inserido em um vetor replicável tal como um plasmídeo para posterior clonagem (amplificação) ou expressão. Um exemplo ilustrati- vo de um sistema de expressão adequado é um sistema de glutamato sintetase (tal como vendido pela Lonza Biologics), com a célula hos- pedeira sendo, por exemplo, CHO ou NSO. Um polinucleotídeo codifi- cando o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado usando pro- cedimentos convencionais. Vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomas dos quais plasmídeos são uma modalidade típica. Geralmente os vetores referi- dos incluem adicionalmente uma sequência de sinal, origem de repli- cação, um ou mais genes marcadores, um elemento reforçador, um promotor e sequências de terminação de transcrição operavelmente ligadas ao polinucleotídeo de cadeia leve e/ou pesada de modo a faci- litar a expressão. Polinucleotídeos codificando as cadeias leves e pe- sadas podem ser inseridos em vetores separados e transfectados na mesma célula hospedeira ou, caso desejada tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve pdoem ser inseridas no mesmo vetor para trans- fecção na célula hospedeira. Ambas as cadeias podem ser arranjadas, por exemplo, sob o controle de um operon dicistrônico e expressadas de modo a resultar na molécula de anticorpo funcional e corretamente dobrada conforme descrito em Skerra, A. (1994) Use of the tetracycli- ne promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli, Gene 151, 131-135, or Skerra, A. (1994) A general vector, pASK8A4, for cloning, bacterial production, and single- step purification of antibody Fab fragments, Gene 141, 79-8. Deste modo, de acordo com um aspecto da presente invenção é proporcio-
nado um processo para construção de um vetor codificando as cadei- as leves e/ou pesadas de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da invenção, cujo método inclui inserir em um ve- tor, um polinucleotídeo codificando ou uma cadeia leve e/ou uma ca- deia pesada de uma molécula de anticorpo da invenção.
[00107] Ao usar técnicas recombinantes, a molécula de anticorpo pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático, ou direta- mente secretadas no meiuo (cf. também Skerra 1994, supra). Se o an- ticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os debris particulados, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter e outros ., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedi- mento para isolar anticorpos os quais são secretados para o espaço periplasmático de E coli. O anticorpo também pode ser produzido em qualquer ambiente oxidante. Um ambiente oxidante semelhante pode ser proporcionado pelo periplasma de bactérias Gram-negativas tais como E. coli, no meio extracelular de bactérias Gram-positivas ou no lúmen do retículo endoplasmático de células eucarióticas (incluindo células de animais tais como insetos ou células de mamíferos) e ge- ralmente favorece a formação de ligações de dissulfeto estruturais. No entanto, também é possível produzir uma molécula de anticorpo da invenção no citosol de uma célula hospedeira tal como E. coli. Neste caso, o polipeptídeo pode ser ou diretamente obtido em um estado so- lúvel e dobrado ou recuperado em forma de corpos de inclusão, se- guido por renaturação in vitro. Uma opção adicional é a utilização de cepas hospedeiras específicas tendo um meio intracelular oxidante, o qual pode portanto permitir a formação de ligações de dissulfeto no citosol (Venturi M, Seifert C, Hunte C. (2002) “High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm.” J. Mol. Biol. 315, 1-8).
[00108] A molécula de anticorpo produzida pelas células pode ser puri- ficada usando qualquer tecnologia de purificação convencional, por exemplo, cromatografia por hidroxilapatita, eletroforese por gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo uma técnica de purificação preferencial. As moléculas de anticorpo podem ser purificadas através de purificação por afinidade com proteí- nas / ligantes que especificamente e reversivelmente ligam domínios constantes tais como os domínios CH1 ou os domínios CL. Exemplos de semelhantes proteínas são proteínas bacterianas de ligação de i- munoglobulina tais como Proteína A, Proteína G, Proteína A/G ou Pro- teína L, em que a ligação de Proteína L é restrita a moléculas de anti- corpo que contêm cadeias leves cápa. Um método alternativo para pu- rificação de anticorpos com cadeias leves |) é a utilização de anticor- pos anti cápa acoplados a contas (KappaSelect). A conveniência da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do iso- tipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos (Lindmark e outros ., J. Imnmunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A Proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para gama 3 humana (Guss e outros ., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A escolha do método de purificação que é usado para uma molécula de anticorpo em particular da invenção está dentro do conhecimento da pessoa moderadamente versada na arte.
[00109] Também é possível equipar uma das cadeias da molécula de anticorpo da invenção com uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade tais como a Strep-tag& ou a Strep-tagO Il (Schmidt, T.G.M. e outros . (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), a myc-tag, a FLAG""-tag, a His6-tag ou a HA-tag permitem fácil detecção e além disso simples purificação da molécula de anticorpo recombinante.
[00110] Os termos “mutado”, “mutante” e “mutação” em referência a um ácido nucleico ou a um polipeptídeo se referem à permuta, elimi- nação, ou inserção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, res- pectivamente, comparado com o ácido nucleico ou polipeptídeo que ocorrem naturalmente, isto é, com uma sequência de referência que pode ser tomada para definir a selvagem.
[00111] Entende-se a este respeito que o termo "posição", quando u- sado de acordo com a presente invenção, significa a posição de um aminoácido dentro de uma sequência de aminoácidos representada aqui, neste requerimento de patente. Esta posição pode ser indicada em relação a uma sequência nativa semelhante, por exemplo, uma sequência de um domínio ou cadeia de IgG que ocorre naturalmente. O termo "correspondente" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, também inclui que uma posição não é necessariamente, ou não somente, determinada pelo número dos nucleotídeos / aminoá- cidos precedentes. Deste modo, a posição de um dado aminoácido de acordo com a presente invenção o qual pode ser substituído pode va- riar devido à eliminação ou à adição de aminoácidos alhures na cadeia do anticorpo.
[00112] Deste modo, sob uma "posição correspondente" de acordo com a presente invenção deve ser entendido que os aminoácidos po- dem diferir no número indicado, mas ainda podem ter aminoácidos vi- zinhos similares. Os aminoácidos referidos os quais podem ser permu- tados, eliminados ou adicionados também são englobados pelo termo "posição correspondente". De modo a determinar se um resíduo ami- noácido em uma dada sequência de aminoácidos corresponde a uma determinada posição na sequência de aminoácidos de um domínio ou de uma cadeia de uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, a pessoa versada pode usar meios e métodos de conhecimento geral na arte, por exemplo, alinhamentos, quer manualmante ou usando pro- gramas de computação tais como BLAST2.0, que representa Basic
Local Alignment Search Tool (ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico) ou ClustalW ou qualquer outro programa adequado o qual seja adequado para gerar alinhamentos de sequências.
[00113] Em algumas modalidades uma substituição (ou reposição) é uma substituição conservadora. Substituições conservadoras são ge- ralmente as substituições que se seguem, listadas de acordo com o aminoácido a ser mutado, cada uma seguida por uma ou mais reposi- ções que podem ser feitas para serem conservadoras: Ala — Gly, Ser, Val; Arg > Lys; Asn — Gln, His; Asp > Glu; Cys — Ser; Glh — Asn; Glu — Asp; Gly — Ala; His — Arg, Asn, Gln; Ile — Leu, Val; Leu — Ile, Val; Lys > Arg, Gln, Glu; Met — Leu, Tyr, lle; Phe — Met, Leu, Tyr; Ser — Thr; Thr — Ser; Trp — Tyr; Tyr — Trp, Phe; Val — Ile, Leu. Ou- tras substituições também são permissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com outras substituições conservadoras ou não conservadoras conhecidas. Como uma orientação adicional, os oito grupos que se seguem cada contêm aminoácidos que podem ser tomados tipicamente para definir substituições conservadoras uns para os outros: 1) Alanina (Ala), Glicina (Gly); 2) Ácido aspártico (Asp), Ácido glutâmico (Glu); 3) Asparagina (Asn), Glutamina (Gln); 4) Arginina (Arg), Lisina (Lys); 5) Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Metionina (Met), Valina (Val); 6) Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr), Triptofano (Trp); 7) Serina (Ser), Treonina (Thr); e 8) Cisteína (Cys), Metionina (Met)
[00114] Se as substituições referidas resultarem em uma modificação na atividade biológica, então alterações mais substanciais, tais como as seguintes, ou conforme adicionalmente descrito abaixo em referên- cia a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas, e os produtos triados para uma característica desejada. Exemplos de semelhantes alterações mais substanciais são: Ala — Leu, Ile; Arg > Glh; Asn — Asp, Lys, Arg, His; Asp > Asn; Cys — Ala; Glh — Glu; Glu — Gln; His — Lys; lle > Met, Ala, Phe; Leu — Ala, Met, Norleucina; Lys — Asn; Met — Phe; Phe — Val, Ile, Ala; Trp > Phe; Tyr — Thr, Ser; Val Met, Phe, Ala.
[00115] Em algumas modalidades uma molécula de anticorpo de acor- do com a invenção inclui um ou mais resíduos aminoácido, incluindo dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete ou dezoito resíduos aminoáci- do, que são mutados para prevenir dimerização através de resíduos cisteína ou para modular a função do Fc. Em algumas destas modali- dades um ou mais resíduos aminoácido do domínio CH2 e/ou da regi- ão de articulação que é capaz de mediar a ligação a receptores de Fc são mutados. Caso presente, o um ou mais resíduos aminoácido ca- pazes de mediar a ligação a receptores de Fc podem ser um resíduo aminoácido que é capaz de ativar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade mediada pelo complemento (CDC). Em algumas modalidades um resíduo aminoácido respectivo capaz de mediar a ligação a receptores de Fc é substituído por outro aminoáci- do, geralmente quando se compara a sequência com a sequência de um domínio correspondente que ocorre naturalmente em uma imuno- globulina, tal como uma IgG. Em algumas modalidades um resíduo aminoácido semelhante capaz de mediar a ligação a receptores de Fc é eliminado, geralmente em relação à sequência de um domínio cor- respondente que ocorre naturalmente em uma imunoglobulina, tal co- mo uma IgG. No entanto, em outras modalidades da invenção que se referem a uma molécula de anticorpo biespecífico que consiste de um fragmento Fab, um fragmento Fv de cadeia única e um domínio CH2 de imunoglobulina, está dentro do âmbito da invenção para introduzir mutações no domínio CH2 de E1 humana, por exemplo, que otimizam a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC). As mutações referi- das estão descritas nos Requerimentos de Patente Internacional Nos. WO?2011/076922 e WO2011/089211, por exemplo.
[00116] Em algumas modalidades o um ou mais resíduos aminoácido mutados, por exemplo, substituídos ou eliminados, é/são um aminoá- cido localizado em uma das posições 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327, e 330. Novamnete, a nu- meração de aminoácidos usada corresponde às posições de sequên- cia de acordo com a numeração Kabat [Índice da União Européia]. Uma eliminação correspondente de um aminoácido pode ser, por e- xemplo, uma eliminação do aminoácido 228, geralmente uma prolina em IgG, uma eliminação do aminoácido 229, geralmente uma cisteína em IgG, uma eliminação do aminoácido 230, geralmente uma prolina em IgG, uma eliminação do aminoácido 231, geralmente uma alanina em IgG, uma eliminação do aminoácido 232, geralmente uma prolina em IgG, uma eliminação do aminoácido 233, geralmente um ácido glu- tâmico em IgG, uma eliminação do aminoácido 234, geralmente uma leucina em IgG, uma eliminação do aminoácido 235, geralmente uma leucina em IgG, uma eliminação do aminoácido 236, geralmente uma glicina em IgG, uma eliminação do aminoácido 237, geralmente uma glicina em IgG, uma eliminação do aminoácido 238, geralmente uma prolina em IgG e uma eliminação do aminoácido 265, geralmente um ácido aspártico em IgG. Uma substituição correspondente de um ami- noácido pode ser, por exemplo, uma substituição do aminoácido 226, geralmente uma cisteína em IgG, uma substituição do aminoácido 228, geralmente uma prolina em IgG, uma substituição do aminoácido 229, geralmente uma cisteína em IgG, uma substituição do aminoácido 230, geralmente uma prolina em IgG, uma substituição do aminoácido 231, geralmente uma alanina em IgG, uma substituição do aminoácido 232,
geralmente uma prolina em IgG, uma substituição do aminoácido 233, geralmente um ácido glutâmico em IgG, uma substituição do aminoá- cido 234, geralmente uma leucina em IgG, uma substituição do amino- ácido 235, geralmente uma leucina em IgG, uma substituição do ami- noácido 265, geralmente um ácido aspártico em IgG, uma substituição do aminoácido 297, geralmente uma asparagina em IgG, uma substitu- ição do aminoácido 327, geralmente uma alanina em IgG, e uma subs- tituição do aminoácido 330, geralmente uma alanina em IgG. Uma substituição respectiva pode ser uma entre substituição Cys226—Ser, substituição Cys229—Ser, substituição Glu233—-Pro, substituição Leu234-Val, substituição Leu235—-Ala, substituição Asp265—Gly, substituição Asn297 >Gln, substituição Ala327>Gln, substituição A- la327 >Gly, e substituição Ala330—>Ser. Conforme pode ser depreen- dido a partir do acima exposto, em algumas modalidades um ou dois dos resíduos cisteína nas posições 226 e 229 na região de articulação estão sendo substituídos por outro aminoácido, por exemplo, substitu- ídos por um resíduo serina. Deste modo a formação de uma ligação de dissulfeto com outra cadeia principal pode ser evitada. Além disso, e conforme também explicado abaixo, a eliminação e/ ou substituição (mutação) de resíduos aminoácido selecionados no domínio CH2 que é capaz de mediar a ligação a receptores de Fc pode fazer com que uma molécula de anticorpo da invenção tenha menos atividade ou ne- nhuma atividade em termos de citotoxicidade celular dependente de anticorpo e fixação do complemento.
[00117] Outro tipo de variante de aminoácido de um anticorpo altera o padrão de glicosilação original (se houver) da molécula de anticorpo. Por alterar se indica elimionar uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou aicionar um ou mais sítios de glicosila- ção que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticor- pos é tipicamente ou N-ligada ou O-ligada. N-ligada se refere à ane-
xasção da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo aspa- ragina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina- X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são de se- quências de reconhecimento para anexação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Deste modo, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada se refere à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, o mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é realizada convenien- temente alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que con- tenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligada).
[00118] No contexto da presente invenção em algumas modalidades a porção da cadeia principal da molécula de anticorpo da invenção, a qual representa a região Fc de uma imunoglobulina, é tipicamente i- nerte, ou no mínimo essencialmente de baixa influência, com respeitto à ligação a receptores de Fc. Conforme dito, isto é obtido eliminando e/ ou substituindo (mutando) no mínimo um dos resíduos aminoácido selecionados no domínio CH2 que são capazes de mediar a ligação a um receptor de Fc. As moléculas referidas também são referidas aqui, neste requerimento de patente, como moléculas de anticorpo “Fc- atenuadas” ou moléculas de anticorpo “Fc“*“. A porção de uma cadeia de anticorpo de acordo com a invenção que pode ser tomada para re- presentar uma porção de um fragmento Fc, isto é, o domínio CH2, e, onde presente, o domínio CH3, deste modo pode definir um “scaffold” (andaime) sem proporcionar uma função biológica particular tal como uma função efetora, por exemplo. No entanto, foi visto na presente in- venção, que este andaime pode proporcionar importantes vantagens em termos de purificação, eficiência de produção e/ou estabilidade das moléculas de anticorpo da invenção comparadas com moléculas de anticorpo conhecidas (cf. os Exemplos).
[00119] Em algumas modalidades o reconhecimento, e por conseguin- te a ligação, desta porção Fc-correspondente a um dado receptor de Fc é de cerca de 2 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 12 vezes, cerca de 15 vezes, cerca de 20 vezes ou menor do que a região Fc de uma imunoglobulina que ocorre natu- ralmente. Em algumas modalidades esta porção Fc-correspondente é inteiramente destituídas de sua capacidade de ligação a receptores de Fc. A ligação de um anticorpo a receptores de Fc, incluindo determina- ção de uma constante de dissociação, pode ser facilmente determina- da pelo técnico versado usando técnicas de rotina tais como resso- nância de plasmon superficial, por exemplo, usando uma medição Bia- core"M, Qualquer outro método de medição da ligação biomolecular pode ser igualmente usado, o qual pode, por exemplo, se basear em meios espectroscópicos, fotoquímicos, fotométricos ou radiológicos. Exemplos para os métodos de detecção correspondentes são espec- troscopia por correlação de fluorescência, reticulação fotoquímica e a utilização de marcadores fotoativos ou radioativos respectivamente. Alguns destes métodos podem incluir técnicas de separação adicio- nais tal como eletroforese ou HPLC.
[00120] Onde requerido, uma substituição ou eliminação de resíduos aminoácidos, conforme explicado acima, pode ser realizada para este efeito. Mutações adequadas podem ser tomadas de Armour e outros . (Eur. J. Immunol. [1999] 29, 2613-2624), por exemplo. Posições ade- quadas adicionais para mutações para uma sequência de uma cadeia de anticorpo podem ser tomadas dos dados de estruturas cristalinas publicados sobre o complexo entre FcERIII e o fragmento Fc de I9G1 humana (Sondermann e outros ., Nature [2000] 406, 267-273). Além de medir a afinidade de ligação conforme descrito acima de modo a avaliar o nível de “atenuação de Fc” ou perda de afinidade de ligação, também é possível avaliar funcionalmente a (falta da) capacidade para mediar ligação a um receptor de Fc.
No caso de moléculas de anticor- po as quais ligam CD3 como um alvo, é por exemplo possível avaliar a ligação através da mitogenidade de semelhantes moléculas de anti- corpo de ligação de CD3 sobre as células.
A mitogenidade é mediada por ligação de anticorpos CD3 aos receptores de Fc sobre células a- cessórias, tais como monócitos.
Se uma molécula de anticorpo da in- venção que tem um sítio de ligação para CD3 não apresenta qualquer efeito mitogênico ao passo que o anticorpo anti-CD3 monocional pa- rental que tem uma parte Fc funcional induz forte mitose em células T, é evidente que, devido à falta de mitose, a molécula de anticorpo da invenção carece da capacidade para ligação de Fc e portanto pode ser considerada como uma molécula de “nocaute de Fc”. Exemplos ilustra- tivos de um método de avaliar a mitogenidade mediada anti-CD3 fo- ram descritos por Davis, Vida & Lipsky (J.ImMmunol (1986) 137, 3758), e por Ceuppens, JL, & van Vaeck, F, (vide J.
Immunol. (1987) 139, 4067, ou Cell.
Immunol. (1989) 118, 136). Exemplos ilustrativos ade- quados adicionais de um teste para avaliar a mitogenidade de um anti- corpo foram descritos por Rosenthal-Allieri e outros . (Rosenthal-Allieri MA, Ticcioni M, Deckert M, Breittumeyer JP, Rochet N, Rouleaux M, 3 Senik A, Bernerd A, Cell Immunol. 1995 163(1):88-95) 2 Grosse- Hovest e outros . (Grosse-Hovest L, Hartlapp |, Marwan W, Brem G, Rammensee H-G, e Jung G, Eur J Immunol. [2003] May; 33(5): 1334- 1340). Além disso, a falta de ligação de Fc pode ser avaliada pela ca- pacidade de uma molécula de anticorpo da invenção para mediar uma ou mais das funções efetoras de conhecimento geral da parte de Fc.
[00121] Conforme observado acima, substituições ou eliminações de resíduos cisteína podem ser realizadsa de modo a introduzir ou a re- mover uma ou mais ligações de dissulfeto, incluindo introduzir ou re- mover uma ligação de dissulfeto potencial ou uma ligação de dissulfeto previamente existente. Deste modo a ligação entre uma cadeia princi- pal e uma cadeia de menor peso / de extensão mais curta de uma mo- lécula de anticorpo de acordo com a invenção pode ser controlada in- cluindo estabelecida, reforçada ou abolida. Por introdução ou remoção de um ou mais resíduos cisteína, uma ponte de dissulfeto pode ser introduzida ou removida. Como um exemplo ilustrativo, uma molécula de anticorpo tetramérica de acordo com a invenção geralmente tem uma ou mais ligações de dissulfeto que ligam duas moléculas de anti- corpo diméricas. Uma ligação de dissulfeto semelhante é tipicamente definida por uma cisteína na cadeia principal de uma primeiro molécula de anticorpo dimérica e uma cisteína na região de articulação de uma segunda molécula de anticorpo dimérica. A este respeito, em algumas modalidades um anticorpo de acordo com a invenção pode incluir uma substituição de aminoácido de um resíduo cisteína nativo nas posições 226 e/ou 229, em relação à sequência de uma imunoglobulina IgG humana de acordo com a numeração Kabat [Índice da União Européi- a], por outro resíduo aminoácido.
[00122] Substituições ou eliminações de resíduos aminoácidos tais como arginina, asparagina, serina, treonina ou tirosina resíduos tam- bém podem ser realizadas de modo a modificar o padrão de glicosila- ção de um anticorpo. Como um exemplo ilustrativo, uma molécula de IgG tem um único carboidrato biantenário N-ligado em Asn297 do do- mínio CH2. Para IgG ou do soro ou produzida ex vivo em hibridomas ou células manipuladas, as IgG são heterogêneas com respeito ao carboidrato ligado por Asn297. Para IgG humana, o oligossacarídeo de núcleo tipicamente consiste de GIcCNAc2Man3GIcNAc, com números diferentes de resíduos externos.
[00123] Conforme indicado, além de ligação de antígenos / epitopes, uma imunoglobulina é conhecida por ter "funções efetoras", atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc da sequência nativa ou região Fc variante da sequência de aminoácidos) de uma imuno- globulina, e variam com o isotipo de imunoglobulina. Exemplos de fun- ções efetoras de anticorpos incluem: ligação de Clq e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação de receptor de Fc; citoto- xicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; hipo re- gulação de receptores da superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B. Exercer funções efetoras de um anticorpo geralmente envolve recrutar de células efetoras. Várias fun- ções efetoras das imunoglobulinas são mediadas por receptores de Fc (FcRs), os quais ligam a região Fc de um anticorpo. FcRs são defini- dos por sua especificidade para isotipos de imunoglobulinas; recepto- res de Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR, para IgE co- mo FceyR, para IgA como FcaR e assim por diante. Qualquer uma des- tas funções efetoras (ou a perda de semelhantes funções efetoras) como uma CDC ou ADCC pode ser usada de modo a avaliar se uma molécula de anticorpo da invenção carece capacidade de ligação de Fc.
[00124] Neste contexto, opbserva-se que o termo "receptor de Fc" ou "FcR" define um receptor, geralmente uma proteína que é capaz de ligação à região Fc de um anticorpo. Receptores de Fc são encontra- dos sobre a superfície de algumas células do sistema imune de um organismo, por exemplo, células natural killer, macrófagos, neutrófilos, e mastócitos. /n vivo receptores de Fc ligam a imunoglobulinas que são imobilizadas sobre células infectadas ou estão presentes sobre patógenos invasores. Sua atividade estimula células fagocíticas ou ci- totóxicas a destruir os micróbios, ou células infectadas por fagocitose mediada por anticorpo ou citotoxicidade celular dependente de anti- corpo. Alguns vírus tais como flavivírus usam receptores de Fc para os ajudar a infectar as células, por um mecanismo conhecido como refor- ço de infecção dependente de anticorpo. FcRs foram revisados em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel e outros ., Inmunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas e outros ., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995).
[00125] "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" se refere à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A ativa- ção do caminho do complemento clássico é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Cla) a anticorpos (da subclasse apropriada) os quais são ligados a seu antígeno cogna- to. De modo a avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um teste de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano- Santoro e outros ., J. Immunol. Methods 202: 163 (1997).
[00126] O termo “sistema do complemento” é usado na arte para se referir a uma série de pequenas proteínas — denominadas fatores do complemento - encontradas no sangue, geralmente circulando como precursores inativos (pró-proteínas). O termo se refere à capacidade deste sistema inalterável e não adaptável para “complementar” a ca- pacidade dos anticorpos e das células fagocíticas para limpar patóge- nos tais como bactérias, bem como complexos de antígeno-anticorpo, de um organismo. Um exemplo de fatores do complemento é o com- plexo C1, o qual inclui C1ig e duas serina protases, C1r e C1s. O com- plexo C1 é um componente do caminho CDC. C1iq é uma molécula hexavalente com um peso molecular de aproximadamente 460.000 e uma estrutura semelhante a um buquê de tulipas no qual seis "caules" de colágeno são conectados a suas regiões principais globulares. De modo a ativar a cascata do complemento, C1q tem de ligar a no míni- mo duas moléculas de IgG1, IgG2 ou 19G3.
[00127] "Citotoxicidade celular dependente de anticorpo" ou ADCC se refere a uma forma de citotoxicidade na qual lg secretada ligada sobre receptores de Fc (FcRs) presentes sobre determinadas células citotó- xicas - tais como células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos - permitem que estas células efetoras citotóxicas liguem especificamen- te a uma célula alvo trazendo antígeno e subsequentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxi- cas e são requeridos para destruição da célula alvo por este mecanis- mo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FCcERIII somente, ao passo que monócitos expressam FcERI, FcERII e FCERIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumi- da na Tabela 3 à página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immu- nol. 9: 457-92 (1991). De modo a avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um teste de ADCC in vitro, tal como descrito nas Patentes dos Estadso Unidso Nos. 5.500.362 ou
5.821.337. Células efetoras úteis para semelhantes testes incluem, mas não estão limitadas a, células mononucleares do sangue periféri- co (PBMC) e células natural killer (NK). Em algumas modalidades a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como revelado e4m Clynes e outros ., PNAS USA 95: 652-656 (1998).
[00128] Várias funções efetoras de anticorpos são mediadas por re- ceptores de Fc (FcRs), os quais ligam a região Fc de um anticorpo. FcRs são definidos por sua especificidade para isotipos de imunoglo- bulinas; receptores de Fc para anticorpos IgG são referidos como FcER, para IgE como FcyR, para IgA como FcaR e assim por diante. Três subclasses de FcER foram identificadas: FCERI (CD64), FcERII (CD32) e FcERII! (CD16).
[00129] Voltando agora para ácidos nucleicos da invenção, uma molé- cula de ácido nucleico codificando uma ou mais cadeias de um anti-
corpo de acordo com a invenção pode ser qualquer ácido nucleico em qualquer configuração possível, tal como de filamento único, de fila- mento duplo ou uma combinação das mesmas. Ácidos nucleicos in- cluem por exemplo, moléculas de DNA, moléculas de RNA, análogos do DNA ou do RNA gerado usando análogos de nucleotídeos ou u- sando química de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico locked (LNA), e moléculas de ácidos nucleicos de proteína (PNA). O DNA ou RNA pode ser de origem genômica ou sintética e pode ser de filamen- to único ou de filamento duplo. O ácido nucleico referido pode ser, por exemplo, mRNA, cRNA, RNA sintético, DNA genômico, cDONA DNA sintético, um copolímero de DNA e RNA, oligonucleotídeos, etc. Um ácido nucleico respectivo pode conter além disso análogos de nucleo- tídeos não-naturais e/ou ser ligado a uma etiqueta de afinidade ou um marcador.
[00130] Em algumas modalidades uma sequência de ácido nucleico codificando uma cadeia, tal como uma cadeia principal e/ou uma ca- deia menor de um anticorpo de acordo com a invenção é incluída em um vetor tal como um plasmídeo. Onde uma substituição ou elimina- ção deve ser incluída em uma cadeia de anticorpo, quando comparada com um domínio ou com uma região que ocorre naturalmente de um anticorpo, a sequência codificante do domínio nativo respectivo / da região nativa respectiva, por exemplo, incluída na sequência de uma imunoglobulina, pode ser usada como um ponto de partida para a mu- tagênese. Para a mutagênese de posições de aminoácidos seleciona- das, a pessoa versda na arte tem à sua disposição os vários métodos de rotina estabelecidos para mutagênese sítio-direcionada. Uma técni- ca comumente usada é a introdução de mutações por meio de PCR (reação de cadeia polimerase) usando misturas de oligonucleotídeos sintéticos, os quais possuem uma composição de bases degeneradas nas posições de sequência desejadas. Por exemplo, o uso do códon
NNK ou NNS (em que N = adenina, guanina ou citosina ou timina; K= guanina ou timina; S = adenina ou citosina) permite a incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o stop códon âmbar durante mutagêne- Se, ao passo que o códon VVS limita o número de aminoácidos possi- velmente incorporados a 12, uma vez que exclui os aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val de serem incorporados na posição se- lecionada da sequência de polipeptídeo; o uso do códon NMS (em que M = adenina ou citosina), por exemplo, restringe o número de possível aminoácidos para 11 em uma posição de sequência selecionada uma vez que exclui os aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val de serem incorporados em uma posição de sequência seleciona- da. A este respeito observa-se que códons para outros aminoácidos (que não os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente regulares) tais como selenocisteína ou pirrolisina também podem ser incorporados em um ácido nucleico de uma molécula de anticorpo. Além disso, é possível, conforme descrito por Wang, L., e outros . (2001) Science 292, 498-500, ou Wang, L., e Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1- 11, usar códons “artificiais” tais como UAG o quais são geralmente re- conhecidos como stop códons de modo a inserir outros aminoácidos incomuns, por exemplo o-metil-L-tirosina ou p-aminofenilalanina.
[00131] A utilização de blocos de construção de nucleotídeos com re- duzida especificidade de pares de bases, como por exemplo, inosina, 8-0x0-2'desoxiguanosina ou G6(2-desoxi- B -D-ribofuranosil)-3,4-di- hidro-8H-pirimin-do-1,2-0xazina-7-one (Zaccolo e outros . (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), é outra opção para a introdução de mutações em um segmento de sequência escolhido. Uma possibilidade adicional é a chamada mutagênese de tripleto. Este método usa misturas de diferentes tripletos de nucleotídeos, cada um dos quais codifica para um aminoácido, para incorporação na sequência codificante (Virnekãs B, e outros ., 1994 Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).
[00132] Uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia, tal como uma cadeia principal e/ou uma cadeia menor de um anticorpo de acordo com a invenção pode ser expressada usando qualquer sistema de expressão adequado, por exemplo em uma célula hospedeira ade- quada ou em um sistema livre de células. A molécula de anticorpo ob- tida é enriquecida por meio de seleção e/ ou isolamento.
[00133] Conforme explicado acima, uma molécula de anticorpo de a- cordo com a invenção pode ser direcionada contra quaisquer epitopes / antígenos alvo desejados. Dependendo dos epitopes / antígenos se- lecionados o anticorpo pode ser adequado no tratamento ou na pre- venção de doença. Por conseguinte, em algumas modalidades um an- ticorpo de acordo com a invenção pode ser usado em um método de tratamento de e/ou prevenção de uma condição médica tal como um distúrbio ou doença. Em modalidades onde um dos anticorpos incorpo- rados em uma molécula biespecífica é capaz de ativar células imunes em uma maneira dependente de FcR, pode ser particularmente útil selecionar uma molécula de anticorpo que tem uma porção Fc- correspondente que mostra reduzida ligação a receptores de Fc. Por este meio é prevenida uma ativação imune indesejável mediada por ligação de FCR. Em algumas modalidades uma doença a ser tratada ou prevenida pode ser uma doença proliferativa. Exemplos de uma doença proliferativa incluem, mas não estão limitadas a, malignidades hematopoiéticas, tais como leucemias linfática e mielóide aguda e crô- nica, bem como linfomas, ou tumores sólidos. Exemplos de tumores sólidos incluem, mas não estão limitados a, tumores do trato gastroin- testinal, dos ossos, pulmonares, renais, de próstata, de mama, cere- brais, de ovário, uterinos, dos testículos, tumores mesenquimais e de pele, tais como melanoma.
[00134] A invenção também proporciona uma composição farmacêuti- ca que inclui uma molécula de anticorpo da invenção e, opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00135] A molécula de anticorpo de acordo com a invenção pode ser administrada através de qualquer via parenteral ou não-parenteral (en- teral) que seja terapeuticamente eficaz para fármacos proteináceos. Métodos de parenteral aplicação incluem, por exemplo, técnicas de injeção e de infusão intracutâneas, subcutâneas, intramusculares, in- tratraqueais, intranasais, intravitreais ou intravenosas, por exemplo, sob a forma de soluções para injeção, soluções para infusão ou tintu- ras, bem como instalação e inalação de aerosóis, por exemplo, sob a forma de misturas de aerosóis, sprays ou pós. Uma visão geral sobre liberação de fármacos pulmonares, isto é, ou através de inalação de aerosóis (os quais também podem ser usados em administração intra- nasal) ou através de instilação intraqueal é dada por J.S. Patton e ou- tros . The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 pgs. 338-344,por exemplo). Modos de liberação não parenteral são, por exemplo, por via oral, por exemplo, sob a forma de pílulas, comprimidos, cápsulas, soluções ou suspen- sões, ou por via retal, por exemplo, sob a forma de supositórios. Molé- culas de anticorpo da invenção dpoem ser administradas sistemica- mente ou topicamente em formulações contendo excipientes ou supor- tes, aditivos e veículos farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos con- vencionais conforme desejado.
[00136] Em uma modalidade da presente invenção o produto farma- cêutico é administrado por via parenteral a um mamífero, e em particu- lar a humanos. Métodos de administração correspondentes incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, técnicas de injeção e de infu- são intracutâneas, subcutâneas, intramusculares, intratraqueais ou intravenosas, por exemplo, sob a forma de soluções para injeção, so- luções para infusão ou tinturas bem como instalação e inalação de ae- rosóis, por exemplo, sob a forma de misturas para aerosóis, sprays ou pós. Uma combinação de infusão e /ou injeção intravenosa e subcutâ- nea pode ser mais conveniente no caso de compostos com uma meia vida sérica relativamente curta. A composição farmacêutica pode ser uma solução aquosa, uma emulsão de óleo em água ou uma emulsão de água em óleo.
[00137] A este respeito observa-se que tecnologias de liberação trans- dérmica, por exemplo, iontoforese, sonoforese ou liberação reforçada por microaguolhas, conforme descrito em Meidan VM e Michniak BB 2004 Am. J. Ther. 11(4): 312-316, também podem ser usadas para liberação transdérmica de uma molécula de anticorpo descrita aqui, neste requerimento de patente. Modos de liberação não parenteral são, por exemplo, oral, por exemplo, sob a forma de pílulas, comprimi- dos, cápsulas, soluções ou suspensões, ou administração retal, por exemplo, sob a forma de supositórios. As moléculas de anticorpo da invenção podem ser administradas sistemicamente ou topicamente em formulações contendo uma variedade de excipientes ou suportes, adi- tivos, e veículos farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencio- nais.
[00138] A dosagem da molécula de anticorpo aplicada pode variar dentro de amplos limites de modo a obter o efeito preventivo desejado ou a resposta terapêutica desejada. Por exemplo, dependerá da afini- dade da molécula de anticorpo por um alvo escolhido bem como da meia vida do complexo entre a molécula de anticorpo e o ligante in vi- vo. Além disso, a dosagem ótima vai depender da biodistribuição da molécula de anticorpo ou de um conjugado da mesma, do modo de administração, da graviidade da doença / do distúrbio sendo tratado bem como da condição médica do paciente. Por exemplo, quando u- sada em uma pomada para aplicações tópicas, pode ser usada uma alta concentração da molécula de anticorpo. No entanto, caso deseja- do, a molécula de anticorpo também pode ser administrada em uma formulação de liberação gradual, por exemplo, dispersões lipossômi- cas ou microsferas poliméricas à base de hidrogel, como PolyActi- veTM ou OctoDEXTM (cf. Bos e outros ., Business Briefing: Pharmate- ch 2003: 1-6). Outras formulações de liberação gradual disponíveis são, por exemplo, polímeros à base de PLGA (PR pharmaceuticals), hidrogéis à base de PLA-PEG (Medincell) e polímeros à base de PEA (Medivas).
[00139] Por conseguinte, as moléculas de anticorpo da presente in- venção podem ser formuladas em composições usando ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem como métodos de preparação es- tabelecidos (Gennaro, A.L. e Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed,., Lippincott Williams & Wil- kins, Philadelphia, PA). De modo a preparar as composições farma- cêuticas, podem ser usados excipientes inorgânicos ou orgânicos far- maceuticamente inertes. Para preparar, por exemplo, pílulas, pós, cápsulas de gelatina ou supositórios, por exemplo, lactose, talco, ácido esteárico e seus sais, podem ser usados gorduras, ceras, polióis sóli- dos ou líquidos, óleos naturais e hidrogenados. Excipientes adequados para a produção de soluções, suspensões, emulsões, misturas de ae- rosóis ou pós para reconstituição em soluções ou misturas de aerosóis antes do uso incluem água, alcoóis, glicerol, polióis, e misturas ade- quadas dos mesmos bem como óleos vegetais.
[00140] A composição farmacêutica também pode conter aditivos, tais como, por exemplo, enchimentos, ligantes, agentes umectantes, desli- zantes, estabilizantes, preservantes, emulsificantes, e, além disso, sol- ventes ou solubilizantes ou agentes para obter um efeito de depósito. O último é que proteínas de fusão podem ser incorporadas em siste- mas de liberação lenta ou gradual ou direcionada, tais como liposso- mas e microcápsulas.
[00141] As formulações podem ser esterilizadas por numerosos meios,
incluindo filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes esterilizante sob a forma de composições só- lidas estéreis as quais podem ser dissolvidas ou dispersadas em água estéril ou outro meio estéril logo antes do uso.
[00142] Existem numerosas aplicações possíveis para a molécula de anticorpo da invenção na medicina. Além de sua utilização em diag- nóstico in vitro ou liberação de fármacos, pode ser gerada uma molé- cula de anticorpo da invenção, a qual liga, por exemplo, moléculas da superfície celular tecido-específicas ou tumor-específicas.
[00143] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exem- plos não-limitantes. EXEMPLO |
[00144] Foi gerada uma molécula bivalente Fc-atenuada biespecífica, também designada para ser do formato bsFc“º-1/2, com especificidade para tumor X CD3, conforme esquematicamente representado na Fig. 1E. Modificações de aminoácidos da região de articulação e do domí- nio CH2 foram introduzidas conforme mostrado na Fig. 10. Foram ge- radas moléculas tetravalentes Fc-atenuadas biespecíficas, também designadas para serem do formato bsFc“º*-1, com especificidade para tumor X CD3, conforme esquematicamente representado na Fig. 1G. Modificações de aminoácidos da região de articulação e do domínio CH2 foram introduzidas conforme mostrado na Fig. 1P.
[00145] Clonagem e amplificação de plasmídeos foi realizada usando Escherichia coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha. O desen- volvimento dos vetores respectivos é representado na Fig. 2.
[00146] Cotransfecção de vetores de expressão codificando cadeias principais e menores, as quais também podem ser referidas como ca- deias pesadas e leves, de especificidades indicadas foram feitas em células de plasmocitoma Sp2/0, obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Para o desenvolvimento dos veto-
res respectivos é feita referência à Fig. 2 (vide também o Exemplo |l abaixo). As células foram cultivadas em meio IMDM, suplementado com 10% de soro de feto de vitelo (PAN-Biotech, Aidenbach, Alema- nha), 1 % de penicilina e estreptomicina (Lonza, Basel, Suíça). Trans- fectantes estáveis foram selecionados adicionando 1 mg/ml de G418 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha).
[00147] Anticorpos biespecíficos foram purificados a partir de sobrena- dantes de culturas de células transfectadas de modo estável através de afinidade cromatografia usando proteína A para o formato Fe-1 e KappaSelect para o formato bsFc“º-1/2 (ambos os meios de cromato- grafia foram obtidos na GE Healthcare, Munich, Alemanha). EXEMPLO |l
[00148] Regiões de imunoglobulina V foram combinadas com as regi- ões C constantes desejadas em um vetor de expressão. O procedi- mento de clonagem indicado aqui permite a introdução de regiões V de Ig completa e sua expressão em células linfóides sem quaisquer alterações de sua sequência de aminoácidos. Para este fim, a se- quência de nucleotídeos de um fragmento VDJ e VJ de um anticorpo monoespecífico foi usada para designar pares de primers (C C'; D D'; Tabela 1). Os fragmentos de DNA reamplificados dos segmentos V foram digeridos (VJ diretamente e VDJ depois de reamplificação com o par de primers E E' Tabela 1) com nucleases de restrição apropriadas (resumido na Tabela 1) e em seguida ligados nos vetores de expres- são. Alternativamente, os domínios V foram sintetizados como frag- mentos de DNA na GeneArt, Regensburg, Alemanha. Este método foi usado para genes codificando para as regiões V do anticorpo direcio- nadas para EGFR (clone C225). Os vetores (Figura 2) contêm genes de regiões constantes pesadas humanas e leves humanas. Deste mo- do, a inserção dos segmentos V amplificados e digeridos reconstitui a organização genômica original dos genes de lg nos vetores sem alte-
rar qualquer aminoácido das regiões V.
[00149] O vetor original para a cadeia pesada contém a cadeia pesada da Ig do isotipo €E1 humana (Fig. 2A). Sítios de restrição foram introdu- zidos nas posições requeridas em íntrons de modo a trocar o fragmen- to Aatll-Clal com o fragmento VDJ da cadeia pesada de anticorpos monoclonais 4G8 (anti-FIt3), BV10 (anti-FLT3), 4G7 (anti-CD19), C225 (anti-=EGFR) e 9.2.27 (anti-CSPG4) ou qualquer outro anticorpo mono- clonal. A região relevante para clonagem do fragmento VDJ é mostra- da ampliada na Figura 2B. O fragmento a ser permutado contém par- tes do primeiro íntron com um sítio de restrição Aatll, o segundo éxon da sequência lider, a região VDJ e parte do íntron de da cadeia pesa- da com o sítio de restrição Clal. Para a substituição de todos os éxons da região constante da cadeia pesada [1€1 humana, sítios de restrição foram introduzidos na posição requerida no íntron de cadeia pesada (Mlul) e na região polyA de cadeia pesada de 5-UTR (região pA; Spel), conforme mostrado na Figura 2A e 2C.
[00150] Além disso, com os vetores de expressão construídos, é pos- sível trocar toda a região constante do isotipo Ig&1 humano (fragmento Mlul-Spel; vide a Figura 2A) ou contra regiões constantes de todos os outros isotipos de anticorpos ou contra partes de Fc com função efeto- ra otimizada ou reduzida. No caso de anticorpos otimizados para acio- nar ADCC, substituições de aminoácidos foram introduzidas no domí- nio CH2 de região constante de E1 humana conforme mostrado nos Requerimentos de patente Internacional Nos. WO?2011/076922 e WO?2011/089211. De modo a gerar anticorpos biespecíficos conforme representado nas Figs. 1A a IN, podem ser inseridos fragmentos de DNA flanqueados por Mlul e Spel contendo ou éxons codificando para domínios constantes selvagens ou modificados da cadeia pesada de Ig. O fragmento Mlul-Spel a ser trocado é mostrado ampliado na Figu- ra 2C. Adicionando a segunda especificidade antigênica de um anti-
corpo biespecífico, fragmentos scFv ou em orientação VH-VL ou VL- VH podem ser incluídos através dos sítios enzimáticos de restrição BspE!l e Spel, conforme também mostrado na Figura 2A. A região re- levante para clonagem de um fragmento scFv em orientação VL-VH é mostrada ampliada na Figura 2C. Fragmentos scFv com a especifida- de para CD3 (clone humanizado UCHT1; orientação VL-VH), CD28 (clone 9.3; orientação VL-VH), TOCRo/ B (clone BMAO31; orientação VH-VL) foram gerados por PCR com os oligonucleotídeos F e F' lista- dos na Tabela 2. Alternativamente, foram sintetizados como fragmen- tos de DNA na GeneArt, Regensburg, Alemanha. Este método foi usa- do para genes codificando para os anticorpos direcionados para CD16 (clone 3G8; orientação VL-VH). O fragmento de DNA dos segmentos scFv em orientação VH-VL e VL-VH, respectivamente, foi digerido com as nucleases de restrição apropriadas (resumido na Tabela 2) e foi em seguida ligado no vetor de expressão.
[00151] O vetor original para a cadeia leve contém a região da cadeia leve VJ e a região C de gene 11) humano (Figura 2D). Sítios de restri- ção foram introduzidos nas localizações requeridas (Xhol e Spel) de modo a substituir o fragmento Xhol-Spel de cadeia leve com o frag- mento VJ apropriado da cadeia leve de anticorpos monoclonais 4G8 (anti-FLT3), BV10 (anti-FLT3), 4G7 (anti-CD19), C225 (anti-EGFR) ou
9.2.27 (anti-cCSPG4) ou qualquer outro anticorpo monoclonal. A região adjacente ao fragmento a ser permutado é mostrada na Figura 2E. Es- ta região contém partes do segundo éxon da sequência lider, um sítio de restrição adequado (Xhol) para fusão in frame, a região VJ e partes do íntron de cadeia cápa com sítio de restrição Spel. De modo a subs- tituir o domínio constante da cadeia leve (CL), sítios de restrição foram introduzidos nas localizações requeridas (Pmll e BsmBl). A região ad- jacente ao fragmento a ser permutado é mostrada ampliada na Figura 2F. Esta região contém partes do íntron de cadeia cápa, um sítio de restrição adequado (Pmll), a região CL e partes da região polyA de cadeia cápa da região 3-UTR (região pA) com sítio de restrição (Bsm- Bl). Tabela 1: Oligonucleotídeos usados para amplificação de seg- mentos VDJ e VJ para a inserção em vetores de expressão C | 4G67-H-for b'-ctc tte aca ggt gtc ctc tet gag gtc cag ctg cag cag tet gga cet ss ss GaBROa C' | 4G7-H-rev 5'-ggg aga agg tag gac tca cct gag gag act gtg aga gtg gtg cet a A egESGRADNDA C |9.2.27-H-for | 5'-tcet tea cag gtg tcc tet coco agg tga agc tac agc aat ctg gac ctg C' | 9.2.27-H-rev | 5-aat ggg aga agg tag gac tca cct gag gag acg gtg acc gtg gte C | 4G8-H-for 5'-tct ctt cac agg tat cct ctc tea ggt cca act gca gca gcec tag gge AP Er o C' | 4G8-H-rev 5'-gag aag gta gga ctc acc tga gga gac tgt gag agt ggt gcc ttg Cs Rs GSGRBDN EA C | BV1I0-H-for |5"-aga cgt cca ctc tgt ctt tcet ctt cac agg tat cct ctce cca ggt gca Ps e sgNBEBDNOAA C' | BV10-H-rev |5'-gag aag gta gga ctc acc tga gga gac ggt gac tga ggat tcc tta E | universal for | 5-aga cgt cca ctc tgt ctt tet ctt cac agg tagt cct ctc c-3' (SEQ ID ue Clnoso e a SS SO E' | universal rev | 5'-tat cga ttt aga atg gga gaa ggt agg act cac-3' (SEQ ID NO: (ia Ma mica SS A Oligonucleotídeos usados para o segmento VJ de cadeia leve 4G7-L-for (Xhol) | 5'-act cga gga gat att gtg atg act cag gct gca ccc tet ata c-
A A
4G7-L-rev 5'-aac tag tac tta cgt ttc age tcc age ttg gtc cca gca ccg Cf smdesmBNR D |9.2.27-L-for 5'-tct cga gga gac atc gag ctc act cag tet cca get tet ttg-3'
9.2.27-L-rev 5'-aac tag tac tta cgt tt atc tcc agc tta gtg ccc cet cca aag
CC D | 4G8-L-for (Xhol) | 5-act cga gga gat att gtg cta act cag tct cca gcc ace cta-3' 4G8-L-rev b'-tac tag tac tta cgt ttt att tcc age ttg gtc coco cet co-3' Cf fseaíea o BV10-L-for 5'-act cga gga gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tec c-3' Cem BERNA BV10-L-rev 5'-act agt act tac gtt tca gct cca get tag tec cag cac cega EC a Sitios de restrição são mostrados em negrito e indicados por letras en- tre parênteses. Tabela 2: Oligonucleotídeos usados para amplificação de seg- mentos scFv para a inserção em vetores de expressão F | UCHT1-for 5'- atc cgg aga tat cca gat gac cca gtc cce gag cte cet 9g-3' e RN F' | UCHT1-rev 5'- tac tag tta tca cga gga gac ggt gac cag ggt tcc ttg ace fe SERRA F | BMAO31-for 5'- atc cgg aga agt gca get gca gca gtc cgg cce tga get-3' F' | BMAO31-rev 5'- tac tag tta tca ctt cag ttc cag ctt ggt gcc age gcc gaa F |9.3-for (BspEl) |5"-atc cgg aga cat tgt gct gac cca gtc cce tac cte cet gg-3' ss DNA
Sitios de restrição são mostrados em negrito e indicados por letras en- tre parênteses.
[00152] Deste modo, foram obtidas moléculas de anticorpo biespeciífi- co com FLT3xCD3 (4G8xUCHT1, BVIOXUCHT1), FLT3XTCRO/ RB (4G8xBMAO31, BVIOXBMAO31), FLT3XCD28 (4G8x9.3, BV10x9.3), FLT3XCD16 (4G8x3G8, BV10Xx3G8) CD1I9xCD3 (4G7xUCHTI1), CD19xTCRo/ B (4G7xBMAO31), CD1I9xCD28 (4G67x9.3), CD19xCD16 (4G7x3G8), —“CSPG4xCD3 (9.2.27xUCHT1I) CSPG4xXTCRW BB (9.2.27XBMAO31), — CSPG4xCD28 (9.2.27x9.3)) CSPG4xCD16 (9.2.27x3G8), — EGFRxCD3 (C225xUCHT1I) EGFRXTCRW BB (C225xBMAO031), EGFRXCD28 (C225x9.3), EGFRXCD16 (C225x3G8) como bsFc'*º-1 tetravalente e bsFc'*º-1/2 bivalente. Sequências das cadeias correspondentes são representadas como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 26 e na Fig. 6.
[00153] Cotransfecção dos vetores de expressão codificando a cadeia quimérica pesada e leve (I9G1/7) ou cadeias pesadas modificadas na linhagem celular de mieloma não-produtora de lg Sp2/0 produziu transfectomas estáveis secretando anticorpos monoclionais biespeciífi- cos os quais são capazes de ligar especificamente ao antígeno dese- jado. A caracterização funcional destas moléculas de anticorpo é ilus- trada nos experimentos que se seguem usando moléculas de anticor- po biespecífico FLT3xCD3, CD19xTCRo/ B e CSPGXCD3. EXEMPLO Ill
[00154] Foi determinada a ativação de células T pelos dois formatos de anticorpo do Exemplo |, o formato bsFc“º-1/2 e o formato bsFc“-1, com e sem células REH positivas para FLT3/CD19. Os dados são mostrados na Fig. 3. As moléculas de anticorpo biespecífico usadas tinham o sítio de ligação FLT3 (primeiro sítio de ligação) do clone 4G8 e um sítio de ligação de CD3 (segundo sítio de ligação) do clone U-
CHT1. A molécula do formato “bsFc“º-1/2” consistiu das cadeias de SEQ ID NO: 1 e de SEQ ID NO: 6) e a molécula do formato “bsFc“º-1” consistiu das cadeias de SEQ ID NO: 1 e de SEQ ID NO: 26. A molé- cula de anticorpo biespecífico que liga CSPG4 e CD3 estava no forma- to “bsFc“*-1/2" e consistiu das cadeias de SEQ ID NO: 3 e de SEQ ID NO: 18. Além disso foi usada uma molécula de anticorpo biespecífico no formato “bsFc“º-1/2" ligando CD19 e TCRo/ B D consistindo das cadeias de SEQ ID NO: 4 e de SEQ ID NO: 15. A) Células mononucleares humanas (PBMCs) foram obtidas a partir de sangue periférico de doadores saudáveis e isoladas usando centrifugação de gradiente de densidade. As PBMCs foram transferi- das para placas de 96 cavidades (100.000/ cavidade). Em seguida, ou células REH positivas para FLT3/CD19 irradiadas (50.000/ cavidade) ou meio foram adicionados, e finalmente anticorpos foram adicionados em concentrações conforme indicado (Fig. 3A). Depois de 24 horas as células foram incubads com *H timidina (0,5 uCi/ cavidade). Depois de um adicional de 24 horas as células foram aplicadas sobre filtros de fibra de vidro usando uma colheitadeira celular. Em seguida a radioati- vidade foi detectada por meio de um contador de cintilação. B) Sangue total heparinizado (50 ul/ cavidade) foi incubado em placas de 96 cavidades com e sem células REH positivas para FLT3/CD19 (50.000/ cavidade) e com anticorpos nas concentrações indicadas na Fig. 3B. Depois de 24 hours a concentração de TNF no sobrenadante foi determinada por ELISA.
[00155] Células REH (Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Alemanha) e células PBMCs foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro de feto de vitelo (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha), 1% de penicilina e estreptomicina (Lonza, Basel, Suíça).
EXEMPLO IV
[00156] Foi determinada a lise de células REH expressando FLT3/CD19 (Fig. 4A) e células SKMel63 expressando CSPG (Fig. 4B) por anticorpos biespecíficos e células CD8+T killer ativadas.
[00157] Células mononucleares humanas (PBMCs) foram estimuladas usando o anticorpo CD3 monoespecífico UCHT1 (10 ng/ml) por três dias. Em seguida células CD8+T ativadas foram isoladas por seleção positiva usando classificação celular magnética. As células foram adi- cionadas a células REH positivas para FLT3/CD19 marcadas com “Cr (Fig. 4A) ou células SKMel63 positivas para CSPG4 (Fig. 4B), e incu- badas com anticorpos nas concentrações conforme indicado. Depois de 4 horas os sobrenadantes celulares foram colhidos sobre placas de cintilação e a radioatividade foi determinada em um contador de cinti- lação.
[00158] A lise específica em percentagem foi analisada sob condições experimentais definidas como se segue: cpmí(exp)-cpom(bg) / cpm(100)-cpm(bg), em que cpm(bg) corresponde à liberação de cromo sem anticorpo e células efetoras, e com(100) corresponde à liberação de cromo depois de incubação de células alvo com um detergente.
[00159] Células SKMel63 foram obtidas do Dr. B. Gúckel, Klinik fúr Gynâkologie, University of Túbingen, Alemanha.
[00160] EXEMPLO V
[00161] A taxa de agregação e de produção de anticorpos FLT3 X CD3 (sítio de ligação de FLT: clone 4G8, sítio de ligação de CD3: clo- ne UCHT1) tendo especificidade idêntica foi comparada entre três dife- rentes formatos: formato de cadeia única biespecífica (bs-scFv), for- mato bsFc“º-1/2, formato bsFc“º-1. A molécula de anticorpo do “forma- to bsFcº-1/2" consistiu das cadeias de SEQ ID NO: 1 e de SEQ ID NO: 6 e a molécula de anticorpo do “formato bsFc“º-1" consistiu das cadeias de SEQ ID NO: 1 e de SEQ ID NO: 26.
[00162] Moléculas de cadeia única biespecíficas foram purificadas por cromatografia por afinidade usando proteína L.
[00163] Foi realizada filtração por gel usando uma coluna superdex 200 PC3.2/80 e um SMARTSystem (GE-Healthcare, Munich, Alema- nha). As proteínas padrão usadas foram catalase (232 kDa, de fígado bovino), aldolase (158 kDa; de músculo de coelho), albumina (67 kDa; de soro bovino) e ribonuclease A (13.7 kDa; de pâncreas bovino). Os resultados são mostrados na Fig. 5A. É evidente a partir da Fig. 5A que a formação de agregados é consideravelmente mais acentuada se o anticorpo for expressado como bs-scFv (taxa de agregação de 43 %) ao invés de bsFcko-1/2 (nenhuma agregação detectada) ou bsFcko-1 (taxa de agregação de 2 %), isto é, as moléculas de anticorpo biespe- cífico da presente invenção permanecem moléculas monoméricas com essencialmente nenhuma tendência para agregação.
[00164] Para comparação das taxas de produção dos genes codifican- do para moléculas biespecíficas contendo a especificidade para 4G8 (anti-FLT3) e a especificidade para UCHT1 (anti-CD3) - nos formatos representados foram introduzidos em células Sp2/0 e anticorpos foram purificados usando cromatografia por afinidade. A quantidade de anti- corpo purificado a partir dos sobrenadantes de clones selecionados para máxima produção é representada na Fig. 5B. As concentrações de anticorpos foram determinadas por espectroscopia ótical presumin- do uma densidade ótica a 280nm de 1,4 para uma concentração de anticorpo de 1 mg/ml. As taxas de produção para as moléculas de an- ticorpo bsFcko-1/2 e bsFcko-1 da invenção foram significativamente maiores do que as para a molécula bs-scFv respectiva.
[00165] Uma pessoa versada na arte vai prontamente reconhecer que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter os fins e as vantagens mencionados, bem como os inerentes à mes- ma. Além disso, será prontamente evidente para uma pessoa versada na arte que podem ser feitas substituições e modificações variáveis para a invenção revelada aqui, neste requerimento de patente, sem se afastar do âmbito e do espírito da invenção. As composições, os mé- todos, os procedimentos, os tratamentos, as moléculas e os compos- tos específicos descritos aqui, neste requerimento de patente, são a- tualmente representativos de determinadas modalidades são exempla- res e não se pretende que sejam considerados como limitações do âmbito da invenção. Modificações dos mesmos e outras utilizações ocorrerão para as pessoas versadas na arte as quais são englobadas dentro do espírito da invenção são definidas pelo âmbito das reivindi- cações. A listagem ou discussão de um documento previamente publi- cado nesta especificação não deve ser tomada necessariamente como um reconhecimento de que o documento é parte do estado da arte ou é conhecimento geral comum.
[00166] A invenção ilustrativamente descrita aqui, neste requerimento de patente, pode ser praticada convenientemente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especifi- camente revelados aqui, neste requerimento de patente. Deste modo, por exemplo, os termos “que compreende”, “incluindo,” contendo”, etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui, neste requerimento de paten- te, foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção na utilização de semelhantes termos e expres- sões de excluir quaisquer equivalentos das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos, mas se reconhece que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Deste modo, deve ser entendido que embora a presente invenção te- nha sido especificamente revelada por modalidades exemplares e ca- racterísticas opcionais, modificação e variação das invenções incorpo- radas na mesma podem ser utilizadas por aqueles versados na arte, e que semelhantes modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invenção.
[00167] A invenção foi amplamente e genericamente descrita aqui, neste requerimento de patente. Cada uma das espécies mais limitadas e dos grupamentos subgenéricos que estejam dentro da revelação ge- nérica também forma parte da invenção. Isto inclui a descrição genéri- ca da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, independente de se ou não o material excisado é especificamente mencionado aqui, neste requerimento de patente.
[00168] Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindica- ções. Além disso, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, as pessoas versadas na arte reconhecerão que a invenção também é descrita desse modo em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. Lista de Referência 1 Davis, L., Vida, R. and Lipsky, P. E. Regulation of human T Iym- phocyte mitogenesis by antibodies to CD3, J. Immunol., 137: 3758- 3767, 1986.
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Claims (16)

UT REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de anticorpo biespecífico recombinante, carac- terizada pelo fato de que consiste de um fragmento Fab que compre- ende um primeiro sítio de ligação para um primeiro antígeno, um frag- mento Fv de cadeia única que compreende um segundo sítio de liga- ção para um segundo antígeno e um domínio CH2 de imunoglobulina, em que o fragmento Fab e o fragmento Fv de cadeia única são ligados através do domínio CH2, em que no mínimo um resíduo aminoácido do domínio CH2 que é capaz de mediar a ligação a receptores de Fc está ausente ou mutado, e em que adicionalmente um ou mais resí- duo(s) aminoácido(s) de posições de sequência 226, 228 e 229, es- tá(ão) ausente(s) ou mutado(s).
2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a) em que ou o primeiro sítio de ligação ou o segundo sítio de ligação se liga a um antígeno associado a tumor, em que (i) o antígeno associado a tumor é, preferencialmente, loca- lizado sobre a vasculatura de um tumor; e/ou (ii) o antígeno associado a tumor é, preferencialmente, um antígeno de superfície ou um antígeno da matriz extracelular/ e/ou (ili) o antígeno associado a tumor é, preferencialmente, se- lecionado do grupo que consiste em CD10, CD19, CD20, CD?21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CDw5?2, ti- rosina quinase semelhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1IR, (CD115), CD133, PDGFR-a (CD140a), PDGFR- B (CD140b), proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPGA, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina associado com melanoma), Muc-1, EGFR, de2- 7-EGFR, EGFRvIll, Proteína de ligação de folato, Her2neu, Her3, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, HLA-DR, IGFR, CD133, IL3R, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Carboanidrase IX (MN/CA IX), Antí geno carcinoembrionário (CEA), ECAM, CDCP1, Derlin1, Tenascina, frizzled 1-10, os antígenos vasculares VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), Endoglin, CLEC14, Tem1-8, e Tie2; e/ou b) em que ou o primeiro sítio de ligação ou o segundo sítio de ligação, preferencialmente, se liga a uma molécula de receptor es- pecífico para células T ou para células NK (natural killer),
em que a molécula de receptor específico para células T ou para células NK é, preferencialmente, uma de CD3, o receptor de célu- las T(TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95,
em que o TCR é, preferencialmente, TCR (alfa/beta) ou TCR (gama/delta); e/ou c) o fragmento Fab é ligado ao domínio CH2 através dos domínios CH1 e VH de cadeia pesada do fragmento Fab ou através dos domínios de cadeia leve CL e VL do fragmento Fab,
em que os domínios de cadeia pesada do fragmento Fab ou os domínios de cadeia leve do fragmento Fab são, preferencial- mente, arranjados no N-terminal da cadeia de polipeptídeo;
em que o domínio CH2 é, preferencialmente, ligado ao fra- gmento scFv através do domínio variável da cadeia leve (domínio VL) do fragmento scFvy que compreende o segundo sítio de ligação ou através do domínio variável da cadeia pesada (domínio VH) do frag- mento scFv que compreende o segundo sítio de ligação; ou
(iv) o fragmento Fab que compreende o primeiro sítio de li- gação para o primeiro antígeno, preferencialmente, consiste do domí- nio VL fusionado ao domínio CH1 e do domínio VH fundido ao domínio CL,
em que o domínio CH1 do fragmento Fab é, preferencial- mente, fusionado ao domínio CH2, e/ou em que a cadeia VL-CH1 do fragmento Fab é, preferencialmente, arranjada no N-terminal da cadeia de polipeptídeo; e/ou d) em que o fragmento Fab compreende uma região de ar- ticulação; e/ou e) em que o primeiro sítio de ligação se liga a um antígeno de superfície associado a tumor e o segundo sítio de ligação se liga a um entre CD3, o receptor de células T (TOR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95.
3. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que no mínimo um resíduo aminoácido do domínio CH2 que é capaz de mediar a ligação a receptores de Fc está ausente ou mutado, é selecionado do grupo que consiste na posi- ção de sequência 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327, e 330 (numeração de posições de sequência de acordo com O Índice da União Européia (EU-index)).
4. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma cisteína em uma ou ambas as po- sições 226 e 229 é substituída por um aminoácido diferente.
5. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende no mínimo uma mu- tação selecionada do grupo que consiste em uma eliminação do ami- noácido 228, uma eliminação do aminoácido 229, uma eliminação do aminoácido 230, uma eliminação do aminoácido 231, uma eliminação do aminoácido 232, uma eliminação do aminoácido 233, uma substi- tuição Glu233—Pro, uma substituição Leu234—- Val, uma eliminação do aminoácido 234, uma substituição Leu235—Ala, uma eliminação do aminoácido 235, uma eliminação do aminoácido 236, uma eliminação do aminoácido 237, uma eliminação do aminoácido 238, uma substi- tuição Asp265—Gly, uma substituição Asn297 >Gln, uma substituição Ala327 >Gln, e uma substituição Ala330—Ser.
6. Molécula de anticorpo biespecífico recombinante, carac- terizada pelo fato de que consiste em um fragmento Fab que compre-
ende um primeiro sítio de ligação para um primeiro antígeno, um frag- mento Fv de cadeia única que compreende um segundo sítio de liga- ção para um segundo antígeno, um domínio CH2 de imunoglobulina, e um domínio CH3 de imunoglobulina, em que o fragmento Fab e o fra- gmento Fv de cadeia única são ligados um ao outro através do domí- nio CH2 e domínio CH3, e em que no mínimo um resíduo aminoácido do domínio CH2 que é capaz de mediar a ligação a um receptor de Fc está ausente ou mutado, em que o no mínimo um resíduo aminoácido do domínio CH2 que é capaz de mediar a ligação a um receptor de Fc ausente ou mutado é selecionado do grupo que consiste nas posições de sequência 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 e 330 (numeração de posições de sequência de acordo com O Índice da União Européia), em que a) o primeiro sítio de ligação se liga a uma molécula de re- ceptor associada a célula T ou célula NK e em que o segundo sítio de ligação se liga a um antígeno de superfície associado a tumor; ou b) o segundo sítio de ligação se liga a uma molécula de re- ceptor associada a célula T ou célula NK e em que o primeiro sítio de ligação se liga a um antígeno de superfície associado a tumor.
7. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que: a) compreende no mínimo uma mutação selecionada entre o grupo que consiste de uma eliminação do aminoácido 228, uma eli- minação do aminoácido 230, uma eliminação do aminoácido 231, uma eliminação do aminoácido 232, uma eliminação do aminoácido 233, uma substituição Glu233—>Pro, uma eliminação do aminoácido 234, uma substituição do aminoácido Leu234-—Val, uma eliminação do aminoácido 235, uma substituição Leu235—Ala, uma eliminação do aminoácido 236, uma eliminação do aminoácido 237, uma eliminação do aminoácido 238, uma substituição Asp265—Gly, uma substituição
Asn297 5Gln, uma substituição Ala327-GInh, e uma substituição Ala330—Ser; e/ou b) em que o antígeno de superfície associado a tumor é se- lecionado do grupo que consiste em CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CDw52, ti- rosina quinase semelhante a Fms 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1IR (CD115), CD133, PDGFR-a (CD140a), PDGFR- B (CD140b), proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPGA4, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina associado com melanoma), Muc-1, EGFR, de2- 7-EGFR, EGFRvIIl, Proteína de ligação de folato, Her2neu, Her3, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, HLA-DR, IGFR, CD133, IL3R, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Carboanidrase IX (MN/CA IX), Antí- geno carcinoembrionário (CEA), EBPCAM, CDCP1, Derlin1, Tenascina, frizzled 1-10, os antígenos vasculares VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), Endoglin, CLEC14, Tem1-8, e Tie2; e/ou c) em que a molécula de receptor associado a célula T ou célula NK é uma entre CD3, o receptor de células T (TCR), CD28, CD16, NKG2D,Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95, em que o TCR é, preferencialmente, TOR (alfa/beta) ou TCR (gama/delta).
8. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fab é ligado ao domínio CH2 através de um domínio de cadeia pesada do fragmento Fab ou através de um domínio de cadeia leve do fragmento Fab, em que os domínios de cadeia pesada do fragmento Fab são, preferencialmente, arranjados no N-terminal da cadeia de polipep- tídeo.
9. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2/CH3 são ligados ao fragmento scFv através do domínio variável da cadeia leve (domínio VL) do fragmento scFv que compreende o segundo sítio de ligação ou através do domínio variável da cadeia pesada (domínio VH) do frag- mento scFv que compreende o segundo sítio de ligação.
10. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação se liga a um antígeno de superfície associado a tumor e o se- gundo sítio de ligação liga um entre CD3, o receptor de células T (TCR), CD28, CD16, NKG2D,Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95, em que a) a molécula de anticorpo, preferencialmente, compreende um resíduo cisteína na posição de sequência 226 e/ou 229 (numera- ção de posições de sequência de acordo com o índice da União Euro- péia), e/ou em que a molécula de anticorpo, preferencialmente, com- preende no mínimo uma modificação no domínio CH3 que previne a dimerização deste domínio; ou b) no mínimo um resíduo aminoácido de cisteína que é ca- paz de formar uma ponte dissulfeto para dimerização é, preferencial- mente, ausente ou mutado.
11. Molécula de anticorpo tetramérica, caracterizada pelo fato de que consiste em um dímero da molécula de anticorpo biespecí- fico, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que a molécula de anticorpo tetramérica, preferencialmente, compreende uma ponte dissulfeto entre as regiões de articulação da molécula de anticorpo biespecífico, em que a ponte de dissulfeto é, preferencial- mente, formada por no mínimo um entre o resíduo cisteína na posição de sequência 226 ou 229 (numeração de posições de sequência de acordo com o índice da União Européia).
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para utili- zação no tratamento de uma doença, em que a doença é, preferenci- almente, uma doença proliferativa selecionada do grupo que consiste em malignidades hematopoiéticas, tais como leucemias linfática e mie- lóide aguda e crônica, bem como linfomas, tumores sólidos tais como tumores do trato gastrointestinal, pulmonares, renais, de próstata, de mama, cerebrais, de ovário, uterinos, tumores mesenquimais e mela- noma.
14. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, preferencialmente, compreendida em um vetor ou uma célula hospedeira compreendendo a referida molécu- la de ácido nucleico ou o referido vetor.
15. Método de produção de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracteri- zado pelo fato de que compreende a expressão de um ácido nucléico codificando a molécula de anticorpo sob condições que permitem a expressão do ácido nucléico, em que a molécula de anticorpo é, prefe- rencialmente, expressa em uma célula hospedeira ou um sistema livre de células.
16. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concre- tizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inici- almente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
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