TW202334223A - Ｃｄ２０－ｐｄ１結合分子及其使用方法 - Google Patents

Ｃｄ２０－ｐｄ１結合分子及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202334223A
TW202334223A TW111142862A TW111142862A TW202334223A TW 202334223 A TW202334223 A TW 202334223A TW 111142862 A TW111142862 A TW 111142862A TW 111142862 A TW111142862 A TW 111142862A TW 202334223 A TW202334223 A TW 202334223A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
protein
agonist
domain
monomer
Prior art date
Application number
TW111142862A
Other languages
English (en)
Inventor
揚 沈
王蓓
那伽 阿瓦魯
家楊 林
安德魯 墨非
艾努爾 赫曼
智惠 金
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商再生元醫藥公司 filed Critical 美商再生元醫藥公司
Publication of TW202334223A publication Critical patent/TW202334223A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本揭示文係關於能與CD20和PD1二者結合之分子，以及包括此等分子之醫藥組成物和其使用方法。

Description

CD20-PD1　結合分子及其使用方法
相關申請案之交互參照
本申請書係聲請2021年11月11日申請之美國臨時申請案號63/278,454及2021年11月11日申請之美國臨時申請案號63/278,374的優先權，其各自內容係以全文引用的方式併入本文中。 序列表
本申請書含有一已以電子方式提交之序列表，且其全部內容係以引用的方式併入本文。該副本係創建於2022年11月8日，命名為RGN-012TW_SL.xml，大小為63,928個位元組。
當有機體對其自體細胞和組織具有異常免疫反應時，即發生自體免疫性疾病。幾十年來已努力了解自體免疫。在此期間，很明顯，免疫系統進化出多種機制來控制自體反應。這些機制中的一或多項缺陷可能導致耐受性崩潰，並可能造成自體免疫疾病。
全身性和器官特異性自體免疫病症之初始觸發可能涉及藉由先天傳感器辨識自體或外來分子。此辨識觸發了發炎反應和先前靜止自體反應性T細胞和B細胞的參與。Theofilopolous、Kono和Baccala, 2017, Nat Immunol, 18(17):716-724。自體反應性範圍從淋巴細胞選擇和免疫系統恆定所必需的低「生理」程度之自體反應性，到表現為循環自體抗體和無臨床後果的小組織浸潤之中等程度的自體免疫，再到與免疫媒介的器官相關損傷之致病性自體免疫。Theofilopolous、Kono和Baccala, 2017, Nat Immunol, 18(17):716-724。自體免疫疾病分為器官特異性(例如第I型糖尿病(T1D)、多發性硬化症(MS)、發炎性腸疾病(IBD)、重症肌無力)和全身性(例如全身性紅斑性狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、薛格連氏症候群(Sjögren’s syndrome))並可藉由自體抗體或細胞毒性T細胞來媒介，但在所有情況下都需要輔助T細胞。Theofilopolous、Konoc和Baccala, 2017, Nat Immunol, 18(17):716-724。
大多數的自體免疫疾病展現出臨床異質性、多基因性質和多因素作用，通常需要遺傳和環境因素。四種機制有助於控制逃逸的自體反應性T細胞和B細胞：抑制分子、無反應性(anergy)、忽略(ignorance)和主動抑制。Kono和Theofilopolous，Kono和Baccala，2017, Nat Immunol, 18(17):716-724。數種抑制性分子(例如CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM3、VISTA、TIGIT、FcγRIIb、特定的Siglecs)係表現在T細胞和B細胞表面，用以抑制正常和抗-自體二者的過度免疫反應。這些分子中某些分子之缺陷會導致自體免疫，其提供了自體反應性淋巴細胞係存在於外周血庫(reperioire)中但正常係在控制中之強力證據。參見Paterson和Sharpe, 2010, Nat Ummunol, 11:109-111；Okazaki et al., 2013, Nat Immunol, 14:1212-1218；Pincetic et al., 2014, Nat Immunol, 15:707-716；Macauley, Crocker, and Paulson, 2914, Nat Rev Immunol, 14:653-666；Ceeraz et al., 2016, Arthritis Rheumatol 69(4):814-825；及Schmitt et al., 2016, J Exp Med, 213:1627-1644。由於不受限制的自體反應性之範圍廣泛的免疫相關不良事件經常發生。Michot et al., 2016, Eur J Cancer, 54:139-148。
現有的自體免疫疾病治療僅具有有限的成效。例如，通常可能經由代謝控制來矯正器官特異性自體免疫疾病。在功能喪失且無法恢復的情況下，機械替代品或組織移植物可能為適合的。雖然使用這種方法可能減輕一些症候，但對於數種最致失能的自體免疫疾病，尚無有效的長期有療效治療。雖然許多化合物，包括胰島素、皮質類固醇和修飾的β干擾素可改善某些自體免疫疾病之症候，但可能具有嚴重的副作用及/或需要長期使用。一般的免疫抑制藥物治療，例如以環孢菌素A(cyclosporin A)、FK506和雷帕黴素(rapamycin)長期治療，亦無法治癒這些疾病，且其使用係伴隨著許多有害的副作用。該等作用包括腎毒性、增加感染性疾病易感性和提升腫瘤形成的發生率。
因此，尋找可用於治療自體免疫疾病之新穎治療組成物和方法。
本揭示文係提供新穎的CD20-PD1結合分子。本揭示文之CD20-PD1結合分子典型地係包括或由CD20-PD1單體所組成，而該CD20-PD1單體係包括一或多個CD20靶向基團及/或一或多個PD1促效劑基團。本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括一蛋白，該蛋白包括至少一個CD20靶向基團、至少一個PD1促效劑基團、至少一個二聚化基團，及視需要一或多個在蛋白中分隔一或多個基團之連接子基團。在一些具體實施例中，CD20靶向基團為抗-CD20 Fab，PD1促效劑基團為PDL1的胞外域，及二聚化基團為Fc結構域具體實施例，視需要i)Fab的輕鏈不與PDL1的胞外域或其PD1結合部分融合；ii)PD1促效劑基團並非N端與抗-CD20 Fab的VH相連接；iii)PD1促效劑基團並非C端與Fc結構域相連接；iv)該蛋白就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為單價的；iv)該蛋白為不對稱的；v)該蛋白係包括Fc異二聚體；或前述(i)至(vi)中二或多個的任何組合。
示例性的CD20-PD1結合分子係揭示於6.2章節和編號具體實施例1至142中。示例性的CD20靶向基團係揭示於6.2.1章節和編號具體實施例2至6中。示例性的PD1促效劑基團係揭示於6.4章節和編號具體實施例7至22中。
本揭示文進一步係提供編碼CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團和PD1促效劑基團之核酸。編碼由二或多條多肽鏈所組成的CD20-PD1結合分子和CD20-PD1單體的核酸可為單一核酸(例如，編碼所有多肽鏈的載體)或多個核酸(例如，二或多個編碼不同多肽鏈的載體)。本揭示文進一步係提供經工程改造用以表現本揭示文之核酸和CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團和PD1促效劑基團的宿主細胞和細胞株。本揭示文進一步係提供製造本揭示文之CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團和PD1促效劑基團的方法。示例性的核酸、宿主細胞、細胞株和製造CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團和PD1促效劑基團的方法係描述於下文6.8章節和編號具體實施例150至152中。
本揭示文進一步係提供包括本揭示文之CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團和PD1促效劑基團的醫藥組成物。示例的醫藥組成物係描述於下文6.9章節和編號具體實施例153中。
本文中進一步係提供使用本揭示文之CD20-PD1結合分子、CD20-PD1單體、CD20靶向基團、PD1促效劑基團和醫藥組成物的方法，例如，用於治療自體免疫疾病、抑制細胞自體免疫反應，或抑制一對象的免疫系統。示例的方法係描述於下文6.10章節和編號具體實施例154至165中。
6.1 定義
約，大約：在整個說明書中，術語「約」、「大約」及類似術語用在數字前面係表示該數字不一定精確(例如，所占的分數，測量精確度及/或準確度、計時等之偏差)。應了解，在其中X為一數字的情況下，「約X」或「大約X」之揭示亦為「X」之揭示。因此，例如，其中一序列與另一序列具有「約X%序列相同性」之具體實施例的揭示亦為其中該序列與另一序列具有「X%序列相同性」之具體實施例的揭示。
及和或：除非另有指出，否則「或」連接詞應希望係按其正確意義用作布林邏輯運算子(Boolean logical operator)，包括替代物中特徵的選擇(A或B，其中A的選擇與B互斥)和結合特徵的選擇(A或B，其中同時選擇A和B)。在本文中的某些地方，術語「及/或」係用於同一目的，不應解釋為暗示「或」用於指稱互斥的替代物。
抗原結合結構域或 ABD ，和抗原結合片段：術語「抗原結合結構域」或「ABD」和「抗原結合片段」如本文中所用係指能夠特異性、非-共價且可逆性與標靶分子結合之靶向基團的部分。
連結：術語「連結」在CD20-PD1結合分子或其組份的情況下(例如，CD20靶向基團；PD1促效劑基團；二聚化基團)係指二或更多條多肽鏈或多肽鏈之部分間的功能關係。特言之，術語「連結」係指二或更多條多肽相互連結，例如經由分子相互作用非共價連結或經由一或更多個雙硫橋或化學交聯共價連結，從而產生一功能性CD20-PD1結合分子。可能存在於本揭示文之CD20-PD1結合分子中的連結實例包括(但不限於)Fc區中同二聚體和異二聚體Fc結構域之間的連結、Fab或scFv中VH和VL區之間的連結、Fab中CH1和CL之間的連結，以及結構域經取代的Fab中CH3和CH3之間的連結。
二價：術語「二價」如本文中所用有關CD20-PD1靶向分子及/或PD1促效劑基團之CD20-PD1結合分子係指分別具有二個CD20靶向基團(例如抗-CD20抗體的二個抗原結合片段)及/或二個PD1促效劑基團(例如，二個PDL1促效劑基團，二個PDL2促效劑基團或其組合)的CD20-PD1結合分子。CD20-PD1結合分子就一基團類型(例如，CD20靶向基團)可能為二價的而就另外的基團類型(例如，PD1促效劑基團)可能為單價的。
CD20-PD1 結合分子：術語「CD20-PD1結合分子」係指包括至少一CD20靶向基團和至少一PD1促效劑基團之分子。一般而言，CD20-PD1結合分子為由一或多條共同包括至少一CD20靶向基團和至少一PD1促效劑基團之多肽鏈(例如，一、二、三或四條多肽鏈)所組成的分子。
在本揭示文之CD20-PD1結合分子的內文中，術語「CD20-PD1結合分子」有時係指分子的核心組份，亦即CD20靶向基團和PD1促效劑基團，且有時亦指二聚化基團，例如Fc結構域和任何/或相連結的連接子基團。除非內文中另有指出，否則應了解，術語「CD20-PD1結合分子」亦延伸至包括額外特徵的分子，例如，一或多個穩定化基團、一或多個二聚化基團、一或多個連接子基團，以及前述的任何組合。
CD20 靶向基團：術語「CD20靶向基團」係指可與CD20結合的任何分子或其結合部分(例如，免疫球蛋白或其抗原結合片段)。在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括抗-CD20抗體的抗原結合片段。抗-CD20抗體的CD20結合片段可為Fab、Fv或scFv之形式。術語「CD20靶向基團」係包括可與CD20之任何結構域或區域，包括拓撲結構域或跨膜結構域結合的分子。在某些具體實施例中，CD20靶向基團為可與胞外展示於細胞(例如，B細胞)表面上之CD20區域結合的分子。CD20靶向基團係進一步描述於6.2章節中。
互補決定區或 CDR：術語「互補決定區」或「CDR」，如本文中所用，係指抗體可變區內賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸序列。一般而言，各重鏈可變區有三個CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，各輕鏈可變區有三個CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用於鑑別CDR邊際的示例性約定包括例如Kabat定義、Chothia定義、ABM定義和IMGT定義。參見，例如Kabat, 1991, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (Kabat編號方案)；Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948 (Chothia編號方案)；Martin et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (ABM編號方案)；和Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 (IMGT編號方案)。亦有可用於鑑別抗體內之CDR序列的公共資料庫。
二聚化基團：術語「二聚化基團」係指能促進兩條多肽鏈之間連結形成二聚體的多肽鏈或胺基酸序列。第一二聚化基團可與相同的第二二聚化基團連結，或可與不同於第一二聚化基團的第二二聚化基團連結。在某些具體實施例中，二聚化基團為Fc一結構域，其中二個Fc結構域的結合形成Fc區。因此，Fc區可為同二聚體或異二聚體。
EC50：術語「EC50」係指一分子(例如CD20-PD1結合分子)的半數最大有效濃度，其係在特定的暴露時間後引發基線和最大值之間的半數反應。EC50基本上係代表其中觀察到50%最大效應之抗體或CD20-PD1結合分子的濃度。在特定的具體實施例中，EC50係等於如7.1.3.3章節所述於一分析中得到的半數最大活化之CD20-PD1結合分子濃度。
表位：表位或抗原決定位為如本文中所述被抗體或其他之抗原結合部分所辨識之抗原(例如，標靶分子)的一部分。表位可為線性或構形。
Fab：術語「Fab」在本揭示文之靶向基團的內容中係指一對多肽鏈，第一條係包含抗體N端的可變重鏈(VH)結構域連接第一恆定結構域(文中稱為C1)，及第二條係包含抗體N-端之可變輕鏈(VL)結構域連接能夠與第一恆定結構域配對的第二恆定結構域(文中稱為C2)。在天然抗體中，VH為N-端連接重鏈的第一個恆定結構域(CH1)而VL為N-端連接輕鏈恆定結構域(CL)。本揭示文之Fab可根據天然方向排列或包括促進正確VH和VL配對之結構域取代或交換。例如，可以一對CH3結構域替換Fab中成對的CH1和CL結構域用以促進異二聚體分子中正確修飾的Fab鏈配對。亦可以將CH1和CL對調，使得CH1與VL相連接，而CL與VH相連接，一種一般稱為Crossmab(一種結構域交換類型)的構型。
Fc 結構域和 Fc 區：術語「Fc結構域」係指與另外重鏈之對應部分配對的重鏈部分。術語「Fc區」係指藉由二個重鏈Fc結構域連結所形成之以抗體為基礎的結合分子區域。Fc區內的二個Fc結構域彼此可相同或不同。在天然抗體中，Fc結構域典型為相同的，但一或二個Fc結構域有利地可經修飾以允許異二聚化，例如，經由旋鈕入孔洞(knob-in-hole)相互作用及/或用於純化，例如經由星狀突變。
宿主細胞或重組的宿主細胞：術語「宿主細胞」和「重組的宿主細胞」如文中所用係指經基因工程改造，例如經由導入一異源性核酸之細胞。應理解，此等術語希望不僅係指特定的主體細胞亦指該等細胞之子代。由於突變或環境影響可能在繼代中發生特定修飾，因此，此等子代實際上可能與親代細胞不相同，但仍包括在本文中所用的術語「宿主細胞」範圍內。宿主細胞可過渡性攜帶異源核酸，例如在染色體外異源表現載體上，或穩定地攜帶異源核酸，例如經由將異源核酸整合至宿主細胞基因體中。就表現CD20-PD1結合分子之目的，宿主細胞可為哺乳動物來源或類哺乳動物特質的細胞株，例如猴腎細胞(COS，例如COS-1、COS-7)、HEK293、幼倉鼠腎(BHK，例如BHK21)、中國倉鼠卵巢(CHO)、NSO、PerC6、BSC-1、人類肝細胞癌細胞(例如HepG2)、SP2/0、HeLa、Madin-Darby牛腎(MDBK)，骨髓瘤和淋巴瘤細胞，或其衍生物和/或工程改造變體。工程改造變體包括，例如，聚醣圖譜修飾和/或位點特異性整合位點衍生物。
單體和 CD20-PD1 單體：術語「單體」和「CD20-PD1單體」如本文所用係指包括第一多肽鏈的分子，該第一多肽鏈係(a)包括至少一CD20靶向基團且能與第二多肽鏈連結；(b)包括至少一PD1促效劑基團且能與第二多肽鏈結合；(c)包括一二聚化基團(例如，一Fc結構域)且能與第二多肽鏈上的對應二聚化基團結合(例如，另外的Fc結構域)；或(d)上述(a)、(b)和(c)的任何組合。單體能經由二聚化基團(例如，Fc結構域)配對與其他單體結合。在某些具體實施例中，單體之間的一或多種結合係經由絞鏈序列或Fc結構域的其他部分來使其穩定。因此，本揭示文之單體能與另外的單體連結，形成二聚體。二聚體可為同二聚體，其中各組成單體為相同的，或異二聚體，其中各組成單體為不同的。如本文中所用，有關「單體」係就方便起見且不排除存在一或多條另外的多肽鏈，例如一或多個Fab結構域的一或多條輕鏈。因此，二個單體的「二聚體」可包括二條以上的多肽鏈，例如，可包括三、四或更多條多肽鏈，且有關單體或二聚體並不希望牽涉多肽鏈之間連結的任何時間順序。
單價：術語「單價」如文中所用有關CD20-PD1結合分子中關於CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團係指分別具有一CD20靶向基團(例如抗-CD20抗體的抗原結構域)及/或一PD1促效劑基團(例如，一PDL1促效劑基團或一PDL2促效劑基團)的CD20-PD1結合分子。CD20-PD1結合分子就一基團類型(例如，PD1促效劑基團)可為單價的，而就另外的基團類型(例如，CD20靶向基團)可為雙價的。
多價：術語「多價」如本文中所用係有關CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團中，關於CD20-PD1結合分子係指CD20-PD1結合分子分別具有二或更多個CD20靶向基團(例如，抗CD20抗體的二個抗原結合片段)及/或二或更多個PD1促效劑基團(例如，二個PDL1促效劑基團、二個PDL2促效劑基團或其組合)。CD20-PD1結合分子就一基團類型(例如，CD20靶向基團)可為多價的，而就另外的基團類型可為單價的(例如，PD1促效劑基團)。
操作上連接：術語「操作上連接」如本文中所用係指多肽鏈之二或更多個區間的功能關係，其中該二或更多個區係相連接而得以產生一功能性多肽，或二或更多個核酸序列，例如，用以產生二個多肽組份之框內融合或將一調節序列連接至一編碼序列。
PD1 促效劑基團：術語「PD1促效劑基團」係指可結合及促效PD1的任何分子或其部分。在某些具體實施例中，PD1促效劑基團係包括與程序性死亡配體1(PDL1)或其PD1結合部分的胞外結構域，較佳地哺乳動物PDL1(例如，人類或小鼠PDL1)具有至少70%序列相同性的胺基酸序列。在其他具體實施例中，PD1促效劑基團係包括與程序性死亡配體(PDL2)或其PD1結合部分的胞外結構域，較佳地哺乳動物PDL2(例如，人類或鼠類PDL2)具有至少70%序列相同性的胺基酸序列。PDL1和PDL2的胞外結構域有時分別稱為「PDL1胞外域」和「PDL2胞外域」。本說明書中方便地使用術語「PDL1胞外域」和「PDL2胞外域」不僅係指PDL1和PDL2胞外域，另外亦指具有PD1結合活性的片段和變體序列。因此，本說明書中有關術語「PDL1胞外域」和「PDL2胞外域」希望係涵蓋PDL1和PDL2胞外域的PD1結合部分以及其具有PD1結合功能的變體，例如與PD1或PD2具有至少70%或更高的序列相同性和保留PDL1結合之胺基酸序列。
CD20-PD1結合分子可包括相較於對應的野生型序列具有一或多個胺基酸取代、刪除及/或插入之PD1促效劑基團。例如，在某些具體實施例中，PD1促效劑基團為包括C113S取代之鼠類PDL1胞外域。
PD1促效劑基團進一步係描述於6.2.1章節。
單鏈 Fv 或 scFv：術語「單鏈Fv」或「scFv」如文中所用係指包括抗體之VH和VL結構域的多肽鏈，其中這些結構域係存在於單一多肽鏈中。
對象：術語「對象」係包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲類和爬蟲類。除非有標註，否則術語「病患」或「對象」在本文中可交換使用。
治、治療：如本文中所用，術語「治」、「治療」係指因投予一分子或組成物(例如，一或多種本揭示文之CD20-PD1結合分子)所產生之降低或改善如本文中所述之病症的進程、嚴重性及/或持續時間，改善如本文中所述之症狀或病症的一或多個症候(較佳地，一或多個可辨別的症候)，或預防如本文中所述之症狀或病症，例如自體免疫或發炎性症狀或病症。在特定的具體實施例中，術語「治」、「治療」係指改善至少一病症，例如自體免疫病症之一個並不一定可由病人辨別的可測量身體參數。在其他的具體實施例中，術語「治療」係指在身體上，藉由，例如穩定可辨別的症候，在生理上，藉由穩定生理參數，或二者，抑制一病症的進程或發作。
通用輕鏈 (universal light chain)：術語「通用輕鏈」如本文中所用，在靶向基團之內容中係指能與靶向基團的重鏈區配對且亦能與其他重鏈區配對之輕鏈多肽。通用輕鏈亦稱為「普通輕鏈(common light chain)」。
VH ：術語「VH」係指抗體的免疫球蛋白重鏈之可變區，包括scFv或Fab之重鏈。
VL ：術語「VL」係指免疫球蛋白輕鏈之可變區，包括scFv或Fab之輕鏈。 6.2. CD20-PD1 結合分子
本揭示文係提供CD20-PD1結合分子，其包括至少一CD20靶向基團和至少一PD1促效劑基團。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子亦包括二聚化基團
本揭示文之CD20-PD1結合分子典型地係包括或由CD20-PD1單體所組成，而該CD20-PD1單體係包括一或多個CD20靶向基團及/或一或多個PD1促效劑基團。本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括一蛋白，該蛋白包括至少一個CD20靶向基團、至少一個PD1促效劑基團、至少一個二聚化基團，及視需要一或多個在蛋白中分隔一或多個基團之連接子基團。
在某些具體實施例中，PD1促效劑基團係位於CD20-PD1單體之CD20靶向基團和二聚化基團之間。在此等具體實施例中，當CD20靶向基團和PD1促效劑基團二者係以N端與二聚化基團連接時，該CD20-PD1單體因此具有CD20靶向基團-PD1促效劑基團-二聚化基團之N-至-C端的向位。在此等具體實施例中，當CD20靶向基團和PD1促效劑基團二者係以C端與二聚化基團連接時，該CD20-PD1單體因此具有二聚化基團-PD1促效劑基團-CD20靶向基團之N-至-C端的向位。
在某些具體實施例中，例如其中CD20靶向基團為抗-CD20 Fab，PD1促效劑基團為PDL1的胞外域，及二聚化基團為Fc結構域的具體實施例中，該CD20-PD1結合分子視需要係具有一或多個下列特徵：i)Fab的輕鏈不與PDL1的胞外域或其PD1結合部分融合；ii)PD1促效劑基團並非N端與抗-CD20 Fab的VH相連接；iii)PD1促效劑基團並非C端與Fc結構域相連接；iv)該蛋白就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為單價的；v)該蛋白為不對稱的；vi)該蛋白係包括Fc異二聚體；或前述(i)至(vi)中二或多個的任何組合。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵i)(亦即Fab的輕鏈不與PDL1的胞外域或其PD1結合部分融合)。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵ii)(亦即，PD1促效劑基團並非N端與抗-CD20 Fab的VH相連接)。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵 iii)(亦即，PD1促效劑基團並非C端與Fc結構域相連接)。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵iv)(亦即，該蛋白就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為單價的)。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵v)(亦即，該蛋白為不對稱的)。在某些具體實施例中，該CD20-PD1結合分子係具有特徵vi)(亦即，該蛋白係包括Fc異二聚體)。本揭示文之CD20-PD1結合分子可具有任何二、三、四、五個或所有前述特徵之組合。例如，在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係具有特徵ii)(亦即，PD1促效劑基團並非N端與抗-CD20 Fab的VH相連接)和特徵iii)(亦即，PD1促效劑基團並非C端與Fc結構域相連接)。
示例的二聚化基團係描述於6.5章節中並包括賦予CD20-PD1結合分子同二聚化或異二聚化能力之Fc結構域。
CD20-PD1結合分子可由一或多條多肽組成。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子係由多個(例如二個)包括至少一CD20靶向基團和/或至少一PD1促效劑基團之單體所組成，並且在某些具體實施例中亦包括二聚化基團。在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係由二個單體所組成，視需要與一或多條額外的多肽鏈(例如，包括抗-CD20 Fab基團之輕鏈的多肽鏈)相連結。單體可為相同的，從而形成同二聚體，或為不同的，從而形成異二聚體。CD20-PD1結合分子之各單體的二聚化基團可經配置共同二聚化。示例的二聚化基團係描述於6.5章節中。
一或多個CD20靶向基團和一或多個PD1促效劑基團可包括在CD20-PD1結合分子的相同臂上(例如，其中CD20靶向基團係包括抗-CD20 Fab而PD1促效劑基團係包括以PDL1為基礎的PD1促效劑基團，抗-CD20 Fab的可變重鏈或可變輕鏈和以PDL1為基礎的PD1促效劑基團係在相同的多肽鏈上)，或可包括在雙特異性CD20-PD1促效劑的不同臂上(例如，其中CD20靶向基團係包括抗-CD20 Fab，PD1促效劑基團係包括以PDL1為基礎的PD1促效劑基團、抗-CD20 Fab的可變重鏈或可變輕鏈以及以PDL1為基礎的PD1促效劑基團係位於不同的多肽鏈上)。本揭示文之CD20-PD1結合分子的示例構型係揭示於，其中包括，圖1A至1L和編號具體實施例31至106中。
CD20-PD1結合分子就CD20靶向基團可為單價的(亦即，具有單一CD20靶向基團)或就CD20靶向基團為多價的(亦即，具有多個CD20靶向基團)。類似地，CD20-PD1結合分子就PD1促效劑基團可為單價的(亦即，具有單一PD1促效劑基團)或就PD1促效劑基團為多價的(亦即，具有多個PD1促效劑基團)。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子就CD20靶向基團為二價的(亦即，具有二個CD20靶向基團)。當CD20-PD1結合分子就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為多價時，該多數個CD20靶向基團彼此可為相同或不同的及/或該多數個PD1促效劑基團彼此可為相同或不同的。
在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子可包括連接其一或多條多肽鏈之各種組分的一或多個連接子序列，例如(1)當存在相同的多肽鏈上時，CD20靶向基團或其一部分(例如，抗-CD20 Fab的重鏈或輕鏈)和PD1促效劑基團或其一部分(例如，PDL1或PDL2)，(2)CD20靶向基團和二聚化結構域(例如，Fc結構域)，(3)PD1促效劑基團和二聚化結構域(例如，Fc結構域)，或(4)上述的任何組合。示例的連接子係描述於6.7章節。
大多數CD20-PD1結合分子憑藉著配置為彼此相連接之二聚化基團(例如，Fc域)而為多聚體。CD20-PD1結合分子可包括二、三、四或更多條多肽鏈，某些係經由二聚化基團連結而其他的係經由VH-VL相互作用連結。僅就方便和描述之目的，本揭示文一般係指含有CD20靶向基團、PD1促效劑基團和/或二聚化基團(例如，第一Fc結構域)的多肽，其能與分別含有CD20靶向基團、PD1促效劑基團及/或對應的二聚化基團(例如，第二Fc結構域)之另外多肽鏈連結合為「單體」。單體可包括一、二、三或更多條多肽鏈。例如，在一具體實施例中，單體可由(a)含有抗-CD20 VH、PD1促效劑基團和Fc結構域的第一多肽鏈和(b)含有能與抗-CD20 VH配對之VL的第二多肽鏈所組成。在另外的具體實施例中，單體可由(a)含有第一抗-CD20 VH、第二抗-CD20 VH和Fc結構域的第一多肽鏈，(b)含有能與第一抗-CD20 VH配對之第一VL的第二多肽鏈以及(c)含有能與第二抗-CD20 VH配對之第二VL的第三多肽鏈所組成。
下文為本本揭示文單體的一些說明性實例，係以N-至-C端方向加以描述。各單體的個別元件係詳述於本文中，例如於後續的小節和編號具體實施例中。
(1)示例單體1：CD20靶向基團–視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1A、1E、1F、1G和1H，左側單體)。
(2)示例單體2：PD1促效劑基團–視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1A，右側單體)。
(3)示例單體3：視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1B、1C和1D，左側單體)。
(4)示例單體4：PD1促效劑基團–視需要連接子– CD20靶向基團–視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1B和1E，右側單體；圖1I，二個單體)。
(5)示例單體5：CD20靶向基團–視需要連接子–二聚化基團–PD1促效劑基團(參見，例如圖1C和1F，右側單體；圖1J，二個單體)。
(6)示例單體6：CD20靶向基團–視需要連接子–PD1促效劑基團–視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1D和1G，右側單體；圖1L，二個單體)。
(7)示例單體7：PD1促效劑基團–視需要連接子–PD1促效劑基團–視需要連接子–二聚化基團(參見，例如圖1H，右側單體)。
(8)示例單體8：CD20靶向基團–視需要連接子–二聚化基團–視需要連接子– CD20靶向基團(參見，例如圖1K，左側單體)。
(9)示例單體9:PD1促效劑基團–視需要連接子–二聚化基團–視需要連接子– PD1促效劑基團(參見，例如圖1K，右側單體)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體1和示例單體2之CD20-PD1結合分子 (參見，例如圖1A)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體3和示例單體4之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1B)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體3和示例單體5之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1C)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體3和示例單體6之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1D)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體1和示例單體4之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1E)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體1和示例單體5之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1F)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體1和示例單體6之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1G)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體1和示例單體7之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1H)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括二個根據示例單體4之單體的CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1I)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括二個根據示例單體5之單體的CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1J)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括示例單體8和示例單體9之CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1K)。
在某些具體實施例中，本揭示文係提供一包括二個根據示例單體6之單體的CD20-PD1結合分子(參見，例如圖1L)。
在本揭示文之CD20-PD1結合分子中，當CD20靶向基團為抗體的抗原結合結構域(「ABD」)時，各單體可由二或更多條多肽鏈所組成，一多肽鏈係帶有重鏈可變區而另一多肽鏈係帶有輕鏈可變區。CD20靶向基團可包括位於個別多肽鏈上之重鏈和輕鏈可變結構域。例如，一單體可由多肽A和多肽B所組成。多肽A，例如，從N-端至C-端可包括：CD20靶向基團的重鏈可變結構域-視需要連接子-PD1促進劑基團-視需要連接子-二聚化基團；而多肽B可包括CD20靶向基團的輕鏈可變結構域。在其中單體就CD20靶向基團為二價時，則該單體可包括一包含CD20靶向基團之另外輕鏈可變結構域的第三多肽鏈(多肽C)。
另一種選擇，CD20靶向基團可為scFv的形式，其中該CD20靶向基團的重鏈和輕鏈可變區係於單一多肽中相互融合。
本揭示文CD20-PD1結合分子之組份的進一步詳情係如下所示。 6.2.1     CD20-PD1 結合分子之生化性質
在活體內，抗體的大複合物可能被吞噬作用迅速消除，而導致抗體功效降低。大複合物亦可能增加治療性抗體的免疫原性。參見，例如WO2020047067A1。在製造期間中，聚集作用為一危及抗體之品質、安全性和功效的常見問題。相較於衍生出CD20靶向基團的親代抗體及/或相較於包括CD20靶向基團和PD1促效劑基團的其他抗體形式，本揭示文之CD20-PD1結合分子可能更不易聚集，例如在活體內或活體外。因此，在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子在哺乳動物細胞株的重組製造期間係具有比親代抗體低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少95%或至少99%的聚集。如7.1.4章節所述，CD20-PD1結合分子的寡聚狀態可藉由例如粒徑排阻超高效液相層析來測定。大多數的CD20-PD1結合分子展現大於85%的單體種類，無需額外的粒徑排阻層析(SEC)(參見7.2.2章節)。然後可用管柱純化來進一步純化單體種類。例如，2+2m20_mPL_4(圖2A的分子L)的單體百分比在二次管柱純化，包括一SEC步驟後，增加到99%(參見7.2.2章節)。
本揭示文之CD20-PD1結合分子亦展現良好的熱穩定性。高熱穩定性和低聚集傾向有利於抗體的製造和儲存並促進較長的血清半衰期。Carter和Merchant，1997，CurrOpinBiotechnol，8(4)：449-454。熱穩定性可藉由本技術領域中已知的方法來測量，包括差示掃描螢光法(DSF)(參見，例如7.1.5章節)。所有受試的CD20-PD1分子當藉由DSF測量係具有類似的熱穩定性，其中熔化溫度1(Tm1)–代表蛋白的第一去摺疊中點–大約60°C(參見7.2.2章節)。 6.3. CD20 靶向基團
在某些具體實施例中，在本揭示文之CD20-PD1結合分子中併入CD20靶向基團係提供高濃度局部化PD1促效劑基團之遞送，用於治療自體免疫性疾病，包括(但不限於)第1型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡和克隆氏症(Crohn’s disease)，以及用於治療移植物抗宿主病(GVHD)。在某些具體實施例中，除了促進PD1促效劑基團的局部遞送外，抗-CD20基團亦提供了對抗此等自體免疫疾病的額外治療途徑。
在本揭示文之特定具體實施例中，CD20-PD1結合分子的各CD20靶向基團係包括一抗-CD20抗體的抗原結合結構域。在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括單一CD20靶向基團(例如，在其中CD20-PD1結合分子就該CD20靶向基團為單價的具體實施例中，在第一單體或第二單體上的CD20靶向基團)。在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括二個CD20靶向基團(例如，在其中CD20-PD1結合分子就該CD20靶向基團為二價的具體實施例中，在第一單體上的第一CD20靶向基團以及在第二單體上的第二CD20靶向基團；或第一和第二CD20靶向基團二者可在第一單體上或在第二單體上)。在此等具體實施例中，二個CD20靶向基團可為相同的，或其可為不同的。當不相同時，二個CD20靶向基團可為正交的，與不同的CD20表位結合，及/或為非競爭性的。
在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括已知抗-CD20抗體的抗原結合結構域。已知抗-CD20抗體之實例包括(但不限於)利妥昔單抗(rituximab)、奧克萊珠單抗(ocrelizumab)、阿托珠單抗(obinutuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab ituxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、TRU-015或維妥珠單抗(veltuzumab)(各自為「參照CD20抗體」)。在另外的具體實施例中，CD20靶向基團係包括具有一參照CD20抗體之CDR序列的CDR。在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括一參照CD20抗體的全部6個CDR序列。在其他的具體實施例中，該靶向基團係包括至少一參照CD20抗體的重鏈CDR序列(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和通用輕鏈的輕鏈CDR序列。在另外方面，CD20靶向基團係包括一VH，而該VH係包括一參照CD20抗體之VH的胺基酸序列。在某些具體實施例中，該CD20靶向基團進一步係包括一VL，而該VL係包括該參照CD20抗體之VL的胺基酸序列。在其他具體實施例中，該靶向基團進一步係包括一通用輕鏈VL序列。
在其他具體實施例中，CD20靶向基團包含一抗原結合結構域，其係與利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗相同之CD20表位結合及/或與彼等競爭和CD20結合。用於測量抗體競爭之分析已為本技術領域中所知。例如，一CD20樣本可與一撐體結合。然後，加入第一抗體和第二抗體。將二種抗體其中之一標定。若經標定的抗體和未經標定的抗體與CD20上的分開和離散位點結合，則無論該未經標定抗體是否存在，該經標定抗體都將以相同量結合。然而，若相互作用位點為相同或重疊，則該未經標定的抗體將競爭，且與抗原結合之經標定抗體的量將降低。若未經標定的抗體係以過量存在，則經標定的抗體，即使有亦極少會結合。在某些具體實施例中，競爭抗體為降低另一抗體與CD20之結合約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%的抗體。進行此等競爭分析之程序的詳情已為本技術領域所熟知並可參見例如Greenfield, Ed., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2014。可藉由使用純化的抗體對此等分析進行定量。可藉由滴定一種自體之抗體來建立標準曲線，亦即，對標定物和競爭物使用相同抗體。滴定未經標定的競爭抗體抑制經標定抗體與測定盤結合的能力。可將結果作圖，並比較達到所欲的結合抑制之程度所需的濃度。在某些具體實施例中，與標靶分子結合之競爭，例如，可在Octet HTX生物傳感器平台(Pall ForteBio Corp.)上使用即時、無標定的生物層干涉分析加以測定。
適合的CD20靶向基團形式係描述於6.3.1章節中。CD20靶向基團較佳地為抗-CD20抗體之CD20結合片段，例如，如6.3.1.1章節中所述的Fab，如6.3.1.2章節中所述的Fv片段或scFv。
CD20靶向基團可併入具有本文中所述之任何構型的CD20-PD1結合分子。CD20-PD1結合分子典型地係由多條多肽鏈所組成，例如如6.2章節中描述的示例單體所示。如6.2章節中所述，CD20靶向基團可併入任一示例單體1、4、5、6和8。併入一或多個示例單體1、4、5、6和8之示例CD20-PD1結合分子係詳述於6.2章節中。 6.3.1.    CD20 靶向基團 形式
在特定方面，CD20靶向基團可為保留與CD20特異性結合之任何類型的抗體或其片段。在某些具體實施例中，抗原結合部分為免疫球蛋白分子，特言之IgG類免疫球蛋白分子，更特言之IgG 1或IgG 4免疫球蛋白分子。抗體片段包括但不限於VH(或V H)片段、VL(或V L)片段、Fab片段、F(ab') 2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗體、雙抗體、三抗體和四抗體。 6.3.1.1. Fab
Fab結構域傳統上係藉由使用酵素例如木瓜蛋白酶對免疫球蛋白分子進行蛋白水解裂解而產生的。在本揭示文之CD20-PD1結合分子中，Fab結構域典型地係重組表現作為CD20-PD1結合分子的一部分。
Fab結構域可包括來自任何適合物種的恆定結構域和可變區序列，且因此可為鼠類、嵌合的、人類或人源化的。在某些具體實施例中，可變區序列及/或恆定結構域區序列係衍生自已知的抗-CD20抗體。已知的抗-CD20抗體之實例包括，但不限於利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗。
在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括一Fab，其係與利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗(各自為「參照CD20抗體」)相同的CD20表位結合及/或與彼等競爭和CD20相結合。在另外的具體實施例中，CD20靶向基團係包括具有一參照CD20抗體之CDR序列的CDR。在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括一參照CD20抗體的全部6個CDR序列。在其他的具體實施例中，該靶向基團係包括至少一參照CD20抗體的重鏈CDR序列(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和通用輕鏈的輕鏈CDR序列。在另外方面，CD20靶向基團係包括一VH，而該VH係包括一參照CD20抗體之VH的胺基酸序列。在某些具體實施例中，該CD20靶向基團進一步係包括一VL，而該VL係包括該參照CD20抗體之VL的胺基酸序列。在其他具體實施例中，該靶向基團進一步係包括一通用輕鏈VL序列。
Fab結構域典型地係包括連接VH結構域的CH1結構域，而該VH結構域係與連接VL結構域的CL結構域配對。在野生型免疫球蛋白中，VH結構域係與VL結構域配對構成Fv區，而CH1結構域係與CL結構域配對進一步使結合模組穩定。二個恆定結構域之間的雙硫鍵可進一步穩定Fab結構域。
就本揭示文之CD20-PD1結合分子，尤其是當輕鏈並非普通或通用輕鏈時，有利的係使用Fab異二聚化策略以允許屬於相同ABD的Fab結構域正確的連結並使屬於不同ABD的Fab結構域之異常配對降至最低。例如，可以使用下表1中所示的Fab異二聚化策略：
表 1 – Fab 異二聚化策略
策略 VH CH1 VL CL 參考文獻
CrossMabCH1-CL(一種類型的「結構與交換」) WT CL結構域 WT CH1結構域 Schaefer et al., 2011, Cancer Cell 2011；20:472-86；PMID:22014573.
正交Fab VHVRD1CH1CRD2 - VLVRD1CλCRD2 39K, 62E H172A, F174G 1R, 38D, (36F) L135Y, S176W Lewis et al., 2014, Nat Biotechnol 32:191-8
正交Fab VHVRD2CH1wt - VLVRD2Cλwt 39Y WT 38R WT Lewis et al., 2014, Nat Biotechnol 32:191-8
TCR CαCβ 39K TCR Cα 38D TCR Cβ Wu et al., 2015, MAbs 7:364-76
CR3 WT T192E WT N137K, S114A Golay at al., 2016, J Immunol 196:3199-211.
MUT4 WT L143Q, S188V WT V133T, S176V Golay at al., 2016, J Immunol 196:3199-211.
DuetMab WT F126C WT S121C Mazor et al., 2015, MAbs 7:377-89；Mazor et al., 2015, MAbs 7:461-669.
結構域交換 WT CH3+旋鈕(knob)或孔洞(hole)突變 WT CH3+孔洞或旋鈕突變 Wozniak-Knopp et al., 2018, PLoSONE13(4):e0195442
因此，在特定的具體實施例中，係藉由將Fab的VL和VH結構域相互交換或將CH1和CL結構域相互交換來促進Fab之二條多肽之間的正確結合，例如，如WO 2009/080251中所述。
正確的Fab配對亦可藉由在Fab的CH1結構域中導入一或多個胺基酸修飾和在CL結構域中導入一或多個胺基酸修飾及/或在VH結構域中導入一或多個胺基酸修飾和在VL結構域中導入一個或多個胺基酸修飾來促進。經修飾的胺基酸典型地為VH:VL和CH1:CL界面的一部分，使得Fab組份優先相互配對，而不是與其他Fab的組份配對。
在一具體實施例中，一或多個胺基酸修飾僅限於可變(VH，VL)和恆定(CH1，CL)結構域的保守性框架殘基，如殘基之Kabat編號所示。Almagro, 2008, Frontiers In Bioscience 13:1619-1633係以Kabat、Chothia和IMGT編號為基礎提供了框架殘基之定義。
在一具體實施例中，在VH和CH1和/或VL和CL結構域中導入的修飾為彼此互補的。重鏈和輕鏈界面的互補性可以空間和疏水性接觸、靜電/電荷相互作用或各種相互作用之組合來實現。蛋白表面間的互補性係就鎖和鑰匙擬合、旋鈕進入孔洞、突出和空腔、供體和受體等廣泛描述於文獻中，其全部皆蘊含二個相互作用表面之間結構和化學匹配的性質。
在一具體實施例中，一或多個導入的修飾係導入一新的氫鍵穿過Fab組份的界面。在一具體實施例中，一或多個導入的修飾係導入一新的鹽橋穿過Fab組份的界面。示例性的取代係描述於WO 2014/150973和WO 2014/082179中，其內容係以引用的方式併入本文中。
在某些具體實施例中，Fab結構域係包括CH1結構域的192E取代和CL結構域的114A和137K取代，其係在CH1和CL結構域之間導入一鹽橋(參見，例如Golay et al., 2016 , J Immunol 196:3199-211)。
在某些具體實施例中，Fab結構域係包括CH1結構域的143Q和188V取代和CL結構域的113T和176V取代，其係用來交換CH1和CL結構域之間接觸的疏水性和極性區(參見，例如Golay et al., 2016, J Immunol 196:3199-211)。
在某些具體實施例中，Fab結構域可在某些或全部的VH、CH1、VL、CL結構域中包括修飾用以導入促進Fab結構域正確組配的正交Fab界面(Lewis et al., 2014 Nature Biotechnology 32:191-198)。在一具體實施例中，係於VH結構域中導入39K、62E修飾，於CH1結構域中導入H172A、F174G修飾，於VL結構域中導入1R、38D、(36F)修飾，及於CL結構域中導入L135Y、S176W修飾。在另外的具體實施例中，係於VH結構域中導入39Y修飾及於VL結構域中導入38R修飾。
Fab結構域亦可經修飾以工程改造的雙硫鍵取代天然的CH1:CL雙硫鍵，從而增加Fab組份配對的效率。例如，可藉由在CH1結構域中導入一126C及在CL結構域中導入一121C來導入經工程改造的雙硫鍵(參見，例如Mazor et al., 2015, MAbs 7:377-89)。
亦可藉由以提升正確組配的替代結構域置換CH1結構域和CL結構域來修飾Fab結構域。例如，Wu et al.,2015, MAbs 7:364-76，描述了以T細胞受體之恆定結構域取代CH1結構域和以T細胞受體之b結構域取代CL結構域，並藉由在VL結構域中導入38D修飾和在VH結構域中導入39K修飾，將這些結構域置換與VL和VH結構域之間的額外電荷-電荷相互作用配對。
代替或除使用Fab異二聚化策略用以促進正確的VH-VL配對外，普通輕鏈(亦稱為通用輕鏈)的VL可用於本揭示文之CD20-PD1結合分子的各Fab VL區。在各種具體實施例中，相較於使用原來同源的VL，使用使用如文中所述的普通輕鏈降低了不適當類別的CD20-PD1結合分子之數目。在各種具體實施例中，CD20-PD1結合分子的VL結構域係從包括輕鏈的單特異性抗體加以鑑別。在各種具體實施例中，CD20-PD1結合分子的VH區係包括在活體小鼠B細胞內重排的人類重鏈可變基因區段，而這些B細胞先前係經工程改造用以表現有限的人類輕鏈庫，或單一人類輕鏈，與人類重鏈同源，且回應暴露於感興趣的抗原，產生含有多數個人類VH的抗體庫，這些VH係與二個可能的人類VL之一或二者同源，其中該抗體庫對於感興趣抗原具有特異性。普通輕鏈為該等衍生自重排的人類Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的輕鏈，並包括體細胞突變(例如，親和力成熟)版本。參見，例如，美國專利第10,412,940號。 6.3.1.2. scFv
單鏈Fv或「scFv」抗體片段係包括單一多肽鏈中的VH和VL結構域，能以單鏈多肽表現並保留衍生該等單鏈Fv或「scFv」抗體片段之完整抗體的特異性。一般而言，此scFv多肽進一步係包括一介於VH和VL結構域之間的多肽連接子，其能使scFv形成用於標靶結合之所欲結構。適合連接scFV之VH和VL鏈的連接子之實例為6.7章節中所確立的連接子。
除非有指出，否則如本文中所用，scFv可具有任一順序的VL和VH可變區，例如就多肽的N-端和C-端而言，scFv可包括VL-連接子-VH或可包括VH-連接子-VL。
scFv可包括來自任何適合物種的VH和VL序列，例如鼠類、人類或人源化VH和VL序列。在某些具體實施例中，scFv可包括來自已知抗-CD20抗體之VH和VL序列。已知抗-CD20抗體之實例包括但不限於利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗。
在某些具體實施例中，CD20靶向基團係包括一scFv，其係與與衍生自利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗之scFv的相同CD20表位結合及/或與彼等競爭和CD20相結合。
就製造一scFv-編碼核酸，VH和VL-編碼DNA片段係操作上連接另一編碼一連接子之片段，例如編碼任何如6.7章節中所述的連接子(典型地含有胺基酸甘胺酸和絲胺酸之重複序列，例如胺基酸序列(Gly4~Ser) 3(SEQ ID NO：1)，使得VH和VL序列可以連續的單鏈蛋白表現，其中VL和VH區係藉由彈性連接子連結(參見，例如Bird et al., 1988, Science 242:423-426；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554)。 6.4. PD1 促效劑基團
在本揭示文之特定具體實施例中，CD20-PD1結合分子之PD1促效劑基團係包括程序性死亡配體1(PDL1)或程序性死亡配體2(PDL2)之野生型或變體PD1結合結構域。在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括單一PD1促進劑基團(例如，在其中CD20-PD1就PD1促進劑基團為單價的情況下，在第一單體或第二單體上的PD1促進劑基團)。在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括二個PD1促進劑基團(例如，在第一單體上的第一PD1促進劑基團以及在第二單體上的PD1促進劑基團；或第一和第二PD1促進劑基團二者係皆在第一單體上或皆在第二單體上)。在此等具體實施例中，二個PD1促進劑基團可為相同的，或其可為不同的。當不相同時，二個PD1促進劑基團可差別性與PD1相互作用(例如，以不同的親和力)。
PD1促效劑基團可併入具有任何本文中所述構型之CD20-PD1結合分子。CD20-PD1結合分子典型地係由多條多肽鏈所組成，例如如描述於6.2章節中的示例單體所示。如6.2章節所述，PD1促效劑基團可併入任一示例單體2、4、5、6、7和9中。併入一或多個示例單體2、4、5、6、7和9之示例CD20-PD1結合分子係詳述於6.2章節中。在某些具體實施例中，PD1促效劑基團為以PDL1為基礎的促效劑基團。在其他具體實施例中，PD1促效劑基團為以PDL2為基礎的促效劑基團。 6.4.1. 以 PDL1- 為基礎的 PD1 促效劑基團
PDL1在引發和維持對自體的免疫耐受中扮演著關鍵角色。作為抑制劑受體PD1的配體，PDL1係調節T細胞的活化閾值並限制T細胞效應子反應。本揭示文係提供CD20-PD1結合分子，其中至少一PD1促效劑基團係包括一包含如本文中所述之PDL1胺基酸序列或與其同源之胺基酸序列。此等PD1促效劑基團在本文中係稱為「以PDL1為基礎的PD1促效劑基團」或類似術語。
人類PDL1蛋白係經合成為290個胺基酸之前驅多肽，從中移除18個胺基酸以產生成熟的hPDL1，其中胺基酸19-238(根據前驅蛋白編號)形成hPDL1胞外結構域，或胞外域。人類PDL1的序列具有Uniprot識別符Q9NZQ7(uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)。鼠類PDL1的序列具有Uniprot識別符Q9EP73(uniprot.org/uniprot/Q9EP73)。
前驅人類PDL1多肽係具有下列胺基酸序列(訊號序列= 加底線；胞外區= 粗黑字體)： MRIFAVFIFMTYWHLLNA FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET (SEQ ID NO：2)。
鼠類PDL1多肽係經合成為290個胺基酸之前驅多肽，從中移除18個胺基酸以產生成熟的mPDL1，其中胺基酸19-239(根據前驅蛋白編號)形成mPDL1胞外結構域，或胞外域。前驅鼠類PDL1多肽係具有下列胺基酸序列(訊號序列= 加底線；胞外區= 粗黑字體)： MRIFAGIIFTACCHLLRA FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET (SEQ ID NO：3)
在某些具體實施例中，PD1促效劑基團為以PDL1-為基礎的促效劑基團，其係包括一包含與哺乳動物，例如人類、鼠類之PD1-結合部分，或哺乳動物，例如人類或鼠類PDL1的整個胞外域為至少70%序列相同性，例如，至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性或100%序列相同性的胺基酸序列。在特定方面，PDL1之PD1-結合部分係包括人類或小鼠PDL1之IgV結構域。在特定的具體實施例中，PDL1之PD1-結合部分係包括人類PDL1之胺基酸19-134或鼠類PDL1之胺基酸19-134。
在特定的具體實施例中，以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團係包括一包含與PDL1或其PD1-結合部分之胞外域具有至少70%(例如，至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)序列相同性以及相較於野生型PDL1具有一或多個胺基酸取代的胺基酸序列。在某些具體實施例中，該一或多個胺基酸取代係增加以PDL1-為基礎之PD1促效劑基團的穩定性。例如，在某些具體實施例中，mPDL1係包括胺基酸取代C113S(根據前驅蛋白編號)。
在某些具體實施例中，以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團係直接或間接，視需要經由一連接子與CD20靶向基團融合(例如，如6.7章節中所述)。當存在相同的單體上時，以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團可以N-端或C-端與CD20靶向劑基團相連接。當以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團係「直接」與CD20靶向基團融合時，以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團和CD20靶向基團係位於相同單體上的相鄰位置，僅被一連接子(若有的話)隔開。當以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團係「間接」與CD20靶向基團融合時，以PDL1-為基礎的PD1促效劑基團和CD20靶向基團係位於相同的單體上被一或更多個其他結構域(例如，二聚化基團)隔開，或位於分開的單體上。 6.4.2. 以 PDL2- 為基礎的 PD1 促效劑基團
PDL2與PD1之相互作用係藉由阻斷細胞週期進程和細胞激素產生來抑制T-細胞增生。本揭示文係提供CD20-PD1結合分子，其中至少一PD1促效劑基團係包括一本文中所述的PDL2胺基酸序列或與其同源的胺基酸序列。此等PD1促效劑基團在文中係稱為「以PDL2為基礎的PD1促效劑基團」或類似術語。
人類PDL2蛋白經合成為一273個胺基酸的前軀多肽，從中移除19個胺基酸以產生成熟的hPDL2，其中胺基酸20-220(根據前驅蛋白編號)形成hPDL2胞外結構域，或胞外域。人類PDL2序列係具有Uniprot識別符Q9BQ51(uniprot.org/uniprot/Q9BQ51)。鼠類PDL2序列係具有Uniprot識別符Q9WUL5(uniprot.org/uniprot/Q9WUL5)。
前驅人類PDL2多肽係具有下列胺基酸序列(訊號序列= 加底線；胞外區= 粗黑字體)： MIFLLLMLSLELQLHQIAA LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI (SEQ ID NO：4)。
鼠類PDL2多肽經合成為一247個胺基酸的前軀多肽，從中移除19個胺基酸產生成熟的mPDL2，其中胺基酸20-221(根據前驅蛋白編號)形成mPDL2胞外結構域，或胞外域。前驅鼠類PDL2多肽係具有下列胺基酸序列(訊號序列= 加底線；胞外區= 粗黑字體)： MLLLLPILNLSLQLHPVAA LFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRTWPLHVFIPACTIALIFLAIVIIQRKRI (SEQ ID NO：5)。
在某些具體實施例中，PD1促效劑基團為以PDL2-為基礎的促效劑基團，其係包括一包含與哺乳動物，例如人類、鼠類之PD1-結合部分，或哺乳動物，例如人類或鼠類PDL1的整個胞外域為至少70%序列相同性，例如，至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性或100%序列相同性的胺基酸序列。在特定方面，PDL2之PD1-結合部分係包括人類或小鼠PDL2之IgV結構域。在特定的具體實施例中，PDL2之PD1-結合部分係包括人類PDL2之胺基酸20-121或鼠類PDL2之胺基酸20-121。
在特定的具體實施例中，以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團係包括一包含與PDL2或其PD1-結合部分之胞外域具有至少70%(例如，至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)序列相同性以及相較於野生型PDL2具有一或多個胺基酸取代的胺基酸序列。
在某些具體實施例中，以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團係直接或間接，視需要經由一連接子與CD20靶向基團融合(例如，如6.7章節中所述)。當存在相同的單體上時，以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團可以N-端或C-端與CD20靶向劑基團相連接。當以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團係「直接」與CD20靶向基團融合時，以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團和CD20靶向基團係位於相同單體上的相鄰位置，僅被一連接子(若有的話)隔開。當以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團係「間接」與CD20靶向基團融合時，以PDL2-為基礎的PD1促效劑基團和CD20靶向基團係位於相同的單體上被一或更多個其他結構域(例如，二聚化基團)隔開，或位於分開的單體上。 6.5. 二聚化基團 6.5.1.    Fc 結構域
在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子和CD20-PD1單體係包括一或多個二聚化基團，例如一或多個為Fc結構域或包括Fc結構域的二聚化基團。在特定的具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1單體係包括單一的二聚化基團(例如，單一Fc結構域)及/或本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括二個二聚化基團(例如，二個可相連結而形成一Fc區的Fc結構域)。
本揭示文之CD20-PD1結合分子和CD20-PD1單體可包括一衍生自任何適合的物種並可操作上連接一CD20靶向基團及/或一PD1促效劑基團之Fc結構域，或一對相連結而形成Fc區的Fc結構域。在一具體實施例中，Fc結構域係衍生自人類Fc結構域。在較佳的具體實施例中，Fc結構域係衍生自人類IgG Fc結構域。
CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團可與IgG Fc結構域的N-端或C-端融合。
本揭示文之一具體實施例係關於包括二個Fc融合多肽的二聚體，其係藉由將一或多個CD20靶向基團和/或PD1促效劑基團與一Fc結構域融合所產生，例如，藉由將CD20靶向基團和PD1促效劑基團二者與一Fc結構域融合，其可在表現後形成能同二聚化之CD20-PD1單體，或藉由將一或多個CD20靶向基團及/或一或多個PD1促效劑基團與第一Fc結構域融合以及一或多個CD20靶向基團及/或一或多個PD1促效劑基團與第二Fc結構域融合，其在表現後係形成二個能異二聚化的不同CD20-PD1單體。二聚體可藉由例如將編碼融合蛋白的融合基因插入適合的表現載體，於經重組表現載體轉化的宿主細胞中表現該融合基因，並允許表現的融合蛋白組配成更類似抗體分子，於是在Fc基團之間形成鏈間鍵而產生二聚體。
可併入CD20-PD1單體的Fc結構域可衍生自任何適合的抗體類別，包括IgA(包括lgA1和lgA2亞類)、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類)及IgM。在一具體實施例中，Fc結構域係衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些具體實施例中，Fc結構域係衍生自IgG1。在某些具體實施例中，Fc結構域係衍生自IgG4。
Fc區內的二個Fc結構域彼此可相同或不同。在天然的抗體中，Fc結構域典型為相同的，但就製造多特異性結合分子之目的，例如，本揭示文之CD20-PD1結合分子，Fc結構域有利地可能不同，以便允許異二聚化，如下文6.5.1章節所述。
在天然的抗體中，IgA、IgD和IgG的重鏈Fc結構域係由二個重鏈恆定結構域(CH2和CH3)所組成，而IgE和IgM的重鏈Fc結構域係由三個重鏈恆定結構域(CH2、CH3和CH4)所組成。這些經二聚化而創造出一Fc區。
在本揭示文之CD20-PD1結合分子中，Fc區及/或其中的Fc結構域可包括來自一或多種不同類別，例如一、二或三種不同類別之抗體的重鏈恆定結構域。
在一具體實施例中該Fc區係包括衍生自IgG1的CH2和CH3結構域
在一具體實施例中該Fc區係包括衍生自IgG2的CH2和CH3結構域。
在一具體實施例中該Fc區係包括衍生自IgG3的CH2和CH3結構域。
在一具體實施例中該Fc區係包括衍生自IgG4的CH2和CH3結構域。
在一具體實施例中該Fc區係包括來自IgM的CH4結構域。該IgM CH4結構域典型地係位於CH3結構域的C-端。
在一具體實施例中該Fc區係包括衍生自IgG的CH2和CH3結構域以及衍生自IgM的CH4結構域。
應了解，用於製造本揭示文CD20-PD1結合分子之Fc區的重鏈恆定結構域可包括上述天然生成的恆定結構域之變體。相較於野生型恆定結構域，此等變體可包括一或多項胺基酸變異。在一實例中，本揭示文之Fc區係包括至少一個在序列上與野生型恆定結構域不同的恆定結構域。應了解，該變體恆定結構域可能比野生型恆定結構域更長或更短。較佳地，該變體恆定結構域與一野生型恆定結構域為至少60％相同或相似。在另外的實例中，該變體恆定結構域為至少70%相同或相似。在另外的實例中，該變體恆定結構域為至少80%相同或相似。在另外的實例中，該變體恆定結構域為至少90%相同或相似。在另外的實例中，該變體恆定結構域為至少95%相同或相似。
IgM和IgA係在人體中自然生成，作為普通H2L2抗體單元的共價多聚體。當IgM併入一J鏈時，其係生成為五聚體，或當其缺少J鏈時，其為六聚體。IgA係以單體和二聚體形式生成。IgM和IgA的重鏈具有18個胺基酸延伸至C端恆定結構域，稱為尾片(tailpiece)。尾片係包括一個在聚合物中的重鏈之間形成雙硫鍵的半胱胺酸殘基，且咸信在多聚化中具有重要作用。尾片亦含有一糖基化位點。在特定的具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子不包括尾片。
併入本揭示文CD20-PD1結合分子之Fc結構域可包括一或多個改變蛋白功能性質的修飾，例如，結合Fc受體如FcRn或白血球受體，結合補體，修飾的雙硫鍵結構，或改變的糖基化模式。改變效應子功能的示例Fc修飾係描述於6.5.1.1章節中。
Fc結構域亦可經改變用以包括改進不對稱CD20-PD1結合分子之可製造性的修飾，例如藉由允許異二聚化，其為不同Fc結構域優先於相同Fc結構域的配對。異二聚化使CD20-PD1結合分子得以製造，其中不同多肽組份係藉由含有序列上不同之Fc結構域的Fc區彼此相互連接。異二聚化策略之實例係舉例說明於6.5.1.2章節中。
應了解，上文所提及之任何修飾可以任何適合的方式組合以達到所欲的功能性質及/或與其他的修飾組合用以改變CD20-PD1結合分子之性質。 6.5.1.1 具有改變的效應子功能之 Fc 結構域
在某些具體實施例中，該Fc結構域係包括一或多個降低與Fc受體結合及/或效應子功能的胺基酸取代。
在一特定的具體實施例中，此Fc受體為Fcγ受體。在一具體實施例中，此Fc受體為人類Fc受體。在一具體實施例中，此Fc受體為活化的Fc受體。在一特定的具體實施例中，此Fc受體為一活化的人類Fcγ受體，更特言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定地為人類FcγRIIIa。在一具體實施例中，該效應子功能為一或多項由下列之群組中選出的效應子功能：補體依賴的細胞毒性作用(CDC)、抗體依賴的細胞媒介細胞毒性作用(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)，以及細胞激素分泌作用。在一特定的具體實施例中，此效應子功能為ADCC。
在一具體實施例中，Fc結構域(例如，CD20-PD1單體之Fc結構域)或Fc區(例如，可經連結形成Fc區之CD20-PD1結合分子受體的一或二個Fc結構域)係在選自E233、L234、L235、G237、N297、A330、P331和P329(根據Kabat EU索引編號)之群組的位置包括一胺基酸取代。在一更特定的具體實施例中，Fc結構域或Fc區係在選自L234、L235和P329(根據Kabat EU索引編號)之群組的位置上包括一胺基酸取代。在某些具體實施例中，Fc結構域或Fc區係包括胺基酸取代L234A和L235A(根據Kabat EU索引編號)。在一此具體實施例中，該Fc結構域或Fc區為Igd Fc結構域或區，特言之人類Igd Fc結構域或區。在一具體實施例中，該Fc結構域或Fc區係在位置P329包括一胺基酸取代。在一更特定的具體實施例中，該胺基酸取代為P329A或P329G，特言之P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一具體實施例中，該Fc結構域或Fc區係在位置P329包括一胺基酸取代及在一選自E233、L234、L235、N297和P331(根據KabatEU索引編號)的位置包括另一胺基酸取代。在一更特定的具體實施例中，該另外的胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一特定的具體實施例中，該Fc結構域或Fc區係在位置P329、L234和L235(根據KabatEU索引編號)包括胺基酸取代。在更特定的具體實施例中，該Fc結構域係包括胺基酸突變L234A、L235A和P329G(「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。
在某些具體實施例中，該Fc結構域或Fc區係在位置L234、L235、G237、A330和P331(根據Kabat EU索引編號)包括胺基酸取代。在一更特定的具體實施例中，該等胺基酸取代為L234A、L235E、G237A、A330S和P331(根據Kabat EU索引編號)。
典型地，在Fc區之二個Fc結構域中係各自存有相同的一或多個胺基酸取代。因此，在一特定的具體實施例中，Fc區的各Fc結構域係包括胺基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引編號)，亦即在Fc區的各第一和第二Fc結構域中，位於234位置的白胺酸殘基係經一丙胺酸殘基置換(L234A)，位於235位置的白胺酸殘基係經一丙胺酸殘基置換(L235A)，及位於329位置的脯胺酸殘基係經一甘胺酸殘基置換(P329G)(根據 Kabat EU索引編號)。在另外的特定具體實施例中，Fc區的各Fc結構域係包括胺基酸取代L234A、L235E、G237A、A330S和P331S(根據KabatEU索引編號)，亦即在Fc區的各第一和第二Fc結構域中，位於234位置的白胺酸殘基係經一丙胺酸殘基置換(L234A)，位於235位置的白胺酸殘基係經一丙胺酸殘基置換(L235A)，位於237位置的甘胺酸殘基係經一丙胺酸殘基置換(G237A)，位於330位置的丙胺酸殘基係經一絲胺酸殘基置換(L330S)，以及位於331位置的脯胺酸殘基係經一絲胺酸殘基置換(P331S)(根據 Kabat EU索引編號)。
在一具體實施例中，該Fc結構域為IgG1 Fc結構域，例如人類IgG1 Fc結構域。在某些具體實施例中，IgG1 Fc結構域為一包括D265A和N297A突變(EU編號)用以降低效應子功能之變體IgG1。在另外的具體實施例中，該IgG1 Fc結構域為一包括L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突變(根據KabatEU索引編號)之變體IgG1，提供效應子無效之IgG1 (IgG1EN)。胺基酸取代L234A、L235E和G237A降低了與FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII之結合，而A330S和P331S取代降低了C1q-媒介的補體結合。
在另外的具體實施例中，該Fc結構域為一降低與Fc受體結合的IgG4 Fc結構域。降低與Fc受體結合之示例的IgG4 Fc結構域可包括選自下表2的胺基酸序列。在某些具體實施例中，該Fc結構域僅包括如下所示序列之粗黑字體部分：
表2–帶有降低與Fc結合之示例的IgG4 Fc結構域
Fc 結構域 序列
WO2014/121087之SEQ ID NO:1 Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys  (SEQ ID NO：6)
WO2014/121087之SEQ ID NO:2 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ ID NO：7)
WO2014/121087之SEQ ID NO:30 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys(SEQ ID NO：8)
WO2014/121087之SEQ ID NO:31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys(SEQ ID NO：9)
WO2014/121087之SEQ ID NO:37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys(SEQ ID NO：10)
WO2014/121087之SEQ ID NO:38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys(SEQ ID NO：11)
在一特定的具體實施例中，帶有降低的效應子功能之IgG4係包括WO2014/121087之SEQ ID NO：31胺基酸序列的粗黑字體部分，在本文中有時稱為IgG4或hIgG4。
就異二聚體之Fc區，可能併入上述變體IgG4 Fc序列之組合，例如包括一包含WO2014/121087之SEQ ID NO:30胺基酸序列(或其粗黑字體部分)的Fc結構域的Fc區和包含WO2014/121087之SEQ ID NO:37胺基酸序列(或其粗黑字體部分)的Fc結構域的Fc區，或包括一包含WO2014/121087之SEQ ID NO:31胺基酸序列(或其粗黑字體部分)的Fc結構域和包含WO2014/121087之SEQ ID NO:38胺基酸序列(或其粗黑字體部分)的Fc結構域的Fc區。 6.5.1.2. Fc 異二聚化變體
特定的CD20-PD1結合分子帶有二個Fc結構域之間的二聚化，其與天然免疫球蛋白不同，係操作上連接到不同的N端區，例如，一Fc結構域係連接一Fab而另一Fc結構域係連接一PD1促效劑基團。二個Fc結構域之不充分異二聚化形成Fc區可能為增加所欲異二聚體分子產率之障礙，且代表了純化之挑戰。本項技術中可取得的各種方法可用於增強可能存在本揭示文之CD20-PD1結合分子中的Fc結構域之二聚化，例如，如EP 1870459A1號；美國專利第5,582,996號；美國專利第5,731,168號；美國專利第5,910,573號；美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號；美國專利第7,183,076號；美國專利申請公開案第2006204493A1號；及PCT公開案第WO 2009/089004A1號中所揭示。
本揭示文係提供包括Fc異二聚體的CD20-PD1結合分子，亦即包括異源、不相同的Fc結構域之Fc區。典型地，Fc異二聚體中的各Fc結構域係包括一抗體的CH3結構域。該CH3結構域係衍生自任何同型、類別或亞類之抗體的恆定區，且較佳地，如前面章節所述，IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)類別。
在CH3結構域中二條不同重鏈的異二聚化產生所欲的CD20-PD1結合分子，而相同重鏈的同二聚化則降低所欲CD20-PD1結合分子的產率。因此，在一較佳的具體實施例中，經連結形成本揭示文之CD20-PD1結合分子的多肽將含有帶有修飾的CH3結構域，其相對於未修飾的Fc結構域係有利於異二聚體連結。
在一特定的具體實施例中，該促進Fc異二聚體形成之修飾為所謂的「旋鈕入孔洞(knob-into-hole)」或「旋鈕在孔洞(knob-in-hole)」修飾，包括在一個Fc結構域中的「旋鈕(knob)」修飾以及在另一Fc 結構域中的「孔洞(hole)」修飾。該旋鈕入孔洞技術係描述於例如，美國專利第5,731,168號；US 7,695,936；Ridgway et al., 1996, Prot Eng 9：617-621和Carter, 2001, Immunol Meth 248：7-15中。一般而言，該方法涉及在第一多肽的界面導入一突起(「旋鈕」)及在第二多肽的界面中導入對應的腔室(「孔洞」)，使得突起可定位在腔室中以便促進異二聚體形成並阻礙同二聚體形成。藉由以較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)替換來自第一多肽界面的小胺基酸側鏈來構建突起。藉由以較小側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)替換大胺基酸側鏈，在第二多肽的界面中製造與突起相同或相似大小的互補腔室。
因此，在某些具體實施例中，在Fc結構域之第一亞單元的CH3結構域中的胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3結構域內製造一突起，該突起可定位在第二亞單元之CH3結構域內的腔室中，並將Fc結構域之第二亞單元的CH3結構域中的胺基酸殘基以具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而產生在第二亞單元之CH3結構域內的腔室，在其內可定位第一亞單元之CH3結構域內的突起。較佳地，該具有較大側鏈體積的胺基酸殘基係由下列組成之群組中選出：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)和色胺酸(W)。較佳地，該具有較小側鏈體積的胺基酸殘基係由下列組成之群組中選出：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)和纈胺酸(V)。藉由改變編碼多肽的核酸，例如，藉由位點特異性突變，或藉由胜肽合成可製造突起和腔室。一示例的取代為Y470T。
在一特定的此具體實施例中，在第一Fc結構域中，位置366的蘇胺酸殘基係經色胺酸殘基置換(T366W)，且在該Fc結構域中，位置407的酪胺酸殘基係經纈胺酸殘基置換(Y407V)，及視需要位置366的蘇胺酸殘基係經絲胺酸殘基置換(T366S)及位置368的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。在另一具體實施例中，在第一Fc結構域中另外地位置354的絲胺酸殘基係經半胱胺胺酸殘基置換(S354C)或位置356的麩胺酸殘基係經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特言之位置354的絲胺酸殘基係經半胱胺酸殘基置換)，而在第二Fc結構域中，另外地位置349的酪胺酸殘基係經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。在一特定的具體實施例中，第一Fc結構域係包括胺基酸取代S354C和T366W，而第二Fc結構域係包括胺基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
在某些具體實施例中，靜電轉向(例如，描述於Gunasekaran et al., 2010, J Biol Chem 285(25)：19637-46中)可用於提升Fc區之第一和第二Fc結構域的連結。
作為另一種選擇，或除了使用經修飾用以提升異二聚化之Fc結構域之外，Fc結構域可經修飾而使其允許能選擇Fc異二聚體之純化策略。在一此具體實施例中，一多肽係包括一消除其與蛋白A結合之修飾的Fc結構域，因而能進行產生異二聚化蛋白之純化方法。參見，例如美國專利第8,586,713號。因此，CD20-PD1結合分子係包括一第一CH3結構域和一第二Ig CH3結構域，其中該第一和第二Ig CH3結構域彼此為至少一個胺基酸不相同，且相較於缺乏此胺基酸差異的對應CD20-PD1結合分子，其中該至少一個胺基酸差異係降低了CD20-PD1結合分子與蛋白A的結合。在一具體實施例中，第一CH3結構域係與蛋白A結合而第二CH3結構域係含有一降低或消除蛋白A結合之突變/修飾，例如H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。此類修飾在文中係稱為「星狀(star)」突變。
在某些具體實施例中，Fc可含有一或多個突變(例如，旋鈕和孔洞突變)用以幫助異二聚化，以及星狀突變用以幫助純化。 6.6. 穩定化基團
本揭示文之CD20-PD1結合分子可包括一可進一步延長該分子在活體內之血清半衰期的穩定化基團。血清半衰期通常分為α期和β期。藉由加入適當的穩定化基團，可顯著提升任一或二個時期。例如，相對於不含有穩定化基團的對應CD20-PD1結合分子，穩定化基團可增加CD20-PD1結合分子的血清半衰期大於5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000%或更高。就本揭示文之目的，血清半衰期可指在人類或其他哺乳動物(例如，小鼠或非人類靈長類動物)中的半衰期。
穩定化基團，包括聚氧化烯基團(例如，聚乙二醇)、糖類(例如，唾液酸)和耐受良好蛋白基團(例如，Fc及其片段和變體、運鐵蛋白或血清白蛋白)。
可用於本揭示文之CD20-PD1結合分子中的其他穩定化基團包括該等描述於Kontermann et al., 2011, Current Opinion in Biotechnology 22：868-76中的穩定化基團。此等穩定化基團包括，但不限於人類血清白蛋白融合物、人類血清白蛋白接合物、人類血清白蛋白結合劑(例如，Adnectin PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(亦即，以三種胺基酸脯胺酸、丙胺酸和絲胺酸為基礎的重組PEG模擬物)、碳水化合物接合物(例如，羥乙基澱粉(HES))、糖基化、聚唾液酸接合物和脂肪酸接合物。
因此，在某些具體實施例中，本揭示文係提供包括一穩定化基團之CD20-PD1結合分子，其中該穩定化基團為一聚合糖。
血清白蛋白亦可經由具有與白蛋白非共價相互作用能力的模組進行半衰期延長。因此，本揭示文之CD20-PD1結合分子可包括一白蛋白結合蛋白作為穩定化基團。白蛋白-結合蛋白可與一或多個本揭示文CD20-PD1結合分子之其他組份接合或基因上融合。已知具有白蛋白結合活性的蛋白係來自特定細菌。例如，鏈球菌蛋白G係含有數個由大約50個胺基酸殘基所組成的小白蛋白結合結構域(6 kDa)。血清白蛋白結合蛋白的另外實例，例如該等描述於美國公開案號2007/0178082和2007/0269422之血清白蛋白結合蛋白。白蛋白結合結構域與蛋白質融合造成半衰期顯著延長(參見Kontermann et al., 2011, Current Opinion in Biotechnology 22：868-76)。
在其他的具體實施例中，該穩定化基團為人類血清白蛋白。在其他的具體實施例中，該穩定化基團為運鐵蛋白。
在某些具體實施例中，該穩定化基團為一Fc結構域，例如6.5.1章節及其小節中所述的任何Fc結構域，其係以引用的方式併入本文中。6.5.1章節中所述的Fc結構域一般而言能二聚化。然而，就穩定化之目的，該Fc結構域可為具有降低的自體連結能力之可溶性單體Fc結構域。參見，例如Helm et al., 1996, J. Biol. Chem. 271：7494-7500 and Ying et al., 2012, J Biol Chem. 287(23):19399–19408。一可溶性單體Fc結構域之實例包括，如美國專利公開案號2019/0367611所述，在相當於CH3中T366及/或Y407位置之胺基酸取代。單體Fc結構域可為任何Ig亞型並可包括如6.5.1章節及其小節中所述之降低效應子功能的另外取代。
又在其他的具體實施例中，該穩定化基團為聚乙二醇基團或另外的聚合物，如下文6.6.1章節中所述。
穩定化基團可經由連接子與一或多個本揭示文CD20-PD1結合分子之其他組份相連接，例如如下文6.7章節中所述。 6.6.1. 聚乙二醇
在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子係包括聚乙二醇(PEG)或另外的親水性聚合物作為穩定化基團，例如乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、葡聚醣或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚合物可為任何分子量，並可為支鏈或非支鏈。
PEG為一熟知的水溶性聚合物，其可從市面上購得或可根據本技術領域熟知的方法藉由乙二醇的開環聚合來製備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York , Vol. 3, pages 138-161)。術語「PEG」係廣泛用來涵蓋任何聚乙二醇分子，不考慮大小或PEG末端的修飾，並可用下式表示：X--O(CH 2CH 2O) n-1CH 2CH 2OH，其中n為20至2300而X為H或端點修飾，例如C 1-4烷基。PEG可含有結合反應所必需，由分子的化學合成所產生的另外化學基團；或作為用於分子部分最佳距離之間隔子。此外，此一PEG可由一或多條連接一起的PEG側鏈所組成。具有一條以上PEG鏈的PEG稱為多臂或支鏈PEG。支鏈的PEG係描述於，例如，歐洲申請案號473084A和美國專利第5,932,462號中。
一或多個PEG分子可連接於CD20-PD1結合分子的不同位置，且此連接可藉由與胺、硫醇或其他適合的反應基團反應來進行。胺基團可為例如在CD20-PD1結合分子(或其組份)之N端所發現的初級胺或存在於胺基酸例如離胺酸或精胺酸中的胺基。
PEG化可藉由定點PEG化來進行，其中係將一適合的反應基團導入蛋白中用以製造一優先發生PEG化的位點。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子係經修飾，在所欲位置導入半胱胺酸殘基，允許在半胱胺酸上定點PEG化。可將突變導入本揭示文之CD20-PD1結合分子的編碼序列中，用以產生半胱胺酸殘基。此項可例如藉由將一或多個胺基酸殘基突變為半胱胺酸來進行。用於突變為半胱胺酸殘基的較佳胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸和其他親水性殘基。較佳地，欲突變為半胱胺酸的殘基為表面暴露的殘基。就以一級序列或三維結構為基礎，預測殘基的表面可及性之演算法已為本技術領域所熟知。可使用例如PEG-馬來醯亞胺、PEG-乙烯基碸、PEG-碘乙醯胺或PEG-鄰吡啶基二硫化物進行半胱胺酸殘基的PEG化。
PEG典型地係以適合與多肽上所欲位置偶合的適合活化基團活化。PEG化方法已為本技術領域所熟知並進一步描述於Zalipsky et al., “Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)和Zalipsky, 1995, Advanced Drug Reviews 16：157-182中。
PEG基團的分子量可廣泛變化並可為支鏈或直鏈。典型地，PEG的重量平均分子量為約100道爾頓至約150,000道爾頓。PEG的示例重量平均分子量包括約20,000道爾頓、約40,000道爾頓、約60,000道爾頓和約80,000道爾頓。在特定的具體實施例中，PEG的分子量為40,000道爾頓。亦可使用具有任何上述之總分子量的支鏈形式PEG。在某些具體實施例中，PEG有二條支鏈。在其他具體實施例中，PEG具有四條支鏈。在另外的具體實施例中，PEG為雙-PEG(NOF Corporation，DE-200MA)。
本技術領域中已知的習用分離和純化技術可用於純化PEG化的CD20-PD1結合分子，例如粒徑排阻(例如，凝膠過濾)和離子交換層析。亦可使用SDS-PAGE分離產物。可分離的產物包括單-、二-、三-、多-和非-PEG化的CD20-PD1結合分子，以及游離的PEG。單-PEG接合物的百分比可藉由在溶離波峰周圍匯集更廣的溶離份來控制，用以增加組成物中單PEG的百分比。大約90%的單-PEG接合物係代表良好的產率和活性平衡。
在某些具體實施例中，PEG化的CD20-PD1結合分子較佳地將保留至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%之與未修飾CD20-PD1結合分子相關的生物活性。在某些具體實施例中，生物活性係指如以K D、k on或k off評估，其與CD20、PD1或CD20和PD1二者結合的能力。 6.7. 連接子
在特定方面，本揭示文係提供CD20-PD1結合分子，其中二或更多個CD20-PD1結合分子組份係藉由一胜肽連接子彼此相連接。舉例而言且非限制，連接子可用於連接(a)CD20靶向基團和二聚體基團；(b) CD20靶向基團和PD1促效劑基團；(c)PD1促效劑基團和二聚化基團；或(d)CD20靶向基團內的不同結構域(例如，scFv中的VH和VL結構域)。
胜肽連接子範圍可從2個胺基酸至60個或更多個胺基酸，且在特定方面，一胜肽連接子長度範圍係從3個胺基酸至50個胺基酸，從4個至30個胺基酸，從5個至25個胺基酸，從10個至25個胺基酸，10個胺基酸至60個胺基酸，從12個胺基酸至20個胺基酸，從20個胺基酸至50個胺基酸，或從25個胺基酸至35個胺基酸。
在特定方面，胜肽連接子長度為至少5個胺基酸，至少6個胺基酸，至少7個胺基酸，及視需要長度為至高30個胺基酸，至高40個胺基酸，至高50個胺基酸或至高60個胺基酸。
在某些具體實施例中，連接子長度範圍係從5個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍從5個至50個，從5個至45個，從5個至40個，從5個至35個，從5個至30個，從5個至25個，或從5個至20個胺基酸。在前述其他的具體實施例中，連接子長度範圍係從6個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍從6個至50個，從6個至45個，從6個至40個，從6個至35個，從6個至30個，從6個至25個，或從6個至20個胺基酸。又在前述其他的具體實施例中，連接子長度範圍係從7個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍從7個至50個，從7個至45個，從7個至40個，從7個至35個，從7個至30個，從7個至25個或從7個至20個胺基酸。
帶電(例如，帶電親水性連接子)及/或彈性連接子為特佳的。
可用於本揭示文CD20-PD1結合分子之彈性連接子的實例包括該等由Chen et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10)：1357-1369和Klein et al., 2014, Protein Engineering, Design & Selection 27(10)：325-330所揭示的彈性連接子。特別有用的彈性連接子為或包括甘胺酸和絲胺酸的重複單元，例如G nS(SEQ ID NO：12)或SG n(SEQ ID NO：13)之單體或多聚體，其中n為1至10之整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一具體實施例中，該連接子為或包括G 4S重複單位，例如(GGGGS) n(SEQ ID NO：14)之單體或多聚體。
聚甘胺酸連接子可適合地用於本揭示文之CD20-PD1結合分子。在某些具體實施例中，該胜肽連接子係包括二個連續的甘胺酸(2Gly)，三個連續的甘胺酸(3Gly)，四個連續的甘胺酸(4Gly)(SEQ ID NO：15)，五個連續的甘胺酸(5Gly)(SEQ ID NO：16)，六個連續的甘胺酸(6Gly)(SEQ ID NO：17)，七個連續的甘胺酸(7Gly)(SEQ ID NO：18)，八個連續的甘胺酸(8Gly)(SEQ ID NO：19)或九個連續的甘胺酸(9Gly)(SEQ ID NO：20)。 6.7.1. 絞鏈序列
在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括一絞鏈區之連接子。特言之，絞鏈可用於連接CD20靶向基團，例如，Fab結構域與二聚化結構域，例如Fc結構域。絞鏈區可為原生的或經修飾的絞鏈區。絞鏈區典型地係在Fc區的N-端發現。術語「絞鏈區」，除非文中另有指出，否則係指天然或非天然生成的絞鏈序列，其在單一或單體多肽鏈之內容中為單體絞鏈結構域而在二聚體多肽鏈之內容中(例如，由二個Fc結構域相連結所形成的同二聚化或異二聚化CD20-PD1結合分子)可包括二個在個別多肽鏈上相連結的絞鏈序列。
原生的絞鏈區為一般可在天然生成抗體中Fab和Fc結構域之間發現的絞鏈區。修飾的絞鏈區為長度及/或組成與原生絞鏈區不相同的任何絞鏈。此等絞鏈可包括來自其他物種的絞鏈區，例如人類、小鼠、大鼠、兔、鯊、豬、倉鼠、駱駝、大羊駝或山羊絞鏈區。其他修飾的絞鏈區可包括衍生自不同類型或亞型抗體之重鏈Fc結構域或Fc區的完整絞鏈區。另一種選擇，此修飾的絞鏈區可包括部分天然絞鏈或其中各重複的單元係衍生自天然絞鏈區的重複單元。在另一替代的選擇中，天然絞鏈區可藉由將一或多個半胱胺酸或其他殘基轉變成中性殘基，例如絲胺酸或丙胺酸來改變，或藉由將適當置入的殘基轉變成半胱胺酸殘基來改變。藉由此等方法，絞鏈區中的半胱胺酸殘基數目可增加或減少。其他修飾的絞鏈區可完全為合成的或可經設計而具有所欲的性質，例如長度、半胱胺酸組成和彈性。
許多修飾的絞鏈區已描述於，例如美國專利第5,677,425號、WO99/15549、WO2005/003170、WO2005/003169、WO 2005/003170、WO98/25971和WO2005/003171中且這些專利係以引用的方式併入本文中。
在一具體實施例中，本揭示文CD20-PD1結合分子係包括Fc區，其中一或二個Fc結構域係在其N-端具有完整的絞鏈區。
在各種具體實施例中，絞鏈區內的位置233-236可為G、G、G和空位；G、G、空位和空位；G、空位、空位和空位；或全部為空位，其中位置號碼係以EU編號。
在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括一相對於相同同型(例如，人類IgG1或人類IgG4)之野生型絞鏈區，對Fcγ受體之結合親和力下降的修飾絞鏈區。
在一具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子係包括一Fc區，其中各Fc結構域係在其N-端具有完整的絞鏈區，其中各Fc結構域和絞鏈區係衍生自IgG4且各絞鏈區係包括修飾的CPPC序列(SEQ ID NO：21)。相較於含有CPPC序列(SEQ ID NO：29)的IgG1，人類IgG4之核心絞鏈區係含有CPSC序列(SEQ ID NO：22)。存在IgG4序列中的絲胺酸殘基使得此區的彈性增加，且因此一定比例的分子在相同蛋白鏈內形成雙硫鍵(鏈內雙硫鍵)，而不是與IgG分子中的另一重鏈橋連而形成鏈間雙硫鍵。(Angel et al., 1993, Mol Immunol 30(1)：105-108)。將絲胺酸殘基換成脯胺酸得到如同IgG1的相同核心序列，得以在IgG4絞鏈區中完全形成鏈間雙硫鍵，因此降低純化產物的異質性。此經改變的同型係稱為IgG4P。 6.7.1.1. 嵌合絞鏈序列
絞鏈區可為嵌合的絞鏈區。
例如，嵌合的絞鏈可包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「上絞鏈」序列與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「下絞鏈」序列組合。
在特定的具體實施例中，嵌合的絞鏈區係包括胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：23)(如先前WO2014/121087之SEQ ID NO：8所揭示，其係以全文引用的方式併入本文中)或ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：24)(如先前WO2014/121087之SEQ ID NO：9所揭示)。此等嵌合絞鏈序列可適當與IgG4 CH2區連接(例如，藉由併入一IgG4 Fc結構域，例如人類或鼠類Fc結構域，其可進一步在CH2及/或CH3區中經修飾用以降低效應子功能，例如，如6.5.1.1章節中所述)。 6.7.1.2. 具有降低的效應子功能之絞鏈序列
在另外的具體實施例中，絞鏈區可經修飾用以降低效應子功能，例如，如WO2016161010A2中所述，其係以全文引用的方式併入本文中。在各種具體實施例中，此修飾絞鏈區的位置233-236為G、G、G和空位；G、G、空位和空位；G、空位、空位和空位；或全部為空位，其中位置號碼係以EU編號(如WO2016161010A2的圖1中所示)。這些片段可以GGG-、GG--、G---或----表示，「-」代表空位。
在標準的人類IgG2中位置236為空位，但在其他標準的人類IgG同型中則為佔用的。在全部四種人類同型中，位置233-235係被G以外的殘基佔據(如WO2016161010A2之圖1中所示)。
位置233-236內的絞鏈修飾可與被P佔據之位置228組合。位置228天然地在人類IgG1和IgG2中係被P佔據，但在人類IgG4中係被S佔據而在人類IgG3中係被R佔據。IgG4抗體中的S228P突變在穩定IgG4抗體和降低外生性和內生性抗體間的成對重鏈輕鏈之交換上為有利的。較佳地位置226-229係分別被C、P、P和C佔據(「CPPC」如SEQ ID NO：21所示)。
示例的絞鏈區係具有殘基226-236，有時候稱為中(或核心)和下絞鏈，其係由指定為GGG-(233-236)、GG--(233-236)、G---(233-236)和無G(233-236)之修飾的絞鏈序列所佔據。視需要，此絞鏈區胺基酸序列係包括CPPCPAPGGG-GPSVF (SEQ ID NO：25)(如先前WO2016161010A2之SEQ ID NO:1所示)，CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO：26) (如先前WO2016161010A2之SEQ ID NO:2所示)，CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO：27)(如先前WO2016161010A2之SEQ ID NO:3所示)或CPPCPAP----GPSVF (SEQ ID NO：28)(如先前WO2016161010A2之SEQ ID NO:4所示)。
上述之修飾絞鏈區可併入重鏈恆定區，而該重鏈恆定區典型地係包括CH2和CH3結構域，且可具有位於指定區側邊的另外絞鏈片段(例如，上絞鏈)。雖然此等存在的另外恆定區片段可為不同的同型之雜交體，但典型地為相同的同型，較佳地人類同型。此等另外的人類恆定區片段之同型較佳地為人類IgG4，但亦可為人類IgG1、IgG2或IgG3或其中結構域為不同之同型的其雜交體。示例的人類IgG1、IgG2和IgG4之序列係如WO2016161010A2之圖2-4中所示。
在特定的具體實施例中，此修飾的絞鏈序列可與IgG4 CH2區連接(例如藉由併入IgG4 Fc結構域，例如人類或鼠類Fc結構域，其可進一步在CH2及/或CH3區經修飾用以降低效應子功能，例如，如6.5.1.1章節中所述)。 6.8. 核酸和宿主細胞
在另外方面，本揭示文係提供編碼本揭示文之CD20-PD1結合分子的核酸。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子係由單一核酸所編碼。在其他具體實施例中，例如在異二聚體分子或包括由一條以上的多肽鏈所組成的CD20靶向基團之分子的情況下，該CD20-PD1結合分子可由多數個(例如二、三、四或更多個)核酸所編碼。
單一核酸可編碼包括單一多肽鏈的CD20-PD1結合分子，包括二或更多條多肽鏈的CD20-PD1結合分子，或包括二條以上多肽鏈的CD20-PD1結合分子之一部份(例如，單一核酸可編碼包括三、四或更多條多肽鏈之CD20-PD1結合分子的二條多肽，或包括四或更多條多肽鏈之CD20-PD1結合分子的三條多肽)。就表現的個別控制而言，編碼二或更多條多肽鏈的開放閱讀框可在個別轉錄調節元件(例如，啟動子及/或增強子)之控制下。編碼二或更多條多肽鏈的開放閱讀框亦可藉由相同的轉錄調節元件控制，並由內部核糖體進入位點(IRES)序列隔開而得以轉譯成個別的多肽。
在某些具體實施例中，包括二或更多條多肽鏈的CD20-PD1結合分子係由二或更多個核酸所編碼。編碼CD20-PD1結合分子的核酸數目可等於或低於CD20-PD1結合分子中多肽鏈的數目(例如，當一條以上的多肽鏈係由單一核酸所編碼時)。
本揭示文之核酸可為DNA或RNA(例如，mRNA)。
在另外方面，本揭示文係提供含有本揭示文核酸之宿主細胞和載體。此等核酸可存在單一載體中或存在相同宿主細胞或個別宿主細胞的個別的載體中，如下文更詳細說明。 6.8.1. 載體
本揭示文係提供包括編碼文中所述之CD20-PD1結合分子或CD20-PD1結合分子組份，例如CD20-PD1結合分子單體之一或二條多肽鏈的核苷酸序列之載體。此等載體係包括，但不限於病毒、質體、黏質體、λ噬菌體或酵母菌人工染色體(YAC)。
可運用許多的載體系統。例如，其中一種載體係利用衍生自動物病毒，例如，舉例而言，牛乳突病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus)、MMTV或MOMLV)或SV40病毒之DNA元件。另一類載體係利用衍生自RNA病毒，例如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、東方馬腦炎病毒和黃熱病毒的RNA元件。
另外，可藉由導入一或多個允許選擇轉染宿主細胞之標記來選擇已穩定整合DNA至其染色體中的細胞。此標記可提供，例如，質子移動作用給營養缺陷的宿主、殺微生物劑阻抗性(例如，抗生素)，或對重金屬，例如銅或諸如此類之阻抗性。可選擇標記基因可直接連接所欲表現的DNA序列，或藉由共轉化導入到相同細胞。就mRNA之最佳合成亦可能需要另外的元件。這些元件可包括剪接訊號，以及轉錄啟動子、增強子和終止訊號。
一但含有該結構的表現載體或DNA序列已備妥供表現，則表現載體可轉染或導入到適當的宿主細胞。此項可運用各種技術來完成，例如，舉例而言，原生質融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、反轉錄病毒轉導、病毒轉染、基因槍、脂質為基礎的轉染或其他習用的技術。用於培養所生成的轉染細胞和用於回收所表現多肽之方法及條件已為本技術領域具有通常知識者所知，且依照特定的表現載體和所用的哺乳動物細胞，以本說明書為基準，可變化或最佳化。 6.8.2. 細胞
本揭示文亦提供包括本揭示文之核酸的宿主細胞。
在一具體實施例中，此宿主細胞係經基因工程改造而包括一或多個文中所述的核酸。
在一具體實施例中，此宿主細胞細係藉由使用表現匣加以基因工程改造。詞語「表現匣」係指能在與此序列相容的宿主中使基因表現之核苷酸序列。此等表現匣可包括一啟動子，有或無內含子之開放閱讀框和終止訊號。亦可使用必要的或有助於進行表現之另外的因子，例如，舉例而言，誘導性啟動子。
本揭示文亦提供包括文中所述之載體的宿主細胞。
此細胞可為，但不限於，真核細胞、細菌細胞、昆蟲細胞或人類細胞。適合的真核細胞包括，但不限於Vero細胞、HeLa細胞、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞和MDCKII細胞。適合的昆蟲細胞包括，但不限於Sf9細胞。 6.9. 醫藥組成物 6.9.1 包括 CD20-PD1 結合分子的醫藥組成物
本揭示文之CD20-PD1結合分子可為包括CD20-PD1結合分子和一或多種載劑、賦形劑及/或稀釋劑之組成物形式。組成物可針對特定用途調配，例如用於獸藥用途或人類的醫藥用途。組成物的形式(例如，乾粉、液體調配物等)和所用的賦形劑、稀釋劑及/或載劑將依照所希望的CD20-PD1結合分子用途，及治療用途，給藥模式而定。
就治療用途，組成物可以包括一醫藥上可接受載劑之無菌醫藥組成物的部份來供應。此組成物可為任何適合的形式(依照將其投予病患之所欲方法而定)。此醫藥組成物可藉由各種路徑投予病患，例如口服、經皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、鞘內或局部地。在任何特定案例中最適合的給藥路徑將依照特定抗體、對象和疾病性質與嚴重度以及該對象的身體狀況而定。典型地，此醫藥組成物將以靜脈內或皮下給藥。
醫藥組成物方便地可以每劑含有預定量之本揭示文CD20-PD1結合分子的單位劑型存在。包括在單位劑量內的CD20-PD1結合分子之量將依照所欲治療的疾病以及本項技術中熟知的其他因子而定。此等單位劑型可為含有一適用於單一給藥之CD20-PD1結合分子之量的凍乾粉末，或為液體形式。乾粉單位劑型可包裝成帶有注射器、適量之稀釋劑及/或可用於給藥的其他組份之套組。液體形式的單位劑量方便地可以預充填一適用於單一給藥之CD20-PD1結合分子之量的注射器形式來供應。
醫藥組成物亦可以含有適用於多次給藥之CD20-PD1結合分子之量的散裝形式來供應。
醫藥組成物可藉由將具有所欲純度之CD20-PD1結合分子與視需要典型用於本項技術之醫藥上可接受載劑、賦形劑或安定劑(其全部在文中係稱為「載劑」)，亦即緩衝劑、安定劑、防腐劑、等張劑、非離子清潔劑、抗氧化劑和其他的各式各樣添加劑混合來製備成凍乾調配物或水溶液供儲存。參見，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)。此等添加劑在所用的劑量和濃度上對於接受者應為無毒的。
緩衝劑係幫助維持近似生理條件之範圍內的pH值。其可以廣泛的各種濃度存在，但典型地將以從約2 mM至約50 mM之濃度範圍存在。適合本揭示文使用的緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽類，例如檸檬酸鹽緩衝劑(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)，琥珀酸鹽緩衝劑(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)，酒石酸鹽緩衝劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)，延胡索酸鹽緩衝劑(例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物等)，葡萄糖酸鹽緩衝劑(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)，草酸鹽緩衝劑(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)，乳酸鹽緩衝劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)及乙酸鹽緩衝液(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑和三甲基胺鹽類，例如Tris。
可加入防腐劑延緩微生物生長，且可以範圍從約0.2%-1 %(w/v)之量加入。適合本揭示文使用的防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化銨、苯扎氯銨鹵化物(benzalconium halide)(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲二銨(hexamethonium chloride)和對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。等張劑，有時候稱為「安定劑」，可加入用以確保本揭示文之液體組成物的等張性，並包括多元糖醇，例如三元或更高級糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。安定劑係指種類廣泛的賦形劑，其功能範圍係從填充劑至溶解治療劑或幫助防止變性或黏附在器壁之添加劑。典型的安定劑可為多元糖醇(列舉於上)；胺基酸，例如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等，有機糖類或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及諸如此類，包括環醇類，例如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫甘油、a-巰基甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如10個或更少殘基的多肽)；蛋白，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯酮，單醣類，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣類，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖；及三醣類，例如棉子糖；及多醣類，例如右旋糖酐。安定劑可以範圍從0.5至10 wt %之CD20-PD1結合分子重量之量存在。
可加入非離子界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕化劑」)幫助溶解糖蛋白以及保護糖蛋白防止攪動引發的聚集作用，其亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不會造成蛋白變性。適合的非離子界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)及複合多元醇(pluronic polyol)。非離子界面活性劑可以約0.05 mg/mL至約1.0 mg/mL之範圍存在，例如約0.07 mg/mL至約0.2 mg/mL。
另外的各式各樣賦形劑包括體積膨脹劑(例如，澱粉)，螯合劑(例如，EDTA)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)和共溶劑。 6.9.2. 用於遞送 CD20-PD1 結合分子 - 編碼核酸之醫藥組成物
本揭示文之CD20-PD1結合分子可藉由任何可用於基因治療的方法來遞送，例如以mRNA或於適合的啟動子控制下經由編碼CD20-PD1結合分子的病毒載體。
示例的基因治療載體包括以腺病毒-或AAV-為基礎的治療劑。用於本文中之方法、用途或組成物中以腺病毒-或AAV-為基礎的治療劑之非限定實例包括，但不限於：rAd-p53，其為編碼野生型人類腫瘤抑制蛋白p53的重組腺病毒載體，例如用於癌症治療(亦稱為 Gendicine®、Genkaxin®，Qi et al., 2006, Modern Oncology, 14:1295-1297)；Ad5_d11520，其為一種缺乏使宿主p53失活之E1B基因的腺病毒(亦稱為H101或ONYX-015；參見，例如Russell et al., 2012, Nature Biotechnology 30:658-670)；AD5-D24-GM-CSF，一種含有細胞激素GM-CSF之腺病毒，例如用於治療癌症(Cerullo et al., 2010, Cancer Res. 70:4297)；rAd-HSVtk,，一種帶有HSV胸苷激酶基因的複製缺陷的腺病毒，用於癌症治療(由Ark Therapeutics公司開發之Cerepro®，參見，例如美國專利第6,579,855號；由Advantagene公司開發為ProstAtak™；國際PCT申請案號WO2005/049094)；rAd-TNFα，一種在化學放射線-可引發的EGR-1啟動子之控制下，表現人類腫瘤凋亡因子(TNFα)之複製缺陷的腺病毒，例如，用於癌症治療(TNFerade™, GenVec；Rasmussen et al., 2002, Cancer Gene Ther. 9:951-7；Ad-IFNβ，一種腺病毒血清型5載體，其中E1和E3基因已被刪除，在巨細胞病毒(CMV)媒介的-早期啟動子的引導下表現人類干擾素-β基因，例如用於癌症治療(BG00001和H5.110CMVhIFN-β, Biogen；Sterman et al., 2010, Mol. Ther. 18:852-860)。
核酸分子(例如，mRNA)或病毒可調配成醫藥組成物中的唯一藥物活性成份，或可與用於特定疾病治療的其他活性劑組合。視需要，本文中所提供的組成物中可以包括其他藥劑、醫藥劑、載劑、佐劑、稀釋劑。例如，任何一或多種的潤濕劑、乳化劑和潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、脫模劑、包膜劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體亦可存在組成物中。可包括在組成物中的示例性其他試劑和賦形劑包括，例如，水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉；油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚；以及金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
當用作為過繼性細胞轉移治療法的輔助治療法，例如6.11.1章節中所描述的CAR-表現細胞治療，細胞療法，例如CAR-表現細胞，可經基因改造用以表現本揭示文之CD20-PD1結合分子。CD20-PD1結合分子可靶向特定的基因組位點，例如在活化或功能障礙的淋巴細胞中活躍的位點，例如PD-1位點，或插入非特異性基因組位點。可經由基因編輯，例如使用鋅指蛋白、CRISPR/Cas9系統及諸如此類，達到靶向特定基因組位點。 6.10. 治療適應症和治療方法
本揭示文之CD20-PD1結合分子可用於治療其中調節宿主免疫系統為有利的疾病狀態，尤其是其中抑制細胞免疫反應為所欲的病症。因此，本揭示文之CD20-PD1結合分子可在各種應用中用於抑制免疫反應。
就抑制細胞免疫反應為所欲的病症可包括由自體免疫反應所造成的疾病狀態。可投予本揭示文之CD20-PD1結合分子的疾病狀態包括，例如其中抑制細胞自體免疫反應將為重要機制之自體免疫疾病。用於本揭示文之CD20-PD1結合分子的特定疾病狀態包括第1型糖尿病(T1D)、全身性紅斑性狼瘡、克隆氏症(Crohn’s disease)和移植物抗宿主病(GVHD)。本揭示文之CD20-PD1結合分子可以本身或以任何適合的醫藥組成物來施予。
在一方面，係提供用作為藥物之本揭示文CD20-PD1結合分子。在另外的方面，係提供用於治療疾病之本揭示文CD20-PD1結合分子。在特定的具體實施例中，係提供用於治療方法中的本揭示文CD20-PD1結合分子。在一具體實施例中，本揭示文係提供如本文中所述之CD20-PD1結合分子供於有此需要之對象中用於治療疾病。在特定的具體實施例中，本揭示文係提供CD20-PD1結合分子供用於治療患有自體免疫疾病之對象的方法中，該方法係包括投予該個體一治療上有效量的CD20-PD1結合分子。在特定的具體實施例中，所欲治療的疾病為自體免疫疾病。在一特定的具體實施例中，該疾病為T1D。在其他的具體實施例中，該疾病為全身性紅斑性狼瘡。在其他的具體實施例中，該疾病為克隆氏症。又在其他的具體實施例中，該疾病為GVHD。在特定的具體實施例中，該方法進一步係包括投予該個體一治療上有效量之至少另一種治療劑。在另外的具體實施例中，本揭示文係提供CD20-PD1結合分子促效劑供用於抑制免疫系統。在特定的具體實施例中，本揭示文係提供CD20-PD1結合分子供用於抑制一對象之免疫系統的方法中，該方法係包括投予該個體一有效量的CD20-PD1結合分子用以抑制免疫系統。根據任何上述具體實施例「個體」為一哺乳動物，例如人類。根據任何上述具體實施例「抑制免疫系統」可包括一或多項之一般的免疫功能下降、T細胞功能下降、B細胞功能下降、T細胞反應性下降及諸如此類。根據任何上述具體實施例「抑制細胞的自體免疫反應」可包括例如免疫訊號下降(例如，免疫活化細胞激素之分泌)、靶向自體抗原之免疫細胞的功能下降及諸如此類。
本揭示文亦提供局部化PD1促效作用之方法，其係包括投予一對象一如文中所述之CD20-PD1結合分子或醫藥組成物。如本文中所用，術語「局部遞送」不需要局部投予而是指CD20-PD1結合分子選擇性或優先定位於希望的免疫調節位置，例如自體免疫活性及/或希望的細胞類型，例如B細胞之位置。
本揭示文進一步係提供一投予該對象具有降低的全身暴露及/或降低的全身毒性之PD1促效劑治療的方法，包括投予該對象如文中所述之CD20-PD1結合分子或醫藥組成物形式的PD1促效劑治療，例如，其中CD20係由所欲及/或希望PD1促效劑治療之組織所表現。
因此，前述方法憑藉在希望PD1促效劑治療之位置優先遞送CD20-PD1結合分子而允許減少脫靶副作用之PD1促效劑治療。
本揭示文亦提供局部調節(例如，抑制)表現CD20之標靶組織中之免疫反應的方法，該方法係包括投予一對象一如文中所述之CD20-PD1結合分子或醫藥組成物。
在某些具體實施例中，給藥並非侷限於該組織。
在另一方面，本揭示文係提供本揭示文之CD20-PD1結合分子於製造或製備供於有此需要之對象中治療疾病之醫藥品的用途。在一具體實施例中，該醫藥品用於一治療疾病的方法中，該方法係包括投予一患有該疾病的對象一治療上有效量的該醫藥品。在特定的具體實施例中，該所欲治療的疾病為自體免疫性疾病。在一特定的實施方案中，該疾病為T1D。在其他具體實施例中，該疾病為全身性紅斑性狼瘡。在其他具體實施例中，該疾病為克隆氏症。在其他具體實施例中，該疾病為GVHD。在特定的具體實施例中，該方法進一步係包括投予該個體一治療上有效量之至少另一種治療劑。在另一具體實施例中，該醫藥品係用於抑制免疫系統。在另一具體實施例中，該醫藥品係用於抑制一對象之免疫系統的方法中，該方法包括投予該個體一有效量之該醫藥品用以抑制免疫系統。根據任何上述實施例「個體」可為哺乳動物，例如人類。根據任何上述具體實施例「抑制免疫系統的」可包括任何一或多項之一般的免疫功能下降、T細胞功能下降低、B細胞功能下降、T細胞反應性下降及諸如此類。
在另一方面，本揭示文係提供一種於一對象中聚集PD1及/或增強PD1活性的方法，該方法係包括投予該對象一有效量之本揭示文CD20-PD1結合分子。本揭示文之CD20-PD1結合分子可在CD20呈遞細胞和T細胞之界面誘發PD1聚集。這舉提供了靶向的免疫抑制，其中CD20呈遞細胞和周圍細胞和組織受到保護而免於受T細胞殺滅。可在B細胞上可發現高量的CD20，其富含於引流淋巴結和自體免疫組織(例如，第1型糖尿病(T1D)中的胰臟中)。本揭示文之CD20-PD1結合分子可以細胞及/或組織特異性方式促效PD1，抑制自體反應性T細胞活化。在T1D中，豐富的CD20+B細胞提供了PD1聚集在自體反應性T細胞上，從而抑制自體反應性細胞毒性T細胞免於殺死胰島細胞。在一具體實施例中，係投予該對象一包括醫藥上可接受形式之本揭示文CD20-PD1結合分子的組成物。
在另一方面，本揭示文係提供於一對象中治療自體免疫疾病的方法，該方法係包括投予該個體一治療上有效量之本揭示文CD20-PD1結合分子。在一具體實施例中，係投予該個體一包括醫藥上可接受形式之本揭示文CD20-PD1結合分子的組成物。在特定的具體實施例中，所欲治療之疾病為自體免疫疾病。本揭示文之CD20-PD1結合分子可治療之自體免疫疾病可包括第1型糖尿病、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、古巴斯徹氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、澱粉樣變性、僵直性脊椎炎、抗腎小球基底膜腎炎、抗腎小管基底膜腎炎、抗磷脂質症候群、自體免疫性肝炎、自體免疫性卵巢炎、移植物抗宿主病(GVHD)、自體免疫性胰臟炎、自體免疫性視網膜病變、貝賽特氏病(Behcet's disease)、克隆氏症、德維克病(Devic’s disease)、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、卓斯勒症候群(Dressler’s syndrome)、纖維化肺泡炎、腎小球腎炎、葛瑞夫茲氏病GD(Graves disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、IgA腎病、IgG4相關硬化病、免疫性血小板減少性紫斑(ITP)、顯微性多血管炎(MPA)、混合性結締組織病(MCTD)、多發性硬化症、多發性神經病變、器官腫大、內分泌病變、單株性症候群(POEMS)、結節性多動脈炎、類風濕性關節炎、施密特症候群(Schmidt syndrome)、鞏膜炎、硬皮病、薛格連氏症候群(Sjögren’s syndrome)、精子或睾丸自體免疫、僵硬人症候群(SPS)、高安氏動脈炎、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑(TTP)、Tolosa-Hunt症候群(THS)、潰瘍性結腸炎和血管炎。
在一特定的具體實施例中，該疾病為T1D。在其他具體實施例中，該疾病為全身性紅斑性狼瘡。在其他具體實施例中，該疾病為克隆氏症。又在其他具體實施例中，該疾病為GVHD。在特定的具體實施例中，該方法進一步係包括投予個體一治療上有效量之至少另一種治療劑。在另一方面，本揭示文係提供一種於一對象中抑制免疫系統的方法，該方法係包括投予該個體一有效量之CD20-PD1結合分子用以抑制免疫系統。根據任何上述實施例「個體」可為哺乳動物，例如人類。根據任何上述具體實施例「抑制免疫系統」可包括任何一或多項之一般的免疫功能下降、T細胞功能下降低、B細胞功能下降、T細胞反應性下降及諸如此類。
在特定的具體實施例中，所欲治療的疾病為自體免疫疾病。CD20-PD1結合分子可用於消除涉及免疫細胞-媒介的病症、自體免疫、移植排斥和移植物抗宿主病之細胞。熟習技術者可容易了解，在許多情況下，CD20-PD1結合分子可能無法提供治癒，但可能僅提供部分利益。因此，在某些具體實施例中，提供生理變化之CD20-PD1結合分子的量係視為「有效量」或「治療上有效量」。需要治療的對象、病患或個體典型地為哺乳動物，更特言之人類。
就疾病的預防或治療，本揭示文之CD20-PD1結合分子的適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他另外的治療劑組合時)將取決於所欲治療疾病的類型、給藥路徑、病患體重、特定的CD20-PD1結合分子、疾病的嚴重度和病程、抗體是否就預防或治療目的給藥、先前或同時的治療干預、病患的臨床病史和對CD20-PD1結合分子的反應，以及主治醫師的判斷。無論如何，負責給藥的醫師將決定組成物中活性成份的濃度和就個別對象的適當劑量。本文中考量了各種給劑療程，包括，但不限於，在各種時間點的單次或多次給藥、團注給藥和脈衝輸注。
CD20-PD1結合分子適當地係一次或以一系列治療投予病患。依照疾病的類型和嚴重度，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.1 mg/kg至10 mg/kg)的CD20-PD1結合分子可為投予病患的起始候選劑量，無論是，例如，藉由一或多次個別給藥，或藉由連續輸注。依照上文所提之因素，一典型的每日劑量範圍可從約1 μg/kg至100 mg/kg或更高。就數天或更長時間的重複給藥，依照症狀，一般應會持續治療直到出現抑制所欲的疾病症候。一CD20-PD1結合分子之示例劑量將在約0.005mg/kg至約10mg/kg的範圍內。在其他非限制性實例中，一劑量亦可包括每次給藥約1 μg/kg/體重、約5 μg/kg/體重、約10 μg/kg/體重、約50 μg/kg/體重、約100 μg/kg/體重、約200 μg/kg/體重、約350 μg/kg/體重、約500 μg/kg/體重、約1 mg/kg/體重、約5 mg/kg/體重，約10 mg/kg/體重，約50 mg/kg/體重，約100 mg/kg/體重，約200 mg/kg/體重，約350 mg/kg/體重，約500 mg/kg/體重，至約1000 mg/kg/體重或更多，以及其中可衍生的的任何範圍。在從本文中所列數字可衍生範圍之非限定實例中，以上述數字為基準，可投予約5 mg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 μg/kg/體重至約500 mg/kg/體重之範圍等。因此，可投予病患一或多個約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之劑量。此等劑量可間歇給藥，例如，每週或每三週(例如，使得患者接受約二至約二十劑，或例如，約六劑CD20-PD1結合分子)。可投予起初較高的負荷劑量，接著一或多個較低劑量。然而，其他劑量療法可能為有用的。此療法的進程可容易藉由習知技術和分析來監測。
本揭示文之CD20-PD1結合分子一般將以一有效量來使用以達到希望之目的。就治療或預防疾病症狀，本揭示文之CD20-PD1結合分子或其醫藥組成物係以治療上有效量來投予或施用。決定治療上有效量係完全在本技術領域具有通常知識者之能力內，尤其是根據本文中所提供詳細揭示。
就全身給藥，治療上有效劑量最初可從活體外分析，例如細胞培養分析來估算。然後可在動物模型中調配劑量用以達到包括如於細胞培養中所測定之EC 50的循環濃度範圍。此等資訊可用於更準確地測定人體中的有用劑量。
最初劑量亦可使用本項技術熟知的技術從活體內數據，例如動物模型中估算。本技術領域具有通常知識者應可以動物數據為基礎容易地最適化對人體的給藥。
劑量和間隔可個別調整用以提供足以維持治療效用之CD20-PD1結合分子的血漿量。通常藉由注射給藥之病患劑量範圍為約0.1至50 mg/kg/天，典型地為約0.5至1 mg/kg/天。治療上有效的血漿量可藉由每天投予多個劑量來進行。血漿中的量可例如，藉由ELISA HPLC來測量。
在局部給藥或選擇性攝入的情況下，CD20-PD1結合分子的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本技術領域具有通常知識者將能在無需過度實驗下最適化治療上有效的局部劑量。
本文中所述的CD20-PD1結合分子之治療上有效劑量一般將在無造成實質毒性下提供治療利益。CD20-PD1結合分子的毒性和治療效用可藉由細胞培養或實驗動物中的標準醫藥程序來測定。細胞培養分析和動物研究可用來測定LD 50(50%群體之致死劑量)和ED 50(50%群體之治療上有效劑量)。毒性和治療效用之間的劑量比為治療指數，其可以LD 50/ED 50比值來表示。展現較大治療指數之CD20-PD1結合分子為較佳的。在一具體實施例中，根據本揭示文之CD20-PD1結合分子展現出高治療指數。從細胞培養分析和動物研究中所獲得的數據可用於調配適用於人類之劑量範圍。劑量較佳地係在包括具有極小毒性或無毒性之ED 50的循環濃度範圍內。依照各種因素，例如，所用的劑型、所用的給藥路徑、該對象的症狀及諸如此類，劑量可在此範圍內變化。確切的調配物、給藥途徑和劑量可由個別醫師基於病患的症狀做選擇。(參見，例如Fingl et al., 1975, In：The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1，其係以全文引用的方式併入本文中)。
以本揭示文之CD20-PD1結合分子治療病患的主治醫師應知曉如何以及何時因毒性、器官功能障礙及諸如此類而終止、中斷或調整給藥。相反地，若臨床反應不足(排除毒性)，主治醫師亦應知曉將治療調整至較高的量。在管理感興趣病症時，給藥劑量之幅度將隨著所欲治療之症狀的嚴重度、給藥路徑及諸如此類而變。症狀的嚴重度可，例如，部分藉由標準的預後評估方法來評估。再者，劑量和可能的給劑頻率亦將根據個別病患的年齡、體重和反應而變。 6.10.1. 第 1 型糖尿病
在某些具體實施例中，根據本揭示文之CD20-PD1結合分子可防止或減緩第1型糖尿病的發展或進程。因此，在某些具體實施例中，本揭示文之CD20-PD1結合分子、核酸及/或醫藥組成物可投予患有T1D或處於發生T1D風險的對象。發生T1D風險的因子包括，但不限於遺傳標記(例如人類白血球抗原(HLA)複合物；參見Flemming and Pociot, 2016, Lancet, 387(10035):2331-2339)、病毒感染(例如、德國麻疹、克沙奇病毒(coxsackie virus)和腮腺炎)、種族/民族(例如，在美國，高加索人更易罹患第1型糖尿病)、家族史、早期飲食和存有其他自體免疫疾病(例如，葛瑞夫茲氏病(Graves disease)、多發性硬化症，惡性貧血)。接受免疫檢查點抑制劑治療的癌症患者亦處於發生T1D的風險。參見Filette et al., 2019, Eur J Endocrinol, 181(3):363-374。辨識和選擇該等處於發生T1D風險的個體係在熟習本項技術者之能力範圍內。
在某些具體實施例中，係依照本揭示文之方法，以本揭示文之CD20-PD1結合分子、核酸和/或醫藥組成物治療處於發生T1D風險的病患。 6.11. 組合治療
根據本揭示文之CD20-PD1結合分子可在治療中與一或多種其他另外的藥劑組合給藥。例如，本揭示文之CD20-PD1結合分子可與至少一另外的治療劑共投予。術語「治療劑」係涵蓋治療需要此治療之對象之症候或疾病所投予的任何藥劑。此另外的治療劑可包括任何適用於所欲治療之特定適應症的活性成份，較佳地該等相互不會有不利影響之具有互補活性的活性成份。在特定的具體實施例中，另外的治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞凋亡之活化劑或增加細胞對細胞凋亡誘發劑之敏感性的藥劑。
此等其他藥劑係以對希望目的有效之量適當地組合存在。此等其他藥劑的有效量係依所用的CD20-PD1結合分子之量、病症或治療的類型以及上述其他因素而定。CD20-PD1結合分子一般係以與本文中所述相同的劑量和給藥路徑，或以本文中所述劑量之約1%至99%，或以經驗上/臨床上確定為適合的任何劑量和任何途徑來使用。
上文提及之此等組合治療係包括組合給藥(其中二或多種治療劑係包含在相同或個別的組成物中)和個別給藥，在該情況下，本揭示文CD20-PD1結合分子之給藥可在投予該另外的治療劑及/或佐劑之前，同時，及/或之後進行。 6.11.1. 使用 CD20-PD1 結合分子治療和免疫治療之組合治療
本揭示文之CD20-PD1結合分子可有利地與嵌合抗原受體(「CAR」)-表現細胞組合使用，例如，CAR-表現Treg(「CAR-Treg」)細胞，例如治療自體免疫疾病之CAR-Treg。在某些具體實施例中，CAR-Treg細胞係由CD20-PD1結合分子中的CD20靶向基團所辨識。CD20靶向基團可辨識CAR-Treg細胞上的Treg細胞受體或另外的細胞表面分子。在某些具體實施例中，CD20-PD1結合分子中的CD20靶向基團能與CAR的胞外結構域結合，例如抗原結合結構域。CAR-Treg細胞係描述於Fritsche et al., 2020, Trends Biotechnol, 38(10):1099-1112；Zhang et al., 2018, Front Immunol, 9:2359；和Mohseni et al., Front Immunol, 11:1608中，其各自係以全文引用的方式併入本文中。 6.12. 評估 CD20-PD1 結合分子
本揭示文之方面係關於以螢光素酶為基礎的報導子分析，用以評估本揭示文之CD20-PD1結合分子在呈遞於HEK293細胞上之CD20的存在下促效Jurkat細胞上之PD1的能力。在某些具體實施例中，係以CD22以及CD20轉導HEK293細胞。
在某些具體實施例中，本文中所揭示之生物分析係包括在HEK293細胞的存在下使用雙特異性抗體(例如CD3xCD22)從已使用慢病毒以AP1(活化子-蛋白1)-螢光素酶報導子、CD3及PD1轉導之Jurkat細胞株引發免疫反應。在Jurkat和HEK293細胞以及抗CD3xCD22雙特異性抗體之存在下，將CD20-PD1結合分子加到孔槽中。最佳促效PD1之分子，如由AP1驅動的螢光素酶活性所測量，具有降低受抗-CD3xCD22雙特異性抗體所刺激之免疫反應量的能力。 7. 實例 7.1. 材料和方法 7.1.1. 設計和製造 CD20-PD1 結合分子
產生如下表1和2所示之編碼雙特異性CD20-PD1促效劑和對照之結構。雙特異性CD20-PD1促效劑包括不同構型之鼠類抗-CD20和修飾的鼠類PDL1胞外域、IgG1效應子無效(EN)(L234A、L235E、G237A、A330S和P331S，EU編號)結構域，以及來自不同G 4S(SEQIDNO：14)之不同長度的連接子。將來自鼠類失活酪胺酸-蛋白激酶跨膜受體ROR1(mROR1)的29個-胺基酸信號序列加到該結構的N-端。所有雙特異性CD20-PD1促效劑係表現為含有訊號序列的前體蛋白。藉由細胞內處理裂解訊號序列，產生成熟蛋白。
形成旋鈕之突變：T366W (EU編號)。
形成孔洞之突變：T366S、L368A和Y407V(EU編號)。
星狀突變：H435R和Y436F (EU編號)。
鼠類抗 -CD20(18B12) 重鏈 VR ： QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：30)
鼠類抗 -CD20(18B12) 輕鏈 VR ： QIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：31)
hIgG4s-Fc ：帶有以IgG2-為基礎之絞鏈區的變體hIgG4 (hIgG4E99-105 hIgG2_HingeC106-A115 hIgG4_CH2_CH3 G117-K237) ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO：32)
hIgG4s( 旋鈕 )-Fc帶有以IgG2-為基礎之絞鏈區和用以幫助與hIgG4s(旋鈕)-Fc異二聚化之突變的變體hIgG4 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO：33)
hIgG4s( 孔洞 - 星狀 )-Fc帶有以IgG2-為基礎之絞鏈區和用以幫助與hIgG4s(孔洞-星狀)-Fc異二聚化之突變的變體hIgG4 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：34)
hIgG1EN-Fc帶有L234A、L235E、G237A、A330S和P331S(EU編號)之變體IgG1 DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：35)
hIgG1EN( 旋鈕 )-Fc帶有L234A、L235E、G237A、A330S和P331S(EU編號)以及幫助與hIgG1EN(旋鈕)異二聚化之突變的變體IgG1 DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：36)
hIgG1EN( 孔洞 - 星狀 )-Fc帶有L234A、L235E、G237A、A330S和P331S (EU編號)和用以幫助與hIgG1EN(孔洞-星狀)異二聚化之突變的變體IgG1 DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：37)
G 4S ： GGGGS (SEQ ID NO：14)
藉由過渡性轉染在Expi293F TM(Thermo Fisher Scientific)細胞中表現該等結構。使用ProteinMaker系統(Protein BioSolutions, Gaithersburg, MD)以HiTrap TMProtein G HP或MabSelect SuRe pcc管柱(Cytiva)純化Expi293F上清液中的蛋白。在單一步驟溶析後，將抗體中和，透析至含5%甘油的磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)的最終緩衝液中，分成等份並儲存於-80°C。對於某些結構，係使用HiPrep 26/60 Sephacryl S-200管柱之粒徑排阻層析的額外步驟。
mPDL1中比對和選擇的突變位置係如圖3B所示。使用MacVector產生mPDL1和hPDL1之間的比對。圖3A係描繪mPDL1和hPDL1的三維結構，包括mPDL1中經改變用以提升產量和穩定性的殘基。
表3–抗-mCD20 x mPDL1胞外域結構
分子鏈 說明 序列
hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀) 帶有L234A、L235E、G237A、A330S和P331S (EU編號)以及幫助與hIgG1EN(旋鈕)異二聚化之突變的變體IgG1 與mPDL1 胞外域-抗-mCD20-Fc異二聚化形成m20_mPL_2(圖2A(B))； 與抗-mCD20-Fc-mPDL1胞外域異二聚化形成m20_mPL_3(圖2A(C)); 與抗-mCD20-mPDL1胞外域-Fc異二聚化形成m20_mPL_4(圖2A(D); 與mPDL1胞外域-Fc異二聚化形成1xNmPDL1Fc(圖2B(N); 與Fc-mPDL1胞外域異二聚化形成1xCmPDL1Fc(圖2B(O); 與mPDL1胞外域-mPDL1胞外域-Fc異二聚化形成NTdm_mPDL1Fc(圖2A(P))；或 與mPDL1 胞外域-Fc-mPDL1胞外域異二聚化形成2xFlxPDL1Fc(圖2B(S)) DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：37)
抗-mCD20-Fc(孔洞-星狀) 與Fc的N-端相連接之抗-鼠類CD20 Fc為hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀) 與mPDL1胞外域-Fc異二聚化形成m20_mPL_1(圖2A(A)); 與mPDL1胞外域-抗-mCD20-Fc異二聚化形成2+1 m20_mPL_1 (圖2A(E)); 與抗-mCD20-Fc-mPDL1異二聚化形成2+1 m20_mPL_2(圖2A(F)); 與抗-mCD20-mPDL1胞外域-Fc異二聚化形成2+1 m20_mPL_3(圖2A(G))；或 與mPDL1-mPDL1-Fc異二聚化形成1+2 m20_mPL_1(圖2A(H)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1EN FcQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：38) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hCκQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20-Fc(孔洞-星狀)-抗-mCD20 與Fc的N-端相連接之第一抗-鼠類CD20，和與Fc的C-端相連接之第二抗-鼠類CD20 Fc為hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀) 與mPDL1-Fc-mPDL1異二聚化形成2+2 m20_mPL_3(圖2A(K)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1EN Fc + 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD (SEQ ID NO：40) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hCκQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
mPDL1胞外域-Fc(旋鈕) 與Fc的N-端相連接之鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN-Fc(旋鈕) 與抗-mCD20-Fc異二聚化形成m20_mPL_1(圖2A(A))； 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成1xNmPDL1F(圖2B(N))；或 與mPDL1胞外域-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成2xNmPDL1Fc(圖2B(Q)) FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：41)
mPDL1胞外域-Fc(孔洞-星狀) 與Fc的N-端相連接之鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀) 與mPDL1胞外域-Fc (旋鈕)異二聚化形成2xNmPDL1Fc(圖2B(Q)) FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：42)
Fc(旋鈕)-mPDL1胞外域 與Fc的C-端相連接之鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN-Fc(旋鈕) 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成1xCmPDL1Fc(圖2B(O))；或 與Fc(孔洞-星狀)-mPDL1胞外域異二聚化形成2xCmPDL1Fc (圖2B(R)) DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRT (SEQ ID NO：43)
Fc(孔洞-星狀)-mPDL1胞外域 與Fc的C-端相連接之鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀) 與Fc(旋鈕)-mPDL1胞外域異二聚化形成2xCmPDL1Fc(圖2B(R)) DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRT (SEQ ID NO：44)
mPDL1胞外域-Fc(旋鈕)-mPDL1 胞外域 與Fc的N-端相連接之第一鼠類PDL1(C113S)胞外域，和與Fc的C-端相連接之第二鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN-Fc(旋鈕) 與 抗-mCD20-Fc-抗-mCD20(圖2A(K))異二聚化；或 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成2xFlxPDL1Fc(圖2B(S)) FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRT (SEQ ID NO：45)
mPDL1胞外域-mPDL1 胞外域-Fc(旋鈕) 與第二mPDL1胞外域的N-端相連接之第一mPDL1(C113S)胞外域，和與Fc的N-端相連接之第二mPDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN(旋鈕) 與抗-mCD20-Fc異二聚化形成1+2 m20_mPL_1 (圖2A(H))；或 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成NTdm_mPDL1Fc(圖2B(P)) FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：46)
mPDL1 胞外域-抗-mCD20-Fc(旋鈕) 與抗-鼠類CD20之N-端相連接的鼠類PDL1 (C113S)胞外域，和與Fc的N-端相連接之抗-鼠類CD20 Fc為hIgG1EN(旋鈕) 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成m20_mPL_2(圖2A(B); 與抗-mCD20-Fc異二聚化形成2+1 m20_mPL_1 (圖2A(E))；或 與mPDL1胞外域-抗-mCD20-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成2+2 m20_mPL_1(圖A2(I)) mPDL1 胞外域 + 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1ENFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：47) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
mPDL1胞外域-抗-mCD20-Fc(孔洞-星狀) 與抗-鼠類CD20之N-端相連接的鼠類PDL1 (C113S)胞外域，和與Fc的N-端相連接之抗-鼠類CD20 Fc為hIgG1EN(孔洞-星狀) 與mPDL1 胞外域-抗-mCD20-Fc(旋鈕)異二聚化形成2+2 m20_mPL_1 (圖2A(I)) mPDL1 胞外域 + 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1ENFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：48) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20-Fc(旋鈕)-mPDL1胞外域 與Fc的N-端相連接之抗-鼠類CD20，和與Fc的C-端相連接之鼠類PDL1(C113S)胞外域 Fc為hIgG1EN(旋鈕) 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成m20_mPL_3(圖2A(C)); 與抗-mCD20-Fc異二聚化形成2+1 m20_mPL_2 (圖2A(F))；或 與抗-mCD20-Fc-mPDL1胞外域異二聚化形成2+2 m20_mPL_2 (圖2A(J)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1EN + mPDL1 胞外域QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRT (SEQ ID NO：49) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20-Fc(孔洞-星狀)-mPDL1胞外域 與Fc的N-端相連接之抗-鼠類CD20，和與Fc的C-端相連接之鼠類PDL1胞外域 Fc為hIgG1EN(孔洞-星狀) 與抗-mCD20-Fc(旋鈕)-mPDL1胞外域異二聚化形成2+2 m20_mPL_2 (圖2A(J)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1EN + mPDL1 胞外域QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRT (SEQ ID NO：50) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20-mPDL1胞外域-Fc(旋鈕) 與N-端鼠類PDL1(C113S)胞外域相連接之抗-鼠類CD20，和與Fc的N-端相連接之鼠類PDL1胞外域 Fc為hIgG1EN(旋鈕) 與hIgG1EN-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成m20_mPL_4(圖2A(D))；或 與抗-mCD20-Fc異二聚化形成2+1 m20_mPL_3 (圖2A(G)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + mPDL1 胞外域 + hIgG1ENQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：51) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20-mPDL1胞外域-Fc 與N-端相鼠類PDL1(C113S)胞外域相連接的抗-鼠類CD20，和與Fc的N-端相連接之PDL1胞外 Fc為hIgG1EN 可同二聚化形成2+2 m20_mPL_4 (圖2A(L)) 抗 -CD20 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + mPDL1 胞外域 + hIgG1ENQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYSCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：52) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20 (18B12)-Fc(旋鈕) 與Fc的N-端相連接之18B12 Fc為hIgG1EN(旋鈕) 可與抗-1B12-Fc(孔洞-星狀)異二聚化形成1B12IgG1EN(圖2B(M)) 抗 -1B12 重鏈 VR+ hIgG1CH1 + hIgG1ENQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：53) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
抗-mCD20 (18B12)-Fc(孔洞-星狀) 與Fc的N-端相連接之18B12 Fc為hIgG1EN(孔洞-星狀) 可與抗-1B12-Fc(旋鈕)異二聚化形成1B12IgG1EN(圖2B(M)) 抗 -1B12 重鏈 VR+ hIgG1 CH1 + hIgG1ENQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：38) 抗 -CD20 輕鏈 VR+ hC κQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：39)
7.1.2. 流式細胞 術
將細胞(HEK293、過度表現mCD20的MC38或過度表現mPD1的Jurkat)以1×10 6個細胞/mL再懸浮於FACS清洗液(含1%FBS之PBS)中。以每孔1×10 5個細胞進行染色。從1.3x10 -07M的起始濃度開始，以1：5的比率稀釋抗體。然後將稀釋的抗體加到含有細胞的孔槽中。於2-8°C將細胞染色30分鐘，並用FACS清洗緩衝液清洗二次。加入APC-接合的山羊抗人類IgG(Jackson Immuno Research, 109-607-003, 1：400)於2-8°C將細胞染色30分鐘。清洗後，於2-8°C將細胞以2%多聚甲醛固定30分鐘。清洗二次後，使用BD LSRFortessa TMFACS儀器分析染色的細胞。以FlowJo分析結果。使用FSC/SSC門閥選擇單核細胞。
就脊椎T細胞浸潤流式細胞術分析，首先藉由膠原酶D(Roche, 11088882001)消化和Percoll(GE Healthcare, 17-0891-02)梯度分離製備脊椎的單細胞懸浮液。將細胞再懸浮於FACS清洗液中，並按照上述方法以LIVE/DEAD™可固定的藍色死細胞染色套組(Thermofisher Scientific, L34962)、抗-小鼠CD45-BV750(Bio Legend, 103157, 1：200稀釋度)、抗-小鼠CD4-BUV563(BD Bioscience, 612923, 1：200稀釋度)和抗-小鼠CD8a-BUV805(BD Bioscience, 564920, 1：100稀釋度)進行染色。藉由BD FACSymphony Cell Analyzer分析細胞。以OMIQ cytometry軟體分析結果。 7.1.3. 螢光素酶報導子分析 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子
使用以螢光素酶為基礎的報導子分析來評估抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子在呈遞於HEK293細胞上之小鼠CD20(mCD20)的存在下促效Jurkat細胞上的小鼠PD1(mPD1)之能力。報導子分析的整體設計係如圖5A和B所示。AP1為一種在T細胞活化期間涉及基因表現的調節之轉錄因子(Samelson 2002, PMID：11861607)。使用與人類CD3和CD22結合的雙特異性抗體(bsAb)，CD3 bsAb(REGN10551)，經由結合標靶細胞上的抗原和T細胞上的受體來刺激T細胞活化，類似之前描述的CD3xCD20 bsAb(Smith et al. 2015,PMID：26659273)。經由mCD20錨定的mCD20xmPDL1與Jurkat細胞上的mPD1結合，導致PD1促效作用-驅動的螢光素酶訊號抑制。 7.1.3.1. 工程改造 Jurkat/AP1-luc/mPD1 細胞
藉由以AP1(活化蛋白1)-螢光素酶報導子慢病毒(QIAGEN CLS-011L)，接著含有mPD1 ORF的慢病毒(mPD1 NM_008798)，連續轉導Jurkat E6-1 細胞(ATCC#TIB-152)，產生Jurkat/AP1-luc/mPD1細胞。 7.1.3.2. 工程改造 HEK293/hCD22/mCD20 細胞
藉由使用人類CD22 ORF-編碼的慢病毒(NP_001762.2)，接著mCD20 ORF-編碼的慢病毒(NP_031667.1)之連續慢病毒轉導，產生HEK293/hCD22/mCD20細胞。 7.1.3.3. 螢光素酶分析設置
就生物分析，係將HEK293/CD22/mCD20標靶細胞以10,000或20,000個細胞/孔接種到96孔盤的分析培養基中(RPMI1640添補10%胎牛血清和L-麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素)並於37°C、5%CO 2中培養至隔夜。隔日，將Jurkat/AP1-luc/mPD1報導子細胞以30,000或50,000個細胞/孔加到含有培養的標靶細胞之孔槽中。然後將本揭示文之分子或對照抗體用分析培養基以1：3連續稀釋至最終濃度範圍為100 nM至1 pM(在無受試分子之附加條件下)，並與1 nM或2.5 nM的CD3bsAb一起加到細胞中。為了得到一定範圍的活化，係將CD3bsAb以1：3連續稀釋至最終濃度範圍為100 nM至1.69 pM(無雙特異性mAb之附加條件下)並加至細胞中。在37°C/5% CO 2下培養5小時後，於添加ONE-Glo™(Promega)試劑後，在Envision多標記盤式判讀儀(PerkinElmer)上偵測螢光素酶活性。所有條件係以雙重複進行試驗。
以GraphPad Prism™軟體使用非線性回歸(4-參數邏輯)測定EC 50/IC 50值。以相對發光單位(RLU)值為基準使用下列方程式計算抑制百分比：
在此方程式中，「RLU基線」為在無試驗分子下經固定量的CD3 bsAb處理之細胞發光值，「RLU抑制」為在最高濃度的試驗分子與固定量的CD3 bsAb下之發光值，而「RLU背景」為無任何CD3 bsAb或試驗分子下的細胞發光值。 7.1.4. 以粒徑排阻 層析測定抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之寡聚化狀態
應用粒徑排阻超高效液相層析(SE-UPLC)評估抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子的粒徑異質性。SE-UPLC分析係於Waters Acquity UPLCH-Class系統上進行，其中係將10 μg的各蛋白樣本注射至Acquity BEH SEC管柱(200 Å, 1.7 μm, 4.6 x 300 mm)，並將流速設定在0.3 mL/ min。移動相緩衝液含有10 mM磷酸鈉、500 mM NaCl，pH7.0。使用光電二極管陣列模組藉由280 nm的UV吸收度偵測溶析樣本。 7.1.5. 熱穩定性
應用差示掃描螢光法(DSF)評估抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子的熱穩定性。DSF分析係於ThermoFisher QuantStudio5系統上進行。將各樣本的儲存溶液以1X PBS-甘油pH 7.4稀釋至0.2 mg/mL，並轉置於96孔盤。將過量(8X)的Sypro Orange™螢光染劑(當蛋白解摺疊時優先與隱藏的疏水性殘基結合)加到各孔槽中，及隨後在20分鐘內於25 oC升溫至95 oC的線性斜坡上測定熱穩定性樣貌。 7.1.6. 組配百分比
雙功能融合分子之組配係依製造商的方法(Perkin Elmer, Waltham, MA)於Cliper LabChip GX上藉由高通量分析加以分析。簡言之，藉由將7 ml的HT蛋白表現樣本與240 µl BME(還原)或25 mM碘乙醯胺(IAM，用於非還原分析)混合製備樣本緩衝液。以樣本緩衝液將樣本標準化至0.5 mg/ml，然後於70°C加熱10分鐘。於各樣本中加入70 µl水，之後載入儀器。根據製造商的說明書製備晶片。使用LabChip GX軟體分析樣本的電泳圖。來自非還原電泳圖的波峰代表完整抗體的%。 7.1.7. 在糖尿病前期的 NOD 小鼠中 抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域 分子之活性
將10週大的糖尿病前期非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(The Jackson Laboratory)，在實驗期間(例如，直到小鼠28週大)，每週二次以1、0.1或0.01 mg/kg之所選的抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子腹膜內治療。每二週監測血糖量，同時每週監測體重。整體實驗設計係如圖7所示。 7.1.8. 在實驗性自體免疫腦脊髓炎 / 多發性硬化小鼠模型中抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之活性
在小鼠中投予髓鞘寡樹突細胞糖蛋白(MOG 35-55)之免疫顯性35-55表位，產生造成脫髓鞘和慢性實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)之抗-MOG抗體，其為一種常用的多發性硬化症(MS)動物模型。
在第1天藉由皮下遞送溶於CFA之200 mg MOG 35-55，於野生型C57BL/6小鼠(10~12週，雄性，The Jackson Laboratory)中引發EAE。有鑑於投予百日咳毒素藉由削弱血腦屏障促進T細胞往中樞神經系統的遷移，在第1天和第2天亦將小鼠以i.p.注射200 ng百日咳毒素。在第1、2、7、10、14、18和20天監測體重和EAE發展。EAE監測評分係以0-5的等級記錄如下：0：健康；1：尾巴不舉；2：步態異常及/或翻正反射缺陷；3：後肢部分癱瘓；4：後肢完全癱瘓；及5：後肢完全癱瘓和前肢部分癱瘓或垂死。
從第2天開始，每週二次給予小鼠i.p.注射選擇的抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子或適當的對照分子。在第20天疾病高峰時進行終點組織收取。脊髓浸潤用於流式細胞術，並以ELISPOT評估脾臟MOG-特異性T細胞反應。 7.2. 實例 1 ：雙特異性抗 -mCD20-mPDL1 胞外域促效劑之製造和安定性 7.2.1. 概觀
藉由DNA合成和選殖從來自Life Technologies(Carlsbad,CA)之pcDNA3.4 Topo表現系統中的即用型結構，製造用於個別重鏈和輕鏈的哺乳動物表現載體。就表現分子，係將重鏈的DNA和通用輕鏈按照製造商的方法共轉染至Expi293細胞(ThermoFisher Scientific)。收取50 ml的細胞培養基並經由HiTrap Protein A FF或Mab Select SuRe管柱(GE Healthcare)進行純化處理。就功能確認，係將選擇的MBM放大至2L並進行一系列純化程序，包括粒徑排阻層析作為最終步驟。 7.2.2. 結果
從Expi293 Freestyle細胞(表4)經由單步驟Mab-Select SuRe管柱表現和純化各種抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子(圖2A)，其中總產量範圍在2.7–7.7 mg之間。一般而言，價數比率為1：1的分子(抗mCD20：mPDL1胞外域)比價數比率為2：1或2：2的分子展現出更高的產量(4.1-7.7mg)(表4)。
表 4- 抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域 融合分子之製造概要
分子 ID ( 圖 2A 和 2B) 分子 結構形式 靶位排列 MW (kDa) 50 ml 之總產量 (mg)
A m20_mPL_1 KiH-1xN-配體 mPD1 x mCD20 123.2 5.5
B m20_mPL_2 KiH-1+N-融合物 mPD1-mCD20 123.8 7.7
C m20_mPL_3 KiH-1+C-融合物 mCD20/mPD1 123.8 5.2
D m20_mPL_4 KiH-1+N-融合物 mCD20-mPDL1 100 4.1
E 2+1 m20_mPL_1 KiH-2+1 N-融合物 (mPD1-mCD20) x mCD20 171.0 3.2
F 2+1 m20_mPL_2 KiH-2+1 C-融合物 (mCD20/mPD1) x mCD20 171.0 2.3
G 2+1 m20_mPL_3 KiH-2+1 H-融合物 (mCD20-mPD1) xmCD20 171.1 2.9
H 1+2 m20_mPL_1 KiH-1x1+1 N-融合物 (mPD1-mPD1)x mCD20 149.8 3.7
I 2+2 m20_mPL_1 KiH-2+2 N-融合物 (mPD1-mCD20) x (mPD1-mCD20) 196.7 4.5
J 2+2 m20_mPL_2 KiH-2+2 C-融合物 (mCD20/mPD1) x (mCD20/mPD1) 196.7 2.8
K 2+2 m20_mPL_3 KiH-2x2 融合物 (mPD1/mPD1) x (mCD20/mCD20) 197.1 2.7
L 2+2 m20_mPL_4 2+2 H-融合物 (mCD20-mPD1) x (mCD20-mPD1) 200 19.2*
M 1B12IgG1EN IgG mCD20 x mCD20 145.3 4.8
N 1xNmPDL1Fc KiH-N-融合物 mPD1 76.0 11.2
O 1xCmPDL1Fc KiH-C-融合物 mPD1 76.7 7.9
P NTdm_mPDL1Fc KiH-N-融合物 mPD1-mPD1 125.8 5.2
Q 2xNmPDL1Fc 融合物-Fc mPD1 x mPD1 101.1 10.0
R 2xCmPDL1Fc Fc-融合物 mPD1 x mPD1 102.3 3.9
S 2xFlxPDL1Fc KiH -2x0 融合物 mPD1/mPD1 101.7 6.4
*200 ml培養物在蛋白A和粒徑排組層析後的總產量； KiH：旋鈕-入-孔洞；x：Hc間的交聯：-：串聯融合物；/：被Fc隔開
在單步驟親和純化後，以SE-UPLC檢測高分子量(HMW)％和單體%，而熱穩定性係藉由差示掃描螢光法(DSF)監測(表5)。在無額外的粒徑排阻層析(SEC)下，大多數的抗-mCD20 x mPDL1胞外域融合分子顯現大於85%的單體種類(表3，圖1中的分子A–L)。就2+2 m20_mPL_4(L)，在包括SEC步驟的二次管柱純化後，單體百分比增加至99%(表5)。藉由DSF以60°C左右的Tm1測量，所有抗-mCD20 x mPDL1胞外域融合物具有類似的熱穩定性(表3)。再者，藉由毛細管電泳SDS(CE-SDS)測定，所有雙功能融合物具有重鏈間良好的組配(表5)。
表 5- 從步驟 1 純化之抗 mCD20 x mPDL1 胞外域融合物和對照組的單體純度 (SE-UPLC) 、熱穩定性 (DSF) 及組配
分子 ID ( 圖 2A 和 2B) 分子 SE-UPLC 熱穩定性 毛細管電泳 SDS
HMW % 單體 % Tm1 °C Tm2 °C 組配 %
A m20_mPL_1 12 87 60.5 NA 100
B m20_mPL_2 15 80 61.5 NA 99
C m20_mPL_3 8 88 61.3 NA 99
D m20_mPL_4 ND ND 61.6 NA 100
E 2+1 m20_mPL_1 14 74 62 85.4 95
F 2+1 m20_mPL_2 7 92 60.7 86.4 98
G 2+1 m20_mPL_3 11 86 61.2 NA 100
H 1+2 m20_mPL_1 8 86 61.6 85.6 100
I 2+2 m20_mPL_1 15 80 62.2 85.4 100
J 2+2 m20_mPL_2 7 91 61.3 85.5 98
K 2+2 m20_mPL_3 9 86 62.2 86.8 100
L 2+2 m20_mPL_4 1* 99* 59.7 NA 100
M 1B12IgG1EN 10 83 58.5 NA 51
N 1xNmPDL1Fc 6 91 59 NA 98
O 1xCmPDL1Fc 4 93 60.6 NA 100
P NTdm_mPDL1Fc 40 60 51.5 NA 62
Q 2xNmPDL1Fc 5 92 59.2 NA 87
R 2xCmPDL1Fc 3 95 60.5 NA 100
S 2xFlxPDL1Fc 7 87 61.5 NA 100
ND：未進行試驗。NA：無法取得 * 200 ml培養物在蛋白A和SEC純化後之定性
7.3. 實例 2 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之結合特性
以流式結合分析評估抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子與其細胞表面上二種標靶之結合能力。 7.3.1. 結果
結合曲線係如圖4A和4B所示。相對於就mPD1和mCD20二者而言結合形式相似的單價分子，在二價分子中觀察到更高的結合效力和最大MFI。特言之，雖然2+2 m20_mPL_4(L)與2+1 m20_mPL_3(G)(圖4A和4B；表6)享有與HEK293/mCD20細胞相似的結合，但2+2 m20_mPL_4(L)由於對mPD1結合的價數增加，而比2+1 m20_mPL_3(G)展現與Jurkat/mPD1細胞更強的結合。在二價和單價分子二者中，結合訊號似乎是方向依賴的，N-端抗-mCD20和hPDL1胞外域方向相對於Fc結構域一般具有更高的效力和最大MFI。當位於Fc之前的N-端基團和絞鏈區之間時，抗-mCD20或mPDL1胞外域顯示結合下降(圖4A和4B；表6)。 7.4. 實例 3 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域 分子之 mPDL1 促效作用
利用圖5所描繪的和7.1.3章節中所述的生物分析，研究抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子之mPD1促效作用。 7.4.1. 結果
來自螢光素酶分析之結果係描繪於圖6和表6中。使用HEK293/CD22/mCD20和帶有CD3 bsAb的Jurkat/AP1-luc/mPD1報導子細胞檢測本揭示文19個分子之PD1促效作用及其T細胞訊號傳遞的調節。如表6所示，本揭示文之19個分子中有4個顯示T細胞訊號傳遞之抑制，IC50值範圍為65-770 pM，最大抑制範圍為27-84%。分子2+2 m20_MPL_4和2+1m20_MPL_3(分別為G和L；表6)展現最強的PD1促效作用，具有74%至84%的最大抑制(圖6C和6E)。19個分子中有15個顯示弱的或無抑制，最大抑制範圍為-10至40%。同型對照抗體並未顯示訊號傳遞之抑制。CD3 bsAb顯示活化T細胞訊號傳遞，EC50值為627 pM和1.15 nM。 7.5. 實例 4 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之活體外分析的數據彙總
表6係提供以各種抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子所收集之活體外數據的彙總，包括以細胞為基礎的流式結合和活體外生物分析結果。螢光素酶分析之結果係如圖6A-6E所示。分子2+2 m20_mPL_4和2+1 m20_mPL_3(分別為表6中的G和L)展現最強的PD1促效作用。藉由以細胞為基礎的流式分析，2+2 m20_mPL_4顯示與mPD1和mCD20最強的結合，然而2+1 m20_mPL_3與mPD1表現細胞僅顯示中度的結合，其表示在APC和效應細胞二者的存在下，經由mCD20的二價結合來聚集mPD1為必需的。整體而言，相似的細胞結合親和力(mPD1或mCD20)並未轉化為相似的PD1促效作用，例如F與G以及K與L(圖6A和表6)，其指出CD20和mPDL1胞外域臂的價數和結構排列對於活性賦予為重要的。 .
表 6– 抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之活體外分析的彙總數據
編號ID 分子 以細胞為基礎的流式結合 生物分析
MC38/mCD20 HEK293/mCD20 Jurkat/mPD1 2.5 nM CD3 bsAb (EC50 = 6.27E-10 M) 1 nM CD3 bsAb (EC50 = 1.15E-09 M)
EC50 (M) 最大MFI EC50 (M) 最大MFI EC50 (M) 最大MFI IC50 (M) 最大抑制% IC50 (M) 最大抑制%
A m20_mPL_1 6.25E-07 16791 NT NT ND 8154 WB/NB 18 NT NT
B m20_mPL_2 5.47E-07 5570 NT NT ND 9949 WB/NB 29 NT NT
C m20_mPL_3 ND 7505 NT NT ND 2611 WB/NB 17 NT NT
D m20_mPL_4 NT NT ND 10382 ND 1757 NT NT ＞100nM 40
E 2+1 m20_mPL_1 6.40E-09 39112 NT NT 1.24E-07 13369 WB/NB 16 NT NT
F 2+1 m20_mPL_2 3.52E-09 42719 NT NT ND 1192 WB/NB 10 NT NT
G 2+1 m20_mPL_3 3.93E-09 52855 1.50E-08 28862 ND 5629 3.16E-10 74 7.70E-10 80
H 1+2 m20_mPL_1 ND 20343 NT NT 2.24E-08 16700 WB/NB 11 NT NT
I 2+2 m20_mPL_1 1.81E-08 31023 NT NT 2.95E-09 11598 1.92E-10 27 NT NT
J 2+2 m20_mPL_2 3.45E-09 37275 NT NT 1.51E-08 8505 WB/NB 8 NT NT
K 2+2 m20_mPL_3 8.42E-09 35294 NT NT 6.31E-09 6982 6.50E-11 33 NT NT
L 2+2 m20_mPL_4 NT NT 1.13E-08 30334 ND 18890 NT NT 1.91E-10 84
M 1B12IgG1EN 1.71E-09 41989 1.35E-08 28240 NB 118 WB/NB 0 WB/NB 19
N 1xNmPDL1Fc NB 129 NB 13.4 ND 3403 WB/NB 12 WB/NB 13
O 1xCmPDL1Fc NB 84.7 NT NT ND 1196 WB/NB -2 NT NT
P NTdm_mPDL1Fc NB 167 NT NT ND 7895 WB/NB -7 NT NT
Q 2xNmPDL1Fc NB 112 NB 12 4.70E-08 11577 WB/NB 2 WB/NB 12
R 2xCmPDL1Fc NB 85.7 NT NT ND 4639 WB/NB 8 NT NT
S 2xFlxPDL1Fc NB 91.4 NT NT 9.43E-09 6819 WB/NB -10 NT NT
18B12-scFvFc 1.80E-08 48302 NT NT NB 198 NT NT NT NT
單臂mPDL1 WT-Fc NB 94.9 NT NT ND 495 NT NT NT NT
REGN1932 (hIgG1對照組) NB 140 NB 14.3 NB 90.4 WB/NB 3 NT NT
WB/NB：弱或無阻斷
NB：無結合
ND：未決定
NT：未檢測
7.6. 實例 5 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子之活體外效用
於糖尿病前期NOD小鼠中評估所選的2+2和2+1抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子預防第1型糖尿病(T1D)發作之能力。實驗設計係描繪於圖7中，以及描述於7.1.7章節中。 7.6.1 結果
個別動物數據係如圖8A-8I所示。圖9A和9B係描繪各所指之時間點無糖尿病小鼠的百分比。通常，80-90%的NOD小鼠在約25週大時發生糖尿病。然而，在此實驗中，僅約30%的小鼠在27週前發生糖尿病。在對照NOD小鼠中有較低的糖尿病發病率的同時，較高劑量的(2+2)抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子2+2 m20_mPL_4(圖2A中的分子L)有明顯的保護趨勢，但(2+1抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子2+1m20_mPL_3則無(圖2A中的分子G) (圖9A和9B)。 7.7. 實例 6 ：抗 -mCD20 x mPDL1 胞外域分子 - 引發的自體免疫 T- 細胞浸潤下降
T細胞浸潤已與自體免疫疾病的發展有關，例如多發性硬化症(Kaskow and Baecher-Allan, 2018. Cold Spring Harb Perspect Med. 8(4)：a029025)和糖尿病的自體免疫模型(Bettini and Vignali, 2011. Curr Opinion in Immunology, 23(6)：754-760)。如7.1.2章節所述經由流式細胞術評估(2+2)抗-mCD20 x mPDL1胞外域分子2+2 m20_mPL_4對抗T細胞浸潤的角色[請補充7.1.2章節與使用小鼠模型之細胞進行實驗相關的流式細胞術資訊]。 7.7.1. 結果
在一項評估中，係於7.1.7章節所描述之給劑0.1或1 mg/kg 2+2 m20_mPL_4或對照分子的NOD小鼠中，分析增生(活化)和較低活化之胰島特異性CD8+T細胞群族。以1 mg/kg 2+2 m20_mPL_4治療係與較低活化之CD8+T細胞簇的百分比顯著增加有關(圖10A)。雖然增殖細胞簇的百分比在不同條件下並無差異(圖10B)，但從以1 mg/kg 2+2 m20_mPL_4(圖10C)治療之NOD小鼠所分離出的胰臟組織中較低活化和增生的細胞簇之比率較高，其表示此治療能降低活化的自體免疫T細胞之胰臟浸潤。
在另外的評估中，係於7.1.8章節所描述的多發性硬化症小鼠模型中評估T細胞的脊椎浸潤。相對於接受相同劑量之對照治療的小鼠脊椎，在以1 mg/kg 2+2 m20_mPL_4治療的小鼠脊椎中，CD3+(圖11A)、CD4+(圖11B)和CD8+(圖11C)T細胞實質上較少。因此，以2+2 m20_mPL_4治療能降低多發性硬化症模型中T細胞的脊椎浸潤。 8. 特定具體實施例、參考文獻之引用
在已說明和描述了各種具體實施例的同時，應了解，在不悖離本揭示文之精神和範圍下可進行各種改變。本揭示文係藉由下列之編號具體實施例作為例示。 1. 一種蛋白，係包括 (a) 至少一CD20靶向基團； (b) 至少一PD1促效劑基團； (c) 至少一二聚化基團；及 (d) 視需要，一或更多個於該蛋白中分隔一或多個基團的連接子基團， 視需要，其中： (i) 該蛋白的基團，從N-至C-端，係以CD20靶向基團–PD1促效劑基團–二聚化基團的順序排列； (ii) 該蛋白的基團，從N-至C-端，係以二聚化基團–PD1促效劑基團–CD20靶向基團的順序排列； (iii) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，及該Fab的輕鏈不與 PDL1的胞外域或其PD1-結合部分融合； (iv) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，及該PD1促效劑基團並非N-端與抗-CD20 Fab之VH相連接； (v) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，及該PD1促效劑基團並非C-端與Fc結構域相連接； (vi) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，及該蛋白就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為單價的； (vii) 該蛋白為不對稱的； (viii) 該蛋白係包括一Fc異二聚體；或 (ix) 前述(i)至(viii)中二或更多個的任何組合。 2. 如具體實施例1之蛋白，其中該至少一CD20靶向基團為一抗-CD20抗體之抗原結合片段。 3. 如具體實施例2之蛋白，其中該抗-CD20抗體之抗原結合片段為Fab、Fv或scFv之形式。 4. 如具體實施例2或具體實施例3之蛋白，其中該抗-CD20抗體係包括： (a) 具有利妥昔單抗(rituximab)、奧克萊珠單抗(ocrelizumab)、阿托珠單抗(obinutuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab ituxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、TRU-015或維妥珠單抗(veltuzumab)之CDR序列的互補決定區(「CDR」)； (b) 利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗之全部6個CDR序列； (c) 至少利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗之重鏈CDR序列(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)和通用輕鏈之輕鏈CDR序列； (d) 包括利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗之VH胺基酸序列的VH和包括相同抗體之胺基酸序列的VL；或 (e) 包括利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗之VH胺基酸序列的VH和包括一通用輕鏈VL序列的VL。 5. 如具體實施例2或具體實施例3之蛋白，其中該抗-CD20抗體係與： (a) CD20的拓撲結構域結合； (b) CD20的跨膜結構域結合；或 (c) 一細胞(例如，B細胞)表面上胞外展現的CD20區域結合。 6. 如具體實施例2或具體實施例3之蛋白，其中該抗-CD20抗體： (a) 係選自利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗 (b) 係與選自利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗的抗-CD20抗體競爭和CD20相結合及/或與彼等相同之表位結合。 7. 如具體實施例1至6中任一例之蛋白，其中該至少一PD1促效劑基團係包括與PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少90%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 8. 如具體實施例7之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少95%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 9. 如具體實施例7之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少97%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 10. 如具體實施例7之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少98%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 11. 如具體實施例7之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少99%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 12. 如具體實施例7之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括PDL1之胞外結構域之PD1-結合部分的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 13. 如具體實施例7至12中任一例之蛋白，其中該PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分係包括人類PDL1之胺基酸19-134或鼠類PDL1之胺基酸19-134。 14. 如具體實施例7至12中任一例之蛋白，其中該PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分係包括或由PDL1胞外域所組成，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。 15. 如具體實施例1至6中任一例之蛋白，其中該至少一PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少90%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 16. 如具體實施例15之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少95%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 17. 如具體實施例15之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少97%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 18. 如具體實施例15之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少98%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 19. 如具體實施例15之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少99%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 20. 如具體實施例15之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括PDL2之胞外結構域之PD1-結合部分的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 21. 如具體實施例15至20中任一例之蛋白，其中該PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分係包括人類PDL2之胺基酸20-121或鼠類PDL2之胺基酸20-121。 22. 如具體實施例15至20中任一例之蛋白，其中該PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分係包括或由PDL2胞外域所組成，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。 23. 如具體實施例1至22中任一例之蛋白，其係包括一或多個連接子基團。 24. 如具體實施例23之蛋白，其中至少一CD20靶向基團和至少一PD1促效劑基團係被一連接子基團隔開。 25. 如具體實施例23或具體實施例24之蛋白，其中至少一CD20靶向基團和至少一二聚化基團係被一連接子基團隔開。 26. 如具體實施例23至25中任一例之蛋白，其中至少一PD1促效劑基團和至少一二聚化基團係被一連接子基團隔開。 27. 如具體實施例21至26中任一例之蛋白，其中各連接子(a)長度為至少5個或至少10個胺基酸，(b)長度為至高20個，至高25個或至高30個胺基酸及/或(c)長度為5-15個胺基酸或5-20個胺基酸。 28. 如具體實施例21至27中任一例之蛋白，其中該至少一連接子基團係包括甘胺酸-絲胺酸連接子。 29. 如具體實施例28之蛋白，其中該甘胺酸-絲胺酸連接子係包括G 4S序列(SEQ ID NO：14)或其多聚體。 30. 如具體實施例29之蛋白，其中該多聚體係包括2、3、4、5或更多個G 4S序列之重複單位(SEQ ID NO：56)。 31. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體1之單體和一根據示例單體2之單體。 32. 如具體實施例31之蛋白，其中示例單體1，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 33. 如具體實施例30之蛋白，其中示例單體1係由一單一多肽鏈所組成。 34. 如具體實施例30之蛋白，其中示例單體1係由二條多肽鏈所組成。 35. 如具體實施例29至34中任一例之蛋白，其中示例單體2，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 36. 如具體實施例31至35中任一例之蛋白，其係具有圖1A中所描繪之構型。 37. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體3之單體和一根據示例單體4之單體。 38. 如具體實施例37之蛋白，其中示例單體3，以N-至C-端的方向，係包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 39. 如具體實施例37或具體實施例38之蛋白，其中示例單體4，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團、CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 40. 如具體實施例39之蛋白，其中示例單體4係由一單一多肽鏈所組成。 41. 如具體實施例39之蛋白，其中示例單體4係由二條多肽鏈所組成。 42. 如具體實施例37至39中任一例之蛋白其係具有圖1B中所描繪之構型。 43. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體3之單體和一根據示例單體5之單體。 44. 如具體實施例43之蛋白，其中示例單體3，以N-至C-端的方向，係包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 45. 如具體實施例43或具體實施例44之蛋白，其中示例單體5，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)所組成。 46. 如具體實施例45之蛋白，其中示例單體5係由一單一多肽鏈所組成。 47. 如具體實施例45之蛋白，其中示例單體5係由二條多肽鏈所組成。 48. 如具體實施例43至47中任一例之蛋白，其係具有圖1C中所描繪之構型。 49. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白其係包括一根據示例單體3之單體和一根據示例單體6之單體。 50. 如具體實施例49之蛋白，其中示例單體3，以N-至C-端的方向，係包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 51. 如具體實施例49或具體實施例50之蛋白，其中示例單體6，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 52. 如具體實施例49至51中任一例之蛋白，其中示例單體6係由一單一多肽鏈所組成。 53. 如具體實施例49至51中任一例之蛋白，其中示例單體6係由二條多肽鏈所組成。 54. 如具體實施例49至53中任一例之蛋白，其係具有圖1D中所描繪之構型。 55. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體1之單體和一根據示例單體4之單體。 56. 如具體實施例55之蛋白，其中示例單體1，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 57. 如具體實施例56之蛋白，其中示例單體1係由一單一多肽鏈所組成。 58. 如具體實施例56之蛋白，其中示例單體1係由二條多肽鏈所組成。 59. 如具體實施例55至58中任一例之蛋白，其中示例單體4，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團、CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 60. 如具體實施例59之蛋白，其中示例單體4係由一單一多肽鏈所組成。 61. 如具體實施例59之蛋白，其中示例單體4係由二條多肽鏈所組成。 62. 如具體實施例55至61中任一例之蛋白，其係具有圖1E中所描繪之構型。 63. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體1之單體和一根據示例單體5之單體。 64. 如具體實施例63之蛋白，其中示例單體1，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 65. 如具體實施例64之蛋白，其中示例單體1係由一單一多肽鏈所組成。 66. 如具體實施例64之蛋白，其中示例單體1係由二條多肽鏈所組成。 67. 如具體實施例63至66中任一例之蛋白，其中示例單體5，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)所組成。 68. 如具體實施例67之蛋白，其中示例單體5係由一單一多肽鏈所組成。 69. 如具體實施例67之蛋白，其中示例單體5係由二條多肽鏈所組成。 70. 如具體實施例63至69中任一例之蛋白，其係具有圖1F中所描繪之構型。 71. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體1之單體和一根據示例單體6之單體。 72. 如具體實施例71之蛋白，其中示例單體1，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 73. 如具體實施例72之蛋白，其中示例單體1係由一單一多肽鏈所組成。 74. 如具體實施例72之蛋白，其中示例單體1係由二條多肽鏈所組成。 75. 如具體實施例71至74中任一例之蛋白，其中示例單體6，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 76. 如具體實施例75之蛋白，其中示例單體6係由一單一多肽鏈所組成。 77. 如具體實施例75之蛋白，其中示例單體6係由二條多肽鏈所組成。 78. 如具體實施例71至77中任一例之蛋白，其係具有圖1G中所描繪之構型。 79. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體1之單體和一根據示例單體7之單體。 80. 如具體實施例79之蛋白，其中示例單體1，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 81. 如具體實施例80之蛋白，其中示例單體1係由一單一多肽鏈所組成。 82. 如具體實施例‎‎80之蛋白，其中示例單體1係由二條多肽鏈所組成。 83. 如具體實施例79至82中任一例之蛋白，其中示例單體7，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團、PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 84. 如具體實施例79至83中任一例之蛋白，其係具有圖1H中所描繪之構型。 85. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括二個根據示例單體4之單體。 86. 如具體實施例85之蛋白，其中各示例單體4，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團、CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 87. 如具體實施例‎‎86之蛋白，其中各示例單體4係由一單一多肽鏈所組成。 88. 如具體實施例86之蛋白，其中各示例單體4係由二條多肽鏈所組成。 89. 如具體實施例85至88中任一例之蛋白，其係具有圖1I中所描繪之構型。 90. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括二個根據示例單體5之單體。 91. 如具體實施例90之蛋白，其中各示例單體5，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)所組成。 92. 如具體實施例91之蛋白‎‎‎，其中各示例單體5係由一單一多肽鏈所組成。 93. 如具體實施例91之蛋白，其中各示例單體5係由二條多肽鏈所組成。 94. 如具體實施例90至93中任一例之蛋白，其係具有圖1J中所描繪之構型。 95. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括一根據示例單體8之單體和一根據示例單體9之單體。 96. 如具體實施例95之蛋白，其中示例單體8，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、二聚化基團、視需要連接子基團和CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)所組成。 97. 如具體實施例96之蛋白，其中各示例單體8係由一單一多肽鏈所組成。 98. 如具體實施例96之蛋白，其中各示例單體8係由二條多肽鏈所組成。 99. 如具體實施例96之蛋白，其中各示例單體8係由三條多肽鏈所組成。 100. 如具體實施例95至99中任一例之蛋白，其中示例單體9，以N-至C-端的方向，係包括或由PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團、二聚化基團、視需要連接子基團、PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)所組成。 101. 如具體實施例95至100中任一例之蛋白，其係具有圖1K中所描繪之構型。 102. 如具體實施例1至30中任一例之蛋白，其係包括二個根據示例單體6之單體。 103. 如具體實施例102之蛋白，其中各示例單體6，以N-至C-端的方向，係包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、PD1促效劑基團(例如包括(i)PDL1或PDL2之胞外結構域的胺基酸序列；(ii)能與PD1結合之(i)的片段；或(iii)與(i)或(ii)具有至少90%序列相同性的胺基酸序列之基團)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。 104. 如具體實施例103之蛋白，其中各示例單體6係由一單一多肽鏈所組成。 105. 如具體實施例103之蛋白，其中各示例單體6係由二條多肽鏈所組成。 106. 如具體實施例102至104中任一例之蛋白，其係具有圖1L中所描繪之構型。 107. 如具體實施例1至54和79至84中任一例之蛋白，其係包括一CD20靶向基團。 108. 如具體實施例107之蛋白，其係包括一PD1促效劑基團。 109. 如具體實施例108之蛋白，其係具有圖1A中所描繪之構型。 110. 如具體實施例108之蛋白，其係具有圖1B中所描繪之構型。 111. 如具體實施例108之蛋白，其係具有圖1C中所描繪之構型。 112. 如具體實施例108之蛋白，其係具有圖1D中所描繪之構型。 113. 如具體實施例107之蛋白，其係包括二個PD1促效劑基團。 114. 如具體實施例113之蛋白，其中此二個PD1促效劑基團為相同的。 115. 如具體實施例113或具體實施例114之蛋白，其係具有圖1H中所描繪之構型。 116. 如具體實施例1至106中任一例之蛋白，其係包括二個CD20靶向基團。 117. 如具體實施例116之蛋白，其中此二個CD20靶向基團為相同的。 118. 如具體實施例116或具體實施例117之蛋白，其係包括一PD1促效劑基團。 119. 如具體實施例118之蛋白，其係具有圖1E中所描繪之構型。 120. 如具體實施例118之蛋白，其係具有圖1F中所描繪之構型。 121. 如具體實施例118之蛋白，其係具有圖1G中所描繪之構型。 122. 如具體實施例116或具體實施例117之蛋白，其係包括二個PD1促效劑基團。 123. 如具體實施例122之蛋白，其中此二個PD1促效劑基團為相同的。 124. 如具體實施例122或具體實施例123之蛋白，其係具有圖1I中所描繪之構型。 125. 如具體實施例122或具體實施例123之蛋白，其係具有圖1J中所描繪之構型。 126. 如具體實施例122或具體實施例123之蛋白，其係具有圖1K中所描繪之構型。 127. 如具體實施例122或具體實施例123之蛋白，其係具有圖1L中所描繪之構型。 128. 如具體實施例1至127中任一例之分子，其中該CD20靶向基團係與人類CD20之胞外結構域結合。 129. 如具體實施例1至128中任一例之分子，其中該PD1促效劑基團係促效人類PD1。 130. 如具體實施例1至127中任一例之分子，其中該CD20靶向基團係與鼠類CD20之胞外結構域結合。 131. 如具體實施例1至127中任一例之分子，其中該PD1促效劑基團係促效鼠類PD1。 132. 如具體實施例1至131中任一例之蛋白，其中該至少一個二聚化基團為或包括一Fc結構域。 133. 如具體實施例132之蛋白，其中該Fc結構域為人類Fc結構域。 134. 如具體實施例132或具體實施例133之蛋白，其中該Fc結構域為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc結構域。 135. 如具體實施例132至134中任一例之蛋白，其中該Fc結構域係具有降低的效應子功能。 136. 如具體實施例132至135中任一例之蛋白，其中該Fc結構域為一IgG4 Fc結構域。 137. 如具體實施例132至136中任一例之蛋白，其中該Fc結構域係包括胺基酸序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO：32)或其部份。 138. 如具體實施例132至137中任一例之蛋白，其係包括一Fc二聚體。 139. 如具體實施例138之蛋白，其中該Fc二聚體為一Fc同二聚體。 140. 如具體實施例138之蛋白，其中該Fc二聚體為一Fc異二聚體。 141. 如具體實施例140之蛋白，其中該Fc異二聚體係包括旋鈕入孔洞突變。 142. 如具體實施例140或具體實施例141之蛋白，其中該Fc異二聚體係包括星狀突變。 143. 如具體實施例1之蛋白，其中該蛋白之基團，從N-至C-端，係以CD20靶向基團–PD1促效劑基團–二聚化基團之順序排列。 144. 如具體實施例1之蛋白，其中該蛋白之基團，從N-至C-端，係以二聚化基團–PD1促效劑基團–CD20靶向基團之順序排列。 145. 如具體實施例1之蛋白，其中該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1之胞外域，該二聚化基團為一Fc結構域，而Fab之輕鏈並非與PDL1之胞外域或其PD1-結合部份融合。 146. 如具體實施例1之蛋白，其中該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1之胞外域，而該二聚化基團為一Fc結構域，以及該PD1促效劑基團並非N-端與抗-CD20 Fab之VH相連接。 147. 如具體實施例1之蛋白，其中該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1之胞外域，而該二聚化基團為一Fc結構域，以及該PD1促效劑基團並非C-端與Fc結構域相連接。 148. 如具體實施例1之蛋白，其中該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1之胞外域，而該二聚化基團為一Fc結構域，以及該蛋白就CD20靶向基團及/或PD1促效劑基團為單價的。 149. 如具體實施例1之蛋白，其中該蛋白為不對稱的。 150. 一種或多數種核酸，其係編碼如具體實施例1至149中任一例之蛋白。 151. 一種宿主細胞，其係經工程改造用以表現如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例150之核酸。 152. 一種製造如具體實施例1至149中任一例之蛋白之方法，其係包括培養如具體實施例151之宿主細胞並回收由此表現的蛋白。 153. 一種醫藥組成物，其係包括如具體實施例1至149中任一例之蛋白和一賦形劑。 154. 一種治療患有與T細胞失調有關的免疫病症或症狀之對象的方法，其係包括投予該對象一有效量之如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物。 155. 如具體實施例154之方法，其中該免疫病症或症狀為第1型糖尿病、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、古巴斯徹氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、澱粉樣變性、僵直性脊椎炎、抗腎小球基底膜腎炎、抗腎小管基底膜腎炎、抗磷脂質症候群、自體免疫性肝炎、自體免疫性卵巢炎、移植物抗宿主病(GVHD)、自體免疫性胰臟炎、自體免疫性視網膜病變、貝賽特氏病(Behcet's disease)、克隆氏症(Crohn’s disease)、德維克病(Devic’s disease)、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、卓斯勒症候群(Dressler’s syndrome)、纖維化肺泡炎、腎小球腎炎、葛瑞夫茲氏病GD(Graves disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、IgA腎病、IgG4相關硬化病、免疫性血小板減少性紫斑(ITP)、顯微性多血管炎(MPA)、混合性結締組織病(MCTD)、多發性硬化症、多發性神經病變、器官腫大、內分泌病變、單株性症候群(POEMS)、結節性多動脈炎、類風濕性關節炎、施密特症候群(Schmidt syndrome)、鞏膜炎、硬皮病、薛格連氏症候群(Sjögren’s syndrome)、精子或睪丸自體免疫、僵硬人症候群(SPS)、高安氏動脈炎、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑(TTP)、Tolosa-Hunt症候群(THS)、潰瘍性結腸炎和血管炎。 156. 如具體實施例154之方法，其中該免疫病症或症狀為第1型糖尿病。 157. 如具體實施例156之方法，其中該第1型糖尿病為小兒發作型第1型糖尿病。 158. 如具體實施例156之方法，其中該第1型糖尿病為成人發作型第1型糖尿病。 159. 如具體實施例156之方法，其中該對象為小兒病患。 160. 如具體實施例156至158中任一例之方法，其中該病患為成人病患。 161. 如具體實施例154之方法，其中該該免疫病症或症狀為全身性紅斑性狼瘡。 162. 如具體實施例154之方法，其中該免疫病症或症狀為克隆氏症。 163. 如具體實施例154之方法，其中該免疫病症或症狀為移植物抗宿主病(GVHD)。 164. 如具體實施例154至163中任一例之方法，其中如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物係以單一劑量給藥。 165. 如具體實施例154至164中任一例之方法，其中如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物的給藥並非重複的。 166. 如具體實施例154至165中任一例之方法，其中該方法係抑制該對象中的細胞免疫反應。 167. 如具體實施例166之方法，其中該方法係抑制該對象的免疫系統。 168. 如具體實施例167之方法，其中該方法係降低該對象中的T細胞功能。 169. 如具體實施例167之方法，其中該方法係降低該對象中的B細胞功能。 170. 如具體實施例167之方法，其中該方法係降低對象中的T細胞反應性。 171. 一種抑制一對象中的細胞免疫反應之方法，其係包括投予該對象一有效量之如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物。 172. 如具體實施例171之方法，其中該方法係降低該對象中的T細胞功能。 173. 如具體實施例171之方法，其中該方法係降低該對象中的B細胞功能。 174. 如具體實施例171之方法，其中該方法係降低對象中的T細胞反應性。 175. 如具體實施例154至174中任一例之方法，進一步係包括投予該對象一另外的治療劑。 176. 如具體實施例175之方法，其中該另外的治療劑為或包括免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡之活化劑或增加細胞對細胞凋亡誘發劑之敏感性的藥劑。 177. 如具體實施例175之方法，其中該另外的治療劑為或包括CAR-表現細胞。 178. 如具體實施例177之方法，其中該CAR-表現細胞為CAR-表現的調節細胞。 179. 一種局部化PD1促效作用之方法，其係包括投予一對象一有效量之如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物。 180. 如具體實施例179之方法，其中投予該蛋白或醫藥組成物係將PD1促效作用局限於該對象的B細胞。 181. 一種於一表現CD20之目標組織或細胞中局部調節免疫反應之方法，其係包括投予一對象一有效量之如具體實施例1至149中任一例之蛋白或具體實施例153之醫藥組成物。 182. 如具體實施例181之方法，其中投予該蛋白或醫藥組成物係調節該對象之B細胞中的免疫反應。 183. 一種定性第I型分子促效PD1之能力的方法，其係包括： (a)  培養穩定表現CD3，穩定表現AP1-螢光素酶報導子基因和穩定表現PD1之第I型細胞與穩定表現CD22和穩定表現CD20之第II型細胞； (b) 在有或無第I型分子或第II型分子的存在下培育步驟a)之培養細胞；及 (c)  在步驟b)之後，測量培養細胞中的螢光素酶活性，其中第I型分子為一多特異性抗原結合分子，其係包括：i)與CD20之胞外域結合的第一結合特異性；及ii) 與PD1結合之第二結合特異性，其中該第II型分子為一多特異性抗原結合分子，其係包括：i)與CD3之胞外域結合的第一結合特異性；和ii)與CD22之胞外域結合的第二結合特異性，且其中第II型分子的存在造成螢光素酶活性增加，而第I型分子之存在造成了由第II型分子所導致的螢光素酶活性下降且其中該螢光素酶活性的下降量為第I型分子促效PD1之能力的指標。 184. 如具體實施例183之方法，其中PD1為mPD1。 185. 如具體實施例183之方法，其中該第I型細胞為Jurkat E6-1細胞。 186. 如具體實施例183之方法，其中該第I型細胞係經轉導用以表現AP1-螢光素酶報導子基因。 187. 如具體實施例183之方法，其中該第I型細胞係經轉導用以表現PD1基因。 188. 如具體實施例186或187之方法，其中該第I型細胞係以慢病毒轉導。 189. 如具體實施例183之方法，其中該CD20為mCD20。 190. 如具體實施例183之方法，其中該第II型細胞為HEK293細胞。 191. 如具體實施例183之方法，其中該第II型細胞係經轉導用以表現CD22。 192. 如具體實施例183之方法，其中該第II型細胞係經轉導用以表現CD20基因。 193. 如具體實施例191或192之方法，其中該第II型細胞係以慢病毒轉導。 194. 如具體實施例183之方法，其中該第II型細胞之細胞係在第I型細胞之前植入。 195. 如具體實施例183之方法，其中該培養的細胞係在第II型分子之存在下，在對照抗體分子之存在下以及無第I型分子下培育。 196. 如具體實施例183之方法，其中該培養的細胞係在第I型分子和第II型分子之存在下培育。 197. 如具體實施例183之方法，其中該第I型分子係包括PDL1之胞外域。
本申請書中所引述的所有公開案、專利、專利申請案和其他文件係就所有目的以全文引用的方式併入本文中，其引用程度就如同將各個個別公開案、專利或專利申請案或其他文件個別地特定就所有目的以全文引用的方式併入。在併入文中的一或多個參考文獻之教導和本揭示文之間有不一致的情況下，係以本說明書之教導為主。
無
圖 1A 至 1L係代表根據特定具體實施例之各種形式CD20-PD1結合分子的一系列草圖。CD20靶向基團的重鏈可變結構域係以條紋圖案顯示，輕鏈可變結構域係以點狀圖案顯示，PD1促效劑基團(例如，PDL1或PDL2的胞外域或其PD1結合部分)係以帶虛線的圓圈顯示。
圖 2A 和 2B係展示一系列代表受試鼠類CD20-PD1結合分子PD1(抗-mCD20 x mPDL1)(分子A-L；圖2A)和對照組(分子M-S；圖2B)的草圖。
圖 3A係描繪hPDL1(左)和mPDL1(右)的三維模型，並標示出mPDL1表面未配對之半胱胺酸殘基(C113)。
圖 3B係描繪mPDL1(上方序列)和hPDL1(下方序列)的部分序列比對(78-137 aa)。該圖式係按出現順序分別揭示為SEQ ID NOS：54-55。
圖 4A 和 4B係描繪流式結合研究的軌跡，並分別代表Jurkat/mPD1和MC38/mCD20或HEK293/mCD20細胞上所指的CD20-PD1結合分子(抗-mCD20xmPDL1胞外域)之mPDL1結合(上圖)或抗-mCD20結合(下圖)。
圖 5A 至 5B係描繪螢光素酶分析方法。圖5A為螢光素酶報導子分析之示意圖，而圖5B為描繪圖5A中描述的關鍵參與者之間相互作用的草圖呈現。
圖 6A 至 6E係描繪受試分子(圖6A)和使用相同分子(圖6B至6E)的一系列形跡圖。該等形跡圖係描繪利用圖5中描繪的生物分析所測量的mPD1促效作用。細胞和分子係如所示用於各個別形跡圖。
圖 7係描繪在糖尿病前期非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中就劑量調定功效試驗的實驗設計。
圖 8A 至 8I係呈現一系列描繪個體動物數據之形跡圖，其係展現在所指的對照組或CD20-PD1結合分子(抗-mCD20xmPDL1胞外域)的存在下自發性糖尿病發作。
圖 9A 和 9B係描繪展現CD20-PD1結合分子(抗-mCD20 x mPDL1胞外域)(上圖：圖2A的分子L；下圖：圖2B的分子G)調節NOD小鼠糖尿病發作之能力的圖表。
圖 10A 至 10C為描繪在以CD20-PD1結合分子(抗-mCD20 x mPDL1胞外域)治療後，浸潤到NOD小鼠胰臟之活化自體反應性胰島特異性CD8+T細胞下降的箱形圖。*p＜0.05。
圖 11A 至 11C為描繪在以CD20-PD1結合分子(抗-mCD20 x mPDL1胞外域)治療後，浸潤到EAE-MS小鼠脊髓中活化之自體反應性CD3+、CD4+和CD8+T細胞下降的箱形圖。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
無
TW202334223A_111142862_SEQL.xml

Claims (55)

  1. 一種蛋白，係包括 (a) 至少一CD20靶向基團； (b) 至少一PD1促效劑基團； (c) 至少一二聚化基團；及 (d) 視需要，一或更多個於該蛋白中分隔一或多個基團的連接子基團， 其中： (i) 該蛋白的基團，從N-至C-端，係以CD20靶向基團–PD1促效劑基團–二聚化基團的順序排列； (ii) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，且該Fab的輕鏈不與該PDL1的胞外域或其PD1-結合部分融合； (iii) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，且該PD1促效劑基團並非N-端與該抗-CD20 Fab之VH相連接； (iv) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，且該PD1促效劑基團並非C-端與該Fc結構域相連接； (v) 該CD20靶向基團為一抗-CD20 Fab，該PD1促效劑基團為PDL1的胞外域或其PD1-結合部分，而該二聚化基團為一Fc結構域，且該蛋白就該CD20靶向基團及/或該PD1促效劑基團為單價的； (vi) 前述(i)至(v)中二或更多者之任何組合。
  2. 如請求項1之蛋白，其中該至少一CD20靶向基團為一抗-CD20抗體之抗原結合片段。
  3. 如請求項2之蛋白，其中該抗-CD20抗體之抗原結合片段為Fab、Fv或scFv之形式。
  4. 如請求項2或請求項3之蛋白，其中該抗-CD20抗體： (a) 係選自利妥昔單抗(rituximab)、奧克萊珠單抗(ocrelizumab)、阿托珠單抗(obinutuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab ituxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、TRU-015和維妥珠單抗(veltuzumab)；或 (b) 係與選自利妥昔單抗、奧克萊珠單抗、阿托珠單抗、奧法木單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、TRU-015或維妥珠單抗的抗-CD20抗體，競爭和CD20相結合及/或結合相同表位。
  5. 如請求項1至4中任一項之蛋白，其中該至少一PD1促效劑基團係包括與該PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。
  6. 如請求項5之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括該PDL1之胞外結構域之PD1-結合部分的胺基酸序列，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。
  7. 如請求項5或6之蛋白，其中該PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分係包括人類PDL1之胺基酸19-134或鼠類PDL1之胺基酸19-134。
  8. 如請求項5或6之蛋白，其中該PDL1之胞外結構域的PD1-結合部分係包括或由PDL1胞外域所組成，視需要其中PDL1為人類或鼠類PDL1。
  9. 如請求項1至4中任一項之蛋白，其中該至少一PD1促效劑基團係包括與PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分具有至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。
  10. 如請求項9之蛋白，其中該PD1促效劑基團係包括PDL2之胞外結構域之PD1-結合部分的胺基酸序列，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。
  11. 如請求項9至10中任一項之蛋白，其中該PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分係包括人類PDL2之胺基酸20-121或鼠類PDL2之胺基酸20-121。
  12. 如請求項9至10中任一項之蛋白，其中該PDL2之胞外結構域的PD1-結合部分係包括或由PDL2胞外域所組成，視需要其中PDL2為人類或鼠類PDL2。
  13. 如請求項1至12中任一項之蛋白，其係包括一或多個連接子基團。
  14. 如請求項13之蛋白，其中1)至少一CD20靶向基團和至少一PD1促效劑基團係被一連接子基團隔開；及2)至少一CD20靶向基團和至少一二聚化基團係被一連接子基團隔開。
  15. 如請求項11至14中任一項之蛋白，其中各連接子(a)長度為至少5個或至少10個胺基酸，(b)長度為至高20個，至高25個或至高30個胺基酸及/或(c)長度為5-15個胺基酸或5-20個胺基酸。
  16. 如請求項11至15中任一項之蛋白，其中至少一連接子基團係包括一甘胺酸-絲胺酸連接子。
  17. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。
  18. 如請求項17之蛋白，其係具有圖1A中所描繪之構型。
  19. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團、CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。
  20. 如請求項19之蛋白，其係具有圖1B中所描繪之構型。
  21. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團所組成。
  22. 如請求項21之蛋白，其係具有圖1C中所描繪之構型。
  23. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、PD1促效劑基團所組成。
  24. 如請求項23之蛋白，其係具有圖1D中所描繪之構型。
  25. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團、CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。
  26. 如請求項25之蛋白，其中該第二單體係由一單一多肽鏈或二條多肽鏈所組成。
  27. 如請求項25或26之蛋白，其係具有圖1E中所描繪之構型。
  28. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團所組成。
  29. 如請求項28之蛋白，其係具有圖1F中所描繪之構型。
  30. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、PD1促效劑基團、視需要連接子基團及二聚化基團所組成。
  31. 如任何請求項30之蛋白，其係具有圖1G中所描繪之構型。
  32. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團和二聚化基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團、PD1促效劑基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。
  33. 如請求項32之蛋白，其係具有圖1H中所描繪之構型。
  34. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括二個單體，各個單體係在N-至C-端的方向上，包含或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團、CD20靶向基團、視需要連接子基團和二聚化基團所組成。
  35. 如請求項34之蛋白，其係具有圖1I中所描繪之構型。
  36. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括二個單體，各個單體係在以N-至C-端的方向上，包含或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、二聚化基團和PD1促效劑基團所組成。
  37. 如請求項36之蛋白，其係具有圖1J中所描繪之構型。
  38. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括(1)一第一單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由CD20靶向基團、視需要連接子基團、二聚化基團、視需要連接子基團和CD20靶向基團所組成，及(2)一第二單體，其在N-至C-端的方向上，包括或由PD1促效劑基團、視需要連接子基團、二聚化基團、視需要連接子基團、PD1促效劑基團所組成。
  39. 如請求項38之蛋白，其係具有圖1K中所描繪之構型。
  40. 如請求項1至16中任一項之蛋白，其係包括二個單體，各個單體係在N-至C-端的方向上，包含或由CD20靶向基團(例如，抗-CD20 Fab、Fv或scFV)、視需要連接子基團、PD1促效劑基團所組成。
  41. 如請求項40之蛋白，其係具有圖1L中所描繪之構型。
  42. 如請求項1至41中任一項之蛋白，其中該CD20靶向基團係與人類CD20之胞外結構域結合。
  43. 如請求項1至42中任一項之蛋白，其中該PD1促效劑基團係促效人類PD1。
  44. 如請求項1至41中任一項之蛋白，其中該CD20靶向基團係與鼠類CD20之胞外結構域結合。
  45. 如請求項1至41和44中任一項之蛋白，其中該PD1促效劑基團係促效鼠類PD1。
  46. 如請求項1至45中任一項之蛋白，其中該至少一個二聚化基團為或包括一Fc結構域。
  47. 一種或多數種核酸，其係編碼如請求項1至46中任一項之蛋白。
  48. 一種宿主細胞，其係經工程改造用以表現如請求項1至46中任一項之蛋白或請求項47之核酸。
  49. 一種製造如請求項1至46中任一項之蛋白的方法，其係包括培養如請求項48之宿主細胞並回收由此表現的蛋白。
  50. 一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至46中任一項之蛋白和一賦形劑。
  51. 一種治療患有與T細胞失調有關的免疫病症或症狀之對象的方法，其係包括投予該對象一有效量之如請求項1至46中任一項之蛋白或請求項50之醫藥組成物。
  52. 如請求項51之方法，其中該免疫病症或症狀為第1型糖尿病。
  53. 一種於一對象中抑制細胞自體免疫反應之方法，其係包括投予該對象一有效量之如請求項1至46中任一項之蛋白或請求項50之醫藥組成物。
  54. 如請求項53之方法，其中該方法係降低該對象中的T細胞功能、B細胞功能或T細胞反應性。
  55. 一種定性第I型分子之促效PD1能力的方法，其係包括： (a)  將穩定表現CD3，穩定表現AP1-螢光素酶報導子基因和穩定表現PD1之第I型細胞與穩定表現CD22和穩定表現CD20之第II型細胞共同培養； (b) 在有或無第I型分子或第II型分子的存在下，培育步驟a)之培養細胞；及 (c)  在步驟b)之後，測量培養細胞中的螢光素酶活性， 其中該第I型分子為一多特異性抗原結合分子，其係包括：i)與CD20之胞外域結合的第一結合特異性；及ii)與PD1結合之第二結合特異性， 其中該第II型分子為一多特異性抗原結合分子，其係包括：i)與CD3之胞外域結合的第一結合特異性；和ii)與CD22之胞外域結合的第二結合特異性，且 其中該第II型分子的存在造成螢光素酶活性增加，而該第I型分子之存在造成了由該第II型分子所導致的螢光素酶活性下降，且其中該螢光素酶活性的下降量為該第I型分子促效PD1之能力的指標。
TW111142862A 2021-11-11 2022-11-09 Ｃｄ２０－ｐｄ１結合分子及其使用方法 TW202334223A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163278454P 2021-11-11 2021-11-11
US202163278374P 2021-11-11 2021-11-11
US63/278,374 2021-11-11
US63/278,454 2021-11-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202334223A true TW202334223A (zh) 2023-09-01

Family

ID=84488718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111142862A TW202334223A (zh) 2021-11-11 2022-11-09 Ｃｄ２０－ｐｄ１結合分子及其使用方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230279153A1 (zh)
AU (1) AU2022383847A1 (zh)
CA (1) CA3238029A1 (zh)
TW (1) TW202334223A (zh)
WO (1) WO2023086812A1 (zh)

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
HU215180B (hu) 1992-01-23 1998-10-28 Merck Patent Gmbh. Eljárás monomer és dimer antitest-fragment fúziós fehérjék előállítására
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9824437D0 (en) 1998-11-06 1999-01-06 Ylo Herttuala Seppo Gene therapy
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20070178082A1 (en) 2002-11-08 2007-08-02 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
WO2004056875A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Wyeth Antibodies against pd-1 and uses therefor
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
US7989594B2 (en) 2003-07-01 2011-08-02 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005049094A1 (en) 2003-11-13 2005-06-02 Advantagene, Inc. A mixed complementary viral vector for gene therapy
AU2005282700A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CN102471378B (zh) 2009-06-26 2014-04-02 瑞泽恩制药公司 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
RU2720472C2 (ru) 2012-11-28 2020-04-30 Займворкс Инк. Сконструированные пары тяжелая-легкая цепи иммуноглобулина и их применение
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
EP2970435B1 (en) 2013-03-15 2020-08-12 Eli Lilly and Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
AU2016242866B2 (en) 2015-03-30 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to FC gamma receptors
EP3515494A4 (en) * 2016-09-26 2020-10-07 The Brigham and Women's Hospital, Inc. REGULATORS OF B-LYMPHOCYTES MEDIA IMMUNOSUPPRESSION
EP3576789A4 (en) 2017-02-01 2020-11-25 Centrymed Pharmaceuticals Inc. MONOMER HUMAN IGG1-FC AND BISPECIFIC ANTIBODIES
TW201930351A (zh) * 2017-10-06 2019-08-01 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
SG11202011969WA (en) 2018-08-30 2020-12-30 Regeneron Pharma Methods for characterizing protein complexes

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023086812A1 (en) 2023-05-19
AU2022383847A1 (en) 2024-06-20
CA3238029A1 (en) 2023-05-19
US20230279153A1 (en) 2023-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240174745A1 (en) Antibody Constructs for CLDN18.2 and CD3
JP7098725B2 (ja) 二重特異性２＋１コントースボディ
JP2023061969A (ja) Ｓｉｒｐ－アルファドメインまたはそのバリアントを有する構築物
US11952424B2 (en) Multivalent antibody
US20180208657A1 (en) Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted t cell activation
CN116063544A (zh) Bcma和cd3双特异性t细胞接合抗体构建体
CN109863170A (zh) 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
BR112014015018A2 (pt) moléculas de anticorpo biespecífico e seu método de produção, bem como composição farmacêutica e molécula de ácido nucleico
US11780919B2 (en) Bispecific antigen binding molecules targeting OX40 and FAP
US20230002466A1 (en) Engineered interleukin-2 receptor beta agonists
US20230416411A1 (en) Antibodies binding to cd3 and folr1
TW202128757A (zh) 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
TW202216766A (zh) 與ｃｄ３結合之抗體
WO2022056197A9 (en) Immune targeting molecules and uses thereof
US20230110958A1 (en) Il27 receptor agonists and methods of use thereof
TW202323281A (zh) 間皮素結合蛋白及其用途
US20220242962A1 (en) 4-1bb and ox40 binding proteins and related compositions and methods, antibodies against 4-1bb, antibodies against ox40
US20230279153A1 (en) Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof
KR20230093503A (ko) 델타 감마 사슬 매개 면역을 조절하는 조성물 및 방법
KR20240099460A (ko) Cd20-pd1 결합 분자 및 이의 사용 방법
WO2023051727A1 (zh) 结合cd3的抗体及其用途
US20240209113A1 (en) Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
JP2023547662A (ja) Ｃｌｄｎ６及びｃｄ３に選択的に結合するポリペプチド構築物
CN116685606A (zh) 选择性地与cldn6和cd3结合的多肽构建体
TW202027788A (zh) 雙特異性抗體構建體之下游加工