KR20220002336A - T 세포 치료제를 제조하기 위한 생체외 방법 및 관련 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 생체외 확장 방법, 및 이러한 T 세포를 함유하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여 암과 같은 질병 및 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 이 출원은 2019년 3월 29일자 미국 가특허출원
No. 62/826,974 (발명의 명칭: T 세포 치료제의 생체외 제조 방법 및 관련 조성물 및 방법), 2019년 11월 27일자 미국 가특허출원 No. 62/941,610 (발명의 명칭: T 세포 치료제의 생체외 제조 방법 및 관련 조성물 및 방법), 및 2020년 2월 18일자 미국 가특허출원 No. 62/978,298 (발명의 명칭: T 세포 치료제의 생체외 제조 방법 및 관련 조성물 및 방법)에 기초한 우선권 주장 출원으로 상기 각 출원의 내용 전체는 본 발명에 참조 병합되었다.
서열 목록의 참조 통합
[0002] 본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2020년 3월 26일에 생성된 165172000240SeqList.txt 라는 명칭의 파일로 제공되며, 그 크기는 5킬로바이트이다. 서열 목록의 전자 형식에 담긴 정보는 그 전체가 참조로 통합된다.
분야
[0003] 본 개시내용은 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 생체외 확장 방법, 및 이러한 T 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시내용의 조성물을 사용하여 암과 같은 질병 및 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
배경
[0004] 암 세포는 종양형성 과정의 일부로서 많은 상이한 DNA 돌연변이를 축적한다. 이러한 돌연변이는 단백질 코딩 영역에서 아미노산 변화를 일으킬 수 있다. 돌연변이가 면역계에 의해 인식되기 위해서는 단백질이 세포 내에서 처리되어야 하고 주조직적합성 복합체(MHC)와 함께 표면에 제시된 돌연변이 펩타이드가 제시되어야 한다. 신생항원(neoantigen)은 TCR 결합을 통해 T-세포에 의해 인식될 수 있는 MHC 복합체에 의해 제시되는 돌연변이 펩타이드이다. 신생항원은 면역요법의 이상적인 표적이다. 이들 항원은 암이 발병하기 전에는 체내에 존재하지 않았던 것으로, 정상 세포에서 발현되지 않는, 진정한 암 특이적이며. 표적 면역 독성을 일으키지 않는다. 임상 연구에 따르면 외과적으로 절제된 종양에서 분리된 T 세포는 신생항원을 인식하는 TCR을 보유하며, 이들 신생항원 반응성 TIL 집단을 확장하여 이들을 환자에게 재주입하면 일부 경우에 극적인 임상 이점을 얻을 수 있는 것으로 입증된 바 있다.
그러나 이러한 세포를 세포 치료에 적용하는 데 있어 가장 큰 걸림돌은 이러한 세포를 얻기가 어렵다는 점이다. 치료 용도를 위한 종양-반응성 T 세포를 함유하는 세포 조성물을 수득하고 제조하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 이러한 요구를 충족하는 실시예가 본원에 제공된다.
개요
[0005] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (c) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계; 및 (d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 배양의 하나 이상의 단계는 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (e) 이 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 더 포함한다.
[0006] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (e) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계로서; 여기서 배양의 하나 이상의 단계는 공동자극 작용제 또는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 확장된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
[0007] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에 수행되는 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0008] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동배양의 적어도 일부 동안 수행된다. 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것의 적어도 일부는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행된다.
[0009] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하는 세포자멸사 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (c) 공동-배양물로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0010] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 공동자극 작용제 및 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다.
[0011] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제 및 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다.
[0012] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계로서; 여기서 배양의 하나 이상의 단계는 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 확장된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
[0013] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0014] 종양 반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 생체외 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 것이고, 여기서 상기 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 농축된 것이며, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포를 활성화시키는 존재 하에서 T 세포 자극 제제(들)과 T 세포와의 인큐베이션 전, 동시 또는 후에 수행되고, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극하는 것인 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0015] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 공동자극 작용제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (c) 공동-배양물로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0016] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 세포자멸사 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 세포자멸사 억제제 및 체크포인트 작용제는 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 추가로 포함한다. 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제 및 공동자극 작용제는 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다.
[0017] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은: (1) (a) 종양-반응성 T 세포를 포함하는 생체외 T 세포 집단을, 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 대해 반응성인 내인성 TCR을 포함하고, 여기서 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 농축된 것인 단계; 및 (b) T 세포를 활성화하는 조건 하에 T 세포를 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 단계 (a)에서의 인큐베이션 전, 동시, 또는 그 후에 수행되고, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0018] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계로서; 여기서 배양의 하나 이상의 단계는 체크포인트 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0019] 임의의 구체예에서, T 세포를 배양하는 것은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 더 포함하되, 여기서 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서 인큐베이션하는 것은 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0020] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에서의 인큐베이션은, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동배양의 적어도 일부 동안 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것의 적어도 일부는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행된다.
[0021] 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에서의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬밭트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0022] 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제 및 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제를 포함하고, 선택적으로 공동자극 수용체는 CD28이고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에서의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0023] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 이 방법은 배양을 위한 단계 중 하나 이상 동안, 예를 들어 T 세포 자극 제제(들) 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트, 예컨대 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제 (예컨대 카스파제 억제제), 또는 체크포인트 억제제와 함께 인큐베이션 동안 세포를 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 단계 동안 T 세포 아쥬반트, 예컨대 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제 (예컨대 카스파제 억제제), 또는 체크포인트 억제제를 일시적으로 첨가 (예컨대, 단 1회, 예를 들어 인큐베이션 또는 배양 개시시와 같이 오직 1회)하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 단계 동안 T 세포 아쥬반트의 연속적인 첨가를 포함한다. 예컨대, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트, 예컨대 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제 (예컨대 카스파제 억제제), 또는 체크포인트 억제제는, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 동안과 같이 세포를 인큐베이션하는 하나 이상의 단계 동안 연속적으로 첨가된다. 예를 들어, 하나 이상의 단계 동안 또는 단계 후에 세포를 세척한 후, 배양 배지를 예컨대 동일한 농도의, T 세포 아쥬반트로 보충한다. 어떤 경우에는 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)도 세제로 보충된다. 세척은 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이tus 동안과 같은, 단계 동안 매일, 격일로, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다 또는 1주일마다 수행될 수 있다.
[0024] 임의의 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계들 중 하나 이상 후에 세포를 세척하는 것을 더 포함한다.
[0025] 임의의 일부 구체예에서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/되거나 최대 20일 동안 수행된다.
[0026] 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 포함한다. 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포로 농축된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 종양-반응성 T 세포로 농축된다(즉, 종양-반응성 T 세포가 풍부하다).
[0027] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함한다.
[0028] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물에 존재하고, 상기 공동-배양은 대상체로부터의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록, APC가 유도된 조건 하에 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 (a) 대상체로부터의 건강한 조직과 종양 조직의 엑솜 시퀀싱에 의해 하나 이상의 종양-관련 항원과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하는 단계; (b) 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 에피토프를 확인하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 에피토프는 네오에피토프인 단계; (c) 대상체의 생물학적 샘플로부터 자가 T 세포 집단을 분리하는 단계; 및 (d) T 세포 집단을, 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상의 펩타이드 중 하나 이상을 제시하는 조건 하에 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩타이드에 노출되거나 또는 이와 접촉된 항원 제시 세포(APC)와 공동-배양함으로써, 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생성된다.
[0029] 일부 구체예에서, APC를 하나 이상의 펩타이드에 노출시키거나 이와 접촉시키는 것은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드의 돌연변이 라이브러리를 생성하는 단계 [선택적으로 펩타이드는 길이가 8 내지 32개 아미노산이고, 길이, 8개 내지 18개 아미노산 길이, 8개 내지 10개 아미노산 길이, 10개 내지 32개 아미노산 길이, 10개 내지 24개 아미노산 길이, 10개 내지 18개 아미노산 길이, 18개 내지 32개 아미노산 길이, 18 내지 24개의 아미노산 길이 또는 24 내지 32개의 아미노산 길이, 임의로 약 9mers이다]; 및 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상에 하나 이상의 펩타이드를 제시하는 조건하에서 펩타이드의 돌연변이 라이브러리로 APC를 펄스화하는 단계를 포함하며, 선택적으로 MHC는 MHC 클래스 I이다 [번역자 주: 본 국어번역문에서 "약"이라는 용어 다음에 수치가 나올 경우 "약"이라는 표현에는 그 수치 자체도 포함되는 것으로 한다. 예를 들어 "약 5"라는 표현에는 "5" 자체도 포함되는 것으로 의도된다]. 일부 구체예에서, APC를 하나 이상의 펩타이드에 노출시키거나 이와 접촉시키는 것은: 체세포 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 종양-관련 항원 또는 그의 일부를 인코딩하는 DNA, 선택적으로 미니유전자 작제물을 생성하는 단계; DNA를 RNA로 시험관내 전사하는 단계; 및 시험관내 전사된 RNA를, 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상에 하나 이상의 펩타이드를 제시하는 조건 하에 APC에 도입하고, 선택적으로 MHC는 MHC 클래스 I인 단계를 포함한다.
[0030] 임의의 일부 구체예에서, 공동배양은 1 내지 7일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동 배양의 적어도 일부 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 이 방법은 공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하는 것을 더 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 농축은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 전에 수행된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 공동 배양 전에 수행되며, 여기서 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포의 집단은 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단에 대한 농축 후에 수행된다. 일부 구체예에서, APC는 대상체에 대해 자가이거나 또는 대상체에 대해 동종이계(allogeneic)이다.
[0031] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포에 대한 항원 제시 세포의 공동-배양 비는 20:1 내지 1:1, 15:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:1, 5:1 내지 1:1, 2.5:1 내지 1:1, 1:20 내지 1:1, 1:15 내지 1:1, 1:10 내지 1:1, 1:5 내지 1:1, 또는 1:2.5 내지 1:1이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포에 대한 항원 제시 세포의 공동-배양 비는 약 1:1이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 공동-배양은 2시간 내지 24시간 동안 수행된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 공동-배양은 약 6시간 동안 수행된다.
[0032] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 병태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않다.
[0033] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은: 대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계; T 세포를 포함하는 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계; APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 활성화된 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 공동-배양은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되어 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 적어도 하나의 애주번트와 함께 인큐베이션하는 단계; 공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계; 및 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함한다.
[0034] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은: 대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계; T 세포를 포함하는 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계; APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 활성화된 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계; 공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계; 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 농축된 집단을 인큐베이션하는 단계; 및 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함한다.
[0035] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은: 대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계; APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계; 종양-반응성 T 세포를 포함하는 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계; 공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 선택은 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 전 또는 후에 수행되는 것인 단계; 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 농축된 집단을 인큐베이션하는 단계; 및 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함한다.
[0036] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동-배양은 1-7일 동안 수행된다.
[0037] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 직접적으로 단리되거나 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 질병 또는 병태를 나타내며, 선택적으로 질병 또는 병태는 암이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 T 세포 집단을 단리 또는 선택하기 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받았다.
[0038] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 자가이고, 선택적으로 여기서 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플이다.
[0039] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포 표면에 대한 농축은 유세포측정법에 의한 것이며, 선택적으로 자동화된 고처리량 유세포측정법에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 농축은 FX500 세포 분류기를 사용하여 수행할 수 있다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하기 위해 유세포측정에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행이 수행된다.
[0040] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집된다. 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 단편을 포함한다. 제공된 임의의 구체예에서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함한다.
[0041] 종양 반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은: (1) (a) T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계; 및 (b) 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 조건 하에 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하기 전, 동안 또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0042] 일부 구체예에서, 종양 반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은: (1) (a) T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계; (b) 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 단계; 및 (c) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께, 세포의 집단의 세포의 확장이 자극되는 조건 하에 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 단계 (b)에서의 인큐베이션 전, 동시 또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0043] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포를 배양하는 단계는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하되, 여기서 하나 이상의 사이토카인의 존재 하의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0044] 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에서의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0045] 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제 및 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제를 포함하고, 선택적으로 공동자극 수용체는 CD28이고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에서의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행된다.
[0046] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션하는 하나 이상의 단계들 후에 세포를 세척하는 단계를 더 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/수행되거나 최대 20일 동안 수행된다.
[0047] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단과 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션의 적어도 일부는, T 세포 집단과 T 세포 자극 제제와의 인큐베이션과 동시에 수행된다.
[0048] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단과 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은, T 세포 집단과 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 후에 수행된다.
[0049] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은: T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계; 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께, 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계; 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 활성화된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 인큐베이션하는 단계; 및 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 것인 단계를 포함하되, 여기서 상기 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션은 세포를 수확하기 1일 내지 5일 전에 수행된다.
[0050] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단을 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하기 전에 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 집단을 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션한 후, 및 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하기 전에, 종양- 반응성 T 세포 및/또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커를 발현하는 T 세포를 농축하며, 여기서 농축된 T 세포의 집단은 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션된다.
[0051] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포이다.
[0052] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 자가 T 세포 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물이며, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행된다. 제공된 구체예 중 일부에서, APC는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 동종이계이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 대상체는 질병 또는 병태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않거나 건강하다.
[0053] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 것이고 선택은 생물학적 샘플로부터 T 세포를 직접 단리하는 것을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 질병 또는 병태를 나타내며, 선택적으로 질병 또는 병태는 암이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 T 세포 집단을 단리 또는 선택하기 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받았다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 자가조직이고, 선택적으로 여기서 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플이다.
[0054] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함한다. 임의의 제공된 구체예 중 일부에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포에 대한 농축은 유세포 분석법에 의해, 선택적으로 자동화된 고처리량 유세포 분석법에 의해, 선택적으로 FX500 세포 분유기에 의해 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하기 위해 유세포측정에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행이 수행된다.
[0055] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집된다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 단편을 포함한다. 제공된 임의의 구체예에서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함한다.
[0056] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터의 T 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; (b) T 세포의 집단으로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0057] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) T 세포의 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계; (b) T 세포의 집단으로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 상기 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극하는 것인 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0058] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 체크포인트 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (c) 공동-배양물로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0059] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 세포자멸사 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, 적어도 하나의 세포자멸사 억제제 및 체크포인트 억제제는 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 공동자극 작용제 및 체크포인트 억제제는 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 세포자멸사 억제제는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제한다.
[0060] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 3, 카스파제 6 또는 카스파제 7 중 하나 이상을 억제한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Emricasan(IDN-6556, PF-03491390), NAIP(뉴런 세포자멸사 억제 단백질; BIRC1), cIAP1 및 cIAP2(세포자멸사 1 및 2의 세포 억제제; 각각 BIRC2 및 BIRC3), XIAP(X-염색체 결합 IAP, BIRC4), 서바이빈(BIRC5), BRUCE(Apollon, BIRC6), 리빈(BIRC7) 및 Ts-IAP(고환-특이적 IAP, BIRC8), Wedelolactone, NS3694, NSCI 및 Z-플루오로메틸 케톤 Z-VAD-FMK 또는 그의 플루오로메틸 케톤 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 구체예 중 일부에서, 세포자멸사 억제제는 2개 이상의 카스파제의 활성화 또는 활성을 억제하는 범-카스파제 억제제이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Z-VAD-FMK이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Z-FA-FMK, Z-VAD(OH)-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VAD(OM2)-FMK, 및 Z-VDVAD-FMK로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0061] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제 (예컨대 카스파제 억제제)는 약 0.5 μM 내지 약 50 μM, 약 0.5 μM 내지 약 40 μM, 약 0.5 μM 내지 약 30 μM, 약 0.5 μM 내지 약 20 μM, 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 40 μM, 약 1 μM 내지 약 30 μM, 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 1 μM 내지 약 5 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제(예컨대, 카스파제 억제제)는 약 2 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제(예컨대, 카스파제 억제제)는 약 10 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제(예컨대, 카스파제 억제제)는 약 25 μM의 농도로 첨가된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제 (예컨대 카스파제 억제제)는 약 0.5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 또는 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL의 농도로 첨가된다.
[0062] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터의 T 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 단계 (a)에서 생성된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (c) 단계 (b)에서 생성된 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0063] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 이 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션하는 하나 이상의 단계들 후에 세포를 세척하는 단계를 더 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/수행되거나 최대 30일 동안 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/되거나 최대 20일 동안 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 대상체, 임의로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물로부터 단리되고, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양으로부터 하나 이상의 신생항원 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, APC는 대상체에 대해 자가이거나 또는 대상체에 동종이계이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않는다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 직접적으로 단리되거나 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 질병 또는 병태를 나타내며, 선택적으로 질병 또는 병태는 암이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 자가이고, 선택적으로 여기서 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는다.
[0064] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플이다.
[0065] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포 표면에 대한 농축은 유세포측정법에 의한 것이며, 선택적으로 자동화된 고처리량 유세포측정법에 의해 수행되고, 선택적으로 FX500 세포 분류기를 사용하여 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하기 위해 유세포측정에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행이 수행된다.
[0066] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집된다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 단편을 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함한다.
[0067] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포에 대한 농축은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함한다.
[0068] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양 반응성 T 세포에 대한 농축은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD69, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD38, CD39, CD6, CD90, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD134 및/또는 CD137이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0069] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된 적어도 2개의 마커를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD137을 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로부터 선택된 적어도 2개의 마커를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 추가로 포함한다.
[0070] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 농축되어 있다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 농축은 세포 표면 마커 CD3에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 선택을 포함하거나 또는 세포 표면 마커 CD4에 대해 표면 양성인 T 세포 및 세포 표면 마커 CD8에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 순차적 또는 동시적 선택을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 농축된 집단은 CD3+ T 세포를, 집단 내 총 세포의 백분율로서 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 포함하거나; 또는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 풍부한 집단은 집단 내 총 세포의 백분율로서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를, 집단 내 총 세포의 백분율로서 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1이다.
[0071] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-관련 항원은 신생항원이고; 및/또는 종양-반응성 T 세포는 신생항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 T 세포를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포가 농축된 집단은 종양-반응성 T 세포를, 집단내 총 세포 또는 총 T 세포의 백분율로서 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 또는 약 95% 이상 포함하고; 및/또는 종양-반응성 T 세포가 농축된 집단은 활성화 표현형을 갖는 T 세포를, 집단내 총 세포 또는 총 T 세포의 백분율로서, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 또는 약 95% 이상 포함하며, 여기서 활성화 표현형은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 포함한다.
[0072] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 이 방법은 생물학적 샘플로부터, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함한다.
[0073] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포의 확장 또는 증식을 위한 조건 하에 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에 선택된 세포를 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다.
[0074] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물이며, 상기 공동-배양은 APC가, 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행된다. 제공된 구체예 중 일부에서, APC는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 동종이계이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않는다.
[0075] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 항원 제시 세포는 유핵 세포, 예컨대 수지상 세포, 단핵 식세포, B 림프구, 내피 세포 또는 흉선 상피이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 항원 제시 세포는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 대해 동종이계이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 하나 이상의 펩타이드는 대상체의 종양-관련 항원으로부터의 적어도 하나의 네오에피토프를 포함한다.
[0076] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래하고 선택은 생물학적 샘플로부터 T 세포를 직접 단리하는 것을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 질병 또는 병태를 나타내며, 선택적으로 질병 또는 병태는 암이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 대상체는 T 세포 집단을 단리 또는 선택하기 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받았다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 대해 자가이고, 선택적으로 여기서 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는다.
[0077] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집된다.
[0078] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함한다.
[0079] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD137을 더 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 반응성 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 반응성 T 세포 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 더 포함한다.
[0080] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 선택은 면역친화성-기반 선택을 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, 면역친화성-기반 선택은 세포를 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고 항체에 결합된 세포를 회수함으로써 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 항체는 입자 상에 고정되고, 선택적으로 입자는 비드 또는 나노입자이고, 선택적으로 입자는 자성 입자이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 선택은 자기-기반 선택을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 항체는 검출가능한 제제로 표지되며, 선택적으로 여기서 검출가능한 제제는 형광단이다. 제공된 구체예 중 일부에서 선택은 유세포 분석을 포함한다.
[0081] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 가용성이거나 및/또는 고체 지지체에 결합되거나 부착되지 않으며, 선택적으로 고체 지지체는 비드이다.
[0082] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 공동자극 작용제 및 적어도 하나의 세포자멸사 차단제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행된다.
[0083] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 CD28에 특이적으로 결합하지 않거나 항-CD28 항체가 아니다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 작용제이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 TNFRSF 구성원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이거나, 또는 TNFRSF 구성원의 리간드의 세포외 도메인 또는 그의 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 제공된 구체예 중 일부에서, TNFRSF 구성원은 OX40, 4-1BB, GITR 및 CD27로부터 선택된다.
[0084] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 OX40에 특이적으로 결합한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 타볼릭시주맙, 포갈리주맙, 11D4, 18D8, Hu119-122, Hu106-222,PF-04518600, GSK3174998, MEDI6469, BMS 986178 또는 9B12로 부터 선택되는 항체 또는 항원-결합 단편이거나, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 MEDI6383인 OX40L 융합 단백질이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 타볼릭시주맙이다.
[0085] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합한다. 제공된 임의의 구체예 중 일부에서, 공동자극 작용제는 우렐루맙 또는 우토밀루맙이거나, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편이다.
[0086] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 CD27에 특이적으로 결합한다.
[0087] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 발리루맙이거나, 전술한 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 공동자극 작용제는 GITR에 특이적으로 결합한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 MK-1248이거나, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편이다.
[0088] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 세포자멸사 억제제를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 CD95(Fas)에 의해 유도된 세포자멸사를 감소시키고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 CD95(Fas) 또는 CD95 리간드(Fas 리간드)에 특이적으로 결합한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 항-Fas 항체 또는 항-Fas 리간드 항체이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fc 면역글로불린 도메인에 융합된 CD95 리간드(Fas 리간드)에 결합하는 CD95(Fas)의 세포외 도메인 또는 이의 특이적 결합 단편을 포함하는 융합 단백질이고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 APG101 또는 CAN008이다.
[0089] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하며, 선택적으로 여기서 카스파제는 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 3, 카스파제 6 또는 카스파제 7이고, 선택적으로 카스파제는 카스파제 3이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 NAIP(뉴런 세포자살 억제 단백질; BIRC1), cIAP1 및 cIAP2(세포자멸사 1 및 2, 각각 BIRC2 및 BIRC3), XIAP(X-염색체 결합 IAP, BIRC4), 서바이빈(BIRC5), BRUCE(Apollon, BIRC6), 리빈(BIRC7) 및 Ts-IAP(고환-특이적 IAP, BIRC8)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 에메리카산이다.
[0090] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 및 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL의 농도로 첨가된다.
[0091] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM-3 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 체크포인트의 활성을 억제한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 면역 체크포인트는 PD-1/PD-L1로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체이고, 선택적으로 항체는 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 니볼루맙으로부터 선택되거나, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항-PDL1 항체이고, 선택적으로 항체는 아벨루맙, 두르발루맙 및 아테졸리주맙으로부터 선택되거나, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편이다.
[0092] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 면역 체크포인트는 OX40이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항-OX40L 항체이고, 선택적으로 항체는 옥셀루맙이거나 그의 항원-결합 단편이다.
[0093] 제공된 구체예 중 일부에서, 면역 체크포인트는 CTLA-4이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체이고, 선택적으로 항체는 이필리무맙이거나 그의 항원-결합 단편이다.
[0094] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 및 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL의 농도로 첨가된다.
[0095] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 배양의 하나 이상의 단계 동안 연속적으로 첨가되며, 여기서 T 세포 아쥬반트는 배양 동안 1회 이상 보충되거나 교체된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 인큐베이션 동안 연속적으로 첨가되며, 여기서 T 세포 아쥬반트는 인큐베이션 동안 1회 이상 보충되거나 교체된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 배양 단계 동안 일시적으로 첨가되며, 여기서 T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 배양 단계 동안 1회만 첨가된다.
[0096] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제 및 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제로부터 선택되고, 선택적으로 여기서 공동자극 수용체는 CD28이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD3 항체, 선택적으로 OKT3이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 선택적으로 비-분열 또는 조사된(irradiated) PBMC를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD28 항체이다. 제공된 구체예 중 일부에서, T 세포 자극 제제(들)는 각각 가용성인 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체이다.
[0097] 일부 구체예에서, 재조합 사이토카인은 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 여기서 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21 중 하나 이상에서 선택된다.
[0098] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)는 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인을 포함한다.
[0099] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
[0100] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 재조합 IL-2를 포함한다.
[0101] 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (1) (a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, IL-7, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 방법에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
[0102] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)는 IL-7 및 IL-15를 포함하는 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2를 추가로 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2를 포함하지 않는다.
[0103] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)는 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b.로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함한다. 제공된 구체예 중 일부에서, 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21 중 하나 이상으로부터 선택된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 재조합 IL-2를 포함한다.
[0104] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인 각각의 농도는 개별적으로 100 IU/mL 내지 6000 IU/mL이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인 각각의 농도는 개별적으로 300 IU/mL 내지 1000 IU/mL이고, 선택적으로 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인 각각의 농도는 약 300 IU/mL 또는 약 1000 IU/mL이다.
[0105] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3 항체, 선택적으로 OKT3을 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 항-CD3 항체의 농도는 약 50ng/mL이다.
[0106] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동-배양은 (a) 대상체로부터의 건강한 조직과 종양 조직의 엑솜 시퀀싱에 의해 하나 이상의 종양-관련 항원과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하는 단계; (b) 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 네오에피토프를 확인하는 단계; (c) 대상체의 생물학적 샘플로부터 자가 T 세포 집단을 분리하는 단계; 및 (d) T 세포 집단을, 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상의 펩타이드 중 하나 이상을 제시하는 조건 하에, 상기 하나 이상의 펩타이드에 노출되거나 또는 이와 접촉된 항원 제시 세포(APC)와 공동-배양함으로써(여기서 상기 하나 이상의 펩타이드는 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 네오에피토프를 포함한다), 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 수행된다.
[0107] 제공된 임의의 일부 구체예에서, MHC 분자는 클래스 I 분자이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, MHC 분자는 클래스 II 분자이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 및 II이다.
[0108] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 세포이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD8+ 세포이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포이다.
[0109] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드는 개별 펩타이드 또는 펩타이드의 풀을 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서 하나 이상의 펩타이드는 하나 이상의 펩타이드를 인코딩하는 시험관내 전사된 합성된 미니유전자 작제물의 형질감염에 의해 항원 제시 세포 상에 로딩되고, 선택적으로 여기서 하나 이상의 펩타이드는 양측에 내인성 단백질로부터의 12개 아미노산이 나란히(in tandem) 플랭킹되어 있고, 여기서 전사된 미니유전자 작제물이 개별 펩타이드를 생성한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드는 펩타이드 펄스에 의해, 임의로 전기천공에 의해 항원 제시 세포 상에 로딩된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드는 각각 개별적으로 5-30개 아미노산, 임의로 12-25개 아미노산, 임의로 약 25개 아미노산 길이이다.
[0110] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드는 펩타이드 풀이고 펩타이드 펄스에 대한 펩타이드 풀 내의 펩타이드 농도는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 0.01 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL이고; 또는 하나 이상의 펩타이드는 개별 펩타이드이고 펩타이드 펄스에 대한 개별 펩타이드 농도는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드의 개별 펩타이드의 농도는 평균적으로 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 펩타이드의 개별 펩타이드의 농도는 평균적으로 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL이다.
[0111] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 수확은 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 배양 및/또는 농축 개시 후 20일 이내에 수행된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 배양은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인의 존재하에 수행된다.
[0112] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 세포는 배양 개시 후 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 10 내지 14일 또는 14 내지 20일에 수확된다.
[0113] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 전체 세포 또는 총 생존가능 세포인 세포의 역치 양, 즉 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포가 달성될 때까지 수행된다.
[0114] 제공된 임의의 구체예에서, 본 방법은 적어도 약 2배 이상, 적어도 약 2배 이상, 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배 이상, 적어도 약 1000배 이상, 또는 그 이상의 T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래한다.
[0115] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고, 선택적으로 성분채집 샘플이며, 여기서: 배양 개시시 세포의 수는 약 1 x 109 내지 7 x 109 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 1 x 109 총 생존가능 세포, 약 2 x 109 총 생존가능 세포, 3 x 109 총 생존가능 세포, 4 x 109 총 생존가능 세포, 5 x 109 총 생존가능 세포, 6 x 109 총 생존가능 세포, 또는 7 x 109 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는 배양 개시시 종양 반응성 T 세포의 백분율은 약 0.02% 내지 약 40%, 약 0.02% 내지 약 24%, 약 0.02% 내지 약 18%, 약 0.02% 내지 약 0.9% 또는 약 0.02% 내지 약 6.0%이거나; 및/또는 배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.1 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 8 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 20 x 106 T 세포, 0.3 x 106 내지 약 35 x 106 T 세포 또는 0.3 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.1 x 106 T 세포, 0.3 x 106 T 세포, 0.6 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5 x 106 T 세포, 10 x 106 T 세포, 35 x 106 T 세포 또는 60 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이다.
[0116] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프 공급원 샘플 또는 종양 공급원 샘플이고, 여기서: 배양 개시 시 세포의 수는 약 10 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 12 x 106 내지 43 x 106 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 10 x 106 총 생존가능 세포, 약 12 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 총 생존가능 세포, 40 x 106 총 생존가능 세포, 60 x 106 총 생존가능 세포, 또는 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는 배양 개시시 종양 반응성 T 의 백분율은 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 25% 또는 약 1% 내지 약 14%이거나; 및/또는 배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.7 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 1 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 또는 약 0.7 x 106 내지 약 5.4 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.7 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5.4 x 106 T 세포, 또는 15 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이다.
[0117] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포를 포함하는 세포 집단은 종양 침윤 림프구, 림프구 또는 말초 혈액 단핵 세포를 포함한다.
[0118] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양이고 T 세포를 포함하는 세포 집단은 종양 침윤 림프구를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포의 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 종양 단편은 2 cm2 당 약 1개의 종양 단편으로 제1 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션을 위해 접종된다. 제공된 구체예 중 일부에서, 종양은 흑색종이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포의 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편의 균질화 및/또는 효소적 소화에 의해 단일 세포 현탁액으로서 처리된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포의 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편의 균질화 및 효소적 소화에 의해 처리된 단일 세포 현탁액이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 효소적 소화는 콜라게나제, 임의로 콜라게나제 IV 또는 콜라게나제 I/II와 함께 인큐베이션함으로써 이루어진다.
[0119] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포를 포함하는 세포 집단은 2 cm2당 약 5 x 105 내지 약 2 x 106개의 총 세포로 제1 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션을 위해 접종된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양은 결장직장암(CRC)이다.
[0120] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 1종 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 세포의 수확 시간까지 최소 24시간 동안 및 세포의 수확까지의 기간이거나, 또는 약 24시간 내지 약 96시간 또는 약 24시간 또는 약 48시간 또는 약 24시간 또는 약 36시간 또는 약 48시간이다.
[0121] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 약 24시간 내지 약 96시간 또는 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간, 약 36시간 또는 약 48시간이다.
[0122] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 7 내지 21일, 선택적으로 7 내지 14일 동안이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 기체 투과성 배양 용기에서 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 생물반응기를 사용하여 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 7 내지 21일, 선택적으로 7 내지 14일 동안이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 폐쇄 시스템에서 이루어진다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 기체 투과성 배양 용기에서 수행된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 생물반응기를 사용하여 수행된다.
[0123] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계들 중 하나 이상은 폐쇄 시스템에서 수행되고, 선택적으로 선택 및/또는 농축 또는 인큐베이션을 위한 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
[0124] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상체에 투여하기 위해 수확된 세포를 제제화하는 것을 추가로 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 제제화는 동결보존을 포함하고, 여기서 세포는 대상체에 투여하기 전에 해동된다.
[0125] 본원에 따라 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 조성물이 제공된다.
[0126] 본원에 따라 종양 반응성 T 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조성물 중 총 세포 또는 총 T 세포의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%는 종양 반응성 T 세포이거나 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이다.
[0127] 본원에 따라 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 종양 반응성 T 세포가 풍부한(농축된) 확장된 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
[0128] 본원에 따라 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
[0129] 제공된 조성물의 임의의 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD137을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 반응성 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 반응성 T 세포 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 더 포함한다.
[0130] 제공된 조성물의 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD3+ T 세포이거나 또는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고, 여기서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1이다.
[0131] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배, 적어도 약 1000배, 또는 그 이상인, T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래한다.
[0132] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 확장된 세포의 조성물은 항원-특이적 자극 후, 약 30pg/mL 초과, 선택적으로 약 60pg/mL 초과의 농도로 IFN감마를 생성할 수 있다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 수확된 세포를 동결보호제로 제형화하는 것을 포함한다.
[0133] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD3+ T 세포이거나 또는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하되, 여기서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1이다.
[0134] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 조성물 중 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 총 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포 또는 그의 생존 세포의 수는 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108, 1 x 108 내지 약 50 x 109, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109, 1 x 108 내지 약 12 x 109, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109개 이다.
[0135] 제공된 조성물의 임의의 일부 구체예에서, 조성물 중 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 총 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포 또는 그의 생존 세포의 수는 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108, 1 x 108 내지 약 50 x 109, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109, 1 x 108 내지 약 12 x 109, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109개 이다.
[0136] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 치료적 유효 용량은 1 x 109 내지 10 x 109 T 세포이다.
[0137] 제공된 조성물의 임의의 일부 구체예에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 동결방지제를 포함한다.
[0138] 제공된 조성물의 임의의 일부 구체예에서, 조성물은 멸균성이다.
[0139] 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 조성물의 치료 용량을 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다.
[0140] 제공된 임의의 조성물을 암에 걸린 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 투여된 조성물의 세포는 대상체에 대해 자가이다. 일부 구체예에서, 암은 상피암이다.
[0141] 일부 구체예에서, 암은 흑색종, 폐 편평상피암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암, 자궁경부암, 두경부암, 위암 또는 자궁암이다. 일부 구체예에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종암, 자궁내막암이고, 선택적으로 유방암은 HR+/Her2- 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 HER2+ 유방암이다.
[0142] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 확장된 세포를 포함하는 조성물은 대상체에서 암을 치료하는 데 사용된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 종양은 상피암의 종양이다. 제공된 임의의 방법에서, 종양은 흑색종, 폐 편평상피암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암(CRC), 자궁경부암, 두경부암, 위 암 또는 자궁암의 종양이다. 제공된 임의의 방법 중 일부에서, 종양은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종암, 자궁내막암의 종양이고, 선택적으로 여기서 유방암은 HR+/Her2- 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 HER2+ 유방암이다.
[0143] 도 1A는 제공된 방법에 따라 T 세포 치료 조성물을 제조하기 위한 예시적인 프로세스의 개략도를 도시한다. 예시적인 프로세스에서 대상체로부터 얻은 자가 T 세포와의 공동-배양 방법에 사용하기 위한 펩타이드의 확인 및 생성을 위해 종양 샘플을 동일한 환자로부터 획득된다. 어떤 경우에는 예를 들어 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 말초 혈액 림프구(PBL)를 함유하는, 환자의 T 세포 집단을, 주조직적합성 복합체에 대한 제시를 위해 펩타이드 네오에피토프에 접촉되거나 노출된 항원 제시 세포와 공동 배양하기에 앞서, 세포를 확장하는 조건에서 자극시킨다. 항원 제시 세포가 주조직적합성 복합체의 맥락에서 펩타이드를 제시하는 조건 하에서 공동 배양 후, 종양-반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(예컨대 CD70a)에 대해 표면 양성인 T 세포를, T 세포 자극 제제(들)(예컨대 항-CD3/항-CD28)와의 인큐베이션과 같은 제공된 방법에 따라 확장을 위한 조건 하에 선택하여 배양할 수 있다. 이러한 단계들에는 제공된 방법에 따라 공동자극 작용제(예컨대 OX40 또는 4-1BB 작용제) 또는 세포자멸사 억제제(예컨대 Fas/Fas 리간드 억제제 또는 카스파제 억제제)인 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 배양은 세포의 증식 및 확장을 지원하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2)의 존재 하에 수행된다. 이 프로세스는 영양소가 함유된 무혈청 배지의 존재 하에 수행될 수 있다. 하나 이상의 단계 또는 모든 단계는 폐쇄 시스템에서, 예를 들어 환경에 세포를 노출시키지 않고 수행할 수 있다. 세포가 치료 용량 또는 역치 수에 도달하면, 세포를 수확 및 제형화하고, 일부 경우에 농축 또는 동결보존하고, 예컨대 주입에 의해 대상체에 투여하는 데 사용될 수 있다.
[0144] 도 1B는 제공된 방법에 따라 T 세포 치료 조성물을 제조하기 위한 예시적인 프로세스의 개략도를 도시한다. 예시적인 프로세스에서, T 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 이 방법을 위한 세포 공급원으로서 사용한다. 생물학적 샘플은 종양 침윤 림프구, 말초 혈액 단핵 세포(예컨대 성분채집술) 또는 림프 유래 림프구를 포함할 수 있다. 종양-반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(예컨대 CD70a)에 대해 표면 양성인 T 세포를 샘플로부터 직접 선택할 수 있고, 공동자극 작용제 (예컨대 OX40 또는 4-1BB 작용제) 또는 세포자멸사 억제제 (예컨대 Fas/Fas 리간드 억제제 또는 카스파제 억제제)인 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션, 및 T 세포 자극 제제(들)(예컨대 항-CD3/항-CD28)와의 인큐베이션을 비롯한, 제공된 방법에 따라 확장을 위한 조건 하에 배양할 수 있다. 배양은 세포의 증식 및 확장을 지원하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2)의 존재 하에 수행된다. 이 프로세스는 영양소가 함유된 무혈청 배지의 존재 하에 수행될 수 있다. 하나 이상의 단계 또는 모든 단계는 폐쇄 시스템에서, 예를 들어 환경에 세포를 노출시키지 않고 수행할 수 있다. 세포가 치료 용량 또는 역치 수에 도달하면, 세포를 수확 및 제형화하고, 일부 경우에 농축 또는 동결보존하고, 예컨대 주입에 의해 대상체에 투여하는 데 사용될 수 있다. 도 1C는 환자 특이적 종양-유래 침윤 T 세포 집단의 생성을 위한 전체적인 프로세스 흐름도를 도시한다.
[0145] 도 2A는 제1 초기 확장 및 제2 급속 확장으로 된 T 세포의 벌크 확장을 수반하는 전형적인 TIL 확장 프로세스에서의 예시적인 동력학 및 T 세포 신생항원 반응성을 도시하며, 여기서 상기 반응성은 최종 생성물을 포함하는 과정 전반에 걸쳐 낮게 유지된다. 도 2B는 제1 초기 확장, 이에 후속하는 신생항원 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와의 공동-배양에 의한 종양-반응성 T 세포의 농축, T 세포 활성화(상향조절) 마커를 위한 종양-반응성 세포의 선택, 및 농축된 반응성 세포의 제2 확장을 포함하는, TIL 확장 프로세스의 예시적인 동력학을 추가로 도시한다.
[0146] 도 3A는 단편 배양, 효소를 사용한 균질화, 및 효소 없는 균질화를 이용하여 환자 유래 CRC 종양 조직으로부터 생존 가능한 전체 집단 1 세포의 생성을 도시한다. 효소가 있거나 없는 분해는 모두 단편에서 배양한 것보다 더 많은 총 세포를 산출하였다. 이들 세포의 생존율이 도 3B에 도시되어 있다. 단편에서 생성되고 효소로 분해된 배양물의 생존력은 효소 없이 균질화를 사용하여 유래된 것보다 더 높았다.
[0147] 도 4A는 단편 배양 또는 효소의 존재 또는 부재하의 균질화를 사용하여 환자 유래 흑색종 종양 조직으로부터 집단 1 세포의 생성을 도시한다. 단편 배양은 단일 세포 현탁액에서 시작된 배양보다 더 많은 총 세포를 산출하였다. 이들 세포의 생존율을 도 4B에 나타내었다. 단편으로부터 생성된 집단은 단일 세포 현탁액으로부터의 세포보다 더 높은 생존력을 나타내었다.
[0148] 도 5는 통상적인 6-웰 배양 플레이트 또는 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트에서 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 성장 곡선(도 5A) 및 배수 확장(도 5B)을 도시한다. 도 5는 또한 단편 또는 단일 세포 현탁액 배양의 세포 추출 방법에 의해 대조되는, 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 5C) 및 배수 확장(도 5D)을 도시한다.
[0149] 도 6은 6-웰 배양 플레이트 또는 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트에서 원발성 흑색종 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 성장 곡선(도 6A) 및 배수 확장(도 6B)을 도시한다.
[0150] 도 7은 무혈청 OpTmizer 또는 5% 인간 혈청이 보충된 RPMI 배지를 사용하여 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 7A) 및 배수 확장(도 7B)을 도시한다. 마찬가지로, 도 8은 무혈청 OpTmizer 또는 5% 인간 혈청이 보충된 RPMI 배지를 사용하여 원발성 흑색종 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 8A) 및 배수 확장(도 8B)을 도시한다.
[0151] 도 9는 CRC 종양으로부터 유래되고 저농도(300IU/mL) 또는 고농도(600IU/mL)의 재조합 인간 IL-2가 보충된 배지에서 배양된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 9A) 및 배수 확장(도 9B)을 도시한다. 이들 데이터는 흑색종 종양 유래 세포에 대해서도 유사하게 도시되어 있다.
[0152] 도 10A-10B. 고농도의 IL-2는 세포 확장에 필요한 것으로 관찰되지 않았다.
[0153] 도 11A는 항-CD3 모노클로날 항체인 OKT3으로 자극되지 않거나 자극된 흑색종 유래 세포 배양물로부터의 집단 2의 총 세포 수를 도시하고 도 11B는 상기 집단 2의 배수 확장을 나타내며, 대체로 유사한 것으로 관찰되었다.
[0154] 도 12A-C는 OKT3를 이용한 활성화 후 0 내지 48시간 사이에 CD8+ T 세포, CD38 및 CD39 (도 12A), CD134 및 CD137 (도 12B), 및 CD69 및 CD90 (도 12C)에 대한 활성화 마커의 상향조절 퍼센트를 도시한다.
[0155] 도 13A-C는 OKT3를 이용한 활성화 후 0 내지 48시간 사이에 CD4+ T 세포, CD38 및 CD39 (도 13A), CD134 및 CD137 (도 13B), 및 CD69 및 CD90 (도 13C)에 대한 활성화 마커의 상향조절 퍼센트를 도시한다.
[0156] 도 14는 제0일에 CRC 종양으로부터 생성된 단일 세포 현탁액 배양물에서 선택된 예시적 마커의 발현을 도시한다.
[0157] 도 15A-E는 집단 1 세포의 CD3+ 세포 순도를 퍼센트로서 도시한 것이다. 도 15A는 무효소, 1 mg/ml(저) 효소 및 5 mg/ml(고) 효소 상태로 균질화 후 CRC 종양으로부터 제0일로부터의 SCS로부터의 세포 순도를 도시한다. 이들 데이터는 도 15B에서 흑색종 유래 배양물에 대해서도 유사하게 나타나 있다. 도 15C는 OKT3 자극의 존재 또는 부재 하에 배양된 단편으로부터 제0일(기준선 SCS) 및 제6일의 CD3+ 집단 1 세포의 순도를 도시한다. 도 15D는 6000IU/mL(고) 또는 300IU/mL(저)의 재조합 IL-2가 보충된 배지에서 배양된 단편을 사용하여 제11일에 CRC 공여자로부터의 CD3+ 세포의 상대적 순도를 보여준다. 도 15E는 OKT3 자극 및/또는 고농도 또는 저농도의 IL-2와 함께 무혈청 OpTmizer 배지 또는 RPMI에서 배양된 단편으로부터의 집단 1 세포(제9일)를 도시한다. 이러한 관찰은 CRC 환자의 종양 생검에서 얻은 SCS가 종양 단편의 배양물에서 얻은 세포보다, 확장을 위한 더 많은 수의 T 세포를 제공할 수 있음을 뒷받침한다.
[0158] 도 16은 고농도 및 저농도 IL-2 및 혈청을 함유하는 RPMI 배지 또는 무혈청 OpTmizer에서의 제9일의 단편 배양물로서, 흑색종 환자로부터 유래된 CD3+ 집단 1 세포의 순도를 도시한다.
[0159] 도 17A는 0.1ng/mL 내지 20ng/mL 농도의 펩타이드가 로딩된 수지상 세포와의 공동-배양 후 집단 3 세포의 생성을 도시한다. 도 17B는 로딩되지 않은 수지상 세포와 공동-배양된 T 세포로부터의 동일한 실험에서의 배수 증가를 도시한다(도 17B).
[0160] 도 18A는 % 41BB/OX40 발현으로서 보고된 1개의 펩타이드 또는 2개의 펩타이드에 의한 자극을 비교한다. 도 18B는 활성화되지 않은 T 세포로부터 배수 증가로서 보고된 1개의 펩타이드 또는 2개의 펩타이드에 의한 자극을 도시한다.
[0161] 도 19A는 % 41BB/OX40 발현으로서 보고된 2개의 T 세포 대 수지상 세포 비율, 1:1 및 1:2를 비교한다. 도 19B는 활성화되지 않은 T 세포로부터 배수 증가로서 보고된 2개의 T 세포 대 수지상 세포 비율, 1:1 및 1:2를 비교한다.
[0162] 도 20A는 자가 신생항원 펩타이드와의 공동배양 전후 및 3명의 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 공급된 T 세포의 분류 전후의 신생항원 반응성 TCR 퍼센트를 도시한다. 도 20B는 CD8+ 세포의 공동배양 전후 및 분류 전후의 평균 클래스 I 반응성을 도시한다.
[0163] 도 21A 및 도 21B는 2개의 독립적인 실행(도 21A) 및 회수 퍼센트(도 21B)에 대한 총 세포 인풋(input) 및 아웃풋(output) 양자 모두로서 Sony FX500을 사용한 세포 분류로부터의 회수를 도시한다.
[0164] 도 22는 Sony FX500을 사용한 세포 분류로부터 CD4+ 집단의 순도 및 게이팅을 도시한다. 이들 결과는 상향조절 마커에 대해 양성인 세포의 선택 및 분류 후 세포의 높은 회수를 입증한다.
[0165] 도 23A-도 23C는 분류 후 종양 침윤 T 림프구의 확장을 도시한다. 도 23A는 총 세포 수를 도시하고 도 23B는 배수 확장을 도시한다. 도 23B는 야생형 펩타이드가 로딩되거나, 종양 관련 펩타이드가 로딩되거나, 또는 펩타이드가 로딩되지 않은 수지상 세포가 있거나 없는 공동-배양 후 집단 4 세포로부터 유래된 집단 5 세포의 배수 확장을 도시하고, 도 23B는 상기 집단 5 세포의 배수 확장을 도시한다. 분류 후 다양한 세포 회수 수에서, 집단 4 세포의 집단 5 세포로의 확장 후의 예상 세포 수를 도 23C에 나타내었다.
[00166] 도 24A는 벌크 공동-배양, 난소암 환자의 돌연변이(mut) 펩타이드 또는 정상, 야생형(WT) 펩타이드로 자극 후, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 IFN-감마 분비를 도시한다. 도 24B는 분류되지 않은 벌크 T 세포와 비교하여 포지티브 분류 및 네거티브 분류에서 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 도시한다. 도 24C는 선택되지 않은 집단과 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론형의 수를 나타내고, 유입되는 TCR의 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단에서 높다는 것과 선택된 집단에서 독특한 TCR 클론이 농축됨을 입증한다. 도 24D는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 것으로 관찰된 샘플 A로부터의 분류 전 및 분류 후 세포 집단을 나타낸 도면으로, 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 가리킨다.
[0167] 도 25A는 벌크 공동-배양, 결장직장암 환자의 항-CD3(OKT3) 자극 후, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 IFN-감마 분비를 도시한다. 도 25B는 분류되지 않은 벌크 T 세포와 비교하여 포지티브 분류 및 네거티브 분류에서 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 도시한다. 도 25C는 선택되지 않은 집단과 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론성 프로파일을 나타낸다. 도 25D는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 것으로 관찰된 분류 전 및 분류 후 세포 집단을 나타낸 도면으로, 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 가리킨다.
[0168] 도 26A는 벌크 공동-배양, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 나타낸다. 도 26B는 선택되지 않은 집단 및 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론성 프로파일을 도시한다. 도 26C는 CD4+ 클래스 I 반응성 및 CD8+ 클래스 II 반응성 세포를 모두 함유하는 것으로 관찰된 분류 전(벌크) 및 분류 후 세포 집단을 도시한다.
[0169] 보충 OKT3 자극이 있는 경우(도 27A-C) 및 없는 경우(도 28A-C), 다수의 T 세포 아쥬반트의 존재하에 성장된 세포에 대한 총 생존가능한 CD3+ 세포 수를 나타낸다. 표시된 결과는 하기 아쥬반트에 대한 것이다: 타볼릭시주맙, 옥셀루맙, 이필리무맙, 토실리주맙, 우렐루맙, 펨브롤리주맙, 발리루맙, 항-GITR MK-1248, 항-인간 FasL의 경우 10μg/mL; Z-VAD-FMK 범-카스파제 억제제의 경우 25μM; HSP 억제제 NVP-HSP990의 경우 250nM; 및 사이토카인(IL-7, IL-15 또는 IL-21)의 경우 1000 IU/mL.
[0170] 도 29는 IL-7 (도 29A) 및 IL-15 (도 29B)에 대한 용량 반응 곡선을 도시한다.
[0171] 3명의 건강한 공여자 각각으로부터 유래되고 기술된 바와 같은 실험 조건에서 성장한 세포에 대한 총 세포 수 및 세포 생존율을 도 30A-B-도 32A-B에 나타내었다. 지속적인 카스파제 억제의 존재하에 성장한 세포는 고유한(inherent) 공여자 가변성에도 불구하고 우수한 성장을 나타내는 것으로 관찰되었다.
[0172] 2명의 공여자에 대한 항-CD3/항-CD28(일시적 활성화) 처리군을 사용한 단일 활성화에 대한 세포 생존력을 도 33A-B에 나타내고, 동일한 처리에 대한 총 세포 수를 도 34A-B에 나타내었다. 2명의 공여자에 대한 항-CD3/항-CD28 처리군에 의한 연속 활성화에 대한 세포 생존력을 도 35A-B에 나타내고, 동일한 처리에 대한 총 세포 수는 도 36A-B에 도시하였다.
[0173] 도 37A-C는 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK의 존재 또는 부재 하에 성장된 SCS 및 종양 단편 유래 배양물 두 가지 모두의 배수 확장(도 37A), 총 생존 세포(도 37B) 및 생존율(도 37C)을 나타낸다.
[0174] 다양한 농도의 이필리무맙 (항-CTLA4), 펨브롤리주맙 (항-PD1), 타볼릭시주맙 (항-TNFRSF4), 우렐루맙 (항-CD137), 및 발리루맙 (항-CD27)의 존재 하에 성장된 T 세포 표현형을 CD3+ (도 38A-D), CD4+ (도 39A-D) 및 CD8+ (도 40A-D)에 대해 나타내었다.
[0144] 도 1B는 제공된 방법에 따라 T 세포 치료 조성물을 제조하기 위한 예시적인 프로세스의 개략도를 도시한다. 예시적인 프로세스에서, T 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 이 방법을 위한 세포 공급원으로서 사용한다. 생물학적 샘플은 종양 침윤 림프구, 말초 혈액 단핵 세포(예컨대 성분채집술) 또는 림프 유래 림프구를 포함할 수 있다. 종양-반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(예컨대 CD70a)에 대해 표면 양성인 T 세포를 샘플로부터 직접 선택할 수 있고, 공동자극 작용제 (예컨대 OX40 또는 4-1BB 작용제) 또는 세포자멸사 억제제 (예컨대 Fas/Fas 리간드 억제제 또는 카스파제 억제제)인 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션, 및 T 세포 자극 제제(들)(예컨대 항-CD3/항-CD28)와의 인큐베이션을 비롯한, 제공된 방법에 따라 확장을 위한 조건 하에 배양할 수 있다. 배양은 세포의 증식 및 확장을 지원하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2)의 존재 하에 수행된다. 이 프로세스는 영양소가 함유된 무혈청 배지의 존재 하에 수행될 수 있다. 하나 이상의 단계 또는 모든 단계는 폐쇄 시스템에서, 예를 들어 환경에 세포를 노출시키지 않고 수행할 수 있다. 세포가 치료 용량 또는 역치 수에 도달하면, 세포를 수확 및 제형화하고, 일부 경우에 농축 또는 동결보존하고, 예컨대 주입에 의해 대상체에 투여하는 데 사용될 수 있다. 도 1C는 환자 특이적 종양-유래 침윤 T 세포 집단의 생성을 위한 전체적인 프로세스 흐름도를 도시한다.
[0145] 도 2A는 제1 초기 확장 및 제2 급속 확장으로 된 T 세포의 벌크 확장을 수반하는 전형적인 TIL 확장 프로세스에서의 예시적인 동력학 및 T 세포 신생항원 반응성을 도시하며, 여기서 상기 반응성은 최종 생성물을 포함하는 과정 전반에 걸쳐 낮게 유지된다. 도 2B는 제1 초기 확장, 이에 후속하는 신생항원 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와의 공동-배양에 의한 종양-반응성 T 세포의 농축, T 세포 활성화(상향조절) 마커를 위한 종양-반응성 세포의 선택, 및 농축된 반응성 세포의 제2 확장을 포함하는, TIL 확장 프로세스의 예시적인 동력학을 추가로 도시한다.
[0146] 도 3A는 단편 배양, 효소를 사용한 균질화, 및 효소 없는 균질화를 이용하여 환자 유래 CRC 종양 조직으로부터 생존 가능한 전체 집단 1 세포의 생성을 도시한다. 효소가 있거나 없는 분해는 모두 단편에서 배양한 것보다 더 많은 총 세포를 산출하였다. 이들 세포의 생존율이 도 3B에 도시되어 있다. 단편에서 생성되고 효소로 분해된 배양물의 생존력은 효소 없이 균질화를 사용하여 유래된 것보다 더 높았다.
[0147] 도 4A는 단편 배양 또는 효소의 존재 또는 부재하의 균질화를 사용하여 환자 유래 흑색종 종양 조직으로부터 집단 1 세포의 생성을 도시한다. 단편 배양은 단일 세포 현탁액에서 시작된 배양보다 더 많은 총 세포를 산출하였다. 이들 세포의 생존율을 도 4B에 나타내었다. 단편으로부터 생성된 집단은 단일 세포 현탁액으로부터의 세포보다 더 높은 생존력을 나타내었다.
[0148] 도 5는 통상적인 6-웰 배양 플레이트 또는 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트에서 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 성장 곡선(도 5A) 및 배수 확장(도 5B)을 도시한다. 도 5는 또한 단편 또는 단일 세포 현탁액 배양의 세포 추출 방법에 의해 대조되는, 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 5C) 및 배수 확장(도 5D)을 도시한다.
[0149] 도 6은 6-웰 배양 플레이트 또는 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트에서 원발성 흑색종 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 성장 곡선(도 6A) 및 배수 확장(도 6B)을 도시한다.
[0150] 도 7은 무혈청 OpTmizer 또는 5% 인간 혈청이 보충된 RPMI 배지를 사용하여 원발성 CRC 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 7A) 및 배수 확장(도 7B)을 도시한다. 마찬가지로, 도 8은 무혈청 OpTmizer 또는 5% 인간 혈청이 보충된 RPMI 배지를 사용하여 원발성 흑색종 종양으로부터 유래된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 8A) 및 배수 확장(도 8B)을 도시한다.
[0151] 도 9는 CRC 종양으로부터 유래되고 저농도(300IU/mL) 또는 고농도(600IU/mL)의 재조합 인간 IL-2가 보충된 배지에서 배양된 집단 2 세포의 총 세포 수(도 9A) 및 배수 확장(도 9B)을 도시한다. 이들 데이터는 흑색종 종양 유래 세포에 대해서도 유사하게 도시되어 있다.
[0152] 도 10A-10B. 고농도의 IL-2는 세포 확장에 필요한 것으로 관찰되지 않았다.
[0153] 도 11A는 항-CD3 모노클로날 항체인 OKT3으로 자극되지 않거나 자극된 흑색종 유래 세포 배양물로부터의 집단 2의 총 세포 수를 도시하고 도 11B는 상기 집단 2의 배수 확장을 나타내며, 대체로 유사한 것으로 관찰되었다.
[0154] 도 12A-C는 OKT3를 이용한 활성화 후 0 내지 48시간 사이에 CD8+ T 세포, CD38 및 CD39 (도 12A), CD134 및 CD137 (도 12B), 및 CD69 및 CD90 (도 12C)에 대한 활성화 마커의 상향조절 퍼센트를 도시한다.
[0155] 도 13A-C는 OKT3를 이용한 활성화 후 0 내지 48시간 사이에 CD4+ T 세포, CD38 및 CD39 (도 13A), CD134 및 CD137 (도 13B), 및 CD69 및 CD90 (도 13C)에 대한 활성화 마커의 상향조절 퍼센트를 도시한다.
[0156] 도 14는 제0일에 CRC 종양으로부터 생성된 단일 세포 현탁액 배양물에서 선택된 예시적 마커의 발현을 도시한다.
[0157] 도 15A-E는 집단 1 세포의 CD3+ 세포 순도를 퍼센트로서 도시한 것이다. 도 15A는 무효소, 1 mg/ml(저) 효소 및 5 mg/ml(고) 효소 상태로 균질화 후 CRC 종양으로부터 제0일로부터의 SCS로부터의 세포 순도를 도시한다. 이들 데이터는 도 15B에서 흑색종 유래 배양물에 대해서도 유사하게 나타나 있다. 도 15C는 OKT3 자극의 존재 또는 부재 하에 배양된 단편으로부터 제0일(기준선 SCS) 및 제6일의 CD3+ 집단 1 세포의 순도를 도시한다. 도 15D는 6000IU/mL(고) 또는 300IU/mL(저)의 재조합 IL-2가 보충된 배지에서 배양된 단편을 사용하여 제11일에 CRC 공여자로부터의 CD3+ 세포의 상대적 순도를 보여준다. 도 15E는 OKT3 자극 및/또는 고농도 또는 저농도의 IL-2와 함께 무혈청 OpTmizer 배지 또는 RPMI에서 배양된 단편으로부터의 집단 1 세포(제9일)를 도시한다. 이러한 관찰은 CRC 환자의 종양 생검에서 얻은 SCS가 종양 단편의 배양물에서 얻은 세포보다, 확장을 위한 더 많은 수의 T 세포를 제공할 수 있음을 뒷받침한다.
[0158] 도 16은 고농도 및 저농도 IL-2 및 혈청을 함유하는 RPMI 배지 또는 무혈청 OpTmizer에서의 제9일의 단편 배양물로서, 흑색종 환자로부터 유래된 CD3+ 집단 1 세포의 순도를 도시한다.
[0159] 도 17A는 0.1ng/mL 내지 20ng/mL 농도의 펩타이드가 로딩된 수지상 세포와의 공동-배양 후 집단 3 세포의 생성을 도시한다. 도 17B는 로딩되지 않은 수지상 세포와 공동-배양된 T 세포로부터의 동일한 실험에서의 배수 증가를 도시한다(도 17B).
[0160] 도 18A는 % 41BB/OX40 발현으로서 보고된 1개의 펩타이드 또는 2개의 펩타이드에 의한 자극을 비교한다. 도 18B는 활성화되지 않은 T 세포로부터 배수 증가로서 보고된 1개의 펩타이드 또는 2개의 펩타이드에 의한 자극을 도시한다.
[0161] 도 19A는 % 41BB/OX40 발현으로서 보고된 2개의 T 세포 대 수지상 세포 비율, 1:1 및 1:2를 비교한다. 도 19B는 활성화되지 않은 T 세포로부터 배수 증가로서 보고된 2개의 T 세포 대 수지상 세포 비율, 1:1 및 1:2를 비교한다.
[0162] 도 20A는 자가 신생항원 펩타이드와의 공동배양 전후 및 3명의 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 공급된 T 세포의 분류 전후의 신생항원 반응성 TCR 퍼센트를 도시한다. 도 20B는 CD8+ 세포의 공동배양 전후 및 분류 전후의 평균 클래스 I 반응성을 도시한다.
[0163] 도 21A 및 도 21B는 2개의 독립적인 실행(도 21A) 및 회수 퍼센트(도 21B)에 대한 총 세포 인풋(input) 및 아웃풋(output) 양자 모두로서 Sony FX500을 사용한 세포 분류로부터의 회수를 도시한다.
[0164] 도 22는 Sony FX500을 사용한 세포 분류로부터 CD4+ 집단의 순도 및 게이팅을 도시한다. 이들 결과는 상향조절 마커에 대해 양성인 세포의 선택 및 분류 후 세포의 높은 회수를 입증한다.
[0165] 도 23A-도 23C는 분류 후 종양 침윤 T 림프구의 확장을 도시한다. 도 23A는 총 세포 수를 도시하고 도 23B는 배수 확장을 도시한다. 도 23B는 야생형 펩타이드가 로딩되거나, 종양 관련 펩타이드가 로딩되거나, 또는 펩타이드가 로딩되지 않은 수지상 세포가 있거나 없는 공동-배양 후 집단 4 세포로부터 유래된 집단 5 세포의 배수 확장을 도시하고, 도 23B는 상기 집단 5 세포의 배수 확장을 도시한다. 분류 후 다양한 세포 회수 수에서, 집단 4 세포의 집단 5 세포로의 확장 후의 예상 세포 수를 도 23C에 나타내었다.
[00166] 도 24A는 벌크 공동-배양, 난소암 환자의 돌연변이(mut) 펩타이드 또는 정상, 야생형(WT) 펩타이드로 자극 후, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 IFN-감마 분비를 도시한다. 도 24B는 분류되지 않은 벌크 T 세포와 비교하여 포지티브 분류 및 네거티브 분류에서 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 도시한다. 도 24C는 선택되지 않은 집단과 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론형의 수를 나타내고, 유입되는 TCR의 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단에서 높다는 것과 선택된 집단에서 독특한 TCR 클론이 농축됨을 입증한다. 도 24D는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 것으로 관찰된 샘플 A로부터의 분류 전 및 분류 후 세포 집단을 나타낸 도면으로, 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 가리킨다.
[0167] 도 25A는 벌크 공동-배양, 결장직장암 환자의 항-CD3(OKT3) 자극 후, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 IFN-감마 분비를 도시한다. 도 25B는 분류되지 않은 벌크 T 세포와 비교하여 포지티브 분류 및 네거티브 분류에서 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 도시한다. 도 25C는 선택되지 않은 집단과 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론성 프로파일을 나타낸다. 도 25D는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 것으로 관찰된 분류 전 및 분류 후 세포 집단을 나타낸 도면으로, 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 가리킨다.
[0168] 도 26A는 벌크 공동-배양, 벌크 공동-배양 세포로부터 CD137 및/또는 CD134의 발현에 의한 포지티브 분류(선택) 집단(농축됨), 또는 벌크 공동-배양 세포로부터의 네거티브 분류(비선택) 집단에서 측정된 종양-반응성 특이 세포의 신생항원 특이 집단의 농축을 나타낸다. 도 26B는 선택되지 않은 집단 및 선택된 집단에 존재하는 TCR 클론성 프로파일을 도시한다. 도 26C는 CD4+ 클래스 I 반응성 및 CD8+ 클래스 II 반응성 세포를 모두 함유하는 것으로 관찰된 분류 전(벌크) 및 분류 후 세포 집단을 도시한다.
[0169] 보충 OKT3 자극이 있는 경우(도 27A-C) 및 없는 경우(도 28A-C), 다수의 T 세포 아쥬반트의 존재하에 성장된 세포에 대한 총 생존가능한 CD3+ 세포 수를 나타낸다. 표시된 결과는 하기 아쥬반트에 대한 것이다: 타볼릭시주맙, 옥셀루맙, 이필리무맙, 토실리주맙, 우렐루맙, 펨브롤리주맙, 발리루맙, 항-GITR MK-1248, 항-인간 FasL의 경우 10μg/mL; Z-VAD-FMK 범-카스파제 억제제의 경우 25μM; HSP 억제제 NVP-HSP990의 경우 250nM; 및 사이토카인(IL-7, IL-15 또는 IL-21)의 경우 1000 IU/mL.
[0170] 도 29는 IL-7 (도 29A) 및 IL-15 (도 29B)에 대한 용량 반응 곡선을 도시한다.
[0171] 3명의 건강한 공여자 각각으로부터 유래되고 기술된 바와 같은 실험 조건에서 성장한 세포에 대한 총 세포 수 및 세포 생존율을 도 30A-B-도 32A-B에 나타내었다. 지속적인 카스파제 억제의 존재하에 성장한 세포는 고유한(inherent) 공여자 가변성에도 불구하고 우수한 성장을 나타내는 것으로 관찰되었다.
[0172] 2명의 공여자에 대한 항-CD3/항-CD28(일시적 활성화) 처리군을 사용한 단일 활성화에 대한 세포 생존력을 도 33A-B에 나타내고, 동일한 처리에 대한 총 세포 수를 도 34A-B에 나타내었다. 2명의 공여자에 대한 항-CD3/항-CD28 처리군에 의한 연속 활성화에 대한 세포 생존력을 도 35A-B에 나타내고, 동일한 처리에 대한 총 세포 수는 도 36A-B에 도시하였다.
[0173] 도 37A-C는 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK의 존재 또는 부재 하에 성장된 SCS 및 종양 단편 유래 배양물 두 가지 모두의 배수 확장(도 37A), 총 생존 세포(도 37B) 및 생존율(도 37C)을 나타낸다.
[0174] 다양한 농도의 이필리무맙 (항-CTLA4), 펨브롤리주맙 (항-PD1), 타볼릭시주맙 (항-TNFRSF4), 우렐루맙 (항-CD137), 및 발리루맙 (항-CD27)의 존재 하에 성장된 T 세포 표현형을 CD3+ (도 38A-D), CD4+ (도 39A-D) 및 CD8+ (도 40A-D)에 대해 나타내었다.
상세한 설명
[0175] 본원에서는 종양과 같은 표적 세포의 표면 상의 펩타이드를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포의 제조 방법을 제공한다. T 세포는 신생항원과 같은 종양-관련 항원을 인식하는 종양-반응성 T 세포일 수 있다. 이 방법은 T 세포가 T 세포에 대한 세포 공급원으로서 생물학적 샘플로부터 분리되거나 수득된 생체외 T 세포 배양을 포함한다. 일부 경우에, 세포 공급원은 말초 혈액 림프구, 림프절 기원 림프구 또는 종양 침윤 림프구를 포함한다. 세포를 배양하는 방법은 세포를 증식 및 확장하는 방법을 포함하며, 특히 종양-반응성 T 세포의 선택에 의해 또는 이러한 세포와 관련된 T 세포 활성화 마커를 기반으로 하는 것과 같이 종양-반응성 T 세포의 증식 및 확장을 풍부하게 하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 제공된 방법은 또한 T 세포 요법의 생체외 생산시 특정한 T 세포 아쥬반트를 이용하기도 한다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 공동자극 작용제(들)이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 세포에서 세포자멸사 또는 세포자멸사 경로를 억제하는 제제(이하 "세포자멸사 억제제")이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 면역 체크포인트 조절제이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 세포에서 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질 활성을 억제하는 작용제이다. T 세포 아쥬반트는 생체외에서 T 세포의 기능성을 증가시키고 생체내 치료 방법에 사용하기 위해 T 세포의 제조에 첨가될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 방법은 비반응성 T 세포에 비해 반응성 T 세포의 확장을 풍부하게 할 수 있고 생체외 배양시 그의 생존 및 성장을 촉진할 수 있다. 제공된 방법은 기존 방법에 비해 훨씬 더 큰 정도로 치료 용량으로의 확장을 증가시키고/시키거나 치료 효과를 위한 T 세포 요법의 기능성을 증가시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 제공된 방법은 예를 들어 환자 공여자 또는 다른 환자에게 다시 전달하기 위해 T 세포 요법제를 생산하는 방법과 관련하여 신체 외부에서 공여자 세포의 성장 및 생존을 지원하는 데 사용될 수 있다.
[0176] 제공된 방법은 신생항원과 같은 종양 관련 항원에 반응성인 T 세포 요법제를 생산하는 것에 관한 것이다. 암세포는 종양 형성 과정의 일부로 다양한 DNA 돌연변이를 축적한다. 이러한 돌연변이는 단백질 코딩 영역에서 아미노산 변경를 일으킬 수 있다. 돌연변이가 면역 체계에 의해 인식되기 위해서는 단백질이 세포 내에서 처리되고 돌연변이된 펩타이드를 주조직적합성 복합체(MHC)와 함께 표면에 제시하여야 한다. 펩타이드 신생항원(본원에서 네오에피토프 또는 펩타이드 네오에피토프로도 지칭됨)은 TCR 결합을 통해 T-세포에 의해 인식될 수 있는 MHC 복합체에 의해 제시되는 돌연변이 펩타이드이다. 면역계가 돌연변이를 인식하기 위해서는 MHC 복합체를 통해 암세포 표면에 발현되어야 하고 T 세포에는 돌연변이 펩타이드를 인식하는 TCR이 있어야 한다. 이들 신생항원은 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II에 의해 제시될 수 있으며, 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 의해 인식된다.
[0177] 제공된 방법의 특정 구체예에서, T 세포의 집단은 표적 세포의 표면 상의 펩타이드 항원을 인식할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 세포 표면 수용체를 발현하는 반응성 T 세포이거나 이를 포함한다. 특히, 항원이 면역계에 의해 인식되기 위해서는 단백질이 세포내에서 펩타이드 단편이 되도록 처리되어야 하며, 이들 단편은 MHC(Major Histocompatibility Complex)와 함께 표면에 제시되어야 한다. TCR에는 특정 세포 표면의 주조직적합성 복합체(MHC) 단백질이 제시하는 특정 펩타이드와 결합하도록 설계된, 두 개의 단백질 사슬이 있다. TCR은 표적 세포의 표면에 발현된 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드를 인식하기 때문에, TCR은 예컨대 암 세포와 같은 표적 세포의 표면에 직접적으로 제시되는 항원 뿐만 아니라, 종양, 염증성 및 감염된 미세 환경 및 이차 림프양 기관에 존재하는 것과 같은 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원도 인식할 가능성이 있다. 이러한 세포 표면 수용체를 발현하는 반응성 T 세포는 비제한적인 예로서, 감염된 세포, 손상된 세포 또는 기능장애 세포를 비롯한 임의의 표적 세포를 표적화하고 사멸시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 표적 세포의 예로는 암세포, 바이러스 감염 세포, 박테리아 감염 세포, 기능장애적으로 활성화된 염증 세포(예를 들어, 염증 내피 세포) 및 기능장애 면역 반응에 관여하는 세포(예를 들어, 자가면역 질환에 관여하는 세포)를 들 수 있다.
[0178] 일부 구체예에서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지됨)을 함유하는 분자이거나, 또는 그의 항원-결합 부분이고, 이는 MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 αβ 형태이다. 전형적으로 αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 일반적으로 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 찾을 수 있다.
[0179] 일부 태양에서, 반응성 T 세포는 암 항원을 인식하는 종양-반응성 T 세포이다. 암세포는 종양 형성 과정의 일부로 다양한 DNA 돌연변이를 축적한다. 이러한 돌연변이는 단백질 코딩 영역에서 아미노산 변화를 일으킬 수 있다. 신생항원은 종양 특이적 돌연변이 유전자에 의해 인코딩되고 TCR 결합을 통해 T 세포에 의해 인식될 수 있는 MHC 복합체에 의해 제시되는 돌연변이 펩타이드이다. 면역계가 돌연변이를 인식하기 위해서는 돌연변이 펩타이드를 인식하는 TCR을 갖는 T 세포에 의해 인식을 위한 MHC 복합체를 통해 암 세포 표면에 신생항원이 발현된다. 이러한 신생항원은 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II에 의해 제시될 수 있으며, 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일부 태양에서, 반응성 T 세포는 암 신생항원을 인식하는 종양-반응성 T 세포이다. 대부분의 신생항원은 패신저 돌연변이에서 발생하는데, 이는, 이들이 암세포에 대한 성장 이점을 유추하지 않음을 의미한다. 적은 수의 돌연변이가 종양 성장을 적극적으로 촉진하며, 이를 드라이버 돌연변이라고 한다. 패신저 돌연변이는 각 환자에게 고유하고 모든 암세포의 하위 집합에 존재할 수 있는 신생항원을 생성할 가능성이 있다. 드라이버 돌연변이는 개체의 모든 종양 세포에 존재하고 잠재적으로 공유될 가능성이 있는 신생항원을 생성한다. 제공된 방법의 일부 구체예에서, T 세포 집단은 패신저 및/또는 드라이버 돌연변이를 함유하는 신생항원을 인식할 수 있는 종양-반응성 T 세포를 함유한다.
[0180] 특정 태양에서, 제공된 방법은 자가 종양-반응성 T 세포의 생체외 확장을 포함하는 T 세포 요법의 생체외 생산에 사용될 수 있다. 일부 태양에서, 신생항원은 질병 특이적 표적을 나타내기 때문에 면역 요법에 대한 이상적인 표적이다. 예를 들어, 이러한 항원은 일반적으로 암이 발병하기 전에는 신체에 존재하지 않으며, 진정으로 암 특이적이고, 정상 세포에서는 발현되지 않으며 표적 면역 독성을 일으키지 않는다. 따라서 환자에 특이적인 신생항원의 독특한 레퍼토리는 정상 세포를 피하면서 암세포에 특이적인 강한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 이것은 질병-특이적 표적이 아닐 수 있는 다른 세포 치료 표적에 비해 유리한데, 이는, 정상 세포에 대한 표적 항원의 수준이 낮은 경우에조차, 일반적인 항원을 표적으로 하는 조작된 치료법의 맥락에서 심각한 치명적인 자가면역 독성을 유발할 수 있기 때문이다. 예를 들어 흑색종 환자의 항 MAGE-A3-TCR 프로그램이, 뇌에서 낮은 수준으로 발현되는 유사한 표적 MAGE-A12와의 교차 반응성으로 인한 연구 관련 사망으로 인해 중단된 바 있다. 암 면역요법의 한 가지 중요한 난관은 암 표적을 식별하는 것이다.
[0181] 최근의 임상 연구 결과, 외과적으로 절제된 종양으로부터 단리된 T 세포가 신생항원을 인식하는 TCR을 보유하고, 이러한 신생항원 반응성 TIL 집단을 확장하고 이를 환자에게 재주입하는 것이 일부 경우에 극적인 임상 이익을 초래할 수 있는 것으로 입증되었다. 이 맞춤식 치료법은 일반적인 상피 종양이 있는 특정 환자에서 놀라운 임상 반응을 이끌어냈다.
[0182] 종양-반응성 T 세포를 수득하고 생성하기 위한 기존 방법은 전적으로 만족스럽지는 않다. 예를 들어, 확장이 없는 대상체로부터 종양-반응성 T 세포를 직접 분리하는 것은 실현 가능하지 않은데, 이는 이들 세포의 치료적 유효량을 수득할 수 없기 때문이다. 이에 대한 대안으로서, 이들 세포는 자가 항원-제시 세포의 존재 하에 자가 벌크 T 세포의 생체외 공동 배양 방법을 통해 확인될 수 있다. 이러한 방법에서, 자가 항원-제시 세포는 신생항원 돌연변이에 반응성인 TCR을 확인하기 위해 공급원 또는 잠재적인 종양 펩타이드와 접촉되거나 존재하도록 만들어진다. 비록 기존 방법으로 반응성 T 세포를 생성할 수 있지만, 절차가 종종 길고 액적 기술을 사용한 단일 세포 공동 배양이 필요하고/하거나 내독소, 마이코플라스마 및 무균과 관련된 안전 위험을 초래하는 GMP 제어 환경 외부의 방법을 포함한다. 입양 세포 치료 방법에 사용하기 위해 T 세포로 TCR을 재조합 조작하기 위해 원하는 신생항원에 특이적인 TCR을 식별하려는 시도도 있어왔다. 그러나 이러한 접근 방식은 특정 신생항원에 대해 단일 TCR만 생성하므로, 다중 종양-특이적 돌연변이의 광범위한 레퍼토리를 인식하기 위한 다양성이 부족하다. 다른 방법은 종양 항원에 반응하지 않고/않거나 억제 활성을 나타낼 수 있는 다수의 방관자(bystander) 세포를 포함할 수 있는 T 세포를 확장할 위험이 있는 종양 공급원으로부터의, T 세포의 대량 확장을 포함한다. 예를 들어, 종양 조절 T 세포(Treg)는 면역 반응 억제를 전문으로 하고 T 세포 생성물의 반응성을 제한할 수 있는, CD4+ T 세포의 하위집단(subpopulation)이다. 생체외에서 종양-반응성 T 세포를 확장하려는 이러한 추가 접근법은 선택적이지 않으므로, 배양물 중 비반응성 T 세포가 반응성 T 세포보다 우선적으로 확장하게 되어, 만족스러운 반응성을 결여하고/결여하거나 종양-반응성 T 세포의 수가 여전히 불충분한 최종 생성물이 얻어진다. 따라서, 치료를 위한 종양-반응성 T 세포를 생산하는 방법이 요구된다.
[0183] 제공된 구체예는 T 세포 요법에 사용하기 위해 종양-반응성 T 세포를 비롯한 T 세포를 생체외에서 확인하고 확장하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 신체 외부에서 종양-반응성 T 세포와 같은 T 세포의 성장 및 생존을 개선하거나 증가시킨다. 특정 구체예에서, 이 방법은 비반응성 T 세포와 비교하여 반응성 T 세포의 확장을 풍부하게 하고 생체외 배양물에서 그의 생존 및 성장을 촉진한다. 일부 구체예에서, 결과적인 방법은 폐쇄 시스템에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서 이들 방법은 자동화된 또는 부분적으로 자동화된 방식으로 수행된다.
[0184] 제공된 구체예에서, 이 방법은 샘플에서 T 세포 중 하나 이상에 의해 발현되는 공동자극 수용체를 자극하거나 활성화하는 조건 하에 공동자극 작용제와 함께 T 세포 집단에 대해 농축된 세포의 생체외 인큐베이션을 포함한다. 특정 구체예에서, 공동자극 작용제는 4-1BB 작용제이다. 다른 특정 구체예에서, 공동자극 작용제는 OX40 작용제이다. 재조합 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21로부터의 하나 이상의 재조합 사이토카인 역시도, 인큐베이션 동안 포함되어 대상체로부터의 세포 집단에서 T 세포를 초기에 확장할 수 있다. 일부 구체예에서, 공동자극 작용제와의 인큐베이션 후 또는 이와 동시에, T 세포의 집단은 또한 집단에서 T 세포의 증식을 유도하거나 매개하는 조건 하에, T 세포 자극 제제(들), 예를 들어 재조합 IL-2 단독과 또는 하나 이상의 다른 재조합 사이토카인 (예컨대 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)과의 조합과 접촉된다. 일부 구체예에서, 공동자극 제제와의 인큐베이션 후 또는 이와 동시에, T 세포의 집단은 또한 집단에서 T 세포의 증식을 유도하거나 매개하는 조건 하에, T 세포 자극 제제(들), 예컨대 항-CD3 항체(예컨대 OKT3) 또는 항-CD3/항-CD28 자극 제제, 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드와 접촉된다. 일부 이러한 태양에서, 4-1BB 작용제 또는 OX40 작용제와 같은 공동자극 작용제는 집단에서 T 세포의 증식 능력 및/또는 기능적 활성을 향상시키거나 부스트하는 초기 자극을 제공한다.
[0185] 제공된 방법에서, 이 방법은 샘플에서 T 세포의 세포자멸사를 감소 또는 방지하기 위한 조건 하에 세포자멸사 억제제와 함께 T 세포 집단에 대해 농축된 세포의 생체외 인큐베이션을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas/Fas 리간드 축의 억제제이거나 카스파제의 억제제이며, 둘 다 특히 활성화된 T 세포의 세포자멸사 유도에 관여한다. 특정 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 하나 이상의 카스파제의 억제제(카스파제 억제제로도 불림)이다. 본원에 제시된 바와 같이, 카스파제 억제제는 특히 환자 종양으로부터 또는 세포가 종양 미세환경에 존재할 수 있는 조건 하에 활성화될 때 종양 반응성 T 세포의 확장 가능성을 현저하게 개선시키는 것으로 본원에서 발견된다. 재조합 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21로부터의 하나 이상의 재조합 사이토카인은 또한, 인큐베이션 동안 포함되어 대상체로부터의 세포 집단에서 T 세포를 초기에 확장할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션 후 또는 이와 동시에, T 세포의 집단은 또한 집단에서 T 세포의 증식을 유도하거나 매개하는 조건 하에, T 세포 자극 제제(들), 예컨대 재조합 IL-2 단독 또는 하나 이상의 다른 재조합 사이토카인(예컨대 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)과 조합된 재조합 IL-2와 접촉된다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션 후 또는 이와 동시에, T 세포의 집단은 또한 집단에서 T 세포의 증식을 유도하거나 매개하는 조건 하에, T 세포 자극 제제(들), 예컨대 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3) 또는 항-CD3/항-CD28 자극 제제, 예를 들어 항-CD3/항-CD28와 접촉된다. 이러한 일부 태양에서, 세포자멸사 억제제는 T 세포를 세포자멸사로부터 보호함으로써 증식 및 확장할 집단에서 T 세포의 잠재능을 다시 활력화시킨다.
[0186] 특정 구체예에서, T 세포 아쥬반트, 예컨대 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제, 면역 체크포인트 조절제 및/또는 열 충격 단백질 억제제는 고체 표면(예컨대 비드 또는 기타 고체 지지체)에 결합되거나 부착되지 않은 단백질과 같은 가용성 단백질이다. T 세포 아쥬반트는 소분자, 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 T 세포 아쥬반트 중에는 가용성 리간드, 항체 또는 항원 결합 단편 또는 기타 결합제가 있다. 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 4-1BB 또는 OX40과 같은 공동자극 분자에 특이적으로 결합하여 세포에서 공동자극 신호를 유도하거나 자극하는 분자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 관여하거나 매개하는 수용체에 특이적으로 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD1과 같은 "체크포인트" 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 열 충격 단백질 억제제는 Hsp90과 같은 열 충격 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 분자들은 예를 들어 세포 제조와 관련하여 또는 투여를 위한 세포의 최종 제제화 전에 세포를 세척함으로써 제조 프로세스 동안 쉽게 제거될 수 있다.
[0187] 제공된 방법의 일부 구체예에서 잠재적인 종양 펩타이드의 공급원을 사용하여 종양 신생항원 펩타이드에 반응성인 T 세포의 확장을 포함하는 과정에서 신생항원에 반응성인 TCR을 확인한다. 제공된 방법에는 생물학적 샘플(예컨대 종양 단편 또는 말초혈액 또는 T 세포의 다른 공급원)로부터 확장된 T 세포의 집단을, 신생항원 펩타이드와 접촉했거나 또는 이를 제시하도록 만드는 항원-제시 세포의 존재 하에 인큐베이션하는, 생체외 공동-배양 방법이 포함된다. 특정 태양에서, T 세포 및 항원-제시 세포는 펩타이드가 확인된 종양-보유 대상체에 대해 자가(autologous)이다. 제공된 방법은 추가의 생체외 확장 전에 또는 이와 관련하여 공동 배양으로부터 종양-반응성 T 세포를 분리, 농축 및/또는 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
[0188] 도 1A는 제공된 방법에 따라 T 세포 치료 조성물을 제조하기 위한 예시적인 프로세스의 개략도를 도시한다. 이 예시적인 프로세스에서 종양 샘플은 동일한 대상체로부터 수득된 펩타이드 및 자가 항원 T 세포를 제시하는 항원 제시 세포(APC)와의 공동-배양 방법에서 사용하기 위한 펩타이드의 확인 및 생성을 위해 환자로부터 수득된다. 일부 경우에서, 예를 들어 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 말초 혈액 림프구(PBL)를 포함하는 환자의 T 세포 집단은, 주조직적합성 복합체에 대한 제시를 위해 펩타이드 네오에피토프와 접촉되거나 이에 노출된 항원 제시 세포와의 공동-배양에 앞서, 세포를 확장하는 조건 하에서 자극된다. 항원 제시 세포가 주조직적합성 복합체의 맥락에서 펩타이드를 제시하는 조건 하에서 공동-배양 후, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 연관된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(상향조절 마커 또는 반응성 T 세포 마커, 예컨대 CD70a라고도 함)에 대해 표면 양성인 T 세포는, 제공된 방법에 따라 확장을 위한 조건, 예컨대 T 세포 자극 제제(들)(예컨대 재조합 IL-2, 항-CD3 및/또는 항-CD28)과의 인큐베이션 하에, 선택 및 배양될 수 있다. 배양은 세포의 증식 및 확장을 지원하기 위해 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2)의 존재 하에 수행될 수 있다. 이 프로세스는 영양소가 포함된 무혈청 배지의 존재 하에 수행될 수 있다. 하나 이상의 단계 또는 모든 단계는 환경에 세포를 노출시키지 않는 것과 같이 폐쇄 시스템에서 수행할 수 있다. 치료 용량 또는 세포의 역치 수에 도달하면, 세포를 수확 및 제형화하고, 일부 경우에 농축 또는 동결보존하고, 주입과 같은 대상체에 투여하기 위해 사용할 수 있다. 제공된 예에서, 하나 이상의 단계는 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제, 면역 체크포인트 조절제 및/또는 열 충격 단백질 억제제와 같은 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행된다. 도 1B는 동결보존 단계가 하나 이상의 단계 후에 수행될 수 있는 예시적인 프로세스를 도시한다.
[0189] 제공된 방법은 TIL을 생성하고 확장하기 위한 기존 방법과 비교하여 이점을 제공하는데, 그 이유는 제공된 방법이 펩타이드 제시 APC와 함께 공동-배양하는 단계에 이어 하나 이상의 T 세포 활성화 마커를 상향조절한 반응성 T 세포 클론을 선택하는 것과 같이 종양 반응성 세포를 농축하는 단계를 포함하기 때문이다. 이 과정 덕분에 생물학적 샘플(예컨대 종양)에서 확장된 종양-반응성 T 세포의 초기 소규모 집단은 후속적인 2차 확장 단계 전에 종양 반응성 세포이거나 종양 반응성 세포일 가능성이 있는 세포에 대해 농축되고, 그에 따라, 관심 세포의 보존 및 확장을 촉진하고 종양 항원에 반응성이 아닌 및/또는 억제 활성을 나타내는 세포를 포함할 수 있는 방관자 T 세포의 확장을 제한할 수 있다(도 2A). 이것은 종양으로부터의 모든 T 세포를, 예컨대 높은 IL-2 농도로 초기 1차 확장시킨 다음, 초기 확장 푸에 존재하는 T 세포를 급속하게 2차 확장시키는 기존 방법과 대조적이다. 그러한 다른 방법에서, 총 생존가능 세포(TVC)는 이러한 대안적 프로세스에 의해 크게 확장될 수 있지만, 종양-반응성 T 세포가 우세하게 증식되도록 적극적으로 보장하는 단계는 없다(도 2B). 또한, 제공된 방법은, 예를 들어 펩타이드-제시 APC와 함께 첫 번째 확장 후에 증식된 모든 세포를 공동-배양한 다음, 공동-배양 후 모든 벌크 세포 중에서, 후속적인 2차 확장 전에 하나 이상의 활성화 마커에 대해 양성인 세포를 선택함으로써, 수집될 수 있는 종양 반응성 세포의 수를 최대화하기 위해 수행된다. 제공된 방법의 태양에서, 이 방법의 모든 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
[0190] 제공된 방법은 생체외에서 종양-반응성 T 세포 치료 조성물을 생산하기 위한 개선되고, 보다 효율적이고/효율적이거나 보다 강력한 방법을 제공하거나 이와 관련된 하나 이상의 특징을 포함한다. 특히, 본 개시내용은 TIL 치료 세포 조성물을 생산하는데 이용가능한 방법에 비해 이점을 제공하는 방법에 관한 것이다. 이러한 이점은 예를 들어 비용 감소, 능률화, 치료 조성물에서 종양 반응성 T 세포의 개선된 농축, 및 상이한 대상체 및 종양 상태 등에 대한 것을 비롯하여, 치료 조성물의 증가된 효능을 포함한다.
[0191] 본 발명의 발견 중 하나는, 하나 또는 둘 모두의 확장 단계 동안 더 낮은 농도의 재조합 IL-2를 성공적으로 사용할 수 있다는 것이다. 기존의 많은 방법은 TIL의 T 세포 확장을 위해 6000IU/mL의 고농도 IL-2를 사용한다. 그러나, 높은 IL-2 농도는 프로세스 비용을 증가시키고 제한적일 수 있다. 일부 경우에서, 높은 IL-2 농도는 치료 T 세포 조성물에서 더 바람직할 수 있는 초기 기억 T 세포보다 이펙터 T 세포 분화를 유도함으로써 T 세포 분화에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 제공된 방법은 6000IU/mL 보다 수 배 낮은 농도, 예를 들어 약 1000 IU/mL 미만의 농도, 예컨대 약 300IU/mL 또는 약 1000IU/mL의 농도로 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, IL-2의 농도는 약 300IU/mL이다.
[0192] 제공된 방법의 구체예에서, T 세포의 집단은 T 세포를 함유하는 것으로 알려진 생물학적 샘플로부터 수득된다. 일부 구체예에서, T 세포의 집단은 대상체, 특히 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 농축된다. 생물학적 샘플은 대량의 T 세포 집단을 포함하는 모든 샘플일 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 또는 혈청 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 샘플이다. 일부 태양에서, 벌크 T 세포는 종양-침윤 T 세포(TIL)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구체예에서 대상체는 암, 바이러스 감염, 박테리아 감염을 갖는 대상체이거나, 또는 염증 상태를 갖는 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 암을 갖는다.
[0193] 제공된 방법의 여러 태양에서, 본 발명 방법의 세포의 출발 공급원은 종양 단편(예컨대 1-8 mm 직경 단편)일 수 있거나 종양 단편의 효소적 분해로부터의 단일 세포 현탁액 제제일 수 있다. 특정 공급원이 일부 종양 유형에 비해 더 우수할 수 있지만 단편 및 단일 세포 현탁액 모두 T 세포 확장 및 종양 반응성 T 세포의 농축을 지원할 수 있음이 본원에서 밝혀졌다. 일부 경우에서, 종양 세포 공급원은 종양으로부터 종양-반응성 T 세포의 확장 및 농축을 예컨대 최적화하거나 증가시키기 위해 종양 유형 또는 암에 따라 선택될 수 있다. 일례로, 암은 흑색종이고 림프구의 출발 집단은 절제된 종양과 같은 종양 단편이다. 또 다른 예에서, 암은 결장직장암이고 림프구의 출발 집단은 종양 단편의 콜라게나제에 의한 것과 같은 효소 분해에 의해 얻은 단일 세포 현탁액이다.
[0194] 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 초기에 확장된 T 세포를 펩타이드가 로딩된 자가 항원 제시 세포와 공동-배양하는 단계를 포함한다. 본원의 발견은 상대적으로 낮은 농도의 펩타이드 또는 펩타이드 풀(복수개, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 , 80, 90 또는 100개 이상, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값의 갯수의 펩타이드를 함유), 예컨대 각각의 개별 펩타이드가 20ng/mL 미만이고, 심지어 0.1 ng/mL 정도로 낮은 경우에도, 배양 중 T 세포의 활성화를 증가시킬 수 있음을 입증한다. 일부 구체예에서, 이는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(즉, 상향조절 마커 또는 반응성 T 세포 마커)에 대해 양성인 세포를 선택하기에 앞서, 공동-배양물에서 종양-반응성 T 세포의 개선된 농축으로 이어질 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 공동-배양 단계에서 T 세포를 함유하는 종양-유래 세포 대 자가 APC(예를 들어, 수지상 세포)의 비는 약 1:5 내지 약 5:1, 예컨대 1:3 내지 약 3:1, 예컨대 약 1:1이고, 개별 펩타이드 또는 펩타이드 풀로 APC를 로딩하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, APC는 개별 펩타이드 또는 펩타이드 풀의 개별 펩타이드가 평균적으로 약 20ng/mL 미만, 예컨대 약 0.1 ng/mL 내지 약 1 ng/mL, 예컨대 약 0.1 ng/mL 농도인, 펩타이드 또는 펩타이드 풀의 농도로 로딩된다.
[0195] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 T 세포의 집단을 농축하거나 선택하는 것을 포함한다. 일부 태양에서, T 세포 또는 T 세포의 특정 하위집단, 예를 들어 예컨대, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포와 같은 하나 이상의 세포 표면 마커에 양성이거나 이들을 높은 수준으로 발현하는 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다. 일부 태양에서, 농축된 T 세포는 CD4+ T 세포에 대해 농축되거나 선택된다. 일부 태양에서, 농축된 T 세포는 CD8+ T 세포에 대해 농축되거나 선택된다. 일부 태양에서, 농축된 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 농축되거나 선택된다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 CD3을 발현하는 벌크 T 세포에 대해 양성적으로 선택될 수 있다. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 CD4를 발현하는 T 세포 하위집단의 양성 선택 및 CD8을 발현하는 T 세포 하위집단의 양성 선택에 의해 동시에 또는 순차적으로 개별적으로 선택될 수 있다. CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 선택은 MHC 클래스 II 및 MHC 클래스 I을 발현하는 T 세포의 농축을 보장하여 암 항원과 같은 다양한 항원 레퍼토리를 인식할 수 있는 범종양 스캐닝 표적인 T 세포 요법을 제공한다.
[0196] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 발현이 상향조절되거나(예를 들어, 휴지기 또는 비-활성화된 T 세포에 비해) 또는 반응성 또는 활성화된 T 세포에 특이적인(이하 "반응성 T 세포 마커" 또는 T 세포 활성화 마커) 하나 이상의 마커를 기반으로 하는 CD3+ T 세포 또는 CD4 및/또는 CD8 서브세트와 같은 T 세포를 농축하는 것을 포함한다. 반응성 T 세포는 TCR이 종양의 신생항원을 인식하는 경우 처럼, 그의 내인성 TCR이 표적 세포 또는 조직의 항원을 인식할 때 특정 반응성 마커를 발현한다. 예시적인 반응성 T 세포 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256, PD-1, TIM-3 또는 LAG-3 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4개 또는 그 이상을 포함한다. 하나 이상의 이러한 반응성 T 세포 마커에 대해 양성인 세포에 대한 농축 또는 선택은 확장 방법의 하나 이상의 단계 이전 또는 도중에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 제공된 방법은 펩타이드-제시 APC(예를 들어, 수지상 세포, DC)와의 공동-배양 인큐베이션에 의한 T 세포 집단의 활성화 후 반응성 또는 활성화된 T 세포 상의 하나 이상의 상향조절 마커에 대해 양성인 세포에 대한 농축 또는 선택을 포함한다. 일부 구체예에서, 공동-배양물로부터 반응성 또는 활성화된 T 세포 상의 하나 이상의 상향조절 마커에 대해 양성인 세포를 선택하는 단계는 항원-특이적 종양-반응성 T 세포의 2배 이상의 농축 및/또는 종양-반응성 T 세포의 농축과 일치하는 TCR 클론형의 농축을 입증하는 TCR 클론성의 실질적인 감소를 초래할 수 있다. 또한, 이러한 농축된 T 세포는 선택되지 않은 T 세포 또는 공동 배양물로부터의 벌크 T 세포와 비교하여 항원-특이적 자극 후 IFN-감마를 생성하는 능력의 개선을 나타낼 수 있다.
[0197] 일부 구체예에서, 이 방법은 질병 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직이 T 세포에 의해 인식되는 항원 표적을 발현하는 것으로 알려지거나 의심되는 질병 또는 상태를 치료하기 위한 입양 세포 요법에서 사용하기 위한 T 세포를 생산하거나 확장한다. 일부 구체예에서, T 세포 요법제는 대상체의 자가 조직이다. 일부 구체예에서, T 세포 요법은 대상체에 대해 동종이계이다.
[0198] 본 출원에 언급된 특허 문서, 과학 기사 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 마치 각 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에서 설명된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 응용 프로그램, 공개된 응용 프로그램 및 기타 간행물에 설명된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본원에서 설명된 정의가 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
[0199] 본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직화 목적을 위한 것일 뿐 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
I. 생체외 확장 방법
[0200] 제공된 방법은 특히 암 치료와 관련하여 사용하기 위한 T 세포 치료 조성물의 생체외 확장 및 생산을 포함한다. 일부 구체예에서, 제조 방법은 체외에서의 환자 세포의 성장 및 조작을 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 종양-관련 항원에 특이적인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포(이하 "종양 반응성 T 세포")를 확장하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 목적 상, 종양-반응성 T 세포라 함은 종양 항원에 대해 반응성을 나타내거나, 또는 T 세포 활성화 마커의 표면 양성 발현 또는 상향조절로 인해 종양 반응성 T 세포일 가능성이 있거나 의심되는 T 세포를 포함한다. 일부 태양에서, 이들 세포의 빈도는 낮을 수 있고, 이러한 세포를 치료 용량으로 확장하기 위해서는 농축 및 확장을 위한 생체외 방법이 필요하다.
[0201] 종양-반응성 T 세포의 확장을 위한 제공된 방법은 T 세포 집단에서 T 세포의 증식을 자극하거나 유도하기 위한 일련의 확장 단계를 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 세포에 1차 및 2차(공자극) 신호를 제공하기 위해,재조합 IL-2 단독 또는 하나 이상의 다른 재조합 사이토카인(예컨대 IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)와의 조합 및 일부 경우에, 하나 이상의 다른 자극성 T 세포 제제와 인큐베이션 하는 것을 포함한다. 추가로, 일부 경우에, 세포자멸사 및 열 충격 단백질 억제제 및 면역 체크포인트 조절제를 포함하는 하나 이상의 T 세포 조절제가 사용될 수 있다. T 세포를 배양하여 세포에 1차 및 2차(공동자극) 신호를 제공하는 표준 방법은, 항-CD3(예컨대 OKT3) 및 항-CD28 시약이 제공하는 T 세포 자극 제제와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제는 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3) 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일반적으로 이러한 자극에는 세포가 신체 외부에서 생존할 수 있도록 배지를 포함하는 영양소 및 하나 이상의 추가 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)도 포함된다.
[0202] 제공된 방법에서, 이들 방법은 생체외에서 종양 반응성 T 세포를 함유하는 T 세포 집단을 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양의 적어도 일부는 약제학적 작용제 및 일부 경우에는 세포자멸사 억제제를 포함하는 추가 T 아쥬반트와의 인큐베이션 또는 열 충격 단백질 매개 경로를 포함한다. T 세포의 제조에 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 첨가는 생체외 및 생체내 T 세포의 기능성을 증가시킬 수 있다. 제공된 방법과 관련하여, 이들 방법은 원하는 치료 세포의 확장을 최대화하기 위해 종양 관련 항원에 특이적인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포("종양 반응성 T 세포")의 농축을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 관련 항원은 신생항원이거나 이를 포함한다.
[0203] 따라서, 제공된 방법 중에는 (1) 부가적인 T 세포 조절 제제들을, 항-CD3/항-CD28 및/또는 재조합 사이토카인 (예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)과 같은 표준 T 세포 자극 제제(들)의 사용 전 또는 이들의 사용과 동시에 사용하는 것을 포함하거나 및 (2) 추가로 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 농축 또는 선택을 더 포함하는 종양 반응성 T 세포의 제조를 위한 T 세포 제조 방법이 포함된다. 제공된 방법은 기존 방법보다 훨씬 더 큰 정도로 치료 용량으로의 확장을 증가시키고/시키거나 치료 효과를 위한 T 세포 요법의 기능성을 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다.
[0204] 제공된 방법은 종양 반응성 T 세포를 함유하는 것으로 알려져 있거나 그럴 가능성이 있는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수집하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양이 있는 대상체로부터 직접 수집될 수 있으며, 여기서 일부 경우에, 이러한 단리되거나 수득된 T 세포는 생체내에서 공동 배양되거나 종양에 노출될 수 있다. 제공된 방법의 구체예에서, T 세포를 함유하는 집단(이하, T 세포의 제1 집단이라고도 함)은 인간 피험체와 같은 피험체로부터의 생물학적 샘플로부터 수득, 선택 또는 단리된 T 세포 집단이다. 일부 구체예에서, T 세포를 함유하는 집단은 종양 반응성 T 세포이거나 이를 포함할 수 있거나 잠재적으로 포함할 수 있는 T 세포를 함유하는 것으로 알려지거나 함유하는 것으로 의심되는 임의의 공급원 샘플로부터 유래할 수 있다. 샘플은 종양 침윤 림프구(TIL)를 포함하는 종양 샘플, 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 혈액 샘플(예컨대 성분채집 또는 백혈구 성분채집 샘플) 또는 림프절 샘플을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 종양 샘플 또는 종양 침윤 림프구 또는 TIL을 함유하는 종양 단편이다. T 세포를 함유하는 집단은 예를 들어 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 T 세포 또는 그의 서브세트를 선택함으로써 대상체(예를 들어, 건강한 대상체 또는 암 대상체)로부터 직접 수득될 수 있다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양을 갖고 종양 반응성 T 세포를 함유하는 대상체 또는 제공된 방법에 의해 농축될 수 있는 종양 반응성 T 세포에 대한 잠재력을 갖거나 함유할 수 있는 대상체로부터 유래한다.
[0205] 종양-반응성 T 세포의 확장을 위해 제공된 방법은 T 세포를 함유하는 선택된 또는 단리된 집단(즉, T 세포의 제1 집단)을, 예를 들어, IL-2 , IL-7, IL-21 및/또는 IL-15 중 하나 이상의 재조합 사이토카인 (일반적으로 재조합 IL-2를 포함)과 함께 배양하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T 세포 자극 제제(들)은 항-CD3 (예컨대 OKT3) 및 항-CD28 시약, 예를 들어 항-CD3 항체 (예컨대 OKT3) 및 항-CD28 항체에 의해 제공되는 것과 같은, 1차 및 2차(공동자극) 신호를 세포에 추가로 제공한다. 일부 경우에, 첫 번째 확장은 또한 하나 이상의 T 세포 조절제, 예컨대, 설명된 바와 같은 TNFSFR 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 열 충격 단백질 억제제의 존재 하에 수행된다. 초기 또는 1차 확장은 제1 집단에 존재하는 T 세포의 확장 또는 증식의 결과로 T 세포가 농축된, T 세포의 제2 집단을 생성한다.
[0206] 제공된 방법의 다른 구체예에서, APC가 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에, 대상체(예컨대 건강한 대상체 또는 암 대상체)로부터 직접 수득한 T 세포가 인공 제시 세포(APC)와 함께 인큐베이션된, 생체외 공동배양을 위해 생물학적 샘플을 수집 및 사용할 수 있다. 수집된 샘플에는 종양에 존재하는 돌연변이에 반응성인 내인성 TCR이 있는 림프구가 포함되어 있다. 이들 세포는 항원 제시 세포의 존재 하에 공동-배양 또는 종양과의 공동-배양과 같은 다양한 방법을 통해 확인될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 제공된 방법에서, 종양 반응성 T 세포는 자극되거나 확장된 T 세포(즉, 제2의 T 세포 집단)를 항원 제시 세포 및 종양 항원의 네오에피토프를 포함하는 하나 또는 복수의 펩타이드(APC/펩타이드 네오에피토프)와 함께 생체외 공동-배양하는 것을 포함하는 하나 이상의 추가 단계에 의해, 제1 단계에서 확장된 자극된 T 세포로부터 추가로 동정 또는 농축될 수 있다. 제공된 방법에는 APC가 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에, 제2의 T 세포 집단이 하나 이상의 펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 펩타이드, 예컨대 합성 펩타이드에 노출되거나 접촉된 인공 제시 세포(APC)와 함께 인큐베이션되는 생체외 공동 배양이 포함된다. 일부 구체예에서, 집단 T 세포는 종양이 있는 대상체로부터의 자가 T 세포이고 합성 펩타이드의 공급원은 동일한 대상체의 종양 항원으로부터의 종양 항원성 펩타이드이다. 일부 구체예에서, 생체외 공동배양으로부터의 세포는 종양 반응성 T 세포가 풍부한 세포의 공급원을 나타내는 T 세포의 집단 (일부 경우에 T 세포의 제3 집단)을 포함한다. 일부 경우에, APC 및 펩타이드와 T 세포의 공동 배양은 또한 하나 이상의 T 세포 조절제(예컨대 TNFSFR 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제)의 존재 하에 수행될 수 있다.
[0207] 일부 경우에, 종양 반응성 T 세포는 종양-반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 세포의 분리 또는 선택에 의해 추가로 농축될 수 있다. 제공된 태양 중에서, 대상체로부터 직접 수득된 샘플 또는 생체외에서 생성된 공동-배양 샘플을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플은, 종양-반응성 T 세포 또는 하나 또는 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 T 세포에 대해 더 농축될 수 있다. T 세포 활성화 마커는 발현이 상향조절되거나 항원에 노출되어 활성화된 T 세포에 특이적인 세포 표면 마커를 포함한다. 이러한 마커의 예는 아래에 설명되어 있다. 제공된 태양에서, 종양-반응성 T 세포를 함유하는 T 세포의 집단은 제공된 방법에 따라 이러한 세포를 확장하기 전에 또는 이와 관련하여 생물학적 샘플로부터 단리, 선택 또는 농축된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포, 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 특정 활성화 마커를 발현하는 T 세포는, 종양을 갖는 것으로 알려진 암 대상체에 내인적으로 존재하는 것들이다. 다른 구체예에서, 종양-반응성 T 세포, 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 특정 활성화 마커를 발현하는 T 세포는, 종양-반응성 T 세포가 생성 및 확인될 수 있는 조건 하에서 종양 항원성 펩타이드의 공급원과, 종양이 있는 대상체로부터의 자가 T 세포를 생체외 공동-배양하여 수득된다.
[0208] 특정 구체예에서, 제2 확장은, 예컨대 종양 반응성 T 세포와 연관된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포의 분리 또는 선택 후에, 공동-배양물로부터 농축되거나 단리된 T 세포에 대해 수행된다. 제2 확장은 T 세포를 추가 자극하기 위해, 항-CD3 항체 (예컨대 OKT3), 항-CD28 항체, 및 재조합 사이토카인(들)(예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)와 같은 T 세포 자극 제제(들), 및 선택적으로 하나 이상의 T 세포 조절제(예컨대 기재된 바와 같은 공동자극 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 열 충격 단백질 억제제)와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포와 같은 T 세포는, 원하는 특정 일 수 동안 및/또는 치료 용량 또는 수확 용량이 만족될 때까지 확장되도록 허용된다. 이어서, 확장된 T 세포의 조성물을 수확하고 대상체의 암 치료를 위해 대상체에 투여하기 위해 제형화할 수 있다.
[0209] 종양-반응성 T 세포를 포함하거나 포함할 가능성이 있거나 포함할 수 있는 T 세포 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하는 프로세스에 의해 세포가 생체외에서 배양되는, 종양-반응성 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하며, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 존재 하에, T 세포의 집단을 T 세포 자극 제제(들), 예컨대 항-CD3 항체(예컨대 OKT3), 항-CD28 항체 및/또는 재조합 사이토카인(들)(예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)과 함께 인큐베이션하기 전, 이와 동시 또는 그 후에 수행된다. 기재된 바와 같은 공동자극 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 열 충격 단백질 억제제는, 제공된 방법에 따라 1차 확장 또는 2차 확장 중 한 가지 또는 두 가지 모두가 일어나는 동안 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 방법은 (a) 종양 관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 생체외 집단을, 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (b) T 세포 집단을 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 조건 하에 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 예를 들어, 1차 또는 2차 확장 중 하나 또는 양자 모두에서 T 세포를 자극 또는 확장하기 위한 인큐베이션의 적어도 일부는, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하기 전, 그와 동시에, 또는 인큐베이션 후에 수행된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션되는 T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포의 집단을 수득, 선택 또는 단리한 후의 T 세포의 제1 집단일 수 있다. 구체예들에서, T 세포의 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 풍부하다 일부 경우에, 종양-반응성 T 세포는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 전 및/또는 적어도 하나의 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 전에, T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 농축될 수 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션되는 T 세포의 집단은, APC/펩타이드 네오에피토프와의 공동-배양 후 활성화 마커를 발현하는 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포에 대해 선택되거나 이들이 농축된 T 세포 집단일 수 있다 (예컨대 일부 경우에서 T 세포의 제4 집단). 일부 구체예에서, 상기 방법은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 및/또는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션 개시 후 최대 20일까지 확장을 위한 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 배양의 적어도 일부는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 및/또는 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 동안 수행된다.
[0210] T 세포를 포함하는 샘플로부터, 종양 관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서, 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 존재 하에, T 세포의 집단을 T 세포 자극 제제(들), 예컨대 항-CD3 항체(예컨대 OKT3), 항-CD28 항체 및/또는 재조합 사이토카인(들)(예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)과 함께 인큐베이션하기 전, 이와 동시 또는 그 후에 수행되는 것인 단계를 포함하는 프로세스에 의해, 세포를 생체외 배양하는, 종양-반응성 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포는 APC가 하나 이상의 MHC-관련 비-천연 펩타이드를 제시하는 조건 하에 복수의 펩타이드들 중 하나 이상에 접촉 또는 노출된 항원 제시 세포(APC)의 존재 하에, 자극된 T 세포를 함유하는 T 세포의 집단(일부 경우 T 세포의 제2 집단)을 공동-배양한 후에 선택되거나 단리된다. 일부 구체예에서, 배양 방법은 (a) T 세포를 포함하는 생물학적 샘플, 예를 들어 T 세포 및 APC/네오에피토프 펩타이드의 공동-배양물로부터, 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 종양 반응성 T 세포가 풍부한 T 세포 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (c) 종양 반응성 T 세포가 풍부한 T 세포 집단을 세포 집단의 세포의 세포 확장을 자극하는 조건 하에 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 T 세포 자극 제제와의 인큐베이션의 적어도 일부는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 인큐베이션하기 전, 그와 동시, 또는 후에 수행되는 것인 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 및/또는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션 개시 후 최대 20일까지 확장을 위한 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 배양의 적어도 일부는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 및/또는 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 동안 수행된다.
[0211] 본원에 따라 T 세포의 집단을 T 세포 자극 제제(들), 예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15으로부터 선택된, 일반적으로 적어도 재조합 IL-2를 포함하는 예컨대 재조합 사이토카인(들)과 같은 T 세포 자극 제제(들), 및 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 인큐베이션은 T 세포의 제2 집단을 생성하기 위해 상기 집단 내 T 세포를 자극 또는 확장하는 조건 하에 수행되는 것인 단계; T 세포의 집단으로부터, 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축시킴으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 종양 반응성 T 세포가 농축된 세포 집단의 세포들을 더 자극하기 위한 조건 하에, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들), 예컨대 항-CD3 항체 (예컨대 OKT3), 항-CD28 항체 및 재조합 사이토카인(들) (예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해, pvh를 생체외에서 배양하는, 종양 반응성 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포는 APC가 하나 이상의 MHC-관련 비-천연 펩타이드를 제시하는 조건 하, 복수의 펩타이드들 중 하나 이상에 접촉하거나 노출된 항원 제시 세포(APC)의 존재 하에 자극된 T 세포를 함유하는 T 세포의 집단(일부 경우에는 T 세포의 제2 집단)을 공동-배양한 후에 선택되거나 단리된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 및/또는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션 개시 후 최대 20일까지 확장을 위한 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 배양의 적어도 일부는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 및/또는 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 동안 수행된다.
[0212] 특정 구체예에서, 제공된 방법은 비제한적인 예로서 다음 단계들, 즉 (1) 대상체의 종양에 특이적인 네오에피토프를 함유하는 다수의 펩타이드를 확인, 획득 또는 생성하는 단계; (2) 공여자 대상체로부터, 예를 들어 절제된 종양으로부터 수득되거나 또는 생물학적 샘플, 예컨대 종양, 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직 또는 체액(T 세포의 제1 집단)으로부터 T 세포를 직접 선택함으로서 T 세포의 집단을 수득하는 단계; (3) IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15로부터의 하나 이상의 재조합 사이토카인과 같은 T 세포 자극 제제(들), 및 선택적으로 TNFRSF 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제와 같은, 하나 이상의 추가 T 세포 조절 제제로 T 세포의 제1 집단을 자극하거나 활성화함으로써 1차 확장을 수행하여, 확장 또는 자극된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; (3) 복수의 펩타이드 중 하나 이상에 접촉되거나 노출된 항원 제시 세포(APC)의 존재 하에, 상기 APC가 하나 이상의 MHC-관련 비천연 펩타이드를 제시하여 T 세포의 제3 집단을 생성하는 조건 하에서 자극된 T 세포를 함유하는 제2 집단을 공동-배양하는 단계; 및 (5) T 세포의 제3 집단으로부터 항원 제시 세포(APC) 상에 존재하는 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포를 농축시켜 T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 태양에서, 내인성 TCR을 함유하는 T 세포는 T 세포의 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리함으로써 농축된다. 대안적으로 또는 추가로, 이러한 세포는 종양-반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택함으로써 농축된다. 특정 구체예에서, 2차 확장은 예를 들어 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 분리 또는 선택 후에, 공동-배양물로부터 농축되거나 단리된 T 세포에 대해 수행된다. 2차 확장은 T 세포를 추가 자극하기 위해, 항-CD3 항체 (예컨대 OKT3), 항-CD28 항체 및 재조합 사이토카인(들) (예컨대 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15)과 같은 T 세포 자극 제제(들) 및 선택적으로 하나 이상의 T 세포 조절 제제(예컨대 TNFSFR 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 열 충격 단백질 억제제)와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다.
[0213] 제공된 방법의 구체예에서, 하나 이상의 단계를 무혈청 배지에서 수행할 수 있다. 일 구체예에서, 무혈청 배지는 OpTmizer CTS (LifeTech), Immunocult XF (Stemcell technologies), CellGro (CellGenix), TexMacs(Miltenyi), Stemline (Sigma), Xvivo15 (Lonza), PrimeXV (Irvine Scientific), 또는 Stem XVivo (RandD systems)이다. 무혈청 배지는 LifeTech사의 ICSR(면역 세포 혈청 대체)과 같은 혈청 대체물로 보충될 수 있다. 혈청 대체물(예를 들어, ICSR)의 수준은 예컨대 최대 5%, 예를 들어 약 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%일 수 있다. 일부 구체예에서, 무혈청 배지는 L-알라닐-L-글루타민(Glutamax™)과 같은 L-글루타민의 디펩타이드 형태를 0.5mM 내지 5mM 함유한다. 일부 구체예에서, L-알라닐-L-글루타민과 같은 L-글루타민의 디펩타이드 형태의 농도는 약 0.5 mM 내지 5 mM, 0.5 mM 내지 4 mM, 0.5 mM 내지 3 mM, 0.5 mM 내지 2 mM, 0.5 mM 내지 1 mM, 1 mM 내지 5 mM, 1 mM 내지 4 mM, 1 mM 내지 3 mM, 1 mM 내지 2 mM, 2 mM 내지 5 mM, 2 mM 내지 4 mM, 2 mM 내지 3 mM, 3 mM 내지 5 mM, 3 mM 내지 4 mM 또는 4 mM 내지 5 mM이다. 일부 구체예에서, L-알라닐-L-글루타민과 같은 L-글루타민의 디펩타이드 형태의 농도는 2mM이거나 약 2mM이다.
[0214] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 하나 이상의 공동자극 작용제, 면역 체크포인트 조절제, 열 충격 단백질 억제제 또는 세포자멸사 억제제와 같은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은, 배양의 전체 과정 또는 그 일부 동안 독립적으로 계속된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 5일 이하, 3일 이하 또는 2일 이하 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은 독립적으로 12시간 내지 96시간, 예를 들어 24시간 내지 48시간 동안, 일반적으로 약 48시간 또는 약 48시간 동안 수행된다.
[0215] 구체예들에서, 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2) 및/또는 항-CD3/항-CD28 항체와 같은 T 세포 자극 제제(들) 각각과의 인큐베이션은 세포를 활성화하거나 자극하기에 충분한 기간동안 지속될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 일반적으로 약 1일 이상, 일반적으로 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 전술한 기간 사이의 시간 범위 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 7-10일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 7일 동안이다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 8일 동안이다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 9일 동안이다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 10일 동안이다. 일부 구체예에서, 재조합 사이토카인(예를 들어, IL-2) 및/또는 항-CD3/항-CD28 항체와 같은 T 세포 자극 제제(들) 각각과의 인큐베이션은 12시간 내지 96시간 동안, 예를 들어 24시간 내지 48시간, 일반적으로 약 48시간 동안 수행된다.
[0216] 일부 구체예에서, 세포는 배양 동안 존재하는 작용제를 제거하기 위해 및/또는 배양 배지에 하나 이상의 추가 작용제를 보충하기 위해 배양 동안 1회 이상 세척된다. 일부 구체예에서, 세포는 배양이 완료되기 전에 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 적어도 하나의 T 세포 자극 제제(들)를 감소 또는 제거하기 위해 배양 동안 세척된다.
[0217] 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트 및/또는 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션을 포함하여 본원에서 제공되는 T 세포를 배양하는 방법은 예컨대 예컨대, 적어도 약 25도씨, 일반적으로 적어도 약 30도씨, 및 일반적으로 약 37도씨와 같은, 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트 및/또는 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션을 포함하는 배양 방법은 무혈청 배지에서 수행된다.
[0218] 특정 구체예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커(예컨대 CD107, CD107a, CD039, CD137, CD59, CD90, CD38 또는 CD103)에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택함으로써, 예컨대 신생항원과 같은 종양-관련 항원을 인식하는 내인성 TCR을 갖는 T 세포를 생물학적 샘플(항원 제시 세포(APC)와의 생체외 공동 배양으로부터 또는 생체내 샘플로부터 직접 공급됨)로부터 농축하는 것을 포함한다.
[0219] 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 중 임의의 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 또는 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 모든 프로세스 작업은 GMP 스위트에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄 시스템은 세포 요법을 제조, 생성 또는 생성하기 위한 방법의 다른 처리 단계 중 하나 이상을 수행하는 데 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 처리 단계 또는 모든 단계, 예를 들어 단리, 선택 및/또는 농축, 처리, 세포의 확장과 관련된 인큐베이션을 포함하는 배양 단계, 및 제제화 단계는 시스템, 장치, 또는 통합 또는 자체 포함된 시스템 및/또는 자동화 또는 프로그래밍 가능한 방식의 장치. 일부 태양에서, 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함하며, 이는 사용자로 하여금 처리, 단리, 엔지니어링 및 제제화 단계의 다양한 태양을 프로그래밍, 제어, 평가 및/또는 조정할 수 있수 있게 해준다.
[0220] 일부 구체예에서, 제공된 중 임의의 방법에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 종양 반응성 세포 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 양성인 세포와 같은 세포의 역치 양이 될 때까지 수행되거나 및/또는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션 개시 후 최대 20일까지 수행된다. 일부 구체예에서, 배양은 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 10 내지 14일 또는 14 내지 20일 동안 수행된다.
[0221] 일부 구체예에서, 배양은 세포의 역치 양이 얻어질 때까지 수행되며, 여기서 역치 양은 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포이다.
[0222] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 상기 방법은 T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래하며, 이는 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배, 적어도 약 1000배 이상이다.
[0223] 제공된 방법의 태양에 대한 비제한적인 설명은 다음 하위 섹션에서 추가로 설명된다.
A. 네오에피토프 동정 및 펩타이드 생성
[0224] 제공된 방법은 적어도 하나의 암 특이적 암 네오에피토프를 함유하는 다수의 펩타이드(또한 "P" 또는 "n-mer"로 지칭됨)를 인실리코(in silico) 생성 또는 확인하는 단계, 및 네오에피토프 서열의 서브세트를 얻기 위해 펩타이드를 인실리코 여과하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 네오에피토프 서열의 서브세트로부터의 서열 정보를 사용하여 적어도 하나의 합성 펩타이드를 제조하고, 이어서 제공된 방법에 따라 상기 합성 펩타이드를 종양-반응성 T 세포를 농축하는 방법에 사용한다.
[0225] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포의 생체외 생성 방법은 대상체의 암 세포로부터 종양-관련 항원 또는 그의 펩타이드 서열을 동정하거나 단리하는 것을 포함한다. 암 세포는 종양 또는 암 세포를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 유래된 임의의 신체 샘플로부터 수득될 수 있다. 신체 샘플은 혈액과 같은 임의의 조직 샘플, 원발성 종양 또는 종양 전이로부터 얻은 조직 샘플, 림프절 샘플 또는 종양 또는 암세포를 포함하는 임의의 다른 샘플일 수 있다. 일부 태양에서, 이러한 암 세포로부터 핵산이 얻어지고 서열결정된다. 구체예들에서, 게놈 내 유전자의 단백질-인코딩 영역은 전체 엑솜 시퀀싱과 같이 시퀀싱된다. 종양-특이적 서열을 동정하기 위해, 시퀀싱 데이터를 참조 시퀀싱 데이터, 예컨대 동일한 대상체의 정상 세포 또는 비암성 세포를 시퀀싱하여 얻은 데이터와 비교할 수 있다. 일부 구체예에서, 차세대 시퀀싱(NGS) 방법이 사용된다.
[0226] 일부 구체예에서, 종양은 혈액 종양이다. 혈액 종양의 비제한적 예에는 급성 백혈병(예컨대 11q23-양성 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구 및 적혈구 백혈병), 만성 백혈병(예컨대 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병), 진성적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(무통성 및 고급형), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄이형 증후군, 모세포 백혈병 및 골수이형성증이 포함된다.
[0227] 일부 구체예에서, 종양은 고형 종양이다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 비제한적인 예에는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종 및 기타 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프절종양, 췌장암, 유방암(기저 유방 암종, 유관 암종 및 소엽 유방암 포함), 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선 수질 암종, 유두 갑상선 암종, 갈색 세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정액종, 방광 암종 및 CNS 종양(예를 들어 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종 , 송과체종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)이 포함된다. 몇몇 예에서, 종양은 흑색종, 폐암, 림프종 유방암 또는 결장암이다.
[0228] 일부 구체예에서, 암은 암 또는 상부 또는 하부 분해관을 포함하는 위장관(GI 관)의 암, 또는 식도, 위, 담도계, 췌장, 소장, 대장, 직장 또는 항문와 같은 분해 보조 기관을 포함하는 위장관 암이다. 일부 구체예에서, 암은 식도암, 위(위)암, 췌장암, 간암(간세포 암종), 담낭암, 점막 관련 림프 조직 암(MALT 림프종), 담도암, 결장직장암(결장암, 직장암 또는 둘 다 포함), 항문암, 또는 위장관 유암종이다. 특정 구체예에서, 암은 결장직장암이다.
[0229] 일부 구체예에서, 종양은 유관 암종 또는 소엽 암종과 같은 유방암으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 전립선암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종 또는 흑색종과 같은 피부암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 폐암, 예를 들어 선암종, 세기관지엽 암종, 대세포 암종, 또는 소세포 암종으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 교모세포종 또는 수막종과 같은 뇌암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 상기 기재된 임의의 것과 같은 위장관암으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 결장암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 간세포 암종과 같은 간암으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 췌장암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 신장 세포 암종과 같은 신장암에서 유래한다. 일부 구체예에서, 종양은 고환암에서 유래한다.
[0230] 일부 구체예에서, 암은 흑색종이 아니다. 흑색종은 일반적으로 돌연변이율이 높은 암이다. 높은 종양 돌연변이 부담은 종양 신생항원을 표적으로 하는 면역요법을 사용한 치료와 관련된 성공을 위해 특히 바람직한 예후 마커로 생각되어 왔다(Simpson et al., Journal of Clinical Oncology 2017, 35:15_suppl, 9567-9567; McGranahan et al. Science 2016, 351:1463-1469). 일부 구체예에서, 제공된 방법은 종양 반응성 T 세포를 능동적으로(수동적인 것과 대조적으로) 농축하기 위해 수행되기 때문에 더 낮은 종양 돌연변이 부담을 갖는 암에 사용될 수 있다.
[0231] 일부 구체예에서, 대상체는 8개 미만의 돌연변이의 종양 돌연변이 부하(TMB)를 갖는 대상체이다. TMB는 하나의 종양 당 비동의 돌연변이의 수를 포함한다. 일부 구체예에서, TMB는 0.8 내지 1.2 메가염기(Mb) 영역에 걸쳐 동의 및 비동의 돌연변이의 수를 계수하고 그 결과를 돌연변이/Mb로서 보고함으로써 계산될 수 있다. 일부 구체예에서, TMB는 종양 조직 샘플에 대한 차세대 서열분석(NGS)에 의해 결정될 수 있다. 경우에 따라 전체 엑솜 시퀀싱을 사용하거나 컴퓨터 생식계열 상태 필터링을 사용할 수 있다(Chalmers et al. Genome Med 2017 9:34). 일부 구체예에서, 대상체는 약 60 돌연변이/Mb 이하, 예를 들어 약 55 돌연변이/Mb 이하, 약 50 돌연변이/Mb 이하, 약 45 돌연변이/Mb 이하, 약 40 돌연변이/Mb, 약 30 돌연변이/Mb 이하, Mb 당 약 25 돌연변이 Mb 이하, 약 20 돌연변이/Mb 이하, 또는 상기 수치들 사이의 임의의 값의 TMB를 갖는다. 일부 구체예에서, 대상체는 약 41 돌연변이/Mb 이하, 약 40 돌연변이/Mb 이하, 약 39 돌연변이/Mb 이하, 약 38 돌연변이/Mb 이하, 약 37 돌연변이/Mb 이하의 TMB를 갖는다.
[0232] 일부 구체예에서, 펩타이드(P)는 상피내 암종, 또는 외음부 상피내 종양, 자궁 경부 상피내 종양, 또는 질 상피내 종양의 변이체와 같은 전암성 상태로부터 유래된 종양 관련 항원이다.
[0233] 일부 태양에서, 종양 또는 암의 이러한 세포로부터 핵산이 얻어지고 서열결정된다. 여러 구체예에서, 게놈 내 유전자의 단백질-코딩 영역은 전체 게놈 시퀀싱 데이터, 엑솜 시퀀싱 데이터 및/또는 전사체 데이터의 분석과 같은 오믹스(omics) 분석에 의해 얻어진다. 종양 특이적 서열을 확인하기 위해, 시퀀싱 데이터는 동일한 대상의 정상 세포 또는 비암성 세포에서 얻은 데이터와 같은 참조 시퀀싱 데이터와 비교할 수 있다. 일부 구체예에서, 차세대 시퀀싱(NGS) 방법이 사용된다.
[0234] 일부 구체예에서, 이들 방법은 종양의 맷칭되는 정상 오믹스 데이터를 사용하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 인실리코 분석은 동일한 환자의 비-질병 조직과 같은 동일한 환자의 정상 조직과 비교하여 종양의 돌연변이를 확인하기 위한 오믹스 분석을 포함한다. 맷칭되는 정상 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터, 엑솜 시퀀싱 데이터 및/또는 전사체 데이터이고, 일치된 정상 오믹스 데이터는 환자의 치료 전에 정상에 대해 일치하는 것으로 일반적으로 고려된다. 특정 구체예에서, 전체 엑솜 시퀀싱은 종양과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하기 위해 건강한 조직 및 질병에 걸린 조직에서 수행된다.
[0235] 일부 구체예에서, 오믹스 데이터는 표준 조직 처리 프로토콜 및 시퀀싱 프로토콜에 따라 하나 이상의 환자 생검 샘플로부터 획득된다. 특정 구체예에서, 데이터는 환자 맷칭된 종양 데이터(예를 들어, 종양 대 동일한 환자 정상)이다. 일부 경우에, 비-맷칭 또는 맷칭된 경우 대 다른 참조(예를 들어, 이전의 동일한 환자 정상 또는 이전의 동일한 환자 종양, 또는 동종 통계)도 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 오믹스 데이터는 새로운 오믹스 데이터 또는 이전 절차(또는 다른 환자)로부터 얻은 오믹스 데이터일 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프는 종양 생검(또는 전이 부위의 림프 생검 또는 생검) 및 맷칭된 정상 조직(즉, 말초 혈액과 같은 동일한 환자로부터의 병에 걸리지 않은 조직)의 전체 게놈 및/또는 엑솜 분석에 의해, 첫번째 단계에서 환자 종양으로부터 동정될 수 있다. 일부 구체예에서, 게놈 분석은 그렇게 획득된 오믹스 정보의 위치-가이드된 동기 비교를 통해 처리될 수 있다.
[0236] 게놈 분석은 임의의 수의 분석 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 차세대 시퀀싱, 예를 들어 대규모 병렬 시퀀싱, 이온 급류 시퀀싱, 파이로시퀀싱을 사용하는, 종양 및 일치된 정상 샘플 모두의 WGS(전체 게놈 시퀀싱) 및 엑솜 시퀀싱을 포함한다. 서열 데이터의 전산 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 데이터 포맷은 SAM, BAM, GAR, 또는 VCF 포맷이다. 예를 들어, 분석은 예를 들어 BAM 파일 및 BAM 서버를 사용하여 US 2012/0059670A1 및 US 2012/0066001 A1에 개시된 바와 같이 종양 및 정상 샘플의 위치-가이드된 동기 정렬에 의해 인실리코 수행될 수 있다. 서열 분석을 위한 대체 파일 포맷(예컨대 SAM, GAR, FASTA 등) 역시도 고려된다.
[0237] 임의의 일부 구체예에서, 미스센스 돌연변이로부터 발생하는 신생항원을 포함하는 펩타이드(P)는 1개 이상의 뉴클레오타이드 다형성에 의해 인코딩되는 아미노산 변경를 포함한다. 프레임시프트 돌연변이, 스플라이스 부위 변이체, 삽입, 역위 및 결실로부터 발생하는 신생항원을 포함하는 펩타이드(P)는 신규 펩타이드 서열 및 신규 펩타이드 서열의 접합부를 포함한다. 새로운 번역 후 변형이 있는 신생항원을 포함하는 펩타이드(P)는 포스페이트 또는 글리칸과 같은 번역 후 변형(들)을 포함하는 아미노산을 포함한다.
[0238] 일단 이들 돌연변이가 확인되면, 네오에피토프가 확인된다. 네오에피토프는 환자의 T 세포에 의해 인식되는 돌연변이 펩타이드이다. 이러한 네오에피토프는 MHC 복합체에 의해 종양 또는 항원 제시 세포에 의해 제시되어야 하고 T 세포 상의 TCR에 의해 인식되어야 한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 종양 및 환자에 특이적인 네오에피토프를 정의하기 위해 하나 이상의 네오에피토프를 계산하는 단계를 포함한다. 결과적으로 환자 및 암 특이적 네오에피토프는 환자 및 종양 유형에 고유한 잠재적 에피토프를 궁극적으로 예측하는 독점적인 인실리코 환경에서 오믹스 정보로부터 식별될 수 있음을 인식해야 한다. 특정 태양에서, 이렇게 확인된 암 네오에피토프는 환자 및 환자의 특정 암에 고유하지만(예를 들어, 모든 네오에피토프의 0.1% 미만, 보다 전형적으로 진단된 암 환자 집단에서 0.01% 미만의 빈도를 갖는다), 그렇게 확인된 암 네오에피토프는 종양에서 제시될 가능성이 높다.
[0239] 임의의 일부 구체예에서, 펩타이드(P)의 길이는 특정 용도에 따라 달라지며 전형적으로 약 5 내지 약 50개 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 펩타이드(P)는 약 7 내지 35개의 아미노산, 예를 들어, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 아미노산 사이이다. 일부 태양에서, 이 방법은 아미노산 서열의 변경(들)(예를 들어, 돌연변이)를 포함하는 개별 펩타이드로 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 이 방법은 풀의 펩타이드가 아미노산 서열의 변경(들)(예를 들어, 돌연변이)를 함유하는 펩타이드 풀로 수행될 수 있다. 펩타이드 풀은 수십에서 수백 개의 개별 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 펩타이드의 풀은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 개별 펩타이드, 또는 전술한 임의의 수치 범위 내의 임의의 값의 펩타이드를 포함한다. 펩타이드의 풀은 하나의 신생항원을 나타내거나 여러 신생항원을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 펩타이드 풀은 동일한 신생-항원의 다중 중첩 펩타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 종양-관련 항원의 경우, 항원은 7 내지 35개 아미노산, 예를 들어 25개 아미노산, 펩타이드(P)로 분할될 수 있으며, 여기서 각각의 펩타이드(P)는 독특한 아미노산 조성을 함유하거나; 또는, 펩타이드(P)는 항원이 7 내지 35개 아미노산, 예를 들어 25개 아미노산, 중첩 서열을 갖는 세트 수로 분할되는 중첩 펩타이드 풀일 수 있다. 예를 들어, 100개 아미노산 항원을 포함하는 중첩 펩타이드 풀은 각각 12개 아미노산으로 오프셋된 8개의 25개 아미노산 펩타이드(P)로 나뉠 수 있다(즉, 100개 아미노산 펩타이드 서열을 포함하는 각각의 후속 25개 아미노산 펩타이드는 이전 펩타이드의 13번째 아미노산 위치에서 시작한다). 당업자는 어떤 항원으로부터 펩타이드 풀을 생성하는데 있어서 많은 순열이 존재한다는 것을 이해한다.
[0240] 본원에서 고려되는 네오에피토프 서열은 비교적 짧은 길이(예를 들어, 5-30머, 보다 전형적으로 7-11머, 또는 12-25머)를 갖는 서열 스트레치로서 정의될 수 있으며, 여기서 이러한 스트레치는 아미노산 서열의 변경(들)(예를 들어 돌연변이)를 포함한다. 가장 일반적으로, 변경(들)은 중심부 또는 중심부 근처에 위치한다(예컨대 중심부 위치에서 4개 미만, 또는 5개 미만, 또는 6개 미만의 아미노산). 특정 태양에서, 본원에서 고려되는 네오에피토프 서열은 특히 단일 아미노산이 맷칭된 정상 서열에 대해 교환된 것들 및 변경된 아미노산의 위치가 네오에피토프 서열의 중심부 또는 중심부 근처에 위치하는 것을 포함할 것이다(예컨대 9-mer에서, 변경된 아미노산은 위치 2, 3, 4 또는 5에 있고, 보다 전형적으로는 위치 3, 4 또는 5에 있으며, 가장 전형적으로는 위치 4 또는 5에 있다). 변경된 아미노산의 위치에 따라 변경된 아미노산을 포함하는 수많은 네오에피토프 서열에 단일 아미노산 변경이 나타날 수 있음을 이해해야 한다.
[0241] 특정 구체예에서, 네오에피토프는 2-50개 아미노산, 보다 일반적으로 5-30개 아미노산, 가장 일반적으로 9-15개 아미노산의 길이를 갖는 것으로 계산될 것이다. 예를 들어, 에피토프가 MHC-I 복합체에 의해 제시되는 경우, 전형적인 에피토프 길이는 약 8-11개의 아미노산일 것인 반면, MHC-II 복합체를 통한 제시를 위한 전형적인 에피토프는 약 13-17개 아미노산 길이를 가질 것이다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 네오에피토프에서 변경된 아미노산의 위치가 중심이 아닐 수 있기 때문에 실제 펩타이드 서열과 그에 따라 네오에피토프의 실제 토폴로지가 상당히 달라질 수 있다. 더욱이, 네오에피토프가 합성 펩타이드로서 면역 적격(또는 다른) 세포에 제시되는 경우, 그 합성 펩타이드는 세포에서 단백질분해 프로세싱을 허용하기 위해 MHC-I 또는 MHC-II 시스템에 의해 궁극적으로 결합되는 펩타이드 부분보다 상당히 길 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 고려되는 합성 펩타이드는 따라서 변경된 아미노산의 상류 및 하류로부터 8 내지 15개의 아미노산을 가질 수 있다.
[0242] 다양한 알고리즘이 개발되었으며 다양한 기원의 단백질 분자 내에서 T 세포 에피토프(MHC 클래스 I 및 클래스 II 제한됨)를 매핑하는 데 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 많은 프로그램은 MHC-결합제를 비-결합제로부터 구별하기 위해 기계 학습(ML) 기반 분류기를 훈련시키기 위해 실험 측정으로부터의 대규모 펩타이드-MHC 결합 친화성 매트릭스의 가용성을 활용한다(예컨대 Zhao et al. (2018) PLoS Comput Biol 14(11): e1006457 참조). MHC 클래스 I(예컨대 9-mer)에 대한 예시적인 예측자 방법에는 smm, smmpmbec, ann (NetMHC3.4), NetMHC4, PickPocket, consensus, NetMHCpan2.8, NetMHCpan3, NetMHCpan4, NetMHCcons, mhcflurry, mhcflurry_pan, 또는 MixMHCpred이 포함된다. MHC 클래스 II(예컨대 15-mer)에 대한 예시적인 예측자 방법은 NetMHCIIpan, NetMHCII2.3, nn_align, smm_align, consensus, comblib, tepitope, 또는 mhcflurry를 포함한다. 이들 방법 중 어느 것이든 사용가능하다.
[0243] 합성 펩타이드가 직접적인 MHC-1 결합에 사용되는 구체예에서, 전체 길이는 8 내지 10개 아미노산일 것이다. 합성 펩타이드가 직접적인 MHC-II 결합을 위해 사용되는 구체예에서, 전체 길이는 12 내지 25개 아미노산, 예를 들어 14개 내지 20개 아미노산일 것이다. MHC 제시 전에 합성 펩타이드가 세포에서 처리되는(전형적으로 프로테아좀 처리를 통해) 일부 경우에서, 전체 길이는 일반적으로 10 내지 40개 아미노산이 될 것이며, 변경된 아미노산은 합성 펩타이드 내 중심 위치 또는 중심부 근처에 있을 것이다. 일부 구체예에서, MHC-1 결합을 위한 펩타이드는 9-mer이다. 일부 구체예에서, MHC-II 결합을 위한 펩타이드는 23-mer이다. 일부 구체예에서, MHC-II 결합을 위한 펩타이드는 25-mer이다.
[0244] 일례로서, 펩타이드(P)는 돌연변이로 인해 발생하는 아미노산 변경 또는 신규 정션에 인접하는 양측부에 0-25개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 펩타이드(P)는 단일 뉴클레오타이드 다형성으로부터 발생하는 아미노산 변경에 인접하는 양측부에 12개 아미노산을 포함하는 신생항원 서열, 예컨대 25개 아미노산 펩타이드이며, 여기서 13번째 아미노산은 단일 뉴클레오타이드 다형성으로 인한 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, 펩타이드(P)는 신규한 번역후 변형으로부터 발생하는 아미노산에 인접하는 양측부에 12개 아미노산을 포함하는 신생항원 서열, 예컨대 25개 아미노산 펩타이드이며, 여기서 13번째 아미노산은 단일 뉴클레오타이드 다형성으로 인한 아미노산 잔기이다. 또 다른 구체예에서, 펩타이드(P)는 삽입, 결실 또는 역위에 의해 생성되는 신규한 정션에 인접하는 양측측부에 0-12 아미노산을 포함한다. 일부 경우에서, 신규한 서열로부터 결과되는 신생항원을 포함하는 펩타이드(P)는 또한 발생할 수 있는 신규 정션의 양측부에 있는 0-25개의 아미노산을 포함하는 전체 신규 서열을 포괄할 수 있다.
[0245] 일부 구체예에서, 암 및 환자 특이적 돌연변이에 기초한 새로운 펩타이드 서열을 유도하는 것들을 확인하기 위해 그렇게 확인된 서열 차이에 대해 추가 다운스트림 분석을 수행할 수 있다. 따라서 네오에피토프는 돌연변이의 유형(예컨대 결실, 삽입, 전이, 전이, 전위) 및 돌연변이의 영향(예컨대 넌센스, 미스센스, 프레임 이동 등)을 고려하여 식별될 수 있으며, 그 자체로 그를 통해 침묵 돌연변이 및 기타 관련되지 않은(예컨대 발현되지 않은) 돌연변이가 제거되는 콘텐츠 필터로서 기능할 수 있다.
[0246] 일부 구체예에서, 확인된 네오에피토프는 확인된 환자 HLA-형에 대해 인실리코(in silico)에서 추가로 여과될 수 있다. 이러한 HLA-맷칭은 유핵 세포의 MHC-I 복합체 및 특정 항원 제시 세포의 MHC-II 복합체에 대한 네오에피토프의 강한 결합을 보장하는 것으로 생각된다. 두 항원 제시 시스템 모두를 표적으로 하는 것은 특히 면역계의 세포 및 체액 분지를 포함하는 치료적으로 효과적이고 지속적인 면역 반응을 생성하는 것으로 생각된다. 이와 같이 확인된 HLA-맷칭된 네오에피토프는 시험관 내에서 생화학적으로 검증될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
[0247] MHC-I 및 MHC-II 모두에 대한 HLA 결정은 다양한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구체예에서, HLA-유형은 공지된 및/또는 일반적인 HLA-유형의 대부분 또는 전부를 포함하는 참조 서열을 사용하여 오믹스 데이터로부터 인실리코 예측될 수 있다. 예를 들어, 환자의 HLA 유형이 확인되고(습식 화학 또는 in silico 결정을 사용하여) HLA 유형에 대한 구조 솔루션을 계산하거나 데이터베이스에서 얻은 다음, 이를 인실리코 도킹 모델로 사용하여 HLA 구조 솔루션에 대한 네오에피토프의 결합 친화도를 결정한다. 결합 친화도의 측정에 적합한 시스템에는 NetMHC 플랫폼(예컨대 Nucleic Acids Res. 2008 Jul 1; 36(Web Server issue): W509-W512 참조.), HLAMatch마커 (http://www. epitopes.net/downloads.html), 및 IEDB Analysis Resource (http://tools.immuneepitope.org/ mhcii/)이 포함된다. 이어서 앞서 결정된 HLA에 대해 높은 친화도(예컨대 MHC-I의 경우 100nM 미만, 75nM 미만, 50nM 미만; MHC-II의 경우 500nM 미만, 300nM 미만, 100nM 미만)를 갖는 네오에피토프들이 선택된다. 가장 높은 친화도를 계산할 때, 네오에피토프에 대한 변형은 환자의 HLA-유형에 대한 합성 네오에피토프의 결합을 추가로 증가시키기 위해 에피토프에 N- 및/또는 C-말단 변형을 추가함으로써 구현될 수 있다. 따라서, 네오에피토프는 확인된 대로 고유하거나 특정 HLA 유형과 더 잘 일치하도록 추가로 수정될 수 있다. 일부 구체예에서, 네오에피토프는 대립유전자 빈도에 백만 개당 전사체를 곱하여 가능성 점수를 얻음에 기초하여 점수화/순위화될 수 있다. 그런 다음 이 점수는 HLA 정보와 환자의 HLA 유형에 대한 계산된 또는 실제 결합 친화도를 사용하여 추가로 증가될 수 있다.
[0248] 제공된 구체예 중에는 인간-동일 서열의 사용을 피하기 위해 공지된 인간 서열을 함유하는 데이터베이스와 네오에피토프를 비교하는 구체예가 있다.
[0249] 적합한 네오에피토프 서열의 인실리코 확인 후, 상응하는 합성 펩타이드를 시험관내(예를 들어, 고체상 합성을 사용하여) 제조된다. 특정 구체예에서, 대상체로부터의 복수의 상이한 네오에피토프를 나타내는 합성 펩타이드의 라이브러리가 제조된다. 라이브러리는 100, 1000, 10000 또는 그 이상의 상이한 펩타이드를 포함할 수 있다. 확인된 네오에피토프(들)에 대한 합성 항체를 얻기 위해, 인 실리코 동정된 것을 시험관 내에서 제조하여 합성 펩타이드를 생성하는 것을 고려한다.
[0250] 합성 펩타이드를 제조하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 네오에피토프 서열을 갖는 펩타이드는 고체상에서 (예를 들어, Merrified 합성을 사용하여), 액체상 합성을 통해, 또는 더 작은 펩타이드 단편으로부터 제조될 수 있다. 펩타이드 에피토프는 시판되는 자동화 펩타이드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 예를 들어 Lu et al (1981).J. Org. Chem. 46,3433 및 그에 인용된 참고 문헌에 기재된, 고상 펩타이드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드를 이용하여 합성될 수 있다. 일부 태양에서, 펩타이드는 적합한 숙주 및 적합한 발현 시스템에서 재조합 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다. 일부 태양에서 펩타이드는 적절한 발현계를 이용하여 적절한 숙주에서 재조합 핵산의 발현에 의해 제조될 수 있다. 일부 태양에서, 재조합 방법은 다중 네오에피토프가 단일 펩타이드 사슬에 있는 경우, 예를 들어 네오에피토프 또는 절단 부위 사이에 스페이서가 있는 경우에 사용될 수 있다.
[0251] 펩타이드는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 분리를 이용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 정제될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 침전되고 추가로 정제될 수 있다. 펩타이드 분석은 박층 크로마토그래피, 전기영동, 특히 모세관 전기영동, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 충격(FAB) 질량 분광 분석, MALDI 및 ESI-Q-TOF 질량 분광 분석을 사용하여 수행할 수 있다.
B. 종양-반응성 T 세포를 함유하는 세포 샘플
[0252] 제공된 방법은 T 세포의 제1 또는 인풋 집단으로서 사용하기 위해 생물학적 샘플로부터 T 세포 집단을 획득하고 농축하거나 선택하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T 세포의 제1 집단은 종양 항원에 반응성인 T 세포를 포함하는 것으로 알려져 있거나 포함할 가능성이 있는 것 또는 예를 들어 종양 항원의 자가 공급원과의 생체외 공동-배양 후, 종양 항원에 대해 반응성일 수 있는 것이다. 예를 들어, 일반적으로 T 세포의 제1 집단은 종양 또는 종양이 있는 것으로 알려졌거나 있을 가능성이 있는 대상체의 생물학적 샘플에서 유래한다. 특정 구체예에서, T 세포의 제1 집단은 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)(예를 들어, IL-2와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인) 및 일부 경우 하나 이상의 T 세포 아쥬반트로 추가로 자극되어 자극 후 확장된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제2 집단 또는 자극된 T 세포 집단을 생성한다.
[0253] 일부 경우에, 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들) 및 일부 경우에는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 배양에 의해 T 세포를 자극하기 위한 조건은 T 세포의 제1 집단 또는 인풋 집단에 존재하는 T 세포의 확장 또는 과성장을 초래한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들), 및 일부 경우에 하나 이상의 T 세포 아쥬반트로 T 세포를 자극하기 위한 조건은 T 세포의 벌크 확장을 초래하는 조건 하에 T 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 세포. 다른 특정 구체예에서, T 세포를 자극하기 위한 조건은 바람직하지 않을 수 있는 특정 T 세포 서브세트를 최소화하거나 감소시키면서 원하는 T 세포의 우선적 또는 선호되는 농축 또는 과성장을 초래하도록 수행되는 조건 하에 T 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
[0254] 제공된 방법에서, T 세포의 자극된 조성물은 그 다음 항원 제시 세포(APC)와 자극된 T 세포의 공동-배양을 포함하는 단계를 포함하는 종양 반응성 T 세포의 농축 및 확장을 위한 후속 다운스트림 단계에서 사용된다 T 세포 네오피토프(돌연변이) 펩타이드 항원의 존재 하에 종양 반응성 T 세포인 T 세포를 생성, 산출 또는 제거한다. 특정 구체예에서, 제공된 방법은 또한 T 세포를 APC/펩타이드 네오에피토프와 공동-배양한 후, 종양 항원에 반응성인 T 세포(종양-반응성 T 세포)를 선택하거나 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 종양 반응성 T 세포 집단은 치료 T 세포 조성물을 생산하기 위한 것과 같은 확장을 위한 조건 하에 배양될 수 있다.
[0255] 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양-반응성 T 세포가 생체내에서 종양 신생항원에 노출되거나 이에 의해 활성화된 종양-반응성 T 세포로 알려져 있거나 포함할 가능성이 있는 종양을 갖는 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플로부터 T 세포를 선택하는 것은 종양-반응성 T 세포와 연관된 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포를 농축하거나 선택하는 것을 추가로 포함한다. T 세포 활성화 마커는 그의 발현이 상향조절되거나, 항원에 노출되어 활성화된 T 세포에 특이적인 세포 표면 마커를 포함한다. 예시적인 마커는 아래 섹션 I.D에 설명되어 있다.
[0256] 제공된 방법 중 임의의 태양에서, T 세포의 인풋 또는 제1 집단은 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)가 세포를 활성화 또는 자극하거나 T 세포의 인풋 또는 제1 집단에 존재하는 T 세포의 확장을 촉진하는 조건 하에 수행된다.
[0257] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)은 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21과 같은 재조합 T 세포 자극 사이토카인을 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 사이토카인은 IL-2를 단독으로 또는 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21 중에서 선택된 다른 사이토카인과 조합하여 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 사이토카인은 IL-7 및 IL-15이다.
[0258] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 CD3 및 공동자극 분자, 예컨대 CD28에 관여하는 작용제 또는 작용제들을 포함할 수 있다. T 세포 자극 제제(들)는 항- OKT3과 같은 CD3 항체 및 항-CD28 제제(APC에 의해 또는 가용성 항체로 제시됨). 구체예들에서, T 세포와 APC와의 공동-배양의 적어도 일부 동안 및/또는 전에, 생물학적 샘플(즉, 인풋 또는 제1 집단)에서 선택된 T 세포는 항-CD3(예컨대 OKT3)/항-CD28 항체와 같은 T 세포 자극 제제의 존재 하에 배양된다. 따라서, APC 존재 하에서의 공동배양 전 또는 반응성 세포의 선택 후, T 세포를 비제한적인 예로서 항-CD3 항체(예컨대 OKT3) 및 항-CD28(APC에 의해 제시되거나 또는 가용성 항체로서 제시됨)와 같은 림프구의 하나 이상의 T-세포 자극 제제와 함께 인큐베이션하여, 활성화되거나 자극된 T 세포를 포함하는 T 세포의 제2 집단을 생성한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인 역시도 인큐베이션 동안 추가 T 세포 자극 제제로서 존재한다.
[0259] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 선택된 T 세포의 인풋 또는 제1 집단에서 직접 수행되며, 여기서 상기 생물학적 샘플(예컨대 대상체의 자가 T 세포)로부터 선택된 T 세포의 집단은 샘플은 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션된다. 다른 구체예에서, T 세포의 인풋 집단은 종양 반응성 T 세포일 가능성이 있거나 의심되는 T 세포를 포함하며, 여기서 이러한 세포는 활성화된 T 세포(예컨대 4-1BB 또는 OX40)에서 상향조절되는 표면 마커에 대해 양성인 세포를 선택함으로써 대상체의 생물학적 샘플로부터 선택된다. 이러한 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단에 대한 농축 후에 수행된다. 제공된 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 이러한 T 세포(자극된 T 세포)를 APC/펩타이드 네오에피토프와 공동배양하기 전에 수행된다.
1. T 세포 집단의 선택
[0260] 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 T 세포의 집단을 선택하거나 획득하는 것을 포함하며, 이는 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)(예컨대 재조합 IL-2 및/또는 항-CD3/항-CD28)을 이용한 자극에 있어 T 세포 공급원 또는 인풋으로서, 그리고 일부 제공된 구체예에서, T 세포 조절 제제(예컨대 T 세포 작용제 또는 세포자멸사 억제제)로서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 종양 반응성 T 세포를 함유하는 것으로 알려져 있거나 포함할 가능성이 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 수집된 생물학적 샘플에는 종양에 존재하는 돌연변이에 반응하는 내인성 TCR이 있는 림프구가 포함되거나 포함되는 것으로 의심된다.
[0261] 제공된 구체예 중 임의의 태양에서, 대상체, 예를 들어 관심 환자, 즉 암에 걸린 것으로 의심되거나 암이 있는 것으로 알려진 환자로부터 적합한 생물학적 샘플이 수득된다. 일부 구체예에서, 샘플은 종양 관련 항원에 특이적이거나 이에 결합하거나 이를 인식하는 내인성 T 세포 수용체(TCR)를 발현할 수 있거나 발현할 가능성이 있는 T 세포와 같은 T 세포를 함유하는 것으로 알려지거나 의심되는 것이다. 샘플은 이러한 T 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 모든 초기 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 태양에서 관심 있는 생물학적 샘플 공급원에는 조직 유래 샘플, 예컨대 균질액, 혈액 또는 이의 유도체와 같은 많은 다른 생리학적 공급원이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
[0262] 다양한 샘플 중 임의의 것이 잠재적으로 반응성인 T 세포의 공급원으로 사용될 수 있다. 종양 및 하류 림프절이 반응성 T 세포의 빈도가 가장 높을 수 있지만(Powell et al., Clin. Cancer. Res., 2014), 다른 샘플 공급원도 사용할 수 있다. 어떤 경우에는 샘플이 종양 샘플, 3차 림프구 부위, 배수 림프절, 말초 혈액 또는 골수이다. 일부 구체예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 일부 구체예에서, 샘플은 림프 샘플이다. 일부 구체예에서, 샘플은 말초 혈액 샘플이다.
[0263] 샘플에는 조직, 체액 및 피험자로부터 직접 채취한 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 예를 들어 분리, 선택 또는 농축, 원심분리, 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원에서 직접 얻은 시료 또는 처리된 시료일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 장기 샘플(이로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
[0264] 일부 태양에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집 또는 백혈구 성분채집 제품이거나 그로부터 유래된다. 예시적인 샘플로는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관, 및/또는 이로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법의 맥락에서 샘플에는 자가 및 동종이계 소스의 샘플이 포함된다.
[0265] 많은 구체예에서, 샘플은 관심 T 세포가 존재하는 것으로 적어도 의심되는 유체로부터 유래될 수 있다. 많은 구체예에서, 샘플에 대한 적절한 초기 공급원은 혈액이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액-유래 샘플이다. 혈액-유래 샘플은 전혈 또는 이의 분획, 예를 들어 혈청, 혈장 등으로부터 유래되는데, 이의 많은 구체예에서 샘플은 전혈로부터 수확된 혈액 세포로부터 유래된다. 일부 태양에서, 샘플 소스는 단핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 말초혈액 단핵구(PBMC)이거나 이를 포함하거나 PBMC에서 파생된다.
[0266] 샘플이 PBMC 유래 샘플인 일부 구체예에서, 샘플은 일반적으로 유체 PBMC 유래 샘플이다. 유체 PBMC 샘플을 생성하기 위한 편리한 임의의 방법론을 사용할 수 있다. 많은 구체예에서, 유체 PBMC 유래 샘플은 전혈로부터 PBMC를 분리함으로써, 즉, 예를 들어 원심분리(예를 들어 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의해. 이러한 분리 절차에 대한 대표적인 프로토콜이 WO 98/15646 및 미국 Pat. No. 5,985,565에 개시됨)에 의해 PBMC를 수집함으로써 제조된다.
[0267] 일부 구체예에서, 샘플은 종양 샘플이고 이에 의해 종양-침윤 림프구(TIL)의 공급원을 제공한다. 일부 태양에서, TIL은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동하거나 종양에 침투한 T 세포이다. 특정 태양에서, TIL은 종양 항원에 반응성이다.
[0268] 환자 종양 샘플은 종양 및 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻는 방법인 다양한 방법 중 어느 것에 의해 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 샘플은 외과적 절제에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 종양 샘플은 바늘 생검에 의해 수득된다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 비롯한 임의의 고형 종양으로부터 유래할 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액 악성종양으로부터 수득된 종양과 같은 액체 종양일 수 있다. 고형 종양은 유방, 췌장, 전립선, 결장직장, 폐, 뇌, 신장, 위(위장관) 및 피부(비제한적인 예로서 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색종)를 비롯한 임의의 암 유형일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 종양은 섹션 IV에 기재된 바와 같은 임의의 것이다. 일부 구체예에서, 종양 샘플은 펩타이드 네오에피토프를 제조하기 위한 신생항원을 확인하는 데 사용된 것과 동일한 종양 공급원으로부터 유래한다.
[0269] 제공된 구체예에서, 수득된 종양 샘플은 약 1 mm3 내지 약 8 mm3 크기, 예를 들어 약 1 mm3 내지 약 6 mm3, 약 1 mm3 내지 약 4 mm3, 약 1 mm3 내지 약 2 mm3. 크기의 작은 조각으로 단편화된다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 약 2-3 mm3이다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 약 1-2 mm3이다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 절개와 같은 물리적 단편화에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다.
[0270] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 수득된 종양 샘플은 약 1 mm 내지 약 8 mm 직경, 예를 들어 약 1 mm 내지 약 6 mm 직경, 약 1 mm 내지 약 4 mm 직경, 약 1 mm 내지 약 2 mm 직경의 작은 조각으로 단편화된다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 직경이 약 2-3 mm이다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 직경이 약 1-2 mm이다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 절개와 같은 물리적 단편화에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다.
[0271] 일부 구체예에서, 종양 샘플은 단편화 전에 동결보존된다. 일부 구체예에서, 종양 단편은 동결보존된다.
[0272] 일부 구체예에서, 수득된 종양 단편은 T 세포 확장을 유지하기 위한 조건, 예컨대 T 세포 자극에 대한 하기 서브섹션 IB2에 기재된 임의의 조건 하에 적절한 영양소와 함께 배양 배지에 배치된다. 일부 구체예에서, 1 내지 500개의 종양 단편(예를 들어, 각각의 크기가 1 내지 8 mm)은 확장을 위한 조건 하에 적절한 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 10, 20, 30, 40, 50개 이상의 단편이 확장 조건 하에 배양된다. 배양 용기는 마이크로웰, 플라스크, 튜브, 백 또는 기타 폐쇄 시스템 장치일 수 있다. 일부 구체예에서 배양 용기는 기체-투과성 플라스크와 같은 기체 투과성 표면을 제공하는 밀폐 용기이다. 기체 투과성 표면을 제공하는 예시적인 배양 용기로는 G-Rex 플레이트 또는 플라스크를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 1개의 종양 단편(직경 약 1-8 mm)이 배양 용기의 각각 약 2 cm2 영역에 배치된다. 이용 가능한 종양 단편의 수 및/또는 원하는 세포 수율에 따라 특정 배양 용기를 선택할 수 있다. 배양 용기(예컨대 G-Rex)의 선택은 배양 용기의 표면에 접종된 단편의 수를 선형으로 확장하여 선택할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 2 cm2(예컨대 G-Rex 24 웰 플레이트)이고 약 1개의 종양 단편(직경 약 1-8 mm)이 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 10 cm2(예를 들어, G-Rex 10 또는 G-Rex 10M)이고 약 5개의 종양 단편(각각 직경이 약 1-8 mm)이 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 100 cm2 (예컨대 G-Rex 100 M/100M-CS)이고 약 50개의 종양 단편(각각 직경이 약 1-8 mm)이 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 500 cm2 (예컨대 G-Rex 500 M/500M-CS)이고 및 약 250개의 종양 단편(각각 직경이 약 1-8 mm)이 배양 용기에 배치된다. 제공된 방법의 태양에서, 배양 용기의 크기를 증가시키고 이에 따라 예컨대, 단편들 사이에 종양간 변동성을 최소화하기 위해 더 많은 수의 단편을 풀링함으로써 용기당 종양 단편의 수를 늘리는 것은, 더 작은 배양 용기 및/또는 용기 당 더 적은 수의 단편을 이용하는 방법에 의해 변동성을 감소시킬 수 있다.
[0273] 일부 구체예에서, 종양 단편은 하기 하위섹션 I.B.2에 기재된 임의의 조건을 사용하여 세포의 자극을 위해 배양 배지에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21로부터의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 IL-12 또는 재조합 IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지이다. 재조합 사이토카인의 농도는 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 약 300 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 예를 들어 약 300 IU/mL의 재조합 IL-2를 함유하는 무혈청 배지이다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 항-CD3 항체 및/또는 CD28 표적화 제제(예를 들어, 항-CD28 항체) 및 하나 이상의 재조합 사이토카인(예를 들어, IL-2)을 함유하는 무혈청 배지이다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 섹션 II에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 T 세포 자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제를 함유한다.
[0274] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 TIL을 수득하기 위한 종양 단편의 효소적 분해에 의해 종양 단편으로부터 세포를 수득하는 것을 포함한다. 효소적 분해는 IV형 콜라게나제 또는 I/II형 콜라게나제와 같은 콜라게나제를 사용하여 수행할 수 있다. 콜라게나제와 같은 효소는 효소적 분해를 위한 배지 내에 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 예를 들어 약 1 mg/mL, 또는 약 2 mg/mL, 또는 약 3 mg/mL, 또는 약 4 mg/mL 또는 약 5 mg/mL, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 효소적 분해는 예를 들어 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 IV형 콜라게나제를 포함하는 배지를 사용한다. 일부 구체예에서, 효소적 분해는 예를 들어 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 I/II 콜라게나제를 포함하는 배지를 사용한다. 다른 구체예에서, Miltenyi 인간 종양 해리 키트로부터의 효소가 사용될 수 있다(예를 들어, Cat. O. 130-095-929; Miltenyi Biotec). 효소를 함유하는 효소 배지는 기술된 바와 같이 무혈청 배지일 수 있다. 특정 구체예에서, 효소 배지는 콜라게나제, 예를 들어 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완충제, 2 mM 글루타메이트(예를 들어, GlutaMAX), 10 mg/mL 겐타마이신, 30 유닛/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)를 포함한다. 일부 구체예에서, 효소 배지는 2mM 글루타메이트(예컨대 GlutaMAX), 10㎍/mL 겐타마이신, 면역 세포 혈청 대체물(예컨대 CTS 면역 세포 혈청 대체물) 및 1.0mg/mL 내지 5.0mg/mL의 콜라게나제를 함유하는 무혈청 배지(예컨대 OpTmizer)를 포함한다. 일부 구체예에서, 콜라게나제는 IV형 콜라게나제이다. 일부 구체예에서, 콜라게나제는 I/II형 콜라게나제이다.
[0275] 이어서, 종양 단편을 기계적으로 해부하여 예를 들어, 조직 해리기를 사용하여 TIL을 해리시킨다. 종양 분해물은 종양을 효소 배지에 넣고 기계적으로 약 1분 동안 종양을 해리시킨 다음 37℃, 5% CO2에서 30분간 배양한 다음, 전술한 조건에서 작은 조직 조각들만 나타날 때까지 기계적 해리 및 배양 주기를 반복함으로써 생성할 수 있다. 이 과정이 끝나면 세포 현탁액에 많은 수의 적혈구 또는 죽은 세포가 포함되어 있는 경우, FICOLL을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다. 미국 특허 출원 공개 No. 2012/0244133 A1에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 대안적인 방법이 사용될 수 있으며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 전술한 방법 중 임의의 것은 제공된 방법에서 사용하기 위한 TIL을 획득하는 방법에 대해 본원에 기재된 임의의 구체예에서 사용될 수 있다.
[0276] 일부 구체예에서, 종양 단편으로부터의 분해된 세포는 T 세포의 자극에 대한 하기 서브섹션 IB2에 기술된 조건과 같은 T 세포 확장을 유지하기 위한 조건 및 적절한 영양소와 함께 배양 배지에 배치된다. 세포는 특정 배양 용기에 적합한 특정 밀도로 접종된다. 배양 용기는 마이크로웰, 플라스크, 튜브, 백 또는 기타 폐쇄 시스템 장치일 수 있다. 일부 구체예에서 배양 용기는 기체-투과성 플라스크와 같은 기체 투과성 표면을 제공하는 밀폐 용기이다. 기체-투과성 표면을 제공하는 예시적인 배양 용기는 G-Rex 플레이트 또는 플라스크를 포함한다. 일부 구체예에서, 효소적으로 분해된 단일 세포 현탁액의 대략 5 x 105 내지 2 x 106 세포가 배양 용기 각 약 2 cm2 면적에 대해 접종된다. 특정 배양 용기는 이용 가능한 세포의 수 및/또는 원하는 세포 수율에 따라 선택될 수 있다. 배양 용기(예컨대 G-Rex)의 선택은 배양 용기의 표면에 접종된 세포 수를 선형으로 확장하여 선택할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 2 cm2(예를 들어, G-Rex 24 웰 플레이트)이고 효소적으로 분해된 단일 세포 현탁액의 약 5 x 105 내지 2 x 106 세포가 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 10 cm2(예컨대 G-Rex 10 또는 G-Rex 10M)이고 효소적으로 분해된 단일 세포 현탁액의 약 2.5 x 106 내지 1 x 107 세포가 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 100 cm2(예컨대 G-Rex 100 M/100M-CS)이고 효소적으로 분해된 단일 세포 현탁액의 약 2.5 x 107 내지 1 x 108 세포 배양 용기에 배치된다. 일부 구체예에서, 배양 용기의 표면적은 약 500 cm2(예컨대 G-Rex 500 M/500M-CS)이고 효소에 의해 분해된 단일 세포 현탁액의 약 1.25 x 108 내지 5 x 108 108 세포가 배양 용기에 배치된다.
[0277] 일부 구체예에서, 배양 배지는 재조합 IL-2를 함유하는 무혈청 배지이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가 T 세포 자극 제제 역시도 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 항-CD3 항체 및/또는 CD28 표적화 제제(예컨대 항-CD28 항체) 및 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2)을 함유하는 무혈청 배지이다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 섹션 II에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 T 세포 자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제를 함유한다.
[0278] 샘플은 다양한 대상체/환자/숙주로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 그러한 숙주는 "포유동물" 또는 "포유동물"이며, 여기서 이러한 용어는 육식동물(예컨대 개 및 고양이), 설치류(예컨대 마우스, 기니피그 및 쥐) 및 영장류(예컨대 인간, 침팬지 및 원숭이)를 설명하는데 널리 사용된다. 많은 구체예에서, 숙주는 인간일 것이다.
[0279] 일부 태양에서, 대상체는 인간이다. 따라서, 일부 구체예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 샘플은 세포가 제공된 방법에 따라 단리, 처리 및/또는 확장되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료 개입을 필요로 하는 환자인 대상체와 같은 치료될 대상체에 대해 자가이다. 일부 구체예에서, 샘플은 치료될 대상체에 대한 동종이계이다.
[0280] 일부 구체예에서, 제공된 방법과 관련하여 사용하기 위한 T 세포는 자성 비드 분리, 형광 세포 분류, 및 일회용 폐쇄 카트리지 기반 세포 분류기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방식으로 농축되거나 분류될 수 있다. 특정 태양에서, 반응성 세포를 선택하기 위한 T 세포 활성화 마커에 특이적인 시약과 같은 T 세포 또는 그의 서브세트에 특이적인 하나 이상의 시약이 사용될 수 있으며, 여기에는 세포 선택 장비 상의 비드, 형광 항체, 또는 나노입자가 포함되고, 이의 비제한적인 예로는 CliniMACS, Sony FX500 또는 Tyto 세포 분류 시스템(Miltenyi)을 들 수 있다.
[0281] 일부 태양에서, T 세포는 T 세포 마커 CD3, CD4 또는 CD8에 기초한 것과 같은 생물학적 샘플로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것은 이러한 마커에 기초한 분리를 위한 임의의 방법을 포함한다.
[0282] 일부 구체예에서, 분리는 친화성 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 태양에서 단리는 예컨대 항체 또는 세포 표면 마커 등의 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 결합된 항체 또는 결합 파트너를 갖는 세포를 세척 및 분리하는 단계에 의해, 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준 또는 세포의 발현에 기초하여 세포 및 세포 집단을 분리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역친화성 기반 선택은 예를 들어, CD3+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는 1차 인간 T 세포와 같은 T 세포의 벌크 집단을 함유하는 샘플 등의 세포 함유 샘플을, 세포 표면 마커 또는 마커들에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 구체 또는 비드, 예를 들어 나노입자, 마이크로비드, 아가로스 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합되어 포지티브 및/또는 네거티브 선택으로 세포 분리를 가능케 한다. 일부 구체예에서, 구체 또는 비드는 CD3+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 1차 인간 T 세포와 같은 세포 함유 샘플이, 컬럼의 매트릭스와 접촉된 후 그로부터 용출되거나 방출되는 면역친화성 크로마토그래피를 수행하기 위해 컬럼에 패킹될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 검출가능하게 표지된다.
[0283] 일부 태양에서, 분리하고자 하는 세포의 샘플 또는 조성물은 나노입자 또는 상자성 비드와 같은 자기 반응성 입자 또는 마이크로입자와 같은 작은 자화성 또는 자기 반응성 물질과 함께 인큐베이션된다. 자기 반응성 물질, 예를 들어 입자는 일반적으로, 포지티브 또는 네거티브하게 선택 분리하고자 하는 세포 또는 세포 집단에 존재하는 예컨대 표면 마커와 같은 분자에 특이적으로 결합하는 항체 등 결합 파트너에 직간접적으로 부착된다. 이러한 비드는 공지되어 있으며, 일부 태양에서 Dynabeads®(Life Technologies, Carlsbad, CA), MACS® 비드(Miltenyi Biotec, San Diego, CA) 또는 Streptamer® 비드 시약(IBA, 독일) 등 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 일부 태양에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 이에 부착된 자기 반응성 또는 자화성 입자를 갖는 세포는 자석에 끌리고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 포지티브 선택의 경우 자석에 유인되는 세포가 유지된다. 네거티브 선택의 경우 유인되지 않은 세포(표지되지 않은 세포)가 유지된다.
[0284] 특정 구체예에서, 샘플은 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합제, 예를 들어 검출가능하게 표지된 결합제와 접촉된다. 특정 구체예에서, 검출가능하게 표지된 결합제(들)은 형광 표지된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 마커에 특이적인 결합제로 표지된 T 세포는 유세포 분석에 의해 확인된다. 특정 구체예에서, 이 방법은 결합제(들)로 표지된 임의의 결과적인 T 세포를 샘플의 다른 성분으로부터 분리하여 하나 이상의 세포 표면 마커에 대해 표면 양성인 T 세포가 풍부한 조성물을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 대규모의 많은 세포 수를 처리하기에 충분히 높은 처리량을 갖는 세포 선택 분류 장비를 사용할 수 있다. 세포 분류 장비의 비제한적인 에로는 Sony FX500 또는 Tyto 세포 분류 시스템(Miltenyi)을 들 수 있다.
[0285] 인큐베이션은 일반적으로 그에 의해, 항체 또는 결합 파트너, 또는 분자, 예를 들어, 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 기타 시약이, 자성 입자 또 비드에 부착되며/부착되거나 샘플 내 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고 검출가능하게 표지되는 조건 하에 수행된다. 일부 태양에서, 항체에 결합된 세포는 샘플에서 결합되지 않은 세포로부터 회수되거나 분리될 수 있다.
[0286] 일부 태양에서, 포지티브 및 네거티브 선택의 조합은 포지티브 및 네거티브 분획이 유지되고 추가 처리되거나 추가 분리 단계의 대상이 되는 동일한 선택 단계 동안 수행된다. 이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 포지티브 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 네거티브 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두가 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 태양에서, 네거티브 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 없는 경우에 특히 유용할 수 있어 분리가 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커를 기반으로 가장 잘 수행될 수 있다.
[0287] 분리가 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 특정 유형의 세포, 예를 들어 마커를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 의미하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 특정 유형의 세포, 예를 들어 마커를 발현하는 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만, 그러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다. 예컨대, 일부 태양에서, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나의 선택은 상기 집단, CD4+ 또는 CD8+ 집단을 풍부하게 하지만, 또한 선택되지 않은 다른 세포를 일부 잔류 또는 작은 백분율로 함유할 수 있으며, 이는 일부 경우에는 농축 집단에 여전히 존재하는 CD4 또는 CD8 집단 중 다른 하나를 포함한다.
[0288] 일부 구체예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단의 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 상대적으로 더 높은 수준(markerhigh)으로 발현되거나 발현된(marker+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 배양함으로써 달성된다.
[0289] 특정 구체예에서, T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다를 포함하는 집단이다. 일부 경우에는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단이 생물학적 시료에서 분리, 선택 또는 농축된다. 많은 일반적인 상피 징후(예컨대 GI)와 같은 고형 종양을 포함한 많은 암은 클래스 I 및 클래스 II 제한된 돌연변이를 발현한다. T 세포 생성물이 그러한 적응증을 표적으로 하기 위해서는, 예를 들어, 일반적인 상피 적응증에서, 클래스 I MHC-제한 분자를 인식하는 CD8+ T 세포 및 클래스 II MHC-제한 분자를 인식하는 CD4+ T 세포 양자 모두가 필요할 것으로 상정된다.
[0290] 일부 구체예에서, 이 방법은 CD3+ 세포의 단리, 선택 및/또는 농축을 포함한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 CD4+ 및 CD8+ 세포의 단리, 선택 및/또는 농축을 포함한다. 일부 태양에서, CD4에 대한 양성 선택 및 CD8에 대한 양성 선택과 같은 CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 일부 태양에서 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 태양에서는 어느 순서로든, 차례로 수행된다. 일부 구체예에서, 이 방법은 CD3에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하거나 CD4에 대해 표면 양성인 T 세포 및 CD8에 대해 표면 양성인 T 세포에 대해 순차적 또는 동시 선택에 의해 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 농축하는 것을 포함한다. 이러한 CD3+ T 세포, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 집단은, 예컨대 섹션 I.D에 설명된 바와 같이, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 연관된 T 세포 활성화 마커의 발현을 갖는 T 세포 상에서 발현되거나 비교적 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 포지티브 또는 네거티브 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
[0291] 일부 구체예에서, 세포 또는 집단의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션되어, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거한다. 일부 예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 구성요소에 대한 저항성과 같은 하나 이상의 특성을 기반으로 분리된다.
[0292] 일부 구체예에서, 선택된 집단은 CD3+ T 세포에 대해 농축되고, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 비율로 집단 내의 총 세포의 백분율로서 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 선택된 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 풍부하고, 집단 내 총 세포의 백분율로서 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 또는 약 95% 초과의 비율로 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1이다.
[0293] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고, 선택적으로 성분채집 샘플이며, 여기서: 배양 개시시 세포의 수는 약 1 x 109 내지 7 x 109 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 1 x 109 총 생존가능 세포, 약 2 x 109 총 생존가능 세포, 3 x 109 총 생존가능 세포, 4 x 109 총 생존가능 세포, 5 x 109 총 생존가능 세포, 6 x 109 총 생존가능 세포, 또는 7 x 109 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는 배양 개시시 종양 반응성 T 세포의 백분율은 약 0.02% 내지 약 40%, 약 0.02% 내지 약 24%, 약 0.02% 내지 약 18%, 약 0.02% 내지 약 0.9% 또는 약 0.02% 내지 약 6.0%이거나; 및/또는 배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.1 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 8 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 20 x 106 T 세포, 0.3 x 106 내지 약 35 x 106 T 세포 또는 0.3 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.1 x 106 T 세포, 0.3 x 106 T 세포, 0.6 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5 x 106 T 세포, 10 x 106 T 세포, 35 x 106 T 세포 또는 60 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이다.
[0294] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 림프 공급원 샘플 또는 종양 공급원 샘플이고, 여기서: 배양 개시 시 세포의 수는 약 10 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 12 x 106 내지 43 x 106 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 10 x 106 총 생존가능 세포, 약 12 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 총 생존가능 세포, 40 x 106 총 생존가능 세포, 60 x 106 총 생존가능 세포, 또는 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는 배양 개시시 종양 반응성 T 의 백분율은 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 25% 또는 약 1% 내지 약 14%이거나; 및/또는 배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.7 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 1 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 또는 약 0.7 x 106 내지 약 5.4 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.7 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5.4 x 106 T 세포, 또는 15 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이다.
[0295] 일부 구체예에서, 선택된 T 세포는 활성화된 T 세포와 연관된 마커의 발현에 기초하여 종양-반응성 T 세포에 대해 추가로 농축될 수 있다. 이러한 종양 반응성 T 세포를 선택하거나 농축하는 데 사용하기 위한 특정 마커는 하기 섹션 I.D에서 논한다. 또 다른 경우에, 종양-반응성 T 세포의 선택 또는 농축은 하나 이상의 돌연변이된 펩타이드(펩타이드 네오에피토프)와의 공동-배양 후와 같이, 과정의 하나 이상의 하나 이상의 후속 단계에서 수행된다.
2. 초기 확장을 위한 T 세포의 자극
[0296] 제공된 방법의 태양에서, 생물학적 샘플로부터의 T 세포(절제된 종양 단편에 존재하는 것과 같은 T 세포의 인풋 또는 제1 집단)는 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하, T 세포를 확장시키는 것과 같이 T 세포를 자극하기 위한 조건 하에서 인큐베이션되거나 배양된다. 일부 경우에, 배양 또는 인큐베이션은 T 세포 작용제 또는 세포자멸사 억제제와 같은 하나 이상의 T 세포 조절제 또는 아쥬반트의 존재하에 추가로 수행된다. 일부 구체예에서, 1종 이상의 T 세포 자극 제제(들) 및/또는 T 세포 조절 제제 또는 아쥬반트와의 인큐베이션 또는 배양은, 제공된 방법의 후속 단계에서 사용하기 위해 선택된 T 세포, 또는 그의 원하는 서브세트 또는 아형 또는 그의 생존 세포의 확장 또는 과성장을 초래한다. T 세포 자극 제제(들) 및/또는 T 세포 조절 제제 또는 아쥬반트 그리고 인큐베이션 또는 배양 조건의 비제한적 예가 본원에 기재되어 있다.
[0297] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21과 같은 재조합 T 세포 자극 사이토카인을 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 사이토카인은 IL-2를 단독으로 또는 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21 중의 다른 사이토카인과 조합하여 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 사이토카인은 IL-7 및 IL-15를 포함한다.
[0298] 제공된 방법 중 임의의 것의 태양에서, T 세포의 집단은 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)가 세포를 활성화 또는 자극하거나 세포의 확장을 촉진하는 조건 하에 수행된다.
[0299] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 작용제 및 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 작용제로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD3 항체, 예컨대 OKT3이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 선택적으로 비분열 또는 광조사된 PBMC를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD28 항체이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 각각 가용성인 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체이다.
[0300] 따라서, 제공된 방법 중에는 종양 반응성 T 세포의 제조를 위해 T 세포를 배양하는 방법이 있으며, 여기서 T 세포는 공동-배양물 중에 존재하는 것과 같은, T 세포를 확장시키는 조건 하, T 세포 자극 제제의 존재 하에 배양 또는 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체이거나 이를 포함한다.
[0301] 제공된 방법의 구체예에서, 자극 조건은 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드 및/또는 T 세포에서 공동자극 신호를 켜거나 개시하는 하나 이상의 작용제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 이러한 제제는 TCR 성분, 예를 들어 항-CD3, 및/또는 공동자극 수용체, 예를 들어 항-CD28 또는 항-4-1BB에 특이적인 항체와 같은 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 제제는 가용성 항체로서 배양 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, 이러한 제제는 비드와 같은 고체 지지체에 결합된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 포함한다.
[0302] 항-CD3 항체는 T 세포의 표면 상의 CD3 수용체, 일반적으로 인간 T 세포 상의 인간 CD3에 대해 지시되거나 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함할 수 있다. 항-CD3 항체에는 무로모납(muromonab)이라고도 알려진 OKT3이 포함된다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3E로도 알려진 UHCTI 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체에는 예를 들어 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙이 포함된다. 항-CD3 항체는 가용성 시약으로 첨가되거나 비드에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 가용성이다.
[0303] 특정 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)은 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 첨가되는 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체는 약 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 약 0.5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 1 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL 또는 약 30 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도 범위로 첨가된다.
[0304] 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT3 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다.
[0305] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3 항체와의 인큐베이션 및 CD28에 특이적으로 결합하거나 세포에서 CD28-매개 신호를 자극 또는 유도하는 추가 제제와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 구체예에서, CD28-매개 신호는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 개시되거나 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, CD28-매개 신호는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 항원 제시 먹이세포(feeder cells)(APC)에 의해 제공될 수 있다.
[0306] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 비분열 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 T 세포 먹이세포의 집단에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 비분열 먹이세포는 감마선 조사된 PBMC 먹이세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 태양에서, 먹이세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 생성된 세포 집단은 확장될 초기 집단의 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40개 이상의 PBMC 먹이세포를 함유한다. 일부 구체예에서, T 세포 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비는 약 1 내지 25, 약 1 내지 50, 약 1 내지 100, 약 1 내지 125, 약 1 내지 150, 약 1 내지 175, 약 1 내지 200, 약 1 내지 225, 약 1 내지 250, 약 1 내지 275, 약 1 내지 300, 약 1 내지 325, 약 1 내지 350, 약 1 내지 375, 약 1 내지 400, 또는 약 1 내지 500이다.
[0307] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)은 세포 집단에 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 항-CD28 항체는 T 세포의 표면 상의 CD28 수용체에 대해 지향되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함할 수 있다. 항-CD28 항체의 비제한적 예에는 NA/LE(예컨대 BD Pharmingen), IM1376(예컨대 Beckman Coulter) 또는 15E8(예컨대 Miltenyi Biotec)이 포함된다. 항-CD28 항체는 가용성 시약으로서 첨가되거나 비드에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 가용성이다. 일부 구체예에서, 항-CD28 항체는 약 1 ng/mL 내지 1000 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도 범위로 첨가된다.
[0308] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)은 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함한다. 일부 구체예에서, 사이토카인은 배양 배지에 첨가되거나 외인성이다. 일부 구체예에서, 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 또는 IL-21 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 및 인큐베이션은 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7의 존재하에 수행된다. 일부 구체예에서, 배양은 IL-2의 존재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 배양은 일부 태양에서 IL-2를 추가로 포함하지 않는 채로 IL-15 및 IL-17의 존재하에 수행된다. 특정 구체예에서, 재조합 사이토카인(들)은 인간이다.
[0309] 재조합 사이토카인은 일반적으로 재조합 인간 단백질이다. 특정 구체예에서, 재조합 사이토카인은 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 적어도 약 또는 약 10 IU/mL, 적어도 약 또는 약 100 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7500 IU/mL, 또는 적어도 약 또는 약 8000 IU/mL의 농도로 존재하다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 또는 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 또는 약 1000 및 약 2000 IU/mL, 약 2000 및 약 3000 IU/mL, 약 3000 및 4000 약 IU/mL, 약 4000 및 약 5000 IU/mL, 약 5000 및 약 6000 IU/mL, 약 6000 및 약 7000 IU/mL, 약 7000 및 약 8000 IU/mL를 포함한다.
[0310] 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 세포 배양 배지에 존재한다. IL-2는 T 세포 회복 및 증식을 지원하는 사이토카인이다. IL-2는 또한 T 세포의 항상성을 지원하여 표현형, 분화 상태 및 면역 기억을 지원한다. 어떤 경우에는, 종양 미세 환경에서 조절 T 세포의 유도가 IL-2의 낮은 생체이용률로 이어질 수 있다. 재조합 IL-2는 다양한 맥락에서 T 세포의 광범위한 확장에 정기적으로 사용되었다. 재조합 IL-2는 상업적으로 이용 가능한다. 특정 구체예에서, 재조합 IL-2는 GMP 등급(예컨대 MACS GMP Recombinant Human IL-2, Miltenyi Biotec)이다.
[0311] 재조합 IL-2는 제공된 프로세스의 다양한 단계 동안 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-2는 TIL 과성장을 촉진하고 고형 종양으로부터의 증식을 허용하는 것과 같이 초기 T 세포 확장(1차 확장)에 포함될 수 있다. IL-2는 또한 분리 또는 선택 전에 신생항원 반응성 T의 피크 활성화를 허용하기 위해 섹션 I.C에 설명된 바와 같이 항원-제시 세포 공동-배양에 포함될 수 있다. 일부 경우에 재조합 IL-2는 섹션 I.E에 설명된 것과 같이 2차 확장 단계 동안 종양 반응성 T 세포를 확장하기 위해 배양물에 포함될 수도 있다.
[0312] 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 10 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL 또는 약 600 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 50 내지 400 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0313] 일부 구체예에서, 인큐베이션은 고용량 IL-2와 함께 수행된다. 일부 태양에서, IL-2는 배양물에 첨가되는 유일한 재조합 사이토카인이다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 예를 들어 약 1000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 6000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 6000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL 또는 약 7000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 농도로 배야 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 6000 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0314] 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 세포 배양 배지에 존재한다. IL-15는 기억 T 세포 항상성과 활성화에 관여하는 사이토카인이다. 어떤 경우 IL-15는 항원이 없는 상태에서 항원-경험 T 세포의 이펙터 기능을 촉진하고 고갈된 표현형으로의 이들의 분화를 방지할 수 있다. IL-15는 또한 T 세포 증식에 역할을 한다. 재조합 IL-15는 상업적으로 이용 가능한다. 특정 구체예에서, 재조합 IL-15는 GMP 등급(예컨대 MACS GMP Recombinant Human IL-15, Miltenyi Biotec)이다.
[0315] 재조합 IL-15는 제공된 프로세스의 다양한 단계 동안 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-15는 TIL 확장을 촉진하여 이들의 과성장을 촉진하고 증식을 허용하고/하거나 고형 종양으로부터 표현형을 안정화시키는 것과 같이 초기 T 세포 확장(1차 확장)에 포함될 수 있다. 재조합 IL-15는 또한 그들의 분리 또는 선택 전에 신생항원 반응성 T의 피크 활성화를 허용하기 위해 섹션 I.C에 설명된 대로 항원 제시 세포 공동 배양에 포함될 수 있다. 일부 경우에 재조합 IL-15는 예를 들어 섹션 I.D에 설명된 바와 같이, 2차 확장 단계 동안 종양-반응성 T 세포의 확장을 위해 배양물에 포함될 수도 있다. 일부 경우에서, 재조합 IL-15는 제공된 방법에서 종양 반응성 T 세포의 활성화, 생존 및/또는 확장을 제공하기 위해 재조합 IL-7과 조합될 수 있다. 이러한 일부 구체예에서, 재조합 IL-7 및 IL-15의 조합은 배양물에서의 재조합 IL-2의 사용에 대한 대안이며, 배양 배지는 재조합 IL-2를 추가로 함유하지 않는다.
[0316] 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 30 IU 내지 30 IU/mL 및 500 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 300 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 또는 약 400 IU/mL 내지 약 500 IU/mL의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL의 양으로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 배양 배지에 약 180 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0317] 일부 구체예에서, 재조합 IL-7이 배양 배지에 첨가된다. IL-7은 T 세포 유지 및 항상성을 촉진하는 데 관여하는 사이토카인이다. 어떤 경우에는 IL-7이 기억 T 세포의 생존과 증식, 특히 중앙 기억 구획을 향상시킬 수 있다. 재조합 IL-7은 상업적으로 이용 가능한다. 특정 구체예에서, 재조합 IL-7은 GMP 등급(예컨대 MACS GMP Recombinant Human IL-7, Miltenyi Biotec)이다.
[0318] 재조합 IL-7은 제공된 프로세스의 다양한 단계 동안 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-7은 TIL 확장을 촉진하여 이들의 과성장을 촉진하고 증식을 허용하고/하거나 고형 종양으로부터 표현형을 안정화시키기 위해, 초기 T 세포 확장(1차 확장)에 포함될 수 있다. IL-7은 또한 분리 또는 선택 전에 신생항원 반응성 T의 피크 활성화를 허용하기 위해 섹션 I.C에 설명된 바와 같이 항원-제시 세포 공동-배양에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-7은 예를 들어 섹션 I.D에 설명된 바와 같이, 2차 확장 단계 동안 종양-반응성 T 세포를 확장하기 위해 배양물에 포함될 수도 있다. 이 과정에 재조합 IL-7을 포함하면 과정에서 기억 T 세포 하위 집단의 확장을 유지하거나 지원할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-7은 재조합 IL-15와 조합되어 제공된 방법에서 종양 반응성 T 세포의 활성화, 생존 및/또는 확장을 제공할 수 있다. 이러한 일부 구체예에서, 재조합 IL-7 및 IL-15의 조합은 배양물에서의 재조합 IL-2의 사용에 대한 대안이며, 배양 배지는 재조합 IL-2를 추가로 함유하지 않는다.
[0319] 일부 구체예에서, 재조합 IL-7은 약 100 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 1500 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 600 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0320] 일부 구체예에서, 재조합 IL-21이 배양 배지에 첨가된다. IL-21은 조절 T 세포 신호전달을 증가시키지 않으면서 광범위한 T 세포 활성화를 지원하는 사이토카인이다. 어떤 경우에는 IL-21이 기억 세포 안정화, 이펙터 기능 및 항원- 경험 T 세포의 증식을 지원할 수 있다. IL-21은 CD4 및 CD8 T 세포 모두에서 이펙터 분자의 상향조절을 유도할 수 있다. 재조합 IL-21은 상업적으로 이용 가능한다. 특정 구체예에서, 재조합 IL-21은 GMP 등급(예컨대 MACS GMP Recombinant Human IL-21, Miltenyi Biotec)이다.
[0321] 재조합 IL-21은 제공된 프로세스의 다양한 단계 동안 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-21은 기억 T 세포 활성화, 기능 및/또는 증식을 안정화시키는 것을 포함하여 고형 종양으로부터 TIL 과성장을 촉진하는 것과 같이 초기 T 세포 확장(1차 확장)에 포함될 수 있다. 일부 태양에서, IL-21의 존재는 TIL의 개선된 복구를 허용한다. 재조합 IL-21은 또한 예를 들어 신생항원 반응성 TIL 상의 활성화 마커의 발현을 비롯한, T 세포 활성화 마커의 발현을 자극하는 능력으로 인해, 섹션 I.C에 설명된 바와 같이 항원 제시 세포 공동 배양에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 IL-21은 또한 기억 표현형의 증식 및 안정화를 지원하기 위해, 섹션 I.D에 설명된 바와 같이 2차 확장 단계 동안 종양 반응성 T 세포를 확장하기 위해 배양물에 포함될 수 있다.
[0322] 일부 구체예에서, 재조합 IL-21은 약 0.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 1 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 또는 약 15 IU/mL 내지 약 20 IU/mL의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 1 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0323] 특정 구체예에서, 세포 확장과 같은 배양 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2를 함유한다. 일부 구체예에서, IL-7, IL-15, IL-21 또는 항-CD3 항체(예컨대 OKT-3)로부터의 하나 이상의 다른 재조합 사이토카인과 같은 하나 이상의 다른 자극 제제가 포함될 수 있다. 항-CD3 항체(예컨대 OKT-3)의 일부 경우에 T 세포 자극 제제(들)는 PBMC와 같은 항원-제시 먹이세포에 의해 제공되는 것과 같은 공동자극 제제 또는 가용성 항- CD28 항체를 포함할 수도 있다.
[0324] 특정 구체예에서, 세포의 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항원-제시 먹이세포, 예를 들어 PBMC를 함유한다.
[0325] 특정 구체예에서, 세포의 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항-CD28 항체를 함유한다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체는 가용성이다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 또는 두 가지 모두는 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 같은 고체 표면에 결합된다.
[0326] 특정 구체예에서, 세포의 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2, 재조합 IL-15, 재조합 IL-7, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항원-제시 먹이세포, 예를 들어 PBMC를 함유한다.
[0327] 특정 구체예에서, 세포의 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-2, 재조합 IL-15, 재조합 IL-7, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항-CD28 항체를 함유한다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체는 가용성이다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 또는 양자 모두는 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 같은 고체 표면에 결합된다.
[0328] 특정 구체예에서, 세포 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-15 및 재조합 IL-7, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항원-제시 먹이세포, 예를 들어 PBMC를 함유한다.
[0329] 특정 구체예에서, 세포 확장과 같은 인큐베이션 동안 존재하는 T 세포 자극 제제(들)는 재조합 IL-15 및 재조합 IL-7, 항-CD3 항체, 예컨대 OKT-3, 및 항-CD28 항체를 함유한다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체는 가용성이다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 또는 둘 모두는 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 같은 고체 표면에 결합된다.
[0330] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 생물학적 샘플로부터 T 세포의 초기 확장을 위한 조건 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 세포는 약 5% CO2와 함께 약 37℃에서 배양된다.
[0331] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 약 1일, 예를 들어 일반적으로 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 기간 범위 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 7-10일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 7일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 8일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 9일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 10일 동안 수행된다.
[0332] 생물학적 샘플에서 T 세포의 초기 확장과 같은 인큐베이션은 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 일부 태양에서 폐쇄 자동화 시스템일 수 있는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)를 함유하는 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 폐쇄 자동화 시스템에서 무혈청 배지를 이용하여 수행된다.
[0333] 일부 구체예에서, 하나 이상의 자극 조건 하에 세포의 초기 확장은 세포 확장에 적합한 배양 용기에 있다. 일부 구체예에서, 배양 용기는 G-Rex 시스템(예컨대 G-Rex 10, G-Rex 10M, G-Rex 100 M/100M-CS 또는 G-Rex 500 M/500M-CS)과 같은 기체 투과성 배양 용기이다. 일부 구체예에서 배양 용기는 폐쇄 시스템에서 세포의 확장에 적합한 마이크로플레이트, 플라스크, 바 또는 기타 배양 용기이다. 일부 구체예에서, 확장은 생물반응기에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 확장은 예를 들어 생물반응기(예를 들어, Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare))와 연계되어 기체 투과성 백으로 세포를 이동시킴으로써 세포 확장 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 일 구체예에서, 세포 확장 시스템은 배양 용기, 예를 들어 백, 예컨대 용적이 약 50 mL, 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 및 약 10 L, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값인 기체 투과성 세포 백일 수 있다. 일부 구체예에서, 프로세스는 자동화되거나 반자동화된다. 자동화된 관류 확장에 적합한 생물반응기의 예에는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, 및 Pall XRS Bioreactor Systems, 또는 Miltenyi Prodigy가 포함된다. 일부 태양에서, 확장 배양은 정적 조건 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 확장 배양은 요동(rocking) 조건 하에 수행된다. 배지는 볼루스로 추가하거나 관류 일정에 따라 추가할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물반응기는 약 37℃의 온도에서 약 5%의 CO2 수준으로, 약, 또는 적어도 0.01 L/분, 0.05 L/분, 0.1 L/분, 0.2 L/분, 0.3 L/분, 0.4 L/분, 0.5 L/분, 1.0 L/분, 1.5 L/분, 또는 2.0 L/분 또는 2.0 L/분을 상회하는 일정한 공기 흐름으로 유지된다. 특정 구체예에서, 배양의 적어도 일부는 290 ml/일, 580 ml/일 및/또는 1160 ml/일의 속도로 관류로 수행된다.
[0334] 일부 구체예에서, 세포는 적절한 배양 용기(예컨대 기체 투과성 백)에, 0.5 x 106 세포/mL 내지 1.5 x 106 세포/mL의 밀도로 접종된다. 일부 구체예에서, 밀도는 약 0.5 x 106 세포/mL, 0.75 x 106 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 1.25 x 106 세포/mL 또는 1.5 x 106 세포/mL, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값이다.
[0335] 일부 태양에서, 세포는 관류가 가능한 자동화된 폐쇄 확장 시스템에서 확장된다. 관류는 최적의 성장률이 달성되도록 지속적으로 세포에 배지를 추가할 수 있다.
[0336] 확장 방법은 폐쇄 자동화 시스템 및 무혈청 배지 사용을 포함하는 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 방법의 단계 중 임의의 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 또는 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 모든 프로세스 작업은 GMP 스위트에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄 시스템은 세포 요법제를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 방법의 다른 처리 단계 중 하나 이상을 수행하는 데 사용된다. 일부 구체예에서, 예컨대 단리, 선택 및/또는 농축, 처리, 세포의 확장과 관련된 인큐베이션을 포함하는 배양 단계, 및 제제화 단계와 같은, 처리 단계 중 하나 이상 또는 모든 단계들은 시스템, 장치, 또는 통합 또는 자체 포함된 시스템 및/또는 자동화 또는 프로그래밍 가능한 방식의 장치를 이용하여 수행된다. 일부 태양에서, 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 통신하고, 사용자로 하여금 결과물을 프로그램, 제어, 평가하고/하거나 처리, 단리, 엔지니어링 및 제제화 단계의 다양한 태양을 조정하게 해주는, 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
[0337] 일부 구체예에서, 인큐베이션 직후, 하기 섹션 I.C에 기재된 방법에 따라 APC와의 후속 공동-배양을 위해 자극된 세포를 수집할 수 있다.
[0338] 일부 구체예에서, 자극된 세포를 수집하고 동결시킨다. 초기 확장 단계 후 동결보존에 의한 중간 유지 단계의 제공은 섹션 I.A에 설명된 바와 같은 네오에피토프 식별 및 펩타이드 생성 및/또는 섹션 I.C에 설명된 바와 같은 APC의 생성과의타이밍을 조율하는 데 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 동결보존을 위해, 자극된 세포는 동결보호제(cryoprotectant)와 함께 조성물로서 제제화된다. 일부 구체예에서, 동결보호제는 DMSO 및/또는 글리세롤이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결보존을 위해 제제화된 조성물은 초저온과 같은 저온, 예를 들어 -40℃ 내지 -150℃의 온도 범위, 예를 들어 또는 약 80℃ ± 6.0℃에서의 보관에서 보관될 수 있다.
[0339] 일부 구체예에서, 동결보존된 세포는 해동에 의해 후속 단계를 위해 준비된다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 세척 단계를 수행한 후 해동 직후 APC 및 펩타이드와 함께 후속 배양되도록 준비될 수 있다.
C.
T 세포와 APC와의 공동-배양
[0340] 일부 구체예에서, 확장을 위한 세포의 공급원은 종양 반응성 T 세포에 대해 농축되도록 생성된 세포의 생체외 공동배양 공급원으로부터 수득될 수 있다. 항원 특이성을 가진 세포를 생성하는 방법은 알려져 있다. 예컨대 미국 공개 출원 번호. US2017/0224800 참조. 따라서, 구체예에서, 제공된 방법은 종양-관련 항원(예컨대 신생항원) 또는 종양-관련 항원의 펩타이드에 대한 항원 특이성을 나타내는 T 세포와 같은 종양-반응성 T 세포를 함유하는 T 세포의 집단이, 생체외에서 동정 또는 생성되는 것들을 포함한다. 이러한 방법은 (1) 생물학적 샘플, 예를 들어, 종양, 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직 또는 체액과 같은 생물학적 샘플로부터 T 세포를 직접 선택함으로써 공여자 대상체로부터 수득된 T 세포 집단을 농축시키는 단계; (2) 상기 집단을, 상기한 바와 같은 하나 이상의 T-세포 자극 제제, 예컨대 항-CD3(예컨대 OKT3) 및 항-CD28 시약, 예컨대 항-CD3 항체(예컨대 OKT3) 및 항-CD28 항체, 및 및 IL-2, IL-7, IL-21 및/또는 IL-15와 같은 하나 이상의 부가적인 재조합 사이토카인으로 자극시켜 활성화된 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계; (3) 하나 이상의 MHC-관련관 비-천연 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포(APC)의 존재 하에 활성화된 T 세포를 함유하는 집단을 공동-배양하는 단계; 및 (4) 항원 제시 세포(APC) 상에 존재하는 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포를 농축시키는 단계를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 태양에서, 내인성 TCR을 함유하는 T 세포는 T 세포의 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리함으로써 농축된다. 별법으로 또는 이에 더해, 이러한 세포는 종양-반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택함으로써 농축된다.
[0341] 특정 구체예에서, 제공된 방법의 구체예에서, 일단 단백질을 코딩하는 네오피토프가 합성되면, 다수의 합성 펩타이드는 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드를 제시하는 조건 하에 항원 제시 세포와 접촉되고 APC에 제시된 펩타이드의 인식을 위한 T 세포의 집단으로부터의 T 세포와 함께 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 합성 펩타이드는 자가 또는 동종이계 APC로 펄싱된 후 환자 T 세포와 공동-배양된다. 항원 제시 세포는 이러한 펩타이드를 제시하는 데 사용된다. APC의 표면에서 이러한 펩타이드를 인식하는 T 세포는 다음과 같이 후술하는 방법에 의해 분리될 수 있다. 인큐베이션된 세포는 종양-반응성 T 세포, 즉 배양물에서 APC에 존재하는 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포를 농축하게 하고 확장시키는 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 방법은 역치 양의 T 세포가 수득될 때까지 및/또는 인큐베이션 개시 후 최대 20일까지 확장을 위한 조건 하에 T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 제공된 방법의 일부 구체예에서, 이 방법은 수 시간 내지 수일의 기간에 걸쳐 T 세포를 APC와 공동-배양한 다음, 종양 반응성 T 세포를 농축하거나 확장하는 조건 하에, T 세포의 확장을 위해 T 세포의 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 제공된 방법의 일부 구체예에서, 이 방법은 1-7일의 기간에 걸쳐 T 세포를 APC와 공동-배양한 다음, 종양 반응성 T 세포를 농축하거나 확장하는 조건 하에, T 세포의 확장을 위해 T 세포의 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 T 세포 상의 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 기초하여 배양물로부터 반응성 T 세포를 단리하거나 선택하는 것을 포함할 수 있다.
[0342] 이 방법은 돌연변이된 아미노산 서열을 제시하도록 환자의 자가 항원 제시 세포(APC)를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 돌연변이된 아미노산 서열을 제시하도록 환자의 자가 항원 제시 세포(APC)를 유도하는 것을 포함할 수 있다. APC는 그 세포 표면에 주조직적합성 복합체(MHC) 분자와 관련하여 단백질의 펩타이드 단편을 제시하는 임의의 세포를 포함할 수 있다. APC는 예를 들어 대식세포, DC, 랑게르한스 세포, B-림프구, 및 T-세포 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, APC는 DC이다. 환자로부터의 자가 APC를 사용함으로써, 방법은 환자에 의해 발현된 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 암-특이적 돌연변이에 의해 코딩되는 돌연변이된 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 T 세포를 식별할 수 있다. MHC 분자는 비제한적인 예로서 MHC Class I, MHC Class II, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR 분자를 비롯하여 환자에 의해 발현되는 MHC 분자이면 어느 것이든 무방하다.
[0343] [0343] 특정 구체예에서, APC는 클래스 I 및 클래스 II 제한 분자를 제시할 수 있는 세포를 포함한다. 예를 들어, B 세포와 DC는 모두 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 제한 분자를 제시하는 능력을 가지고 있다. 일부 구체예에서, APC 세포 샘플은 B 세포 및 DC를 포함한다. 일부 구체예에서, APC 세포 샘플은 예를 들어 1차 세포 샘플로부터의 선택 또는 단리에 의해 B 세포에 대해 농축된다. 일부 구체예에서, APC 세포 샘플은 예를 들어 1차 세포 샘플로부터의 선택 또는 단리에 의해 DC에 대해 농축된다.
[0344] 일부 구체예에서, APC는 T 세포의 공급원이 수득된 맷칭된 HLA를 갖는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자를 발현한다. 특정 구체예에서, APC 및 T 세포 양자 모두는 동일한 대상체로부터 단리된 것이며, 즉 암 환자의 자가 조직이다. 일부 구체예에서, 본 방법은 돌연변이된 아미노산 서열을 제시하도록 환자의 자가 항원 제시 세포(APC)를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 환자로부터의 자가 APC를 사용함으로써, 본 방법은 환자에 의해 발현된 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 암-특이적 돌연변이에 의해 인코딩되는 돌연변이된 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 T 세포를 식별할 수 있다.
[0345] 일부 구체예에서, APC는 환자와 같은 대상체로부터의 혈액 또는 성분채집 샘플로부터의 세포이다. 일부 구체예에서, APC는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플에 존재하는 세포를 포함한다. 전형적으로 PBMC 배양에서 APC 기능은 주로 단핵구와 B 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 단리된 PBMC의 집단은 제공된 방법에서 APC로서 사용될 수 있다. PBMC는 Ficoll-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 경우에, APC는 혈액 또는 성분채집술 샘플 또는 PBMC 샘플에서 분리된 B 세포이거나 이를 포함한다. 또 다른 경우에, APC는 혈액 또는 성분채집 샘플 또는 PBMC 샘플로부터 단리된 단핵구이거나 이를 포함한다. 일부 태양에서, 단핵구는 APC로 사용하기 위한 단핵구-유래 DC를 제조하기 위한 공급원으로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단핵구- 유래 DC의 공급원(예컨대 CD11chighMHCIIhighCD14low 세포)은 단핵구-유래 수지상 세포를 생성하기 위해 4 내지 6일 동안 GM-CSF 및 IL-4와의 배양에 의해, 단리된 단핵구로부터 생체외에서 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 단핵구는 예를 들어 CD14 선택에 의해 PBMC로부터 단리된 다음, 4 내지 6일 동안 GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양된다.
[0346] 일부 구체예에서, APC는 복제 능력이 있는 1차 세포(예를 들어, B 세포 또는 단핵구 유래 DC)이고, 예를 들어 세포는 불활성화를 초래할 광조사(irradiation), 열처리 또는 기타 방법으로 처리되지 않는다. 특정 구체예에서, 제공된 방법은 광조사된 APC를 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, APC는 대상체로부터 수득된 신선하게 단리된 1차 세포이거나, 대상체로부터 수득된 1차 세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, APC는 냉동보존된 후, 제공된 방법에 따라 자극된 T 세포와의 공동-배양 전에 후속적으로 해동되었다.
[0347] 일부 특정 구체예에서, B 세포는 APC의 공급원으로서 사용되고 종양 단편 및/또는 T 세포가 수득된 대상체에 대해 자가인 조직의 성분채집과 같은 환자 성분채집으로부터 생성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 단핵구-유래 수지상 세포는 APC의 공급원으로서 사용되며, 종양 단편 및/또는 T 세포가 수득되는 대상체에 대해 자가인 조직의 성분채집과 같은 환자 성분채집으로부터의 단핵구로부터 생성된다.
[0348] 일부 구체예에서, 단리되거나 생성된 APC는 수집되고 동결된다. APC의 단리 또는 생성 후 동결보존에 의한 중간 유지 단계의 제공은 섹션 I.A에 설명된 것과 같은 네오에피토프 식별 및 펩타이드 생성 및/또는 섹션 I.B에 설명된 것과 같은 T 세포의 초기 확장과의 타이밍을 조율하는 데 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 동결보존을 위해, 단리되거나 생성된 APC는 동결보호제와 함께 조성물로서 제제화된다. 일부 구체예에서, 동결보호제는 DMSO 및/또는 글리세롤이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결보존을 위해 제제화된 조성물은 초저온과 같은 저온, 예를 들어 -40℃ 내지 -150℃의 온도 범위, 예컨대 또는 약 80℃ ± 6.0℃에서의 보관에서 보관될 수 있다.
[0349] 일부 구체예에서, 동결보존된 세포는 해동에 의해 후속 단계를 위해 준비된다. 일부 경우에, 세포는 하나 이상의 세척 단계 후 해동 직후 T 세포 및 펩타이드와 함께 후속 배양을 위해 준비될 수 있다.
[0350] 특정 구체예에서, 종양 반응성 세포를 농축하거나 선택하는 방법은 PBMC를 돌연변이된 아미노산 서열, 예컨대 하나 이상, 예컨대 복수의 네오에피토프 펩타이드와 접촉시킴으로써 개시된다. 그런 다음 PBMC/펩타이드를 자극된 T 세포와 함께 배양할 수 있다. PBMC와 T 세포는 동일한 대상체로부터 얻을 수 있다.
[0351] 특정 구체예에서, 종양 반응성 세포를 농축하거나 선택하는 방법은 B 세포를 돌연변이된 아미노산 서열, 예컨대 하나 이상, 예컨대 복수의 네오에피토프 펩타이드와 접촉시킴으로써 개시된다. 그런 다음 B 세포/펩타이드를 자극된 T 세포와 함께 배양할 수 있다. B 세포와 T 세포는 동일한 대상체로부터 얻을 수 있다.
[0352] 특정 구체예에서, 종양 반응성 세포를 농축하거나 선택하는 방법은 단핵구-유래 DC를 돌연변이된 아미노산 서열, 예를 들어 하나 이상, 예컨대 복수의 네오에피토프 펩타이드와 접촉시킴으로써 개시된다. 그런 다음 단핵구-유래 DC/펩타이드를 자극된 T 세포와 함께 배양할 수 있다. 단핵구 유래 DC 및 T 세포는 동일한 대상체로부터 얻거나 유래될 수 있다.
[0353] 일부 구체예에서, APC는 인공 항원 제시 세포(aAPC)이다. 전형적으로, aAPC는 MHC 분자의 발현, 자극 및 공동자극 분자(들), Fc 수용체, 접착 분자(들)의 발현 및/또는 사이토카인(예를 들어, IL-2)을 생성하거나 분비하는 능력을 포함하는, 천연 APC의 특징을 포함한다. 일반적으로, aAPC는 상기 중 하나 이상의 발현이 결여된 세포주이며, MHC 분자, 저친화성 Fc 수용체(CD32), 고친화성 Fc 수용체 (CD64), 공동자극 신호 (예컨대 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6 또는 B7-H3의 리간드; 또는 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Toll 리간드 수용체 또는 CD83의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체) 중 하나나 이상, 세포 부착 분자 (예컨대 ICAM-1 또는 LFA-3) 및/또는 사이토카인 (예컨대 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론-알파(IFNα), 인터페론-베타(IFNβ), 인터페론-감마(IFNγ), 종양 괴사 인자-알파(TNFα), 종양 괴사 인자-베타(TNFβ), 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF), 및 과립구 집락 자극인자(GCSF))로부터 누락된 요소 중 하나 이상의 도입(예컨대 형질감염 또는 형질도입)에 의해 생성된다. 일부 경우에서, aAPC는 일반적으로 MHC 분자를 발현하지 않지만, MHC 분자를 발현하도록 조작될 수 있거나, 일부 경우에는 사이토카인에 의한 자극과 같이 MHC 분자를 발현하도록 유도되거나 유도될 수 있다. 일부 경우에, aAPC는 또한 예를 들어 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 또는 항-CD2 항체를 포함할 수 있는 자극성 또는 공동-자극성 리간드로 로딩될 수 있다. aAPC를 생성하기 위한 백본으로 사용될 수 있는 세포주의 예로는 K562 세포주 또는 섬유아세포 세포주를 들 수 있다. 다양한 aAPC가 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 미국 특허 No. 8,722,400, 공개 출원 No. US2014/0212446; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol. Ther., 15:981-988 참조). 특정 구체예에서, 종양 반응성 세포를 농축하거나 선택하는 방법은 aAPC를 돌연변이된 아미노산 서열, 예를 들어 하나 이상, 예를 들어 복수의 네오에피토프 펩타이드와 접촉시킴으로써 개시된다. 그런 다음 aAPC/펩타이드를 자극된 T 세포와 함께 배양할 수 있다.
[0354] 특정 구체예에서, 전체 엑솜 시퀀싱은 종양과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하기 위해 건강한 조직 및 질병에 걸린 조직에서 수행된다. 이러한 돌연변이가 확인되면 네오에피토프인 반응성 신생항원이 확인된다. 신생항원은 환자의 T 세포에 의해 인식되는 돌연변이 펩타이드이다. 이러한 신생항원은 MHC 복합체에 의해 종양 또는 항원 제시 세포에 의해 제시되어야 하고 T 세포 상의 TCR에 의해 인식되어야 한다. 일단 단백질을 인코딩하는 네오피토프가 확인되면 돌연변이 라이브러리가 생성될 수 있다. 긴 펩타이드는 항원 제시 세포로의 전기천공법을 사용하여 합성 및 펄스화될 수 있다. 그 다음 긴 펩타이드는 CD8 세포에 의해 인식될 항원 제시 세포에 의해 제시될 수 있다. 긴 펩타이드는 CD8 세포에 의한 인식을 위해 MHC 클래스 I 제한 분자에 의한 발현에 적합한다. 긴 펩타이드는 CD4 세포에 의한 인식을 위해 MHC 클래스 II 제한 분자에 대해 작동하지 않는다. MHC 클래스 II 제한 분자는 돌연변이의 DNA를 인코딩하는 유전자로 제시되어야 하고 항원 제시 세포에 전기천공되어야 한다.
[0355] 돌연변이된 아미노산 서열을 제시하도록 환자의 자가 APC(예를 들어, B 세포 또는 단핵구 유래 DC)를 유도하는 것은 다양한 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 돌연변이된 아미노산 서열(예를 들어, 펩타이드 네오에피토프)을 제시하도록 환자의 자가 APC를 유도하는 것은, 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드 또는 펩타이드 풀(여기서 풀 내의 각각의 펩타이드는 상이한 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다)로 자가 APC를 펄싱하는 것을 포함한다. 어떤 경우에는 항원 제시 세포에 전기천공법을 사용하여 APC를 펩타이드로 펄스한다. 그런 다음 합성 펩타이드는 CD8 세포(MHC 클래스 I) 또는 CD4 세포(MHC 클래스 II)에 의해 인식되도록 항원 제시 세포에 의해 제시될 수 있다. 특정 특정 구체예에서, 합성 펩타이드는 CD8 세포에 의한 인식을 위해 MHC 클래스 I 제한 분자에 의한 발현에 적합하도록 생성된다. 다른 특정 구체예에서, 합성 펩타이드는 CD4 세포에 의한 인식을 위해 MHC 클래스 II 제한 분자에 의한 발현에 적합하도록 생성된다.
[0356] 일부 구체예에서, APC(예를 들어, PBMC, B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 단일 펩타이드 또는 펩타이드 풀과 접촉된다. 펩타이드 풀은 예를 들어 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 100개의 펩타이드, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 갯수의 펩타이드와 같은 다양한 돌연변이된 아미노산 서열을 나타낼 수 있다.
[0357] 펩타이드 또는 펩타이드 풀은 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상에서의 그들의 제시에 적합한 농도로 펩타이드 펄싱과 같은 방법으로 항원 제시 세포(예컨대 수지상 세포)에 로딩된다.
[0358] 일부 구체예에서, 개별 또는 단일 펩타이드를 나타내는 펩타이드 농도는 약 0.00000 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 개별 또는 단일 펩타이드를 나타내는 펩타이드 농도는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 개별 또는 단일 펩타이드를 나타내는 농도는 약 0.00000 1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값의 농도일 수 있다.
[0359] 일부 구체예에서, 펩타이드는 많은 상이한 돌연변이된 아미노산 서열을 나타내는 펩타이드의 풀이고, 풀 내의 개별 또는 단일 펩타이드의 평균 농도는 약 0.00000 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 많은 상이한 돌연변이된 아미노산 서열을 나타내는 펩타이드의 풀이고, 풀 내의 개별 또는 단일 펩타이드의 평균 농도는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 풀 내의 개별 또는 단일 펩타이드의 평균 농도는 약 0.00000 1 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값의 농도일 수 있다.
[0360] 일부 구체예에서, 하나 이상의 비천연 펩타이드의 개별 펩타이드의 농도는 평균적으로 0.02㎍/mL 미만이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비천연 펩타이드의 개별 펩타이드의 농도는 평균적으로, 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 예를 들어 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.0005 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.0002 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.00005 ㎍/mL, 또는 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.00002 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.0005 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.0002 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.00002 ㎍/mL 내지 약 0.00005 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.0005 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.0002 ㎍/mL, 또는 약 0.00005 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.0005 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.0002 ㎍/mL, 또는 약 0.0005 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.0005 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.0005 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.002 ㎍/mL, 또는 약 0.002 ㎍/mL 내지 약 0.005 ㎍/mL이다.
[0361] 일부 구체예에서, 단일 펩타이드 또는 펩타이드 풀을 나타내는, 펩타이드 농도는 약 0.0001㎍/mL 내지 약 40㎍/mL의 범위일 수 있다. 단일 펩타이드 또는 펩타이드 풀을 나타내는 펩타이드 농도는, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 0.001 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 0.001 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 0.001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 0.01 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 예를 들어 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.05 ㎍/mL, 0.05 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 또는 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 예를 들어 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 또는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL, 또는 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 또는 약 25 ㎍/mL 내지 약 40 ㎍/mL의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 펩타이드 또는 펩타이드 풀을 나타내는 펩타이드 농도는 약 0.0001 ㎍/mL, 또는 약 0.001 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL, 또는 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL, 또는 약 10 ㎍/mL, 또는 약 20 ㎍/mL, 또는 약 30 ㎍/mL 또는 약 40 ㎍/mL 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값의 농도일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 농도는 펩타이드 풀의 농도이다. 일부 구체예에서, 펩타이드 농도는 단일 또는 개별 펩타이드의 농도이다.
[0362] 일부 구체예에서, 펩타이드 펄스화를 위해 APC(예를 들어, B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 펩타이드와 함께, 약 2시간 내지 약 48시간, 예를 들어 약 2시간 내지 약 36시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 18시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 2시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 48시간, 약 18시간 내지 약 36시간, 약 18시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, APC(예컨대 B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 펩타이드와 함께 약 4시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값의 기간 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, APC(예컨대 PBMC, B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 펩타이드와 함께 밤새, 예를 들어 약 8 내지 12시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 공동-배양 인큐베이션은 약 6시간 동안 수행된다.
[0363] 일 구체예에서, 돌연변이된 아미노산 서열을 제시하도록 환자의 자가 APC를 유도하는 것은 돌연변이된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 APC 내로 도입하는 것을 포함한다. APC에 뉴클레오타이드 서열을 도입하여 APC가 MHC 분자에 결합된 돌연변이된 아미노산 서열을 세포막에 발현하고 표시하도록 한다. 돌연변이된 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있다. APC에 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 것은 다양한 상이한 방식으로 수행될 수 있다. APC에 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 데 유용한 기술의 비제한적 예로는 형질전환, 형질도입, 형질감염 및 전기천공을 들 수 있다. 두 개 이상의 유전자가 식별되는 구체예에서, 이 방법은 각각 상이한 유전자에 의해 인코딩되는 돌연변이된 아미노산 서열을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 제조하고, 각각의 뉴클레오타이드 서열을 상이한 APC 집단에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 각각의 집단이 상이한 돌연변이된 아미노산 서열을 발현하고 표시하는 다수의 APC 집단이 수득될 수 있다.
[0364] 일부 경우에서, MHC 클래스 II 제한 분자에 결합하기 위한 펩타이드는 돌연변이 DNA를 인코딩하는 유전자로서 제시되고 항원 제시 세포로 전기천공된다. 그런 다음 이 DNA는 CD4+ 세포가 인식할 수 있도록 표면의 펩타이드를 인코딩하는 RNA로 시험관 내에서 전사된다. 경우에 따라 MHC 클래스 II 제한 분자에 대해 Tandem Mini Gene 방법을 사용하여 이를 수행할 수 있다(예컨대, 공개된 PCT 특허 출원 번호 WO2016/053338 및 Parkhurst et al. (2016) Clin Cancer Res., 23:2491-505 참조). 일부 경우에서 직렬(tandem) 미니유전자가 사용되는 경우, APC(예컨대 B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 다른 돌연변이 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA(복수 DNA)의 혼합물로 전기천공된 다음, CD4+ T 세포에 의한 표면 인식을 위해 펩타이드를 인코딩하는 RNA로 시험관 내 전사된다. 일부 구체예에서, APC(예컨대 B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 Lonza 4D Nucleofector 연속 전기천공 시스템을 사용하여 전기천공된다.
[0365] 일단 이들 긴 펩타이드 및 DNA가 합성되고 자가 또는 동종이계 항원 제시 세포로 펄스되면 이들은 환자 T 세포와 함께 배양된다. 항원 제시 세포는 이러한 펩타이드를 제시하는 데 사용된다. APC의 표면에서 이러한 펩타이드를 인식하는 T 세포는 다음과 같은 방법으로 분리할 수 있다. 이들 방법은 T 세포(예를 들어, 종양이 있는 환자로부터)를 펩타이드를 제시하는 APC의 배양물과 함께 첨가하고, 집단 내 하나 이상의 T 세포에 의한 APC의 표면 상의 펩타이드의 제시 및 인식을 허용하도록 일정 기간 동안 APC 및 T 세포를 공동-배양하는 것을 포함한다. 제공된 구체예에서, T 세포는 자극된 T 세포의 집단을 포함한다.
[0366] T 세포(예를 들어, 자극된 T 세포) 및 APC(예를 들어, B 세포 또는 단핵구-유래 DC)는 1:100 내지 100:1, 예를 들어 1:50 내지 50:1, 1:25 내지 25:1, 1:10 내지 10:1, 또는 1:5 내지 5:1의 T 세포 대 APC의 비율로 배양물에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 (예컨대 자극된 T 세포) 대 APC의 비는 약 1:100, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2.5, 약 1:1, 약 2:5:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 25:1, 약 50:1 또는 약 100:1, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값이다. 일부 구체예에서, T 세포 (예컨대 자극된 T 세포) 대 APC의 비는 20:1 내지 1:1, 15:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:1, 5:1 내지 1:1, 또는 2.5:1 내지 1:1이다. 일부 구체예에서, T 세포 (예컨대 자극된 T 세포) 대 APC의 비는 1:20 내지 1:1, 1:15 내지 1:1, 1:10 내지 1:1, 1:5 내지 1:1, 또는 1:2.5 내지 1:1이다. 특정 구체예에서, 공동배양은 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포의 집단, 및 APC (예컨대 B 세포 또는 단핵구-유래 DC)를 대략 3:1의 비로 혼합함으로써 수행될 것이다. 일부 구체예에서, 공동배양은 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포의 집단, 및 APC (예컨대 B 세포 또는 단핵구-유래 DC)를 대략 1:1의 비로 혼합함으로써 수행될 것이다.
[0367] 일부 구체예에서, T 세포를 유지하기 위한 하나 이상의 재조합 사이토카인이 공동-배양물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 또는 IL-21 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공동-배양은 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 공동-배양은 IL-2의 존재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 공동-배양은 IL-15 및 IL-17의 존재하에 수행되되, 일부 태양에서 IL-2는 추가로 포함되지 않는다.
[0368] 재조합 사이토카인은 일반적으로 재조합 인간 단백질이다. 특정 구체예에서, 재조합 사이토카인은 공동배양 동안 세포 배양 배지에 적어도 약 또는 약 10 IU/mL, 적어도 약 또는 약 100 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7500 IU/mL, 또는 적어도 약 또는 약 8000 IU/mL의 농도로 존재한다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 또는 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 또는 약 1000 내지 약 2000 IU/mL, 약 2000 내지 약 3000 IU/mL, 약 3000 내지 4000 약 IU/mL, 약 4000 내지 약 5000 IU/mL, 약 5000 내지 약 6000 IU/mL, 약 6000 내지 약 7000 IU/mL, 약 7000 내지 약 8000 IU/mL를 포함한다.
[0369] 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 세포 배양 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 배양 배지에 약 10 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL 또는 약 600 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 50 내지 400 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0370] 일부 구체예에서, 인큐베이션은 고용량 IL-2와 함께 수행된다. 일부 태양에서, IL-2는 배양물에 첨가되는 유일한 재조합 사이토카인이다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 1000 IU/mL 약 8000 IU/mL, 예를 들어 약 1000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 2000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 4000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 6000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 약 6000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL 또는 약 7000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 6000 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0371] 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 세포 배양 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 배양 배지에 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 30 IU /mL, 약 30 IU/mL 내지 500 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 300 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 또는 약 400 IU/mL 내지 약 500 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 배양 배지에 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 배양 배지에 약 180 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0372] 일부 구체예에서, 재조합 IL-7이 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-7은 배양 배지에 약 100 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 1500 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 600 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0373] 일부 구체예에서, 재조합 IL-21이 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-21은 배양 배지에 약 0.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 1 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 또는 약 15 IU/mL 내지 약 20 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 1 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0374] 제공된 방법에서, APC/펩타이드와 T 세포의 공동-배양은 또한 섹션 II에 기재된 것과 같은 T 세포 아쥬반트와 함께 수행될 수 있다. 일부 태양에서, T 세포 아쥬반트는 OX40 및 41BB의 작용제를 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 수용체(TNFSR) 작용제와 같은 공동자극 작용제이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 축의 억제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포자멸사 억제제이다.
[0375] APC 및 T 세포의 공동-배양물은 MHC 상의 펩타이드 제시 및 배양물 중 T 세포의 활성화에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30℃ 및 일반적으로 약 37℃의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 최대 96시간 동안 수행된다. 인큐베이션은 24시간 내지 96시간 동안, 예컨대 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간 또는 약 96시간, 또는 상기 중 임의의 시간 사이의 시간 동안 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 공동-배양물은 24 내지 48시간 동안 인큐베이션된다.
[0376] 일부 구체예에서, 공동-배양 말기에 종양 반응성 T 세포는 공동-배양물에 존재하는 APC로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 분리는 APC를 제거하거나 제거하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 공동-배양물에 존재하는 T 세포를 양성으로 선택하거나 보유하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공동-배양물에서 총 T 세포가 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 T 세포를 선택할 수 있다.
D. 종양-반응성 T 세포의 선택
[0377] 제공된 방법의 구체예에서, 본 방법은 종양-반응성 T 세포와 연관된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하거나 단리함으로써 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포일 가능성이 있거나 의심되는 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포를 농축 또는 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 섹션 I.B.1에 기재된 바와 같이 생물학적 샘플로부터 단리되거나 선택된 T 세포의 집단으로부터 추가로 선택되거나 농축된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 섹션 I. B.2에 기재된 바와 같이 자극된 T 세포의 집단으로부터 추가로 선택되거나 농축된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 섹션 I.C에 기재된 바와 같이, APC와의 공동-배양 후, T 세포의 집단으로부터 추가로 선택 또는 농축될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 방법은 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포일 가능성이 있거나 의심되는 T 세포를 수득하거나 농축하기 위한 임의의 상기 선택의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 농축된 세포 집단은 제공된 방법 중 임의의 것의 하나 이상의 단계에 따라 배양, 자극 또는 활성화, 및/또는 확장을 포함하는 후속 프로세싱 단계와 같은 후속 프로세싱 단계에서 사용된다.
[0378] 제공된 구체예 중 임의의 태양에서, 종양-반응성 T 세포 및/또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 적어도 하나의 T 세포 활성화 마커를 발현하는 T 세포는 제공된 임의의 방법에 따라 생물학적 샘플로부터 농축된다. 일부 태양에서, 농축 전 또는 농축과 동시에, T 세포는 예를 들어 T 세포 마커 CD3, CD4 또는 CD8에 기초하여 생물학적 샘플로부터 농축되거나 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 농축은 이러한 마커에 기초한 분리를 위한 임의의 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리는 친화성 기반 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예컨대, 일부 태양에서 단리는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하되, 예컨대, 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후, 세척 단계 및 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터, 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 분리하는 방법에 의한다.
[0379] 일부 구체예에서, 공동-배양물로부터 T 세포를 추가로 확장하기 전에, 제공된 방법은 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포일 가능성이 있거나 의심되는 T 세포의 농축 또는 선택을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 농축은 종양 반응성 T 세포와 관련된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 공동-배양물로부터 T 세포를 선택하거나 단리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 공동-배양물로부터 선택된 T 세포는 이러한 T 세포 활성화 마커 중 하나 이상에 대해 추가로 양성인 CD3+ T 세포 또는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 풍부한(이들에 대해 농축된) T 세포 집단을 생성한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포는 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포를 포함하거나 이에 대해 농축된다. 예를 들어, 이러한 CD3+ T 세포, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 집단은, 종양 반응성 T 세포 또는 종양 반응성 T 세포와 관련된 T 세포 활성화 마커의 발현을 갖는 T 세포 상에서 발현되거나 비교적 고도로 발현되는 마커에 대한 포지티브 또는 네거티브 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다. 특정 구체예에서, 농축된 세포 집단은 섹션 I.E에 설명된 바와 같이, 확장을 위한 조건 하에 배양된다.
[0380] 일부 태양에서, 포지티브 선택은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 수행된다. T 세포가 표적 또는 돌연변이 펩타이드에 의해 활성화되면 이것은 비제한적인 예로서 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134 (OX40), CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및/또는 LAG-3과 같은 상향조절 마커를 발현하기 시작한다. 특정 구체예에서, 상향조절 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD137, CD59, CD90, CD38, 또는 CD103이다. 그런 다음 이들 마커를 사용하여 반응성 세포를 선택할 수 있다. 특히, T 세포 활성화 마커 중에는 상향조절되고/되거나 그의 발현이 T 세포의 항원 자극 후에 특이적으로 검출되어, 항원 특이적 이펙터가 세포를 활성화하거나 자극하는 항원의 대리물로 식별될 수 있는 것들이 있다. 예컨대, 항원-유도 자극 후 인간 T 세포는 CD25, CD69, CD38 등과 같은 다중 활성화 관련 분자의 상향조절된 표면 발현을 비롯한, 동적 기능 및 표현형 변화를 겪는다. 표면 분자의 상향조절은 상향조절된 결정인자의 항체 결합 및 자기 분리 및 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 포함하는 방법을 포함하는 유세포 분석에 의한 후속 농축을 통해 종양 반응성 T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포를 식별하고 분리할 수 있는 기회를 제공한다.
[0381] 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및/또는 LAG-3 중 어느 하나 이상에 대해 선택된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및/또는 CD256 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및/또는 CD38 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다.
[0382] 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD107a이거나 이를 포함한다. CD107a는 일반적으로 T 세포 표면에서 발견되는 리소좀 관련 단백질이다. TCR이 촉발되면 CD8 T 세포의 탈과립화가 빠르게 일어날 수 있고 CD107과 다른 리소좀 단백질이 세포막으로 수송되어 퍼포린과 그랜자임의 방출을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 CD107 발현은 항원 특이적 CD8 T 세포에서, 예를 들어 자극 후 30분 만에 일찍 검출될 수 있다(Betts et al. (2003) J. Immunol. Methods 281:6578).
[0383] 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD39이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD103이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD59이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD90이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD38이거나 이를 포함한다.
[0384] 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD137(41BB)이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD134(OX40)이거나 이를 포함한다.
[0385] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포는 적어도 두 개 이상의 T 세포 활성화 마커, 예를 들어 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 T 세포 활성화 마커의 양성 표면 발현에 기초하여 선택, 농축 또는 단리된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포는 PD-1, TIM-3, LAG-3, CD137, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및/또는 CD256 중 두 개 이상의 양성 표면 발현에 기초하여 선택, 농축 또는 단리된다.
[0386] 일부 구체예에서, 적어도 두 개의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된다.
[0387] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포는 PD-1, TIM-2, LAG-3 및/또는 CD137 및 적어도 하나의 다른 T 세포 활성화 마커의 양성 표면 발현에 기초하여 선택, 농축 또는 단리된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포는 CD137 및 적어도 하나의 다른 T 세포 활성화 마커의 양성 표면 발현에 기초하여 선택, 농축 또는 단리된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 다른 T 세포 활성화 마커는 PD-1, TIM-3, LAG-3, CD107, CD107a, CD137, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 다른 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 다른 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137의 양성 표면 발현에 기초하여 선택, 농축 또는 단리된다.
[0388] 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD137(41BB) 및 CD134(OX40)를 포함한다.
[0389] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포는 돌연변이-관련 또는 종양-관련 펩타이드에 결합된 MHC 테트라머를 사용하여 선택된다. 일부 구체예에서, 테트라머는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 알고리즘을 사용하여 제조된다. 일부 구체예에서, 테트라머는 형광 표지된 것과 같이 검출가능하게 표지된다. 일부 구체예에서, 테트라머는 생물학적 세포의 공급원이 수득되는 대상체에 HLA-맷칭된다. 일부 구체예에서, MHC 테트라머를 사용하는 세포의 선택은 세포 공급원, 예를 들어, 세포 공급원으로부터 직접적으로 이루어진다. 대상체의 샘플에 대한 말초 혈액. 일부 구체예에서, MHC 테트라머를 사용한 세포의 선택은 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하거나 농축한 후이다.
[0390] 세포를 단리, 선택 및/또는 농축하는 방법은 상기 섹션 I.B에 기재된 바와 같은 임의의 방법을 사용하는 것과 같은 양성 또는 음성 선택 기반과 같은 다양한 방법 중 임의의 것에 의한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 방법은 면역친화성-기반 선택을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 자성 비드 분리, 형광 세포 분류, 및 일회용 폐쇄 카트리지 기반 세포 분류기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방식으로 농축되거나 분류될 수 있다. 특정 태양에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 비제한적인 예로서, CliniMACS, Sony FX500 또는 Tyto 세포 분류 시스템(Miltenyi)와 같은 세포 선택 장비 상에서 형광성 항체, 나노입자 또는 비드를 이용하여, 반응성 세포를 선택하는데 이용될 수 있다.
[0391] 일부 구체예에서, 선택은 이러한 T 세포 활성화 마커 중 하나 이상에 대해 추가로 양성인, CD3+ T 세포 또는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 농축된 세포 집단과 같은 농축된 세포 집단을 생성한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포는 종양-반응성 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포와 관련된 T 세포를 포함하거나 이에 대해 농축된다. 일부 구체예에서, 농축된 세포 집단은 제공된 방법 중 임의의 것의 하나 이상의 단계에 따라 배양, 자극 또는 활성화, 및/또는 확장을 포함하는 후속 프로세싱 단계와 같은 후속 프로세싱 단계에서 사용된다.
[0392] 일부 구체예에서, 농축된 세포 집단은 전술한 바와 같이, 농축된 세포 집단 내의 특정 표현형의 세포, 예컨대 종양-반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포의 백분율이, 출발 샘플 내 그러한 세포의 백분율보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 500%, 1000%, 5000% 또는 그 이상 증가되는, 출발 샘플로부터의 농축된 세포이다. 일부 구체예에서, 농축된 조성물 중 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포 또는 종양-반응성 CD3+ T 세포의 순도, 즉 농축된 세포 집단 내 총 세포에 대한 선택된 세포 표면 마커에 대해 양성인 세포의 백분율은, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%이고, 일반적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다.
E. 추가 확장 및 수확
[0393] 일부 구체예에서, 공동-배양물로부터의 T 세포, 또는 그로부터 선택된 T 세포는 공동-배양 후 세포를 생체외에서 확장시키는 조건 하에 추가로 인큐베이션된다. 인큐베이션은 T 세포를 확장시키는 것과 같이 T 세포를 자극하기 위한 조건 하에 하나 이상의 T 세포 자극 제제의 존재 하에 수행된다. T 세포 자극 제제(들)는 상기 섹션 B.2에 기술된 바와 같은 것을 포함할 수 있다.
[0394] APC의 존재 하에 공동배양 전 또는 반응성 세포의 선택 후에, T 세포는 APC에 의해 제시된 항-CD3 및 항-CD28과 같은(이에 국한되지 않음) 림프구의 하나 이상의 T 세포 자극 제제와 함께 인큐베이션된다. 또는 가용성 항체로서 활성화된 T 세포 집단을 생성할 수 있다. 제공된 구체예에서, 이러한 확장은 비제한적인 예로서 OX40 및 41BB의 작용제를 비롯한 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 수용체(TNFSR) 작용제와 같은 공동자극 작용제의 존재 하, 및/또는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 축 억제제를 비롯한 세포자멸사 억제제의 존재 하에 7-20일에 걸쳐 일어날 수 있다. 이러한 가용성 작용제 및 세포자멸사 억제제는 확장 단계의 최대 배양 시간 또는 최소 24시간 동안 배양물에 존재할 수 있다. 일반적으로 배양 및 인큐베이션은 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)의 존재 하에 발생할 수 있다. 확장 방법은 폐쇄 자동화 시스템 및 무혈청 배지 사용을 포함하여 GMP 조건에서 수행할 수 있다. 확장 후 치료 용량에 도달하면 제품을 농축하고 냉동 보존 배지에서 동결할 수 있다. 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 T 세포의 집단 및 그의 제약 조성물도 제공된다.
[0395] 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제 및/또는 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제로부터 선택된다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD3 항체, 예컨대 OKT3이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 선택적으로 비분열 또는 광조사된 PBMC를 포함한다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD28 항체이다. 제공된 임의의 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 각각 가용성인 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체이다.
[0396] 제공된 방법의 구체예에서, 자극 조건은 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드 및/또는 T 세포에서 공동자극 신호를 켜거나 개시하는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 이러한 제제는 TCR 성분, 예컨대 항-CD3, 및/또는 공동자극 수용체, 예컨대 항-CD28 또는 항-4-1BB에 특이적인 항체와 같은 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 제제는 가용성 항체로서 배양 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, 이러한 제제는 비드와 같은 고체 지지체에 결합된다. 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 포함한다.
[0397] 항-CD3 항체는 T 세포, 전형적으로 인간 T 세포 상의 인간 CD3 표면 상의 CD3 수용체에 대해 지향되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함할 수 있다. 항-CD3 항체에는 무로모납이라고도 알려진 OKT3이 포함된다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3E로도 알려진 UHCTI 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체에는 예를 들어 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙이 포함된다. 항-CD3 항체는 가용성 시약으로 첨가되거나 비드에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 가용성이다.
[0398] 특정 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3 항체를 포함하고, 이는 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 항-CD3 항체는 약 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 약 0.5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 1 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 at 또는 50 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL 또는 약 30 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도 범위로 첨가된다.
[0399] 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 OKT3이다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT3 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다.
[0400] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD3 항체와의 인큐베이션 및 CD28에 특이적으로 결합하거나 세포에서 CD28-매개 신호를 자극 또는 유도하는 추가 제제와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 구체예에서, CD28-매개 신호는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 개시되거나 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, CD28-매개 신호는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 항원-제시 먹이세포(APC)에 의해 제공될 수 있다.
[0401] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 비분열 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 T 세포 먹이세포의 집단에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 비분열 먹이세포는 감마선 조사된 PBMC 먹이세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 태양에서, 먹이세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 결과적인 세포 집단은 확장될 초기 집단의 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40개 이상의 PBMC 먹이세포를 함유한다. 일부 구체예에서, T 세포 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다.
[0402] 일부 구체예에서, T 세포 자극 제제(들)는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 세포 집단에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 항-CD28 항체는 T 세포의 표면 상의 CD28 수용체에 대해 지향되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함할 수 있다. 항-CD28 항체의 비제한적 예에는 NA/LE(예컨대 BD Pharmingen), IM1376(예컨대 Beckman Coulter) 또는 15E8(예컨대 Miltenyi Biotec)이 포함된다. 항-CD28 항체는 가용성 시약으로 첨가되거나 비드에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD3 항체는 가용성이다. 일부 구체예에서, 항-CD28 항체는 약 1 ng/mL 내지 1000 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도 범위로 첨가된다.
[0403] 일반적으로, 배양 및 인큐베이션은 재조합 사이토카인의 존재하에 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 사이토카인은 배양 배지에 첨가되거나 외인성이다. 제공된 구체예 중 일부에서, 배양은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인의 존재하에 수행된다. 일부 구체예에서, 배양 및 인큐베이션은 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 배양은 IL-2의 존재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 배양은 일부 태양에서 IL-2를 추가로 포함하지 않는 IL-15 및 IL-17의 존재하에 수행된다.
[0404] 재조합 사이토카인은 일반적으로 재조합 인간 단백질이다. 특정 구체예에서, 재조합 사이토카인은 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 적어도 또는 적어도 약 0.5 IU/mL, 적어도 또는 적어도 약 1.0 IU/mL, 적어도 또는 적어도 약 5 IU/mL, 적어도 약 또는 약 10 IU/mL, 적어도 약 또는 약 100 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 1500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 2500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 3500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 4500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 5500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 6500 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7000 IU/mL, 적어도 약 또는 약 7500 IU/mL, 또는 적어도 약 또는 약 8000 IU/mL의 농도로 존재한다. 일 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 또는 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 또는 약 1000 내지 약 2000 IU/mL, 약 2000 내지 약 3000 IU/mL, 약 3000 내지 4000 약 IU/mL, 약 4000 내지 약 5000 IU/mL, 약 5000 내지 약 6000 IU/mL, 약 6000 내지 약 7000 IU/mL, 약 7000 내지 약 8000 IU/mL를 포함한다.
[0405] 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 세포 배양 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 배양 배지에 약 10 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL 또는 약 600 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 50 내지 400 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0406] 일부 구체예에서, 인큐베이션은 고용량 IL-2와 함께 수행된다. 일부 태양에서, IL-2는 배양물에 첨가되는 유일한 재조합 사이토카인이다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 배양 배지에 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL, 예를 들어 약 1000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 2000 IU/mL at 약 8000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 2000 IU/mL 내지 약 4000 IU/mL, 4000 IU/mL at 약 8000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 4000 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL, 약 5000 IU/mL at 약 8000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL, 약 5000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL, 약 6000 IU/mL at 약 8000 IU/mL, 약 6000 IU/mL 내지 약 7000 IU/mL 또는 약 7000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-2는 약 6000 IU/mL의 양으로 존재한다.
[0407] 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 세포 배양 배지에 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-15는 배양 배지에 약 10 IU/mL 및 500 IU/mL, 예를 들어 약 10 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 30 IU /mL, 약 30 IU/mL 내지 500 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 30 IU/mL 내지 약 50 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 50 IU/mL 내지 약 70 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 70 IU/mL 내지 약 100 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 300 IU/mL, 약 300 IU/mL 내지 약 500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 또는 약 400 IU/mL 내지 약 500 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 배양 배지에 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-15는 배양 배지에 약 180 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0408] 일부 구체예에서, 재조합 IL-7이 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-7은 배양 배지에 약 100 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 200 IU/mL 내지 약 400 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 400 IU/mL 내지 약 600 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약1000 IU/mL, 약 600 IU/mL 내지 약 800 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 800 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL, 약 1000 IU/mL 내지 약 1500 IU/mL, 약 1500 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 1000 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-7은 배양 배지에 약 600 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0409] 일부 구체예에서, 재조합 IL-21이 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 재조합 IL-21은 배양 배지에 약 0.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 0.5 IU/mL 내지 약 1 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 1 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 2.5 IU/mL 내지 약 5 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 약 5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 20 IU/mL, 약 10 IU/mL 내지 약 15 IU/mL, 또는 약 15 IU/mL 내지 약 20 IU/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 0.5 IU/mL 내지 약 2.5 IU/mL의 양으로 첨가된다. 일부 구체예에서, IL-21은 배양 배지에 약 1 IU/mL의 양으로 첨가된다.
[0410] 제공된 구체예에서, 이러한 확장은 섹션 II에 기재된 임의의 것과 같은 T 세포 아쥬반트의 존재하에 발생할 수 있다. 일부 태양에서, T 세포 아쥬반트는 OX40 및 41BB의 작용제를 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 수용체(TNFSR) 작용제와 같은 공동자극 작용제이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 축의 억제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포자멸사 억제제이다. 이러한 가용성 작용제 및 세포자멸사 억제제는 확장 단계의 최대 배양 시간 또는 최소 24시간 동안 배양물에 존재할 수 있다.
[0411] 분류 또는 선택된 T 세포는 일부 구체예에서, 하나 이상의 자극 조건 하에 세포 확장에 적합한 배양 용기 내에서 확장될 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 용기는 G-Rex 시스템(예컨대 G-Rex 10, G-Rex 10M, G-Rex 100 M/100M-CS 또는 G-Rex 500 M/500M-CS)과 같은 기체 투과성 배양 용기이다. 일부 구체예에서 배양 용기는 폐쇄 시스템에서 세포의 확장에 적합한 마이크로플레이트, 플라스크, 바 또는 기타 배양 용기이다. 일부 구체예에서, 확장은 생물반응기에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 확장된 T 세포의 조성물은 폐쇄 시스템으로부터 제거되고 확장을 위해 생물반응기에 배치되고/되거나 연결된다. 분류되거나 선택된 T 세포는 생물반응기(예컨대 Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare))와 연결된 기체 투과성 백으로 세포로 이동하여 세포 확장 시스템을 사용하여 확장할 수 있다. 일 구체예에서, 세포 확장 시스템은 배양 용기, 예를 들어 백, 예컨대 용적이 약 50 mL, 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 및 약 10 L, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값인 기체 투과성 세포 백일 수 있다. 일부 구체예에서, 프로세스는 자동화되거나 반자동화된다. 자동화된 관류 확장에 적합한 생물반응기의 예에는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, 및 Pall XRS Bioreactor Systems, 또는 Miltenyi Prodigy가 포함된다. 일부 태양에서, 확장 배양은 정적 조건 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 확장 배양은 요동(rocking) 조건 하에 수행된다. 배지는 볼루스로 추가하거나 관류 일정에 따라 추가할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물반응기는 약 37℃의 온도에서 약 5%의 CO2 수준으로, 약, 또는 적어도 0.01 L/분, 0.05 L/분, 0.1 L/분, 0.2 L/분, 0.3 L/분, 0.4 L/분, 0.5 L/분, 1.0 L/분, 1.5 L/분, 또는 2.0 L/분 또는 2.0 L/분을 상회하는 일정한 공기 흐름으로 유지된다. 특정 구체예에서, 배양의 적어도 일부는 290 ml/일, 580 ml/일 및/또는 1160 ml/일의 속도로 관류로 수행된다.
[0412] 일부 구체예에서, 세포는 적절한 배양 용기(예컨대 기체 투과성 백)에, 0.5 x 106 세포/mL 내지 1.5 x 106 세포/mL의 밀도로 접종된다. 일부 구체예에서, 밀도는 약 0.5 x 106 세포/mL, 0.75 x 106 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 1.25 x 106 세포/mL 또는 1.5 x 106 세포/mL, 또는 전술한 임의의 값 사이의 임의의 값이다.
[0413] 일부 태양에서, 세포는 관류가 가능한 자동화된 폐쇄 확장 시스템에서 확장된다. 관류는 최적의 성장률이 달성되도록 지속적으로 세포에 배지를 추가할 수 있다.
[0414] 일부 구체예에서, 확장은 Xuri 세포 확장 시스템 생물반응기를 사용하여 수행된다. 세포는 mL당 50만-150만개의 세포로 접종할 수 있다. 세포는 정적 또는 요동 조건에서 배양될 수 있다. 배지는 볼루스 또는 관류 일정에 따라 추가할 수 있다. 구체예에서, 생물반응기는 약 37℃ 부근의 온도 및 약 5% 부근의 CO2 수준을 유지한다. 배양물의 부피는 대략 0.5 L 내지 1.0 L로 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 확장은 7-14일, 예컨대 7-10일 동안 수행된다. 일부 태양에서, 확장은 확장 후 1억 내지 500억 개의 세포 및/또는 10 내지 1000배 확장의 배수 확장을 초래한다.
[0415] 일부 구체예에서, 확장은 Miltenyi Prodigy 생물반응기를 사용하여 수행된다. 세포는 mL당 50만-150만 세포로 접종할 수 있다. 세포는 정적 또는 진탕 조건에서 배양될 수 있다. 배지는 볼루스 또는 관류 일정에 따라 추가할 수 있다. 구체예에서, 생물반응기는 약 37℃ 부근의 온도 및 약 5% 부근의 CO2 수준을 유지한다. 배양물의 부피는 약 70mL에서 400mL로 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 확장은 7-14일, 예컨대 7-10일 동안 수행된다. 일부 태양에서, 확장은 확장 후 1억 내지 30억 개의 세포 및/또는 10 내지 1000배 확장을 초래한다.
[0416] 일부 구체예에서, 확장은 기체 투과성 백을 사용하여 수행된다. 세포는 mL당 50만-150만 세포로 접종할 수 있다. 세포는 정적 조건에서 배양될 수 있다. 구체예에서, 생물반응기는 약 37℃ 부근의 온도 및 약 5% 부근의 CO2 수준을 유지한다. 이러한 태양에서, 세포 농도가 mL당 200만 세포를 초과하는 경우, 세포 농도가 mL당 50만 내지 100만 세포가 되도록 배지를 첨가할 수 있다. 부피가 백의 최대 부피에 도달하면 동일한 조건에서의 배양을 위해 세포를 더 큰 백 또는 여러 백에 첨가한다. 일부 구체예에서, 확장은 7-14일, 예컨대 7-10일 동안 수행된다.
[0417] 확장 방법은 폐쇄 자동화 시스템 및 무혈청 배지 사용을 포함하는 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 방법의 단계 중 임의의 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 또는 GMP 조건 하에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 모든 프로세스 작업은 GMP 스위트에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄 시스템은 세포 요법제를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 방법의 다른 처리 단계 중 하나 이상을 수행하는 데 사용된다. 일부 구체예에서, 예컨대 단리, 선택 및/또는 농축, 처리, 세포의 확장과 관련된 인큐베이션을 포함하는 배양 단계, 및 제제화 단계와 같은, 처리 단계 중 하나 이상 또는 모든 단계들은 시스템, 장치, 또는 통합 또는 자체 포함된 시스템 및/또는 자동화 또는 프로그래밍 가능한 방식의 장치를 이용하여 수행된다. 일부 태양에서, 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 통신하고, 사용자로 하여금 결과물을 프로그램, 제어, 평가하고/하거나 처리, 단리, 엔지니어링 및 제제화 단계의 다양한 태양을 조정하게 해주는, 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
[0418] 일부 구체예에서, 종양 반응성 세포의 확장을 위한 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 약 1일, 일반적으로 예컨대 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 기간 범위 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 종양 반응성 세포의 확장을 위한 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 7-21일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14,일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 기간 범위 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 7-14일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 7-10일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 7일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 8일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 9일 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 약 10일 동안 수행된다. 일부 경우 배지는 배양 또는 인큐베이션 동안 매일, 격일로, 3일마다, 5일마다 또는 매주 교환할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 제제(예를 들어, 사이토카인, 항-CD3)는 각 배지 교환에서 보충된다.
[0419] 일부 구체예에서, 제공된 임의의 방법에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 종양-반응성 세포 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 양성인 세포와 같은 세포의 역치 양이 수득될 때까지 수행된다. 일부 구체예에서, 제공된 임의의 방법에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 림프구를 농축한 시점으로부터 최대 30일까지 수행된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제공된 방법 중 임의의 것에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 배양 개시 시점으로부터 최대 30일까지 수행된다. 일부 구체예에서, 제공된 임의의 방법에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 1차 확장의 개시 후 최대 20일까지 수행된다. 일부 구체예에서, 제공된 임의의 방법에 따라 세포를 확장하기 위한 배양 방법은 공동-배양 개시 후 최대 20일까지 수행된다. 제공된 임의의 구체예에서, 수확은 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 배양 및/또는 농축 개시 후 20일 이내에 수행된다. 일부 태양에서, 세포는 약 7일, 또는 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일, 약 15일 또는 약 16일, 약 17일 또는 약 18일, 약 19일 또는 약 20일, 또는 약 21일, 약 22일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일 일, 약 29일 또는 약 30일, 또는 전술한 값 중 임의의 것 사이의 임의의 시점에서 수확된다. 제공된 임의의 구체예에서, 세포는 배양 개시 후 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 10 내지 14일 또는 14 내지 20일에 수확된다. 여기서 일수는 세포가 배양물에 존재하는 일수와 관련이 있으며 임의의 하나 이상의 단계로부터의 세포가 동결보존을 위한 조건 하에 저장될 수 있는 기간은 포함하지 않는 것으로 이해하여야 한다.
[0420] 제공된 임의의 일부 구체예에서, 배양은 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 전체 세포 또는 전체 생존 세포인 세포의 역치 양, 즉 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포가 달성될 때까지 수행된다.
[0421] 제공된 임의의 구체예에서, 본 방법은 적어도 약 2배 이상, 적어도 약 2배 이상, 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배 이상, 적어도 약 1000배 이상, 또는 그 이상의 T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래한다.
[0422] 확장 후 후 치료 용량에 도달하면 생성물을 동결보존 배지에서 농축 및 동결시킬 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 T 세포의 집단 및 그의 의약 조성물이 제공된다.
II. T 세포 조절 제제 또는 아쥬반트
[0423] 제공된 임의의 방법 태양에서, T 세포 집단은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 인큐베이션은 아쥬반트가 집단에서 T 세포의 생존을 촉진 또는 증가시키고, 세포자멸사를 감소 또는 방지하고 및/또는 제공된 방법에 의해 세포의 확장을 지속시키는 조건 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 비제한적인 예로서 T 세포 아쥬반트는 OX40 및 41BB의 작용제를 비롯한 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 수용체(TNFSR) 작용제와 같은 공동자극 작용제이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 축의 억제제를 비롯한 세포자멸사 억제제이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 비제하적인 예Fh서 PD-1의 길항제를 비롯한, 체크포인트 억제제와 같은 체크포인트 조절제이다. 일부 구체예에서, T 세포 아쥬반트는 비제한적인 예로서 Hsp90 단백질의 억제제를 비롯한 열 충격 단백질 억제제이거나 이를 포함할 수 있다.
[0424] 제공된 방법의 태양에서, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트(예컨대 공동자극 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 체크포인트 억제제)는 제공된 방법의 하나 이상 또는 모든 단계 동안 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트는 생물학적 샘플로부터 T 세포의 1차 확장 또는 초기 확장 동안 포함된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트는 공동-배양물로부터 종양-반응성 T 세포의 농축 후 T 세포의 2차 확장 또는 최종 확장 동안 포함된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트는 1차 확장 및 2차 확장 양자 모두 동안에 포함된다. 일부 경우에, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트는 APC/펩타이드 네오에피토프와 T 세포와의 공동-배양 동안 포함된다.
[0425] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 1종 이상의 공동자극 작용제, 세포자멸사 억제제, 체크포인트 억제제 또는 열 충격 단백질 억제제와 같은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은, 배양의 전체 과정 또는 그 일부 동안 동안 독립적으로 계속된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 5일 이하, 3일 이상 또는 2일 이하 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 각각과의 인큐베이션은 독립적으로 12시간 내지 96시간, 예컨대 24시간 내지 48시간, 예컨대 일반적으로 약 48시간 동안 수행된다.
A. 제제 또는 아쥬반트
1. 공동자극 작용제
[0426] 제공된 임의의 방법 태양에서, T 세포의 집단은 하나 이상의 공동자극 작용제의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 공동자극 작용제는 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자에 특이적으로 결합하여 세포에서 하나 이상의 세포내 신호를 자극하고/하거나 T 세포의 하나 이상의 기능적 또는 생물학적 활성을 자극하는 분자이다. 일부 구체예에서, 작용제는 T 세포의 생존 및 활성을 촉진한다. 일부 구체예에서, 공동자극 분자는 수용체의 종양 괴사 인자 수퍼패밀리(TNFSR)의 구성원이다. 예시적인 공동자극 분자는 4-1BB, OX40, GITR 및 CD27을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 4-1BB 작용제, OX40 작용제, GITR 작용제 또는 CD27 작용제이다.
[0427] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 공동자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
[0428] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 공동자극 수용체의 리간드의 세포외 결합 도메인 또는 그의 특이적 결합 부분이거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 세포외 결합 도메인, 또는 이의 특이적 결합 단편은 작용제의 결합력(binding avidity)을 증가시키기 위해 다른 폴리펩타이드와의 융합 단백질로서 제공된다. 예를 들어, 일부 경우에 폴리펩타이드는 분자의 이량체화, 삼량체화, 사량체화 또는 오량체화를 촉진할 수 있는 다량체화 도메인이다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 이량체이다. 일부 구체예에서, 다량체화 도메인은 상보적 다량체화 도메인과 상호작용하여 안정한 단백질-단백질 상호작용을 형성하여 폴리펩타이드 분자와 다른 폴리펩타이드 분자의 다량체를 생성할 수 있는 아미노산의 임의의 서열을 포함한다. 예를 들어, 다량체화 도메인은 상보적 분자와 이황화 결합을 형성할 수 있는 분자일 수 있다. 예시적인 다량체화 도메인은 면역글로불린 서열 또는 이의 일부분, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 및 양립가능한 단백질-단백질 상호작용 도메인을 포함한다. 다량체화 도메인은 예를 들어 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형을 포함하는 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM로부터의 Fc 도메인 또는 변형된 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 Fc 융합 단백질이다.
[0429] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 OX40(CD134) 작용제이다. 세포 표면 당단백질이자 종양 괴사 인자 수용체 패밀리(TNFRSF)의 구성원인 OX40은 T-림프구에서 발현되고 활성화된 T-세포의 증식 및 생존을 위한 공동 자극 신호를 제공한다. OX40은 일반적으로 CD28과 달리 휴지기 나이브 T 세포에서 구성적으로 발현되지 않는다. OX40은 일부 태양에서 활성화 후 24 내지 72시간 후에 발현되는 2차 공동자극 면역 체크포인트 분자이며; 이것은 일부 태양에서, 활성화 후 24 내지 72 시간 후에 발현된다; 그의 리간드인 OX40L 역시 휴지기 항원 제시 세포에서 발현되지 않고 그들의 활성화를 따른다. OX40의 발현은 T 세포의 완전한 활성화에 의존한다; CD28 자극이 없는 경우와 같은 일부 경우에는 OX40의 발현이 지연되고 발현이 더 낮다. OX40은 활성화 후(예를 들어, 항-CD3, 예를 들어 OKT3/항-CD28과 함께) 또는 종양 항원 표적을 제시하도록 유도된 APC의 생체외 공동 배양 후에, 체내 T 세포 상에서 발현될 수 있거나(종양과의 공동 배양), 또는 종양 항원 표적을 제시하도록 유도된 APC의 생체외 공동 배양 후에 발현될 수 있다. OX40L에 의한 OX40의 결합은 OX40 경로의 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, 이 경로의 활성화는 증가된 활성화, 생존, 기억 반응 및 면역 억제 활성의 감소를 유도하는 다른 경로의 상향조절을 유도한다.
[0430] 일부 구체예에서, OX40 작용제는 인간 또는 포유동물 OX40에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편 또는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, OX40 작용제는 T 세포의 표면 상에 발현된 인간 OX40과 같은 인간 OX40에 결합한다. 일부 구체예에서, OX40 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하고 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 제거한다. 일부 구체예에서, OX40 작용제는 항체-의존성 세포 식세포 작용(ADCP)을 폐지한다. 일부 구체예에서, OX40 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 폐지한다. 일부 태양에서, OX40 작용제가 OX40 단백질 수용체에 결합할 때, 이는 T 세포 및 염증성 사이토카인의 생산 증가와 관련된 공동-자극 신호를 촉발한다. 제공된 방법에 사용하기 위한 OX40 작용제는 당업자에게 공지된 임의의 것을 포함한다.
[0431] 일부 구체예에서, OX40 작용제는 융합 단백질이다. OX40 융합 단백질에는 OX40L의 일부에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 것들이 포함된다. Sadun et al., (2009) J. Immunother., 182:1481-89 참조. 일부 구체예에서, 삼량체 또는 육량체 OX40 작용제(6개의 리간드 결합 도메인 중 3개 포함)와 같은 다량체 OX40 작용제가 사용될 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인을 함유하고 Fc와의 융합체로서 삼량체(3가) 또는 육량체(또는 6가) 또는 그 이상의 융합 단백질이 알려져 있고 사용될 수 있다. 예컨대 Gieffers et al. (2013) Cancer Therapeutics, 12:2735-47 참조.
[0432] 일부 구체예에서, OX40 작용제는 OX40L의 하나 이상의 도메인이 하나 이상의 추가 단백질 도메인에 공유적으로 연결된 융합 단백질이다. OX40 작용제로서 사용될 수 있는 예시적인 OX40L 융합 단백질은 미국 특허 번호 6,312,700; 7,622,444, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2011109789; 및 WO2010105068에 설명되어 있다. 일부 구체예에서, OX40 작용제는 다량체(예를 들어, 삼량체 또는 육량체) OX40L 융합 단백질로 자가-조립되는 OX40L 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 예를 들어 Morris et al. (2007) Mol Immunol. 44(12): 3112-3121, 미국 특허 번호 7,959,925에 설명되어 있다. 본원에 제공된 일부 구체예에 따라 사용될 수 있는 특이적 융합 단백 중 한 가지는 인간 OX40 리간드 융합 단백질인 MEDI6383(AZY/Medlmmune에 의해 생산됨)이며, 예를 들어 미국 특허 제6,312,700호를 참조할 수 있다.
[0433] 일부 구체예에서, OX40 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 제공된 방법에 사용하기 위한 예시적인 OX40 작용제의 비제한적인 예로는 타볼릭시주맙 (MEDI0562 또는 MEDI-0562로도 알려짐), 11D4 (미국 특허 Nos. 7,960,515; 8,236,930; 9,028,824), 18D8 (예컨대 미국 특허 Nos. 7,960,515; 8,236,930; 9,028,824); Hu119-122 (예컨대 미국 특허 Nos. 9,006,399 및 9,163,085, 및 국제 특허 공개 No. WO2012/027328); Hu106-222 (예컨대 미국 특허 Nos. 9,006,399 및 9,163,085, 및 국제 특허 공개 No. WO2012/027328); MEDI6469 (9B12로도 알려짐; 예컨대 Weinberg et al. (2006) J. Immunother., 29:575-585); 포갈리주맙 (MOXR0916 및 RG7888로도 알려짐; Genentech, Inc.); GSK3174998 (GlaxoSmithKline), 또는 PF-04518600 (PF-8600; Hamid et al. (2016) Journal of Clinical Immunology, 34:3079); BMS 986178; 또는 전술한 것들의 항원-결합 단편을 들 수 있다. OX40 작용제는 또한 타볼리지주맙, 11D4, 18D8, Hu119-122, Hu106-22, MED16469, 포갈리주맙, GSK3174998, PF-04518600 또는 BMS 986178에 포함된 6개의 CDR을 포함하는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 임의의 결합 분자를 포함한다.
[0434] 일부 구체예에서, OX40 작용제는 국제 특허출원 공개 Nos. WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, 및 WO 2014/148895; 유럽 특허 출원 EP 0672141; 미국 특허출원 공개 Nos. US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506, 및 US 2015/132288 (클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 Nos. 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399, 및 9,163,085 등에 개시된 OX40 작용제이다. OX40 작용제는 또한 L106 BD (Pharmingen Product #340420); ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073); 또는 항-mCD134/mOX40 (clone OX86), (InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH로부터 상업적으로 구입 가능함)과 같은 상업적으로 입수가능한 항체를 포함할 수도 있다
[0435] 제공된 임의의 구체예에 따라 사용될 수 있는 다른 OX40 작용제에는 예를 들어 Linch et al. (2015) Front Oncol. 5:34, 미국 특허 번호 6,312,700 및 미국 출원 공개 번호 20140271677에 설명된 바와 같은 뉴클레오타이드, 발현 벡터 및 펩타이드가 포함된다.
[0436] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 4-1BB(CD137) 작용제이다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 인간 또는 포유동물 4-1BB에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편 또는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 T 세포의 표면 상에 발현된 인간 4-1BB와 같은 인간 4-1BB에 결합한다. 4-1BB(CD137, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 9)는 활성화된 T 및 자연 살해(NK) 세포에서 발현되는 유도성 공동자극 수용체이다. T 세포에 대한 4-1BB 결찰은 항세포자멸사 분자의 상향 조절, 사이토카인 분비 및 향상된 이펙터 기능을 초래하는 신호 캐스케이드를 촉발한다. 감소된 세포독성 능력을 갖는 기능장애 T 세포에서 4-1BB 결찰은 이펙터 기능을 회복시키는 강력한 능력을 보여준다. NK 세포에서 4-1BB 신호전달은 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증가시킬 수 있다. 4-1BB를 표적으로 하는 작용성 모노클로날 항체는 암 면역요법을 위한 4-1BB 신호전달을 이용하기 위해 개발되었다. 다양한 유도 및 자발적 종양 모델에 있어서의 전임상 결과는 작용제 항체로 4-1BB를 표적으로 하는 것이 종양 제거 및 지속적인 항종양 면역으로 이어질 수 있음을 시사한다.
[0437] 일부 구체예에서 4-1BB 작용제는 독성을 감소시키는데 충분한 방식으로 4-1BB에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 폐지하는 작용성 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP)을 폐지하는 작용성 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 폐지하는 작용성 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다.
[0438] 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 융합 단백질이다. 4-1BB 융합 단백질은 4-1BBL에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 Fc에 융합된 4-1BB에 대한 결합을 위해 2개 이상, 예컨대 3개, 4개 또는 그 이상의 도메인을 포함하는 이량체(2가), 삼량체(3가) 또는 육량체(6가) 또는 그 이상의 융합체이다.
[0439] 일 구체예에서, 4- 1BB 작용제는 국제 특허출원 공개 Nos. WO 2008/025516 Al, WO 2009/007120 Al, WO 2010/003766 Al, WO 2010/010051 Al, 및 WO 2010/078966 Al; 미국 특허출원 공개 Nos. US 2011/0027218 Al, US 2015/0126709 Al, US 2011/0111494 Al, US 2015/0110734 Al, 및 US 2015/0126710 Al; 및 미국 특허 Nos. 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, 및 8,450,460에 설명된 4-1BB 작용성 융합 단백질이다.
[0440] 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 EU-101(Eutilex Co. Ltd.) 우토밀루맙, 또는 우렐루맙, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 우토밀루맙(PF-05082566, PF-2566 또는 MOR-7480으로도 알려짐)이다. 우토밀루맙 및 이의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 Nos. 8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 및 국제 특허출원 공개 No. WO 2012/032433 Al에 설명되어 있다. 일부 구체예에서, 4-1BB 작용제는 우렐루맙(BMS-663513 또는 20H4,9.h4a로도 공지됨)이다. 우렐루맙 및 그의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,288,638 및 8,962,804에 기재되어 있다. OX40 작용제는 우토밀루맙 또는 우렐루맙에 포함된 6개의 CDR을 포함하는 임의의 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 결합 분자도 포함한다.
[0441] 일 구체예에서, 4-1BB 작용제는 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-Ml27 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), ATCC No. HB-11248로 기탁되고 미국 특허 No. 6,974,863에 개시된 세포주에 의해 생산된 항체, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), 미국 특허출원 공개 No. US 2005/0095244에 개시된 항체, 미국 특허 No. 7,288,638 (예컨대 20H4.9-IgGl (BMS-663031))에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,887,673 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271)에 개시된 항체, 미국 특허 No. 7,214,493에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,569,997에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,905,685 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271)에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,362,325 (예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3El)에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,974,863 (예컨대 53A2); 미국 특허 No. 6,210,669 (예컨대 1D8, 3B8, 또는 3El)에 개시된 항체, 미국 특허 No. 5,928,893에 설명된 항체, 미국 특허 No. 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 No. 6,569,997, 국제 특허출원 공개 Nos. WO 2012/177788, WO 2015/119923, 및 WO 2010/042433에 설명된 항체, 및 이의 단편, 유도체, 컨쥬게이트, 변이체 또는 바이오시밀러로부터 선택된다.
[0442] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 CD27 작용제이다. 일부 구체예에서, CD27 작용제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 CD27에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, CD27 작용제는 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 폐지하는 작용성 CD27 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, CD27 작용제는 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP)을 폐지하는 작용성 CD27 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, CD27 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 폐지하는 작용성 CD27 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다.
[0443] 일부 구체예에서, CD27 작용제는 CD27에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, CD27 작용제는 모노클로날 항체 발리루맙(CDX-1127 또는 IFS로도 공지됨)이고, 그의 항원-결합 단편이다. 발리루맙의 제조 및 특성은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/145085 A2 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0274685 A1 및 US 2012/0213771 A1에 기재되어 있다.
[0444] 일부 구체예에서, CD27 작용제는 융합 단백질이다. CD27 융합 단백질은 CD27의 리간드(CD70)에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 Fc에 융합된 CD27에 결합하기 위한 2개 이상, 예컨대 3개, 4개 또는 그 이상의 CD70 도메인을 포함하는 이량체(2가), 삼량체(3가) 또는 육량체(6가) 또는 그 이상의 융합체이다.
[0445] 일 구체예에서, CD27 작용제는 미국 특허출원 공개 No. US 2014/0112942 Al, US 2011/0274685 Al, 또는 US 2012/0213771 Al, 또는 국제 특허출원 공개 No. WO 2012/004367 Al에 설명된 CD27 작용제이다.
[0446] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 GITR 작용제이다. 일부 구체예에서, GITR 작용제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 GITR에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, GITR 작용제는 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 폐지하는 작용성 GITR 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, GITR 작용제는 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 폐지하는 작용성 GITR 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, GITR 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 폐지하는 작용성 GITR 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다.
[0447] 일부 구체예에서, GITR 작용제는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 6C8 및 Ch-6C8-Agly로도 알려져 있는, 작용성, 항-GITR 모노클로날 항체 TRX518(TolerRx, Inc.)이다. 6C8 및 2F8 항체 및 이들의 변이체의 제조, 특성 및 용도는 미국 특허 번호 7,812,135; 8,388,967; 및 9,028,823에 기재되어 있다.
[0448] 일부 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 1D7, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 1D7의 제조 및 특성에 대하여는 미국 특허출원 공개 No. US 2015/0064204 Al에 설명되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 33C9, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 33C9의 제조 및 특성은 미국 특허출원 공개 No. US 2015/0064204 Al에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 33F6, 또는 또는 그의 항원-결합 단편이다. 33F6의 제조 및 특성은 미국 특허출원 공개 No. US 2015/0064204 Al에 기재되어 있다. 34G4의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 35B10, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 35B1O의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 41E11, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 41E11의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 41GS이거나 그의 항원-결합 단편이다. 41G5의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 42A11이거나, 그의 항원-결합 단편이다. 42A11의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 44C1, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 44C1의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 45A8, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 45A8의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 46E11, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 46E11의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 48H12, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 48H12의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 48H7, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 48H7의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 49D9이거나, 그의 항원-결합 단편이다. 49D9의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 49E2이거나 그의 항원 결합 단편이다. 49E2의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 48A9이거나, 그의 항원-결합 단편이다. 48A9의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 5H7, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 5H7의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 7A10이거나 그의 항원-결합 단편이다. 7A10의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 모노클로날 항체 9H6, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 9H6의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0064204 A1에 기재되어 있다.
[0449] 일 구체예에서, GITR 작용제는 미국 특허 제8,709,424호; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0189639 A1 및 US 2014/0348841 A1 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/028683 A1(Merck Sharp & Dohme Corp.)에 기재된 작용성 항-GITR 모노클로날 항체이다. 일 구체예에서, GITR 작용제는 36E5, 3D6, 61 G6, 6H6, 61F6, 1D8, 17F10, 35D8, 49Al, 9E5, 및 31H6으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용성, 항-GITR 모노클로날 항체, 및 그의 항원-결합 단편이다. 이들 항체의 구조, 특성 및 제조는 미국 특허 번호 8,709,424; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0189639 A1 및 US 2014/0348841 A1에 설명되어 있다.
[0450] 일 구체예에서, GITR 작용제는 국제 특허출원 공개 Nos. WO 2013/039954 Al 및 WO 2011/028683 Al; 미국 특허출원 공개 Nos. US 2013/0108641 Al, US 2012/0189639 Al, 및 US 2014/0348841 Al; 및 미국 특허 Nos. 7,812,135; 8,388,967; 및 9,028,823에 설명된 GITR 작용제이다.
[0451] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 확장 방법에서 T 세포 (예컨대 종양-반응성 T 세포) 대 공동자극 작용제의 비 (세포 대 mole)은 약 1 to 25, 약 1 내지 50, 약 1 내지 100, 약 1 내지 125, 약 1 내지 150, 약 1 내지 175, 약 1 내지 200, 약 1 내지 225, 약 1 내지 250, 약 1 내지 275, 약 1 내지 300, 약 1 내지 325, 약 1 내지 350, 약 1 내지 500, 약 1 내지 1000, 또는 약 1 내지 10000이다.
[0452] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 하나 이상의 공동-자극 작용제가 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 공동자극 작용제 각각은 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 또는 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 농도 범위로 독립적으로 첨가된다.
[0453] 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 확장을 위한 배양 방법을 수행하기 위한 T 세포의 단리 또는 선택 전에 대상체에게 투여된다. 이러한 구체예에서, 종양 반응성 T 세포 또는기재된 바와 같은 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 제공된 방법에 따라 세포를 배양하기 위해 생체외 단리, 선택 및/또는 농축 전에 생체내에서 재활력화되는 것으로 고려된다. 이러한 일부 구체예에서, 공동자극 작용제는 약 5 mg, 약 8 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 및 약 2000 mg, 또는 전술한 값들 사이의 임의의 값으로 이루어지는 군으로부터 선택된 용량을 주입함으로써 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 개시된 공동자극 작용제의 유효 용량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
[0454] 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 매주 투여된다. 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 2주마다 투여된다. 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 3주마다 투여된다. 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 매월 투여된다. 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 12주 기간에 걸쳐 4회 용량에 대해 매 3주마다 주어진 8 mg의 용량으로 정맥내 투여된다. 일 구체예에서, 공동자극 작용제는 초기에 낮은 용량으로 투여되고, 이후 매월 투여되는 후속 간격으로 투여될 때 증량된다. 예를 들어, 첫 번째 주입은 300mg의 공동자극 작용제를 전달할 수 있고, 후속되는 주 단위 용량은 8주 동안 공동자극 작용제 2,000mg을 전달할 수 있고, 이어서 매월 2,000mg의 공동자극 작용제를 전달하도록 할 수 있다.
2. 면역 체크포인트 억제제
[010] 일부 구체예에서, T 세포 조절제는 면역 체크포인트 경로를 억제하는 면역 체크포인트 억제제이다. 면역계에는 자가 내성을 유지하고 면역 반응을 조절하는데 관여하는 여러 억제 경로가 있다. 종양은 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 저항의 주요 기전으로 특정 면역 체크포인트 경로를 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). 이러한 많은 면역 체크포인트는 리간드-수용체 상호작용에 의해 시작되기 때문에 이들은 리간드 및/또는 그들의 수용체에 대한 항체에 의해 쉽게 차단될 수 있다.
[011] 따라서, 소분자, 핵산 억제제(예컨대 RNAi) 또는 항체 분자와 같은 면역 체크포인트 경로를 차단하는 길항 분자를 이용하는 요법은 암 및 기타 질병에 대한 면역 요법의 유망한 수단이 되고 있다.
[012] 본원에 사용된 용어 "면역 체크포인트 억제제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 간섭 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 체크포인트 단백질은 T 세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 이 단백질은 T 세포 반응의 공동-자극 또는 억제성 상호작용을 담당한다. 면역 체크포인트 단백질은 자가 내성과 생리적 면역 반응의 지속 기간 및 진폭을 조절하고 유지한다.
[013] 면역 체크포인트 억제제는 면역계의 억제 경로를 통계적으로 유의한 방식으로 차단하거나 억제하는 임의의 제제를 포함한다. 이러한 억제제는 소분자 억제제를 포함할 수 있거나 면역 체크포인트 수용체 리간드에 결합하고 이를 차단하거나 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 차단 또는 억제를 위해 표적화될 수 있는 예시적인 면역 체크포인트 분자의 비제한적인 예로는, PD1 (CD279), PDL1 (CD274, B7-H1), PDL2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG3 (CD223), TIM3, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, OX40 (CD134, TNFRSF4), CXCR2, 종양 관련 항원 (TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 분자 패밀리에 속하며 모든 NK, γδ 및 메모리 CD8+(αβ) T 세포에서 발현됨), CD160(BY55라고도 함) 및 CGEN-15049를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체이다. 면역 체크포인트 억제제는 PD1, PDL1, PDL2, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, 4-1BBL, GITR, CD40, OX40, CXCR2, TAA, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160, 및 CGEN-15049 중 하나 이상에 결합하여 이들의 활성을 차단하거나 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 기타 결합 단백질을 포함한다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제에는 이필리무맙 (항-CTLA4), 펨브롤리주맙 (항-PD1), 트레멜리무맙 (CTLA-4 차단 항체), 항-OX40L (예컨대 옥셀루밥), 및 PD-L1 모노클로날 항체 (항-B7-H1; MEDI4736)이 포함된다.
[014] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD1의 활성을 억제한다. 프로그램된 세포 사멸 1(PD1)은 B 세포, NK 세포 및 T 세포에서 발현되는 면역 체크포인트 단백질이다(Shinohara et al., 1995, Genomics 23:704-6; Blank et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56:739-45; Finger et al., 1997, Gene 197:177-87; Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). PD1의 주요 역할은 감염에 대한 반응으로 염증 동안 말초 조직에서 T 세포의 활성을 제한하고 자가면역을 제한하는 것이다(Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). PD1 발현은 활성화된 T 세포에서 유도되고 PD1의 내인성 리간드 중 하나에 대한 결합은 자극 키나제를 억제하고 TCR "정지 신호"를 억제하는 작용을 함으로써 T 세포 활성화를 억제하는 작용을 한다(Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). PD1은 조절 T 세포에서 고도로 발현되며 리간드의 존재 하에 이들의 증식을 증가시킬 수 있다(Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). 항-PD 1 항체는 흑색종, 비소세포폐암, 방광암, 전립선암, 결장직장암, 두경부암, 삼중음성 유방암, 백혈병, 림프종 및 신세포암의 치료에 사용되어 왔다 (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Lipson et al., 2013, Clin Cancer Res 19:462-8; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:3044-51; Gildener-Leapman et al., 2013, Oral Oncol 49:1089-96; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85). 예시적인 항-PD1 항체는 니볼루맙(BMS의 Opdivo), 펨브롤리주맙(Merck의 Keytruda), 피딜리주맙(Cure Tech의 CT-011), 람브롤리주맙(Merck의 MK-3475), 및 AMP-224(Merck)를 포함한다.
[015] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD-L1의 활성을 억제한다. PD-L1(CD274 및 B7-H1로도 알려짐) 및 PD-L2(CD273 및 B7-DC로도 알려짐)는 활성화된 T 세포, B 세포, 골수 세포, 대식세포 및 일부 유형의 종양 세포에서 발견되는 PD1에 대한 리간드이다. PD1과 PD-L1의 복합체는 CD8+ T 세포의 증식을 억제하고 면역 반응을 감소시킨다 (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Brahmer et al., 2012, N Eng J Med 366:2455-65). 항-PD-L1 항체는 비소세포폐암, 흑색종, 결장직장암, 신장세포암, 췌장암, 위암, 난소암, 유방암 및 혈액암의 치료에 사용되어 왔다 (Brahmer et al., N Eng J Med 366:2455-65; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300-9; Radvanyi et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5541; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:13044-51). 예시적인 항-PD-L1 항체로는 MDX-1105 (Medarex), MEDI4736 (Medimmune) MPDL3280A (Genentech), BMS-935559 (Bristol-Myers Squibb) 및 MSB0010718C를 들 수 있다.
[016] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4의 활성을 억제한다. CD152로도 알려진 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA-4)은, T-세포 활성화를 조절하는 기능을 하는 공동-억제성 분자이다. CTLA-4는 T 세포에서만 발현되는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA-4는 T-세포 활성화를 억제하는 작용을 하며 헬퍼 T-세포 활성을 억제하고 조절 T-세포 면역억제 활성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다(Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). 항-CTLA-4 항체는 흑색종, 전립선암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암의 치료를 위한 임상 시험에서 사용되어 왔다(Robert & Ghiringhelli, 2009, Oncologist 14:848-61; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300; Weber, 2007, Oncologist 12:864-72; Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). 예시적인 항-CTLA-4 항체에는 이필리무맙 (Bristol-Myers Squibb) 및 트레멜리무맙 (Pfizer)이 포함된다. 이필리무맙은 전이성 흑색종의 치료에 대해 FDA 승인을 받았다 (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).
[017] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 LAG-3의 활성을 억제한다. CD223으로도 알려진 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)은 또 다른 면역 체크포인트 단백질이다. LAG-3는 림프구 활성의 억제 및 어떤 경우에는 림프구 무산소증의 유도와 관련이 있다. LAG-3는 B 세포, NK 세포 및 수지상 세포를 비롯한 면역계의 다양한 세포에서 발현된다. LAG-3은 MHC 클래스 II 수용체에 대한 천연 리간드이며, 이는 강력한 면역 억제 활성이 부여된 세포를 포함하는 흑색종 침윤 T 세포에서 실질적으로 발현된다 (Goldberg et al., Curr Top Microbiol Immunol (344) 269-278, 2011). 예시적인 항-LAG-3 항체에는 렐라틀리맙으로도 알려진 BMS-986016이 포함된다. IMP321은 면역 체크포인트 분자 LAG-3의 가용성 버전으로서, 수지상 세포를 활성화하여 항원 제시를 증가시킨다.
[018] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 TIM-3의 활성을 억제한다. CD366으로도 알려진 T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인-3(TIM-3)은 활성화된 Th1 세포에서 처음 확인되었으며 면역 반응의 음성 조절자인 것으로 나타났다. TIM-3의 차단은 T 세포 매개 항종양 면역을 촉진하고 다양한 마우스 종양 모델에서 항종양 활성을 갖는다. 항-PDL1 항체 등과 같은 다른 면역치료제와 TIM-3 차단의 조합은 항종양 효과를 증가시키는 데 있어 부가적이거나 상승적일 수 있다. TIM-3 발현은 흑색종, NSCLC 및 신장암을 비롯한 다양한 종양 유형과 관련이 있으며, 추가로 종양내 TIM-3의 발현은 NSCLC, 자궁경부암, 및 위암. 예시적인 항-TIM3 항체에는 TSR-022 및 LY3321367을 비롯한 종양 유형에 걸쳐 저조한 예후와 연관된 것으로 나타났다.
3. 세포자멸사 억제제
[0455] 제공된 임의의 방법 태양에서, T 세포의 집단은 세포에서 세포자멸사 또는 세포자멸사 신호전달 경로의 하나 이상의 억제제(이하 "세포자멸사 억제제")의 존재 하에 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, T 세포 요법의 생체외 제조 과정 동안 세포자멸사 억제제가 포함되면 확장 과정 동안 관심대상 T 세포의 개선된 수율을 초래한다. 특정 태양에서, 이러한 방법은 희귀하고 드문 내인성 세포 집단을 나타내는 종양-반응성 T 세포의 생체외 제조와 관련하여 사용된다. 설명된 공동 배양 방법에 의해 이러한 세포가 생체외에서 농축되는 경우에조차, 세포를 확장하는 과정에서 세포자멸사에 취약할 수 있다. 제공된 방법은 세포자멸사를 방지하거나 감소시키면서 증식을 증가시키고 이들의 활성화 및 확장을 지원함으로써 이러한 세포에 활력을 부여한다.
[0456] 일부 태양에서, 세포자멸사의 부재를 나타내는 하나 이상의 표현형이 제공된 방법에 의해 생성된 세포에서 감소된다. 세포자멸사는 특징적인 세포 변화와 죽음으로 이어지는 일련의 고정관념적 형태 및 생화학적 사건을 포함하는 프로그램된 세포 죽음의 과정이다. 이러한 변화에는 수포, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축, 염색체 DNA 단편화 및 전체 mRNA 붕괴가 포함된다. 세포자멸사는 잘 특성화된 과정이고, 다양한 단계와 관련된 특정 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 세포자멸사의 초기 단계에서, 세포 및 미토콘드리아 막의 변화가 분명해진다. 생화학적 변화는 세포질과 세포 핵에서도 분명한다. 예를 들어, 세포자멸사의 초기 단계는 특정 카스파제, 예를 들어 2, 8, 9 및 10의 활성화에 의해 나타날 수 있다. 세포자멸사의 중기에서 후기 단계는 막 완전성의 추가 상실, 염색질 응축 및 DNA 단편화를 특징으로 하며, 카스파제 3, 6 및 7의 활성화와 같은 생화학적 사건을 포함한다.
[0457] 특정 구체예에서, 제공된 방법에 의해 생성된 세포 또는 본원에 제공된 치료 T 세포 조성물은, 세포자멸사 마커에 대해 양성인 세포를 감소된 백분율 또는 빈도로 갖는다. 다양한 세포자멸사 마커가 당업자에게 공지되어 있으며 이의 비제한적인 예로는 하나 이상의 카스파제의 활성 증가, 즉 활성화된 카스파제의 활성 증가, PARP 절단의 증가, Bcl-2 패밀리 단백질의 활성화 및/또는 전위, 세포 사멸 경로의 구성원, 예를 들어 Fas 및 FADD, 핵 수축의 존재(예컨대 현미경으로 모니터링) 및 염색체 DNA 단편화의 존재(예컨대 염색체 DNA 사다리의 존재) 또는 TUNEL 염색및 Annexin V 염색을 포함하는 세포자멸사 분석을 들 수 있다. Annexin V는 세포자멸사 동안 원형질막의 내부에서 외부 소엽으로 전위되는 지질인 고친화성 포스파티딜세린(PS)과 우선적으로 결합하는 단백질이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법에 의해 생성된 세포 또는 본원에 제공된 치료 T 세포 조성물은, 세포자멸사를 개시하는 것으로 알려진 세포자멸사 촉진 인자(pro-apoptotic factors), 예를 들어, 사멸 수용체 경로의 구성원, 미토콘드리아(고유) 경로의 활성화된 구성원, 예를 들어 Bcl-2 패밀리 구성원, 예를 들어 Bax, Bad 및 Bid, 및 카스파제를 비롯한, 세포자멸사와 관련된 하나 이상의 인자의 발현에 대해 양성인 세포를 감소된 백분율 또는 빈도로 갖는다. 특정 구체예에서, 제공된 방법에 의해 생성된 세포 또는 본원에서 제공되는 치료 T 세포 조성물은, 예를 들어, T 세포 염색에 대해 양성인 세포의 감소된 백분율 또는 빈도를 갖는다. Annexin V 분자는 세포 조성물과 함께 배양되거나 접촉될 때 세포 사멸을 겪는 세포에 우선적으로 결합한다. 임의의 이러한 구체예에서, 이러한 세포의 감소된 빈도 또는 백분율은 유사한 과정에 의해 생성되지만 이러한 과정이 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션을 포함하지 않는 유사한 프로세스에 의해 생성된 치료 T 세포 조성물에 비해 감소된다. 일부 구체예에서, 세포자멸사는 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상 감소된다.
[0458] 특정 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas/Fas 리간드 축의 억제제이거나 카스파제의 억제제이며, 둘 다 특히 활성화된 T 세포의 세포자멸사를 유도하는 데 관여한다. 제공된 방법의 태양에서, 세포자멸사 억제제는 Fas/Fas-리간드 축에 의해 매개되고/되거나 카스파제에 의해 매개되는 신호전달을 감소 또는 파괴할 수 있다.
[0459] 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas/Fas-리간드 축(CD95/CD95L 축)을 파괴함으로써 세포자멸사를 억제한다. 일부 태양에서, 세포자멸사 억제제는 CD95에 의해 유도되거나 매개되는 세포자멸사를 억제한다. Fas 리간드(FasL 또는 CD95L)는 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리에 속하는 II형 막관통 단백질이다. 수용체와의 결합은 세포 사멸을 유도한다. Fas 리간드/수용체 상호작용은 면역계의 조절과 암의 진행에 중요한 역할을 한다. T 세포의 활성화는 Fas 리간드의 발현을 유도한다. T 세포는 초기에 클론 확장 동안 Fas-매개 세포자멸사에 내성이 있지만 이들이 더 오래 활성화될수록 점차적으로 더 민감해져서 궁극적으로 활성화 유도 세포 사멸(AICD)을 초래한다. 일부 태양에서, 이 과정은 과도한 면역 반응을 방지하고 자가반응성 T-세포를 제거하기 위해 생체내에서 필요한다. Fas 또는 Fas 리간드의 유해한 돌연변이가 있는 사람과 마우스는 비정상적인 T 세포의 축적을 일으켜 림프절병증, 비장 비대 및 홍반성 루푸스를 유발한다.
[0460] 제공된 방법의 태양에서, 종양-반응성 T 세포를 함유하는 집단과 같은 T 세포 집단은, Fas와 Fas 리간드 사이의 상호작용을 방해하거나 차단하는 세포자멸사 억제제와 인큐베이션되거나 접촉되며, 여기서 이러한 인큐베이션은 항원 및/또는 집단에서 T 세포를 활성화하거나 자극하는 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)에 의한 T 세포의 활성화와 동시에 또는 후속적으로 수행된다. 일부 구체예에서, T 세포의 활성화는 세포 표면에 발현된 Fas와 상호작용할 수 있는 Fas 리간드의 발현을 상향조절할 수 있고, 이에 의해 Fas와 결합하여 세포자멸사를 유발할 수 있다.일부 구체예에서, 이러한 상호작용을 차단하는 세포자멸사 억제제는 Fas 또는 Fas 리간드에 특이적으로 결합하여 이들의 상호작용을 차단함으로써 세포에서 Fas 신호전달 경로 및/또는 세포자멸사를 적어도 부분적으로 감소시키거나 차단하는 결합 분자일 수 있다. Fas 신호 경로 활성을 결정 및/또는 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Lavrik et. 알. (2012) Cell Death Differ., 19(1):36-41에 설명되어 있다.
[0461] 본 개시내용에 따른 억제제는 단백질 수준 및/또는 핵산 수준에 작용할 수 있다. 단백질 수준에 작용하는 억제제는 항체, 단백질 및/또는 소분자로부터 선택될 수 있다. 핵산 수준에 작용하는 억제제는 예를 들어 안티센스 분자, RNAi 분자 및/또는 리보자임이다. 억제제는 Fas(CD95) 및/또는 Fas 리간드(CD95L)에 결합한다. 추가 구체예에서, Fas/Fas 리간드 상호작용이 억제될 수 있다.
[0462] 일부 구체예에서, 억제제는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 일부 태양에서, 항체인 억제제는 Fas(CD95)에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체인 억제제는 CD95L에 결합할 수 있다. CD95L에 결합하는 항체의 예는 Nok-1 또는 이의 항원 결합 단편이며, 예컨대 카탈로그 No. 16-9919-81, ThermoFisher Scientific, Waltham MA)를 참조할 수 있다.
[0463] 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 가용성 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 CD95의 세포외 부분을 함유하지만 막관통 도메인이 없는 가용성 CD95 수용체 분자이다. 가용성 CD95 수용체 분자는 EP-A-0595659 또는 EP-A-0965637에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 WO99/65935에 기재된 바와 같은 CD95 수용체 펩타이드이거나 이를 포함한다.
[0464] 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas 리간드에 결합하는 융합 단백질이다. 특정 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 Fas(CD95)의 세포외 도메인 또는 Fas 리간드에 결합하는 그의 특이적 결합 단백질을 함유하고, 여기서 세포외 도메인 또는 특이적 결합 부분은, Fc 면역글로불린 분자와 같은 이종 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 구체예에서, 가용성 Fas 분자는 WO99/144330 또는 WO99/50413에 기재된 바와 같은 임의의 것이다. 일부 구체예에서, 가용성 Fas 분자는 FLINT 또는 DCR3 또는 그의 단편으로 알려진 분자이다.
[0465] 특정 구체예에서 세포자멸사 억제제는 Fas 리간드(CD95 리간드)에 결합하고 세포외 Fas(CD95) 도메인 및 Fc 도메인, 특히 인간 Fc 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. 일 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 CD95의 아미노산 26-173으로 제시된 성숙 CD95의 세포외 도메인의 전부 또는 인접을 포함하는 Fas의 세포외 도메인을 포함한다(예를 들어, UniProt 수탁 번호 P25445; 5,891,434). 일부 구체예에서, CD95는 인간 CD95이고 하기 서열(인간 CD95의 아미노산 26-173)을 갖는 세포외 도메인을 함유한다:
QVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSN
[0466] 일부 구체예에서, Fas(CD95)-Fc 융합 단백질은 WO2014/013039 또는 WO2014/013037에 기재된 바와 같은 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 세포외 Fas(CD95) 도메인은 인간 CD95의 아미노산 170, 171, 172 또는 173까지의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 인간 CD95의 아미노산 26-172를 함유한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편은 면역글로불린의 CH2 및/또는 CH3 도메인, 및 선택적으로 힌지 영역 도메인 또는 이로부터 유래된 변형된 면역글로불린 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 면역글로불린 도메인은 IgG, IgM, IgD 또는 IgE 면역글로불린 도메인 또는 이로부터 유래된 변형된 면역글로불린 도메인일 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 불변 IgG 면역글로불린 도메인의 적어도 일부를 함유하는 IgG의 Fc이다. IgG 면역글로불린 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 도메인 또는 이로부터 변형된 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc는 인간 Fc 도메인, 예를 들어 IgG Fc 도메인, 예를 들어 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 특정 구체예에서, Fas의 세포외 도메인 또는 그의 특이적 결합 단편은 예컨대 인간의 IgG1 분자로부터의 힌지 영역을 포함하는 Fc 면역글로불린 분자에 융합된다. 세포외 CD95 도메인 및 인간 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 WO 95/27735 또는 WO2004/085478에 기재되어 있다.
[0467] 일부 구체예에서, Fas (CD95)-Fc 융합 단백질은 APG101(아수너셉트: asunercept) 또는 그의 기능적 단편이다.
[0468] 일부 구체예에서, Fas (CD95)-Fc 융합 단백질은 CAN008이거나 또는 그의 기능적 단편이다.
[0469] 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 카스파제에 의해 유도되거나 매개되는 세포자멸사를 억제한다. 카스파제는 세포자멸사 및 염증을 유발하는 기능을 포함하여 세포 기능의 조절자로서 중요한 역할을 하는 관련 시스테인 프로테아제 패밀리이다. 카스파제 활성화 및 조절은 여러 메커니즘을 통해 엄격하게 제어된다. 위에서 설명한 7가지 카스파제는 세포자멸사 과정에 구체적으로 관여한다. 카스파제는 프로-도메인 및 활성화 메커니즘의 길이에 따라 개시제 및 이펙터 카스파제로 더 세분화된다. 개시제 카스파제는 연장된 프로-도메인의 결과로 카스파제 활성화 복합체에 동원(recruited)될 수 있다. 이펙터 카스파제 3 및 7은 단백질 분해 절단에 의해 활성화된다. 이들은 핵 응축, DNA 단편화, 원형질막 수포(plasma membrane blebbing) 및 결국 세포 사멸을 초래할 수 있는 다양한 세포 단백질을 절단할 수 있다. 카스파제 매개 세포자멸사의 억제는 위에서 설명한 카스파제 경로 구성요소 중 하나 또는 임의의 것의 억제로 인해 발생할 수 있다.
[0470] 카스파제 활성화를 통한 세포자멸사는 미토콘드리아 경로, 사멸 수용체 경로(즉, Fas/FasL, TNF/TNF 수용체), 소포체 스트레스 경로, 및 세포자멸사-유도 프로테아제 그랜자임 B 경유하는 것을 비롯하여 다양한 중복 경로로 개시될 수 있다.
[0471] 특정 구체예에서, 카스파제의 억제제인 세포자멸사 억제제는 집단의 세포에서 카스파제의 활성화를 감소시킨다. 특정 구체예에서, 카스파제 활성화는 당업자에게 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성화된 카스파제에 특이적으로 결합하는(즉, 절단된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는) 항체를 사용하여 카스파제 활성화를 검출할 수 있다. 또 다른 예에서, 카스파제 활성의 형광색소 억제제(FLICA) 분석을 이용하여, 카스파제-3에 의한 아세틸 Asp-Glu-Val-Asp 7-아미도-4-메틸쿠마린(Ac-DEVD-AMC)의 가수분해를 검출함으로써 카수파제-3- 활성화를 검출할 수 있다(즉, 형광성 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)의 방출을 검출함). FLICA 분석은 다중 카스파제(예컨대 FAM-VAD-FMK FLICA)에 의해 처리된 기질의 생성물을 검출함으로써 카스파제 활성화를 결정하는 데 사용할 수 있다. 다른 기술로는 발광성 카스파제-8 테트라펩타이드 기질 (Z-LETD-아미노루시페린), 카스파제-9 테트라펩타이드 기질 (Z-LEHD-아미노루시페린), 카스파제-3/7 기질 (Z-DEVD-아미노루시페린), 카스파제-6 기질 (Z-VEID-아미노루시페린), 또는 카스파제-2 기질 (Z-VDVAD-아미노루시페린)를 이용하는 CASPASE-GLO® 카스파제 분석법(PROMEGA)이 있다.
[0472] 세포자멸사 억제제의 예로는 범-카스파제 및 카스파제 특이적 억제제 양자를 모두 들 수 있다. 세포자멸사 억제제의 예로는 카스파제 억제제, 예를 들어 Emricasan (IDN-6556, PF-03491390), NAIP (뉴런 세포자멸사 억제 단백질; BIRC1), cIAP1 및 cIAP2 (세포자멸사 1 및 2의 세포 억제제; 각각 BIRC2 및 BIRC3), XIAP (X-염색체 결합 IAP; BIRC4), 서바이빈(BIRC5), BRUCE (Apollon; BIRC6), 리빈(BIRC7) 및 Ts-IAP (고환-특이적 IAP; BIRC8), Wedelolactone, NS3694, NSCI 및 Z-플루오로메틸 케톤 Z-VAD-FMK 및 그 안의 모든 플루오로메틸 케톤 변이체 (즉, Z-FA-FMK, Z-VAD(OH)-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VAD(OM2)-FMK, Z-VDVAD-FMK, 등)을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 카스파제 억제제는 카스파제-특이적 억제제이다. 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 범-카스파제 억제제이다.
[0473] 특정 구체예에서, 카스파제 억제제는 XIAP이다. 일부 태양에서, XIAP는 카스파제 3, 7 및 9에 결합하고 이를 억제하는 능력과 같은 카스파제 과잉생산에 의해 유도되는 세포자멸사 세포사를 중단할 수 있다. XIAP의 BIR2 도메인은 카스파제 3 및 7을 억제하는 반면, BIR3은 카스파제 9에 결합하여 억제한다.
[0474] 특정 구체예에서, 카스파제 억제제는 Z-VAD-FMK(카르보벤족시-발릴-알라닐-아스파르틸-[O-메틸]-플루오로메틸케톤)이다. 일부 태양에서, Z-VAD-FMK는 예를 들어 여러 카스파제 프로테아제의 활성 부위에 결합하는 능력을 통해 카스파제에 의해 유도되는 세포자멸사 세포 사멸을 막을 수 있다.
[0475] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 확장 방법에서 T 세포(예컨대 종양 반응성 T 세포) 대 세포자멸사 억제제의 비율(세포 대 mole)은 약 1 내지 25, 약 1 내지 50, 약 1 to 100, 약 1 내지 125, 약 1 내지 150, 약 1 내지 175, 약 1 내지 200, 약 1 내지 225, 약 1 내지 250, 약 1 내지 275, 약 1 내지 300, 약 1 내지 325, 약 1 내지 350, 약 1 내지 500, 약 1 내지 1000, 또는 약 1 내지 10000이다.
[0476] 제공된 방법의 임의의 구체예에서, 하나 이상의 세포자멸사 억제제는 인큐베이션 동안 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 세포자멸사 억제제 각각은 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 및 at 또는 abouu 50 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 0.5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 또는 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 범위의 농도로 독립적으로 첨가된다.
[0477] 일부 구체예에서, 세포자멸사 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 50 μM, 약 0.5 μM 내지 약 40 μM, 약 0.5 μM 내지 약 30 μM, 약 0.5μM 내지 약 20μM, 약 0.5μM 내지 약 10μM, 약 0.5μM 내지 약 5μM, 약 0.5μM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 50μM, 약 1μM 내지 약 40μM, 약 1μM 내지 약 30μM, 약 1μM내지 약 20μM, 약 1μM 내지 약 10μM, 또는 약 1 μM 내지 약 5 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구체예에서, 농도는 약 2 μM이다. 일부 구체예에서, 농도는 약 10 μM이다. 일부 구체예에서, 농도는 약 25μM이다.
[0478] 특정 구체예에서, T 세포 조절제는 열 충격 단백질의 억제제이다. 열 충격 단백질(Hsps)은 스트레스에 대한 응답으로 세포에서 생성할 수 있는 분자 샤페론을 포함하는 다양한 단백질 그룹이다. 스트레스 요인에는 열, 산화 스트레스, 감염, 허혈, 중금속 노출 및 영양 결핍이 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 일부 Hsps는 입증 가능한 항-세포자멸사 효과가 있다. 예를 들어 Hsp70은 Bax 단백질의 미토콘드리아 전위 억제를 통해 세포자멸사를 약화시키는 것으로 설명된다. 다른 Hsps는 프로-카스파제 3의 활성화와 관련된 Hsp10과 같이 세포자멸사 반응을 촉진할 수 있는 신호전달 캐스케이드에 관여한다(Ikwegbue et al., Pharmaceuticals 11(1): 2, 2018).
[0479] 특정 구체예에서, Hsp 억제제는 Hsp90의 억제제이다. Hsp90은 Hsp90과 Hsp70이 협력하여 스트레스에 대한 응답으로 열 충격 인자 1을 통해 위험한 단백질 응집을 방지함에도 불구하고 Hsp70을 부정적으로 억제하는 ATP 의존성 단백질 샤페론이다. Hsp90의 과발현은 단백질 안정화, 세포 증식, 혈관신생 및 암세포의 생존 증가를 초래하는 것으로 관찰되었다. Hsp90은 또한 EGFR을 포함하여 발암성 신호 전달 경로와 관련된 여러 수용체를 안정화시키는 것으로 입증되었다(Chatterjee et al., Int J Mol Sci (18)9, 2017). 이러저러한 이유로 Hsp90 억제제는 암의 전임상 모델과 여러 I 및 II상 연구에서 단일 제제 및 다른 제제와의 조합으로 평가되었다(Spreafico et al., Brit J of Cancer (112) 650-659, 2015).
[0480] hsp 억제제의 비제한적인 예로는 MKT-077, 디히드로피리미딘(즉, SW02, MAL2-IIB, MAL3-101, NSC630668 등), 플라보노이드(즉, 에피갈로카테킨, 미리세틴 등), 15-DSG, 아포토졸, VER-155008, 앱타머 A17, 앱타머 A8, cmHSP70.1을 들 수 있다. hsp90 억제제의 예로는 17-AAg, 17-DMAG, IPI-504, NVP-AUY922, AT13387, Ganetespib, KW-2478, CNF-2024 (BIIB021), Debio 0932, PU-H71, MPC-310, SNX-5422, Ds-2248, XL-888, TAS-116, 및 NVP-HSP990을 들 수 있다.
B. 예시적인 확장 방법
[0481] 표적 세포의 표면 상의 펩타이드를 인식하는 내인성 TCR을 발현하는 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
[0482] 일부 구체예에서 이 방법은 (1) 말초 혈액 림프구, 림프절 유래 림프구 또는 종양 침윤 림프구를 포함하나 이에 제한되지 않는 공여자 대상체로부터 수득된 림프구의 집단을 농축하여 T 세포의 제1 집단을 생성하는 단계; (2) 상기 제1 T 세포 집단을, 비제한적인 예로서 APC에 의해 제시된 또는 가용성 항체로서 제시된 항-CD3 및 항-CD28과 같은 림프구(예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체) 및/또는 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)을 사용하여 자극함으로써, 상기 자극에 의해 T 세포가 확장된, 활성화된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 상기 자극은 무혈청 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; (3) 하나 이상의 MHC-관련 비-천연 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포의 존재 하에 T 세포의 제2 집단을 공동-배양하는 단계로서, 여기서 펩타이드는 펩타이드 네오에피토프이고 공동-배양에 의해 배양물에서 APC에 존재하는 펩타이드에 반응성인 활성화된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제3 집단이 생성되는 것인 단계; (4) 폐쇄 시스템에서 T 세포의 제3 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 분리는 펩타이드를 제시하는 유핵 세포의 존재 하에 배양 후 T 세포 상의 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 기초하여 APC에 존재하는 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포 집단을 상기 T 세포의 제3 집단으로부터 선택함으로써 수행되고, 여기서 선택은 무혈청 배지를 사용하는 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계(일부 구체예에서, 이러한 선택은 비제한적인 예로서 CliniMACS, Sony FX500 또는 Miyltenyi Tyto 세포 분류 시스템을 비롯하여 세포 선택 장비 상의 형광성 항체, 나노입자 또는 비드를 사용하여 수행될 수 있다); 및 (5) 무혈청 배지를 사용하는 폐쇄 자동화 시스템에서, 비제한적인 예로서 가용성 항체로서 항-CD3 및 항-CD28(예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD3 및/또는 -CD28 항체) 및/또는 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)와 같은, 림프구의 제2 T-세포 자극 제제의 존재 하에 선택된 세포의 제4 집단을 확장하는 단계를 포함하나 이들 단계들로 한정되지 않는다. 확장 후 치료 용량에 도달하면 세포 조성물은 동결보존 배지에서 농축되고 동결될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 제1 집단의 자극은 비제한적인 예로서 본원에 설명된 바와 같은, OX40 및 41BB의 작용제와 같은 TNFSR 작용제와 같은 공동자극 작용제의 존재 하에 및/또는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 억제제를 비롯한 세포자멸 억제제의 존재 하에 및/또는 체크포인트 억제제(예컨대 항-PD1 항체)의 존재 하에 및/또는 임의의 T 세포 조절제의 존재 하에 7-10일 동안 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 공동-배양은 비제한적인 예로서 본원에 설명된 바와 같은, OX40 및 41BB의 작용제와 같은 TNFSR 작용제와 같은 공동자극 작용제의 존재 하에 및/또는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 억제제를 비롯한 세포자멸 억제제의 존재 하에 및/또는 체크포인트 억제제(예컨대 항-PD1 항체)의 존재 하에 및/또는 임의의 T 세포 조절제의 존재 하에 1-7일 동안 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 선택된 세포의 제4 집단의 확장은 비제한적인 예로서 본원에 설명된 바와 같은, OX40 및 41BB의 작용제와 같은 TNFSR 작용제와 같은 공동자극 작용제의 존재 하에 및/또는 체크포인트 억제제(예컨대 항-PD1 항체)의 존재 하에 및/또는 체크포인트 억제제(예컨대 항-PD1 항체)의 존재 하에 및/또는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드 억제제를 비롯한 세포자멸 억제제의 존재 하에 및/또는 임의의 T 세포 조절제의 존재 하에 7-10일 동안 일어날 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제는 재조합 IL-2와 같은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로부터의 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제는 재조합 IL-2와 같은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로부터의 적어도 하나의 재조합 사이토카인을 포함한다. 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 T 세포의 집단 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.
[0483] 일부 구체예에서 이 방법은 (1) 말초 혈액 림프구, 림프절 유래 림프구 또는 종양 침윤 림프구를 포함하나 이에 제한되지 않는 공여자 대상체로부터 수득된 림프구의 집단을 농축하여 T 세포의 제1 집단을 생성하는 단계; (2) 상기 집단을, 비제한적인 예로서 APC에 의해 제시된 또는 가용성 항체로서 제시된 항-CD3 및 항-CD28과 같은 림프구(예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체) 및/또는 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)을 사용하여 자극함으로써, 상기 자극에 의해 T 세포가 확장된, 활성화된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 상기 자극은 무혈청 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; (3) 하나 이상의 MHC-관련 비-천연 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포의 존재 하에 T 세포의 제2 집단을 공동-배양하는 단계로서, 여기서 펩타이드는 펩타이드 네오에피토프이고 공동-배양에 의해 배양물에서 APC에 존재하는 펩타이드에 반응성인 활성화된 T 세포를 함유하는 T 세포의 제3 집단이 생성되는 것인 단계; (4) 폐쇄 시스템에서 T 세포의 제3 집단으로부터 항원 제시 세포를 분리하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 분리는 펩타이드를 제시하는 유핵 세포의 존재 하에 배양 후 T 세포 상의 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 기초하여 APC에 존재하는 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포 집단을 상기 T 세포의 제3 집단으로부터 선택함으로써 수행되고, 여기서 선택은 무혈청 배지를 사용하는 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계(일부 구체예에서, 이러한 선택은 비제한적인 예로서 CliniMACS, Sony FX500 또는 Miyltenyi Tyto 세포 분류 시스템을 비롯하여 세포 선택 장비 상의 형광성 항체, 나노입자 또는 비드를 사용하여 수행될 수 있다); 및 (5) 무혈청 배지를 사용하는 폐쇄 자동화 시스템에서, 비제한적인 예로서 가용성 항체로서 항-CD3 및 항-CD28(예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD3 및/또는 -CD28 항체) 및 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)와 같은, 림프구의 제2 T-세포 자극 제제의 존재 하에 선택된 세포의 제4 집단을 확장하는 단계를 포함하나 이들 단계들로 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 제1 T 세포 자극 제제는 재조합 IL-2와 같은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로부터의 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 T 세포 자극 제제는 재조합 IL-2와 같은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로부터의 적어도 하나의 재조합 사이토카인을 포함한다. 확장 후 치료 용량에 도달하면 제품은 동결보존 배지에서 농축되고 동결된다. 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 T 세포의 집단 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.
[0484] 일부 구체예에서, 이들 방법은 하기 샘플에서 직접 유래한 T 세포에 대한 하나 이상의 T 세포 활성화 마커를 기반으로, 생체 내 APC에 제시된 펩타이드에 반응성인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포의 집단을 선택함으로써, 비제한적인 예로서 말초 혈액 림프구, 림프절 유래 림프구 또는 종양 침윤 림프구를 비롯한 공여자 대상체로부터 수득된 림프구 집단을 농축하는 것을 포함하되, 여기서 선택은 무혈청 배지를 사용하는 폐쇄 시스템에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 이러한 선택은 비제한적인 예로서 CliniMACS, Sony FX500 또는 Miltenyi Tyto 세포 분류 시스템과 같은, 세포 선택 장비 상에서 형광 항체, 나노입자 또는 비드를 사용하여 수행될 수 있다.
[0485] 일부 구체예에서, 확장 방법은 비제한적인 예로서 OX40 및 41BB의 작용제를 비롯한 TNFSFR 작용제와 같은 공동자극 작용제의 존재 하에 및/또는 비제한적인 예로서 카스파제 억제제 또는 Fas/Fas 리간드의 억제제를 비롯한 세포자멸사 억제제의 존재 하에, 및/또는 체크포인트 억제제(예컨대 항-PD1 항체)의 존재 하에 및/또는 본원에 기재된 임의의 T 세포 조절제의 존재 하에 7-20일의 기간 동안 일어날 수 있다. 제공된 방법 중 임의의 것에서, 이 방법은 카스파제 억제제인 세포자멸사 억제제를 사용하여 수행된다. 제공된 방법 중 임의의 것에서, 이 방법은 4-1BB, CD27, OX40 또는 GITR의 작용제와 같은 공동자극 작용제를 이용하여 수행된다. 제공된 방법 중 임의의 것에서, 이 방법은 항-PD-1 항체와 같은 체크포인트 억제제를 사용하여 수행된다. 이러한 가용성 작용제 및 억제제, 예를 들어 세포자멸사 억제제 또는 체크포인트 억제제는 확장 방법의 최대 배양 시간 또는 방법의 임의의 단계까지 또는 최소 24시간 동안 포함될 수 있다. 공동자극 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제 및/또는 기타 조절제는 제공된 방법에서 초기 자극, 공동 배양, 선택 또는 확장의 적어도 일부 동안 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 작용제는 해당 방법의 적어도 일부 동안, 비제한적인 예로서 선택 전, 선택 후, 확장 동안, 및 세포 생성물의 수확 및 동결보존 전 5 내지 1일을 포함하는 기간 동안 사용될 수 있다. 확장 후 치료 용량에 도달하면 제품은 냉동보존 배지에서 농축되고 냉동된다. 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 T 세포의 집단 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.
III. 조성물 및 약학 제형
[0486] 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 것과 같은 확장된 T 세포를 함유하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 종양 반응성 T 세포 또는 신생항원과 같은 종양 관련 항원에 특이적인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포를 함유한다. 특히, 제공된 조성물 중에는 종양 반응성 T 세포 또는 신생항원과 같은 종양 관련 항원에 특이적인 내인성 TCR을 함유하는 T 세포가 농축된 세포의 조성물이 있다.
[0487] 일부 구체예에서, 조성물은 약 5-99%의 종양-반응성 T 세포 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포, 또는 5 내지 99%의 임의의 백분율의 이러한 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은, 세포가 단리된 대상체 또는 생물학적 샘플에 자연적으로 존재하는 총 세포 또는 총 CD3+ T 세포에 대한 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포 또는 종양-반응성 CD3+ T 세포의 백분율과 비교하여, 조성물 내 총 세포 또는 총 CD3+ T 세포에 대한 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포 또는 종양-반응성 CD3+ T 세포를 증가된 또는 더 큰 백분율로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 백분율은 적어도 또는 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배, 200배 또는 그 이상 증가된다. 이러한 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 설명된 것 중 어느 것이든 무방하며, 예를 들어 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및/또는 CD38 중 어느 하나 이상일 수 있다.
[0488] 일부 구체예에서, 조성물은 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 실질적으로 100% 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 30% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 40% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 50% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 60% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 70% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 80% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 90% 초과의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 이러한 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 설명된 것 중 어느 것이든 무방하며, 예를 들어 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및/또는 CD38 중 어느 하나 이상일 수 있다.
[0489] 일부 구체예에서, 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포 또는 종양 반응성 CD3+ T 세포는 조성물 내에 치료적 유효 용량으로 존재할 수 있다. 세포의 유효량은 환자뿐만 아니라 질병의 유형, 중증도 및 정도에 따라 다를 수 있다. 따라서 의사는 대상체의 건강, 질병의 정도와 정도, 기타 변수를 고려한 후 유효량이 얼마인지 결정할 수 있다.
[0490] 특정 구체예에서, 조성물 중 이러한 세포의 수는 치료적 유효 용량이다. 일부 구체예에서, 상기 양은 동물에서 암, 바이러스 감염, 미생물 감염 또는 패혈성 쇼크와 관련된 중증도, 기간 및/또는 증상을 감소시키는 양이다. 일부 구체예에서, 치료적 유효 용량은 본원에 설명된 조성물이 투여된 환자 또는 동물에 있어서의 암의 성장 또는 확산을, 조성물이 투여되지 않은 환자(또는 동물) 또는 환자(또는 동물)의 그룹에서의 암의 성장 또는 확산에 비해 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 25%, 적어도 35%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, by 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시키는 세포의 용량이다. 일부 구체예에서, 치료적 유효 용량은 암, 바이러스 및 미생물 세포의 성장을 억제하거나 감소시키는 활성을 초래하는 세포독성 활성을 초래하는 양이다.
[0491] 일부 구체예에서, 조성물은 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를, 약 105 내지 약 1012 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 105 내지 약 108 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 106 내지 약 1012 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 108 내지 약 1011 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 109 내지 약 1010 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포의 양으로 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 105 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 106 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 107 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 108 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 109 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약1010 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 1011 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 1012 개를 초과하는 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 양은 암 환자와 같은 질병 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 설명된 것중 어느 것이든 무방하며, 예를 들어 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및/또는 CD38 중 어느 하나 이상일 수 있다.
[0492] 일부 구체예에서, 조성물은 CD3+ T 세포를 집단 내 총 세포의 백분율로서 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과 또는 약 95% 초과인 백분율로 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 집단 내 총 세포의 백분율로서 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과 또는 약 95% 초과인 백분율로 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물 중 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1이다.
[0493] 일부 구체예에서, 조성물의 부피는 적어도 또는 적어도 약 10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL 또는 500 mL, 예를 들어 또는 약 10 mL 내지 500 mL, 10 mL 내지 200 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 50 mL 내지 500 mL, 50 mL 내지 200 mL, 50 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 200 mL 또는 200 mL 내지 500 mL이다. 일부 구체예에서, 조성물의 세포 밀도는 적어도 또는 적어도 약 1 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/ mL이다. 일부 구체예에서, 조성물의 세포 밀도는 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 106 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 또는 1 x 107 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL이다.
[0494] 조성물 중에는 입양 세포 요법과 같은 투여를 위한 의약 조성물 및 제형이 있다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된다.
[0495] 약학적으로 허용가능한 담체는 약학적 투여와 양립할 수 있는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다(Gennaro, 2000, Remington: The science and practice of pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 이러한 담체 또는 희석제의 예로는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 리포좀 및 고정유와 같은 비수성 비히클도 사용할 수 있다. 보조 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다. 약학적 담체는 식염수, 덱스트로스 용액 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액과 같이 NK 세포에 적합한 것이어야 한다.
[0496] 일부 구체예에서, 이러한 조성물을 위한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클은 살아있는 NK 세포의 투여를 허용하기에 충분한 시간 동안 NK 세포가 유지되거나 생존할 수 있는 임의의 무독성 수용액이다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클은 식염수 또는 완충 식염수일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클은 또한 NK 세포의 효율을 증가시킬 수 있는 다양한 바이오 물질을 포함할 수 있다. 세포 비히클 및 담체에는, 예컨대, 다당류 예를 들어 메틸셀룰로스 (M. C. Tate, D. A. Shear, S. W. Hoffman, D. G. Stein, M. C. LaPlaca, Biomaterials 22, 1113, 2001, 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), 키토산(Suh J K F, Matthew H W T. Biomaterials, 21, 2589, 2000; Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford D S, et al., J Biomed Mater Res, 51, 586, 2000, 이들 문헌 각각은 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), N-이소프로필아크릴아미드 코폴리머 P(NIPAM-co-AA) (Y. H. Bae, B. Vernon, C. K. Han, S. W. Kim, J. Control. Release 53, 249, 1998; H. Gappa, M. Baudys, J. J. Koh, S. W. Kim, Y. H. Bae, Tissue Eng. 7, 35, 2001, 이들 문헌 각각은 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), 및 폴리(옥시에틸렌)폴리((D,L-락트산-코-글리콜산) (B. Jeong, K. M. Lee, A. Gutowska, Y. H. An, Biomacromolecule 3, 865, 2002, 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), P(PF-co-EG) (Suggs L J, Mikos A G. 세포 Trans, 8, 345, 1999, 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), PEO/PEG (Mann B K, Gobin A S, Tsai A T, Schmedlen R H, West J L., Biomaterials, 22, 3045, 2001; Bryant S J, Anseth K S. Biomaterials, 22, 619, 2001, 이들 문헌 각각은 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), PVA (Chih-Ta Lee, Po-Han Kung 및 Yu-Der Lee, Carbohydrate Polymers, 61, 348, 2005, 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), 콜라겐 (Lee C R, Grodzinsky A J, Spector M., Biomaterials 22, 3145, 2001, 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다), 알긴산염(Bouhadir K H, Lee K Y, Alsberg E, Damm K L, Anderson K W, Mooney D J. Biotech Prog 17, 945, 2001; Smidsrd O, Skjak-Braek G., Trends Biotech, 8, 71, 1990, 이들 문헌 각각은 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다)이 포함된다.
[0497] 일부 구체예에서, 의약 조성물을 포함하는 조성물은 멸균된다. 일부 구체예에서, 세포의 단리 또는 농축은 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 수행된다. 일부 구체예에서, 무균은 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
[0498] 또한, 종양 반응성 T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 포함하는, 제공된 T 세포를 동결보존하는데 적합한 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 동결보호제를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결보호제는 DMSO 및/또는 글리세롤이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결보존을 위해 제제화된 조성물은 초저온과 같은 저온, 예를 들어 -40℃ 내지 -150℃의 온도 범위, 예를 들어 또는 약 80℃ ± 6.0℃에서의 보관에서 보관될 수 있다.
[0499] 일부 구체예에서, 동결보존된 세포는 해동에 의해 투여를 위해 준비된다. 일부 경우에, 세포는 해동 직후 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 구체예에서, 조성물은 추가 처리 없이 바로 사용할 수 있다. 다른 경우에, 세포는 해동 후, 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 재현탁, 활성화제 또는 자극 제제와의 인큐베이션에 의해 추가로 처리되거나, 또는 대상체에 투여하기 전에 활성화 세척되고 약학적으로 허용되는 완충액에 재현탁된다.
IV. 치료 방법 및 치료 적용
[0500] 암과 같은 대상체의 질병 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 제공된 치료 세포 조성물과 관련된 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법 및 용도는 치료 방법 및 용도를 포함하며, 예를 들어 치료 세포 또는 이를 함유하는 조성물을 질환, 상태 또는 장애를 갖는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 어떤 경우에는 질병 또는 장애는 종양 또는 암이다. 일부 구체예에서, 세포 또는 그의 의약 조성물은 질병 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서, 그리고 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에 있어서의 세포 또는 이의 약제학적 조성물의 용도를 포함한다. 이에 따라 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 질병 또는 병태 또는 장애를 치료한다.
[0501] 일부 구체예에서, 치료 방법은 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 함유하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 조성물은 제공된 방법에 의해 생성된 조성물을 포함하여 본원에 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다.
[0502] 일부 구체예에서, 대상체(예컨대 자가)에게 약 105 내지 약 1012 개의, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 또는 약 105 내지 약 108 개의, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 또는 약 106 내지 약 1012 개의, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 또는 약 108 내지 약 1011 개의, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 또는 약 109 내지 약 1010 개의, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포를 투여한다. 일부 구체예에서, 투여를 위한 치료적 유효 용량은 약 105 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 106 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 107 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 108 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 109 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 1010 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 약 1011 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포, 또는 약 1012 개를 초과하는, 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 CD3+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 이러한 양은 암 환자와 같은 질병 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여되는 T 세포의 수는 생존 T 세포이다.
[0503] 일부 구체예에서 약 105 내지 약 1012 개의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 설명된 임의의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 105 내지 약 108 개의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 106 내지 약 1012 개의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 108 내지 약 1011 개의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 109 내지 약 1010 개의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포를 개체에게 투여한다. 일부 구체예에서, 투여를 위한 치료적 유효 용량은 약 105 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 106 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 107 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 108 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 109 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 1010 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 약 1011 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포, 또는 약 1012 개 이상의 종양 반응성 CD3+ T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 CD3+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 이러한 양은 암 환자와 같은 질병 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 설명된 것중 임의의 것일 수 있고, 예컨대 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및/또는 CD38 중 하나 이상일 수 있다.
[0504] 일부 구체예에서, 양은 균일 용량(flat dose)으로 투여된다. 다른 구체예에서, 이러한 양은 대상체의 체중 킬로그램당 투여된다.
[0505] 일부 구체예에서, 제공된 임의의 방법에 의해 생성되는 조성물 또는 종양-반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 함유하는 조성물은, 제공된 방법에 따른 확장 직후 개체에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 확장된 종양 반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포와 같은 확장된 T 세포는, 투여에 앞서, 전술한 방법에 의해 동결보존된다. 예를 들어, 종양 반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포와 같은 T 세포는, 개체에 투여되기 전에 6, 12, 18 또는 24개월 이상 동안 저장가능하다. 이러한 동결보존된 세포는 투여 전에 해동될 수 있다.
[0506] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 함유하는 제공된 조성물은 피하, 근육내, 정맥내 및/또는 경막외 투여 경로와 같은 비경구 경로를 포함하는 임의의 편리한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
[0507] 일부 구체예에서, 종양-반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 함유하는 조성물은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 한 달에 한 번, 2주에 한 번, 일주일에 한 번, 또는 이틀에 한 번일 수 있다. 이러한 조성물 및 세포의 투여는 필요한 기간 동안 계속될 수 있다.
[0508] 일부 구체예에서, 제공된 조성물, 예컨대 임의의 제공된 방법에 의해 생성된 조성물 또는 종양 반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 함유하는 조성물의 투여에 앞서, 대상체는 림프고갈 요법을 투여받는다. 림프구 고갈 요법에는 플루다라빈 및/또는 사이클로포스파미드(활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 이들의 조합의 투여가 포함될 수 있다. 이러한 방법은 문헌 [Gassner et al. (Cancer Immunol Immunother 201 1 60(l):75-85, Muranski, et al, Nat Clin Pract Oncol, 2006 3(12):668-681, Dudley, et al., J Clin Oncol 2008, 26:5233-5239, 및 Dudley, et al., J Clin Oncol. 2005, 23(10):2346-2357]에 설명되어 있으며 이들 문헌 모두가 본 발명에 참조 병합된다. 일부 구체예에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량, 또는 전술한 투여량들 중 임의의 투여량 사이의 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 플루다라빈은 2-7일, 예를 들어 3-5일, 예를 들어 약 3일, 약 4일 또는 약 5일 동안 투여된다. 일부 구체예에서, 사이클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 구체예에서, 사이클로포스파미드는 정맥내(즉, i.v.) 투여된다. 일부 구체예에서, 사이클로포스파미드 치료는 2-7일, 예를 들어 3-5일, 약 3일, 약 4일 또는 약 5일 동안 수행된다. 림프고갈 요법제는 제공된 세포 조성물 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 림프고갈 요법은 제공된 세포 조성물의 투여 1주일 이내에, 예를 들어 세포 용량을 투여하기 5-7일 전에 수행된다.
[0509] 본원에 기재된 조성물은 과증식성 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이들은 암 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 태양에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 유방암, 두경부암, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 결장직장암 및 육종일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 돌연변이 부담이 높은 암이다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종, 편평 폐암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암, 자궁경부암, 두경부암, 위암 또는 자궁암이다.
[0510] 일부 구체예에서, 암은 상피암이다. 일부 구체예에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종암, 자궁내막암으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 유방암은 HR+/Her2- 유방암이다. 일부 구체예에서, 유방암은 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 일부 구체예에서, 유방암은 HER2+ 유방암이다.
[0511] 일부 구체예에서, 대상체는 혈액 종양인 암을 갖는다. 혈액 종양의 비제한적 예로는 백혈병, 예컨대 급성 백혈병(예컨대 1 1q23-양성 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구 및 적혈구 백혈병), 만성골수성백혈병, 만성 백혈병 (예를 들어 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프성 백혈병), 진성적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(무통성 및 고악성형), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄이형 증후군 , 모세포 백혈병 및 골수이형성증을 들 수 있다.
[0512] 일부 구체예에서, 대상체는 고형 종양 암을 갖는다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 비제한적인 예에는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종 및 기타 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프절종양, 췌장암, 유방암(기저 유방 암종, 유관 암종 및 소엽 유방암 포함), 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선 수질 암종, 유두 갑상선 암종, 갈색 세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정액종, 방광 암종 및 CNS 종양(예를 들어 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종 , 송과체종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)이 포함된다. 몇몇 예에서, 종양은 흑색종, 폐암, 림프종 유방암 또는 결장암이다.
[0513] 일부 구체예에서, 암은 피부암이다. 특정 구체예에서, 암은 피부 흑색종과 같은 흑색종이다. 일부 구체예에서, 암은 머켈 세포 또는 전이성 피부 편평 세포 암종(CSCC)이다.
[0514] 일부 구체예에서, 종양은 상피 세포로부터 발병하거나 상피 기원의 암인 암종이다. 일부 구체예에서, 암은 비제한적인 예로서, 유방암, 기저 세포 암종, 선암종, 위장관 암, 입술암, 구강암, 식도암, 소장암 및 위암, 결장암, 간암, 방광암, 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 유방암 및 피부암, 예를 들어 편평세포암 및 기저세포암, 전립선암, 신세포암종, 및 전신의 상피 세포에 영향을 미치는 기타 알려진 암으로부터 발생한다.
[0515] 일부 구체예에서, 대상체는 암 또는 상부 또는 하부 분해관, 또는 분해에 관련된 부속 기관, 예컨대 식도, 위, 담도계, 췌장, 소장, 대장, 직장 또는 항문의 암을 비롯한 위장관 암이다. 일부 구체예에서, 암은 식도암, 위장(위)암, 췌장암, 간암(간세포 암종), 담낭암, 점막 관련 림프 조직 암(MALT 림프종), 담도암, 결장직장암(결장암, 직장암 또는 둘 다 포함), 항문암, 또는 위장관 유암종이다. 특정 구체예에서, 암은 결장직장암이다. 일부 구체예에서, 암은 결장직장암이다. 결장직장암(CRC)은 발병률이 증가하는 흔한 종양으로, 많은 경우에 체크포인트 억제 또는 기타 면역요법에 반응하지 않는다. 이는 그러한 암이 상당히 높은 돌연변이율 및 T 세포 침윤 수준과의 예후의 잘 확립된 연관성과 같은, 반응과 관련된 특성을 가지고 있는 경우에 조차 그러하다.
[0516] 일부 구체예에서, 암은 난소암이다. 일부 구체예에서, 암은 삼중-음성 유방암(TNBC)이다.
[0517] 일부 구체예에서, 암은 폐암이다. 일부 구체예에서, 암은 유방암이다. 일부 구체예에서, 암은 결장직장암이다. 일부 구체예에서, 암은 췌장암이다. 일부 구체예에서, 암은 메르켈 세포암이다. 일부 구체예에서, 암은 전이성 피부 편평 세포 암종(CSCC)이다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종이다.
[0518] 일부 구체예에서, 대상체는 암이 항-PD1 또는 항-PD-L1 요법과 같은 체크포인트 차단에 대한 치료에 불응성이고 또는 이에 따른 치료 후에 재발한 대상체이다.
[0519] 일부 구체예에서, 대상체는 치료 세포 조성물을 생산하기 위해 수득된 생물학적 샘플과 동일한 대상체이다. 이러한 일부 구체예에서, 제공된 치료 방법은 대상체에 대해 자가인 T 세포를 함유하는 치료 조성물을 사용한 입양 세포 요법이다.
[0520] 일부 구체예에서, 본원에 제공된 세포 조성물은 치료될 대상체에 대해 자가이다. 이러한 구체예에서, 확장을 위한 출발 세포는 본원에 기재된 바와 같은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 직접 단리되며, 경우에 따라, 기재된 바와 같은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 농축, 본원에 제공된 바와 같은 확장 조건 하에서의 배양을 포함한다. 일부 구체예에서, 배양은 공동자극 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제와 같은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 및 기재된 바와 같은 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 태양에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 종양 또는 림프절 샘플이거나 이를 포함하고, 이러한 샘플 종양 및 이러한 조직의 양은 절제 또는 생검(예를 들어, 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인)에 의해 얻어진다. 피험자로부터의 생물학적 시료는 성분채집 시료와 같은 말초혈액 시료이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법에 따라 확장을 위한 조건 하에 배양 후, 세포를 제제화하고 선택적으로 암 치료를 위해 동일한 대상체에게 후속 투여하기 위해 동결보존시킨다.
[0521] 일부 구체예에서, 본원에 제공된 세포 조성물은 치료될 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 태양에서, 세포가 유래되거나 단리된 대상체는 건강한 대상체이거나 암과 같은 질병 또는 상태를 갖는 것으로 알려져 있지 않은 대상체이다. 이러한 구체예에서, 확장을 위한 출발 세포는 본원에 기재된 바와 같은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 직접 단리되고, 일부 경우에는 기재된 바와 같은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 양성인 T 세포에 대한 농축을 포함하고, 본원에 제공된 확장을 위한 조건 하에 배양된다. 일부 구체예에서, 배양은 공동자극 작용제 및/또는 세포자멸사 억제제와 같은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 및 기재된 바와 같은 하나 이상의 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 태양에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 종양 또는 림프절 샘플이거나 이를 포함하고, 이러한 샘플 종양 및 이러한 조직의 양은 절제 또는 생검(예를 들어, 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인)에 의해 얻어진다. 일부 구체예에서, 피험자로부터의 생물학적 시료는 성분채집 시료와 같은 말초혈액 시료이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 확장을 위한 조건하에서 배양한 후, 세포는 제제화되고 선택적으로 이러한 상이한 대상체에서 암을 치료하기 위해 상이한 대상체에 대한 후속 투여를 위해 동결보존된다.
[0522] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 다른 면역요법과 함께 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제인 면역 조절제이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28, TIGIT 및 VISTA 중에서 선택된 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체 또는 항원-결합 단편, 소분자 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, 이필리무맙, 트레멜리무맙, IMP31, BMS-986016, 우렐루맙, TRX518, 다세투주맙, 루카투무맙, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MEDI4736, MOXR0916, AMP-224, 및 MSB001078C로부터 선택되거나, 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
[0523] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 기재된 바와 같은 세포 요법 및 PD-1 또는 PD-L1 억제제의 조합 요법을 포함한다. PD-1 또는 PD-L1 억제제는 결합 항체, 길항제 또는 억제제(즉, 차단제)를 포함할 수 있다.
[0524] 일 구체예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb Co.로부터 OPDIVO로서 상업적으로 입수가능), 또는 그의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트, 또는 변이체이다. 니볼루맙은 PD-1 수용체를 차단하는 완전한 인간 IgG4 항체이다. 일 구체예에서, 항-PD-1 항체는 면역글로불린 G4 카파, 항(인간 CD274) 항체이다. 니볼루맙은 CAS(Chemical Abstracts Service) 등록 번호 946414-94-4로 지정되었으며 5C4, BMS-936558, l\tIDX-1106, 및 ONO-4538로도 알려져 있다. 니볼루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 No. 8,008,449 및 국제 특허 공개 No. WO 2006/121168에 기재되어 있다.
[0525] 또 다른 구체예에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙(미국 뉴저지주 케닐워스 소재의 Merck & Co., Inc.로부터 KEYTRUDA로서 상업적으로 입수가능함), 또는 그의 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 또는 변이체를 포함한다. 펨브롤리주맙은 CAS 등록 번호 1374853-91-4로 지정되었으며 람브롤리주맙, MK-3475 및 SCH-900475로도 알려져 있다. 펨브롤리주맙의 특성, 용도 및 제조는 국제 특허 공개 No. WO 2008/156712 Al, 미국 특허 No. 8,354,509 및 미국 특허 출원 공개 Nos. US 2010/0266617 Al, US 2013/0108651 Al, 및 US 2013/0109843 A2에 기재되어 있다.
[0526] 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 MEDI4736(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하며, AstraZeneca plc.의 자회사인 Medimmune로부터 상업적으로 입수가능)으로도 공지된 더발루맙, 또는 항원 결합 단편, 컨쥬게이트, 또는 이의 변이체이다. 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 미국 특허 No. 8,779,108 또는 미국 특허 출원 공개 No. 2013/0034559에 개시된 항체이다.
[0527] 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 MSB0010718C(Merck KGaA/EMD Serono로부터 상업적으로 입수가능)로도 공지된 아벨루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 컨쥬게이트, 또는 변이체이다. 아벨루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 No. US 2014/0341917 A1에 기재되어 있다.
[0528] 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 MPDL3280A 또는 RG7446(스위스 바젤 소재 Roche Holding AG의 자회사인 Genentech, Inc.로부터 TECENTRIQ로서 상업적으로 입수가능)으로도 공지된 아테졸리주맙, 또는 항원 결합 단편, 컨쥬게이트 또는 이의 변이체이다. 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 미국 특허 No.8,217,149에 개시된 항체이며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 일 구체예에서, PD-LI 억제제는 미국 특허 출원 공개 Nos. 2010/0203056 Al, 2013/0045200 Al, 2013/0045201 Al, 2013/0045202 Al, 또는 2014/0065135 Al에 개시된 항체이다. 아테졸리주맙의 제조 및 특성은 미국 특허 No. 8,217,149에 기재되어 있다.
V. 키트 및 제조 물품
[0529] 종양 반응성 T 세포 또는 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 함유하거나 농축된 조성물과 같은 제공된 조성물을 포함하는 제조품 및 키트가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 제공된 임의의 방법에 의해 생성된다.
[0530] 키트는 사용 지침서, 장치 및 추가 시약(예를 들어, 조성물의 희석 및/또는 동결건조된 단백질의 재구성을 위한 멸균수 또는 식염수 용액) 및 방법의 실행을 위한 튜브, 용기 및 주사기와 같은 구성요소 등, 하나 이상의 구성요소를 선택적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 샘플의 수집, 샘플의 제조 및 처리를 위한 시약, 및/또는 샘플에서 하나 이상의 표면 마커의 양을 정량화하기 위한 시약, 예를 들어, 비제한적인 예로서 검출 시약, 예를 들어 항체, 완충액, 효소 염색을 위한 기질, 크로마젠 또는 슬라이드, 용기, 미세역가 플레이트와 같은 기타 물질 및 선택적으로 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함한다. 당업자는 제공된 방법에 따라 사용될 수 있는 많은 다른 가능한 용기 및 플레이트 및 시약을 인식할 것이다.
[0531] 일부 구체예에서, 키트는 세포, 항체 또는 시약, 또는 그의 조성물, 또는 하나 이상의 다른 구성 요소의 포장을 위한 포장재를 포함하는 제조 물품으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 용기, 튜브, 바이알 및 키트의 구성 요소를 분리하거나 정리하는데 적합한 모든 포장재를 포함할 수 있다. 하나 이상의 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기는 본 방법에 사용하기 위한 세포 또는 항체 또는 기타 시약을 포함하는 조성물을 함유한다. 본원의 제조 물품 또는 키트는 세포, 항체 또는 시약을 별도의 용기 또는 동일한 용기에 함유할 수 있다.
[0532] 일부 구체예에서,조성물을 보유하는 하나 이상의 용기는 일회용 바이알이거나 또는 일부 경우에 조성물의 반복 사용을 허용할 수 있는 다회용 바이알일 수 있다. 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 지침서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적, 치료적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
[0533] 일부 구체예에서, 키트는 선택적으로 지침서를 포함할 수 있다. 지침서에는 일반적으로 세포 조성, 선택적으로 키트에 포함된 기타 구성요소, 및 이를 사용하는 방법에 대한 상세한 설명이 포함된다. 일부 구체예에서, 지침서는 제공된 임의의 구체예에 따라 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여하기 위한 세포 조성물을 사용하는 방법을 지시한다. 일부 구체예에서, 지침서는 용기 상에, 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물로서 제공된다. 일부 구체예에서, 지침서는 조성물의 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 나타낼 수 있다.
VI. 정의
[0534] 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 명료함 및/또는 용이한 참조를 위해, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어를 본원에 정의하였으며, 본원에 그러한 정의를 포함시킨 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[0535] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기술된 태양 및 변형예들은 태양 및 변형예들로 "구성되고" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 이해된다.
[0536] 본 명세서 전반에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 태양이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 아니되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위와 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 어떤 범위의 값이 제시되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한과 그 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 중간 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 청구된 주제 내에 포함된다. 명시된 범위가 상하한 중 어느 하나 또는 양자 모두를 포함하는 경우, 상하한 중 어느 하나 또는 양자 모두를 배제하는 범위들도 청구된 주제에 포함된다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
[0537] 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 이 기술 분야의 숙련자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 값 또는 매개변수 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체에 관한 예시를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명에는 "X"에 대한 설명이 포함된다.
[0538] 용어 "에피토프"는 단백질 항원으로부터 유래된 짧은 펩타이드를 의미하며, 여기서 펩타이드는 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하고 MHC-결합 맥락에서 T 세포에 의해 인식된다. 에피토프는 MHC 클래스 I 분자(예컨대 HLA-A1 HLA-A2 또는 HLA-A3) 또는 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
[0539] 용어 "T 세포 아쥬반트"는 T 세포 생존을 촉진하고, 세포를 세포자멸사로부터 구하고, 확장을 유지하고/하거나 사이토카인 생산을 증가시키는 제제 또는 분자를 지칭한다. 예시적인 T 세포 아쥬반트는 예를 들어 T 세포 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제를 포함한다.
[0540] 공동자극 작용제와 관련하여 용어 "작용제(agonist)" 및 "작용성(agonistic)"은 OX40 또는 4-1BB 또는 기타 공동자극 수용체와 같은 공동자극 수용체에 의해 매개되는 생물학적 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로, 실질적으로 유도, 촉진 또는 향상시킬 수 있는 분자를 지칭하거나 설명한다. 작용제는 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있거나 공동자극 수용체의 리간드일 수 있다. 예를 들어, 작용제는 상보적인 생물학적 활성 수용체에 결합하고 수용체에서 생물학적 반응을 일으키거나 수용체의 기존 생물학적 활성을 향상시키기 위해 수용체를 활성화시키는 생물학적 활성 리간드일 수 있다.
[0541] 본원에 사용된 용어 "동종이계(allogeneic)"는 한 유기체로부터 제거된 후 동일한 종의 유전적으로 유사하지 않은 유기체에 주입되거나 입양적으로 전달되는 세포 또는 조직을 의미한다.
[0542] 본원에 사용된 용어 "자가(autologous)"는 한 유기체로부터 제거된 후 나중에 동일한 유기체로 주입되거나 입양으로 전달되는 세포 또는 조직을 의미한다.
[0543] 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 예컨대 온전한 항체 및 기능성 (항원-결합) 항체 단편, 예컨대 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일 사슬 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및 단일 도메인 항체 (예컨대 sdAb, sdFv, 나노바디) 단편이 이에 포함된다. 이 용어는 면역글로불린의 유전적으로 조작된 및/또는 달리 변형된 형태, 예를 들어 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 이종접합 항체, 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤을 포함한다. di-scFv, 탠덤 tri-scFv. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 그의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 IgG 및 이의 서브클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 서브클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다. 제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다.
[0544] "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항원에 결합하는 적어도 가변 영역을 함유하는 통상적인 또는 온전한 항체의 일부를 포함하되, 통상적인 또는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 비제한적인 예로는 Fv, 단일 사슬 Fvs (sdFvs), Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; VH 영역(VHH)만을 포함하는 단일 도메인 항체를 들 수 있다.
[0545] 본 명세서에 사용된 바와 같이, "결합하다", "결합된" 또는 이들의 문법적 변형은 두 분자가 서로 매우 근접하여 안정한 회합을 초래하는, 다른 분자와의 임의의 유인적인 상호작용에서의 분자의 참여를 지칭한다. 결합에는 비공유 결합, 공유 결합(예컨대 가역 및 비가역 공유 결합)이 포함되지만 이에 국한되지 않으며, 비제한적인 예로서 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 작은 약물을 비롯한 화합물과 같은 소분자와 같은 분자들 간의 상호작용이 이에 포함된다.
[0546] "생물학적 샘플"이라는 용어는 생물 또는 이전에 생물이었던 것에서 추출한 어떠한 양의 물질을 의미한다. 이러한 물질에는 혈액(예컨대 전혈), 혈장, 혈청, 소변, 양수, 활액, 내피 세포, 백혈구, 단핵구, 기타 세포, 장기, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
[0547] 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단과 관련하여 "농축시키다 (또는 풍부하게 하다); enriching"라는 언급은 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현되는 마커에 기초한 양성 선택에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포에 존재하지 않는 마커에 기초한 음성 선택에 의해, 예컨대 다른 세포 유형에 비해 또는 조성물의 또는 조성물 내 총 세포수에 비해, 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 의미한다. 이 용어는 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형, 또는 집단의 완전한 제거를 요구하는 것은 아니며, 그렇게 농축된 세포가 농축된 조성물에 100% 또는 거의 100%로 존재할 것을 요구하는 것이 아니다.
[0548] 용어 "동시에"는 본원에서 2개 이상의 제제와 연관된 인큐베이션, 선택, 농축 또는 투여와 같은 절차를 지칭하는데 사용되며, 이 경우 하나의 제제를 사용하는 특정 절차의 적어도 일부가 적어도 두 번째 제제를 사용하는 것과 시간상 중첩된다.
[0549] 용어 "간헐적으로"는 본원에서 2개 이상의 제제와 연관된 인큐베이션, 선택, 농축 또는 투여와 같은 절차를 지칭하는데 사용되며, 이 경우 각 제제가 관여하는 특정 절차는 규칙적인 간격으로 발생하지 않거나 연속적이지 않거나 또는 사이의 기간 동안 반복적으로 중단 또는 개시된다.
[0550] "순차적으로"라는 용어는 본원에서 2개 이상의 제제와 연관된 인큐베이션, 선택, 농축 또는 투여와 같은 절차를 지칭하는데 사용되며, 이 경우 각 제제가 관여하는 특정 절차는 시간상 중첩되지 않는다.
[0551] 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 "단리된" 또는 "정제된"은 다른 모든 폴리펩타이드, 오염물, 출발 시약 또는 기타 물질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적 합성시 다른 화학 물질 화학적 전구체가 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 순도를 평가하기 위해 당업자에 의해 사용되는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC) 또는 모세관 전기영동(CE)과 같은 표준 분석 방법에 따라 쉽게 검출할 수 있는 불순물이 없는 것으로 보이는 경우 그 제제는 불순물이 실질적으로 없는 것으로 결정되거나, 또는 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 특성을 검출가능하게 변경하지 않을 경우 충분히 순수한 것으로 결정된다.
[0552] 본원에 사용된 용어 "재조합"은 외인성, 예컨대 이종 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 조절, 탈조절 또는 구성되도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭하는 것으로, 이러한 변경 또는 변형은 유전 공학에 의해 도입될 수 있는 것이다. 유전적 변경은 예를 들어 하나 이상의 단백질 또는 효소를 인코딩하는 핵산 분자(프로모터와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 기타 핵산 분자의 추가, 결실, 치환 또는 세포의 유전 물질의 기타 기능적 파괴 또는 추가를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 참조 분자 또는 모 분자로부터의 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드의 코딩 영역 또는 그의 기능적 단편에서의 변형을 포함한다. 용어 "재조합"은 또한 이러한 핵산 분자 또는 벡터, 또는 외인성 핵산으로 도입되거나 변형된 이러한 세포 또는 미생물로부터 발현된 단백질 생성물을 지칭할 수도 있다.
[0553] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하는 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
[0554] 본 명세서에 사용된 바와 같이, "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않음을 의미하고, 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 기는 그 기가 비치환되거나 치환됨을 의미한다.
[0555] 용어 "의약 조성물"은 포유동물 대상체, 종종 인간에서 약학적 사용에 적합한 조성물을 지칭한다. 의약 조성물은 전형적으로 유효량의 활성제(예를 들어, 제공된 방법에 따라 확장된 세포) 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제는 전형적으로 각각 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제이다.
[0556] "약학적으로 허용되는 담체"는 대상체에 대한 투여를 위해, 당해 기술 분야에서 치료제와 함께 "의약 조성물"을 구성하는, 무독성, 반고체 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화 재료, 보조 제형 또는 담체를 가리킨다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 대상체에 무독성이며 제형의 다른 성분들과 양립가능하다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 제형에 적합한 것이다.
[0557] 본원에서 "세포 집단(또는 세포의 집단)"에 대한 언급은 공통 형질을 공유하는 다수의 세포를 지칭하는 것을 의미한다. 세포 집단은 일반적으로 약 100개 이상의 세포, 약 1000개 이상의 세포와 같은 다수의 세포를 포함하고, 전형적으로 그 수는 1 x 104 내지 1 x 1010의 범위이다.
[0558] 단백질과 관련하여 본원에 사용된 용어 "가용성"은 단백질이 세포 또는 고체 지지체, 예를 들어, 세포 또는 고체 지지체, 예컨대 비드와 같은 입자에 결합, 고정 또는 부착되지 않음을 의미한다. 예를 들어, 가용성 단백질은 세포의 세포막에 막횡단 단백질로서 결합되지 않은 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 단백질의 용해도는 링커를 통해 직접 또는 간접적으로 Fc 도메인과 같은 다른 분자에 대한 연결 또는 부착에 의해 향상될 수 있으며, 이는 일부 경우에 단백질의 안정성 및/또는 반감기를 향상시킬 수도 있다. 일부 태양에서, 가용성 단백질은 Fc 융합 단백질이다.
[0559] 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 충분한 통계적 크기의 무작위 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 집합에 대한 동일한 단백질의 평균 친화도 또는 결합력에 비해, 특이적 결합 조건 하에서 상기 동일한 단백질이 표적 단백질에 대해 적어도 10배, 그러나 임의로는 50배, 100배, 250배 또는 500배, 심지어 1000배 더 높은 크기의 친화도 또는 결합력으로 결합하는 능력을 의미한다. 특이적으로 결합하는 단백질은 단일 표적 분자에만 결합할 필요는 없지만 하나 이상의 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 특이적으로 결합하는 단백질은 표적 단백질(예를 들어, 파라로그 또는 오르쏘로그)과 구조적 형태가 유사한 단백질에 결합할 수 있다. 당업자는 다른 종의 동물에서 동일한 기능을 갖는 분자(즉, 오르쏘로그) 또는 표적 분자와 실질적으로 유사한 에피토프를 갖는 분자(예컨대 파라로그)에 대한 특이적 결합이 가능하다는 것과 고유한 비표적(예컨대 무작위 폴리펩타이드)의 통계적으로 유효한 집합과 관련하여 결정되는 결합의 특이성으로부터 이탈하지 않음을 인식할 것이다. 고체상 ELISA 면역분석, ForteBio Octet 또는 Biacore 측정을 사용하여 두 단백질 간의 특이적 결합을 결정할 수 있다. 일반적으로, 2개의 결합 단백질 사이의 상호작용은 약 1x10-5 M 미만이며, 종종 약 1 x 10-12 M의 낮은 해리 상수(Kd)를 갖는다. 본 개시내용의 특정 태양에서, 2개의 결합 단백질 사이의 상호작용은 약 1x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 1x10-8 M이하, 1x10-9 M 이하, 1x10-10 M이하, 또는 1x10-11 M 이하의 해리 상수를 갖는다.
[0560] 본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성 또는 포지티브"라 함은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상에서 또는 세포 내에서 검출가능하게 존재함을 가리킨다. 표면 마커라 할 때, 이 용어는, 유세포 분석에 의해, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 유세포 분석에 의해, 이소타입-맷칭된 대조군을 이용하여 동일한 절차 수행시(다른 조건은 동일함) 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준 및/또는 당해 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준, 및/또는 당해 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 높은 수준으로 검출가능하다.
[0561] 본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성 또는 네거티브"라 함은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상에서 또는 세포 내에서 실질적으로 검출가능하게 존재하지 않음을, 즉 부재함을 가리킨다. 표면 마커라 할 때, 이 용어는, 유세포 분석에 의해, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기서 염색은 유세포 분석에 의해, 이소타입-맷칭된 대조군을 이용하여 동일한 절차 수행시(다른 조건은 동일함) 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준 및/또는 당해 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준, 및/또는 당해 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 높은 수준으로 검출되지 않는다.
[0562] 본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이고, 전형적으로 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며 유아, 청소년, 청소년, 성인 및 노인 대상을 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다.
[0563] "유효량" 또는 "치료적 유효 용량"이라는 용어는 환자에게 투여시 병태, 장애 또는 질병 또는 기타 징후의 증상을 개선시키거나 달리 유리하게 변경시키는 방식을 초래하는, 예컨대 제공된 방법에 따라 확장된 세포를 함유하는 것과 같은 치료 조성물의 양 및/또는 농도를 가리킨다. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 유효량은 질병 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 증상 또는 생물학적 반응 또는 효과를 경감, 경감 또는 경감시키거나, 질병 또는 장애의 진행을 예방하거나, 또는 환자의 신체 기능을 개선하는 양일 수 있다. 특정 태양에서, 예를 들어 질병의 증상 및/또는 원인을 개선 또는 제거함으로써 질병 진행의 통계적으로 유의한 억제가 존재한다. 세포 요법의 경우, 유효량은 환자에게 투여되는 유효량 또는 세포의 수이다. 일부 구체예에서 환자는 인간 환자이다.
[0564] 본원에 사용된 "질병", 장애" 또는 "병태"는 감염, 후천적 병태, 유전적 병태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 원인 또는 병태로부터 야기되고 식별가능한 증상을 특징으로 하는 유기체의 병리학적 병태를 지칭한다 . 특히, 이러한 용어는 치료가 필요하고/필요하거나 요망되는 상태이다.
[0565] 본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료", 또는 "요법"은 본 발명의 면역조절 단백질 또는 조작된 세포를 단독으로 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 화합물과 조합하여 투여함으로써, 임상적 또는 진단적 중 어느 하나의 감소, 중지 또는 제거에 의해 입증되는 바와 같이, 질병 또는 장애의 진행을 늦추거나, 중지시키거나 역전시키는 것을 의미한다. "치료하는", "치료" 또는 "요법"은 또한 급성 또는 만성 질환 또는 장애에서 증상의 중증도 감소 또는 예를 들어 자가면역 질환의 재발 또는 완화 과정의 경우와 같은 재발률의 감소 또는 자가면역 질환의 염증성 태양의 경우 염증의 감소를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 질병 또는 장애의 "예방하는", "예방" 또는 "예방"은 면역조절 단백질 또는 본 발명의 면역조절 단백질을 발현하는 조작된 세포를 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여 투여하여, 질병 또는 장애의 발생 또는 발병 또는 질병 또는 장애의 증상의 일부 또는 전부를 예방하거나 질병 또는 장애의 발병 가능성을 감소시키는 것을 가리킨다. 예를 들어, 암의 맥락에서, 암의 "치료" 또는 "억제하다", "억제하는" 또는 "억제"라는 표현은: 종양 성장 속도의 통계적으로 유의한 감소, 고형 종양에 대한 반응 평가 기준(RECIST)과 같은 표준 기준에 의해 측정된 종양 성장 또는 종양의 크기, 질량, 대사 활성 또는 부피 감소, 또는 무진행 생존(PFS) 또는 전체 생존(OS)에서의 통계적으로 유의한 증가 중 적어도 하나를 의미한다.
[0566] 용어 "항원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 항원은 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체와 같은 면역 분자의 인식 부위에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 항원의 일부인 각 에피토프가 항체 또는 TCR/MHC 복합체의 인식 부위에 의해 결합될 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 유도하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.
[0567] 본원에 사용된 "종양-관련 항원" 또는 "종양-특이적 항원"은 정상 세포가 아닌 암세포에서만 발견되는 단백질 또는 기타 분자를 지칭한다.
[0568] 본원에 사용된 "신생항원"은 바이러스 감염, 신생물 형질전환, 약물 대사 또는 기타 방식에 의해 숙주 항원의 변경에 의해 발생하는 것과 같이, 면역계가 이전에 노출된 적이 없는 항원을 지칭한다. 특정 태양에서, 신생항원은 종양-특이적 돌연변이 유전자에 의해 인코딩되는 항원이거나 종양 세포에서 발생하는 새로운 항원이다.
[0569] "생체내(in vivo)"라는 용어는 포유동물 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
[0570] "생체외(ex vivo)"라는 용어는 포유동물 대상체의 조직 또는 세포 상에서 또는 그 내부에서 발생하지만 포유동물 대상체의 신체 외부에서 발생하는 사건을 지칭한다. 일반적으로 이 사건은 외부 환경에서 수행된다. 특정 태양에서, 생체외 절차는 장기, 세포 또는 조직이 치료 또는 절차를 위해 대상체, 일반적으로 생체로부터 채취된 다음 그 대상체에게 반환되는 임의의 것을 포함한다.
[0571] "시험관내(in vitro)"라는 용어는 실험실과 같은 테스트 시스템에서 발생하는 사건을 나타낸다.
[0572] 본원에 사용된 키트는 조합 또는 이의 요소의 사용을 위한 추가 시약 및 설명서와 같은 다른 요소를 선택적으로 포함하는 포장된 조합이다.
[0573] 용어 "패키지 삽입물"은 그러한 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 그러한 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭하는 데 사용된다.
[0574] 본원에서 사용되는 "제조 물품(article of manufacture)"은 제조되고 일부 경우에는 판매될 수 있는 제품이다. 일부 구체예에서, 이 용어는 용기와 패키징에 함유된 조성물을 지칭할 수 있다.
[0575] 본 명세서에 기재된 본 발명의 태양 및 구체예는 태양 및 구체예를 "포함하거나", "구성되거나" 및 "본질적으로 구성되는" 것을 모두 포함하는 것으로 이해된다.
예시적인 구체예
[0576] 다음의 구체예들이 제공된다:
1. 종양 반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 생체외 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 것이고, 여기서 상기 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 농축된 것이며, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포를 활성화시키는 존재 하에서 T 세포 자극 제제(들)과 T 세포와의 인큐베이션 전, 동시 또는 후에 수행되고, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극하는 것인 단계; 및
상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 다음을 포함하는 방법에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양-반응성 T 세포를 포함하는 생체외 T 세포 집단을, 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 대해 반응성인 내인성 TCR을 포함하고, 여기서 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 농축된 것인 단계; 및
(b) T 세포를 활성화하는 조건 하에 T 세포를 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 단계 (a)에서의 인큐베이션 전, 동시, 또는 그 후에 수행되고, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계; 및
(2) 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계
를 포함하는 방법.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, T 세포를 배양하는 단계는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 더 포함하되, 여기서 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 것인 방법.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션한 후에 상기 세포를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/되거나 최대 20일 동안 수행되는 방법.
6. 구체예 1 또는 구체예 5에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 포함하는 것인 방법.
7. 구체예 1-6 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대해 농축된 것인 방법.
8. 구체예 1-7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 종양-반응성 T 세포에 대해 농축된 것인 방법.
9. 구체예 1-8 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포는 대상체, 임의로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 것인 방법.
10. 구체예 1-9 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물에 존재하고, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행되는 것인 방법.
11. 구체예 1-10 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은:
(a) 대상체로부터의 건강한 조직과 종양 조직의 엑솜 시퀀싱에 의해 하나 이상의 종양-관련 항원과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하는 단계;
(b) 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 에피토프를 확인하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 에피토프는 네오에피토프인 단계;
(c) 대상체의 생물학적 샘플로부터 자가 T 세포 집단을 분리하는 단계;
(d) T 세포 집단을, 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상의 펩타이드 중 하나 이상을 제시하는 조건 하에 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩타이드에 노출되거나 또는 이와 접촉된 항원 제시 세포(APC)와 공동-배양함으로써, 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계
를 포함하는 프로세스에 의해 생성되는 것인 방법.
12. 구체예 11에 있어서, APC를 하나 이상의 펩타이드에 노출시키거나 이와 접촉시키는 것은:
하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드의 돌연변이 라이브러리를 생성하는 단계 [선택적으로 펩타이드는 길이가 8 내지 32개 아미노산이고, 길이, 8개 내지 18개 아미노산 길이, 8개 내지 10개 아미노산 길이, 10개 내지 32개 아미노산 길이, 10개 내지 24개 아미노산 길이, 10개 내지 18개 아미노산 길이, 18개 내지 32개 아미노산 길이, 18 내지 24개의 아미노산 길이 또는 24 내지 32개의 아미노산 길이, 임의로 약 9mers이다]; 및
주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상에 하나 이상의 펩타이드를 제시하는 조건하에서 펩타이드의 돌연변이 라이브러리로 APC를 펄스화하는 단계로서, 선택적으로 MHC는 MHC 클래스 I인 것인 단계
를 포함하는 방법.
13. 구체예 11에 있어서, APC를 하나 이상의 펩타이드에 노출시키거나 이와 접촉시키는 것은:
하나 이상의 종양-관련 항원 또는 체세포 돌연변이를 포함하는 이의 일부를 인코딩하는 DNA, 선택적으로 미니유전자 작제물을 생성하는 단계;
시험관내에서 DNA를 RNA로 전사하는 단계;
시험관내 전사된 RNA를 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상에 하나 이상의 펩타이드를 제시하는 조건 하에 APC 내로 도입하는 단계로서, 선택적으로 MHC는 MHC 클래스 II인 단계
를 포함하는 방법.
14. 구체예 10-13 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동배양은 1 내지 7일 동안 수행되는 방법.
15. 구체예 10-24 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동 배양의 적어도 일부 동안 수행되는 방법.
16. 구체예 11-14 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 공동배양물로부터 추가로 선택함으로써, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 방법.
17. 구체예 16에 있어서, 농축은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션 전에 수행되는 방법.
18. 구체예 10-17 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 공동배양 전에 수행되고, 여기서 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포의 집단은 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션되는 것인 방법.
19. 구체예 15 또는 구체예 16에 있어서, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단에 대한 농축 후에 수행되는 방법.
20. 구체예 10-19 중 어느 하나의 구체예에 있어서, APC는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 동종이계인 방법.
21. 구체예 9-20 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않은 방법.
22. 구체예 1-21 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은:
대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계;
T 세포를 포함하는 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계;
APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 활성화된 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 공동-배양은 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되어 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 적어도 하나의 애주번트와 함께 인큐베이션하는 단계;
공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계; 및
하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계
를 포함하는 방법.
23. 구체예 1-21 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은:
대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계;
APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계;
종양-반응성 T 세포를 포함하는 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계;
공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 선택은 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션 전 또는 후에 수행되는 것인 단계; 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 농축된 집단을 인큐베이션하는 단계; 및
하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계
를 포함하는 방법.
24. 구체예 1-21, 배양은:
대상체의 생물학적 샘플로부터 T 세포를 포함하는 세포 집단을 단리하는 단계;
T 세포를 포함하는 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계;
APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 APC의 존재 하에 활성화된 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 생성하는 단계; 공동배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 T 세포를 선택하여, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 농축하는 단계; 및
적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 농축된 집단을 인큐베이션하는 단계; 및
하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션, APC의 존재 하에 공동 배양 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계
를 포함하는 방법.
25. 구체예 10-23 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동-배양은 1-7일 동안 수행되는 방법.
26. 구체예 1-9 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터 직접 단리되거나 선택되는 방법.
27. 구체예 9-20 및 26 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 질환 또는 병태를 나타내고, 선택적으로 질환 또는 병태은 암인 방법.
28. 구체예 26 또는 구체예 27에 있어서, 대상체는 T 세포 집단의 단리 또는 선택 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받은 대상체인 방법.
29. 구체예 1-28 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 대해 자가이고, 선택적으로, 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는 대상체인 방법.
30. 구체예 1-29 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은이 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플인 방법.
31. 구체예 30에 있어서,the 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집인 방법.
32. 구체예 30 또는 구체예 31에 있어서,the 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함하는 것인 방법.
33. 구체예 30-32 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양 반응성 T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 농축은 유세포 분석에 의하고, 선택적으로 FX500 세포 분류기 또는 Miltenyi Tyto 세포 분류기를 사용함으로써, 선택적으로, 자동화된 고처리량 유세포 분석법에 의해 수행되는 것인 방법.
34. 구체예 30-33 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 유세포 분석에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행을 수행하여 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 방법.
35. 구체예 30에 있어서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 임의로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집되는 것인 방법
36. 구체예 1-30 또는 35 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함하는 방법.
37. 종양 반응성 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은:
(1) 다음 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계; 및
(b) 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 조건 하에 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하기 전, 동안 또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
38. 종양 반응성 T 세포를 제조하는 방법으로서, 이 방법은:
(1) 다음 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계;
(b) 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포의 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께, 세포의 집단의 세포의 확장이 자극되는 조건 하에 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 단계 (b)에서의 인큐베이션 전, 동시 또는 후에 수행되되, 여기서 배양은 T 세포 집단의 세포 확장을 자극하는 것인 단계; 및
(2) 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
39. 구체예 37 또는 구체예 38에 있어서, T 세포를 배양하는 단계는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은, T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 및/또는 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 것인 방법.
40. 구체예 37-39 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 상기 하나 이상의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션한 후에 상기 세포를 세척하는 것을 더 포함하는 방법.
41. 구체예 37-40 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/되거나 20일 이하 동안 수행되는 것인 방법.
42. 구체예 1-38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것의 적어도 일부는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제와 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행되는 것인 방법.
43. 구체예 1-38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것은 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션한 후에 수행되는 것인 방법.
44. 구체예 26-43 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은:
T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것인 단계;
반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께, 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 인큐베이션하여 활성화된 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계;
적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 활성화된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 인큐베이션하는 단계; 및
하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 것인 단계
를 포함하되, 여기서 상기 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극하는 것인 방법
45. 구체예 43 또는 구체예 44에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하의 인큐베이션은 세포를 수확하기 1일 내지 5일 전에 수행되는 방법.
46. 구체예 1-38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 것은 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하기 전에 수행되는 것인 방법.
47. 구체예 46에 있어서, T 세포 집단을 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션한 후, 그리고 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션하기 전에, 종양- 반응성 T 세포 및/또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커를 발현하는 T 세포를 농축하되, 여기서 농축된 T 세포의 집단은 T 세포 자극 제제(들)와 함께 인큐베이션되는 방법.
48. 구체예 37-47 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포는 대상체, 임의로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포인 방법.
49. 구체예 37-48 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물이고, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행되는 방법.
50. 구체예 49에 있어서, APC는가 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 동종이계인 방법.
51. 구체예 48-50 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않은 방법.
52. 구체예 37-49 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래하고 선택은 생물학적 샘플로부터 T 세포를 직접 단리하는 것을 포함하는 방법.
53. 구체예 37-49 및 52 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 질환 또는 병태를 나타내고, 선택적으로 질환 또는 병태는 암인 방법.
54. 구체예 52 또는 구체예 53에 있어서, 대상체는 T 세포 집단의 단리 또는 선택 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받은 대상체인 방법.
55. 구체예 37-54 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 자가이고, 선택적으로 치료될 대상체는가 종양 또는 암을 갖는 것인 방법.
56. 구체예 37-55 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플인 방법.
57. 구체예 56에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집인 방법.
58. 구체예 57에 있어서, 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함하는 것인 방법.
59. 구체예 57 또는 구체예 58에 있어서, 종양 반응성 T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 농축은 유세포 분석에 의하고, 선택적으로 FX500 세포 분류기 또는 Miltenyi Tyto 세포 분류기를 사용함으로써, 선택적으로, 자동화된 고처리량 유세포 분석법에 의해 수행되는 것인 방법.
60. 구체예 57-59 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 유세포 분석에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행을 수행하여 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 방법.
61. 구체예 56에 있어서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집되는 것인 방법.
62. 구체예 37-56 또는 61 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함하는 것인 방법.
63. 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 다음 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) T 세포의 집단을 공동자극 작용제 또는 세포자멸사 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) T 세포의 집단으로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 단계로서, 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(c) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서의 인큐베이션은 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행되고, 여기서 상기 배양은 T 세포 집단의 세포의 확장을 자극하는 것인 단계; 및
(2) 상기 방법에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계
를 포함하는 방법.
64. 구체예 63에 있어서, 상기 방법은 세포를 T 세포 자극 제제(들), 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계들 중 하나 이상의 단계 후에 세포를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
65. 구체예 63 또는 구체예 64에 있어서, 배양은 역치 양의 세포가 얻어질 때까지 수행되고/되거나 최대 20일 동안 수행되는 방법.
66. 구체예 63에 있어서, T 세포의 집단은 대상체, 임의로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포를 포함하는 것인 방법.
67. 구체예 63 또는 구체예 66에 있어서, T 세포의 집단은 대상체의 생물학적 샘플로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물로부터 단리되고, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양으로부터 하나 이상의 신생항원 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행되는 방법.
68. 구체예 67에 있어서, APC는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 대해 동종이계인 방법.
69. 구체예 66-68 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체가 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않은 방법.
70. 구체예 63 또는 구체예 66에 있어서, T 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 직접 단리되거나 선택되는 것인 방법.
71. 구체예 63, 66 및 70 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체가 질환 또는 병태를 나타내고, 선택적으로 질환 또는 병태가 암인 방법.
72. 구체예 63-71 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 자가이고, 선택적으로 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는 것인 방법.
73. 구체예 63-72 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플인 방법.
74. 구체예 73에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집인 방법.
75. 구체예 74에 있어서, 생물학적 샘플은 50 mL 내지 400 mL의 부피를 포함하는 것인 방법.
76. 구체예 74 또는 구체예 75에 있어서, 종양 반응성 T 세포 또는 하나 이상의 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포에 대한 농축은 유세포 분석에 의하고, 선택적으로 FX500 세포 분류기 또는 Miltenyi Tyto 세포 분류기를 사용함으로써, 선택적으로, 자동화된 고처리량 유세포 분석법에 의해 수행되는 것인 방법.
77. 구체예 74-76 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 유세포 분석에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행을 수행하여 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 방법.
78. 구체예 73에 있어서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 임의로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집되는 것인 방법.
79. 구체예 6-73 또는 78 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 종양 침윤 림프구를 포함하는 것인 방법.
80. 구체예 37-79 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 종양-반응성 T 세포에 대한 농축은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법.
81. 구체예 37-80 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 방법.
82. 구체예 37-81 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 농축된 것인 방법.
83. 구체예 1-36 및 82 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 농축은 세포 표면 마커 CD3에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함하거나 또는 세포 표면 마커 CD4에 대해 표면 양성인 T 세포 및 세포 표면 마커 CD8에 대해 표면 양성인 T 세포를 순차적 또는 동시적으로 선택하는 것을 포함하는 방법.
84. 구체예 1-36, 82 및 83 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 풍부한 집단은 집단 내 총 세포에 대한 백분율로서 CD3+ T 세포를 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 백분율로서 포함하거나; 또는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 풍부한 집단은 집단 내 총 세포에 대한 백분율로서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 백분율로서 포함하는 방법.
85. 구체예 1-36 및 82-84 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1인 방법.
86. 구체예 1-85 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
종양-관련 항원은 신생항원이고; 및/또는
종양-반응성 T 세포는 신생항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 T 세포를 포함하는 방법.
87. 구체예 8-86 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
종양-반응성 T 세포가 농축된 집단은 종양-반응성 T 세포를, 집단내 총 세포 또는 총 T 세포의 백분율로서 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 또는 약 95% 이상 포함하고; 및/또는
종양-반응성 T 세포가 농축된 집단은 활성화 표현형을 갖는 T 세포를, 집단내 총 세포 또는 총 T 세포의 백분율로서, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 또는 약 95% 이상 포함하며, 여기서 활성화 표현형은 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 포함하는 방법.
88. 구체예 6-36 및 80-87 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
89. 구체예 6-36 및 80-88 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
90. 종양-반응성 T 세포를 단리하는 방법으로서, 상기 방법은 생물학적 샘플로부터, CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법.
91. 구체예 90에 있어서, 세포의 확장 또는 증식을 위한 조건 하, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트 및/또는 T 세포 자극 제제의 존재 하에서, 선택된 세포를 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하는 방법.
92. 구체예 90 또는 구체예 91에 있어서, T 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터의 1차 T 세포인 방법.
93. 구체예 90-92 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 자가 T 세포 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 생체외 공동-배양물이고, 상기 공동-배양은 APC가 대상체의 종양 관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드를 제시하도록 유도된 조건 하에 수행되는 방법.
94. 구체예 93에 있어서, APC는 대상체에 대해 자가 또는 대상체에 대해 동종이계인 방법.
95. 구체예 92-94 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 건강하거나 질병 또는 상태를 나타내는 것으로 알려져 있지 않은 방법.
96. 구체예 90-95 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 것이고 선택은 생물학적 샘플로부터 T 세포를 직접 단리하는 것을 포함하는 방법.
97. 구체예 90-93 및 96 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체는 질환 또는 병태를 나타내고, 선택적으로 질환 또는 병태는 암인 방법.
98. 구체예 96 또는 구체예 97있어서, 대상체는 T 세포 집단을 단리 또는 선택하기 전에 공동자극 작용제를 사전에 투여받은 대상체인 방법.
99. 구체예 90-98 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포는 치료될 대상체에 대해 동종이계이거나 치료될 대상체에 대해 자가이고, 선택적으로 치료될 대상체는 종양 또는 암을 갖는 것인 방법.
100. 구체예 90-99 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플인 방법.
101. 구체예 95에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플은 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되며, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집인 방법.
102. 구체예 100에 있어서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집되는 것인 방법.
103. 구체예 6-36 및 80-102 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
104. 구체예 103에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 방법.
105. 구체예 89-104 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커가 CD137을 추가로 포함하는 것인 방법.
106. 구체예 105에 있어서, 하나 이상의 반응성 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 방법.
107. 구체예 89-106 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 반응성 T 세포 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 추가로 포함하는 방법.
108. 구체예 80-107 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 선택은 면역친화성-기반 선택을 포함하는 방법.
109. 구체예 108에 있어서, 면역친화성 기반 선택은 세포를 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고 항체에 결합된 세포를 회수함으로써 수행되는 방법.
110. 구체예 109에 있어서, 항체가 입자 상에 고정되고, 선택적으로 입자는 비드 또는 나노입자이며, 선택적으로 입자는 자성 입자인 방법.
111. 구체예 110에 있어서, 선택은 자기-기반 선택을 포함하는 방법.
112. 구체예 110에 있어서, 항체는 검출가능한 제제로 표지되고, 상기 검출가능한 제제는 선택적으로 형광단인 방법.
113. 구체예 112에 있어서, 선택은 유세포 분석을 포함하는 방법.
114. 구체예 1-89 및 91-113 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 가용성이거나 및/또는 고체 지지체에 결합되거나 부착되지 않고, 선택적으로 고체 지지체는 비드인 방법.
115. 구체예 1-89 및 91-114 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제 및 적어도 하나의 세포자멸사 차단제를 포함하는 방법.
116. 구체예 115에 있어서, 적어도 하나의 공동자극 작용제 및 적어도 하나의 세포자멸사 차단제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 방법.
117. 구체예 1-89 및 91-116 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 포함하는 방법.
118. 구체예 1-117 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 CD28에 특이적으로 결합하지 않거나 항-CD28 항체가 아닌 방법.
119. 구체예 1-89 및 91-118 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 작용제인 방법.
120. 구체예 119에 있어서, 공동자극 작용제는 TNFRSF 구성원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이거나, 또는 TNFRSF 구성원의 리간드의 세포외 도메인 또는 그의 결합 부분을 포함하는 융합 단백질인 방법.
121. 구체예 119 또는 구체예 120에 있어서, 상기 TNFRSF 구성원은 OX40, 4-1BB, GITR 및 CD27로부터 선택되는 방법.
122. 구체예 1-89 및 91-121 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하는 방법.
123. 구체예 1-89 및 91-122 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 타볼릭시주맙, 포갈리주맙, 11D4, 18D8, Hu119-122, Hu106-222,PF-04518600, GSK3174998, MEDI6469, BMS 986178 또는 9B12로부터 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이거나, 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
124. 구체예 1-89 및 91-121 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 MEDI6383인 OX40L 융합 단백질인 방법.
125. 구체예 1-89 및 91-121 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 방법.
126. 구체예 1-89, 89-121 및 125 중 어느 하나의 구체예에 있어서 공동자극 작용제는 우렐루맙 또는 우토밀루맙이거나, 상기 중 어느 하나의 항원-결합 단편인 방법.
127. 구체예 1-89 및 91-121 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 공동자극 작용제는 CD27에 특이적으로 결합하는 방법.
128. 구체예 1-89 및 91-116 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 세포자멸사 억제제를 포함하는 방법.
129. 구체예 1-89, 91-116 및 128 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포자멸사 억제제는 CD95 (Fas)에 의해 유도되는 세포자멸사를 감소시키고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 CD95 (Fas) 또는 CD95 리간드 (Fas 리간드)에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
130. 구체예 129에 있어서, 세포자멸사 억제제는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 항-Fas 항체 또는 항-Fas 리간드 항체인 방법.
131. 구체예 129에 있어서, 세포자멸사 억제제는 CD95(Fas) 또는 Fc 면역글로불린 도메인에 융합된 CD95 리간드 (Fas 리간드)에 결합하는 그의 특이적 결합 단편을 포함하는 융합 단백질이고, 선택적으로 여기서 세포자멸사 억제제는 APG101 또는 CAN008인 방법.
132. 구체예 1-89, 91-116 및 128 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포자멸사 억제제는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하고, 선택적으로 카스파제는 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 및 카스파제인 방법. 카스파아제 3, 카스파아제 6 또는 카스파아제 7이며, 여기서 선택적으로 카스파아제는 카스파아제 3인 방법.
133. 구체예 1-89, 91-116, 128 및 132 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포자멸사 억제제는 NAIP(뉴런 세포자멸사 억제 단백질; BIRC1), cIAP1 및 cIAP2(세포자멸사 1 및 2의 세포 억제제; 각각 BIRC2 및 BIRC3), XIAP(X-염색체 결합 IAP, BIRC4), 서바이빈(BIRC5), BRUCE(Apollon, BIRC6), 리빈(BIRC7) 및 Ts-IAP(고환-특이적 IAP, BIRC8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
134. 구체예 1-89, 91-116, 128 및 132 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포자멸사 억제제는 에메리카산인 방법.
135. 구체예 1-89 및 91-134 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 자극 제제(들)은 TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제 및 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제로부터 선택되고, 선택적으로 여기서 공동자극 수용체는 CD28인 방법.
136. 구체예 135에 있어서, TCR/CD3 세포내 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD3 항체, 선택적으로 OKT3인 방법.
137. 구체예 135 또는 구체예 136에 있어서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 선택적으로 비-분열 또는 조사된 PBMC를 포함하는 방법.
138. 구체예 135 또는 구체예 136에 있어서, 공동자극 수용체를 통해 신호전달을 개시하는 제제는 항-CD28 항체인 방법.
139. 구체예 138에 있어서, T 세포 자극 제제(들)은 각각 가용성인 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체인 방법.
140. 구체예 135-139 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포 자극 제제(들)은 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로부터 선택된 재조합 사이토카인을 포함하고, 선택적으로 상기 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-22 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
141. 구체예 1-140 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 수확은 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 배양 및/또는 농축 개시 후 20일 이내에 수행되는 방법.
142. 구체예 141에 있어서, 배양은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인의 존재 하에 수행되는 방법.
143. 구체예 141 또는 구체예 142에 있어서, 상기 세포는 배양 단계의 개시 후 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 10 내지 14일 또는 14 내지 20일에 수확되는 방법.
144. 구체예 5-143 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 배양은 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 전체 세포 또는 총 생존가능 세포인 세포의 역치 양, 즉 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 1 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109 총 세포 또는 총 생존가능 세포가 달성될 때까지 수행되는 방법.
145. 구체예 1-144 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 방법은 적어도 약 2배 이상, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배 이상, 적어도 약 1000배 이상, 또는 그 이상의 T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래하는 것인 방법.
146. 구체예 1-145 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고, 선택적으로 성분채집 샘플이며, 여기서:
배양 개시시 세포의 수는 약 1 x 109 내지 7 x 109 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 1 x 109 총 생존가능 세포, 약 2 x 109 총 생존가능 세포, 3 x 109 총 생존가능 세포, 4 x 109 총 생존가능 세포, 5 x 109 총 생존가능 세포, 6 x 109 총 생존가능 세포, 또는 7 x 109 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는
배양 개시시 종양 반응성 T 세포의 백분율은 약 0.02% 내지 약 40%, 약 0.02% 내지 약 24%, 약 0.02% 내지 약 18%, 약 0.02% 내지 약 0.9% 또는 약 0.02% 내지 약 6.0%이거나; 및/또는
배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.1 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 8 x 106 T 세포, 0.1 x 106 내지 약 20 x 106 T 세포, 0.3 x 106 내지 약 35 x 106 T 세포 또는 0.3 x 106 내지 약 60 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.1 x 106 T 세포, 0.3 x 106 T 세포, 0.6 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5 x 106 T 세포, 10 x 106 T 세포, 35 x 106 T 세포 또는 60 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값인 방법.
147. 구체예 1-145 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 림프 공급원 샘플 또는 종양 공급원 샘플이고, 여기서:
배양 개시 시 세포의 수는 약 10 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 내지 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 12 x 106 내지 43 x 106 총 생존가능 세포이거나; 또는 약 10 x 106 총 생존가능 세포, 약 12 x 106 총 생존가능 세포, 20 x 106 총 생존가능 세포, 40 x 106 총 생존가능 세포, 60 x 106 총 생존가능 세포, 또는 100 x 106 총 생존가능 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값이거나; 및/또는
배양 개시시 종양 반응성 T 의 백분율은 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 25% 또는 약 1% 내지 약 14%이거나; 및/또는
배양 개시시 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포의 수는 약 0.7 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 1 x 106 내지 약 15 x 106 T 세포, 또는 약 0.7 x 106 내지 약 5.4 x 106 T 세포이거나; 또는 약 0.7 x 106 T 세포, 1 x 106 T 세포, 5.4 x 106 T 세포, 또는 15 x 106 T 세포, 또는 전술한 임의의 값들 사이의 임의의 값인 방법.
148. 구체예 1-146 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 방법의 단계들 중 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행되고, 선택적으로 선택 및/또는 농축 또는 인큐베이션을 위한 단계 중 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행되는 방법.
149. 구체예 1-148 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 최소 24시간 및 세포의 수확 시간까지이거나 또는 약 24시간 내지 약 96시간 또는 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간, 약 36시간 또는 약 48시간 동안 수행되거나; 및/또는
T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 약 24시간 내지 약 96시간 또는 약 24시간 내지 약 48시간 또는 약 24시간 또는 약 36시간 또는 약 48시간 동안 수행되는 방법.
150. 구체예 1-148 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 대상체에 투여하기 위해 수확된 세포를 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
151. 구체예 150에 있어서, 제제화는 동결보존을 포함하고, 여기서 세포는 대상체에 투여되기 전에 해동되는 것인 방법.
152. 구체예 1-151 중 어느 하나의 구체예의 방법에 의해 제조된 조성물.
153. 종양-반응성 T 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 조성물 내 총 세포 또는 총 T 세포의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%는 종양 반응성 T 세포이거나 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 것인 조성물.
154. 구체예 153에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
155. 구체예 153 또는 구체예 154에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
156. 구체예 153-155 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
157. 구체예 153-156 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 조성물.
158. 구체예 153-157 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD137을 더 포함하는 조성물
159. 구체예 158에 있어서, 하나 이상의 반응성 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 조성물.
160. 구체예 153-159 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 반응성 T 세포 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 더 포함하는 조성물.
161. 구체예 153-160 중 어느 하나의 구체예에 있어서 T 세포는 CD3+ T 세포이거나 또는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물.
162. 구체예 153-161 중 어느 하나의 구체예에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고, 여기서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1인 조성물.
163. 구체예 153-162 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 조성물 중 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 총 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포 또는 그의 생존 세포의 수는 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108, 1 x 108 내지 약 50 x 109, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109, 1 x 108 내지 약 12 x 109, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109인 조성물.
164. 구체예 153-162 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
165. 구체예 153-164 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 동결보호제를 포함하는 조성물.
166. 구체예 153-165 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 멸균성인 조성물.
167. 구체예 151의 조성물을 암에 걸린 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
168. 구체예 168에 있어서, 투여된 조성물의 세포는 상기 대상체에 대해 자가인 방법.
169. 구체예 167 또는 구체예 168에 있어서, 암은 상피암인 방법.
170. 구체예 167-169 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 암은 흑색종, 폐 편평상피암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암, 자궁경부암, 두경부암, 위암 또는 자궁암인 방법.
171. 구체예 167-169 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종 암, 자궁내막암, 선택적으로 여기서 유방암은 HR+/Her2- 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 HER2+ 유방암인 방법.
VII. 실시예
[0577] 하기 실시예는 예시 목적으로만 포함된 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1 종양-유래 T-세포의 집단을 수득하데 있어서 종양 처리 방법론의
평가
[0578] 결장직장암(CRC) 또는 흑색종을 앓는 환자로부터의 종양을 후술하는 바와 같이 처리하고 생성된 침윤 T-세포 집단을 세포 수 생존력에 대해 분석하였다.
A. 결장직장암
[0579] 종양은 결장직장암 환자의 원발성 종양에서 유래되었고 4℃에서 HypoThermosol에서 밤새 운송되었다. 종양은 단편 또는 단일 세포 현탁액(SCS) 배양물로서 처리되었다.
[0580] 단편 배양의 경우, 종양을 직경 1 - 8 mm의 단편으로 잘게 썰고, 각각의 1 - 8 mm 단편을 5% 인간 혈청 또는 무혈청 OpTmizer 배지(ThermoFisher)를 포함하는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)의 존재 하에 기체 투과성 24-웰 배양 플레이트 또는 통상적인 6-웰 플레이트인 배양 용기의 웰에 넣었다. 배지에 300 또는 6000 IU/mL 재조합 IL-2가 보충되었으며, 제조업체의 권장 사항에 따라 10μg/ml의 겐타마이신, 2~5%의 면역 세포 혈청 대체물(ThermoFisher) 및 글루타민을 최종 농도 2.0 mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)로 함유시켰다. 단편 배양은 대략 배양 5일에서 11일 사이에 세포 계수가 수행될 때까지 유지되고 시각적으로 모니터링되었다.
[0581] SCS 배양의 경우에도, 종양을 직경 1 - 8 mm의 단편으로 잘게 썰었다. 그런 다음, 종양을 분해시키기 위한 효소의 존재 또는 부재 하에 Miltenyi GentleMACS를 사용하여 폐쇄 시스템에서 균질화시켰다. 여기서 상기 효소는 제조업체 추천에 따라 사용된 Miltenyi Tumor Dissociation Kit, human(part 130-095-929) Collagenase I/II 블렌드(Nordmark, Collagenase NB 4G Proved Grade, part: S1746503) 또는 Collagenase IV(Worthington Biomedical part: LS004130)로부터의 1 mg/ml 또는 5 mg/ml 효소 칵테일이었다. 균질화 및 효소 분해가 있는 SCS용으로 할당된 단편을 총 60분 동안 효소 칵테일 또는 콜라게나제와 함께 인큐베이션하였다. SCS 생성 직후, NC-200 자동 세포 계수기(ChemoMetec)로 세포 수 및 생존력 평가를 수행하였다.
[0582] 도 3A에 도시된 바와 같이, 효소 분해가 있거나 없는 SCS 배양은 CRC 종양 단편으로부터 배양 후 수득된 것보다 더 많은 총 생존 세포(TVC)를 산출하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 생존 세포의 백분율은 효소의 존재 하에 균질화에 의해 생성된 SCS 또는 단편에서 생성된 배양물에서 유사하였다.
B. 흑색종
[0583] 종양은 흑색종 환자의 원발성 종양에서 유래되었고 4℃에서 HypoThermosol에서 밤새 운송되었다. 세포를 상기 기재된 바와 유사하게 배양하였다.
[0584] 간략히 설명하면, 단편 배양의 경우 종양을 직경 1 - 8 mm의 단편으로 잘게 썰고, 각각의 1 - 8 mm 단편을 300IU/ml 또는 6000IU/ml 농도로 재조합 IL-2가 보충된 5% 인간 혈청 또는 무혈청 OpTmizer 배지를 포함하는 RPMI의 존재 하에, 기체 투과성 24-웰 배양 플레이트 또는 기존의 6-웰 플레이트의 웰에서 배양하였다. 배지에는 10μg/ml의 겐타마이신과 최종 농도 2.0mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)도 포함되어 있다. 단편 배양을 유지하고 배양 5일 내지 9일에 세포 계수를 수행할 때까지 시각적으로 모니터링하였다.
[0585] SCS 배양물을 생성하기 위해, 1 mg/mL 또는 5 mg/mL 농도의 콜라게나제 IV 또는 1 mg/mL 또는 5 mg/mL 농도의 콜라게나제 I/II 블렌드를 포함하는 효소의 존재 또는 부재 하에, Miltenyi GentleMACS를 사용하여 종양 단편을 균질화하였다(Nordmark, 콜라게나제 NB 4G Proved Grade, part: S1746503). 전술한 바와 같이, NC-200 Automated Cell Counter(Chemometec)를 사용하여 SCS 생성 직후 세포 수 및 생존력 평가를 수행하였다.
[0586] 도 4A에 도시된 바와 같이, 흑색종 종양 단편으로부터 생성된 배양물은 균질화 및 효소에 의한 분해에 의해 생성된 SCS보다 더 많은 총 생존 세포를 산출하였다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 단편 배양물은 또한 효소 균질화와 상관없이 SCS 배양물 중의 세포에 비해 더 높은 퍼센트 생존 세포를 가졌다.
실시예 2: 종양 유래 세포의 T 세포 확장 역학의 평가
[0587] 종양을 실시예 1에 기술된 바와 같이 처리하여 직경 1 - 8 mm 단편 또는 SCS 배양물을 생성한 다음, 이를 종양 내에 존재하는 T 세포 집단을 확장시키는 조건 하에 인큐베이션하였다. 세포 확장을 평가하기 위해 하기에 기술된 바와 같이 재조합 IL-2의 존재 하에 다양한 시험 조건 하에 배양물을 성장시켰다. 테스트된 조건 중에는 배양 플레이트 유형, 배양 배지 및 IL-2 농도가 세포 확장에 미치는 영향이 포함된다.
A. 배양 조건
[0588] 실시예 1에 기재된 바와 같이, CRC 또는 흑색종을 갖는 공여자 환자로부터의 원발성 종양의 균질화 및 효소 분해에 의해 수득된 단일 세포 현탁액(SCS)을 통상적인 6-웰 플레이트 또는 기체-투과성 24-웰 배양물에서 배양하였다. 가능한 경우 각 공여자의 여러 조건을 시작하고 평균을 냈다(오차 막대는 ± 표준 편차를 나타냄). 6웰 플레이트의 경우 세포를 250,000~1,000,000개 세포/mL로, 기체 투과성 24웰 플레이트의 경우 5,000~750,000개 세포/mL로 세포를 접종하였다. 두 경우 모두, 세포를 300IU/mL 또는 6000IU/mL 농도로 보충된 재조합 IL-2가 포함된 무혈청 OpTmizer 배지 또는 5% 인간 혈청을 포함하는 RPMI에 접종하였다. 배지는 또한 10μg/ml의 겐타마이신과 2.0mM의 최종 농도의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)을 포함하였다. 세포를 최대 31일, 일반적으로 14 내지 21일 동안 인큐베이션하였고, 여기서 세포 배지의 50%는 배양 5일째부터 시작하여 격일로 교환되었다.
[0589] 종양 단편으로부터의 확장을 위해, CRC 또는 흑색종을 갖는 공여자 환자의 원발성 종양으로부터 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득한 개별 1-8 mm 종양 단편을 기체 투과성 24-웰 배양 플레이트 또는 6웰 플레이트의 웰에 넣고, 300IU/mL 또는 6000IU/mL 농도로 보충된 재조합 IL-2가 포함된 무혈청 OpTmizer 배지 또는 5% 인간 혈청을 포함하는 RPMI에서 배양한다. 배지에는 10μg/ml의 겐타마이신과 최종 농도 2.0mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)도 포함되어 있다. 세포를 최대 31일 동안, 예를 들어 통상적으로 14 내지 21일 동안 인큐베이션하였고, 여기서 세포 배지의 50%는 배양 5일째부터 시작하여 격일로 교환하였다.
[0590] 모든 조건에 대해, 세포 계수는 NC-200 자동 세포 계수기(Chemometec)를 사용하여 대략 격일로 수행되었고 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위해 세포를 수집하였다. 확장 단계가 완료된 후(예컨대 14 - 31일), 세포를 PBS로 세척한 다음 동결보호제의 존재 하에 동결 보존하였다. CoolCell 장치(Corning) 또는 VIA Freeze(GE Healthcare)를 사용하여 냉동보존을 수행하였다.
B. 결과
1. 성장 곡선
[0591] 상이한 배양 용기에서의 확장 배양 후 CRC 공여자 환자로부터의 종양 단편으로부터 수득된 SCS의 확장의 성장 곡선을 도 5A 및 5B에 도시하였다. 도시된 결과는 두 가지 배지 유형에서 300 IU/mL 또는 6000 IU/mL 농도 모두의 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션되고, 출발 세포의 공급원에 기초하여 분리된 배양물로부터 얻어진 것이다. 도시된 바와 같이, 이러한 조건 하에서 CRC 공여자의 종양으로부터의 SCS로부터 종양 유래 세포를 확장하는 것이 가능하였다. 일부 공여자에서는 CRC 종양에서 직접 얻은 세포의 초기 확장 단계에서 2배 이상, 심지어 10배 이상의 확장이 관찰되었다.
[0592] CRC 종양 생검 제품으로부터의 종양 단편과 비교하여 SCS로부터 달성된 확장을 평가하였다. 도 5C 및 5D에 도시된 바와 같이, 단편으로서 또는 SCS로서 추출 및 배양되든 간에 이러한 조건하에서 CRC 종양으로부터 세포를 확장하는 것이 가능하였다. 그러나, 일반적으로 단편을 통해 추출된 배양 세포와 비교하여 더 높은 총 세포 수(도 5C) 및 배수 확장(도 5D)에 의해 입증되는 바와 같이, SCS로 추출된 CRC 배양물에서 더 큰 확장이 달성되었다.
[0593] 상이한 배양 용기에서 확장 배양 후 상이한 흑색종 공여자로부터 추출된 종양 단편으로서 또는 종양 단편으로부터의 SCS로서 배양된 세포의 확장의 성장 곡선을 도 6A 및 6B에 도시하였다. 도시된 결과는 두 가지 배지 유형에서 300 IU/mL 또는 6000 IU/mL 농도 모두의 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션되고, 출발 세포의 공급원에 기초하여 분리된 배양물로부터 얻어진 것이다. 도시된 바와 같이, 어느 배양 용기에서든 종양 단편으로 추출된 흑색종 배양물에서 실질적인 확장이 관찰된 반면, SCS로 배양된 흑색종 세포에서는 더 적은 확장이 관찰되었다.
[0594] 이전 관찰과 일관되게, 특정 공여자로부터의 종양 세포는 종양 유형에 관계없이 확장에 순응할 수 없었는데, 이는 공여자들 간 및 더 나아가 동일한 공여자 종양의 종양 단편 간의 확장 잠재력의 내재적인 가변성을 가리키는 것이다. 공여자 환자의 종양 단편이 배양 중에 풀링되는 대규모 방법은, 동일한 공여자 종양의 종양 조각을 조합시킴으로써 종양 내 변동성을 완화할 것으로 예상된다.
2. 세포성 배지에 의한 성장 평가
[0595] 5% 인간 혈청 또는 혈청 대체 제제(OpTmizer 배지)를 함유하는 RPMI 배지에서 전술한 바와 같이 생성된 확장된 배양물을 14일 내지 21일 동안의 확장 후 비교하였다. 도시된 결과는 두 가지 배지 유형에서 300 IU/mL 또는 6000 IU/mL 농도 모두의 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션되고, 배지 유형에 기초하여 분리된 배양물로부터 얻어진 것이다. CRC 종양에 대한 결과는 종양 단편에서 얻은 SCS의 배양물로부터 얻은 반면(도 7A 및 7B), 흑색종 종양의 결과는 종양 단편의 배양물에서 얻은 것이다(도 8A 및 8B).
[0596] 5% 인간 혈청 또는 혈청 대체물 배지에서의 배양에 의해, 두 종양 유형 모두에 대해, 총 세포 수(도 7A 및 도 8A) 및 배수 확장(도 7B 및 도 8B)의 증가가 관찰되었다. 테스트된 샘플에서, 초기 확장 단계의 말기에서 더 높은 전체 세포 수에 의해 입증된 바와 같이, OpTmizer 배지 사용시 확장이 개선되는 경향이 있었다(도 7A 및 도 8A).
3. IL-2 농도
[0597] 상이한 종양 유형으로부터의 확장 동안 상이한 IL-2 농도의 효과를 비교하였다. 배양물은 300IU/mL 또는 6000IU/mL 재조합 IL-2과 함께 혈청 대체 제제(OpTmizer 배지) 또는 5% 인간 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 전술한 바와 같이 14일 내지 21일 동안 배양물을 확장시켰다. 도시된 결과는 두 가지 유형의 배지 및 두 가지 유형의 배양 용기에서 인큐베이션되고, IL-2 농도에 기초하여 분리된 배양물에서 얻은 것이다. CRC 종양에 대한 결과는 종양 단편으로부터 얻은 SCS의 배양물로부터 얻은 반면(도 9A 및 9B), 흑색종 종양의 결과는 종양 단편의 배양물에서 얻은 것이다(도 10A 및 10B).
[0598] 두 종양 유형 모두에 있어서, 결과는 확장 후 유사한 총 세포 수(도 9A 및 도 10A) 및 확장 배수(도 9B 및 도 10B)에 의해 입증되는 바와 같이, 고농도 또는 저농도 IL-2에서 성장한 세포의 유사한 확장을 나타내었다. 이러한 데이터는 약 300IU/mL의 IL-2 용량이 확장을 지원하며, CRC 또는 흑색종 배양에 대한 세포 확장에 있어 6000IU/mL와 같은 고용량 IL-2가 필요한 것은 아니라는 관찰을 뒷받침한다.
[0599] 이와 함께, 결과는 확장이 공여자 및 또한 종양 샘플 의존적일 수 있지만, CRC 종양 침윤 T-세포가 다수의 공여자에 걸쳐 단편 배양물로부터의 흑색종 침윤 T-세포 및 SCS 배양물로부터 성공적으로 성장되었음을 보여준다. 마찬가지로, 흑색종 및 CRC 유래 T-세포 배양물 양자 모두에 있어서, 고농도의 IL-2의 첨가가 저용량과 비교할 때 현저하게 뚜렷한 확장 반응을 초래하지는 않은 것으로 관찰되었다.
실시예 3: 종양 유래 세포의 확장에 대한 항-CD3 자극의 평가
[0600] 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 흑색종 종양 단편으로부터 처리된 세포를, 인간 항-CD3 모노클로날 항체인 50ng/mL OKT3의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 세포 배양은 RPMI 또는 OpTmizer 배지와 함께 기존의 6-웰 플레이트 또는 기체 투과성 배양 플레이트에서 14일 내지 31일 동안 수행되었다. 배양물에는 또한 300 또는 6000IU/mL 재조합 IL-2, 10μg/mL 겐타마이신 및 2.0mM의 최종 농도의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement; Thermofisher)을 보충하였다. 세포 배지의 약 50%는 이전에 설명한 대로 배양 5일째부터 시작하여 격일로 교환되었다. 그런 다음 NC-200 자동 세포 계수기(Chemometec)를 사용하여 세포를 계수하였다.
[0601] 도시된 결과는 300 IU/mL 또는 6000 IU/mL의 두가지 농도의 재조합 IL-2, 상이한 배지 및 두 가지 유형의 배양 용기를 이용하여 인큐베이션되고, 항 -CD3 자극의 존재 또는 부재 하에 기초하여 분리된 배양물로부터 얻어진 것이다. 공여자 6의 세포는 항-CD3 자극의 존재 또는 부재 하 모두에서 테스트되었으며, 모든 조건에서 2-4배 확장을 입증했으며, 항-CD3 자극 (-OKT3) 부재하에 300 IU/mL IL-2이 공급된 OpTmizer 배지에서 인큐베이션된 경우 13배 확장이 관찰되었다. 도 11A-11B에 도시된 결과는 OKT3을 통한 CD3 자극이 T 세포 확장을 지원했지만, 총 세포 수(도 11A) 또는 배수 확장(도 11B)에 실질적으로 영향을 미치지는 않았음을 입증한다. 이러한 데이터는 항-CD3 자극(예컨대 OKT3을 통한)이 종양 배양물로부터의 세포 확장에 필요하지 않을 수 있다는 발견과 일치한다.
실시예 4 자극 후 CD4+ 및 CD8+ 활성화 마커의 평가
[0602] 3명의 건강한 공여자의 T-세포를 해동하고, 300IU/mL 재조합 IL-2가 보충된 OpTmizer 배지에서 밤새 휴지시킨 후, 인간 항-CD3 모노클로날 항체인 50ng/mL OKT3를 사용하여 활성화시켰다. CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에 대한 활성화의 특정 마커를 3-48 시간의 기간 동안 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 다음 마커를 평가하였다: CD38 및 CD39 (도 12A 및 도 13A), CD134 및 CD137 (도 12B 및 도 13B), 및 CD69 및 CD90 (도 12C 및 도 13C).
[0603] CD8 세포의 표면에서 활성화 마커의 발현에 대한 결과를 도 12A-12C에 도시하였으며, 이들 도면은 OKT3의 부재 하의 배양과 비교하여, OKT3으로 자극한 후 48시간 이내에 CD8+ T 세포에 대한 마커의 상향조절의 동역학을 입증한다. 일부 경우에서, 자극 전 제0일에 마커의 일부 기저 수준을 볼 수 있다. 도시된 바와 같이, 평가된 모든 마커는 이 시간 과정 동안 어느 정도 상향조절되었으며, 이 연구 동안 마커 CD38(도 12A), CD134(도 12B) 및 CD69(도 12C)에 대해 가장 높은 백분율로 세포가 상향조절되었다.
[0604] CD4 세포의 표면에서 활성화 마커의 발현에 대한 결과를 도 13A-13C에 도시하였으며, 이들 도면은 OKT3의 부재 하의 배양과 비교하여, OKT3으로 자극한 후 최초 48시간 이내에 CD4+ T 세포에 대한 마커의 상향조절의 동역학을 입증한다. 도시된 바와 같이, 평가된 모든 마커는 이 시간 과정 동안 어느 정도 상향조절되었으며, 이 연구 동안 마커 CD38(도 13A), CD137(도 13B) 및 CD69(도 13C)에 대해 가장 높은 백분율로 세포가 상향조절되었다.
[0605] 종합하면, 이들 데이터는 상기 마커의 발현이, 신생항원 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와의 공동 배양 후에 발생하는 바와 같이, 다음과 같이 TCR-CD3 복합체를 통한 신호전달을 자극할 것으로 예상되는 활성화 조건을 포함하여 활성화된 T 세포를 선택하기 위한 상향조절 마커로서 사용될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 5: 공여자 세포 표현형 및 세포 생존력의 결정
[0606] T 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 흑색종 또는 CRC가 있는 환자의 원발성 종양으로부터 공급받았다. 세포를 종양으로부터 실시예 1에 기재된 바와 같이 종양 단편 또는 SCS로서 추출한 다음, 유세포 분석에 의해 T 세포 표현형에 대해 평가하였다.
[0607] 종양 단편의 경우, 각각의 1 - 8 mm 단편을 기체 투과성 24-웰 배양 플레이트 또는 통상적인 6-웰 플레이트인 배양 용기의 웰에 넣고 무혈청 OpTmizer 배지(ThermoFisher) 또는 5% 인간 혈청을 포함하는 RPMI의 존재하에 5 내지 11일 동안 인큐베이션하였다. 배지에 300 또는 6000 IU/mL 재조합 IL-2를 보충하고 10 μg/ml의 겐타마이신과 최종 농도 2.0 mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement; Thermofisher)을 함유시켰다. 또한 50ng/mL의 항-CD3 항체 OKT3의 존재 또는 부재하에 인큐베이션을 수행하였다. 세포 계수를 수행할 수 있다고 결정될 때까지 단편 배양물을 시각적으로 모니터링한 다음(일반적으로 배양 5일 내지 9일), 세포를 염색하고 T 세포 마커에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다.
[0608] 별법으로, SCS 배양물의 경우, 종양을 직경 1 - 8 mm의 단편으로 다진 다음, 1 mg/ml 또는 5 mg/ml의 콜라게나제 IV(Worthington Biomedical part: LS004130) 또는 1 mg/ml의 콜라게나제 NB4G Proved Grade(Nordmark Biomedicals, 카탈로그 번호 S1746503)의 존재 또는 부재 하에 균질화하였다. 약 90분 동안 효소와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 즉시 염색하고 T 세포 마커에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다.
[0609] 게이팅 계층화(gating hierarchies)를 다음과 같이 설계하였다: 먼저, 전체 세포 이벤트의 집단으로부터의 CD3+ 세포의 백분율을 기록하고, 이어서 부모 CD3+ 집단으로부터의 생존 가능한 CD4+ 세포의 백분율을 기록하고, 다음으로 동일한 부모 CD3+ 집단으로부터 생존 가능한 CD8+ 세포의 백분율을 기록하였다. 그런 다음 기억 T 세포 집단(Tem)을 그들 각각의 CD4+ 및 CD8+ 부모 집단을 기반으로 계산하였다. 따라서, CD4/Tem은 생존 가능한 CD4+ 세포의 모 집단으로부터 결정된 반면, CD8/Tem은 생존 가능한 CD8+ 세포의 모 집단으로부터 결정되었다. 따라서, 도 12에 도시된 결과는, 기록된 총 세포 이벤트의 부모 집단으로부터의 CD3+ 세포의 백분율이며, 이는 각 부모 집단의 계층에 따른 백분율로서 하위 집단으로 계층분류된 것이다. 도 14는 예시적인 CRC 공여자(공여자 1)로부터 균질화 및 효소 분해에 의한 종양 단편의 추출 직후 단일 세포 현탁액에서 선택된 T 세포 마커에 대해 양성인 생존 세포의 백분율을 도시한다.
[0610] CD3+ 세포의 백분율을, 균질화 단독(콜라게나제 없음) 또는 저농도 콜라게나제(1mg/mL) 또는 고농도 콜라게나제(5mg /mL)를 이용한 분해 후 균질화에 의해 추출된 SCS 샘플들에서 비교하였다. 두 번째 CRC 및 흑색종 환자로부터의 결과를 각각 도 15A 및 도 15B에 도시하였다. 도 15A에 도시된 바와 같이, 이들 결과는 균질화 및 저농도의 콜라게나제를 사용한 분해 후 CRC 공여자로부터의 SCS에서 CD3+ T 세포의 증가된 회수를 입증한다. 흑색종 도어로부터의 SCS에서 CD3+ 세포의 백분율이 더 낮았지만, 이들 결과는 저농도 콜라게나제를 사용한 균질화 및 분해가 가장 높은 백분율의 CD3+ T 세포를 산출하였음도 입증한다(도 15B). 종합하면, 이러한 관찰은 흑색종 종양으로부터 유래된 SCS로부터의 세포의 상대적인 고순도가 달성될 수 있음을 입증하며, SCS가 흑색종 유래 CD3+ 세포의 실행가능한 공급원임을 뒷받침할 수 있다.
[0611] 추가의 예시적인 CRC 공여자의 종양으로부터 추출된 SCS에서 CD3+ 세포의 백분율 역시도 또한 평가되었다. 이에 더해, 이 동일한 공여자에서, 균질화 및 분해 직후 SCS의 CD3+ T 세포 백분율을 (1) 300 IU/mL IL-2(저) 또는 6000 IU/mL IL-2(고)와 함께 SCS 배양 후의 CD3+ 세포 백분율, 또는 (2) CD3 자극(OKT3) 존재 또는 부재 하에 300 IU/mL IL-2 (저) 또는 6000 IU/mL (고)와 함께 최대 6일 동안 개별 종양 단편의 배양 후의 CD3+ 세포의 백분율과 비교하였다. 도 15C에 도시된 바와 같이, 기준선(0일) SCS에서 CD3 세포의 백분율은 IL-2 또는 OKT3과 함께 종양 단편을 6일 동안 배양 후 수득한 배양물 중의 CD3+ 세포의 백분율보다 실질적으로 더 높았다. 2명의 추가 공여자로부터의 종양 단편의 배양으로부터 유사한 결과가 관찰되었으며, 여기서 IL-2 및/또는 OKT3와 함께 11일 동안(도 15D) 또는 9 동안(도 15E) CRC-유래 종양 단편을 배양 후 수득된 배양물 중 CD3+ 세포의 백분율 역시도 일반적으로 다양하게 평가된 조건 하에서 CRC 종양 단편으로부터의 종양 세포 추출 시 낮은 수율을 나타내었다. 이들 결과는 CRC 환자의 종양 생검으로부터의 SCS가, 종양 단편을 배양하여 수득된 세포보다, 확장을 위한 T 세포를 증가된 수로 제공할 수 있다는 발견과 일치한다.
[0612] CRC 환자에 대한 종양 단편의 배양 결과와 대조적으로, 도 16은 저농도(300 IU/mL) 또는 고농도(6000 IU/mL)의 IL-2의 존재, CD3 자극(OKT3)의 존재 또는 부재 또는 상이한 배지와 같은 다양한 조건 하에서, 흑색종 종양 단편의 배양물로부터 CD3+ T 세포가 높은 백분율로 수득될 수 있음을 보여준다. 도 16에 도시된 결과는 배양 제0일로부터 얻은 것이다. 이러한 결과는 흑색종 환자의 종양 단편 배양이, 확장을 위해 증가된 수의 T 세포를 제공하는데 있어, 종양 생검의 SCS에서 얻은 세포에 비해 더 우수한 능력을 갖는다는 발견과 일치한다.
실시예 6: 항원 제시 세포와의 공동-배양 후 종양 유래 T 세포의 활성화의
정량
[0613] T 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 종양 단편으로서 흑색종 또는 CRC가 있는 환자의 원발성 종양으로부터 공급되었다. 300IU/mL 재조합 IL-2, 10 μg/ml의 겐타마이신, 제조업체의 권장 사항에 따라 2 내지 5%의 면역 세포 혈청 대체물(ThermoFisher), 및 최종 농도 2.0mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)이 보충된 무혈청 OpTmizer 배지(ThermoFisher)에서 5일 동안 배양한 후, 종양 유래 세포를 OpTmizer 배지로 세척하고 이어서 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 2 x 106 세포/mL로 현탁시켰다. 그런 다음 세포를 통상적인 6-웰 배양 플레이트에 10,000,000개 세포/웰로 접종하였다.
[0614] 병행 배양에서, 공급된 T 세포와 동일한 환자(자가조직)로부터 수득한 PBMC로부터 항원 제시 수지상 세포(DC)를 분화시켰다. 성분채취된 공여자로부터 분리된 냉동 PBMC의 냉동 바이알을 액체 질소 저장소에서 해동하였다. 세포를 10배 부피의 1X DPBS(Gibco)에서 해동하고 계수하였다(NucleoCounter NC200). 세척 후, 세포는 제조사 키트 지침에 따라 CD14 마이크로비드 양성 선택(MACS Miltenyi)에 즉시 사용되었다. 정제된 CD14(단핵구) 세포를 계수하고, 세포를 DendriMAC(MACS Miltenyi)에 재현탁하고 적절한 배양 플라스크에 mL당 0.5-2 x 106개 세포의 밀도로 접종하였다. 미성숙 수지상 세포로의 분화를 촉진하기 위해 GM-CSF(100ng/mL) 및 IL-4(20ng/mL)를 배양물에 첨가하였다. 단핵구를 총 5일 동안 배양하고 분화시켰으며, 2일째에 출발 배지량의 50%와 동일한 배지를 50% 첨가하였다.
[0615] 종양 특이적 펩타이드의 코딩 전사체는 문헌에 기재된 바와 같이 전체 엑솜 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱으로부터 각 환자에 대해 자가로 확인되었다[in Parkhurst, Maria R., et al. "Unique neoantigens arise from somatic mutations in patients with gastrointestinal cancers." Cancer discovery 9.8 (2019): 1022-1035]. 환자 샘플의 전체 엑솜 시퀀싱(WES)은 스냅 동결되고, 고정되지 않은 종양 조직 및 정상 말초 혈액 세포(정상 출처)에 대해 수행되었다. novocraft(http://www.novocraft.com/)의 novoalign MPI를 사용하여 인간 게놈 빌드 hg19에 대한 종양 대 정상 샘플의 서열 정렬을 수행하였다. 중복은 Picard의 MarkDuplicates 도구를 사용하여 표시하였다. GATK 모범 사례 워크플로(https://www.broadinstitute.org/gatk/)에 따라 삽입 삭제 재정렬 및 염기 재교정을 수행하였다. 데이터 정리 후 파일업 파일을 samtools mpileup (http://samtools.sourceforge.net) 및 Varscan2, (http://varscan.sourceforge.net), SomaticSniper (http://gmt.genome.wustl.edu/packages/somatic-sniper/), Strelka (https://sites.google.com/site/strelkasomaticvariantcaller/), 및 Mutect (https://www.broadinstitute.org/gatk/)을 이용하여 생성하였다. VCF 파일을 GATK CombineVariant 도구를 사용하여 병합하고 Annovar(http://annovar.openbioinformatics.org)를 사용하여 주석을 달았다. 환자 종양에 존재하는 변이체(돌연변이)에 대해 Annovar(http://annovar.openbioinformatics.org)를 사용하여 주석을 달았다.
[0616] 평가를 위한 추정 돌연변이의 초기 목록을 생성하기 위해 다음 필터를 사용하였다: (1) 10보다 큰 종양 및 정상 범위, (2) 7% 이상의 변이 대립유전자 빈도(VAF), (3) 4개 이상의 변이체 판독 카운트, (4) 돌연변이를 식별하는 4개 호출자 중 2개. 삽입 및 삭제의 경우 필터를 통과하는 데 돌연변이를 식별하는데 1개의 호출자만 필요하다는 점을 제외하고 동일한 컷오프가 사용되었는데, 이들은 varscan 및 strelka에서만 호출되기 때문이다. 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV)(Nmer)의 상류 및 하류 영역에 의해 인코딩된 12개 아미노산에 연결된 돌연변이체 잔기에 해당하는 아미노산 서열 표를, 상기 4가지 필터를 통과한 변이체에 대해 생성하였다. 프레임 이동된 전사체의 경우, 정상 코딩 영역 또는 3' 비번역 영역에서 정지 코돈이 생성될 때까지 서열이 번역되었다. 그런 다음 매핑된 정렬을 시각화할 수 있는 Integrative Gen오믹스 Viewer(IGV, Broad Institute)를 사용하여 변형 호출의 수동 큐레이션을 수행하였다. 수동 큐레이션에서 Nmer를 인코딩하는 전사체 내에 존재하는 추가 체세포 변이체 또는 생식계열 변이체로 인한 비동의적 변화가 드러났을 때 Nmer의 서열이 변경되었다. 여러 개의 일치하지 않는 뉴클레오타이드를 포함하는 리드에서 추론된 변이체, 다른 리드의 다른 위치에 매핑되는 삽입/삭제 및 빈번한 SNP에 해당하는 변이체는 제거를 위해 플래그가 지정되었다.
[0617] 두명 이상의 환자 종양에서 검출되었지만 전체 종양의 2.5% 미만에서 검출된 변이체에 대해 플래그를 지정하였지만 통과된 변이체 목록에 포함시켰다. ENSEMBL 데이터베이스에만 주석이 달린 변이 전사체는 일반적으로 확인되지 않은 코딩 영역을 나타내며 이 또한 제거하였다. 알려진 단일 뉴클레오타이드 다형성으로 표시되거나 여러 종양에 존재하는 것으로 표시된 변이체는 자동으로 제거되지는 않았는데, 이는 T 세포에 의해 인식되는 생성물을 인코딩할 가능성이 별로 없는 잠재적인 거짓 양성 제거가, 거짓 음성을 나타낼 수 있는 후보를 제거하는 것보다는 덜 중요하기 때문이다.
[0618] 이어서, 이들 시퀀싱 데이터를 사용하여 종양과 관련된 돌연변이된 펩타이드 및 질병이 없는 말초 혈액 세포와 관련된 야생형 펩타이드를 나타내는 펩타이드 풀을 생성하였다.
[0619] Fmoc 화학을 통해 합성 펩타이드를 합성하였다. 삽입결실(indels)의 경우, 다음 정지 코돈까지 프레임-이동된 서열의 번역에 기초하여 10개 아미노산에 의해 중첩되는 25개 아미노산 펩타이드를 합성하였다. 일부 경우에서, 최소 에피토프의 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드를 DMSO에 용해시키고 동일한 부피로 혼합하였다.
[0620] 분화된 DC를 종양 세포:DC의 여러 비율로 종양 유래 배양물에 첨가하기 전에, 상기 기재된 바와 같이 확인된 펩타이드 풀로부터 펩타이드의 다양한 수 및 농도로 로딩하였다. 그런 다음 DC 및 종양 유래 세포를 5% CO2에서 6시간 동안 37℃에서 공동 배양한 후 배양물을 부드럽게 교반하고 현탁액 중의 세포를 회수하였다. 그런 다음, 회수된 세포를 T 세포 활성화 4-1BB 및 OX40의 마커를 사용하여 활성화된 T 세포에 대해 유세포 분석을 통해 분류하였다.
[0621] 도 17A 및 17B는 20 내지 0.1ng/mL의 펩타이드 범위에 걸친 종양 유래 T 세포 활성화를 보여준다. 도 17A에 도시된 바와 같이, 테스트된 3가지 펩타이드 농도 각각으로 로딩된 DC와의 T 세포 공동 배양은, 1ng/mL 펩타이드에서 대략 80% 정도로 높은 수준을 포함하여, 쉽게 검출가능한 수준의 4-1BB/OX40+ T 세포를 생성하였다. 로딩되지 않은 DC와 함께 배양된 세포에 비해, T 세포 활성화 마커 발현의 증가가 도 17B에 도시되어 있는데, 해당 도면에서 0.1ng/mL가 가장 큰 델타를 초래했지만 3가지 농도의 펩타이드 모두는 포지티브한 배수 변화를 초래하였다. 이들 데이터는 20ng/mL 미만의 낮은 펩타이드 농도로도 공동 배양 후 T 세포 활성화 마커(상향 조절 마커)의 상향 조절을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
[0622] 도 16은 DC가 공동-배양 동안 표면 제시를 위해 하나 또는 두 개의 펩타이드로 펄스화된 연구에서, 41BB/OX40 발현의 함수로서 종양 유래 T 세포 활성화를 유사하게 묘사한다. 도 18A 및 다시 도 18B에, 배수 변화로서 나타나 있는 바와 같이, 오직 하나의 펩타이드가 로딩된 DC가 공동-배양에서 T 세포를 활성화하는데 더 현저하게 더 효율적이었다.
[0623] 도 19에 도시된 바와 같이, T 세포 활성화 41BB 및 OX40의 마커는 종양 유래 T 세포가 1:1에 비해 1:2(T 세포:DC)의 비율로 DC와 공동-배양될 때 실질적으로 상향조절되었다.
실시예 7: 세포 분류를 통한 활성화된 T-세포의 농축 및 회수
[0624] 건강한 공여자로부터의 T-세포를 면역친화성 기반 선택에 의해 단리한 다음 동결보존하였다. T 세포를 해동하고 밤새 휴지시킨 다음, 항-CD4 FITC (BD), 항-CD8 PerCPCy.5.5 (BD), 항-CD134 (Beckman Couleter), 및 항-CD137 (MACs Miltenyi)로 염색하기에 앞서, 50 ng/mL OKT3로 24-48시간 동안 활성화시켰다. 세포를 약 20 x 106 세포/mL의 농도로 만들고 BD FACSAriaII를 사용하여 초당 약 15,000개 이벤트의 분류 속도로 분류하였다. CD134, CD137 또는 CD134와 CD137을 모두 발현하는 세포 주위에 게이트를 그려 단일 집단으로 분류하였다. 이것은 양성 정렬된 집단이었다. CD134 및 CD137 발현이 모두 결여된 세포는 별도의 집단으로 분류하였다. 이것은 음성 정렬된 집단이었다. 분류 후, 순도를 확인하고 회수율을 평가하기 위해 양성 및 음성 분류된 집단과 분류되지 않은 집단의 세포를 대체 유세포 분석기에서 분석하였다.
[0625] 도 20에 도시된 바와 같이, 분류되지 않은 종양 유래 T 세포 집단(분류전:pre-sort)을, 실시예 6에서 이전에 기술된 바와 같이 돌연변이 펩타이드가 로딩된 자가 수지상 세포와의 공동 배양 후에 수집되고 41BB/OX40 양성 집단으로 분류된 양성 분류 집단과 비교하였다. 이러한 게이팅 전략은 3명의 공여자(도 20A) 및 평균 클래스 I 반응성(도 20B)에 대한 퍼센트 반응성 TCR에 대한 농축을 증가시키는 것으로 관찰되었다.
[0626] 세포 분류로부터 전체 세포 회수를 총 세포 입력에 대해 도 21A에 도시하였다. 도 21B에 마찬가지로 도시된 바와 같이, 2개의 독립적인 실행으로부터의 회수 백분율은 대략 80%였다. 이러한 결과는 상향조절 마커에 대해 양성인 세포의 선택 및 분류 후에 높은 세포 회수율을 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.
[0627] 도 22는 OKT3로 활성화되고 상기 기재된 바와 같이 염색된 건강한 공여자 T 세포의 유세포 분석을 통한 CD4+ 집단 순도를 도시한다. 세포를 먼저 CD4+에 게이트시킨 다음, 가장 높은 강도의 CD134+를 표현하는 집단을 다음으로 게이트시키자, 아웃풋은 CD4+ 대 CD8+ 및 CD137+ 대 CD134+를 표시하는 것으로 표시되었다. 이들 데이터는 종양 침윤 T 세포의 고순도 집단을 게이팅하기 위한 이들 마커의 사용을 뒷받침한다.
실시예 8: 활성화된 종양 유래 T 세포의 분류 후 확장
[0628] 원발성 CRC 종양에서 유래한 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리한 다음, 실시예 6에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 펩타이드 제시 수지상 세포와 공동-배양하였다. 간략하게, 단리된 종양 침윤 림프구를, 건강한 조직과 관련된 펩타이드(야생형, WT), 종양 조직과 관련된 펩타이드(돌연변이)를 발현하도록 로딩되거나, 또는 펩타이드가 전혀 로딩되지 않은(펩타이드 없음) 자가 DC와 함께 배양하였다. T 세포의 대조군 하위집단은 DC 없이 배양되었다(비활성화됨). 공동 배양 후, 활성화 마커 4-1BB 및 OX40의 표면 발현을 기반으로 하는 형광 가능 Sony FX500을 통해 세포를 분류하였다.
[0629] 이어서, 세포를 300IU/mL 농도의 재조합 IL-2, 10㎍/mL의 겐타마이신, 및 2.0mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태의 글루타민(GlutaMAX Supplement, Thermofisher)이 보강된 무세포 OpTimizer 배지에서 250,000-1,000,000 세포/cm2로 기체 투과성 24 웰 배양 플레이트에 접종하였다. 세포는 배양 5일째부터 격일로 50% 배지를 교환하면서 총 7일 동안 배양하였다. 각 배양일에, NC-200 Automated Cell Counter(Chemometec)를 사용하여 세포 계수를 수행하였다.
[0630] 도 23A 및 다시 도 23B에 배수 확장으로서 도시된 바와 같이, 시험된 각각의 종양 침윤 림프구(TIL) T 세포 집단은 배양 3일 내지 5일 사이에 측정 가능한 확장을 겪었고 배양 기간의 7일 종료 시점에서 계속 상향 추세를 보였다. 돌연변이 종양 관련 펩타이드가 로딩된 DC와 함께 배양된 종양 침윤 T 세포는 실험 과정에서 가장 높은 총 세포 수에 도달하였다.
[0631] 상기 데이터를 사용하여, 분류 후 회수된 세포 수와 확장 단계 후 배양물에 존재하는 예상 세포 수 사이의 관계를 예측하기 위해 도 23C에 도시된 이론적 수학적 모델을 생성하였다.
실시예 9: 종양 유래 T 세포의 생체외 확장의 몬테카를로 모델링
[0632] 실시예 8의 결정론적 포인트 분석을 보완하여, 실시예 2에 기재된 바와 같이 1차 확장으로부터 생성된 종양 침윤 림프구의 수를 예측하기 위해 제1 확률론적 몬테카를로 시뮬레이션을 설계하였다. 고유한 불확실성, 회수 효율성 및 배수 확장 용량 중 두 가지 인자에 대한 확률 분포를 대체함으로써, 추출 및 1차 확장 후 가능한 총 생존가능 및 총 반응성 T 세포 수의 몬테카를로 시뮬레이션을 실행하였다. 결과는 회수된 세포의 평균값을 낮은(low) 및 중간(mid) 회수로 정의하고, 확장의 배수 변화에 대한 평균값을 낮은, 중간 및 높은 확장 포텐셜로서 정의하는 정규 분포로 수만 번 반복 계산하였다. 그런 다음 총 생존 T 세포 수와 총 반응성 T 세포에 대한 분포를 계산하였다.
[0633] 가능한 T 세포 아웃풋이 1차 확장에 대해 계산되는 초기 몬테카를로 시뮬레이션의 경우, 테스트 케이스를 실행하여낮은 회복/낮은 확장, 중간 회복/낮은 확장, 중간 회복/중간 확장 및 중간 회복/ 높은 확장 조건을 모델링하였다. 회수 및 확장 변수 모두에 대한 평균 및 표준 편차 값은 다음과 같이 지정되었다. (1) 낮은 회수는 처리된 종양에서 총 2천만 개의 생존 세포를 배양하는 것으로 정의되었다(표준 편차 6백만) (2) 중간 회수는 5천만 또는 6천만 세포로 정의되었다(표준 편차 1500만). (3) 낮은 1차 배수 확장은 50배로 정의되었다(표준 편차 11). (4) 중간 확장은 15배로 정의되었다(표준 편차 75) (5) 높은 확장은 500배로 정의되었다(표준 편차 160).
[0634] 첫 번째 몬테카를로 시뮬레이션 A로부터의 각 테스트 케이스에 대한 데이터를 하기 표 E1에 나타내었다.
[0635] 이들 데이터를 사용하여, 두 번째 세트의 몬테카를로 시뮬레이션을 설계하여 APC와의 공동 배양, 유세포 분석을 통한 분류 및 실시예 8에 기재된 바와 같은 제2 확장 후 반응성 종양 침윤 림프구의 최종 수를 예측하였다. 종양 단편 또는 SCS로부터 배양된 총 T 세포의 집단에 존재하는 반응성 T 세포의 백분율에 대한 값은 평균 8% 및 표준 변동 2.50에 할당되었다. 수만 번의 반복 계산에 이어 두 번째 몬테카를로 시뮬레이션의 각 테스트 케이스에 대한 데이터를 하기 표 E2에 나타내었다.
[0636] 종양 처리 후 1차 확장 또는 APC와의 하류 공동 배양 후 2차 확장으로부터의 종양 침윤 반응성 T 세포의 회수 및 확장 가능성은 공여자에 걸쳐 그리고 종양 세포 집단 내에서 본질적으로 가변적인 인자들이다. 여기에 설명된 프로세스에 의해 생성된 T 세포 수의 예상 범위는 10번째 내지 90번째 백분위수 내에 포함된다. 10번째 백분위수 미만의 세포 수는 생성될 가능성이 낮고 사용 가능한 의약품이 되지 않을 가능성이 높다. 따라서 표 E1 및 E2에 제시된 몬테카를로 시뮬레이션의 관찰은, 10번째와 90번째 백분위수 사이의 모든 시나리오에서 확장 포텐셜에 대한 가변성 수준의 범위가 주어지면 본원에 설명된 방법이 다음과 같은 강력한 T 세포 출력을 제공할 가능성이 있음을 뒷받침한다. 치료 용량에 요구되는 세포 수에 근접한 강력한 T 세포 아웃풋을 제공할 가능성이 있음을 뒷받침한다.
실시예 10: IFN-감마 생산 및 TCR 클론성에 의한 종양-반응성 TCR 농축의
평가
[0637] 난소암(샘플 A), CRC(샘플 B) 또는 흑색종(샘플 C)을 앓는 환자의 원발성 종양으로부터 유래된 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 종양 단편으로부터 처리하였다. 초기 확장 후, T 세포를 이어서 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 펩타이드 제시, 자가 수지상 세포와 공동-배양하였다. 공동-배양을 위해, 자가 DC에 환자 종양에 고유한 단일의 긴 돌연변이 펩타이드(예를 들어, 25mer) 또는 환자의 정상 샘플과 비교하여 돌연변이되지 않은 단일의 긴 야생형 펩타이드를 로딩하였다. 공동 배양 후, 4-1BB(CD137) 및/또는 OX40(CD134)의 발현을 위해 종양 반응성 T 세포를 염색하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 세포를 분류함으로써 농축시켰다. 41BB 및 OX40 중 어느 하나 또는 양자 모두에 대해 양성인 세포는 "양성" 집단("돌연변이 농축" 집단이라고도 함)으로 수집되었고 41BB 및 OX40에 대해 이중 음성인 세포는 "음성" 집단(또한 "야생형 비농축" 집단이라고도 함)으로서 수집되었다.
[0638] 이어서, 돌연변이체 및 야생형 T 세포 집단을 배지 단독으로 또는 IFN-감마 분비를 자극하는 조건 하에 16시간 동안 배양하였다. 41BB 및 OX40 발현을 기반으로 분류되지 않은 공동-배양물의 분류되지 않고, 농축되지 않은 T 세포(벌크 T 세포)를 선택전(pre-selection) 대조군으로서 포함시키고 유사하게 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-감마 분비 수준을 ELISA에 의해 결정하였다.
[0639] 펩타이드 네오-에피토프에 반응성인 TCR을 발현하는 분류된 집단 내의 T 세포의 백분율을 단일 세포 TCR 서열분석에 의해 결정하였다. T 세포 집단에서 TCR 클론성 역시도 TCR-베타 및 TCR-알파 사슬에 대한 단일 세포 RNA-시퀀싱에 의해 결정되었다.
1. 샘플 A(난소암)
[0640] 샘플 A 종양 세포로부터 생성된 돌연변이체 및 야생형 농축 T 세포 집단, 또는 대조군 벌크 T 세포를 배지 단독으로 배양하거나 또는 돌연변이 펩타이드(네오-에피토프)에 상응하는 최소 펩타이드 에피토프(8mer) 또는 각각의 환자 종양으로부터의 야생형 펩타이드와 함께 항-CD28 및 항-CD49d 항체와 함께 16시간 동안 배양함으로써 자극하였다. 도 24A에 도시된 바와 같이, 벌크 T 세포는 배양 배지 단독과 비교하여 네오-에피토프와의 배양 후 증가된 IFN-감마 분비에 의해 입증되는 바와 같이 개선된 반응성을 나타내었다. IFN-감마를 생성하는 능력은 네오-에피토프로 자극된 돌연변이 농축된 T 세포 집단에서 추가로 증가했지만, 배지 단독의 자극 대 네오-에피토프 조건으로 자극한 후, 야생형 농축 T 세포 집단에서는 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 야생형 비농축 T 세포 집단은 배지 단독과 비교하여 IFN-감마 분비의 상향조절에 의해 입증된 바와 같이 어느 정도의 신생항원 반응성 T 세포를 여전히 포함하였다. 이 데이터는 공동-배양 후 벌크 T 세포가 41BB 및 OX40의 발현에 기초한 분류에 의해 농축된 신생항원 반응성 집단을 함유함을 나타낸다. 또한, 결과는 또한 신생항원 농축의 특이성을 입증한다.
[0641] RNA 시퀀싱 및 유세포 분석에 의한 네오에피토프 특이적 TCR의 분석 결과, 돌연변이 농축된 T 세포 집단에서 신생항원 "A"-특이적 TCR이 17% 농축된데 비해, 초기 벌크 T 세포 집단에서는 2% 또는 야생형 농축 T 세포 집단에서는 0.1%인 것으로 나타났다(도 24B). 선택된 집단(돌연변이 농축된 T 세포 집단)과 비교한 선택되지 않은 집단(야생형 농축된 T 세포 집단)에서 T 세포의 TCR 클론성을 도 24C에 나타내었는데, 이 도면은 유입되는 TCR 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단에서 높고, 선택된 집단에서 독특한 TCR 클론의 농축이 달성된다는 것을 보여준다. 도 24D는 분류 전(벌크) 및 분류 후 세포 집단이 CD4 및 CD8 세포를 함유함을 입증하고, 이는 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 나타낸다,
2. 샘플 B(CRC 환자)
[0642] 샘플 B 종양 세포로부터 생성된, 돌연변이체 및 야생형 농축 T 세포 집단, 또는 대조군 벌크 T 세포를 배지 단독에서 16시간 동안 배양하거나 항-CD3 항체(OKT3)를 사용하여 일반적인 TCR 자극에 반응하여 자극시켰다. 도 25A에 도시된 바와 같이, 모든 T 세포 집단은 일반적인 TCR 자극에 대한 반응으로 공동배양 및 분류 후에 기능성(즉, IFNg 생산)을 나타냈다.
[0643] 네오에피토프-특이적 TCR의 분석 결과, 돌연변이 농축된 T 세포 집단에서 신생항원 "B"-특이적 TCR이 71% 농축된데 비해, 초기 벌크 T 세포 집단에서는 42% 또는 야생형 농축 T 세포 집단에서는 17%인 것으로 나타났다(도 25B). 공동 배양 후 벌크 T 세포와 비교하여, 이것은 분류된 T 세포 집단의 종양-반응성 T 세포에서 대략 1.7배 농축을 나타내고 분류되지 않은 T 세포 집단의 종양-반응성 T 세포에서 대략 2.5배 감소를 나타낸다. 선택된 집단(돌연변이 농축된 T 세포 집단)과 비교한 선택되지 않은 집단(야생형 농축된 T 세포 집단)에서의 T 세포의 TCR 클론성이 도 25C에 도시되어 있는데, 이 도면은 유입되는 TCR 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단(807개의 고유한 TCR 클론)에서 높고, 선택된 집단(64개의 고유한 TCR 클론)에서 독특한 TCR 클론의 농축이 달성된다는 것을 보여준다. 도 25D는 분류 전(벌크) 및 분류 후 T 세포 집단이 CD4 및 CD8 세포를 함유함을 입증하고, 이는 클래스 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 나타낸다,
3. 샘플 C(흑색종 환자)
[0644] 샘플 C 종양 세포로부터 생성된, 돌연변이체 및 야생형 농축 T 세포 집단의 T 세포, 또는 대조군 벌크 T 세포를 RNA 시퀀싱 및 유세포 분석 및 TCR 클론성에 의해 네오에피토프 특이적 TCR에 대해 평가하였다. 그 결과 돌연변이 농축된 T 세포 집단에서 신생항원 "C"-특이적 TCR이 33% 농축된데 비해, 초기 벌크 T 세포 집단에서는 5% 또는 야생형 농축 T 세포 집단에서는 4%인 것으로 나타났다(도 26A). 공동 배양 후 벌크 T 세포와 비교하여 이것은 분류된 T 세포 집단에서 종양 반응성 T 세포의 대략 7배 농축을 나타내고 분류되지 않은 T 세포 집단에서는 종양 반응성 T 세포가 농축되지 않음을 나타낸다. 선택된 집단(돌연변이 농축된 T 세포 집단)과 비교한 선택되지 않은 집단(야생형 농축된 T 세포 집단)에서의 T 세포의 TCR 클론성이 도 26B에 도시되어 있으며, 이 도면은 유입되는 TCR 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단(182개의 고유한 TCR 클론)에서 높고, 고유한 TCR 클론의 농축이 선택된 집단(15개의 고유한 TCR 클론)에서 달성된다는 것을 보여준다. 도 26c는 분류 전(벌크) 및 분류 후 세포 집단이 CD4 및 CD8 세포를 함유함을 입증하며, 이는 클래스 류 I 및 클래스 II 반응성 세포가 농축된 집단에 존재함을 나타낸다.
4. 결론
[0645] 이와 함께, 이들 결과는 유입되는 TCR 다양성이 분류되지 않은 T 세포 집단(예를 들어, 100-900 TCR)에서 높다는 것을 보여준다. 이 분류되지 않은 집단은 낮은 수준의 IFN감마(예컨대 5-25 pg/mL)를 생성한다. 활성화 마커, 예컨대 OX40/41BB를 기반으로 TCR 집단을 분류한 후, TCR 집단은 분류되지 않은 집단 및 음성 분류 집단(5pg/mL)에 비해 더 높은 IFN감마(예컨대 65.3-98.6pg/mL)를 생성하는 반응성 TCR 집단(예컨대 15-64 TCR)으로 농축된다. 이러한 결과는 이것이 종양 반응성 T 세포의 농축과 일치하는 특이적 활성화임을 나타내는데, 이는 이것이 야생형의 분류되지 않은 공동 배양에서 볼 수 없기 때문이다.
실시예 11: T 세포 생존력에 대한 T 세포 아쥬반트의 효과 평가
[0646] 세포를 3명의 건강한 공여자의 성분채집 재료로부터 Ficoll 구배 분리에서 유래된 PBMC에서 확장시켰다. 300IU/mL 재조합 IL-2, 겐타마이신 10μg/ml, 면역 세포 혈청 대체물(ThermoFisher)이 2~5%, 및 최종 농도 2.0 mM의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태가 보충된 OpTmizer 세포 배양 배지에 PBMC를 2 x 106개 세포/ml로 접종하고, 48시간 동안 인간 항-CD3 항체 OKT3 항체로 활성화시켰다. 다음으로 세포를 기체 투과성 100M 배양 용기에 접종하고 7~14일 동안 확장하여 T 세포의 라지 뱅크를 얻고 이를 냉동보존하였다. 3명의 건강한 공여자로부터 이전에 확장된 인간 T 세포를 해동한 다음 이를 300 IU/mL 재조합 IL-2, 겐타마이신 10 ㎍/ml, 면역 세포 혈청 대체물(ThermoFisher) 2 내지 5%, 및 최종 농도 2.0 mM의 글루타민의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태 (GlutaMAX Supplement; Thermofisher)가 보충된 OpTmizer 세포 배양 배지에 소정 농도 범위로 테스트 아쥬반트와 함께 접종하였다. 웰의 절반에 인간 항-CD3 모노클로날 항체인 50ng/mL OKT3를 추가로 보충하였다. 총 15개의 테스트 아쥬반트 제제를 항-CD3 활성화의 존재 및 부재 하에 세포 생존력에 미치는 영향에 대해 시험하였다(표 E3 참조). 세포를 배양 3일째에 50% 배지 교환을 포함하여 총 6일 동안 배양하고 총 생존 가능한 CD3+ 세포 수에 대해 모니터링하였다.
[0647] OKT3 자극의 부재 및 존재 하에 성장한 세포에 대한 총 생존가능한 CD3+ 세포 수를 도 27A-C 및 도 28A-C에 각각에 나타내었다. 표시된 결과는 하기 농도의 아쥬반트에 대한 것이다: 테스트된 항체 (타볼릭시주맙, 옥셀루맙, 이필리무맙, 토실리주맙, 우렐루맙, 펨브롤리주맙, 발리루맙, 항-GITR MK-1248, 항-인간 FasL)의 경우 10μg/mL; Z-VAD-FMK 범-카스파제 억제제의 경우 25μM; HSP 억제제 NVP-HSP990의 경우 250nM; 및 사이토카인(IL-7, IL-15 또는 IL-21)의 경우 1000 IU/mL.
[0648] 전반적으로, 시험된 화합물 중 어느 것에도 독성이 관찰되지 않았으며, 이는 이들 화합물이 TIL 제조에 유해하지 않을 것임을 나타낸다. 고유한 공여자 가변성이 관찰되었지만, 항-PD1 항체 펨브롤리주맙, 항-OX40L 항체 옥셀루맙 및 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK를 사용한 치료는 활성화 상태에 관계없이 DMSO 치료 대조군보다 일관되게 더 높은 생존 세포 수를 초래하였다.
[0649] 도 29A 및 도 29A에 각각 도시된 IL-7 및 IL-15에 대한 용량 반응 곡선은, 농도가 증가함에 따라 세포 수가 증가하는 용량 의존적 반응을 나타내었다. 이러한 데이터는 시험된 이러한 농도 범위에서 IL-7 및 IL-15가 배양 중 총 T 세포 수를 강화하는 데 유익할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 12: Fas 리간드 또는 카스파제 억제를 이용한 T 세포 확장
[0650] Fas- 및 카스파제-매개 경로에 대해 지시된 세포자멸사 억제제를 제조 동안 종양 반응성 T 세포에 대한 효과를 결정하기 위해 평가하였다. 이 연구는 건강한 공여자에서 수행되었으므로, 종양 미세 환경(TME)에 존재하는 조건을 모방하기 위해 T 세포의 자극을 항-CD3(OKT3) 또는 항-CD3/항-CD28 자극으로 수행하였다. 항-CD3 또는 항-CD3/항-CD28 활성화에 의해 자극될 수 있는, 종양 미세환경에 존재하는 일정한 활성화 신호는 T 세포 성장에 해로울 수 있다. 세포 생존력과 프로젝트된 세포 수를 사용하여, 세포자멸사 경로의 조절 영향을 일시적 활성화 및 지속적인 활성화 분석 모두에서 비교하였다. 후자는 종양 미세 환경을 보다 더 엄밀하게 재현하였다.
A. 항-CD3 자극
[0651] 3명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 해동하고 300 IU/mL 재조합 IL-2, 겐타마이신 10 ㎍/ml, 면역 세포 혈청 대체물 (ThermoFisher) 5%, 및 최종 농도 2.0 mM의 글루타민의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태 (GlutaMAX Supplement; Thermofisher)이 보충된 OpTmizer 세포 배양 배지로 세척하였다. 그런 다음 세포를 2.14 x 105 세포/mL(7.5 x 105 세포/cm2)의 밀도로 24웰 기체 투과성 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 인간 항-CD3 모노클로날 항체인 OKT3 50ng/ml를 사용하여 세포를 48시간 동안 활성화하고, 하기 기재된 바와 같이 제제로 추가로 처리하였다.
[0652] 배양 웰들을 다음과 같이 5개의 처리군 중 하나에 할당하였다: (1) 추가의 세포자멸사 조절제 없이 기재된 바와 같이 세포 배지만을 함유하는, 억제제가 없는 배양 대조군; (2) 2μM의 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK를 배양 제0일에만 배지에 첨가함(일시적); (3) 2 μM의 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK를 배양 제0일에 추가하고 동일한 농도로 각 배지를 교환하여 추가로 보충하였다(연속). (4). 500ng/ml의 Fas 리간드(FasL) 차단 항체 NOK-1(BioLegend)을 제0일에만 배양 배지에 첨가함(일시적); 또는 (5) 500ng/ml의 Fas 리간드(FasL) 차단 항체 NOK-1(BioLegend)을 제0일에만 배양 배지에 첨가하고 추가로 각 배지를 교환하여 보충하였다(연속 억제).
[0653] 배양 제2일에 시작하여 격일로 50% 배지 교환으로 적어도 13일 동안 배양물을 유지하였다. 세포 수 및 생존력을 격일로 모니터링하였다. 세포가 3 x 106 세포/ml에 도달했을 때, 1.5 x 106 세포를 7 mL 최종 부피의 배지가 있는 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트의 새로운 웰에 계대배양하고 위에서 설명한 대로 배양을 계속하였다.
[0654] 3명의 공여자 각각에 대한 총 세포 수 및 세포 생존율을 30A-30B (공여자 1), 도 31A-31B (공여자 2) 및 도 32A-32B (공여자 3)에 나타내었다. 생존력은 배양 기간 동안 모든 처리 조건에서 높게 유지되었지만 지속적인 FasL 차단 조건은 나머지보다 명목상 낮은 생존력을 보였다. 이들 세포는 또한 가장 느리게 성장했으며 이들의 성장은 모든 공여자에 걸쳐, 다른 어떤 조건보다 먼저 성장이 정체되었다. 배지에 지속적으로 존재하는 카스파제 억제제가 있는 세포 배양물은 공여자 전반에 걸쳐 가장 큰 세포 성장을 보인 반면, 대조군 및 일시적 처리 조건에서는 유사하게 성장하였다. FasL 차단 항체 NOK-1을 사용한 일시적 처리도 상당한 T 세포 확장을 초래하였다.
[0655] 이러한 결과는 카스파제 억제제의 사용이 특히 고밀도 배양에서 확장을 최대화하고 생존력을 유지하는데 있어, TIL 제조의 확장 단계 동안 유용할 수 있음을 보여준다. T 세포 활성화, 공동 배양 또는 다른 세포 유형, 특히 종양 세포가 있는 처리 조건에서 FasL 차단을 일시적으로 사용하는 것도 전-세포자멸사 환경(pro-apoptotic environment)에서 Fas 신호 전달을 차단하는 데 유용할 수 있다.
B. 항-CD3/항-CD28 자극
[0656] 2명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 해동하고 300 IU/mL 재조합 IL-2, 겐타마이신 10 ㎍/ml, 면역 세포 혈청 대체물 (ThermoFisher) 5%, 및 최종 농도 2.0 mM의 글루타민의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태 (GlutaMAX Supplement; Thermofisher)가 보충된 OpTmizer 세포 배양 배지로 세척하였다. 그런 다음 세포를 1.5 x 105개 세포/mL(5.0 x 105개 세포/cm2)의 밀도로 24웰 기체 투과성 세포 배양 플레이트에 접종하였다.
[0657] 배양 웰을 일시적 또는 연속적 활성화의 두 처리 그룹 중 하나에 할당하였다. 일시적인 활성화를 위해, 항-CD3/항-CD28 상자성 비드(Dyanbeads™)를 배양 제0일에 시작하여 세포당 1개의 비드의 비율로 배양 배지에 첨가한 다음, 제2일에 배지 교환 중에 제거하였다. 지속적인 활성화를 위해, 항-CD3/항-CD28 상자성 비드(DyanbeadsTM)를 배양 제0일에 시작하여 세포당 1개의 비드의 비율로 배양 배지에 첨가한 다음, 제4일에 다시 첨가하고, 제6일에 세포당 1개의 비드의 비율로 다시 첨가하였다. 항-CD3/항-CD28 상자성 비드는 제2일, 제4일 또는 제6일에 제거되지 않았다.
[0658] 연속 및 일시적 활성화 모두에 있어서, 배양 웰을 공여자당 총 10개 조건에 대해 상기 기재된 바와 같이 5개 처리군 중 하나로 할당하였다.
[0659] 세포 수 및 생존력을 격일로 모니터링하였다. 세포가 3 x 106 세포/ml에 도달했을 때, 1.5 x 106 세포를 배지의 최종 부피가 7 mL인 24-웰 기체 투과성 배양 플레이트의 새로운 웰에 계대배양하고 상기 기재된 바와 같이 배양을 계속하였다.
[0660] 항-CD3/항-CD28(일시적 활성화) 처리군을 사용한 단일 활성화에 대한 세포 생존율을 도 33A (공여자 1) 및 도 33B (공여자 2)에 나타내고, 동일한 치료에 대한 총 세포 수는 각각 도 34A (공여자 1) 및 도 34B (공여자 2)에 나타내었다. 고유한 공여자 가변성이 관찰되었지만, 일시적 활성화(단일 활성화) 자극에 노출된 모든 치료 조건에 대해 생존력이 높게 유지되었다. 생존율은 FasL의 연속 차단 조건의 경우를 제외한 모든 처리 조건에서 높게 유지되었는데, FasL의 연속 차단 조건의 경우 생존율과 총 생존가능 세포가 경시적으로 감소하였다(도 33A-B).
[0661] 항-CD3/항-CD28 처리군에 의한 연속적인 활성화를 위한 세포 생존력을 도 35A(공여자 1) 및 도 35B (공여자 2)에 나타내고, 동일한 처리에 대한 총 세포 수를 도 36A (공여자 1) 및 도 36B (공여자 2)에 나타내었다. 천연 종양 미세 환경과 유사한 항-CD3/항-CD28을 사용한 지속적인 활성화에 노출된 경우, 일시적인 활성화 이벤트만 포함하는 조건에 비해, 총 생존가능 세포 수와 생존력 모두 치료 조건 간에 더 많이 달랐다. 지속적으로 활성화된 집단에서는, 일시적으로나 지속적으로 카스파제 억제제에 노출된 세포가 다른 조건을 능가했으며, 지속적인 카스파제 억제가 일시적인 조건을 능가하는 것으로 나타났다. 또한, FasL 차단에 노출된 세포는 총 세포 수와 생존율 모두에서 가장 큰 감소를 보인 반면, 일시적으로 FasL 차단에 노출된 세포와 추가 처리가 없는 세포는 유사한 결과를 보였다.
[0662] 이러한 결과는 배양 동안 카스파제 억제를 사용하면, 이 분석 시스템과 유사하게, 세포가 구성적으로 활성화 신호를 나타낼 수 있는 종양에서 직접 처리되는 경우와 같이, 정상적인 T 세포 성장에 적대적일 수 있는 환경에서의 세포의 능력을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 FasL 신호전달의 지속적인 차단이 일시적 및 지속적인 T 세포 활성화 조건 모두에서 T 세포 성장에 해로울 수 있다는 것과, FasL의 차단이 일시적으로 제공될 경우 T 세포 성장에 강하게 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 종양 처리에 있어서 카스파제 억제의 평가
[0663] 콜라게나제 I/II 블렌드(Nordmark, Collagenase NB 4G Proved Grade, 부품: S1746503)를 사용하여 공여자로부터의 CRC 종양을 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리하여 단편 또는 SCS 배양물을 생성하였다. 종양 단편과 SCS 배양물 모두 300 IU/mL 재조합 IL-2, 겐타마이신 at 10 ㎍/ml, 면역 세포 혈청 대체물 (ThermoFisher) 5%, 및 최종 농도 2.0 mM of 글루타민의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태 (GlutaMAX Supplement; Thermofisher)가 보충된 OpTmizer 배지를 이용하여 기체 투과성 24웰 배양 플레이트에서 유지시켰다. 배양물의 절반은 2μM의 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK가 추가로 보충된 배지를 포함하였으며 이는 각 배지 교환시 보충되었다. 배양물은 배양 5일 후 매 2-3일마다 발생하는 50% 배지 교환과 함께 최소 18일 동안 약 37℃에서 배양되었다. 세포 계수는 제5일에 그리고 NC-200 Automated Cell Counter (ChemoMetec)를 이용하여 수행하였다.
[0664] 도 37A-C는 Z-VAD-FMK의 존재 또는 부재 하에 성장된 SCS 및 종양 단편 유래 배양물 두 가지 모두의 배수 확장(도 37A), 총 생존가능 세포(도 37B) 및 생존력(도 37C)을 나타낸다. 도 37A 및 도 37B는 세포의 성장이 범-카스파제 억제제를 함유하는 종양 단편-유래 조건에서 더 우수함을 입증한다. 또한, 도 37C에 나타난 바와 같이, 이 조건에서 세포 생존력도 높았다. T 세포의 성장이 SCS 조건에서 관찰되지 않았음에도 불구하고 카스파제 억제 존재 하에 SCS로 배양된 세포에서 세포 생존력이 유사하게 높았다. 이러한 데이터는 카스파제 억제가 종양에서 성장한 T 세포에 있어 높은 생존력과 증식을 유지하는 메커니즘이 될 수 있음을 가리킨다.
실시예 14: T 세포 표현형에 대한 체크포인트 조절제 및 공동자극 작용제 항체의 평가
[0665] 2명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 해동하고 300IU/mL 재조합 IL-2, 젠타마이신 10μg/ml, 면역 세포 혈청 대체물(ThermoFisher) 5% 및 최종 농도 2.0 mM의 글루타민의 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 형태 (GlutaMAX Supplement; Thermofisher)가 보충된 OpTmizer 세포 배양 배지로 세척하였다. 그런 다음 세포를 5.0 x 105 세포/cm2의 밀도로 24웰 기체 투과성 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 인간 항-CD3 모노클로날 항체인 OKT3 50ng/ml를 사용하여 세포를 48시간 동안 활성화시키고, 하기에 기술된 제제로 추가 처리하였다. 배양 48 시간 후, 세포들의 표현형을 분석하였다.
[0666] 세포를 다음과 같이 6개의 처리군으로 나누었다: 이필리무맙(항-CTLA4), 펨브롤리주맙(항-PD1), 타볼릭시주맙(항-TNFRSF4), 우렐루맙(항-CD137), 및 발리루맙(항-CD27), 그리고 무처리 대조군. 모든 시험 그룹에 대해, 각 처리 그룹의 세포를 0.5, 1, 10 또는 20㎍/mL의 모노클로날 항체 존재 하에 배양하였다.
[0667] 시험된 항체 중 어느 것도 T 세포의 기억 분화 상태에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 활성화 OX40, 41BB, CD107a 및 PD1의 마커에 대한 유세포 분석을 통해 독립적으로 T 세포 표현형을 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 평가하였다. 결과를 도 38 (CD3+), FIG 39 (CD4+) 및 도 40 (CD8+)에 나타내었다. 더 높은 농도의 작용제 항-CD27 항체인 발리루맙은 CD3+ T 세포(도 38B 및 38C), CD4+ T 세포(도 39B 및 39C) 및 CD8+ T 세포(도 40B 및 40C)에서 41BB 및 CD107a 발현을 촉진하였다. 작용제 CD137 수용체 항체인 우렐루맙은 CD4 T 세포(도 39B) 및 CD8+ T 세포(도 40B) 상에서 41BB 발현을 촉진하였다. 항-PD-1 길항제인 펨브롤리주맙은 CD4 T 세포에서 PD1 발현을 감소시켰다(도 39D).
[0668] 이들 데이터는 세포 활성화 상태를 조절하는 수단으로서 T 세포 확장에 사용하기 위한 모노클로날 항체 조절제의 사용을 뒷받침한다.
[0669] 본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 태양을 예시하기 위해 제공되는 특정 개시된 구체예로 그 범위가 제한하도록 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형이 가능하다는 것이 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 정신을 벗어남이 없이 실시될 수 있고 본 개시의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Myst Therapeutics, Inc.
Langer, Timothy J.
<120> EX VIVO METHODS FOR PRODUCING A T CELL
THERAPEUTIC AND REPLATED COMPOSITIONS AND METHODS
<130> 16517-20002.40
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently herewith
<150> 62/826,974
<151> 2019-03-29
<150> 62/941,610
<151> 2019-11-27
<150> 62/978,298
<151> 2020-02-18
<160> 1
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 148
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> UniProt Accesion No. P25445
<400> 1
Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val
1 5 10 15
Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln
20 25 30
Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys
35 40 45
Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys
50 55 60
Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg
65 70 75 80
Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg
85 90 95
Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser
100 105 110
Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile
115 120 125
Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Asn
145
Claims (157)
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계들을 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계;
여기서 배양의 하나 이상의 단계는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하는 세포자멸사 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 세포를 수확하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 확장된 T 세포 조성물을 생성하는 단계
를 포함하는 것인, 종양-반응성 T 세포의 제조 방법. - 청구항 1에 있어서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, 여기서 T 세포 자극 제제(들)의 존재 하에 인큐베이션하는 것은, 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에서 인큐베이션하기 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동배양의 적어도 일부 동안 수행되는 방법.
- 청구항 1-3 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 집단과 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단과 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션과 동시에 수행되는 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하는 세포자멸사 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(c) 공동-배양물로부터, 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 세포를 수확하는 단계. - 청구항 1-5 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 6에 있어서, 적어도 하나의 공동자극 작용제와의 인큐베이션 및 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-5 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 8에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제와의 인큐베이션 및 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계들을 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계;
여기서 배양의 하나 이상의 단계는 공동자극 작용제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 세포를 수확하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 확장된 T 세포 조성물을 생성하는 단계
를 포함하는 것인, 종양-반응성 T 세포의 제조 방법. - 청구항 10에 있어서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션하기 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동배양의 적어도 일부 동안 수행되는 방법.
- 청구항 10-12 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 집단과 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행되는 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 공동자극 작용제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(c) 공동-배양물로부터, 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계. - 청구항 10-14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 세포자멸사 억제제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 15에 있어서, 적어도 하나의 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션 및 체크포인트 작용제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 방법.
- 청구항 10-14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 17에 있어서, incubating with 적어도 하나의 체크포인트 억제제와의 인큐베이션 및 공동자극 작용제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계들을 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계;
여기서 배양의 하나 이상의 단계는 체크포인트 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 세포를 수확하여 종양 반응성 T 세포가 농축된 확장된 T 세포 조성물을 생성하는 단계
를 포함하는 것인, 종양-반응성 T 세포의 제조 방법. - 청구항 19에 있어서, 제1 또는 제2 T 세포 자극 제제(들)는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하고, T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 하나 이상의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 인큐베이션하기 전, 동안 및/또는 후에 수행되는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션은 공동배양의 적어도 일부 동안 수행되는 방법.
- 청구항 19-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 집단과 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트와의 인큐베이션의 적어도 일부는 T 세포 집단을 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행되는 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계를 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 상기 인큐베이션은 체크포인트 억제제인 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트의 존재 하에 수행되는 것인 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(c) 공동-배양물로부터, 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함하는 종양-반응성 T 세포를 농축함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(d) 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단의 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계. - 청구항 19-23, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 세포자멸사 억제제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 24에 있어서, 적어도 하나의 세포자멸사 억제제와의 인큐베이션 및 체크포인트 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 방법.
- 청구항 19-23 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 아쥬반트는 적어도 하나의 공동자극 작용제를 더 포함하는 방법.
- 청구항 26에 있어서, 적어도 하나의 공동자극 작용제와의 인큐베이션 및 체크포인트 억제제와의 인큐베이션은 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 수행되는 방법.
- 청구항 15, 16, 24 및 25 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 카스파제 활성화 또는 활성을 억제하는 것인 방법.
- 청구항 1-9, 15, 16, 24, 25 및 28 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 하나 이상의 of 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 3, 카스파제 6 또는 카스파제 7 중 하나 이상을 억제하는 방법.
- 청구항 1-9, 15, 16, 24, 25, 28 및 29 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 Emricasan(IDN-6556, PF-03491390), NAIP(뉴런 세포자멸사 억제 단백질; BIRC1), cIAP1 및 cIAP2(세포자멸사 1 및 2의 세포 억제제; 각각 BIRC2 및 BIRC3), XIAP(X-염색체 결합 IAP, BIRC4), 서바이빈(BIRC5), BRUCE(Apollon, BIRC6), 리빈(BIRC7) 및 Ts-IAP(고환-특이적 IAP, BIRC8), Wedelolactone, NS3694, NSCI 및 Z-플루오로메틸 케톤 Z-VAD-FMK 또는 그의 플루오로메틸 케톤 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-9, 15,1 6, 24, 25, 및 28- 30 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 2종 이상의 카스파제의 활성화 또는 활성을 억제하는 범-가스파제 억제제인 방법.
- 청구항 1-9, 15,1 6, 24, 25, 및 28-31 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 Z-VAD-FMK인 방법.
- 청구항 1-9, 15,1 6, 24, 25, 및 28-32 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 Z-FA-FMK, Z-VAD(OH)-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VAD(OM2)-FMK, 및 Z-VDVAD-FMK로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-9, 15,1 6, 24, 25, 및 28-33 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 50 μM, 약 0.5 μM 내지 약 40 μM, 약 0.5 μM 내지 약 30 μM, 약 0.5 μM 내지 약 20 μM, 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 40 μM, 약 1 μM 내지 약 30 μM, 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 1 μM 내지 약 5 μM의 농도로 첨가되고, 선택적으로, 상기 농도는 약 2 μM, EH는 약 10 μM 또는 약 25 μM인 방법.
- 청구항 1-9, 15,1 6, 24, 25, 및 28-33 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포자멸사 억제제는 약 0.5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 또는 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL의 농도로 첨가되는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26 및 27 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF) 작용제인 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 TNFRSF 구성원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이거나 또는 TNFRSF 구성원의 리간드의 세포외 도메인 또는 그의 결합 부분을 포함하는 융합 단백질인 방법.
- 청구항 36에 있어서, TNFRSF 구성원은 OX40, 4-1BB, GITR 및 CD27로부터 선택되는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36-39 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 타볼릭시주맙, 포갈리주맙, 11D4, 18D8, Hu119-122, Hu106-222,PF-04518600, GSK3174998, MEDI6469, BMS 986178 또는 9B12로부터 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이거나 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 40에 있어서, 공동자극 작용제는 타볼릭시주맙인 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27, 36-38 및 42 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 우렐루맙 또는 우토밀루맙이거나, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 CD27에 특이적으로 결합하는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27, 36-38 및 44 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 발리루맙이거나, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27 및 36-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 GITR에 특이적으로 결합하는 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27, 36-38 및 46 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 MK-1248이거나, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 6, 7, 10-18, 26, 27, 36-47 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동자극 작용제는 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 및 약 10 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL의 농도로 첨가되는 방법.
- 청구항 8, 9, 17, 18, 19-27 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM-3 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트의 활성을 억제하는 방법.
- 청구항 49에 있어서, 면역 체크포인트는 PD-1/PD-L1으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 50에 있어서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체이고, 선택적으로 항체는 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 니볼루맙으로부터 선택되거나, 또는 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 50 또는 청구항 51에 있어서, 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙인 방법.
- 청구항 50에 있어서, 체크포인트 억제제는 항-PDL1 항체이고, 선택적으로 항체는 아벨루맙, 더발루맙 및 아테졸리주맙으로부터 선택되거나, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 49에 있어서, 면역 체크포인트는 OX40인 방법.
- 청구항 54에 있어서, 체크포인트 억제제는 항-OX40L 항체이고, 선택적으로 항체는 옥셀루맙이거나 그의 항원-결합 단편인 방법.
- 청구항 49에 있어서, 면역 체크포인트는 CTLA-4인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체이고, 선택적으로 항체는 이필리무맙이거나 그의 항원 결합 단편인 방법.
- 청구항 8, 9, 17, 18, 19-27 및 49-57 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 체크포인트 억제제는 약 0.5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 및 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL의 농도로 첨가되는 방법.
- 청구항 1-58 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 아쥬반트는 배양의 하나 이상의 단계 동안 연속적으로 첨가되고, 여기서 T 세포 아쥬반트는 배양의 하나 이상의 단계 동안 1회 이상 보충되거나 교체되는 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-59 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 인큐베이션 동안 연속적으로 첨가되고, 여기서 T 세포 아쥬반트는 인큐베이션 동안 1회 이상 보충되거나 교체되는 방법.
- 청구항 1-58 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 아쥬반트는 배양의 하나 이상의 단계 동안 일시적으로 첨가되고, 여기서 T 세포 아쥬반트는 배양의 하나 이상의 단계 동안 1회만 첨가되는 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-58 및 61 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포 아쥬반트는 하나 이상의 재조합 사이토카인과의 인큐베이션 동안 일시적으로 첨가되고, 여기서 T 세포 아쥬반트는 인큐베이션 동안 1회만 첨가되는 방법.
- 청구항 1-62 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)은 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인을 포함하는 방법.
- 청구항 1-62 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)은 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 사이토카인을 포함하는 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-64 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-65 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 재조합 IL-2을 포함하는 방법.
- 종양-반응성 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 하기 단계들을 포함하는 프로세스에 의해 T 세포를 배양하는 단계:
(a) 종양을 갖는 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터의 T 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 집단의 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, IL-7, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 제1 T 세포 자극 제제(들)과 함께 인큐베이션하여 자극된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 대상체의 종양-관련 항원으로부터 하나 이상의 펩타이드가 제시되도록 항원 제시 세포(APC)가 유도된 조건 하, 상기 APC의 존재 하에, 자극된 T 세포의 집단을 공동-배양함으로써, 종양 반응성 T 세포를 포함하는 T 세포를 함유하는 집단을 생성하는 단계;
(d) 공동-배양물로부터 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양 반응성 T 세포의 집단을 농축하는 단계로서, 여기서 상기 종양-반응성 T 세포는 종양-관련 항원에 반응성인 내인성 TCR을 포함함으로써, 종양-반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(d) 종양 반응성 T 세포가 농축된 T 세포 집단을, 상기 집단 내 T 세포의 확장을 자극하는 조건 하에서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과 인큐베이션하는 단계; 및
(2) 상기 프로세스에 의해 생성된 확장된 세포를 수확하는 단계
를 포함하는 것인, 종양-반응성 T 세포의 제조 방법. - 청구항 67에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)은 IL-7 및 IL-15로부터 선택된 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 방법.
- 청구항 66-68 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)은 재조합 IL-2를 더 포함하는 방법.
- 청구항 66-69 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)은 재조합 IL-2를 포함하지 않는 방법.
- 청구항 66-70 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)은 IL-10, IL-1a, IL-5, IL-7, IL-12, IL-23p40, IL-16, IL-17A, IL-15, IL-22, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL13, 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재조합 사이토카인을 포함하는 방법.
- 청구항 71에 있어서, 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-7 및 IL-21 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 71 또는 청구항 72에 있어서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 재조합 IL-2를 포함하는 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-73 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 재조합 사이토카인의 각각의 농도는 개별적으로 100 IU/mL 내지 6000 IU/mL인 방법.
- 청구항 2-9, 11-19 및 20-64, 하나 이상의 재조합 사이토카인의 각각의 농도는 개별적으로 300 IU/mL 내지 6000 IU/mL, 300 IU/mL 내지 3000 IU/mL, 또는 300 IU/mL 내지 1000 IU/mL이고, 선택적으로, 하나 이상의 재조합 사이토카인의 각각의 농도는 약 300 IU/mL이거나 또는 약 1000 IU/mL인 방법.
- 청구항 1-75 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)은 항-CD3 항체, 선택적으로 OKT3을 더 포함하고, 선택적으로 항-CD3 항체의 농도는 약 50 ng/mL인 방법.
- 청구항 1-76 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포는수지상 세포, 단핵 식세포, B 림프구, 내피 세포 또는 흉선 상피와 같은 유핵세포인 방법.
- 청구항 1-77 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포는 수지상 세포인 방법.
- 청구항 1-78 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포는 대상체에 자가이거나 대상체에 대해 동종이계인 방법.
- 청구항 1-79 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포.
- 청구항 1-80 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 대상체에 대해 자가인 방법.
- 청구항 1-81 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드는 대상체의 종양-관련 항원으로부터의 적어도 하나의 네오에피토프를 포함하는 방법.
- 청구항 1-82 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동-배양은:
(a) 대상체로부터의 건강한 조직과 종양 조직의 엑솜 시퀀싱에 의해 하나 이상의 종양-관련 항원과 관련된 체세포 돌연변이를 확인하는 단계;
(b) 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 네오에피토프를 확인하는 단계;
(c) 대상체의 생물학적 샘플로부터 자가 T 세포 집단을 분리하는 단계; 및
(d) T 세포 집단을, 주조직적합성 복합체(MHC)의 표면 상의 펩타이드 중 하나 이상을 제시하는 조건 하에, 상기 하나 이상의 펩타이드에 노출되거나 또는 이와 접촉된 항원 제시 세포(APC)와 공동-배양함으로써(여기서 상기 하나 이상의 펩타이드는 하나 이상의 종양-관련 항원의 적어도 하나의 네오에피토프를 포함한다), 하나 이상의 펩타이드에 반응성인 종양-반응성 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 수행되는 방법. - 청구항 1-83 중 어느 하나의 청구항에 있어서, MHC 분자는 클래스 I 분자인 방법.
- 청구항 1-83 중 어느 하나의 청구항에 있어서, MHC 분자는 클래스 II 분자인 방법.
- 청구항 1-83 중 어느 하나의 청구항에 있어서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 및 II인 방법.
- 청구항 1-86 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD4+ 세포인 방법.
- 청구항 1-86 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD8+ 세포인 방법.
- 청구항 1-86 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포인 방법.
- 청구항 1-89 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드는 개별 펩타이드 또는 펩타이드의 풀을 포함하는 방법.
- 청구항 1-90 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드는 하나 이상의 펩타이드를 인코딩하는 시험관내 전사된 합성된 미니유전자 작제물의 형질감염에 의해 항원 제시 세포 상에 로딩되고, 선택적으로 여기서 하나 이상의 펩타이드의 각 측부에는 내인성 단백질로부터의 12개 아미노산이 플랭킹되어 있으며, 여기서 전사된 미니유전자 구축물은 개별 펩타이드를 생성하는 것인 방법.
- 청구항 1-90 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드는 펩타이드 펄스, 선택적으로 전기천공에 의해 항원 제시 세포 상에 로딩되는 방법.
- 청구항 92에 있어서, 하나 이상의 펩타이드는 각각 개별적으로 5-30개 아미노산, 선택적으로 12-25개 아미노산, 선택적으로 약 25개 아미노산 길이인 방법.
- 청구항 92 또는 청구항 93에 있어서:
하나 이상의 펩타이드는 펩타이드의 풀이고 펩타이드 펄스에 대한 펩타이드 풀 내의 펩타이드 농도는 약 0.001㎍/mL 내지 약 40㎍/mL, 0.01㎍/mL 내지 약 40μg/mL 또는 약 0.1μg/mL 내지 약 40μg/mL 또는 약 1μg/mL 내지 약 40μg/mL 또는 약 0.01μg/mL 내지 약 10 ㎍/mL 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL이거나; 또는
하나 이상의 펩타이드는 개별 펩타이드이고 펩타이드 펄스에 대한 개별 펩타이드의 농도는 0.00001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL 또는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL인 방법. - 청구항 92-94 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드의 개별 펩타이드 농도는, 평균적으로 약 0.00001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL인 방법.
- 청구항 92-94 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 펩타이드의 개별 펩타이드 농도는, 평균적으로 약 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL인 방법.
- 청구항 1-96 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포 대 T 세포의 공동-배양 비는 20:1 내지 1:1, 15:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:1, 5:1 내지 1:1, 2.5:1 내지 1:1, 1:20 내지 1:1, 1:15 내지 1:1, 1:10 내지 1:1, 1:5 내지 1:1, 또는 1:2.5 내지 1:1인 방법.
- 청구항 1-97 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 제시 세포 대 T 세포의 공동-배양 비는 약 1:1인 방법.
- 청구항 1-98 중 어느 하나의 청구항에 있어서,the 공동-배양은 2 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 방법.
- 청구항 1-99 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 공동-배양은 약 6 시간 동안 수행되는 방법.
- 청구항 1-100 중 어느 하나의 청구항에 있어서, enriching for 종양 반응성 T 세포를 농축하는 것은 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 101에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD137 (4-1BB), CD59, CD69, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258, CD256, PD-1, TIM-3 및 LAG-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-102 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD38, CD39, CD6, CD90, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-103 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD134 및/또는 CD137인 방법.
- 청구항 1-104 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107, CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90, CD38, CD30, CD154, CD252, CD134, CD258 및 CD256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-102 및 105 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a, CD39, CD103, CD59, CD90 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 1-102, 105 및 106 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD39, CD107a 및 CD103, CD107a 및 CD59, CD107a 및 CD90, CD107a 및 CD38, CD39 및 CD103, CD39 및 CD59, CD39 및 CD90, CD39 및 CD38, CD103 및 CD59, CD103 및 CD90, CD103 및 CD38, CD59 및 CD90, CD59 및 CD38 및 CD90 및 CD38로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 방법.
- 청구항 105-107 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD137을 더 포함하는 방법.
- 청구항 108에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 CD107a 및 CD137, CD38 및 CD137, CD103 및 CD137, CD59 및 CD137, CD90 및 CD137 및 CD38 및 CD137로부터 선택된 적어도 두 개의 마커를 포함하는 방법.
- 청구항 103-109 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커는 PD-1, TIM-3 및 LAG-3로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 더 포함하는 방법.
- 청구항 101-110 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 T 세포를 선택하는 것은 유세포 분석에 의하고, 선택적으로 FX500 세포 분류기 또는 Miltenyi Tyto 세포 분류기에 의해 선택적으로 자동화된 고처리량 유세포 분석법에 의해 수행되는 것인 방법.
- 청구항 111에 있어서, 유세포 분석에 의한 1회, 2회, 3회 또는 4회 실행을 수행하여 샘플로부터 종양-반응성 T 세포를 농축하는 방법.
- 청구항 1-112 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 방법의 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행되는 방법.
- 청구항 1-113 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 7 내지 21일, 선택적으로 7 내지 14일 동안인 방법.
- 청구항 1-114 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-115 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 기체 투과성 배양 용기 내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-116 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제1 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 생물반응기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-117 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션은 7 내지 21일, 선택적으로 7 내지 14일 동안인 방법.
- 청구항 1-118 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-119 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 기체 투과성 배양 용기 내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-119 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 제2 T 세포 자극 제제(들)과의 인큐베이션은 생물반응기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-121 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 수확은 종양-반응성 세포를 포함하는 T 세포의 배양 및/또는 농축 개시 후 30일 이내에 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-122 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포는 배양 개시 후 최대 30일, 선택적으로 배양 개시 후 7 내지 30일, 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 10 내지 14일 또는 14 내지 20일의 시점에서 수확되는 것인 방법.
- 청구항 1-123 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 대상체는 암을 나타내는 방법.
- 청구항 1-124 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 확장된 세포를 포함하는 조성물은 대상체에서 암을 치료하는 데 사용되는 것인 방법.
- 청구항 1-125 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양은 상피암의 종양인 방법.
- 청구항 1-126 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양은 흑색종, 폐 편평상피암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암(CRC), 자궁경부암, 두부 및 목암, 위암 또는 자궁암의 종양인 방법.
- 청구항 1-127 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종 암, 자궁내막암의 종양이고, 여기서 선택적으로 유방암은 HR+/Her2- 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 HER2+ 유방암인 방법.
- 청구항 1-128 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프절 샘플, 또는 종양 샘플인 방법.
- 청구항 129에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이고 말초 혈액 샘플이 채혈 또는 성분채집에 의해 수집되고, 선택적으로 성분채집은 백혈구 성분채집인 방법.
- 청구항 129에 있어서, 생물학적 샘플은 림프절 샘플 또는 종양 샘플이고, 여기서 샘플은 바늘 생검, 선택적으로 코어 바늘 생검 또는 세바늘 흡인에 의해 수집되는 것인 방법.
- 청구항 1-131 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포를 포함하는 세포 집단은 종양 침윤 림프구, 림프구 또는 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-132 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생물학적 샘플은 종양이고 T 세포를 포함하는 세포 집단은 종양 침윤 림프구를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-133 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편인 방법.
- 청구항 134에 있어서, 하나 이상의 종양 단편이 2 cm2 당 약 1개의 종양 단편으로 제1 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션을 위해 접종되는 것인 방법.
- 청구항 1-134 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양은 흑색종인 방법.
- 청구항 1-134 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편의 균질화 및/또는 효소적 소화에 의해 단일 세포 현탁액으로서 처리되는 것인 방법.
- 청구항 1-134 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생물학적 샘플은 절제된 종양이고 T 세포를 포함하는 세포 집단은 절제된 종양으로부터의 하나 이상의 종양 단편의 균질화 및 효소적 소화에 의해 처리된 단일 세포 현탁액인 방법.
- 청구항 137 또는 청구항 138에 있어서, 효소적 소화는 콜라게나제, 선택적으로 콜라게나제 IV 또는 콜라게나제 I/II와의 인큐베이션에 의한 것인 방법.
- 청구항 137-139 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포를 포함하는 세포 집단은 2 cm2 당 약 5 x 105 내지 약 2 x 106 총 세포로 제1 T 세포 자극 제제(들)와의 인큐베이션을 위해 접종되는 것인 방법.
- 청구항 1-135 및 137-140 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 종양은 결장직장암(CRC)인 방법.
- 청구항 1-141 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 방법은 T 세포의 배수 확장 또는 종양 반응성 T 세포의 배수 확장을 초래하며, 이는 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 250배, 적어도 약 500배, 적어도 약 1000배 또는 그 이상인 방법.
- 청구항 1-142 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 확장된 세포의 조성물은 항원-특이적 자극 후 약 30pg/mL 초과, 선택적으로 약 60pg/mL 초과 농도에서 IFN감마를 생성할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1-143 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 수확된 세포를 동결보호제로 제형화하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 1-144 중 어느 하나의 청구항의 방법에 의해 생성된 종양 반응성 T 세포가 풍부한 확장된 T 세포를 포함하는 조성물.
- 청구항 145에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
- 청구항 145 또는 청구항 146에 있어서, T 세포는 CD3+ T 세포이거나 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 145-147 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고, 여기서 CD8+ T 세포 대 CD4+ T 세포의 비는 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 2.5:1인 조성물.
- 청구항 145-148 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 조성물 중 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 총 T 세포 또는 종양-반응성 T 세포 또는 그의 생존 세포의 수는 약 0.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 30 x 109, 0.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 0.5 x 108 내지 약 1 x 108, 1 x 108 내지 약 50 x 109, 약 1 x 108 내지 약 30 x 109, 1 x 108 내지 약 12 x 109, 약 1 x 108 내지 약 60 x 108, 약 1 x 108 내지 약 15 x 108, 약 1 x 108 내지 약 8 x 108, 약 1 x 108 내지 약 3.5x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 50 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 30 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 12 x 109, 약 3.5 x 108 내지 약 60 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 15 x 108, 약 3.5 x 108 내지 약 8 x 108, 약 8 x 108 내지 약 50 x 109, 약 8 x 108 내지 약 30 x 109, 약 8 x 108 내지 약 12 x 109, 약 8 x 108 내지 약 60 x 108, 약 8 x 108 내지 약 15 x 108, 약 15 x 108 내지 약 50 x 109, 약 15 x 108 내지 약 30 x 109, 약 15 x 108 내지 약 12 x 109, 약 15 x 108 내지 약 60 x 108, 약 60 x 108 내지 약 50 x 109, 약 60 x 108 내지 약 30 x 109, 약 60 x 108 내지 약 12 x 109, 약 12 x 109 내지 약 50 x 109, 약 12 x 109 내지 약 30 x 109, 또는 약 30 x 109 내지 약 60 x 109인 조성물.
- 청구항 145-149 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 동결보호제를 포함하는 조성물.
- 청구항 145-150 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 멸균성인 조성물.
- 암에 걸린 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 청구항 145-151 중 어느 하나의 청구항의 조성물의 치료 용량을 종양이 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 152에 있어서, 치료적 유효 용량은 1 x 109 내지 10 x 109 T 세포인 방법.
- 청구항 152 또는 청구항 153에 있어서, 투여된 조성물의 세포는 대상체에 대해 자가인 방법.
- 청구항 152-154 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 암은 상피암인 방법.
- 청구항 152-154 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 암은 흑색종, 폐 편평상피암, 폐 선암종, 방광암, 폐 소세포암, 식도암, 결장직장암, 자궁경부암, 두경부암, 위암 또는 자궁암인 방법.
- 청구항 152-154 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), CRC, 난소암, 유방암, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암종 암, 자궁내막암이고, 선택적으로 여기서 유방암은 HR+/Her2- 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 HER2+ 유방암인 방법.
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