JP6002903B2 - Tnfスーパーファミリーコレクチン融合タンパク質 - Google Patents
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Description
第1表
以下に、本発明の組換えタンパク質の基本構造を、本明細書に説明されるようなTNFスーパーファミリーサイトカインを例示して示す。
(GSS)a(SSG)b(GSG)c(配列中、a、b、cは、各0、1、2、3、4、5、または6である)。
1. 材料および方法
1.1 三量体形成ドメインに由来のC末端に位置するコレクチンによって安定化したTNF−SFタンパク質の構築
ヒトコレクチン11(Col11)、コレクチン11「コイルドコイル」(CC11)、ヒト肺サーファクタントタンパク質D(SP−D)、SP−Dの「コイルドコイル」(CCSPD)に由来する三量体形成モチーフ(第2表および第3表)を、それぞれCD95Lのヒト受容体結合ドメイン(RBD)(「CD95L−RBD」;Glu142−Leu281)、ヒトTRAIL−RBD(Gln120−Gly281)、ヒトLIGHT−RBD(Glu91−Val240)、およびヒトAPRIL−RBD(Lys113−Leu250)にC末端融合させた。
本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードする核酸分子は、融合タンパク質を発現するための適切なベクターにクローン化され得る。そのようなベクターを作製するために必要な分子ツールは、当業者に公知であり、ならびに制限酵素、ベクター、およびベクターを伝播するための適切な宿主を含む。
10%のFBS、100ユニット/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したDMEM+GlutaMAX(GibCo)培地で増殖させたHEK293T細胞を、本明細書に説明されるような融合タンパク質をコードするプラスミドに一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、組換えタンパク質を含有する細胞培養の上清を収集して、300xgで遠心分離し、続いて0.22μm無菌フィルターを通す濾過によって浄化した。アフィニティー精製のために、4mlの50%ストレプタクチン・セファロース(IBA GmbH、ドイツ国ゲッティンゲン)を2mlカラムに充填して、30mlのリン酸緩衝食塩水、pH7.4(PBS;Invitrogen Cat. 10010)または緩衝液W(100mMのTris−HCl、150mMのNaCl、pH8.0)で平衡化した。細胞培養の上清を、4℃で、カラムに2ml/分の流速で注いだ。続いて、カラムをPBSまたは緩衝液Wで洗浄して、特異的に結合したタンパク質を5×2mlの緩衝液E(PBSまたは2.5mMのデスチオビオチンを加えた緩衝液W、pH7.4)を加えることによって段階的に溶出させた。溶出液画分のタンパク質含有量を、吸収分光法および銀染色SDS−PAGEによって分析した。陽性画分を、続いて限外濾過(Sartorius, Vivaspin, 10,000Daカットオフ)によって濃縮し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析した。
カスパーゼ活性化を分析するために、Jurkat A3永久ヒトT細胞株(カタログ番号CRL2570、ATCC)による細胞アッセイを用いた。Jurkat細胞を、10%FBS(Biochrom)、100ユニット/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシン(GibCo)を補充したRPMI1640培地+GlutaMAX(GibCo)を用いてフラスコ内で増殖させた。アッセイの前に、ウェルあたり100,000細胞を96ウェルのマイクロタイタプレートに播種した。架橋抗体の有無にかかわらずタンパク質を含有する異なる溶液をウェルに添加(最終容量:200μl)し、続いて37℃で3時間インキュベートした。20μlの溶解緩衝液(250mMのHEPES、50mMのMgCl2、10mMのEGTA、5%のTriton−X−100、100mMのDTT、10mMのAEBSF、pH 7.5)を加えることで、細胞を溶解させて、プレートを氷上で30分から2時間インキュベートした。アポトーシスはカスパーゼの活性の増加に近似する。従って、特定のカスパーゼ基質Ac−DEVD−AFC(Biomol)の切断を用いてアポトーシスの程度を決定した。カスパーゼ活性アッセイのために、20μlの細胞可溶化物を黒い96ウェルマイクロタイタープレートに移した。50mMのHEPES、1%のショ糖、0.1%のCHAPS、50μMのAc−DEVD−AFC、および25mMのDTT、pH7.5を含有する80μlの緩衝液を添加した後、プレートを、Tecan Infinite F500マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度の増加を観察した(励起波長400nm、発光波長505nm)。
TRAIL融合タンパク質の効果を決定するために、初代ヒト肝細胞を健常なドナーから調製して、96ウェルプレートでウェルあたり25,000細胞を用いて、Williams E培地で培養した。2日目に培地を、10%のFCS、ヒトインスリン、ペニシリン/ストレプトマイシン、最小必須培地(MEM)、ピルビン酸ナトリウム、および10mMのHEPESを補充したDMEM−F12に変えて、もう一日培養した。3日目に、架橋抗体(StrepMabimmo, IBA GmbH)の存在下または非存在下で、表示したタンパク質の濃度を変えて細胞を刺激した。化学療法剤とリガンドの同時処置の潜在的な肝毒性作用を評価するために、TRAIL−ASPD_F335Dを種々の濃度で、5mMのドキソルビシンまたは5mMのゲムシタビンとともに同時インキュベートした。細胞を37℃、5%CO2で、5時間または24時間インキュベートし、次いで、「細胞死アッセイ」のセクションで説明するように、カスパーゼ活性の決定のために溶解した。
構築したリガンドとの受容体の結合を決定するために、ストレプタクチンをコーティングした96ウェルマイクロプレートを使用した。従って、一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞、マウス血清、または精製タンパク質からの上清をストレプタクチンプレート(IBA GmbH)上で、PBS中で1〜3時間固定化した。試料を、ELISA結合/遮断緩衝液(PBS、0.1%のTween−20、20%のSuperBlock T20−PBS(Pierce))で希釈した。プレートを、PBS+0.1%のTween−20で洗浄して、マウス坑TRAIL抗体(Pharmingen,クローンRIK−2)、TRAIL受容体1−Fc(R&D Systems)、TRAIL受容体2−Fc(R&D Systems)、TACI−Fc(R&D Systems)、またはHVEM−Fc(R&D Systems)とともに室温で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄して、Fcタンパク質を、坑ヒト−もしくは坑マウス−Fc特異的ペルオキシダーゼ結合型抗体(Sigma)を用いて検出した。呈色反応を、ウェルあたり100μlのTMB基質(Kem−En−Tec Diagnostics)を添加することで行った。停止液として25%のH2OS4を25μl加えてから、450nmおよび630nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。値を、450nm〜630nmとしてMS Excelで算出した。
ELISAプレート(Nunc Maxisorp)を、無菌のコーティング緩衝液(15mMのNa2CO3、35mMのNaHCO3、0.025%のNaN3、pH9.6)中で、10μg/ウェルの酵母マンナン(Sigma)とともに4℃で一晩インキュベートした。プレートを、最初に緩衝液BB(20mMのTris、140mMのNaCl、5mMのCaCl2、0.1%のBSA、および20%のSuperBIock T20−PBS(Pierce))とともに室温で1時間インキュベートし、次に緩衝液BB中で、表示したリガンドの濃度を変えてさらに90分間インキュベートした。プレートを緩衝液WB(20mMのTris、140mMのNaCl、5mMのCaCl2、0.05%のTween−20)で洗浄して、緩衝液BB中で、ストレプタクチン−HRP(IBA GmbH)を用いての検出を行った。プレートを洗浄して、TMB基質(Kem−En−Tec Diagnostics)で展開させた。停止液として25%のH2OS4を25μl加えてから、450nmおよび630nmでの吸収をELISAリーダーで測定した。値を、450nm〜630nmとしてMS Excelで算出した。
雄CDIマウス(Charles River)に、300μlのPBS(Invitrogen)に溶解させた10μgのタンパク質を静脈内注入した。0分(投与前)、5分後、30分後、2時間後、6時間後、および24時間後に血液を採取した。各時点で、試料を2つ採取した。血液試料を処理して血清を取得し、−15℃で保管した。TRAIL融合タンパク質の濃度を、以下(第1.9章)に説明するようにELISAを用いて測定し、半減期を算出した(GraphPad Prism v4.0)。
マウス血清(薬物動態研究に由来する)中のTRAILタンパク質の濃度を定量化するために、96ウェルマイクロプレートを使用するELISA方法を用いた。
2.1 CD95L融合タンパク質の特徴づけ(CD95L−ASPD)
ランニング緩衝液としてPBSを用いて、ストレプタクチンアフィニティー精製したCD95L−ASPDから0.5ml(0.86mgのタンパク質)をSuperdex200カラム上に0.5ml/分の流速で添加した。0.5mlの画分を収集した(A1〜A11を表示する)。サイズ排除基準から測定すると、11.92mlでの主ピークの保持量は、170kDaに相当した。これは、タンパク質がグリコシル化単量体で構成された三量体であることを示した。単量体ポリペプチドの算出分子量は、38kDaである。画分A1〜A11のアリコートをSDS−PAGEおよびカスパーゼ活性のために使用した。明確な三量体ピーク(画分A7〜A10)だけを、最終分析で用いた。結果を図1に示す。
ランニング緩衝液としてPBSを用いて、アフィニティー精製したLIGHT−ASPDから0.5ml(1.56mg)をSuperdex200カラム上に0.5ml/分の流速で添加して、分解させた。11.96mlで検出した主ピークは、サイズ170〜180kDaに相当し、LIGHT−ASPDが3つのグリコシル化単量体で構成された三量体であることを示した。三量体ピーク(画分A7〜A10)を収集して、最終分析で用いた。挿入図は、個別に精製した三量体LIGHT−ASPDの2つのバッチ(0917および0918と名付ける)の銀染色SDS−PAGEを示す。結果を図5に示す。
HEK293細胞に、TRAIL融合タンパク質をコードする24の異なる発現ベクターを一過性にトランスフェクトした(第6表)。
HEK293細胞に、種々のTRAIL受容体選択的SPDコンストラクトをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトさせた:
番号 トランスフェクトした発現ベクター
1 TRAILR1変異タンパク質−A−SPD
2 TRAILR1変異タンパク質−A−CCSPD
3 TRAILR1変異タンパク質−D−SPD
4 TRAILR1変異タンパク質−D−CCSPD
5 TRAILR2変異タンパク質−A−SPD
6 TRAILR2変異タンパク質−A−CCSPD
7 TRAILR2変異タンパク質−D−SPD
8 TRAILR2変異タンパク質−D−CCSPD
9 TRAIL−A−SPD
10 TRAIL−A−CCSPD
11 TRAIL−D−SPD
12 TRAIL−D−CCSPD
トランスフェクションから3日後、上清を収集して、抗体特異的Strep−tagIIを使用するSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングのためにアリコートを使用した。およそ38kDa(SPD融合タンパク質)および28kDa(コイルドコイル−SPD融合タンパク質)で特異的バンドを検出した。発現したタンパク質の量は、リガントそれ自体(TRAILR1変異タンパク質>TRAILR2変異タンパク質>TRAIL)に、第二に使用したリンカーの長さ(A>D)、および第三に使用した三量体形成モチーフ(SPD>CCSPD)に依存した。見かけの分子量は、算出したサイズ(SPD融合タンパク質およびCCSPD融合タンパク質に対してそれぞれ40kDaおよび27kDa)から予想どおりであった。結果を図13に示す。
図24に示すように、アフィニティー精製したTRAIL−ASPD_F335Aを、0.5mlのPBS溶液(0.4mgのタンパク質)を、Superdex200カラムに添加することによって、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液としてPBSを用いて、タンパク質を0.5ml/分で分解させて、0.5mlの画分を収集した(画分A1〜A13を示す)。サイズ排除基準から測定すると、12.27mlの保持量は135〜145kDaに相当する。これは、40kDaの予想される単量体分子量から算出されるようにTRAIL−ASPD_F335Aがホモ三量体であることを示した。8.32mlおよび10.68mlでの2つのさらなるピークは、TRAIL−ASPD_F335Aの凝集体が形成されたことを示した。三量体ピークだけを、後の分析で使用した。
いくつかの種に由来する野生型で完全長のオリゴマーのSP−Dタンパク質およびヒトSP−Dの三量体ネック+CRDは、いくつかの異なる糖に結合することが示されている。さらに、ヒトSP−Dのネック+CRDは、免疫細胞(例えば好中球)のための走化性因子として役割を果たすことによって免疫調節効果を発揮することも示されている(Cai et al., 1999, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 276:131−136)。他の細胞も、SP−Dによって補充されることもある。マルトースの添加によって走化性機能が抑制されるように、ヒトSP−Dのネック+CRDの走化性効果は、グリコ結合機能に依存することが示されている。従って、SP−Dが媒介する走化性機能を有するTNFSFのリガンドは、天然のアミノ酸配列を有するリガンドまたはそのコンストラクトと比較して、優れた活性であり得る。例えば、癌治療におけるように細胞効果が望ましい場合のシナリオでは、そのような記述されたリガンドが望ましいこともある。
TRAIL−SPD融合タンパク質の半減期を測定するために、10マイクログラムのTRAIL−ASPD(A)またはTRAIL−ASPD_F335D(B)を雄CD1マウスの静脈内に注入し、次いで血清試料をいくつかの時点(投与前、5分後、30分後、2時間後、6時間後、および24時間後)で採取した。マウスの血清中のTRAILタンパク質を、ELISAによって定量化し、そのデータを用いて半減期を算出した。結果を図31に示す。分析した2つのタンパク質に関しては、TRAIL−ASPD(A)およびTRAIL−ASPD_F335D(B)に対して7〜14時間の半減期を算出した。観察期間中、死亡したまたは不耐性の徴候を示した動物はなかった。げっ歯類において3〜5分の範囲で半減期間を有することが報告されている(Kelley et. al 2001)野生型TRAILと比較して、血清半減期が少なくとも80倍向上したことを、データは示している。
TRAIL−ASPD、TRAIL−ASPD_F335A、またはTRAIL−ASPD_F335Dの潜在的な肝毒性作用を分析するめに、初代ヒト肝細胞(PHH)を、架橋抗体(坑Strep−tagII)とともにまたは架橋抗体なして、種々の濃度の表示したTRAIL−SPD−融合タンパク質とともにインキュベートした。対照として、CD95Lの安定化変異体、CD95L−T4(WO2008/025516に記載されている)を用いた。結果を図32に示す。
HEK293細胞に、APRIL−A69(WO2008025516)、APRIL−ASPD、APRIL−ACCSPD、またはAPRIL−ACol11をコードする発現ベクターを一過性にトランスフェクした。3日後、上清を、ウエスタンブロッティングによって分泌タンパク質について分析した。結果を図33に示す。APRIL融合タンパク質の検出のために、Strep−tagIIに特異的な抗体を使用した。矢印は、およそ40kDa(それぞれAPRIL−ASPDおよびAPRIL−ACol11)で、ならびにおよそ25kDa(それぞれAPRIL−A69およびAPRIL−ACCSPD)で検出した特異的バンドを示す。従って、APRIL発現カセットは機能的であり、これらのタンパク質が適切に折り畳まれていることをタンパク質の分泌は示した。分析した他のTNFSFタンパク質に関しては、最高レベルの分泌タンパク質は、ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」+CRDから構成された三量体形成モチーフに融合したAPRILに見られた(APRIL−ASPD、レーン番号2)。APRIL−ASPDを用いて、受容体TAClとの結合を分析した。
Claims (41)
- (i)TNFスーパーファミリーサイトカインの受容体結合ドメインと、
(ii)コレクチン三量体形成ドメインと
(iii)(i)と(ii)との間に位置する可動性リンカーエレメントと
を含み、
前記可動性リンカーエレメントが3〜15のアミノ酸の長さを有するグリシン/セリン・リンカーであり、
前記コレクチン三量体形成ドメインが前記TNFスーパーファミリーサイトカインの受容体結合ドメインのC末端に位置し、かつ
前記コレクチン三量体形成ドメインが配列番号21のヒトサーファクタントタンパク質Dの225〜257のアミノ酸を含む、
融合タンパク質。 - 前記可動性リンカーエレメントが3、6、9、10、12または15のアミノ酸の長さを有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記可動性リンカーエレメントがアミノ酸配列(GSS)a(SSG)b(GSG)c(配列中、a、b、cは、各0、1、2、3、4、5、または6である)を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記可動性リンカーエレメントが9〜15のアミノ酸の長さを有する、請求項1から3までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)がLTA(配列番号1)、TNFα(配列番号2)、LTB(配列番号3)、OX40L(配列番号4)、CD40L(配列番号5)、CD95L(配列番号6)、CD27L(配列番号7)、CD30L(配列番号8)、CD137L(配列番号9)、TRAIL(配列番号10)、RANKL(配列番号11)、TWEAK(配列番号12)、APRIL1(配列番号13)、APRIL2(配列番号14)、BAFF(配列番号15)、LIGHT(配列番号16)、TL1A(配列番号17)、GITRL(配列番号18)、EDA−A1(配列番号19)またはEDA−A2(配列番号20)の受容体結合ドメインから選択される、請求項1から4までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)がLTA(配列番号1)の59〜205または60〜205、TNFα(配列番号2)の86〜233、LTB(配列番号3)の82〜244または86〜244、OX40L(配列番号4)の52〜183または55〜183、CD40L(配列番号5)の112〜261または117〜261、CD27L(配列番号7)の51〜193または56〜193、CD30L(配列番号8)の97〜234、98〜234、または102〜234、CD137L(配列番号9)の86〜254、RANKL(配列番号11)の161〜317、TWEAK(配列番号12)の103〜249、104〜249、または105〜249、APRIL1(配列番号13)の111〜247または112〜247、APRIL2(配列番号14)の111〜247または112〜250、BAFF(配列番号15)の140〜285、LIGHT(配列番号16)の91〜240、TL1A(配列番号17)の91〜251または93〜251、GITRL(配列番号18)の52〜177、EDA−A1(配列番号19)の245〜391、EDA−A2(配列番号20)の245〜389のアミノ酸を含む、請求項1から5までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)がCD95Lの受容体結合ドメインである、請求項1から5までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)がヒトCD95L(配列番号6)の142〜281または144〜281のアミノ酸を含む、請求項7に記載の融合タンパク質。
- (i)がTRAILの受容体結合ドメインである、請求項1から5までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)がヒトTRAIL(配列番号10)の95〜281、116〜281、117〜281、118〜281、119〜281、または120〜281のアミノ酸を含む、請求項9に記載の融合タンパク質。
- (i)がTRAILR1および/またはTRAILR2に結合および/または活性化するTRAILの受容体結合ドメインの変異体を含む、請求項1から5または9から10までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- (i)が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項1から11までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸置換がヒトTRAIL(配列番号10)の次のアミノ酸位、R130、G160、Y189、R191、Q193、E195、N199、K201、Y213、T214、S215、H264、I266、D267、D269のうちの少なくとも一つで行われ、および前記アミノ酸置換が次のアミノ酸位、R130E、G160M、Y189A、Y189Q、R191K、Q193S、Q193R、E195R、N199V、N199R、K201R、Y213W、T214R、S215D、H264R、I266L、D267Q、D269H、D269R、またはD269Kのうちの少なくとも一つである、請求項12に記載の融合タンパク質。
- (ii)が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項1から13までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸置換が配列番号21のヒトサーファクタントタンパク質Dのアミノ酸位F355で行われる、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸置換がF355A、F355S、F355T、F355E、F355D、F355K、またはF355Rのうちの一つである、請求項15に記載の融合タンパク質。
- (ii)がマンノースに結合しない変異体を含む、請求項1から16までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- プロテアーゼ切断部位を有し得るN末端シグナルペプチドドメインをさらに含む、請求項1から17までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記N末端シグナルペプチドドメインが配列番号23、配列番号24、または配列番号25の配列を含む、請求項18に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質がN末端またはC末端に位置する認識/精製ドメインをさらに含む、請求項1から19までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記認識/精製ドメインがStrep−tagまたはポリHisドメインである、請求項20に記載の融合タンパク質。
- 前記認識/精製ドメインを有し得るおよび/または前記認識/精製ドメインに連結し得る末端の可動性エレメントをさらに含む、請求項1から21までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 三量体複合体としてまたは三量体複合体のオリゴマーとして存在する、請求項1から22までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記三量体複合体が三つの融合タンパク質間の共有結合によって形成され、および前記共有結合が(ii)のシステイン間のジスルフィド架橋からなる、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記三量体複合体が三つの同一の融合タンパク質からなる、請求項23または24に記載の融合タンパク質。
- 核酸分子であって、請求項1から22までのいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- 発現制御配列に作用可能に結合される、請求項26に記載の核酸分子。
- ベクター上に位置する、請求項26または27に記載の核酸分子。
- 請求項26から28までのいずれか1項に記載の核酸分子で形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞。
- 原核細胞である、請求項29に記載の細胞。
- 真核細胞である、請求項29に記載の細胞。
- 前記真核細胞が、哺乳類細胞である、請求項31に記載の細胞。
- 前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項32に記載の細胞。
- 請求項26から28までのいずれか1項に記載の核酸分子で形質転換されたまたはトランスフェクトされた非ヒト生物。
- 活性剤として請求項1から25までのいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項26から28のいずれかに記載の核酸分子、または請求項29から33までのいずれか1項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 活性剤として請求項1から25までのいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項26から28のいずれかに記載の核酸分子、または請求項29から33までのいずれか1項に記載の細胞を含む、診断組成物。
- 療法で使用するための請求項1から25までのいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 増殖性障害、TNFサイトカインの機能障害に関連しておよび/または付随して起こる障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および/または処置における医薬組成物の製造のための、請求項1から25いずれか1項に記載の融合タンパク質の使用。
- 増殖性障害、TNFサイトカインの機能障害に関連しておよび/または付随して起こる障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および/または処置における医薬組成物の製造のための、請求項26から28までのいずれか1項に記載の核酸分子の使用。
- 増殖性障害、TNFサイトカインの機能障害に関連しておよび/または付随して起こる障害、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患、ならびに移植拒絶反応の予防および/または処置における医薬組成物の製造のための、請求項29から33までのいずれか1項に記載の細胞の使用。
- アポトーシス増感剤および/またはアポトーシス誘導剤と組み合わせた請求項38から40までのいずれか1項に記載の使用。
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