TW202208616A - 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於基於PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT表現預選TIL的方法以及用於擴增彼等預選之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以產生具有增強的腫瘤特異性殺滅能力(例如增強的細胞毒性)之治療性TIL群體的方法。
Description
相關申請案之交叉引用
本申請主張2020年5月4日提交申請之美國臨時專利申請案第63/019,907號及2021年2月5日提交申請之美國臨時專利申請第63/146,400號之優先權，其揭示內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤性淋巴球(tumor infiltrating lymphocyte；TIL)治療大型(bulky)、難治性癌症表示對於不良預後患者的一種強大的治療方案。Gattinoni等人，《自然免疫學評論(Nat. Rev. Immunol.
)》2006, 6,
383-393。成功免疫療法需要大量TIL，且商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增之技術、邏輯及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2之TIL擴增及隨後的「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增之較佳方法。Dudley等人，《科學(Science)》2002
，298, 850-54；Dudley等人，《臨床腫瘤學雜誌(J. Clin. Oncol.
)》2005, 23,
2346-57；Dudley等人，《臨床腫瘤學雜誌》2008
,26,
5233-39；Riddell等人，《科學》1992, 257,
238-41；Dudley等人，《免疫療法雜誌(J. Immunother.
)》2003
,26,
332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如200倍)的經照射的通常來自多個供體之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為飼養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量之IL-2。Dudley等人，《免疫療法雜誌》2003, 26,
332-42。已經歷REP程序之TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼細胞療法。目前的輸注接受性參數依賴於TIL之組成的讀數(例如CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物之擴增倍數及存活率。
目前的TIL製造過程受限於長度、成本、無菌性考量及本文所描述之其他因素，使得該等過程之商業化潛力受到嚴重限制。雖然已有TIL表徵，例如已顯示TIL表現各種受體，包含抑制性受體計劃化細胞死亡1(PD-1；亦稱為CD279)(參見Gros, A.等人，《臨床調查研究(Clin Invest.)》124(5):2246-2259(2014))，但此資訊在發展治療性TIL群體方面之有用性尚未完全實現。迫切需要提供適用於商業規模製造且經法規核准用於多個臨床中心的人類患者之TIL製造過程及基於該等過程之療法。本發明藉由提供基於PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT表現預選TIL以獲得具有增強之腫瘤特異性殺滅能力(例如增強之細胞毒性)之TIL的方法來滿足此需求。
本發明提供用於擴增TIL及產生治療性TIL群體的方法，該等方法包含PD-1+、CD39+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+狀態預選步驟。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
(a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；
(b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體；
(c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體；
(d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中添加之APC的數目係步驟(c)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及
(f) 將來自步驟(e)之經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；
b)自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體；
c)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體；
d)藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及
e)收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體。
在一些實施例中，在步驟(c)中，細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(d)中的培養基中之APC之數目大於步驟(c)中的培養基中之APC之數目。
在一些實施例中，在步驟(c)中，細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(d)中的培養基中之APC之數目等於步驟(c)中的培養基中之APC之數目。
在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high/lo、CD38lo、CD103high/lo、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
(a) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養經選擇呈PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性之第一TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，該第一TIL群體可藉由腫瘤碎解以處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL而獲得，其中在包括第一透氣表面區域之容器中進行初始第一擴增，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於第一TIL群體；
(b) 藉由使該第二TIL群體與具有另外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL群體的細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中APC的數目係步驟(a)中之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；及
(c) 收集獲自步驟(b)之治療性TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
(a) 藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體以進行經選擇呈PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性之第一TIL群體的初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於第一TIL群體；
(b) 藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及
(c) 收集獲自步驟(b)之治療性TIL群體。
在一些實施例中，在步驟(a)中，細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(b)中的培養基中之APC之數目大於步驟(a)中的培養基中之APC之數目。
在一些實施例中，在步驟(a)中，細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(b)中的培養基中之APC之數目等於步驟(a)中的培養基中之APC之數目。
在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high、CD38lo、CD103high、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇或步驟(a)之選擇包括選自由以下組成之群組的選擇方法：流動式細胞測量術(包含例如FACS)、基於抗體之珠粒選擇及基於抗體之磁珠選擇。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇或步驟(a)之選擇包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇或步驟(a)之選擇包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。
在一些實施例中，進行PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL之選擇，直至存在至少1×106
個PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，用於培養第一TIL群體之細胞培養基包括2-巰基乙醇。
在一些實施例中，用於培養第二TIL群體之細胞培養基包括2-巰基乙醇。
在一些實施例中，用於培養第一TIL群體及第二TIL群體之細胞培養基包括2-巰基乙醇。
在一些實施例中，分別使用抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，分別使用抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合磁珠選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL分別與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合，且PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陰性TIL並未分別與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合。
在一些實施例中，單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗(nivolumab)或其變體、片段或結合物。
在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。
在一些實施例中，快速第二擴增中APC之數目與初始第一擴增中APC之數目的比率選自約1.5:1至約20:1之範圍。
在一些實施例中，該比率係選自約1.5:1至約10:1之範圍。
在一些實施例中，該比率係選自約2:1至約5:1之範圍。
在一些實施例中，該比率係選自約2:1至約3:1之範圍。
在一些實施例中，該比率為約2:1。
在一些實施例中，初始第一擴增中APC之數目係選自約1×108
個APC至約3.5×108
個APC之範圍，且其中快速第二擴增中APC之數目係選自約3.5×108
個APC至約1×109
個APC之範圍。
在一些實施例中，初始第一擴增中APC之數目係選自約1.5×108
個APC至約3×108
個APC之範圍，且其中快速第二擴增中APC之數目係選自約4×108
個APC至約7.5×108
個APC之範圍。
在一些實施例中，初始第一擴增中APC之數目係選自約2×108
個APC至約2.5×108
個APC之範圍，且其中快速第二擴增中APC之數目係選自約4.5×108
個APC至約5.5×108
個APC之範圍。
在一些實施例中，將約2.5×108
個APC添加至初始第一擴增且將5×108
個APC添加至快速第二擴增。
在一些實施例中，第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率為約1.5:1至約100:1。
在一些實施例中，第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率為約50:1。
在一些實施例中，第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率為約25:1。
在一些實施例中，第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率為約20:1。
在一些實施例中，第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率為約10:1。
在一些實施例中，第二TIL群體在數目上比第一TIL群體大至少50倍。
在一些實施例中，該方法包括在收集治療性TIL群體的步驟之後進行以下另一步驟：
將經收集之治療性TIL群體轉移至輸注袋。
在一些實施例中，初始第一擴增係在複數個分開的容器中進行，在每一分開容器中，第二TIL群體係獲自初始第一擴增步驟中的第一TIL群體，且第三TIL群體係獲自快速第二擴增步驟中的第二TIL群體，且其中獲自第三TIL群體之治療性TIL群體係自該複數個容器中之每一者中收集且經合併以產生經收集之TIL群體。
在一些實施例中，複數個分開的容器包括至少兩個分開的容器。
在一些實施例中，複數個分開的容器包括兩個至二十個分開的容器。
在一些實施例中，複數個分開的容器包括兩個至十個分開的容器。
在一些實施例中，複數個分開的容器包括兩個至五個分開的容器。
在一些實施例中，分開的容器各包括第一透氣表面區域。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟係在單一容器中進行。
在一些實施例中，單一容器包括第一透氣表面區域。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約4個細胞層之厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之第一容器中進行，且在快速第二擴增步驟中，快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之第二容器中進行。
在一些實施例中，第二容器大於第一容器。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約4個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，在各容器中對第一TIL群體進行初始第一擴增，在同一容器中對自該第一TIL群體產生之第二TIL群體進行快速第二擴增。
在一些實施例中，各容器包括第一透氣表面區域。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，APC係以約4個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，在各容器中對第一TIL群體進行初始第一擴增，該容器包括第一透氣表面區域，該細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且該等APC層疊至第一透氣表面區域上，且其中在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.1至約1:10之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.2至約1:8之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.3至約1:7之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.4至約1:6之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.5至約1:5之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.6至約1:4之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.7至約1:3.5之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.8至約1:3之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.9至約1:2.5之範圍。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率為約1:2。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中2天至3天之後，用另外的IL-2補充細胞培養基。
在一些實施例中，該方法進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存在收集治療性TIL群體之步驟中收集之TIL群體。
在一些實施例中，該方法進一步包括冷凍保存輸注袋之步驟。
在一些實施例中，使用1:1比率之經收集之TIL群體與冷凍保存培養基來進行冷凍保存過程。
在一些實施例中，抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，細胞培養基包括周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在初始第一擴增步驟中，細胞培養基中PBMC的總數為2.5×108
。
在一些實施例中，在快速第二擴增步驟中，細胞培養基中之抗原呈現細胞(APC)為周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在快速第二擴增步驟中添加至細胞培養基之PBMC的總數為5×108
。
在一些實施例中，抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，在收集治療性TIL群體之步驟中，收集係使用基於膜之細胞處理系統進行。
在一些實施例中，步驟(d)中之收集係使用LOVO細胞處理系統進行。
在一些實施例中，在初始第一擴增步驟中，多個片段包括每容器約60個片段，其中各片段之體積為約27 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由以下組成之群組的容器中：G容器及Xuri細胞袋。
在一些實施例中，在步驟(d)中2天至3天之後，用另外的IL-2補充細胞培養基。
在一些實施例中，IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，在將經收集之治療性TIL群體轉移至輸注袋之步驟中，輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包括二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之第一時段及快速第二擴增步驟中之第二時段各自個別地在5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之第一時段係在5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之第一時段係在8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，快速第二擴增步驟中之第二時段係在7天、8天或9天之時段內進行。
在一些實施例中，快速第二擴增步驟中之第二時段係在10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之第一時段及快速第二擴增步驟中之第二時段各自個別地在7天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之第一時段及快速第二擴增步驟中之第二時段各自個別地在11天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟係在約14天至約16天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟係在約15天至約16天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟係在約14天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟係在約15天之時段內進行。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟係在約16天之時段內進行。
在一些實施例中，該方法進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存經收集之治療性TIL群體的步驟，其中初始第一擴增步驟至收集治療性TIL群體之步驟及冷凍保存步驟係在16天內或少於16天內進行。
在一些實施例中，在收集治療性TIL群體之步驟中收集的治療性TIL群體包括足以用於TIL之治療有效劑量的TIL。
在一些實施例中，足以用於治療有效劑量的TIL之數目為約2.3×1010
至約13.7×1010
。
在一些實施例中，快速第二擴增步驟中的第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
在一些實施例中，快速第二擴增步驟中的第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自快速第二擴增步驟中的第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該初始第一擴增步驟中的第二TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，將來自收集治療性TIL群體之步驟的治療性TIL群體輸注至患者中。
在一些實施例中，該方法進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存包括經收集之TIL群體之輸注袋的步驟。
在一些實施例中，使用1:1比率之經收集之TIL群體與冷凍保存培養基來進行冷凍保存過程。
在一些實施例中，抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
在一些實施例中，抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，收集步驟係使用基於膜之細胞處理系統進行。
在一些實施例中，收集步驟係使用LOVO細胞處理系統進行。
在一些實施例中，多個片段包括約60個片段，且其中各片段之體積為約27 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由以下組成之群組的容器中：G容器及Xuri細胞袋。
在一些實施例中，IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，步驟(d)中之輸注袋為含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包括二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，其中冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
在一些實施例中，步驟(c)中之第一時段及第二時段各自個別地在5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，第一時段在5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，第二時段在10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，第一時段及第二時段各自個別地在7天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約22天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約21天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約20天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約19天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約18天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約17天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天至約16天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約15天至約16天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約14天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約15天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟均在約16天之時段內進行。
在一些實施例中，所有步驟及冷凍保存均在16天或少於16天內進行。
在一些實施例中，經收集之治療性TIL群體包括足以用於TIL之治療有效劑量的TIL。
在一些實施例中，足以用於治療有效劑量的TIL之數目為約2.3×1010
至約13.7×1010
。
在一些實施例中，初始第一擴增步驟中之容器大於快速第二擴增步驟中之容器。
在一些實施例中，第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
在一些實施例中，第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自第二細胞群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加之CD8及CD28表現。
在一些實施例中，經收集之TIL係輸注至患者中。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包括投予經擴增之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包括：
(a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；
(b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體；
(c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天，以獲得該第二TIL群體；
(d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中添加至該快速第二擴增之APC的數目係步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；
(e) 收集獲自步驟(c)之該治療性TIL群體；
(f) 將來自步驟(d)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋；及
(g) 向個體投予治療有效劑量之來自步驟(e)之TIL。
在一些實施例中，足以用於投予步驟(g)中之治療有效劑量的TIL之數目為約2.3×1010
至約13.7×1010
。
在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high、CD38lo、CD103high/lo、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。
在一些實施例中，單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。
在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。
在一些實施例中，抗原呈現細胞(APC)為PBMC。
在一些實施例中，在步驟(g)中投予治療有效劑量之TIL細胞之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱(fludarabine)五天。
在一些實施例中，該方法進一步包括以下步驟：始於步驟(g)中向個體投予TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療患者。
在一些實施例中，高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直至耐受為止。
在一些實施例中，步驟(c)中第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
在一些實施例中，步驟(d)中第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自第二TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加之CD8及CD28表現。
在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在一些實施例中，癌症為黑色素瘤。
在一些實施例中，癌症為HNSCC。
在一些實施例中，癌症為子宮頸癌。
在一些實施例中，癌症為NSCLC。
在一些實施例中，癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在一些實施例中，癌症為胃腸癌。
在一些實施例中，癌症為高突變癌症。
在一些實施例中，癌症為小兒高突變癌症。
在一些實施例中，初始第一擴增在第一容器中進行且快速第二擴增在第二容器中進行，且其中第一容器及第二容器中之每一者為GREX-10。
在一些實施例中，初始第一擴增在第一密閉容器中進行且快速第二擴增在第二密閉容器中進行，且其中第一密閉容器及第二密閉容器中之每一者包括GREX-100。
在一些實施例中，初始第一擴增在第一密閉容器中進行且快速第二擴增在第二密閉容器中進行，且其中第一密閉容器及第二密閉容器中之每一者包括GREX-500。
在一些實施例中，個體先前已用抗PD-1抗體治療。
在一些實施例中，個體先前未經抗PD-1抗體治療。
在一些實施例中，藉由使第一TIL群體與抗PD-1抗體接觸形成抗PD-1抗體與第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟。
在一些實施例中，抗PD-1抗體包括Fc區，其中在形成第一複合物之步驟之後且在分離第一複合物之步驟之前，該方法進一步包括以下步驟：使第一複合物與結合至抗PD-1抗體之Fc區的抗Fc抗體接觸形成抗Fc抗體與第一複合物之第二複合物，且其中分離第一複合物之步驟係藉由分離第二複合物進行。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係選自由以下組成之群組：EH12.2H7、PD1.3.1、SYM021、M1H4、A17188B、納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶(Bristol-Myers Squibb)；Opdivo®)、帕博利珠單抗(pembrolizumab) (蘭立珠單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，默克公司(Merck)；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實(ShangHai JunShi))、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(Pidilizumab)(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州(BeiGene))，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞(ShangHai HengRui))、人類單株抗體REGN2810(再生元(Regeneron))、人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)、人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司(Novartis))及RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell目錄號BP0146。
在一些實施例中，抗PD-1抗體為EH12.2H7。
在一些實施例中，抗PD-1抗體與納武單抗或帕博利珠單抗結合至不同抗原決定基。
在一些實施例中，抗PD-1抗體與EH12.2H7或納武單抗結合至同一抗原決定基。
在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗。
在一些實施例中，個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由使第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成第二抗PD-1抗體與第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟，且其中該第二抗PD-1抗體沒有被第一TIL群體上未經溶解之第一抗PD-1抗體阻斷與第一TIL群體的結合。
在一些實施例中，個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由使第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成第二抗PD-1抗體與第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟，且其中該第二抗PD-1抗體被第一TIL群體上未經溶解之第一抗PD-1抗體阻斷與第一TIL群體的結合。
在一些實施例中，第一抗PD-1抗體及第二抗PD-1抗體包括Fc區，其中在形成第一複合物之步驟之後且在分離第一複合物之步驟之前，該方法進一步包括以下步驟：使第一複合物與結合至第一抗PD-1抗體之Fc區及第二抗PD-1抗體之Fc區的抗Fc抗體接觸形成抗Fc抗體與第一複合物之第二複合物，且其中分離第一複合物之步驟係藉由分離第二複合物進行。
在一些實施例中，個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由以下對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟：(i)使第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成第二抗PD-1抗體與第一TIL群體的第一複合物，其中該第二抗PD-1抗體被第一TIL群體上未經溶解之第一抗PD-1抗體阻斷與PD-1陽性TIL的結合，其中第一抗PD-1抗體及第二抗PD-1抗體包括Fc區；(ii)使第一複合物與結合至第二抗PD-1抗體之Fc區的抗Fc抗體接觸形成抗Fc抗體與第一複合物之第二複合物且使第一TIL群體上未經溶解之第一抗PD-1抗體與抗Fc抗體接觸形成抗Fc抗體與第一TIL群體上未經溶解之第一抗PD-1抗體的第三複合物；及(iii)分離第二複合物及第三複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種由選自獲自患者之腫瘤組織樣本碎解物的PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性細胞製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中該治療性TIL群體提供增加之功效及/或增加之干擾素-γ產生。
在一些實施例中，治療性TIL群體提供增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，治療性TIL群體提供增加之功效。
在一些實施例中，治療性TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，治療性TIL群體相較於藉由長於16天至22天之過程製備之TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，對為其中至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟。
在一些實施例中，藉由以下步驟對為PD-1陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體進行初始第一擴增步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體。
在一些實施例中，第一TIL群體及PBMC群體兩者中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1中間TIL及PD-1陽性TIL的低、中及高強度水準。
在一些實施例中，FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
在一些實施例中，PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，為PD-1陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體的至少80%為PD-1陽性TIL，為LAG3陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體的至少80%為LAG3陽性TIL，為TIM3陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體的至少80%為TIM3陽性TIL，及/或為TIGIT陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體的至少80%為TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
(a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；
(b) 自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體，其中至少10%至80%之範圍的第一TIL群體為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL；
(c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體；
(d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中添加之APC的數目係步驟(c)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及
(f) 將來自步驟(e)之經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含PD-1之TIL群體。
在一些實施例中，第一群體與PBMC群體兩者中螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立低、中及高強度水準：
i)分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1低TIL、PD-1中間TIL及PD-1陽性TIL；
ii)分別對應於CD39陰性TIL、CD39低TIL、CD39中間TIL及CD39陽性TIL；
iii)分別對應於CD38陰性TIL、CD38低TIL、CD38中間TIL及CD38陽性TIL；
iv)分別對應於CD103陰性TIL、CD103低TIL、CD103中間TIL及CD103陽性TIL；
v)分別對應於CD101陰性TIL、CD101低TIL、CD101中間TIL及CD101陽性TIL；
vi)分別對應於LAG3陰性TIL、LAG3低TIL、LAG3中間TIL及LAG3陽性TIL；
vii)分別對應於TIM3陰性TIL、TIM3低TIL、TIM3中間TIL及TIM3陽性TIL；及/或
viii)分別對應於TIGIT陰性TIL、TIGIT低TIL、TIGIT中間TIL及TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
在一些實施例中，PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，至少80%之富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體為PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，第三TIL群體在容器包括至少約1×108
個TIL。
在一些實施例中，第三TIL群體在容器中包括至少約1×109
個TIL。
在一些實施例中，在初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約1×104
至約1×106
。
在一些實施例中，在初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約5×104
至約1×106
。
在一些實施例中，在初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約2×105
至約1×106
。
在一些實施例中，該方法進一步包括在進行步驟(a)之前冷凍保存來自個體所切除之腫瘤之第一TIL群體的步驟。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括：
(a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；
(b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體；
(c) 藉由在包括第一細胞培養基、IL-2及以下中任一者之第一TIL細胞培養物中培養該第一TIL群體來進行初始第一擴增：
i)獲自抗原呈現飼養細胞(APC)之第一培養物之第一培養物上清液，其中該第一培養物上清液包括OKT-3，或
ii)APC及OKT-3，
其中藉由在包括第一透氣表面區域之第一容器中培養該第一TIL細胞培養物持續約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段來進行該初始第一擴增，以獲得第二TIL群體，且其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體；
(d) 藉由將該第一TIL細胞培養物轉移至包括補充有第二細胞培養基、IL-2及以下中任一者之第二透氣表面區域之第二容器中來進行快速第二擴增：
i)獲自APC之第二培養物之第二培養物上清液，其中該第二培養物上清液包括OKT-3，或
ii)APC及OKT-3；
以形成第二TIL細胞培養物，其中藉由培養該第二TIL細胞培養物持續約1天至11天之第二時段來進行該快速第二擴增，以獲得第三TIL群體，且其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；其中該第一TIL細胞培養物不包括該第一培養物上清液及APC兩者；其中該第二TIL細胞培養物不包括該第二培養物上清液及補充APC兩者；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及
(f) 將來自步驟(e)之經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
在一些實施例中，在步驟(c)之初始第一擴增中，第一TIL細胞培養物包括第一培養物上清液，且其中在步驟(d)之快速第二擴增中，用OKT-3及APC補充第一TIL細胞培養物以形成第二TIL細胞培養物。
在一些實施例中，在步驟(c)之初始第一擴增中，第一TIL細胞培養物包括OKT-3及APC，且其中在步驟(d)之快速第二擴增中，用第二培養物上清液補充第一TIL細胞培養物以形成第二TIL細胞培養物。
在一些實施例中，在步驟(c)之初始第一擴增中，第一TIL細胞培養物包括第一培養物上清液，且其中在步驟(d)之快速第二擴增中，用第二培養物上清液補充第一TIL細胞培養物以形成第二TIL細胞培養物。
在一些實施例中，獲得用於步驟(c)之第一培養物上清液包括：
1)提供包括IL-2及OKT-3之APC細胞培養基；
2)在來自1)之該APC細胞培養基中培養至少約5×108
個APC持續約3至4天，以產生該第一培養物上清液；及
3)自2)中的細胞培養物收集第一培養物上清液。
在一些實施例中，獲得用於步驟(d)之第二培養物上清液包括：
1)提供包括IL-2及OKT-3之APC細胞培養基；
2)在來自1)的該APC細胞培養基中培養至少約1×107
個APC持續約3至4天，以產生該第二培養物上清液；及
3)自2)中的細胞培養物收集第二培養物上清液。
在一些實施例中，步驟(d)之快速第二擴增進一步包括以下步驟：
i)在步驟(d)中第二時段開始之後約3或4天，用另外的IL-2補充第二TIL細胞培養物。
在一些實施例中，APC對於個體為外源性的。
在一些實施例中，APC為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，步驟(d)之快速第二擴增進一步包括以下步驟：
i)在第二時段開始之後剛好或大約3或4天，將第二TIL細胞培養物自第二容器轉移至複數個第三容器中，以在複數個第三容器中之每一者中形成第二TIL細胞培養物的繼代培養物；及
ii)在第二時段之剩餘時間中，在複數個第三容器中之每一者中培養第二TIL細胞培養物之繼代培養物。
在一些實施例中，在步驟i)中，將等體積之第二TIL細胞培養物轉移至複數個第三容器中。
在一些實施例中，每個第三容器的大小與第二容器相等。
在一些實施例中，每個第三容器大於第二容器。
在一些實施例中，第三容器之大小相等。
在一些實施例中，第三容器大於第二容器。
在一些實施例中，第三容器小於第二容器。
在一些實施例中，第二容器為G-Rex 100M培養瓶。
在一些實施例中，第二容器為G-Rex 100M培養瓶且複數個第三容器中之每一者為G-Rex 100M培養瓶。
在一些實施例中，複數個第三容器選自由以下組成之群組：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20個第二容器。
在一些實施例中，複數個第二容器為2個第三容器。
在一些實施例中，在步驟ii)之前，該方法進一步包括用另外的IL-2補充第二TIL細胞培養物之各繼代培養物。
在一些實施例中，在步驟ii)之前，該方法進一步包括用第二細胞培養基及IL-2補充第二TIL細胞培養物之各繼代培養物。
在一些實施例中，第一細胞培養基與第二細胞培養基相同。
在一些實施例中，第一細胞培養基與第二細胞培養基不同。
在一些實施例中，第一細胞培養基為DM1且第二細胞培養基為DM2。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、CD38陽性(CD38+)及CD101陽性(CD101+)。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1high、LAG3high、CD38lo及CD101lo。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD38陽性(CD38+)。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1high、LAG3high及CD38lo。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD101陽性(CD101+)。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1high、LAG-3high及CD101lo。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)及CD38陽性(CD38+)。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1hi及CD38lo。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)及CD101陽性(CD101+)。
在一些實施例中，TIL經選擇為PD-1high及CD101lo。
在一些實施例中，選擇包括選自由以下組成之群組的選擇方法：流動式細胞測量術(包含例如FACS)、基於抗體之珠粒選擇及基於抗體之磁珠選擇。
在一些實施例中，選擇方法包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
在一些實施例中，選擇方法包括基於抗體之珠粒選擇。
在一些實施例中，選擇包括基於抗體之磁珠選擇。
在一些實施例中，選擇包括兩步選擇，其包括：
i)第一選擇步驟，其包括針對PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+進行選擇之方法，及
ii)第二選擇步驟，其包括針對CD38+及/或CD101+進行選擇之方法。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括針對PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh進行選擇之方法。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括針對PD-1high或LAG3high進行選擇之方法。
在一些實施例中，第二選擇步驟包括針對CD38lo及/或CD101lo進行選擇之方法。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)且其中第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇且其中第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括基於抗體之磁珠選擇，且其中第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
在一些實施例中，第一選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇或基於抗體之磁珠選擇，且第二選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇或基於抗體之磁珠選擇。
在一些實施例中，用於PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL之基於抗體之珠粒選擇的珠粒分別為抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒。
在一些實施例中，用於CD38+或CD101+ TIL之基於抗體之珠粒選擇的珠粒分別為抗CD38或抗CD101抗體結合珠粒。
在一些實施例中，用於PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL之基於抗體之磁珠選擇的珠粒分別為抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合磁珠。
在一些實施例中，用於CD38+或CD101+ TIL之基於抗體之磁珠選擇的珠粒分別為抗CD38或抗CD101抗體結合磁珠。
在一些實施例中，PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL分別與抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合，且PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陰性TIL分別不與抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合。
在一些實施例中，對自獲自患者或個體之腫瘤樣本碎解物選擇或富集的第一TIL群體進行初始第一擴增步驟。
在一些實施例中，用酶混合物進行碎解。
在一些實施例中，酶混合物包括中性蛋白酶、膠原蛋白酶及DNA酶。
序列表的簡要說明
SEQ ID NO: 1為莫羅單抗(muromonab)之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 2為莫羅單抗之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 3為重組人類IL-2蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 4為阿地介白素之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5為重組人類IL-4蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6為重組人類IL-7蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7為重組人類IL-15蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8為重組人類IL-21蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：9為人類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO：10為鼠類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 11為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab)(PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO: 12為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO: 13為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 14為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 15為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 16為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 17為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 18為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 19為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 20為4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 21為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab)(BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO: 22為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO: 23為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 24為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 25為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 26為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 27為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 28為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 29為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 30為4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 31為TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域。
SEQ ID NO: 32為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 33為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 34為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 35為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 36為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 37為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 38為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 39為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 40為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 41為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 42為TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域。
SEQ ID NO: 43為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 44為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 45為TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO: 46為4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO: 47為4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO: 48為4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 49為4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 50為4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 51為4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 52為4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 53為4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 54為人類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 55為鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 56為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO: 57為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO: 58為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 59為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 60為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 61為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 62為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 63為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 64為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 65為OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 66為OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO: 67為OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO: 68為OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 69為OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 70為OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 71為OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 72為OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 73為OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 74為OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 75為OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 76為OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO: 77為OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO: 78為OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 79為OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 80為OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 81為OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 82為OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 83為OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 84為OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 85為OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 86為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 87為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 88為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 89為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 90為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 91為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 92為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 93為OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 94為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 95為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 96為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO: 97為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO: 98為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO: 99為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO: 100為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO: 101為OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO: 102為OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO: 103為OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO: 104為OX40L多肽之替代性可溶性部分。
SEQ ID NO: 105為OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 106為OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 107為OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 108為OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 109為OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 110為OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 111為OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 112為OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 113為OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 114為OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 115為OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 116為OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 117為人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 118為人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 119為人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 120為人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 121為人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 122為人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 123為人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 124為人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO: 125為OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO: 126為OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO：127-462當前未分配。
SEQ ID NO: 463為PD-1抑制劑納武單抗之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO: 464為PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO: 465為PD-1抑制劑納武單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：466為PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：467為PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：468為PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：469為PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：470為PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：471為PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：472為PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：473為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：474為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：475為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：476為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：477為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：478為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：479為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：480為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：481為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：482為PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：483為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗(durvalumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：484為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：485為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：486為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：487為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：488為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：489為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：490為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：491為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：492為PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：493為PD-L1抑制劑阿維魯單抗(avelumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：494為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：495為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：496為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：497為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：498為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：499為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：500為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：501為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：502為PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：503為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗(atezolizumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：504為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：505為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：506為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：507為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：508為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：509為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：510為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：511為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：512為PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：513為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗(ipilimumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：514為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：515為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：516為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：517為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：518為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：519為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：520為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：521為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：522為CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：523為CTLA-4抑制劑曲美單抗(tremelimumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：524為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：525為CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：526為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：527為CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：528為CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：529為CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：530為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：531為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：532為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：533為CTLA-4抑制劑紮來昔單抗之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：534為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO：535為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗(zalifrelimab)之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO：536為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO：537為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：538為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：539為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：540為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO：541為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO：542為CTLA-4抑制劑澤氟利單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO：543為IL-2序列。
SEQ ID NO：544為IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO：545為IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO：546為IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO：547為IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO：548為IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO：549為IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 kabat。
SEQ ID NO：550為IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO：551為IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO：552為IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 clothia。
SEQ ID NO：553為IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO：554為IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO：555為IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 IMGT。
SEQ ID NO：556為IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO：557為IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO：558為IgG.IL2R67A.H1的VH鏈。
SEQ ID NO：559為IgG.IL2R67A.H1之重鏈。
SEQ ID NO：560為IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO：561為IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO：562為IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO：563為IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO：564為IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO：565為IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO：566為VL鏈。
SEQ ID NO：567為輕鏈。
SEQ ID NO：568為輕鏈。
SEQ ID NO：569為輕鏈。
I. 定義
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的含義相同的含義。本文所提及之所有專利及公開案均以全文引用的方式併入本文中。
術語「活體內」係指發生於個體體內之事件。
術語「活體外」係指發生於個體體外之事件。活體外分析涵蓋採用活細胞或死細胞的基於細胞之分析，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞之分析。
術語「離體」係指涉及對已自個體身體移除的細胞、組織及/或器官進行治療或執行程序的事件。適當地，細胞、組織及/或器官可利用手術或治療方法返回至個體體內。
術語「快速擴增」意謂抗原特異性TIL之數目在一週時間內增加至少約3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更佳地在一週時間內增加至少約10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最佳在一週時間內增加至少約100倍。下文概述多個快速擴增方案。
本文中「腫瘤浸潤性淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包含(但不限於)CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包含初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」係如本文所概述之獲自患者組織樣本的TIL(有時稱為「新鮮獲得」或「新鮮分離」)，且「繼代TIL」係任何如本文所論述之經擴增或增殖的TIL細胞群體，包含(但不限於)主體TIL(bulk TIL)及經擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞群體可包含經遺傳修飾之TIL。
本文中之「細胞群體」(包含TIL)意指許多具有共同特質之細胞。一般而言，群體數目在1×106
至1×1010
之範圍內，其中不同的TIL群體包括不同數目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生長產生大約1×108
個細胞之主體TIL群體。一般進行REP擴增以提供1.5×109
至1.5×1010
個細胞群體用於輸注。
本文中「冷凍保存之TIL」意謂在約-150℃至-60℃之範圍內處理且儲存TIL，無論係初代的、主體的或經擴增的(REP TIL)。用於冷凍保存之通用方法亦描述於本文別處，包含在實例中描述。為了清楚起見，「冷凍保存之TIL」可與可用作初代TIL來源之冷凍組織樣本區分。
本文中「解凍之冷凍保存之TIL」意謂先前經冷凍保存且隨後處理以恢復至室溫或更高溫度(包含但不限於細胞培養溫度或可向患者投予TIL之溫度)的TIL群體。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標誌中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。
術語「冷凍保存培養基(cryopreservation media/cryopreservation medium)」係指可用於冷凍保存細胞之任何培養基。此類培養基可包含包括7%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包含CryoStor CS10、HypoThermosol以及其組合。術語「CS10」係指獲自幹細胞科技公司(Stemcell Technologies)或Biolife Solutions之冷凍保存培養基。CS10培養基可以商品名「CryoStor®CS10」來指代。CS10培養基為包括DMSO之無血清、無動物成分的培養基。
術語「中央記憶T細胞」係指在人類中為CD45R0+且組成性表現CCR7(CCR7hi
)及CD62L(CD62hi
)之T細胞子集。中央記憶T細胞之表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發之後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞主要存在於血液的CD4隔室中，且在人類中按比例富集於淋巴結及扁桃體中。
術語「效應記憶T細胞」係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如中央記憶T細胞，為CD45R0+，但已經失去對CCR7的組成性表現(CCR7lo
)並且對於CD62L表現而言為異質的或低的(CD62Llo
)。中央記憶T細胞的表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激之後快速分泌高含量發炎性細胞介素，包含干擾素-γ、IL4-及IL-5。效應記憶T細胞主要存在於血液的CD8隔室中，且在人類中按比例富集於肺、肝臟及腸道中。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
術語「密閉系統」係指對外部環境密閉之系統。適用於細胞培養方法之任何密閉系統均可用於本發明之方法。密閉系統包含例如(但不限於)密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統中，該系統不對外部環境開放，直至TIL準備好向患者投予為止。
如本文所用，術語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞之過程，包含機械碎斷方法，諸如壓碎、切片、分割及粉碎腫瘤組織，以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構的方法。
術語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之周邊血液細胞，包含淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC為一種類型之抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞較佳地係經照射之同種異體周邊血液單核細胞。
術語「周邊血液淋巴球」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施例中，PBL係與來自供體之全血或血球分離術產物分離。在一些實施例中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+ CD45+之T細胞表型)而與來自供體之全血或血球分離術產物分離。
術語「抗CD3抗體」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的抗體或其變體，例如單株抗體，且包含人類、人源化、嵌合、鼠類或哺乳動物抗體。抗CD3抗體包含OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包含UHCT1選殖株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包含例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizuma)及維西珠單抗(visilizumab)。
術語「OKT-3」(在本文中亦被稱作「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的單株抗體或其生物類似物或變體，包含人類、人源化、嵌合或鼠類抗體，且包含市售形式，諸如OKT-3(30 ng/mL，MACS GMP CD3純，美國加利福尼亞州聖地亞哥美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotech,Inc , San Diego, CA, USA))及莫羅單抗或其變體、保守胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2)。能夠產生OKT-3之融合瘤寄存於美國菌種保藏中心(美國菌種保藏中心)且所指派之ATCC寄存號為CRL 8001。能夠產生OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)且所指派之目錄號為86022706。
術語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-2係描述於例如Nelson的《免疫學雜志(J . Immunol
.)》2004, 172,
3983-88及Malek, 《免疫學年度評論(Annu. Rev. Immunol.
)》2008, 26,
453-79，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 3)。舉例而言，術語IL-2涵蓋人類重組形式之IL2，諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)以及由美國新罕布什爾州次茅斯的CellGenix, Inc.或美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他商業等效物。阿地介白素(去丙胺醯基-1，絲胺酸-125人類IL-2)為分子量大約15 kDa之非糖基化人類重組形式的IL-2。適用於本發明之阿地介白素之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 4)。術語IL-2亦涵蓋如本文所描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包含聚乙二醇化IL2前藥貝培阿地介白素(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如同SEQ ID NO: 4之聚乙二醇化人類重組IL-2，其中平均6個離胺酸殘基係經[(2,7-雙{[甲基聚(氧乙烯)]胺基甲醯基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基取代的N6
)，其可購自美國加利福尼亞州南舊金山的Nektar Therapeutics，或可藉由本領域中已知之方法製備，諸如國際專利申請公開案第WO 2018/132496 A1號之實例19中描述之方法或美國專利申請公開案第US 2019/0275133 A1號之實例1中描述之方法，該等公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之貝培阿地介白素(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL2分子描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案第WO 2012/065086 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的結合IL-2描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4,902,502號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，適合用於本發明之IL-2形式為可購自Synthorx,Inc.之THOR-707。THOR-707及適用於本發明之另外替代形式之IL-2的製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2020/0181220 A1號及第US 2020/ 0330601 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為介白素2(IL-2)結合物，其包括：分離及純化之IL-2多肽；及在選自以下之胺基酸位置結合至分離及純化之IL-2多肽的結合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107，其中胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自R38及K64。在一些實施例中，胺基酸位置選自E61、E62及E68。在一些實施例中，胺基酸位置在E62。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成離胺酸、半胱胺酸或組胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成離胺酸。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包括N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-離胺酸(PraK)、BCN-L-離胺酸、降冰片烯離胺酸、TCO-離胺酸、甲基四嗪離胺酸、烯丙氧基羰基離胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、2-胺基-8-側氧基辛酸、對乙醯基-L-苯丙胺酸、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)、對碘-L-苯丙胺酸、間乙醯基苯丙胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、對炔丙基氧基苯丙胺酸、對炔丙基-苯丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對溴苯基丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、O-烯丙基酪胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、膦醯基酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、L-磷絲胺酸、膦醯基絲胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、2-胺基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-側氧基丙基)胺基)乙基)硒烷基)丙酸、2-胺基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱胺酸。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，IL-2結合物與IL-2受體α(IL-2Rα)次單元之親和力降低。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係與IL-2Rα之結合親和力降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大於99%。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些實施例中，結合部分削弱或阻斷IL-2與IL-2Rα之結合。在一些實施例中，結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，另外的結合部分包含水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯嗎啉)或其組合。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包括PEG。在一些實施例中，PEG為線性PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包括多醣。在一些實施例中，多醣包括聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包括聚醣。在一些實施例中，水溶性聚合物各獨立地包括多元胺。在一些實施例中，結合部分包括蛋白質。在一些實施例中，另外的結合部分包括蛋白質。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包括白蛋白、轉鐵蛋白(transferrin)或運甲狀腺素蛋白(transthyretin)。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包括Fc部分。在一些實施例中，蛋白質各獨立地包括IgG之Fc部分。在一些實施例中，結合部分包括多肽。在一些實施例中，另外的結合部分包括多肽。在一些實施例中，多肽各獨立地包括XTEN肽、富甘胺酸高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白質(GLK)聚合物。在一些實施例中，分離及純化之IL-2多肽藉由麩胺醯化修飾。在一些實施例中，結合部分直接結合至分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，結合部分經由連接子間接結合至分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，連接子包括同型雙官能連接子。在一些實施例中，同型雙官能連接子包括羅曼特氏試劑(Lomant's reagent)二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代雙(丙酸磺基琥珀醯亞胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、糖基雙(琥珀醯亞胺基丁二酸)伸乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二琥珀醯亞胺酯(DSC)、二亞胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代雙丙醯亞胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB)(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、己二酸二醯肼、碳醯肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基聯苯、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，連接子包括異型雙官能連接子。在一些實施例中，異型雙官能連接子包括3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(sIAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝苯酯(NPIA)、羰基反應性及硫氫基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8(M2
C2
H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮水楊酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-疊氮柳基醯胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對疊氮柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-疊氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-疊氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸對硝苯酯(ρNPDP)、對硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對疊氮苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，連接子包括可裂解連接子，視情況包括二肽連接子。在一些實施例中，二肽連接子包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，連接子包括不可裂解連接子。在一些實施例中，連接子包括順丁烯二醯亞胺基，視情況包括順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些實施例中，連接子進一步包括間隔子。在一些實施例中，間隔子包括對胺基苯甲基醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，另外的結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為本文所描述之任一種IL-2形式的片段。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係如美國專利申請公開案US 2020/0181220 A1號及美國專利申請公開案US 2020/0330601 A1號中所揭示般聚乙二醇化。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO：5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，IL-2多肽包括相對於SEQ ID NO: 5之一個殘基的N端缺失。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式缺乏IL-2R α鏈接合，但保持與中間親和力IL-2R β-γ傳訊複合物的正常結合。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO：5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO: 5具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO：5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO: 5具有至少98%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO：570中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。
在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式之內維介白素α(nemvaleukin nemvaleukin)(亦稱為ALKS-4230(SEQ ID NO: 571)，其購自阿爾凱默斯公司(Alkermes, Inc.))。內維介白素α亦被稱為人類介白素2片段(1-59)變體(Cys125
＞Ser51
)，其經由肽基連接子(60
GG61
)融合至人類介白素2片段(62-132)，經由肽基連接子(133
GSGGGS138
)融合至人類介白素2受體α鏈片段(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，經糖基化；人類介白素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125
(51)＞Ser]-突變體(1-59)，其經由G2
肽連接子(60-61)融合至人類介白素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且經由GSG3
S肽連接子(133-138)融合至人類介白素2受體α鏈(IL2R次單位α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，糖化形式α。內維介白素α之胺基酸序列係SEQ ID NO: 571中所載。在一些實施例中，內維介白素α展現以下轉譯後修飾：在以下位置處之雙硫鍵：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO: 571中之編號)，及使用SEQ ID NO: 571中之編號在位置N187、N206、T212處之糖基化位點。內維介白素α以及適用於本發明之另外替代形式的IL-2之製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2021/0038684 A1號及美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為與SEQ ID NO: 571具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式具有SEQ ID NO: 571中所載之胺基酸序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括SEQ ID NO: 572之胺基酸24-452或其變體、片段或衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括與SEQ ID NO: 572之胺基酸24-452或其變體、片段或衍生物具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之胺基酸序列的融合蛋白。適合用於本發明之其他IL-2形式描述於美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。視情況，在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括第一融合搭配物之融合蛋白，該第一融合搭配物藉由黏蛋白域多肽連接子與第二融合搭配物連接，其中該第一融合搭配物為IL-1Rα或與IL-1Rα具有至少98%胺基酸序列一致性並且具有IL-Rα的受體拮抗劑活性的蛋白質，並且其中該第二融合搭配物包括全部或部分包括Fc區的免疫球蛋白，其中該黏蛋白域多肽連接子包括SEQ ID NO：573或與SEQ ID NO：573具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，並且其中融合蛋白的半衰期與第一融合搭配物在沒有黏蛋白域多肽連接子的情況下與第二融合搭配物的融合相比有所改良。
在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式包含抗體細胞介素移植蛋白，該抗體細胞介素移植蛋白包括：重鏈可變區(VH
)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL
)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH
或VL
之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH
)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL
)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH
或VL
之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括投予美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中所描述之抗體，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括：重鏈可變區(VH)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH
或VL
之CDR中；其中該IL-2分子為突變蛋白(mutein)，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞，並且其中該抗體進一步包括IgG類重鏈及IgG類輕鏈，其選自由以下組成之群組：包括SEQ ID NO: 569之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 568之IgG類重鏈；包括SEQ ID NO: 567之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO:559之IgG類重鏈；包括SEQ ID NO: 569之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 559之IgG類重鏈；以及包括SEQ ID NO: 37之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 568之IgG類重鏈。
在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VH
之HCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VH
之HCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VH
之HCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VL
之LCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VL
之LCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至VL
之LCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。
IL-2分子之插入可在CDR之N端區處或附近，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL2序列不會將CDR序列框移。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL-2序列置換CDR序列之全部或一部分。IL-2分子置換可在CDR之N端區處，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。IL-2分子置換可少至CDR序列或整個CDR序列之一或兩個胺基酸。
在一些實施例中，IL-2分子直接移植至無肽連接子之CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間沒有另外的胺基酸。在一些實施例中，IL-2分子間接移植至具有肽連接子之CDR中，其中CDR序列與IL-2序列之間存在一個或多個另外的胺基酸。
在一些實施例中，本文所描述之IL-2分子為IL-2突變蛋白。在一些情況下，IL-2突變蛋白包括R67A取代。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括胺基酸序列SEQ ID NO：544或SEQ ID NO：545。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中表1中的胺基酸序列，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文。
在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由SEQ ID NO: 546、SEQ ID NO: 549、SEQ ID NO: 552及SEQ ID NO: 555組成之群組的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包括選自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 543及SEQ ID NO: 546組成之群組的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括HCDR1，其選自由以下組成之群組：選自由SEQ ID NO: 547、SEQ ID NO: 550、SEQ ID NO: 553及SEQ ID NO: 556組成之群組的HCDR2。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由SEQ ID NO: 548、SEQ ID NO: 551、SEQ ID NO: 554及SEQ ID NO: 557組成之群組的HCDR3。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括VH
區，其包括SEQ ID NO:558之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈，其包括SEQ ID NO: 559之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括VL
區，其包括SEQ ID NO: 566之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括輕鏈，其包括SEQ ID NO: 567之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括VH
區，其包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列；及VL
區，其包括SEQ ID NO: 566之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 559之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 567之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 559之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 569之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 568之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 567之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 568之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 569之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其變體、衍生物或片段，或其保守胺基酸取代，或與其具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白之抗體組分包括帕利珠單抗之免疫球蛋白序列、構架序列或CDR序列。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地介白素或可比分子)長。
術語「IL-4」(在本文中亦稱「IL4」)係指被稱為介白素4之細胞介素，其由Th2 T細胞及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish，《呼吸研究(Respir. Res.
)》2001, 2,
66-70。在由IL-4活化後，Th2 T細胞隨後以正回饋迴路產生另外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖及II類MHC表現，且誘導來自B細胞之類別轉換至IgE及IgG1表現。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-211)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc.)(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 5)。
術「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化的組織衍生性細胞介素，其可獲自基質及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall，
《血液(Blood
)》2002 ， 99 ， 3892-904
。IL-7可以刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(一種由IL-7受體α及共同γ鏈受體組成之異二聚體)結合，其屬於對於T細胞在胸腺內之發育及在周邊內之存活而言重要之一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-254)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 6)。
術語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri的《血液》2001
, 97, 14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人類IL-15為 分子質量為12.8 kDa的含有114個胺基酸(及N端甲硫胺酸)的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-15可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-230-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 7)。
術語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白，且包含所有形式之IL-21，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard，《自然綜述：藥物發現(Nat. Rev. Drug.Disc.
)》2014, 13,
379-95，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-21主要藉由自然殺手T細胞及經活化之人類CD4+
T細胞產生。重組人類IL-21為分子質量為15.4 kDa之含有132個胺基酸的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-21可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-408-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，本發明組成物待投予的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病狀的個別差異來確定。通常說明本文所描述之包括腫瘤浸潤性淋巴球(例如繼代TIL或遺傳修飾之細胞毒性淋巴球)的醫藥組成物可以104
至1011
細胞/公斤體重(例如，105
至106
、105
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、105
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、108
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至1011
或109
至1010
細胞/公斤體重)的劑量投予，包含在彼等範圍內之所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴球(在一些情況下包含經遺傳修飾之細胞毒性淋巴球)組成物亦可以此等劑量多次投予。腫瘤浸潤性淋巴球(在一些情況下，包含基因上的)可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術進行投予(參見例如Rosenberg等人，《新英格蘭醫學雜誌(New Eng. J. of Med.
)》319: 1676, 1988)。特定患者之最佳劑量及治療方案可容易由所屬醫藥領域的技術人員藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整治療來確定。
術語「血液惡性病(hematological malignancy/ hematologic malignancy)」或有相關意義之術語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包含但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包含(但不限於)急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。術語「B細胞惡性血液病」係指影響B細胞之血液惡性病。
術語「實體腫瘤」係指通常不含囊腫或液體區域的異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。術語「實體腫瘤癌症」係指惡性、贅生性或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌症包含(但不限於)肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實體腫瘤之組織結構包含相互相依組織隔室，包含實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支援性微環境之支援性基質細胞。
術語「液體腫瘤」係指性質上為流體的異常細胞團塊。液體腫瘤癌症包含(但不限於)白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤之TIL在本文中亦可稱為骨髓浸潤性淋巴球(MIL)。獲自液體腫瘤(包含在周邊血液中循環之液體腫瘤)之TIL在本文中亦可稱為PBL。術語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且僅基於衍生細胞之組織類型而有所不同。
如本文所用，術語「微環境」可指作為整體之實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所用，腫瘤微環境係指以下之複雜混合物：「促進贅生性轉化、支援腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移茁壯成長之生態棲位(niche)之細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械信號」，如Swartz等人，《癌症研究(Cancer Res.
)》,2012
,72
, 2473中所描述。儘管腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但由於微環境之免疫抑制，免疫系統清除腫瘤的情況係罕見的。
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，可提供TIL群體，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27至23天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第27至25天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)，然後氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第25至23天)。在一些實施例中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2的靜脈內輸注以達到生理耐受。
實驗發現表明，在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗盡藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(「細胞介素庫」)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之rTIL之前在患者身上採用淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。
如本文所用，術語「共同投予(co-administration/co-administering)」、「與…組合投予(administered in combination with/administering in combination with)」、「同時(simultaneous)」及「併發(concurrent)」涵蓋向個體投予兩種或更多種活性醫藥成分(在本發明之一較佳實施例中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)，以使得活性醫藥成分及/或其代謝物兩者同時存在於個體中。共同投予包含以分開的組成物同時投給予、以分開的組成物在不同時間投予或以其中存在兩種或更多種活性醫藥成分之組成物之形式投予。以分開的組成物同時投予及以其中存在兩種試劑之組成物之形式投予為較佳的。
術語「有效量」或「治療有效量」係指如本文所描述之化合物或化合物組合之量，其足以實現所預期應用，包含但不限於疾病治療。治療有效量可視預期應用(活體外或活體內)或所治療之個體及疾病病狀(例如，個體之體重、年齡及性別)、疾病病狀之嚴重程度或投給、予方式而變化。該術語亦適用於將誘發目標細胞中之特定反應(例如血小板黏附及/或細胞遷移減少)之劑量。特定劑量將視以下而變化：所選特定化合物、所依循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時序、其所投予之組織及其中攜帶化合物之物理遞送系統。
術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病之任何治療，且包含：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即促使疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送試劑以便提供藥理學效應，即使在不存在疾病或病狀之情況下亦如此。舉例而言，「治療」涵蓋可在不存在疾病病狀之情況下(例如在疫苗之情況下)引發免疫反應或賦予免疫性的組成物之遞送。
當參考核酸或蛋白質之部分使用時，術語「異源」指示核酸或蛋白質包括兩個或更多個在自然界中發現彼此之間沒有相同關係的子序列。舉例而言，通常以重組方式產生核酸，其具有兩個或更多個來自無關基因的經佈置以製造新的功能性核酸序列的序列，例如來自一個來源之啟動子及來自另一來源之編碼區或來自不同來源之編碼區。類似地，異源蛋白指示蛋白質包括兩個或更多個在自然界中未發現彼此呈相同關係之子序列(例如融合蛋白)。
在兩個或更多個核酸或多肽之上下文中，術語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義詞，例如「99%一致」)係指兩個或更多個序列或子序列在進行比較及排比(需要時引入間隔)以達到最大對應性且不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之部分時，該兩個或更多個序列或子序列係相同的或具有相同的特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。所屬領域中已知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比的各種演算法及軟體。用以判定序列一致性百分比之適合的程式包含例如可購自美國政府的國家生物技術資訊中心(U.S. Government's National Center for Biotechnology Information)BLAST網站之BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美國加利福尼亞州南舊金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可購自DNASTAR)係另外的可用於排比序列之可供大眾使用的軟體程式。本領域中熟習此項技術者可以藉由特定的比對軟體來判定用於最大比對的適當參數。在某些實施例中，使用排比軟體的預設參數。
如本文所用，術語「變體」涵蓋(但不限於)包括與參考抗體之胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白，不同之處在於在參考抗體之胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一個或多個取代、缺失及/或添加。與參考抗體之胺基酸序列相比，變體可以在其胺基酸序列中包括一個或多個保守取代。保守取代可涉及例如類似帶電或不帶電胺基酸之取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。術語變體亦包含聚乙二醇化抗體或蛋白質。
本文中「腫瘤浸潤性淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包含(但不限於)CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包含初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」係如本文所概述之獲自患者組織樣本的TIL(有時稱為「新鮮獲得」或「新鮮分離」)，且「繼代TIL」係任何如本文所論述之經擴增或增殖的TIL細胞群體，包含(但不限於)主體TIL及經擴增之TIL(「REP TIL」)以及「reREP TIL」)。reREP TIL可包含例如第二經擴增TIL或第二另外的經擴增TIL(諸如例如於圖27之步驟D中描述的TIL，包含稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標誌中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。TIL可進一步藉由效力表徵 - 例如若例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可視為強效的。若例如干擾素(IFNγ)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL、大於約300 pg/mL、大於約400 pg/mL、大於約500 pg/mL、大於約600 pg/mL、大於約700 pg/mL、大於約800 pg/mL、大於約900 pg/mL、大於約1000 pg/mL，則TIL可視為強效的。
術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包含任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑，以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途為本領域中所熟知的。除非任何習知醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則考慮其在本發明之治療組成物中之用途。諸如其他藥物之另外活性醫藥成分亦可併入所描述之組成物及方法中。
術語「約」或「大約」意指在值之統計學上有意義的範圍內。此範圍可在既定值或範圍之一數量級內，較佳地50%內，更佳地20%內，再更佳地10%內，且甚至更佳地5%內。由術語「約」或「大約」涵蓋之允許差異取決於研究下之特定系統，且可由所屬領域中具有通常知識者容易地理解。此外，如本文所用，術語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量(quantity)及特徵並不精確且不需要精確，而是可以視需要為近似值及/或較大或較小的，反映出公差、轉換因子、四捨五入、量測誤差等，以及本領域中熟習此項技術者已知的其他因素。一般而言，無論是否如此明確說明，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」的。應注意，大小、形狀及尺寸非常不同之實施例可採用所描述之佈置。
當以原始及修改形式用於所附申請專利範圍中時，過渡術語「包括(comprising)」、「基本上由…組成(consisting essentially of)」及「由…組成(consisting of)」相對於哪些未敍述之另外的請求項要素或步驟(若存在)被排除在申請專利範圍之範疇之外來定義請求項範疇。術語「包括」意欲為包括性的或開放性的，且不排除任何另外的、未敍述之要素、方法、步驟或材料。術語「由…組成」不包括除申請專利範圍中指定之要素、步驟或材料以外的任何要素、步驟或材料，且在後一情況中排除與指定材料一般相關之雜質。術語「基本上由…組成」將請求項之範疇限於所指定要素、步驟或材料及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的要素、步驟或材料。在替代實施例中，本文所描述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可由任何過渡術語「包括」、「基本上由…組成」及「由…組成」更具體地定義。
術語「PD-1高」或「PD-1high」或「PD-1high
」係指細胞(諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴球或T細胞)相對於來自健康個體之對照細胞的高PD-1蛋白質表現量。在一些實施例中，使用本領域中熟習此項技術者已知的用於量測存在於細胞上之蛋白質含量的標準方法(諸如流動式細胞測量術、螢光活化細胞分選(FACS)、免疫細胞化學等)測定PD-1表現量。在一些情況下，與來自健康個體之免疫細胞相比，PD1高TIL表現更高含量之PD-1。在一些情況下，與來自健康個體或一群健康個體之免疫細胞(例如周邊血液單核細胞)群體，PD-1高TIL群體表現更高含量之PD-1。PD-1high細胞可以稱為PD-1明亮細胞。
術語「PD-1中間」或「PD-1int」或「PD-1int
」係指細胞(諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴球或T細胞)相對於來自健康個體之對照細胞的中間或中等的PD-1蛋白質表現量。舉例而言，PD-1int T細胞所表現之PD-1蛋白質的量或範圍係類似於或實質上相當於來自健康個體之對照細胞(例如周邊血液單核細胞)所表現之PD-1蛋白質的最高範圍。換言之，PD-1int TIL具有的PD-1表現量類似於或實質上相當於來自健康個體之對照免疫細胞的PD-1表現背景量。PD-1int細胞可以稱為PD-1暗淡(dim)細胞。本領域中熟習此項技術者認識到PD-1陽性TIL可以為PD-1high TIL或PD-1int TIL。
術語「PD-1陰性(PD-1 negative)」或「PD-1neg」或「PD-1neg
」係指細胞(諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴球或T細胞)相對於來自健康個體之對照細胞的陰性或低PD-1蛋白質表現量。例如，PD-1neg T細胞不表現PD-1蛋白質。在一些情況下，PD-1neg T細胞所表現之PD-1蛋白質的量係類似於或實質上相當於來自健康個體之對照細胞(例如周邊血液單核細胞)所表現之PD-1蛋白質的最低量。PD-1neg淋巴球可以與對照群體中之大部分淋巴球相同之量或範圍表現PD-1。
PD-1high、PD-1int及PD-1neg TIL係根據本文所描述之方法經離體擴增之獨特且不同的TIL子集。在一些實施例中，經離體擴增之TIL群體包括PD-1high TIL、PD-1int TIL及PD-1neg TIL。II. TIL 製造過程 (Gen 3 過程之實施例，視情況包含確定培養基 )
除本文所描述之方法以外，國際申請案第PCT/US2019/059716號出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。在不受任何特定理論限制的情況下，咸信如本發明方法中所描述之起動T細胞活化的初始第一擴增及隨後的加強T細胞活化的快速第二擴增，允許製備保留「較年輕」表型之經擴增T細胞，且因此預期本發明之經擴增T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞可對癌細胞展現較高細胞毒性。特定言之，咸信如本發明方法所教示之藉由暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及視情況選用之抗原呈現細胞(APC)來起動T細胞之活化且接著藉由後續暴露於另外的抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC來加強，其限制或避免培養基中之T細胞的成熟，從而產生具有較不成熟表型之T細胞群體，該等T細胞因培養擴增而耗竭較少且對癌細胞展現較高細胞毒性。在一些實施例中，快速第二擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大(scaling up)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小規模培養中培養T細胞約3天至4天之時段來進行快速第二擴增；且接著(b)實現將小規模培養中的T細胞轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)並且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的T細胞約4天至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大(scaling out)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小規模培養中培養T細胞約3天至4天之時段來進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自第一小規模培養的T細胞轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養的T細胞部分係於第二小規模培養中培養約4天至7天之時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小規模培養中培養T細胞約3天至4天之時段來進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養中的T細胞轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約4天至7天之時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小規模培養中培養T細胞約3天至4天之時段來進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養中的T細胞轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至此類第二容器的來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約5天之時段。
在一些實施例中，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增所實現之T細胞活化開始降低、趨緩、衰退或消退之後進行。
在一些情況下，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增實現之T細胞活化已降低剛好或大約(at or about)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後進行。
在一些實施例中，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增所實現之T細胞活化已降低剛好或大約1%至100%之範圍中的百分比之後進行。
在一些實施例中，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增實現之T細胞活化已降低剛好或大約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%之範圍中之百分比之後進行。
在一些實施例中，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增實現之T細胞活化已降低在至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之後進行。
在一些情況下，快速第二擴增係在藉由初始第一擴增實現之T細胞活化已降低剛好或大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後進行。
在一些實施例中，藉由初始第一擴增實現之T細胞活化之降低係藉由T細胞回應於抗原刺激而釋放之干擾素γ之量的減少來判定。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於至多剛好或大約7天或大約8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於至多剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二擴增係於至多剛好或大約11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二擴增係於至多剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於在處於或約1天至處於或約7天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係在處於或約1天至處於或約11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於至多剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係於至多剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於在處於或約1天至處於或約8天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係在處於或約1天至處於或約9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係在8天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係在9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係於在處於或約1天至處於或約7天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係在處於或約1天至處於或約9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一擴增係在7天之時段內進行且T細胞之快速第二擴增係在9天之時段內進行。
在某些實施例中，T細胞為腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)。
在一些實施例中，T細胞為骨髓浸潤性淋巴球(MIL)。
在一些實施例中，T細胞為周邊血液淋巴球(PBL)。
在一些實施例中，T細胞獲自罹患癌症之供體。
在一些實施例中，T細胞為獲自罹患癌症之患者所切除之腫瘤的TIL。
在一些實施例中，T細胞為獲自罹患血液惡性病之患者之骨髓的MIL。
在一些實施例中，T細胞為獲自供體之周邊血液單核細胞(PBMC)的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可使用本領域中熟習此項技術者已知之任何數目之技術(諸如FICOLL分離)自收集自個體之血液單元獲得。在一個較佳態樣中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。血球分離術產物通常含有淋巴球，包含T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿級份且視情況將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，細胞係用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代實施例中，洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經由PERCOLL梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，自周邊血液淋巴球分離T細胞。
在一些實施例中，T細胞為自供體之全血或富含淋巴球之血球分離術產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可使用本領域中熟習此項技術者已知之任何數目之技術(諸如FICOLL分離)自收集自個體之血液單元獲得。在一個較佳態樣中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。血球分離術產物通常含有淋巴球，包含T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿級份且視情況將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，細胞係用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代實施例中，洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經由PERCOLL梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，自周邊血液淋巴球分離T細胞。
在一些實施例中，T細胞為自供體之全血或富含淋巴球之血球分離術產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。在一些實施例中，PBL係藉由使用正向或負向選擇方法而自全血或富含淋巴球之血球分離術產物分離，亦即使用T細胞表型標誌(例如CD3+ CD45+)移除PBL，或移除非T細胞表型細胞而留下PBL。在其他實施例中，PBL係藉由梯度離心分離。在自供體組織分離PBL後，PBL之初始第一擴增可根據本文所描述之任何方法之初始第一擴增步驟，藉由將適合數目之經分離PBL(在一些實施例中，約1×107
個PBL)接種於初始第一擴增培養物中來起始。
含有一些此等特徵的稱為過程3(在本文中亦被稱作GEN3)之例示性TIL過程描繪於圖1中(特別是例如圖1B中)，且本發明之此實施例優於過程2A之一些優勢描述於圖1、圖2、圖30及圖31中(特別是例如圖1B中)。過程3之兩個實施例顯示於圖1及圖30中(特別是例如圖1B中)。過程2A或Gen 2描述於美國專利公開案第2018/0280436號中，其以全文引用之方式併入本文中。Gen 3過程亦描述於2018年11月5日提交申請之USSN 62/755,954(116983-5045-PR)中。
如本文中所論述及大體上概述，TIL係取自患者樣本，並且使用本文所描述且稱為Gen 3之TIL擴增過程操作以在移植至患者中之前擴增其數目。在一些實施例中，TIL可視情況如下文所論述經基因操作。在一些實施例中，TIL可在擴增之前或之後冷凍保存。解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加其代謝。
在一些實施例中，初始第一擴增(包含本文中稱為預快速擴增(預REP)的過程，以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示為步驟B之過程)縮短為1至8天，且快速第二擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示出為步驟D的過程)縮短為1至9天，如以下及實例及圖式中所詳細論述。在一些實施例中，初始第一擴增(包含本文中稱為預快速擴增(預REP)的過程，以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示為步驟B之過程)縮短為1至8天，且快速第二擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示出為步驟D的過程)縮短為1至8天，如以下及實例及圖式中所詳細論述。在一些實施例中，初始第一擴增(包含本文中稱為預快速擴增(預REP)的過程，以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示為步驟B之過程)縮短為1天至7天，且快速第二擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示出為步驟D的過程)縮短為1至9天，如以下及實例及圖式中所詳細論述。在一些實施例中，初始第一擴增(包含本文中稱為預快速擴增(預REP)的過程，以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示為步驟B之過程)為1天至7天，且快速第二擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中示出為步驟D的過程)為1天至10天，如以下及實例及圖式中所詳細論述。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)縮短至8天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為7至9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為8天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為8至9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)縮短至7天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為7至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)縮短至8天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為8天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為8天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為8天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為7天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為7至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為7天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為8至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)為7天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為9至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B之擴增)縮短至7天，且快速第二擴增(例如，如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟D中所描述之擴增)為7至9天。在一些實施例中，初始第一擴增及快速第二擴增(例如，在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中描述為步驟B及步驟D之擴增)之組合為14至16天，如以下及實例及圖式中所詳細論述。特定言之，認為本發明之某些實施例包括初始第一擴增步驟，其中TIL藉由在IL-2存在下暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露於抗原而活化。在某些實施例中，在如上文所描述之初始第一擴增步驟中活化之TIL為第一TIL群體，亦即，其為初代細胞群體。
以下的「步驟」標識A、B、C等參考圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中之非限制性實例且參考本文所描述之某些非限制性實施例.以下及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中的步驟次序為例示性的，且本申請案及本文中所揭示之方法涵蓋步驟之任何組合或次序，以及另外的步驟、步驟重複及/或步驟省略。A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣本
一般而言，TIL最初係獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)或獲自循環淋巴球(諸如周邊血液淋巴球，包含具有TIL樣特徵之周邊血液淋巴球)，且接著擴增成較大群體以進行如本文所描述之進一步操作，視情況經冷凍保存且視情況評估表型及代謝參數作為TIL保健的指標。
患者腫瘤樣本可使用本領域中已知之方法獲得，通常經由手術切除、細針活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段獲得。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為任何癌症類型，包含(但不限於)乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包含例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，適用的TIL係獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出此等腫瘤具有特別高含量之TIL。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成1 mm3
至約8 mm3
之間的小片，其中約2 mm3
至3 mm3
為尤其適用的。TIL係自此等片段使用酶素性腫瘤碎解物培養。此類腫瘤碎解物可藉由在酶素性培養基(例如羅斯威爾公園癌症研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素(gentamicine)、30單位/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，接著進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤碎解物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶素性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織片。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用FICOLL分支鏈親水性多醣之密度梯度分離以移除此等細胞。可使用本領域中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
腫瘤解離酶混合物可包含一或多種解離(消化)酶，諸如(但不限於)膠原蛋白酶(包含任何摻合或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、彈性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶(pronase))、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中重構。
在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 ml至15 ml緩衝液中重構。在一些實施例中，在重構後，膠原蛋白酶儲備液的範圍為約100 PZ U/ml至約400 PZ U/ml，例如，約100 PZ U/ml至約400 PZ U/ml、約100 PZ U/ml至約350 PZ U/ml、約100 PZ U/ml至約300 PZ U/ml、約150 PZ U/ml至約400 PZ U/ml、約100 PZ U/ml、約150 PZ U/ml、約200 PZ U/ml、約210 PZ U/ml、約220 PZ U/ml、約230 PZ U/ml、約240 PZ U/ml、約250 PZ U/ml、約260 PZ U/ml、約270 PZ U/ml、約280 PZ U/ml、約289.2 PZ U/ml、約300 PZ U/ml、約350 PZ U/ml或約400 PZ U/ml。
在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶175 DMC U。凍乾儲備酶之濃度可為175 DMC/mL。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液之範圍為100 DMC/ml至約400 DMC/ml，例如，約100 DMC/ml至約400 DMC/ml、約100 DMC/ml至約350 DMC/ml、約100 DMC/ml至約300 DMC/ml、約150 DMC/ml至約400 DMC/ml、約100 DMC/ml、約110 DMC/ml、約120 DMC/ml、約130 DMC/ml、約140 DMC/ml、約150 DMC/ml、約160 DMC/ml、約170 DMC/ml、約175 DMC/ml、約180 DMC/ml、約190 DMC/ml、約200 DMC/ml、約250 DMC/ml、約300 DMC/ml、約350 DMC/ml或約400 DMC/ml。
在一些實施例中，DNA酶I係在1 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在重構後，DNA酶I儲備液的範圍為約1 KU/ml至10 KU/ml，例如約1 KU/ml、約2 KU/ml、約3 KU/ml、約4 KU/ml、約5 KU/ml、約6 KU/ml、約7 KU/ml、約8 KU/ml、約9 KU/ml或約10 KU/ml。
在一些實施例中，酶儲備液會發生變化，因此請驗證凍乾儲備液之濃度，並相應地修改添加至碎解混合物中的酶之最終量。
在一些實施例中，酶混合物包含中性蛋白酶、DNA酶及膠原蛋白酶。
在一些實施例中，酶混合物包含約4.7 ml無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3 μl膠原蛋白酶(1.2 PZ/ml)及250 μl DNA酶I(200 U/ml)。
如上文所指出，在一些實施例中，TIL係衍生自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷且以全腫瘤進行酶素性碎解。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中碎解。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO2
下在包括膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO2
、旋轉下在包括膠原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶之酶混合物中碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下碎解隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO2
、恆定旋轉下碎解隔夜。在一些實施例中，整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤碎解反應混合物。在一些實施例中，在繼續進行選擇過程之前，將腫瘤碎解，然後冷凍。在一些實施例中，在繼續進行擴增過程之前，將腫瘤碎解，然後冷凍。
在一些實施例中，在無菌緩衝液中用凍乾酶重構腫瘤。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包括膠原蛋白酶。在一些實施例中，膠原蛋白酶為膠原蛋白酶IV。在一些實施例中，膠原蛋白酶之工作儲備液為100 mg/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000IU/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、1000 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、500 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括約10 mg/ml膠原蛋白酶、約1000 IU/ml DNA酶及約1 mg/ml玻尿酸酶。
一般而言，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。在某些實施例中，新鮮獲得之TIL細胞群體暴露於包括抗原呈現細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍碎解物。
在一些實施例中，碎斷包含物理碎斷，包含例如分割以及碎解。在一些實施例中，碎斷為物理碎斷。在一些實施例中，碎斷為分割。在一些實施例中，碎斷係藉由碎解。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶素性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶素性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在例如步驟A(如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所提供)中獲得腫瘤樣本之後，腫瘤進行物理碎解。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷在獲得腫瘤之後並且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，碎斷步驟係活體外或離體過程。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將10、20、30、40或更多個片段或片置於各容器中進行初始第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將30或40個片段或片置於各容器中進行初始第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將40個片段或片置於各容器中進行初始第一擴增。在一些實施例中，多個片段包括約4個至約50個片段，其中各片段之體積為約27 mm3
。在一些實施例中，多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包括約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm3
與10 mm3
之間。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm3
與8 mm3
之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段為1至4 mm×1至4 mm×1至4 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為1 mm×1 mm×1 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為2 mm×2 mm×2 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為3 mm×3 mm×3 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為4 mm×4 mm×4 mm。
在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各片上出血性、壞死及/或脂肪組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各片上出血性組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各片上壞死組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使每個片上脂肪組織的量減至最小。在某些實施例中，腫瘤碎斷步驟係活體外或離體方法。
在一些實施例中，進行腫瘤碎斷以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，在不使用解剖刀進行鋸切動作的情況下進行腫瘤碎斷。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(加利福尼亞州奧本美天旎生物技術的GentleMACS)來產生腫瘤碎解物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。隨後可將溶液在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後若大片組織仍存在，則施加1或2次另外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用Ficoll之密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，將初始第一擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。
在一些實施例中，細胞可視情況在樣本分離之後(例如在獲得腫瘤樣本後及/或在自腫瘤樣本獲得細胞懸浮液後)冷凍，且在進入步驟B中所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟B進一步詳細描述於下文且例示於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中。1.
粗針/小活體組織切片衍生之TIL
在一些實施例中，TIL最初係獲自藉由粗針活體組織切片或類似程序獲得之患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且隨後擴增成較大群體以進行如本文所描述之進一步操作，視情況經冷凍保存且視情況評估表型及代謝參數。
在一些實施例中，患者腫瘤樣本可使用本領域中已知之方法獲得，通常經由小活體組織切片、粗針活體組織切片、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段獲得。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。在一些實施例中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之單一腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之一個、兩個、三個或四個腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。實體腫瘤可為任何癌症類型，包含(但不限於)乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包含例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，適用的TIL係獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出此等腫瘤具有特別高含量之TIL。
一般而言，獲自腫瘤核心或片段之細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。在某些實施例中，新鮮獲得之TIL細胞群體暴露於包括抗原呈現細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，若腫瘤為轉移性腫瘤且在過去已有效治療/移除原發性病灶，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施例中，若可用，微創方法係移除皮膚病灶或頸部或腋窩區域上的淋巴結。在一些實施例中，移除皮膚病灶或移除其小活體組織切片。在一些實施例中，移除淋巴結或其小活體組織切片。在一些實施例中，可採用肺或肝轉移性病灶或其腹部內或胸部淋巴結或其小活體組織切片。
在一些實施例中，腫瘤為黑色素瘤。在一些實施例中，黑色素瘤之小活體組織切片包括黑痣或其一部分。
在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚中獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚中獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚中獲得，並且移除一片圓形皮膚。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長物。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片且連同小邊緣之正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長物。
在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分之黑痣或生長物。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片，且該切開式活體組織切片係在其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時使用。
在一些實施例中，小活體組織切片為肺活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。一般而言，支氣管鏡檢係在患者麻醉下使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入支氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施例中，在無法經由支氣管鏡檢達到腫瘤或生長物的情況下，可以採用經胸針吸活體組織切片。一般而言，對於經胸針吸活體組織切片，患者亦處於麻醉下且將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施例中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如使用x射線或CT掃描引導針頭)。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經內視鏡超音波獲得(例如，內視鏡附燈且經口置於食道中)。在一些實施例中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施例中，小活體組織切片為頭頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片，其中自外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施例中，若容易接近異常區，則無需住院即可採集樣本。在一些實施例中，若腫瘤在口腔或咽喉內部較深處，則活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施例中，小活體組織切片為細針抽吸(FNA)。在一些實施例中，小活體組織切片為細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭自腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑區域。
在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡的附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於對一小部分之子宮頸進行活體組織切片檢查。在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術以自子宮頸移除較大片組織。在一些實施例中，除了有助於確診之外，錐狀活體組織切片亦可以用作初始治療。
術語「實體腫瘤」係指通常不含囊腫或液體區域的異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。術語「實體腫瘤癌症」係指惡性、贅生性或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌包含(但不限於)肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實體腫瘤之組織結構包含相互相依組織隔室，包含實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支援性微環境之支援性基質細胞。
在一些實施例中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、粗針活體組織切片、小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)形式獲得。在一些實施例中，首先將樣本置於G-Rex 10中。在一些實施例中，當有1個或2個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置於G-Rex 10中。在一些實施例中，當有3個、4個、5個、6個、8個、9個或10個或更多個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置於G-Rex 100中。在一些實施例中，當有3個、4個、5個、6個、8個、9個或10個或更多個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置於G-Rex 500中。
FNA可獲自選自由以下組成之群組的腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、神經膠母細胞瘤、結腸直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施例中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)患者的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC患者先前已經受外科治療。
本文所描述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用在18號針頭至25號針頭範圍中的細號規針頭自患者獲得或分離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施例中，來自患者之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些情況下，本文所描述之TIL係獲自粗針活體組織切片樣本。在一些情況下，粗針活體組織切片樣本係使用在11號針頭至16號針頭範圍中的外科或醫用針頭自患者獲得或分離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施例中，來自患者之粗針活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
一般而言，經收集之細胞懸浮液被稱為「初代細胞群體」或「新鮮收集的」細胞群體。
在一些實施例中，TIL並非獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，實體腫瘤核心未經碎斷。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(加利福尼亞州奧本美天旎生物技術的GentleMACS)來產生腫瘤碎解物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。隨後可將溶液在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後若大片組織仍存在，則施加1或2次另外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用Ficoll之密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，獲得第一TIL群體包括多病灶取樣方法。
腫瘤解離酶混合物可包含一或多種解離(消化)酶，諸如(但不限於)膠原蛋白酶(包含任何摻合或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶)、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中重構。
在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 ml至15 ml緩衝液中重構。在一些實施例中，在重構後，膠原蛋白酶儲備液的範圍為約100 PZ U/ml至約400 PZ U/ml，例如，約100 PZ U/ml至約400 PZ U/ml、約100 PZ U/ml至約350 PZ U/ml、約100 PZ U/ml至約300 PZ U/ml、約150 PZ U/ml至約400 PZ U/ml、約100 PZ U/ml、約150 PZ U/ml、約200 PZ U/ml、約210 PZ U/ml、約220 PZ U/ml、約230 PZ U/ml、約240 PZ U/ml、約250 PZ U/ml、約260 PZ U/ml、約270 PZ U/ml、約280 PZ U/ml、約289.2 PZ U/ml、約300 PZ U/ml、約350 PZ U/ml或約400 PZ U/ml。
在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度可為每小瓶175 DMC U。凍乾儲備酶之濃度可為175 DMC/mL。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液之範圍為100 DMC/ml至約400 DMC/ml，例如，約100 DMC/ml至約400 DMC/ml、約100 DMC/ml至約350 DMC/ml、約100 DMC/ml至約300 DMC/ml、約150 DMC/ml至約400 DMC/ml、約100 DMC/ml、約110 DMC/ml、約120 DMC/ml、約130 DMC/ml、約140 DMC/ml、約150 DMC/ml、約160 DMC/ml、約170 DMC/ml、約175 DMC/ml、約180 DMC/ml、約190 DMC/ml、約200 DMC/ml、約250 DMC/ml、約300 DMC/ml、約350 DMC/ml或約400 DMC/ml。
在一些實施例中，DNA酶I係在1 ml無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在重構後，DNA酶I儲備液的範圍為約1 KU/ml至10 KU/ml，例如約1 KU/ml、約2 KU/ml、約3 KU/ml、約4 KU/ml、約5 KU/ml、約6 KU/ml、約7 KU/ml、約8 KU/ml、約9 KU/ml或約10 KU/ml。
在一些實施例中，酶儲備液會發生變化，因此請驗證凍乾儲備液之濃度，並相應地修改添加至碎解混合物中的酶之最終量。
在一些實施例中，酶混合物包含中性蛋白酶、膠原蛋白酶及DNA酶
在一些實施例中，酶混合物包含約4.7 ml無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3 μl膠原蛋白酶(1.2 PZ/ml)及250 μl DNA酶I(200 U/ml)。2.
胸膜滲出液TIL
在一些實施例中，樣本為胸膜液樣本。在一些實施例中，根據本文所描述之過程的用於擴增之TIL的來源為胸膜液樣本。在一些實施例中，樣本為源於胸膜滲出液之樣本。在一些實施例中，根據本文所描述之過程的用於擴增之TIL的來源為源於胸膜滲出液之樣本。參見例如美國專利公開案US 2014/0295426中所描述之方法，其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可以採用疑似及/或含有TIL之任何胸膜液或胸膜滲出液。此類樣本可來源於原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣本可為來源於另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜滲出物(pleural exudate)。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物樣本可包含含有TIL之其他漿液，包含例如來自腹部之腹水液或胰囊腫液。腹水液及胸膜液涉及非常類似的化學系統；腹部及肺兩者在相同的惡性腫瘤事件中於胸腔及腹腔中皆具有間皮細胞株及流體形式，且在一些實施例中，此類流體含有TIL。在本發明例示胸膜液的一些實施例中，可以使用含有TIL之腹水或其他囊腫液進行相同的方法以得到類似結果。
在一些實施例中，胸膜液呈未經處理之形式直接自患者移除。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未經處理之胸膜液置於標準血液收集管(諸如EDTA或肝素管)中。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未經處理之胸膜液置於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，在自患者收集之後立即將樣本置於CellSave管中，以避免活TIL之數目減少。若保留在未經處理之胸膜液中，即使在4℃下，活TIL之數目可能在24小時內顯著降低。在一些實施例中，樣本係在自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，樣本係在4℃下自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。
在一些實施例中，可以稀釋來自所選個體之胸膜液樣本。在一些實施例中，稀釋度為1:10胸膜液對稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:9胸膜液對稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:8胸膜液對稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:5胸膜液對稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1 2胸膜液對稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:1胸膜液對稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑包含鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、另一緩衝液或生理學上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，樣本係在自患者收集及稀釋之後立即置於CellSave管中，以避免活TIL減少，若保留在未經處理之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL可能在24至48小時內顯著減少。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且在4℃下稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。
在又一實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由習知手段濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在胸膜液必須冷凍保存以便運送至進行該方法之實驗室或用於後續分析(例如，在收集後24至48小時之後)之情形下，此胸膜液之預處理較佳。在一些實施例中，藉由在將胸膜液樣本自個體中取出後將其離心並將離心液或沈澱物再懸浮於緩衝液中來製備胸膜液樣本。在一些實施例中，對胸膜液樣本進行多次離心及再懸浮，隨後將其冷凍保存以用於運輸或以後的分析及/或處理。
在一些實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在接觸步驟中使用之胸膜液樣本係藉由將流體經由含有已知且基本均勻的孔徑的過濾器過濾而製備的，該孔徑允許胸膜液通過膜但保留腫瘤細胞。在一些實施例中，膜中的孔之直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中，可為6 μM、7 μM、8 μM、9 μM或10 μM中之任一者。過濾之後，可將被膜保留之細胞(包含TIL)自膜上衝出至適合的生理學上可接受之緩衝液中。然後可以將以此方式濃縮之細胞(包含TIL)用於該方法之接觸步驟中。
在一些實施例中，使胸膜液樣本(包含例如未經處理之胸膜液)、經稀釋之胸膜液或再懸浮之細胞沈澱物與溶解試劑接觸，該溶解試劑係差異性地溶解樣本中存在之無核紅血球。在一些實施例中，在胸膜液含有大量RBC之情形下，此步驟係在進一步的處理步驟之前進行。適合的溶解試劑包含單一溶解試劑或溶解試劑及淬滅試劑，或溶解試劑、淬滅試劑及固定試劑。適合的溶解系統為市售的，且包含BD Pharm Lyse™系統(碧迪醫療公司(Becton Dickenson))。其他溶解系統包含Versalyse™系統、FACSlyse™系統(碧迪醫療公司)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter, Inc.))或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求而變化，該等需求為紅血球之有效溶解及TIL之保守性及胸膜液中TIL之表型特性。除採用單一試劑用於溶解之外，適用於本文所描述之方法的溶解系統可包含第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或延遲溶解試劑之效應的第二試劑，例如Stabilyse™試劑(貝克曼庫爾特公司)。視溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施而定，亦可採用習知固定試劑。
在一些實施例中，在約-140℃之溫度下冷凍保存如上文所描述之未經處理、稀釋或多次離心或處理的胸膜液樣本，隨後如本文所提供進行進一步處理及/或擴增。3.
擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)之方法
PBL方法1。在本發明之一些實施例中，PBL係使用本文所描述之方法擴增。在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自全血之PBMC樣本。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+級份之負向選擇以自PBMC中分離純T細胞來富集T細胞。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+級份之基於磁珠之負向選擇以自PBMC中分離純T細胞來富集T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBL方法1如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且計算PBMC之數目。使用人類泛T細胞分離套組與LS管柱(美天旎生物技術)分離T細胞。
PBL方法2。在本發明之一些實施例中，PBL係使用PBL方法2擴增，該方法包括獲得來自全血之PBMC樣本。藉由在37℃下培育PBMC至少三小時且接著分離非附著細胞來富集來自PBMC之T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBL方法2如下進行：在第0天，將經冷凍保存之PMBC樣本解凍，且將PBMC細胞以每孔6百萬個細胞接種於CM-2培養基中之6孔盤中並且在37℃下培育3小時。3小時後，移除非附著細胞(其係PBL)且計算其數目。
PBL方法3。在本發明之一些實施例中，PBL係使用PBL方法3擴增，該方法包括獲得來自周邊血液之PBMC樣本。B細胞係使用CD19+選擇分離且T細胞係使用負向選擇PBMC樣本之非CD19+級份來選擇。
在本發明之一些實施例中，PBL方法3如下進行：在第0天，將來源於周邊血液的冷凍保存之PBMC解凍且計算其數目。使用CD19多分選人類套組(美天旎生物技術)分選CD19+ B細胞。在非CD19+細胞級份中，使用人類泛T細胞分離套組及LS管柱(美天旎生物技術)純化T細胞。
在一些實施例中，PBMC係自全血樣本分離。在一些實施例中，使用PBMC樣本作為擴增PBL之起始物質。在一些實施例中，樣本在擴增過程之前經冷凍保存。在其他實施例中，使用新鮮樣本作為擴增PBL之起始物質。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之方法自PBMC分離T細胞。在一些實施例中，使用人類泛T細胞分離套組及LS管柱分離T細胞。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之抗體選擇方法(例如CD19負向選擇)自PBMC分離T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBMC樣本係在有效鑑別非附著細胞之所需溫度下培育一段時間。在本發明之一些實施例中，培育時間為約3小時。在本發明之一些實施例中，溫度為約37℃。接著使用上述過程擴增非附著細胞。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自視情況已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，腫瘤樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者，其已進行治療至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或1年以上。在其他實施例中，PBMC係來源於當前進行ITK抑制劑方案(諸如伊布替尼(ibrutinib))之患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療且難以用激酶抑制劑或ITK抑制劑(諸如伊布替尼)治療之個體或患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療並且尚未進行治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或1年以上之個體或患者。在其他實施例中，PBMC來源於先前暴露於ITK抑制劑但在至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少1年內尚未經治療之患者。
在本發明之一些實施例中，在第0天，針對CD19+選擇細胞且據此分選。在本發明之一些實施例中，使用抗體結合珠粒進行選擇。在本發明之一些實施例中，在第0天自PBMC分離純T細胞。
在本發明之一些實施例中，對於未經伊布替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，10 ml至15 ml白血球層將產生約5×109
個PBMC，其又將產生約5.5×107
個PBL。
在本發明之一些實施例中，對於經伊布替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，擴增過程將產生約20×109
個PBL。在本發明之一些實施例中，40.3×106
個PBMC將產生約4.7×105
個PBL。
在任何前述實施例中，PBMC可來源於全血樣本，藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。4.
擴增來自骨髓衍生之PBMC的骨髓浸潤性淋巴球(MIL)的方法
MIL方法3。在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自骨髓之PBMC。在第0天，針對CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+選擇PBMC且分選，且將非CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+細胞級份進行音波處理且將一部分經音波處理之細胞級份添加回至所選細胞級份中。
在本發明之一些實施例中，MIL方法3如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且計算PBMC之數目。將細胞用CD3、CD33、CD20及CD14抗體染色且使用S3e細胞分選器(Bio-Rad)分選。將細胞分選成兩種級份：免疫細胞級份(MIL部分)(CD3+CD33+CD20+ CD14+)及AML胚細胞級份(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本發明之一些實施例中，PBMC係獲自骨髓。在一些實施例中，PBMC係經由血球分離術、抽吸、針吸活體組織切片或本領域中已知之其他類似方式獲自骨髓。在一些實施例中，PBMC為新鮮的。在其他實施例中，PBMC經冷凍保存。
在本發明之一些實施例中，MIL係自10 ml至50 ml骨髓抽吸物擴增。在本發明之一些實施例中，自患者獲得10 ml骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得20ml骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得30ml骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得40ml骨髓抽吸物。在其他實施例中，自患者獲得50ml骨髓抽吸物。
在本發明之一些實施例中，自約10 ml至50 ml骨髓抽吸物產生之PBMC的數目為約5×107
至約10×107
個PBMC。在其他實施例中，產生之PMBC之數目為約7×107
個PBMC。
在本發明之一些實施例中，約5×107
至約10×107
個PBMC產生約0.5×106
至約1.5×106
個MIL。在本發明之一些實施例中，產生約1×106
個MIL。
在本發明之一些實施例中，來源於骨髓抽吸物之12×106
個PBMC產生大約1.4×105
個MIL。
在任何前述實施例中，PBMC可來源於全血樣本、骨髓、藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。5.
PD-1 - PD1之預選(如圖1之步驟A2中所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前經預選呈PD-1陽性(PD-1+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生大於1e9的TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為PD-1陽性(PD-1+)(例如，在預選之後及在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% PD-1陽性、至少80% PD-1陽性、至少85% PD-1陽性、至少90% PD-1陽性、至少95% PD-1陽性、至少98% PD-1陽性或至少99% PD-1陽性(例如，在預選之後及在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，PD-1群體為PD-1high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% PD-1high、至少30% PD-1high、至少35% PD-1high、至少40% PD-1high、至少45% PD-1high、至少50% PD-1high、至少55% PD-1high、至少60% PD-1high、至少65% PD-1high、至少70% PD-1high、至少75% PD-1high、至少80% PD-1high、至少85% PD-1high、至少90% PD-1high、至少95% PD-1high、至少98% PD-1high或至少99% PD-1high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% PD-1陽性、至少80% PD-1陽性、至少85% PD-1陽性、至少90% PD-1陽性、至少95% PD-1陽性、至少98% PD-1陽性、或至少99% PD-1陽性或100% PD-1陽性。在一些實施例中，PD-1high由至少80% PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由至少85%PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由至少90%PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由至少95%PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由至少98%PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由至少99%PD-1陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，PD-1high由100%PD-1陽性的TIL群體指示。
在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少25%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少30%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少35%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少40%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少45%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少50%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少55%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少60%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少65%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少70%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少75%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少80%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少85%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少90%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少95%，所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高至少99%，或所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高100%。
在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高1倍或更多倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高一倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高兩倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高三倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高四倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高五倍。在一些實施例中，PD-1high由TIL群體指示，其中TIL所表現的PD-1比對照或基線PD-1水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗PD-1抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL進行PD-1陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗PD-1抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類PD-1多株抗體、山羊抗人類PD-1多株抗體等。在一些實施例中，抗PD-1抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含例如但不限於：EH12.2H7、PD1.3.1、SYM021、M1H4、A17188B、納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)、帕博利珠單抗(蘭立珠單抗、MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)、人類單株抗體REGN2810(再生元)、人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)，及/或人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目錄號BP0146。其他用於預選用於根據本發明之方法(如本文所描述之步驟A至F所例示)擴增TIL之PD-1陽性TIL的適合抗體係美國專利第8,008,449號中所揭示之抗PD-1抗體，該美國專利以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與帕博利珠單抗(蘭立珠單抗，MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體REGN2810(再生元)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell目錄號BP0146結合至不同抗原決定基。納武單抗結合及帕博利珠單抗與PD-1結合之結構為已知的且已描述於例如Tan, S.等人(Tan、S.等人，《自然通訊》 8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369(2017)；其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，抗PD-1抗體為EH12.2H7。在一些實施例中，抗PD-1抗體為PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體為M1H4。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是M1H4。
在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現PD-1之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療，或接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療，但未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療且接受過化學治療劑治療，但未接受過抗PD-1抗體治療。
在患者先前已用第一抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗PD-1抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗PD-1抗體沒有被第一抗PD-1抗體阻斷與初代細胞群體TIL之表面上的PD-1之結合。
在患者先前已用抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗PD-1抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在一些實施例中，其中患者先前已用抗PD-1人類或人源化IgG抗體治療，且初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗PD-1抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗PD-1抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1中間TIL及PD-1陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，PD-1high群體係定義為超過在PBMC中觀察到之PD-1陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間PD-1+群體涵蓋PBMC中之PD-1+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之PD-1預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定PD-1高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的用於PD-1高圈選的PD-1之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，PD-1陽性(PD-1+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，PD-1陽性TIL為PD-1high TIL。在一些實施例中，PD-1陽性TIL為PD-1中間TIL。在一些實施例中，PD-1+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，PD-1+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，PD-1+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，PD-1+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗PD-1抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇PD-1+及CD3+ TIL。在一些實施例中，珠粒選擇方法中採用之抗PD-1抗體包含例如但不限於：EH12.2H7、PD1.3.1、SYM021、M1H4、A17188B、納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)、帕博利珠單抗(蘭立珠單抗、MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)、人類單株抗體REGN2810(再生元)、人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)，及/或人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目錄號BP0146。其他用於預選用於根據本發明之方法(如本文所描述之步驟A至F所例示)擴增TIL之PD-1陽性TIL的適合抗體係美國專利第8,008,449號中所揭示之抗PD-1抗體，該美國專利以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與帕博利珠單抗(蘭立珠單抗，MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體REGN2810(再生元)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell目錄號BP0146結合至不同抗原決定基。納武單抗結合及帕博利珠單抗與PD-1結合之結構為已知的且已描述於例如Tan, S.等人(Tan、S.等人，《自然通訊》8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369 (2017)；其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，抗PD-1抗體為EH12.2H7。在一些實施例中，抗PD-1抗體為PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體為M1H4。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是M1H4。
在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集PD-1+細胞及/或PD-1陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/ EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少30%至80% PD-1陽性TIL、至少40%至80% PD-1陽性TIL、至少50%至80% PD-1陽性TIL、至少10%至70% PD-1陽性TIL、至少20%至70% PD-1陽性TIL、至少30%至70% PD-1陽性TIL、或至少40%至70% PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇PD-1陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含PD-1之TIL群體。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL為PD-1high TIL。
在一些實施例中，PD-1high表現係藉由流動式細胞測量術使用標準化螢光強度之最小截留值測定，該標準化螢光強度選自由約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%或約10%組成之群組。
在一些實施例中，至少70%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少80%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少90%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少95%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少99%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，100%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，進行PD-1陽性TIL之選擇，直至存在至少1×104
個TIL PD-1陽性TIL、至少1×105
個TIL PD-1陽性TIL、至少1×106
個TIL PD-1陽性TIL、至少1×107
個TIL PD-1陽性TIL、至少1×108
個TIL PD-1陽性TIL。在一些實施例中，進行PD-1陽性TIL之選擇，直至存在至少1×106
個TIL PD-1陽性TIL。
不同的抗PD-1抗體展現與PD-1內之不同抗原決定基的不同結合特徵。在一些實施例中，抗PD-1抗體與帕博利珠單抗結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，抗PD1抗體與PD-1之IgV域外部之N端環中之抗原決定基結合。在一些實施例中，抗PD1抗體經由PD-1之IgV域外部之N端環結合。在一些實施例中，抗PD-1抗體為抗PD-1抗體，其經由PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合。在一些實施例中，抗PD-1抗體為單株抗PD-1抗體，其經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合。在一些實施例中，單株抗PD-1抗體為抗PD-1 IgG4抗體，其經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合。參見例如Tan, S.《自然通訊》第8卷，第14369條：1-10(2017)。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。在一些實施例中，單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗PD-1抗體與EH12.2H7或納武單抗結合於相同的抗原決定基。
在一些實施例中，採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為PD-1high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之PD-1表現量之參考值。參考樣本中之PD-1陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，PD-1表現量係於來自健康個體之CD3+/PD-1+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之PD-1的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為PD-1high T細胞之PD-1免疫染色的最小強度。因此，PD-1表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為PD-1high細胞。在一些情況下，PD-1high TIL表示彼等具有最高PD-1免疫染色強度的TIL，對應於最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，PD-1high TIL表示彼等具有最高PD-1免疫染色強度之TIL，對應於最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，PD-1high TIL表示彼等具有最高PD-1免疫染色強度的TIL，對應於最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一種情況下，PD-1high TIL表示彼等具有最高PD-1免疫染色強度之TIL，對應於最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
NSCLC患者。簡言之，PD-1hi、PD-1int及PD-1neg子集可以基於其經量測螢光強度進行鑑別。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選的PD-1陽性(PD-1+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗PD-1抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗PD-1抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗PD-1-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇PD-1陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE (藻紅素(Phycoerythrin))、APC(別藻藍蛋白(allophycocyanin))、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質(peridinin chlorophyll protein))、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包含(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。6.
CD39 - CD39之預選選擇(如圖1之步驟A2中所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前經預選呈CD39陽性(CD39+)。
在一些實施例中，針對諸如CD39之耗竭標誌預選本發明之TIL(參見例如或Canale, F. P.,等人，《癌症研究》78:115-128(2018)及或Duhne, T.,等人，《自然通訊》9:2724(2018))。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前經預選呈CD39陽性(CD39+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生大於1e9的TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD39陽性(CD39+)(例如，在預選之後及在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD39陽性、至少80% CD39陽性、至少85% CD39陽性、至少90% CD39陽性、至少95% CD39陽性、至少98% CD39陽性或至少99% CD39陽性(例如，在預選之後及在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD39群體為CD39high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD39high、至少30% CD39high、至少35% CD39high、至少40% CD39high、至少45% CD39high、至少50% CD39high、至少55% CD39high、至少60% CD39high、至少65% CD39high、至少70% CD39high、至少75% CD39high、至少80% CD39high、至少85% CD39high、至少90% CD39high、至少95% CD39high、至少98% CD39high或至少99% CD39high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% CD39陽性、至少80% CD39陽性、至少85% CD39陽性、至少90% CD39陽性、至少95% CD39陽性、至少98% CD39陽性、或至少99% CD39陽性或100% CD39陽性。在一些實施例中，CD39high由至少80% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由至少85% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由至少90% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由至少95% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由至少98% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由至少99% CD39陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD39high由100% CD39陽性的TIL群體指示。
在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少25%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少30%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少35%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少40%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少45%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少50%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少55%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少60%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少65%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少70%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少75%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少80%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少85%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少90%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少95%，所表現的CD39比對照或基線CD39水準高至少99%，或所表現的CD39比對照或基線CD39水準高100%。
在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高1倍或更多倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高一倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高兩倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高三倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高四倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高五倍。在一些實施例中，CD39high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD39比對照或基線CD39水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗CD39抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL進行CD39陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗CD39抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類CD39多株抗體、山羊抗人類CD39多株抗體等。在一些實施例中，抗CD39抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗CD39抗體包含例如但不限於BY40(參見Nikolova, M.等人《PLoS病原體(PLoS Pathog.)》7, e1002110(2011))、IPH5201、TTX-0303、SRF617及/或5F2。
在一些實施例中，用於預選之抗CD39抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現CD39之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療，或接受過抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗CD39抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療，但未接受過抗CD39抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療且接受過化學治療劑治療，但未接受過抗CD39抗體治療。
在患者先前已用第一抗CD39抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗CD39抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗CD39抗體沒有被第一抗CD39抗體阻斷與初代細胞群體TIL之表面上的CD39之結合。
在患者先前已用第一抗CD39抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD39抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在一些實施例中，患者先前已用抗CD39人類或人源化IgG抗體治療，且初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗CD39人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗CD39人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗CD39人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗CD39人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗CD39抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗CD39抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD39抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於CD39陰性TIL、CD39中間TIL及CD39陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，CD39high群體係定義為超過在PBMC中觀察到之CD39陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間CD39+群體涵蓋PBMC中之CD39+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之CD39預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定CD39高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的用於CD高圈選的CD39之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05% 1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，CD39陽性(CD39+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，CD39陽性TIL為CD39high TIL。在一些實施例中，CD39陽性TIL為CD39中間TIL。在一些實施例中，CD39+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD39+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，CD39+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD39+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗CD39抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇CD39+及CD3+ TIL。在一些實施例中，珠粒選擇方法中所用之抗CD39抗體包含例如但不限於BY40(參見Nikolova, M.等人《PLoS病原體》7, e1002110(2011))、IPH5201、TTX-0303、SRF617及/或5F2。
在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集CD39+細胞及/或CD39陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇CD39陽性TIL以獲得富含CD39之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4%呈CD39陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% CD39陽性TIL、至少20%至80% CD39陽性TIL、至少30%至80% CD39陽性TIL、至少40%至80% CD39陽性TIL、至少50%至80% CD39陽性TIL、至少10%至70% CD39陽性TIL、至少20%至70% CD39陽性TIL、至少30%至70% CD39陽性TIL、或至少40%至70% CD39陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇CD39陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗CD39 IgG4抗體，該抗體經由在CD39之IgV域外部的N端環與CD39結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中CD39陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含CD39之TIL群體。
在一些實施例中，CD39陽性TIL為CD39high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含CD39之TIL群體為CD39陽性TIL。
在一些實施例中，選擇CD39陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL CD39陽性TIL、至少1×105
個TIL CD39陽性TIL、至少1×106
個TIL CD39陽性TIL、至少1×107
個TIL CD39陽性TIL、至少1×108
個TIL CD39陽性TIL。在一些實施例中，選擇CD39陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL CD39陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗CD39 IgG4抗體，該單株抗CD39 IgG4抗體經由在CD39之IgV域外部之N端環與CD39結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含CD39之TIL群體。在一些實施例中，單株抗CD39 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗CD39抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD39high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD39表現量之參考值。參考樣本中之CD39陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD39表現量係於來自健康個體之CD3+/CD39+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD39的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD39high T細胞之CD39免疫染色的最小強度。因此，CD39表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD39high細胞。在一些情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對CD39採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD39high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD39表現量之參考值。參考樣本中之CD39陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD39表現量係於來自健康個體之CD3+/CD39+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD39的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD39high T細胞之CD39免疫染色的最小強度。因此，CD39表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD39high細胞。在一些情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD39high TIL表示彼等具有最高CD39免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的CD39陽性(CD39+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗CD39抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗CD39抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗CD39-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇CD39陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。7.
CD38 - CD38之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD38陽性(CD38+)。
在一些實施例中，針對諸如CD38(參見例如Canale, F. P.等人《癌症研究》78:115-128(2018)及或Duhne, T.等人,《自然通訊》9:2724(2018))之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD38陽性(CD38+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD38陽性(CD38+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD38陽性、至少80% CD38陽性、至少85% CD38陽性、至少90% CD38陽性、至少95% CD38陽性、至少98% CD38陽性或至少99% CD38陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD38群體為CD38低(CD38lo)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD38lo、至少30% CD38lo、至少35% CD38lo、至少40% CD38lo、至少45% CD38lo、至少50% CD38lo、至少55% CD38lo、至少60% CD38lo、至少65% CD38lo、至少70% CD38lo、至少75% CD38lo、至少80% CD38lo、至少85% CD38lo、至少90% CD38lo、至少95% CD38lo、至少98% CD38lo或至少99% CD38lo(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，該TIL群體為不超過5% CD38陽性、不超過10% CD38陽性、不超過15% CD38陽性、不超過20% CD38陽性、不超過25% CD38陽性、不超過30% CD38陽性、35% CD38陽性、不超過40% CD38陽性、不超過45% CD38陽性、不超過50% CD38陽性、不超過55% CD38陽性、不超過60% CD38陽性。在一些實施例中，CD38lo由不超過5% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38lo由不超過10% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38lo由不超過15% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38lo由不超過20% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38lo由不超過25% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38lo由不超過30% CD38陽性的TIL群體指示。
在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低25%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低30%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低35%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低40%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低45%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低50%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低55%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低60%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低65%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低70%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低75%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低80%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低85%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低90%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準低95%、或所表現的CD38比對照或基線CD38水準低99%。
在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38為對照或基線CD38水準的1倍或更低。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38為對照或基線CD38水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更低。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低一倍。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低兩倍。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低三倍。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低四倍。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低五倍。在一些實施例中，CD38lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準低十倍。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD38陽性(CD38+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD38陽性、至少80% CD38陽性、至少85% CD38陽性、至少90% CD38陽性、至少95% CD38陽性、至少98% CD38陽性或至少99% CD38陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD38群體為CD38high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD38high、至少30% CD38high、至少35% CD38high、至少40% CD38high、至少45% CD38high、至少50% CD38high、至少55% CD38high、至少60% CD38high、至少65% CD38high、至少70% CD38high、至少75% CD38high、至少80% CD38high、至少85% CD38high、至少90% CD38high、至少95% CD38high、至少98% CD38high或至少99% CD38high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% CD38陽性、至少80% CD38陽性、至少85% CD38陽性、至少90% CD38陽性、至少95% CD38陽性、至少98% CD38陽性、或至少99% CD38陽性或100% CD38陽性。在一些實施例中，CD38high由至少80% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由至少85% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由至少90% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由至少95% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由至少98% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由至少99% CD38陽性的TIL群體指示。在一些實施例中，CD38high由100% CD38陽性的TIL群體指示。
在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少25%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少30%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少35%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少40%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少45%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少50%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少55%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少60%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少65%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少70%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少75%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少80%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少85%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少90%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少95%、所表現的CD38比對照或基線CD38水準高至少99%、或所表現的CD38比對照或基線CD38水準高100%。
在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38為對照或基線CD38水準的1倍或更高。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38為對照或基線CD38水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高一倍。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高兩倍。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高三倍。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高四倍。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高五倍。在一些實施例中，CD38high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD38比對照或基線CD38水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗CD38抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行CD38陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗CD38抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類CD38多株抗體、山羊抗人類CD38多株抗體等。在一些實施例中，抗CD38抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗CD38抗體包含但不限於例如MOR03087、達雷木單抗(Daratumumab)、GSK2857916、MOR202、STI-6129、艾沙妥昔單抗(Isatuximab)(SAR650984)及/或TAK-079。
在一些實施例中，用於預選之抗CD38抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現CD38之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗CD38抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD38抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD38抗體治療。
在患者先前已用第一抗CD38抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗CD38抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗CD38抗體與初代細胞群體TIL之表面上的CD38之結合不被第一抗CD38抗體阻斷。
在患者先前已用抗CD38抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD38抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在患者先前已用抗CD38人類或人源化IgG抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗CD38人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗CD38人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗CD38人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗CD38人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗CD38抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗CD38抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD38抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於CD38陰性TIL、CD38中間TIL及CD38陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，CD38high群體定義為超過在PBMC中觀察到之CD38陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間CD38+群體涵蓋PBMC中之CD38+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之CD38預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定CD38高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對CD38高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的CD38之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，CD38陽性(CD38+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法來進行分選。在一些實施例中，CD38陽性TIL為CD38high TIL。在一些實施例中，CD38陽性TIL為CD38中間TIL。在一些實施例中，CD38+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD38+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，CD38+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD38+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗CD38抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇CD38+及CD3+ TIL。在一些實施例中，在珠粒選擇方法中採用的抗CD38抗體包含但不限於例如MOR03087、達雷木單抗、GSK2857916、MOR202、STI-6129、艾沙妥昔單抗(SAR650984)及/或TAK-079。
在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集CD38+細胞及/或CD38陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇CD38陽性TIL以獲得富含CD38之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% CD38陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% CD38陽性TIL、至少20%至80% CD38陽性TIL、至少30%至80% CD38陽性TIL、至少40%至80% CD38陽性TIL、至少50%至80% CD38陽性TIL、至少10%至70% CD38陽性TIL、至少20%至70% CD38陽性TIL、至少30%至70% CD38陽性TIL、或至少40%至70% CD38陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇CD38陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗CD38 IgG4抗體，該單株抗CD38 IgG4抗體經由在CD38之IgV域外部之N端環與CD38結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中CD38陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含CD38之TIL群體。
在一些實施例中，CD38陽性TIL為CD38high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含CD38之TIL群體為CD38陽性TIL。
在一些實施例中，選擇CD38陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL CD38陽性TIL、至少1×105
個TIL CD38陽性TIL、至少1×106
個TIL CD38陽性TIL、至少1×107
個TIL CD38陽性TIL、至少1×108
個TIL CD38陽性TIL。在一些實施例中，選擇CD38陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL CD38陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗CD38 IgG4抗體，該單株抗CD38 IgG4抗體經由在CD38之IgV域外部之N端環與CD38結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含CD38之TIL群體。在一些實施例中，單株抗CD38 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗CD38抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD38high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD38表現量之參考值。參考樣本中之CD38陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD38表現量係於來自健康個體之CD3+/CD38+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD38的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD38high T細胞之CD38免疫染色的最小強度。因此，CD38表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD38high細胞。在一些情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對CD38採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD38high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD38表現量之參考值。參考樣本中之CD38陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD38表現量係於來自健康個體之CD3+/CD38+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD38的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD38high T細胞之CD38免疫染色的最小強度。因此，CD38表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD38high細胞。在一些情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD38high TIL表示彼等具有最高CD38免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的CD38陽性(CD38+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗CD38抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗CD38抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗CD38-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗CD38抗體培育之後，選擇CD38陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。8.
CD103 - CD103之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD103陽性(CD103+)。
在一些實施例中，針對諸如CD103(亦稱為αeβ7或αEβ7，參見例如或Duhne, T.等人, 《自然通訊》 9:2724(2018))之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD103陽性(CD103+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD103陽性(CD103+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD103陽性、至少80% CD103陽性、至少85% CD103陽性、至少90% CD103陽性、至少95% CD103陽性、至少98% CD103陽性或至少99% CD103陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD103群體為CD103high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD103high、至少30% CD103high、至少35% CD103high、至少40% CD103high、至少45% CD103high、至少50% CD103high、至少55% CD103high、至少60% CD103high、至少65% CD103high、至少70% CD103high、至少75% CD103high、至少80% CD103high、至少85% CD103high、至少90% CD103high、至少95% CD103high、至少98% CD103high或至少99% CD103high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% CD103陽性、至少80% CD103陽性、至少85% CD103陽性、至少90% CD103陽性、至少95% CD103陽性、至少98% CD103陽性、或至少99% CD103陽性或100% CD103陽性。在一些實施例中，CD103high由至少80% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由至少85% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由至少90% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由至少95% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由至少98% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由至少99% CD103陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD103high由100% CD103陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少25%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少30%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少35%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少40%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少45%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少50%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少55%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少60%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少65%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少70%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少75%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少80%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少85%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少90%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少95%、所表現的CD103比對照或基線CD103水準高至少99%、或所表現的CD103比對照或基線CD103水準高100%。
在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103為對照或基線CD103水準的1倍或更高。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103為對照或基線CD103水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高一倍。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高兩倍。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高三倍。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高四倍。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高五倍。在一些實施例中，CD103high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD103比對照或基線CD103水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗CD103抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行CD103陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗CD103抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類CD103多株抗體、山羊抗人類CD103多株抗體等。在一些實施例中，抗CD103抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗CD103抗體包含但不限於例如APC(17-1031-82)、Ber-ACT8及/或M290。
在一些實施例中，用於預選之抗CD103抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現CD103之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗CD103抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD103抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD103抗體治療。
在患者先前已用第一抗CD103抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗CD103抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗CD103抗體與初代細胞群體TIL之表面上的CD103之結合不被第一抗CD103抗體阻斷。
在患者先前已用抗CD103抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD103抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在患者先前已用抗CD103人類或人源化IgG抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗CD103人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗CD103人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗CD103人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗CD103人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗CD103抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗CD103抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD103抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於CD103陰性TIL、CD103中間TIL及CD103陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，CD103high群體定義為超過在PBMC中觀察到之CD103陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間CD103+群體涵蓋PBMC中之CD103+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之CD103預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定CD103高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對CD103高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的CD103之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，CD103陽性(CD103+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，CD103陽性TIL為CD103high TIL。在一些實施例中，CD103陽性TIL為CD103中間TIL。在一些實施例中，CD103+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD103+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，CD103+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD103+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗CD103抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇CD103+及CD3+ TIL。在一些實施例中，在珠粒選擇方法中採用的抗CD103抗體包含但不限於例如APC (17-1031-82)、Ber-ACT8及/或M290。
在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集CD103+細胞及/或CD103陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇CD103陽性TIL以獲得富含CD103之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% CD103陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% CD103陽性TIL、至少20%至80% CD103陽性TIL、至少30%至80% CD103陽性TIL、至少40%至80% CD103陽性TIL、至少50%至80% CD103陽性TIL、至少10%至70% CD103陽性TIL、至少20%至70% CD103陽性TIL、至少30%至70% CD103陽性TIL、或至少40%至70% CD103陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇CD103陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗CD103 IgG4抗體，該單株抗CD103 IgG4抗體經由在CD103之IgV域外部之N端環與CD103結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中CD103陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含CD103之TIL群體。
在一些實施例中，CD103陽性TIL為CD103high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含CD103之TIL群體為CD103陽性TIL。
在一些實施例中，選擇CD103陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL CD103陽性TIL、至少1×105
個TIL CD103陽性TIL、至少1×106
個TIL CD103陽性TIL、至少1×107
個TIL CD103陽性TIL、至少1×108
個TIL CD103陽性TIL。在一些實施例中，選擇CD103陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL CD103陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗CD103 IgG4抗體，該單株抗CD103 IgG4抗體經由在CD103之IgV域外部之N端環與CD103結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含CD103之TIL群體。在一些實施例中，單株抗CD103 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗CD103抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD103high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD103表現量之參考值。參考樣本中之CD103陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD103表現量係於來自健康個體之CD3+/CD103+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD103的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD103high T細胞之CD103免疫染色的最小強度。因此，CD103表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD103high細胞。在一些情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對CD103採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD103high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD103表現量之參考值。參考樣本中之CD103陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD103表現量係於來自健康個體之CD3+/ CD103+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD103的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD103high T細胞之CD103免疫染色的最小強度。因此，CD103表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD103high細胞。在一些情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD103high TIL表示彼等具有最高CD103免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的CD103陽性(CD103+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗CD103抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗CD103抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗CD103-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇CD103陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。9.
CD101 - CD101之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD101陽性(CD101+)。
在一些實施例中，針對諸如CD101(Philip, M.等人,《自然(Nature)》545(7655):452-456(2017))之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD101陽性(CD101+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD101陽性(CD101+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD101陽性、至少80% CD101陽性、至少85% CD101陽性、至少90% CD101陽性、至少95% CD101陽性、至少98% CD101陽性或至少99% CD101陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD101群體為CD101high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD101high、至少30% CD101high、至少35% CD101high、至少40% CD101high、至少45% CD101high、至少50% CD101high、至少55% CD101high、至少60% CD101high、至少65% CD101high、至少70% CD101high、至少75% CD101high、至少80% CD101high、至少85% CD101high、至少90% CD101high、至少95% CD101high、至少98% CD101high或至少99% CD101high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為CD101陽性(CD101+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% CD101陽性、至少80% CD101陽性、至少85% CD101陽性、至少90% CD101陽性、至少95% CD101陽性、至少98% CD101陽性或至少99% CD101陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，CD101群體為CD101低(CD101lo)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% CD101lo、至少30% CD101lo、至少35% CD101lo、至少40% CD101lo、至少45% CD101lo、至少50% CD101lo、至少55% CD101lo、至少60% CD101lo、至少65% CD101lo、至少70% CD101lo、至少75% CD101lo、至少80% CD101lo、至少85% CD101lo、至少90% CD101lo、至少95% CD101lo、至少98% CD101lo或至少99% CD101lo(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，該TIL群體不超過5% CD101陽性、不超過10% CD101陽性、不超過15% CD101陽性、不超過20% CD101陽性、不超過25% CD101陽性、不超過30% CD101陽性、35% CD101陽性、不超過40% CD101陽性、不超過45% CD101陽性、不超過50% CD101陽性、不超過55% CD101陽性、不超過60% CD101陽性。在一些實施例中，CD101lo由不超過5% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101lo由不超過10% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101lo由不超過15% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101lo由不超過20% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101lo由不超過25% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101lo由不超過30% CD101陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低25%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低30%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低35%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低40%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低45%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低50%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低55%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低60%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低65%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低70%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低75%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低80%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低85%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低90%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準低95%、或所表現的CD101比對照或基線CD101水準低99%。
在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101為對照或基線CD101水準的1倍或更低。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101為對照或基線CD101水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更低。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低一倍。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低兩倍。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低三倍。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低四倍。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低五倍。在一些實施例中，CD101lo由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準低十倍。
在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% CD101陽性、至少80% CD101陽性、至少85% CD101陽性、至少90% CD101陽性、至少95% CD101陽性、至少98% CD101陽性、或至少99% CD101陽性或100% CD101陽性。在一些實施例中，CD101high由至少80% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由至少85% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由至少90% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由至少95% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由至少98% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由至少99% CD101陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，CD101high由100% CD101陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少25%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少30%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少35%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少40%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少45%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少50%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少55%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少60%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少65%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少70%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少75%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少80%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少85%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少90%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少95%、所表現的CD101比對照或基線CD101水準高至少99%、或所表現的CD101比對照或基線CD101水準高100%。
在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101為對照或基線CD101水準的1倍或更高。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101為對照或基線CD101水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高一倍。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高兩倍。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高三倍。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高四倍。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高五倍。在一些實施例中，CD101high由TIL群體指示，其中TIL所表現的CD101比對照或基線CD101水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗CD101抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行CD101陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗CD101抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類CD101多株抗體、山羊抗人類CD101多株抗體等。在一些實施例中，抗CD101抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗CD101抗體包含但不限於例如BB27。
在一些實施例中，用於預選之抗CD101抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現CD101之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗CD101抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD101抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗CD101抗體治療。
在患者先前已用第一抗CD101抗體治療之一些實施例中，預選係藉由用第二抗CD101抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行，該第二抗CD101抗體與初代細胞群體TIL之表面上的CD101之結合不被第一抗CD101抗體阻斷。
在患者先前已用抗CD101抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD101抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在患者先前已用抗CD101人類或人源化IgG抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗CD101人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗CD101人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗CD101人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗CD101人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗CD101抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗CD101抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗CD101抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於CD101陰性TIL、CD101中間TIL及CD101陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，CD101high群體定義為超過在PBMC中觀察到之CD101陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間CD101+群體涵蓋PBMC中之CD101+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之CD101預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定CD101高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對CD101高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的CD101之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，CD101陽性(CD101+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，CD101陽性TIL為CD101high TIL。在一些實施例中，CD101陽性TIL為CD101中間TIL。在一些實施例中，CD101+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD101+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，CD101+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，CD101+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗CD101抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇CD101+及CD3+ TIL。在一些實施例中，在珠粒選擇方法中採用的抗CD101抗體包含但不限於例如BB27。
在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集CD101+細胞及/或CD101陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇CD101陽性TIL以獲得富含CD101之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% CD101陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% CD101陽性TIL、至少20%至80% CD101陽性TIL、至少30%至80% CD101陽性TIL、至少40%至80% CD101陽性TIL、至少50%至80% CD101陽性TIL、至少10%至70% CD101陽性TIL、至少20%至70% CD101陽性TIL、至少30%至70% CD101陽性TIL、或至少40%至70% CD101陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇CD101陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗CD101 IgG4抗體，該單株抗CD101 IgG4抗體經由在CD101之IgV域外部之N端環與CD101結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中CD101陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含CD101之TIL群體。
在一些實施例中，CD101陽性TIL為CD101high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含CD101之TIL群體為CD101陽性TIL。
在一些實施例中，選擇CD101陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL CD101陽性TIL、至少1×105
個TIL CD101陽性TIL、至少1×106
個TIL CD101陽性TIL、至少1×107
個TIL CD101陽性TIL、至少1×108
個TIL CD101陽性TIL。在一些實施例中，選擇CD101陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL CD101陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗CD101 IgG4抗體，該單株抗CD101 IgG4抗體經由在CD101之IgV域外部之N端環與CD101結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含CD101之TIL群體。在一些實施例中，單株抗CD101 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗CD101抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD101high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD101表現量之參考值。參考樣本中之CD101陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD101表現量係於來自健康個體之CD3+/CD101+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD101的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD101high T細胞之CD101免疫染色的最小強度。因此，CD101表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD101high細胞。在一些情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對CD101採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為CD101high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之CD101表現量之參考值。參考樣本中之CD101陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，CD101表現量係於來自健康個體之CD3+/CD101+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之CD101的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為CD101high T細胞之CD101免疫染色的最小強度。因此，CD101表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為CD101high細胞。在一些情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，CD101high TIL表示彼等具有最高CD101免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的CD101陽性(CD101+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗CD101抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗CD101抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗CD101-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇CD101陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE (藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。10.
LAG3 - LAG3之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈LAG3陽性(LAG3+)。
在一些實施例中，針對諸如LAG3(Philip, M.等人,《自然》545(7655):452-456(2017))之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈LAG3陽性(LAG3+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為LAG3陽性(LAG3+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% LAG3陽性、至少80% LAG3陽性、至少85% LAG3陽性、至少90% LAG3陽性、至少95% LAG3陽性、至少98% LAG3陽性或至少99% LAG3陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，LAG3群體為LAG3high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% LAG3high、至少30% LAG3high、至少35% LAG3high、至少40% LAG3high、至少45% LAG3high、至少50% LAG3high、至少55% LAG3high、至少60% LAG3high、至少65% LAG3high、至少70% LAG3high、至少75% LAG3high、至少80% LAG3high、至少85% LAG3high、至少90% LAG3high、至少95% LAG3high、至少98% LAG3high或至少99% LAG3high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% LAG3陽性、至少80% LAG3陽性、至少85% LAG3陽性、至少90% LAG3陽性、至少95% LAG3陽性、至少98% LAG3陽性、或至少99% LAG3陽性或100% LAG3陽性。在一些實施例中，LAG3high由至少80% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由至少85% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由至少90% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由至少95% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由至少98% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由至少99% LAG3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，LAG3high由100% LAG3陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少25%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少30%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少35%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少40%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少45%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少50%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少55%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少60%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少65%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少70%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少75%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少80%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少85%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少90%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少95%、所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高至少99%、或所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高100%。
在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3為對照或基線LAG3水準的1倍或更高。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3為對照或基線LAG3水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高一倍。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高兩倍。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高三倍。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高四倍。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高五倍。在一些實施例中，LAG3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的LAG3比對照或基線LAG3水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗LAG3抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行LAG3陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗LAG3抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類LAG3多株抗體、山羊抗人類LAG3多株抗體等。在一些實施例中，抗LAG3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗LAG3抗體包含但不限於例如TSR-033、Sym022(抗LAG-3)、BMS 986016、GSK2831781及/或LAG525。
在一些實施例中，用於預選之抗LAG3抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現LAG3之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗LAG3抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗LAG3抗體治療。
在患者先前已用第一抗LAG3抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗LAG3抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗LAG3抗體與初代細胞群體TIL之表面上的LAG3之結合不被第一抗LAG3抗體阻斷。
在患者先前已用抗LAG3抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗LAG3抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在一些實施例中，患者先前已用抗LAG3人類或人源化IgG抗體治療，且初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗LAG3人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗LAG3人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗LAG3人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗LAG3人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗LAG3抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗LAG3抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗LAG3抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於LAG3陰性TIL、LAG3中間TIL及LAG3陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，LAG3high群體定義為超過在PBMC中觀察到之LAG3陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間LAG3+群體涵蓋PBMC中之LAG3+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之LAG3預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定LAG3高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對LAG3高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的LAG3之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，LAG3陽性(LAG3+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，LAG3陽性TIL為LAG3high TIL。在一些實施例中，LAG3陽性TIL為LAG3中間TIL。在一些實施例中，LAG3+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，LAG3+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，LAG3+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，LAG3+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗LAG3抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇LAG3+及CD3+ TIL。在一些實施例中，在珠粒選擇方法中採用的抗LAG3抗體包含但不限於例如TSR-033、Sym022(抗LAG-3)、BMS 986016、GSK2831781及/或LAG525。
在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集LAG3+細胞及/或LAG3陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇LAG3陽性TIL以獲得富含LAG3之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% LAG3陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% LAG3陽性TIL、至少20%至80% LAG3陽性TIL、至少30%至80% LAG3陽性TIL、至少40%至80% LAG3陽性TIL、至少50%至80% LAG3陽性TIL、至少10%至70% LAG3陽性TIL、至少20%至70% LAG3陽性TIL、至少30%至70% LAG3陽性TIL、或至少40%至70% LAG3陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇LAG3陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗LAG3 IgG4抗體，該單株抗LAG3 IgG4抗體經由在LAG3之IgV域外部之N端環與LAG3結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中LAG3陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含LAG3之TIL群體。
在一些實施例中，LAG3陽性TIL為LAG3high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL。
在一些實施例中，選擇LAG3陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL LAG3陽性TIL、至少1×105
個TIL LAG3陽性TIL、至少1×106
個TIL LAG3陽性TIL、至少1×107
個TIL LAG3陽性TIL、至少1×108
個TIL LAG3陽性TIL。在一些實施例中，選擇LAG3陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL LAG3陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗LAG3 IgG4抗體，該單株抗LAG3 IgG4抗體經由在LAG3之IgV域外部之N端環與LAG3結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含LAG3之TIL群體。在一些實施例中，單株抗LAG3 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗LAG3抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為LAG3high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之LAG3表現量之參考值。參考樣本中之LAG3陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，LAG3表現量係於來自健康個體之CD3+/LAG3+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之LAG3的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為LAG3high T細胞之LAG3免疫染色的最小強度。因此，LAG3表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為LAG3high細胞。在一些情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對LAG3採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為LAG3high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之LAG3表現量之參考值。參考樣本中之LAG3陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，LAG3表現量係於來自健康個體之CD3+/LAG3+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之LAG3的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為LAG3high T細胞之LAG3免疫染色的最小強度。因此，LAG3表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為LAG3high細胞。在一些情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，LAG3high TIL表示彼等具有最高LAG3免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的LAG3陽性(LAG3+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗LAG3抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗LAG3抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗LAG3-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇LAG3陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。11.
TIM3 - TIM3之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIM3陽性(TIM3+)。
在一些實施例中，針對諸如TIM3之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIM3陽性(TIM3+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為TIM3陽性(TIM3+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% TIM3陽性、至少80% TIM3陽性、至少85% TIM3陽性、至少90% TIM3陽性、至少95% TIM3陽性、至少98% TIM3陽性或至少99% TIM3陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，TIM3群體為TIM3high。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% TIM3high、至少30% TIM3high、至少35% TIM3high、至少40% TIM3high、至少45% TIM3high、至少50% TIM3high、至少55% TIM3high、至少60% TIM3high、至少65% TIM3high、至少70% TIM3high、至少75% TIM3high、至少80% TIM3high、至少85% TIM3high、至少90% TIM3high、至少95% TIM3high、至少98% TIM3high或至少99% TIM3high(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% TIM3陽性、至少80% TIM3陽性、至少85% TIM3陽性、至少90% TIM3陽性、至少95% TIM3陽性、至少98% TIM3陽性、或至少99% TIM3陽性或100% TIM3陽性。在一些實施例中，TIM3high由至少80% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由至少85% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由至少90% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由至少95% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由至少98% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由至少99% TIM3陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIM3high由100% TIM3陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少25%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少30%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少35%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少40%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少45%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少50%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少55%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少60%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少65%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少70%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少75%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少80%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少85%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少90%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少95%、所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高至少99%、或所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高100%。
在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3為對照或基線TIM3水準的1倍或更高。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3為對照或基線TIM3水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高一倍。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高兩倍。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高三倍。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高四倍。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高五倍。在一些實施例中，TIM3high由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIM3比對照或基線TIM3水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗TIM3抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行TIM3陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗TIM3抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類TIM3多株抗體、山羊抗人類TIM3多株抗體等。在一些實施例中，抗TIM3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗TIM3抗體包含但不限於例如MAB2365、PA1-41295、ab185703、TSR-022、LY3321367、BGB-A425、Sym023、MBG453及/或INCAGN02390。
在一些實施例中，用於預選之抗TIM3抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現TIM3之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗TIM3抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗TIM3抗體治療。
在患者先前已用第一抗TIM3抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗TIM3抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗TIM3抗體與初代細胞群體TIL之表面上的TIM3之結合不被第一抗TIM3抗體阻斷。
在患者先前已用抗TIM3抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗TIM3抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在一些實施例中，患者先前已用抗TIM3人類或人源化IgG抗體治療，且初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗TIM3人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗TIM3人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗TIM3人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗TIM3人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗TIM3抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗TIM3抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗TIM3抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於TIM3陰性TIL、TIM3中間TIL及TIM3陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，TIM3high群體定義為超過在PBMC中觀察到之TIM3陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間TIM3+群體涵蓋PBMC中之TIM3+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之TIM3預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定TIM3高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對TIM3高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的TIM3之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，TIM3陽性(TIM3+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，TIM3陽性TIL為TIM3high TIL。在一些實施例中，TIM3陽性TIL為TIM3中間TIL。在一些實施例中，TIM3+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，TIM3+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，TIM3+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，TIM3+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗TIM3抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇TIM3+及CD3+ TIL。在一些實施例中，抗TIM3抗體包含但不限於例如MAB2365、PA1-41295、ab185703、TSR-022、LY3321367、BGB-A425、Sym023、MBG453及/或INCAGN02390。
在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集TIM3+細胞及/或TIM3陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇TIM3陽性TIL以獲得富含TIM3之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% TIM3陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% TIM3陽性TIL、至少20%至80% TIM3陽性TIL、至少30%至80% TIM3陽性TIL、至少40%至80% TIM3陽性TIL、至少50%至80% TIM3陽性TIL、至少10%至70% TIM3陽性TIL、至少20%至70% TIM3陽性TIL、至少30%至70% TIM3陽性TIL、或至少40%至70% TIM3陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇TIM3陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗TIM3 IgG4抗體，該單株抗TIM3 IgG4抗體經由在TIM3之IgV域外部之N端環與TIM3結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中TIM3陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含TIM3之TIL群體。
在一些實施例中，TIM3陽性TIL為TIM3high TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL。
在一些實施例中，選擇TIM3陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL TIM3陽性TIL、至少1×105
個TIL TIM3陽性TIL、至少1×106
個TIL TIM3陽性TIL、至少1×107
個TIL TIM3陽性TIL、至少1×108
個TIL TIM3陽性TIL。在一些實施例中，選擇TIM3陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL TIM3陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗TIM3 IgG4抗體，該單株抗TIM3 IgG4抗體經由在TIM3之IgV域外部之N端環與TIM3結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含TIM3之TIL群體。在一些實施例中，單株抗TIM3 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗TIM3抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為TIM3high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之TIM3表現量之參考值。參考樣本中之TIM3陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，TIM3表現量係於來自健康個體之CD3+/TIM3+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之TIM3的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為TIM3high T細胞之TIM3免疫染色的最小強度。因此，TIM3表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為TIM3high細胞。在一些情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對TIM3採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為TIM3high，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之TIM3表現量之參考值。參考樣本中之TIM3陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，TIM3表現量係於來自健康個體之CD3+/TIM3+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之TIM3的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為TIM3high T細胞之TIM3免疫染色的最小強度。因此，TIM3表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為TIM3high細胞。在一些情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，TIM3high TIL表示彼等具有最高TIM3免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的TIM3陽性(TIM3+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗TIM3抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗TIM3抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗TIM3-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇TIM3陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE (藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。12.
TIGIT - TIGIT之預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIGIT陽性(TIGIT+)。
在一些實施例中，針對諸如TIGIT(Philip, M.等人,《自然》545(7655):452-456(2017))之耗竭標誌預選本發明之TIL。根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIGIT陽性(TIGIT+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生多於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為TIGIT陽性(TIGIT+)(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少75% TIGIT陽性、至少80% TIGIT陽性、至少85% TIGIT陽性、至少90% TIGIT陽性、至少95% TIGIT陽性、至少98% TIGIT陽性或至少99% TIGIT陽性(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，TIGIT群體為TIGIThigh。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL為至少25% TIGIThigh、至少30% TIGIThigh、至少35% TIGIThigh、至少40% TIGIThigh、至少45% TIGIThigh、至少50% TIGIThigh、至少55% TIGIThigh、至少60% TIGIThigh、至少65% TIGIThigh、至少70% TIGIThigh、至少75% TIGIThigh、至少80% TIGIThigh、至少85% TIGIThigh、至少90% TIGIThigh、至少95% TIGIThigh、至少98% TIGIThigh或至少99% TIGIThigh(例如，在預選之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，該TIL群體為至少75% TIGIT陽性、至少80% TIGIT陽性、至少85% TIGIT陽性、至少90% TIGIT陽性、至少95% TIGIT陽性、至少98% TIGIT陽性、或至少99% TIGIT陽性或100% TIGIT陽性。在一些實施例中，TIGIThigh由至少80% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由至少85% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由至少90% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由至少95% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由至少98% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由至少99% TIGIT陽性之TIL群體指示。在一些實施例中，TIGIThigh由100% TIGIT陽性之TIL群體指示。
在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少25%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少30%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少35%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少40%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少45%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少50%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少55%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少60%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少65%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少70%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少75%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少80%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少85%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少90%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少95%、所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高至少99%、或所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高100%。
在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT為對照或基線TIGIT水準的1倍或更高。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT為對照或基線TIGIT水準的一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更高。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高一倍。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高兩倍。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高三倍。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高四倍。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高五倍。在一些實施例中，TIGIThigh由TIL群體指示，其中TIL所表現的TIGIT比對照或基線TIGIT水準高十倍。
在一些實施例中，藉由用抗TIGIT抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行TIGIT陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗TIGIT抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類TIGIT多株抗體、山羊抗人類TIGIT多株抗體等。在一些實施例中，抗TIGIT抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗TIGIT抗體包含但不限於例如替拉格魯單抗(tiragolumab)(抗TIGIT、RG6058)、BMS-986207、OMP-313M32、BGB-A1217、IBI939、COM902、EOS884448(EOS-448)、厄提吉利單抗(etigilimab)、MK-7684及/或AB154。
在一些實施例中，用於預選之抗TIGIT抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現TIGIT之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗TIGIT抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗TIGIT抗體治療。
在患者先前已用第一抗TIGIT抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗TIGIT抗體染色初代細胞群體、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來進行預選，該第二抗TIGIT抗體與初代細胞群體TIL之表面上的TIGIT之結合不被第一抗TIGIT抗體阻斷。
在患者先前已用抗TIGIT抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗TIGIT抗體之Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在患者先前已用抗TIGIT人類或人源化IgG抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗TIGIT人類或人源化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗TIGIT人類或人源化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗TIGIT人類或人源化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗TIGIT人類或人源化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗TIGIT抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗TIGIT抗體接觸且接著用抗Fc抗體染色初代細胞群體TIL來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未經溶解之抗TIGIT抗體之Fc區結合。
在一些實施例中，使用細胞分選方法進行預選。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於TIGIT陰性TIL、TIGIT中間TIL及TIGIT陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本本身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，TIGIThigh群體定義為超過在PBMC中觀察到之TIGIT陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間TIGIT+群體涵蓋PBMC中之TIGIT+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，各預選程序之TIGIT預選之圈選為固定的。在一些實施例中，固定的圈選程序為CD3+圈選程序。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體來判定。在一些實施例中，圈選程序並非固定的，而是基於在各分選事件期間獲得的群體為CD3+圈選程序來判定。
在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約0.5% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，當用PBMC設定TIGIT高圈選時，平均螢光強度(MFI)之圈選及補償在約1.75% ± 0.25%之範圍內。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的平均值。在一些實施例中，MFI計算採用自1、2、3或4或更多批或批次之PBMC量測的中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對TIGIT高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的TIGIT之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，TIGIT陽性(TIGIT+)細胞係藉由FAC及/或其他流動式細胞測量術方法進行分選。在一些實施例中，TIGIT陽性TIL為TIGIThigh TIL。在一些實施例中，TIGIT陽性TIL為TIGIT中間TIL。在一些實施例中，TIGIT+細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，TIGIT+細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，TIGIT+高細胞藉由採用珠粒選擇方法來進行分選。在一些實施例中，TIGIT+高細胞藉由採用磁珠選擇方法來進行分選。在一些實施例中，珠粒選擇採用抗體結合之珠粒(例如但不限於市售珠粒，諸如美天旎或飛世爾)來進行選擇。在一些實施例中，抗TIGIT抗體直接或間接與珠粒結合。在一些實施例中，珠粒選擇過程選擇TIGIT+及CD3+ TIL。在一些實施例中，抗TIGIT抗體包含但不限於例如替拉格魯單抗(抗TIGIT、RG6058)、BMS-986207、OMP-313M32、BGB-A1217、IBI939、COM902、EOS884448(EOS-448)、厄提吉利單抗、MK-7684及/或AB154。
在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液不包含血清。在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液包含血清。在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液包含用以減小或減少分選緩衝液與下游緩衝液及/或培養基之間的黏度差異的組分。在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液僅包含人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液包含等量之HSA及PBS/EDTA緩衝液。在一些實施例中，用於收集TIGIT+細胞及/或TIGIT陰性細胞之收集緩衝液包含1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1比率之HSA及PBS/EDTA緩衝液。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇TIGIT陽性TIL以獲得富含TIGIT之TIL群體，其包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4% TIGIT陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% TIGIT陽性TIL、至少20%至80% TIGIT陽性TIL、至少30%至80% TIGIT陽性TIL、至少40%至80% TIGIT陽性TIL、至少50%至80% TIGIT陽性TIL、至少10%至70% TIGIT陽性TIL、至少20%至70% TIGIT陽性TIL、至少30%至70% TIGIT陽性TIL、或至少40%至70% TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇TIGIT陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗TIGIT IgG4抗體，該單株抗TIGIT IgG4抗體經由在TIGIT之IgV域外部之N端環與TIGIT結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中TIGIT陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含TIGIT之TIL群體。
在一些實施例中，TIGIT陽性TIL為TIGIThigh TIL。
在一些實施例中，至少70%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，100%之富含TIGIT之TIL群體為TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，選擇TIGIT陽性TIL，直至存在至少1×104
個TIL TIGIT陽性TIL、至少1×105
個TIL TIGIT陽性TIL、至少1×106
個TIL TIGIT陽性TIL、至少1×107
個TIL TIGIT陽性TIL、至少1×108
個TIL TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，選擇TIGIT陽性TIL，直至存在至少1×106
個TIL TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，如圖1之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗TIGIT IgG4抗體，該單株抗TIGIT IgG4抗體經由在TIGIT之IgV域外部之N端環與TIGIT結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於螢光團之流式細胞分選以獲得富含TIGIT之TIL群體。在一些實施例中，單株抗TIGIT IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗TIGIT抗體與EH12.2H7或納武單抗結合相同的抗原決定基。
為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為TIGIThigh，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之TIGIT表現量之參考值。參考樣本中之TIGIT陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，TIGIT表現量係於來自健康個體之CD3+/TIGIT+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之TIGIT的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為TIGIThigh T細胞之TIGIT免疫染色的最小強度。因此，TIGIT表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為TIGIThigh細胞。在一些情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，針對TIGIT採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為TIGIThigh，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之TIGIT表現量之參考值。參考樣本中之TIGIT陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，TIGIT表現量係於來自健康個體之CD3+/TIGIT+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之TIGIT的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為TIGIThigh T細胞之TIGIT免疫染色的最小強度。因此，TIGIT表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為TIGIThigh細胞。在一些情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，TIGIThigh TIL表示彼等具有最高TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，可以在進行初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)之前冷凍所選擇的TIGIT陽性(TIGIT+)細胞。
a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗TIGIT抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗TIGIT抗體及抗CD3-FITC的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗TIGIT-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州賽默飛世爾，目錄號L23105)的混合物染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇TIGIT陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一擴增進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含(但不限於)螢光素染料。螢光素染料之實例包括(但不限於)5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括(但不限於)四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包括(但不限於)Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。13.
多重預選選擇(如圖1之步驟A2所例示)
在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD39陽性(CD39+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD38陽性(CD38+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD103陽性(CD103+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈LAG3陽性(LAG3+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIM3陽性(TIM3+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈TIGIT陽性(TIGIT+)。
在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及CD39陽性(CD39+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及CD103陽性(CD103+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD39陽性(CD39+)及CD103陽性(CD103+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD39陽性(CD39+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)及CD103陽性(CD103+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD39陽性(CD39+)及CD103陽性(CD103+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD103陽性(CD103+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈CD39陽性(CD39+)、CD103陽性(CD103+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及LAG3陽性(LAG3+陽性)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及TIM3陽性(TIM3+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及TIGIT陽性(TIGIT+)。
在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之任何兩者呈陽性。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之任何三者呈陽性。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之任何四者呈陽性。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之任何五者呈陽性。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之任何六者呈陽性。在一些實施例中，TIL在初始第一擴增之前係經預選而針對PD-1陽性(PD-1+)、CD39陽性(CD39+)、CD38陽性(CD38+)、CD103陽性(CD103+)、CD101陽性(CD101+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、TIM3陽性(TIM3+)及/或TIGIT陽性(TIGIT+)中之所有者呈陽性。
在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、CD38陽性(CD38+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1high、LAG3high、CD38lo及CD101lo。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD38陽性(CD38+)。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1high、LAG3high及CD38lo。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1high、LAG-3high及CD101lo。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及CD38陽性(CD38+)。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1high及CD38lo。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1陽性(PD-1+)及CD101陽性(CD101+)。在一些實施例中，TIL係經預選而呈PD-1high及CD101lo。
a. 螢光方法/分析
本發明提供了包含例如流動式細胞測量術方法(諸如FACS)之方法，其中該等分析採用經螢光標記之抗體來進行偵測。可用於此等分析及實施例之螢光染料為此項技術中所熟知。在一些實施例中，螢光染料包含但不限於例如PE、APC、PE-Cy5、Alexa Fluor 647、PE-Cy-7、PerCP-Cy5.5、Alexa Fluor 488、Pacific Blue、FITC、AmCyan、APC-Cy7、PerCP及APC-H7。
在一些實施例中，針對PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為「高」，本領域中熟習此項技術者可利用對應獲自一個或多個健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT表現量之參考值。參考樣本中之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT表現量係於來自健康個體之CD3+/(PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+)周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh T細胞之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色的最小強度。因此，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被視為PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh細胞。在一些情況下，PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL表示彼等具有最高PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL表示彼等具有最高PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL表示彼等具有最高PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一情況下，PD-1high、CD39高、CD38high、CD103high、CD101high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL表示彼等具有最高PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。
在一些實施例中，相對於腫瘤樣本中之TIL總數或相對於參考樣本中之PBMC總數定量PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL(其中陽性TIL分別展現出等於或高於預定參考值1(例如稱為REF1)之PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT免疫染色強度)，得到腫瘤樣本中PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL之百分比(%)。
在一些實施例中，用於建立PD-1免疫染色強度之預定參考值1(REF1)的方法包括以下步驟：i)自健康人類供體提供至少一個血液樣本；ii)自該血液樣本分離周邊血液單核細胞(PBMC)；iii)在允許特定抗原-抗體與針對人類T淋巴球標誌(M，諸如CD3)之抗體(例如經標記抗體)結合且與針對PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之經標記抗體結合的條件下培育步驟(ii)之PBMC樣本，從而允許偵測該PBMC樣本中之M+細胞，包含PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+T細胞及M+/(PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT)T細胞；iv)量測步驟(iii)之M+/(PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ T細胞之PD-1免疫染色強度；v)選擇步驟(iv)之M+/(PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+)T細胞中具有最高PD-1免疫染色強度的上限0.50%至上限1.5%，較佳上限1%；及vi)判定步驟(v)之M+/(PD-1+、CD39+、CD38+、CD103+、CD101+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+)T細胞之上限0.50%至上限1.5%，較佳上限1.0%中之最小PD-1免疫染色強度，從而建立預定參考值(REF)或基線值。
在此實施例中，極為有利的係，使用與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體連接之螢光染劑，從而使得流動式細胞儀能夠基於尺寸、粒度及螢光來進行分選。因此，流動式細胞儀可經組態以提供關於以下各者之資訊：細胞樣本之相對尺寸(前向散射或「FSC」)、粒度或內部複雜性(側面散射或「SSC」)及相對螢光強度。螢光基於PD-1表現、CD39表現、CD38表現、CD103表現、CD101表現、LAG3表現、TIM3表現及/或TIGIT表現分類，使得細胞儀能夠鑑別並富集此等單核球。
在一些實施例中，螢光方法或分析用作將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法的部分。該方法包括以下步驟：
(a) 獲得及/或接受自個體切除且碎解之腫瘤樣本的第一TIL群體，以產生包括該第一TIL群體之腫瘤碎解物；
(b) 自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體，其中至少0.5%至90%之範圍的第一TIL群體為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL；
(c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體；
(d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中添加之APC的數目係步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及
(f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少0.5%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少0.5%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少0.5%至70%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少0.5%至60%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少0.5%至50%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少1%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少1%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少5%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少5%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少10%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少10%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少15%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少15%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少20%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少20%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少30%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少30%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少40%至90%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，步驟(b)中之選擇包括選擇至少40%至80%之範圍的第一TIL群體作為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，步驟(b)之選擇包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之與PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT結合之抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體(或與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT結合之其他抗體)，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體。
在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於PD-1、CD39、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT中之任何一者或多者之陰性、中間及高TIL陽性的低、中及高強度水準。
在一些實施例中，該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL為PD-1high TIL。在一些實施例中，PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。在一些實施例中，至少80%之富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體為PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
在一些實施例中，第一群體及PBMC群體中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於以下之低、中及高強度水準：PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陰性TIL；PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT中間TIL；及PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。在一些實施例中，PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。在一些實施例中，至少80%之富含PD-1、CD39、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL，至少80%之富含LAG3之TIL群體為LAG3陽性TIL，至少80%之富含TIM3之TIL群體為TIM3陽性TIL，及/或至少80%之富含TIGIThigh之TIL群體為PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，螢光團之強度可藉由直接強度或標準化強度量測。在一些實施例中，該強度與對照或參考強度相比較。在一些實施例中，螢光強度與參考或對照強度相比增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%,65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更多。在一些實施例中，與參考或對照強度相比至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更多之螢光強度增加指示參考標記之陽性TIL群體。
在一些實施例中，螢光團之強度可藉由直接強度或標準化強度量測。在一些實施例中，該強度與對照或參考強度相比較。在一些實施例中，螢光強度與參考或對照強度相比增加至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍或更多。在一些實施例中，與參考或對照強度相比至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更多之螢光強度增加指示參考標記之陽性TIL群體。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，調整用於判定平均螢光強度(MFI)的FACS分選之圈選及補償方法，使得針對PD-1高圈選，對照PBMC(例如來自健康供體之PBMC)的PD-1之MFI在約0.5%至2.0%之範圍內(例如約0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1.0%、1.05%、1.1%、1.15%、1.2%、1.25%、1.3%、1.35%、1.4%、1.45%、1.5%、1.55%、1.6%、1.65%、1.7%、1.75%、1.8%、1.85%、1.9%、1.95%或2.0%)。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之平均值。在一些實施例中，MFI計算為使用至少兩個PBMC樣本量測之中位值。
在一些實施例中，使用選自由約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%或約10%組成之群組的標準化螢光強度之最小截留值，藉由流動式細胞測量術測定PD-1high表現、LAG3高表現、TIM3高表現及/或TIGIT高表現。
對照、對照值、參考、參考值或參考水準可為絕對值；相對值；具有上限或下限之值；值之範圍；均值；中位值；平均值；或與特定對照或基線值之比較值。參考值可基於個別樣本值，諸如自所測試個體之樣本獲得但時間點較早的值。參考值可基於大量樣本，諸如來自實齡匹配群組之個體群體，或基於包含或不包含待測試樣本之樣本池。B. 步驟 B ：初始第一擴增
在一些實施例中，本發明方法提供較年輕TIL，該等較年輕TIL相較於較老TIL(亦即，在向個體/患者投予之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療益處。年輕TIL之特徵已在文獻中描述，例如Donia等人, 《斯堪的納維亞免疫學雜誌(Scandinavian Journal of Immunology
)》,
75:157-167(2012)；Dudley等人, 《臨床癌症研究(Clin Cancer Res
)》, 16:6122-6131(2010)；Huang等人, 《免疫療法雜誌》, 28(3):258-267(2005)；Besser等人, 《臨床癌症研究》, 19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人, 《免疫療法雜誌》 32:415-423(2009)；Robbins等人, 《免疫學雜誌(J Immunol
)》 2004; 173:7125-7130；Shen等人, 《免疫療法雜誌》, 30:123-129(2007)；Zhou等人, 《免疫療法雜誌》, 28:53-62(2005)；及Tran等人, 《免疫療法雜誌》, 31:742-751(2008)，其皆以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該過程為如圖1A中所提供以及PCT/US2018/012633中所描述之過程。
在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟A中所描述的腫瘤片段及/或腫瘤片段之分割或碎解(例如為了獲得全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液)之後，將所得細胞在有利於TIL但不利於腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、OKT-3及飼養細胞(例如抗原呈現飼養細胞或同種異體經照射PBMC)之血清中。在一些實施例中，IL-2、OKT-3及飼養細胞在培養起始時(例如在第0天)與腫瘤碎解物及/或腫瘤片段一起添加。在一些實施例中，腫瘤碎解物及/或腫瘤片段以每容器至多60個片段(在採用片段之實施例中)及6000 IU/mL IL-2培育於容器中。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天之時段，通常1至8天，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此時段稱為活化I。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天之時段，通常1至7天，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至8天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至7天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至3天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至4天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至5天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至6天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生5至8天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生5至7天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約6至8天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約6至7天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約7至8天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約7天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約8天之時段，產生通常約1 × 108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。
在一些實施例中，此初始第一擴增發生約6至11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約7至11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約8至11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約9至11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約10至11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約9天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約10天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約11天之時段，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。
可投予任何合適劑量之TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目為約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
之範圍內。
在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始第一擴增步驟(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B中所描述之彼等者，其可包含稱為預REP或初始REP之過程且其自第0天及/或自培養起始含有飼養細胞)進行，接著進行如下文步驟D及本文所描述之快速第二擴增(步驟D，包含稱為快速擴增方案(REP)步驟之過程)，隨後進行視情況選用之冷凍保存，且接著進行如下文及本文所描述之第二步驟D(包含稱為再刺激REP步驟之過程)。獲自此過程之TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。在一些實施例中，腫瘤片段介於約1 mm3
與10 mm3
之間。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在一些實施例中，第一擴增培養基包括2-巰基乙醇(亦稱為β-巰基乙醇)。在一些實施例中，第一擴增培養基(例如有時稱為CM1或第一細胞培養基)包括55µ 2-巰基乙醇。
在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段。在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段被放入少於或等於4個容器中。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，少於或等於60個腫瘤片段被放入1個容器中。在一些實施例中，各容器包括每容器少於或等於500 mL培養基。在一些實施例中，培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，培養基包括抗原呈現飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在一些實施例中，培養基包括每容器2.5 × 108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每容器30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2、30 ng OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現飼養細胞。
在製備腫瘤片段、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液之後，將所得細胞(亦即，為初代細胞群體之片段及/或碎解物)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、抗原呈現飼養細胞及OKT-3之培養基中，且其允許自第0天培養起始開始TIL起動及加速生長。在一些實施例中，腫瘤碎解物及/或腫瘤片段與6000 IU/mL IL-2以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3一起培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，通常1至8天，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，在初始第一擴增期間的生長培養基包括IL-2或其變體以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天之時段，通常1至7天，產生通常約1×108
個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，在初始第一擴增期間的生長培養基包括IL-2或其變體以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3。在一些實施例中，IL-2為重組人類IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20至30×106
IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×106
IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×106
IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×106
IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4至8×106
IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5至7×106
IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×106
IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液如實例C中所描述製備。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括1000至2000 IU/mL、2000至3000 IU/mL、3000至4000 IU/mL、4000至5000 IU/mL、5000至6000 IU/mL、6000至7000 IU/mL、7000至8000 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括0.1 ng/mL至1 ng/mL、1 ng/mL至5 ng/mL、5 ng/mL至10 ng/mL、10 ng/mL至20 ng/mL、20 ng/mL至30 ng/mL、30 ng/mL至40 ng/mL、40 ng/mL至50 ng/mL、及50 ng/mL至100 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括15 ng/ml至30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。
在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基在細胞培養基中包括一種或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成0.1 µg/mL至100 µg/mL之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成20 µg/mL至40 µg/mL之濃度。
在一些實施例中，除了一種或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一擴增細胞培養基進一步包括初始濃度約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一種或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，除了一種或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一擴增細胞培養基進一步包括初始濃度約6000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一種或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施例中，CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在一些實施例中，CM為實例(參見實例A)中所描述之CM1。在一些實施例中，初始第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始第一擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞(在本文中亦稱為飼養細胞)。
在一些實施例中，本文揭示之擴增過程中使用的培養基為無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或確定培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下中之一者或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種抗生素及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM的2-巰基乙醇及2 mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM的麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2 mM之麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一種或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一種或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種微量元素及一種或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白或白蛋白取代物及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群組：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中甘胺酸之濃度在約5至200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5至250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5至400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1至45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1至250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10至500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2至110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3至175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5至500 mg/L，硫胺素之濃度為約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1至200 mg/L，鐵飽和運鐵蛋白之濃度為約1至50 mg/L，胰島素之濃度為約1至100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001至0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、一種或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人,《使用新穎無Xeno CTS免疫細胞血清替代物離體擴增人類T細胞以用於過繼免疫療法》,《臨床轉化免疫學》, 4(1) 2015(數位物件識別碼：10.1038/cti.2014.31)中所描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™用作基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為1至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為2至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為3至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為4至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為1至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為2至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為2至7天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為3至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為3至7天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為4至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為4至7天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為5至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為5至7天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為6至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為6至7天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為7至8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所提供之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為8天。在一些實施例中，初始第一擴增過程(包含諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所提供之彼等過程，其可包含有時稱為預REP或初始REP之彼等過程)為7天。
在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行1天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行1天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行2天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行2天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行3天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行3天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行4天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行4天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行5天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行5天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行6天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行6天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行7至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後進行7天。
在一些實施例中，TIL之初始第一擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在初始第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合可包含在初始第一擴增期間，包含例如在根據圖1(特別是例如圖1B)以及本文所描述之步驟B過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在初始第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合可包含在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)以及如本文所描述之步驟B過程期間。
在一些實施例中，初始第一擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟B)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-10。1.
飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增(初始REP)期間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第4至8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第4至7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第5至8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第5至7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第6至8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第6至7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第7或8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第8天期間的任何時間添加。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟B中所描述之彼等擴增以及稱為預REP或初始REP之彼等擴增)在TIL擴增起始時及初始第一擴增期間需要飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用2.5×108
個飼養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每容器2.5×108
個飼養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每GREX-10 2.5×108
個飼養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每GREX-100 2.5×108
個飼養細胞。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且如實例中所描述用於REP程序，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之複製非勝任之例示性方案。
在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在初始第一擴增第0天放入培養的初始活細胞數目，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在初始第一擴增第0天放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在初始第一擴增第0天放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序需要約2.5×108
個飼養細胞與約100×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序需要約2.5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，初始第一擴增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用於快速第二擴增之飼養細胞數目。
在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基包括每容器2.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每容器30 ng OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器每2.5×108
個抗原呈現飼養細胞500 mL培養基及15 µg OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每容器500 mL培養基及15 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、15 µg OKT-3及2.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器每2.5×108
個抗原呈現飼養細胞500 mL培養基及15 µg OKT-3。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一擴增程序在第二擴增期間需要多於TIL的過量飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖式及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，在初始第一擴增中使用人工抗原呈現細胞來替代PBMC或與PBMC組合使用。2.
細胞介素
本文所描述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)之培養基，如此項技術中所已知。
替代地，使用細胞介素之組合用於TIL之初始第一擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者之組合如國際公開案第WO 2015/189356及WO 2015/189357號中大體上所概述，在此明確地以全文引用之方式併入。因此，可能組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。
C. 步驟 C ：初始第一擴增至快速第二擴增之轉變
在一些情況下，獲自初始第一擴增(其可包含有時稱作預REP之擴增)之主體TIL群體，包含例如獲自例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所指示之步驟B的TIL群體，可進行快速第二擴增(其可包含有時稱作快速擴增方案(REP)之擴增)且接著如下文所論述冷凍保存。類似地，在經遺傳修飾之TIL將用於療法的情況下，來自初始第一擴增之經擴增TIL群體或來自快速第二擴增之經擴增TIL群體可在擴增步驟之前或在初始第一擴增之後且在快速第二擴增之前進行遺傳修飾以用於合適治療。
在一些實施例中，獲自初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所指示之步驟B)之TIL經儲存直至為了選擇而測定表型。在一些實施例中，獲自初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所指示之步驟B)之TIL不經儲存且直接進行快速第二擴增。在一些實施例中，獲自初始第一擴增之TIL在初始第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在腫瘤碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約6天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約8天發生。
在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後2天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後2天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後6天至7天發生.在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後7天發生在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後8天發生。
在一些實施例中，TIL在初級(primary)第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行快速第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所展示的步驟B至步驟D之轉變期間不經儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所描述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自初始第一擴增之TIL(第二TIL群體)直接進行快速第二擴增而無轉變期。
在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變(例如根據圖1(特別是例如圖1B)之步驟C)在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如GREX-10或GREX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增之轉變涉及容器大小之規模縱向擴大。在一些實施例中，初始第一擴增與快速第二擴增相比係在較小容器中進行。在一些實施例中，初始第一擴增在GREX-100中進行且快速第二擴增在GREX-500中進行。
在一些實施例中，在初始第一擴增結束時獲得最多1×106
個細胞TIL。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時獲得0.1 ×106
、0.2 ×106
、0.3 ×106
、0.4 ×106
、0.5 ×106
、0.6 ×106
、0.7 ×106
、0.8 ×106
、0.9 ×106
、1.0 ×106
、1.1 ×106
、1.2 ×106
、1.3 ×106
、1.4 ×106
或0.5 ×106
個TIL。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約9%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約10%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約15%至約30% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約20%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約20%至約30% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約10%至約20% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約9%至約40% PD-1high。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約15%至約30% PD-1high。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約20%至約40% PD-1high。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約20%至約30% PD-1high。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約10%至約20% PD-1high。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL為約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40% PD-1high。D. 步驟 D ：快速第二擴增
在一些實施例中，TIL細胞群體在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所指示之收集及初始第一擴增(步驟A及步驟B)及稱為步驟C之轉變之後進一步擴增數目。此進一步擴增在本文中稱為快速第二擴增，其可包含在此項技術中通常稱為快速擴增過程(快速擴增方案或REP)之擴增過程；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D中所指示之過程。快速第二擴增通常使用包括多種組分(包含飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中完成。在一些實施例中，在快速第二擴增起始後1天、2天、3天或4天(亦即，在整體Gen 3過程之第8、9、10或11天)，將TIL轉移至較大體積容器。在一些實施例中，此快速第二擴增稱為活化II。
在一些實施例中，在快速第二擴增開始時添加最多1×106
個細胞TIL。在一些實施例中，在快速第二擴增開始時添加0.1 ×106
、0.2 ×106
、0.3 ×106
、0.4 ×106
、0.5 ×106
、0.6 ×106
、0.7 ×106
、0.8 ×106
、0.9 ×106
、1.0 ×106
、1.1 ×106
、1.2 ×106
、1.3 ×106
、1.4 ×106
或0.5 ×106
個TIL。在一些實施例中，來自初始第一擴增之最大細胞密度為1e6個細胞以提供1e9來起始快速第二擴增。
在一些實施例中，TIL之快速第二擴增(其可包含有時稱作REP之擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D中所指示之過程)可使用本領域中熟習此項技術者已知之任何TIL培養瓶或容器進行。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約1天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約1天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約2天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約2天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約3天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約3天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約4天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約4天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約5天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約5天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約6天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約6天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約8天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約9天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約1天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約2天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約3天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約4天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約5天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約6天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約7天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約8天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行約10天。
在一些實施例中，快速第二擴增以兩個時段之形式發生，包括快速第二擴增內的活化II時段，接著為分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增發生1至11天之時段。在一些實施例中，快速第二擴增發生1至10天之時段，產生主體TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增發生1至9天之時段。在一些實施例中，快速第二擴增發生1至8天之時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1至4天之活化II時段，接著為1至7天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1至3天之活化II時段，接著為1至6天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1至4天之活化II時段，接著為1至6天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1至7天之活化II時段，接著為1至7天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1至3天之活化II時段，接著為1至7天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，快速第二擴增包括1天、2天、3天或4天之活化II時段，接著為1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之分瓶或分裂及進一步生長時段。在一些實施例中，分瓶或分裂亦可包含規模縱向擴大至增加數目之容器(包含例如袋子及/或GREX容器)。在一些實施例中，分瓶或分裂亦可包含規模縱向擴大至增加數目之容器(包含例如袋子及/或GREX容器)，自活化II步驟期間之數目之容器規模縱向擴大至進一步生長時段期間之增加數目之容器。
在一些實施例中，快速第二擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包含例如稱作REP之擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D中所指示之過程)進行。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)存在下擴增。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及飼養細胞存在下擴增，其中將飼養細胞添加至最終濃度，該最終濃度為存在於初始第一擴增中之飼養細胞濃度的兩倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。舉例而言，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激而快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包含例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/ml OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的美天旎生物技術公司)或UHCT-1(可購自美國加利福尼亞州聖地亞哥市的BioLegend)。TIL可藉由在第二擴增期間包含一種或多種癌症之抗原(包含其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1 :26-35(27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他適合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如實例經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二擴增之部分發生。在一些實施例中，第二擴增在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括1000至2000 IU/mL、2000至3000 IU/mL、3000至4000 IU/mL、4000至5000 IU/mL、5000至6000 IU/mL、6000至7000 IU/mL、7000至8000 IU/mL、或8000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括0.1 ng/mL至1 ng/mL、1 ng/mL至5 ng/mL、5 ng/mL至10 ng/mL、10 ng/mL至20 ng/mL、20 ng/mL至30 ng/mL、30 ng/mL至40 ng/mL、40 ng/mL至50 ng/mL、及50 ng/mL至100 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括30 ng/ml至60 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約60 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。
在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括每容器7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括每容器500 mL培養基及30 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每容器5×108
至7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括每容器500 mL培養基及30 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及5×108
至7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增中之培養基包括每容器500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及5×108
至7.5×108
個抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基包括一種或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成0.1 µg/mL至100 µg/mL之濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑之添加濃度足以在細胞培養基中達成20 µg/mL至40 µg/mL之濃度。
在一些實施例中，除了一種或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一種或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合可包含在第二擴增期間，包含例如在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)以及本文所描述之步驟D過程期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合可包含在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)以及如本文所描述之步驟D過程期間。
在一些實施例中，第二擴增可在包括IL-2、OKT-3、抗原呈現飼養細胞且視情況包括TNFRSF促效劑之補充細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在補充細胞培養基中發生。在一些實施例中，補充細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現飼養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞(亦即抗原呈現細胞)之細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第二擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1比10、約1比15、約1比20、約1比25、約1比30、約1比35、約1比40、約1比45、約1比50、約1比75、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400、或約1比500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL與PBMC之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，REP及/或快速第二擴增在培養瓶中進行，其中主體TIL與100倍或200倍過量的去活化飼養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2混合於150 ml培養基中，其中飼養細胞濃度係初始第一擴增中之飼養細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。替換培養基(通常經由抽取2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基替換來替換2/3培養基)直至細胞轉移至替代生長箱室。替代生長箱室包含G-REX培養瓶及透氣容器，如下文更充分論述。
在一些實施例中，快速第二擴增(其可包含稱為REP過程之過程)為7至9天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第二擴增為7天。在一些實施例中，第二擴增為8天。在一些實施例中，第二擴增為9天。
在一些實施例中，第二擴增(其可包含稱為REP之擴增，以及在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D中提及之彼等者)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣培養瓶(G-Rex 100，可購自美國明尼蘇達州新布賴頓市的威爾遜狼製造公司(Wilson Wolf Manufacturing Corporation))中進行，5×106
或10×106
個TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及60 ng/ml 抗CD3(OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2
中培育。在第5天，可將250 mL上清液移除並放入離心瓶中且以1500 rpm(491 × g)離心10分鐘。可將TIL沈澱物用150 mL的含有5%人類AB血清、6000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回原始GREX-100培養瓶中。當TIL在GREX-100培養瓶中連續擴增時，在第10或11天可將TIL移至較大培養瓶，諸如GREX-500。細胞可在培養的第14天收集。細胞可在培養的第15天收集。細胞可在培養的第16天收集。在一些實施例中，替換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，藉由抽取2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基替換來替換掉2/3的培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包含GREX培養瓶及透氣容器，如下文更充分論述。
在一些實施例中，本文揭示之擴增過程中使用的培養基為無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或確定培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下中之一者或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種抗生素及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM的2-巰基乙醇。
在一些實施例中，確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM的2-巰基乙醇及2 mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM之麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2 mM之麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55 mM之2-巰基乙醇。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一種或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一種或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種微量元素及一種或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白或白蛋白取代物及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群組：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中甘胺酸之濃度在約5至200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5至250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5至400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1至45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1至250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10至500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2至110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3至175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5至500 mg/L，硫胺素之濃度為約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1至200 mg/L，鐵飽和運鐵蛋白之濃度為約1至50 mg/L，胰島素之濃度為約1至100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001至0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、一種或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人,《使用新穎無Xeno CTS免疫細胞血清替代物離體擴增人類T細胞以用於過繼免疫療法》,《臨床轉化免疫學》, 4(1) 2015(數位物件識別碼：10.1038/cti.2014.31)中所描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™用作基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，在快速第二擴增(包含稱為REP之擴增)之第9至17天之間，細胞培養基補充有另一細胞培養基。在一些實施例中，在快速第二擴增(包含稱為REP之擴增)之第15至17天之間，細胞培養基補充有另一細胞培養基。在一些實施例中，在快速第二擴增(包含稱為REP之擴增)之第16天，細胞培養基補充有另一細胞培養基。在一些實施例中，在快速第二擴增(包含稱為REP之擴增)之第9、10、11、12、13、14、15、16或17天之間，細胞培養基補充有另一細胞培養基。在一些實施例中，另一細胞培養基包括IL-2、OKT-3及GlutaMAXTM
。在一些實施例中，另一細胞培養基稱為CM4，如本文及實例中所描述。
在一些實施例中，進行快速第二擴增(包含稱為REP之擴增)，且其進一步包括其中選擇具有優異腫瘤反應性之TIL之步驟。可使用此項技術中已知之任何選擇方法。舉例而言，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述之方法可用於選擇具有優異腫瘤反應性之TIL。
視情況，可在快速第二擴增(包含稱為REP擴增之擴增)之後使用此項技術中已知之標準分析來進行細胞存活性分析。舉例而言，可在主體TIL樣本上進行台盼藍排除分析，其選擇性標記死亡細胞且允許存活性評定。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(馬薩諸塞州勞倫斯市的Nexcelom Bioscience)計算及判定存活性。在一些實施例中，存活性係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動化細胞計數器方案判定。
T及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增中獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性係增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(即，TCRα/β)之表現增加。
在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及如下文更詳細論述之抗原呈現飼養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括6000 IU/mL IL-2、30 μg/培養瓶OKT-3以及如下文更詳細論述之7.5 × 108
個抗原呈現飼養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及如下文更詳細論述之抗原呈現飼養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括6000 IU/mL IL-2、30 μg/培養瓶OKT-3以及如下文更詳細論述之5×108
個抗原呈現飼養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括2-巰基乙醇(亦稱為β-巰基乙醇)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括55 µ 2-巰基乙醇。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-500。1.
飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文所描述之快速第二擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)步驟D中所描述之彼等擴增以及稱為REP之彼等擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二擴增期間需要過量的飼養細胞及/或來自包括OKT-3之飼養細胞(例如APC)培養物的培養物上清液。在許多實施例中，飼養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且如實例中所描述用於REP程序，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之複製非勝任之例示性方案。
在一些實施例中，若第7或14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二擴增第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二擴增第0天(亦即第二擴增之起始日)放入培養的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC係複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比10、約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約100 × 106
個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約100×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5 × 108
個飼養細胞與約25 × 106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的兩倍數目的飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約7.5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，快速第二擴增需要初始第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數目的飼養細胞。
在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約100×106
個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約100×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的相同數目的飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約2.5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約7.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約7.5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，快速第二擴增需要初始第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數目的飼養細胞。
在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約100 × 106
個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約100×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約50×106
個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，本文所描述之第二擴增程序需要約7.5×108
個飼養細胞與約25×106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的相同數目的飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約2.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約2.5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約5×108
個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一擴增需要約7.5×108
個飼養細胞時，快速第二擴增需要約7.5×108
個飼養細胞。
在一些實施例中，本文所描述之快速第二擴增程序在快速第二擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。在一些實施例中，PBMC以添加至初始第一擴增之PBMC濃度的兩倍添加至快速第二擴增。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖式及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，在快速第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來替代PBMC或與PBMC組合使用。
可投予任何合適劑量之TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目為約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
之範圍內。
2.
細胞介素
本文所描述之快速第二擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)之培養基，如此項技術中所已知。
替代地，使用細胞介素之組合用於TIL之快速第二擴增係另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者之組合如國際公開案第WO 2015/189356及WO 2015/189357號中大體上所概述，在此明確地以全文引用之方式併入。因此，可能組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。E. 步驟 E ：收集 TIL
在快速第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所提供之一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所提供之兩個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B)中所提供之兩個擴增步驟(一個初始第一擴增及一個快速第二擴增)之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法為此項技術中熟知的且任何此類已知方法均可與本發明過程一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自各種來源，包含例如費森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃爾默(Perkin Elmer)及Inotech Biosystems International, Inc.。本發明方法可採用任何基於細胞之收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統為基於膜之細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由費森尤斯卡比製造)進行。術語「LOVO細胞處理系統」亦係指由任何供應商製造之任何可在無菌及/或密閉系統環境中將包括細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)的儀器或裝置，從而允許連續流動及細胞處理以移除上清液或細胞培養基而不發生團塊化。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-500。
在一些實施例中，根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟E係根據本文所描述之過程進行。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉特性。在一些實施例中，採用如本文所描述之密閉系統。
在一些實施例中，根據本文所描述之方法收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法收集第14與16天之間的TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第14天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第15天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第16天收集TIL。F. 步驟 F ：最終調配 / 轉移至輸注袋
在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中以例示性次序提供且如上文及本文中所概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於向患者投予。在一些實施例中，一旦使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，將其轉移至容器以用於向患者投予。
在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之TIL係以醫藥組成物之形式向患者投予。在一些實施例中，醫藥組成物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。如本文所揭示擴增之TIL可藉由如此項技術中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，TIL係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投予，其較佳持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴內。G. PBMC 飼養細胞比
在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法(參見例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H))的培養基包含抗CD3抗體，例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合在TIL群體中誘導T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab')2片段，前者通常較佳；參見例如Tsoukas等人,《免疫學雜誌》1985,135
, 1719，特此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，PBMC飼養細胞層之數目如下計算：
A. T細胞體積(直徑10 µm)：V
= (4/3) πr3
=523.6 µm3
B. 具有40 µm(4個細胞)高度之G-Rex 100(M)體積：V
= (4/3) πr3
= 4×1012
µm3
C. 填滿體積B所需的細胞數目：4×1012
µm3
/523.6 µm3
= 7.6×108
µm3
* 0.64 = 4.86×108
D. 可在4D空間中被最佳活化的細胞數目：4.86×108
/24 = 20.25×106
E. 外推至G-Rex 500之飼養細胞及TIL數目：TIL：100×106
及飼養細胞：2.5×109
在此計算中，使用在具有100 cm2
基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數目。計算得到約5×108
之實驗結果為T細胞活化臨限，其密切反映NCI實驗資料。(1)
(C)乘數(0.64)係如Jaeger及Nagel在1992年計算的當量球體隨機填充密度(2)
。(D)除數24係4維空間中可接觸類似物體的當量球體數目「牛頓數」。(3)
(1)
Jin, Jianjian等人, 《透氣培養瓶中人類腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)生長至患者治療所需數目之簡化方法(Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment)》.《免疫療法雜誌》2012年4月; 35(3): 283-292。
(2)
Jaeger HM, Nagel SR.《顆粒狀態之物理學(Physics of the granular state)》.《科學(Science)》. 1992年3月20日;255(5051):1523-31。
(3)
O. R. Musin(2003). 《二十五個球體之問題(The problem of the twenty-five spheres)》. 《俄羅斯數學評論(Russ. Math. Surv.)》 58 (4): 794-795。
在一些實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞數目大約為在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞數目的一半。在某些實施例中，方法包括在相較於快速第二擴增之細胞培養基包括大約50%較少抗原呈現細胞的細胞培養基中進行初始第一擴增。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞(APC)數目大於在初始第一擴增期間外源供應的APC數目。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約20:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係剛好或大約2:1。
在其他實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一擴增期間外源供應的APC數目之比率係剛好或大約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數目係剛好或大約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數目係剛好或大約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在其他實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數目係選自剛好或大約1.5×108
個APC至剛好或大約3×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數目係選自剛好或大約4×108
個APC至剛好或大約7.5×108
個APC的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數目係選自剛好或大約2×108
個APC至剛好或大約2.5×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數目係選自剛好或大約4.5×108
個APC至剛好或大約5.5×108
個APC的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數目係剛好或大約2.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數目係剛好或大約5×108
個APC。
在一些實施例中，在初始第一擴增第0天添加的APC(包含例如PBMC)數目係在初始第一擴增第7天(例如方法之第7天)添加的PBMC數目的大約一半。在某些實施例中，方法包括在初始第一擴增第0天添加抗原呈現細胞至第一TIL群體且在第7天添加抗原呈現細胞至第二TIL群體，其中在第0天添加之抗原呈現細胞的數目係在初始第一擴增第7天(例如方法之第7天)添加之抗原呈現細胞數目的大約50%。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目大於在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數目。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約1.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約1.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約2×106
個APC/cm2
至剛好或大約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以剛好或大約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以剛好或大約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約6.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以剛好或大約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約1.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約1.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約6×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約2×106
個APC/cm2
至剛好或大約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以選自剛好或大約4×106
個APC/cm2
至剛好或大約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以剛好或大約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以剛好或大約4×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約20:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係剛好或大約2:1。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係剛好或大約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係剛好或大約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC(包含例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係剛好或大約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1
×109 個 APC( 包含例如 PBMC)
。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約1×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約3.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約3.5×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約1×109
個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約1.5×108
個APC至剛好或大約3×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約4×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約7.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約1×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約3.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約3.5×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約1×109
個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約1.5×108
個APC至剛好或大約3×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約4×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約7.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約2×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約2.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自剛好或大約4.5×108
個APC(包含例如PBMC)至剛好或大約5.5×108
個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係剛好或大約2.5×108
個APC(包含例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係剛好或大約5×108
個APC(包含例如PBMC)。
在一些實施例中，在初始第一擴增第0天添加的APC(包含例如PBMC)層數係在快速第二擴增第7天添加的APC(包含例如PBMC)層數的大約一半。在某些實施例中，方法包括在初始第一擴增第0天添加抗原呈現細胞層至第一TIL群體且在第7天添加抗原呈現細胞層至第二TIL群體，其中在第0天添加之抗原呈現細胞層的數目係在第7天添加之抗原呈現細胞層的數目的大約50%。
在其他實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)層數大於在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)層數。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約4個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約一個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約1.5個細胞層至剛好或大約2.5個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約一個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約1個細胞層至剛好或大約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約3個細胞層至剛好或大約10個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約2個細胞層至剛好或大約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約4個細胞層至剛好或大約8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約4個細胞層至剛好或大約8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度剛好或大約1、2或3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度剛好或大約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:10的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:8的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:7的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:6的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:5的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:4的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:3的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:2的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.2至剛好或大約1:8的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.3至剛好或大約1:7的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.4至剛好或大約1:6的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.5至剛好或大約1:5的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.6至剛好或大約1:4的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.7至剛好或大約1:3.5的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.8至剛好或大約1:3的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.9至剛好或大約1:2.5的範圍。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係剛好或大約1:2。
在其他實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自剛好或大約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些實施例中，初始第一擴增中之APC數目係選自約1.0×106
個APC/cm2
至約4.5×106
個APC/cm2
的範圍，且快速第二擴增中之APC數目係選自約2.5×106
個APC/cm2
至約7.5×106
個APC/cm2
的範圍。
在一些實施例中，初始第一擴增中之APC數目係選自約1.5×106
個APC/cm2
至約3.5×106
個APC/cm2
的範圍，且快速第二擴增中之APC數目係選自約3.5×106
個APC/cm2
至約6.0×106
個APC/cm2
的範圍。
在一些實施例中，初始第一擴增中之APC數目係選自約2.0×106
個APC/cm2
至約3.0×106
個APC/cm2
的範圍，且快速第二擴增中之APC數目係選自約4.0×106
個APC/cm2
至約5.5×106
個APC/cm2
的範圍。H. 視情況選用的細胞培養基組分 1.
抗CD3抗體
在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法(參見例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H))的培養基包含抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合在TIL群體中誘導T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab')2片段，前者通常較佳；參見例如Tsoukas等人,《免疫學雜誌》1985, 135
, 1719，特此以全文引用之方式併入。
如本領域中熟習此項技術者將瞭解，一些合適的抗人類CD3抗體可用於本發明，包含來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包含(但不限於)鼠類、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在特定實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的美天旎生物技術公司)。2.
4-1BB(CD137)促效劑
在一些實施例中，初始第一擴增及/或快速第二擴增之細胞培養基包括TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB(CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為此項技術中已知之任何4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人類或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包括免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類之免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文所使用，術語結合分子亦包含抗體(包含全長抗體)；單株抗體(包含全長單株抗體)；多株抗體；多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；人類、人源化或嵌合抗體；以及抗體片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現文庫產生的片段、任何上述者之抗原決定基結合片段，以及與4-1BB結合之抗體之經工程改造形式，例如scFv分子。在一些實施例中，4-1BB促效劑為一種完全人類抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑為一種人源化抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，用於本發明所揭示之方法及組成物中之4-1BB促效劑包含抗4-1BB抗體、人類抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體誘導強烈免疫反應。Lee等人, 《公共科學圖書館·綜合(PLOS One
)》2013
,8,
e69677。在一些實施例中，4-1BB促效劑為促效性抗4-1BB人源化或完全人類單株抗體(亦即，衍生自單一細胞株之抗體)。在一些實施例中，4-1BB促效劑為EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。
在一些實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白。在一些實施例中，相較於通常具有兩個配體結合域之促效性單株抗體，多聚4-1BB促效劑，諸如三聚或六聚4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合域)可誘導優良受體(4-1BBL)聚類及內部細胞傳訊複合物形成。包括三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接兩個或更多個此等融合蛋白之三聚(三價)或六聚(或六價)或更大融合蛋白係描述於例如Gieffers等人, 《分子癌症治療學(Mol. Cancer Therapeutics
)》2013, 12,
2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白誘導強烈免疫反應。在一些實施例中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(例如NK細胞細胞毒性)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，4-1BB促效劑之特徵為以高親和力及促效活性與人類4-1BB(SEQ ID NO: 9)結合。在一些實施例中，4-1BB促效劑為與人類4-1BB(SEQ ID NO: 9)結合之結合分子。在一些實施例中，4-1BB促效劑為與鼠類4-1BB(SEQ ID NO: 10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列概述於表6中。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含如下4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約100 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約90 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約80 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約70 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約60 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約50 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、以約40 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB、或以約30 pM或更低之KD
結合人類或鼠類4-1BB。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含以約7.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約7.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約8×105
l/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約8.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約9×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約9.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合、或以約1×106
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類4-1BB結合的4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含以約2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.1×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.4×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.5×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.6×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、或以約2.7×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.8×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.9×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合、或以約3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類4-1BB結合的4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約10 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約9 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約8 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約7 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約6 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約5 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約4 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約3 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、以約2 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合、或以約1 nM或更低之IC50
與人類或鼠類4-1BB結合。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可購自輝瑞公司(Pfizer, Inc.)。烏圖木單抗為免疫球蛋白G2-λ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(完全人類)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列闡述於表7中。烏圖木單抗包括位於Asn59及Asn292之糖基化位點；位於位置22-96(VH
-VL
)、143-199(CH
1-CL)、256-316(CH
2)及362-420(CH
3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22'-87'(VH
-VL
)及136'-195'(CH
1-CL)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異型體位置218-218、219-219、222-222及225-225、位於IgG2A/B異型體位置218-130、219-219、222-222及225-225及位於IgG2B異型體位置219-130(2)、222-222及225-225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；以及位於IgG2A異型體位置130-213'(2)、IgG2A/B異型體位置218-213'及130-213'及位於IgG2B異型體位置218-213'(2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及性質描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案第WO 2012/032433 A1號中，其中每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵描述於Fisher等人,《癌症免疫學及免疫治療(Cancer Immunolog. & Immunother.
)》2012, 61,
1721-33中。目前烏圖木單抗在多種血液及實體腫瘤適應症之臨床試驗包含美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括SEQ ID NO: 11所載之重鏈及SEQ ID NO: 12所載之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH
)包括SEQ ID NO: 13所示之序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL
)包括SEQ ID NO: 14所示之序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少99%一致之VH
及VL
區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少98%一致之VH
及VL
區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少97%一致之VH
及VL
區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少96%一致之VH
及VL
區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少95%一致之VH
及VL
區。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括scFv抗體，該scFv抗體包括各自與SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14所示序列至少99%一致之VH
及VL
區。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為藥物管理機構參考烏圖木單抗批准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括4-1BB抗體，該4-1BB抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其與該參考藥品或參考生物產品相比包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包括之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包括之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可購自百時美施貴寶公司及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗為免疫球蛋白G4-κ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(完全人類)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列闡述於表8中。烏瑞魯單抗包括位於位置298(及298'')之N-糖基化位點；位於位置22-95(VH
-VL
)、148-204(CH
1-CL)、262-322(CH
2)及368-426(CH
3)(及位於位置22''-95''、148''-204''、262''-322''及368''-426'')之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23'-88'(VH
-VL
)及136'-196'(CH
1-CL)(及位於位置23'''-88'''及136'''-196''')之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227-227''及230-230''之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135-216'及135''-216'''之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及性質描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵描述於Segal等人,《臨床癌症研究(Clin. Cancer Res.
)》2016
,請訪問
http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實體腫瘤適應症之臨床試驗包含美國國家衛生研究院clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括SEQ ID NO: 21所載之重鏈及SEQ ID NO: 22所載之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 22所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:23中所示序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:24中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括VH及VL區，其各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少99%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括VH及VL區，其各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少98%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括VH及VL區，其各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少97%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括VH及VL區，其各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少96%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括VH及VL區，其各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少95%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括含有VH及VL區之scFv抗體，該等區各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少99%一致。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為藥物管理機構參考烏瑞魯單抗核准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括4-1BB抗體，該4-1BB抗體包括與參考藥品或參考生物學產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中4-1BB促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。
在一些實施例中，4-1BB促效劑係選自由以下組成之群組：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(賽默飛世爾(Thermo Fisher)MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、藉由寄存為ATCC第HB-11248號之細胞株產生且美國專利第6,974,863號中揭示之抗體、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、美國專利申請公開案第US 2005/0095244號中揭示之抗體、美國專利第7,288,638號中揭示之抗體(諸如20H4.9-IgGl(BMS-663031)、美國專利第6,887,673號中揭示之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、美國專利第7,214,493號中揭示之抗體、美國專利第6,303,121號中揭示之抗體、美國專利第6,569,997號中揭示之抗體、美國專利第6,905,685號中揭示之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、美國專利第6,362,325號中揭示之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美國專利第6,974,863號中揭示之抗體(諸如53A2)；美國專利第6,210,669號中揭示之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、美國專利第5,928,893號中描述之抗體、美國專利第6,303,121號中揭示之抗體、美國專利第6,569,997號中揭示之抗體、國際專利申請公開案第WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433號中揭示之抗體，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為以下中描述之4-1BB促效融合蛋白：國際專利申請公開案第WO 2008/025516 A1號、第WO 2009/007120 A1號、第WO 2010/003766 A1號、第WO 2010/010051 A1號及第WO 2010/078966 A1號；美國專利申請公開案第US 2011/0027218 A1號、第US 2015/0126709 A1號、第US 2011/0111494 A1號、第US 2015/0110734 A1號及第US 2015/0126710 A1號；及美國專利第9,359,420號、第9,340,599, 8,921,519號及第8,450,460號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白)如中所描繪之4-1BB促效融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物，如圖20中提供。
在結構I-A及I-B(參見圖20)中，圓柱係指個體多肽結合域。結構I-A及I-B包括三個線性連接的TNFRSF結合域，該等TNFRSF結合域衍生自例如4-1BBL(4-1BB配體、CD137配體(CD137L)或腫瘤壞死因子超家族成員9(TNFSF9)或結合4-1BB之抗體，該等TNFRSF結合域摺疊以形成三價蛋白質，接著該三價蛋白質經由IgG1-Fc(包含CH3及CH2域)與第二三價蛋白質連接，隨後該IgG1-Fc用於經由二硫鍵(細長小橢圓)將兩個三價蛋白質連接在一起，從而使結構穩定且提供能夠將六個受體之細胞內傳訊域放在一起且傳訊蛋白質以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱之TNFRSF結合域可為包括例如由連接子連接之VH及VL鏈的scFv域，該連接子可包括親水性殘基及提供柔性的Gly與Ser序列以及提供溶解性的Glu與Lys。可使用任何scFv域設計，諸如以下中描述之彼等scFv域：de Marco, 《微生物細胞工廠(Microbial Cell Factories)》,2011
, 10, 44；Ahmad等人, 《臨床及發育免疫學(Clin.& Dev.Immunol.)》2012
, 980250；Monnier等人, 《抗體(Antibodies)》,2013
, 2, 193-208；或本文中別處併入之參考文獻。此形式之融合蛋白結構描述於美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
表9中給出了結構I-A之其他多肽域之胺基酸序列。Fc域較佳包括完整恆定域(SEQ ID NO:31之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO:31之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc-抗體之較佳的連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41中所載之實施例，包括適合於融合其他多肽之連接子。
表10中給出了結構I-B之其他多肽域之胺基酸序列。若Fc抗體片段如在結構I-B中與TNRFSF促效劑融合蛋白之N端融合，則Fc模組之序列較佳地為SEQ ID NO:42中顯示之彼序列，且連接子序列較佳地係選自SED ID NO: 43至SEQ ID NO:45中所闡述之彼等實施例。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個選自由以下組成之群組之4-1BB結合域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表11中描述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合，及其片段、衍生物、結合物、變體及生物類似物。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個含有4-1BBL序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個含有根據SEQ ID NO:46之序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個含有可溶性4-1BBL序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個包含根據SEQ ID NO:47之序列的4-1BB結合域。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個4-1BB結合域，該4-1BB結合域為包括各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14中所示序列至少95%一致之VH及VL區的scFv域，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個4-1BB結合域，該4-1BB結合域為包括各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24中所示序列至少95%一致之VH及VL區的scFv域，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一個或多個4-1BB結合域，該4-1BB結合域為包括各自與表11中給出之VH及VL序列至少95%一致之VH及VL區的scFv域，其中VH及VL域由連接子連接。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB結合域，(ii)第一肽連接子，(iii)第二可溶性4-1BB結合域，(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性4-1BB結合域，進一步包括在N端及/或C端之另外域，且其中該另外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB結合域，(ii)第一肽連接子，(iii)第二可溶性4-1BB結合域，(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性4-1BB結合域，進一步包括在N端及/或C端之另外域，且其中該另外域為Fab或Fc片段域，其中可溶性4-1BB域中之各者缺乏莖區(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某一距離，但不為4-1BB結合域之一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域，(ii)第一肽連接子，(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域，(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中可溶性TNF超家族細胞介素域中之各者缺乏莖區且該第一及第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度，且其中各TNF超家族細胞介素域為4-1BB結合域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效scFv抗體，其包括與任一前述VL域連接之任一前述VH域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為BPS Bioscience 4-1BB促效劑抗體，目錄號79097-2，可購自美國加利福尼亞州聖地亞哥之BPS Bioscience(BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一些實施例中，4-1BB促效劑為Creative Biolabs 4-1BB促效劑抗體，目錄號MOM-18179，可購自美國紐約州雪利市之Creative Biolabs(Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。3.
OX40(CD134)促效劑
在一些實施例中，TNFRSF促效劑為OX40(CD134)促效劑。OX40促效劑可為本領域已知的任何OX40結合分子。OX40結合分子可以為能夠與人類或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白。OX40促效劑或OX40結合分子可包括免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類之免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文所用，術語結合分子亦包含抗體(包含全長抗體)、單株抗體(包含全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類抗體、人源化或嵌合抗體及抗體片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現文庫產生之片段、任一上述者之抗原決定基-結合片段及與OX40結合之抗體之經工程改造形式，例如scFv分子。在一些實施例中，OX40促效劑為一種完全人類抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為一種人源化抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包含抗OX40抗體、人類抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40阿德奈汀(adnectin)、抗OX40域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。在一些實施例中，OX40促效劑為促效性抗OX40人源化或完全人類單株抗體(亦即，源自單個細胞株的抗體)。
在一些實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白。包括與OX40L融合之Fc域之OX40融合蛋白描述於例如Sadun等人, 《免疫療法雜誌》2009, 182, 1481-89。在一些實施例中，相較於通常具有兩個配體結合域之促效性單株抗體，多聚OX40促效劑，諸如三聚或六聚OX40促效劑(具有三個或六個配體結合域)可誘導優良受體(OX40L)聚類及內部細胞傳訊複合物形成。包括三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接兩個或更多個此等融合蛋白之三聚(三價)或六聚(或六價)或更大融合蛋白描述於例如Gieffers等人, 《分子癌症治療學》 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白可誘導強烈免疫反應。Curti等人, 《癌症研究》 2013, 73, 7189-98。在一些實施例中，OX40促效劑為以足夠減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合之單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除Fc區功能之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，OX40促效劑之特徵為以高親及力及促效性活性與人類OX40(SEQ ID NO:54)結合。在一些實施例中，OX40促效劑為與人類OX40(SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一些實施例中，OX40促效劑為與鼠類OX40(SEQ ID NO:55)結合之結合分子。表12中概述與OX40促效劑或結合分子結合之OX40抗原之胺基酸序列。
在一些實施例中，所描述組成物、過程及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約100 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約90 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約80 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約70 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約60 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約50 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40、以約40 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40或以約30 pM或更低之KD結合人類或鼠類OX40。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約7.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合、以約7.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合、以約8×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合、以約8.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合、以約9×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合、以約9.5×105
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合或以約1×106
1/M·s或更快之kassoc
與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.1×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.4×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.5×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.6×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.7×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.8×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合、以約2.9×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合或以約3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，所描述之組成物、過程及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約10 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約9 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約8 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約7 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約6 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約5 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約4 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約3 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合、以約2 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合或以約1 nM或更低之IC50
與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，OX40促效劑為塔沃西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西單抗可獲自阿斯利康公司(AstraZeneca，Inc.)之醫學免疫子公司(MedImmune subsidiary)。塔沃西單抗為免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人源化及嵌合單株抗體。塔沃西單抗之胺基酸序列闡述於表13中。塔沃西單抗包括在位置301及301''處之N-糖基化位點，具有岩藻糖基化複合物二觸角CHO型聚醣；在位置22-95(VH
-VL
)、148-204((CH
1-CL
)、265-325(CH
2)及371-429(CH
3)處(及在位置22''-95''、148''-204''、265''-325''及371''-429''處)之重鏈鏈內雙硫鍵；在位置23'-88'(VH
-VL
)及134'-194'(CH
1-CL
)處(及在位置23'''-88'''及134'''-194'''處)之輕鏈鏈內雙硫鍵；在位置230-230''及233-233''處之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及在224-214'及224''-214'''處之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。塔沃西單抗在各種實體腫瘤適應症中之當前臨床試驗包含美國國家衛生研究院clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:56所載之重鏈及SEQ ID NO:57所載之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中所示序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括塔沃西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:58中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:59中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少99%一致的VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少98%一致的VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少97%一致的VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少96%一致的VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少95%一致的VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括scFv抗體，該scFv抗體包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少99%一致的VH及VL區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考塔沃西單抗核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。
在一些實施例中，OX40促效劑為11D4，其為可獲自輝瑞公司之完全人類抗體。11D4之製備及特性描述於美國專利第7,960,515號、第8,236,930號及第9,028,824號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。11D4之胺基酸序列闡述於表14中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:66所載之重鏈及SEQ ID NO:67所載之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:68中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:69中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少99%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少98%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少97%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少96%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少95%一致之VH及VL區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考11D4核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。
在一些實施例中，OX40促效劑為18D8，其為可獲自輝瑞公司之完全人類抗體。18D8之製備及特性描述於美國專利第7,960,515號、第8,236,930號及第9,028,824號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。18D8之胺基酸序列闡述於表15中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:76所載之重鏈及SEQ ID NO:77所載之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:78中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:79中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少99%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少98%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少97%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少96%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少95%一致之VH及VL區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考18D8核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。
在一些實施例中，OX40促效劑為Hu119-122，其為可獲自葛蘭素史克公共有限公司(GlaxoSmithKline plc)之人源化抗體。Hu119-122之製備及特性描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列闡述於表16中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:86中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:87中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少99%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少98%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少97%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少96%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少95%一致之VH及VL區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考Hu119-122核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。
在一些實施例中，OX40促效劑為Hu106-222，其為可獲自葛蘭素史克公共有限公司之人源化抗體。Hu106-222之製備及特性描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列闡述於表17中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:94中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:95中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少99%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少98%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少97%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少96%一致之VH及VL區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少95%一致之VH及VL區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考Hu106-222核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。
在一些實施例中，OX40促效劑抗體為MEDI6469(亦稱為9B12)。MEDI6469為鼠類單株抗體。Weinberg等人,《免疫療法雜誌》2006
, 29, 575-585。在一些實施例中，OX40促效劑為由9B12雜交瘤產生，由Biovest Inc.(美國馬薩諸塞州馬爾文(Malvern, MA, USA))寄存的抗體，如Weinberg等人,《免疫療法雜誌》2006
, 29, 575-585中所描述，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體包括MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，抗體包括MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一些實施例中，OX40促效劑為L106 BD(Pharmingen，產品號340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體L106(BD Pharmingen，產品號340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體L106(BD Pharmingen，產品號340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為鼠類單株抗體抗mCD134/mOX40(純系OX86)，可購自新罕布什爾州西黎巴嫩之BioXcell Inc之InVivoMAb。
在一些實施例中，OX40促效劑係選自以下中描述之OX40促效劑：國際專利申請公開案第WO 95/12673號、第WO 95/21925號、第WO 2006/121810號、第WO 2012/027328號、第WO 2013/028231號、第WO 2013/038191號及第WO 2014/148895號；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案第US 2010/136030號、第US 2014/377284號、第US 2015/190506號及第US 2015/132288號(包含純系20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101號、第7,550,140號、第7,622,444號、第7,696,175號、第7,960,515號、第7,961,515號、第8,133,983號、第9,006,399號及第9,163,085號，其中之每一者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，OX40促效劑為如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白)中所描繪之OX40促效性融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之特性已在上文及美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中。表9中給出了結構I-A之多肽域之胺基酸序列。Fc域較佳包括完整恆定域(SEQ ID NO:31之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO:31之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc-抗體之較佳的連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41中所載之實施例，包括適合於融合其他多肽之連接子。同樣，表10中給出了結構I-B之多肽域之胺基酸序列。若Fc抗體片段如在結構I-B中與TNRFSF融合蛋白之N端融合，則Fc模組之序列較佳地為SEQ ID NO:42中所示之彼序列，且連接子序列較佳地係選自SED ID NO:43至SEQ ID NO:45中所闡述之彼等實施例。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個選自由以下組成之群組之OX40結合域：塔沃西單抗的可變重鏈及可變輕鏈、11D4的可變重鏈及可變輕鏈、18D8的可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122的可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222的可變重鏈及可變輕鏈、選自表18中描述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述之可變重鏈及可變輕鏈的任何組合，及其片段、衍生物、結合物、變體及生物類似物。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個含有OX40L序列之OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個含有根據SEQ ID NO:102之序列的OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個含有可溶性OX40L序列之OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個含有根據SEQ ID NO:103之序列的OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個含有根據SEQ ID NO:104之序列的OX40結合域。
在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中所示序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中所示序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87中所示序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中所示序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一個或多個OX40結合域，該OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自與表18中給出之VH及VL序列至少95%一致之VH及VL區，其中VH及VL域由連接子連接。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40結合域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性OX40結合域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包括在N端及/或C端處之另外域，且其中該另外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40結合域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性OX40結合域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包括在N端及/或C端處之另外域，其中該另外域為Fab或Fc片段域，其中可溶性OX40結合域中之各者缺乏莖區(其促成三聚作用且提供距離細胞膜之某一距離，但不為OX40結合域之一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中可溶性TNF超家族細胞介素域中之各者缺乏莖區且該第一及第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度，且其中TNF超家族細胞介素域為OX40結合域。
在一些實施例中，OX40促效劑為MEDI6383。MEDI6383為OX40促效性融合蛋白且可如美國專利第6,312,700號中所描述來製備，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性scFv抗體，其包括與任一前述VL域連接之任一前述VH域。
在一些實施例中，OX40促效劑為Creative Biolabs OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自美國紐約州雪利市之Creative Biolabs，Inc.。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性抗體純系Ber-ACT35，可購自美國加利福尼亞州聖地亞哥之BioLegend, Inc.。I.
視情況選用之細胞存活性分析
視情況，在初始第一擴增(有時稱為初始主體擴增(initial bulk expansion))之後，可使用本領域已知之標準分析進行細胞存活性分析。因此，在某些實施例中，方法包括在初始第一擴增之後進行細胞存活性分析。舉例而言，可在主體TIL樣本上進行台盼藍排除分析，其選擇性標記死細胞且允許存活性評定。其他用於測試存活性之分析可包括但不限於阿爾瑪藍(Alamar blue)分析及MTT分析。1.
細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施例中，量測細胞計數及/或存活性。標誌(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及本文所揭示或描述之任何其他標誌)之表現可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCantoTM流動式細胞儀(碧迪生物科學(BD Biosciences))，用抗體，例如但不限於可購自碧迪生物科學之彼等者(碧迪生物科學，加利福尼亞州聖荷西)量測。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR，伊利諾伊州巴達維亞)手動計算，且存活性可使用本領域中已知之任何方法，包含但不限於台盼藍染色評定。細胞存活性亦可基於USSN15/863,634分析，其以全文引用之方式併入本文中。細胞存活性亦可基於美國專利公開案第2018/0280436號或國際專利公開案第WO/2018/081473號分析，兩者全文均出於所有目的併入本文中。
在一些情況下，主體TIL群體可使用下文論述之方案立即冷凍保存。替代地，主體TIL群體可進行REP且接著如下文所論述冷凍保存。類似地，在其中遺傳修飾的TIL將用於療法中之情況下，主體或REP TIL群體可進行遺傳修飾以用於合適治療。2.
細胞培養
在一些實施例中，用於擴增TIL之方法(包括上文所論述以及圖1，尤其例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H中例示之彼等方法)可包含使用約5,000 mL至約25,000 mL之細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL之細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL之細胞培養基。在一些實施例中，培養基為不含血清培養基。在一些實施例中，初始第一擴增中之培養基不含血清。在一些實施例中，第二擴增中之培養基不含血清。在一些實施例中，初始第一擴增及第二擴增(亦稱為快速第二擴增)中之培養基均不含血清。在一些實施例中，擴增TIL數目使用不超過一種類型之細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM建它黴素硫酸鹽)細胞培養基(英傑公司(Invitrogen)，加利福尼亞州喀斯巴德(Carlsbad CA))。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數目所需之培養基的量及培養基類型的數目。在一些實施例中，擴增TIL數目可包括頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在透氣容器中擴增細胞數目藉由減少擴增細胞所需之餵養頻率，簡化擴增細胞數目所需之程序。
在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
在一些實施例中，方法期間包括獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中培養腫瘤組織樣本持續約1至8天(例如約8天)之期間作為初始第一擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器且在第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7至9天(例如約7天、約8天或約9天)之期間，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，方法期間包括獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中培養腫瘤組織樣本持續約1至7天(例如約7天)之期間作為初始第一擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器且在第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7至9天(例如約7天、約8天或約9天)之期間，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，方法期間包括獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中培養腫瘤組織樣本持續約1至7天(例如約7天)之期間作為初始第一擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器且在第二透氣容器中擴增TIL數目持續約7至10天(例如約7天、約8天、約9天或約10天)之期間，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，TIL係在透氣容器中擴增。已使用透氣容器來擴增TIL，使用PBMC，使用本領域中已知之方法、組成物及裝置，包含美國專利申請案公開案第2005/0106717 A1號中描述之彼等，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，TIL係在透氣袋中擴增。在一些實施例中，TIL使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統(諸如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare))擴增。在一些實施例中，TIL使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統(諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare))擴增。在一些實施例中，細胞擴增系統包含透氣細胞袋，該透氣細胞袋之容積選自由以下組成之群組：約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L。
在一些實施例中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自威爾遜狼製造公司)中擴增。此類實施例允許細胞群體自約5×105
個細胞/平方公分擴增至介於10×106
與30×106
個細胞/平方公分之間。在一些實施例中，此係未進行餵養。在一些實施例中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中之培養基位於約10 cm之高度。在一些實施例中，此係未進行餵養但添加一種或多種細胞介素。在一些實施例中，細胞介素可作為推注添加，不需要將細胞介素與培養基混合。此類容器、裝置及方法為本領域中已知的且已用於擴增TIL，且包含以下中描述之彼等者：美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際公開案第WO 2014/ 210036 A1號、美國專利申請公開案第us 2013/0115617 A1號、國際公開案第WO 2013/188427 A1號、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際公開案第WO 2011/072088 A2號、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際公開案第WO 2012/129201 A1號、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際公開案第WO 2013/173835 A1號、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。此類過程亦描述於Jin等人,《免疫療法雜誌》,2012
, 35:283-292中。J. 視情況選用之 TIL 之基因工程改造
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL在擴增步驟之前、期間或之後，包含在密閉無菌製造過程期間(各者如本文所提供)經進一步操作，以用暫時性方式改變蛋白質表現。在一些實施例中，暫時性改變的蛋白質表現係因為暫時性基因編輯。在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施例中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現之分子提供TIL群體中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞之數目。
在某些實施例中，方法包括基因編輯TIL群體。在某些實施例中，方法包括基因編輯第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明包含經由核苷酸插入，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包含插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA(siRNA)至TIL群體中進行基因編輯，以促進一種或多種蛋白質之表現或抑制一種或多種蛋白質之表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質之組合。
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL經歷暫時性改變蛋白質表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第一擴增之前的主體TIL群體，包含例如獲自例如如圖1(尤其圖1B及圖1C)中所指示之步驟A的TIL群體中。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第一擴增期間，包含例如在例如如圖1(例如圖1B)中所指示之步驟B中擴增的TIL群體中。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第一擴增之後，包含例如在第一與第二擴增之間轉變的TIL群體(例如如本文所描述之第二TIL群體)、獲自例如如圖1中所指示之步驟B且包含於步驟C中的TIL群體中。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第二擴增之前的主體TIL群體中，包含例如在獲自例如如圖1中所指示之步驟C且在步驟D中其擴增之前的TIL群體中。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第二擴增期間，包含例如在例如如圖1中所指示之步驟D中擴增之TIL群體(例如第三TIL群體)中。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現發生在第二擴增之後，包含例如在獲自例如如圖1中所指示之步驟D中之擴增的TIL群體中。
在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含電穿孔之步驟。電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong, 《生物物理學雜誌(Biophys. 雜誌》1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb, 《病毒學(Virology)》 1973, 52, 456-467；Wigler等人, 《美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.)》 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea, 《分子細胞生物學(Mol. Cell.Biol.)》 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n, n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1: 1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人,《生物技術(Biotechniques)》 1991, 10, 520-525及Felgner等人, 《美國國家科學院院刊》, 1987, 84, 7413-7417以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含使用以下中描述之方法之轉染步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994 號及第7,189,705號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，使用國際專利申請案第WO 2019/136456 A1或WO 2019/210131 A1號(其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中)中描述之方法，包含其中用於基因編輯TIL以基因剔除特定目標基因，諸如編碼PD-1及CTLA-4之基因所描述之方法，本發明之TIL經進一步修飾以暫時性或永久性抑制一個或多個基因。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致幹記憶T細胞(Stem Memory T cell；TSCM)增加。TSCM為抗原經歷中樞記憶T細胞之早期前驅細胞。TSCM一般呈現定義幹細胞之長期存活、自我更新及多效能能力，且一般為產生有效TIL產物所需的。TSCM在授受性細胞轉移之小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集之增強的抗腫瘤活性(Gattinoni等人《自然醫學》2009, 2011；Gattinoni, 《自然癌症綜述(Nature Rev.Cancer)》, 2012；Cieri等人《血液》2013)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有包括高比例之TSCM之組成的TIL群體。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIL群體中之TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性導致具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之TIL群體。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之治療性TIL群體。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施例中，回春包含例如增加增殖、增加T細胞活化及/或增加抗原識別。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現改變一大部分T細胞之表現，以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤衍生之TCR貯庫。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質導致改變特定基因之表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向包含但不限於以下之基因：PD-1(亦稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受體(chimeric co-stimulatory receptor；CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率群組(high mobility group；HMG)匣(TOX)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6輔抑制物(BCOR)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6輔抑制物(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受體(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率群組(high mobility group；HMG)匣(TOX)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6輔抑制物(BCOR)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6輔抑制物(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4 / 5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2(MCP-1)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3(MIP-1α)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4(MIP1-β)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5(RANTES)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向胸腺細胞選擇相關之高遷移率群組(HMG)匣(TOX)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向錨蛋白重複域11(ANKRD11)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向BCL6輔抑制物(BCOR)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施例中，因暫時性蛋白質表現而過度表現之趨化激素受體包含具有配體之受體，該配體包含但不限於CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及/或TGFβ之表現降低及/或減少(包含導致例如TGFβ路徑阻斷)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CBLB(CBL-B)之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL運輸或運動至腫瘤部位。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致嵌合共刺激受體(CCR)增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由以下組成之群組之趨化激素受體增加及/或過度表現：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致介白素增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由以下組成之群組之介白素增加及/或過度表現：IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致VHL增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CD44增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致cAMP蛋白激酶A(PKA)之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由以下組成之群組之分子之表現降低及/或減少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由以下組成之群組之兩種分子之表現降低及/或減少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及選自由以下組成之群組之一種分子之表現降低及/或減少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致以下之表現降低及/或減少：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及以下中之一者之表現降低及/或減少：LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及PD-1之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及LAG3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CBLB之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合組成之群組之黏著分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL群體、第二TIL群體或所收集TIL群體中(例如黏著分子之表現增加)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合組成之群組之分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及其組合組成之群組之分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。
在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
在一些實施例中，表現增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%。在一些實施例中，表現增加至少約85%。在一些實施例中，表現增加至少約90%。在一些實施例中，表現增加至少約95%。在一些實施例中，表現增加至少約99%。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現之分子處理TIL來誘導。在一些實施例中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現之分子的細胞內遞送。證明將包含轉錄因子之蛋白質遞送至多種初代人類細胞(包含T細胞)之能力的此類方法已描述於以下中：美國專利申請公開案第US 2019/0093073 A1號、第US 2018/0201889 A1號及第US 2019/0017072 A1號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。此類方法可用於本發明中，以將TIL群體暴露於轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現之分子，其中該等TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現之分子提供TIL群體中之腫瘤抗原之表現增加及/或腫瘤抗原特異性T細胞之數目增加，從而導致TIL群體重新程式化及重新程式化TIL群體之治療功效相較於非重新程式化TIL群體增加。在一些實施例中，重新程式化導致相對於開始或先前TIL群體(亦即，在重新程式化之前)，效應T細胞及/或中樞記憶T細胞亞群增加，如本文所描述。
在一些實施例中，轉錄因子(TF)包含但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為TCF-1。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)與誘導性富潛能幹細胞培養物(iPSC)，諸如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/賽默飛世爾)一起投予，以誘導另外TIL重新程式化。在一些實施例中，轉錄因子(TF)與iPSC混合物一起投予，以誘導另外TIL重新程式化。在一些實施例中，轉錄因子(TF)不與iPSC混合物一起投予。在一些實施例中，重新程式化導致TSCM之百分比增加。在一些實施例中，重新程式化導致TSCM之百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之TSCM。
在一些實施例中，如上文所描述之暫時性改變蛋白質表現之方法可與遺傳修飾TIL群體之方法組合，包含穩定併入基因以產生一種或多種蛋白質之步驟。在某些實施例中，方法包括遺傳修飾TIL群體之步驟。在某些實施例中，方法包括遺傳修飾第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含逆轉錄病毒轉導之步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含慢病毒轉導之步驟。慢病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如以下中：Levine等人, 《美國國家科學院院刊》2006, 103, 17372-77；Zufferey等人, 《自然生物技術學》 1997, 15, 871-75；Dull等人, 《病毒學雜誌》1998, 72, 8463-71及美國專利第6,627,442號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含γ-逆轉錄病毒轉導之步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如Cepko及Pear,《分子生物學中之當前方案》1996, 9.9.1-9.9.16，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含轉位子介導之基因轉移之步驟。轉位子介導之基因轉移系統為本領域中已知的，且包含其中轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質提供，使得轉位酶之長期表現不發生在轉殖基因細胞中，例如提供為mRNA(例如包括帽及多腺苷酸尾之mRNA)的轉位酶。包含類鮭魚型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11及SB100x；及酶活性增加之經工程改造酶之合適的轉位子介導之基因轉移系統描述於例如以下中：Hackett等人,《分子療法(Mol. Therapy)》2010, 18, 674-83及美國專利第6,489,458號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變TIL中之蛋白質表現係由小干擾RNA(small interfering RNA；siRNA)誘導，該小干擾RNA有時稱為短干擾RNA或靜默RNA，其為雙股RNA分子，長度一般為19-25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNA interference；RNAi)中，其中siRNA干擾具有互補核苷酸序列之特定基因之表現。siRNA可用於暫時性減弱TIL中根據本發明亦經修飾為CCR之基因。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現為由自我遞送RNA干擾(self-delivering RNA interference；sdRNA)誘導之表現減少，該自我遞送RNA干擾為具有高百分比之2'-OH取代(通常氟或-OCH3)之化學上合成的不對稱siRNA雙螺旋，其包括20個核苷酸之反義(引導)股及使用四乙基乙二醇(TEG)連接子在其3'端處與膽固醇結合之13至15個鹼基有義(乘客)股。小干擾RNA(siRNA)，有時稱為短干擾RNA或靜默RNA，為雙股RNA分子，長度一般為19-25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)中，其中siRNA干擾具有互補核苷酸序列之特定基因之表現。sdRNA為進入細胞不需要遞送媒介之共價及疏水性修飾之RNAi化合物。sdRNA一般為具有極小雙股區之不對稱化學修飾核酸分子。sdRNA分子通常含有單股區及雙股區，且可在分子之單股及雙股區內含有各種化學修飾。另外，如本文所描述，sdRNA分子可與疏水性結合物，諸如習知及高級固醇型分子連接。sdRNA及製備此類sdRNA之相關方法亦已廣泛描述於例如以下中：美國專利申請公開案第US 2016/0304873 A1號、第US 2019/0211337 A1號、第US 2009/0131360 A1號及第US 2019/0048341 A1號，及美國專利第10,633,654號及第10,913,948B2號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。為了最佳化sdRNA結構、化學性質、靶向位置、序列偏好及其類似者，已開發一種演算法且將其用於sdRNA效能預測。基於此等分析，功能性sdRNA序列一般定義為在1 µM濃度下表現減少超過70%，其中概率超過40%。
雙股DNA(dsRNA)可通常用以定義包括一對互補RNA股，一般有義(乘客)及反義(引導)股之任何分子，且可包括單股懸垂臂區。與siRNA不同，術語dsRNA一般係指包含siRNA分子之序列之前驅物分子，該siRNA分子藉由裂解酶系統(包含Dicer)之作用自較大dsRNA分子釋放。
在一些實施例中，包括暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包括使用siRNA或sdRNA。使用sdRNA之方法已描述於以下中：Khvorova及Watts,《自然生物技術學》2017
, 35, 238-248；Byrne等人,《眼藥理學與治療學雜誌(J. Ocul.Pharmacol.Ther.)》2013
, 29, 855-864；及Ligtenberg等人,《分子療法》2018
(印製中)，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，siRNA之遞送係使用電穿孔或細胞膜破壞(諸如擠壓或SQZ法)來完成。在一些實施例中，遞送sdRNA至TIL群體不需要使用電穿孔、SQZ或其他方法來完成，實際上使用1至3天時段使TIL群體暴露於濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA。在某些實施例中，方法包括遞送siRNA或sdRNA至TIL群體，其包括將TIL群體暴露於濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之siRNA或sdRNA持續1至3天之間的時段。在一些實施例中，遞送siRNA或sdRNA至TIL群體係使用1至3天時段使TIL群體暴露於濃度為10 µM/10,000個TIL於培養基中之siRNA或sdRNA來完成。在一些實施例中，遞送siRNA或sdRNA至TIL群體係使用1至3天時段使TIL群體暴露於濃度為50 µM/10,000個TIL於培養基中之siRNA或sdRNA來完成。在一些實施例中，遞送siRNA或sdRNA至TIL群體係使用1至3天時段使TIL群體暴露於濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間的sdRNA來完成。在一些實施例中，遞送siRNA或sdRNA至TIL群體係使用1至3天時段使TIL群體暴露於濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間的siRNA或sdRNA來完成，其中暴露於siRNA或sdRNA藉由添加新鮮siRNA或sdRNA至培養基來進行兩次、三次、四次或五次。其他合適過程描述於例如以下中：美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1號、第US 2013/0131141 A1號及第US 2013/0131142 A1號，及美國專利第9,080,171號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，在製造期間將siRNA或sdRNA插入TIL群體中。在一些實施例中，siRNA或sdRNA編碼干擾以下之RNA：NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB。在一些實施例中，表現減少係基於例如如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評定之基因靜默之百分比而判定。在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
基於化學修飾siRNA或sdRNA之自我可遞送RNAi技術可用於本發明之方法中，以成功遞送siRNA或sdRNAs至如本文所描述之TIL。具有不對稱siRNA或sdRNA結構之主鏈修飾與疏水性配體之組合(參見例如Ligtenberg等人,《分子療法》2018
及US20160304873)允許sdRNA或sd RNA藉由簡單添加至培養基而穿透培養的哺乳動物細胞而不需要另外的調配物及方法，從而利用siRNA或sdRNA之核酸酶穩定性。此穩定性允許僅藉由維持siRNA或sdRNA於培養基中之有效濃度，支持恆定含量之RNAi介導之目標基因活性減少。儘管不受理論束縛，但siRNA或sdRNA之主鏈穩定化提供延長減少基因表現效應，其在非分裂細胞中可持續數月。
在一些實施例中，超過95%之TIL轉染效率及目標之表現減少藉由各種特定siRNA或sdRNA發生。在一些實施例中，含有若干未經修飾之核糖殘基之siRNA或sdRNA經完全修飾的序列置換，以增加RNAi效應之效能及/或壽命。在一些實施例中，表現減少效應維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更久。在一些實施例中，表現減少效應在siRNA或sdRNA處理TIL 10天或更久後降低。在一些實施例中，目標表現維持超過70%之表現減少。在一些實施例中，TIL中之目標表現維持超過70%之表現減少。在一些實施例中，PD-1/PD-L1路徑中之表現減少允許TIL展現更強效的活體內效應，此在一些實施例中係因為避免PD-1/PD-L1路徑之抑制效應。在一些實施例中，因siRNA或sdRNA之PD-1之表現減少導致增加TIL增殖。
在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現70%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現75%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現80%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現85%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現90%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現95%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列展現99%之目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約0.25 µM至約4 µM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約0.25 µM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約0.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約0.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約1.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約1.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約1.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約1.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約2.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約2.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約2.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約2.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約3.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約3.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約3.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約3.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之siRNA或sdRNA序列當以約4.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸劑包括一種或多種修飾以增加治療劑之穩定性及/或有效性及實現寡核苷酸至待治療之細胞或組織之有效遞送。此類修飾可包含2'-O-甲基修飾、2'-O-氟修飾、二硫代磷酸酯修飾、2' F修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的及/或2'去氧核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸經修飾以包含一個或多個疏水性修飾，包含例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苯甲基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在另一特定實施例中，化學修飾的核苷酸為硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施例中，糖可經修飾且經修飾的糖可包含但不限於D-核糖、2'-O-烷基(包含2'-O-甲基及2'-0-乙基)，亦即2'-烷氧基、2'-胺基、2'-S-烷基、2'-鹵基(包含2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2
CH=CH2
)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及其類似者。在一個實施例中，糖部分可為己醣且併入寡核苷酸中，如Augustyns等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》18:4711(1992)，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整個長度上為雙股，亦即在分子之任一端處無懸垂單股序列，亦即為鈍端。在一些實施例中，個別核酸分子可具有不同長度。換言之，本發明之雙股寡核苷酸在其整個長度上不為雙股。舉例而言，當使用兩個分開的核酸分子時，分子中之一者，例如包括反義序列之第一分子可比與其雜交之第二分子更長(留下一部分之分子為單股)。在一些實施例中，當使用單核酸分子時，在任一端處之一部分之分子可保持單股。
在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在至少約70%之寡核苷酸長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少約80%之寡核苷酸長度上為雙股的。在其他實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在至少約90%-95%之寡核苷酸長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少約96%-98%之寡核苷酸長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如藉由修飾3'或5'鍵聯而實質上保護免受核酸酶影響(例如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526)。舉例而言，寡核苷酸可藉由納入「阻斷基團」而具有抗性。如本文所用之術語「阻斷基團」係指可作為用於合成之保護基或偶合基團與寡核苷酸或核單體連接之取代基(例如除OH基團以外)(例如FITC、丙基(CH2
-CH2
-CH3
)、二醇(-0-CH2
-CH2
-O-)磷酸鹽(PO3 2"
)、膦酸氫鹽或胺基亞磷酸酯)。「阻斷基團」亦可包含「末端阻斷基團」或「核酸外切酶阻斷基團」，其保護寡核苷酸之5'及3'端，其包含經修飾的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA內之至少一部分連續多核苷酸藉由取代基鍵聯，例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施例中，化學修飾可導致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500細胞攝取siRNA或sdRNA增強。在一些實施例中，C或U殘基中之至少一者包含疏水性修飾。在一些實施例中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%之C及U可含有疏水性修飾。在一些實施例中，所有C及U均含有疏水性修飾。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子經由併入可質子化胺展現增強的胞內體釋放。在一些實施例中，將可質子化胺併入有義股中(在RISC裝載後被捨棄的分子部分中)。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物包括不對稱化合物，該不對稱化合物包括雙螺旋區(有效RISC進入所需，10-15個鹼基長)及4-12個核苷酸長之單股區；具有13個核苷酸的雙螺旋。在一些實施例中，採用6個核苷酸的單股區。在一些實施例中，siRNA或sdRNA之單股區包括2-12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施例中，採用6-8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物亦包含獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。舉例而言，引導股亦可藉由任何證實穩定性而不干擾RISC進入之化學修飾來修飾。在一些實施例中，引導股中之化學修飾模式包含大部分為2' F修飾且5'端經磷酸化之C及U核苷酸。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA中至少30%之核苷酸為經修飾的。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸為經修飾的。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中100%之核苷酸為經修飾的。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有極少雙股區。在一些實施例中，分子之雙股區介於8-15個核苷酸長範圍內。在一些實施例中，分子之雙股區為8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施例中，雙股區為13個核苷酸長。引導股與乘客股之間可有100%互補性，或引導股與乘客股之間可存在一個或多個錯配。在一些實施例中，在雙股分子之一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸之懸垂臂。分子之單股區在一些實施例中係介於4-12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施例中，單鏈區亦可小於4個核苷酸或大於12個核苷酸長。在某些實施例中，單股區為6或7個核苷酸長。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有增加的穩定性。在一些情況下，化學修飾的siRNA或sdRNA分子在培養基中之半衰期長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時，包含任何中間值。在一些實施例中sd-rxRNA在培養基中之半衰期長於12小時。
在一些實施例中，對siRNA或sdRNA進行最佳化以增加效能及/或減少毒性。在一些實施例中，引導股及/或乘客股之核苷酸長度及/或引導股及/或乘客股中硫代磷酸酯修飾之數目在一些態樣中可影響RNA分子之效能，而用2'-0-甲基(2'OMe)修飾置換2'-氟(2'F)修飾在一些態樣中可影響分子之毒性。在一些實施例中，預期減少分子之2'F含量將減少分子之毒性。在一些實施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾之數目可影響攝取分子至細胞中，例如被動攝取分子至細胞中之效率。在一些實施例中，sdRNA不具有2'F修飾，但其特徵為細胞攝取與組織滲透方面之功效相等。
在一些實施例中，引導股之長度為大約18-19個核苷酸且具有大約2-14個磷酸酯修飾。舉例而言，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超過14個經磷酸酯修飾之核苷酸。引導股可含有一個或多個賦予增加的穩定性而不干擾RISC進入之修飾。磷酸酯修飾的核苷酸，諸如硫代磷酸酯修飾的核苷酸，可在3'端、5'端或遍佈於整個引導股中。在一些實施例中，引導股之3'端10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2'F及/或2'OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施例中，引導股中位置一之核苷酸(引導股之最5'位置中之核苷酸)經2'OMe修飾及/或磷酸化。引導股內之C及U核苷酸可經2'F修飾。舉例而言，19個核苷酸之引導股之位置2-10(或不同長度之引導股中之對應位置)中之C及U核苷酸可經2'F修飾。引導股內之C及U核苷酸亦可經2'OMe修飾。舉例而言，l9個核苷酸之引導股之位置11-18(或不同長度之引導股中之對應位置)中之C及U核苷酸可經2'OMe修飾。在一些實施例中，在引導股之最3'端處之核苷酸未經修飾。在某些實施例中，引導股內之大部分C及U經2'F修飾，且引導股之5'端經磷酸化。在其他實施例中，位置1及位置11-18中之C或U經2'OMe修飾，且引導股之5'端經磷酸化。在其他實施例中，位置1及位置11-18中之C或U經2'OMe修飾，引導股之5'端經磷酸化，且位置2-10中之C或U經2'F修飾。
自我可遞送RNAi技術提供一種直接用RNAi劑(無論是siRNA、sdRNA或是其他RNAi劑)轉染細胞而無需另外調配物或技術之方法。轉染難以轉染細胞株之能力、高活體內活性及使用簡單為該等組成物及方法之特徵，其相對於基於siRNA之傳統技術存在顯著的功能優勢，且因此在關於減少本發明之TIL中目標基因表現之方法之若干實施例中採用sdRNA方法。sdRNAi方法允許直接遞送化學合成化合物至廣泛範圍之離體及活體內初代細胞及組織。在本文中本發明之一些實施例中描述之sdRNA可購自美國馬薩諸塞州伍斯特之Advirna LLC。
siRNA及sdRNA形成為疏水性修飾的siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrne等人, 2013年12月, 《眼科藥理學及治療雜誌(J. Ocular Pharmacology and Therapeutics)》, 29(10): 855-864中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所描述之TIL。在某些實施例中，方法包括無菌電穿孔TIL群體以遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合遞送至細胞。在一些實施例中，此跨膜遞送系統包括脂質、病毒載體及其類似者。在一些實施例中，寡核苷酸劑為不需要任何遞送劑之自我遞送RNAi劑。在某些實施例中，方法包括使用跨膜遞送系統來遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群體。
使寡核苷酸及寡核苷酸組成物與本文所描述之TIL接觸(例如使其接觸，在本文中亦稱為投予或遞送至)且被攝入，包含經由TIL被動攝取。siRNA或sdRNA可在以下時添加至如本文所描述之TIL：在第一擴增期間(例如步驟B)、在第一擴增之後(例如在步驟C期間)、在第二擴增之前或期間(例如在步驟D之前或期間)、在步驟D之後且在步驟E中收集之前、在步驟F中收集期間或之後、在步驟F中最終調配及/或轉移至輸注袋之前或期間、以及在步驟F中任何視情況選用之冷凍保存步驟之前。此外，siRNA或sdRNA可在自步驟F中任何冷凍保存步驟解凍之後添加。在一些實施例中，可將一個或多個靶向如本文中所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之siRNA或sdRNA，以選自由100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM組成之群組之濃度，添加至包括TIL及其他藥劑之細胞培養基。在一些實施例中，可將一個或多個靶向如本文中所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之siRNA或sdRNA，以選自由以下組成之群組之量添加至包括TIL及其他藥劑之細胞培養基：0.1 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.5 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.75 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.25 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.5 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、2 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、5 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基或10 μM siRNA或sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基。在一些實施例中，可將一個或多個靶向如本文中所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之sdRNA，在REP前或REP階段期間一天兩次、一天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養物。
本發明之寡核苷酸組成物，包含siRNA或sdRNA，可在擴增過程期間，例如藉由將高濃度siRNA或sdRNA溶解於細胞培養培養基中及允許足夠時間發生被動攝取而與如本文所描述之TIL接觸。在某些實施例中，本發明方法包括使TIL群體與如本文所描述之寡核苷酸組成物接觸。在某些實施例中，方法包括將寡核苷酸，例如siRNA或sdRNA，溶解於細胞培養基中，且使細胞培養基與TIL群體接觸。TIL可為如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體。
在一些實施例中，遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸至細胞中可藉由合適的本領域公認方法增強，包含磷酸鈣、DMSO、甘油或聚葡萄糖、電穿孔或藉由轉染，例如使用陽離子、陰離子或中性脂質組成物或脂質體，使用本領域中已知的方法(參見例如WO 90/14074、WO 91/16024、WO 91/17424、美國專利第4,897,355號；Bergan等人1993.《核酸研究(Nucleic Acids Research)》.21 :3567)。
在一些實施例中，使用超過一種siRNA或sdRNA來減少目標基因表現。在一些實施例中，靶向siRNA或sdRNA之PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一者或多者一起使用。在一些實施例中，PD-1 siRNA或sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一者或多者一起使用，以減少超過一種基因目標之表現。在一些實施例中，LAG3 siRNA或sdRNA與靶向siRNA或sdRNA之CISH組合使用，以減少兩種目標之基因表現。在一些實施例中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一者或多者之siRNA或sdRNA可購自美國馬薩諸塞州伍斯特的Advirna LLC。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且另一種siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自以下之基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自PD-1及以下中之一者之基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。
如上文所論述，本發明之實施例提供已經由基因編輯進行遺傳修飾以增強其治療效果之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)。本發明之實施例涵蓋經由核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群體中進行之基因編輯，以促進一種或多種蛋白質之表現及抑制一種或多種蛋白質之表現以及其組合本發明之實施例亦提供用於將TIL擴增為治療性群體之方法，其中該等方法包括基因編輯TIL。存在若干種可用於遺傳修飾TIL群體之基因編輯技術，該等基因編輯技術適合於根據本發明使用。
在一些實施例中，方法包括遺傳修飾TIL群體之方法，該方法包含穩定併入用於產生一種或多種蛋白質之基因的步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含逆轉錄病毒轉導之步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含慢病毒轉導之步驟。慢病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如以下中：Levine等人, 《美國國家科學院院刊》2006, 103, 17372-77；Zufferey等人, 《自然生物技術學》1997, 15, 871-75；Dull等人, 《病毒學雜誌》1998, 72, 8463-71及美國專利第6,627,442號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含γ-逆轉錄病毒轉導之步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如Cepko及Pear, 《分子生物學中之當前方案》 1996, 9.9.1-9.9.16，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含轉位子介導之基因轉移之步驟。轉位子介導之基因轉移系統為本領域中已知的，且包含其中轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質提供，使得轉位酶之長期表現不發生在轉殖基因細胞中，例如提供為mRNA(例如包括帽及多腺苷酸尾之mRNA)的轉位酶。包含類鮭魚型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11及SB100x；及酶活性增加之經工程改造酶之合適的轉位子介導之基因轉移系統描述於例如以下中：Hackett等人, 《分子療法》 2010, 18, 674-83及美國專利第6,489,458號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，方法包括遺傳修飾TIL群體之方法，該TIL群體例如如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含穩定併入用於產生或抑制(例如靜默)一種或多種蛋白質之基因之步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含電穿孔之步驟。電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong, 《生物物理雜誌》1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用本領域中已知之其他電穿孔方法，諸如以下中描述之彼等電穿孔方法：美國專利第5,019,034號、第5,128,257號、第5,137,817號、第5,173,158號、第5,232,856號、第5,273,525號、第5,304,120號、第5,318,514號、第6,010,613號及第6,078,490號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以誘導TIL中孔形成之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同，使得所誘導的孔持續相對長的時段，及使得維持TIL之存活性。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb, 《病毒學》 1973, 52, 456-467；Wigler等人, 《美國國家科學院院刊》 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea, 《分子細胞生物學》1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n, n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1: 1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人, 《生物技術》 1991, 10, 520-525及Felgner等人, 《美國國家科學院院刊》, 1987, 84, 7413-7417以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含使用以下中描述之方法進行轉染之步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994號及第7,189,705號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。TIL可為如本文所描述之第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。
根據一實施例，基因編輯方法可包括使用介導在一個或多個免疫檢查點基因處產生雙股或單股斷裂之可程式化核酸酶。此類可程式化核酸酶藉由在特定基因體基因座處引入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，亦即其依賴於識別基因體內之特定DNA序列以將核酸酶域靶向此位置且介導在目標序列處產生雙股斷裂。DNA中之雙股斷裂隨後將內源性修復機制募集至斷裂位點，以藉由非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)來介導基因體編輯。因此，斷裂之修復可導致引入擾亂(例如靜默、抑制或增強)目標基因產物之插入/缺失突變。
經開發而使得能夠進行位點特異性基因體編輯之核酸酶之主要類別包含鋅指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)、轉錄活化因子樣核酸酶(transcription activator-like nucleases；TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。此等核酸酶系統可基於其DNA識別模式而大致分類為兩類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA相互作用達成特定DNA結合，而CRISPR系統，諸如Cas9，藉由與目標DNA直接鹼基配對之短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。參見例如Cox等人,《自然醫學(Nature Medicine)》, 2015, 第21卷, 第2期。
可根據本發明之TIL擴增方法使用之基因編輯方法之非限制性實例包含CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，該等方法在下文更詳細地描述。根據一實施例，將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如GEN 3過程)之任一實施例或如PCT/US2017/ 058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述進行，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一者或多者基因編輯至少一部分的TIL，以產生可提供增強治療效果的TIL。根據一實施例，可藉由活體外比較基因編輯的TIL與未經修飾的TIL，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之活體外效應功能、細胞介素概況等，來評估基因編輯的TIL之改善的治療效果。在某些實施例中，方法包括使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法來基因編輯TIL群體。
在本發明之一些實施例中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例之合適的流式電穿孔系統之實例為市售MaxCyte STX系統。有若干種可能適用於本發明之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus之AgilePulse系統或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龍沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯樂(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文中所描述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。
用於將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如過程GEN 3)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因編輯至少一部分的TIL。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現增強。
CRISPR代表「成簇規律間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」。使用CRISPR系統進行基因編輯之方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型之併入RNA及Cas蛋白且可根據本發明使用之CRISPR系統：I、II及III型。II型CRISPR(藉由Cas9例示)為最充分表徵之系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物之域)之天然防禦機制。此等生物體使用CRISPR衍生之RNA及各種Cas蛋白(包含Cas9)，藉由切碎及破壞外來入侵者之DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR為具有兩個獨特特徵之DNA特化區：存在核苷酸重複序列及間隔子。核苷酸之重複序列分佈在整個CRISPR區中，其中短外來DNA區段(間隔子)穿插在重複序列中。在II型CRISPR/Cas系統中，間隔子整合於CRISPR基因體基因座內且轉錄並加工成短CRISPR RNA(crRNA)。此等crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，且引導Cas蛋白進行序列特異性裂解及靜默病原性DNA。Cas9蛋白進行之目標識別需要crRNA內之「種子」序列及crRNA結合區上游之含有二核苷酸的保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向以裂解幾乎任何DNA序列。原生系統中之crRNA及tracrRNA可簡化為大約100個核苷酸之單引導RNA(sgRNA)以用於基因工程改造。CRISPR/Cas系統藉由共同遞送表現Cas9核酸內切酶及必需crRNA組分之質體可直接攜帶入人類細胞。可使用不同的Cas蛋白變體來減少靶向限制(例如Cas9之異種同源物，諸如Cpf1)。
可經由CRISPR方法永久性基因編輯TIL而靜默或抑制之基因之非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可經由CRISPR方法永久性基因編輯TIL而增強之基因之非限制性實例包含CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
藉由CRISPR方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於以下中：美國專利第8,697,359號、第8,993,233號、第8,795,965號、第8,771,945號、第8,889,356號、第8,865,406號、第8,999,641號、第8,945,839號、第8,932,814號、第8,871,445號、第8,906,616號及第8,895,308號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源，諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體，可購自公司，諸如金斯瑞(GenScript)。
在一些實施例中，遺傳修飾如本文中所描述之TIL群體可使用如美國專利第US 9790490號中所描述之CRISPR/Cpf1系統進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
用於將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由TALE方法基因編輯至少一部分的TIL。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增過程期間使用TALE方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現增強。
TALE代表「轉錄活化因子樣效應」蛋白，其包含TALEN(「轉錄活化因子樣效應核酸酶」)。使用TALE系統來基因編輯之方法在本文中亦稱為TALE方法。TALE為來自植物病原細菌黃單孢菌屬(Xanthomonas)之天然存在蛋白質，且含有由一系列各自識別單鹼基對之33-35個胺基酸之重複域構成之DNA結合域。TALE特異性係藉由被稱為重複可變二殘基(repeat-variable di-residue；RVD)之兩個高變胺基酸判定。模組化TALE重複序列連接在一起以識別連續DNA序列。DNA結合域中之特異性RVD識別目標基因座中之鹼基，從而提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合域。將TALE之DNA結合域與IIS型FokI核酸內切酶之催化域融合，以製備可靶向的TALE核酸酶。為了誘導位點特異性突變，由14-20個鹼基對間隔區域分開之兩個個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚合及產生靶向的雙股斷裂。
若干個利用各種組裝方法之大的系統性研究指示，可併入TALE重複序列以識別幾乎任何使用者定義的序列。定製設計的TALE陣列亦由Cellectis Bioresearch(法國巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals (美國肯塔基州列克星敦(Lexington, KY, USA))及Life Technologies(美國紐約州格蘭德島(Grand Island, NY, USA))市售。適用於本發明之TALE及TALEN方法描述於以下中：美國專利申請公開案第US 2011/0201118 A1號、第US 2013/0117869 A1號、第US 2013/0315884 A1號、第US 2015/0203871 A1號及第US 2016/0120906 A1號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
可經由TALE方法永久性基因編輯TIL而靜默或抑制之基因之非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
可經由TALE方法永久性基因編輯TIL而增強之基因之非限制性實例包含CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
藉由TALE方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於美國專利第8,586,526號中，其以引用之方式併入本文中。
用於將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如過程GEN 3)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯至少一部分的TIL。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一種或多種免疫檢查點基因之表現增強。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α-螺旋表面上之幾個胺基酸通常以不同的選擇性水準接觸DNA主溝槽中的3 bp。鋅指具有兩個蛋白域。第一域為DNA結合域，其包含真核轉錄因子且含有鋅指。第二域為核酸酶域，其包含FokI限制酶且負責催化裂解DNA。
個別ZFN之DNA結合域通常含有介於三個與六個之間的個別鋅指重複且各自可識別介於9個與18個之間的鹼基對。若鋅指域對其預期目標位點具有特異性，則甚至一對識別總共18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中之單個基因座。一個產生新的鋅指陣列之方法為組合具有已知特異性之較小鋅指「模組」。最常見的模組組裝過程涉及組合三個分開的可各自識別3個鹼基對DNA序列之鋅指，以產生可識別9個鹼基對目標位點之3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方法，諸如寡聚池工程改造(oligomerized pool engineering；OPEN)，來自隨機分組文庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組文庫考慮介於鄰近指之間的上下文依賴性相互作用(context-dependent interaction)。工程改造的鋅指為可商購的；Sangamo Biosciences(美國加利福尼亞州里奇蒙(Richmond))已與西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich)(美國密蘇里州聖路易斯(St.Louis, MO, USA))合作開發一種用於鋅指構築之專用平台(CompoZr®)。
可經由鋅指方法永久性基因編輯TIL而靜默或抑制之基因之非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1, ANKRD11及BCOR。
可經由鋅指方法永久性基因編輯TIL而增強之基因之非限制性實例包含CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
藉由鋅指方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於以下中：美國專利第6,534,261號、第6,607,882號、第6,746,838號、第6,794,136號、第6,824,978號、第6,866,997號、第6,933,113號、第6,979,539號、第7,013,219號、第7,030,215號、第7,220,719號、第7,241,573號、第7,241,574號、第7,585,849號、第7,595,376號、第6,903,185號及第6,479,626號，其以引用之方式併入本文中。
藉由鋅指方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之其他實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於Beane等人, 《分子療法》, 2015, 23 1380-1390中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，TIL視情況經基因工程改造以包含另外官能性，該等官能性包含但不限於高親和力T細胞受體(T cell receptor；TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)處之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)。在某些實施例中，方法包括基因工程改造TIL群體以包含高親和力T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)處之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。適當地，TIL群體可為如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體。K. 用於 TIL 製造之密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。此類密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用兩個容器。
此類密閉系統為本領域中熟知的且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm處。
無菌連接裝置(Sterile connecting device；STCD)在兩件相容性管之間產生無菌熔接部分(weld)。此程序允許無菌連接多個容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包含魯爾鎖(luer lock)及熱封系統，如例如實例9中所描述。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例9中所描述之密閉系統。在一些實施例中，根據實例9「最終調配及填充」部分中所描述之方法，將TIL調配至最終產物調配容器中。
在一些實施例中，自獲得腫瘤片段之時間至準備向患者投予TIL或冷凍保存為止，密閉系統使用一個容器。在一些實施例中，當使用兩個容器時，第一容器為密閉G容器，且在不打開第一密閉G容器之情況下離心TIL群體且將其轉移至輸注袋。在一些實施例中，當使用兩個容器時，輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統之特徵在於，一旦已添加腫瘤樣本及/或腫瘤片段，則系統自外部緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在不存在微生物污染下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
此外，TIL細胞培養環境之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓各自隨細胞培養而變化。因此，即使適合於細胞培養之培養基經循環，但密閉環境仍需要不斷地維持為TIL增殖之最佳環境。為了此目的，合乎需要的是，藉助於感測器監測密閉環境之培養液內之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓之物理因素，其訊號用於控制安設在培養環境之入口處的氣體交換器，及根據培養液中之變化實時調整密閉環境之氣體分壓以便最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在至密閉環境之入口處併入配備有量測密閉環境之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓之監測裝置的氣體交換器，且藉由基於來自監測裝置之訊號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施例中，連續地或間歇地控制密閉環境內之壓力。即，密閉環境中之壓力可藉助於例如壓力維持裝置來改變，從而確保空間在正壓力狀態下適合於TIL生長或促進在負壓力狀態下滲出流體且因此促進細胞增殖。此外，藉由間歇性地施加負壓力，有可能藉助於暫時性縮小密閉環境之容積而均勻且有效地置換密閉環境中之循環液體。
在一些實施例中，可替換或添加TIL增殖之最佳培養物組分，且可添加包含諸如IL-2及/或OKT3以及組合之因子。L. 視情況選用之 TIL 之冷凍保存
主體TIL群體(例如第二TIL群體)或擴增TIL群體(例如第三TIL群體)可視情況進行冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存發生於治療性TIL群體。在一些實施例中，冷凍保存發生於在第二擴增後收集之TIL。在一些實施例中，冷凍保存發生於圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之例示性步驟F中之TIL。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係在置於輸注袋中之前冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存TIL且不將其置於輸注袋中。在一些實施例中，使用冷凍保存培養基進行冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲基亞碸(DMSO)。此一般藉由將TIL群體放置於冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲基亞碸(DMSO))中來完成。將溶液中之細胞置放於低溫小瓶中且儲存在-80℃ 24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器用於冷凍保存。參見Sadeghi等人, 《腫瘤學報(Acta Oncologica)》 2013, 52, 978-986。
在適當時，自冷凍器取出細胞且在37℃水浴中解凍直至大約4/5之溶液解凍。一般將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一次或多次。在一些實施例中，可計算解凍的TIL且如本領域中已知的來評定存活性。
在一些實施例中，TIL群體係使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10，BioLife Solutions)冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用含有二甲基亞碸(DMSO)之冷凍保存培養基冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用1:1(vol:vol)比率之CS10與細胞培養基冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用約1:1(vol:vol)比率之CS10與細胞培養基(進一步包括另外IL-2)冷凍保存。
如上文所論述且如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中提供之步驟A至E中所例示，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的多個點。在一些實施例中，在第二擴增後之擴增TIL群體(如例如根據圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)之步驟D所提供)可進行冷凍保存。冷凍保存一般可藉由將TIL群體置放於冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲基亞碸(DMSO))中來完成。將溶液中之細胞置放於低溫小瓶中且儲存在-80℃ 24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器用於冷凍保存。參見Sadeghi等人, 《腫瘤學報》2013
, 52, 978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例D中提供之方法冷凍保存。
在適當時，自冷凍器取出細胞且在37℃水浴中解凍直至大約4/5之溶液解凍。一般將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一次或多次。在一些實施例中，可計算解凍的TIL且如本領域中已知的來評定存活性。
在一些情況下，步驟B TIL群體可使用下文論述之方案立即冷凍保存。替代地，主體TIL群體可進行步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中遺傳修飾TIL將用於療法中之情況下，步驟B或步驟D TIL群體可進行遺傳修飾以用於合適的治療。M. 擴增 TIL 之表型特徵
在一些實施例中，分析TIL在擴增後之多種表型標誌之表現，該等標誌包含本文及實例中所描述之彼等者。在一些實施例中，檢查一種或多種表型標誌之表現。在一些實施例中，在步驟B中之第一擴增後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在步驟C中之轉變期間分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據步驟C之轉變期間及在冷凍保存後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據步驟D之第二擴增後分析TIL之表型特徵。在一些實施例中，在根據步驟D之兩次或更多次擴增後分析TIL之表型特徵。
在一些實施例中，標誌係選自由CD8及CD28組成之群組。在一些實施例中，檢查CD8之表現。在一些實施例中，檢查CD28之表現。在一些實施例中，相較於其他過程(例如如例如圖1(特定言之，例如圖1B)中提供之Gen 3過程)，相較於如例如圖1(特定言之，例如圖1B)中提供之2A過程，根據本發明過程製造之TIL上之CD8及/或CD28的表現更高。在一些實施例中，相較於其他過程(例如如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中提供之Gen 3過程)，相較於如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中提供之2A過程，根據本發明過程製造之TIL上之CD8的表現更高。在一些實施例中，相較於其他過程(例如如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中提供之Gen 3過程)，相較於如例如圖1(特定言之，例如圖1A)中提供之2A過程，根據本發明過程製造之TIL上之CD28的表現更高。在一些實施例中，高CD28表現指示較年輕、更持久的TIL表型。在一些實施例中，量測一種或多種調節標誌之表現。
在一些實施例中，在用於擴增本文所描述之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之方法之任一步驟期間，未基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL群體、第二TIL群體、第三TIL群體或所收集TIL群體。
在一些實施例中，相較於其他過程(例如如例如圖1(特定言之，例如圖1B)中提供之Gen 3過程)，相較於如例如圖1(特定言之，例如圖1A)中提供之2A過程，關於根據本發明過程製造之TIL之中樞記憶細胞的百分比更高。在一些實施例中，中樞記憶細胞之記憶標誌係選自由CCR7及CD62L組成之群組。
在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL記憶子集可分為不同記憶子集。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括中樞記憶(central memory，CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括效應記憶(effector memory，EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括RA+效應記憶/效應(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些實施例中，TIL表現一種或多種選自由以下組成之群組之標誌：顆粒酶B、穿孔蛋白及顆粒溶解素。在一些實施例中，TIL表現顆粒酶B。在一些實施例中，TIL表現穿孔蛋白。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解素。
在一些實施例中，亦可使用細胞介素釋放分析，評估再刺激的TIL之細胞介素釋放。在一些實施例中，可評估TIL之干擾素-γ(IFN-γ)分泌。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA分析量測。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA分析在快速第二擴增步驟之後、在如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)所提供之步驟D之後量測。在一些實施例中，TIL健康係藉由IFN-γ(IFN-γ)分泌量測。在一些實施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力之另一種量測。IFN-γ產生可藉由測定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激之TIL培養基中之細胞介素IFN-γ之含量量測。來自此等受刺激TIL之培養基中之IFN-γ含量可藉由量測IFN-γ釋放測定。在一些實施例中，例如如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中提供之Gen 3過程中步驟D TIL相較於例如如圖1(特定言之，例如圖1A)中提供之2A過程中步驟D之IFN-γ產生增加，指示步驟D TIL之細胞毒性潛力增加。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，IFN-γ之分泌增加三倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組量測。在一些實施例中，量測離體TIL中之IFN-γ。在一些實施例中，量測離體TIL中之IFN-γ，包含藉由本發明之方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於一倍之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於兩倍之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於三倍之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於四倍之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於五倍之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少100 pg/ml至約1000 pg/ml或更多之IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，在能夠分泌至少200 pg/ml、至少250 pg/ml、至少300 pg/ml、至少350 pg/ml、至少400 pg/ml、至少450 pg/ml之TIL、至少500 pg/ml、至少550 pg/ml、至少600 pg/ml、至少650 pg/ml、至少700 pg/ml、至少750 pg/ml、至少800 pg/ml、至少850 pg/ml、至少900 pg/ml、至少950 pg/ml或至少1000 pg/ml或更多IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少300 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少400 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少600 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少700 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少800 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少900 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少10,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少15,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少20,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少25,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少30,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少35,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少40,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少45,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少50,000 pg/ml IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少100 pg/ml/5e5個細胞至約1000 pg/ml/5e5個細胞或更多IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠具有至少200 pg/ml/5e5個細胞、至少250 pg/ml/5e5個細胞、至少300 pg/ml/5e5個細胞、至少350 pg/ml/5e5個細胞、至少400 pg/ml/5e5個細胞、至少450 pg/ml/5e5個細胞、至少500 pg/ml/5e5個細胞、至少550 pg/ml/5e5個細胞、至少600 pg/ml/5e5個細胞、至少650 pg/ml/5e5個細胞、至少700 pg/ml/5e5個細胞、至少750 pg/ml/5e5個細胞、至少800 pg/ml/5e5個細胞、至少850 pg/ml/5e5個細胞、至少900 pg/ml/5e5個細胞、至少950 pg/ml/5e5個細胞或至少1000 pg/ml/5e5個細胞或更多IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少300 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少400 pg/ml/ 5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少600 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少700 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少800 pg/ml/ 5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少900 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少10,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少15,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少20,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少25,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少30,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少35,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少40,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少45,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少50,000 pg/ml/5e5個細胞IFN-γ之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL至300000 pg/106個TIL或更多顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL、高於5000 pg/106個TIL、高於7000 pg/106個TIL、高於9000 pg/106個TIL、高於11000 pg/106個TIL、高於13000 pg/106個TIL、高於15000 pg/106個TIL、高於17000 pg/106個TIL、高於19000 pg/106個TIL、高於20000 pg/106個TIL、高於40000 pg/106個TIL、高於60000 pg/106個TIL、高於80000 pg/106個TIL、高於100000 pg/106個TIL、高於120000 pg/106個TIL、高於140000 pg/106個TIL、高於160000 pg/106個TIL、高於180000 pg/106個TIL、高於200000 pg/106個TIL、高於220000 pg/106個TIL、高於240000 pg/106個TIL、高於260000 pg/106個TIL、高於280000 pg/106個TIL、高於300000 pg/106個TIL或更多顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於5000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於7000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於9000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於11000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於13000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於15000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於17000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於19000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於20000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於40000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於60000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於80000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於100000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL至300000 pg/106個TIL或更多顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL、高於5000 pg/106個TIL、高於7000 pg/106個TIL、高於9000 pg/106個TIL、高於11000 pg/106個TIL、高於13000 pg/106個TIL、高於15000 pg/106個TIL、高於17000 pg/106個TIL、高於19000 pg/106個TIL、高於20000 pg/106個TIL、高於40000 pg/106個TIL、高於60000 pg/106個TIL、高於80000 pg/106個TIL、高於100000 pg/106個TIL、高於120000 pg/106個TIL、高於140000 pg/106個TIL、高於160000 pg/106個TIL、高於180000 pg/106個TIL、高於200000 pg/106個TIL、高於220000 pg/106個TIL、高於240000 pg/106個TIL、高於260000 pg/106個TIL、高於280000 pg/106個TIL、高於300000 pg/106個TIL或更多顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於5000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於7000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於9000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於11000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於13000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於15000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於17000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於19000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於20000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於40000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於60000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於80000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於100000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/106個TIL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。
在一些實施例中，展現分泌高於1000 pg/ml至300000 pg/ml或更多之顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於1000 pg/ml、高於2000 pg/ml、高於3000 pg/ml、高於4000 pg/ml、高於5000 pg/ml、高於6000 pg/ml，更大之TIL。大於7000 pg/ml、高於8000 pg/ml、高於9000 pg/ml、高於10000 pg/ml、高於20000 pg/ml、高於30000 pg/ml、高於40000 pg/ml、高於50000 pg/ml、高於60000 pg/ml、高於70000 pg/ml、高於80000 pg/ml、高於90000 pg/ml、高於100000 pg/ml或更多顆粒酶B之TIL為藉由擴增產生之TIL本發明之方法，包括例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於1000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於2000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於3000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於4000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於5000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於6000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於7000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於8000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於9000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於10000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於20000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於30000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於40000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於50000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於60000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於70000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於80000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於90000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於100000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/ml顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)產生之TIL。
在一些實施例中，本發明之擴增方法產生展現相較於非擴增TIL群體增加的活體外顆粒酶B分泌的擴增TIL群體，包括例如如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H中提供的TIL。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少一倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少兩倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少三倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少四倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少五倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少六倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少七倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少八倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少九倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多含量之TNF-α(亦即，TNF-alpha)之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少一倍含量之TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少兩倍含量之TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少三倍含量之TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少四倍含量之TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少五倍含量之TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠相較於IFN-γ分泌分泌低至少200 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α(亦即，TNF-alpha)之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/ 5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/ml/ 5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/ml/5e5個細胞至約10,000 pg/ml/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL。
在一些實施例中，量測IFN-γ及顆粒酶B含量以判定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ及TNF-α含量以判定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測顆粒酶B及TNF-α含量以判定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ，顆粒酶B及TNF-α含量以判定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H方法)產生之TIL的表型特徵。
T及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收集的TIL及/或使用除本文中提供之方法以外之其他方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性，該等其他方法包含例如除圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中實施之方法以外的方法。在一些實施例中，相較於新鮮收集的TIL及/或使用如圖1(特定言之，例如圖1A)中例示之稱為過程2A之方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增中獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性係增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(即，TCRα/β)之表現增加。在一些實施例中，如本文所描述之過程(例如Gen 3過程)相較於其他過程(例如稱為Gen 2之過程)，基於樣本內獨特肽CDR之數目，顯示更高的純系多樣性(參見例如圖12-14)。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包含如例如圖1中所描述之方法)製備之TIL，相較於藉由其他方法(包含未在圖1中例示之方法，諸如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加的多株性指示治療功效及/或增加癌症治療之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療功效。在一些實施例中，相較於使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(除圖1中實施之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加1000倍。
在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可藉由檢查一種或多種標誌判定。在一些實施例中，活化及耗竭可使用多色流動式細胞測量術判定。在一些實施例中，標誌之活化及耗竭包含但不限於一種或多種選自由以下組成之群組之標誌：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103及/或LAG-3)。在一些實施例中，標誌之活化及耗竭包含但不限於一種或多種選自由以下組成之群組之標誌：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，標誌之活化及耗竭包含但不限於一種或多種選自由以下組成之群組之標誌：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，可判定及/或分析T細胞標誌(包含活化及耗竭標誌)以檢查T細胞活化、抑制或功能。在一些實施例中，T細胞標誌可包含但不限於一種或多種選自由以下組成之群組之標誌：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4及/或CD59。
在一些實施例中，表型特徵係在冷凍保存之後檢查。N.
另外過程實施例
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增，以產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以得到第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1至11天之第二時段，以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(e)收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增，以產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以得到第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1至11天之第二時段，以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(e)收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增，以產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以得到第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1至11天之第二時段，以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(e)收集獲自步驟(d)之治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行初始以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，該第一TIL群體可藉由利用腫瘤消化處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL獲得，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與具有另外IL-2、OKT-3及APC之第二TIL群體之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增中APC之數目為步驟(a)中APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1至11天的第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行初始以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，該第一TIL群體可藉由利用腫瘤消化處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL獲得，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與具有另外IL-2、OKT-3及APC之第二TIL群體之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增中APC之數目為步驟(a)中APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1至11天的第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行初始以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，該第一TIL群體可藉由利用腫瘤消化處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL獲得，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與具有另外IL-2、OKT-3及APC之第二TIL群體之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增中APC之數目為步驟(a)中APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1至11天的第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行第一TIL群體之初始第一擴增以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增進行約1至11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行第一TIL群體之初始第一擴增以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增進行約1至11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體進行第一TIL群體之初始第一擴增以產生第二TIL群體，該第一TIL群體已選擇為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(b)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中快速第二擴增進行約1至11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體；及(c)收集獲自步驟(b)的治療性TIL群體。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包括投予擴增的腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增以產生第二TIL群體，其中初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天以獲得第二TIL群體；(d)藉由向第二TIL群體之細胞培養基補充另外IL-2、OKT-3及APC進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中添加至快速第二擴增之APC的數目為步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中快速第二擴增進行約1至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；(e)收集獲自步驟(c)的治療性TIL群體；(f)將來自步驟(d)的所收集TIL群體轉移至輸注袋；及(g)向該個體投予治療有效劑量的來自步驟(e)的TIL。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包括投予擴增的腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增以產生第二TIL群體，其中初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天以獲得第二TIL群體；(d)藉由向第二TIL群體之細胞培養基補充另外IL-2、OKT-3及APC進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中添加至快速第二擴增之APC的數目為步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中快速第二擴增進行約1至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；(e)收集獲自步驟(c)的治療性TIL群體；(f)將來自步驟(d)的所收集TIL群體轉移至輸注袋；及(g)向該個體投予治療有效劑量的來自步驟(e)的TIL。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包括投予擴增的腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體進行初始第一擴增以產生第二TIL群體，其中初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中初始第一擴增進行約1至7、8、9、10或11天以獲得第二TIL群體；(d)藉由向第二TIL群體之細胞培養基補充另外IL-2、OKT-3及APC進行快速第二擴增以產生第三TIL群體，其中添加至快速第二擴增之APC的數目為步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中快速第二擴增進行約1至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的容器中進行；(e)收集獲自步驟(c)的治療性TIL群體；(f)將來自步驟(d)的所收集TIL群體轉移至輸注袋；及(g)向該個體投予治療有效劑量的來自步驟(e)的TIL。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括第一細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之第一TIL細胞培養物中培養第一TIL群體進行初始第一擴增：i)獲自第一抗原呈現飼養細胞(APC)培養物的第一培養物上清液，其中第一培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中初始第一擴增係藉由在包括第一透氣表面區域的第一容器中培養第一TIL細胞培養物約1至7、8、9、10或11天的第一時段進行以獲得第二TIL群體，且其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由將第一TIL細胞培養物轉移至補充有第二細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之包括第二透氣表面區域的第二容器中進行快速第二擴增以形成第二TIL細胞培養物：i)獲自第二APC培養物的第二培養物上清液，其中第二培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中快速第二擴增係藉由培養第二TIL細胞培養物約1至11天的第二時段進行以獲得第三TIL群體，且其中第三TIL群體為治療性TIL群體；其中第一TIL細胞培養物不包含第一培養物上清液及APC；其中第二TIL細胞培養物不包含第二培養物上清液及補充性APC；(e)收集獲自步驟(d)的治療性TIL群體；及(f)將來自步驟(e)所收集TIL群體轉移至輸注袋。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括第一細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之第一TIL細胞培養物中培養第一TIL群體進行初始第一擴增：i)獲自第一抗原呈現飼養細胞(APC)培養物的第一培養物上清液，其中第一培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中初始第一擴增係藉由在包括第一透氣表面區域的第一容器中培養第一TIL細胞培養物約1至7、8、9、10或11天的第一時段進行以獲得第二TIL群體，且其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由將第一TIL細胞培養物轉移至補充有第二細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之包括第二透氣表面區域的第二容器中進行快速第二擴增以形成第二TIL細胞培養物：i)獲自第二APC培養物的第二培養物上清液，其中第二培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中快速第二擴增係藉由培養第二TIL細胞培養物約1至11天的第二時段進行以獲得第三TIL群體，且其中第三TIL群體為治療性TIL群體；其中第一TIL細胞培養物不包含第一培養物上清液及APC；其中第二TIL細胞培養物不包含第二培養物上清液及補充性APC；(e)收集獲自步驟(d)的治療性TIL群體；及(f)將來自步驟(e)所收集TIL群體轉移至輸注袋。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至8天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至6天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多腫瘤片段而獲得及/或接收來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；(b)自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，以獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集的TIL群體；(c)藉由在包括第一細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之第一TIL細胞培養物中培養第一TIL群體進行初始第一擴增：i)獲自第一抗原呈現飼養細胞(APC)培養物的第一培養物上清液，其中第一培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中初始第一擴增係藉由在包括第一透氣表面區域的第一容器中培養第一TIL細胞培養物約1至7、8、9、10或11天的第一時段進行以獲得第二TIL群體，且其中第二TIL群體在數目上大於第一TIL群體；(d)藉由將第一TIL細胞培養物轉移至補充有第二細胞培養基、IL-2及以下中之任一者之包括第二透氣表面區域的第二容器中進行快速第二擴增以形成第二TIL細胞培養物：i)獲自第二APC培養物的第二培養物上清液，其中第二培養物上清液包括OKT-3，或ii)APC及OKT-3，其中快速第二擴增係藉由培養第二TIL細胞培養物約1至11天的第二時段進行以獲得第三TIL群體，且其中第三TIL群體為治療性TIL群體；其中第一TIL細胞培養物不包含第一培養物上清液及APC；其中第二TIL細胞培養物不包含第二培養物上清液及補充性APC；(e)收集獲自步驟(d)的治療性TIL群體；及(f)將來自步驟(e)所收集TIL群體轉移至輸注袋。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養之第二TIL群體轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，來自小規模培養之第二TIL群體係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養之第二TIL群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在一些實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第二TIL群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養之第二TIL群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，自小規模培養轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由使第一TIL群體與進一步包括外源性抗原呈現細胞(APC)之培養基接觸來進行，其中步驟(c)中培養基中之APC數目大於步驟(b)中培養基中之APC數目。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，培養基補充有另外外源性APC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約20:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約9:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約8:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約7:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約6:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約5:1之範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約1.1:1至剛好或大約2:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約10:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約5:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約4:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約3:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率係選自剛好或大約2:1至剛好或大約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率為剛好或大約2:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數目與步驟(b)中添加之APC數目的比率為剛好或大約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1 ，2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1 ，4.9:1或5:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中初始第一擴增中添加之APC數目為剛好或大約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且其中快速第二擴增中添加之APC數目為剛好或大約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中初始第一擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約1×108
個APC至剛好或大約3.5×108
個APC的範圍，且其中快速第二擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約3.5×108
個APC至剛好或大約1×109
個APC的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中初始第一擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約1.5×108
個APC至剛好或大約3×108
個APC的範圍，且其中快速第二擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約4×108
個APC至剛好或大約7.5×108
個APC的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中初始第一擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約2×108
個APC至剛好或大約2.5×108
個APC的範圍，且其中快速第二擴增中添加之APC數目係選自剛好或大約4.5×108
個APC至剛好或大約5.5×108
個APC的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中剛好或大約2.5×108
個APC係添加至初始第一擴增，且剛好或大約5×108
個APC係添加至快速第二擴增。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個腫瘤片段係分佈至複數個分開的容器中，在各分開的容器中，第一TIL群體係在步驟(a)中獲得，第二TIL群體該步驟(b)中獲得，且第三TIL群體係在步驟(c)中獲得，且將來自步驟(c)中複數個容器之治療性TIL群體合併以產生來自步驟(d)之經收集的TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個腫瘤均勻分佈至複數個分開的容器中。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括至少兩個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括兩個至二十個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括兩個至十五個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括兩個至十個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括兩個至五個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中複數個分開的容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個分開的容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在各容器中對步驟(b)中之第一TIL群體進行初始第一擴增，在同一容器中對由此類第一TIL群體產生之第二TIL群體進行步驟(c)中的快速第二擴增。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中分開的容器中之各者包括第一透氣表面區域。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個腫瘤片段分佈於單一容器中。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中單一容器包括第一透氣表面區域。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中在步驟(c)中添加之APC數目大於在步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中，APC以剛好或大約一個細胞層至剛好或大約三個細胞層的平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約1.5個細胞層至剛好或大約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3個細胞層至剛好或大約10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約4個細胞層至剛好或大約8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域的第一容器中進行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域的第二容器中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二容器大於第一容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中在步驟(c)中添加之APC數目大於在步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中，APC以剛好或大約一個細胞層至剛好或大約三個細胞層的平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約1.5個細胞層至剛好或大約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3個細胞層至剛好或大約10個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約4個細胞層至剛好或大約8個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域的第一容器中進行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係在第一容器中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中在步驟(c)中添加之APC數目大於在步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中，APC以剛好或大約一個細胞層至剛好或大約三個細胞層的平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約1.5個細胞層至剛好或大約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3個細胞層至剛好或大約10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約4個細胞層至剛好或大約8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中，APC以剛好或大約以下之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:10的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:9的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:8的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:7的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:6的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:5的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:4的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:3的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1至剛好或大約1:2的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.2至剛好或大約1:8的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.3至剛好或大約1:7的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.4至剛好或大約1:6的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.5至剛好或大約1:5的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.6至剛好或大約1:4的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.7至剛好或大約1:3.5的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.8至剛好或大約1:3的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.9至剛好或大約1:2.5的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:2的範圍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係藉由用另外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基進行，其中步驟(c)中添加之APC數目大於步驟(b)中添加之APC數目，且其中步驟(b)中層疊的APC之平均層數與步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率係選自剛好或大約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體中之TIL數目與第一TIL群體中之TIL數目的比率為剛好或大約1.5:1至剛好或大約100:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體中之TIL數目與第一TIL群體中之TIL數目的比率為剛好或大約50:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體中之TIL數目與第一TIL群體中之TIL數目的比率為剛好或大約25:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體中之TIL數目與第一TIL群體中之TIL數目的比率為剛好或大約20:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體中之TIL數目與第一TIL群體中之TIL數目的比率為剛好或大約10:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體在數目上比第一TIL群體高至少剛好或大約50倍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中第二TIL群體在數目上比第一TIL群體高至少剛好或大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中之第二時段開始後剛好或大約2天或剛好或大約3天，對細胞培養基補充另外的IL-2。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存步驟(d)中之經收集的TIL群體的步驟。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，包括在步驟(d)後執行將來自步驟(d)之經收集的TIL群體轉移至視情況含有HypoThermosol之輸注袋的另外步驟(e)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，包括使用冷凍保存過程冷凍保存包括步驟(e)中之經收集之TIL群體的輸注袋的步驟。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中使用1:1比率之經收集之TIL群體與冷凍保存培養基來進行冷凍保存過程。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中PBMC為經照射且同種異體的。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(b)中添加至細胞培養物之APC總數為2.5 × 108
個。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(c)中添加至細胞培養物之APC總數為5 × 108
個。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中APC為PBMC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中PBMC為經照射且同種異體的。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中使用基於膜之細胞處理系統來進行步驟(d)中之收集。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中使用LOVO細胞處理系統來進行步驟(d)中之收集。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約5至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約10至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約15至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約20至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約25至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約30至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約35至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約40至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約45至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約50至剛好或大約60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括在步驟(b)中每容器剛好或大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個片段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約27 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約20 mm3
至剛好或大約50 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約21 mm3
至剛好或大約30 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約22 mm3
至剛好或大約29.5 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約23 mm3
至剛好或大約29 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約24 mm3
至剛好或大約28.5 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約25 mm3
至剛好或大約28 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約26.5 mm3
至剛好或大約27.5 mm3
之體積。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中各片段具有剛好或大約以下之體積：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mm3
。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括剛好或大約30至剛好或大約60個片段，其中總體積為剛好或大約1300 mm3
至剛好或大約1500 mm3
。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括剛好或大約50個片段，其中總體積為剛好或大約1350 mm3
。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中多個片段包括剛好或大約50個片段，其中總質量為剛好或大約1公克至剛好或大約1.5公克。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中細胞培養基係提供於呈G容器或Xuri細胞袋之容器中。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中冷凍保存培養基包括二甲基亞碸(DMSO)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(b)中之第一時段係於剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(c)中之第二時段係於剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自分別係於剛好或大約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自分別係於剛好或大約5天、6天或7天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自分別係於剛好或大約7天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約14天至剛好或大約18天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約15天至剛好或大約18天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約16天至剛好或大約18天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約14天至剛好或大約17天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約15天至剛好或大約17天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約14天至剛好或大約16天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約15天至剛好或大約16天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約14天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約15天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約16天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約17天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約18天中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約14天或更短中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約15天或更短中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約16天或更短中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約17天或更短中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共剛好或大約18天或更短中進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(d)中收集之治療性TIL群體包括足以用於TIL之治療有效劑量的TIL。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中足以用於治療有效劑量之TIL數為剛好或大約2.3×1010
個至剛好或大約13.7×1010
個。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(c)中之第三TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中相較於藉由長於16天之過程來製備的TIL，步驟(c)中之第三TIL群體提供至少一倍至五倍或更多的干擾素-γ產生。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中相較於藉由長於17天之過程來製備的TIL，步驟(c)中之第三TIL群體提供至少一倍至五倍或更多的干擾素-γ產生。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中相較於藉由長於18天之過程來製備的TIL，步驟(c)中之第三TIL群體提供至少一倍至五倍或更多的干擾素-γ產生。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中相對於獲自步驟(b)第二細胞群體之效應T細胞及/或中樞記憶T細胞，獲自步驟(c)第三TIL群體之效應T細胞及/或中樞記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為密閉容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為G容器。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-10。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-100。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-500。
在其他實施例中，本發明提供藉由如上適用之任何前述段落中描述之方法製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)或OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)之情況下進行之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無添加的抗原呈現細胞(APC)及無添加的OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由過程長於16天之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由過程長於17天之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由過程長於18天之過程製備的TIL，治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體提供增加的干擾素-γ產生。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體提供增加的多株性。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體提供增加的功效。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於16天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於17天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於18天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於16天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於17天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於18天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於16天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於三倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於17天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於三倍的干擾素-γ。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之治療性TIL群體，其中相較於藉由長於18天之過程製備的TIL，該治療性TIL群體能夠產生至少多於三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於三倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性腫瘤浸潤性淋巴球群體能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性腫瘤浸潤性淋巴球群體產生至少多於一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的APC之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性TIL群體產生至少多於兩倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的APC之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性TIL群體產生至少多於兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性TIL群體產生至少多於兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於兩倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的APC之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性TIL群體產生至少多於三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，相較於藉由其中TIL之第一擴增係在無任何添加的OKT3之情況下進行之過程製備的TIL，該治療性TIL群體產生至少多於三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，由於本文中描述，例如如上文步驟A至F中或根據上文步驟A至F描述之擴增過程(亦如例如圖1(特定言之，例如圖1B及/或圖1C及/或圖1D及/或圖1E及/或圖1F及/或圖1G及/或圖1H)中所示)，使得TIL能夠產生至少多於三倍的干擾素-γ。
在其他實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包括：(a)藉由培養獲自供體之第一T細胞群體來進行該第一T細胞群體的初始第一擴增，以實現生長及啟動第一T細胞群體的活化；(b)在步驟(a)中啟動之第一T細胞群體之活化開始衰退後，藉由培養第一T細胞群體進行第一T細胞群體的快速第二擴增以實現生長及增強第一T細胞群體的活化，以獲得第二T細胞群體；及(c)收集第二T細胞群體。在其他實施例中，快速第二擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移至大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，及在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞群體約4至7天的時段。在其他實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自第一小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞群體部分係在第二小規模培養中培養約4至7天的時段。在其他實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約4至7天的時段。在其他實施例中，快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至至少2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速第二擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移至大於第一容器之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，及在第二容器中之較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞群體約5至7天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之第一小規模培養中培養第一T細胞群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自第一小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞群體部分係在第二小規模培養中培養約5至7天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約2至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5至7天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5至6天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此類第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約5天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此等第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約6天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中之小規模培養中培養第一T細胞群體約3至4天之時段進行快速第二擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養之第一T細胞群體轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，轉移至此等第二容器之來自小規模培養的第一T細胞群體部分係在較大規模培養中培養約7天的時段。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係在至多7天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係在至多8天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係在至多9天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係在至多10天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係在至多11天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在7天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多9天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在7天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多10天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在7天或8天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多9天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在7天或8天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多10天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在8天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多9天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中步驟(a)中之初始第一擴增係在8天之時段內進行，且步驟(b)之快速第二擴增係在至多8天之時段內進行。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包括OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3及IL-2。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一培養基包括OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈遞細胞(APC)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包括第一透氣表面之容器中於第一培養基中培養，其中第一培養基包括OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體係在容器中於第二培養基中培養，其中第二培養基包括OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體大。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包括第一透氣表面之容器中於第一培養基中培養，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體係在容器中於第二培養基中培養，其中第二培養基包括OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體大。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包括第一透氣表面之容器中於第一培養基中培養，其中第一培養基包括OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體係在容器中於第二培養基中培養，其中第二培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體大。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞群體係在包括第一透氣表面之容器中於第一培養基中培養，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈遞細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞群體係在容器中於第二培養基中培養，其中第二培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體大。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第二APC群體中之APC之數目與第一APC群體中之APC之數目的比率為約2:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一APC群體中之APC之數目為約2.5×108
，且第二APC群體中之APC之數目為約5×108
。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以2個APC層之平均厚度層疊至第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中，第二APC群體以選自4至8個APC層之範圍內的平均厚度層疊至第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中層疊至第一透氣表面上之APC層的平均數目與在步驟(a)中層疊至第一透氣表面上之APC層的平均數目的比率為2:1。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自剛好或大約1.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自在或約2.0×106
個APC/cm2
至在或約3.0×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以剛好或大約2.0×106
個APC/cm2
之密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約7.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約6.0×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約5.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(b)中，第二APC群體以剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
之密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自剛好或大約1.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約4.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約2.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約7.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自剛好或大約1.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約3.5×106
個APC/cm2
至剛好或大約6.0×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以選自剛好或大約2.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約3.0×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
至剛好或大約5.5×106
個APC/cm2
之範圍內的密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(a)中，第一APC群體以剛好或大約2.0×106
個APC/cm2
之密度接種在第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以剛好或大約4.0×106
個APC/cm2
之密度接種在第一透氣表面上。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中APC為周邊血液單核細胞(PBMC)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中PBMC經照射且對於第一T細胞群體之供體為外源性的。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中T細胞為腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中T細胞為骨髓浸潤性淋巴球(MIL)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中T細胞為周邊血液淋巴球(PBL)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一T細胞群體係藉由自供體之全血分離而獲得。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一T細胞群體係藉由自供體之血球分離術產物分離而獲得。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中第一T細胞群體係藉由T細胞表型之正向或負向選擇自供體之全血或血球分離術產物分離。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中T細胞表型為CD3+及CD45+。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在進行第一T細胞群體之初始第一擴增之前，自NK細胞分離T細胞。在其他實施例中，藉由自第一T細胞群體移除CD3-CD56+細胞來將第一T細胞群體中之T細胞與NK細胞分離。在其他實施例中，藉由使用移除CD3-CD56+細胞級份且回收陰性級份之圈選策略對第一T細胞群體進行細胞分選，自第一T細胞群體移除CD3-CD56+細胞。在其他實施例中，前述方法係用於以高百分比之NK細胞為特徵的第一T細胞群體中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於以高百分比之CD3-CD56+細胞為特徵的第一T細胞群體中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於以存在大量NK細胞為特徵的腫瘤組織中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於以大量CD3-CD56+細胞為特徵的腫瘤組織中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於自患有以存在大量NK細胞為特徵之腫瘤的患者獲得的腫瘤組織中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於自患有以存在大量CD3-CD56+細胞為特徵之腫瘤的患者獲得的腫瘤組織中之T細胞擴增。在其他實施例中，前述方法係用於自患有卵巢癌之患者獲得的腫瘤組織中之T細胞擴增。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中將剛好或大約1×107
個來自第一T細胞群體之T細胞接種於容器中，以起始此類容器中之初始第一擴增培養。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中將第一T細胞群體分佈至複數個容器中，且在各容器中接種剛好或大約1×107
個來自第一T細胞群體之T細胞，以起始此類容器中之初始第一擴增培養。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的方法，其中在步驟(c)中收集之第二T細胞群體為治療性TIL群體。III. 醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之TIL係以醫藥組成物之形式向患者投予。在一些實施例中，醫藥組成物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知的任何適合途徑投予。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投予，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投予途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴管內投予。
可投予任何適合劑量之TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×1010
個TIL，特別是在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目為約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數目在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度小於例如醫藥組成物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度大於醫藥組成物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度在醫藥組成物的約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度在醫藥組成物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在廣泛劑量範圍內有效。準確劑量將視投予途徑、化合物投予形式、待治療個體之性別及年齡、待治療個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。適當時亦可使用TIL之臨床確定劑量。使用本文之方法投予之醫藥組成物的量，諸如TIL之劑量將視所治療之人類或哺乳動物、病症或病狀之嚴重程度、投予速率、活性醫藥成分之配置及開處方醫師之判斷而定。
在一些實施例中，TIL可以單次劑量投予。此類投予可藉由例如靜脈內注射之注射進行。在一些實施例中，TIL可以多次劑量投予。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為每月一次、每兩週一次、一週一次或每隔一天一次。TIL之投予可視需要而繼續。
在一些實施例中，TIL之有效劑量為約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施例中，TIL之有效劑量在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
之範圍內。
在一些實施例中，TIL之有效劑量在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg之範圍內。
在一些實施例中，TIL之有效劑量在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg、或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg之範圍內。
有效量之TIL可藉由投予具有類似效用之試劑的任一種公認模式，包含鼻內及經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、局部、藉由移植或藉由吸入，以單次或多次劑量投予。
在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包括如上適用的在任何前述段落中描述的治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)組成物，其包括如上適用的在任何前述段落中描述的治療性TIL群體及醫藥學上可接受之載劑。
在其他實施例中，本發明提供一種輸注袋，其包括如上適用的在任何前述段落中描述的TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供一種如上適用的在任何前述段落中描述的治療性TIL群體的冷凍保存製劑。
在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)組成物，其包括如上適用的在任何前述段落中描述的治療性TIL群體及冷凍保存培養基。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其中冷凍保存培養基含有DMSO。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其中冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在一些實施例中，本發明提供在無血清培養基或確定培養基中包括TIL的TIL組成物。在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或確定培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下中之一者或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種抗生素及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
"、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM的2-巰基乙醇。
在一些實施例中，確定培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(賽默飛世爾科技)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM的2-巰基乙醇及2 mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(賽默飛世爾科技)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM的麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2 mM之麩醯胺酸(亦即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55 mM之2-巰基乙醇。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一種或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一種或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一種或多種白蛋白或白蛋白取代物、一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物、一種或多種微量元素及一種或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白或白蛋白取代物及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：一種或多種胺基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白取代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素取代物、一種或多種膠原蛋白前驅物及一種或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包括白蛋白及一種或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和運鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部分Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
"、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由以下組成之群組：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良達爾伯克氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中甘胺酸之濃度在約5至200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5至250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5至400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1至45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1至250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10至500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2至110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3至175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5至500 mg/L，硫胺素之濃度為約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1至200 mg/L，鐵飽和運鐵蛋白之濃度為約1至50 mg/L，胰島素之濃度為約1至100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001至0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、一種或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人, 《使用新穎無Xeno CTS免疫細胞血清替代物離體擴增人類T細胞以用於過繼免疫療法》, 《臨床轉化免疫學》, 4(1) 2015(數位物件識別碼：10.1038/cti.2014.31)中所描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™用作基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在其他實施例中，本發明提供一種適用的在任何前述段落中描述的TIL組成物的冷凍保存製劑。
IV.治療患者之方法
治療方法始於原始TIL收集及TIL培養。此類方法均已描述於例如以全文引用之方式併入本文中的Jin等人, 《免疫療法雜誌》,2012
, 35(3):283-292之領域中。下文貫穿各個部分，包含實例，描述了治療方法之實施例。
發現根據本文所描述之方法，包含例如如上文步驟A至F中所描述或根據上文步驟A至F(亦如例如圖1，特別是例如圖1B中所示)而產生的擴增TIL在治療癌症患者方面的特殊用途(例如，如以全文引用之方式併入本文中的Goff等人,《臨床腫瘤學雜誌》,2016
, 34(20):2389-239以及補充內容中所描述)。在一些實施例中，如先前描述自經切除轉移性黑色素瘤寄存物生長TIL(參見以全文引用之方式併入本文中的Dudley等人, 《免疫療法雜誌》,2003
, 26:332-342)。可在無菌條件下分割新鮮腫瘤。可收集代表樣本以用於正式病理分析。可使用2 mm3
至3 mm3
之單個片段。在一些實施例中，自每位患者獲得5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得20、25或30個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得20、22、24、26或28個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得24個樣本。可將樣本置於24孔盤之個別孔中，維持於含高劑量IL-2(6,000 IU/mL)之生長培養基中，並監測腫瘤破壞及/或TIL增殖。如本文所描述，可將在處理後剩餘活細胞之任何腫瘤酶碎解成單細胞懸浮液並冷凍保存。
在一些實施例中，可對成功生長之TIL進行取樣以用於表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)，並在可用時針對自體腫瘤進行測試。若隔夜共培養產生之干擾素-γ(IFN-γ)含量˃ 200 pg/mL且為背景之兩倍，則可認為TIL具反應性。(Goff等人, 《免疫療法雜誌》,2010
, 33:840-847；以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，可選擇已證明具自體反應性或充足生長模式的培養物用於第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B)之步驟D中所提供之第二擴增，包含有時稱作快速擴增(REP)的第二擴增)。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在第二擴增期間高度增殖)的經擴增TIL用於另外的第二擴增。在一些實施例中，選擇具高自體反應性(例如在如圖1(特別是例如圖1B)之步驟D中所提供之第二擴增期間高度增殖)的TIL用於根據圖1(特別是例如圖1B)之步驟D的另外之第二擴增。
在一些實施例中，IFN-γ指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療的個體之血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。藉由測定由本發明方法製備之TIL治療的個體之血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ含量，可量測IFN-γ產生，該等方法包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法。在一些實施例中，IFN-γ增加指示對用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1及/或圖8中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。
在一些實施例中，患者不直接進行ACT(過繼細胞轉移)，例如，在一些實施例中，在腫瘤收集及/或第一擴增之後，不立即利用細胞。在一些實施例中，可冷凍保存且在向患者投予之前2天解凍TIL。在一些實施例中，可冷凍保存且在向患者投予之前1天解凍TIL。在一些實施例中，可冷凍保存且在即將向患者投予之前解凍TIL。
可藉由針對表面標誌CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA之流動式細胞測量術(例如FlowJo)(碧迪生物科學)以及藉由本文所描述之任一種方法分析輸注袋TIL之冷凍保存樣本之細胞表型。藉由使用標準酶聯免疫吸附分析技術量測血清細胞介素。血清IFN-g之升高定義為˃100 pg/mL及大於43之基線水準。
在一些實施例中，藉由本文所提供之方法，例如圖1(特別是例如圖1B)中例示之方法產生的TIL獲得對TIL之臨床功效的驚人改善。在一些實施例中，相較於藉由除本文所描述方法外之方法(包含例如除圖1(特別是例如圖1B)中例示之方法外的方法)產生的TIL，藉由本文所提供之方法，例如圖1(尤其例如圖1B)中例示之方法產生的TIL展現增加之臨床功效。在一些實施例中，除本文所描述之方法外的方法包含稱作過程1C及/或第1代(Gen 1)之方法。在一些實施例中，藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應量測增加之功效。在一些實施例中，相較於藉由除本文所描述方法外之方法(包含例如除圖1(特別是例如圖1B)中例示之方法外的方法，例如Gen 1過程)產生的TIL，藉由本文所提供之方法，例如圖1(尤其例如圖1B)中例示之方法產生的TIL展現類似反應時間及安全性概況。
在一些實施例中，IFN-γ指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療的個體之血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。藉由測定由本發明方法製備之TIL治療的個體之血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ含量，可量測IFN-γ產生，該等方法包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法。在一些實施例中，IFN-γ增加指示對用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組量測IFN-γ。在一些實施例中，量測用藉由本發明方法，包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法製備的TIL治療的個體之離體TIL中之IFN-γ。在一些實施例中，量測用藉由本發明方法，包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法製備的TIL治療的個體之血液中之IFN-γ。在一些實施例中，量測用藉由本發明方法，包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法製備的TIL治療的個體之TIL血清中之IFN-γ。
在一些實施例中，相較於藉由其他方法(包含例如圖1(特別是例如圖1B)中未例示之方法，諸如稱作過程1C方法之方法)產生的TIL，藉由本發明方法，包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法製備的TIL展現增加之多株性。在一些實施例中，顯著提高之多株性及/或增加之多株性指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明方法產生之TIL的治療功效。在一些實施例中，相較於使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備的TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。
功效之量度可包含疾病控制率(DCR)以及總反應率(ORR)，如本領域已知以及本文所描述。1. 治療癌症及其他疾病之方法
本文所描述之組成物及方法可用於一種治療疾病之方法中。在一些實施例中，其用於治療過度增生病症。其亦可用於治療如本文及以下段落中所描述之其他病症。
在一些實施例中，過度增生病症為癌症。在一些實施例中，過度增生病症為實體腫瘤癌症。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群組：神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、三陰性乳癌(TNBC)、肉瘤、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，過度增生病症為血液惡性病。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群組：慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。
在一些實施例中，癌症為高突變癌症表型。高突變癌症廣泛描述於Campbell等人(《細胞》, 171: 1042-1056(2017)；出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9至10個突變。在一些實施例中，小兒高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9.91個突變。在一些實施例中，成人高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9個突變。在一些實施例中，增強高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，增強小兒高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，增強成人高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，小兒超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，成人超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。
在一些實施例中，高突變腫瘤具有複製修復路徑之突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有複製修復相關DNA聚合酶之突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有微衛星不穩定性。在一些實施例中，超高突變腫瘤具有複製修復相關DNA聚合酶之突變且具有微衛星不穩定性。在一些實施例中，腫瘤之高突變與對免疫檢查點抑制劑之反應相關。在一些實施例中，高突變腫瘤對免疫檢查點抑制劑治療具有抗性。在一些實施例中，高突變腫瘤可使用本發明之TIL治療。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由環境因素(外在暴露)引起。舉例而言，UV光可為惡性黑色素瘤中大量突變之主要原因(參見例如Pfeifer, G.P.、You, Y.H.及Besaratinia, A.(2005).《突變研究(Mutat. Res.)》 571, 19-31.；Sage, E.(1993).《光化學與光生物學(Photochem. Photobiol.)》57, 163-174.)。在一些實施例中，腫瘤之高突變可歸因於直接突變原暴露而由菸草煙霧中大於60種之肺及喉腫瘤以及其他腫瘤致癌物引起(參見例如Pleasance, E.D.、Stephens, P.J.、O'Meara, S.、McBride, D.J.、Meynert, A.、Jones, D.、Lin, M.L.、Beare, D.、Lau, K.W.、Greenman, C等人(2010).《自然》 463, 184-190)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由已顯示在廣泛範圍之癌症中引起C至T轉換量增加的催化性多肽樣脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)家族成員的失調引起(參見例如Roberts, S.A.、Lawrence, M.S.、Klimczak, L.J.、Grimm, S.A.、Fargo, D.、Stojanov, P.、Kiezun, A.、Kryukov, G.V.、Carter, S.L.、Saksena, G等人(2013).《自然-遺傳學(Nat. Genet.)》45, 970-976)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由缺陷性DNA複製修復引起，該缺陷性DNA複製修復係由損害主要複製酶Pol3及Pold1所進行之校讀的突變造成。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由與結腸直腸癌、子宮內膜癌及其他癌症之高突變相關的DNA錯配修復缺陷引起(參見例如Kandoth, C.、Schultz, N.、Cherniack, A.D.、Akbani, R.、Liu, Y.、Shen, H.、Robertson, A.G.、Pashtan, I.、Shen, R.、Benz, C.C等人(2013).《自然》 497, 67-73.；Muzny, D.M.、Bainbridge, M.N.、Chang, K.、Dinh, H.H.、Drummond, J.A.、Fowler, G.、Kovar, C.L.、Lewis, L.R.、Morgan, M.B.、Newsham, I.F.等人(2012).《自然》 487, 330-337)。在一些實施例中，DNA複製修復突變亦發現於癌症易感症候群，諸如組成性或雙對偶錯配修復缺陷(constitutional or biallelic mismatch repair deficiency；CMMRD)、林奇症候群(Lynch syndrome)及聚合酶校讀相關息肉病(PPAP)中。
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中癌症為高突變癌症。在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中癌症為增強高突變癌症。在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中癌症為超高突變癌症。
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉賓25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27至23天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉賓25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第27至25天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)，然後為氟達拉賓25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第25至23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非骨髓清除式化療及TIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2的靜脈內輸注以達到生理耐受。
可使用本領域已知的為人類疾病治療提供指南之各種模型來測試本文所描述之化合物及化合物組合在治療、預防及/或控制所指示疾病或病症中的功效。舉例而言，用於測定卵巢癌治療功效之模型描述於例如Mullany等人, 《內分泌學(Endocrinology
)》2012, 153
, 1585-92；及Fong等人, 《卵巢研究雜誌(J. Ovarian Res
.)》2009
, 2, 12中。用於測定胰臟癌治療功效之模型描述於Herreros-Villanueva等人, 《世界胃腸病學雜誌(World J. Gastroenterol.
)》2012, 18,
1286-1294中。用於測定乳癌治療功效之模型描述於例如Fantozzi, 《乳癌研究(Breast Cancer Res.
)》2006, 8,
212中。用於測定黑色素瘤治療功效之模型描述於例如Damsky等人, 《色素細胞及黑色素瘤研究(Pigment Cell & Melanoma Res.
)》2010, 23,
853-859中。用於測定肺癌治療功效之模型描述於例如Meuwissen等人, 《基因與發育(Genes&Development
)》,2005, 19,
643-664中。用於測定肺癌治療功效之模型描述於例如Kim, 《臨床與實驗耳鼻喉科學(Clin. Exp. Otorhinolaryngol.
)》2009, 2,
55-60；及Sano, 《頭頸癌腫瘤學(Head Neck Oncol.
)》2009, 1,
32中。
在一些實施例中，IFN-γ指示過度增生病症治療之治療功效。在一些實施例中，用TIL治療的個體之血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。藉由測定由本發明方法製備之TIL治療的個體之血液中之細胞介素IFN-γ含量，可量測IFN-γ產生，該等方法包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法。在一些實施例中，相較於用使用如圖1(特別是例如圖1B)及整個本申請案所例示之稱作Gen 3過程之方法製備的TIL治療之個體，藉由本發明方法獲得之TIL在用本發明方法之TIL治療的個體之血液中提供增加之IFN-γ。在一些實施例中，IFN-γ增加指示對用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組量測IFN-γ。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組量測IFN-γ。在一些實施例中，量測來自用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者的離體TIL中之IFN-γ。在一些實施例中，量測用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者的血液中之IFN-γ。在一些實施例中，量測用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者的血清中之IFN-γ。
在一些實施例中，相較於藉由其他方法(包含例如圖1(特別是例如圖1B)中未例示之方法，諸如稱作過程1C方法之方法)產生的TIL，藉由本發明方法，包含如例如圖1(特別是例如圖1B)中所描述之方法製備的TIL展現增加之多株性。在一些實施例中，顯著提高之多株性及/或增加之多株性指示對癌症治療之治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明方法產生之TIL的治療功效。在一些實施例中，相較於使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備的TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用不同於本文所提供方法的方法(包含例如除體現於圖1(特別是例如圖1B)中之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。2. 共同投予方法
在一些實施例中，如本文所描述產生之TIL，包含例如來源於圖1(特別是例如圖1B)之步驟A至F中所描述之方法的TIL，可與一種或多種免疫檢查點調節因子(諸如下文所描述之抗體)組合投予。舉例而言，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予的抗體包含例如但不限於納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)、帕博利珠單抗(蘭立珠單抗、MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、SYM021、NAT 105、人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)、人類單株抗體REGN2810(再生元)、人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)及/或人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目錄號BP0146。適合與如本文所描述根據步驟A至F產生的TIL一起用於共同投予方法中的其他適合抗體為揭示於以引用之方式併入本文中的美國專利第8,008,449號中之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分特異性結合至PD-L1且抑制其與PD-1之相互作用，從而增加免疫活性。本領域已知的結合至PD-L1且破壞PD-1與PD-L1之相互作用並刺激抗腫瘤免疫反應的任何抗體均適合與如本文所描述根據步驟A至F產生的TIL一起用於共同投予方法中。舉例而言，靶向PD-L1且處於臨床試驗中之抗體包含BMS-936559(百時美施貴寶)及MPDL3280A(基因泰克)。靶向PD-L1之其他適合之抗體揭示於以引用之方式併入本文中的美國專利第7,943,743號中。一般技術者應理解，結合至PD-1或PD-L1、破壞PD-1/PD-L1相互作用且刺激抗腫瘤免疫反應之任何抗體均適合與如本文所描述根據步驟A至F產生的TIL一起用於共同投予方法中。在一些實施例中，當患者患有單獨投予抗PD-1抗體難以治療之癌症類型時，向投予根據步驟A至F產生之TIL之組合的個體共同投予抗PD-1抗體。在一些實施例中，當患者患有難治性黑色素瘤時，向患者投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施例中，當患者患有非小細胞肺癌(NSCLC)時，向患者投予TIL與抗PD-1之組合。3.
PD-1及PD-L1抑制劑
在一些實施例中，提供給癌症患者之TIL療法可包含單獨用治療性TIL群體治療，或可包含組合治療，包含TIL及一種或多種PD-1及/或PD-L1抑制劑。
計劃性死亡1(PD-1)為由T細胞、B細胞、自然殺手(NK)T細胞、活化單核球及樹突狀細胞表現之288胺基酸跨膜免疫檢查點受體蛋白。PD-1，亦稱為CD279，屬於CD28家族，且在人類中係由2號染色體上之Pdcd1基因編碼。PD-1由一個免疫球蛋白(Ig)超家族域、跨膜區及細胞內域組成，該細胞內域含有免疫受體酪胺酸抑制模體(ITIM)及免疫受體酪胺酸切換模體(ITSM)。已知PD-1及其配體(PD-L1及PD-L2)在免疫耐受性中起重要作用，如Keir等人, 《免疫學年度評論》2008, 26, 677-704中所描述。PD-1提供負向調節T細胞免疫反應的抑制信號。PD-L1(亦稱為B7-H1或CD274)及PD-L2(亦稱為B7-DC或CD273)表現於腫瘤細胞及基質細胞上，其可能遇到表現PD-1之活化T細胞，導致對T細胞之免疫抑制。PD-L1為由人類9號染色體上之Cd274基因編碼的290胺基酸跨膜蛋白。使用PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑及/或PD-L2抑制劑阻斷PD-1與其配體PD-L1及PD-L2之間的相互作用，可克服免疫抗性，如近期臨床研究，諸如Topalian等人, 《新英格蘭醫學雜誌(N. Eng. J. Med.)》 2012, 366, 2443-54中所描述之研究所顯示。PD-L1表現於許多腫瘤細胞株上，而PD-L2表現於主要地表現於樹突狀細胞及一些腫瘤株上。除T細胞(其在活化後誘導性表現PD-1)以外，PD-1亦表現於B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、活化單核球及樹突狀細胞上。
在一些實施例中，PD-1抑制劑可為本領域已知的任何PD-1抑制劑或PD-1阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的PD-1抑制劑或阻斷劑之一。關於PD-1抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及作為抗體之PD-1抑制劑時可指代化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及PD-1抑制劑時亦可指代小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為抗體(亦即抗PD-1抗體)、其片段，包含其Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-1抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑競爭結合PD-1，及/或結合至PD-1上之抗原決定基。在一些實施例中，抗體競爭結合PD-1，及/或結合至PD-1上之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約100 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約90 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約80 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約70 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約60 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約50 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約40 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約30 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約20 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約10 pM或更低之KD結合人類PD-1，或以約1 pM或更低之KD結合人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約7.5×105
l/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1、以約7.5×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1、以約8×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1、以約8.5×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1、以約9×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1、以約9.5×105
l/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1，或以約1×106
l/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.1×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.4×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.5×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.6×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1，或以約2.7×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.8×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.9×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1，或以約3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合，或以約1 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗(可自百時美施貴寶公司以OPDIVO商購)或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。納武單抗為阻斷PD-1受體之完全人類IgG4抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為免疫球蛋白G4κ抗(人類CD274)抗體。納武單抗經指派化學文摘社(CAS)登記號946414-94-4且亦稱為5C4、BMS-936558、MDX-1106及ONO-4538。納武單抗之製備及特性描述於美國專利第8,008,449號及國際專利公開案第WO 2006/121168號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。納武單抗在各種形式之癌症中的臨床安全性及功效已描述於Wang等人, 《癌症免疫學研究(Cancer Immunol Res.)》2014, 2, 846-56；Page等人,《年度醫學評論(Ann. Rev. Med.)》, 2014, 65, 185-202；及Weber等人, 《臨床腫瘤學雜誌》, 2013, 31, 4311-4318中，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。納武單抗之胺基酸序列闡述於表19中。納武單抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22''-96''、140''-196''、254''-314''及360''-418''處具有重鏈內雙硫鍵；在23'-88'、134'-194'、23'''-88'''及134'''-194'''處具有輕鏈內雙硫鍵；在127-214'、127''-214'''處具有重鏈-輕鏈間雙硫鍵；在219-219''及222-222''處具有重鏈-重鏈間雙硫鍵；且在290、290''處具有N-糖基化位點(H CH2 84.4)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括SEQ ID NO:463所載之重鏈及SEQ ID NO:464所載之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:463及SEQ ID NO:464中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括納武單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:465中所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:466中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:465及SEQ ID NO:466中所示之序列至少99%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:465及SEQ ID NO:466中所示之序列至少98%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:465及SEQ ID NO:466中所示之序列至少97%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:465及SEQ ID NO:466中所示之序列至少96%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:465及SEQ ID NO:466中所示之序列至少95%一致的VH區及VL區。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:468及SEQ ID NO:469中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:470、SEQ ID NO:471及SEQ ID NO:472中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為藥物管理機構參考納武單抗核准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投予。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投予：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投予。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投予：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投予納武單抗。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，投予納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤，且每2週以約240 mg進行投予。在一些實施例中，投予納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤，且每4週以約480 mg進行投予。在一些實施例中，投予納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤，且每3週於同一天投予約1 mg/kg納武單抗，然後投予3 mg/kg伊匹木單抗，持續4次劑量，隨後每2週投予240 mg或每4週投予480 mg納武單抗。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以輔助治療黑色素瘤。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以輔助治療黑色素瘤。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以輔助治療黑色素瘤。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約3 mg/kg投予納武單抗且每6週以約1 mg/kg投予伊匹木單抗，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每3週以約360 mg投予納武單抗，加上每6週1 mg/kg伊匹木單抗與2個週期之含鉑雙重化療，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg或每4週以480 mg投予納武單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，每3週以約360 mg投予納武單抗且每6週投予1 mg/kg伊匹木單抗，以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天以約1 mg/kg投予伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投予240 mg納武單抗，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天以約1 mg/kg投予伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投予240 mg、每4週投予480 mg納武單抗，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，投予納武單抗以治療成人及小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療≥40 kg之成人及小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療≥40 kg之成人及小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，每2週以約3 mg/kg投予納武單抗以治療＜40 kg之小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天投予1 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投予240 mg納武單抗，以治療≥40 kg之成人及小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天投予1 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每4週投予480 mg納武單抗，以治療≥40 kg之成人及小兒患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，以約1 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天投予3 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投予納武單抗240 mg，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，以約1 mg/kg投予納武單抗，然後每3週在同一天投予3 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每4週投予480 mg納武單抗，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，投予納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投予納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投予納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始納武單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始納武單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括帕博利珠單抗(可自美國新澤西州凱尼爾沃思之默克公司以KEYTRUDA商購)或抗原結合片段、結合物或變體。帕博利珠單抗經指派CAS登記號1374853-91-4且亦稱為蘭立珠單抗、MK-3475及SCH-900475。帕博利珠單抗具有免疫球蛋白G4抗(人類蛋白PDCD1(計劃性細胞死亡1))抗體，含(人類家鼷鼠單株重鏈)雙硫鍵與人類家鼷鼠單株輕鏈二聚體結構。帕博利珠單抗之結構亦可描述為免疫球蛋白G4抗(人類計劃性細胞死亡1)抗體；含人源化小鼠單株[228-L-脯胺酸(H10-S＞P)]γ4重鏈(134-218')雙硫鍵與人源化小鼠單株κ輕鏈二聚體(226-226'':229-229'')雙二硫鍵。帕博利珠單抗之特性、用途及製備描述於國際專利公開案第WO 2008/156712 A1號、美國專利第8,354,509號以及美國專利申請公開案第US 2010/0266617 A1號、第US 2013/0108651 A1號及第US 2013/0109843 A2號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。帕博利珠單抗在各種形式之癌症中的臨床安全性及功效描述於Fuerst, 《腫瘤學時報(Oncology Times)》, 2014, 36, 35-36；Robert等人, 《柳葉刀(Lancet)》, 2014, 384, 1109-17；及Thomas等人, 《生物治療專家意見(Exp. Opin.Biol. Ther.)》, 2014, 14, 1061-1064中。帕博利珠單抗之胺基酸序列闡述於表20中。帕博利珠單抗包含以下雙硫鍵：22-96、22''-96''、23'-92'、23'''-92'''、134-218'、134''-218'''、138'-198'、138'''-198'''、147-203、147''-203''、226-226''、229-229''、261-321、261''-321''、367-425及367''-425''；以及以下糖基化位點(N)：Asn-297及Asn-297''。帕博利珠單抗為在Fc區中含穩定化S228P突變的IgG4/κ同型；IgG4鉸鏈區中此突變之插入防止形成IgG4抗體通常觀測到之半分子。帕博利珠單抗在各重鏈之Fc域內於Asn297處異質糖基化，使得完整抗體之分子量為大約149 kDa。帕博利珠單抗之主要糖型為岩藻糖基化去半乳糖基雙線聚糖形式(G0F)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括SEQ ID NO:473所載之重鏈及SEQ ID NO:474所載之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:473及SEQ ID NO:474中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括帕博利珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:475中所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:476中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:475及SEQ ID NO:476中所示之序列至少99%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:475及SEQ ID NO:476中所示之序列至少98%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:475及SEQ ID NO:476中所示之序列至少97%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:475及SEQ ID NO:476中所示之序列至少96%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:475及SEQ ID NO:476中所示之序列至少95%一致的VH區及VL區。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:478及SEQ ID NO:479中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:481及SEQ ID NO:482中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為藥物管理機構參考帕博利珠單抗核准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且帕博利珠單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投予。在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且帕博利珠單抗係以如下劑量投予：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，其中帕博利珠單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投予。在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投予：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，其中每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投予帕博利珠單抗以治療黑色素瘤。在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療黑色素瘤。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療黑色素瘤。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投予帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投予帕博利珠單抗以治療小細胞肺癌(SCLC)。在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療SCLC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療SCLC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投予帕博利珠單抗以治療頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療HNSCC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療HNSCC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，小兒每3週以約約2 mg/kg(至多200 mg)投予帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)癌。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR癌。在一些實施例中，小兒每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投予帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷大腸直腸癌(dMMR CRC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR CRC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療胃癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療胃癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療食道癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療食道癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療子宮頸癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療子宮頸癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療肝細胞癌(HCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療HCC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，成人每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療默克氏細胞癌(Merkel cell carcinoma；MCC)。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療MCC。在一些實施例中，小兒每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投予帕博利珠單抗以治療MCC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療腎細胞癌(RCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗且每天兩次經口投予阿西替尼5 mg以治療RCC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療子宮內膜癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗且每天一次經口投予用於非MSI-H或dMMR腫瘤之樂伐替尼20 mg以治療子宮內膜癌。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，成人每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療高腫瘤突變負荷(TMB-H)癌症。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療TMB-H癌症。在一些實施例中，小兒每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投予帕博利珠單抗以治療TMB-H癌症。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療cSCC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投予帕博利珠單抗以治療三陰性乳癌(TNBC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投予帕博利珠單抗以治療TNBC。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，若患者或個體為成人，亦即治療成人適應症，則可採用另外的每6週400 mg之給藥方案。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，在IL-2投予後1、2或3天開始帕博利珠單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投予帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投予帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為可商購抗PD-1單株抗體，諸如抗m-PD-1選殖株J43(目錄號BE0033-2)及RMP1-14(目錄號BE0146)(美國新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell, Inc.)。多種可商購抗PD-1抗體為本領域一般熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為揭示於美國專利第8,354,509號或美國專利申請公開案第2010/0266617 A1號、第2013/0108651 A1號、第2013/0109843 A2號中之抗體，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為描述於美國專利第8,287,856號、第8,580,247號及第8,168,757號以及美國專利申請公開案第2009/0028857 A1號、第2010/0285013 A1號、第2013/0022600 A1號及第2011/0008369 A1號中之抗PD-1抗體，該等專利之教示內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，PD-1抑制劑為揭示於美國專利第8,735,553 B1號中之抗PD-1抗體，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為皮立珠單抗，亦稱為CT-011，其描述於美國專利第8,686,119號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-1抑制劑可為小分子或肽或肽衍生物，諸如美國專利第8,907,053號、第9,096,642號及第9,044,442號以及美國專利申請公開案第US 2015/0087581號中所描述之小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-噁二唑化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第2015/0073024號中所描述之1,2,4-噁二唑化合物及衍生物；環狀肽模擬化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2015/0073042號中所描述之環狀肽模擬化合物及衍生物；環狀化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2015/0125491中所描述之環狀化合物及衍生物；1,3,4-噁二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物，諸如國際專利申請公開案第WO 2015/033301號中所描述之1,3,4-噁二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物；基於肽之化合物及衍生物，諸如國際專利申請公開案第WO 2015/036927號及第WO 2015/04490號中所描述之基於肽之化合物及衍生物；或基於肽之巨環化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2014/0294898號中所描述之基於肽之巨環化合物及衍生物；該等專利中之每一者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑可為本領域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制劑、拮抗劑或阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的PD-L1或PD-L2抑制劑、拮抗劑或阻斷劑之一。關於PD-L1及PD-L2抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及作為抗體之PD-L1或PD-L2抑制劑時可指代化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及PD-L1或PD-L2抑制劑時亦可指代化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
在一些實施例中，本文所描述之組成物、過程及方法包含PD-L1或PD-L2抑制劑。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為小分子。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為抗體(亦即抗PD-1抗體)、其片段，包含其Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑競爭結合PD-L1或PD-L2及/或結合至PD-L1或PD-L2上之抗原決定基。在一些實施例中，抗體競爭結合PD-L1或PD-L2，及/或結合至PD-L1或PD-L2上之抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供之PD-L1抑制劑對PD-L1具選擇性，因為化合物與PD-L1結合或相互作用之濃度相比其與包含PD-L2受體之其他受體結合或相互作用之濃度低得多。在某些實施例中，化合物以如下結合常數結合至PD-L1受體，該結合常數為相比結合至PD-L2受體之濃度高至少約2倍之濃度、高約3倍之濃度、高約5倍之濃度、高約10倍之濃度、高約20倍之濃度、高約30倍之濃度、高約50倍之濃度、高約100倍之濃度、高約200倍之濃度、高約300倍之濃度或高約500倍之濃度。
在一些實施例中，本文提供之PD-L2抑制劑對PD-L2具選擇性，因為化合物與PD-L2結合或相互作用之濃度相比其與包含PD-L1受體之其他受體結合或相互作用之濃度低得多。在某些實施例中，化合物以如下結合常數結合至PD-L2受體，該結合常數為相比結合至PD-L1受體之濃度高至少約2倍之濃度、高約3倍之濃度、高約5倍之濃度、高約10倍之濃度、高約20倍之濃度、高約30倍之濃度、高約50倍之濃度、高約100倍之濃度、高約200倍之濃度、高約300倍之濃度或高約500倍之濃度。
不受任何理論束縛，咸信腫瘤細胞表現PD-L1，且T細胞表現PD-1。然而，腫瘤細胞對PD-L1之表現不為PD-1或PD-L1抑制劑或阻斷劑之功效所需。在一些實施例中，腫瘤細胞表現PD-L1。在其他實施例中，腫瘤細胞並不表現PD-L1。在一些實施例中，方法可包含PD-1及PD-L1抗體(諸如本文所描述之PD-1及PD-L1抗體)與TIL之組合。可同時或依序投予PD-1及PD-L1抗體與TIL之組合。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約100 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約90 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約80 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約70 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約60 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約50 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約40 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2，或以約30 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約7.5×105
l/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約8×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約8.5×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約9×105
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約9.5×105
l/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2，或以約1×106
1/M·s或更快之kassoc
結合至人類PD-L1及/或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約2×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-L1或PD-L2、以約2.1×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.2×10-5
l/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.3×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.4×10-5
l/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.5×10-5
1/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.6×10-5
l/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-1、以約2.7×10-5
l/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-L1或PD-L2，或以約3×10-5
l/s或更慢之kdissoc
結合至人類PD-L1或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合，或以約1 nM或更低之IC50阻斷人類PD-1或阻斷人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為德瓦魯單抗，亦稱為MEDI4736(其可=自馬里蘭州蓋瑟斯堡阿斯特捷利康製藥公司子公司Medimmune, LLC商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利第8,779,108號或美國專利申請公開案第2013/0034559號中之抗體，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之臨床功效已描述於Page等人, 《年度醫學評論》, 2014, 65, 185-202；Brahmer等人, 《臨床腫瘤學雜誌》2014, 32, 5s(增刊，摘要8021)；及McDermott等人,《癌症治療評論(Cancer Treatment Rev.)》, 2014, 40, 1056-64中。德瓦魯單抗之製備及特性描述於美國專利第8,779,108號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之胺基酸序列闡述於表21中。德瓦魯單抗單株抗體包含22-96、22''-96''、23'-89'、23'''-89'''、135'-195'、135'''-195'''、148-204、148''-204''、215'-224、215'''-224''、230-230''、233-233''、265-325、265''-325''、371-429及371''-429'處之雙硫鍵；及Asn-301及Asn-301''處之N-糖基化位點。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:483所載之重鏈及SEQ ID NO:484所載之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:484中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括德瓦魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:485中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:486中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:485及SEQ ID NO:486中所示之序列至少99%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:485及SEQ ID NO:486中所示之序列至少98%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:485及SEQ ID NO:486中所示之序列至少97%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:485及SEQ ID NO:486中所示之序列至少96%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:485及SEQ ID NO:486中所示之序列至少95%一致的VH區及VL區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488及SEQ ID NO:489中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:490、SEQ ID NO:491及SEQ ID NO:492中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為藥物管理機構參考德瓦魯單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿維魯單抗，亦稱為MSB0010718C(可自默克集團/雪蘭諾商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。阿維魯單抗之製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2014/0341917 A1號中，該專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。阿維魯單抗之胺基酸序列闡述於表22中。阿維魯單抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22''-96''、147''-203''、264''-324''及370''-428''處之重鏈內雙硫鍵(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22'''-90'''及138'''-197'''處之輕鏈內雙硫鍵(C23-C104)；223-215' 及223''-215'''處之重鏈-輕鏈內雙硫鍵(h 5-CL 126)；229-229''及232-232''處之重鏈-重鏈內雙硫鍵(h 11，h 14)；300、300''處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化複合物雙線CHO類聚糖；及450及450'處之H CHS K2 C端離胺酸裁剪。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:493所載之重鏈及SEQ ID NO:494所載之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:493及SEQ ID NO:494中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括阿維魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:495中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:496中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:495及SEQ ID NO:496中所示之序列至少99%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:496及SEQ ID NO:496中所示之序列至少98%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:495及SEQ ID NO:496中所示之序列至少97%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:495及SEQ ID NO:496中所示之序列至少96%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:495及SEQ ID NO:496中所示之序列至少95%一致的VH區及VL區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498及SEQ ID NO:499中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501及SEQ ID NO:502中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為藥物管理機構參考阿維魯單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗，亦稱為MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞爾羅氏之子公司基因泰克公司以TECENTRIQ商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利第8,217,149號中之抗體，該專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利申請公開案第2010/0203056 A1號、第2013/0045200 A1號、第2013/0045201 A1號、第2013/0045202 A1號或第2014/0065135 A1號中之抗體，該等專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。阿替利珠單抗之製備及特性描述於美國專利第8,217,149號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。阿替利珠單抗之胺基酸序列闡述於表23中。阿替利珠單抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22''-96''、145''-201''、262''-322''及368''-426''處之重鏈內雙硫鍵(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23'''-88'''及134'''-194'''處之輕鏈內雙硫鍵(C23-C104)；221-214'及221''-214'''處之重鏈-輕鏈內雙硫鍵(h 5-CL 126)；227-227''及230-230''處之重鏈-重鏈內雙硫鍵(h 11，h 14)；及298及298'處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4＞A)。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:503所載之重鏈及SEQ ID NO:504所載之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:503及SEQ ID NO:504中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括阿替利珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:505中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:506中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:505及SEQ ID NO:506中所示之序列至少99%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:505及SEQ ID NO:506中所示之序列至少98%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:505及SEQ ID NO:506中所示之序列至少97%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:505及SEQ ID NO:506中所示之序列至少96%一致的VH區及VL區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:505及SEQ ID NO:506中所示之序列至少95%一致的VH區及VL區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:507、SEQ ID NO:508及SEQ ID NO:509中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:510、SEQ ID NO:511及SEQ ID NO:512中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，抗PD-L1抗體為藥物管理機構參考阿替利珠單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。在一些實施例中，該一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化，氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含美國專利申請公開案第US 2014/0341917 A1號中所描述之彼等抗體，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，亦包含與此等抗體中之任一種競爭結合至PD-L1的抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MDX-1105，亦稱為BMS-935559，其揭示於美國專利第US 7,943,743號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係選自揭示於美國專利第US 7,943,743號中之抗PD-L1抗體，該專利以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為可商購單株抗體，諸如INVIVOMAB抗m-PD-L1選殖株10F.9G2(目錄號BE0101，美國新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell, Inc.)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為可商購單株抗體，諸如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多種可商購抗PD-L1抗體為本領域一般熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，PD-L2抑制劑為可商購單株抗體，諸如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2aκ同型(目錄號329602，加利福尼亞聖地亞哥Biolegend, Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗體(目錄號SAB3500395，密蘇里州聖路易斯西格瑪奧瑞奇公司)或本領域一般熟習此項技術者已知的其他可商購抗PD-L2抗體。4.
CTLA-4抑制劑
在一些實施例中，提供給癌症患者之TIL療法可包含單獨用治療性TIL群體治療，或可包含組合治療，包含TIL及一種或多種CTLA-4抑制劑。
細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)為免疫球蛋白超家族成員且表現於輔助T細胞表面上。CTLA-4為CD28依賴性T細胞活化之負向調節因子且充當適應性免疫反應之檢查點。類似於T細胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4結合抗原在細胞上呈遞CD80及CD86。CTLA-4將抑制因子信號遞送至T細胞，而CD28遞送刺激信號。針對人類CTLA-4之人類抗體已描述為許多疾病病狀之免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒及細菌感染且治療癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。各種臨床前研究已顯示諸如單株抗體之CTLA-4抑制劑對CTLA-4之阻斷增強針對免疫原性腫瘤的宿主免疫反應且甚至可以消除已形成腫瘤。已在臨床試驗中針對治療各種類型的實體腫瘤研究了多種完全人類抗人類CTLA-4單株抗體(mAb)，該等抗體包含但不限於伊匹木單抗(MDX-010)及曲美單抗(CP-675,206)。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑可為本領域已知的任何CTLA-4抑制劑或CTLA-4阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的CTLA-4抑制劑或阻斷劑之一。關於CTLA-4抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及作為抗體之CTLA-4抑制劑時可指代化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及CTLA-4抑制劑時亦可指代小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
適用於本發明之方法的CTLA-4抑制劑包含但不限於抗CTLA-4抗體、人類抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人源化抗CTLA-4抗體、單株抗CTLA-4抗體、多株抗CTLA-4抗體、嵌合抗CTLA-4抗體、MDX-010(伊匹木單抗)、曲美單抗、抗CD28抗體、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4域抗體、單鏈抗CTLA-4片段、重鏈抗CTLA-4片段、輕鏈抗CTLA-4片段、促效共刺激路徑之CTLA-4抑制劑、揭示於PCT公開案第WO 2001/014424號中之抗體、揭示於PCT公開案第WO 2004/035607號中之抗體、揭示於美國公開案第2005/ 0201994號中之抗體及揭示於授與歐洲專利第EP 1212422 B1號中之抗體，該等專利中之每一者的揭示內容以引用之方式併入本文中。另外的CTLA-4抗體描述於美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號中；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/37504號中；及美國公開案第2002/0039581號及第2002/086014號中，該等專利中之每一者的揭示內容以引用之方式併入本文中。可用於本發明方法中之其他抗CTLA-4抗體包含例如揭示於以下中之抗體：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz等人, 《美國國家科學院院刊》, 95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《臨床腫瘤學雜誌》, 22(145): 摘要號2505(2004)(抗體CP-675206)；Mokyr等人, 《癌症研究》, 58:5301-5304(1998)；及美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號，該等專利中之每一者的揭示內容以引用之方式併入本文中。
另外的CTLA-4抑制劑包含但不限於以下：通常由於經活化而能夠破壞CD28抗原結合至其同源配體之能力、抑制CTLA-4結合至其同源配體之能力、增強經由共刺激路徑之T細胞反應、破壞B7結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞B7活化共刺激路徑之能力、破壞CD80結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞CD80活化共刺激路徑之能力、破壞CD86結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞CD86活化共刺激路徑之能力及破壞共刺激路徑的任何抑制劑。此必定包含：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員之小分子抑制劑；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的抗體；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的反義分子；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的RNAi抑制劑(單股及雙股)；以及其他CTLA-4抑制劑。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑以如下Kd結合至CTLA-4，該Kd為約10−6
M或更小、10−7
M或更小、10−8
M或更小、10−9
M或更小、10−10
M或更小、10−11
M或更小、10−12
M或更小，例如10−13
M與10−16
M之間，或在任兩個前述值作為端點的任何範圍內。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，CTLA-4抑制劑結合至CTLA-4的Kd不超過伊匹木單抗之Kd之10倍。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，CTLA-4抑制劑結合至CTLA-4的Kd與伊匹木單抗之Kd大致相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，與CTLA-4分別與CD80或CD86結合的伊匹木單抗介導之抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值高不超過10倍。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，與CTLA-4分別與CD80或CD86結合的伊匹木單抗介導之抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值大致相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些實施例中，以如下量使用CTLA-4抑制劑，該量足以相對於適合之對照將CTLA-4之表現抑制及/或使CTLA-4之生物活性降低至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如50%與75%、75%與90%或90%與100%之間。在一些實施例中，以如下量使用CTLA-4路徑抑制劑，該量足以藉由使CTLA-4與CD80、CD86或兩者之結合相對於適合之對照減少至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如相對於適合之對照減少50%與75%、75%與90%或90%與100%之間來降低CTLA-4之生物活性。在評定或量化所關注之藥劑之效應的上下文中之適合對照通常為尚未暴露於所關注之藥劑(例如CTLA-4路徑抑制劑)或用該藥劑處理的相當之生物系統(例如細胞或個體)(或已暴露於可忽略量或用可忽略量進行處理)。在一些實施例中，生物系統可充當其自身之對照，例如可在暴露於藥劑或用藥劑處理之前評定生物系統並與開始或結束暴露或處理之後的狀態進行比較。在一些實施例中，可使用歷史對照。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗(可自百時美施貴寶公司以Yervoy商購)或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。如本領域中已知，伊匹木單抗係指抗CTLA-4抗體，一種來源於具有編碼重鏈及輕鏈之人類基因以產生功能性人類譜系之轉殖基因小鼠的完全人類IgG1κ抗體。伊匹木單抗亦可藉由其CAS登記號477202-00-9及在PCT公開案第WO 01/14424中提及，該公開案出於所有目的以全文引用之方式併入。其以抗體10DI之形式揭示。特定言之，伊匹木單抗含有輕鏈可變區及重鏈可變區(具有包括SEQ ID NO:516之輕鏈可變區且具有包括SEQ ID NO:515之重鏈可變區)。表示特異性結合於CTLA-4之人類單株抗體或其抗原結合位點。伊匹木單抗之醫藥組成物包含含有伊匹木單抗及一種或多種稀釋劑、媒劑及/或賦形劑的所有醫藥學上可接受之組成物。含有伊匹木單抗之醫藥組成物之實例描述於PCT公開案第WO 2007/67959號中。伊匹木單抗可靜脈內(IV)投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:513所載之重鏈及SEQ ID NO:514所載之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列的重鏈及輕鏈或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:513及SEQ ID NO:514中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括伊匹木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(VH
)包括SEQ ID NO:515中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(VL
)包括SEQ ID NO:516中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:515及SEQ ID NO:516中所示之序列至少99%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:515及SEQ ID NO:516中所示之序列至少98%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:515及SEQ ID NO:516中所示之序列至少97%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:515及SEQ ID NO:516中所示之序列至少96%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:515及SEQ ID NO:516中所示之序列至少95%一致的VH
區及VL
區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518及SEQ ID NO:519中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:520、SEQ ID NO:521及SEQ ID NO:522中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考伊匹木單抗核准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投予。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以如下劑量投予：約 0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，其中伊匹木單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投予。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以如下劑量投予：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約 500 mg。在一些實施例中，在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投予伊匹木單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，每3週以約mg/kg投予伊匹木單抗，持續最多4次劑量以治療不可切除性或轉移性黑色素瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以輔助治療黑色素瘤。在一些實施例中，每3週以約10 mg/kg投予伊匹木單抗，持續4次劑量，然後每12週投予10 mg/kg，持續至多3年，以輔助治療黑色素瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前) 1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每3週以約1 mg/kg投予伊匹木單抗，緊接著在同一天投予3 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，在完成組合之4次劑量之後，可根據標準給藥方案針對晚期腎細胞癌及/或腎細胞癌以單一試劑形式投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每3週經30分鐘以約1 mg/kg靜脈內投予伊匹木單抗，緊接著在同一天經30分鐘靜脈內投予3 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在完成組成物之4次劑量之後，如根據標準給藥方案所推薦針對高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌以單一試劑形式投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每3週經30分鐘以約3 mg/kg靜脈內投予伊匹木單抗，緊接著在同一天經30分鐘靜脈內投予1 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，在完成組合之4次劑量之後，根據標準給藥方案針對肝細胞癌以單一試劑形式投予納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每6週以約1 mg/kg投予伊匹木單抗且每2週投予3 mg/kg納武單抗，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每6週以約1 mg/kg投予伊匹木單抗，加上每3週360 mg納武單抗與2個週期之含鉑雙重化療，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
在一些實施例中，投予伊匹木單抗以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，每6週以約1 mg/kg投予伊匹木單抗且每3週投予360 mg納武單抗，以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投予。
曲美單抗(亦稱為CP-675,206)為完全人類IgG2單株抗體且CAS編號為745013-59-6。曲美單抗以抗體11.2.1形式揭示於美國專利第6,682,736號(以引用之方式併入本文中)中。曲美單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別闡述於SEQ IND NO:xx及xx中。已在臨床試驗中針對治療包含黑色素瘤及乳癌之各種腫瘤研究了曲美單抗；其中每4或12週以0.01與15 mg/kg之間的劑量範圍呈單次劑量或多次劑量靜脈內投予曲美單抗。在本發明提供之方案中，局部投予，尤其是皮內或皮下投予曲美單抗。皮內或皮下投予之曲美單抗的有效量通常在每人5-200毫克/劑的範圍內。在一些實施例中，曲美單抗之有效量在每人每劑10-150毫克/劑的範圍內。在一些特定實施例中，曲美單抗之有效量為每人約10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:523所載之重鏈及SEQ ID NO:524所載之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列的重鏈及輕鏈或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:523及SEQ ID NO:524中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括曲美單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(VH
)包括SEQ ID NO:525中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(VL
)包括SEQ ID NO:526中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:525及SEQ ID NO:526中所示之序列至少99%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:525及SEQ ID NO:526中所示之序列至少98%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:525及SEQ ID NO:526中所示之序列至少97%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:525及SEQ ID NO:526中所示之序列至少96%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:525及SEQ ID NO:526中所示之序列至少95%一致的VH
區及VL
區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:528及SEQ ID NO:529中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:530、SEQ ID NO:531及SEQ ID NO:532中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考曲美單抗核准之抗CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投予。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以如下劑量投予：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，其中曲美單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投予。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以如下劑量投予：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投予曲美單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投予。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投予。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為來自Adgenus之澤弗利單抗或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。澤弗利單抗為完全人類單株抗體。澤弗利單抗經指派化學文摘社(CAS)登記號2148321-69-9且亦稱為亦稱為AGEN1884。澤弗利單抗之製備及特性描述於美國專利第10,144,779號及美國專利申請公開案第US2020/ 0024350 A1號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:533所載之重鏈及SEQ ID NO:534所載之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列的重鏈及輕鏈或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:533及SEQ ID NO:534中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括澤弗利單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:535中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:536中所示之序列及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:535及SEQ ID NO:536中所示之序列至少99%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:535及SEQ ID NO:536中所示之序列至少98%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:535及SEQ ID NO:536中所示之序列至少97%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:535及SEQ ID NO:536中所示之序列至少96%一致的VH
區及VL
區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:535及SEQ ID NO:536中所示之序列至少95%一致的VH
區及VL
區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:536、SEQ ID NO:538及SEQ ID NO:539中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:540、SEQ ID NO:541及SEQ ID NO:542中所闡述之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考澤弗利單抗核准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一個或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，一個或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一種或多種賦形劑之組成物，其中該一種或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。
另外的抗CTLA-4抗體之實例包含但不限於：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659及ADG116，其為本領域一般熟習此項技術者已知。
在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為揭示於任一以下專利公開案(以引用之方式併入本文中)中之抗CTLA-4抗體：US2019/0048096A1；US2020/0223907；US2019/0201334；US2019/0201334；US2005/0201994；EP 1212422 B1；WO2018204760；WO2018204760；WO2001014424；WO2004035607；WO2003086459；WO2012120125；WO2000037504；WO2009100140；WO200609649；WO2005092380；WO2007123737；WO2006029219；WO20100979597；WO200612168；及WO1997020574。另外的CTLA-4抗體描述於以下中：美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/37504號；以及美國公開案第2002/0039581號及第2002/086014號；及/或美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號(以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為例如揭示於以下中之抗體：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz等人, 《美國國家科學院院刊》, 95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《臨床腫瘤學雜誌》, 22(145): 摘要號2505(2004)(抗體CP-675206)；Mokyr等人,《癌症研究》, 58:5301-5304 (1998)(以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為如WO1996040915(以引用之方式併入本文中)中所揭示之CTLA-4配體。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為CTLA-4表現之核酸抑制劑。舉例而言，抗CTLA-4 RNAi分子可呈Mello及Fire在以下中描述之分子的形式：PCT公開案第WO 1999/032619號及第WO 2001/029058號；美國公開案第2003/0051263號、第2003/0055020號、第2003/0056235號、第2004/265839號、第2005/0100913號、第2006/ 0024798號、第2008/0050342號、第2008/0081373號、第2008/0248576號及第2008/055443號；及/或美國專利第6,506,559號、第7,282,564號、第7,538,095號及第7,560,438號(以引用之方式併入本文中)。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子呈由Tuschl在歐洲專利第EP 1309726號(以引用之方式併入本文中)中描述之雙股RNAi分子形式。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子呈由Tuschl在美國專利第7,056,704號及第7,078,196號(以引用之方式併入本文中)中描述之雙鏈RNAi分子形式。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為PCT公開案第WO2004081021號(以引用之方式併入本文中)中所描述之適體。
在其他實施例中，本發明之抗CTLA-4 RNAi分子為Crooke在美國專利第5,898,031號、第6,107,094號、第7,432,249號及第7,432,250號以及歐洲申請案第EP 0928290號(以引用之方式併入本文中)中描述之RNA分子。5. 患者之淋巴球耗盡預調節
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，本發明包含用於治療已用非骨髓清除式化療預治療之患者之癌症的TIL群體。在一些實施例中，TIL群體係藉由輸注投予。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27及26天)及氟達拉賓25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27至23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2(阿地介白素，可以PROLEUKIN商購)之靜脈內輸注以達到生理耐受。在某些實施例中，TIL群體用於與IL-2組合治療癌症，其中IL-2係在TIL群體之後投予。
實驗發現表明，在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗盡藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(『細胞介素庫』)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前在患者身上採用淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。
一般而言，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱作馬磷醯胺)及其組合之投予實現淋巴球耗盡。此類方法描述於Gassner等人, 《癌症免疫學及免疫治療》2011
, 60, 75-85、Muranski等人, 《自然臨床實踐腫瘤學》, 2006,
3, 668-681、Dudley等人, 《臨床腫瘤學雜誌》2008
,26,
5233-5239及Dudley等人, 《臨床腫瘤學雜誌》2005
,23,
2346-2357中，所有該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，投予氟達拉濱治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10毫克/公斤/天、15毫克/公斤/天、20毫克/公斤/天、25毫克/公斤/天、30毫克/公斤/天、35毫克/公斤/天、40毫克/公斤/天或45毫克/公斤/天之劑量投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投予2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投予4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25毫克/公斤/天投予4至5天。
在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得濃度為0.5 μg/mL至10 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得濃度為1 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，投予環磷醯胺治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100毫克/平方公尺/天、150毫克/平方公尺/天、175毫克/平方公尺/天、200毫克/平方公尺/天、225毫克/平方公尺/天、250毫克/平方公尺/天、275毫克/平方公尺/天或300毫克/平方公尺/天之劑量投予。在一些實施例中，環磷醯胺係靜脈內(亦即i.v.)投予。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35毫克/公斤/天投予2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投予4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投予4天。
在一些實施例中，藉由將氟達拉濱及環磷醯胺一起投予給患者進行淋巴球耗盡。在一些實施例中，經4天以25毫克/平方公尺/天靜脈內投予氟達拉濱且以250毫克/平方公尺/天靜脈內投予環磷醯胺。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天及以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投予環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天及以約25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投予環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投予環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投予環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天及以約15毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投予環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉(mesna)一起投予。在一些實施例中，美司鈉係以15 mg/kg投予。在一些實施例中，輸注美司鈉，且若連續輸注，則歷經24小時，伴隨各自環磷醯胺劑量開始，美司鈉可經大約2小時與環磷醯胺一起輸注(第-5天及/或第-4天)，隨後在剩餘22小時以3毫克/千克/小時之速率輸注。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括以下步驟：始於在向患者投予第三TIL群體之後當天，用IL-2方案治療患者。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括以下步驟：始於向患者投予第三TIL群體當天，用IL-2方案治療患者。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括5天之預調節治療。在一些實施例中，天數指示為第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的60 mg/kg靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉一起投予。在一些實施例中，該方案進一步包括氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括25 mg/m2
靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m2
靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m2
靜脈內氟達拉濱。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱(fludarabine)五天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱一天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表27投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表28投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表29投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表30投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表31投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表32投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表33投予。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表34投予。
6. IL-2 方案
在一些實施例中，IL-2方案包括高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包括阿地介白素或其生物類似物或變體，其在投予治療性TIL群體之治療有效部分之後當天開始靜脈內投予，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸注以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者體重)之劑量投予直至耐受，最多為14個劑量。在休止9天後，可重複此時程再投予14次劑量，最多總計28次劑量。在一些實施例中，IL-2係以1、2、3、4、5或6次劑量投予。在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投予。在一些實施例中，高劑量IL-2方案適用於小兒用途。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為600,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為400,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為300,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為200,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為100,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。
在一些實施例中，IL-2方案包括遞減IL-2方案。遞減IL-2方案已描述於O'Day等人, 《臨床腫瘤學雜誌》1999
, 17, 2752-61及Eton等人, 《癌症》2000, 88,
1703-9，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括經6小時靜脈內投予18×106
IU/m2
，然後經12小時靜脈內投予18×106
IU/m2
，然後經24小時靜脈內投予18×106
IU/m2
，然後經72小時靜脈內投予4.5×106
IU/m2
。此治療週期可每28天重複，達最多四個週期。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括第1天18,000,000 IU/m2
，第2天9,000,000 IU/m2
以及第3天及第4天4,500,000 IU/m2
。
在一實施例中，IL-2方案包括低劑量IL-2方案。可使用本領域中已知之任何低劑量IL-2方案，包含Dominguez-Villar及Hafler，《自然免疫學(Nat.Immunology
)》2000, 19,
665-673；Hartemann等人, 《柳葉刀糖尿病與內分泌學(Lancet Diabetes Endocrinol
.)》2013
,1
, 295-305；及Rosenzwaig等人, 《風濕病年鑒(Ann. Rheum
.Dis.
)》2019, 78,
209-217中所描述之低劑量IL-2方案，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，低劑量IL-2方案包括每24小時18×106
IU/m2
之阿地介白素或其生物類似物或變體，以連續輸注形式投予5天；之後2至6天不投予IL-2療法；視情況之後再靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體5天，以每24小時連續輸注18×106
IU/m2
之形式；視情況在之後3週不投予IL-2療法，其後可進行另外週期之投予。
在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投予。在一些實施例中，高劑量IL-2方案適用於小兒用途。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為600,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為400,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為300,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為200,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8至12小時劑量為100,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投予貝培阿地介白素或其片段、變體或生物類似物。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投予THOR-707或其片段、變體或生物類似物。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投予內維介白素α或其片段、變體或生物類似物。
在一些實施例中，IL-2方案包括投予移植至抗體主鏈上之IL-2片段。在一些實施例中，IL-2方案包括投予結合IL-2低親和力受體之抗體細胞介素移植蛋白。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH
)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL
)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH
或VL
之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH
)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL
)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH
或VL
之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投予抗體或其片段、變體或生物類似物，該抗體包括選自由SEQ ID NO:559及SEQ ID NO:568組成之群組的重鏈及選自由SEQ ID NO:567及SEQ ID NO:569組成之群組的輕鏈。
在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地介白素(Proleukin®)或可比分子)長。
在一些實施例中，與骨髓清除式淋巴球耗盡方案之前述實施例一起使用之TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組成物且亦可包含代替TIL輸注之MIL及PBL輸注，以及添加IL-2方案及投予如本文所描述之共同療法(諸如PD-1及/或PD-L1抑制劑及/或CTLA-4抑制劑)。
6. 另外之治療方法
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向個體投予治療有效劑量之如上適用的在任何前述段落中描述之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向個體投予治療有效劑量之如上適用的在任何前述段落中描述之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中在分別投予治療有效劑量的如上適用的在任何前述段落中描述的治療性TIL群體及TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其進一步包括以下步驟：始於在向個體投予TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療個體。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投予600,000或720,000 IU/kg直至耐受。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之在任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為黑色素瘤。在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為難治性或不可切除性黑色素瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其中癌症為小兒高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向個體投予治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向個體投予治療有效劑量之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供經修改的如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其中在向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其進一步包括以下步驟：始於在向患者投予TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療患者。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投予600,000或720,000 IU/kg直至耐受。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為黑色素瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其中癌症為小兒高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體在用於治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投予治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投予治療有效劑量之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案且隨後向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其進一步包括以下步驟：始於在向患者投予TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療患者。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投予600,000或720,000 IU/kg直至耐受。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為黑色素瘤。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供經修改之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其中癌症為小兒高突變癌症。
實例
現參考以下實例描述本文中涵蓋之實施例。此等實例僅出於說明之目的提供且本揭示案決不應理解為限於此等實例，而應理解為涵蓋由於本文提供之教示而變得顯而易見的任何及所有變化形式。
實例1：製備用於PRE-REP及REP過程之培養基
此實例描述製備用於涉及培養來源於各種腫瘤類型之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)的方案中之組織培養基的程序，該等腫瘤類型包含但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌。此培養基可用於製備本申請案及實例中所描述之任一TIL。製備 CM1
自冷藏庫取出以下試劑並使其在37℃水浴中升溫：(RPMI1640、人AB血清、200 mM L-麩醯胺酸)。根據下表35，藉由將每一成分添加至適於待過濾體積之0.2 µm過濾器單元的頂部來製備CM1培養基。儲存於4℃下。
使用當天，將所需量之CM1在37℃水浴中預熱並添加6000 IU/ml IL-2。
根據表36的按需另外補充。
製備 CM2
自冰箱取出已製備之CM1或根據上表35製備新鮮CM1。自冰箱取出AIM-V®，且藉由在無菌培養基瓶中混合已製備之CM1與等體積AIM-V®來製備所需量之CM2。在使用當天向CM2培養基中添加3000 IU/ml IL-2。在使用當天用3000 IU/ml IL-2製成足夠量之CM2。將CM2培養基瓶標記上名稱、製備者名字縮寫、過濾/製備日期、兩週之過期日期，且在需要用於組織培養之前儲存於4℃下。製備 CM3
在需要使用的當天，製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，但在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM3。藉由輕微振盪進行充分混合。添加AIM-V之後，立即將瓶子標記上「3000 IU/ml IL-2」。若存在過量CM3，則將其儲存於處於4℃下之瓶子中，標記上培養基名稱、製備者名字縮寫、製備培養基之日期及其過期日期(製備後7天)。儲存於4℃下7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。製備 CM4
CM4與CM3相同，但另外補充2 mM GlutaMAXTM
(最終濃度)。每1L CM3添加10 ml之200 mM GlutaMAXTM
。藉由向AIM-V瓶或袋直接添加IL-2儲備液及GlutaMAXTM
儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM4。藉由輕微振盪進行充分混合。添加AIM-V之後，立即將瓶子標記上「3000 IL/ml IL-2及GlutaMAX」。若存在過量CM4，則將其儲存於處於4℃下之瓶子中，標記上培養基名稱、「GlutaMAX」及其過期日期(製備後7天)。儲存於4℃下7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。實例 2 ：製備 IL-2 儲備液 (CELLGENIX)
此實例描述將經純化之凍乾重組人類介白素-2溶解於適合用於其他組織培養方案(包含本申請案及實例中所描述之所有彼等方案)之儲備樣本中的過程，包含涉及使用rhIL-2之彼等過程。程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29 mL無菌水轉移至50mL錐形管中。向50mL錐形管中添加l mL 1N乙酸。藉由倒轉管2至3次進行充分混合。藉由使用Steriflip過濾器對HAc溶液進行滅菌。
製備含1% HSA之PBS。在150 mL無菌過濾器單元中，向96 mL PBS中添加4 mL 25%HSA儲備液。過濾溶液。儲存於4℃下。針對製備的每一小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2儲備液(6×106
IU/mL最終濃度)。每一批次之rhIL-2不同，且所需資訊見於製造商之分析證書(COA)，諸如：1)每小瓶rhIL-2之質量(mg)、2)rhIL-2之比活性(IU/mg)及3)推薦0.2% HAc復原體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批次所需的1% HSA之體積：
舉例而言，根據CellGenix之rhIL-2批次10200121 COA，1 mg小瓶之比活性為25×106
IU/mg。推薦於2 mL 0.2% HAc中復原rhIL-2。
用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶之橡膠塞。使用連接於3mL注射器之16G針頭，將推薦體積之0.2% HAc注入小瓶中。請小心不要在拔出針頭時取開塞子。將小瓶倒轉3次並旋動直至所有粉末溶解為止。小心地取下塞子並擱置於酒精擦拭物上。向小瓶中添加所計算體積之1% HSA。
儲存rhIL-2溶液。對於短期儲存(＜ 72小時)，將小瓶儲存於4℃下。對於長期儲存(＞ 72小時)，將小瓶等分成較小體積，且在準備使用之前儲存於-20℃下之冷凍小瓶中。避免冷凍/解凍循環。記錄製備日期後6個月之過期日期。Rh-IL-2標籤包含供應商及目錄號、批號、過期日期、操作員姓名縮寫、濃度及等分體積。實例 3 ：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed受控速率冷凍機型號7454(Thermo Scientific)的利用實例9中所描述之簡短閉合程序製備的TIL之冷凍保存過程方法。
所用設備如下：鋁製卡盒支架(與CS750冷凍袋相容)、用於750mL袋的冷凍盒、低壓(22 psi)液氮罐、冰箱、熱電偶感測器(帶式袋)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程在自成核至-20℃之間提供0.5℃速率且在至-80℃終點溫度之間提供1℃/分鐘之冷卻速率。程式參數如下：步驟1—在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)達至-4℃；步驟3：20.0℃/min(箱室溫度)達至-45℃；步驟4：10.0℃/min(箱室溫度)達至-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(箱室溫度)達至-20℃；且步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)達至-80℃。實例 4 ：利用確定培養基之腫瘤擴增過程
。
用根據本發明之確定培養基(例如CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM，賽默飛世爾，包含例如DM1及DM2)替代CM1及CM2培養基來進行揭示於實例1至7中之過程。實例 5 ：使用納武單抗藉由流動式細胞測量術分選選擇 PD-1+ TIL 及以完整規模擴增以進行臨床製造
目的
此報告描述經PD-1選擇之TIL之擴增結果，其使用納武單抗在本發明實例中所描述之完整規模製造實驗中進行選擇。
範疇
研究範疇為擴增來自黑色素瘤或肺腫瘤或頭頸腫瘤或卵巢瘤之經PD-1選擇之TIL。
在第0天，將腫瘤碎解物相等分佈至兩個組，且每一實驗組之腫瘤碎解物係使用作為一級抗體之納武單抗或抗PD1選殖株# EH12.2H7(研究級)及FITC結合抗IgG4二級抗體染色。隨後藉由流動式分選自經染色群體選擇表現PD-1之TIL。使用兩步擴增過程來擴增經PD-1選擇之TIL，以供完整規模臨床製造。在第0天至第11天進行擴增之第一步(「活化」)。在第11天至第22天進行擴增過程之第二步(「快速擴增期」或「REP」，包含第16天之分瓶)。在第22天收集最終產物。
對於小規模過程(1/100規模)而言，在第0天使用10%具有最低分選結果之經PD-1選擇之TIL起始活化，且將彼數目之來自每一分選之TIL轉移至含有飼養細胞及OKT-3與IL-2培養基的各別G-Rex-10M培養瓶中。按照TP-19-004起始REP、分瓶及收集。下文在方法部分中概述相關時間點之簡要說明。
對於完整規模過程而言，在第0天使用具有類似細胞數目之經PD-1選擇之TIL，利用100e6個同種異體飼養細胞及30 ng/mL OKT3起始活化，持續11天。在第11天自所收集產物起始REP。按照IOVA製造批次記錄進行REP(第11天)以及後續的第16天(分瓶)及第22天(收集)過程。下文在實驗設計中概述相關時間點之簡要說明(表37)。
評定經擴增最終產物TIL之細胞生長、存活率、表型及功能(IFN-γ及顆粒酶B分泌、刺激後CD107a移動)。
對擴展之表徵資料進行進一步分析，以建立EH12.2H7與納武單抗之等效性。
背景資訊
實例21提供一種先前開發的方案，該方案設計為使用PE結合抗PD-1抗體(選殖株# EH12.2H7)自腫瘤碎解物中選擇表現PD-1之TIL，以富集用於自體腫瘤反應性T細胞的TIL產物。
在當前研究中，調適實例9及實例21以使用納武單抗代替PE結合選殖株# EH12.2H7作為抗PD1抗體及使用FITC結合抗IgG4抗體作為二級染色抗體來獲得經PD1選擇之TIL。
實驗設計
按照TP-19-004進行兩個小規模實驗及主體對照條件。
按照實例6進行一次完整規模實驗。
對小規模及完整規模實驗之概述提供於表37及38中。
結果
下表39指定用於評估小規模(外推TVC)及完整規模實驗效能的接受準則。
結果
下表40列出此研究中使用之腫瘤以及相關組織學。
流動式分選輸出。
全部三種腫瘤之分選後純度(PD-1+%)符合＞ 80%之準則。
活化及REP收集輸出
下表42彙總兩次小型完整規模實驗和一次完整規模實驗以及其主體對應實驗(在括號中標註)的總活細胞計數和產物屬性。
過程產率：在活化結束時，使用納武單抗或EH12染色選擇的TIL產生的細胞數目大於100e6(＞ 1200擴增倍數，平均9.1次細胞倍增)，具有足以起始REP培養之產率。
在REP收集時，所有培養產生＞ 80e9個TVC。在第11天至第22天之間觀測到平均9次細胞倍增。該細胞倍增次數與先前臨床前實驗(TP-19-004R及實例21R)觀測到之結果極其類似。
劑量：自完整規模運行(H3046)起，使用納武單抗染色之最終產物劑量為88.5e9個TVC，具有85%存活率及99.7% CD45+CD3+細胞。最終產物為高度富集之TIL產物。
功能：TIL之功能性係基於利用aCD3/aCD28/aCD137 Dynabead隔夜刺激最終產物來表徵。在刺激24小時之後收集上清液並冷凍。進行ELISA以分析釋放至上清液中的IFNγ及顆粒酶B的濃度。IFNγ釋放符合接受準則，且所有TIL培養在刺激後分泌較高量之顆粒酶B。與先前研究中產生之TIL產物類似，來自最終產物的高比率之TIL在用PMA/IO刺激時表現CD107A(CD4+及CD8+ TIL兩者)。
TIL 端粒長度及端粒酶活性：
資料等待中。當資料可得時，修訂該報告以包含此資料。
TIL 選殖性
：資料等待中。當資料可得時，修訂該報告以包含此資料。
擴展表型：
表43、44及45描述TIL之擴展表型分析。使用多色流動式細胞測量術表徵REP TIL之TIL純度、鑑別性、記憶子集、活化及耗竭狀態。＜ 1%之可偵測B細胞、單核球或NK細胞存在於最終收集之TIL中(表43)。REP TIL大多由主要具有效應記憶分化之TCRα/β組成。納武單抗與EH12.2H7之間的CD8/CD4比率相當，但卵巢腫瘤例外。CD8/CD4比率之偏離可能歸因於卵巢腫瘤類型之異源性及選擇程序中缺乏CD4及CD8之選擇標誌。
歸因於TIL之TCR刺激增殖，所有經PD-1選擇之TIL條件顯示CD28表現上調及CD27表現下調。另外，所有經PD-1選擇之TIL顯示低分化表型且具有較低KLRG1表現。
CD27、CD28、CD56、CD57、BTLA、CD25及CD69之量與使用Gen 2製程產生的黑色素瘤TIL的結果類似。
納武單抗與EH12.2H7選擇程序在分化、活化及耗竭狀態方面無顯著差異。
使用EH12.2H7及納武單抗產生經PD-1選擇之TIL而獲得PD-1+
TIL，藉由流動式細胞測量術評定其CD4、CD8、CCR7、CD45RA及PD-1表現。在使用納武單抗及EH12.2H7衍生之經PD-1選擇者在CD4及CD8之表現上未觀測到顯著差異。對三種分析之腫瘤而言，兩種TIL產物產生相對於CD4+
T細胞比例更高之CD8+
T細胞(圖1)。在三種經PD-1選擇之TIL產物中CD4及CD8表現之類似性表明使用納武單抗選擇PD-1+相較於EH12.2H7並未改變CD4/CD8之比率。
如同T細胞譜系，TIL之記憶狀態在使用EH12.2H7及納武單抗產生之經PD-1選擇之TIL中類似。TIL群體主要由效應記憶T細胞構成。使用納武單抗及EH12.2H7產生的經PD-1選擇之TIL與Iovance之LN-145研究產品相似，表明使用任一抗PD-1選殖株選擇PD-1不會使TIL之記憶表型偏離。
為了評定PD-1表現是否在培養後類似地減少，在擴增前及擴增後評定使用納武單抗及EH12.2H7產生的經PD-1選擇之TIL。分選後，兩者新近分選之TIL製劑中的PD-1+ TIL之百分比接近100%(上表)在使用EH12.2H7及納武單抗產生的經PD-1選擇者中，PD-1表現在擴增後顯著且相當地減少。如所預測，擴增後PD-1表現之減少表明在使用EH12.2H7及納武單抗的經PD-1+分選之TIL中的先前高PD-1表現者大多隨著擴增而回復成PD-1-。
由經EH12.2H7及納武單抗分選之PD-1+ TIL產生的經PD-1選擇之TIL的功能表徵
為了評定使用納武單抗衍生之經擴增PD-1+ TIL是否與使用EH12.2H7選殖株衍生之TIL具有類似功能，利用αCD3/αCD28/α41BB活化珠粒非特異性地刺激來自3個腫瘤的經PD-1選擇之TIL，且評估其IFNγ及顆粒酶B分泌。納武單抗及EH12.2H7衍生的經PD-1選擇之TIL回應於刺激產生類似量之IFNγ及顆粒酶B。使用納武單抗及EH12.2H7產生的經PD-1選擇之TIL回應於非特異性刺激(αCD3/αCD28/αCD137珠粒)分泌可觀量之IFNγ及顆粒酶B，表明經選擇之TIL在擴增後具有高度功能性。
資訊
在第0天，歸因於物流問題，無法收到本實例之新鮮腫瘤。所有實驗均使用冷凍腫瘤碎解物代替新鮮腫瘤進行。研究資料表明，當測試新鮮或冷凍腫瘤時，PD-1表現不存在差異。
結論及建議
開發完整規模的經PD-1選擇之TIL過程以在22天內將PD-1+ TIL擴增至＞ 80 e9。以開發規模製造的所有六個批次(納武單抗及EH12兩種染色方法，2個完整規模及4個小規模)符合交付參數之接受準則。
總體而言，此實例展現，由使用納武單抗的經PD-1分選之TIL所產生的經PD-1選擇之TIL與使用EH12.2H7選殖株所產生的TIL相當，由此支持在臨床製造中使用納武單抗進行PD-1選擇。
實例6：使用納武單抗藉由流動式細胞測量術分選選擇PD-1+ TIL及以完整規模擴增以進行臨床製造
製備第0天之CM1培養基及第11天之CM2培養基
資訊：一個CM1批次為10 L。
關於IL-2之資訊。遵循優先次序及可獲得性選擇IL-2。相應地完成計算。
第一：IL-2 Akron預填充準備好使用的注射器1mL。以6000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM1所需的IL-2之體積：(10000mL×6000 IU/mL=60×106
IU每袋)。待轉移IL-2：60×106
UI/IL-2比活性=每個10L RPMI袋的IL-2之毫升數(1位小數)。計算所需注射器之數目：IL-2總體積/每注射器容積=______mL/1 mL=_______個注射器(捨入為無小數)。
第二：待利用1 mL WFI復原IL-2 Akron粉末。以6000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM1所需的IL-2之毫克數：(10000 mL×6000 IU/mL=60×106
IU每袋)。將60×106
IU/IL-2比活性轉化成每個10L RPMI袋的IL-2之毫克數(1位小數)。將待轉移之IL-2(1mg =1mL)轉換成每個10L RPMI袋的IL-2之毫升數(1位小數)。計算所需IL-2毫克數的總數。計算所需的袋子及小瓶之數目。
最後：利用2 mL乙酸復原的IL-2 Cellgenix粉末。以6000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM1所需的IL-2之毫克數：(10000 mL×6000 IU/mL=60×106
IU每袋)。將60×106
IU/IL-2比活性轉化成每個10L RPMI袋之IL-2之毫克數(1位小數)。待轉移之IL-2：計算所需IL-2毫克數的總數。計算每袋IL-2之毫克數及袋數。
解凍人AB血清：每10L CM1製備10瓶×100 mL人AB血清。
初步製備
自第1部分開始使用IL-2：若使用預填充注射器中之Akron IL-2，則無需復原。若使用粉末Akron IL-2，則轉至步驟2.2以繼續進行復原。若使用粉末Cellgenix IL-2，則轉至步驟2.5以繼續進行復原。記錄待復原之小瓶數目。將材料轉移至BSC中：
使用10mL注射器，刺入注射用水(WFI)瓶中，吸取1 mLWFI。將18G針頭連接至注射器並將1 mL WFI轉移至IL-2小瓶。將小瓶倒轉2至3次並旋動直至所有粉末溶解為止。避免泡沫形成，且不要劇烈混合。重複此步驟來復原所需數目之小瓶(若需要，使用新注射器)。在使用前保存於BSC中。記錄待復原之小瓶數目。將材料轉移至BSC中。
打開HAc瓶，使用連接有18G針頭之10mL注射器或自動泵吸吸液管，吸取2 mL HAc。透過隔膜將2 mL HAc轉移至IL-2小瓶中。將小瓶倒轉2至3次並旋動直至所有粉末溶解為止。避免泡沫形成，且不要劇烈混合。重複此步驟以復原第5部分中所需數目之小瓶。在使用之前保存於BSC中。
製備CM1培養基並進行標記。當使用兩個5L RPMI + GlutaMAX袋時，將標記有CM1合併培養基的10L Labtainer轉移至BSC中，並附接增設裝置。泵引出罩之一端附接至CM1合併培養基且另一端附接至第一個5L RPMI + GlutaMAX袋。將全部體積泵吸至CM1合併培養基中。對第二袋5L RPM +GlutaMAX進行重複，使得CM1合併培養基中之RPMI + GlutaMAX之總體積為10 L。
將10 mL 2-巰基乙醇移取至2-巰基乙醇管中。向一瓶人AB血清中添加10 mL建它黴素且均勻化。將瓶子進行標記，指示已添加。在10L袋(參見第5部分)中吸取所需體積之IL-2並轉移至一瓶人AB血清中，且均勻化。將吸液管尖端置入2-巰基乙醇中且抽吸10 mL至CM1合併培養基中。
將添加有IL-2之一瓶100 mL人AB血清抽吸至CM1合併培養基中。將添加有建它黴素之一瓶100 mL人AB血清抽吸至CM1合併培養基中。將剩餘8瓶人AB血清抽吸至CM1合併培養基中。
將CM1培養基置於去皮重天平上。自CM1合併培養基泵吸990 ±10 mL至CM1培養基中。假定1 g等於1 mL。記錄步驟12.20中之CM1培養基體積。熱封並取出CM1培養基。對剩餘CM1培養基袋重複步驟。將袋子儲存於2至8℃下。
熱封並自泵引出罩取出CM1合併培養基，並保存以進行無菌性測試。自無菌CM1袋取出20 mL培養基。將10 mL接種至厭氧BacT/Alert瓶中且將10 mL接種至好氧BacT/Alert瓶中。可在取樣之後捨棄袋子。若要送去外部測試：將無菌CM1袋置於2至8℃下。藉由將樣本送至外部供應商以藉由膜過濾使其無菌來實現無菌性。對可用微生物學培養物進行後處理，且記錄寄存編號。IL-2 Proleukin 等分試樣製備
製備含1% HAD之PlasmaLyte A
用70%異丙醇擦拭所有試劑及用品外部，並置於BSC中。
在無菌過濾器單元中，向384 mL PlasmaLyte A中添加16 mL 25% I-ISA儲備液。記錄以下體積。注意：以上體積足以準備最終濃度為6×104
IU/mL之一個IL-2小瓶。
經由0.22 gm過濾器單元過濾培養基。
標記為含1% FBA之PlasmaLyte A。
製備rhIL-2儲備液。
在含1% HSA之PlasmaLyte A中製備rhIL-2儲備液(6×108
IU/mL最終濃度)。
將18G針頭附接至3mL注射器，且吸取1.2 mL WFI。注入IL-2小瓶中。不自小瓶取出注射器。
將小瓶倒轉2至3次並旋動直至所有粉末溶解為止。不要搖晃或渦旋以防止起泡。不自小瓶取出注射器，自小瓶吸取並量測(在步驟2.4中於表格中記錄為A)溶液，且置於500mL無菌瓶中。
計算所需1% HSA稀釋劑之體積。注意：按照製造商的說明，在利用1.2 mL WFI復原後，每個小瓶含有18×106
IU/mL。
將500mL無菌瓶標記上IL-2工作儲備液6×104
IU/mL。將計算量之1% HSA(來自步驟2.4之D)轉移至已添加經復原IL-2之500mL無菌瓶中。充分混合。必要時將適當量轉移至無菌樣品杯，以便於等分。標記為IL-2工作儲備液6×104
IU/mL。
將自1L-2工作儲備液6×104
IU/mL復原之IL-2以l mL等分試樣等分至經標記之管中。
● 將管標記為Proleukin 1L-2，6×104
IU/mL
● 記錄製備日期、批號、有效期、體積及操作員姓名縮寫。
● 儲存於-80℃下
● 在製備之後3個月過期
完成等分後，記錄所製備之1 mL等分試樣之數目。經 PD-1 選擇之 TIL 過程第 0 天
記錄CM1培養基培育之開始日期及時間。在處理之前，培育CM1培養基袋隔夜。記錄在索尼細胞分選儀上執行的最近之圈選及補償的日期。確證索尼FX500H細胞分選儀在最近30天已開啟及/或運行。
製備腫瘤洗滌介質、分選緩衝液及收集緩衝液。將空的500mL瓶標記為分選緩衝液。夾住血漿轉移裝置，並用尖端刺穿PBS/EDTA袋。使用注射器將490 mL PBS/EDTA轉移至分選緩衝液瓶中。將10 mL FBS添加至490 mL PBS/EDTA。不使用時儲存於2至8℃下。
將一個500 mL HBSS瓶標記為腫瘤洗滌介質。將5 mL建它黴素(50 mg/mL)添加至標記上腫瘤洗滌介質的500 mL HBSS瓶中。
將15mL錐形管標記上收集緩衝液。將7 mL HBSS及7 mL人AB血清添加至15mL錐形管中。不使用時儲存於2至8℃下。
酶之復原：膠原蛋白酶AF-1(1)、中性蛋白酶(1)、DNA酶I(2)。若適用，按以下步驟復原試劑，且不使用時儲存於2至8℃下。若提前製備了等分試樣，則可用步驟不適用。
若適用，使用適當大小之注射器及針頭於10 mL無菌HBSS中復原凍乾膠原蛋白酶AF-1小瓶(Nordmark，瑞典，N0003554)。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶2892 PZ U。復原後，膠原蛋白酶儲備液為289.2 PZ U/ml。
若適用，使用適當大小之注射器及針頭於1 mL無菌HBSS中復原中性蛋白酶(Nordmark，瑞典，N0003553)。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶175 DMC U。凍乾儲備酶之濃度可為175 DMC/mL。
使用適當大小之注射器及針頭於1 mL無菌HBSS中復原DNA酶I(羅氏，瑞士，03724751)。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4 KU。復原後，DNA酶I儲備液為4 KU/mL。準備兩個小瓶。
準備組織分割。將『C形管片段1』盤之4個孔標記為『1』、『2』、『3』及『4』。將『C形管片段1』盤之剩餘孔標記為『H』。將『C形管片段2』盤之4個孔標記為『5』、『6』、『7』及『8』。將5 mL『腫瘤洗滌介質』添加至標記有『C形管片段1』及『C形管片段2』的6孔盤之所有經標記孔中。將50 mL腫瘤洗滌介質添加至標記有『Wash 01』、『Wash_02』、『Wash 03』及『不適宜』的每個100 mm皮氏培養皿中。將20 mL腫瘤洗滌介質添加至標記有『鑷子洗滌介質』、『解剖刀洗滌介質』的每一個50mL錐形管中。將腫瘤洗滌介質保存於BSC中以供進一步使用。僅對於分割而言，將解剖刀及鑷子置於標記有『鑷子洗滌介質』、『解剖刀洗滌介質』的適當管中。
組織分割
將腫瘤容器轉移至BSC中。使用長鑷子將腫瘤自樣品瓶轉移至標記有Wash_01'之100 mm皮氏培養皿中。在環境溫度下於Wash_01'中培育腫瘤3 min。記錄時間。重新蓋好樣品瓶且轉移至天平。記錄樣品瓶之重量且計算腫瘤組織之重量差。將以下物質轉移至BSC中：10 mL血清吸液管；標記有「腫瘤運送介質」之50mL錐形管。將10 mL腫瘤運送介質轉移至標記有「腫瘤運送介質」的管中。用18G針頭將10 mL腫瘤運送介質吸取至注射器中。在每個厭氧無菌瓶及好氧無菌瓶中灌輸5 mL腫瘤運送介質。記錄腫瘤培育停止時間(培育3 min後)。使用長鑷子將腫瘤轉移至標記有『Wash_02』之100 mm皮氏培養皿中且在環境溫度下培育腫瘤3 min。記錄培育停止時間。使用長鑷子將腫瘤轉移至標記有『Wash_03』之100 mm皮氏培養皿中且在環境下培育腫瘤3 min。記錄腫瘤培育停止時間。將直尺置於100 mm皮氏培養皿之蓋子(培養皿蓋)下面，且用長鑷子將腫瘤轉移至蓋子上進行量測及分割。量測且記錄腫瘤長度及接受之片段數目。腫瘤之長度經量測為所有個別片段長度之總和。
在培養皿蓋上進行腫瘤之初步分割。分割成三個中間碎片或分組成3個等體積組。切割時要注意保留每個中間碎片之腫瘤結構。將未主動分割的任何中間腫瘤碎片轉移至『C形管片段1』6孔盤的分開的『H』孔中，以保留組織水分。
分割開始：每個中間片段的分割目標時間平均在20 min內。開始第一中間片段的最終碎斷。記錄第一中間片段之分割開始時間。
在100 mm皮氏培養皿蓋下用直尺作為參考，輕緩地將腫瘤分割成大約216 mm3
之片段(6×6×6 mm)。快速加工且將整個組織分割成片段。使用吸液管、解剖刀或鑷子，選擇至多四個組織片段以供培養，且將該等片段轉移至『C型管分段』6孔盤之經編號孔中。在將片段添加至另一孔之前，用4個片段填充每個孔。每個孔代表在碎解中使用的一個C形管。注意在整個分割程序中始終保留組織水分。將不適宜之組織及廢物轉移至『不適宜組織』培養皿中。黃色脂肪組織或壞死組織指示組織不適宜。每個中間片段最多使用6孔盤之3個孔。必要時，使用第二6孔盤之孔來容納至多8個C形管。根據操作員之判斷，使用新的解剖刀或鑷子。
記錄所有片段的分割停止時間。計算由三個中間片段分割之片段的總數。使用的每個孔應含有4個片段。若存在額外片段，則每孔添加1個額外片段至最多5個片段。每個C形管視情況含4個片段；視可得總片段數目而定，允許含3至5個片段。記錄孔1至8中之最終片段數目。在需要之前將片段儲存於六孔盤中以確保組織保持水分。每個孔代表一個C形管。為Octodissociator準備多達8個C形管。若片段總數超過40，則將多餘的保留於標記有患者識別號之50mL錐形管中且加入適當量腫瘤洗滌介質，以確保組織保持水分。告知Iovance有可用的多餘腫瘤。48小時後捨棄多餘腫瘤。
製備腫瘤碎解物溶劑
將每個C形管標記為『腫瘤碎解物』，附有以第一管開始之編號，且添加以下體積之物質：
4.7 mL無菌HBSS
10.2 pL中性蛋白酶
21.3 pL膠原蛋白酶AF-1
250 pL DNA酶I
記錄所準備之C形管的數目。
對於每個含有待碎解之片段的孔而言，使用鑷子將所有腫瘤片段轉移至如步驟6.2中所指示而標記的對應C形管中。(1)
腫瘤碎解物
將C形管(「腫瘤碎解物1」、「腫瘤碎解物2」、「腫瘤碎解物3」等)插入GentleMACS OctoDissociator上之托架中。
記錄所列舉之類型。基於腫瘤組織類型清單將GEntleMACS OctoDissociateor設定成適當程式，且標示所選程式。下表47。
啟動OctoDissociator。記錄碎解開始時間。取出C形管。記錄碎解停止時間。
腫瘤碎解後處理
將70 pm細胞過濾器定位於碎解後1管上，且使用25mL血清吸液管使腫瘤碎解內容物透過過濾器轉移至『碎解後1』管中。對至多4個『腫瘤碎解物』管進行重複。按需要或針對每個C形管更換過濾器。若腫瘤碎解物C形管超過4個，則使用70 pm細胞過濾器，且將每個剩餘C形管中之物過濾至經標記碎解後2管中。按需要視C形管更換過濾器。
使用血清吸液管，用5 mL HBSS輕緩地沖洗每個腫瘤碎解物C形管內部。倒轉C形管以進行徹底沖洗，且經由70 pm細胞過濾器將5 mL過濾至對應碎解後管中。在沖洗所有管之後，捨棄細胞過濾器。
使用血清吸液管，將HBSS添加至碎解後管中，直至達至50 mL標記為止。將「碎解後」管轉移至離心機，且在室溫下以400× g在全加速度及制動下離心5 min。
自培育箱取出一袋CM1。使用注射器收集大約30 mL CM1並置入標記有『CM1』之50mL錐形管中。將450 pL CM1轉移至每個標記有C1至C4之冷凍小瓶中。
將碎解後管轉移至BSC。輕緩地抽吸上清液並捨棄。使用5mL血清吸液管將細胞沈澱物再懸浮於5 mL溫熱CM1中。上下移取6次以再懸浮細胞沈澱物。若存在「碎解後2」管，則將內容物轉移至「碎解後1」管中。量測並記錄「碎解後1」管之容積。
再懸浮沈澱物後，立即將50 pL轉移至「C1」、「C2」、「C3」及「C4」。上下移取3次以潤濕尖端，之後獲取樣本。
在NC-200上使用『Viability and Cell Count_Iovance』方案。使用NC-200，對樣本1進行細胞數目計算。以1:10稀釋度製備樣本。必要時，製備另外的適當稀釋液。記錄所使用之稀釋因數。按需要記錄活(存活)細胞濃度及存活率。針對樣本2、3及4進行重複。記錄資訊。
使用在步驟8.9中記錄之資料計算四個計數之平均值(碎解後1管+碎解後2管+碎解後3管+碎解後4管)/4
計算活細胞總數。[細胞懸浮液體積-用於數目計算之0.2 mL]×平均濃度。
腫瘤碎解物染色
計算5×105
個活細胞之體積。將彼體積自碎解後管轉移至PE FMO Prep管及FITC FMO Prep管。不使用時置於2至8℃下。
計算碎解後管中剩餘的TVC。
將10 mL HBSS添加至PE FMO Prep管及FITC Prep管中。將5 mL HBSS添加至碎解後管中。
將所有管轉移至離心機。在室溫下以400×g在全加速度及全制動下離心5 min。
如下進行1:100稀釋，以稀釋濃縮納武單抗溶液[10 mg/mL]：將10 pL納武單抗添加至冷凍小瓶中之990 pL分選緩衝液中並輕緩地渦旋5秒以徹底混合。在進一步使用之前置於2至8℃下。
抗IgG4-PE：如下進行1:50稀釋，以稀釋抗IgG4-PE溶液[0.5 mg/mL]：將10 pL抗IgG4-PE添加至冷凍小瓶中之490 pL分選緩衝液中並輕緩地渦旋5秒以徹底混合。在進一步使用之前置於2至8℃下。
將碎解後管、PE FMO Prep管及FITC FMO Prep管轉移回BSC。自每個管抽吸並捨棄上清液，且如下再懸浮：
10×106
個細胞/毫升之碎解後再懸浮細胞的計算如下：(步驟9.3之TVC)÷10×106
個細胞/毫升=添加之分選緩衝液(mL)攪動沈澱物且隨後添加所計算體積之分選緩衝液(捨入至下一毫升)。上下移取5次。________(TVC)個細胞/10×106
個細胞/毫升= _____mL(1位小數)。
藉由攪動沈澱物及利用微量吸液管添加300 pL分選緩衝液來使FITC FMO Prep管中之物再懸浮。上下移取3次。
藉由攪動沈澱物及利用微量吸液管添加300 pL分選緩衝液來使PE FMO Prep管中之物再懸浮。上下移取3次。將PE FMO Prep管儲存於2至8℃下，直至完成30分鐘之納武單抗培育為止。
向添加(步驟9.9)至碎解後管中的每1 mL分選緩衝液添加10 uL經1:100稀釋之納武單抗溶液。將10 uL經1:100稀釋之納武單抗溶液添加至FITC FMO Prep管。
輕彈混合兩個管，並在2至8℃下培育細胞30分鐘。在培育期間每10分鐘藉由輕彈進行攪動，以確保徹底染色。在每次定期攪動之後，檢查下框。
培育後，在室溫下在全加速度及全制動下，將10 mL分選緩衝液添加至碎解後管及FITC FMO Prep管。
將碎解後管及FITC FMO Prep管轉移回BSC。輕緩地抽吸上清液並捨棄。下文為如下再懸浮細胞之步驟。
碎解後管：藉由攪動沈澱物及利用微量吸液管添加400 pL分選緩衝液來再懸浮。上下移取3次。
FITC FMO Prep管：藉由攪動沈澱物及利用微量吸液管添加300 pL分選緩衝液來再懸浮。上下移取3次。
使用1mL血清吸液管及吸液管輔助件量測碎解後管及FITC FMO Prep管之容積；記錄以下容積：碎解後管之容積。FITC FMO Prep管之容積。
根據下文在步驟10.22及10.23中之計算，向碎解後管及FITC FMO Prep管中，每0.1 mL體積添加10 pL中間經稀釋抗IgG4-PE。隨後將『FITC FMO Prep』管置於2至8℃下。
計算：10 uL中間經稀釋抗IgG4-PE×(碎解後管容積/0.1 mL)
計算：10 uL中間經稀釋抗IgG4-PE×(「FITC FMO Prep」管容積/0.1 mL)。將PE FMO Prep管轉移至BSC。量測PE FMO Prep管之容積。根據計算，向碎解後管及PE FMO Prep管中，每0.1 mL體積添加3 pL抗CD3-FITC。
計算：3 uL抗CD3-FITC(PE FMO Prep管容積/0.1 mL)。
計算：3 uL抗CD3-FITC(PE FMO Prep管容積/0.1 mL)。
藉由輕緩地攪動混合碎解後管、FITC FMO Prep管及PE FMO Prep管中之物，且在2至8℃下培育細胞30分鐘。在培育期間每10分鐘藉由輕彈進行攪動，以確保徹底染色。
培育後，將10 mL分選緩衝液添加至「碎解後」管、「FMO FMO Prep」管及「FITC FMO Prep」管中。
經由30 uM預先分離過濾器將每一管中之物過濾至分別標記有碎解後分選、PE FMO及FITC FMO的15mL錐形管中。
將碎解後分選管、PE FMO管及FITC FMO管在室溫下以400× g在全加速度及全制動下離心5 min。
將碎解後分選管、PE FMO管及FITC FMO管轉移回BSC。自每個管抽吸並捨棄上清液，且輕緩地再懸浮於殘餘上清液中。如下進一步再懸浮。
碎解後分選管：藉由攪動沈澱物及添加所計算體積之分選緩衝液以510×106
個細胞/毫升再懸浮細胞。使用原始體積；未捨入至下一毫升。輕緩地上下移取3次，以徹底混合。將封蓋之管置於2至8℃下之暗處，直至準備好分選為止。
PE FMO管：藉由攪動沈澱物及數次添加300 pL分選緩衝液來再懸浮。將封蓋之管置於2至8℃下之暗處，直至準備好分選為止。
FITC FMO管：藉由攪動沈澱物及數次添加300 pL分選緩衝液來再懸浮。將封蓋之管置於2至8℃下之暗處，直至準備好分選為止。
將2 mL收集緩衝液添加至標記有PD-1陽性之15mL錐形管中；針對PD-1陰性管進行重複。
自腫瘤碎解物管起始對經PD-1選擇之TIL的流動式細胞測量術分選。若PD-1陽性管獲得多於1×106
個細胞，則可停止分選。用以接種至G-Rex 100MCS培養瓶的經PD-1選擇之TIL的最大數目為1×106
±10%個細胞。若PD-1陰性管獲得多於4×106
個經分選細胞，則用含有2 mL收集緩衝液之另一15mL錐形管替換該管並添加編號以標記上後綴來區分多個管。始終將經分選細胞儲存於2至8℃下，直至準備好置於G-Rex 100MCS培養瓶中為止。記錄分選後收集的經PD-1選擇之TIL的總數目。
準備含CM1之G-Rex100MCS培養瓶
自培育箱取出CM1培養基袋並記錄日期及時間。確保使培養基升溫隔夜。
閉合G-Rex100MCS之所有夾子。不閉合G-Rex100MCS上過濾器管線處之夾子。
將CM1培養基袋熔接至G-Rex100MCS之紅色管線。
將G-Rex100MCS置於去皮重稱上。藉由重力400 t將10 mL CM1轉移至G-Rex100MCS中。記錄轉移之體積。認為l g等於1 ml。
熱封G-Rex100MCS之紅色管線。
將G-Rex100MCS標記上經PD-1選擇之TIL DO，且將培養瓶及CM1培養基袋轉移至37℃培育箱中，直至進一步使用。
將G-Rex 100MCS標識為「經PD-1選擇之TIL D0」
準備飼養細胞袋。將CM1袋無菌熔接至飼養細胞袋。將飼養細胞袋置於去皮重天平上。藉由重力將100 mL±10 mL CM1轉移至飼養細胞袋中，且記錄增加之體積。認為l g等於*1 ml。熱封飼養細胞袋並自增設裝置取出，留出相同原始長度之導管。
準備飼養細胞。記錄飼養細胞袋之批號。記錄飼養細胞解凍之前的水浴溫度。在37℃水浴中解凍飼養細胞袋3至5 min，直至僅剩下較小冰塊為止。記錄解凍開始時間；解凍結束時間。自水浴取出飼養細胞袋，並確證袋子為乾燥的。
使用魯爾接頭或藉由無菌熔接將飼養細胞袋連接至集束。用新的50mL注射器替換注射器集束。將集束之尖端自解凍飼養細胞袋之單個端口刺入解凍飼養細胞袋。旋轉活栓閥，使得飼養細胞袋處於『關閉』位置。閥門指示已關閉。打開解凍飼養細胞袋管線之夾子，自飼養細胞袋單次吸取大約10 mL飼養細胞至注射器中。旋轉活栓閥，使得解凍飼養細胞袋處於『關閉』位置，且沿飼養細胞袋方向打開所有夾子。將注射器之內容物分配至飼養細胞袋中，同時輕緩混合。必要時，自袋子抽出空氣並用來徹底清空管線。旋轉活栓，使得飼養細胞袋處於『關閉』位置。將細胞充分混合於『飼養細胞』袋中。將10mL注射器附接至『飼養細胞』袋之NIS端口，對袋中之物進行混合並經由NIS端口取出1 mL樣本。將樣本轉移至冷凍小瓶1中。針對每個樣本，使用新注射器對冷凍小瓶2至4重複此操作。
計算飼養細胞袋之容積
飼養細胞計數。製備適當的稀釋液(推薦1:10)。使用NC-200，對樣本1進行細胞數目計算。記錄使用之稀釋因數。記錄以下活(存活)細胞濃度及存活率。針對樣本2、3及4進行重複。使用步驟13.2中記錄之資料計算四個計數的平均活細胞濃度(飼養細胞袋1 +飼養細胞袋2 +飼養細胞袋3/飼養細胞袋4)/4。計算活飼養細胞總數。若活細胞總數超過1×108
個細胞，則繼續至第14部分。
將飼養細胞添加至G-Rex100MCS。計算100×106
個細胞的飼養細胞體積。若必須取出較大體積之飼養細胞，則可使用第二注射器來完成體積減少及清空管線。測定待取出之體積。使用適當大小之注射器自飼養細胞袋取出所計算之體積(步驟14.3)。每次視需要使用新注射器重複自袋子取出一定體積。使用新注射器，抽出適當量之空氣並分配空氣以清空管線。捨棄該體積之取出細胞。記錄取出之體積。使用附接有18G針頭之1mL注射器，吸取0.030 mL OKT3。移除針頭並藉由NIS將OKT3分配至『飼養細胞』袋。利用至少0.5 mL飼養細胞懸浮液沖洗注射器以確保將所有OKT3添加至袋子中。確保飼養細胞中有足夠的空氣，以允許靠重力進料至G-Rex 100MCS中。必要時，將足夠體積之空氣吸取至新注射器中，且經由NIS添加至飼養細胞袋以清空管線。熱封『飼養細胞』袋，留出足夠之導管以供將來熔接。
自培育箱取出G-Rex100MCS經PD-1選擇之TIL D0，並置於熔接器旁。使用一個未使用之導管將『飼養細胞』袋無菌熔接至G-Rex100MCS上之紅色管線。
鬆開管線，使飼養細胞藉重力流入G-Rex 100MCS中。閉合夾子且在初始熔接處附近熱封『飼養細胞』袋。
將經PD-1選擇之TIL添加至G-Rex100MCS中，且最後添加CM1培養基
將4"血漿轉移裝置或增設裝置無菌熔接至GREX 100 MCS之紅色管線，以在紅色管線上增加可用魯爾接頭。將G-Rex 100 MCS轉移至BSC。
將PD-1陽性管加蓋，且輕緩地倒轉5至10次。取下帽蓋並使用自動泵吸吸液管來抽吸PD-1陽性管之內容物。若還有另外的PD-1陽性管，則重複操作。記錄體積。倒轉自動泵吸吸液管，且將2 mL空氣吸取至注射器中。
使自動泵吸吸液管自注射器斷開。連接至G-Rex 100MCS之紅色管線。將注射器中之體積分配至紅色管線中，且使用注射器中之空氣清空管線。必要時使用含更多空氣之新注射器來清空管線。熱封G-Rex 100MCS之紅色管線。
計算需要添加至G-Rex 100MCS以使得最終體積為1000 mL的體積。
將CM1袋無菌熔接至G-Rex 100MCS之紅色管線。將G-Rex 100MCS置於去皮重稱上。使CM1藉重力流入培養瓶，直至達到目標體積(步驟15.5 ± 10 mL)為止。記錄添加之體積。熱封培養瓶之紅色管線。注意：認為l g等於1 mL。
將培養瓶返回至BSC。記錄時間。等待20分鐘以使TIL沈降，隨後將一個10mL注射器連接至藍色加蓋NIS並吸取2 mL培養基。記錄吸取之體積。分別在一個厭氧BacT/Alert瓶及一個好氧BacT/Alert瓶中灌輸1 mL培養瓶上清液。記錄時間。
將G-Rex 100MCS置於培育箱中。記錄處理停止時間。
確證並記錄培育條件，且記錄培育箱ID。
細胞計數結果
經 PD 選擇之 TIL 過程第 11 天
初步操作
記錄CM2培育之開始時間及日期。在處理之前，培育CM2培養基袋隔夜。確保預溫熱保溫包可用。
準備飼養細胞袋及含CM2之G-Rex 500MCS培養瓶。自培育箱取出CM2。記錄取出之日期及時間。判定流逝之CM2培育時間是否可接受。應至少培育CM2隔夜。
閉合合併飼養細胞袋上之所有夾子。將CM2袋無菌熔接至合併飼養細胞袋。將合併飼養細胞袋置於去皮重天平上。藉由重力將大約500 ± 10 mL CM2轉移至合併飼養細胞袋中。記錄轉移之體積。注意：1 g等效於1 mL。
熱封並自CM2袋上取下合併飼養細胞袋。將合併飼養細胞袋轉移至BSC中。
將泵引出罩及G-Rex 500MCS培養瓶轉移至BSC中。確保除大過濾器管線以外，培養瓶上之所有夾子閉合。使用魯爾接頭，將泵引出罩之出口管線連接至培養瓶上之紅色管線。將泵引出罩之入口管線無菌熔接至CM2袋。將G-Rex 500MCS置於去皮重稱上。
將CM2泵吸至G-Rex 500MCS培養瓶中，直至體積達至4000 ± 10 mL為止。記錄添加至培養瓶中之體積。夾緊並熱封。在需要之前將培養瓶置於培育箱中。記錄培育箱ID。注意：1 g等效於1 mL
準備飼養細胞。自至少兩個不同批次中取回三袋飼養細胞。記錄批號。目視檢查袋子以確保其為可接受的(無任何裂縫、破損端口及密封不良)。記錄水浴溫度。記錄所有三個飼養細胞袋的解凍開始時間。記錄所有三個飼養細胞袋的解凍停止時間。合併，且計算飼養細胞數目。
藉由刺穿、無菌熔接或視需要附接以下適當接頭來準備飼養細胞袋集束。確保在集束之單側存在最少三個可用尖端。集束應在中央具有一個三通活栓。另外，集束的另一側必須有一個可用的魯爾接頭/尖端接頭以在步驟4.2中熱封合併飼養細胞袋。記錄用於製作集束的組件。注意：將所有不使用的接頭進行熱封。
將合併飼養細胞袋無菌熔接或附接至集束。飼養細胞袋集束與合併飼養細胞袋附接(1)。將冷凍小瓶標記為第11天飼養細胞1至4。打開新的100mL注射器並吸取20 mL空氣。用新的100mL注射器替換飼養細胞袋集束上的注射器。將飼養細胞袋集束之尖端刺入三個解凍飼養細胞袋中之每一個的單個端口。旋轉活栓，使得合併飼養細胞袋處於關閉位置。將保溫包置於合併飼養細胞袋下方。
打開解凍飼養細胞袋的所有夾子。吸取所有飼養細胞袋的全部內容物，將所有袋子的內容物合併在一起。記錄回收之飼養細胞的總體積。
旋轉活栓，使得解凍飼養細胞袋處於關閉位置。沿合併飼養細胞袋的方向打開所有夾子。將細胞自注射器轉移至合併飼養細胞袋。
將10mL注射器附接至NIS端口，對袋內之物進行充分混合，取出1 mL樣本，且將樣本置於冷凍小瓶中。使用新的10mL注射器及冷凍小瓶進行重複，獲得總計四個1 mL樣本。
計算合併飼養細胞袋之容積。必要時，在AIM-V中稀釋樣本(推薦以1:10稀釋度開始)。記錄稀釋因數。對所有四個樣本進行重複並記錄以下資料。注意：未經稀釋之NC-200之最佳濃度範圍為5×104
至5×106
個細胞/毫升。將用訊息提示使用者超出此範圍之計數。如下計算四個計數之平均活細胞濃度及存活率：(計數1 +計數2 +計數3 +計數4)÷4。計算合併飼養細胞袋中之活細胞總數。合併飼養細胞袋中之TVC是否超過5×109
個細胞?
解凍另外的飼養細胞。需要將另一袋飼養細胞解凍。記錄所用之飼養細胞之批號。
目視檢查袋子以確保其為可接受的(無任何裂縫、破損端口及密封不良)。記錄水浴溫度。記錄飼養細胞袋的解凍開始時間。記錄飼養細胞袋的解凍停止時間。目視檢查袋子以確保其為可接受的(無任何裂縫及洩漏)。
用新的100mL注射器替換飼養細胞袋集束上的注射器。將飼養細胞袋集束之尖端刺入解凍飼養細胞袋之單個端口。必要時，藉由無菌熔接再添加一個尖端。旋轉活栓，使得合併飼養細胞袋處於關閉位置。將保溫包置於合併飼養細胞袋下方。
打開解凍飼養細胞袋的夾子。單次吸取以吸取解凍飼養細胞袋之全部內容物。記錄回收之飼養細胞的總體積。
旋轉活栓，使得解凍飼養細胞袋處於關閉位置。沿合併飼養細胞袋的方向打開所有夾子。將細胞自注射器轉移至合併飼養細胞袋。
將10mL注射器附接至NIS端口，對袋內之物進行充分混合，取出1 mL樣本，且將樣本置於冷凍小瓶中。使用新的10mL注射器及冷凍小瓶進行重複，獲得總計四個1 mL樣本。
計算合併飼養細胞袋之新容積。必要時，在AIM-V中稀釋樣本(推薦以1:10稀釋度開始)。記錄稀釋因數。對所有四個樣本進行重複並記錄以下資料。注意：未經稀釋之NC-200之最佳濃度範圍為5×104
至5×106
個細胞/毫升。將用訊息提示使用者超出此範圍之計數。
如下計算四個計數之平均活細胞濃度及存活率：(計數5 +計數6 +計數7 +計數8)/4。計算合併飼養細胞袋中之活細胞總數。合併飼養細胞袋中之TVC是否超過5×109
個細胞?
將飼養細胞添加至G-Rex 500MCS。計算5×109
個活細胞所需之體積。計算待自合併飼養細胞袋取出以便在袋子中留下5×109
個細胞的體積。自合併飼養細胞袋取出所計算之體積，以在袋子中留下5×109
個細胞。記錄取出之體積。必要時，使用含足夠空氣之新注射器來清空通往合併飼養細胞袋之管線。
使用附接有18G針頭之1mL注射器，吸取0.15 mL OKT-3。取下針頭並經由NIS端口將OKT-3分配至合併飼養細胞袋中。利用0.5 mL飼養細胞沖洗注射器以確保將所有OKT-3添加至袋子中。清空管線。確保飼養細胞袋中存在足夠空氣以有利於借重力流入G-Rex 500MCS培養瓶中，隨後熱封合併飼養細胞袋，留出足夠之導管以供將來熔接。
自培育箱取出G-Rex500MCS並置於無菌熔接器旁。將合併飼養細胞袋無菌熔接至G-Rex 500 MCS上之紅色管線。將合併飼養細胞袋懸掛於IV桿上，且使全部內容物藉重力自袋子流入G-Rex 500MCS培養瓶中。確保在添加飼養細胞之後清空管線。
閉合夾子，且自培養瓶熱封合併飼養細胞袋。將培養瓶標記為TIL培養物+飼養細胞(第11天)，且將培養瓶置於培育箱中。記錄將培養瓶返回至培育箱之時間及培育箱ID。
製備TIL
將EV1000N袋或EXP-1L標記為TIL收集。熱封內孔魯爾接頭之一並取下夾子。稱量空袋並記錄重量。將適當大小之袋子標記為廢物。將廢物袋無菌熔接至G-Rex 100MCS培養瓶上之紅色管線。
若處理經PD-1選擇之TIL，則不需要血液過濾器，且可將G-Rex 100MCS之清空收集管線直接熔接至TIL收集袋。若處理Gen 2.1 TIL，則將血液過濾器之進口導管管線之一無菌熔接至G-Rex 100MCS培養瓶之清空收集管線。熱封另一入口管線以防止洩漏。將過濾器之出口管線無菌熔接至TIL收集袋。
自第一G-Rex 100MCS培養瓶取出大約900 mL上清液。當完成取出上清液時，將TIL收集袋置於廢物袋頂部以用作保溫包。旋動並輕敲培養瓶，直至所有細胞自膜剝落為止。若細胞收集吸管不再壁與膜之接面處，則輕敲培養瓶，同時傾斜45°角以適當地定位吸管。朝收集導管緩慢傾斜培養瓶，使得片段保持在培養瓶的對側上(若適用)。
在保持G-Rex 100MCS培養瓶傾斜的同時，將剩餘細胞懸浮液轉移至TIL收集袋中。將血液過濾器保持豎直以使其充滿懸浮液。若適用，應避免將腫瘤片段轉移出G-Rex 100MCS培養瓶。
當完成細胞收集時，閉合清空管線上之夾子，並打開紅色培養基管線之夾子。輕緩地擠壓廢物袋以使培養基開始流入培養瓶，且繼續填充直至培養瓶底部上之膜的三分之一至二分之一被覆蓋為止。夾緊紅色管線。劇烈旋動並敲打培養瓶，且打開清空管線上的夾子。收集剩餘細胞懸浮液。一旦完成收集，即夾緊並熱封紅色管線及清空管線。
重複步驟7.2至7.10，直至所有G-Rex 100MCS培養瓶均已進行收集為止。捨棄廢物袋。放平天平，並獲取TIL收集袋之重量。
計算TIL收集袋中之細胞懸浮液之體積。注意：認為1 g等於1 mL。
將10mL注射器附接至NIS端口，對袋內之物進行充分混合，取出1 mL樣本，且將樣本置於冷凍小瓶中。使用新的10mL注射器及冷凍小瓶進行重複，獲得總計四個1 mL樣本。
計算TIL收集袋之新容積。將TIL收集袋置於培育箱中。記錄置於培育箱中之時間及培育箱ID。
TIL細胞計數。必要時，在AIM-V中稀釋樣本(推薦以1:10稀釋度開始)。記錄稀釋因數。對所有四個樣本進行重複並記錄以下資料。注意：未經稀釋之NC-200之最佳濃度範圍為5×104
至5×106
個細胞/毫升。將用訊息提示使用者超出此範圍之計數。
如下計算四個計數之平均活細胞濃度、總細胞濃度及存活率：(計數1 +計數2 +計數3 +計數4)÷4。計算TIL收集袋中之活細胞總數。TIL收集袋中之總活細胞計數是否超過55×106
個細胞？
QC取樣
計算體積以取出5×106
個細胞用於流動式細胞測量術。自TIL收集袋取出上文所計算之體積，且轉移至標記上D11流量5×106
個細胞以及取樣批號及日期的容器中。送至QC進行測試。計算QC取樣後TIL收集袋剩餘之容積。計算QC取樣後TIL收集袋中剩餘之活細胞數。剩餘之總活細胞計數是否＞200×106
個活細胞？
計算將200×106
個活細胞接種至G-Rex 500MCS所需的體積。計算待取出之體積以便將200×106
個活細胞保留在TIL收集袋中。
將適當大小之注射器連接至TIL收集袋。自TIL收集袋取出上文所計算之體積，且置於標記上過量TIL的適當大小之錐形管中。記錄取出之體積。在進一步處理之前置於培育箱中。記錄培育箱ID。
將TIL添加至G-Rex500MCS
自培育箱取出G-Rex500MCS TIL培養物+飼養細胞(第11天)並緊鄰無菌熔接器置放。將TIL收集袋無菌熔接至G-Rex500MCS培養瓶之紅色管線。鬆開自TIL收集袋至G-Rex 500MCS培養瓶之所有夾子，且使TIL收集袋之全部內容物靠重力進料至培養瓶中。清空管線，熱封，且捨棄TIL收集袋。
確保除大過濾器管線以外，G-Rex 500MCS培養瓶上之所有夾子閉合。將培養瓶至於培育箱中且記錄培育箱資訊。確保G-Rex 500MCS培養瓶中之培養基在擱置於培育箱擱架上時為水平的。
冷凍保存過量TIL
計算待添加至過量TIL之CS10量。注意：將CS10體積捨入為整數。細胞濃度將為大約100×106
個細胞/毫升。在20℃下以350G將過量TIL管離心10分鐘。
使用適當大小之血清吸液管，自過量TIL管抽吸上清液並捨棄於廢物瓶中。輕敲管底以使細胞再懸浮於剩餘流體中。使用針頭及適當大小之注射器吸取所計算體積之CS10。將該體積之CS10逐滴添加至過量TIL管中。使用適當大小之吸液管進行充分混合。於冷凍小瓶中準備過量TIL管之1 mL等分試樣。記錄所準備之冷凍小瓶的數目。藉由將1 mL CS10添加至標記上空白之1.8mL冷凍小瓶，準備將在CRF中與小瓶探針一起使用的空白小瓶。冷凍。
過量TIL之冷凍保存後操作。在運行完成後使冷凍機停止，且記錄儲存資訊。製備第 16 天之 CM4 培養基
待製備的CM4之總體積。注意：一種產物需要25 L培養基。應以10 L之增量製備各批次。
待製備的CM4袋之數目(一個CM4袋為5 L)：n = 待製備之CM4之總體積/5 L
所選類型之AIM-V容器：AIM-V容器10L袋。所需袋子數量：A =待製備之CM4的總數量/10 L；IM-V容器1L瓶；所需瓶子數量：B =待製備之CM4之數量/1 L。
第一：IL-2 Akron預填充準備好使用的注射器1mL。
AIM-V容器10L袋。
以3000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM4所需的IL-2之體積：(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)à待轉移之IL-2：30×106
UI/IL-2比活性。
計算所需IL-2總體積：每袋IL-2之體積×AIM-V 10L袋之數目(A)=________mL×__ = _____mL(1位小數)。
計算所需注射器之數目：IL-2總體積/每注射器容積=______mL/1 mL=_______個注射器(捨入為整數)。
AIM-V容器1L瓶(一袋CM4 = 10×1L AIM-V瓶)
計算製備一個10L袋所需的IL-2之體積：(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)；待轉移之IL-2：30×106
UI/IL-2比活性=每個10L AIM-V袋的IL-2之毫升數(1位小數)。
計算所需IL-2總體積：每袋IL-2之體積×10L CM4袋之數目(n)=____mL×__ = _____mL(1位小數)。
第二：供利用1 mL WFI復原IL-2 Akron粉末。
AIM-V容器10L袋
以3000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM4所需的IL-2之毫克數(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)30×106
UI/IL-2比活性-每個10L AIM-V袋的IL-2之毫克數(1位小數)；待轉移之IL-2(1 mg = 1 mL)=每個10L AIM-V袋的IL-2之毫升數(1位小數)。
計算所需IL-2總毫克數：每袋IL-2之毫克數×10L AIM-V袋之數目(A)=____mg×__ = _____mg(1位小數)。
計算所需小瓶數目(1個小瓶含有1 mg)：______個小瓶(捨入為整數)。
AIM-V容器1L瓶(一袋CM4 = 10×1L AIM-V瓶)
以3000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM4所需的IL-2之毫克數(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)30×106
UI/IL-2比活性=每個10L CM4袋的IL-2之毫克數(1位小數)；待轉移之IL-2(1 mg = 1 mL)=每個10L CM4袋的IL-2之毫升數(1位小數)。
計算所需IL-2總毫克數：每袋IL-2之毫克數×10L CM4袋之數目(n)=____mg×__ = _____mg(1位小數)。
計算所需小瓶數目(1個小瓶含有1 mg)：______個小瓶(捨入為整數)。
最後：利用2 mL乙酸復原IL-2 Cellgenix粉末。
AIM-V容器10L袋
以3000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM4所需的IL-2之毫克數(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)30×106
UI/IL-2比活性-每個10L AIM-V袋的IL-2之毫克數(1位小數)；待轉移之IL-2(1 mg = 1 mL)=每個10L AIM-V袋的IL-2之毫升數(1位小數)。
計算所需IL-2總毫克數：每袋IL-2之毫克數×10L AIM-V袋之數目(A)=____mg×__ = _____mg(1位小數)。
計算所需小瓶數目(1個小瓶含有1 mg)：______個小瓶(捨入為整數)。
AIM-V容器1L瓶(一袋CM4 = 10×1L AIM-V瓶)
以3000 IU/mL計算製備一個10L袋之CM4所需的IL-2之毫克數(10000 mL×3000 IU/mL = 30×106
IU每袋)30×106
UI/IL-2比活性=每個10L CM4袋的IL-2之毫克數(1位小數)；待轉移之IL-2(1 mg = 1 mL)=每個10L CM4袋的IL-2之毫升數(1位小數)
計算所需IL-2總毫克數：每袋IL-2之毫克數×10L CM4袋之數目(n)=____mg×__ = _____mg(1位小數)
計算所需小瓶數目(1個小瓶含有1 mg)：______個小瓶(捨入為整數)
參見第1部分使用IL-2：若使用預填充注射器中之Akron IL-2，則無需復原，轉至第3部分。若使用粉末Akron IL-2，則前進至步驟2.2以繼續進行復原。若使用粉末Cellgenix IL-2，則前進至步驟11.7以繼續進行復原。
記錄待復原之小瓶數目。使用10mL注射器刺入WFI瓶，吸取1 mL WFI。將18G針頭連接至注射器並將1 mL WFI轉移至IL-2小瓶。將小瓶倒轉2至3次並旋動直至所有粉末溶解為止。避免泡沫形成，且不要劇烈混合。重複此步驟來復原所需數目之小瓶(若需要，使用新注射器)。在使用前保存於hl BSC中。若使用10L AIM-V袋，則前進至第12部分；或若使用1L AIM-V瓶，則前進至第4部分。
使用自動泵吸吸液管或含18G針頭之10mL注射器，每小瓶吸取2 mL HAc以進行復原。若需要，將18G針頭連接至注射器且將2 mL HAc轉移至小瓶中。將小瓶倒轉2至3次並旋動直至所有粉末溶解為止。
避免泡沫形成，且不要劇烈混合。重複此步驟來復原第1部分中所需數目之小瓶。每10 mL HAc使用1個自動泵吸吸液管轉移。在使用前保存於BSC中。若使用10L AIM-V袋，則前進至第3部分；或若使用1L AIM-V瓶，則前進至第4部分。
利用AIM-V培養基10L袋製備CM4培養基。經由魯爾鎖將第一增設裝置連接至第一CM4培養基5L袋。對每個CM4培養基5L袋重複此步驟。自BSC取出CM4培養基5L袋。將5L Labtainer袋標識為CM4培養基。
以下量必須乘以待準備之AIM-V 10L袋之數目A。將以下物質轉移至BSC中：以下量必須乘以用於製備總體積之AIM-V 10L袋的數目A。將10L AIM-V袋標記為CM4合併培養基#。
使用足夠容量之注射器及18G針頭，在一個10L袋吸取所需體積之IL-2(參見第5部分)並轉移至GlutaMAX 1中。將瓶子進行標記，指示已添加。根據將準備之10L AIM V袋之數目對每個所需GlutaMAX重複此步驟。每一個10L AIM V袋將使用一瓶Glutamax + IL-2。
使用適當大小之注射器及流體分配接頭，將第5部分中所計算之體積的IL-2自預填充注射器轉移至GlutaMAX 1中。將瓶子進行標記，指示已添加。根據將準備之10L AIM V袋之數目對每個所需GlutaMAX瓶重複此步驟。每一個10L AIM V袋將使用一瓶Glutamax + IL-2。
將第一CM4合併培養基袋轉移至BSC中。利用4"血漿轉移裝置刺入第一CM4合併培養基袋並經由魯爾鎖附接增設裝置。對每個CM4培養基袋重複此步驟。
將以下物質轉移至BSC中：泵引出罩(1)。將泵引出罩連接至CM4合併培養基1。
將泵引出罩置於Acacia泵中並設定參數。
在BSC中，將泵引出罩之剩餘端連接至自動泵吸吸液管。使用自動泵吸吸液管將一個GlutaMAX瓶之全部內容物轉移至一個CM4合併培養基袋中。完成(亦即將GlutaMAX 1轉移至CM4合併培養基袋1中，以此類推)時，將每個袋子標示為準備好。對每個CM4合併培養基袋重複此步驟。
無菌熔接至CM4培養基袋。使用速度100RPM手動起動通向CM4培養基之管線。將CM4培養基袋置於去皮重天平上。設定Acacia泵之參數。將4900 ± 10 mL之培養基自CM4合併培養基袋泵吸至CM4培養基袋。記錄體積。閉合夾子並熱封，以便取下經填充CM4培養基袋。填充兩個CM4培養基袋之後，熱封每個CM4合併培養基袋。保留以供無菌性測試。針對剩餘CM4培養基袋進行重複。將CM4合併培養基袋標識為無菌#。
記錄添加至每個CM4培養基袋中的CM4之體積。將袋子儲存於2至8℃下。
利用AIM-V培養基1L瓶製備CM4培養基。以下量必須乘以待準備之CM4袋之數目。
使用足夠容量之注射器及18G針頭，為一個10L袋吸取所需體積之IL-2(參見第1部分)並轉移至GlutaMAX 1中。根據將準備之CM4合併培養基袋之數目對每個所需GlutaMAX瓶重複此步驟。每一個CM4合併培養基袋將使用一瓶Glutamax + IL-2。
使用適當大小之注射器及流體分配接頭，將第1部分中所計算之體積的IL-2自預填充注射器轉移至GlutaMAX 1中。根據將準備之CM4合併培養基袋之數目對每個所需GlutaMAX瓶重複此步驟。每一個CM合併培養基袋將使用一瓶Glutamax + IL-2。
將第一CM4合併培養基袋轉移至BSC中。若需要，將增設裝置附接至CM4合併培養基。將泵引出罩轉移至BSC中。將泵引出罩連接至CM4合併培養基。
將泵引出罩置於Acacia泵中並設定參數。將泵引出罩之剩餘端連接至自動泵吸吸液管。使用自動泵吸吸液管將一個GlutaMAX + IL-2 1之全部內容物轉移至一個CM4合併培養基袋中。對10× 1L AIM-V瓶繼續。視需要添加增設裝置，對所有CM4合併培養基袋進行重複。完成(亦即將GlutaMAX 1轉移至CM4合併培養基袋1中，以此類推)時，將每個袋子標示為準備好。將增設裝置附接至所有CM4培養基袋。將帶紅色帽蓋的泵引出罩末端無菌熔接至CM4培養基袋上。使用速度100RPM手動起動通向CM4培養基之管線。
將CM4培養基袋置於去皮重天平上。設定Acacia泵之參數。將4900 ± 10 mL之培養基自CM4合併培養基袋泵吸至CM4培養基袋。在步驟4.13中記錄體積。閉合夾子並熱封，以便取下經填充CM4培養基袋。填充兩個CM4培養基袋之後，熱封每個CM4合併培養基袋。保留以供無菌性測試。針對剩餘CM4培養基袋重複步驟4.8至4.10。
將CM4合併培養基袋標識為無菌#。標示無菌選項：若內部測試無菌性：自無菌#袋取出20 mL培養基。將10 mL接種至厭氧BacT/Alert瓶中且將10 mL接種至好氧BacT/Alert瓶中。可在取樣之後捨棄袋子。若要送去外部測試：將無菌#袋置於2至8℃下。藉由將樣本送至外部供應商以藉由膜過濾使其無菌來實現無菌性。
記錄添加至每個CM4培養基袋中的CM4之體積。將袋子儲存於2至8℃下。經 PD-1 選擇之 TIL 過程第 16 天
記錄CM4培育之開始時間及日期。在處理之前，培育CM4培養基袋隔夜。記錄製造開始時間。
閉合10L Labtainer袋上之所有夾子，以進行上清液收集。在袋子上標記上清液。使用魯爾，附接增設裝置。自培育箱取出G-Rex 500MCS培養瓶並緊鄰GatheRex置放。檢查除大過濾器管線以外，所有夾子閉合。
將上清液袋無菌熔接至G-Rex上之紅色收集管線。將EV1000N袋或EXP-1L標記為細胞級份(CF)。熱封袋子在末端附近的一個管線，並取下夾子。記錄CF袋之乾重。
標識細胞級份(CF)袋。將CF袋無菌熔接至G-Rex 500MCS之清空管線。將紅色管線及清空管線插入GatheRex之對應插槽。將GatheRex管線連接至G-Rex 500MCS上之過濾器管線。上清液收集：鬆開通向上清液袋之所有夾子，並減小培養瓶容量。
啟動GatheRex。當空氣進入管線時，GatheRex將停止。完成時，閉合夾子。
細胞級份收集
收集期間將CF袋置於上清液袋頂部以保溫。或者置於已在保溫箱中調節隔夜的保溫包上。記錄TIL收集起始時間。
輕敲培養瓶並旋動培養基，以使細胞自膜剝離，檢查是否所有細胞均已剝落。藉由歪斜培養瓶，確保軟管處於培養瓶邊緣及流體當中。在下一步驟期間維持邊緣傾斜。
鬆開通向CF袋的夾子。啟動GatheRex以收集細胞級份。完成後，閉合夾子。
閉合細胞收集管線上之夾子，並打開紅色培養基管線上之夾子。藉由以下步驟反洗並將更多細胞轉移至CF袋。鬆開紅色管線上之夾子。藉由重力使足夠之培養基流入培養瓶中，以覆蓋G-Rex 500MCS表面底部之1/3。閉合夾子。若細胞仍黏附於膜上，則重複反洗步驟，且注意不要使細胞懸浮液袋因來自重複反向沖洗之空氣而過度充氣。
閉合所有夾子並在紅色管線及清空管線上之先前封口附近進行熱封。對於CF袋，留出與步驟2.6中記錄乾重時相同之長度的導管。捨棄G-Rex 500MCS，在培養物分瓶中將不再使用。保留上清液以供進一步使用。
計算CF袋之容積。認為1 g等於1 mL。
將10mL注射器附接至NIS端口，充分混合袋中之物，取出1 mL。用酒精擦拭物擦拭CF袋之NIS端口。將10mL注射器附接至NIS端口，充分混合袋中之物，取出1 mL。
在需要之前將CF袋轉移至培育箱中。計算剩餘細胞級份(CF)袋之容積。
在NC-200上使用Viability and Cell Count lovance進行細胞數目計算。必要時，在AIM-V中稀釋樣本(推薦以1:10稀釋度開始)。記錄稀釋因數。對所有四個樣本進行重複並記錄以下資料。注意：未經稀釋之NC-200之最佳濃度範圍為5×104
至5×106
個細胞/毫升。將用訊息提示使用者超出此範圍之計數。
如下計算四個計數之平均活細胞濃度及存活率：(計數1 +計數2 +計數3 +計數4)÷4。計算CF之體積，以取出1×106
個細胞用於黴漿菌樣本。
將三個15mL錐形管標記上黴漿菌D16 1至3且將兩個15mL錐形管標記上黴漿菌D16參考1至2。標籤上包含取樣日期。
使用適當大小之注射器取出上文測定之體積的細胞級份(步驟3.16)，且轉移至標記有黴漿菌D16 1之管中。用新注射器重複對黴漿菌D16 2管、黴漿菌016 3管、黴漿菌參考D16 1管及黴漿菌參考D16 2管進行取樣。將CF袋放回培育箱中。計算取出之總體積。
計算使每個黴漿菌D16管含總計10 mL所需的上清液之體積。
使用適當大小之注射器，自上清液袋取出在步驟3.20中計算之體積的上清液並轉移至黴漿菌D16 1管中。對步驟3.19中所準備之所有剩餘管進行重複。
BacT/Alert樣本製備
使用適當大小之注射器，自上清液袋取10 mL沖洗注射器3次。取出10 mL上清液。將18G針頭附接至注射器，且將5 mL注入一個厭氧瓶中並將5 mL注入一個好氧瓶中。
計算待接種之G-Rex500MCS之數目。計算剩餘細胞級份袋之容積。計算剩餘活細胞總數。計算待接種之G-Rex 500MCS之數目。捨入至最接近之整數。若待接種之G-Rex 500MCS之量＞5，則待接種之G-Rex 500MCS之數目將為5。超過5×109
之細胞懸浮液將在所有培養瓶之間均勻分配。針對每個G-Rex 500MCS培養瓶，計算待接種之細胞級份袋之溶劑。用TIL接種G-Rex500MCS培養瓶。將在BSC中打開所需G-Rex培養瓶。確保魯爾鎖牢固且除較大過濾器管線以外，所有塑膠夾子均已閉合。標記新的G-Rex培養瓶。
將細胞級份袋無菌熔接至G-Rex 500MCS培養瓶上之紅色管線。懸掛袋子並確保細胞級份袋中之物的常規混合。將G-Rex培養瓶置於分析性去皮重天平上。在下一次量皮重之前，必須清空第一G-Rex上之管線；否則會使重量不正確。
鬆開所有管線，且藉由重力將以重量計算之體積(步驟5.5)的細胞級份轉移至G-Rex 500MCS培養瓶1中。認為1 g等於1 mL。轉移至G-Rex 500MCS培養瓶中。記錄添加至培養瓶之細胞級份之量。一旦已藉由重力將所需體積轉移至G-Rex培養瓶中，即閉合較靠近G-Rex之導管附近的夾子，以停止將TIL添加至培養瓶中。清空管線並熱封紅色導管，且按需要保留足夠之導管用於下一次熔接。將G-Rex置於培育箱中。
G-Rex 2、3、4、5：對於另外的新G-Rex 500MCS培養瓶，重複與接種相同之操作。記錄細胞懸浮液添加體積。記錄TIL添加之結束時間
培養基添加
自培育箱取出CM4培養基袋。將泵引出罩之一端無菌熔接至CM4培養基袋。將泵引出罩之另一端無菌熔接至G-Rex 500MCS之紅色管線，懸掛CM4袋。
設定泵導管，且利用以下設置程式化泵：程式：體積；速度300 rmp。標示G-Rex 500MCS培養瓶之刻度上的5000 mL標誌。將CM4泵吸至培養瓶中，直至達到刻度上之標誌。熱封並取出培養瓶。置於37℃及5% CO2下之培育箱中。對剩餘培養瓶進行重複。記錄培育箱之培育開始時間(將最後一個培養瓶置於培育箱中之時間)、溫度及CO2讀數。經 PD-1 選擇之 TIL 過程第 22 天
洗滌緩衝液製備(1% HAS/PlasmaLyte A)。閉合51_labtainer上之所有夾子且標識為Plasmalyte 1% HSA洗滌緩衝液。製備之洗滌緩衝液在一天後過期。
使用魯爾接頭，將增設裝置附接至5L Labtainer袋。用小尖端刺入每個HSA瓶，且使用適當大小之注射器，將125 mL 25% HSA轉移至5L Labtainer中。記錄添加之體積。將泵引出罩無菌熔接至與5L Labtainer附接的增設裝置上。閉合4S-4M60或等效集束上之所有夾子。刺穿每個1L PlasmaLyte袋。自BSC取出PlasmaLyte袋，且將集束的與PlasmaLyte袋相對之側上的接頭無菌熔接至泵引出罩之剩餘末端。鬆開通向PlasmaLyte袋之所有夾子，並將全部體積泵吸至5L Labtainer中。記錄添加之體積。熱封管線並取出5L Labtainer。留出足夠之管線用於將來熔接。
將Plasmalyte 1% HSA洗滌緩衝液袋放回BSC內。使用50mL注射器，將50 mL洗滌緩衝液轉移至CS750袋中。將冷凍袋標記為空白。在LOVO中包含帶製造批號、縮寫及日期的清洗緩衝液袋。可將洗滌緩衝液袋保存在BSC外部及室溫下，直至再次需要。
選擇是新近製備抑或預先製備IL-2。
使用適當大小之注射器，將40 mL洗滌緩衝液轉移至標記有IL-2 6×104
IU/mL之50mL錐形管中。將此管保存於BSC中以供IL-2製備。
IL-2製備(Proleukin)
將標籤上之以下資訊記錄於IL-2小瓶上。依據製造商說明復原IL-2。在準備使用之前將復原之IL-2儲存於2至8℃下。
計算待添加至洗滌緩衝液中的經復原IL-2之體積。注意：6.0×104
IU/mL × 40 mL=2.4×106
IU
使用注射器及針頭，取出上文計算之體積的經復原IL-2並轉移至標記有IL-2 6×104
IU/mL之50mL錐形管中。
收集前準備
記錄將處理的G-Rex 500MCS培養瓶的數目。計算自所有培養瓶收集上清液所需的10L Labtainer之數目，捨入成最接近之整數。
測定收集細胞懸浮液將需要的EV3000N、EXP-3L或同等袋子的數量。兩個或少於兩個培養瓶將需要一個袋子。三至四個培養瓶將需要2個袋子。五個培養瓶將需要3個袋子。不要將超過2個培養瓶中之物收集至單個袋子中。注意：不要過度填充EV3000N或EXP-3L袋；最大填充體積為2000 mL。閉合10L Labtainer上之夾子，且藉由魯爾接頭將增設裝置附接至每個Labtainer並用印刷標籤或標誌將袋子標記為上清液。若將使用兩個或更多個10L廢物Labtainer，則可同時使用第二GatheRex泵。當第一G-Rex 500MCS代之容量減小時，可準備下一個培養瓶以減少體積。
利用LOVO進行G-Rex 500MCS收集及細胞濃縮。記錄自第一G-Rex 500MCS培養瓶收集細胞之開始時間。
使用GatheRex自G-Rex 500MCS培養瓶取出上清液。旋動G-Rex 500MCS培養瓶以使細胞自膜剝落。鬆開通向細胞收集池的夾子。啟動GatheRex以開始經由清空管線收集細胞。在進行細胞收集時輕緩地攪動培養瓶以保持細胞懸浮。保持培養瓶傾斜，使得收集吸管位於培養瓶的角落，其可在此收集所有細胞懸浮液。完成細胞收集時，閉合清空管線上之夾子。
繼續進行反洗：鬆開紅色管線上的夾子。藉由重力使足夠之培養基流入培養瓶中，以覆蓋G-Rex 500MCS底部之1/3。閉合紅色管線上之夾子，且劇烈敲打並旋動培養瓶以剝離細胞。將細胞級份轉移至細胞收集池中。若細胞仍黏附於膜上，則重複反洗步驟。注意不要使細胞懸浮液袋因空氣或產物而過度充氣。
重複直至對所有G-Rex 500MCS培養瓶進行收集(減少體積及收集細胞)為止。
如下標記五個15mL錐形管：
上清液-黴漿菌1
上清液-黴漿菌2
上清液-黴漿菌3
上清液-黴漿菌參考1
上清液-黴漿菌參考2
使用50mL注射器，根據以下取樣計劃自上清液袋取出50 mL上清液，以獲得樣本。
將10 mL上清液等分至每個15mL錐形管中。在轉移至QC之前儲存於2至8℃下。捨棄上清液袋。完成轉移後，閉合所有夾子，並使用另一導管端口上之標誌作為導引熱封LOVO來源袋，以確保導管長度約等於獲取乾重時的長度。
稱量含有細胞懸浮液之LOVO來源袋。計算細胞級份體積(CF)。視為l g等於1 mL。
充分混合LOVO來源袋中之物。使用10mL注射器以經由NIS取出1 mL細胞級份，轉移至1.8 mL冷凍小瓶中。為每個等分試樣使用一個新的10mL注射器，對接下來之3個冷凍小瓶進行重複。將冷凍小瓶標記上1至4。將LOVO來源袋置於培育箱中。記錄培育箱及時間。
取出四個1 mL樣本後，重新計算LOVC來源袋中之體積。
必要時，在AIM-V中稀釋樣本(推薦以1:10稀釋度開始)。記錄稀釋因數。對所有四個樣本進行重複並記錄以下資料。注意：未經稀釋之NC-200之最佳濃度範圍為5×104
至5×106
個細胞/毫升。將用訊息提示使用者超出此範圍之計數。
計算四個計數之平均值(計數1 +計數2 +計數3 +計數4)/4；平均總活細胞濃度。平均總細胞濃度。平均存活率%
計算總細胞數(LOVO前)：平均總細胞濃度×LOVO來源袋中之體積。
計算總活細胞(LOVO前)：平均總活細胞濃度×LOVO來源袋中之體積。
在一些實施例中，若總細胞＞ 5×109
，則取出5×108
個細胞以冷凍保存為MDA保留樣本。5×108
/總細胞濃度=待取出之體積。若總細胞為5×109
，則取出4×106
個細胞以冷凍保存為MDA保留樣本。4×106
/總細胞濃度=待取出之體積。使用適當大小之注射器自LOVO來源袋取出所需體積並置於標記有MDA保留的50mL錐形管中。在冷凍保存步驟之前保存於培育箱中。
計算LOVO來源袋中剩餘之體積。LOVO來源袋之容積-為MDA保留小瓶取出之體積=LOVO來源袋中剩餘之體積。
判定LOVO來源袋中剩餘之總細胞數是否大於150×109
。LOVO來源袋中剩餘之體積×總細胞濃度=LOVO來源袋中剩餘之總細胞數。
計算要取出以保留150×109
個活細胞的細胞數目。LOVO來源袋中剩餘之總細胞數- 150×109
個細胞=待自LOVO來源袋取出之細胞數目
計算自LOVO來源袋取出之細胞體積。自LOVO來源袋取出之細胞數目/總細胞濃度(步驟5.23)=自LOVO來源袋取出之細胞體積。
使用適當大小之注射器，取出並捨棄所計算之體積的細胞懸浮液。
計算LOVO來源袋中所含細胞級份之剩餘體積。LOVO來源袋之原始容積-取出以保留150×109
個細胞之體積=LOVO來源袋中剩餘之體積。
將LOVO來源袋放回培育箱中。記錄培育箱ID及時間。將10L Labtainer標記上LOVO廢物，閉合夾子，並經由魯爾接頭附接增設裝置。接通LOVO裝置並遵循說明進行處理。LOVO運行結束。
IL-2添加
將18G針頭連接至3mL注射器。自經選擇之IL-2 6×104
IU/mL吸取上文標示之體積的IL-2。自注射器取下針頭並經由袋子上之NIS將注射器轉移至FCF Post LOVO。沖洗注射器三次以確保將所有IL-2添加至產物中。利用空氣清空管線。記錄添加之IL-2的體積。
一旦已將IL-2添加至FCF Post LOVO，即藉由熔接至剩餘接頭中之一者將FCF Post LOVO附接至集束(參見步驟7.7中之圖)。保留歧管上之夾子。
最終調配物
將50mL錐形管標記上FCF保留。將100mL注射器附接至歧管/活栓。吸取一定體積之CS10以添加至FCF Post LOVO中。將CS10分配至FCF Post LOVO袋中。若適用，保留剩餘CS10以用於MDA保留小瓶。記錄完成CS10分配之時間。記錄添加至FCF Post LOVO中之CS10的體積。
確證每個DP袋要添加的FCF體積以及每個DP袋要取出的保留體積。一次操控一個袋子。取下歧管上之注射器並用新的100mL注射器替換。沿FCF Post LOVO的方向打開所有夾子，充分混合細胞產物，且將適當體積之細胞懸浮液吸取至注射器中。 閉合通向FCF Post LOVO的夾子，且沿DP袋1之方向打開夾子。將注射器之內容物分配至DP袋1中。充分混合DP袋1中之物，並吸取適當量之細胞懸浮液以保留在袋子中及自袋子移除全部過剩空氣。將注射器中之體積分配至標記有FCF保留之50mL錐形管中。記錄取出之體積。三重熱封接近DP袋1之管線，切割中間封口，並自BSC取出DP袋1。對剩餘DP袋進行重複。
將50mL錐形管標記上FCF Post LOVO。用10mL注射器吸取FCF Post LOVO之所有剩餘體積並轉移至標記有FCF Post LOVO之管中。此操作將用於產生衛星小瓶。
開始冷凍運行。將所有冷凍袋及適用冷凍小瓶置於冷凍機內，關閉CRF門，且記錄冷凍機條件。等待樣本溫度達至8 ± 1℃，且等待箱室溫度達至4 ± 1℃，隨後按Run(運行)以開始程式。記錄開始時間。計算細胞在CS10中經過之時間。
最終細胞調配物計數及存活率
製備待計算數目之FCF樣本的稀釋液。推薦1:100稀釋度。(以兩次1:10連續稀釋製備)。NC200之最佳範圍在5×104
與5×106
個細胞/毫升之間。
在NC-200上使用Viability and Cell Count_Iovance方案。對所有四個TIL樣本進行細胞數目計算。確保在每次樣本運行時記錄樣本及稀釋劑體積。
計算四個計數之平均值：(計數+計數2 +計數3 +計數4)/4；平均總活細胞濃度(活)；平均總細胞濃度(活+死)；平均存活率%。
計算活細胞數目。活細胞濃度×FCF體積(袋子數目×袋子容積)。
計算細胞總數。總細胞濃度×FCF體積(袋子數目×袋子容積)
完成CRF運行
確證存在成核，且溫度未超過0℃。一旦完成冷凍運行，立即將小瓶及袋子轉移至LN2儲存罐中。
在當前過程GEN 3期間量測TIL群體之IFN-γ分泌
在第22天，在當前過程Gen 3期間TIL的IFN-γ分泌。
下表顯示在當前過程Gen 3期間的各天TIL群體之IFN-γ分泌的量測結果。下表52。
實例7：選擇及擴增PD-1+ TIL以用於完整規模製造
介紹
已在患有轉移性黑色素瘤之患者群中證實使用自體腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之過繼性T細胞療法具有持久反應率(Rosenberg, S.A.等人,《臨床癌症研究》, 2011.17(13): 第4550-7頁)。用於治療之TIL產物包括異源T細胞，其識別腫瘤特異性抗原、突變源性患者特異性新抗原及非腫瘤相關抗原(Kvistborg, P.,等人, 《腫瘤免疫學(Oncoimmunology)》, 2012.1
(4): 第409-418頁；Simoni，Y.，等人，《自然》，2018.557
(7706): 第575-579頁)。研究證實新生抗原特異性T細胞顯著促進TIL之抗腫瘤活性(Schumacher, T.N.及R.D. Schreiber, 《科學》, 2015.348(6230): 第69-74頁)。預期針對腫瘤反應性富集TIL的策略將產生更有效的治療產品，尤其是在已知含有大量旁觀者T細胞的上皮癌中(Turcotte，S.,等人,《免疫學雜誌》, 2013.191(5): 第2217-25頁)。多項研究證實，PD-1在TIL上的表現(一種通常與T細胞耗竭相關的標誌)鑑別自體腫瘤反應性T細胞(Inozume, T.,等人,《免疫療法雜誌》, 2010.33(9): 第956-64頁；Gros，A.,等人, 《臨床調查研究雜誌》，2014年。124(5)：第2246-59頁；Thommen, D.S., 等人,
《自然醫學》, 2018)。此實例提供一種設計成選擇PD-1陽性(PD-1+)細胞來富集自體性腫瘤反應性T細胞之TIL產物的方案。
此實例提供用於分選及擴增PD-1+ TIL之臨床規模製造方案。參見例如圖28。
此實例詳述關於使用2-REP方案(例如如本文所描述之基於GEN3之方案)擴增自黑色素瘤、肺癌及頭頸癌分選的PD-1+ TIL的工作。評定經擴增TIL之細胞生長、存活率、表型、端粒長度及功能(IFNγ及顆粒酶B分泌、CD107a移動)。
此方案將包含如下兩個實驗階段：
第 1 階段
：使TIL擴增過程縱向擴大規模及最佳化臨床規模的可行性研究(參見圖29)。
將進行第1階段以確保PD-1+ TIL在經PD1+選擇之Gen 2過程「PD1+Gen2」中充分擴增(圖1)。將對經PD-1+選擇之TIL、經PD-1選擇之TIL及主體CD3+ TIL進行小規模培養。
另外，將測試研究方案、確定培養基(CTS OpTimizer + 3% SR)及17天早期REP過程(縮短REP 2起始及分瓶之時間點)。下文在方法部分中概述相關時間點之簡要說明(圖28)。
第 2 階段
：以完整規模測試經PD1+選擇之Gen 2過程(選擇及擴增)，以進行臨床製造(圖2)
除第0天外，每製造批次記錄將對經PD-1+選擇之TIL進行三次完整規模經PD1+選擇之Gen 2過程培養。第0天將僅依據BR遵循腫瘤處理及碎斷步驟。如附件2至4中所描述，將依據IOVA製造批次記錄進行第11天REP、第16天規模縱向擴大及第22天收集。
在第0天，將使用含有中性蛋白酶、DNA酶I及膠原蛋白酶之GMP碎解混合物分離腫瘤碎解物。將洗滌碎解物、染色並進行流動分選以純化PD-1+ TIL。
REP 1將在第0天起始，使用經純化PD-1+ TIL及100e6同種異體飼養細胞以及30 ng/mL OKT3，持續11天。
將在第11天使用收集之REP 1產物起始REP 2。如附件2至4中所描述，將依據IOVA製造批次記錄進行REP 2(第11天)以及後續第16天及第22天過程。下文在方法部分中概述相關時間點之簡要說明(圖30)。
材料 腫瘤 組織
接受各種組織學之腫瘤。 用於 TIL 生長之標準試劑，包含：
G-Rex 5M、10M、100M及500 MCS培養瓶(分別為Wilson Wolf目錄號80055S、80110S、81100、85500S-CS)
GMP重組IL-2(Cell-Genix，德國，目錄號1020-1000)
用於CM1、CM2及CM4之培養基試劑。
用於CTS OpTimizer+3% SR之確定培養基試劑
CTS OpTimizer SFM(賽默飛世爾，目錄號A1048501)
GlutaMAX 100X(賽默飛世爾，目錄號35050061)
健他黴素50 mg/mL(賽默飛世爾，目錄號15750060)
CTS™免疫細胞SR(賽默飛世爾，目錄號A2596101) 流動式細胞測量術染色及分析試劑
流動式細胞測量術抗體：
● 抗PD-1 PE，選殖株EH12.2H7，Biolegend，目錄號329906
● 抗CD3 FITC，選殖株OKT3，Biolegend，目錄號317306
● 抗IgG4 Fc-PE，選殖株HP6025，Southern Biotech，目錄號9200-09
分選緩衝液：HBSS，含2% FBS，經無菌過濾。
收集緩衝液：hAB血清。
程序
腫瘤製備
處理腫瘤。
將自研究聯盟及組織採購供應商接收新近切除之腫瘤樣本。腫瘤在HypoThermosol(Biolife Solutions，華盛頓，目錄號101104)(含抗生素)中運送隔夜。
自包裝中取出腫瘤，並在腫瘤洗滌緩衝液(含50 ug/mL健他黴素之經過濾HBSS)中洗滌3×，每次洗滌2分鐘。
將整個腫瘤碎斷成4至6 mm的片段，以製備腫瘤碎解物。將6mm片段保存在含有10 mL腫瘤洗滌緩衝液的6孔盤之一個孔中。用於腫瘤消化之酶製備
對於第1階段研究而言，將使用製備之研究級DNA酶、膠原蛋白酶及玻尿酸酶來碎解腫瘤。
對於第2階段研究，將使用如下文所描述之GMP膠原蛋白酶及中性蛋白酶碎解腫瘤。
以下文針對每一種消化酶指示的無菌HBSS量來復原凍乾酶。確保自瓶側及自瓶開口上之保護箔獲取所有殘餘粉末。上下移取若干次且旋動以確保完全復原。
在10 ml無菌HBSS中復原膠原蛋白酶AF-1(Nordmark，瑞典，N0003554)。凍乾儲備酶的濃度為每小瓶2892 PZ U。因此，復原後，膠原蛋白酶儲備液為289.2 PZ U/ml。**注意，酶儲備液會發生變化，因此請確證凍乾儲備液之濃度，並相應地修改添加至碎解混合物中的酶之最終量**。等分成100 uL等分試樣且儲存於-20℃下
在1 ml無菌HBSS中復原中性蛋白酶(Nordmark，瑞典，N0003553)。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶175 DMC U。因此，復原後，中性蛋白酶儲備液為175 DMC/ml。**注意，酶儲備液會發生變化，因此請確證凍乾儲備液之濃度，並相應地修改添加至碎解混合物中的酶之最終量**。等分成20 uL等分試樣且儲存於-20℃下
在1 ml無菌HBSS中復原DNA酶I(羅氏，瑞士，03724751)。凍乾儲備酶之濃度為每小瓶4KU。因此，復原後，DNA酶儲備液為每小瓶4KU。**注意，酶儲備液會發生變化，因此請確證凍乾儲備液之濃度，並相應地修改添加至碎解混合物中的酶之最終量**。等分成250 uL等分試樣且儲存於-20℃下
解凍GMP碎解混合物之3種組分，且如下製備工作GMP碎解混合物：將10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3μ l膠原蛋白酶AF-1(1.2 PZ/ml)及250 μl DNA酶I(200 U/ml)添加至4.7 ml無菌HBSS中。將碎解混合物直接置於C形管中。腫瘤處理及碎解
如上文所指示將至多4個6 mm腫瘤片段轉移至各GentleMACS C形管(C形管)中之5 ml碎解混合物中，置於GentleMACS OctoDissociator中。將另外的GentleMACS C形管用於另外的腫瘤片段。
將各C形管轉移至GentleMACS OctoDissociator中。藉由將解離器設定成適於下文在表54中所列之各別腫瘤組織學的程式來進行碎解。解離將進行大約一小時。
表54：碎解後，自Octodissociator或旋轉器取出C形管並置於BSC中。利用25 mL血清學吸液管自每個C形管取出碎解物並使主體碎解物穿過70 µm細胞過濾器進入50mL錐形管中。未碎解之腫瘤部分可能無法穿過過濾器，不允許碎解物由於壓力而自移液器濺出。利用另外10 mL HBSS洗滌C形管，且使洗滌物穿過細胞過濾器。利用HBSS將50mL錐形管QS為50 mL。
將碎解物在室溫下以400× G離心5分鐘(全加速度及全制動)。
將錐形管轉移至BSC且抽吸或傾析上清液。將沈澱物再懸浮於5 mL溫熱CM-1+6000 IU/mL IL-2中並上下移取5至6次。依據LAB-056在不稀釋之情況下於NC-200進行2次細胞數目計算。
將1 mL碎解物置於一旁以用於CD3+主體對照，且將2×500 uL碎解物等分試樣冷凍保存以用於腫瘤反應性分析。將碎解物保存在冰上。使碎解之腫瘤染色以進行流動式細胞測量術分析及細胞分選
留出少量樣本(約1e5個細胞)以放入15mL錐形PE FMO管中。
根據以下方案將剩餘腫瘤碎解物用包含染色PD-1-PE、抗IgG4 Fc-PE(用於納武單抗及帕博利珠單抗之二級抗體)及CD3-FITC的混合物染色。FMO樣本將僅用CD3-FITC染色。
細胞數目計算後，將10 mL HBSS添加至碎解物中，且在室溫下以400× G離心5分鐘(全加速度及全制動)。
將錐形管轉移至BSC中且 傾析
上清液。使用微量吸液管獲得在傾析之後剩餘體積之碎解物。向管中添加3×此體積之分選緩衝液。若獲得之體積為150 uL，則添加450 uL分選緩衝液，總體積為600 uL。
每100 μL添加3 μl抗CD3-FITC(亦即，若體積為600 uL，則添加6×3 = 18 uL抗體)。 ( 添加至兩個樣本。 )
每100 μL添加2.5 μl抗PD-1-PE(亦即，若體積為600 uL，則添加6×2.5 = 12.5 uL抗體)。 ( 不添加至 FMO 。 )
以1:500稀釋度添加抗IgG4-Fc-PE(亦即，每500 uL體積添加1 uL抗體)。 ( 不添加至 FMO 。 )
用1 mL微量吸液管輕緩地混合碎解物並在冰上培育細胞30分鐘。培育期間避光。在培育期間每10分鐘藉由輕彈進行攪動，以確保徹底染色。
將完全染色之細胞再懸浮於20 mL分選緩衝液中，向FMO添加10 mL分選緩衝液。
使完全染色之溶液穿過30-μm細胞過濾器進入新的50 ml錐形管中。同樣使FMO穿過30-μm細胞過濾器進入新的50-ml錐形管中。
在室溫下以400× G離心5 min(全加速度及全制動)。將細胞以至多10e6
/ml總細胞(活細胞及死細胞)再懸浮於分選緩衝液中。最小體積為300 μl。
轉移至15-ml錐形管中。將管儲存於冰中，覆蓋鋁箔直至進一步使用為止。
準備15-ml收集管以用於經分選群體。將2 ml收集緩衝液(含2% hAB血清之D-PBS)置於管中。將收集管儲存於冰中直至進一步使用為止。細胞數目計算及存活率
用於使用Chemometec NC-200細胞計數器獲得細胞及存活率計數的程序描述於LAB-056中。FACS 分選 (FX500 Startup)
打開BSC。打開JUN-AIR真空泵。按壓儀器前面的電源/待機按鈕來打開FX500。打開細胞分選儀軟體並運行。使用校準試劑運行自動校準。樣本收集
確證樣本及收集箱室處於5℃且選擇攪動樣本圖標並遵循關於樣本及補償的細胞儀提示。確證正確地圈選細胞群體。參見圖31。
可能需要調整BSC或FSC設置。勿調整任何其他通道之電壓。必要時調整PD-1圈選。參見圖32。
當圈選令人滿意時，記錄儘可能多的事件(或最多20,000個CD3事件)。您可以將樣本壓力設定為10，以加快此收集速度。
停止收集並取出管。將先前製成之無菌dH20的15-ml錐形管裝載至樣本平台上。重複直至CD3圈選無事件為止。將待收集之樣本添加至裝載平台上。確證設置為正確的。
將15-ml收集腔區塊裝載至箱室。將含有收集緩衝液之收集管裝載至箱室區塊中。倒轉加蓋管若干次，以用收集緩衝液塗覆管頂部。將一個管標記上樣本名稱及加號。取下帽蓋並將其置於左箱室中。將第二管標記上樣本名稱及減號。取下帽蓋並將其置於右箱室中。
運行裝載收集圖標並等待細胞出現在螢幕上。約15秒。調整樣本壓力，使每秒總事件少於5,000。點擊開始分選圖標。調整樣本壓力以將分選效率維持為至少85%。記錄50,000個CD3事件。將自動停止記錄。
若任一級份中收集超過4.5×106
個細胞，則將需要更換收集管。
繼續分選，直至所有樣本脫離樣本管為止。將管置於冰上。確證PD-1級份之選擇性百分比。重複處理負向選擇樣本。導出並保存資料，且關閉流動式細胞儀。
第1階段(可行性研究)第 0 天 -REP1
培養基製備
製備500 mL CM-1 + 6000 IU/mL IL-2或使其升溫。
確定培養基製備
製備100 mL CTS OpTimizer + 3% SR及6000 IU/mL IL-2或使其升溫。自CTS OpTimizer之1L瓶取出30 mL。添加30 mL CTS免疫細胞SR、1 mL 50 mg/mL健他黴素、10 mL 100X GlutaMAX及1瓶CTS補充劑(訂購時提供CTS OpTimizer)。在需要之前將培養基儲存於4℃下。
PBMC飼養細胞製備
解凍適當數目之小瓶以用於REP 1(將需要10e6 PBMC以用於各種條件，假定每1mL小瓶含60e6至80e6 PBMC)。將40 mL溫熱CM1+IL-2置於50mL錐形管中且將1mL PBMC飼養細胞小瓶中之物移取至錐形管中。上下移取經解凍PBMC飼養細胞以徹底混合，並在NC-200上進行2次細胞數目計算。
計算待轉移至用於轉移10e6 PBMC之每個G-Rex 10M的適當體積。向每個培養瓶添加3 uL aCD3(OKT-3)並將培養瓶置於培育箱中。
REP1之TIL接種
將10% PD-1+分選體積(藉由血清學吸液管獲得)置於標記有PD-1+、PD-1+ DM及PD-1+早期REP之G-Rex 10M培養瓶中。用CM-1+ IL-2將PD-1+及PD-1+早期REP填充至100 mL，用確定培養基+IL-2將PD-1+ DM填充至100 mL。
計算將同等數目之PD-1細胞接種至PD-1- G-Rex 10M培養瓶中的PD-1-之適當體積。用CM-1 + IL-2將培養瓶填充至100 mL。CD3+主體TIL對照條件將添加與另一條件中之PD-1+細胞的數目等同之CD3+細胞。為獲得適當體積之碎解物，遵循以下步驟。藉由將步驟9.3.5中獲得之碎解物TVC乘以自分選報告獲得的活細胞之CD3+%，計算碎解物中之CD3+TVC/mL。(亦即，10e6×10% = 1e6)。獲得此數目後，將在每種條件下接種之PD-1+細胞之數目除以此數目。(亦即，1e5/1e6 = 0.1 mL)。將此體積(0.1 mL)之碎解物添加至主體CD3+ TIL培養瓶中並用CM1+IL-2填充至100 mL。將所有培養瓶置於37℃、5% CO2
培育箱中。第 5 天 ( 早期
REP) 及第 11 天 -
REP
培養基製備
製備250 mL CM2 + 3000 IU/mL或使其升溫。
確定培養基製備。
依據第9.12.1部分製備溫熱的50 mL確定培養基。(3000 IU/mL IL-2代替6000 IU/mL)。
REP1收集
減少培養瓶體積並將培養物置於經適當標記之50mL錐形管中。在NC-200上對每個樣本進行2次細胞數目計算。將每個所收集REP1之體積的10%(REP2允許最多2e6個細胞)置於其各別G-Rex 5M培養瓶中，且用溫熱CM2 + IL-2(PD-1+、PD-1+、PD-1+早期REP、PD-1-及主體CD3+ TIL)或溫熱確定培養基(PD-1+ DM)填充至50 mL。
PBMC飼養細胞製備
解凍適當數目之小瓶以用於REP 1(將需要50e6 PBMC以用於各種條件，假定每1mL小瓶含60e6至80e6 PBMC)。將40 mL溫熱CM1+IL-2置於50mL錐形管中且將1mL PBMC飼養細胞小瓶中之物移取至錐形管中。上下移取經解凍PBMC飼養細胞以徹底混合，並在NC-200上進行2次細胞數目計算。計算待轉移之適當體積，且將飼養細胞轉移至新的經適當標記之G-Rex 5M中，以轉移50e6 PBMC。向每個培養瓶添加1.5 uL aCD3(OKT-3)並將培養瓶置於培育箱中。將所有培養瓶置於37℃、5% CO2
培育箱中。第 12 天 ( 早期 REP) 及第 16 天規模縱向擴大
培養基製備
製備250 mL CM4 + 3000 IU/mL或使其升溫。
確定培養基製備
依據第9.12.1部分製備溫熱的50 mL確定培養基。(3000 IU/mL IL-2代替6000 IU/mL)。
REP2收集
減少培養瓶體積並將培養物置於經適當標記之50mL錐形管中。在NC-200上對每個樣本進行2次細胞數目計算。
規模縱向擴大
進行計算以判定要縱向擴大規模的子培養瓶的適當數目。TVC/10e6，捨入，最大為5。將收集之培養瓶之容積除以子培養瓶之數目，且將該體積放回各別G-Rex 5M培養瓶之培養物中。用溫熱CM4+IL-2(PD-1+、-1+、PD-1+早期REP、PD-1-及主體CD3+ TIL)或溫熱確定培養基(PD-1+ DM)將培養瓶填充至50 mL。第 17 天 ( 早期 REP) 及第 22 天收集
收集
減少培養瓶體積並將培養物置於經適當標記之50mL錐形管中。
在NC-200上對每個樣本進行2次細胞數目計算。
冷凍保存
將PBS添加至收集產物中使其達至50 mL，且在室溫下以400×G離心5分鐘(全加速度及全制動)。
將每種培養物再懸浮於3 mL低溫CS-10中並等分至1.8mL冷凍小瓶中。
將冷凍小瓶置於Mr.Frosty中，並放置至-80℃隔夜。第二天置於LN2儲存件中。第 2 階段 第 0 天 -REP1
培養基製備
製備1L CM-1 + 6000 IU/mL IL-2或使其升溫。
PBMC飼養細胞製備
解凍適當數目之小瓶以用於REP 1(將需要100e6 PBMC以完整規模，且將需要10e6以用於主體CD3+對照，假定每1mL小瓶含60e6至80e6 PBMC)。
將40 mL溫熱CM1+IL-2置於50mL錐形管中且將1mL PBMC飼養細胞小瓶中之物移取至錐形管中。
上下移取經解凍PBMC飼養細胞以徹底混合，並在NC-200上進行2次細胞數目計算。
計算待分別轉移至用於轉移100e6及10e6 PBMC之G-Rex 100M及G-Rex 10M的適當體積。
向G-Rex 100M添加30 uL aCD3(OKT-3)並向G-Rex 10M添加3 uL。將培養瓶置於培育箱中。
REP1之TIL接種
將所有PD-1+分選物置於G-Rex 100M中。
CD3+主體TIL對照條件將以1/10比率添加與完整規模中之PD-1+細胞的數目等同之CD3+細胞。為獲得適當體積之碎解物，遵循以下步驟。
藉由將步驟9.3.5中獲得之碎解物TVC乘以自分選報告獲得的活細胞之CD3+%，計算碎解物中之CD3+TVC/mL。(亦即，10e6×10% = 1e6)。
獲得此數目後，將在完整規模條件下接種之PD-1+細胞之數目除以此數目。(亦即，1e5/1e6 = 0.1 mL)。
將此體積(0.1 mL)之碎解物添加至主體CD3+ TIL培養瓶中並用CM1+IL-2填充至100 mL。
將所有培養瓶置於37℃、5% CO2
培育箱中。第 11 天、第 16 天、第 22 天
將依據IOVA製造批次記錄遵循完整規模過程。
將與針對小規模可行性研究之第1階段中所描述之步驟類似地處理主體CD3+ TIL條件。
最終產物之交付測試
對於第2階段研究而言，將進行除微生物學及內毒素外的所有選定交付測試。
對最終產物之擴展測試
對於第1階段及第2階段而言，將依據研究方案(TP-18-015)進行另外表徵，且將記錄結果僅供參考。
結果及接受準則。
實例8：測試抗PD1耦聯微珠以自腫瘤碎解物正向選擇PD-1+ TIL
磁珠選擇之背景/基本原則
抗體/磁珠結合方法。使用抗PD-1磁珠選擇抗PD-1+ TIL
結果：
PD-1+ TIL可使用抗PD-1(EH12.H7)微珠自REP TIL選擇(圖35)。
PD-1+ TIL可使用抗PD-1(M1H4)微珠自REP TIL選擇(圖36)。
使用流動式細胞測量術方法或磁珠方法進行PD-1+ TIL之面對面研究、選擇及擴增(圖37)。
第0天的分選前/後TVC
分析最終產物之產物屬性。擴展最終產物之表型表徵。
進行TCR選殖株型分析。
開發用於PD-1選擇之磁珠分選方案，作為流動式分選之替代實施例。
● 處理更快
● 處理量更高
● 更便宜
● 操作員所需技術專項知識更少(流動式分選是一個繁瑣的過程)
● 實現封閉系統處理
使用磁性選擇的經PD-1選擇之TIL可能與PD-1+
(當前流動式方法)不同。
緩和
考慮來自賽默飛世爾之替代抗PD-1抗體(選殖株MIH4)，其將僅選擇PD-1+
。
在一些實施例中，將幹細胞科技之EasySep「自助」正向選擇套組用於結合過程。
選用於結合之抗體：
● CD279(PD-1)單株抗體(選殖株MIH4)，eBioscience™
● GoInVivo™純化抗人類CD279(PD-1)抗體(選殖株EH12.2H7)
結合方法
將15 ug初級抗體添加至100 uL組分A(抗體之專用摻合物)及100 uL組分B(抗體之專用摻合物)中。
● 在370℃下培育混合物，置於4℃下隔夜。
● 次日，用PBS QS至1 mL。
● 以結合抗PD-1微珠儲存於4℃下，直至進一步使用為止。
● 將腫瘤碎解物濃度調整至1e8個細胞/毫升(最小體積為100 uL)。
● 將100 uL結合之抗PD-1微珠添加至1000 uL腫瘤碎解物溶液。
● 在室溫下培育15分鐘。
● 渦旋RapidSpheres 30秒，將RapidSpheres(50 uL/mL)添加至細胞並在室溫下培育10分鐘。
● QS至2.5 mL。
● 在EasySep磁體中培育5至10分鐘。
● 捨棄上清液。
● 重複步驟4至6一次。
● 將經分離細胞再懸浮於CM1中。
處理並使用GMP酶(膠原蛋白酶、DNA酶I及中性蛋白酶)以酶促方式碎解腫瘤(M1149)。
經由索尼細胞分選儀以及用兩種不同抗體選殖株(EH12.2H7及M1H4)製成的幹細胞抗PD-1磁珠分選相等部分之腫瘤碎解物的PD-1+ TIL。
使用EH12.2H7分選後之細胞數目產率高於流動式分選方法。
然而，使用流動式分選方法之PD-1+純度高於磁性方法。此可能是歸因於磁性方法中用於檢查純度的二級抗體(參見圖34)。
使用之珠粒套組：EasySep™人類「自助」正向選擇套組II：目錄號17699。
初步資料表明基於磁珠之分選可用於選擇PD-1+
TIL。
目前，吾人之染色方法涉及兩個步驟。利用納武單抗，隨後利用抗CD3 FITC及抗IgG4 PE對腫瘤碎解物染色。
對於磁珠方法而言，吾人提出使用磁珠結合抗IgG4(HP-6023)。
● 利用來自美天旎(CliniMACS)之生物素化微珠的抗生物素化抗體。
● Sepmag。
● Dyna磁體。
實施例1
將利用納武單抗對腫瘤碎解物染色，隨後使用珠粒耦聯抗IgG4(HP6023)對PD-1+ TIL進行磁性選擇。
實施例2
需要分析選擇PD-1+
TIL群體的抗體(抗PD-1)選殖株。分析M1H4選殖株及來自(A17188B)Biolegend選殖株的新抗PD-1選殖株。實例 9 ：冷凍保存 TIL 細胞療法之例示性生產
此實例描述一種根據當前組織優良操作規範(current Good Tissue Practices)及當前優良製造規範(current Good Manufacturing Practices)在G-Rex培養瓶中進行TIL細胞療法過程的例示性cGMP製造。
初始過程資訊
第0天CM1培養基製備
在BSC中，向RPMI 1640培養基瓶添加試劑。添加以下試劑t，每瓶添加：加熱不活化人AB血清(100.0 mL)；GlutaMax(10.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/mL(1.0 mL)；2-巰基乙醇(1.0 mL)
自BSC取出不必要之材料。自BSC分發培養基試劑，將硫酸建它黴素及HBSS保留在BSC以用於調配洗滌介質製備。
解凍IL-2等分試樣。解凍一個1.1 mL IL-2等分試樣(6×106
IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。記錄IL-2：批號及有效期
將IL-2儲備液轉移至培養基中。在BSC中，將1.0 mL IL-2儲備液轉移至準備之CM1第0天培養基瓶中。添加CM1第0天培養基1瓶及IL-2(6×106
IU/mL)1.0 mL。
將G-Rex100MCS傳遞至BSC中。將G-Rex100MCS(W3013130)無菌傳遞至BSC中。
將所有完全CM1第0天培養基泵吸至G-Rex100MCS培養瓶中。組織片段錐形管或GRex100MCS 。
第0天腫瘤洗滌介質製備
在BSC中，將5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)添加至1×500 mL HBSS培養基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/ml(5.0 mL)。經由1L 0.22微米過濾器單元(W1218810)製備含有建它黴素之經過濾HBSS。
第0天腫瘤處理
獲得腫瘤。自QAR獲得腫瘤樣品並立即轉移至2至8℃下之套件中進行處理。
等分腫瘤洗滌介質。
腫瘤洗滌1 使用8''鑷子(W3009771)，自樣品瓶取出腫瘤並轉移至準備之「洗滌1」培養皿中。隨後為腫瘤洗滌2及腫瘤洗滌3。
量測腫瘤。評定腫瘤。評定是否觀測到整個腫瘤面積之＞ 30%壞死及/或為脂肪組織。若適用：清除分割。若腫瘤較大且觀測到＞30%組織外表壞死/為脂肪，則藉由使用解剖刀及/或鑷子之組合移除壞死/脂肪組織並同時保留腫瘤內部結構來進行「清除分割」。
分割腫瘤使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成偶數個適當大小之片段(至多6個中間片段)。轉移中間腫瘤片段。將腫瘤片段分割成大小為3×3×3 mm之碎片。儲存中間片段以防脫水。
重複中間片段分割。測定收集之碎片數目。若僅保留所需組織，則自「有利中間片段」6孔盤選擇另外的有利腫瘤碎片來填充丟棄碎片，使得最多達50個碎片。
準備錐形管。將腫瘤碎片轉移至50mL錐形管中。準備用於G-REX100MCS之BSC。自培育箱取出G-REX100MCS。將G-Rex100MCS培養瓶無菌傳遞至BSC中。將腫瘤片段添加至G-Rex100MCS培養瓶中。使碎片均勻分佈。
按以下參數使G-Rex100MCS保溫：使G-Rex培養瓶保溫：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。計算：保溫時間；下限=保溫時間+252小時；上限=保溫時間+276小時。
過程完成後，捨棄所有剩餘已升溫培養基並解凍IL-2之等分試樣。
第11天-培養基製備
監測培育箱。監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
在培育箱中使3×1000 mL RPMI 1640培養基(W3013112)瓶及3×1000 mL AIM-V(W3009501)瓶升溫≥30分鐘。自培育箱取出RPMI 1640培養基瓶。準備RPMI 1640培養基瓶。過濾培養基。解凍3×1.1 mL IL-2等分試樣(6×106
IU/mL)(BR71424)。自培育箱取出AIM-V培養基瓶。將IL-2添加至AIM-V中。將10L Labtainer袋及中繼泵轉移裝置無菌轉移至BSC中。
準備10L Labtainer培養基袋。準備Baxa泵。準備10L Labtainer培養基袋。將培養基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自動泵吸管。
混合培養基。輕緩地揉按袋子以進行混合。依據取樣計劃對培養基進行取樣。取出20.0 mL培養基並置於50mL錐形管中。在BSC中準備細胞計數稀釋管 ，將4.5 mL已標記有「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V培養基添加至四個15mL錐形管中。將試劑自BSC轉移至2至8℃下。準備1L轉移包。在BSC外部，將1L轉移包熔接(依據過程註釋5.11)至附接於所準備的「完全CM2第11天培養基」袋的轉移裝置上。準備飼養細胞轉移包。培育完全CM2第11天培養基。
第11天-TIL收集
預處理表格。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。自培育箱取出G-Rex100MCS。準備300mL轉移包。將轉移包熔接至G-Rex100MCS。
準備用於TIL收集之培養瓶並起始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透過血液過濾器將細胞懸浮液轉移至300mL轉移包中。檢查膜上之黏附細胞。
沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex100MCS上之夾子。確保所有夾子閉合。熱封TIL及「上清液」轉移包。計算TIL懸浮液之體積。準備用於取樣之上清液轉移包。
抽取Bac-T樣本。在BSC中，自1L「上清液」轉移包中吸取約20.0 mL上清液，並分配至無菌的50mL錐形管中。
依據取樣計劃接種BacT。使用適當大小之注射器自準備的標記有BacT之50mL錐形管取出1.0 mL樣本並接種於厭氧瓶。
培育TIL。在需要之前將TIL轉移包置於培育箱中。進行細胞數目計算及演算。測定進行細胞數目計算之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。存活率÷2。活細胞濃度÷2。測定計數之上限及下限。下限：活細胞濃度平均值×0.9。上限：活細胞濃度平均×1.1。確認兩個計數在可接受界限內。根據進行的所有四次數目計算測定平均活細胞濃度。
調整TIL懸浮液之體積 計算取出細胞數目計算樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積(A)。取出的細胞數目計算樣本之體積(4.0 ml)(B)經調整TIL細胞總體積C = A - B。
計算活TIL細胞總數。平均活細胞濃度*：總體積；活細胞總數：C = A×B。
流動式細胞測量術之計算：若活TIL細胞總計數為≥4.0×107
，則計算獲得用於流動式細胞測量術樣本的1.0×107
個細胞的體積。
流動式細胞測量術所需之活細胞總數：1.0×107
個細胞。流動式細胞測量術所需之細胞體積：活細胞濃度除以1.0×107
個細胞A。
計算等於2.0×108
個活細胞的TIL懸浮液之體積。按需要，計算待取出的過量TIL細胞體積，且取出過量TIL並按需要將TIL置於培育箱中。計算按需要取出之過量TIL總量。
將以供冷凍之目標細胞濃度添加至過量TIL細胞的CS-10培養基之計算量為1.0×108
個細胞/毫升。按需要使過量TIL離心。觀測錐形管 並添加CS-10。
填充小瓶。將1.0 mL細胞懸浮液等分至適當大小之冷凍小瓶中。將剩餘體積等分至適當大小之冷凍小瓶中。若體積≤0.5 mL，則將CS10添加至小瓶，直至體積為0.5 mL為止。
樣本之TIL冷凍保存
計算獲得用於冷凍保存之1×107
個細胞所需之細胞體積。取出樣本以進行冷凍保存。將TIL置於培育箱中。
樣本之冷凍保存。
觀測錐形管，且緩慢添加CS-10並記錄添加0.5 mL CS10後的體積。
第11天-飼養細胞
獲得飼養細胞。自LN2冷凍機獲得至少兩個不同批號的3袋飼養細胞。在準備解凍之前將細胞保存於乾冰上。準備水浴或Cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm處解凍飼養細胞約3至5分鐘或直至冰剛好消失為止。自培育箱取出培養基。合併解凍之飼養細胞。將飼養細胞添加至轉移包。將飼養細胞自注射器分配至轉移包中。對合併飼養細胞進行混合，且標記轉移包。
計算轉移包中之飼養細胞懸浮液之總體積。
取出細胞數目計算樣本。針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，使用非必要注入口自飼養細胞懸浮液轉移包抽取4×1.0 mL細胞數目計算樣本。將每個樣本等分至經標記之冷凍小瓶中。進行細胞數目計算，且判定乘數選定方案並輸入乘數。測定進行細胞數目計算之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上部及下限，並確認其在界限內。
調整飼養細胞懸浮液之體積。計算取出細胞數目計算樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。計算活飼養細胞總數。按需要獲得另外的飼養細胞。按需要解凍另外的飼養細胞。將第4飼養細胞袋置於拉鏈袋中，且在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解凍約3至5分鐘並合併另外的飼養細胞。量測體積。量測注射器中飼養細胞之體積並記錄在下面(B)。計算飼養細胞之新的總體積。將飼養細胞添加至轉移包。
按需要製備稀釋液，將4.5 mL AIM-V培養基添加至四個15mL錐形管中。準備計算細胞數目。針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，使用非必要注入口自飼養細胞懸浮液轉移包取出4×1.0 mL細胞數目計算樣本。進行細胞數目計算及演算。根據進行的所有四次數目計算測定平均活細胞濃度。調整飼養細胞懸浮液之體積，且計算取出細胞數目計算樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。飼養細胞總體積減去取出之4.0 mL。計算獲得5×109
個活飼養細胞所需的飼養細胞懸浮液之體積。計算過量飼養細胞體積。計算待取出之過量飼養細胞之體積。取出過量飼養細胞。
使用1.0mL注射器及16G針頭，吸取0.15 mL OKT3並添加OKT3。熱封飼養細胞懸浮液轉移包。
第11天 G-Rex填充及接種
設定G-Rex500MCS。自培育箱取出「完全CM2第11天培養基」並將培養基泵吸至G-Rex500MCS中。將4.5 L培養基泵吸至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶上標示之線處。按需要熱封並使培養瓶保溫。將飼養細胞懸浮液轉移包熔接至G-Rex500MCS。將飼養細胞添加至G-Rex500MCS。熱封。將TIL懸浮液轉移包熔接至培養瓶。將TIL添加至G-Rex500MCS。熱封。將G-Rex500MCS在37.0±2.0℃下保溫，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
計算保溫範圍。進行計算以確定在第16天自培育箱取出G-Rex500MCS的適當時間。下限：保溫時間+108小時。上限：保溫時間+132小時。
第11天 過量TIL冷凍保存
適用：冷凍過量TIL小瓶。確證在冷凍前已設定CRF。進行冷凍保存。將小瓶自速率受控冷凍機轉移至適當儲存件中。完成冷凍後，將小瓶自CRF轉移至適當儲存容器。將小瓶轉移至適當儲存件中。記錄在LN2中的儲存位置。
第16天 培養基製備
預熱AIM-V培養基。針對培養基袋1、2及3計算使培養基升溫的時間。確保所有袋子已升溫12至24小時之持續時間。設定用於上清液之10L Labtainer。使用魯爾接頭將流體泵轉移裝置之較大直徑端附接至10L Labtainer袋之一個凹形端口。設定用於上清液之10L Labtainer並進行標記。設定用於上清液之10L Labtainer。確保在自BSC之前取出前閉合所有夾子。注意：在TIL收集期間使用上清液袋，該TIL收集可與培養基製備並行地進行。
解凍IL-2。每袋CTS AIM V培養基解凍5×1.1 mL IL-2等分試樣(6×106
IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。等分100.0 mL GlutaMax。將IL-2添加至GlutaMax。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。多級Baxa泵。準備調配培養基。將GlutaMax + IL-2泵吸至袋子中。監測之參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。使完全CM4第16天培養基升溫。製備稀釋液。
第16天 REP分瓶
監測培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。自培育箱取出G-Rex500MCS。準備1L轉移包且標記為TIL懸浮液並加權為1 L。
G-Rex500MCS之體積減少。將約4.5 L培養物上清液自G-Rex500MCS轉移至10L Labtainer。
準備用於TIL收集之培養瓶。取出上清液後，閉合通向紅色管線之所有夾子。
起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以使細胞剝離，以確保所有細胞剝落。
TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液轉移包之所有夾子。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確保維持邊緣傾斜，直至收集到所有細胞及培養基為止。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex500MCS上之夾子。熱封含有TIL之轉移包。熱封含有上清液之10L Labtainer。記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算懸浮液體積。準備用於樣本取出之轉移包。自細胞上清液取出測試樣本。
無菌性及BacT測試取樣：自準備的標記有BacT之15mL錐形管取出1.0 mL樣本。取出細胞數目計算樣本。在BSC中，針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包取出4×1.0 mL細胞數目計算樣本。
取出黴漿菌樣本。使用3mL注射器，自TIL懸浮液轉移包取出1.0 mL並置於準備的標記有「黴漿菌稀釋劑」之15mL錐形管中。
準備用於接種之轉移包。將TIL置於培育箱中。自BSC取出細胞懸浮液，且在需要之前置於培育箱中。進行細胞數目計算及演算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至準備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞數目計算樣本進行稀釋，稀釋度為1:10。測定進行細胞數目計算之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度調整稀釋度。根據進行的所有四次數目計算測定平均活細胞濃度。調整TIL懸浮液之體積。計算取出細胞數目計算樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積減去取出以用於測試之5.0 mL。
計算活TIL細胞總數。計算待接種之培養瓶之總數目。注意：待接種的G-Rex500MCS培養瓶之最大數目為五。若計算的待接種培養瓶之數目超過五，則使用可用的所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。
計算用於繼代培養之培養瓶數目。計算除所準備之袋子以外還需要之培養基袋的數目。按計算需要每兩個G-Rex-500M培養瓶準備一個10L「CM4第16天培養基」袋。繼續接種第一GREX-500M培養瓶，同時準備另外的培養基並使其升溫。準備確定的所計算數目之其他培養基袋並使其升溫。填充G-Rex500MCS。準備泵吸培養基並將4.5 L培養基泵吸至G-Rex500MCS中。熱封。重複填充。使培養瓶保溫。計算待添加至新G-Rex500MCS培養瓶中的TIL懸浮液之目標體積。若計算之培養瓶數目超過五，則使用所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。準備用於接種之培養瓶。自培育箱取出G-Rex500MCS。準備用於泵吸之G-Rex500MCS。除較大過濾器管線外，閉合所有夾子。自培育箱取出TIL。製備用於接種之細胞懸浮液。將「TIL懸浮液」轉移包無菌熔接(依據過程註釋5.11)至泵入口管線。將TIL懸浮液袋置於稱上。
用TIL懸浮液接種培養瓶。泵吸所計算體積之TIL懸浮液至培養瓶中。熱封。填充剩餘培養瓶。
監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。使培養瓶保溫。
測定在第22天自培育箱取出G-Rex500MCS的時間範圍。
第22天 洗滌緩衝液製備
準備10L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾接頭將4''血漿轉移裝置附接至10L Labtainer袋。準備10L Labtainer袋。在轉移出BSC之前，閉合所有夾子。注意：為待進行收集之每兩個G-Rex500MCS培養瓶準備一個10L Labtainer袋。將Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，且藉由翻轉泵及操控袋子之位置來自3000mL Origen袋移除空氣。華不過人類白蛋白25%添加至3000mL袋中。獲得最終體積為120.0 mL的人類白蛋白25%。
製備IL-2稀釋劑。使用10mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋上之無針注入口取出5.0 mL LOVO洗滌緩衝液。將LOVO洗滌緩衝液分配至50mL錐形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100mL注射器，自無針注入口吸取70.0 mL LOVO洗滌緩衝液。
解凍IL-2。解凍一份1.1 mL IL-2(6×106
IU/mL)，直至所有冰融化為止。IL-2製備。將50 µL IL-2儲備液(6×106
IU/mL)添加至標記有「IL-2稀釋劑」之50mL錐形管中。
冷凍保存準備。將5個冷凍盒置於2至8℃下，以對其進行預處理，以便用於最終產物冷凍保存。
製備細胞數目計算稀釋液。在BSC中，向4個單獨的15mL錐形管中添加4.5 mL已標記有批號及「用於細胞數目計算稀釋」的AIM-V培養基。準備計算細胞數目。將4個冷凍小瓶標記上小瓶編號(1至4)。將小瓶保存在BSC以供使用。
第22天 TIL收集
監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37±2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。自培育箱取出G-Rex500MCS培養瓶。準備TIL收集袋並進行標記。封閉額外之接頭。體積減少：將約4.5 L上清液自G-Rex500MCS轉移至上清液袋。
準備用於TIL收集之培養瓶。起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以剝離細胞。確保所有細胞剝落。起始TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液收集袋之所有夾子。TIL收集。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000mL收集袋中。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex500MCS上之夾子，並確保閉合所有夾子。將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。閉合所有夾子。熱封。取出4×1.0 mL細胞數目計算樣本。
進行細胞數目計算。利用NC-200進行細胞數目計算及演算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至準備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞數目計算樣本進行稀釋。得到1:10稀釋度。測定進行細胞數目計算之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。測定計數之上限及下限。測定進行細胞數目計算之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。稱量LOVO來源袋。計算活TIL細胞總數。計算成核細胞總數。
製備黴漿菌稀釋劑。經由魯爾樣本口自一個上清液袋取出10.0 mL並置於15mL錐形管中。
LOVO
進行「TIL G-Rex收集」方案並測定最終產物目標體積。裝載一次性套組。取出濾液袋。輸入濾液容量。將濾液容器置於實驗台上。附接PlasmaLyte。確證已附接PlasmaLyte，且觀測到PlasmaLyte正在移動。將來源容器附接至導管，且確證已附接來源容器。確認PlasmaLyte正在移動。
最終調配及填充
目標體積/袋子計算。計算待調配於空白袋中之CS-10及LOVO洗滌緩衝液的體積。準備CRF空白袋。
計算待添加至最終產物的IL-2之體積。所需最終IL-2濃度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作儲備液：6×104
IU/mL。組裝連接設備。將4S-4M60無菌熔接至CC2單元接頭。將CS750冷凍袋無菌熔接(依據過程註釋5.11)至準備之集束上。將CS-10袋熔接至4S-4M60之尖端上。用IL-2製備TIL。使用適當大小之注射器，自「IL-2 6×104
」等分試樣取出所測定量之IL-2。標記經調配TIL袋。將經調配TIL袋添加至設備。添加CS10。切換注射器。將約10 mL空氣吸取至100mL注射器中並替換設備上之60mL注射器。添加CS10。準備CS-750袋。分配細胞。
自最終產物袋移除空氣並獲得保留物。一旦已填充最後一個最終產物袋，即閉合所有夾子。將10 mL空氣吸取至新的100mL注射器中並替換設備上之注射器。
將保留物分配至50mL錐形管中並將管標記為「保留物」及批號。針對每個袋子重複空氣移除步驟。
準備用於冷凍保存之最終產物，包括目視檢查。在冷凍保存之前將冷凍袋保存於降溫包上或2至8℃下。
取出細胞數目計算樣本。使用適當大小之吸液管，取出2.0 mL保留物並置於15mL錐形管中以用於細胞數目計算。進行細胞數目計算及演算。注意：僅將一個樣本稀釋至確證稀釋度足夠的適當稀釋度。將另外的樣本稀釋至適當稀釋因數並繼續進行數目計算。測定進行細胞數目計算之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度調整稀釋度。測定活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。計算IFN-γ。熱封最終產物袋。
依據以下例示性取樣計劃標記並收集樣本。
無菌性及BacT。測試取樣。在BSC中，自使用適當大小之注射器收集的保留細胞懸浮液中取出1.0 mL樣本，並接種厭氧瓶。對好氧瓶重複以上操作。
最終產物冷凍保存
準備速率受控冷凍機。確證已設定CRF。設定CRF探針。將最終產物及樣本置於CRF中。測定要達至4℃±1.5℃所需的時間並繼續進行CRF運行。完成CRF並儲存。完成運行後停止CRF。自CRF取出盒子及小瓶。將盒子及小瓶轉移至氣相LN2進行儲存。記錄儲存位置。
後處理概述
後處理：最終藥品
(第22天)在第22天REP中藉由流動式細胞測量術測定CD3+細胞
(第22天)革蘭氏染色法(GMP)
(第22天)藉由凝膠凝塊LAL分析(Gel Clot LAL Assay)進行細菌內毒素測試(GMP)
(第16天)BacT無菌性分析(GMP)
(第16天)藉由TD-PCR進行黴漿菌DNA偵測(GMP)
可接受的外觀屬性
(第22天)BacT無菌性分析(GMP)(第22天)
(第22天)IFN-γ分析
提供上述實例以為本領域中熟習此項技術者提供如何製得並使用本發明之組成物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且並不意欲限制本發明人定義其發明之範疇。本領域中熟習此項技術者顯而易見的進行本發明之上文所描述模式的修改意欲在以下申請專利範圍之範疇內。本說明書中提及之所有專利及公開案指示本領域中熟習本發明所屬領域者之技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式具限制性。舉例而言，本領域中熟習此項技術者應瞭解根據本文所描述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文中引用之所有參考文獻以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特定且個別地指示出於所有目的以全文引用的方式併入本文中一般。
如本領域中熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本申請案之精神及範疇的情況下對其進行多種修改及改變。本文所描述之特定實施例及實例僅作為實例提供，且本申請案僅受隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍授權之等效物的全部範疇限制。
[圖 1A 至圖 1H
]： A)
顯示2A過程(大約22天過程)與用於TIL製造之PD-1 Gen 3過程實施例(大約14天至22天過程)之間的比較。B)
例示性PD-1 Gen3過程圖，其提供步驟A至F之概述(大約14天至22天過程)。C)
例示性PD-1 Gen3過程圖，其提供步驟A至F之概述(大約14天至22天過程)。D)
提供三種例示性Gen 3過程的圖，其中概述步驟A至F(大約14天或18天過程)的三種過程變化中之每一者。E)
提供三種例示性PD-1 Gen 3過程的圖，其中概述步驟A至F(大約14天或18天過程)的三種過程變化中之每一者。F)
提供例示性PD-1 Gen 3過程的圖，其中概述步驟A至F(大約14天至18天過程)。G)
提供例示性PD-1 Gen 3過程的圖，其中概述步驟A至F(大約14天至18天過程)。H)
提供例示性PD-1 Gen 3過程的圖，其中概述步驟A至F(大約14天至18天過程)。
[圖 2
]：提供GEN 2(2A過程)與PD-1 GEN 3之間的可比較性之實驗流程圖。
[圖 3
]：
顯示各種Gen 2(2A過程)與Gen 3.1過程實施例之間的比較。
[圖 4
]：
描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0過程之實施例之各種特徵的表。
[圖 5
]：Gen 3過程(被稱作Gen 3.1)之實施例之培養基條件的概述。
[圖 6
]：Gen 3過程(16天過程)之例示性實施例之示意圖。
[圖 7
]：在擴增之前進行的PD-1選擇之示意圖。
[圖 8
]：納武單抗與PD-1之結合結構。參見Tan, S.等人(Tan, S.等人，《自然通訊(Nature Communications
)》，
8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369 (2017))中的圖5。
[圖 9
]：帕博利珠單抗
與PD-1的結合結構。參見Tan, S.等人(Tan, S.等人，《自然通訊》，8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369(2017))中的圖5。
[圖 10
]：開發簡化方案以將PD1+ TIL擴增至臨床相關水準。自患者切除腫瘤且將其運送至研究實驗室。到達時，碎解腫瘤，且對單細胞懸浮液進行CD3及PD1染色。使用FX500儀器(索尼(Sony))藉由FACS對PD1+ TIL進行分類。將PD1+細胞級份放入具有抗人類CD3抗體(OKT3；30 ng/ml)之培養瓶中，並以1:100(TIL:飼養細胞)的比率照射同種異體PBMC(飼養細胞)且快速擴增22天(REP)。
[圖 11
]：
腫瘤組織碎解方法之鑑別。
[圖 12
]：腫瘤碎解及PD-1+選擇步驟(包含PD-1 high選擇)之例示性實施例的示意圖。
[圖 13
]：
針對PD1選擇之TIL開發的經修改Gen 2過程之例示性實施例之示意圖。
[圖 14
]：
針對PD1選擇之TIL開發的經修改擴增過程之例示性實施例之示意圖。
[圖 15
]：針對PD1選擇之TIL開發的經修改擴增過程之例示性實施例之示意圖。
[圖 16
]：PD1 TIL培養物之完整規模過程實施例之示意圖。
[圖 17
]：小規模過程實施例：PD1-A為使用此方案中所概述之納武單抗染色程序之條件。PD1-B為使用抗PD1-PE(選殖株號EH12.2H7)染色方法的條件。主體條件用作對照。
[圖 18
]：
PD-1 + Hig Gen 2過程之實施例的概述。
[圖 19
]：
PD-1 + TIL培養過程的例示性實施例(研究/ PD-1 + Gen 2/確定的培養基/早期REP)。
[圖 20
]：
提供結構I-A及I-B，圓柱體係指單個多肽結合域。結構I-A及I-B包括三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB的抗體的TNFRSF結合域，其摺疊形成三價蛋白質，該三價蛋白質接著經由IgG1-Fc(包含CH3和CH2域)與第二三價蛋白質連接，該IgG1-Fc隨後經由雙硫鍵(小長橢圓形)將兩個三價蛋白質連接在一起，從而穩定結構並提供能夠將六個受體之細胞內傳訊域與傳訊蛋白集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體之TNFRSF結合域可為scFv域，其包括例如由連接子連接之VH及VL鏈，該連接子可包括親水性殘基及提供柔性的Gly與Ser序列以及提供溶解性的Glu與Lys。
[圖 21
]：多種癌症類型中PD-1highTIL之鑑定及PD-1選擇之TIL的擴增。
[圖 22
]：
離體擴增之PD-1-選擇的TIL表現出自體腫瘤反應性。
[圖 23
]：
在幾種體外分析中，
離體擴增的PD1 + TIL表現出效應活性。資料表明PD1 +選擇之TIL具有抗原特異性，並且具有更大的效應功能。
[圖 24
]：例示性選擇及擴增方案之示意圖。
[圖 25
]：
顯示CD39 +陽性細胞的表型性質的資料。
[圖 25
]：
顯示CD39 +陽性細胞特性的資料。
[圖 26
]：
資料顯示在PD-1選擇之TIL的腫瘤碎解物中的表型評定結果。
[圖 27
]：
資料顯示在PD-1選擇之TIL的腫瘤碎解物中的表型評定結果。
[圖 28
]：
PD1 +選擇之Gen 2過程概述。
[圖 29
]：
第1階段實驗概述。
[圖 30
]：第2階段完整規模PD1+選擇之Gen 2過程之實驗概述。
[圖 31
]：
顯示實施例7的細胞群體圈選的資料。
[圖 32
]：
顯示實施例7的細胞群體圈選的資料。
[圖 33
]：
兩種示例性PD-1選擇方法的示意圖。
[圖 34
]：
抗PD-1微珠結合及偵測。
[圖 35
]：
當使用抗PD-1(EH12.2H7)進行PD-1 + TIL的磁性選擇時，獲得的資料表明純度＞ 85%。將2e6 REP TIL添加至10 ul混合物(EH12.2H7)+ 5 ul微珠中，在室溫下培育15分鐘，在磁體中於室溫培育1分鐘，使用磁體進行兩次陽性篩選。將分選後的細胞用二級mIgG1-PE、aCD3 FITC染色。
[圖 36
]：
當使用抗PD-1(M1H4)進行PD-1 + TIL的磁性選擇時，獲得的資料表明純度＞ 85%。
[圖 37
]：
實驗設計。兩種例示性實施例的比較：流式分選與磁性分選。
[圖 38
]：使用磁性方法(EH12.2H7)之分選後TVC產量高於流式分選方法。
[圖 39
]：PD-1選擇之TIL之生長特徵、一致性、磁性選擇TIL之功能與流式分選TIL相當。
[圖 40
]：分化、活化及耗竭(CD4+)表型標誌為類似的。
[圖 41
]：分化、活化及耗竭(CD8+)表型標誌為類似的。
[圖 42
]：
磁性分選(EH12.H7)中有＞ 99%的經流式分選的PD-1選擇之TIL的TCR Vbeta選殖株。資料顯示所有測試樣本的獨特CDR3計數及Shannon多樣性指數。
[圖 43
]：
磁性分選(EH12.H7)中有＞ 99%的經流式分選的PD-1選擇之TIL TCR Vbeta選殖株。資料顯示了測試樣本之間重疊的uCDR3樣本。
[圖 44
]：
用CD39進行預選。PD1high
CD39-
大多由CD4 +細胞構成。與未經選擇的TIL相比，PD1high
CD39+
具有顯著減少之CD69含量。當用抗CD3/抗CD28/抗41BB刺激時，與未經選擇及PD-1high
CD39-TIL相比，PD-1high
CD39+
具有顯著減少之IFNγ分泌。在6個可評估的腫瘤中之4個的PD-1high
CD39+
TIL中偵測到了對自體腫瘤有反應的IFNγ分泌(有2個腫瘤未評定)。
Claims (277)
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： (a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體； (b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體； (c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； (d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中添加之APC的數目係步驟(c)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及 (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： f) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體； g) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體； h) 藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； i) 藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及 j) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體。
- 如請求項2之方法，其中在步驟(c)中，該細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(d)中的該培養基中之APC之數目大於步驟(c)中的該培養基中之APC之數目。
- 如請求項2之方法，其中在步驟(c)中，該細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(d)中的該培養基中之APC之數目等於步驟(c)中的該培養基中之APC之數目。
- 如請求項1或2之方法，其中該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high/lo、CD38lo、CD103high/ lo、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： (a) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養經選擇呈PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性之第一TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，該第一TIL群體可藉由腫瘤碎解以處理來自個體之腫瘤樣本且選擇該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL而獲得，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； (b) 藉由使該第二TIL群體與具有另外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL群體的細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中APC的數目係步驟(a)中之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；及 (c) 收集獲自步驟(b)之該治療性TIL群體。
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： (a) 藉由在包括IL-2、OKT-3且視情況包括抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL群體以進行經選擇呈PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性之該第一TIL群體的初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； (b) 藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及 (c) 收集獲自步驟(b)之該治療性TIL群體。
- 如請求項7之方法，其中在步驟(a)中，該細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(b)中的該培養基中之APC之數目大於步驟(a)中的該培養基中之APC之數目。
- 如請求項7之方法，其中在步驟(a)中，該細胞培養基進一步包括抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(b)中的該培養基中之APC之數目等於步驟(a)中的該培養基中之APC之數目。
- 如請求項6或7之方法，其中該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high、CD38lo、CD103high、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(b)之該選擇，或如請求項6或7之方法，其中步驟(a)之該選擇包括選自由以下組成之群組的選擇方法：流動式細胞測量術(包含例如FACS)、基於抗體之珠粒選擇及基於抗體之磁珠選擇。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(b)之該選擇，或如請求項6或7之方法，其中步驟(a)之該選擇包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
- 如請求項1或2或12之方法，其中步驟(b)之該選擇，或如請求項6或7之方法，其中步驟(a)之該選擇包括以下步驟：(i)使該第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中進行PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL之該選擇，直至存在至少1×106 個PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中用於培養該第一TIL群體之該細胞培養基包括2-巰基乙醇。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中用於培養該第二TIL群體之該細胞培養基包括2-巰基乙醇。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中用於培養該第一TIL群體及該第二TIL群體之該細胞培養基包括2-巰基乙醇。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中分別使用抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒選擇該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中分別使用抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合磁珠選擇該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
- 如請求項18或19之方法，其中該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL分別與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合，且該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陰性TIL並未分別與抗PD-1、抗CD39、抗CD38、抗CD103、抗CD101、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合。
- 如請求項13之方法，其中該單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。
- 如請求項21之方法，其中該抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該快速第二擴增中APC之數目與該初始第一擴增中APC之數目的比率選自約1.5:1至約20:1之範圍。
- 如請求項23之方法，其中該比率係選自約1.5:1至約10:1之範圍。
- 如請求項23之方法，其中該比率係選自約2:1至約5:1之範圍。
- 如請求項23之方法，其中該比率係選自約2:1至約3:1之範圍。
- 如請求項23之方法，其中該比率為約2:1。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC之數目係選自約1×108 個APC至約3.5×108 個APC之範圍，且其中該快速第二擴增中APC之數目係選自約3.5×108 個APC至約1×109 個APC之範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC之數目係選自約1.5×108 個APC至約3×108 個APC之範圍，且其中該快速第二擴增中APC之數目係選自約4×108 個APC至約7.5×108 個APC之範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC之數目係選自約2×108 個APC至約2.5×108 個APC之範圍，且其中該快速第二擴增中APC之數目係選自約4.5×108 個APC至約5.5×108 個APC之範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中將約2.5×108 個APC添加至該初始第一擴增且將5×108 個APC添加至該快速第二擴增。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該第二TIL群體中TIL之數目與該第一TIL群體中TIL之數目的比率為約1.5:1至約100:1。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該第二TIL群體中TIL之數目與該第一TIL群體中TIL之數目的比率為約50:1。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該第二TIL群體中TIL之數目與該第一TIL群體中TIL之數目的比率為約25:1。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該第二TIL群體中TIL之數目與該第一TIL群體中TIL之數目的比率為約20:1。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該第二TIL群體中TIL之數目與該第一TIL群體中TIL之數目的比率為約10:1。
- 如請求項31中任一項之方法，其中該第二TIL群體在數目上比該第一TIL群體大至少50倍。
- 如請求項2至37中任一項之方法，其中該方法包括在收集該治療性TIL群體的該步驟之後進行以下另一步驟： 將該經收集之治療性TIL群體轉移至輸注袋。
- 如請求項1至38中任一項之方法，其中該初始第一擴增係在複數個分開容器中進行，在每一分開容器中，該第二TIL群體係獲自該初始第一擴增步驟中的該第一TIL群體，且該第三TIL群體係獲自該快速第二擴增步驟中的該第二TIL群體，且其中獲自該第三TIL群體之該治療性TIL群體係自該複數個容器中之每一者中收集且經合併以產生該經收集之TIL群體。
- 如請求項39之方法，其中該複數個分開的容器包括至少兩個分開的容器。
- 如請求項39之方法，其中該複數個分開的容器包括兩個至二十個分開的容器。
- 如請求項39之方法，其中該複數個分開的容器包括兩個至十個分開的容器。
- 如請求項39之方法，其中該複數個分開的容器包括兩個至五個分開的容器。
- 如請求項39至43中任一項之方法，其中該等分開放入容器中之每一者包括第一透氣表面區域。
- 如請求項1至38中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟係在單一容器中進行。
- 如請求項45之方法，其中該單一容器包括第一透氣表面區域。
- 如請求項45或46之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且該等APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項47之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項48之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項47至49中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項50之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項51之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約4個細胞層之厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項2至46中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之第一容器中進行，且在該快速第二擴增步驟中，該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之第二容器中進行。
- 如請求項53之方法，其中該第二容器大於該第一容器。
- 如請求項53或54之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且該等APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項55之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項55之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項53至57中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之平均厚度層疊至該第二透氣表面區域上。
- 如請求項58之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之平均厚度層疊至該第二透氣表面區域上。
- 如請求項58之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約4個細胞層之平均厚度層疊至該第二透氣表面區域上。
- 如請求項1至52中任一項之方法，其中在各容器中對第一TIL群體進行該初始第一擴增，在同一容器中對自該第一TIL群體產生之該第二TIL群體進行該快速第二擴增。
- 如請求項61之方法，其中各容器包括第一透氣表面區域。
- 如請求項62之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且該等APC係以約一個細胞層至約三個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項63之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項64之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該等APC係以約2個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項62至65中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3個細胞層至約5個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項66之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項67之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該等APC係以約4個細胞層之平均厚度層疊至該第一透氣表面區域上。
- 如請求項1至68中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，在各容器中對第一TIL群體進行該初始第一擴增，該容器包括第一透氣表面區域，該細胞培養基包括抗原呈現細胞(APC)，且該等APC層疊至該第一透氣表面區域上，且其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.1至約1:10之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.2至約1:8之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.3至約1:7之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.4至約1:6之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.5至約1:5之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.6至約1:4之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.7至約1:3.5之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.8至約1:3之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率係選自約1:1.9至約1:2.5之範圍。
- 如請求項69之方法，其中在該初始第一擴增步驟中層疊之APC的平均層數與在該快速第二擴增步驟中層疊之APC的平均層數的比率為約1:2。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中2至3天之後，用另外的IL-2補充該細胞培養基。
- 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存在收集該治療性TIL群體之該步驟中收集之該TIL群體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包括冷凍保存該輸注袋之步驟。
- 如請求項80或81之方法，其中使用1:1比率之經收集之TIL群體與冷凍保存培養基來進行該冷凍保存過程。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項83之方法，其中該等PBMC經照射且為同種異體的。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包括周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基中PBMC的總數為2.5×108 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該細胞培養基中之該等抗原呈現細胞(APC)為周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該快速第二擴增步驟中添加至該細胞培養基中之PBMC的總數為5×108 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在收集該治療性TIL群體之該步驟中，該收集係使用基於膜之細胞處理系統進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)中之該收集係使用LOVO細胞處理系統進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該多個片段包括每容器約60個片段，其中各片段之體積為約27 mm3 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
- 如請求項91之方法，其中該多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該細胞培養基提供於選自由以下組成之群組的容器中：G容器及Xuri細胞袋。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(d)中2至3天之後，用另外的IL-2補充該細胞培養基。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在將該經收集之治療性TIL群體轉移至輸注袋之該步驟中，該輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。
- 如請求項80至82中任一項之方法，其中該冷凍保存培養基包括二甲亞碸(DMSO)。
- 如請求項99之方法，其中該冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟中之該第一時段及該快速第二擴增步驟中之該第二時段各自個別地在5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟中之該第一時段係在5天、6天或7天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟中之該第一時段係在8天、9天、10天或11天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中之該第二時段係在7天、8天或9天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中之該第二時段係在10天或11天之時段內執行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟中之該第一時段及該快速第二擴增步驟中之該第二時段各自個別地在7天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟中之該第一時段及該快速第二擴增步驟中之該第二時段各自個別地在11天之時段內執行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟係在約14天至約16天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟係在約15天至約16天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟係在約14天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟係在約15天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟係在約16天之時段內進行。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存該經收集之治療性TIL群體的步驟，其中該初始第一次擴增步驟至收集該治療性TIL群體之該步驟及冷凍保存步驟係在16天內或少於16天內進行。
- 如請求項1至113中任一項之方法，其中在收集該治療性TIL群體之該步驟中收集的該治療性TIL群體包括足以用於該等TIL之治療有效劑量的TIL。
- 如請求項114之方法，其中足以用於治療有效劑量的TIL之數目為約2.3×1010 至約13.7×1010 。
- 如請求項1至115中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中的該第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
- 如請求項1至115中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中的該第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項1至115中任一項之方法，其中獲自該快速第二擴增步驟中的該第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自在該初始第一擴增步驟中的該第二TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
- 如請求項1至118中任一項之方法，其中將來自收集該治療性TIL群體之該步驟的該治療性TIL群體輸注至患者中。
- 如請求項1或38之方法，其進一步包括使用冷凍保存過程冷凍保存包括該經收集之TIL群體之該輸注袋的步驟。
- 如請求項120之方法，其中使用1:1比率之經收集之TIL群體與冷凍保存培養基來進行該冷凍保存過程。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞為周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項122之方法，其中該等PBMC經照射且為同種異體的。
- 如請求項1至121中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該收集步驟係使用基於膜之細胞處理系統進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該收集步驟係使用LOVO細胞處理系統進行。
- 如請求項1或2之方法，其中該多個片段包括約60個片段，且其中各片段之體積為約27 mm3 。
- 如請求項1或2之方法，其中該多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
- 如請求項128之方法，其中該多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
- 如請求項1或2之方法，其中該多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該細胞培養基提供於選自由以下組成之群組的容器中：G容器及Xuri細胞袋。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(d)中之該輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。
- 如請求項121之方法，其中該冷凍保存培養基包括二甲亞碸(DMSO)。
- 如請求項135之方法，其中其中該冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(c)中之該第一時段及該第二時段各自個別地在5天、6天或7天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該第一時段係在5天、6天或7天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該第二時段係在10天或11天之時段內執行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該第一時段及該第二時段各自個別地在7天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約22天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約21天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約20天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約19天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約18天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約17天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天至約16天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約15天至約16天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約14天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約15天之時段內進行。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中所有步驟係在約16天之時段內進行。
- 如請求項151之方法，其中所有步驟及冷凍保存均在16天或少於16天內進行。
- 如請求項1至152中任一項之方法，其中經收集之該治療性TIL群體包括足以用於該等TIL之治療有效劑量的TIL。
- 如請求項153之方法，其中足以用於治療有效劑量的TIL之數目為約2.3×1010 至約13.7×1010 。
- 如請求項1至154中任一項之方法，該初始第一擴增步驟中之該容器大於該快速第二擴增步驟中之該容器。
- 如請求項1至155中任一項之方法，其中該第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
- 如請求項1至156中任一項之方法，其中該第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項1至157中任一項之方法，其中獲自該第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加之CD8及CD28表現。
- 如請求項1至158中任一項之方法，其中將該等經收集之TIL輸注至患者中。
- 一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包括投予經擴增之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)，該方法包括： (a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體； (b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體； (c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天，以獲得該第二TIL群體； (d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中添加至該快速第二擴增之APC的數目係步驟(b)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行； (e) 收集獲自步驟(c)之該治療性TIL群體； (f) 將來自步驟(d)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋；及 (g) 向該個體投予治療有效劑量之來自步驟(e)之該等TIL。
- 如請求項160之方法，其中在步驟(g)中足以用於投予治療有效劑量之TIL的數目為約2.3×1010 至約13.7×1010 。
- 如請求項160或161之方法，其中該等PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、CD39high、CD38lo、CD103high/lo、CD101lo、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
- 如請求項160至162中任一項之方法，其中步驟(b)之該選擇包括以下步驟：(i)使該第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合，(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及(iii)進行基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。
- 如請求項163之方法，其中該單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。
- 如請求項164之方法，其中該抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株HP6023選殖株。
- 如請求項165之方法，其中該等抗原呈現細胞(APC)為PBMC。
- 如請求項160至166中任一項之方法，其中在步驟(g)中投予治療有效劑量之TIL細胞之前，已向該個體投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
- 如請求項167之方法，其中該非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投予環磷醯胺兩天，然後以25毫克/平方公尺/天之劑量投予氟達拉濱五天。
- 如請求項160至168中任一項之方法，其進一步包括以下步驟：始於步驟(g)中向該個體投予該等TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療該患者。
- 如請求項169之方法，其中該高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注投予600,000或720,000 IU/kg直至耐受為止。
- 如請求項160至170中任一項之方法，其中步驟(c)中之該第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
- 如請求項160至171中任一項之方法，其中步驟(d)中之該第三TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中獲自該第三TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二TIL群體之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加之CD8及CD28表現。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為黑色素瘤。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為HNSCC。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為子宮頸癌。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為NSCLC。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為胃腸癌。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為高突變癌症。
- 如請求項160至172中任一項之方法，其中該癌症為小兒高突變癌症。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該初始第一擴增在第一容器中進行且該快速第二擴增在第二容器中進行，且其中該第一容器及該第二容器中之每一者為GREX-10。
- 如請求項1至184中任一項之方法，其中該初始第一擴增在第一密閉容器中進行且該快速第二擴增在第二密閉容器中進行，且其中該第一密閉容器及該第二密閉容器中之每一者包括GREX-100。
- 如請求項1至184中任一項之方法，其中該初始第一擴增在第一密閉容器中進行且該快速第二擴增在第二密閉容器中進行，且其中該第一密閉容器及該第二密閉容器中之每一者包括GREX-500。
- 如請求項160至183中任一項之方法，其中該個體先前已用抗PD-1抗體治療。
- 如請求項160至183中任一項之方法，其中該個體先前未經抗PD-1抗體治療。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中藉由使該第一TIL群體與抗PD-1抗體接觸形成該抗PD-1抗體與該第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的該第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟。
- 如請求項189之方法，其中該抗PD-1抗體包括Fc區，其中在形成該第一複合物之該步驟之後且在分離該第一複合物之該步驟之前，該方法進一步包括以下步驟：使該第一複合物與結合至該抗PD-1抗體之該Fc區的抗Fc抗體接觸形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中分離該第一複合物之該步驟係藉由分離該第二複合物進行。
- 如請求項189或190之方法，其中該抗PD-1抗體係選自由以下組成之群組：EH12.2H7、PD1.3.1、SYM021、M1H4、A17188B、納武單抗(BMS-936558，百時美施貴寶；Opdivo®)、帕博利珠單抗(蘭立珠單抗、MK03475或MK-3475，默克公司；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人源化抗PD-1抗體JS001(上海君實)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(百濟神州)，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(上海恆瑞)、人類單株抗體REGN2810(再生元)、人類單株抗體MDX-1106(百時美施貴寶)、人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(諾華公司)及RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell目錄號BP0146。
- 如請求項189或190之方法，其中該抗PD-1抗體為EH12.2H7。
- 如請求項189或190之方法，其中該抗PD-1抗體與納武單抗或帕博利珠單抗結合至不同抗原決定基。
- 如請求項189或190之方法，其中該抗PD-1抗體與EH12.2H7或納武單抗結合至同一抗原決定基。
- 如請求項189或190之方法，其中該抗PD-1抗體為納武單抗。
- 如請求項160至183中任一項之方法，其中該個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由使該第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的該第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟，且其中該第二抗PD-1抗體沒有被該第一TIL群體上未經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL群體的結合。
- 如請求項160至183中任一項之方法，其中該個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由使該第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL群體中之TIL細胞的第一複合物且隨後分離該第一複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體，對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的該第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟，且其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL群體上未經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL群體的結合。
- 如請求項196或197之方法，其中該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包括Fc區，其中在形成該第一複合物之該步驟之後且在分離該第一複合物之該步驟之前，該方法進一步包括以下步驟：使該第一複合物與結合至該第一抗PD-1抗體之該Fc區及該第二抗PD-1抗體之該Fc區的抗Fc抗體接觸形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中分離該第一複合物之該步驟係藉由分離該第二複合物進行。
- 如請求項160至183中任一項之方法，其中該個體先前已用第一抗PD1抗體治療，其中藉由以下對為PD-1陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟：(i)使該第一TIL群體與第二抗PD-1抗體接觸形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL群體的第一複合物，其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL群體上未經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該等PD-1陽性TIL的結合，其中該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包括Fc區；(ii)使該第一複合物與結合至該第二抗PD-1抗體之該Fc區的抗Fc抗體接觸形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物且使該第一TIL群體上未經溶解之該第一抗PD-1抗體與該抗Fc抗體接觸形成該抗Fc抗體與該第一TIL群體上未經溶解之該第一抗PD-1抗體的第三複合物；及(iii)分離該第二複合物及該第三複合物以獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體。
- 一種由選自獲自患者之腫瘤組織樣本碎解物的PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性細胞製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)群體，其中該治療性TIL群體提供增加之功效及/或增加之干擾素-γ產生。
- 如請求項200之治療性TIL群體，其提供增加之干擾素-γ產生。
- 如請求項200或請求項201之治療性TIL群體，其提供增加之功效。
- 如請求項200至202中任一項之治療性TIL群體，其中該治療性TIL群體相較於藉由長於16天之過程製備之TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
- 如請求項200至203中任一項之治療性TIL群體，其中該治療性TIL群體相較於藉由長於16天至22天之過程製備之TIL能夠產生至少多於一倍的干擾素-γ。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中對為其中至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL所選擇或富集的第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中藉由以下步驟對為PD-1陽性TIL所選擇或富集之第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟： (i)使該第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合， (ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，及 (iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的該第一TIL群體中該等PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在該PBMC群體中的強度的比較，獲得為PD-1陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體。
- 如請求項206之方法，其中該第一TIL群體及該PBMC群體兩者中之螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1中間TIL及PD-1陽性TIL的低、中及高強度水準。
- 如請求項207之方法，其中該等FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中為PD-1陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體的至少80%為PD-1陽性TIL，為LAG3陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體的至少80%為LAG3陽性TIL，為TIM3陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體的至少80%為TIM3陽性TIL，及/或為TIGIT陽性TIL所選擇或富集之該第一TIL群體的至少80%為TIGIT陽性TIL。
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： (a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體； (b) 自(a)中之第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體，其中至少10%至80%之範圍的第一TIL群體為PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL； (c) 藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體以進行初始第一擴增從而產生第二TIL群體，其中該初始第一擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一擴增進行約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； (d) 藉由用另外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL群體的該細胞培養基以進行快速第二擴增從而產生第三TIL群體，其中在該快速第二擴增中添加之APC的數目係步驟(c)中添加之APC的數目的至少兩倍，其中該快速第二擴增進行約1天至11天之第二時段以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該快速第二擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及 (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
- 如請求項211之方法，其中步驟(b)之該選擇包括以下步驟： (i)使該第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合， (ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體， (iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的該第一TIL群體中該等PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在該PBMC群體中的強度的比較，獲得富含PD-1之TIL群體。
- 如請求項212之方法，其中該第一群體及該PBMC群體兩者中螢光團之強度係用於設定FACS圈選以建立低、中及高強度水準： i)分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1低TIL、PD-1中間TIL及PD-1陽性TIL； ii)分別對應於CD39陰性TIL、CD39低TIL、CD39中間TIL及CD39陽性TIL； iii)分別對應於CD38陰性TIL、CD38低TIL、CD38中間TIL及CD38陽性TIL； iv)分別對應於CD103陰性TIL、CD103低TIL、CD103中間TIL及CD103陽性TIL； v)分別對應於CD101陰性TIL、CD101低TIL、CD101中間TIL及CD101陽性TIL； vi)分別對應於LAG3陰性TIL、LAG3低TIL、LAG3中間TIL及LAG3陽性TIL； vii)分別對應於TIM3陰性TIL、TIM3低TIL、TIM3中間TIL及TIM3陽性TIL；及/或 viii)分別對應於TIGIT陰性TIL、TIGIT低TIL、TIGIT中間TIL及TIGIT陽性TIL。
- 如請求項211至213中任一項之方法，其中該等FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
- 如請求項211至214中任一項之方法，其中該等PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL為PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh TIL。
- 如請求項211至215中任一項之方法，其中該富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體的至少80%為PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL。
- 如請求項211至216中任一項之方法，其中該第三TIL群體在該容器中包括至少約1×108 個TIL。
- 如請求項211至217中任一項之方法，其中該第三TIL群體在該容器中包括至少約1×109 個TIL。
- 如請求項211至218中任一項之方法，其中該初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約1×104 至約1×106 。
- 如請求項211至219中任一項之方法，其中該初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約5×104 至約1×106 。
- 如請求項211至220中任一項之方法，其中該初始第一擴增中富含PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL的數目為約2×105 至約1×106 。
- 如請求項211至221中任一項之方法，其進一步包括在進行步驟(a)之前冷凍保存來自該個體所切除之該腫瘤之該第一TIL群體的步驟。
- 一種用於將腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體的方法，其包括： (a) 藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體； (b) 自(a)中之該第一TIL群體選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL以獲得富含PD-1、CD39、CD38、CD103、CD101、LAG3、TIM3及/或TIGIT之TIL群體； (c) 藉由在包括第一細胞培養基、IL-2及以下中任一者之第一TIL細胞培養物中培養該第一TIL群體來進行初始第一擴增： i)獲自抗原呈現飼養細胞(APC)之第一培養物之第一培養物上清液，其中該第一培養物上清液包括OKT-3，或 ii)APC及OKT-3， 其中藉由在包括第一透氣表面區域之第一容器中培養該第一TIL細胞培養物持續約1天至7天、8天、9天、10天或11天之第一時段來進行該初始第一擴增，以獲得第二TIL群體，且其中該第二TIL群體於數目上大於該第一TIL群體； (d) 藉由將該第一TIL細胞培養物轉移至包括補充有第二細胞培養基、IL-2及以下中任一者之第二透氣表面區域之第二容器中來進行快速第二擴增： i)獲自APC之第二培養物之第二培養物上清液，其中該第二培養物上清液包括OKT-3，或 ii)APC及OKT-3； 以形成第二TIL細胞培養物，其中藉由培養該第二TIL細胞培養物持續約1天至11天之第二時段來進行該快速第二擴增，以獲得第三TIL群體，且其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；其中該第一TIL細胞培養物不包括該第一培養物上清液及APC兩者；其中該第二TIL細胞培養物不包括該第二培養物上清液及補充APC兩者； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL群體；及 (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL群體轉移至輸注袋。
- 如請求項223之用於擴增TIL之方法，其中在步驟(c)之該初始第一擴增中，該第一TIL細胞培養物包括該第一培養物上清液，且其中在步驟(d)之該快速第二擴增中，用OKT-3及APC補充該第一TIL細胞培養物以形成該第二TIL細胞培養物。
- 如請求項223或224之用於擴增TIL之方法，其中在步驟(c)之該初始第一擴增中，該第一TIL細胞培養物包括OKT-3及APC，且其中在步驟(d)之該快速第二擴增中，用該第二培養物上清液補充該第一TIL細胞培養物以形成該第二TIL細胞培養物。
- 如請求項223至225之用於擴增TIL之方法，其中在步驟(c)之該初始第一擴增中，該第一TIL細胞培養物包括該第一培養物上清液，且其中在步驟(d)之該快速第二擴增中，用該第二培養物上清液補充該第一TIL細胞培養物以形成該第二TIL細胞培養物。
- 如請求項223至226之用於擴增TIL之方法，其中獲得用於步驟(c)中之該第一培養物上清液包括： 1)提供包括IL-2及OKT-3之APC細胞培養基； 2)在來自1)之該APC細胞培養基中培養至少約5×108 個APC持續約3至4天，以產生該第一培養物上清液；及 3)自2)中的該細胞培養物收集該第一培養物上清液。
- 如請求項223至227之用於擴增TIL之方法，其中獲得用於步驟(d)中之該第二培養物上清液包括： 1)提供包括IL-2及OKT-3之APC細胞培養基； 2)在來自1)的該APC細胞培養基中培養至少約1×107 個APC持續約3至4天，以產生該第二培養物上清液；及 3)自2)中的該細胞培養物收集該第二培養物上清液。
- 如請求項223至228之方法，其中步驟(d)之該快速第二擴增進一步包括以下步驟： i)在步驟(d)中該第二時段開始之後約3或4天，用另外的IL-2補充該第二TIL細胞培養物。
- 如請求項223至229之方法，其中該等APC對於該個體為外源性的。
- 如請求項223至230之方法，其中該等APC為周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項223至231之方法，其中步驟(d)之該快速第二擴增進一步包括以下步驟： i)在該第二時段開始之後約3或4天，將該第二TIL細胞培養物自該第二容器轉移至複數個第三容器中，以在該複數個第三容器中之每一者中形成該第二TIL細胞培養物的繼代培養物；及 ii)在該第二時段之剩餘時間中，在該複數個第三容器中之每一者中培養該第二TIL細胞培養物之該繼代培養物。
- 如請求項232之方法，其中在步驟i)中，將等體積之該第二TIL細胞培養物轉移至該複數個第三容器中。
- 如請求項232或233之方法，其中該等第三容器中之每一者的大小與該第二容器相等。
- 如請求項232或233之方法，其中該等第三容器中之每一者大於該第二容器。
- 如請求項232至235之方法，其中該等第三容器之大小相等。
- 如請求項236之方法，其中該等第三容器大於該第二容器。
- 如請求項232或233之方法，其中該等第三容器小於該第二容器。
- 如請求項223至238之方法，其中該第二容器為G-Rex 100M培養瓶。
- 如請求項239之方法，其中該第二容器為G-Rex 100M培養瓶且該複數個第三容器中之每一者為G-Rex 100M培養瓶。
- 如請求項240之方法，其中該複數個第三容器係選自由以下組成之群組：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20個第二容器。
- 如請求項240之方法，其中該複數個第二容器為2個第三容器。
- 如請求項240之方法，其中在步驟ii)之前，該方法進一步包括用另外的IL-2補充該第二TIL細胞培養物之各繼代培養物。
- 如請求項240之方法，其中在步驟ii)之前，該方法進一步包括用第二細胞培養基及IL-2補充該第二TIL細胞培養物之各繼代培養物。
- 如請求項223至244中任一項之方法，其中該第一細胞培養基與該第二細胞培養基相同。
- 如請求項223至244中任一項之方法，其中該第一細胞培養基與該第二細胞培養基不同。
- 如請求項223至244中任一項之方法，其中該第一細胞培養基為DM1且該第二細胞培養基為DM2。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)、CD38陽性(CD38+)及CD101陽性(CD101+)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1high、LAG3high、CD38lo及CD101lo。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD38陽性(CD38+)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1high、LAG3high及CD38lo。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)、LAG3陽性(LAG3+陽性)及CD101陽性(CD101+)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1high、LAG3high及CD101lo。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)及CD38陽性(CD38+)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1hi及CD38lo。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1陽性(PD-1+)及CD101陽性(CD101+)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該等TIL經選擇為PD-1high及CD101lo。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該選擇包括選自由以下組成之群組的選擇方法：流動式細胞測量術(包含例如FACS)、基於抗體之珠粒選擇及基於抗體之磁珠選擇。
- 如請求項258之方法，其中該選擇方法包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
- 如請求項258之方法，其中該等選擇方法包括基於抗體之珠粒選擇。
- 如請求項258之方法，其中該選擇包括基於抗體之磁珠選擇。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該選擇包括兩步選擇，其包括： i)第一選擇步驟，其包括針對PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+進行選擇之方法，及 ii)第二選擇步驟，其包括針對CD38+及/或CD101+進行選擇之方法。
- 如請求項262之方法，其中該第一選擇步驟包括針對PD-1high、LAG3high、TIM3high及/或TIGIThigh進行選擇之方法。
- 如請求項262之方法，其中該第一選擇步驟包括針對PD-1high或LAG3high進行選擇之方法。
- 如請求項263或264之方法，其中該第二選擇步驟包括針對CD38lo及/或CD101lo進行選擇之方法。
- 如請求項262至265之方法，其中該第一選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)，且其中該第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
- 如請求項262至265之方法，其中該第一選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇，且其中該第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
- 如請求項262至265之方法，其中該第一選擇步驟包括基於抗體之磁珠選擇，且其中該第二選擇步驟包括流動式細胞測量術(包含例如FACS)。
- 如請求項262至265之方法，其中該第一選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇或基於抗體之磁珠選擇，且該第二選擇步驟包括基於抗體之珠粒選擇或基於抗體之磁珠選擇。
- 如請求項269之方法，其中用於PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL之該基於抗體之珠粒選擇的該等珠粒分別為抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒。
- 如請求項269或270之方法，其中用於CD38+或CD101+ TIL之該基於抗體之珠粒選擇的該等珠粒分別為抗CD38或抗CD101抗體結合珠粒。
- 如請求項269至271之方法，其中用於PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL之該基於抗體之磁珠選擇的該等珠粒分別為抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合磁珠。
- 如請求項269至272之方法，其中用於CD38+或CD101+ TIL之該基於抗體之磁珠選擇的該等珠粒分別為抗CD38或抗CD101抗體結合磁珠。
- 如請求項269至273之方法，其中該等PD-1+、LAG3+、TIM3+及/或TIGIT+ TIL分別與抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合，且該等PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陰性TIL並未分別與抗PD-1、抗LAG3、抗TIM3及/或抗TIGIT抗體結合珠粒結合。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中對自獲自患者或個體之腫瘤樣本碎解物選擇或富集的第一TIL群體進行該初始第一擴增步驟。
- 如請求項275之方法，其中用酶混合物進行碎解。
- 如請求項276之方法，其中該酶混合物包括中性蛋白酶、膠原蛋白酶及DNA酶。
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