TW201938177A - 產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法 - Google Patents

產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201938177A
TW201938177A TW108100760A TW108100760A TW201938177A TW 201938177 A TW201938177 A TW 201938177A TW 108100760 A TW108100760 A TW 108100760A TW 108100760 A TW108100760 A TW 108100760A TW 201938177 A TW201938177 A TW 201938177A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
til
rna
til population
days
population
Prior art date
Application number
TW108100760A
Other languages
English (en)
Inventor
賽西爾 夏提爾科陶德
克里 理堤皮海
Original Assignee
美商艾歐凡斯生物治療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商艾歐凡斯生物治療公司 filed Critical 美商艾歐凡斯生物治療公司
Publication of TW201938177A publication Critical patent/TW201938177A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明提供用於重新編程TIL以製備具有增加的治療療效之TIL治療性族群之經改良及/或經縮短的過程及方法。該等經重新編程的TIL用於治療性治療方案(regimen)。

Description

產生富含腫瘤抗原特異性Ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ＴＩＬ）產物之方法
本發明係關於產生富含腫瘤抗原特異性Ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)產物之方法。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤淋巴球(TIL)治療大體積、難治性癌症對於預後不良患者代表一種強大的治療方案。Gattinoni,et al. ,Nat. Rev. Immunol. 2006,6, 383-393。成功免疫療法需要大量的TIL，而商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增的技術、後勤及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2的TIL擴增然後「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al. ,Science 2002,298, 850-54; Dudley,et al. ,J. Clin.Oncol. 2005,23, 2346-57; Dudley,et al. ,J. Clin.Oncol. 2008,26, 5233-39; Riddell,et al. ,Science 1992,257, 238-41; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003,26, 332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如 ，200倍)的經照射(irradiated)的通常來自多個供體之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量的IL-2。Dudley,et al., J. Immunother. 2003,26, 332-42。經歷REP程序的TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼性細胞療法。
有提供更強效或更有效的TIL製造過程及基於該等過程之療法的迫切需求，該等過程適用於商業規模製造且經法規核准用於多個臨床中心的人患者。本發明藉由提供用於重新編程TIL以製備具有增加的治療療效之TIL治療性族群之暫時性基因改變過程來符合此需求。
本發明提供用於擴增TIL及產生治療性TIL族群的經改良及/或經縮短的方法。
本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(i)自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；(ii)藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(iv)使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在一些實施態樣中，方法進一步包含使第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生。
在一些實施態樣中，方法進一步包含藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充第三TIL族群之細胞培養基來在步驟(iv)之前或之後執行額外第二擴增，其中額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中較大的治療性TIL族群展現腫瘤抗原特異性T細胞數量的改變。
在一些實施態樣中，方法進一步包含使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施態樣中，冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存介質執行。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，PBMC經照射且為同種異體。在一些實施態樣中，PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至細胞培養。在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，步驟(e)之收集係使用基於膜之細胞處理系統執行。
在一些實施態樣中，步驟(e)之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在一些實施態樣中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
在一些實施態樣中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施態樣中，細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，步驟(d)之細胞培養基進一步包含IL-15及/或IL-21。
在一些實施態樣中，IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施態樣中，IL-15濃度係約500 IU/mL至約100 IU/mL。
在一些實施態樣中，IL-21濃度係約20 IU/mL至約0.5 IU/mL。
在一些實施態樣中，步驟(f)之輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，冷凍保存介質包含二甲亞碸(DMSO)。在一些實施態樣中，冷凍保存介質包含7%至10%二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施態樣中，步驟(c)之第一期間及步驟(e)之第二期間各自個別地於一段10天、11天或12天的期間內執行。
在一些實施態樣中，步驟(c)之第一期間及步驟(e)之第二期間各自個別地於一段11天的期間內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約20天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約15天至約20天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約20天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約15天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在20天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在15天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在10天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(e)所收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率增加。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係於步驟(d)之第二期間添加至TIL而無需打開系統。
在一些實施態樣中，當投予至個體時，步驟(d)之第三TIL族群提供至少五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統減少。
在一些實施態樣中，來自步驟(f)或(g)之TIL係輸注至患者。
在一些實施態樣中，多個片段包含約4個片段。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之方法，方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存；及
(i) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該患者。
在一些實施態樣中，步驟(f)所收集之治療性TIL族群包含對步驟(h)之投予治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在一些實施態樣中，對步驟(h)之投予治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施態樣中，PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至細胞培養。
在一些實施態樣中，在步驟(h)之投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向患者投予非骨髓清除式淋巴球耗盡方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)。
在一些實施態樣中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
在一些實施態樣中，方法進一步包含始於步驟(h)之向患者投予TIL細胞之後當天使用高劑量IL-2方案(regimen)治療患者的步驟。
在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施態樣中，癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌及NSCLC所組成之群組。
在一些實施態樣中，癌症係黑色素瘤。
在一些實施態樣中，癌症係HNSCC。
在一些實施態樣中，癌症係子宮頸癌。
在一些實施態樣中，癌症係NSCLC。
本發明亦提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 將自患者所切除的腫瘤之經處理的腫瘤片段添加至密閉系統以獲得第一TIL族群；
(b) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(a)轉變至步驟(b)無需打開該系統而發生；
(c) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；及
(e) 將得自步驟(d)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(d)轉移至步驟(e)無需打開該系統而發生。
在一些實施態樣中，步驟(d)所收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施態樣中，方法進一步包含使用冷凍保存過程將包含經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施態樣中，冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存介質執行。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，PBMC經照射且為同種異體。
如請求項68之方法，其中該PBMC係於步驟(e)之第9至14天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施態樣中，步驟(d)之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在一些實施態樣中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
在一些實施態樣中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施態樣中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施態樣中，第二細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，步驟(e)之輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施態樣中，步驟(b)之第一期間及步驟(c)之第二期間各自個別地於一段10天、11天或12天的期間內執行。
在一些實施態樣中，步驟(b)之第一期間及步驟(c)之第二期間各自個別地於一段11天的期間內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約20天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約15天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(e)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率增加。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係於步驟(c)之第二期間添加至TIL而無需打開系統。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統減少。
在一些實施態樣中，來自步驟(e)之TIL係輸注至患者。
在一些實施態樣中，密閉容器包含單一生物反應器。
在一些實施態樣中，密閉容器包含G-REX-10。
在一些實施態樣中，密閉容器包含G-REX-100。
在一些實施態樣中，在步驟(d)中，抗原呈現細胞(APC)係以25:1至100:1之APC:TIL比例添加至第二TIL族群之細胞培養。
在一些實施態樣中，細胞培養具有2.5×109 個APC對100×106 個TIL之比例。
在一些實施態樣中，在步驟(c)中，抗原呈現細胞(APC)係以25:1至100:1之APC:TIL比例添加至第二TIL族群之細胞培養。
在一些實施態樣中，細胞培養具有2.5×109 個APC對100×106 個TIL之比例。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之經擴增的TIL族群，其中經擴增的TIL族群係可藉由方法獲得之第三TIL族群，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及
(h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存。
在一些實施態樣中，TIL族群係用於根據以上及本文所述之方法治療癌症個體，其中方法進一步包含一或多個以上及本文所引述之特徵。
本發明亦提供用於判定TIL存活性之測定方法。本揭露提供藉由擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成為較大TIL族群而用於測定TIL存活性之方法，其包含：
(i)獲得先前已擴增之第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；及
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，且其中進一步測定該第三TIL族群存活性。
在一些實施態樣中，方法進一步包含：
(iv)藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之細胞培養基來執行額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的TIL族群，且其中進一步測定該第三族群存活性。
在一些實施態樣中，在步驟(i)之前，細胞係經冷凍保存。
在一些實施態樣中，細胞在執行步驟(i)之前解凍。
在一些實施態樣中，重複步驟(iv)一至四次以獲得足夠的TIL以供分析。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約40天至約50天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約42天至約48天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約42天至約45天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約44天之內執行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(iv)之細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，PBMC係於步驟(iii)之第9至17天中任一天添加至細胞培養。
在一些實施態樣中，APC係人工APC (aAPC)。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼高親和性T細胞受體之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟，該嵌合抗原受體包含與T細胞傳訊分子之至少一個胞內域融合之單鏈可變片段抗體。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後及在步驟(iv)後測定TIL存活性。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含使TIL暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子以產生治療性TIL族群，其中TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變導致誘導蛋白質表現。
在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變導致減少蛋白質表現。
在一些實施態樣中，採用一或多種sd-RNA以減少暫時性蛋白質表現。
本發明亦提供一種用於評估轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子之方法，其中方法包含擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群、使TIL暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子以產生治療性TIL族群，其中TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及cAMP蛋白質激酶A (PKA)。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 使該第一TIL族群與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(e) 視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(f) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(h) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生；
(i) 收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 使該第一TIL族群與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(e) 視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(f) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(h) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生；
(i) 收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(e)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些實施態樣中，sd-RNA在第一擴增期間係以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至第一細胞族群。
在一些實施態樣中，sd-RNA在第一擴增期間係以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至第二細胞族群。
在一些實施態樣中，添加二種sd-RNA以用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的二種分子表現。
在一些實施態樣中，添加二種sd-RNA以用於抑制二種分子表現，其中二種分子係選自由下列所組成之群組：
i. PD-1及LAG-3，
ii. PD-1及TIM-3，
iii. PD-1及CISH，
iv. PD-1及CBLB，
v. LAG-3及TIM-3，
vi. LAG-3及CISH，
vii. LAG-3及CBLB，
viii. TIM-3及CISH，
ix. TIM-3及CBLB，及
x. CISH及CBLB。
在一些實施態樣中，添加超過二種sd-RNA以用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的超過二種分子表現。
在一些實施態樣中，選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的至少一種分子之表現在與至少一種sd-RNA接觸的TIL中係減少至少80%、85%、90%或95%。
在一些實施態樣中，選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的至少一種分子之表現在與至少一種sd-RNA接觸的TIL中係減少至少80%、85%、90%或95%達至少12小時、至少24小時或至少48小時。
I.介紹
利用快速擴增規程(REP)離體(ex vivo )培養之TIL的過繼性細胞療法已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的REP規程對於將被輸注至患者的TIL之健康少有深入了解。T細胞從它們的初始狀態(naïve)到效應T細胞的成熟過程期間經歷重大代謝偏移(見Chang,et al. ,Nat. Immunol. 2016,17, 364，特此明白將全文併入，且特別是關於厭氧及有氧代謝之標誌的討論)。例如，初始T細胞依賴粒線體呼吸來產生ATP，然而成熟、健康的效應T細胞諸如TIL具有高度醣解性，依賴有氧醣解作用來提供它們增生、遷移、活化及抗腫瘤療效所需的生物能基質。
目前的TIL製造過程受限於長度、成本、無菌性考量及其他本文所述之因子使得將該等過程商業化之潛力嚴重受限，且由於這些和其他原因，在目前尚無可用的商業過程。本發明提供採用暫時性蛋白質表現改變方法之TIL製造過程及基於該等過程之療法，該等過程適用於商業規模製造且經法規核准用於多個臨床中心的人患者。本發明提供用於重新編程TIL以製備具有增加的治療療效之TIL治療性族群之暫時性基因改變過程。
II.定義
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬領域之技藝人士所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案係以參照方式被整體納入。
用語「體內(in vivo )」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「體外(in vitro )」係指發生在個體身體以外的事件。體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「離體(ex vivo )」係指涉及在從個體身體移除之細胞、組織及/或器官上所進行處理或執行程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療的方法回到個體體內。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤淋巴球(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球的一細胞族群，這些細胞離開個體的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL (bulk TIL)及擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞族群可包括基因修飾的TIL。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106 至1×1010 ，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108 個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109 至1.5×1010 個用於輸注的細胞族群。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的冷凍保存TIL (thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL族群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至患者的溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
用語「冷凍保存介質」係指任何可用於冷凍保存細胞的介質。該等介質可包括包含7%至10% DMSO的介質。例示性介質包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及其組合。用語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷凍保存介質。CS10介質可以其商品名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10介質是不含血清、不含動物組分的包含DMSO之介質。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人中為CD45R0+且組成性表現CCR7(CCR7hi )及CD62L(CD62hi )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞」係指人或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo )且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至患者為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。較佳地，周邊血液單核細胞係經照射的同種異體周邊血液單核細胞。PBMC是一種抗原呈現細胞。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人、人源化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人、人源化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3(30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如Nelson,J. Immunol. 2004,172, 3983-88及Malek,Annu.Rev. Immunol. 2008,26, 453-79，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人IL-2)係非糖基化人重組形式的IL-2，分子量為大約15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214(可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)幫手T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir. Res. 2001,2, 66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1 。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall,Blood 2002,99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001,97, 14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard,Nat. Rev. Drug.Disc. 2014,13, 379-95，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及活化的人CD4+ T細胞產生。重組人IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及患者(個體)病況差異判定。通常說明本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴球(例如繼代TIL或基因修飾的細胞毒性淋巴球)的醫藥組成物可以104 至1011 細胞/kg體重(例如105 至106 、105 至1010 、105 至1011 、106 至1010 、106 至1011 、107 至1011 、107 至1010 、108 至1011 、108 至1010 、109 至1011 或109 至1010 細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴球(在一些情況下包括基因修飾的細胞毒性淋巴球)組成物亦可以這些劑量投予多次。腫瘤浸潤性淋巴球(在一些情況下包括基因的)可使用在免疫療法中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。對特定患者而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測患者的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴球(MIL)。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz,et al., Cancer Res., 2012,72, 2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
在一實施態樣中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一些實施態樣中，可提供rTIL族群，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴球耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施態樣在導入本發明之rTIL之前，對患者進行淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施態樣中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於個體中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二或更多種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(體外或體內)或所欲治療之個體及疾病病況(例如個體的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展或進展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二或更多個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施態樣中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考抗體的胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
在本文中的「腫瘤浸潤淋巴球(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球的一細胞族群，這些細胞離開個體的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)的TIL，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL、擴增TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖8步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TILS可進一步藉由效力表徵-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TILS可被認為有效。
用語「去氧核糖核苷酸」涵蓋天然及合成的、未經修飾及經修飾的去氧核糖核苷酸。修飾包括改變糖部份、鹼基部份及/或寡核苷酸中的去氧核糖核苷酸之間的鍵聯。
用語「RNA」定義包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。用語「核糖核苷酸」定義在b-D-核呋喃糖部份的2’位置具有羥基的核苷酸。用語RNA包括雙股RNA、單股RNA、單離RNA諸如部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA以及藉由添加、刪除、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然發生RNA不同之經改變的RNA。本文所述之RNA分子的核苷酸亦可包含非標準核苷酸，諸如非天然發生的核苷酸或化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。這些經改變的RNA可稱為類似物或天然發生的RNA之類似物。
用語「經修飾的核苷酸」係指具有一或多個對核苷、核鹼基、五碳糖環或磷酸基團之修飾的核苷酸。例如，經修飾的核苷酸排除含有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸尿苷及單磷酸胞苷之核糖核苷酸及含有單磷酸去氧腺苷、單磷酸去氧鳥苷、單磷酸去氧胸苷及單磷酸去氧胞苷之去氧核糖核苷酸。修飾包括該些天然發生者，其係由修飾核苷酸之酶諸如甲基轉移酶所進行之修飾導致。
經修飾的核苷酸亦包括合成的或非天然發生的核苷酸。合成的或非天然發生的核苷酸修飾包括該些具有2’修飾者，例如2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟基、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基]、4’-硫基、4’-CH2-O-2’-橋(bridge)、4’-(CH2)2-O-2’-橋、2’-LNA及2’-O--(N-甲基胺甲酸酯)或該些包含鹼基類似物者。關於本揭露所述之2’-經修飾的核苷酸，所謂「胺基」係指2’-NH2或2’-O--NH2，其可經修飾或未經修飾。該等經修飾的基團係描述於例如美國專利第5,672,695號及第6,248,878號；以引用方式併入本文中。
用語「微小RNA (microRNA)」或「miRNA」係指形成單股RNA之核酸，當miRNA與基因或目標基因表現於相同細胞中時，該單股RNA具有改變該基因或目標基因表現(減少或抑制表現；調節表現；直接或間接增強表現)的能力。在一實施態樣中，miRNA係指與目標基因具有實質或完全一致性且形成單股miRNA之核酸。在一些實施態樣中，miRNA可呈前-miRNA之形式，其中該前-miRNA係雙股RNA。miRNA之序列可對應全長目標基因或其子序列。一般而言，miRNA係至少約15至50個核苷酸長(例如單股miRNA之各序列係15至50個核苷酸長，且雙股前 -miRNA係約15至50個鹼基對長)。在一些實施態樣中，miRNA係20至30個鹼基核苷酸。在一些實施態樣中，miRNA係20至25個核苷酸長。在一些實施態樣中，miRNA係20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。
用語「目標基因」包括已知或識別為調節涉及免疫抗性機制之基因表現的基因且可為數種基因群組中之一者，諸如抑制性受體例如CTLA4及PD1；去活化免疫細胞之細胞介素受體例如TGF-β受體、LAG3及/或TIM3及其組合。在一些實施態樣中，目標基因包括下列一或多者：PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)、NOTCH配體mDLL1、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A (PKA)。
片語「小干擾RNA」或「siRNA」或「短干擾RNA」或「靜默RNA」定義一群雙股RNA分子，包含同義及反義RNA股，各股通常為約1022個核苷酸長，視需要包括1至3個核苷酸之3’懸端。siRNA在RNA干擾(RNAi)途徑中具有活性，且利用互補核苷酸序列干擾特定目標基因的表現。
用語sd-RNA係指形成為不對稱雙股RNA-反義寡核苷酸雜交物之「可自我遞送」RNAi劑。雙股RNA包括約19至25個核苷酸之引導(同義)股及約10至19個核苷酸之乘客(反義)股，其形成雙股且導致約5至9個核苷酸之單股硫代磷酸化尾。在一些實施態樣中，RNA序列可經穩定及疏水性修飾諸如固醇例如膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及苯基的修飾，該修飾授予在任何轉染試劑或調配物不存在下的穩定性及有效細胞攝取性。在一些實施態樣中，測試IFN誘導之蛋白質的免疫反應測定指示sd-RNA相較於其他RNAi劑產生減少的免疫刺激輪廓。見例如Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864，以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，本文所述的sd-RNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散介質、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習用醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所涵蓋之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施態樣可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施態樣中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。

III.暫時性改變TIL中之蛋白質表現的方法
在一些實施態樣中，本發明之擴增TIL在擴增步驟之前、之期間或之後包括在密閉、無菌製造過程期間(各提供於本文中)經進一步操作以改變蛋白質表現。在一些實施態樣中，暫時性改變的蛋白質表現是因為暫時性基因編輯。在一些實施態樣中，本發明之擴增TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施態樣中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在一些實施態樣中，本發明包括經由核苷酸插入TIL族群之基因編輯，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包括插入傳訊RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA(siRNA)，以促進一或多個蛋白質的表現或抑制一或多個蛋白質的表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質的組合。
在一些實施態樣中，本發明之擴增TIL經歷蛋白質表現的暫時性改變。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖8所示之步驟A的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增期間，包括例如在例如圖8所示之步驟B擴增的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之後，包括例如在第一至第二擴增之間轉變的TIL族群中、獲自例如圖8所示之步驟B且包括於步驟C之TIL族群。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖8所示之步驟C且在彼之步驟D擴增之前的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增期間，包括例如在例如圖8所示之步驟D擴增的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之後，包括例如在獲自例如圖8所示之步驟D擴增的TIL族群中。
在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括電穿孔的步驟。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群中之蛋白質表現的方法係根據圖30及圖31所描繪之方法執行。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J. 1991,60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括磷酸鈣轉染的步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面塗層及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology 1973,52, 456-467；Wigler,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 1979,76, 1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol. 1987,7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括脂質體轉染的步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N -[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n ,n ,n -三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al. ,Biotechniques 1991,10, 520-525及Felgner,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1987,84, 7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致幹記憶T細胞(TSCM)增加。TSCM是抗原經歷中央記憶T細胞的早期祖細胞。TSCM通常顯示定義幹細胞的長期存活、自我再生及多能能力，且通常為產製有效TIL產物之所欲。TSCM在過繼性細胞轉移的小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集增強的抗腫瘤活性(Gattinoniet al . Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieriet al . Blood 2013)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有包含高比例的TSCM之組成物的TIL族群。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIL族群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的TIL族群。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的治療性TIL族群。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施態樣中，回春包括例如增加增生、增加T細胞活化及/或增加抗原辨識。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現改變T細胞一大組份的表現，以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤衍生之TCR貯庫。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質導致改變特定基因的表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向包括但不限於下列基因：PD-1(亦稱為PDCD1或CD279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A(PKA)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A (PKA)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4/5。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-7。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-10。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH傳訊途徑，諸如經由NOTCH 1/2 ICD及/或經由其他NOTCH配體諸如mDLL1(見例如Kondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)，其全文以引用方式併入本文中)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2 (MCP-1)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3 (MIP-1α)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4 (MIP1-β)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5 (RANTES)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白質激酶A (PKA)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，因暫時性蛋白質表現而過度表現的趨化激素受體包括配體包括但不限於CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17之受體。在一些實施態樣中，因暫時性蛋白質表現而過度表現的趨化激素受體包括配體包括但不限於IL-2、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21，還有NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH傳訊途徑，諸如經由NOTCH 1/2 ICD及/或經由其他NOTCH配體諸如mDLL1(見例如Kondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)，其全文以引用方式併入本文中)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及/或TGFβ的表現降低及/或減少(包括導致例如TGFβ途徑阻斷)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CBLB (CBL-B)的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL移動或運動至腫瘤部位。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CCR(嵌合共刺激受體)增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3所組成之群組的趨化激素受體增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致介白素增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21所組成之群組的介白素增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH傳訊途徑，諸如經由NOTCH 1/2 ICD及/或經由其他NOTCH配體諸如mDLL1(見例如Kondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)，其全文以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH配體諸如mDLL1增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致VHL增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CD44增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致cAMP蛋白質激酶A (PKA)的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的二個分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (Br3)及其組合所組成之群組的一個分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及其組合的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合中之一者的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及PD-1的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CBLB的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合所組成之群組的黏著性分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群(例如黏著性分子的表現增加)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及其組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。
在一些實施態樣中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%。在一些實施態樣中，表現減少至少約90%。在一些實施態樣中，表現減少至少約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約99%。
在一些實施態樣中，表現增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約80 %。在一些實施態樣中，表現增加至少約85%。在一些實施態樣中，表現增加至少約90%。在一些實施態樣中，表現增加至少約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約99%。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現係藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理TIL來誘導。在一些實施態樣中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子的細胞內遞送。該等證實遞送蛋白質(包括轉錄因子)至多種初代人細胞(包括T細胞)之能力的方法(Shareiet al . PNAS 2013以及Shareiet al. PLOS ONE 2015及Greisbecket al. J. Immunology vol. 195, 2015)已經描述，包括使用微流體狹窄變形細胞以使TF或其他分子進入細胞之快速方法；見例如，國際專利申請案公開號WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1或WO 2017/123663A1或美國專利申請案公開號US 2014/0287509A1、US 2018/0201889A1或US 2018/0245089A1，所有全文皆以引用方式併入本文中。該等描述於國際專利申請案公開號WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1或WO 2017/123663A1或美國專利申請案公開號US 2014/0287509A1、US 2018/0201889A1或US 2018/0245089A1之方法可為本發明所採用，以暴露TIL族群至轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子，其中TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子提供增加腫瘤抗原的表現及/或增加TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量，因此導致TIL族群的重新編程及經重新編程之TIL族群相較於未重新編程之TIL族群的治療療效增加。在一些實施態樣中，重新編程導致效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群相對於如本文所述之TIL的起始或先前(即在重新編程之前)族群增加。
在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)包括但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係TCF-1。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係NOTCH 1/2 ICD。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係MYB。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係與誘導多能幹細胞培養(iPSC)諸如市售KNOCKOUT Serum Replacement (Gibco/ThermoFisher)一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係與iPSC雞尾酒一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)不與iPSC雞尾酒一起投予。在一些實施態樣中，重新編程導致TSCM的百分比增加。在一些實施態樣中，重新編程導致TSCM的百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的TSCM。
在一些實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i) 自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(ii) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；
(iii) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在一實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移；
(f) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生；
(h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(i) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群，
其中該無菌電穿孔步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA。
根據一實施態樣，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 對該第二TIL族群執行SQZ微流體膜破壞步驟，其中該SQZ微流體膜破壞步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移；
(f) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生；
(h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(i) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群，
其中該SQZ微流體膜破壞步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA。
在一些實施態樣中，如上述之暫時性改變蛋白質表現如上述之方法可與基因修飾TIL族群之方法組合，包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導的步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al. ,Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006,103, 17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol. 1997,15, 871-75；Dull,et al. ,J. Virology 1998,72 , 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導的步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移的步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al. ,Mol. Therapy 2010,18, 674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟或SQZ微流體膜破壞步驟，其中該無菌電穿孔步驟或SQZ微流體膜破壞步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移；
(f) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生；
(h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(i) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群，
其中該電穿孔步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA，且進一步其中選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合所組成之群組的黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入該第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群中。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現係指由自我遞送RNA干擾(sd-RNA)所誘導之表現減少，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3 )之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3’端接合至膽固醇。使用sd-RNA之方法已描述於Khvorova and Watts,Nat. Biotechnol. 2017,35, 238-248；Byrne,et al. ,J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013,29, 855-864；及Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 2018,(印製中)，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，遞送sd-RNA至TIL族群不需使用電穿孔、SQZ或其他方法完成，而是使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為1 µM/10,000個TIL於介質中之sd-RNA。在一實施態樣中，遞送sd-RNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為10 µM/10,000個TIL於介質中之sd-RNA完成。在一實施態樣中，遞送sd-RNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為50 µM/10,000個TIL於介質中之sd-RNA完成。在一實施態樣中，遞送sd-RNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於介質中之間之sd-RNA完成。在一實施態樣中，遞送sd-RNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於介質中之間之sd-RNA完成，其中暴露至sd-RNA藉由添加新鮮sd-RNA至介質來執行二、三、四或五次。其他合適過程係描述於例如美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1、US 2013/0131141 A1及US 2013/0131142 A1號及美國專利第9,080,171號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，使用根據圖32之過程在製造期間將sd-RNA插入TIL族群中。在一些實施態樣中，sd-RNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、NOTCH配體mDLL1、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白質激酶A (PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施態樣中，表現減少係基於基因靜默的百分比判定，例如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評估。在一些實施態樣中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%。在一些實施態樣中，表現減少至少約90%。在一些實施態樣中，表現減少至少約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約99%。
在一實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、一或多種自我遞送RNA (sd-RNA)、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生；
(h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(i) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群，
其中該一或多種sd-RNA暫時性抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子之表現。
在一實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、一或多種自我遞送RNA (sd-RNA)、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生；
(h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(i) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群，
其中該一或多種sd-RNA暫時性抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的分子之表現，且進一步其中選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合所組成之群組的黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入該第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群中。

A.sd-RNA方法
基於化學修飾siRNA之可自我遞送RNAi技術可為本發明之方法所採用，以成功遞送sd-RNA至如本文所述之TIL。不對稱siRNA結構對主鏈的修飾與疏水性配體之組合(見例如Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 2018及美國專利公開號20160304873以及本文中之圖36及37)允許sd-RNA藉由簡單添加至培養基而穿透培養的哺乳動物細胞，不需要額外調配物及方法，充分利用sd-RNA的核酸酶穩定性。此穩定性允許在只需維持sd-RNA於介質中的有效濃度下，支持RNAi媒介之目標基因活性減少的恆定水準。雖然不受理論限制，sd-RNA的主鏈穩定化提供延長減少基因表現效應，其在非分裂細胞中可持續數月。
在一實施態樣中，在本文中使用以靶向在本文中揭示之基因的sd-RNA具有圖36或圖37所示之結構。
在一些實施態樣中，超過95%的TIL轉染效率及目標的表現減少藉由各種特異性sd-RNA發生。在一些實施態樣中，含有數個未經修飾的核糖殘基之sd-RNA係經完全修飾的序列置換，以增加RNAi效應的效力及/或壽命。在一些實施態樣中，表現減少效應係維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更多天。在一些實施態樣中，表現減少效應在TIL經sd-RNA處理後10天或更多天降低。在一些實施態樣中，目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施態樣中，TIL中的目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施態樣中，PD-1/PD-L1途徑的表現減少允許TIL展現更強效的體內效應，這在一些實施態樣中是因為避免PD-1/PD-L1途徑的抑制效應。在一些實施態樣中，因sd-RNA之PD-1表現減少導致增加TIL增生。

1.sd-RNA選擇及特徵
a.sd-RNA寡核苷酸結構
小干擾RNA (siRNA)(有時稱為短干擾RNA或靜默RNA)是一種雙股RNA分子，長度通常為19至25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其利用互補核苷酸序列干擾特定基因的表現。
雙股DNA (dsRNA)通常可用於定義包含一對RNA互補股(通常為同義(乘客)及反義(引導)股)之任何分子且可包括單股懸端區。相對於siRNA，用語dsRNA通常係指包括siRNA分子序列的前驅物分子，該siRNA分子係藉由切割酶系統包括Dicer酶的作用從較大dsRNA分子釋放。
sd-RNA(可自我遞送RNA)是一種新類型的經共價修飾的RNAi化合物，其不需要遞送媒劑即可進入細胞且相較於傳統siRNA具有改良的藥理學。「可自我遞送RNA」或「sd-RNA」是經疏水性修飾的RNA干擾-反義雜交物，經證實在體外初代細胞及體內局部投予時高度有效。已證實強健攝取及/或靜默且無毒性。sd-RNA是大致上不對稱的經化學修飾的核酸分子，具有極少雙股區域。sd-RNA分子一般含有單股區域及雙股區域，且在分子的單股及雙股區域內皆可含有多種化學修飾。此外，sd-RNA分子可附接至疏水性接合物，諸如本文所述之習知及先進的固醇類分子。sd-RNA(及/或能夠以與sd-RNA類似之方式採用之RNA)及用於製造該sd-RNA之相關方法亦已廣泛描述於例如，美國專利公開號US 2016/0304873、國際專利申請案公開號WO2010/033246、國際專利申請案公開號WO2017/070151、國際專利申請案公開號WO2009/102427、國際專利申請案公開號WO201/1119887、國際專利申請案公開號WO2010/033247、國際專利申請案公開號WO2009045457、國際專利申請案公開號WO2011/119852、國際專利申請案公開號WO2011/119871、美國專利公開號US 2011/0263680、國際專利申請案公開號WO2010/033248、國際專利申請案公開號WO2010/078536、國際專利申請案公開號WO2010/090762、美國專利公開號US 20110039914、國際專利公開號WO2011/109698、國際專利申請案公開號WO2010/090762、美國專利第US 8,815,818號、國際專利申請案公開號WO2016/094845、國際專利申請案公開號WO2017/193053、美國專利公開號US 2006/0276635、國際專利申請案公開號WO2001/009312、美國專利公開號US 2017/0043024、美國專利公開號US 2017/0312367、美國專利公開號US 2016/0319278、美國專利公開號US 2017/0369882、美國專利第US 8,501,706號、美國專利公開號US 2004/0224405、美國專利第US 8,252,755號、美國專利公開號US 2007/0031844、美國專利公開號US 2007/0039072、美國專利公開號US 2007/0207974、美國專利公開號US 2007/0213520、美國專利公開號US 2007/0213521、美國專利公開號US 2007/0219362、美國專利公開號US 2007/0238868、美國專利公開號US 2014/0148362、美國專利公開號US 2016/0193242、美國專利公開號US 2016/01946461、美國專利公開號US 2016/0201058、美國專利公開號US 2016/0201065、美國專利公開號US 2017/0349904、美國專利公開號US 2018/0119144、美國專利第US 7,834,170號、美國專利第US 8,090,542號及美國專利公開號US 2012/0052487，所有全文皆以引用方式併入本文中以符合所有目的；sd-RNA亦可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。為了最佳化sd-RNA結構、化學、靶向位置、序列優先性等，開發了專用演算法且運用於sd-RNA的效力預測(見例如，US 20160304873)。基於這些分析，功能性sd-RNA序列通常被定義為在1 µM濃度下具有超過70%的表現減少，且機率超過40%。

b.sd-RNA寡核苷酸結構
在一些實施態樣中，用於本發明之一或多種sd-RNA可自線性雙股DNA模板產生。在一些實施態樣中，用於產生一或多種sd-RNA之線性雙股DNA模板係如美國專利第US 8,859,229號所述以及如下所述者。
在一些實施態樣中，藉由聚合酶鏈反應(PCR) 所獲得且適用於體外(in vitro)轉錄mRNA之線性雙股DNA模板自5’至3’包含：在該雙股DNA之編碼股上之RNA聚合酶啟動子；長度小於3,000個核苷酸且在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之5’非轉譯區；編碼該多肽之開放閱讀框，其中該多肽對於待轉染之細胞是異源性的且其中該多肽係選自由免疫細胞之配體或受體、刺激或抑制免疫系統功能之多肽及抑制致癌多肽之功能的多肽所組成之群組；在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之3’非轉譯區；及在該雙股DNA之編碼股上之50至5,000個核苷酸的聚(A)延伸，其中該啟動子對於該開放閱讀框是異源性的，且其中該DNA模板並不包含在DNA載體內且終止於該聚(A)延伸的3’端。在一些實施態樣中，RNA聚合酶啟動子包含選自由T7、T3或SP6 RNA聚合酶所組成之群組的RNA聚合酶之一致結合序列。在一些實施態樣中，開放閱讀框編碼融合多肽。在一些實施態樣中，開放閱讀框編碼選自由PD-1、TGFBR2、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMP蛋白質激酶A (PKA)及其組合所組成之群組的多肽。在一些實施態樣中，開放閱讀框編碼選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的多肽。在一些實施態樣中，線性雙股進一步包含內部核糖體進入位點。在一些實施態樣中，聚(A)延伸係300至400個核苷酸長。
在一些實施態樣中，如請求項1之線性雙股DNA模板，其中該模板自5’至3’係由下列組成：在該雙股DNA之編碼股上之RNA聚合酶啟動子；長度小於3,000個核苷酸且在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之5’非轉譯區；編碼該多肽之開放閱讀框，其中該多肽對於待轉染之細胞是異源性的且其中該多肽係選自由免疫細胞之配體或受體、刺激或抑制免疫系統功能之多肽及抑制致癌多肽之功能的多肽所組成之群組；在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之3’非轉譯區；及在該雙股DNA之編碼股上之50至5,000個核苷酸的聚(A)延伸，其中該啟動子對於該開放閱讀框是異源性的，且其中該DNA模板並不包含在DNA載體內且終止於該聚(A)延伸的3’端。在一些實施態樣中，該3’非轉譯區係至少100個核苷酸長。
在一些實施態樣中，本發明提供產生上述線性雙股DNA模板之方法，其中方法包含產生前置及反置引子，其中前置引子包含實質上與受到關注之目標雙股DNA非編碼股互補之複數個核苷酸及作用為RNA聚合酶結合部位之複數個核苷酸，其中反置引子包含實質上與受到關注之目標雙股DNA編碼股互補之複數個核苷酸及複數個去氧胸苷核苷酸，及使用前置及反置引子執行聚合酶鏈反應擴增目標DNA以形成線性雙股DNA模板。在一些實施態樣中，本發明提供產生上述線性雙股DNA模板之方法，其中方法包含產生前置及反置引子，其中前置引子包含實質上與受到關注之目標雙股DNA直接上游的核苷酸區域互補之複數個核苷酸，其中反置引子包含實質上與受到關注之目標雙股DNA直接下游的核苷酸區域互補之複數個核苷酸及複數個去氧胸苷核苷酸，及使用前置及反置引子執行聚合酶鏈反應擴增目標DNA以形成線性雙股DNA模板。在一些實施態樣中，引子包含實質上與受到關注之雙股DNA的5’及3’非轉譯區中之核苷酸延伸互補的核苷酸序列。在一些實施態樣中，引子包含實質上與受到關注之雙股DNA的開放閱讀框內之核苷酸延伸互補的核苷酸序列。在一些實施態樣中，引子包含實質上與受到關注之雙股DNA的開放閱讀框內之核苷酸延伸互補的核苷酸序列，其中引子進一步包含其中包含5’及3’非轉譯區之核苷酸延伸，其中前置引子中包含5’非轉譯區之核苷酸延伸係介於包含RNA聚合酶啟動子之核苷酸與實質上與受到關注之目標雙股DNA非編碼股互補之核苷酸之間，且其中反置引子中包含3’非轉譯區之核苷酸延伸係介於複數個去氧胸苷核苷酸與實質上與受到關注之目標雙股DNA編碼股互補之核苷酸之間。在一些實施態樣中，前置引子及開放閱讀框包含一致Kozak序列。
在一些實施態樣中，本發明提供一種產生一或多種用於轉染細胞之RNA的方法，該方法包含自線性雙股DNA模板執行體外轉錄。在一些實施態樣中，方法進一步包含使用聚(A)聚合酶以一或多個腺嘌呤核苷酸或其類似物延長RNA之聚(A)尾。在一些實施態樣中，方法進一步包含在轉錄期間添加作用為轉錄RNA之5’罩蓋的核苷酸。在一些實施態樣中，RNA靶向選自由PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMP蛋白質激酶A (PKA)及其組合所組成之群組的多肽。在一些實施態樣中，RNA靶向選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的多肽。
在一些實施態樣中，本發明採用一或多種自線性雙股DNA模板產生之單離RNA之用途，該單離RNA包含一或多個開放閱讀框。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於在細胞中表現一或多種RNA之方法，該方法包含使細胞與一或多種自線性雙股DNA模板生產之RNA接觸。在一些實施態樣中，RNA係以不等莫耳量存在，以提供分開的細胞中RNA表現水準。在一些實施態樣中，一或多種RNA靶向選自由PD-1、TGFBR2、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMP蛋白質激酶A (PKA)及其組合所組成之群組的多肽。在一些實施態樣中，一或多種RNA靶向選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的多肽。

(i)非轉譯區
亦可使用有能力促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳地具有5’及3’ UTR。以下實例證實，在PCR模板中納入44個5’ UTR鹼基對相較於含有僅6個5’ UTR鹼基對之PCR模板使得轉錄的CFP RNA具有較高轉譯效率。實例亦證實，添加113個3’ UTR鹼基對相較於含有僅11個3’ UTR鹼基對之PCR模板使得轉錄的GFP RNA具有較高轉譯效率。一般來說，3’ UTR的長度超過100個核苷酸，且因此長於100個核苷酸之3’ UTR係較佳。在一實施態樣中，3’ UTR序列係介於100與5000個核苷酸之間。5’ UTR的長度不像3’ UTR的長度那麼關鍵且可以較短。在一實施態樣中，5’ UTR的長度係介於零與3000個核苷酸之間。欲添加至編碼區的5’及3’ UTR序列的長度可藉由不同方法改變，包括但不限於設計用於PCR之與UTR之不同區域黏合的引子。使用此方式，所屬技術領域中具有通常知識者可修飾在轉染轉錄的RNA後欲達成最佳轉譯效率所需的5’及3’ UTR長度。
5’及3’ UTR可為受到關注之基因的天然發生、內源性5’及3’ UTR。替代地，受到關注之基因的非內源性UTR序列可藉由將UTR序列併入前置及反置引子或藉由對模板進行任何其他修飾來添加。受到關注之基因的非內源性UTR序列之用途可有用地用於修飾RNA的穩定性及/或轉譯效率。例如，已知3’ UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA的穩定性。因此，可選擇或設計3’ UTR，以基於所屬技術領域中廣知的UTR之性質來增加轉錄的RNA之穩定性。
在一實施態樣中，5’ UTR可含有內源性基因的Kozak序列。替代地，當受到關注之基因的非內源性5’ UTR如上述藉由PCR添加時，可藉由添加5’ UTR序列重新設計一致Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎不是使所有RNA能夠有效轉譯所需。許多mRNA需要Kozak序列係所屬技術領域中已知。在其他實施例中，5’ UTR可衍生自RNA病毒，其RNA基因體在細胞中穩定。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3’或5’ UTR中以妨礙核酸外切酶降解mRNA。

(ii)RNA聚合酶啟動子
為了能夠在無需基因選殖下自DNA模板合成RNA，應將轉錄啟動子附接至DNA模板欲轉錄序列上游。噬菌體RNA聚合酶啟動子序列可藉由不同基因工程改造方法諸如DNA接合附接至St UTR，或可被添加至實質上與目標DNA互補之序列的前置引子(5’)。當作用為RNA聚合酶啟動子之序列被添加至前置引子的5’端時，RNA聚合酶啟動子變成併入待轉錄開放閱讀框上游之PCR產物中。在一較佳實施態樣中，啟動子係如上述之T7聚合酶啟動子。其他有用的啟動子包括但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之一致核苷酸序列係所屬技術領域中已知。

(iii)聚(A)尾及5’罩蓋
在一較佳實施態樣中，mRNA具有在5’端的罩蓋及3’聚(A)尾，兩者決定在細胞中的核糖體結合、轉譯起始及mRNA穩定性。在環狀DNA模板例如質體DNA上，RNA聚合酶產生長多聯體(concatameric)產物，其不適合在真核細胞中表現。在3’ UTR端經線性化的質體DNA的轉錄導致正常大小的mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，仍無法進行有效真核轉染。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄物的3’端延長超過模板的最後一個鹼基(Schenborn and Mierendorf,Nuc. Acids Res. , 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz,Eur. J. Biochem. , 270:1485-65 (2003)。此可導致跑出(runoff)轉錄物彎折，隨後模板與第二DNA股或RNA本身的轉錄物交換(Triana-Alonso et al.,J. Biol. Chem. , 270:6298-307 (1995)；Dunn and Studier,J. Mol. Biol. , 166:477-535 (1983)；Arnaud-Barbe et al.,Nuc. Acids Res. , 26:3550-54 (1998)；Macdonald et al., 1993)，且接著導致反方向異常轉錄及雙股RNA累積，其可抑制基因表現。DNA線性化本身不足以正確轉錄(Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995); Dunn and Studier,J. Mol. Biol. , 166:477-535 (1983); Arnaud-Barbe et al., 1998Nuc. Acids Res. , 26:3550-54 (1998); Macdonald et al.,J. Mol. Biol. , 232:1030-47 (1993); Nakano et al.,Biotechnol. Bioeng. , 64:194-99 (1999)，在64至100個核苷酸的聚(A/T)延伸下游線性化的質體DNA導致良好模板(Saeboe-Larssen et al.,J. Immunol. Meth. , 259:191-203 (2002); Boczkowski et al.,Cancer Res ., 60:1028-34 (2000); Elango et al.,Biochem Riophys Res Commun. , 330:958-966 2005)。T7 RNA聚合酶的內源性終止信號編碼可折疊成莖環結構後接一條尿苷殘基鏈(a track of uridine residues)之RNA(Dunn and Studier,J. Mol. Biol. , 166:477-535 (1983); Arnaud-Barbe et al., 1998Nuc. Acids Res. , 26:3550-54 (1998))。即使沒有髮夾結構(hairpin)，一條合成的尿苷鏈可減弱轉錄(Kiyama and Oishi,Nuc. Acids Res. , 24:4577-4583 (1996)。假設在聚(A/T)延伸下游的質體DNA線性化可能形成一種預防潛在異常轉錄的「動態」終止子：RNA轉錄物的3’延長超過聚(A/T)延伸及反方向轉錄將產生類生長終止信號，即延長的聚(U)延伸及聚(A/U)髮夾。因此，逆轉錄PCR引子設計為GFP基因下游的3’錨定序列及5’ 100個鹼基延伸的聚(T)(圖38)。
整合聚A/T延伸至DNA模板中的習知方法係分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可造成質體的不穩定，這也就是為什麼獲自細菌細胞的質體DNA模板通常具有刪除及其他異常的高度污染。這使得選殖程序不僅耗費人力及時間，通常也不可靠。這也就是為什麼允許不需選殖而建構具有聚A/T 3’延伸之DNA模板係高度所欲。
轉錄性DNA模板的聚A/T區段可在PCR期間使用含有聚T尾諸如100T尾(大小可為50至5000個T)之反置引子產生或在PCR之後藉由任何其他方法產生，包括但不限於DNA接合或體外重組。聚(A)尾亦提供RNA穩定性且減少其降解。大致上，聚(A)尾的長度與轉錄的RNA之穩定性有正向相關。在一實施態樣中，聚(A)尾係介於100與5000個腺苷之間。以下實例證實，100個鹼基對延伸的聚(A)足以使RNA轉錄物能夠有效轉譯。
RNA的聚(A)尾在體外轉錄後可進一步使用聚腺苷酸聚合酶延長，諸如大腸桿菌(E. coli)聚A聚合酶(E-PAP)。以下實例證實，將聚(A)尾的長度從100個核苷酸增加至介於300與400個核苷酸之間導致RNA轉譯效率約增加二倍。此外，附接不同化學基團至3’端可增加mRNA穩定性。該附接可含有經修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。例如，可使用聚腺苷酸聚合酶將ATP類似物併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步增加RNA的穩定性。合適的ATP類似物包括但不限於心磷脂(cordiocipin)及8-氮雜腺苷。
5’罩蓋亦可提供穩定性給RNA分子。在一較佳實施態樣中，藉由在本文中揭示之方法所產生的RNA包括5’罩蓋。5’罩蓋可為例如m7 G(5’)ppp(5’)G、m7 G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G或G(5’)ppp(5’)A罩蓋類似物，所有皆可購自商業途徑。5’罩蓋亦可為抗反向罩蓋類似物(ARCA)(見Stepinski, et al.,RNA , 7:1468-95 (2001))或任何其他合適類似物。5’罩蓋係使用所屬技術領域中已知及本文所述之技術提供(Cougot, et al.,Trends in Biochem. Sci. , 29:436-444 (2001); Stepinski, et al.,RNA , 7:1468-95 (2001); Elango, et al.,Biochim. Biophys. Res. Commun. , 330:958-966 (2005))。
藉由在本文中揭示之方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列，其起始罩蓋非依賴性核糖體與mRNA之結合且促進轉譯之起始。可包括任何適用於細胞電穿孔之溶質，其可含有促進細胞性穿透性及存活性之因子，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM/10,000個TIL或約0.25 µM至約4 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM/10,000個TIL的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM/10,000個TIL/100 μL介質的濃度遞送時展現目標基因表現減少。

c.sd-RNA修飾
在一些實施態樣中，寡核苷酸劑包含一或多種修飾以增加治療劑的穩定性及/或有效性及致效寡核苷酸至所欲治療之細胞或組織的有效遞送。該等修飾可包括2’-O-甲基修飾、2’-O-氟基修飾、二硫代磷酸酯修飾、2’ F修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的及/或2’去氧核苷酸。在一些實施態樣中，寡核苷酸係經修飾以包括一或多種疏水性修飾，包括例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在額外特定實施態樣中，經化學修飾的核苷酸係硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施態樣中，糖可經修飾且經修飾的糖可包括但不限於D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基及2’-0-乙基)，即2’-烷氧基、2’-胺基、2’-S-烷基、2’-鹵基(包括2’-氟基)、T-甲氧基乙氧基、2’-烯丙基氧基(-OCH2 CH=CH2 )、2’-丙炔基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及類似物。在一實施態樣中，糖部份可為己糖且如所述併入寡核苷酸中(Augustyns, K., et al.,Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992))。
在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸的全長係雙股，即分子任一端不具有懸端單股序列，即為鈍端。在一些實施態樣中，個別核酸分子可具有不同長度。換句話說，本發明之雙股寡核苷酸不是全長雙股。例如，當使用二個分開的核酸分子時，其中一個分子例如包含反義序列的第一分子可比與其雜交之第二分子更長(留下一部分的分子為單股)。在一些實施態樣中，當使用單一核酸分子時，一部分的分子在任一端可維持單股。
在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在寡核苷酸至少約70%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約80%的長度中為雙股。在另一實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約90%至95%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約96%至98%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施態樣中，寡核苷酸可藉由修飾例如3’或5’鍵聯(例如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526)而實質上不受核酸酶作用。例如，可藉由納入「阻斷基團」而使寡核苷酸具有抗性。本文中使用之用語「阻斷基團」係指可附接至寡核苷酸或核單體(nucleomonomer)作為合成之保護基或偶合基團(例如FITC、丙基(CH2 -CH2 -CH3 )、二醇(-0-CH2 -CH2 -O-)磷酸鹽(PO3 2” )、氫膦酸鹽或胺基磷酸酯(phosphoramidite))之取代基(例如除OH基團以外)。「阻斷基團」亦可包括保護寡核苷酸的5’及3’末端的「末端阻斷基團」或「核酸外切酶阻斷基團」，其包括經修飾的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。
在一些實施態樣中，sd-RNA內之至少一部分毗連多核苷酸係藉由取代基鍵聯例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施態樣中，化學修飾可導致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500種細胞攝取增強(enhancements in cellular uptake)。在一些實施態樣中，C或U殘基中之至少一者包括疏水性修飾。在一些實施態樣中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施態樣中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的C及U可含有疏水性修飾。在一些實施態樣中，所有C及U含有疏水性修飾。
在一些實施態樣中，sd-RNA或sd-rxRNA經由併入可質子化胺展現增強的胞內體釋放sd-rxRNA分子。在一些實施態樣中，可質子化胺被併入同義股(在RISC裝載後被棄置的分子部分)。在一些實施態樣中，本發明之sd-RNA化合物包含不對稱化合物，該不對稱化合物包含雙股區域(有效RISC進入所需，10至15個鹼基長)及4至12個核苷酸長的單股區域；具有13個核苷酸雙股。在一些實施態樣中，採用6個核苷酸的單股區域。在一些實施態樣中，sd-RNA之單股區域包含2至12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施態樣中，採用6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，本發明之sd-RNA化合物亦包括獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。
舉例來說，引導股亦可藉由任何證實穩定性且不干擾RISC進入的化學修飾來修飾。在一些實施態樣中，引導股中的化學修飾模式包括大部分C及U核苷酸是2’ F修飾的，且5’端經磷酸化。
在一些實施態樣中，sd-RNA或sd-rxRNA中至少30%的核苷酸是經修飾的。在一些實施態樣中，sd-RNA或sd-rxRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸是經修飾的。在一些實施態樣中，sd-RNA或sd-rxRNA中100%的核苷酸是經修飾的。
在一些實施態樣中，sd-RNA分子具有極少雙股區域。在一些實施態樣中，雙股的分子區域從8至15個核苷酸長不等。在一些實施態樣中，雙股的分子區域是8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施態樣中，雙股區域是13個核苷酸長。引導與乘客股之間可有100%互補性，或者引導與乘客股之間可有一或多個錯配。在一些實施態樣中，在雙股分子的一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸懸端。分子的單股區域在一些實施態樣中是介於4至12個核苷酸長。在一些實施態樣中，單股區域可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施態樣中，單股區域亦可少於4個或大於12個核苷酸長。在某些實施態樣中，單股區域是6或7個核苷酸長。
在一些實施態樣中，sd-RNA分子具有降低的穩定性。在一些例子中，經化學修飾的sd-RNA或sd-rxRNA分子在介質中具有長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時(包括任何中間值)的半衰期。在一些實施態樣中，sd-rxRNA在介質中具有長於12小時的半衰期。
在一些實施態樣中，sd-RNA係經最佳化以增加效力及/或減少毒性。在一些實施態樣中，引導及/或乘客股的核苷酸長度及/或引導及/或乘客股中的硫代磷酸酯修飾數量在一些態樣可影響RNA分子的效力，然而以2’-0-甲基(2’OMe)修飾置換2’-氟基(2’F)修飾在一些態樣中可影響分子的毒性。在一些實施態樣中，預期減少分子的2’F含量可減少分子的毒性。在一些實施態樣中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾的數量可影響細胞的分子攝取，例如被動攝取分子至細胞中的效率。在一些實施態樣中，sd-RNA不具有2’F修飾，但仍以相等的細胞攝取性及組織穿透效率為表徵。
在一些實施態樣中，引導股的長度大約是18至19個核苷酸且具有大約2至14個磷酸鹽修飾。例如，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或超過14個經磷酸鹽修飾的核苷酸。引導股可含有一或多個授予增加的穩定性且不干擾RISC進入的修飾。經磷酸鹽修飾的核苷酸(諸如經硫代磷酸酯修飾的核苷酸)可位於3’端、5’端或分布在整個引導股。在一些實施態樣中，引導股3’末端之10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2’F及/或2’OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施態樣中，在引導股位置一之核苷酸(引導股最5’位置的核苷酸)是經2’OMe修飾的及/或經磷酸化的。引導股內的C及U核苷酸可經2’F修飾。例如，19個nt之引導股的位置2至10(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’F修飾。引導股內的C及U核苷酸亦可經2’OMe修飾。例如，19個nt之引導股的位置11至18(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’OMe修飾。在一些實施態樣中，在引導股最3’端的核苷酸未經修飾。在某些實施態樣中，在引導股內大部分C及U係經2’F修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施態樣中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施態樣中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾，引導股的5’端係經磷酸化且在位置2至10的C或U係經2’F修飾。

d.遞送sd-RNA
可自我遞送RNAi技術提供用RNAi劑直接轉染細胞之方法，無須額外調配物或技術。轉染難以轉染細胞系的能力、高體內活性及易於使用是這類組成物及方法的特徵，相較於基於siRNA之傳統技術呈現顯著功能優點，且因此在數個關於在本發明之TIL中目標基因表現減少的方法之實施態樣中採用sd-RNA方法。sd-RNAi方法允許直接遞送化學合成化合物至廣泛範圍的離體(ex-vivo )及體內初代細胞及組織。在本發明的一些實施態樣中描述的sd-RNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
sd-RNA分子的一般結構係顯示於圖36。sd-RNA係形成為經疏水性修飾的siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，sd-RNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所述之TIL。
在一些實施態樣中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合以遞送至細胞。在一些實施態樣中，此跨膜遞送系統包含脂質、病毒載體及類似物。在一些實施態樣中，寡核苷酸劑係自我遞送RNAi劑，不需要任何遞送劑。
在實施例中，寡核苷酸諸如本文所述之RNA或sd-RNA可使用不同方法導入目標細胞中，例如包括但不限於下列之市售方法：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, MA)、NeonTM 轉染系統(可購自ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)及/或Gene Pulser II (BioRad, Denver, CO)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、使用脂質體轉染之陽離子脂質體媒介之轉染、聚合物包封、肽媒介之轉染或生物彈道粒子遞送系統諸如「基因槍」(見例如Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8):861-70 (2001)，其全文以引用方式併入本文中)。亦見美國專利第8,859,229號、美國專利申請案號2016/0230188以及Amaxa Nucleofector ® II使用手冊(可得自全球資訊網http://icob.sinica.edu.tw/pubweb/bio-chem/Core%20Facilities/Data/R401-core/Nucleofector_Manual_II_Apr06.pdf)。
在一些實施態樣中，可根據廠商建議使用Amaxa NUCLEOFECTOR.TM.-II執行電穿孔。在一些實施態樣中，TIL可使用NUCLEOFECTOR.TM.-II溶液V及建議電穿孔方案組轉染。在一些實施態樣中，TIL可使用溶液V、T及R及不同電穿孔方案轉染。在一些實施態樣中，TIL可使用T細胞NUCLEOFECTOR.TM.-II溶液及不同電穿孔方案轉染。亦可採用核酸遞送之替代方法以轉染本文所述之寡核苷酸：使用LIPOFECTIN或LIPOFECTAMIN (Invitrogen)執行陽離子脂質體媒介之轉染。電穿孔亦使用ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, MA)、Gene Pulser II (BioRad, Denver, CO)、Multiporator (Eppendorf, Hamburg Germany)及/或NeonTM 轉染系統(可購自ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)執行。在一些實施態樣中，可採用pmaxGFP質體DNA (Amaxa Biosystems)作為DNA對照。在一些實施態樣中，轉染效率(ET)可在轉染後大約3、6、9、12、15及/或18小時藉由螢光激活細胞分選(FACS)判定。在一些實驗中，可進一步每12小時至24小時分析一次轉染細胞直到GFP對照組無法偵測到GFP為止。在一些實施態樣中，細胞存活性可藉由台盼藍染料排除判定。
寡核苷酸及寡核苷酸組成物接觸(例如，使接觸，在本文中亦稱為投予或遞送至)本文所述之TIL且被攝入，包括經由TIL被動攝取。sd-RNA可在第一擴增期間(例如，步驟B)、在第一擴增之後(例如，步驟C期間)、第二擴增之前或期間(例如，步驟D之前或期間)、步驟D之後及步驟E收集之前、步驟F收集期間或之後、步驟F最終調配物及/或轉移至輸注袋之前或期間、以及步驟F任何可選的冷凍保存步驟之前添加至本文所述之TIL。另外，sd-RNA可在從步驟F任何冷凍保存步驟解凍後添加。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM所組成之群組的濃度添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在REP前或REP階段期間，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第一、第二及額外擴增階段期間，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。
本發明之寡核苷酸組成物包括sd-RNA可在擴增過程期間與本文所述之TIL接觸，例如以高濃度溶解sd-RNA於細胞培養基中且允許足夠時間讓被動攝取發生。在一些實施態樣中，高濃度包括0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL。在一些實施態樣中，高濃度包括2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL。在一些實施態樣中，高濃度包括5 μM sd-RNA/10,000個TIL或至多10 μM sd-RNA/10,000個TIL。
在一些實施態樣中，遞送寡核苷酸至細胞中可藉由合適的本領域認可方法增強，包括磷酸鈣、DMSO、甘油或葡聚糖、電穿孔，或藉由使用例如陽離子、陰離子或中性脂質組成物或脂質體使用所屬技術領域中已知之方法轉染(見例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美國專利第4,897,355號；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21 :3567)。

e.sd-RNA組合
在一些實施態樣中，使用超過一個sd-RNA來減少目標基因的表現。在一些實施態樣中，一起使用一或多種靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH之sd-RNA。在一些實施態樣中，使用PD-1 sd-RNA與TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者，以減少超過一個基因目標的表現。在一些實施態樣中，使用LAG3 sd-RNA與靶向CISH之sd-RNA的組合，以減少兩個目標的基因表現。在一些實施態樣中，在本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者之sd-RNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。在一些實施態樣中，靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者之sd-RNA具有圖36或圖37所示之結構。
在一些實施態樣中，sd-RNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向PD-1且另一個sd-RNA靶向選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及其組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向選自PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及其組合的基因。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向選自PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合中之一者的基因。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向PD-1且一個sd-RNA靶向LAG3。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向PD-1且一個sd-RNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向PD-1且一個sd-RNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向LAG3且一個sd-RNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向LAG3且一個sd-RNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向CISH且一個sd-RNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向TIM3且一個sd-RNA靶向PD-1。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向TIM3且一個sd-RNA靶向LAG3。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向TIM3且一個sd-RNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sd-RNA靶向TIM3且一個sd-RNA靶向CBLB。

f.過度表現共刺激受體或黏著性分子
根據額外實施態樣，在TIL擴增方法期間改變TIL的蛋白質表現亦可允許在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，改變蛋白質表現可造成刺激受體的表現受到增強，這表示相較於未經基因修飾的刺激受體的表現，其係過度表現。可藉由暫時性改變本發明之TIL的蛋白質表現來展現增強表現之免疫檢查點基因的非限制性實例包括某些趨化激素受體及介白素，諸如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。

(i)CCR及CCL
為了使過繼性T細胞免疫療法有效，必須藉由趨化激素使T細胞適當移動至腫瘤中。由腫瘤細胞分泌之趨化激素、存在於周邊的趨化激素與T細胞所表現的趨化激素受體之間的匹配對於使T細胞成功移動至腫瘤床中來說是重要的。
根據具體實施態樣，本發明之改變蛋白質表現方法可用於增加TIL中某些趨化激素受體的表現，諸如一或多種CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及/或CX3CR1。CCR之過度表現可能有助於促進TIL在過繼性轉移後的效應功能及增生。在一些實施態樣中，本發明之改變蛋白質表現方法可用於增加TIL中CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17的表現。
根據具體實施態樣，TIL中一或多種CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及/或CX3CR1的表現係根據本發明之組成物及方法增強。例如，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法的任何實施態樣(例如過程2A或圖20及21所示之方法)進行，其中方法包含藉由增強一或多種CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及/或CX3CR1的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶在趨化激素受體基因處媒介產生雙股或單股斷裂。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於增強TIL中某些趨化激素受體的表現。
在一實施態樣中，CCR4及/或CCR5黏著性分子係使用如本文所述之γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入TIL族群中。在一實施態樣中，CXCR2黏著性分子係使用如Forget,et al., Frontiers Immunology 2017,8 , 908 or Peng,et al. ,Clin. Cancer Res. 2010,16 , 5458所述之γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入TIL族群中，其揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i) 自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(ii) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；
(iii) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量，其中改變的表現係一或多種CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1、CXCL8及/或CCL22的表現增加。

(ii)介白素及其他
根據額外實施態樣，本發明之基因編輯方法可用於增加某些介白素的表現，諸如一或多種IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21，還有NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)。某些介白素已證實可放大T細胞的效應功能且媒介腫瘤控制。
根據具體實施態樣，TIL中之一或多種IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21還有NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)的表現係根據本發明之組成物及方法而增強。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(i) 自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(ii) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；
(iii) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量，其中改變的表現係一或多種IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21還有NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)的表現增加。

IV.TIL製造過程
含有一些這些特徵的例示性TIL過程(稱為過程2A)係描繪於圖1，且本發明之此實施態樣的一些優於過程1C的優點係描述於圖2以及圖13及14。過程1C係顯示於圖3以供比較。基於過程2A之二個用於TIL療法之替代性時間表係顯示於圖4(較高細胞計數)及圖5(較低細胞計數)。過程2A之實施態樣係顯示於圖6以及圖8。圖13及14進一步提供例示性2A過程與例示性1C過程之比較。
如本文中所討論，本發明可包括關於再刺激冷凍保存的TIL的步驟，以增加彼等的代謝活性及因此在移植至患者中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自患者樣本且經操作以在移植至患者中之前擴增彼等之數量。在一些實施態樣中，TIL視需要可經如下討論之基因操作。
在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加彼等之代謝。
在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增(包括稱為REP前之過程以及圖8步驟A所示之過程)縮短至3至14天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖8步驟B所示之過程)縮短至7至14天。在一些實施態樣中，第一擴增(例如，圖8步驟B所述之擴增)縮短至11天且第二擴增(例如，圖8步驟D所述之擴增)縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4、5、6及7。在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增與第二擴增(例如，如圖8步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合縮短為22天。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖8且參照本文所述之某些實施態樣。以下及圖8中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。

A.步驟A：獲得患者腫瘤樣本
一般來說，TIL最初獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，視需要冷凍保存、如本文概述之再刺激及視需要評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
患者腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術部分切除、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施態樣中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施態樣中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3 之間的小片(small pieces)，且約2至3 mm3 特別有用。TIL係自這些片段使用酶性腫瘤消化物培養。該腫瘤消化物可藉由在酶性介質(例如Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中孵養，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤放入酶性介質中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及孵養循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣執行密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施態樣中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施態樣中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及消化。在一些實施態樣中，碎斷係物理碎斷。在一些實施態樣中，碎斷係分割。在一些實施態樣中，碎斷係藉由消化。在一些實施態樣中，TIL最初可自獲自患者的酶性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一實施態樣中，TIL最初可自獲自患者的酶性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施態樣中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖8中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施態樣中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施態樣中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施態樣中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40或更多個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。在一些實施態樣中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。在一些實施態樣中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施態樣中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與8 mm3 之間。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約1 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約2 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約3 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約4 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約5 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約6 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約7 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約8 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約9 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約10 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤係1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係1 mm x 1 mm x 1 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係2 mm x 2 mm x 2 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係3 mm x 3 mm x 3 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係4 mm x 4 mm x 4 mm。
在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上出血性、壞死及/或脂肪組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上出血性組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上壞死組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上脂肪組織的量。
在一些實施態樣中，腫瘤碎斷的執行是為了維持腫瘤內部結構。在一些實施態樣中，腫瘤碎斷的執行不包括使用解剖刀執行鋸切動作。在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施態樣中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶介質後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再孵養30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施態樣中，細胞可在樣本收集後視需要冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖8中例示。

B.步驟B：第一擴增
在一些實施態樣中，本方法提供獲得年輕TIL，該年輕TIL在投予至個體/患者後能夠增加複製循環且因此相較於較老TIL(即在投予至個體/患者之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)；Huang et al.,J Immunother , 28(3):258-267 (2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res , 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al.,J Immunother 32:415-423 (2009)；Robbins, et al.,J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al.,J Immunother , 28:53-62 (2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
T及B淋巴球的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程1C之方法(如在圖13所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在例如諸如圖8步驟A所述之分割或消化腫瘤片段之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2的血清中培養。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常3至14天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養7至14天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養10至14天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養約11天，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一較佳實施態樣中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖8步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之視需要以表型特徵及代謝參數表徵。
在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養盤(Corning Incorporated, Corning, NY))的實施態樣中，各孔可接種1×106 個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段於含IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)的2 mL完全培養基(CM)中。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2 的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數介質。
在製備腫瘤片段後，將所得細胞(即片段)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞族群存在下)及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常10至14天)，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，在第一擴增期間的生長介質包含IL-2或其變體。在一些實施態樣中，該IL係重組人IL-2 (rhIL-2)。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有4至8×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有5至7×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有6×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液係如實例4所述製備。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施態樣中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中(圖1)，各培養瓶裝載10至40 x 106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2 的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數介質。在一些實施態樣中，CM係實例中所述的CM1，見實例5。在一些實施態樣中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖8步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖8步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖8步驟B所述之擴增。在一些實施態樣中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施態樣中，第一擴增縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖8步驟B所述之擴增。
在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可被包括在第一擴增期間，包括例如在根據圖8步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可被包括在根據圖8步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括稱為REP前的過程；例如根據圖8之步驟B)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，步驟B之第一擴增縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施態樣中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4、5、6及7。在一些實施態樣中，第一擴增縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4、5、6及7。
在一些實施態樣中，第一擴增(例如根據圖8之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量在第一擴增期間(例如根據圖8之步驟B)添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第一擴增期間(例如根據圖8之步驟B)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第一擴增期間(例如根據圖8之步驟B)，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第一擴增期間(例如根據圖8之步驟B)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。

C.步驟C：第一擴增至第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自第一擴增的主體TIL族群包括例如獲自例如圖8所示之步驟B的TIL族群可使用本文以下討論的規程立即冷凍保存。替代地，獲自第一擴增的TIL族群(稱為第二TIL族群)可進行第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增)且接著如以下討論進行冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，第一TIL族群(有時稱為主體TIL族群)或第二TIL族群(其在一些實施態樣中可包括稱為REP TIL族群的族群)可在擴增之前或在第一擴增之後且在第二擴增之前經受基因修飾以用於合適治療。
在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖8所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖8所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行第二擴增。在一些實施態樣中，獲自第一擴增的TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至10天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約7天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約14天。
在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的12天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的13天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的2天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天。
在一些實施態樣中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施態樣中，在如圖8所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施態樣中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施態樣中，來自第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行第二擴增而無轉變期。
在一些實施態樣中，從第一擴增至第二擴增的轉變(例如根據圖8之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量在從第一擴增至第二擴增的轉變期間(例如根據圖8之步驟C)添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在從第一擴增至第二擴增的轉變期間(例如根據圖8之步驟C)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在從第一擴增至第二擴增的轉變期間(例如根據圖8之步驟C)，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在從第一擴增至第二擴增的轉變期間(例如根據圖8之步驟C)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。

1.細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴球產製，且特別是如其中所述的T細胞。

D.步驟D：第二擴增
在一些實施態樣中，TIL細胞族群於數量上在收集及初始主體處理(例如圖8所示之步驟A及步驟B)及轉變(稱為步驟C)之後擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(REP；如圖8步驟D所示之過程)的擴增過程。第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。
在一些實施態樣中，TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖8步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施態樣中，第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖8步驟D所示之過程)執行。例如，TIL可在介白素2 (IL-2)或介白素15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ or Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL體外刺激，該等抗原視需要在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下視需要自載體表現，諸如人白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的癌症相同抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射的自體淋巴球或用經照射的HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施態樣中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施態樣中，第二擴增在經照射的自體淋巴球或經照射的HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2的存在下發生。
在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何其組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖8步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何其組合可被包括在根據圖8步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈現餵養細胞及視需要TNFRSF促效劑的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施態樣中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施態樣中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。置換介質(通常經由抽吸新鮮介質置換2/3介質)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)縮短至7至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第二擴增縮短至11天。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增可使用T-175培養瓶及如先前描述之氣體可通透袋子(Tran,et al. ,J. Immunother. 2008,31, 742-51; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003,26, 332-42)或氣體可通透培養器皿(G-Rex培養瓶)執行。在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係於T-175培養瓶中執行，且可將懸浮於150 mL的介質中之約1 x 106 TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可培養於CM及AIM-V介質的1比1混合物中，補充有每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3。T-175培養瓶可在37℃下在5% CO2 中孵養。一半的介質可在第5天使用含有每mL 3000 IU的IL-2之50/50介質交換。在一些實施態樣中，在第7天可將來自二個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中並將300 mL含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2之AIM V添加至300 ml的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量每天或每二天計算一次，且添加新鮮介質以保持細胞計數介於0.5與2.0×106 個細胞/mL。
在一實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖8步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106 或10×106 TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50介質中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中孵養。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2之新鮮介質再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。當TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-Rex 100培養瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL之含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶可在37° C下在5% CO2 中孵養，且在4天之後可將150 mL之含有每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各G-REX 100培養瓶。細胞可在培養的第14天收集。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。在一些實施態樣中，進行置換介質直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施態樣中，藉由抽吸新鮮介質置換掉2/3的介質。在一些實施態樣中，替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
視需要，在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施態樣中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施態樣中，存活性係根據例如實例15所述之細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
在一些實施態樣中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前描述之T-175培養瓶及氣體可通透袋子(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008,J Immunother. , 31:742-751及Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003,J Immunother. , 26:332-342)或氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增係於T-175培養瓶中執行，且約1×106 TIL懸浮於約150 mL的介質中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經照射(50 Gy)的同種異體PBMC以1比100的比例培養，且將細胞培養於補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之CM與AIM-V介質的1比1混合物(50/50介質)中。T-175培養瓶在37℃下在5% CO2 中孵養。在一些實施態樣中，一半的介質在第5天使用含有3000 IU/mL的IL-2之50/50介質更換。在一些實施態樣中，在第7天將來自2個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中，並將300 mL含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2之AIM-V添加至300 mL的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量可每天或每二天計算一次，且可添加新鮮介質以保持細胞計數介於約0.5與約2.0 x 106 個細胞/mL。
在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm2 氣體可通透矽底之培養瓶(G-Rex 100, Wilson Wolf)中執行(圖1)，將約5x106 或10 x 106 TIL與經照射的同種異體PBMC以1至100的比例培養於400 mL的補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/ mL的抗CD3之50/50介質中。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中孵養。在一些實施態樣中，在第5天將250mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491g)下離心10分鐘。接著可將TIL團塊用150 mL的含有3000 IU/mL的IL-2之新鮮50/50介質再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。在將TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增的實施態樣中，在第7天將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-Rex 100培養瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL之含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中孵養，且在4天之後將150 mL之含有3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶。細胞在培養的第14天收集。
T及B淋巴球的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施態樣中，第二擴增(例如根據圖8之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量在第二擴增期間(例如根據圖8之步驟D)添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一些實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第二擴增期間(例如根據圖8之步驟D)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第二擴增期間(例如根據圖8之步驟D)，以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多種靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sd-RNA在第二擴增期間(例如根據圖8之步驟D)，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。

1.餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序(例如包括諸如該些圖8步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，同種異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估照射同種異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施態樣中，如果第14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在5至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約100×106 TIL的比例。在另一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約50×106 TIL的比例。在又一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約25×106 TIL。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施態樣中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在例如圖4、5、6及7中所述之例示性程序。
在一實施態樣中，在第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。

2.細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴球產製，且特別是如其中所述的T細胞。

E.步驟E：收集TIL
在第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施態樣中，在例如圖8所提供之一、二、三、四或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施態樣中，在例如圖8所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施態樣中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施態樣中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，收集(例如根據圖8之步驟E)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，根據圖8之步驟E係根據實例16所述之過程執行。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用如實例16所述的密閉系統。
在一些實施態樣中，根據實例16所述之方法收集TIL。在一些實施態樣中，使用如第8.5節所述之方法，收集介於第1天與第11天之間的TIL(在實例16中稱為第11天TIL收集)。在一些實施態樣中，使用如第8.12節所述之方法，收集介於第12天與第22天之間的TIL(在實例16中稱為第22天TIL收集)。

F.步驟F：最終調配/轉移至輸注袋
在如圖8以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至患者。在一些實施態樣中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至患者。
在一實施態樣中，使用本揭露之APC擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。

1.醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施態樣中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施態樣中，投予約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL，平均約7.8×1010 個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施態樣中，投予約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施態樣中，投予約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施態樣中，投予約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施態樣中，投予約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施態樣中，投予約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施態樣中，投予約7×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7.8×1010 個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7×1010 至約8×1010 個TIL。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。

G.可選的細胞介質組分
1.抗CD3抗體
在一些實施態樣中，用於本文所述之擴增方法(包括該些稱為REP者，見例如圖A)中之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985,135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施態樣中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ or Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。

2.4-1BB (CD137)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB (CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人源化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種人源化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB粘連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al. ,PLOS One 2013,8, e69677。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人源化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係EU-101 (Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且視需要進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013,12, 2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係由以高親和性及促效性活性與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合來表徵。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB (SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表3中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8×105 l/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表4所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之醣化位點；位於位置22至96 (VH -VL )、143至199 (CH 1-CL )、256至316 (CH 2)及362至420 (CH 3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’至87’ (VH -VL )及136’至195’ (CH 1-CL )之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218至218、219至219、222至222及225至225、位於IgG2A/B異構體位置218至130、219至219、222至222及225至225、及位於IgG2B異構體位置219至130 (2)、222至222及225至225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130至213’ (2)、IgG2A/B異構體位置218至213’及130至213’及位於IgG2B異構體位置218至213’ (2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al. ,Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表5所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298”)之N-醣化位點；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、262至322 (CH 2)及368至426 (CH 3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、262”至322”及368”至426”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及136’至196’ (CH 1-CL )(及位於位置23”’至88”’及136”’至196”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227至227”及230至230”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135至216’及135”至216”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al. ,Clin. Cancer Res. 2016,available at http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U. S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組：1D8、3Elor、4B4 (BioLegend 309809)、H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532)、BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX)、145501 (Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4 (BioLegend 31 1503)、C65-485 (BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl (BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物：

在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH 3及CH 2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH 及VL 鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories , 2011,10 , 44；Ahmad,et al. ,Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250；Monnier,et al. ,Antibodies, 2013,2, 193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表6中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表7中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表8所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表8給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。

3.OX40 (CD134)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人源化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種人源化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40粘連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係促效性抗OX40人源化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施態樣中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al. ,J. Immunother. 2009,182, 1481-89。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且視需要進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013,12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al. ,Cancer Res. 2013,73, 7189-98。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係由以高親和性及促效性活性與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合來表徵。在一實施態樣中，OX40促效劑係與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係與鼠OX40 (SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表9中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人 TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人源化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表10所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301”之N-醣化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、265至325 (CH 2)及371至429 (CH 3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、265”至325”及371”至429”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及134’至194’ (CH 1-CL )(及位於位置23”’至88”’及134”’至194”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230至230”及233至233”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224至214’及224”至214”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。11D4之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表11所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。18D8之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表12所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人源化抗體。Hu119-122之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表13所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人源化抗體。Hu106-222之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
在一些實施態樣中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al. ,J. Immunother .2006,29 , 575-585。在一些實施態樣中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al. ,J. Immunother . 2006,29 , 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施態樣中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施態樣中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括克隆20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之特性係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表6中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表7中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表15所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表15給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。

在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施態樣中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性抗體克隆Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。

H.可選的細胞存活性分析
視需要，在第一擴增步驟B之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。視需要，在第一擴增(有時稱為初始主體擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。其他用於測試存活性之測定可包括但不限於阿爾瑪藍測定及MTT測定。

1.細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施態樣中，測量細胞計數及/或存活性。標誌之表現(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文揭示或描述者)可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCantoTM 流動式細胞測量儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於該些可購自BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA)者)測量。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且存活性可使用任何所屬技術領域中已知之方法包括但不限於台盼藍染色評估。
在一些情況下，主體TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可如以下討論進行REP且接著冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，主體或REP TIL族群可經受基因修飾以用於合適治療。

2.細胞培養
在一實施態樣中，用於擴增TIL之方法可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞介質、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞介質或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞介質。在一實施態樣中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞介質(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的介質的量及介質類型的數量。在一實施態樣中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地添加新鮮細胞培養基至細胞(亦稱為餵養細胞)。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質係未經過濾。使用未經過濾細胞介質可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施態樣中，該方法的期間包含自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在其中含有細胞介質之第一氣體可通透容器中培養腫瘤組織樣本；自腫瘤組織樣本獲得TIL；在其中含有細胞介質之第二氣體可通透容器中使用aAPC擴增TIL數量一段約14至約42天例如約28天的期間。
在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施態樣中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施態樣允許細胞族群自約5x105 細胞/cm2 擴增至介於10x106 與30x106 細胞/cm2 之間。在一實施態樣中，此擴增係於不添加新鮮細胞培養基至細胞(亦稱為餵養細胞)下進行。在一實施態樣中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的介質位在約10 cm的高度。在一實施態樣中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施態樣中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與介質混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al. ,J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292。

I.可選的TIL基因工程改造
在一些實施態樣中，TIL視需要經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。

J.可選的TIL冷凍保存
如上所討論且例示於如圖8中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施態樣中，在第二擴增(例如根據圖8步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係根據實例8及9所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全介質中且視需要洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。

K.用於表型表徵擴增TIL之方法
顆粒溶解酶B產生：顆粒溶解酶B是TIL殺死目標細胞的能力的另一種測量。如上述使用抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體再刺激之介質上清液的顆粒溶解酶B水準亦根據廠商指示使用人顆粒溶解酶B DuoSet ELISA套組(R & D Systems, Minneapolis, MN)評估。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖8步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加的顆粒溶解酶B產生。
在一些實施態樣中，端粒長度可用來作為細胞存活性及/或細胞性功能的測量。在一些實施態樣中，在本發明所生產之TIL中的端粒相較於使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8中體現之方法以外的方法)製備的TIL意外地具有相同長度。端粒長度測量：多種方法已用於測量基因體DNA及細胞學製劑的端粒長度。端粒限制片段(TRF)分析是測量端粒長度的黃金標準(de Lange et al., 1990)。然而，TRF的重大限制在於需要大量DNA (1.5 ^g)。二種廣泛用於測量端粒長度的方法，也就是螢光原位雜交(FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)及定量PCR可為本發明所採用。
在一些實施態樣中，TIL健康係藉由IFN-γ分泌測量。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激的TIL介質中的細胞介素IFN-γ水準來測量。來自這些受刺激TIL之介質中的IFN-γ水準可使用測量IFN-γ釋放來判定。
在一些實施態樣中，根據TIL測定的生物發光重定向裂解測定(效力測定)，使用TIL與生物發光細胞系P815(殖株G6)之共培養測定來評估TIL裂解目標細胞的細胞毒性潛力，其以高度敏感劑量依賴性方式測量TIL細胞毒性。
在一些實施態樣中，本方法提供使用上述方法用於評估TIL存活性的測定。在一些實施態樣中，TIL的擴增如上所討論，包括例如圖8所提供者。在一些實施態樣中，TIL在評估存活性之前經冷凍保存。在一些實施態樣中，存活性評估包括在執行第一擴增、第二擴增及額外第二擴增之前解凍TIL。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與TIL族群存活性有關之用語的測定。存活性可藉由任何上述之TIL代謝測定以及任何所屬技術領域中已知用於評估細胞存活性之方法來測量。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與使用本文所述之方法(包括該些例示於圖8者)擴增之TIL的存活性有關之用語的測定。
本發明亦提供用於判定TIL存活性之測定方法。在一些實施態樣中，TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8中體現之方法以外的方法)製備的TIL具有相等的存活性。在一些實施態樣中，TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8中體現之方法以外的方法)製備的TIL具有增加的存活性。本揭露提供藉由擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成為較大TIL族群而用於測定TIL存活性之方法，其包含：
(i) 獲得先前已擴增之第一TIL族群；
(ii) 執行第一擴增，其藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL族群，以產生第二TIL族群；及
(iii) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，且其中進一步測定該第三TIL族群存活性。
在一些實施態樣中，方法進一步包含：
(iv) 藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之細胞培養基來執行額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的TIL族群，且其中進一步測定該第三族群存活性。
在一些實施態樣中，在步驟(i)之前，細胞係經冷凍保存。
在一些實施態樣中，細胞在執行步驟(i)之前解凍。
在一些實施態樣中，重複步驟(iv)一至四次以獲得足夠的TIL以供分析。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約40天至約50天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約42天至約48天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約42天至約45天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約44天之內執行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(iv)之細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，PBMC係於步驟(iii)之第9至17天中任一天添加至細胞培養。
在一些實施態樣中，APC係人工APC (aAPC)。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼高親和性T細胞受體之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟，該嵌合抗原受體包含與T細胞傳訊分子之至少一個胞內域融合之單鏈可變片段抗體。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後及在步驟(iv)後測定TIL存活性。
T及B淋巴球的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性(有時稱為多株性)之TIL的方法。在一些實施態樣中，T細胞貯庫多樣性的增加係相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8中體現之方法以外的方法)製備的TIL具有增加的存活性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
根據本揭露，一種用於測定TIL存活性及/或投予至個體之進一步用途的方法。在一些實施態樣中，用於測定腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法包含：
(i) 獲得第一TIL族群；
(ii) 執行第一擴增，其藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL族群，以產生第二TIL族群；及
(iii) 執行第二擴增，其藉由將第二TIL族群的細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於第二TIL族群至少50倍；
(iv) 收集、洗滌及冷凍保存第三TIL族群；
(v) 儲存冷凍保存TIL在冷凍溫度下；
(vi) 解凍第三TIL族群以提供解凍的第三TIL族群；及
(vii) 執行一部分解凍的第三TIL族群的額外第二擴增，其藉由將第三族群的細胞培養基補充IL-2、OKT-3及APC一段至少3天的額外擴增期間(有時稱為reREP期間)，其中執行第三擴增以獲得第四TIL族群，其中比較第四TIL族群中的TIL數量與第三TIL族群中的TIL數量以獲得比例；
(viii) 基於步驟(vii)中的比例判定解凍的TIL族群是否適用於投予至患者；
(ix) 當步驟(viii)中之第四TIL族群中的TIL數量對第三TIL族群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，投予治療有效劑量的解凍的第三TIL族群至患者。
在一些實施態樣中，額外擴增期間(有時稱為reREP期間)係執行直到第四TIL族群中的TIL數量對第三TIL族群中的TIL數量之比例大於50:1。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約40天至約50天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約42天至約48天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約42天至約45天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約44天之內執行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(vii)之該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。在一些實施態樣中，細胞是TIL。
在一些實施態樣中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，PBMC係於步驟(iii)之第9至17天中任一天添加至細胞培養。
在一些實施態樣中，APC係人工APC (aAPC)。
在一些實施態樣中，轉導第一TIL族群之步驟用包含編碼高親和性T細胞受體之核酸之表現載體進行。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，轉導第一TIL族群之步驟用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸之表現載體進行，該嵌合抗原受體包含與T細胞傳訊分子之至少一個胞內域融合之單鏈可變片段抗體。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，在步驟(vii)後測定TIL存活性。
本揭露亦提供測定TIL之進一步方法。在一些實施態樣中，本揭露提供一種測定TIL之方法，其包含：
(i) 獲得一部分的第一冷凍保存TIL族群；
(ii) 將該部分的第一冷凍保存TIL族群解凍；
(iii) 執行第一擴增，其藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該部分的第一TIL族群一段至少3天的額外擴增期間(有時稱為reREP期間)以產生第二TIL族群，其中比較來自第一TIL族群的該部分與第二TIL族群以獲得TIL數量的比例，其中第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群的該部分中的TIL數量的比例係大於5:1；
(iv) 基於步驟(iii)中的比例判定第一TIL族群是否適用於治療性投予至患者；
(v) 當步驟(iv)中之第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，判定該第一TIL族群適用於治療性投予。
在一些實施態樣中，第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群的該部分中的TIL數量之比例係大於50:1。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含根據本文提供之任何實施態樣所述之方法，執行來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL族群的擴增。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含投予來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL族群至患者。

L.用於TIL製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施態樣中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
在一些實施態樣中，密閉系統包括例如實例16所述之魯爾鎖及熱封系統。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用如實例16所述的密閉系統。在一些實施態樣中，將TIL根據實例16第8.14節「最終調配及填充」所述之方法調配到最終產物調配物容器中。
如FDA網站上所提供，使用無菌方法的密閉系統係已知且廣為描述。見https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm，如上參照且提供於以下相關部分。

介紹
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。此指南描述使用這些裝置的建議作業及程序。此指南並不涉及無菌連接裝置廠商必須提交給FDA以獲得核准或上市許可證的資料或資訊。也很重要的是應注意，使用經核准或許可的無菌連接裝置於非標示核准之目的，可造成該裝置依據聯邦食品、藥品及化妝品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)被視為攙假及不實標示。
在一些實施態樣中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到準備將TIL投予至患者或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施態樣中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施態樣中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之介質係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施態樣中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施態樣中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施態樣中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。

C.細胞培養
在一實施態樣中，用於擴增TIL之方法(包括該些以上討論以及圖8例示者)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞介質、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞介質或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞介質。在一些實施態樣中，介質係不含血清介質，如例如實例21中所述。在一些實施態樣中，在第一擴增中之介質係不含血清。在一些實施態樣中，在第二擴增中之介質係不含血清。在一些實施態樣中，在第一及第二擴增中之介質皆不含血清。在一實施態樣中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞介質(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的介質的量及介質類型的數量。在一實施態樣中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質係未經過濾。使用未經過濾細胞介質可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施態樣中，該方法的期間包含自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在其中含有細胞介質之第一氣體可通透容器中培養腫瘤組織樣本；自腫瘤組織樣本獲得TIL；在含有細胞介質之第二氣體可通透容器中擴增TIL數量一段約7至14天例如約11天的期間。在一些實施態樣中，REP前係約7至14天，例如約11天。在一些實施態樣中，REP係約7至14天，例如約11天。
在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施態樣中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施態樣允許細胞族群自約5×105 細胞/cm2 擴增至介於10×106 與30×106 細胞/cm2 之間。在一實施態樣中，此係未進行餵養。在一實施態樣中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的介質位在約10 cm的高度。在一實施態樣中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施態樣中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與介質混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al. ,J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292。

A.可選的TIL基因工程改造
在一些實施態樣中，TIL視需要經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。
B.可選的TIL冷凍保存
主體TIL族群或經擴增TIL族群視需要可經冷凍保存。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於治療性TIL族群。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於圖8的例示性步驟F中的TIL。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施態樣中，冷凍保存使用冷凍保存介質執行。在一些實施態樣中，冷凍保存介質含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全介質中且視需要洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用CS10冷凍保存介質(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存介質冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用1：1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用約1：1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
如上於步驟A至E所討論，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。
如上所討論且例示於如圖8中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施態樣中，在第二擴增(例如根據圖A步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係根據實例16所提供之方法冷凍保存。
在一些實施態樣中，在根據步驟B之第一擴增後的主體TIL族群或在一或多個根據步驟D之第二擴增後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全介質中且視需要洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可經受步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL族群可經受基因修飾以用於合適治療。

II.治療患者之方法
治療方法始於初始TIL收集及培養TIL。該等方法皆已由所屬技術領域例如Jinet al., J. Immunotherapy , 2012, 35(3):283-292描述，其全文以引用方式併入本文中。治療方法之實施態樣係描述於以下所有章節，包括實例。
根據本文所述之方法包括例如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如例如圖8所述)產生的擴增TIL有治療癌症患者的具體用途(例如Goff, et al.,J. Clinical Oncology , 2016, 34(20):2389-239以及補充內容所述)；其全文以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，TIL係如先前描述生長自轉移性黑色素瘤的經切除之寄存物(見Dudley, et al.,J Immunother ., 2003, 26:332-342；其全文以引用方式併入本文中)。新鮮腫瘤可在無菌條件下分割。可收集代表性樣本進行正式病理分析。可使用2 mm3 至3 mm3 的單一片段。在一些實施態樣中，獲得每患者5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施態樣中，獲得每患者20、25或30個樣本。在一些實施態樣中，獲得每患者20、22、24、26或28個樣本。在一些實施態樣中，獲得每患者24個樣本。樣本可放入24孔板之個別孔中，維持於含有高劑量IL-2 (6,000 IU/mL)之生長介質中且監測腫瘤的破壞及/或TIL的增生。任何在處理後仍有存活細胞的腫瘤可如本文所述經酶消化成單一細胞懸浮液且經冷凍保存。
在一些實施態樣中，成功生長的TIL可經取樣進行表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)且當可用時在自體腫瘤測試。如果整夜共培養產生干擾素-γ (IFN-γ)水準˃ 200 pg/mL且為背景的二倍，則TIL可被視為反應性。(Goff, et al.,J Immunother. , 2010, 33:840-847；其全文以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，可選擇具有自體反應性或足夠生長模式證據的培養進行第二擴增(例如根據圖8步驟D提供的第二擴增)，包括有時稱為快速擴增(REP)的第二擴增。在一些實施態樣中，選擇具有高自體反應性(例如在第二擴增期間高增生)的擴增TIL進行額外第二擴增。在一些實施態樣中，選擇具有高自體反應性(例如在圖8步驟D提供的第二擴增期間的高增生)的TIL進行根據圖8步驟D的額外第二擴增。
在一些實施態樣中，患者並不直接移入ACT(過繼性細胞轉移)，例如，在一些實施態樣中，不立即利用在腫瘤收集及/或第一擴增後的細胞。在該些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前2天解凍。在該些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前1天解凍。在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前立即解凍。
輸注袋TIL冷凍保存樣本的細胞表型可藉由流動式細胞測量術(例如FlowJo)分析表面標誌CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA (BD BioSciences)，以及藉由本文所述之任何方法分析。使用標準連結酶免疫吸收測定技術測量血清細胞介素。血清IFN-g上升定義為˃100 pg/mL且大於4 3基線水準。
在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖8例示者)產生之TIL提供意外改善TIL的臨床療效。在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖8例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8例示之方法以外的方法)產生之TIL展現增加的臨床療效。在一些實施態樣中，除該些在本文中描述之方法以外的方法包括稱為過程1C及/或第1代(Gen 1)的方法。在一些實施態樣中，增加療效係藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應測量。在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖8例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8例示之方法以外的方法，例如第1代過程)產生之TIL展現類似的發生反應所需時間(time to response)及安全性輪廓。
在一些實施態樣中，IFN-γ指示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施態樣中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖8中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ水準來測量。在一些實施態樣中，IFN-γ增加指示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的治療療效。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖8中描述之方法)製備之TIL治療之個體的離體TIL中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖8中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖8中描述之方法)製備之TIL治療之個體的TIL血清中測量。
在一些實施態樣中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖8中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖8例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施態樣中，顯著改良之多株性及/或增加之多株性指示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施態樣中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施態樣中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。
療效的測量可包括疾病控制率(DCR)以及整體反應率(ORR)，如所屬技術領域中已知及本文中所述。

1.治療癌症及其他疾病之方法
本文所述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一實施態樣中，彼等用於治療過度增生性病症。彼等亦可用於治療其他如本文及以下段落所述之病症。
在一些實施態樣中，過度增生性病症係癌症。在一些實施態樣中，過度增生性病症係實質腫瘤癌症。在一些實施態樣中，實質腫瘤癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施態樣中，實質腫瘤癌係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏 淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。
在一實施態樣中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
在本文中描述之化合物及化合物之組合在治療、預防及/或處理所示疾病或病症的療效可使用各種所屬技術領域中已知之模型測試，該等模型提供人疾病治療之指南。例如，用於判定卵巢癌治療療效的模型係描述於例如Mullany,et al. ,Endocrinology 2012,153, 1585-92；及Fong,et al. ,J. Ovarian Res. 2009,2, 12。用於判定胰癌治療療效的模型係描述於Herreros-Villanueva,et al. ,World J. Gastroenterol. 2012,18, 1286-1294。用於判定乳癌治療療效的模型係描述於例如Fantozzi,Breast Cancer Res. 2006,8, 212。用於判定黑色素瘤治療療效的模型係描述於例如Damsky,et al. ,Pigment Cell & Melanoma Res. 2010,23, 853-859。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Meuwissen,et al. ,Genes & Development , 2005,19, 643-664。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Kim,Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009,2, 55-60；及Sano,Head Neck Oncol. 2009,1, 32。
在一些實施態樣中，IFN-γ指示過度增生性病症治療的治療療效。在一些實施態樣中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖8中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中之細胞介素IFN-γ水準來測量。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL提供經本方法之TIL治療之個體相較於經使用稱為過程1C(如圖13例示)之方法所製備的TIL治療之個體的血液中增加之IFN-γ。在一些實施態樣中，IFN-γ增加指示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的治療療效。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於來自經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的離體TIL中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血液中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血清中測量。
在一些實施態樣中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖8中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖8例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施態樣中，顯著改良之多株性及/或增加之多株性指示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施態樣中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施態樣中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施態樣中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖8體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。

2.共投方法
在一些實施態樣中，如本文所述產生之TIL(包括例如衍生自圖8之步驟A至F所述之方法的TIL)可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(lambrolizumab, MK03475 or MK-3475, Merck; Keytruda®)、人源化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011, Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施態樣中，PD-1抗體係來自殖株：RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell cat# BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且破壞PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中的抗體包括BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A (Genentech)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、破壞PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。在一些實施態樣中，當個體具有的癌症類型為單獨投予抗PD-1抗體所難治時，對於投予根據步驟A至F產生之TIL組合的個體共投抗PD-1抗體。在一些實施態樣中，當患者具有難治性黑色素瘤時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施態樣中，當患者具有非小細胞肺癌(NSCLC)時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。

3.可選的患者淋巴球耗盡前處理
在一實施態樣中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，本發明包括用於治療已先經非骨髓清除式化療治療之患者的癌症之TIL族群。在一實施態樣中，TIL族群係用於輸注投予。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2(阿地介白素，以PROLEUKIN市售)的靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施態樣中，TIL族群係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL族群之後投予。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴球耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施態樣在導入本發明之TIL之前，對患者進行淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
一般來說，淋巴球耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。該等方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother . 2011,60, 75-85、Muranski,et al. ,Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006,3, 668-681、Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008,26, 5233-5239及Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005,23, 2346-2357，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，環磷醯胺係以100 mg/m2 /天、150 mg/m2 /天、175 mg/m2 /天、200 mg/m2 /天、225 mg/m2 /天、250 mg/m2 /天、275 mg/m2 /天或300 mg/m2 /天之劑量投予。在一些實施態樣中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4至5天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一些實施態樣中，淋巴球耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至患者執行。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以25 mg/m2 /天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一實施態樣中，淋巴球耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2 /天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2 /天共五天執行。

4.IL-2方案
在一實施態樣中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包含靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體，始於投予治療有效部分的治療性TIL族群之後當天，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸液投予直到耐受為止，最多14劑。在休息9天之後，可重複此時程再投予14劑，最多總共28劑。
在一實施態樣中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day,et al. ,J. Clin. Oncol. 1999,17, 2752-61及Eton,et al. ,Cancer 2000,88, 1703-9，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，漸減IL-2方案包含在6小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在12小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在24小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在72小時內靜脈內投予 4.5×106 IU/m2 。此治療週期可每28天重複一次，最多可達四個週期。在一實施態樣中，漸減IL-2方案包含第1天18,000,000 IU/m2 ，第2天9,000,000 IU/m2 及第3及4天4,500,000 IU/m2 。
在一實施態樣中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。

5.過繼性細胞轉移
過繼性細胞轉移(ACT)是一種非常有效的免疫療法形式且涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移至癌症患者。ACT是涉及體外辨識具有抗腫瘤活性之淋巴球、體外擴增這些細胞至大量及將彼等輸注至荷癌宿主的治療方式。用於過繼性轉移之淋巴球可衍生自經切除之腫瘤的基質(腫瘤浸潤淋巴球或TIL)。用於ACT之TIL可如本文所述製備。在一些實施態樣中，TIL係根據例如圖8描述之方法製備。如果彼等經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)、經混合之淋巴球腫瘤細胞培養(MLTC)濃化或使用自體抗原呈現細胞及腫瘤衍生肽選殖，則彼等亦可衍生自或來自血液。其中淋巴球源自待輸注荷癌宿主的ACT稱為自體ACT。美國專利公開號2011/0052530關於一種用於執行過繼性細胞療法以促進癌症消退之方法，主要用於治療罹患轉移性黑色素瘤的患者，該案全文以引用方式併入本文中以用於這些方法。在一些實施態樣中，TIL可如本文所述投予。在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL及/或細胞毒性淋巴球可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL及/或細胞毒性淋巴球的投予可視需要持續進行。

6.例示性治療實施態樣
在一些實施態樣中，本揭露提供用腫瘤浸潤淋巴球(TIL)族群治療癌症之方法，該方法包含步驟：(a)自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；(b)在第一細胞培養基中執行第一TIL族群的初始擴增以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用骨髓樣人工抗原呈現細胞(骨髓樣aAPC)族群執行第二TIL族群的快速擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群在快速擴增開始7天後於數量上高於第二TIL族群至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2及OKT-3；(d)投予治療有效部分的該第三TIL族群至癌症患者。在一些實施態樣中，本揭露用於治療癌症之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)族群，其中該TIL族群可藉由包含步驟之方法獲得：(b)在第一細胞培養基中執行自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群的初始擴增以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用骨髓樣人工抗原呈現細胞(骨髓樣aAPC)族群執行第二TIL族群的快速擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群在快速擴增開始7天後於數量上高於第二TIL族群至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2及OKT-3；(d)投予治療有效部分的該第三TIL族群至癌症患者。在一些實施態樣中，方法包含自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群之第一步驟(a)。在一些實施態樣中，該IL-2係以約3000 IU/mL的初始濃度存在且OKT-3抗體係以約30 ng/mL的初始濃度存在於該第二細胞培養基中。在一些實施態樣中，第一擴增係於不超過14天的期間執行。在一些實施態樣中，第一擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對aAPC族群的比例係介於1至80與1至400之間。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對aAPC族群的比例係約1至300。在一些實施態樣中，所治療的癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌及子宮頸癌所組成之群組。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係卵巢癌。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係子宮頸癌。在一些實施態樣中，治療癌症之方法進一步包含在向患者投予第三TIL族群之前用非骨髓清除式淋巴球耗盡方案治療該患者的步驟。在一些實施態樣中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。在一些實施態樣中，用於治療之TIL已與一或多種靶向如本文所述之基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之sd-RNA接觸，該sd-RNA可在第一及/或第二擴增期間(例如根據圖8之步驟B、C及/或D)添加至細胞培養基，其中TIL及其他劑可以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量添加。在一些實施態樣中，用於治療之TIL已與一或多種靶向如本文所述之基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之sd-RNA接觸，該sd-RNA可在第一及/或第二擴增期間(例如根據圖8之步驟B、C及/或D)以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。在一實施態樣中，用於治療之TIL已與一或多種靶向如本文所述之基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之sd-RNA接觸，其中TIL及其他劑可在第一及/或第二擴增期間(例如根據圖8之步驟B、C及/或D)以選自由0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL所組成之群組的量添加。在一實施態樣中，用於治療之TIL已與一或多種靶向如本文所述之基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB)之sd-RNA接觸，其中TIL及其他劑可在第一及/或第二擴增期間(例如根據圖8之步驟B、C及/或D)以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。

實例
在本文中涵蓋的實施態樣現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。

實例1：密閉系統測定
如本文中所討論，開發規程及測定用於在密閉系統中自患者腫瘤產生TIL。
此實例描述用於在G-REX裝置中自患者經切除之腫瘤組織產生臨床相關數量的TIL及冷凍保存最終細胞產物的新穎的簡化程序。此程序的額外態樣描述於實例2至8。

程序
事前準備：第0天(提前至多36小時執行)，藉由用50 µg/mL建它黴素補充500 mL Hanks平衡鹽溶液來製備TIL單離洗滌緩衝液(TIWB)。就10 mg/mL建它黴素儲備溶液而言，轉移2.5 mL至HBSS。就50 mg/mL儲備溶液而言，轉移0.5 mL至HBSS。
依照CM2指示的LAB-005「製備用於PreREP及REP之介質」，用GlutaMaxTM 製備CM1介質。儲存在4℃下至多24小時。使用前允許在37℃下溫熱至少1小時。
自-20℃冷凍器移出IL-2等分試樣且將等分試樣放入2至8℃冰箱中。移出腫瘤樣品且儲存在4℃下直到準備處理為止。
未使用的腫瘤在HypoThermasol中運送或以在CryoStor CS10中之冷凍片段運送(兩者皆可購自BioLife Solutions, Inc.)。

TIL腫瘤處理
將下列材料視需要無菌轉移至BSC，且根據下表16標示。
將5 mL建它黴素轉移至HBSS瓶。標示為TIWB。渦漩混合。吸取50 mL TIWB至各培養皿。使用長鑷子，將腫瘤自樣品瓶移出並轉移至洗滌1培養皿。在洗滌培養皿中在環境溫度下孵養腫瘤3分鐘。將腫瘤轉移至洗滌培養皿且在洗滌培養皿中在環境溫度下孵養腫瘤3分鐘。在新的洗滌培養皿中重複洗滌。
測量且記錄腫瘤長度。將腫瘤片(tumor pieces)執行初始分割成10個中間片且保留各中間片的腫瘤結構。一次處理一個中間腫瘤片，小心地將腫瘤切成至多3x3x3 mm片段。對剩餘的中間腫瘤片重複。
如果可用的腫瘤片段少於4個，將其他片段當作可用來使用以達成40個片段的目標。當小於40個片段時，將10至40個放入單一G-Rex 100M培養瓶中。

接種G-Rex 100M培養瓶
將下列材料視需要無菌轉移至BSC，且根據下表4標示。
每公升的CM1用1 mL的IL-2儲備溶液(6×106 IU/mL)補充。
將1000 mL之含有6,000 IU/mL的IL-2之預熱CM1放入依照下表5判定之各所需的G-REX 100M生物反應器中。使用移液吸管，將適當數量的腫瘤片段轉移至各G-Rex 100M培養瓶，依照表5分布片段。當轉移至G-Rex 100M培養瓶之一或多個腫瘤片段漂浮時，獲得一個額外的若可用之腫瘤片段且將其轉移至G-Rex 100M培養瓶。記錄添加至各培養瓶的片段總數。將各G-REX 100M生物反應器放入37℃、5% CO2孵養箱中。
當獲得＞41個片段時，將1000 mL的預熱完全CM1放入第二G-REX 100M生物反應器中。


事前製備：第11天(提前至多24小時製備)
用GlutaMax製備6 L的CM2。使用CM2指示的參考實驗室程序「製備用於PreREP及REP之介質」。使用前在37℃下溫熱1小時。解凍IL-2等分試樣：自冷凍器移出IL-2等分試樣且放在4℃下。

收集TIL(第11天)
自孵養箱移出G-REX -100M培養瓶且放在BSC2中。不擾動培養瓶底部的細胞。使用GatherRex或蠕動泵自培養瓶抽吸約900 mL的細胞培養上清液。藉由輕柔渦旋培養瓶來重懸TIL。觀察到所有細胞皆與膜脫離。將殘餘之細胞懸浮液轉移至適當大小的血液轉移包(300至1000mL)。小心不要讓片段轉移至血液轉移包。將轉移包用4”血漿轉移組穿刺。混合細胞懸浮液且使用3 mL注射器移出1 mL TIL懸浮液進行細胞計數。將轉移包放入孵養箱中直到準備使用為止。

介質製備
允許介質在37℃下溫熱＞1hr。添加3 mL的6×106 IU/mL rhIL-2原液至6 L CM2以達到3,000 IU/mL rhIL-2的最終濃度(「完全CM2」)。將具有母魯爾(female luer)之4”血漿轉移組無菌接合至1L轉移包。將500mL完全CM2轉移至1L轉移包。使用帶針頭的1.0mL注射器抽取150 µL的1 mg/mL抗CD3(殖株OKT3)且轉移至500 mL「完全CM2」。使用前儲存在37℃下。

培養瓶製備
將4.5L「完全CM2」轉移至G-REX -500M培養瓶且將培養瓶放入37℃孵養箱中直到就緒為止。

解凍經照射的餵養細胞
利用來自二或更多個供體之5.0×109 個同種異體經照射餵養細胞以供使用。自LN2冷凍器移出餵養細胞。在37℃孵養箱或珠浴中解凍餵養細胞。當幾乎完全解凍但仍冰冷時，自浴中移出餵養細胞。將各餵養細胞袋直接添加至開放的G-Rex 500M以確保足夠數量的經照射細胞(5×109 個細胞，+/-20%)。移出具有500 mL「完全CM2」+OKT3之1L轉移包且轉移至BSC。將餵養細胞袋的所有內容物抽取至注射器，記錄體積，且將5.0×109 個同種異體經照射餵養細胞分配至轉移包。
當+/-10%的目標細胞數量(5.0×109 )達到＞70%存活性時，即繼續進行。當小於90%的目標細胞數量(5.0×109 )達到＞70%存活性時，解凍另一袋且重複上述。當達成大於110%的目標細胞數量時，計算所欲細胞劑量所需之適當體積且繼續進行。

在G-REX 500M培養瓶中共培養TIL與餵養細胞
自孵養箱移出含有製備介質的G-REX 500M培養瓶。將餵養細胞轉移包附接至G-REX -500M且允許袋中的內容物引流至500M中。計算要添加的TIL懸浮液體積以達成200×106 個總存活細胞。
(TVC/mL)/200 x 106 =mL
當TIL介於5至200×106 個之間的總存活細胞時，將所有TIL(總體積)添加至G-REX-500M。當TIL計數大於200×106 個總存活細胞時，添加欲將200×106 個TIL分布至個別G-REX-500M所需的計算體積。將剩餘的TIL離心且以至多108 /mL於CS10中冷凍於至少二個冷凍小瓶，且標示TIL識別及冷凍日期。
將G-REX -500M放入37℃、5% CO2 孵養箱中5天。

事前準備：第16至18天
在37℃下溫熱用於小於50×106 個TIL起始培養之一個10L袋子的AIM V、大於50×106 個TIL起始則溫熱二個袋子至少1 hr或準備使用為止。

執行TIL細胞計數：第16至18天
自孵養箱移出G-REX-500M培養瓶且小心不擾動培養瓶底部的細胞培養。自G-REX-500M培養瓶移出4 L的細胞培養基且放入無菌容器中。渦漩G-REX -500M直到所有TIL自膜重懸。將細胞懸浮液轉移至2L轉移包。保留500M培養瓶以供稍後使用。根據下式計算繼代培養需要的培養瓶總數。將分數進位。
總存活細胞 /1.0 x10 = 培養瓶數量

製備CM4
每二個所需的500M培養瓶製備一個10L袋子的AIM-V。視需要溫熱額外介質。就所需的每10 L的AIM-V而言，添加100 mL的GlutaMAX以製備CM4。用rhIL-2補充CM4介質以達3,000 IU/mL rhIL-2之最終濃度。將細胞培養分瓶。將各G-REX -500M填充至5 L。將TIL體積平均分布於計算數量的G-REX -500M之間。將培養瓶放入37℃、5% CO2 孵養箱中直到REP第22天收集。

事前準備：第22至24天
藉由添加40mL的25% HSA至二個1L袋子的PlasmaLyte A 7.4中之各者來製備2L的1% HSA洗滌緩衝液。匯合至LOVO輔助袋子。用IL-2以600 IU/mL補充200 mL CS10。在4℃下預冷卻四個750 mL鋁冷凍罐。

收集TIL：第22至24天
自37℃孵養箱移出G-REX -500M培養瓶且小心不擾動培養瓶底部的細胞培養。自各培養瓶抽吸且棄置4.5 L的細胞培養上清液。渦漩G-REX -500M培養瓶至完全重懸TIL。收集TIL至生物處理袋。將袋子混合均勻且使用3mL注射器採集2×2 mL樣本進行細胞計數。秤重袋子且發現初始與最終重量之間的差異。使用下列計算判定細胞懸浮液的體積。
細胞懸浮液淨重 (mL)/1.03= 體積 (mL)
過濾TIL及製備LOVO來源袋。一旦所有細胞皆轉移至LOVO來源袋，關閉所有管夾管夾且密封LOVO來源袋管路以移除過濾器且秤重。計算體積。
調配TIL 1:1於補充有600 IU/mL rhIL-2之冰冷CS10中。
計算所需的冷凍袋的需要數量。
( 細胞產物的體積 x2)/100= 需要的袋子數量 ( 向下捨入 )
計算分配至各袋子的體積。
( 細胞產物的體積 x2)/ 需要的袋子數量 = 添加至各袋子的體積
將表6中之下列材料無菌轉移至BSC。

TIL調配
連接LOVO最終產物、CS10袋子魯爾鎖及適當數量的冷凍袋。所需CS10體積的量相當於LOVO最終產物袋子的體積。藉由翻轉混合LOVO最終產物袋子。
將100 mL經調配的產物轉移至各冷凍袋。自冷凍袋移除所有氣泡且密封。將密封袋子轉移至4℃且放入預冷卻的鋁冷凍罐。
使用控速冷凍器(CRF)冷凍保存TIL。
遵守控速冷凍器的標準程序。在使用CRF後，將冷凍袋儲存於液態氮(LN2 )。

實例2：淋巴球耗盡
細胞計數可在第7天及淋巴球耗盡之前進行。最終細胞產物包括經調配於最小50% HypoThermosol™於Plasma-Lyte A™中(體積/體積)及至多含有300 IU/mL IL2之0.5% HSA(相容於人輸注)中之至多大約150×109 個存活細胞。最終產物可用於以二種輸注體積中之一者投予：
1) 250 mL(於300-mL容量輸注袋中)，當所收集的總TIL≤ 75×109 個
或
2) 500 mL(於600-mL容量輸注袋中)，當所收集的總TIL＜ 150×109 個
由於在REP步驟期間患者間T細胞擴增率的差異，因此無法預測可經產製用於每位患者最終TIL輸注產物之細胞總數。在3至14天REP之第3、4、5、6、7天的細胞下限設定係基於為了做出使用環磷醯胺加上氟達拉濱化療方案淋巴球耗盡患者的決定所需的最小細胞數量。一旦我們基於此最小達到細胞數量開始進行淋巴球耗盡，我們就致力於以我們在REP到第3至14天中任一天且在許多情況中到第7天所產生的可用數量TIL治療患者。輸注範圍上限(150×109 個存活細胞)係基於已知發表的達到臨床反應之安全輸注上限。Radvanyi, et al.,Clin Cancer Res 2012,18, 6758-6770。

實例3：過程2A-第0天
此實例描述在實例3至6中描述之2A過程的詳細第0天規程。
製備。
確認腫瘤洗滌介質、CM1及IL-2在到期日以內。將CM1(細胞介質1)放入孵養箱中。
方法。
製備含有6000 IU/mL IL-2之TIL介質CM1：1L CM1及1ml IL-2 (6,000,000 IU/mL)。將25ml的CM1+IL2放入待用於當添加至G-REX片段之50 mL錐形管且放入37℃孵養箱中預熱。
將975 ml之含有6,000 IU/ml的IL-2之預熱CM1泵送至各G-REX 100MCS生物反應器。將G-REX 100MCS放在孵養箱中直到需要為止。

組織分割
記錄腫瘤處理的起始時間。將3至5 mL之腫瘤洗滌介質吸取至一個六孔板中之各孔用於過量腫瘤片。吸取50 mL的腫瘤洗滌介質以洗滌培養皿1至3及繫留培養皿(holding dish)。將二個150 mm分割培養皿放入生物安全櫃中。將3個無菌50 mL錐形管放入BSC中。添加5至20 mL的腫瘤洗滌介質至各錐形管。在腫瘤洗滌及分割過程期間，視需要將鑷子及解剖刀浸入腫瘤洗滌介質中。
將腫瘤自樣品瓶移出並轉移至洗滌1培養皿。在洗滌1培養皿中在環境中孵養腫瘤≥3分鐘。將腫瘤轉移至洗滌2培養皿。在洗滌2培養皿中在環境中孵養腫瘤≥3分鐘。將腫瘤轉移至洗滌3培養皿。在洗滌3培養皿中在環境中孵養腫瘤≥3分鐘。將腫瘤轉移至分割培養皿，測量並記錄腫瘤的長度。
將腫瘤片在分割培養皿中執行初始分割成中間片，小心保留各中間片的腫瘤結構。將任何不是正在分割成片段的中間腫瘤片轉移至組織繫留培養皿，以確保組織在整個分割程序期間維持水合。
一次處理一個中間腫瘤片，小心地在分割培養皿中將腫瘤切成大約3x3x3 mm片段。持續自中間腫瘤片分割片段，直到所有中間片的組織皆已評估。選擇較佳片段且使用移液吸管將至多4個較佳片段轉移至腫瘤片段培養皿一個圓圈中的洗滌介質液滴中。使用移液吸管解剖刀或鑷子，將盡可能多的不佳組織及廢棄物轉移至「不佳組織(Unfavorable Tissue)」。將所有剩餘組織放入六孔板中的一孔。(黃色脂肪組織或壞死組織指示不佳組織。)持續處理剩餘中間腫瘤片，一次處理一個中間片直到整個腫瘤皆已處理。
將至多50個最佳腫瘤片段轉移至含有CM1之標示腫瘤片段的50 mL錐形管。自50 mL錐形管移除漂浮物。記錄片段及漂浮物數量。渦漩具有腫瘤片段之錐形管且將50ml錐形管之內容物倒入G-Rex 100MCS培養瓶中。如果轉移至G-Rex 100M培養瓶之一或多個腫瘤片段漂浮，自較佳組織培養皿獲得一個若可用之額外的腫瘤片段且將其轉移至G-Rex 100M培養瓶。
記錄孵養箱#及添加至各培養瓶的片段總數。將G-REX 100M生物反應器放入37℃、5% CO2 孵養箱中。

實例4：過程2A-第11天
此實例描述在實例3至6中描述之2A過程的詳細第11天規程。

事前準備。
處理前一天：
CM2可在處理發生前一天製備。放置在4℃下。
處理當天。
製備餵養細胞制具(harness)。每CTF-FORM-318製備5 mL的冷凍保存介質且放在4℃下直到需要為止。
製備G-Rex 500MCS培養瓶。使用10 mL注射器將每公升CM2(細胞介質2)0.5mL的IL-2(原液為6×106 IU/mL)經由未使用的無菌母魯爾接頭無菌轉移至生物處理袋。確保所有IL-2與介質混合。泵送4.5公升的CM2介質至G-Rex 500MCS中。將G-Rex 500MCS放入孵養箱中。

製備經照射餵養細胞
記錄1L轉移包(TP)的乾重。將500mL CM2藉由重量泵送至TP中。在37℃(+/- 1℃)水浴中解凍餵養細胞。將最終餵養細胞調配物混合均勻。使用5 mL注射器及無針埠，用一些細胞溶液潤洗埠以確保正確取樣且移出1ml的細胞，放入經標示用於計數的管中。對餵養細胞樣本執行單細胞計數且記錄資料並將計數原始資料黏貼至批次紀錄。如果細胞計數＜5×109 個，則解凍更多細胞、計數且添加至餵養細胞。重新秤重餵養細胞袋子且計算體積。計算要移出之細胞的體積。
添加餵養細胞至G-REX
均勻混合細胞且移出以上計算的體積以達成5.0×109 個細胞。丟棄不需要的細胞。使用1mL注射器及18G針頭抽取0.150mL的OKT3，移除針頭且經由母魯爾轉移至餵養細胞TP。將餵養細胞袋子無菌接合至G-Rex 500MCS上的紅色管線。鬆開管線管夾且允許餵養細胞藉由重力流入培養瓶中。將G-Rex 500MCS放回孵養箱且記錄時間。
製備TIL：記錄TIL收集的起始時間
自孵養箱小心移出G-Rex 100MCS。使用GatheRex轉移約900mL的培養上清液至1L轉移包。渦漩培養瓶直到所有細胞皆自膜脫附。檢查膜以確定所有細胞皆脫附。傾斜培養瓶遠離收集管路並允許腫瘤片段沿著邊緣沉降。緩慢地將培養瓶傾向收集管路，以使片段維持在培養瓶的對側。使用GatheRex將殘餘之細胞懸浮液轉移至300mL轉移包且避免腫瘤片段。重新檢查所有細胞皆自膜移出。如有需要，藉由鬆開GatheRex上的管夾且允許一些介質藉由重力流入G-Rex 100MCS培養瓶來回洗。劇烈拍打培養瓶以釋放細胞且泵送至300ml TP中。在收集完成後，關閉紅色管線且熱封。
記錄含有細胞懸浮液之300ml TP的質量(包括乾質量)且計算細胞懸浮液的體積。均勻混合細胞。無菌附接5mL注射器抽取1mL，放入冷凍小瓶中。用第二注射器重複。這些係用於存活性細胞計數。放入孵養箱中且記錄放入孵養箱中的時間。在各樣本執行單細胞計數且記錄。如有需要，調整總存活TIL密度至≤ 2x108 個存活細胞。計算欲移除之體積或附註無須調整。
將過量細胞轉移至適當大小錐形管且放入孵養箱中，把蓋子鬆開用於稍後冷凍保存。
將G-Rex 500MCS自孵養箱移出且將細胞泵送至培養瓶中。將G-Rex 500MCS放回孵養箱且記錄放入G-Rex孵養箱的時間。

冷凍保存過量品
計算欲添加至細胞之冷凍介質的量：
在20℃下以400 x g離心TIL 5 min，使用全速煞車及全速加速。無菌抽吸上清液。將細胞重懸於剩餘流體中，且當處於重懸狀態時，緩慢添加經製備的冷凍介質。等分且放入-80℃中。

實例5：過程2A-第16天
此實例描述在實例3至6中描述之2A過程的詳細第16天規程。

收集且計數TIL。
在37℃孵養箱中溫熱用於小於50×106 個TIL起始培養之一個10L袋子的CM4至少30分鐘或準備使用為止。自孵養箱移出G-Rex 500MCS培養瓶且使用GatheRex將約4L的培養上清液轉移至10L Labtainer。根據適當的GatheRex收集指示收集。
在移出上清液後，渦漩培養瓶直到所有細胞皆自膜脫附。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。使用GatheRex將殘餘之細胞懸浮液轉移至2L TP且維持傾斜邊緣直到所有細胞皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。劇烈拍打培養瓶以釋放細胞。將細胞添加至2L TP。將2 L轉移包熱封。記錄含細胞懸浮液之轉移包的質量並計算細胞懸浮液的體積。判定細胞懸浮液體積，包括乾質量。
輕柔混合細胞且抽取11ml並如表21所示等分。
基於細胞懸浮液體積及移出用於QC之體積(11 mL)，計算2 L轉移包中之新體積且記錄體積。
接種且訂購無菌性測試。將黴漿菌樣本儲存在4℃下黴漿菌測試準備架。放在一旁直到TIL接種為止。

細胞計數：
執行單細胞計數且記錄資料並將計數原始資料黏貼至批次紀錄。記載稀釋。記載細胞計數器計數程式。驗證正確的稀釋輸入細胞計數器中。計算繼代培養所需的培養瓶總數。

添加IL-2至CM
放置10L袋子的含有Glutamax之Aim V。抽取5mL的IL-2至注射器(最終濃度為3000 IU/ml)且將IL-2分配至袋子中。重複於剩餘的Aim V袋子。

製備G-REX500MCS培養瓶
判定欲添加至培養瓶之CM4的量。記錄每培養瓶添加的細胞體積及CM4 5000mL-A的體積。將培養瓶放入37℃、5% CO2 中。

用TIL接種培養瓶
將細胞產物袋放在分析天平上且記錄將TIL添加至G-REX培養瓶的時間。均勻混合細胞。重複進行細胞轉移至所有培養瓶。將培養瓶放入37℃、5% CO2 中且記錄將TIL添加至G-REX培養瓶的時間。向微生物實驗室訂購落菌培養皿測試以及有氧及厭氧無菌性測試。
流動式或過量細胞冷凍保存：
計算所需之冷凍介質的量：目標細胞濃度為1×108 個/ml；記錄移出之總細胞數。目標細胞濃度為1×108 個細胞/mL。計算欲添加之冷凍介質的總體積。
製備冷凍保存介質且放置在40℃下直到需要為止。在20℃下以400 x g離心TIL 5 min，使用全速煞車及全速加速。抽吸上清液。輕柔拍打管底部以將細胞重懸於剩餘流體中，且當輕柔拍打管時，緩慢添加經製備的冷凍介質。等分至適當大小的已標示冷凍管。放入-80℃冷凍器中。在72小時內，轉移至永久儲存地點且記載及記錄放入-80℃冷凍器中的日期及時間。

實例6：過程2A-第22天
此實例描述在實例3至6中描述之2A過程的詳細第22天規程。

事前準備
將三個1L袋子的PlasmaLyte A放入BSC中。製備匯合且標示PlasmaLyte A袋子為1% HSA。裝載120 mL的25% HSA進行轉移。將HSA轉移至3L PlasmaLyte袋子。混合均勻。自3公升袋子上的無針埠移出5 mL的含有1% HSA之PlasmaLyte。標示為LOVO洗滌緩衝液及日期。
IL-2製備
自5 mL注射器分配Plasmalyte/1%HSA至經標示的50 ml無菌錐形管。將0.05mL IL-2原液添加至含有PlasmaLyte之管且標示IL-2 6X104 。儲存在2至8℃下。

製備細胞
自37℃移出G-REX 500M培養瓶。使用GatheRex泵，將第一培養瓶的體積減少。渦漩G-REX 500M培養瓶直到TIL完全重懸，同時避免噴濺或起泡。確定所有細胞皆自膜脫離。傾斜G-Rex培養瓶以使細胞懸浮液匯合在收集吸管位處的培養瓶該側。開始GatherRex以收集細胞懸浮液且確保自培養瓶移出所有細胞。如果仍有細胞在培養瓶中，則將100mL的上清液回加至培養瓶、渦漩且收集至細胞懸浮液袋子。重複於額外培養瓶。熱封且標示為LOVO來源袋。記錄乾重。
允許TIL自細胞懸浮液袋子經由過濾器引流至LOVO來源袋。一旦所有細胞皆轉移至LOVO來源袋，關閉所有管夾、在緊鄰記號上方熱封且分離。均勻混合袋子且使用二支3mL注射器自注射器樣本埠採集2個獨立的2 mL樣本用於細胞計數及存活性。秤重袋子且判定初始與最終重量之間的差異。記錄資料且放入孵養箱中，包括乾質量。

細胞計數。
對各樣本執行單細胞計數且記錄資料並將計數原始資料黏貼至批次紀錄。記載細胞計數器計數程式。驗證正確的稀釋輸入細胞計數器中。判定有核細胞總數。判定待移出保留之TNC數量=1.5 X 1011 個細胞用於LOVO處理。將移出之細胞放入適當大小的容器用於棄置(disposal)。

LOVO收集
事前準備中具有Baxter延長組之10L Labtainer是接合至LOVO套組之置換濾液袋。遵守LOVO顯示。要開始程序，自下拉式選單選擇「TIL G-Rex收集(TIL G-Rex Harvest)」規程且遵守指示。
當最終產物體積(滯留物體積)螢幕顯示時，使用來自表15之總有核細胞(TNC)值，判定下表中之最終產物目標體積(表16)。在LOVO程序設定期間輸入與該細胞範圍相關之最終產物體積(mL)。

要靶向表16所指明之體積，輕觸最終產物體積(mL)輸入欄位。顯示數字鍵盤。輸入所欲的最終產物體積，單位為mL。
記下所顯示之濾液及溶液1(讀為PlasmaLyte)的體積。記下所顯示之濾液及溶液1(讀為PlasmaLyte)的體積。
預先包覆IP袋子。混合來源袋。在LOVO程序期間，系統自動暫停以允許作業者與不同袋子互動。在不同暫停期間顯示不同螢幕。遵守各螢幕對應指示。

來源潤洗暫停
在引流來源袋後，LOVO添加洗滌緩衝液至來源袋以潤洗袋子。在組態體積的洗滌緩衝液經添加至來源袋後，LOVO自動暫停且顯示來源潤洗暫停(Source Rinse Paused)螢幕。
LOVO處理來自來源袋的潤洗液，接著繼續自動化程序。

混合IP袋子暫停
要製備用於另一通過旋轉機之通道的細胞，將IP袋子用洗滌緩衝液稀釋。在添加洗滌緩衝液至IP袋子後，LOVO自動暫停且顯示「混合IP袋子(Mix IP bag)」暫停螢幕。
當「混合IP袋子(Mix IP bag)」暫停螢幕顯示時，作業者倒轉IP袋子數次以徹底混合細胞懸浮液。遵守指示以恢復LOVO處理來自IP袋子的流體。

按摩IP角落暫停
在LOVO程序的最終洗滌循環期間，將細胞自IP袋子泵送通過旋轉機至滯留物(最終產物)袋子。當IP袋子清空時，將10 mL洗滌緩衝液添加至IP袋子的底埠以潤洗袋子。在添加潤洗液後，LOVO自動暫停且顯示「按摩IP角落(Massage IP corners)」暫停螢幕。
當「按摩IP角落(Massage IP corners)」暫停螢幕時，作業者按摩袋子角落以將任何殘餘細胞帶入懸浮液中。恢復LOVO以將潤洗液自IP袋子泵出。
在LOVO程序結束時，顯示移除產物螢幕(Remove Products Screen)。
以表17的格式記錄結果資料。
關閉LOVO關閉程序
記錄最終經調配的產物體積。從最終產物表計算所需之IL-2的量。
判定冷凍袋數量及保留體積
在以下的目標體積及保留表標示冷凍保存袋的數量及產物滯留樣本體積。
目標體積/袋子計算：(最終經調配的體積 - 因無法得到100%回收率所作之體積調整=10 mL)/袋子數量。
用1：1(體積:體積)的CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions)及IL-2製備細胞。
製備含有IL-2之細胞且連接設備。將細胞及設備放入運輸袋中且放置在2-8℃下≤ 15 min。

添加CS10
抽取在「最終經調配的產物體積(Final Formulated Product Volume)」表中判定的冰冷CS10之量。緩慢且在輕柔混合下將CS10(1：1，體積:體積)添加至細胞。
添加經調配的細胞產物至冷凍袋
將注射器置換為適用於待放入各冷凍袋中之細胞體積大小的注射器。混合細胞產物。打開通往細胞產物袋的管夾且抽取適當體積。

記錄最終產物體積
使用無針埠及適當大小注射器，抽取先前判定的保留量。將保留物放入標示「保留(Retain)」之50 mL錐形管。使用附接至制具的注射器，將所有空氣自袋子移除，抽取細胞至超過袋子進入管路約1”。放置在2至8℃下。混合細胞產物袋中的細胞且剩餘的CS750袋子在活栓上使用新的注射器重複步驟3至8，且使用新的注射器以獲得細胞保留物。保留物應放在一旁，待產物一放入CRF後即進行處理。

控速冷凍器(CRF)程序(亦見實例16)
將冷凍器保持在4℃直到準備添加樣本為止。添加樣本至CRF。
等待直到CRF回到4℃。一旦溫度達到後，遵守CRF程式進行冷凍保存。執行目視檢查冷凍袋下列項目(注意：不檢查過度或不足裝填)：容器完整性、埠完整性、密封完整性、細胞結塊存在及粒子存在。
將冷凍袋放入預處理的卡匣中且轉移至CRF中。將卡匣平均分布於CRF中的架上。將帶型熱電偶施加在中央卡匣或將虛擬袋(dummy bag)放在中央位置。
關閉CRF的門。一旦室溫度達到4℃+/-1.5℃。記錄產物轉移至CRF的時間及室溫度。
處理品管樣本
將下列材料視需要無菌轉移，且根據QC及滯留表25標示。1個細胞計數管、1個內毒素管、1個黴漿菌管、1個革蘭氏染色管、1個再刺激管及1個流動式管進行QC立即測試。將剩餘雙份(duplicate)管放入控速冷凍器。
細胞計數
對各樣本執行單細胞計數且記錄資料並將計數原始資料黏貼至批次紀錄。記載細胞計數器計數程式。驗證正確的稀釋輸入細胞計數器中。
冷凍保存調配後滯留細胞：將小瓶放入CRF中。在冷凍完成後移至儲存地點且記錄放入CFR中的日期及時間。記錄移至LN2 的日期及時間。
微生物測試：訂購有氧及厭氧無菌性測試。

冷凍保存後細胞產物袋
運行完成後停止冷凍器。將冷凍袋自卡匣移出。將卡匣轉移至汽相LN2。

實例7：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例1至10之TIL過程之組合。
使用實例1至10之過程，TIL係在實驗的一組中在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013,11: 37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+ 及CD8+ 兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL中偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+ 族群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中的IFN-γ及CD107a上升。

實例8：第2期、多中心、三研究世代黑色素瘤研究
此第2期、多中心、三研究世代的研究係設計來評估根據(如本文所述之)過程1C製造之TIL療法用於轉移性黑色素瘤患者的安全性及療效。研究世代一及二各將收案至多30名患者且研究世代三係再治療研究世代，即在至多十名患者進行第二次TIL輸注。前二個研究世代評估二種不同的製造過程：過程1C及過程2A的一實施態樣(分別描述於實例1至10)。研究世代一的患者接受新鮮、非冷凍保存的TIL且研究世代二的患者接受經由實例1至10產製冷凍保存產物描述之過程所製造的產物。研究設計顯示於圖26。該研究係第2期、多中心、三研究世代的研究，評估自體TIL用於治療轉移性黑色素瘤患者子族群之安全性及療效。關鍵納入標準包括：可測量的轉移性黑色素瘤及≥ 1個可部分切除用於TIL產製之病灶；至少一種現有線上全身性療法；年齡≥ 18；且ECOG體能狀態為0至1。治療研究世代包括非冷凍保存TIL產物(使用過程1C製備)、冷凍保存的TIL產物(使用過程2A的一實施態樣製備)及用TIL產物再治療無反應或在初始反應後進展的患者。主要終點為安全性且次要終點為療效，定義為客觀反應率(ORR)、完全緩解率(CRR)、無進展存活期(PFS)、反應持續時間(DOR)及整體存活期(OS)。

實例9：合格化經γ照射的周邊單核細胞個別批量
此實例描述使經γ照射的周邊單核細胞(PBMC，亦稱為MNC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為同種異體餵養細胞。
各批經照射的MNC餵養細胞係自個別供體製備。各批或供體在經純化的抗CD3(克隆OKT3)抗體及介白素2 (IL-2)存在下在REP中擴增TIL的能力係經個別篩檢。此外，各批餵養細胞在不添加TIL下測試，以驗證所接受的γ輻射劑量足以使彼等複製不能。

背景
經γ照射、生長停頓的MNC餵養細胞係TIL之REP所需。餵養細胞MNC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與REP培養瓶中的TIL交聯，刺激TIL擴增。餵養細胞批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、照射並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的患者不得輸注存活餵養細胞，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此餵養細胞藉由接受細胞γ-照射來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失MNC細胞的細胞存活性。

評估標準及實驗設置
以二個標準評估餵養細胞批量：1)彼等在共培養中擴增TIL的能力＞100倍，及2)彼等之複製不能性。
餵養細胞批量在迷你REP格式中利用二個在直立式T25組織培養培養瓶中生長的初代REP前TIL細胞系測試。餵養細胞批量係以二個不同的TIL細胞系測試，其中各TIL細胞系在REP中因應活化而增生的能力不同。一批過去已顯示符合以上標準的經照射的MNC餵養細胞在測試批量旁一起運行作為對照組。
為了確保所有單一實驗中的測試批量接受等效測試，相同REP前TIL細胞系的足夠原液可用於測試所有條件及所有餵養細胞批量。
每批測試的餵養細胞總共有六個T25培養瓶：REP前TIL細胞系#1(2個培養瓶)；REP前TIL細胞系#2(2個培養瓶)；及餵養細胞對照組(2個培養瓶)。評估含有TIL細胞系#1及#2的培養瓶中之餵養細胞批量擴增TIL的能力。評估餵養細胞對照組培養瓶中之餵養細胞批量的複製不能性。

實驗規程
第-2/3天，解凍TIL細胞系
製備CM2介質。在37℃水浴中溫熱CM2。製備40 ml的補充有3000IU/ml IL-2之CM2。保持溫熱直到使用。將20 ml不含IL-2的預熱CM2放入二個標示有所使用的TIL細胞系名稱之50ml錐形管中之各者。自LN2儲存移出二個指定的REP前TIL細胞系並將小瓶轉移至組織培養室。將小瓶放在密封夾鏈儲存袋中在37℃水浴中解凍，直到剩下少量的冰。
使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至經製備、標示的50ml錐形管中的20ml CM2中。使用不含IL-2的CM2補足至40ml以洗滌細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於補充有3000 IU/ml IL-2之5ml溫熱CM2中。
移出雙份小等分試樣(20µl)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。當計數時，將含有TIL細胞的50ml錐形管放入增濕37℃、5% CO2 孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。判定細胞濃度並將TIL稀釋至1×106 個細胞/ml於補充有3000 IU/ml IL-2之CM2中。
在增濕37℃孵養箱中視需要培養於24孔組織培養盤中盡可能多孔的2ml/孔中直到迷你REP的第0天。在分開的24孔組織培養盤上培養不同的TIL細胞系，以避免混淆及可能的交叉污染。

第0天，起始迷你REP
為欲測試的餵養細胞批量數製備足夠的CM2介質。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備800ml的CM2介質)。取等分試樣的一部分上述製備之CM2並補充3000 IU/ml IL-2以用於培養細胞。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備500ml的含3000 IU/ml IL-2之CM2介質)。
分開處理各TIL細胞系以預防交叉污染，自孵養箱移出有TIL培養的24孔板且轉移至BSC。
使用無菌移液吸管或100至1000µl吸量管及吸管尖，自所欲使用的TIL各孔移出約1ml的介質並放入24孔組織培養盤之未使用孔中。
使用新的無菌移液吸管或100至1000µl吸量管及吸管尖，將剩餘介質與TIL在孔中混合以重懸細胞，接著將細胞懸浮液轉移至標示TIL名稱且記錄體積的50ml錐形管中。
用儲備介質洗滌孔，並將該體積轉移至相同的50ml錐形管。將細胞在400 x CF下離心以收集細胞團塊。抽吸掉介質上清液並將細胞團塊重懸於含有3000 IU/ml IL-2之2-5ml的CM2介質中，所欲使用的體積基於收集的孔數及團塊大小而定，該體積應足以確保＞1.3 x 106 個細胞/ml的濃度。
使用血清吸管，將細胞懸浮液徹底混合並記錄體積。移出200µl，使用自動細胞計數器進行細胞計數。當計數時，將含有TIL細胞的50ml錐形管放入增濕、5% CO2 、37℃孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。記錄計數。
自孵養箱移出含有TIL細胞之50ml錐形管，並將細胞以1.3 x106 個細胞/ml之濃度重懸於補充有3000 IU/ml IL-2之溫熱CM2中。將50ml錐形管放回孵養箱，蓋子鬆開。
第二TIL細胞系重複以上步驟。
在將TIL接種至T25培養瓶進行實驗之前，將TIL如以下所示稀釋1:10以達1.3 x 105 個細胞/ml之最終濃度。

製備MACS GMP CD3純(OKT3)工作溶液
自4℃冰箱取出OKT3儲備溶液(1mg/ml)並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30ng/ml的OKT3。
在實驗的各T25培養瓶中，20ml需要600ng的OKT3；此相當於每20ml需要60µl的10µg/ml溶液，或每批餵養細胞的所有6個測試培養瓶需要360µl。
就每批測試的餵養細胞而言，製備400µl的1mg/ml OKT3之1:100稀釋液，工作濃度為10µg/ml(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備1600µl的1mg/ml OKT3之1：100稀釋液：16µl的1mg/ml OKT3+1.584ml的含3000 IU/ml IL-2之CM2介質)。

製備T25培養瓶
在製備餵養細胞之前，標示各培養瓶並用CM2介質填充培養瓶。將培養瓶放入37℃增濕5% CO2 孵養箱以保持介質溫熱，等待添加剩餘組分。一旦餵養細胞製備好，將組分添加至各培養瓶中的CM2中。

製備餵養細胞
此規程測試的每批最少需要78 x 106 個餵養細胞。由SDBB冷凍的每1ml小瓶在冷凍時具有100 x 106 個存活細胞。假設自LN2儲存解凍後有50%回收率，建議每批解凍至少二個1ml小瓶的餵養細胞，各REP給出預估100×106 個存活細胞。替代地，如果供應1.8ml小瓶，僅一個小瓶提供足夠的餵養細胞。
在解凍餵養細胞之前，為每批欲測試的餵養細胞預熱大約50ml的不含IL-2之CM2。自LN2儲存移出指定的餵養細胞批量小瓶、放入夾鏈儲存袋中並放在冰上。將密封夾鏈儲存袋內的小瓶浸入37℃水浴中解凍。自夾鏈袋移出小瓶、噴灑或擦拭70% EtOH並將小瓶轉移至BSC。
使用移液吸管，立即將餵養細胞小瓶的內容物轉移至50ml錐形管中的30ml溫熱CM2中。用小體積的CM2洗滌小瓶，以移除小瓶中的任何殘餘細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於4ml溫熱CM2加上3000 IU/ml IL-2中。移出200 µl，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。
將細胞以1.3×107 個細胞/ml重懸於溫熱CM2加上3000 IU/ml IL-2中。將TIL細胞自1.3×106 個細胞/ml稀釋至1.3×105 個細胞/ml。

設置共培養
將TIL細胞自1.3×106 個細胞/ml稀釋至1.3×105 個細胞/ml。添加4.5ml的CM2介質至15ml錐形管。自孵養箱移出TIL細胞並使用10ml血清吸管重懸均勻。自1.3×106 個細胞/ml TIL懸浮液移出0.5ml的細胞並添加至15ml錐形管中4.5ml的介質。將TIL原液小瓶放回孵養箱。混合均勻。第二TIL細胞系重複進行。
將含有預熱介質之單一餵養細胞批量培養瓶從孵養箱轉移至BSC。用1ml吸管尖吸放混合餵養細胞數次並轉移1 ml(1.3×107 細胞)的餵養細胞批量至各培養瓶。添加60µl的OKT3工作原液(10µg/ml)至各培養瓶。將二個對照培養瓶放回孵養箱。
將1 ml (1.3×105 )的各TIL批量轉移至對應標示的T25培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養。不要擾動直到第5天。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。

第5天，介質更換
製備含3000 IU/ml IL-2之CM2。各培養瓶需要10ml。使用10ml吸量管，將含3000 IU/ml IL-2的10ml溫熱CM2轉移至各培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養直到第7天。重複進行於所有測試的餵養細胞批量。

第7天，收集
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各測試培養瓶移出10ml的介質且從各對照組培養瓶移出15ml的介質。
使用10ml血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200µl進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。在第7天記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
根據下表TT，評估餵養細胞對照組培養瓶中之複製不能性及評估含有TIL之培養瓶自第0天的擴增倍數。

第7天，持續餵養細胞對照組培養瓶至第14天
在完成餵養細胞對照組培養瓶的第7天計數後，添加含有3000 IU/ml IL-2之15ml的新鮮CM2介質至各對照組培養瓶。將對照組培養瓶放回孵養箱並以直立位置孵養直到第14天。

第14天，餵養細胞對照組培養瓶的延長不增生
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各對照組培養瓶移出大約17ml的介質。使用5ml血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。記錄各培養瓶的體積。
在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200µl進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。

結果及接受標準
結果
γ照射的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，且亦證實REP培養第7天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。
預期所有餵養細胞批量到REP培養第7天皆符合TIL生長100倍擴增之評估標準。
預期餵養細胞對照組培養瓶的第14天計數持續第7天所見之不增生趨勢。

接受標準
每批餵養細胞測試的每個複製TIL細胞系皆符合下列接受標準。
接受如下為兩面向(如下表27所概述)。
評估輻射劑量是否足以使MNC餵養細胞在30ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養時複製不能。複製不能係藉由在REP第7天及第14天的自動化細胞計數判定的總存活細胞計數(TVC)評估。
接受標準為「無生長」，表示在第7天及第14天的總存活細胞數量相較於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量並未增加。
評估餵養細胞支持TIL擴增的能力。TIL生長係以存活細胞從REP的第0天開始培養到REP的第7天的擴增倍數測量。在第7天，TIL培養達成最小100倍擴增(即大於在REP第0天放入培養中的總存活TIL細胞數量的100倍)，如自動化細胞計數所評估。

不符合接受標準的MNC餵養細胞批量之列聯測試(Contingency Testing)
如果MNC餵養細胞批量不符合以上概述之任一接受標準，將採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其原因。
如果該批量有二或更多個剩餘衛星測試小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星測試小瓶，則該批量根據上列接受標準為失敗。
為了合格，有問題的批量及對照組批量必須達成上述接受標準。符合這些標準後，該批量才可放行提供使用。

實例10：合格化經γ照射的周邊血液單核細胞個別批量
此實例描述使經γ照射的周邊血液單核細胞(PBMC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為同種異體餵養細胞。此實例提供評估用於產生TIL臨床批量之經照射的PBMC細胞批量之規程。各批經照射的PBMC係自個別供體製備。在超過100個合格化規程期間，顯示在所有情況下，來自SDBB (San Diego Blood Bank)之經照射的PBMC批量在REP第7天擴增TIL ＞100倍。此經改良的合格化規程意圖用於來自SDBB之經照射的供體PBMC批量，該等批量接著經過進一步測試以驗證接受γ輻射劑量足以使彼等複製不能。一旦證實彼等在14天期間維持複製不能，即認為供體PBMC批量「合格」，可用於產生TIL臨床批量。

背景
經γ照射、生長停頓的PBMC係目前TIL之標準REP所需。PBMC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與培養中的TIL交聯，刺激TIL擴增。PBMC批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、照射並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的患者不得輸注存活PBMC，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此供體PBMC藉由接受細胞γ-照射來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失PBMC的細胞存活性。

評估標準
經照射的PBMC批量之複製不能性的評估標準。

實驗設置
餵養細胞批量在迷你REP格式中如同彼等將與TIL共培養般測試，使用直立式T25組織培養培養瓶。對照組批量：一批過去已顯示符合以上標準的經照射的PBMC在實驗批量旁一起運行作為對照組。每批測試的經照射的供體PBMC皆以雙份培養瓶運行。

實驗方案
第0天
為欲測試的每批供體PBMC製備約90ml的CM2介質。將CM2於37℃水浴中保持溫熱。解凍等分試樣的6×106 IU/ml IL-2。將CM2介質放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。就每批測試的PBMC而言，移出約60ml的CM2至分開的無菌瓶。添加解凍的6×106 IU/ml IL-2儲備溶液至此介質以達3000 IU/ml之最終濃度。將此瓶標示為「CM2/IL2」(或類似用語)以與未經補充的CM2區別。

製備OKT3
自4℃冰箱取出抗CD3 (OKT3)儲備溶液並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30ng/ml的OKT3。從1mg/ml儲備溶液製備10µg/ml的抗CD3 (OKT3)工作溶液。放在冰箱中直到需要為止。
就每批測試的PBMC而言，製備150µl的抗CD3 (OKT3)原液之1：100稀釋液。例如，為了一次測試4批PBMC，添加6µl的1mg/ml儲備溶液至594µl的補充有3000 IU/ml IL-2之CM2，製備600µl的10µg/ml抗CD3 (OKT3)。

製備培養瓶
添加每培養瓶19ml的CM2/IL-2至經標示的T25培養瓶，並將培養瓶放入37℃、增濕、5% CO2 孵養箱中，同時製備細胞。

製備照射的PBMC
自LN2儲存取出欲測試的PBMC批量小瓶。在解凍之前將其等放在-80℃下或保持在乾冰上。對於每個欲解凍的批量，將30ml的CM2(不含IL-2補充物)放入50ml錐形管。在各管標示欲解凍的PBMC之不同批號。在使用前將管的蓋子蓋緊並放入37℃水浴中。視需要，將50 ml錐形管放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。
自冷藏移出PBMC小瓶並放入在37℃水浴中之漂浮式管架以解凍。允許解凍進行，直到小瓶中剩下少量的冰。使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至50 ml錐形管中的30ml CM2中。自管中移出約1ml的介質以潤洗小瓶；將潤洗液放回50ml錐形管中。將蓋子蓋緊並輕柔渦漩以洗滌細胞。
在400 x g下在室溫下離心5min。使用1000µl吸管尖抽吸上清液並將細胞團塊重懸於1ml的溫熱CM2/IL-2中。替代地，在添加介質之前，藉由將加蓋管沿著空管架拖行使細胞團塊重懸。在重懸細胞團塊之後，使用CM2/IL-2介質將體積加至4ml。記錄體積。
移出小等分試樣(例如100µl)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。根據特定自動細胞計數器SOP，執行雙份計數。極有可能必須在執行細胞計數之前執行PBMC稀釋。建議起始稀釋為1：10，但此將視所使用的細胞計數器類型而異。記錄計數。
使用CM2/IL-2介質，將PBMC濃度調整至1.3 ×107 個細胞/ml。藉由輕柔渦漩或藉由使用血清吸管輕柔上下抽吸來混合均勻。

設置培養瓶
將二個經標示的T25培養瓶從組織培養孵養箱放回BSC。將10µg/ml小瓶的抗CD3/OKT3放回BSC。添加1ml的1.3×107 PBMC細胞懸浮液至各培養瓶。添加60µl的10µg/ml抗CD3/OKT3至各培養瓶。將加蓋培養瓶放回組織培養孵養箱，在不擾動下生長14天。將抗CD3/OKT3小瓶放回冰箱中，直到下一批需要為止。重複於欲評估的各批PBMC。

第14天，測量PBMC的不增生
將雙份T25培養瓶放回BSC。對於各培養瓶，使用新的10ml血清吸管，自每個培養瓶移出約17ml，接著小心抽起剩餘介質以測量培養瓶中剩餘的體積。記錄體積。
使用同一支血清吸管上下吸放，均勻混合樣本。
自各培養瓶移出200µl樣本進行計數。使用自動細胞計數器計數細胞。重複步驟7.4.26至7.4.31，評估每批PBMC。

結果及接受標準
結果
預期γ照射的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，證實REP培養第14天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。

接受標準
每批測試的經照射的供體PBMC皆符合下列接受標準：「無生長」，表示第14天存活細胞總數小於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量。

不符合接受標準的PBMC批量之列聯測試。
如果經照射的供體PBMC批量不符合上述接受標準，採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其失敗原因。如果該批量有二或更多個剩餘衛星小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星小瓶，則該批量根據上述接受標準為失敗。
為了合格，進行列聯測試的PBMC批量中的兩個對照組批量及兩個有問題的批量複製皆需達成接受標準。符合此標準後，該批量才可放行提供使用。

實例11：製備IL-2儲備溶液
此實例描述將經純化、冷凍乾燥的重組人介白素-2溶解成適用於進一步組織培養規程之原液樣本的過程，包括所有該些於本申請案及實例所述者，包括該些涉及使用rhIL-2者。

程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29mL無菌水轉移至50ml錐形管。添加lmL 1N乙酸至50ml錐形管。倒轉管2至3次以混合均勻。將HAc溶液藉由使用Steriflip過濾器過濾滅菌。
製備含1% HSA的PBS。添加4mL的25% HSA儲備溶液至於150mL無菌過濾器單位中之96mL PBS。過濾溶液。儲存在4℃下。對於所製備的各小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2儲備溶液(6×106 IU/mL最終濃度)。每批rh1L-2皆不同且需要廠商檢驗證明書(COA)中提供的資訊，諸如：1)rhIL-2的每小瓶質量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)建議0.2% HAc重構體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批量所需的1% HSA體積：
例如，根據CellGenix的rhIL-2批量10200121 COA，1mg小瓶的比活性為25×106 IU/mg。建議將rhIL-2重構於2mL 0.2% HAc中。
用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡膠瓶塞。使用附接至3mL注射器的16G針頭，注射建議體積的0.2% HAc至小瓶中。在抽出針頭時，小心不要使瓶塞脫出。倒轉小瓶3次且渦漩直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。添加經計算體積的1% HSA至小瓶。
儲存rhIL-2溶液。短期儲存時(＜72hrs)，將小瓶儲存在4℃下。長期儲存時(＞72hrs)，將小瓶等分成更小體積且儲存在-20℃冷凍小瓶中，直到準備使用為止。避免冷凍/解凍循環。製備日期後6個月到期。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄編號、批號、到期日、作業者首字母、等分試樣的濃度及體積。

實例12：製備用於REP前及REP過程的介質
此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基使用於涉及衍生自各種腫瘤類型包括但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)培養之規程。此介質可用於製備本申請案及實例中所述之任何TIL。

CM1之製備
將下列試劑移出冷藏並使彼等在37℃水浴中溫熱：(RPMI1640、人AB血清、200mM L-麩醯胺酸)。根據下表28，藉由添加各成分至所欲過濾之體積適當的0.2 um過濾器單位的頂部，製備CM1介質。儲存在4℃下。
在使用當天，在37℃水浴中預溫熱所需量的CM1並添加6000 IU/m1 IL-2。
額外補充 - 根據表29如需要補充。

CM2之製備
將製備好的CM1自冰箱移出或如上7.3節所示製備新鮮CM1。自冰箱移出AIM-V®，將製備好的CM1與等體積的AIM-V®在無菌介質瓶中混合來製備所需量的CM2。在使用當天添加3000 IU/ml IL-2至CM2介質。在使用當天做足量的含3000 IU/ml IL-2之CM2。將CM2介質瓶標示名稱、製備者首字母、過濾/製備日期、二週到期日並儲存在4℃下直到需要用於組織培養為止。

CM3之製備
在需要使用的當天製備CM3。CM3與AIM-V®介質相同，在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由直接添加IL-2儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM3量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IU/ml IL-2」。如果有過量的CM3，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、製備者首字母、介質製備日期及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之介質在4℃下儲存7天後丟棄。

CM4之製備
CM4與CM3相同，但具有額外的2mM GlutaMAXTM (最終濃度)補充物。在每1L的CM3中添加10ml的200mM GlutaMAXTM 。藉由直接添加IL-2儲備溶液及GlutaMAXTM 儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM4量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IL/nil IL-2 and G1utaMAX」。如果有過量的CM4，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、「G1utaMAX」及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之介質在4℃下儲存7天後丟棄。
實例13：評估用於2A過程之無血清介質
此實例提供資料顯示以無血清介質置換目前2A過程所使用之標準CM1、CM2及CM4介質的有效性評估。本研究測試可用之無血清介質(SFM)及無血清替代物在三期中作為置換的有效性；
第1期：比較使用標準相較於無論有無血清置換或血小板溶解物之CTS Optimizer或Prime T CDM或Xvivo-20無血清介質在TIL擴增(n=3)上的有效性。
第2期：在迷你規模2A過程中使用G-Rex 5M測試候選無血清介質條件(n=3)。

背景資訊
雖然目前用於REP前及後培養的介質組合已證實有效，但REP失敗可發生於AIM-V。如果識別出有效的無血清替代物，藉由將所使用之介質類型數量從3種減少成1種，將可使過程更為直接且易於在CMO中執行。此外，SFM藉由清除人血清的使用而減少意外疾病的機會。此實例提供資料顯示支持在2A過程中使用無血清介質。


實驗設計
REP前及REP係如LAB-008中提及起始。此3期實驗的概覽如下圖所示：
如上圖所提供，該計畫暗示以二步驟測試無血清介質及補充劑。
步驟1。選擇無血清介質供應商。設置REP前及REP後以在G-Rex 24孔板中模擬2A過程。REP前係藉由每條件三重複或四重複培養各片段/G-Rex 24孔板之孔起始。REP係在第11天藉由培養4 x 10e5個TIL/G-Rex 24孔板之孔起始、在第16天分瓶、在第22天收集。使用CTS OpTimizer、X-Vivo 20及Prime T-CDM作為REP前及REP中使用的潛在無血清介質替代物。CTS Immune SR血清置換(Life Technologies)或血小板溶解物血清(SDBB)以3%添加至SFM。計畫用至少3種腫瘤於REP前及REP後測試各條件以模擬2A過程。
步驟2。經識別的候選物進一步按照規程(TP-17-007)以迷你規模2A過程測試。簡言之，REP前係藉由每條件三重複培養2個片段/G-Rex 5M培養瓶起始。REP係在第11天使用2 x 10e6/G-Rex 5M培養瓶起始、在第16天分瓶、在第22天收集。
注意：一些腫瘤係經處理及設置以在一個實驗中測量多個參數

觀察
當比較無血清介質與2A過程所使用之標準時，觀察細胞生長之等效或統計較佳結果
當與生長於2A過程所使用之標準介質中的TIL比較時，觀察生長於無血清介質中的TIL之類似表型、IFN-y產生及代謝物分析。

結果
在REP前及後TIL擴增測試無血清介質的有效性。
CTS Optimizer + SR(血清置換)顯示增強REP前TIL擴增及可相比的REP TIL擴增。經3% CTS Immune CTS SR添加或不添加之CTS OpTimizer、X-Vivo 20及Prime T-CDM係相較於標準條件測試。在M1079及L4026中，當與標準條件(CM1、CM2、CM4)比較時，CTS OpTimizer + CSR條件顯示顯著增強的REP前TIL擴增(p ＜0.05)。相反地，無添加CSR之CTS Optimizer不幫助REP前TIL擴增(附件1、2、3)。在3種測試腫瘤中的二種，CTS Optimizer + CSR在REP後顯示可相比的TIL擴增(圖2B)。X-Vivo 20及Prime T-CDM條件在REP前及後中發生大量變異，然而CTS Optimizer在四重複之間相對一致。此外，當與標準比較時，SFM添加血小板溶解物不增強REP前及REP後TIL擴增。此發現暗示血清置換是提供與我們的標準可相比生長所必然需要的，CTS optimizer +CSR可為候選物。
在G-Rex 5M mini中測試候選條件。
REP後TIL的表型分析。見下表31。
干擾素-γ可相比性
干擾素-γ ELISA (Quantikine)。IFN-y的產生使用R&D系統的Quantikine ELISA套組測量。當與我們的標準條件比較時，CTS+SR產生可相比的IFN-y量。

實例14：T細胞生長因子雞尾酒IL-2/IL-15/IL-21增強腫瘤浸潤T細胞的擴增及效應功能
自體腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的過繼性T細胞療法已在轉移性黑色素瘤及子宮頸癌患者證實臨床療效。在一些研究中，較佳的臨床結果與輸注細胞總數及/或CD8+ T細胞百分比有正向相關。大部分目前的產生方案僅利用IL-2來促進TIL生長。使用含有IL-15及IL-21之方案已報告增強淋巴球擴增。本研究描述添加IL-15及IL-21至最近在臨床施行之第二代IL-2-TIL規程的正面效應。

材料及方法
產生TIL之過程包括快速擴增規程前(REP前)，其中1至3 mm3 大小的腫瘤片段放在含有IL-2之介質中。在REP前期間，TIL游出(emigrate out)腫瘤片段且因應IL-2刺激而擴增。
為了進一步刺激TIL生長，TIL經過稱為快速擴增規程(REP)之繼代培養期間擴增，該規程包括經照射的PBMC餵養細胞、IL-2及抗CD3。在本研究中，開發了縮短的REP前及REP擴增規程來擴增TIL，同時維持最終TIL產物的表型及功能屬性。
此縮短的TIL產生規程係用於評估僅IL-2相較於IL2/IL-15/IL-21之組合的影響。比較這兩種培養方案在生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺腫瘤及腎腫瘤的TIL之產生。在REP前完成時，評估培養TIL的擴增、表型、功能(CD107a+及IFNγ)及TCR Vβ貯庫。
REP前培養使用標準IL-2 (600 IU/ml)規程或除IL-2之外還添加IL-15 (180 IU/ml)及IL-21 (IU/ml)起始。在REP前完成時評估細胞的擴增。如果整體生長增強至少20%，則將培養分類為比IL-2具有增加的擴增。在本文中呈現黑色素瘤及肺表型及功能研究。見下表32。
這些資料證實當TIL與IL-2/IL15/IL-21相較於僅IL-2培養時，除了在肺的表型及功能差異之外，TIL產物的產率增加。
三重雞尾酒對TIL擴增的效應為適應症特異性且最有益於低產率腫瘤。
NSCLC TIL產物處理增加CD8+/CD4+ T細胞比例。
T細胞活性似乎藉由添加IL-15及IL-21至IL-2來增強，如藉由黑色素瘤及NSCLC中之CD107a表現水準所評估。
此處提供之資料顯示使用較短、更強健的過程(諸如本說明書此處及其他實例所述之2A過程)的TIL擴增可經調適以涵蓋IL-2/IL-15/IL-21細胞介素雞尾酒，藉此提供進一步特別是在特定適應症中促進TIL擴增的手段。
持續進行中的實驗正進一步評估IL-2/IL-15/IL-21對TIL功能的效應。
額外實驗將評估三重雞尾酒在REP(第一擴增)期間的效應。
這些觀察對於優化及標準化大規模製造TIL所需的TIL培養方案特別重要，具有主流抗癌症療法需要的廣泛應用性及可用性。

實例15：評估100:1至25:1之同種異體餵養細胞細胞:TIL比例範圍
本研究測試以25:1及50:1同種異體餵養細胞對TIL相較於目前在過程1C中利用的100:1對照組之TIL的增生。
美國國家癌症研究所(National Cancer Institute)手術部門發表的研究顯示在G-Rex 100培養瓶中TIL之最佳活化臨限為REP起始時每cm2 5×106 個同種異體餵養細胞(1) 。此已經由數學模型驗證且相同模型預測使用經細胞：每單位面積細胞接觸優化的餵養細胞層，同種異體餵養細胞相對於TIL之比例可降低至25:1而極小影響TIL活化及擴增。
本研究建立在REP開始時每單位面積餵養細胞的最佳密度，且驗證在REP起始時需要的同種異體餵養細胞比例之有效範圍以降低及標準化每臨床批量所使用之餵養細胞的量。該研究亦驗證以小於200×106 個TIL與固定數量的餵養細胞共培養起始REP。
A. T細胞體積(直徑10 µm)：V =(4/3)πr3 = 523.6 µm3
B.具有40 µm(4個細胞)高度之G-Rex 100 (M)體積：V =(4/3)πr3 =4×1012 µm3
C.需要填滿B體積的細胞數量：4×1012 µm3 / 523.6 µm3 =7.6x108 µm3 * 0.64=4.86×108
D.可在4D空間中被最佳活化的細胞數量：4.86×108 /24=20.25×106
E.外推至G-Rex 500之餵養細胞及TIL數量：TIL：100×106 及餵養細胞：2.5×109
算式1。在具有100 cm2 基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數量。計算得到約5×108 的實驗結果為T細胞活化臨限，其密切反映NCI實驗資料。(1) (C)乘數(0.64)是如Jaeger及Nagel在1992年計算的當量球體隨機填充密度(2) 。(D)除數24是4維空間中可接觸類似物體的當量球體數量「牛頓數」(3) 。

參考文獻
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL)in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment.J Immunother.2012 Apr; 35(3): 283-292。
(2) Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31。
(3) O. R. Musin (2003)."The problem of the twenty-five spheres".Russ.Math.Surv.58 (4): 794-795。

實例16：使用密閉系統產生冷凍保存TIL細胞療法
此實例描述Iovance Biotherapeutics, Inc.根據現行人體細胞組織優良操作規範及現行藥品優良製造規範cGMP製造在G-Rex培養瓶中之TIL細胞療法過程。此材料將依照US FDA藥品優良製造規範法規(21 CFR第210、211、1270及1271部分)製造，第I期至商用材料適用ICH Q7標準。
過程摘要提供於下表33。
在此實例中，假設1.0 mL/L=1.0 g/kg，除非另外指明。一旦打開後，下列到期日適用於2℃至8℃下：人血清AB型(HI)Gemini，1個月；2-巰乙醇，1個月。硫酸建它黴素50mg/ml原液可在室溫下保持1個月。含有10L的AIM-V介質之袋子僅可在使用前至多24小時在室溫下溫熱一次。在第22天收集期間，可使用二個GatherexTM 收集來自G-Rex500MCS培養瓶的TIL。

第0天CM1介質製備
製備RPMI 1640介質。在BSC中，使用適當大小的吸量管，自1000 mL RPMI 1640介質中移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。
在BSC中，添加試劑至RPMI 1640介質瓶。添加表中顯示之下列試劑至RPMI 1640介質瓶。記錄添加的體積。每瓶添加的量：熱去活化人類AB血清(100.0 mL)；GlutaMax (10.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/mL (1.0 mL)；2-巰乙醇(1.0 mL)
將RPMI 1640介質瓶加蓋並將瓶渦漩以確保試劑混合徹底。將來自步驟8.1.6的RPMI 1640介質過濾通過1L 0.22微米過濾器單位。標示過濾介質。無菌地將過濾介質加蓋且標示下列資訊。
解凍一個1.1 mL IL-2等分試樣(6×106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL-2：批號及到期日。將IL-2儲備溶液轉移至介質。在BSC中，將1.0 mL的IL-2儲備溶液轉移至在步驟8.1.8中製備的CM1第0天介質瓶。添加CM1第0天介質1瓶及IL-2 (6×106 IU/mL)1.0 mL。將瓶加蓋並渦漩以混合含有IL-2之介質。重新標示為「完全CM1第0天介質」。
使用適當大小的吸量管移出20.0 mL的介質並分配至50ml錐形管。在BSC中，將25.0 mL的「完全CM1第0天介質」(在步驟8.1.13中製備)轉移至50 mL錐形管。將管標示為「組織片」。將G-Rex100MCS (W3013130)無菌地傳遞至BSC中。在BSC中，關閉所有G-Rex100MCS上的管夾，只剩通氣孔過濾器的管夾打開。將G-Rex100MCS培養瓶的紅色管線經由魯爾連接連接至中繼器泵流體轉移組(W3009497)的較大直徑端。將Baxa泵緊鄰BSC放置。將中繼器泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至中繼器泵中。在BSC內，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)(W3012720)的注射器並丟棄。
將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至中繼器泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入「完全CM1第0天介質」中進行抽吸。打開介質與G-Rex100MCS之間的所有管夾。泵送完全CM1介質至G-Rex100MCS培養瓶中。設定泵速至「高」及「9」並將所有完全CM1第0天介質泵送至G-Rex100MCS培養瓶中。一旦所有介質皆轉移後，清除管線並停止泵。
將泵與培養瓶的連接斷開。確保培養瓶上的所有管夾皆關閉，但通氣孔過濾器除外。將中繼器泵流體轉移組自紅色介質管線移除，並將紅色蓋子(W3012845)蓋在紅色介質管線上。將G-Rex100MCS培養瓶自BSC移出，熱封紅色管線靠近末端魯爾的紅色蓋子。將G-Rex100MCS培養瓶標示QA提供的過程中「第0天」標籤。將樣本附接以下的「第0天」標籤。孵養箱參數：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2 。
將50mL錐形管放入孵養箱中≥ 30分鐘進行溫熱。

第0天腫瘤洗滌介質製備
添加建它黴素至HBSS。在BSC中，添加5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)至1×500 mL HBSS介質(W3013128)瓶中。記錄體積。每瓶添加：HBSS (500.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/ml (5.0 mL)。徹底混合試劑。將步驟8.2.1製備的含建它黴素之HBSS過濾通過1L 0.22微米過濾器單位(W1218810)。無菌地將過濾介質加蓋且標示下列資訊。

第0天腫瘤處理
獲得腫瘤樣品並立即轉移至在2℃至8℃下的套件(suite)進行處理並記錄腫瘤資訊。標示三個50ml錐形管：第一個為「鑷子」、第二個為「解剖刀」、第三個為「新鮮腫瘤洗滌介質」。將5個100 mm培養皿標示為「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」、「繫留」及「不佳」。將一個6孔板標示為「較佳中間片段」。
使用適當大小吸量管，將5.0 mL的「腫瘤洗滌介質」轉移至一個較佳中間腫瘤片段6孔板的各孔中(總共30.0 mL)。使用適當大小吸量管，將在步驟8.2.4中製備的50.0 mL「腫瘤洗滌介質」轉移至每個「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」及「繫留」之100 mm培養皿中(總共200.0 mL)。使用適當大小吸量管，將在步驟8.2.4中製備的20.0 mL「腫瘤洗滌介質」轉移至每個50 mL錐形管中(總共60.0 mL)。無菌地移除二個6孔板的蓋子。將蓋子利用於選定的腫瘤片。將腫瘤無菌地傳遞至BSC中。記錄處理開始時間。
腫瘤洗滌1：使用鑷子，將腫瘤自樣品瓶移出並轉移至「洗滌1」。使用鑷子，輕柔洗滌腫瘤並記錄時間。將20.0 mL(或可用體積)的溶液按照樣本計畫自腫瘤樣品瓶轉移至50mL錐形管。標示並在2至8℃下儲存所收集的生物負載樣本直到提交測試為止。
腫瘤洗滌2：使用一支新的鑷子，將腫瘤自「洗滌1」培養皿移出並轉移至「洗滌2」培養皿。使用鑷子，藉由輕柔攪拌≥ 3分鐘洗滌腫瘤樣品並允許其靜置。記錄時間。
使用移液吸管，將4滴來自錐形管之腫瘤洗滌介質放入6孔板向上翻轉的蓋子(2個蓋子)上的6個圓圈之各者中。二個圓圈多放一滴，總共50滴。
腫瘤洗滌3：使用鑷子，將腫瘤自「洗滌2」培養皿移出並轉移至「洗滌3」培養皿。使用鑷子，藉由輕柔攪拌洗滌腫瘤樣品並允許其靜置≥ 3分鐘。記錄時間。
在150 mm培養皿蓋子下方放置一支尺。使用鑷子，將腫瘤樣品無菌地轉移至150 mm分割培養皿蓋子。將所有腫瘤樣品片端對端排列並記錄大約整體長度及片段數量。評估腫瘤的壞死/脂肪組織。評估是否觀察到＞ 30%的整體腫瘤區域為壞死及/或脂肪組織；如果是的話，確保腫瘤如果如此繼續進行的話具有適當大小。評估是否觀察到＜ 30%的整體腫瘤區域為壞死或脂肪組織；如果是的話，則繼續進行。
清除分割。如果腫瘤大且觀察到＞30%的組織外部為壞死/脂肪，藉由移除壞死/脂肪組織來執行「清除分割」，同時使用解剖刀及/或鑷子的組合保留腫瘤內部結構。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。
使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成均勻、適當大小的片段(至多6個中間片段)。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。確保保持非分割中間片段完全浸沒在「腫瘤洗滌介質」中。將各中間片段轉移至「繫留」培養皿。
一次操作一個中間片段，將腫瘤中間片段在分割培養皿中分割成大小大約3x3x3mm的片，將每片上的出血、壞死及/或脂肪組織的量最小化。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。
選擇至多八(8)個無出血、壞死及/或脂肪組織的腫瘤片。使用尺作為參考。持續分割直到已獲得8個較佳片，或已分割整個中間片段。將各選定片轉移至「腫瘤洗滌介質」液滴中之一者。
在從中間片段選擇至多八(8)片之後，將中間片段的殘留物放入「較佳中間片段」6孔板中的新單一孔。
如果仍有所欲組織，從「較佳中間片段」6孔板選擇額外較佳腫瘤片以最多50片填滿液滴。記錄所產生的分割片的總數。
將「組織片」50mL錐形管從孵養箱移出。確保錐形管加熱≥30 min。將「組織片」50mL錐形管傳遞至BSC中，確保不破壞開放處理表面的無菌性。
使用移液吸管、解剖刀、鑷子或組合，將選定的50個最佳腫瘤片段從較佳培養皿蓋子轉移至「組織片」50 mL錐形管。如果腫瘤片在轉移過程中掉落且仍有所欲組織，則添加來自較佳腫瘤中間片段孔的額外片。記錄片數。
將含有介質的G-Rex100MCS從孵養箱移出。將G-Rex100MCS培養瓶無菌地傳遞至BSC中。當轉移培養瓶時，不要握住容器的蓋子或底部。拿握側邊來轉移容器。在BSC中，將G-Rex100MCS培養瓶蓋子拿掉，確保維持內部管路的無菌性。渦漩含有腫瘤片的錐形管以懸浮，並將內容物快速倒入G-Rex100MCS培養瓶中。確保腫瘤片均勻分布在培養瓶的膜上。如有需要將培養瓶輕柔來回傾斜，以使腫瘤片均勻分布。記錄容器底部膜上的腫瘤片段數量以及所觀察到漂浮在容器中的數量。注意：如果接種片段數量不等於收集的數量，聯絡地區管理，並記載在第10.0節。
以下列參數孵養G-Rex100MCS：孵養G-Rex培養瓶：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0± 1.5% CO2。執行計算以判定在第11天將G-Rex100MCS移出孵養箱的適當時間。計算：孵養時間；下限=孵養時間+252小時；上限=孵養時間+276小時。

第11天，介質製備
監測孵養箱。孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。將3個1000 mL RPMI 1640介質(W3013112)瓶及3個1000 mL AIM-V (W3009501)瓶在孵養箱中溫熱≥ 30分鐘。記錄時間。介質：RPMI 1640及AIM-V。將額外1個1000 ml AIM-V介質瓶(W3009501)放在室溫下以供進一步使用。
當時間到達後，移出RPMI 1640介質。記錄結束孵養時間於步驟8.4.4。確保介質溫熱≥30 min。在BSC中，從三個預熱的1000 mL RPMI 1640介質瓶中的每一瓶移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。在BSC中，添加下列試劑到三個RPMI 1640介質瓶中的每一瓶，並記錄添加到每一瓶的體積。GemCell熱去活化AB型人類血清(100.0 mL)、GlutaMax (10.0 mL)、硫酸建它黴素50 mg/ml (1.0 mL)、2-巰乙醇(1.0 mL)。
將瓶加蓋並渦漩以確保試劑混合徹底。將每一瓶介質過濾通過分開的1L 0.22微米過濾器單位。將過濾介質無菌地加蓋並將每一瓶標示為CM1第11天介質。解凍3×1.1mL等分試樣的IL-2 (6×106 IU/mL)(BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL 2批號及到期日。
將三瓶AIM-V介質自孵養箱移出。記錄結束孵養時間。確保介質已溫熱≥ 30分鐘。使用微量吸管，添加3.0mL解凍的IL-2至一瓶1L預熱AIM-V介質中。在分配IL-2後用介質潤洗微量吸管尖端。每個等分試樣使用新的無菌微量吸管尖端。記錄總添加體積。將瓶標示為「含有IL-2的AIM-V」。將10L Labtainer袋子及中繼器泵轉移組無菌地轉移至BSC中。關閉10L Labtainer袋子上的所有管線。將中繼器泵轉移組的較大直徑管路端經由魯爾鎖連接附接至10L Labtainer袋子的中間母埠。
將Baxa泵緊鄰BSC放置。將轉移組管路裝入Baxa泵。將Baxa泵設定至「高」及「9」。移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。確保不破壞PLDS吸量管的無菌性。
將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至中繼器泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入含有IL-2的AIM-V介質瓶(在步驟8.4.13中製備)中進行抽吸。打開介質瓶與10L Labtainer之間的所有管夾。
使用PLDS，將製備的含有IL-2的預熱AIM-V介質以及二瓶額外的AIM-V轉移至10L Labtainer袋子中。添加三瓶過濾的CM1第11天介質。在添加最終瓶後，清除通往袋子的管線。注意：在添加每瓶介質之間停止泵。將PLDS自轉移組移除並將紅色蓋子蓋在BSC中之管線的魯爾上。輕柔按摩袋子以混合。將介質袋子標示下列資訊。到期日為自製備日期起的24小時。
將60mL注射器附接至「完全CM2第11天介質」袋子的可用母埠。移出20.0mL的介質並放入50mL錐形管中。將紅色蓋子蓋在「完全CM2第11天介質」袋子的母埠上。標示並在2至8℃下儲存介質保留樣本直到提交測試為止。熱封靠近紅色蓋子的轉移組管線上的紅色蓋子。將轉移組保持在袋子上。
在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V介質至四個15mL錐形管。將管標示批號及管編號(1至4)。將4支冷凍小瓶標示「餵養細胞」及小瓶編號(1至4)。將任何剩餘的2-巰乙醇、GlutaMax及人類血清自BSC轉移至2至8℃。
在BSC外，將1L轉移包接合至附接至經製備的「完全CM2第11天介質」袋子的轉移組。將轉移包標示為「餵養細胞CM2介質」及批號。在1L轉移包管路離袋子幾英寸處的管路上作一個記號。將空的轉移包放在磅秤上，使得該記號處以上的管路在磅秤上。將磅秤歸零，並將空的轉移包留在磅秤上。
將Baxa泵設定至「中」及「4」。將500.0 ± 5.0mL的在步驟8.4.22中製備的「完全CM2第11天」介質泵送至細胞CM2介質轉移包中。測量重量並記錄添加至轉移包的完全CM2介質體積。
一旦填滿，熱封管線。將含轉移組的CM2第11天介質袋與餵養細胞介質轉移包分開，將接合保留在1L轉移包。將所製備的「完全CM2第11天介質」放在孵養箱中直到使用。

第11天，TIL收集
孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。將G-Rex100MCS自孵養箱移出前，執行檢查以確保符合孵養參數。下限與上述相同。
記錄自孵養箱移出的時間。小心地將G-Rex100MCS自孵養箱移出並確保所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)。記錄處理開始時間。
將300mL轉移包標示為「TIL懸浮液」。將重力血液過濾器的TIL懸浮液轉移(單一管線)無菌接合。將300mL轉移包放在磅秤上並記錄乾重。將1L轉移包標示為「上清液」。
將來自G-Rex100MCS的紅色介質移除管線無菌接合至「上清液」轉移包。將來自G-Rex100MCS的透明細胞移除管線無菌接合至連接至「TIL懸浮液」轉移包之血液過濾器頂端的二個穿刺針管線的其中之一。將G-Rex100MCS放在GatheRex的左側且將「上清液」及「TIL懸浮液」轉移袋放在右側。
將來自G Rex100MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex100MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex100MCS培養瓶的無菌過濾器。在從G-Rex100MCS培養瓶移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。將約900 mL的培養上清液從G-Rex100MCS轉移至1L轉移包。目視檢查G-Rex100MCS培養瓶以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。
在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。注意：如果細胞沒有脫附，聯絡地區管理。傾斜培養瓶遠離收集管路並允許腫瘤片沿著邊緣沉降。緩慢地將培養瓶傾向收集管路，使片維持在培養瓶的對側。如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。
鬆開所有通往TIL懸浮液轉移包的管夾。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移通過血液過濾器至300mL轉移包中。維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。潤洗G-Rex100MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。確保所有管夾皆已關閉。在TIL懸浮液轉移包盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以使整體管路長度維持大約相同。將「上清液」轉移包熱封。維持足夠管線以接合。記錄TIL懸浮液轉移包的重量並計算細胞懸浮液的體積。
將4”血漿轉移組接合至「上清液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。將4”血漿轉移組接合至300mL「TIL懸浮液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。
自1L「上清液」轉移包抽取大約20.0 mL的上清液並分配至標示「Bac-T」的無菌50mL錐形管中。使用適當大小的注射器自標示BacT的50mL錐形管移出1.0 mL樣本並接種厭氧瓶。
將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。使用分開的3mL注射器，自使用魯爾連接的TIL懸浮液轉移包抽出4×1.0mL細胞計數樣本並放入各別冷凍小瓶。將紅色蓋子(W3012845)蓋在管線上。將TIL轉移包放在孵養箱中直到需要為止。執行細胞計數及計算。執行未稀釋的初始細胞計數。如果不需要稀釋，「樣本[µL]」=200，「稀釋[µL]」=0。
記錄細胞計數及TIL數量。如果總存活TIL細胞為＜ 5x106 個細胞，則繼續進行至「第11天G-Rex填充及接種」。如果總存活TIL細胞為＞ 5x106 ，則繼續進行至「流動式細胞測量術的計算」。

流動式細胞測量術的計算。
如果總存活TIL細胞計數為≥ 4.0×107 ，則計算體積以獲得流動式細胞測量術樣本的1.0×107 個細胞。流動式細胞測量術所需的總存活細胞：1.0×107 個細胞。流動式細胞測量術所需之細胞體積：存活細胞濃度除以1.0×107 個細胞。
如適用：重新計算總存活細胞及體積流。計算在移除以下細胞測量術樣本之後剩餘的總存活細胞及剩餘體積。

TIL冷凍保存樣本
如適用：計算用於冷凍保存的體積。計算要獲得用於冷凍保存的1×107 個細胞所需之細胞體積。
如適用：移出用於冷凍保存之樣本。自TIL懸浮液轉移包移出所計算之體積。放入適當大小的錐形管並標示為「冷凍保存樣本1×107 細胞」、日期及批號。將紅色蓋子(W3012845)蓋在TIL懸浮液轉移包上。
根據下列參數將「冷凍保存樣本1×107 個細胞」離心：速度：350 x g，時間：10:00分鐘，溫度：室溫，煞車：全速(9)；加速：全速(9)。
添加CS-10。在BSC中，無菌地抽吸上清液。輕柔拍打管底部以將細胞重懸於剩餘流體中。添加CS-10。緩慢添加0.5mL的CS10。記錄添加的體積。冷凍保存填充約0.5mL的樣本小瓶。

第11天，餵養細胞
從LN2冷凍器獲得3袋至少二個不同批號的餵養細胞。將細胞保持在乾冰上直到準備解凍為止。記錄餵養細胞的細胞資訊。確認獲得至少二個不同批量的餵養細胞。將餵養細胞細胞袋放入基於批號之個別夾鏈袋中，並在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解凍約3至5分鐘或直到冰開始消失。
餵養細胞細胞制具製備。將4S-4M60接合至CC2 Cell Connect (W3012820)，用4S-4M60歧管的4穿刺針端置換Cell Connect設備的單一穿刺針。視需要接合。
附接介質轉移包將「餵養細胞CM2介質」轉移包接合至CC2魯爾。該袋將用無針注射埠附接至制具側邊。將含有完全CM2第11天介質的總成轉移至BSC中。
匯合解凍的餵養細胞。在BSC內，抽取10mL的空氣至100mL注射器中。使用此置換CC2上的60mL注射器。在移除罩蓋之前，用酒精棉擦拭餵養細胞袋上的每個埠。使用CC2的三支穿刺針穿刺三個餵養細胞袋。在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。打開活栓，使得來自餵養細胞袋的管線打開且通往無針注射埠的管線關閉。抽取餵養細胞袋的內容物至注射器中。所有三個袋子同時抽光。一旦餵養細胞袋已抽光，在維持注射器壓力下，將通往餵養細胞袋的管線夾住。不要拔開在制具注射器下方的注射器。記錄注射器中餵養細胞的總體積。
添加餵養細胞至轉移包。轉動活栓，使得通往餵養細胞袋的管線關閉且通往介質轉移包的管線打開。確保通往介質轉移包的管線沒有夾住。自注射器分配餵養細胞至「餵養細胞CM2介質」轉移包。夾住通往含有餵養細胞的轉移包的管線並留下附接至制具的注射器。按摩袋子以混合轉移包中匯合的餵養細胞。將袋子標示為「餵養細胞懸浮液」。
計算餵養細胞懸浮液的總體積。移出細胞計數樣本。每個樣本使用分開的3mL注射器，使用無針注射埠從餵養細胞懸浮液轉移包抽取4×1.0mL細胞計數樣本。將各樣本等分至標示的冷凍小瓶中。
利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至標示批號及「用於細胞計數稀釋」之4.5mL的AIM-V介質中，稀釋細胞計數樣本。此將給出1:10稀釋。
記錄細胞計數及樣本體積。如果總存活細胞＜ 5×109 個，則繼續進行。如果總存活細胞≥ 5×109 個，則如上述較高細胞計數繼續進行。視需要獲得額外之餵養細胞且添加至如上所討論之轉移包。計算要獲得5×109 存活餵養細胞所需之餵養細胞懸浮液的體積。計算要移除之過量餵養細胞的體積。向下捨入至最靠近的整數。
移除過量餵養細胞。在新的100mL注射器中，抽取10mL的空氣並將注射器附接至制具。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的管線。使用注射器抽取所計算的餵養細胞體積加上來自轉移包之額外的10.0mL至100mL注射器。一旦移除餵養細胞體積，關閉通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。不要移除最終注射器。一旦注射器已填滿，用新的注射器置換。多支注射器可用於移除總體積。使用每支新的注射器時，抽取10mL的空氣。記錄移除餵養細胞的總體積(包括額外10mL)。
添加OKT3。在BSC中，使用1.0mL注射器及16G針頭，抽取0.15mL的OKT3。將注射器的針頭無菌地移除並將注射器附接至無針注射埠。注射OKT3。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的活栓並添加先前移除的10mL餵養細胞以將OKT3沖過管線。將注射器由上翻轉向下並推注空氣以清除通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。將剩餘的餵養細胞懸浮液留在注射器中。關閉所有管夾並將制具從BSC移出。將餵養細胞懸浮液轉移包熱封，留下足夠管路以接合。

第11天，G-Rex填充及接種
設置G-Rex500MCS。將G-Rex500MCS自包裝移出並檢視培養瓶有無任何裂縫或管路扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。關閉G-Rex500MCS管線上的所有管夾，但通氣孔過濾器管線除外。使用奇異筆在4.5L刻度處畫一條線。自孵養箱移出「完全CM2第11天介質」。
準備泵送介質。將G-Rex500MCS的紅色管線與附接至完全CM2第11天介質的中繼器泵轉移組接合。將「完全CM2第11天介質」袋子吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。泵送介質至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」。泵送4.5L的介質至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶4.5L刻度處標示的線。在靠近接合處熱封G-Rex500MCS的紅色管線。將培養瓶標示「第11天」標籤。將餵養細胞懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合至「餵養細胞懸浮液」轉移包。
添加餵養細胞至G-Rex500MCS。打開餵養細胞懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加餵養細胞懸浮液至培養瓶。在靠近接合處熱封紅色管線。將TIL懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合至「TIL懸浮液」轉移包。
添加TIL至G-Rex500MCS。打開TIL懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加TIL懸浮液至培養瓶。在靠近接合處熱封紅色管線，以移除TIL懸浮液袋子。
孵養G-Rex500MCS。檢查G-Rex500MCS的所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)，並放在孵養箱中。孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。
計算孵養窗。執行計算以判定在第16天將G-Rex500MCS移出孵養箱的適當時間。下限：孵養時間+108小時。上限：孵養時間+132小時。

第11天，過量TIL冷凍保存
冷凍過量TIL小瓶。記錄並驗證放入控速冷凍器(CRF)中的小瓶總數。在完成冷凍後，將小瓶從CRF轉移至適當儲存容器。

第16天，介質製備
預熱AIM-V介質。將三個CTS AIM V 10L介質袋在使用前至少12小時自2至8℃移出並放在室溫下避免光照。標示每一袋。記錄溫熱起始時間及日期。確保所有袋已溫熱一段介於12與24小時之間的期間。
將流體泵轉移組的較大直徑端使用魯爾接頭附接至10L Labtainer袋子的一個母埠。設置10L Labtainer用於上清液。標示為「上清液」。設置10L Labtainer用於上清液。在從BSC移出之前，確保所有管夾關閉。
每袋CTS AIM V介質解凍5x1.1mL等分試樣的IL-2(6×106 IU/mL)(BR71424)直到所有冰熔化。將100.0 mL的Glutamax等分至適當大小接受器中。記錄添加至各接受器的體積並將各接受器標示為「GlutaMax」。
添加IL-2至GlutaMax。使用微量吸管，添加5.0mL的IL-2至各GlutaMax接受器。確保按照過程注意事項 5.18潤洗吸管尖，並且添加每mL使用新的吸量管尖。記錄添加至各Glutamax接受器的體積並將各接受器標示為「GlutaMax + IL-2」及接受器編號。
製備用於調配之CTS AIM V介質袋。確保CTS AIM V 10L介質袋(W3012717)在使用前12至24小時在室溫下溫熱且避免光照。記錄結束孵養時間。在BSC中，關閉4”血漿轉移組上的管夾，接著使用穿刺針埠連接至該袋。在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。將中繼器泵流體轉移組的較大直徑端經由魯爾連接至4”血漿轉移組。
將Baxa泵緊鄰BSC放置。將中繼器泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至中繼器泵中。
準備調配介質。在BSC中，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。確保不破壞PLDS吸量管的無菌性。將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至中繼器泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入以上製備之「GlutaMax + IL-2」中進行抽吸。打開介於接受器與10L袋子之間的所有管夾。
泵送GlutaMax +IL-2至袋中。設定泵速至「中」及「3」並將所有「GlutaMax + IL-2」泵送至10L CTS AIM V介質袋中。一旦沒有剩餘溶液，清除管線並停止泵。記錄添加至以下每個Aim V袋之含有IL-2之GlutaMax的體積。
移除PLDS。確保所有管夾關閉，並將PLDS吸量管從中繼器泵流體轉移組移除。移除中繼器泵流體轉移組並將4”血漿轉移組蓋上紅色蓋子。
標示所製備的每袋「完全CM4第16天介質」。
按照樣本計畫移除介質保留。使用30mL注射器，藉由將注射器附接至4”血漿轉移組移除20.0mL的「完全CM4第16天介質」，並分配樣本至50mL錐形管中。在移除注射器後，確保4”血漿轉移組用管夾夾住或用紅色蓋子蓋住。
附接新的中繼器泵流體轉移組。將新的流體泵轉移組的較大直徑端附接至連接至「完全CM4第16天介質」袋子的4”血漿轉移組上。用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存介質保留樣本直到提交測試為止。
監測孵養箱。若適用，監測所製備的額外袋。孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。
溫熱完全CM4第16天介質。在孵養箱中溫熱第一袋完全CM4第16天介質≥ 30分鐘，直到準備使用為止。若適用，溫熱額外袋。
製備稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」之AIM-V介質至各4x15mL錐形管。標示錐形管。標示4個冷凍小瓶。

第16天REP分瓶
監測孵養箱。孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。
自孵養箱移出G-Rex500MCS。執行以下檢查，以在自孵養箱移出G-Rex500MCS之前確保符合孵養參數：上限、下限、移出時間。自孵養箱移出G-Rex500MCS。
將1L轉移包(W3006645)熱封，留下約12”的管線。將1L轉移包標示為TIL懸浮液。將1L轉移包(包括完整管線)放在磅秤上並記錄乾重。
GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色介質移除管線無菌接合至以上製備之10L labtainer袋「上清液」上的中繼器泵轉移組。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線無菌接合至以上製備的TIL懸浮液轉移包。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液labtainer袋及TIL懸浮液轉移包放在右側。將來自G-Rex500MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500 MCS的無菌過濾器。注意：在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。
G-Rex500MCS的體積減少。按照SOP-01777，將約4.5L的培養上清液從G-Rex500MCS轉移至10L Labtainer。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。
製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
起始TIL收集。記錄TIL收集的起始時間。劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。
TIL收集。鬆開所有通往TIL懸浮液轉移包的管夾。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確定維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。
潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保G-Rex500MCS上的所有管夾皆關閉。
熱封。在含有TIL的轉移包盡可能靠近接合處熱封，以使整體管路長度維持大約相同。將含有上清液之10L Labtainer熱封並傳遞至BSC中進行樣本收集。
記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算體積懸浮液。製備轉移包以進行樣本移除。將4”血漿轉移組接合至上述TIL懸浮液轉移包，留下盡量靠近袋子附接的母魯爾端。
移除細胞上清液的測試樣本。在BSC中，使用母魯爾埠及適當大小的注射器，自10L labtainer移出10.0 mL的上清液。放入15mL錐形管中並標示「BacT」且保留該管以用於BacT樣本。使用分開的注射器，移出10.0 mL的上清液並放入15mL錐形管中。保留該管用於黴漿菌測試樣本。標示管為「黴漿菌稀釋劑」。關閉上清液袋。將紅色蓋子蓋在魯爾埠上以關閉袋，並傳遞出BSC。
移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包的魯爾連接移出4x1.0 mL細胞計數樣本。將樣本放入以上製備的冷凍小瓶中。
移出黴漿菌樣本。使用3mL注射器，自TIL懸浮液轉移包移出1.0 mL並放入以上製備之標示「黴漿菌稀釋劑」的15 mL錐形管中。標示並在2至8℃下儲存黴漿菌樣本直到提交測試為止。
製備用於接種之轉移包。在BSC中，將中繼器泵流體轉移組的大直徑管路端附接至含有TIL之轉移包上的魯爾轉接頭。使用止血鉗夾住靠近轉移包的管線。將紅色蓋子蓋在轉移組的端上。
將TIL放入孵養箱中。將細胞懸浮液從BSC移出並放入孵養箱直到需要為止。記錄時間。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至以上製備的4.5mL的AIM-V介質中稀釋細胞計數樣本。此給出1:10稀釋。
計算培養瓶以進行繼代培養。計算要接種的培養瓶總數。注意：將G-Rex500MCS培養瓶的數量進位以求出最近的整數。
接種之G-Rex500MCS培養瓶的最大數量為五。如果計算出的接種培養瓶數量超過五，使用可用細胞懸浮液的全部體積僅接種五瓶。
判定需要的額外介質袋數量。計算除了以上製備的袋子之外所需的介質袋數量。將所需的介質袋數量進位至下一個整數。
視需要製備額外介質。以上計算之所需的每二個G-REX -500M培養瓶製備一個10L「CM4第16天介質」袋。繼續進行並接種第一GREX -500M培養瓶，同時製備並溫熱額外介質。
視需要製備額外介質袋。製備並溫熱以上判定之計算數量的額外介質袋。
填充G-Rex500MCS。在檯面上打開G-Rex500MCS並檢視瓶身是否有裂縫或管路是否扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。用奇異筆在培養瓶外面4500mL刻度處畫一條線。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。將G-Rex500MCS的紅色介質管線無菌接合至以上製備之介質袋上的流體轉移組。
準備泵送介質。將「CM4第16天介質」吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。
泵送介質至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」且泵送4500mL的介質至培養瓶中。泵送4.5L的「CM4第16天介質」至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶如上標示的線。一旦已轉移4.5L的介質，停止泵。
熱封。在靠近所產生的接合處熱封G-Rex500MCS的紅色介質管線，移除介質袋子。
重複填充。在溫熱及製備供使用的介質時，對以上所計算的每個培養瓶重複進行填充及封閉步驟。可使用重力填充或多個泵，同時填充多個培養瓶。每袋介質僅填充二個培養瓶。
記錄並標示填充的培養瓶。以字母及「第16天」標籤標示每個培養瓶。
視需要孵養培養瓶。在等待接種TIL時，將培養瓶保持在孵養箱中。記錄填充的培養瓶總數。
計算要添加的細胞懸浮液體積。計算要添加至新的G-Rex500MCS培養瓶之TIL懸浮液的目標體積。
如果培養瓶數量超過五個，使用細胞懸浮液的全部體積僅接種五瓶。
製備用於接種之培養瓶。自孵養箱移出步驟8.10.70的G-Rex500MCS。
準備泵送。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。將泵管路裝入Baxa泵。
自孵養箱移出TIL。將「TIL懸浮液」轉移包從孵養箱移出並記錄孵養結束時間。
製備用於接種之細胞懸浮液。將上述「TIL懸浮液」轉移包無菌接合至泵入口管線。
將TIL懸浮液袋放在磅秤上。使用設定至「低」及「2」的Baxa泵，自TIL懸浮液袋灌注管線至接合處。將磅秤歸零。
用TIL懸浮液接種培養瓶。將Baxa泵設定至「中」及「5」。泵送以上計算之體積的TIL懸浮液至培養瓶中。記錄添加至每個培養瓶中之TIL懸浮液的體積。
熱封。將「TIL懸浮液」轉移包熱封，留下足夠管路以接合至下一個培養瓶。
填充剩餘培養瓶。在每個接種的培養瓶之間，確保混合「TIL懸浮液」轉移包並重複填充及熱封步驟以接種所有剩餘培養瓶。
監測孵養箱。如果培養瓶必須分至兩個孵養箱，確保監測兩者。孵養箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。記錄每個培養瓶放入孵養箱中的時間。
計算孵養窗。執行以下計算以判定在第22天將G-Rex500MCS移出孵養箱的時間範圍。下限：時間+132小時；上限：時間+156小時。

第22天洗滌緩衝液製備
製備10 L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾連接將4”血漿轉移組附接至10L Labtainer袋。製備10 L Labtainer袋。標示「上清液」、批號及首字母/日期。轉移出BSC之前關閉所有管夾。注意：每二個所欲收集的G-Rex500MCS培養瓶製備一個10L Labtainer袋。
接合流體轉移組。在BSC外，關閉4S-4M60上的所有管夾。將中繼器流體轉移組接合至4S-4M60的一個公魯爾端。
將Plasmalyte-A及人類白蛋白25%傳遞至BSC中。將4S-4M60及中繼器流體轉移組總成傳遞至BSC中。

將Plasmalyte泵送至3000mL袋子中。將三袋Plasmalyte-A用4S-4M60接頭組穿刺。注意：在移除埠罩蓋之前，用酒精拭子(W3009488)擦拭埠罩蓋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。將Origen 3000mL收集袋經由魯爾連接連接至中繼器泵轉移組的較大直徑端。關閉3000mL Origen袋之未使用管線上的管夾。將Baxa泵緊鄰BSC放置。將轉移組管路裝入位在BSC外之Baxa泵。將泵設定至「高」及「9」。打開自Plasmalyte-A至3000mL Origen袋的所有管夾。泵送所有Plasmalyte-A至3000 mL Origen袋中。一旦已轉移所有Plasmalyte-A，停止泵。如有需要，藉由逆轉泵及操作袋子的位置，自3000mL Origen袋移除空氣。關閉所有管夾。
將3000mL袋子經由魯爾連接自中繼器泵流體轉移組移除並將紅色蓋子(W3012845)蓋在通往袋子的管線上。
添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。打開通氣的迷你穿刺針。不破壞穿刺針的無菌性，確保藍色蓋子穩固蓋好。用通氣的迷你穿刺針穿刺人類白蛋白25%瓶子的隔膜。注意：確保不破壞穿刺針的無菌性。重覆二次，總共穿刺三(3)次人類白蛋白25%瓶子。移除一個通氣的迷你穿刺針的藍色蓋子並將60mL注射器附接至人類血清白蛋白25%瓶子。抽取60mL的人類血清白蛋白25%。可能需要使用超過一瓶人類血清白蛋白25%。如有需要，將注射器與通氣的迷你穿刺針去連接並將注射器連接至在人類血清白蛋白25%瓶子中的下一個通氣的迷你穿刺針。一旦獲得60mL，將注射器自通氣的迷你穿刺針移除。將注射器附接至填充Plasmalyte-A之3000mL Origen袋子上的無針注射埠。分配所有人類白蛋白25%。重複以獲得最終體積120.0 mL的人類白蛋白25%。在添加所有人類白蛋白25%後，輕柔混合袋子。標示為「LOVO洗滌緩衝液」並指定24小時到期日。
製備IL-2稀釋劑。使用10mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋子上的無針注射埠移出5.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。分配LOVO洗滌緩衝液至50mL錐形管中並標示為「IL-2稀釋劑」。
等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100mL注射器，自無針注射埠抽取70.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。注意：每次使用前用酒精棉擦拭無針注射埠。將紅色蓋子蓋在注射器上並標示為「空白冷凍袋」及批號。注意：將注射器保持在室溫下，直到步驟8.14.3需要為止。
完成洗滌緩衝液製備。關閉LOVO洗滌緩衝液袋上的所有管夾。
解凍IL-2。解凍一個1.1mL的IL-2 (6x106 IU/mL)直到所有冰熔化為止。記錄IL-2批號及到期日。注意：確保IL-2標籤已附接。
IL-2製備。添加50µL IL-2原液(6x106 IU/mL)至標示「IL-2稀釋劑」之50mL錐形管。
IL-2製備。將錐形管重新標示「IL-2 6×104 」、日期、批號及24小時到期日。蓋上蓋子並儲存在2℃至8˚C下。
冷凍保存製備。將5個冷凍卡匣放在2℃至8℃下前處理，以進行最終產物冷凍保存。
製備細胞計數稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示批號及「用於細胞計數稀釋」之AIM-V介質至4支分開的15mL錐形管並將管標示。
製備細胞計數。將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。

第22天，TIL收集
監測孵養箱。孵養箱參數：溫度LED顯示：37 ± 2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。
自孵養箱移出G-Rex500MCS培養瓶。檢查培養瓶並在自孵養箱移出G-Rex500MCS之前證實符合孵養參數(孵養時間)。
製備TIL收集袋。標示3000mL收集袋為「TIL懸浮液」、批號及首字母/日期。
密封多餘連接。將收集袋上的二個魯爾連接靠近每個連接末端處熱封。
GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色介質移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至以上製備之10L labtainer袋。注意：參照過程注意事項5.16關於多個GatheRex裝置的使用。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至以上製備之TIL懸浮液收集袋。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液Labtainer袋及匯合的TIL懸浮液收集袋放在右側。將來自G-Rex500MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500MCS的無菌過濾器。在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。
體積減少。將約4.5L的上清液從G-Rex500MCS轉移至上清液袋。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。若有需要重複步驟。
製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
起始TIL的收集。記錄TIL收集的起始時間。劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。將「TIL懸浮液」3000mL收集袋放在平坦表面上的乾擦巾上。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。注意：如果細胞收集管子不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位管子。
TIL收集。鬆開所有通往TIL懸浮液收集袋的管夾。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000mL收集袋中。注意：維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。
潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。
關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保所有管夾皆已關閉。
熱封。在含有TIL的收集袋盡可能靠近接合處熱封，以使整體管路長度維持大約相同。將上清液袋子熱封。
完成收集剩餘的G-Rex 500 MCS培養瓶。重複以上步驟，將所有TIL匯合至相同的收集袋。每個第二培養瓶後必須置換10L上清液袋。
製備LOVO來源袋。獲得新的3000mL收集袋。標示為「LOVO來源袋」、批號及首字母/日期。將「LOVO來源袋」上的管路熱封，移除母魯爾，留下足夠管線以接合。
秤重LOVO來源袋。將適當大小的塑膠籃放在磅秤上並歸零。將LOVO來源袋(包括埠及管線)放在籃中並記錄乾重。
將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。關閉170 µm重力血液過濾器的所有管夾。
將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。將重力血液過濾器的長形末端無菌接合至LOVO來源袋。將過濾器的二個來源管線其中一個無菌接合至「匯合TIL懸浮液」收集袋。一旦接合完成，將過濾器上未使用的管線熱封以移除。打開所有必要管夾並藉由將收集袋吊掛在IV點滴架上抬高TIL懸浮液，以起始TIL重力-流動轉移通過血液過濾器並進入LOVO來源袋。排放時輕柔轉動或揉捏TIL懸浮液袋以保持TIL為均勻懸浮液。
關閉所有管夾。一旦所有TIL皆轉移至LOVO來源袋，關閉所有管夾。
熱封。在盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以移除重利血液過濾器。
移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自LOVO來源袋的無針注射埠移出4×1.0mL細胞計數樣本。將樣本放入在步驟8.11.36中製備的冷凍小瓶。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至以上製備的4.5mL的AIM-V介質中稀釋細胞計數樣本。此給出1：10稀釋。
記錄細胞計數及樣本體積。計算總存活TIL細胞。如果總存活細胞≥ 1.5×109 ，繼續進行。計算總成核細胞。
製備黴漿菌稀釋劑。在BSC中，自一個上清液袋經由魯爾樣本埠移出10.0 mL並放入15mL錐形管。標示15mL錐形管為「黴漿菌稀釋劑」。

LOVO
打開LOVO並開始「TIL G-Rex收集」規程並遵守螢幕提示。緩衝劑類型為PlasmaLyte。遵守LOVO觸控螢幕提示。
判定最終產物目標體積。使用總成核細胞(TNC)值及以下表，判定最終產物目標體積並記錄(mL)。
遵守LOVO觸控螢幕提示。
裝載拋棄式套組。在裝載拋棄式套組之前，用酒精棉隨後用無棉絨擦巾擦拭壓力感測器埠。裝載拋棄式套組。遵守螢幕指示裝載拋棄式套組。
移除濾液袋。當已裝載標準LOVO拋棄式套組，輕觸Next鍵。顯示容器資訊及位置螢幕(Container Information and Location Screen)。自磅秤移除濾液袋。
確保濾液容器是新的且離開磅秤(New and Off-Scale)。
輸入濾液容量。將LOVO Ancillary Bag無菌接合至現有濾液袋的公魯爾管線上。確保所有管夾打開且流體路徑為透明。輕觸濾液容器容量(Filtrate Container Capacity)輸入欄位。顯示數字鍵盤。輸入新的總濾液容量(5,000mL)。輕觸按鍵以接受輸入。注意：預估濾液體積不應超過5000 mL。
將濾液容器放在檯面上。注意：如果接合期間將管路移出F管夾，將管路放回管夾。將新的濾液容器放在檯面上。不要將濾液袋吊掛在3號磅秤上。3號磅秤在程序期間將是空的。
在變換至濾液容器後，遵守LOVO觸控螢幕提示。
確保套組裝載正確。顯示拋棄式套組乾式檢查(Disposable Kit Dry Checks)覆蓋。檢查套組裝載正確，且所有管夾皆打開。檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且可能的話進行改正。確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。按壓Yes鍵。所有LOVO機械式管夾自動關閉且顯示檢查拋棄式套組安裝(Checking Disposable Kit Installation)螢幕。LOVO進行一系列加壓步驟以檢查套組。
套組檢查結果。如果通過套組檢查，繼續進行至下一步驟。*如果未通過，在檢查完畢後可進行第二次套組檢查。*如果未通過，檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且進行改正。*如果未通過，確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。如果第二次套組檢查失敗：聯絡地區管理並準備安裝第10.0節的新套組。重複需要的步驟8.13.23至步驟8.13.30。
附接PlasmaLyte。顯示連接溶液(Connect Solutions)螢幕。洗滌值將總是為3000 mL。在螢幕上輸入此值。
將PlasmaLyte的3000mL袋子無菌接合至通過管夾1的管路。將PlasmaLyte袋吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。
驗證PlasmaLyte已附接。打開任何塑膠管夾。驗證溶液體積輸入為3000mL。輕觸「Next」鍵。顯示拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)覆蓋。驗證PlasmaLyte已附接且通往PlasmaLyte袋的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開，接著輕觸Yes鍵。
觀察PlasmaLyte正在移動。拋棄式套組灌注開始且顯示灌注拋棄式套組螢幕(Priming Disposable Kit Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過連接至PlasmaLyte袋子的管路。如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)。遵守LOVO觸控螢幕提示。
附接來源容器至管路。將在步驟8.12.31中製備之LOVO來源袋按照過程注意事項5.11無菌接合至通過管夾S的管路。可能必須將管路自管夾移除。注意：如果移除，確定將來源管路置換成S管夾。
吊掛來源容器。將來源容器吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。不要將來源吊掛在1號磅秤上。打開所有通往來源袋的管夾。
驗證來源容器已附接。輕觸Next鍵。顯示來源灌注(Source Prime)覆蓋。驗證來源附接至拋棄式套組，且通往來源的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開。輕觸Yes鍵。
證實PlasmaLyte正在移動。來源灌注開始且顯示灌注來源螢幕(Priming Source Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過附接至來源袋的管路。如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復來源灌注(Source Prime)。
開始程序螢幕(Procedure Screen)。當來源灌注成功完成時，顯示開始程序螢幕(Start Procedure Screen)。按壓開始，在按壓開始後立即出現「預洗滌循環1(Pre-Wash Cycle 1)」暫停螢幕。
倒轉過程中袋子(In Process Bag)。將過程中袋子自2號磅秤移除(亦可自過程中頂埠管路導引器移除管路)且將其手動倒轉以允許在拋棄式套組灌注步驟期間添加的洗滌緩衝液塗佈袋子的所有內部表面。重新將過程中袋子吊掛在2號磅秤上(袋子上的標籤朝向左側)。置換管路導引器中的頂埠管路如果其被移除。
倒轉來源袋。在按下開始鍵之前，在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，藉由按摩袋子角落並輕柔攪拌細胞混合來源袋，以產生均質細胞懸浮液。按壓恢復鍵。LOVO開始處理來自來源袋的流體且顯示洗滌循環1螢幕(Wash Cycle 1 Screen)。
來源潤洗暫停。一旦來源容器排空且LOVO已添加洗滌緩衝液至來源袋，顯示潤洗來源暫停(Rinse Source Pause)螢幕。在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，按摩角落並混合均勻。按壓恢復。
混合過程中袋子暫停。要製備用於另一通過旋轉機之通道的細胞，將過程中袋子用洗滌緩衝液稀釋。在添加洗滌緩衝液至過程中袋子後，LOVO將自動暫停且顯示「混合過程中袋子(Mix In Process Bag)」暫停螢幕。在不將袋子自磅秤移除的情況下，輕柔擠壓袋子將產物混合均勻。按壓恢復。
按摩過程中角落暫停。當過程中袋子清空時，將洗滌緩衝液添加至過程中袋子的底埠以潤洗袋子。在添加潤洗液後，LOVO自動暫停且顯示「按摩IP角落(Massage IP corners)」暫停螢幕。當「按摩IP角落」暫停螢幕顯示時，不要移除2號磅秤上的袋子。當過程中袋子仍然吊掛在2號磅秤上時，按摩袋子角落以將任何殘餘細胞帶入懸浮液中。確保袋子沒有在磅秤上晃動並按壓恢復鍵。
等待移除產物螢幕。在LOVO程序結束時，顯示移除產物螢幕(Remove Products Screen)。當此螢幕顯示時，可操作LOVO套組上的所有袋子。注意：不觸碰任何袋子，直到顯示移除產物(Remove Products)為止。
移除滯留物袋。將止血鉗夾住非常靠近滯留物袋上之埠的管路，以防止細胞懸浮液沉降進入管路中。在止血鉗下方熱封(按照過程注意事項5.12)，確定維持足夠管線以在步驟8.13.48中接合。移除滯留物袋。
製備用於調配之滯留物袋。將4”血漿轉移組之母魯爾鎖端接合至滯留物袋。轉移滯留物袋。
移除產物。遵守移除產物螢幕(Remove Products Screen)上之指示。關閉LOVO套組上之所有管夾以預防流體移動。
移除產物。輕觸Next鍵。所有LOVO機械式管夾打開且顯示移除套組螢幕(Remove Kit Screen)。
記錄資料。遵守移除套組螢幕上之指示。輕觸「Next」鍵。所有LOVO機械式管夾關閉且顯示結果摘要螢幕(Results Summary Screen)。記錄結果摘要螢幕上的資料。關閉所有泵及過濾器支持。當LOVO提示時將套組移除。所記錄的所有時間直接由LOVO記錄。

最終調配及填充
目標體積/袋計算。從以下表DDD，選擇對應以上LOVO滯留物體積的欲填充之CS750袋子數量、每袋之目標填充體積、每袋之移除保留體積及每袋之最終目標體積。
製備CRF空白。計算CS-10及LOVO洗滌緩衝液之體積以調配空白袋。
製備CRF空白。在BSC外，使用以上製備之LOVO洗滌緩衝液的注射器，經由魯爾連接添加經計算之體積至任何空的CS750袋。注意：空白CS750袋調配不需要無菌進行。使用適當大小之注射器，添加經計算之CS-10體積至以上製備之相同的CS750袋。將紅色蓋子蓋在CS750袋上。盡可能移除CS-750袋中盡量多的空氣。在盡可能靠近袋子處熱封CS750袋，移除管路。將CS750袋標示「CRF空白」、批號及首字母/日期。將CRF空白放在冰袋上，直到將其放入CRF中為止。
計算IL-2所需體積。計算欲添加至最終產物之IL-2的體積。
組裝連接設備。將4S-4M60無菌接合至CC2 Cell Connect，用4S-4M60歧管的4穿刺針端置換Cell Connect設備的單一穿刺針。
組裝連接設備。將CS750冷凍袋無菌接合至以上製備之制具，將四個公魯爾端(E)中之一者置換成各袋。將CS-10袋接合(按照過程注意事項5.11)至4S-4M60的穿刺針。將袋子放在二個在2至8℃下處理的冰袋之間以保持CS-10低溫。
製備含IL-2之TIL。使用適當大小的注射器，自「IL-2 6x104」等分試樣移除以上判定之量的IL-2。將注射器經由魯爾連接連接至以上製備之滯留物袋並注射IL-2。自注射器推注空氣通過管線以清除管線。
標示經調配的TIL袋。關閉轉移組上的管夾並將袋子標示為「經調配的TIL」並將袋傳遞出BSC。
將經調配的TIL袋添加至設備。一旦IL-2已添加，將「經調配的TIL」袋接合至設備上剩餘的穿刺針。
添加CS10。將經組裝的、附接有經調配的TIL、CS-750袋及CS-10之設備傳遞至BSC中。注意：將CS-10袋及所有CS-750袋放在二個在2℃至8℃下預處理的冰袋之間。不要將經調配的TIL袋放在冰袋上。確保設備上的所有管夾皆關閉。轉動活栓使注射器關閉。
更換注射器。抽取約10mL的空氣進入100mL注射器並置換設備上的60mL注射器。
添加CS10。轉動活栓使通往CS750袋的管線關閉。打開通往CS-10袋的管夾並抽取以上計算之體積至注射器中。注意：將使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。關閉通往CS-10之管夾且打開通往經調配的TIL袋之管夾且添加CS-10。以大約10.0mL/分鐘，添加第一個10.0mL之CS10。以大約1.0mL /sec之速率，添加剩餘的CS-10。注意：使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。記錄時間。注意：自第一次添加CS-10至開始冷凍的目標時間為30分鐘。記錄每次CS10添加之體積及總添加體積。關閉所有通往CS10袋的管夾。
製備CS-750袋。轉動活栓使注射器打開。打開通往經調配的TIL袋之管夾且抽取懸浮液到懸浮液即將到達活栓之前停止。關閉通往經調配的TIL袋之管夾。轉動活栓使其打開通往空的CS750最終產物袋。使用新的注射器，藉由將空氣抽出，盡可能移除CS750最終產物袋中盡量多的空氣。在維持注射器柱塞的壓力下，夾住關閉袋子。抽取約20mL空氣進入新的100mL注射器並連接至設備。注意：每個CS-750最終產物袋應在二個冰袋之間以保持經調配的TIL懸浮液低溫。
分配細胞。轉動活栓使通往最終產物袋的管線關閉。自經調配的TIL袋抽取以上計算的體積至注射器中。注意：多支注射器可用於獲得正確體積。轉動活栓使通往經調配的TIL袋的管線關閉。一次處理一個最終產物袋，將細胞分配至最終產物袋。記錄添加至以上每個CS750袋之細胞的體積。用注射器中的空氣清除管線，以使細胞等齊於穿刺針埠的頂部。關閉經填充的袋子上的管夾。每個最終產物袋皆重複步驟，在每袋之間輕柔混合經調配的TIL袋。記錄放入以下每個最終產物袋中之TIL的體積。
移除最終產物袋中的空氣並取出保留。一旦最後的最終產物袋已填充，關閉所有管夾。抽取約10mL的空氣進入新的100mL注射器並置換設備上的注射器。一次操作單一袋子，抽取每個產物袋的所有空氣加上以上判定用於保留之產物體積。注意：當移除樣本體積時，倒轉注射器並使用空氣清除管線至產物袋的頂埠。一旦保留體積及空氣已移除，夾住通往袋子的管線。
記錄自每袋移除之保留體積。
分配保留。將保留分配至50mL錐形管並標示管為「保留」及批號。重複進行於每袋。
製備最終產物以進行冷凍保存。使用止血鉗，靠近袋子夾住管線。移除注射器並將原本安裝注射器的設備上的魯爾連接蓋上紅色蓋子。將設備傳遞出BSC。在F(按照過程注意事項5.12)熱封，移除空的滯留物袋及CS-10袋。注意：保留設備上用於注射器之魯爾連接。丟棄空的滯留物及CS-10袋。
標示最終產物袋。將樣本附接以下的最終產物標籤。
製備最終產物以進行冷凍保存。將冷凍袋保持在冰袋上或2至8℃下，直到冷凍保存為止。
移出細胞計數樣本。使用適當大小的吸量管，移除2.0 mL以上移除的保留並放入欲用於細胞計數之15mL錐形管。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。注意：僅稀釋一個樣本至適當稀釋以驗證稀釋即已足夠。稀釋額外樣本至適當稀釋因數並繼續進行計數。記錄細胞計數及樣本體積。注意：如果不需要稀釋，「樣本[µL]」=200，「稀釋[µL]」=0。判定平均存活細胞濃度且執行細胞計數之存活性。
計算流動式細胞測量術樣本。執行計算以確保用於流動式細胞測量術取樣之足夠細胞濃度。
經計算之IFN-γ樣本。執行計算以確保用於IFN-γ取樣之足夠細胞濃度。
熱封。一旦樣本體積已判定，在盡可能靠近袋子處熱封最終產品袋，以自設備移除。
以黴漿菌樣本而言，將經調配的細胞懸浮液體積添加至上述標示「黴漿菌稀釋劑」之15mL錐形管。無菌性 & BacT。測試取樣。在BSC中，使用適當大小的注射器，自上述收集之保留的細胞懸浮液移出1.0mL樣本並接種厭氧瓶。重複上述於好氧瓶。
標示且儲存樣本。用樣本計畫庫存標籤標示所有樣本並適當儲存直到轉移為止。繼續下面步驟進行最終產物及樣本的冷凍保存。

最終產物冷凍保存
準備控速冷凍器。驗證CRF已在冷凍之前設置。記錄CRF設備。執行冷凍保存。
設置CRF探針。穿刺CRF空白袋上的隔膜。插入6mL小瓶溫度探針。
將最終產物及樣本放入CRF中。將空白袋放入預處理的卡匣中且轉移至CRF架的大約中間位置。將最終產物卡匣轉移至CRF架中且將小瓶轉移至CRF小瓶架中。將產物架及小瓶架轉移入CRF中。記錄將產物轉移入CRF的時間及室溫度。
判定達到4℃±1.5℃的所需時間且進行CRF運行。一旦室溫度達到4℃±1.5℃，開始運行。記錄時間。
完成及儲存。運行完成後停止CRF。將卡匣及小瓶自CRF移除。將卡匣及小瓶轉移至氣相LN2儲存。

實例17：產生富含腫瘤抗原特異性T細胞且具有增強治療活性的TIL產物
目標：為了產生富含腫瘤抗原特異性T細胞且具有增強治療活性的TIL產物。

背景：
與惡性病灶相關之T細胞一般而言功能異常且無法控制/預防腫瘤生長(Schietingeret al . Immunity 2016)。所有此實例中之文獻以參照方式整體納入以符合所有目的。
腫瘤浸潤淋巴球(TIL)可經萃取、活化及離體增殖且在體內重新輸注時誘導有效的抗腫瘤反應(Rosenberget al . Clin Cancer Res 2011)。最先在罹患轉移性黑色素瘤的患者使用的過繼性細胞轉移方式在額外的實質腫瘤組織學中測試。TIL療法在黑色素瘤及頭頸癌及子宮頸癌的臨床活性已經報告(SITC, 2017)。因此，可將腫瘤特異性TIL自抑制性腫瘤微環境救援且重新調理及/或擴增至足夠數量以有效地靶向腫瘤。
TIL臨床試驗的回溯分析暗示具有強健增生及存活能力的較低分化腫瘤反應性T細胞相對於效應及效應記憶T細胞授予優異的抗腫瘤療效且後代TIL產物應一致地包含較高水準的較低分化T細胞(Klebanoffet al . J Immunother 2012)。
幹記憶T細胞(TSCM)是抗原經歷中央記憶T細胞的早期祖細胞；它們顯示定義幹細胞的長期存活、自我再生及多能能力；且因此被視為用於產生有效TIL產物之最為所欲。TSCM在過繼性細胞轉移的小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集增強的抗腫瘤活性(Gattinoniet al . Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieriet al . Blood 2013)。
需要使TIL組成物偏向高比例的TSCM之策略，以確保最佳抗腫瘤活性。
抗原經歷T細胞的回春係使用經由誘導多能幹細胞(iPSC)技術開發的重新編程工具達成(Nishimuraet al . Cell Stem Cell 2012; Vizcardoet al . Cell Stem Cell 2012)。此方式需要將iPSC進一步離體分化成最適合打擊腫瘤的T細胞族群，使其成為容易限制原始T細胞受體(TCR)貯庫的耗時2步驟過程。關於細胞內材料遞送的體外及體內遞送策略，亦見Stewart,et al. 538:183-192 (2016)。
傳訊途徑包括Wnt、NOTCH及Myb已顯示支持從初始及/或抗原經歷T細胞直接產生TSCM樣細胞(Gattinoniet al . Nat Med 2009, Kondoet al . Nat Comm 2017, Gautamet al . SITC 2017)。
細胞命運重新編程需要暫時性暴露至適當轉錄因子(TF)。以TIL為例，此暴露需要靶向一大組份的T細胞以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。
無SQZ載體微流體平台代表一種先進的細胞內遞送策略；其已證實遞送蛋白質包括轉錄因子至多種初代人細胞包括T細胞的能力(Shareiet al . PNAS 2013以及Shareiet al. PLOS ONE 2015及Greisbecket al. The J of Immunology vol. 195, 2015)。亦見國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1，所有全文皆以引用方式併入本文中。該等描述於國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1之方法可為本發明所採用，以暴露TIL族群至轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子，其中TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子提供增加腫瘤抗原的表現及/或增加TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量，因此導致TIL族群的重新編程及經重新編程之TIL族群相較於未重新編程之TIL族群的治療療效增加。

策略：
提議使用SQZ細胞內TF蛋白質遞送技術來比較各種重新編程策略產生富含腫瘤抗原特異性T細胞且具有增強治療活性的TIL產物的能力。
工作計畫包括下列要點/問題：
1. 腫瘤類型
▪黑色素瘤
2. 最佳遞送條件
▪SQZ 人 T 細胞優化規程 + 額外條件
▪監測遞送效率
3. TF選項
▪TCF-1
▪NOTCH1/2 ICD
▪MYB
▪+/- 現有 iPSC 雞尾酒用於「完全」重新編程 ?
4. 靶向TIL之活化/擴增階段
▪REP 第 0 天
▪其他 ?
5. 重新編程之動力學
▪天數 7 、 11 、 14 、 18…
6. 欲靶向之TIL子集
▪最初主體
▪稍後比較經分選之個別子集 (TCM 、 TEM 、 TEFF 、 TEMRA) 。
7. 培養基中需要額外因子
▪IL7
▪RSPO3/WNT3A
▪其他 ?
8. 讀數
▪REP 前及後 TIL 擴大表型分析 ( 改良的 ?) 項目 1 、 2 及 3
▪REP 後 TIL 效應功能評估 ( 細胞介素及 / 或活化標誌產生測定 )
▪REP 後 TIL 腫瘤反應性評估 ( 自體腫瘤細胞共培養測定 )
▪TCR 貯庫分析 ( 流動式細胞測量術及 / 或 RNA-seq)
▪活細胞代謝測定諸如 Seahorse
• 額外考量
1. 蛋白質TF產生
2. 腫瘤採購
3. 後勤(細胞運送)

實例18：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed控速冷凍器型號7454 (Thermo Scientific)，將實例16中所述之簡化密閉程序製備的TIL冷凍保存的過程方法。
使用的設備如下：鋁盒固定架(與CS750冷凍袋相容)、750 mL袋子的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液態氮瓶、冰箱、熱電偶感測器(用於袋子的帶型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供0.5℃速率從成核到-20℃及每分鐘1℃到-80℃終末溫度的冷卻速率。程式參數如下：步驟1 -在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)到-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫度)到-45℃；步驟4：10.0℃/min (室溫度)到-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫度)到-20℃；及步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)到-80℃。
此實例之程序描繪係與實例16之過程搭配提供。

實例19：產生富含腫瘤抗原特異性T細胞且具有增強治療活性的TIL產物之程序
第1a期：採購一個經驗證的用於有效且特異性靜默之sd-RNAfm
初始期將涉及採購一個經驗證的用於有效且特異性靜默下列3個基因之sd-RNAfm：PD-1(亦稱為PDCD1 )、TIM3及CBLB。

第1b期：識別用於強效靜默LAG3及CISH之序列
將設計至多20個用於新目標的sd-RNA。將評估HeLa細胞中之外源性目標及活化初代T細胞中之內源性目標的基因靜默。表現水準減少超過80%的每個受到關注之基因(包括PD-1及LAG-3)將選擇一至二個前導序列(lead)。將產生選定sd-RNA之經完全修飾的版本。
預期將產生一至二個LAG3及CISH特異性sd-RNAfm。每個目標基因二個靶向RNA係為較佳。

第2期：在REP前TIL中驗證sd-RNA媒介之基因靜默。
將使用至多6個冷凍黑色素瘤/其他REP前細胞系來驗證sd-RNA目標(包括PD-1、TIM3、CBLB、LAG3及CISH)。條件將測試sd-RNA濃度、解凍後時間、重複/依序遞送及培養條件。讀數將為基因靜默的%，如藉由流動式及/或qPCR所評估。RNA遞送對於TIL生長及隨時間之靜默持久性的影響將藉由擴增TIL來評估。
預期80%靜默REP後24小時收集將獲得前導序列。總細胞數量將在未處理對照組的10%以內。

第3期：在過程2A中施行sd-RNA媒介之基因靜默。
基因靜默將在3至6個研究規模新鮮TIL製劑中優化。條件將測試sd-RNA濃度、時間、重複/依序遞送及培養條件。讀數將為REP後TIL中基因靜默的%，如藉由流動式及/或qPCR所評估。基因靜默對TIL表型及功能的影響將使用流動式細胞測量術測定評估。將進行可選的救援實驗及/或基因表現分析以驗證效應的特異性(例如潛在非目標靜默的程度及影響)。將選擇至少2個目標/sd-RNA對用於進一步工作。接著將表徵TIL表型。將評估相當於或高於對照TIL之非特異性及特異性TIL活性以判定最佳目標/sd-RNA。

第4期：在完整規模TIL製備中施行優化靜默規程。
每個目標基因將執行一次完整規模TIL製備。除了放行所需者外，將開發具有第3期定義之新特徵的TIL產物。

實例20：例示性SD-RNA製備及用途
sd-RNA設計
一給定目標將產生大約2至20個sd-RNA序列。在一些情況下，將基於根據超過500個sd-RNA序列功能篩選設計之選擇演算法(可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA)選擇sd-RNA序列。將使用回歸分析建立特定核苷酸及sd-RNA雙股中任何特定位置之修飾的發生頻率與其在基因抑制測定中之功能性之間的相關性。選定序列將藉由商業途徑合成(例如藉由TriLink Biotechnologies)為0.2-μmole規模且溶解於無菌之無RNase、無DNA酶注射用水(可購自CalBiochem, 4.86505)。雙股可藉由加熱至95℃達5 min且逐漸冷卻至室溫黏合。

sd-RNA 直接遞送 ( 被動攝取 )
寡核苷酸(包括本文所述之sd-RNA靶向基因)可用無血清介質稀釋且以三重複分配至96孔培養盤。可將細胞接種於含有減少FBS之適當培養基與預稀釋化合物之板中達所示之時間。HeLa細胞可以10,000個細胞/孔轉染於含有3% FBS之EMEM介質中。初代人T細胞(AllCells, CA)可培養於含有500 IU/ml IL2 (ProSpec)之完全AIM-V (Gibco)介質中。根據廠商指示在轉染前至少4天將細胞用抗CD3/CD28 Dynabeads (Gibco, 11131)活化。T細胞可在不移除Dynabeads下以100,000個細胞/孔在5% FBS中轉染，除非另外指明。可使用Olympus BX-60顯微鏡自經Cy3接合之sd-RNA轉染之活細胞獲得螢光影像以證實轉染效率。可藉由使用Hoechst 33342 (Molecular Probes, H1398)添加至轉染細胞30分鐘及影像處理來獲得核染色。

前導序列 sd-RNA 化合物識別
實例18描述的前導序列可使用此規程識別。可藉由將PDCD1靶向區域插入psiCheck2質體(Promega, C8021)中Renilla螢光素酶序列下游來建構螢光素酶報導子質體。為了進行比較，可將先前經驗證之MAP4K4 sd-RNA序列插入作為陽性對照。
為了進行篩選，可根據廠商指示使用Fugene HD (Promega, E2311)將HeLa細胞用經選殖之質體轉染。簡言之，可將細胞以2.5 x 106 個細胞/ 10 cm2 390培養皿接種於不含抗生素之EMEM (ATCC, 30-2003)介質中且稍後用質體以2.5：1 FuGENE：DNA比例轉染6小時。細胞可孵養16至18 hrs、用PBS洗滌3次、經胰蛋白酶處理且與預稀釋之sd-RNA化合物以最終濃度1 μM sd-RNA/10,000個細胞/100 μl含3% FBS之EMEM接種至96孔板。細胞可用sd-RNA處理48 h以促進被動細胞攝取化合物、用Glo溶解緩衝液(Promega, E266A)溶解且可測定Renilla及Firefly螢光素酶之表現。為此，將20 μl等分試樣的各溶解物添加至雙份不透光96孔板且與Matthews (Renilla)測定緩衝液59 397或Firefly螢光素酶398測定緩衝液(25 mM甘胺醯甘胺酸、15 mM MgSO4、4 mM EGTA、1 mM DTT、2 mM ATP、15 mM 399 K2PO4 pH 7.8及1 mM D-螢光素)混合。受質D-螢光素(Promega, E1605)及h-腔腸素(NanoLight, 301)在馬上要使用前添加。發光可在SpectraMax i3 (Molecular Devices)上測量、經標準化(Renilla/Firefly)且表示為未處理對照百分比。

藉由 qPCR 之 mRNA 定量
總RNA可根據廠商建議使用PureLinkTM Pro96純化套組(Invitrogen, 12173-011A)自轉染細胞單離。可製備1:5及1:25之非轉染(NT)細胞用於產生標準曲線。基因表現係於一步驟多目標(multiplex)qPCR 407中藉由在相同反應中混合20至40 ng經純化之RNA與Quanta qScript RT-qPCR ToughMix (VWR, 89236672)及Taqman探針- PDCD1-FAM (Taqman, Hs01550088_m1)及GAPDH-VIC (Applied Biosystems, 4326317E)來分析。樣本可使用Quanta建議設定在StepOnePlus qPCR機器(Applied Biosystems)中擴增。PDCD1表現可標準化至GAPDH、調整至標準曲線且表示為非靶向對照(NTC)轉染細胞的百分比。

細胞存活性測定
根據本發明經擴增的TIL可用各種劑量的sd-RNA寡核苷酸轉染72 h。將細胞洗滌且用1:10稀釋的CellTiter-Blue試劑(Promega, G808A)在37C下孵養1 h。將板放至室溫下且以530 nm ex/590 nm em記錄螢光。線性範圍可藉由以相同條件接種4系列的2倍細胞稀釋及螢光讀數作圖來證實。

腫瘤浸潤淋巴球單離
腫瘤浸潤淋巴球可如本文所述製備，例如圖8以及圖14所概述。

TIL 擴增
TIL可如本文所述接種於培養瓶中且執行第一及/或第二擴增步驟。sd-RNA可在第一擴增期間例如步驟b、在第一擴增之後例如在步驟C期間、在第二擴增之前或期間例如在步驟D之前或期間、在步驟D之後且在步驟E的收集之前、在步驟F的收集期間或之後、在步驟F的最終調配及/或轉移至輸注袋之前或期間以及在步驟F的任何可選的冷凍保存步驟之前添加。另外，sd-RNA可在自步驟F的任何冷凍保存步驟解凍之後添加。

胸苷併入測定
TIL樣本可在任何擴增步驟期間收集且以三重複接種在96孔板(104 443個細胞/孔)上的補充有2%人AB血清之CellGro介質中。在1小時後，可將1 μCi/孔的[甲基-3444 H]胸苷(PerkinElmer, Waltham, MA)添加至各孔且孵養四小時。接著可收集細胞且可在Trilux 1450 microBeta液體閃爍計數器(Wallac)中測量3 H-胸苷併入以檢查TIL生長。

sd-RNA 處理細胞之 IFN- γ分泌
經刺激之T細胞的IFN-γ產生可如廠商指示使用人IFN-γ ELISA發展套組(Mabtech)在上清液中測量。TIL可如本文中提供製備且用例如2 μM sd-RNA處理數天，在一些情況下處理四天。在此期間之後，可收集上清液用於ELISA分析以判定IFN- γ產生水準。

TIL 治療
可如本文所述採用經sd-RNA處理之TIL於用於治療癌症患者之方法。

實例21：例示性電穿孔方法
TIL係根據本文所述之任何方法製備。將測試下列轉染方法：lipofectin及Lipofectamin脂質體轉染、使用方波BTX ECM 830設備或Bio-Rad基因脈衝產生器II之電穿孔、使用Eppendorf Multiporator之指數衰退波電穿孔及Amaxa核轉染系統(nucleofector)。所有方法最初將基於廠商建議且視需要進行潛在修改。Amaxa核轉染規程可給予最高的轉染效率。Amaxa程序將使用三種溶液(V、R及T)中的一種與8種電穿孔程式之不同組合優化。亦見美國專利申請案號2016/0230188及美國專利第8,859,229號中描述之方法，兩者全文皆以引用方式併入本文中。電穿孔亦可根據Menger et al.,Cancer Res. , 2016 Apr 15; 76(8): 2087-93(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法，使用Agile Pulse BTX系統(Harvard Apparatus)進行。經電穿孔之細胞可藉由在本文他處描述之REP前及REP方法擴增。亦可使用所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。脈衝電穿孔優化可使用所述之方法執行且使用該方法之下列程式或修改：
TIL可在0.4 cm間隙樣品管中(大約為約106 個細胞/mL)以約20 μg的編碼GFP之質體及對照質體pUC使用不同的電穿孔程式或方法電穿孔。在電穿孔後約24小時，藉由流動式細胞測量術分析電穿孔細胞中的GFP表現來判定轉染效率。在TIL中質體電穿孔所需之最小電壓先前已報告於國際專利申請公開案號WO 2014/184744及美國專利申請公開案號US 2013/0315884 A1，彼等揭露以引用方式併入本文中。

實例22：製備富含腫瘤抗原特異性T細胞且具有增強治療活性的TIL產物之暫時性轉染規程
此實例中的實驗將研究二種不同TIL改善策略的效應。策略1：暫時性表現IL-2或膜結合形式的IL-15 (mb-IL15)。策略2：NOTCH媒介之TIL重新編程。在一些實施態樣中，NOTCH媒介之重新編程包括NOTCH1或NOTCH2之細胞內結構域(ICD)的mRNA表現。在一些實施態樣中，NOTCH媒介之重新編程包括NOTCH配體DLL1的mRNA表現。
所研究的腫瘤類型將為黑色素瘤、肺腫瘤、肉瘤及其他。
將使用如本文以上所述之過程產製TIL，包括例如在實例16中描述之過程。
RNA分子將使用例如實例21所述之方法遞送(亦見美國專利申請案號2016/0230188及美國專利第8,859,229號中描述之方法，兩者全文皆以引用方式併入本文中)。
將判定遞送條件，包括例如mRNA試劑驗證、暫時轉染及重新編程之時間、電穿孔時間與所使用之TIL過程的相容性、效率(包括轉染效率)及規模可擴充性。
實驗讀數將包括TIL表型(流動式細胞測量術)、TIL效應功能(細胞介素產生測定)、TIL腫瘤反應性(自體腫瘤細胞共培養測定)、TCR貯庫分析(流動式細胞測量術及/或RNA-seq)及TIL代謝狀態(活細胞代謝測定諸如Seahorse)或任何其他本文上述之參數。

預期結果：
遞送條件將視需要設計以導致受到關注之蛋白質在REP後TIL中的高表現。冷凍黑色素瘤REP前樣本將被用於篩選條件。為了優化實驗所遞送的試劑將為GFP mRNA。條件將測試數種TIL活化方法及電穿孔規程。讀數將為細胞存活性及相對於非電穿孔對照組的GFP陽性細胞%，如流動式細胞測量術所評估。選擇條件將在可用組織學之2至3個新鮮TIL製劑證實。在一些實施態樣中，轉染效率(ET)可在轉染後大約3、6、9、12、15及/或18小時藉由螢光激活細胞分選(FACS)判定。在一些實驗中，可進一步每12小時至24小時分析一次轉染細胞直到無法偵測到GFP為止。在一些實施態樣中，細胞存活性可藉由台盼藍染料排除判定。預期此規程將導致＞80%存活性及＞70轉染效率。
將產生人IL-2及mb結合之IL-15 mRNA且測試功能。將使用經驗證條件轉染來自各種組織學之至多6個TIL培養。讀數將為轉染效率、TIL表型及TIL效應功能。預期此規程將導致＞80%存活性、＞70%轉染效率、相對於對照組可相比或改良的TIL表型及顯著增加的TIL效應功能。
遞送條件將視需要設計以導致T細胞重新編程。儲存在Iovance之冷凍黑色素瘤REP前樣本將被用於篩選條件。所遞送的試劑將為NOTCH1或2 ICD mRNA。條件將測試數種TIL活化方法及電穿孔時間。讀數將為細胞存活性、轉染效率及相對於非電穿孔對照組的幹記憶T細胞(TSCM)%，如流動式細胞測量術所評估。選擇條件將在可用組織學之2至3個新鮮TIL製劑證實。預期此規程將導致＞80%存活性、＞70%轉染效率及顯著增加的TSCM頻率。
重新編程實驗將在來自各種組織學之至多6個TIL製劑上使用以上判定之轉染條件執行。讀數將為轉染效率、TIL表型、TCR貯庫及TIL效應功能。預期此規程將導致顯著增加的TSCM頻率、將允許維持TSCM子集相對於全TIL之TCR貯庫且將允許維持相對於對照組的效應功能。

實例23：採購及驗證SD-RXRNA
此實例中的實驗提供關於5個關注目標之sd-rxRNA建構體的資料：PDCD1 、TIM3 、CBLB 、LAG3 及CISH 。
第1期：採購5個關注目標之sd-rxRNA。
第2期：在REP前TIL中(8週)驗證sd-rxRNA媒介之基因靜默。
至多6個冷凍黑色素瘤/其他REP前細胞系。判定實驗條件。
讀數：
• 靜默%：≥ 80%預期
• 靜默持久性
• TIL生長：預期在對照組的10%以內
• TIL功能：預期增加細胞介素產生
第3期：在第2及/或3代過程(3個月)中施行sd-rxRNA媒介之基因靜默
• 3至6個研究規模之新鮮TIL製劑
• 如上之相同讀數
• TIL表型
• TIL腫瘤反應性
• 將選擇至少2個目標/sd-rxRNA對用於進一步工作
第4期：在完整規模TIL製備(8週)中施行優化靜默規程。
• 每個目標基因一個完整規模製備。

原理：
在TME中，TIL表現數種負面調節彼等之效應功能的抑制分子。
當離體培養TIL時可恢復功能性，但在重新輸注後將再次遭遇免疫抑制。
確保T細胞抑制途徑在重新輸注後維持靜默至少數天可改善TIL用於ACT的效力。
自我遞送siRNA (sd-rxRNA)提供敲低T細胞基因之有效方法。見例如Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 26(6):1482-1493 (2018)。

目標：
藉由靜默抑制途徑來重新建立TIL效應功能。

策略：
在快速擴增規程期間使用sd-rxRNA暫時性敲低1)PDCD1、2)TIM3、3)CBLB、4)LAG3及5)CISH。特別注意在快速擴增規程期間使用sd-rxRNA暫時性敲低PD1。

程序：
在經REP之TIL中驗證sd-rxRNA媒介之基因靜默(KD效率及持久性；T細胞存活性)。
基因靜默對TIL表型及功能(腫瘤反應性)的影響。

結果摘要
在REP期間添加sd-rxRNA導致成功基因KD 5個目標中的3個，包括高於80% (＞80%)的PD1敲低。
• PD1：＞80%
• TIM3：~70%
• LAG3：~70%
• CISH：~40%
• CBLB：無法偵測
PD1 KD(敲低)與降低存活性相關。PD1 KD與降低TIL擴增相關。
顯著表型改變與PD1及TIM3 KD相關，暗示較高活化水準(增強CD25、CCR7、CD56、4-1BB及OX40表現)。特別是，顯著表型改變與PD1 KD相關，暗示高活化水準(相對於NTC對照組增強CD25、CCR7、4-1BB及OX40表現)。
在這些實驗中沒有sd-rxRNA導致因應再刺激(INF g/IL-2/TNF-a)的增加細胞介素分泌。特別是，TIL暴露至PDCD1 sd-rxRNA不增加因應再刺激之CD107a移動或細胞介素分泌(INFγ/IL-2/TNF-α)。見例如圖54。
PD1 KD(敲低)增加TIL的體外殺滅能力(見例如圖49)。
方法：
• 第0天：REP前起始。添加介質加上IL-2。
• 第11天：REP起始解凍/新鮮REP前+ sd-rxRNA(即第二擴增起始)，介質包含IL-2加上PBMC
• 第14天：介質更換+ sd-rxRNA，含有IL-2、OKT及餵養細胞(PBMC)。
• 第17天：介質更換+ sd-rxRNA(添加額外sd-rxRNA)
• 第21天：介質更換+ sd-rxRNA(添加額外sd-rxRNA)
• 第22天：如上述收集TIL。
細胞計數及判定存活性。
判定KD(敲低)效率(Q-PCR，流動式)
如上述執行表型測定以表徵TIL。
檢查活化標誌(CD107a、IFNγ)(見例如圖45抑制/耗竭標誌及圖46 IFNγ)。
如圖40所提供的，此實驗在五種腫瘤類型中執行：黑色素瘤、乳房、肺、肉瘤及卵巢。

實例24：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法可包含：
(i) 自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(ii) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群；
(iii) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv) 使該第二及/或第三TIL族群在第11天與第21天之間暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量；及
(v) 在第22天或之後收集獲自步驟(iv)之治療性TIL族群，其中；且
(vi) 視需要，將自步驟(v)收集的TIL族群轉移至輸注袋。在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例25：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法可包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群在第11天與第21天之間暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 在第22天或之後收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例26：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於治療癌症個體之方法且該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群在第11天與第21天之間暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存；及
(i) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該患者。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM (在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC (包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例27：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，可提供一種用於治療癌症個體之經擴增的TIL族群，其中該經擴增的TIL族群係可藉由方法獲得之第三TIL族群，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二及/或第三TIL族群在第11天與第21天之間暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量；
(f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；及
(g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(f)轉移至步驟(g)無需打開該系統而發生；及
(h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例28：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA、0.5 μM sd-RNA、0.75 μM sd-RNA、1 μM sd-RNA、1.25 μM sd-RNA、1.5 μM sd-RNA、2 μM sd-RNA、5 μM sd-RNA或10 μM sd-RNA之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；及
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例29：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以2 μM sd-RNA之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；及
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例30：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA、0.5 μM sd-RNA、0.75 μM sd-RNA、1 μM sd-RNA、1.25 μM sd-RNA、1.5 μM sd-RNA、2 μM sd-RNA、5 μM sd-RNA或10 μM sd-RNA之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例31：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 使該第一TIL族群在介於第11與21天之間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(e) 視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(f) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(h) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生；
(i) 收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例32：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 使該第一TIL族群在介於第11與21天之間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(e) 視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(f) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(h) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生；
(i) 收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例33：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例34：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000 個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。

實例35：實例23的變體實施態樣
根據在實例23中討論的方法，描述擴增TIL同時暫時性改變蛋白質表現的方法。此實例提供與實例23所述之方法一致的進一步變化實施態樣。
在上述方法之一些實施態樣中，提供用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含：
(a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；
(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增；
(d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 使該第二TIL族群靜置約1天；
(f) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間(包括介於第11與21天之間)與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現；
(h) 視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移；
(i) 收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(e)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群；
(j) 將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及
(k) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
在一些變體實施態樣中，其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子包含sd-RNA，包括例如但不限於sd-rxRNA。在一些實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天暴露至sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現70%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現75%的PD-1表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現80%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現85%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現90%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現95%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列展現99%的PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM至約10 µM(在一些實施態樣中約0.25 µM至約4 µM)的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約5.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約6.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約7.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約8.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約9.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sd-RNA序列當以約10.0 µM的濃度遞送時展現PD-1表現減少。在任何前述實施態樣中，所指明之濃度可就交換介質之前或之後的TIL培養基判定。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約0.75 µM至約3 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.0 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約1.5 µM至約2.5 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少二天以2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及/或第21天中之至少三天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，TIL在第11天、第14天、第17天及第21天中之所有天以約2 µM的sd-RNA濃度暴露至sd-RNA。在一些變體實施態樣中，連同介質更換以約2 µM的sd-RNA濃度添加sd-RNA。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
在一些實施態樣中，在第11天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA、IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)之介質中。在一些實施態樣中，在第14天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第17天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，在第21天添加的sd-RNA係添加於包含sd-RNA且視需要包括IL-2、OKT3及APC(包括例如PBMC)中之一或多者之介質中。在一些實施態樣中，sd-RNA靶向PD-1。
上述實例係經提供以給出如何實施及使用本發明之組成物、系統及方法的實施態樣的完整揭露及說明給所屬技術領域中具有通常知識者，並非意圖限制發明人對於他們的發明之主張範圍。用於實施本發明之上述模式的修飾為該領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於下列權利要求範圍之內。說明書中所提及的所有專利及公開案指示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文所引證之所有參考文獻皆以引用方式且出於所有目的完整併入本文中，猶如個別公開案或專利或專利申請案係特別且個別明示以全文引用方式併入本文中以用於所有目的。
如所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行許多修改及變化。本文所述之特定實施態樣及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之用語以及申請專利範圍有權主張之等效物的全部範疇限制。
圖1：顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施態樣的圖。
圖2：顯示用於TIL製造之1C過程與2A過程實施態樣之間的比較。
圖3：顯示1C過程時間表。
圖4：顯示用於較高細胞計數之使用TIL製造過程2A之TIL療法實施態樣，包括投予及共療法步驟。
圖5：顯示用於較低細胞計數之使用TIL製造過程2A之TIL療法實施態樣，包括投予及共療法步驟。
圖6：顯示2A過程實施態樣的詳細示意圖。
圖7：描繪過程2A實施態樣的主要步驟，包括冷凍保存步驟。
圖8：例示性過程2A之圖提供步驟A至F之概覽。
圖9：過程2A資料收集計畫之程序流程圖。
圖10：快速擴增規程(REP)例示性實施態樣方案。腫瘤一抵達即經碎斷、放入含IL-2之G-Rex培養瓶進行TIL擴增(REP前擴增)共11天。就三重雞尾酒研究而言，在REP前起始時添加IL-2/IL-15/IL-21。就快速擴增規程(REP)而言，TIL係與餵養細胞及OKT3一起培養，進行額外11天的REP擴增。
圖11：冷凍保存TIL例示性製造過程(約22天)。
圖12：顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施態樣的圖。
圖13：過程1C及過程2A之例示性實施態樣的步驟A至F之比較表。
圖14：過程1C實施態樣與過程2A實施態樣之詳細比較。
圖15：描繪冷凍保存TIL製造過程(22天)之實施態樣。
圖16：第1代至第2代之過程改良表。
圖17：第2代冷凍保存LN-144製造過程方案。
圖18：顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施態樣的圖。
圖19：顯示無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)TIL懸浮液轉移包至重力血液過濾器的底部(單一管線)的示意圖。
圖20：顯示無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)來自GRex100MCS的紅色介質移除管線至「上清液」轉移包的示意圖。
圖21：顯示將4S-4M60接合(見實例16之過程注意事項5.11)至CC2 Cell Connect之示意圖，用4S-4M60歧管在(G)處的4穿刺針端置換Cell Connect設備(B)的單一穿刺針。
圖22：顯示將中繼器流體轉移組接合(見實例16之過程注意事項5.11)至4S-4M60的一個公魯爾端之示意圖。
圖23：顯示將重力血液過濾器的長形末端無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)至LOVO來源袋的示意圖。
圖24：顯示將過濾器的二個來源管線其中一個無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)至「匯合TIL懸浮液」收集袋之示意圖。
圖25：顯示將4S-4M60無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)至CC2 Cell Connect之示意圖，用4S-4M60歧管在(G)處的4穿刺針端置換Cell Connect設備(B)的單一穿刺針。
圖26：顯示將CS750冷凍袋無菌接合(見實例16之過程注意事項5.11)至步驟8.14.8所製備之制具之示意圖，將四個公魯爾端(E)中之一者置換成各袋。
圖27：顯示將CS-10袋接合(見實例16之過程注意事項5.11)至4S-4M60的穿刺針之示意圖。
圖28：顯示將「經調配的TIL」袋接合(見實例16之過程注意事項5.11)至步驟8.14.10所製備之設備上剩餘的穿刺針(A)之示意圖。
圖29：顯示在F(見實例16之過程注意事項5.12)熱封之圖，移除空的滯留物袋及CS-10袋。
圖30：顯示用於暫時性基因編輯之TIL過程實施態樣之示意圖。
圖31：顯示用於暫時性基因編輯之TIL過程實施態樣之示意圖。
圖32：顯示關於將RNA轉移步驟併入TIL過程以達暫時性基因重新編程目的之示意圖。
圖33：顯示所提議之用於暫時性改變TIL中之基因表現的基因工程改造方式概覽。
圖34：顯示可對其採用暫時性基因表現改變以改善TIL移動至腫瘤部位的趨化激素及趨化激素受體概覽。
圖35：顯示可對其採用暫時性基因表現改變以改善TIL移動至腫瘤部位的趨化激素及趨化激素受體第二概覽。
圖36：顯示例示性自我遞送核糖核酸(sd-RNA)實施態樣之示意性結構代表。見Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 2018。
圖37：顯示例示性sd-RNA實施態樣之示意性結構代表。見美國專利公開號2016/0304873。
圖38：顯示使用藉由利用特殊設計引子之PCR所獲得之DNA模板來合成mRNA之例示性方案。前置引子含有適用於體外轉錄之噬菌體啟動子且反置引子含有聚T延伸(stretch)。PCR產物係適用於體外轉錄之表現卡匣。新生mRNA 3’端的聚腺苷酸可預防異常RNA跑出(runoff)合成且產生雙股RNA產物。在轉錄完成後，可由聚(A)聚合酶額外延長聚A尾。(見美國專利第8,859,229號)。
圖39：本圖顯示Sd-rxRNA媒介之PDCD1 、TIM3 、CBLB 、LAG3 及CISH 的靜默。
圖40：TIL中Sd-rxRNA媒介之基因靜默；例示性規程。例示性腫瘤包括黑色素瘤(新鮮或冷凍；n=6)、乳房腫瘤(新鮮或冷凍；n=5)、肺腫瘤(n=1)、肉瘤(n=1)及/或卵巢(n=1)。
圖41：蛋白質表現減少係於5個目標中的4個偵測到。PD1：n=9、TIM3：n=8、LAG3/CISH：n=2、Cbl-b n=2。REP前黑色素瘤及新鮮乳癌TIL製劑，2uM sd-rxRNA。% KD計算為(100-(100*(關注基因/NTC)))。
圖42：Sd-rxRNA誘導之KD隨時間及刺激下降。n=3，REP前黑色素瘤TIL製劑，2uM sd-rxRNA。
圖43：TIL存活性稍微受到PDCD1 sd-rxRNA的影響。PD1、TIM3 n＞6，REP前黑色素瘤/新鮮乳癌TIL製劑。LAG3、CISH n=2，REP前黑色素瘤及乳癌TIL製劑，2uM sd-rxRNA。
圖44：Sd-rxRNA媒介之PD1及TIM3的KD與指示TIL活化之表型改變相關。n=3，REP前黑色素瘤TIL製劑，2uM sd-rxRNA。
圖45：由sd-rxRNA進行的PD1及TIM3敲低不影響其他抑制/耗竭標誌的表現。A)及B)n=3，TIM3：n=2，REP前黑色素瘤TIL製劑，2uM sd-rxRNA。
圖46：PD1及TIM3 KD不顯著改善IFNγ分泌。n=3，REP前黑色素瘤TIL製劑，2uM sd-rxRNA。
圖47：CD107a移動不受任何sd-rxRNA影響。A)n=6，REP前黑色素瘤TIL製劑，2uM sd-rxRNA。B)n=2，REP前黑色素瘤及乳癌TIL製劑，2uM sd-rxRNA。C)n=3，冷凍黑色素瘤及新鮮乳癌TIL。D)n=3，冷凍黑色素瘤及新鮮乳癌及肺癌TIL。E)及F)n=3，乳癌腫瘤新鮮製劑。
圖48：xCELLigence即時細胞分析(RTCA)。
圖49：PD1 KD TIL誘發較高殺滅效率。A)殺滅效率代表圖。B)n=3，黑色素瘤TIL，2uM sd-rxRNA之代表圖。
圖50：Sd-rxRNA劑量反應實驗。A)n=3，乳癌腫瘤新鮮製劑。B)n=3，REP前黑色素瘤TIL製劑。
圖51：Sd-rxRNA媒介之CBLB敲低無法被偵測到。A)圖。B)流動式細胞測量術測定圖。n=2，REP前黑色素瘤及新鮮乳癌TIL製劑。CBLB的mRNA水準相較於NTC沒有改變。使用流動式細胞測量術測定之Cbl-b的蛋白質水準沒有改變。
圖52：顯示測試Iovance之TIL製造過程中sd-rxRNA所媒介之基因靜默，評估TIL表型。sd-rxRNA媒介之PD-1敲低與指示TIL活化之表型改變相關。PD-1，n＞6，REP前黑色素瘤/新鮮乳癌TIL製劑，2uM sd-rxRNA。B)CD25、CCR7、CD27、CD28、CD56、CD95、4-1BB及OX40。B)CD25、CD56、CCR7、4-1BB及OX40。N=12，新鮮及冷凍TIL；乳房、黑色素瘤、卵巢及肺。
圖53：PD1 sd-rxRNA添加顯著減少細胞生長但不減少TIL存活性。A)擴增倍數。B)細胞存活性。n=7，乳房、肉瘤及肺TIL。
圖54：PD1 KD不改善因應非特異性刺激之CD107a移動及IFNγ分泌。A)刺激前及後表現CD107a之CD8細胞的百分比。B)刺激前及後IFNγ分泌。n=6，黑色素瘤TIL。
序列表簡單說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係重組人IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6係重組人IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係重組人IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8係重組人IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9係人4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係鼠類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab)(PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:12係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:13係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:14係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:15係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:16係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:17係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:18係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:19係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:20係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:21係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab)(BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:22係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:23係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:24係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:25係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:26係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:27係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:28係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:29係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:30係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:31係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:32係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:33係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:34係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:35係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:36係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:37係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:38係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:39係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:40係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:41係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:42係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:43係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:44係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:45係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:46係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:47係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:54係人OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:57係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:58係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:59係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:60係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:61係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:62係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:63係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:64係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:65係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:66係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:67係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:68係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:69係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:70係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:71係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:72係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:73係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:74係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:75係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:76係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:77係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:78係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:79係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:80係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:81係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:82係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:83係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:84係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:85係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:86係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:102係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:103係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:104係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:117係人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:118係人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:119係人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:120係人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:121係人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:122係人源化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:123係人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:124係人源化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。

Claims (70)

  1. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (i)自患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (ii)藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群； (iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行至少14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (iv)使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
  2. 如請求項1之方法，其中該方法進一步包含： (v)藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之細胞培養基來在步驟(iv)之前或之後執行額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中該較大的治療性TIL族群展現腫瘤抗原特異性T細胞數量的改變。
  3. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量； (f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生。
  4. 如請求項3之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟。
  5. 如請求項4之方法，其中該冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存介質執行。
  6. 如請求項4之方法，其中該抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
  7. 如請求項6之方法，其中該PBMC經照射且為同種異體。
  8. 如請求項6之方法，其中該PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至該細胞培養。
  9. 如請求項6之方法，其中該抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
  10. 如請求項3之方法，其中步驟(e)之該收集係使用基於膜之細胞處理系統執行。
  11. 如請求項3之方法，其中步驟(e)之該收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
  12. 如請求項3之方法，其中該多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
  13. 如請求項3之方法，其中該多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
  14. 如請求項13之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
  15. 如請求項1之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
  16. 如請求項3之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
  17. 如請求項3之方法，其中步驟(d)之該細胞培養基進一步包含IL-15及/或IL-21。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
  19. 如請求項17之方法，其中該IL-15濃度係約500 IU/mL至約100 IU/mL。
  20. 如請求項17之方法，其中該IL-21濃度係約20 IU/mL至約0.5 IU/mL。
  21. 如請求項3之方法，其中步驟(f)之該輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
  22. 如請求項5之方法，其中該冷凍保存介質包含二甲亞碸(DMSO)。
  23. 如請求項22之方法，其中該冷凍保存介質包含7%至10% DMSO。
  24. 如請求項3之方法，其中步驟(c)之該第一期間及步驟(e)之該第二期間各自個別地於一段10天、11天或12天的期間內執行。
  25. 如請求項3之方法，其中步驟(c)之該第一期間及步驟(e)之該第二期間各自個別地於一段11天的期間內執行。
  26. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約10天至約22天的期間內執行。
  27. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約20天至約22天的期間內執行。
  28. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約15天至約20天的期間內執行。
  29. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約10天至約20天的期間內執行。
  30. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約10天至約15天的期間內執行。
  31. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在22天或更少天內執行。
  32. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在20天或更少天內執行。
  33. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在15天或更少天內執行。
  34. 如請求項3之方法，其中步驟(a)至(f)在10天或更少天內執行。
  35. 如請求項5之方法，其中步驟(a)至(f)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
  36. 如請求項3至35中任一項之方法，其中步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL而言足夠的TIL。
  37. 如請求項36之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
  38. 如請求項3至37中任一項之方法，其中步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率增加。
  39. 如請求項3至38中任一項之方法，其中該抗原呈現細胞係於步驟(d)之該第二期間添加至該TIL而無需打開該系統。
  40. 如請求項3至39中任一項之方法，其中當投予至個體時，步驟(d)之該第三TIL族群提供至少五倍或更多倍的干擾素-γ產生。
  41. 如請求項3至40中任一項之方法，其中微生物汙染之風險相較於開放系統減少。
  42. 如請求項3至41中任一項之方法，其中來自步驟(f)或(g)之該TIL係輸注至患者。
  43. 如請求項3至42中任一項之方法，其中該多個片段包含約4個片段。
  44. 一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量； (f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存；及 (i) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該患者。
  45. 一種用於治療癌症個體之經擴增的TIL族群，其中該經擴增的TIL族群係可藉由方法獲得之第三TIL族群，該方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及視需要OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 使該第二及/或第三TIL族群暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量； (f) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (g) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(f)轉移至步驟(g)無需打開該系統而發生；及 (h) 使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之該經收集的TIL族群之該輸注袋視需要冷凍保存。
  46. 如請求項44或45之用於治療癌症個體之TIL族群，其中該方法進一步包含一或多個如請求項1至43中任一項引述之特徵。
  47. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含使TIL暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子以產生治療性TIL族群，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中增加的腫瘤抗原表現及/或增加腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中該蛋白質表現的暫時性改變導致誘導蛋白質表現。
  49. 如請求項1至48中任一項之方法，其中該蛋白質表現的暫時性改變導致減少蛋白質表現。
  50. 如請求項49之方法，其中採用一或多種sd-RNA以減少暫時性蛋白質表現。
  51. 一種用於評估轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子之方法，其中該方法包含擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群、使TIL暴露至轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子以產生治療性TIL族群，其中該TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供該治療性TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及cAMP蛋白質激酶A(PKA)。
  53. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e)對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移； (f)使該第二TIL族群靜置約1天； (g)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h)收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i)將得自步驟(h)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該無菌電穿孔步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA。
  54. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，該方法包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e)對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟或SQZ微流體膜破壞步驟，其中該無菌電穿孔步驟或SQZ微流體膜破壞步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移； (f)使該第二TIL族群靜置約1天； (g)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h)收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i)將得自步驟(h)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該電穿孔步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA，且進一步其中選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合所組成之群組的黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入該第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群中。
  55. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e)對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種短干擾RNA或一種傳訊RNA之轉移； (f)使該第二TIL族群靜置約1天； (g)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h)收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i)將得自步驟(h)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該無菌電穿孔步驟包含遞送用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現之短干擾RNA。
  56. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)使該第一TIL族群與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現； (e)視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移； (f)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g)使該第二TIL族群靜置約1天； (h)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生； (i)收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (j)將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及 (k)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
  57. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)使該第一TIL族群與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現； (e)視需要對該第一TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移； (f)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g)使該第二TIL族群靜置約1天； (h)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生； (i)收集獲自步驟(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(h)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (j)將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及 (k)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
  58. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e)使該第二TIL族群靜置約1天； (f)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g)使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sd-RNA/10,000個TIL/100 μL介質之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現； (h)視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移； (i)收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(i)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (j)將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(i)轉移至步驟(j)無需打開該系統而發生；及 (k)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
  59. 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b)將該腫瘤片段加入密閉系統； (c)藉由在包含IL-2及視需要包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d)添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e)使該第二TIL族群靜置約1天； (f)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、視需要OKT-3抗體、視需要OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(e)轉變至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g)使該第二TIL族群在步驟(d)、(e)及/或(f)之任一者的期間與至少一種sd-RNA接觸，其中該sd-RNA係以0.1 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、0.75 μM sd-RNA/10,000個TIL、1 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.25 μM sd-RNA/10,000個TIL、1.5 μM sd-RNA/10,000個TIL、2 μM sd-RNA/10,000個TIL、5 μM sd-RNA/10,000個TIL或10 μM sd-RNA/10,000個TIL之濃度添加，且其中該sd-RNA係用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB及其組合所組成之群組的分子表現； (h)視需要對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介該至少一種sd-RNA之轉移； (i)收集獲自步驟(g)或(h)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(e)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (j)將得自步驟(i)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (k)使用基於二甲亞碸之冷凍保存介質冷凍保存該經收集的TIL族群。
  60. 如請求項56至59中任一項之方法，其中該sd-RNA在該第一擴增期間係以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至該第一細胞族群。
  61. 如請求項56至59中任一項之方法，其中該sd-RNA在該第一擴增期間係以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至該第二細胞族群。
  62. 如請求項56至61中任一項之方法，其中添加二種sd-RNA以用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的二種分子表現。
  63. 如請求項56至61中任一項之方法，其中添加二種sd-RNA以用於抑制二種分子表現，其中該二種分子係選自由下列所組成之群組： i. PD-1及LAG-3， ii. PD-1及TIM-3， iii. PD-1及CISH， iv. PD-1及CBLB， v. LAG-3及TIM-3， vi. LAG-3及CISH， vii. LAG-3及CBLB， viii. TIM-3及CISH， ix. TIM-3及CBLB，及 x. CISH及CBLB。
  64. 如請求項56至62中任一項之方法，其中添加超過二種sd-RNA以用於抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的超過二種分子表現。
  65. 如請求項56至64中任一項之方法，其中選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的至少一種分子之表現在與該至少一種sd-RNA接觸的該TIL中係減少至少80%、85%、90%或95%。
  66. 如請求項56至64中任一項之方法，其中選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的至少一種分子之表現在與該至少一種sd-RNA接觸的該TIL中係減少至少80%、85%、90%或95%達至少12小時、至少24小時或至少48小時。
  67. 如請求項56至64中任一項之方法，其中該sd-RNA係藉由方法製備，該方法包含自藉由聚合酶鏈反應(PCR)所獲得且適用於體外(in vitro )轉錄sd-RNA之線性雙股DNA模板執行體外轉錄，該線性雙股DNA模板自5’至3’包含：在該雙股DNA之編碼股上之RNA聚合酶啟動子；長度小於3,000個核苷酸且在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之5’非轉譯區；編碼該多肽之開放閱讀框，其中該多肽對於待轉染之細胞是異源性的且其中該多肽係選自由免疫細胞之配體或受體、刺激或抑制免疫系統功能之多肽及抑制致癌多肽之功能的多肽所組成之群組；在轉染至真核細胞後用於將mRNA有效轉譯成可偵測多肽之3’非轉譯區；及在該雙股DNA之編碼股上之50至5,000個核苷酸的聚(A)延伸，其中該啟動子對於該開放閱讀框是異源性的，且其中該DNA模板並不包含在DNA載體內且終止於該聚(A)延伸的3’端。
  68. 如請求項67之方法，其中該RNA聚合酶啟動子包含選自由T7、T3或SP6 RNA聚合酶所組成之群組的RNA聚合酶之一致結合序列。
  69. 如請求項67之方法，其中該開放閱讀框編碼選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB所組成之群組的多肽。
  70. 如請求項67之方法，其中該線性雙股DNA模板進一步包含內部核糖體進入位點。
TW108100760A 2018-01-08 2019-01-08 產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法 TW201938177A (zh)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862614887P 2018-01-08 2018-01-08
US62/614,887 2018-01-08
US201862664034P 2018-04-27 2018-04-27
US62/664,034 2018-04-27
US201862669319P 2018-05-09 2018-05-09
US62/669,319 2018-05-09
US201862697921P 2018-07-13 2018-07-13
US62/697,921 2018-07-13
US201862734868P 2018-09-21 2018-09-21
US62/734,868 2018-09-21
US201862773715P 2018-11-30 2018-11-30
US62/773,715 2018-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201938177A true TW201938177A (zh) 2019-10-01

Family

ID=65324542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108100760A TW201938177A (zh) 2018-01-08 2019-01-08 產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220204932A1 (zh)
EP (1) EP3737743A1 (zh)
JP (2) JP2021509586A (zh)
KR (1) KR20200119242A (zh)
CN (2) CN117866899A (zh)
AU (1) AU2019205823A1 (zh)
BR (1) BR112020013848A2 (zh)
CA (1) CA3087771A1 (zh)
IL (1) IL275724A (zh)
MA (1) MA51636A (zh)
MX (1) MX2020007046A (zh)
SG (1) SG11202006541UA (zh)
TW (1) TW201938177A (zh)
WO (1) WO2019136456A1 (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CN111010866A (zh) 2017-05-24 2020-04-14 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
BR112020018658A2 (pt) 2018-03-15 2020-12-29 KSQ Therapeutics, Inc. Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada
AU2020279240A1 (en) 2019-05-20 2021-12-23 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
JP2022546486A (ja) * 2019-08-29 2022-11-04 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 細胞凍結保存培地
US20220389381A1 (en) * 2019-10-25 2022-12-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
KR20220119439A (ko) 2019-12-20 2022-08-29 인스틸 바이오 유케이 리미티드 종양 침윤 림프구를 분리하기 위한 장치 및 방법 및 그것의 용도
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
JP2023524108A (ja) 2020-05-04 2023-06-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
US20230172987A1 (en) 2020-05-04 2023-06-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
CN115315509B (zh) * 2021-02-08 2024-05-07 苏州沙砾生物科技有限公司 肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途
US20220313806A1 (en) 2021-03-25 2022-10-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
AU2022263418A1 (en) 2021-04-19 2023-10-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
WO2023090774A1 (ko) * 2021-11-17 2023-05-25 의료법인 성광의료재단 종양 침윤 림프구의 개선된 제조방법
WO2023143515A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
EP4289939A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-13 Apeiron Biologics AG Population of transfected immune cells and method for their production
WO2024025878A2 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Manufacturing processes for adoptive cell therapies
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024081791A2 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for maintaining a ccl3/ccl4 and ccr5 interaction program expressed during tumor progression
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
CN117025530B (zh) * 2023-10-10 2023-12-12 再少年(北京)生物科技有限公司 用肿瘤坏死因子受体超家族激动剂扩增肿瘤浸润淋巴细胞（til）的方法

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
ES2198414T3 (es) 1992-10-23 2004-02-01 Immunex Corporation Procedimientos para preparar proteinas oligomericas solubles.
GB9317380D0 (en) 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US5691188A (en) 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
EP0769063A1 (en) 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
JP2911056B2 (ja) 1995-04-08 1999-06-23 株式会社エルジ化学 ヒト４−１ｂｂに特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生する細胞株
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US6010613A (en) 1995-12-08 2000-01-04 Cyto Pulse Sciences, Inc. Method of treating materials with pulsed electrical fields
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
NZ334691A (en) 1996-10-11 2000-12-22 Bristol Myers Squibb Co Compositions of anti-4-1BB antibody effective for immunomodulation and treatment of T-cell autoimmune disease
US6248878B1 (en) 1996-12-24 2001-06-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside analogs
ATE466948T1 (de) 1997-03-11 2010-05-15 Univ Minnesota Dns-basiertes transposon-system für die einführung von nucleinsäure in die dns einer zelle
US6475994B2 (en) 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
EP1206532A2 (en) 1999-08-03 2002-05-22 Sequitur, Inc. Improvements in antisense oligomers, delivery of antisense oligomers, and identification of antisense oligomer targets
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US6627442B1 (en) 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
EP2316490A3 (en) 2000-10-31 2012-02-01 PR Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
CA2489004C (en) 2002-06-13 2013-01-08 Crucell Holland B.V. Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor
PL375144A1 (en) 2002-07-30 2005-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9839649B2 (en) 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US10011836B2 (en) 2002-11-14 2018-07-03 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US20040224405A1 (en) 2003-05-06 2004-11-11 Dharmacon Inc. siRNA induced systemic gene silencing in mammalian systems
CN103173354B (zh) 2003-10-08 2017-07-14 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
EP1814568A4 (en) 2004-10-29 2009-08-12 Univ Southern California ANTI-CANCER POLYIMMUNOTHERAPY IN WHICH CO-STIMULATING MOLECULES ARE USED
ES2605380T3 (es) 2005-05-06 2017-03-14 Providence Health & Services - Oregon Proteina de fusión OX40-inmunoglobulina trimérica y métodos de uso
CN101213297B (zh) 2005-05-09 2013-02-13 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及单独使用或与其它免疫治疗剂联合使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101411165B1 (ko) 2005-07-01 2014-06-25 메다렉스, 엘.엘.시. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날항체
KR100650384B1 (ko) * 2005-09-12 2006-11-30 전남대학교산학협력단 성숙자연살해세포의 분화용 조성물 및 그 제조 방법
TWI466269B (zh) 2006-07-14 2014-12-21 Semiconductor Energy Lab 非揮發性記憶體
EP1894940A1 (en) 2006-08-28 2008-03-05 Apogenix GmbH TNF superfamily fusion proteins
CA2663601C (en) 2006-09-22 2014-11-25 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
US20100136030A1 (en) 2007-02-27 2010-06-03 Lamhamedi-Cherradi Salah-Eddine Antagonist ox40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
ES2567704T3 (es) 2007-07-10 2016-04-26 Apogenix Gmbh Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF
CA2702028A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
EP2851374B1 (en) 2007-12-14 2017-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human OX40 receptor
US10131904B2 (en) 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
EP2540740B1 (en) 2008-06-17 2014-09-10 Apogenix GmbH Multimeric TNF receptors
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
PL2310509T3 (pl) 2008-07-21 2015-08-31 Apogenix Ag Jednołańcuchowe cząsteczki TNFSF
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
EP2829550B1 (en) 2009-01-09 2016-11-16 Apogenix AG Fusion proteins forming trimers
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US8383099B2 (en) * 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
CA2783550A1 (en) 2009-12-08 2011-06-16 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
WO2011109698A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Formulations and methods for targeted delivery to phagocyte cells
US9080171B2 (en) 2010-03-24 2015-07-14 RXi Parmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
CA2794187C (en) 2010-03-24 2020-07-14 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
CN110042099A (zh) 2010-03-24 2019-07-23 菲奥医药公司 皮肤与纤维化症候中的rna干扰
DK2609118T3 (en) 2010-08-23 2017-04-03 Univ Texas Anti-OX40 antibodies and methods for their use
NZ729044A (en) 2010-09-09 2020-07-31 Pfizer 4-1bb binding molecules
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
HUE054318T2 (hu) 2010-11-12 2021-08-30 Nektar Therapeutics IL-2 molekularész konjugátumai és polimer
AR084752A1 (es) * 2010-12-30 2013-06-05 Anthrogenesis Corp Metodos para crioconservar y encapsular celulas
WO2012129201A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
WO2012177788A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
CN103946238B (zh) 2011-08-23 2016-10-12 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体及使用其的方法
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
AU2012326203B2 (en) 2011-10-17 2017-11-30 Massachusetts Institute Of Technology Intracellular delivery
SG10202111564SA (en) 2012-05-18 2021-12-30 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
WO2013176916A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Roman Galetto Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
SG11201407819UA (en) 2012-06-11 2014-12-30 Wolf Wilson Mfg Corp Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8959044B2 (en) 2012-11-28 2015-02-17 Linkedin Corporation Recommender evaluation based on tokenized messages
RU2671897C2 (ru) 2013-03-01 2018-11-07 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Способы получения из опухоли обогащенных популяций реактивных в отношении опухоли т-клеток
PT2976361T (pt) 2013-03-18 2018-10-19 Janssen Pharmaceuticals Inc Anticorpos anti-cd134 (ox40) humanizados e utilizações dos mesmos
KR102220382B1 (ko) 2013-05-13 2021-02-25 셀렉티스 면역요법을 위한 매우 활성인 ｔ 세포를 조작하는 방법
US9840692B2 (en) 2013-06-24 2017-12-12 Wilson Wolf Manufacturing Closed system device and methods for gas permeable cell culture process
JP6772062B2 (ja) 2013-12-02 2020-10-21 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． 癌の免疫療法
EP3527587A1 (en) 2013-12-17 2019-08-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-l1 binding antagonists
US10899840B2 (en) 2014-02-04 2021-01-26 Pfizer Inc. Combination of a PD-1 antagonist and a 4-1BB agonist for treating cancer
US20170044496A1 (en) * 2014-04-10 2017-02-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Adoptive Cell Therapy
JP7413639B2 (ja) 2014-06-11 2024-01-16 ポリバイオセプト ゲーエムベーハー 能動的細胞免疫療法のためのサイトカイン組成物を用いたリンパ球の増殖
US20170362556A1 (en) * 2014-12-09 2017-12-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Systems and Methods for Aseptic Sampling
CN107532162A (zh) 2014-12-12 2018-01-02 托德·M·伍尔夫 用于利用寡核苷酸编辑细胞中核酸的组合物和方法
US9944894B2 (en) * 2015-01-16 2018-04-17 General Electric Company Pluripotent stem cell expansion and passage using a rocking platform bioreactor
US20160319278A1 (en) 2015-04-03 2016-11-03 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
CA2988996A1 (en) 2015-07-09 2017-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of materials to anucleate cells
WO2017030973A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
WO2017041051A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
US11021707B2 (en) 2015-10-19 2021-06-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding RNA
ES2964746T3 (es) * 2015-12-30 2024-04-09 Celgene Corp Métodos de producción de linfocitos T y linfocitos T producidos mediante el mismo
JP7033535B2 (ja) 2016-01-12 2022-03-10 スクイーズ バイオテクノロジーズ カンパニー 複合体の細胞内送達
EP3408391A4 (en) 2016-01-31 2019-08-28 University of Massachusetts BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES
CA3022319A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
EP3248627B1 (en) * 2016-05-27 2020-02-26 Fenwal, Inc. Systems and methods for priming a fluid circuit
WO2017219150A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Mcmaster University Adoptive cell transfer and oncolytic virus combination therapy
CA3049163A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists

Also Published As

Publication number Publication date
CA3087771A1 (en) 2019-07-11
US20220204932A1 (en) 2022-06-30
EP3737743A1 (en) 2020-11-18
BR112020013848A2 (pt) 2020-12-01
WO2019136456A1 (en) 2019-07-11
JP2024015137A (ja) 2024-02-01
IL275724A (en) 2020-08-31
JP2021509586A (ja) 2021-04-01
CN111836887A (zh) 2020-10-27
CN117866899A (zh) 2024-04-12
KR20200119242A (ko) 2020-10-19
SG11202006541UA (en) 2020-08-28
MX2020007046A (es) 2020-09-07
MA51636A (fr) 2020-11-18
AU2019205823A1 (en) 2020-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201938177A (zh) 產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法
TWI833719B (zh) 來自細針抽吸物及小活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞（ｔｉｌ）擴增
TWI831776B (zh) 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途
WO2019136459A1 (en) Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
TW202039830A (zh) 用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途
BR112019020326A2 (pt) métodos para expandir linfócitos infiltrando os tumores e para tratar um indivíduo com câncer, e, população de linfócitos infiltrando os tumores.
JP2022506508A (ja) Ａｋｔ経路阻害剤を利用したｔｉｌの拡大培養
TW202039829A (zh) 改善之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
JP2021503885A (ja) 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
JP2022514023A (ja) 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用
US11713446B2 (en) Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
JP2024506557A (ja) 修飾された腫瘍浸潤リンパ球を作製する方法及び養子細胞療法におけるそれらの使用
WO2020232029A1 (en) Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
KR20210091212A (ko) 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
JP2022522473A (ja) 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用
JP2024519029A (ja) Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
TW202208616A (zh) 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
CN113748202B (zh) 由液体肿瘤扩增肿瘤浸润淋巴细胞及其治疗用途
CN117940557A (zh) 制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用
CN117480246A (zh) 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物