KR20220119439A - 종양 침윤 림프구를 분리하기 위한 장치 및 방법 및 그것의 용도 - Google Patents

종양 침윤 림프구를 분리하기 위한 장치 및 방법 및 그것의 용도 Download PDF

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조앤 맥커프리
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인스틸 바이오 유케이 리미티드
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Abstract

본 발명은 TIL 집단의 팽창 전에 절제된 종양의 무균성 분해, 풍부화, 및 냉동보존을 위한 반자동 장치 및 키트의 사용을 통하는 방법을 포함하여, 종양 침윤 림프구 (TIL)를 분리하고 냉동보존하며 TIL의 치료 집단을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 TIL, 예를 들어 UTIL의 팽창, 및/또는 안정화 방법, 그것을 포함하는 조성물 및 그것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

Description

종양 침윤 림프구를 분리하기 위한 장치 및 방법 및 그것의 용도
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 2019년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/951,559호, 2020년 2월 27일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/982,470호, 2020년 7월 2일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 29/740,293호 및 2020년 7월 2일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 63/047,431호로부터의 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원들의 내용은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
2017년 1월 13일에 출원된 영국 특허 출원 일련 번호 GB1700621.4, 2018년 1월 12일에 출원된 유럽 특허 출원 EP18701791.8, 2018년 1월 12일에 출원되고 2018년 7월 19일에 PCT 공개 번호 WO 2018/130845로서 공개된 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/GB2018/050088, 유럽 특허 공보: EP3568459, 및 2019년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/951,559호를 참조하며, 이들은 참조로 포함된다.
2019년 3월 1일에 출원된 영국 특허 출원 일련 번호 GB1902763.0, 2019년 3월 27일에 출원된 영국 특허 출원 일련 번호 GB1904249.8, 및 2020년 2월 28일에 출원되고, 2020년 9월 10일에 WO 2020/177920로서 공개된 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/EP2020/000053을 참조한다.
전술한 출원들, Biomarker Predictive of Tumor Infiltrating Lymphocyte Therapy and the Uses Thereof, WO2019145711A1 PCT/GB2019/050188, Tumor Infiltrating Lymphocyte Therapy and Uses Thereof USA, PCT/GB2020/051790 및 미국 출원 일련 번호 62/878,001, Receptors Providing Targeted Costimulation for Adoptive Cell Therapy WO　2020/152451, 미국 출원 일련 번호 62/951,770 및 GB1900858.0, Cells Expressing Recombinant Growth Factor Receptors WO　2017/103596A1, 미국 출원 일련 번호 16/061,435, 및 유럽 특허 출원 공보 EP3390436, 및 Chimeric Growth Factor Receptors WO2019243835A1 PCT/GB2019/051745, 및 그 안에서 또는 그것들의 출원 중에 인용된 모든 문서 ("출원 인용 문서") 및 출원 인용 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서, 및 여기서 인용되거나 참조된 모든 문서 ("본원 인용 문서"), 및 여기서 또는 그 안에서 참조로 포함된 임의의 문서에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침, 설명, 제품 사양, 및 제품 시트와 함께 여기서 인용된 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서가 본원에 참조로 포함되며, 발명의 실시에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 언급된 문서는 각각의 개별 문서가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시되는 것과 같은 정도로 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 종양의 반자동 무균 조직 프로세싱을 통해 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocyte, TIL)를 분리하고 냉동시킴으로써 TIL의 치료 집단(therapeutic population)을 생성하기 위한 방법 및 장치를 제공한다.
T 세포는 골수에 상주하지만 계속해서 흉선으로 이동하여 성숙해지는 조혈모세포로부터 유래된다. 성숙 과정 중에, T 세포는 일련의 선택 과정을 거침으로써, 다양한 T 세포 레퍼토리를 생성한다. 그런 후 이들 세포는 말초 순환계로 방출되어 적응 면역 체계의 일부로서의 그것의 특이적 기능을 수행한다.
T 세포는 세포의 균질한 그룹은 아니지만 많은 계통으로 이루어지고, 그 중에서 우세한 유형은 2개의 추가의 세포 마커의 발현에 의해 정의된다. CD4 발현 T 세포는 일반적으로 헬퍼 (Th)로 명명되고 세포-세포 접촉에 의해 및 사이토카인으로 불리는 매개체 분자의 생성을 통해 면역 체계의 많은 기능을 조정하는 것으로 여겨진다. CD8 T 세포는 세포독성 (Tc)인 것으로 간주되며 표적 세포의 직접적인 사멸을 수행하는 세포인 것으로 여겨진다. 이들 활성은 T 세포 수용체/항원/MHC 상호작용을 통해 제어된다 - 따라서, 표적 세포 상에서 펩타이드/MHC가 성공적으로 인식될 때, CD4 및 CD8 세포는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 포함하여, 표적 세포를 제거하기 위해 사이토카인 생성 및 세포독성 활성을 통해 협력하여 작용한다.
T 세포는 온전한 단백질 (항원)을 인식하지 못하지만 주요 조직적합성 복합체 (MHC)로 불리는 특정 단백질에 의해 표적 세포의 표면 상에 제공된 짧은, 단백질 단편에 반응한다. 성숙 과정 중에, T 세포는 세포 표면에 항원-특이적 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는데, 그것은 MHC 분자에 의해 제공된 이들 짧은 단백질 (펩타이드) 항원을 인식한다. 따라서, 정확한 펩타이드가 정확한 MHC 분자와 관련된 표적 세포의 표면 상에 제공될 때에만 T 세포는 그것의 면역 기능을 활성화할 것이다. 그러므로, 종양 특이적 T 세포의 빈도는 종양에서 풍부하여 그것을 종양 특이적 T 세포 즉 종양-침윤 림프구 (TIL)의 이상적인 공급원으로 만든다 (Andersen et al., Cancer Res. 2012 Apr 1;72(7):1642-50. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2614. Epub 2012 Feb 6).
물론, 이것은 매우 단순화된 관점이고 T 세포 기능의 짧은 일반적인 개요를 나타낸다. 적응 면역 반응은 단독으로는 작용하지 않지만, 정확한 면역 반응이 개시되고 면역 반응이 제어되며 필요하면 꺼지는 것을 보장하기 위하여, 필요한 활성 부위로 T 세포의 효율적인 이동을 촉진하기 위해 다양한 면역 및 비-면역 세포와의 광범위한 상호작용을 필요로 한다. 그러므로, 제조된 TIL이 종양에 대한 면역 반응을 개시하는 환자에서도 그것은 환자 자신의 면역 체계 및 종양 환경에 의해 지지되거나 약화될 수 있다.
종양 특이적 TIL은 전이성 암 환자의 종양으로부터 분리된다. 대부분의 암 환자에서 순환하는 종양-특이적 T 세포는 혈액에서 거의 검출될 수 없다. 그러나, 피부의 흑색종과 같은 특정 암은 그것이 특히 종양 영역 내에서, 종양 성장의 자연적인 과정 중에 항-종양 활성을 가진 상당수의 T 세포를 유도하는 능력을 가지기 때문에 면역원성인 것으로 나타난다 (Muul et al., J Immunol. 1987 Feb 1;138(3):989-95). "종양에 특이적인 T 세포로서 선택된" 종양-반응성 T 세포는 종양 물질로부터 분리되고 생체외에서 높은 수로 팽창(expansion)될 수 있다. 보고서는 이들 세포가 항-종양 활성을 함유하며, 환자에게 재주입될 때 종양 파괴 및 임상 반응을 초래할 수 있음을 보여주었다 (Dudley et al., Science. 2002 Oct 25;298(5594):850-4. Epub 2002 Sep 19). 후속 실험에서 T 세포 특성의 중요성이 확인되었고 "젊은(young)" 빠르게 성장하는 세포 "젊은 TIL"의 이익이 확인됨으로써 세포는 전혀 "특이성에 대해 선택되지 않는다". 현저하게 이것은 TIL 또는 CD8 선택된 TIL에서 약 50%의 우수한 반응 속도를 유발한다 (Besser et al., Anticancer Res. 2009 Jan;29(1):145-54; Dudley et al., Clin Cancer Res. 2010 Dec 15;16(24):6122-31. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-1297. Epub 2010 Jul 28).
Andersen 등에 의한 연구 (Cancer Res. 2012 Apr 1;72(7):1642-50. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2614. Epub 2012 Feb 6)는 흑색종 특이적 T 세포 (알려져 있는 암 항원의 경우)가 말초혈 중의 T 세포와 비교하여 종양 내에 풍부한 것을 확인하였다. 이것은 분리된 TIL 집단이 종양 특이적 T 세포에서 풍부하여 말초혈로부터 분리된 T 세포를 사용하는 흑색종 환자에서의 초기 실험과 비교할 때 향상된 항-종양 활성을 초래하며 IL2 또는 정맥내 IL-2 단독의 유사한 수준으로 팽창된다는 도그마를 지지한다 (LAK cells - Bordignon et al., Haematologica. 1999 Dec;84(12):1110-49).
미국 특허 제 10,398,734호는 TIL을 팽창시키는 방법 및 TIL의 치료 집단을 생성하는 방법에 관한 것이다. '734 특허의 종양은 벌크 종양(bulk tumor)으로서 구입할 수 있으며, 벌크 종양 내부의 TIL은 빠르게 산소 결핍이 되고 시간이 지남에 따라 점진적으로 악화된다. '734 특허의 종양은 또한 악화된 내부 세포 집단을 가지는 단편으로 프로세싱된다. 나아가, 제조를 위해 사용된 TIL은 조직 단편으로부터 팽창된 TIL일뿐만 아니라 내부에 보유된 임의의 TIL일 것이다. 그러므로, 결과적으로 생성된 세포 집단은 종양 환경의 전체 다양성을 반영할 수 없다.
TIL을 수득하는 것은 TIL 집단의 배양 및 팽창 전에 벌크 종양으로서 고체 조직의 무균 분해(aseptic disaggregation)를 필요로 한다. 고체 조직 분해 중의 상태 및 세포를 수득하는데 걸리는 시간은 최종 세포화 물질의 생존 능력 및 회수에 실질적인 영향을 나타낸다. 종래 방법을 사용하여 얻어진 고체 조직 유래 세포 현탁액은 자주 광범위한 상이한 세포 유형, 분해 배지, 조직 파편 및/또는 유체를 포함한다. 이것은 예를 들어 재생 의약품의 제조, 입양 세포 요법, ATMP, 진단적 시험관내 연구 및/또는 과학적 연구조사 전에 선택적인 표적화의 사용 및/또는 세포 유형의 분리를 필요로 할 수 있다.
현재, 선택 또는 풍부화 기법은 일반적으로: 크기, 모양, 밀도, 부착력, 강력한 단백질-단백질 상호작용 (즉 항체-항원 상호작용) 중 하나를 활용한다. 예를 들어, 일부 경우에 선택은 성장 지지 환경을 제공하고 배양 조건 또는 자성(magnetic) 또는 비-자성 고체 또는 반고체상 기질에 대한 반영구적 또는 영구적 결합과 관련된 보다 복잡한 세포 마커 상호작용을 제어함으로써 수행될 수 있다.
풍부화, 분리, 또는 선택을 위해, 임의의 분류 기술, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 항체-의존적 분리 기법이 사용될 수 있다. 기술분야에 알려져 있는 임의의 리간드-의존적 분리 기법이 세포의 물리적 특성에 의존하는 양성 및 음성 분리 기법 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 특히 강력한 분류 기술은 자기 세포 분류이다. 세포를 자기적으로 분리하는 방법은 상업적으로, 예컨대 Thermo Fisher, Miltenyi Biotech, Stemcell Technologies, Cellpro Seattle, Advanced Magnetics, Boston Scientific, 또는 Quad Technologies로부터 이용 가능하다. 예를 들어, 단클론성 항체는 Dynal M 450과 같은 자성 폴리스티렌 입자 또는 유사한 자성 입자에 직접 결합되고, 예를 들어 세포 분리를 위해 사용될 수 있다. 다이나비드 기술(Dynabeads technology)은 칼럼을 기반으로 하지 않고, 대신 세포가 부착되는 이들 자기 비드는 샘플 튜브에서 액상 동역학을 가지며, 세포는 자기 랙(rack) 상에 튜브를 놓음으로써 분리된다.
샘플로부터 세포를 풍부하게 하고, 분류하고 및/또는 검출하는 것은 예를 들어 다당류 (예컨대 자기-활성화 세포 분류 (MACS) 기술 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany))의 유기 코팅을 가지는 콜로이드상 초상자성 미세입자와 함께 단클론성 항체를 사용하는 것을 포함한다. 입자 (예컨대, 나노비드 또는 마이크로비드)는 단클론성 항체에 직접 콘쥬게이션되거나 또는 항-면역글로불린, 아비딘, 또는 항합텐-특이적 마이크로비드와 함께 사용되거나, 또는 선택적 결합 특성을 가지는 다른 포유류 분자로 코팅될 수 있다.
위에서 기술된 것과 같은 자기 입자 선택 기술은 세포가 특정 표면 마커에 대해 지시된 항체 또는 다른 모이어티로 코팅된 자기 나노입자와 함께 인큐베이션됨으로써 양성으로 또는 음성으로 분리되는 것을 가능하게 한다. 이것은 이 마커를 발현하는 세포가 자기 나노입자에 부착되도록 한다. 그 후에 세포 용액은 강력한 자기장에서 고체 또는 유연한 용기 내에 배치된다. 이 단계에서, 세포 (마커를 발현함)는 나노입자에 부착되고 칼럼 상에 머물지만, 다른 세포 (마커를 발현하지 않음)는 칼럼을 통과한다. 이 방법으로, 세포는 특정 마커(들)와 관련하여 양성으로 또는 음성으로 분리될 수 있다.
양성 선택의 경우에, 자기 칼럼에 부착되는, 관심 있는 마커(들)를 발현하는 세포는 자기장으로부터 칼럼이 제거된 후 별도의 용기로 세척된다.
음성 선택의 경우 사용된 항체 또는 선택 모이어티는 관심이 없는 세포 상에 존재하는 것으로 알려져 있는 표면 마커(들)에 대해 지시된다. 세포/자기 나노입자 용액의 칼럼 상으로의 적용 후 이들 항원을 발현하는 세포는 칼럼에 결합되며, 관심 있는 세포를 함유하는 것이기 때문에, 통과하는 분획이 수집된다. 이들 세포는 나노입자에 결합된 선택적 항체 또는 모이어티(들)에 의해 표지화되지 않기 때문에 그것들은 "접촉되지 않는다". 알려진 매뉴얼 또는 반자동 고체 조직 프로세싱 단계는 노동 집약적이고 기술분야의 지식을 필요로 한다.
더불어, 물질이 치료 목적으로 사용되는 경우, 프로세싱은 세포 배양의 취급, 예를 들어 분해의 일부로서 또는 분해 전의 조직 프로세싱, 효소 소화 및 보관 장치로의 전달, 또는 분해/세포화 및 가변적인 조직 수율에 대한 인큐베이션 조건 중에 엄격하게 규제된 환경 조건을 필요로 한다. 전형적으로, 이 과정은 동일한 활동을 안전하게 수행하고 또한 오염(들)의 위험을 최소화하기 위하여 다수의 실험실 및 조직 프로세싱 장비, 및 위험 격리 또는 조직 프로세싱 설비(들) 무균 환경(들) 내에 함유된 중요한 단계의 과학적 기술에 대한 숙련도 및 지식을 가진 인력을 필요로 한다.
조직으로부터의 원하는 생성물의 생존 능력 및 회수는 조직 수집, 분해, 및 세포의 수득 중의 조건에 의해 영향을 받을 수 있다.
발명은 위에서 기술된 충족되지 않은 필요를 달성하는 상기 프로세싱을 수행하는 기구/장치를 포함하여, 개선된 조직 프로세싱을 제공할 필요성으로부터 발생한다.
본 출원에서 임의의 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서가 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것은 아니다.
본 발명은:
(a) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계;
(b) 절제된 종양을 일회용 무균 키트에 보관하는 단계, 여기서 무균 키트는:
고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈;
분해된(disaggregated) 고형 조직 물질(solid tissue material)의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및
분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고,
각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및
각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트(port)를 포함하는 것인 단계;
(c) 절제된 종양을 분해 모듈에서 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계;
(d) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
(e) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여 UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계;
(f) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계
를 포함할 수 있는 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 분리하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 단계 a)는 선택적이다.
본 발명은:
(a) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계;
(b) 절제된 종양을 일회용 무균 키트에 보관하는 단계, 여기서 무균 키트는:
고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈;
분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및
분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고,
각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및
각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계;
(c) 절제된 종양을 분해 모듈에서 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계, 여기서 절제된 종양은 세포 손상을 최소화하면서 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해되는 것인 단계;
(d) 분해된 종양을 안정화 모듈에서 냉동보존하는 단계;
(e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
(f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여 UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계;
(g) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계
를 포함할 수 있는 냉동보존된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 분리하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 단계 a)는 선택적이다.
분해는 물리적 분해, 효소적 분해, 또는 물리적 및 효소적 분해를 포함할 수 있다. 유리한 구체예에서, 분해된 종양은 세포화되거나 정제된다.
본 발명에서, 상호연결되고 특정 별도 기능을 갖는 용기 세트가 무균적으로 폐쇄된 시스템을 유지하여 프로세싱하고, 분해된 및 세포화된 종양을 선택적으로 풍부화하지만 안정화시킨다. 본질적으로 발명은 절제된 종양의 프로세싱 중에 필요한 시간 및 오염 또는 작업자 노출을 최소화하기 위하여 급속한 사전 멸균 환경을 제공한다.
무균 키트는 폐쇄된 고형 조직 프로세싱을 가능하게 하여, 특히 과정이 조직 회수/조달(procurement) 부위 내에서 수행되고 그것의 궁극적인 유용을 위해 최종 세포 프로세싱 전에 보관을 필요로 할 때 표준 비-폐쇄 조직 프로세싱와 비교하여 최종 세포화된 생성물의 오염 위험을 제거한다. 더불어, 작업자의 안전성은 바이러스와 같은 감염성 유기체를 함유할 수 있는 생물학적 위험 물질과 직접적인 접촉의 감소로 인해 증가된다. 키트는 또한 최종적으로 프로세싱된 세포화된 물질의 전부 또는 일부가 그것의 궁극적인 유용을 위해 프로세싱되기 전에 수송 또는 보관을 위해 안정화되는 것을 가능하게 한다.
발명은 절제된 종양이 절제시에, 또는 필요하다면 나중에, 세포화된 종양의 회수 절차 또는 생존 능력에 영향을 미치지 않으면서 프로세싱되는 것을 가능하게 할 것이다.
일부 구체예에서, 더 이상 필요하지 않은 시약; 세포 파편; 비-분해 종양 조직 및 지방과 같은 불순물을 감소시키기 위한 물리적 정제 형태를 통한 선택적 풍부화가 사용될 수 있다. 무균 키트는 이 목적을 위해 안정화 전에 선택적 풍부화 모듈을 가질 수 있다. 단일 세포 또는 작은 세포 수의 응집체는 5 μm 미만의 입자 및 유체 또는 약 200 μm 또는 그 이상의 불완전하게 분해된 물질을 배제시킴으로써 분해 후에 안정화를 위해 풍부화될 수 있지만 이것은 조직 및 분해 효능에 따라 달라질 것이며 조직 특이적 키트의 다양한 형태의 구체예가 조직 또는 분해된 종양의 궁극적인 유용성에 따라 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 단일 세포 현탁액이 단계 (c) 후에 제공된다.
또 다른 구체예에서, UTIL의 제1 집단은 약 1-2천만개의 UTIL을 필요로 한다.
또 다른 구체예에서, 단계 (e)는 절제된 종양 출발 물질 중에서 UTIL의 성장과 이어서 단계 (f)의 급속한 팽창을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 단계 (e)는 약 2주 동안 수행될 수 있고 단계 (f)는 약 2주 동안 수행될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 추가 단계 (h)는 UTIL의 제2 집단을 현탁시키는 것을 포함한다. 현탁은 완충 식염수, 인간 혈청 알부민, 및/또는 다이메틸설폭사이드 (DMSO)에서 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 의해 얻어진 냉동보존된 UTIL의 치료 집단을 포함할 수 있다. 치료 집단은 약 5x109 내지 5x1010 개의 T 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 개시된 치료 집단의 냉동보존된 백을 포함한다. 냉동보존된 백은 정맥내 주입에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 치료 집단 또는 본원에 개시된 냉동보존된 백을 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 치료 집단, 제약학적 조성물 또는 냉동보존된 백을 포함한다. 암은 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 자궁경부암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)을 포함함), 폐암, 흑색종, 난소암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신장암, 또는 신장 세포 암종일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 하나 이상의 유연한 용기는 탄력 있는 변형 물질을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 하나 이상의 밀봉 가능한 개구부를 포함한다. 분해 모듈 및/또는 안정화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 또한 열 밀봉 가능한 용접을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 하나 이상의 유연한 용기는 내부적으로 둥근 가장자리를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 그 안의 고체 종양을 기계적으로 부수고 전단하기 위해 적응된 분해 표면을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 풍부화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 세포화된 분해된 고체 종양의 잔류물(retentate)을 보유하는 필터를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 안정화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 생존 가능한 세포를 용액으로 또는 냉동보존된 상태로 보관하기 위한 배지 제형을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트는 디지털, 전자식, 또는 전자기식 태그 식별자를 추가로 포함한다. 태그 식별자는 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화 과정의 유형, 속도 제어 동결(controlled rate freezing)에 적합한 선택적 동결 용액을 포함한, 상기 과정에 사용된 배지의 하나 이상의 유형을 규정하는 특정 프로그램에 관련된 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 동일한 유연한 용기는 분해 모듈, 안정화 모듈, 및 선택적 풍부화 모듈 중 하나 이상의 부분을 형성할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 분해 모듈은 프로세싱될 조직을 수령하기 위한 제1 유연한 용기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 분해 모듈은 분해용 배지를 포함하는 제2 유연한 용기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 선택적 풍부화 모듈은 풍부해진 여과물을 수령하기 위한 제1 유연한 용기 및 제3 유연한 용기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 분해 모듈 및 안정화 모듈은 둘 다 제2 유연한 용기를 포함하고 제2 유연한 용기는 소화 배지 및 안정화 배지를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 안정화 모듈은 안정화 배지를 포함하는 제4 유연한 용기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 무균 키트의 안정화 모듈은 또한 보관 및/또는 냉동보존을 수행하기 위한 제1 유연한 용기 및/또는 제3 유연한 용기를 포함한다.
본 발명은 또한:
(a) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계;
(b) 절제된 종양을 일회용 무균 키트에 보관하는 단계, 여기서 무균 키트는:
고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈;
분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및
분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고,
여기서 각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및
각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계;
(c) 절제된 종양을 분해 모듈에서 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계, 여기서 절제된 종양은 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해되는 것인 단계;
(d) 분해된 종양을 안정화 모듈에서 냉동보존하는 단계;
(e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
(f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여 UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계;
(g) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계
를 포함하는, 냉동보존된 UTIL의 치료 집단을 분리하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 단계 a)는 선택적이다.
또 다른 구체예에서, 자동화 장치는 예컨대 본 발명의 구체예의 자동화 장치 내에서, 자동화 프로세싱 중에 무균 키트가 스캐닝되고 인식될 수 있도록 무균 키트의 인식을 위한 무선 주파수 식별 태그 판독기를 추가로 포함한다. 결정적으로 태그는 자동 프로세싱되기 위해 필요한 조건 및 단계에 대한 정보를 제공하여서, 간단하게 키트를 스캐닝함으로써, 조직을 프로세싱하기 위해 키트와 함께 사용된 임의의 자동화 시스템은 추가의 개입 또는 오염 없이 실행될 수 있다. 조직 샘플이 분해 모듈에 놓이게 되면, 그것은 예를 들어 프로세싱이 시작되기 전에, 수동으로 또는 자동으로 밀봉될 수 있다.
자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 또한 태그를 통해 무균 키트를 인식할 수 있고 후속해서 분해, 풍부화, 및 안정화 과정의 유형, 및 속도 제어 동결에 적합한 선택적 동결 용액을 포함한, 상기 과정들에 필요한 각각의 배지 유형을 규정하는 키트 프로그램을 실행할 수 있다.
자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈, 풍부화 모듈, 및/또는 안정화 모듈과 연통하고 그것을 제어하기 위해 적응될 수 있다. 다른 말로 하면, 키트는 그러므로 종양을 프로세싱하기 위한 특정한 완전 자동 방법을 실행하기 위해 사용된 자동화 장치에 의해 그러한 장치에 삽입될 때 판독될 수 있다.
자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈을 제어하여 고형 조직 물질의 물리적 및/또는 생물학적 붕괴(breakdown)를 가능하게 할 수 있다. 이런 붕괴는 고형 조직 물질의 물리적 또는 효소적 붕괴일 수 있다. 고형 조직 물질의 효소적 붕괴는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 및 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 효소 용액에 의해 이루어질 수 있다.
또 다른 구체예에서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하는 분해 유연한 용기 내에서 분해 표면을 제어한다. 일부 구체예에서, 분해 표면은 기계식 피스톤에 의해 제어된다.
또 다른 구체예에서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기에 풍부해진 분해된 고형 조직을 냉동보존하도록 안정화 모듈을 제어한다. 이것은 장치에 삽입된 키트의 태그를 판독함으로써 결정되는 조건인 프로그래밍 가능한 온도 설정을 사용하여 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 과정의 상이한 기능을 수행하기 위하여, 장치 및/또는 키트의 추가 구성요소 중 하나 이상이 제공되며 임의의 조합으로 활용될 수 있다. 이것으로는: 분해된 고형 조직이 선택적 풍부화 모듈로 옮겨지기 전에 분해 과정이 분해 모듈에서 완료되었는지의 여부를 인식할 수 있는 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 결정하고 각각의 용기간 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기 내의 온도를 제어하기 위한 센서; 모듈의 각 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서; 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프; 풍부화 모듈 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서; 풍부화 모듈 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는 각 모듈의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프를 들 수 있다.
또 다른 구체예에서, 자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기가 제거될 때까지 안정화 모듈에서 최적의 보관 온도 범위를 유지하기 위해 적응되거나; 또는 제어된 동결 단계를 실행한다. 이것은 UTIL이 안정화 모듈과 함께 사용된 유형 또는 안정화 과정에 따라 궁극적인 유용 전에 단기간(수분 내지 수일) 동안 보관되거나 장기간(수일 내지 수년) 동안 보관되는 것을 허용한다.
또 다른 구체예에서, 자동화 장치는 사용자 인터페이스를 추가로 포함한다. 인터페이스는 사용자가 파라미터를 입력하거나, 사전 프로그래밍된 단계를 확인하거나, 오류를 경고하거나, 또는 이것들의 조합을 안내하는 지침을 표시하기 위한 디스플레이 스크린을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 자동화 장치는 운반 가능하도록 적응되며 따라서 바퀴, 타이어, 및/또는 핸들과 같은 용이한 기동성을 허용하거나 및/또는 이동을 보조하는 치수를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 냉동보존된 UTIL의 치료 집단을 분리하기 위한 반자동 무균 조직 프로세싱 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 무균성 프로세싱 키트와 관련된 디지털, 전자식, 또는 전자기식 태그 식별자로부터 무균성 분해 조직 프로세싱 단계 및 그것과 관련된 조건을 자동으로 결정하는 단계, 여기서 무균 키트는:
고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈;
분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및
분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고,
여기서 각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및
각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계;
(b) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계;
(c) 종양을 무균 키트의 분해 모듈의 유연한 플라스틱 용기에 넣는 단계;
(d) 절제된 종양이 무균적으로 분해되고 그로써 분해된 종양이 생성되는 곳이며, 절제된 종양은 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해되는 것인 분해 모듈;
분해된 종양이 여과되어 분해된 고형 조직 물질이 제거되고 비-분해된 조직 및 여과물이 분리되는 것인 선택적 풍부화 모듈;
분해된 종양이 냉동보존되는 안정화 모듈
과 연통하고 그것들을 제어함으로써 하나 이상의 조직 프로세싱 단계를 자동으로 실행함으로써 종양을 프로세싱하는 단계;
(e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
(f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여, UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계;
(g) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 b)는 선택적이다.
백과 같은 유연한 용기는 조직 물질을 프로세싱하기 위해 사용될 수 있다. 프로세싱은 조직을 분리 또는 붕괴할 수 있는 치료를 포함할 수 있고, 예를 들어, 물리적 붕괴는 교반, 예컨대, 부드러운 교반을 사용하여 이루어질 수 있고, 생물학적 및/또는 효소적 붕괴는 효소적 소화, 및/또는 백 안의 조직 물질의 구성요소의 추출을 포함할 수 있다.
조직을 프로세싱하기 위한 유연한 용기, 예컨대 백은 제작 중에 밀봉되는 유연한 용기의 적어도 3개의 가장자리 및 사용 중에 그곳을 통해 조직 물질이 삽입되는 유연한 용기 상의 개방 가장자리를 가진 밀봉 가능한 중합체로 만들어진 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 하나 이상의 연결부가 유연한 용기를 튜빙(tubing)을 통해 적어도 하나의 요소에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 조직이 유연한 용기에 넣어진 후, 개방 가장자리와 가장 가까운 유연한 용기의 섹션이 밀봉되거나 용접되어 밀봉(seal)을 형성할 수 있다. 밀봉은 적어도 3 mm의 폭을 가질 수 있고 실질적으로 개방 가장자리와 나란히 배치될 수 있으며 유연한 용기의 개방 가장자리로부터 떨어져 있을 수 있다. 일부 경우에, 밀봉은 약 5 mm보다 큰 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 조직이 백의 개방 가장자리에 가깝게 배치된 적어도 5 mm의 밀봉을 가지도록 내부에 배치된 후에 밀봉될 수 있다. 밀봉은 개방 가장자리와 평행할 수 있고 백의 개방 가장자리로부터 떨어져 있을 수 있다.
유연한 용기는 돌출부를 가진 클램프를 사용하여 추가로 고정될 수 있고 밀봉 가까이에 배치될 수 있으며 밀봉보다 유연한 용기의 개방 가장자리로부터 더 멀리 떨어져 있을 수 있다.
일부 경우에, 밀봉 및 유연한 용기는 유연한 용기가 사용 중에 유연한 용기에 적용된 100 N의 힘을 견딜 수 있도록 구성된다. 그러한 밀봉과 함께 클램프를 사용하면 사용된 물질의 유형 및/또는 밀봉의 구조에 따라 일부 경우에 유리할 수 있다. 그러므로, 유연한 용기, 예컨대 백의 사용 중에, 밀봉과 클램프의 조합은 유연한 용기에 적용된 100 N의 힘을 견딜 수 있다.
일부 경우에, 밀봉 및 유연한 용기는 유연한 용기가 사용 중에 유연한 용기에 적용된 75 N의 힘을 견딜 수 있도록 구성된다. 그러한 밀봉과 함께 클램프를 사용하면 사용된 물질의 유형 및/또는 밀봉의 구조에 따라 일부 경우에 유리할 수 있다. 그러므로, 유연한 용기, 예컨대 백의 사용 중에, 밀봉과 클램프의 조합은 유연한 용기에 적용된 75 N의 힘을 견딜 수 있다.
유연한 용기는 조직 물질의 분해와 같은 프로세싱 중에 조직을 유지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 유연한 용기, 예컨대 백은 조직 물질의 분해, 분해된 조직 물질의 여과, 및/또는 비-분해된 조직 및 여과물의 분리를 위해 사용될 수 있다.
백과 같은 유연한 용기는 탄력 있는 변형 물질로부터 형성될 수 있다. 유연한 용기, 예컨대 백에 사용하기 위한 물질은 한정하는 것은 아니지만 열 용접으로 인한 밀봉성(sealability)과 같은 밀봉성, 또는 무선 주파수 에너지, 가스 투과성, 유연성, 예를 들어 저온 유연성 (예컨대, -150℃, 또는 -195℃에서), 탄력성, 예를 들어 저온 탄력성, 내화학성, 광학적 선명도, 세포독성과 같은 생체적합성, 용혈 활성, 침출 저항성, 적은 미립자를 가짐, 특정 가스 (예컨대 산소 및/또는 이산화탄소)에 대한 높은 전송 속도, 및/또는 규제 요구사항의 준수를 포함하는 하나 이상의 특성에 대해 선택될 수 있다.
유연한 용기, 예컨대 백은 지표를 포함할 수 있다. 지표는 샘플, 샘플이 유래된 환자를 확인하기 위해 사용될 수 있거나, 및/또는 치료 과정을 통해 특정 샘플의 진행을 추적하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 지표는 샘플의 진행을 추적하기 위해 자동 또는 반자동 시스템에 의해 스캐닝될 수 있다.
마크는 유연한 용기, 예컨대 백 상에서, 백이 배치되고, 처리되고, 밀봉되어야 하는 장소, 또는 조직을 포함하는 백과 관련하여 취해질 수 있는 임의의 다른 작용을 표시하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 백은 밀봉을 위한 다중 마크를 포함할 수 있다.
백의 개방 단부는 조직이 백에 삽입된 후에 밀봉될 수 있다. 임의의 밀봉이 밀봉 장치 (예컨대, 히터 실러)를 사용하여 형성될 수 있다.
일부 경우에, 유연한 용기, 예컨대 백은 또한 분해 장치를 포함할 수 있는 분해 요소의 일부로서 사용하기 위한 분해 용기로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 배지 및/또는 효소는 장치의 분해 요소 내에서 백에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백은 유연한 용기에 배치된 조직 물질을 기계적으로 부수는 장치와 함께 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 백과 같은 유연한 용기 중의 조직은 분해 중에 전단될 수 있다. 특히, 유연한 용기는 조직 물질을 전단하기 위해 구성될 수 있다.
유연한 용기는 포유류 세포 또는 세포 응집체의 무균성 분해, 안정화 및/또는 선택적인 풍부화를 위한 반자동화 또는 자동화 과정에서 사용될 수 있다.
조직으로부터 원하는 물질의 추출을 위한 키트는 적어도 일부 조직이 처리되어 프로세싱된 유체를 형성하는 분해 요소, 원하는 물질을 형성하기 위하여 프로세싱된 유체의 적어도 일부를 풍부화할 수 있는 풍부화 요소 (예컨대, 필터), 원하는 물질의 일부를 보관할 수 있는 안정화 요소, 및 과정과 관련하여 조직의 표면, 조직의 상태 중 적어도 하나를 제공할 수 있는, 분해 요소, 풍부화 요소, 또는 안정화 요소 중 적어도 하나에 배치된 지표 태그, 또는 식별자를 포함할 수 있다.
원하는 물질은 특정 크기의 생물학적 물질 또는 구성요소일 수 있다. 예를 들어, 원하는 물질은 종양 침윤 림프구 (TIL)일 수 있다.
분해 요소 및 안정화 요소에 의해 수행된 다양한 과정에 상이한 유형의 배지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 배지가 키트에 제공되어 동결 속도를 제어하기 위하여 안정화 요소에서 사용될 수 있다.
분해 요소가 제1 유연한 용기를 포함할 수 있고 안정화 요소가 제2 유연한 용기를 포함할 수 있는 장치에 사용하기 위한 키트.
포유류 고형 조직으로부터 세포 또는 세포 응집체의 반자동 무균성 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화를 위한 자동화 장치는 프로그래밍 가능한 프로세서 및 본원에서 기술된 유연한 용기를 포함하는 키트를 포함할 수 있다. 자동화 장치는 추가로 지표 태그 판독기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 지표 태그 판독기는 임의의 요소 (예컨대, 키트에서 조직 물질의 분해, 풍부화, 또는 안정화)에 배치될 수 있다.
일부 경우에, 자동화 장치는 키트에서 유연한 용기의 샘플을 인식하기 위한 무선 주파수 식별 태그 판독기를 추가로 포함할 수 있다.
자동화 장치는 QR 코드와 같은 지표 태그를 통해 백과 같은 키트의 구성요소 상에 배치된 지표를 인식할 수 있는 프로그래밍 가능한 프로세서를 포함할 수 있다. 샘플이 백에 있는지를 측정한 후, 프로그래밍 가능한 프로세서는 후속해서 분해, 풍부화, 및 안정화 과정의 유형을 규정하는 프로그램을 실행하고 그 과정들에 필요한 각각의 배지 유형을 제공한다.
자동화 장치에서 사용하기 위한 키트로는 분해 유연한 용기 또는 백을 들 수 있다. 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 요소 및 분해 유연한 용기가 고형 조직의 물리적 및/또는 생물학적 붕괴를 가능하게 할 수 있도록 제어할 수 있다.
프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 표면이 분해 유연한 용기 가까이에 배치되어 분해 유연한 용기에서 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단할 수 있도록 자동화 장치의 요소들을 제어할 수 있고, 선택적으로 여기서 분해 표면은 기계식 피스톤이다.
시스템의 분해 요소는 분해 유연한 용기에서 조직이 고형 조직의 물리적 및 효소적 붕괴가 가능해지도록 프로세서에 의해 제어될 수 있다. 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 배지 효소 용액이 조직의 효소적 붕괴를 돕기 위해 분해 유연한 용기에 제공될 수 있다.
시스템은 분해 유연한 용기 및 안정화 유연한 용기 및 프로그래밍 가능한 프로세서를 포함하는 키트를 포함할 수 있다. 프로그래밍 가능한 프로세서는: 분해 요소; 풍부화 요소; 및 안정화 요소 중 하나 이상을 제어하기 위해 적응될 수 있다.
프로그래밍 가능한 프로세서는 안정화 용기에서 풍부해진 분해된 고형 조직을 냉동보존하기 위해 안정화 요소를 제어할 수 있다. 일부 구체예에서, 미리 정해진 온도가 프로그래밍될 수 있다.
자동화 장치는 다양한 조합으로 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 구성요소는 분해된 고형 조직의 선택적인 풍부화 요소로의 전달 전에 분해 과정이 분해 모듈에서 완료되었는지의 여부를 인식할 수 있는 센서; 분해 요소, 풍부화 요소, 및/또는 안정화 요소 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 측정하고 각각의 용기 사이에서 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서, 분해 요소; 풍부화 요소; 및/또는 안정화 요소 중 하나 이상의 용기 내에서 온도를 제어하는 센서; 요소의 각 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서; 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프; 풍부화 요소 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서; 풍부화 요소 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는 각 요소의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프를 포함할 수 있다.
자동화 장치는 용기가 제거될 때까지 안정화 모듈에서 최적의 보관 온도 범위를 유지하기 위해 적응된 프로그래밍 가능한 프로세서를 포함할 수 있다. 구체예에서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 제어된 동결 단계를 실행할 수 있다.
일부 경우에, 자동화 장치는 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 자동화 장치의 인터페이스는 사용자에게 파라미터를 입력하거나, 사전 프로그래밍된 단계를 확인하거나, 오류를 경고하거나, 또는 이것들의 조합을 안내하는 지침을 표시하는 디스플레이 스크린을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 자동화 장치는 운반 가능하게 적응될 수 있다.
자동적인 조직 프로세싱 방법은 키트의 구성요소와 관련된 디지털, 전자식 또는 전자기식 태그 지표로부터 프로세싱 단계에 대한 조건 및 관련된 조건을 자동적으로 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 사용 중에 조직 샘플은 적어도 하나의 개방 가장자리를 가지는 키트의 유연한 용기에 배치될 수 있다. 유연한 용기에 조직이 배치된 후, 개방 가장자리는 밀봉될 수 있다. 사용 중에 조직은 지표와 관련된 정보와 연통하여 유연한 용기 근처의 조건 및/또는 유연한 용기의 위치를 제어함으로써 하나 이상의 조직 프로세싱 단계에 의해 자동적으로 실행되어 프로세싱될 수 있다. 추가로, 물질의 키트에의 첨가는 지표와 관련된 정보를 토대로 제어될 수 있다. 프로세싱된 조직의 적어도 일부는 여과된 유체가 생성되도록 여과될 수 있다. 여과된 유체의 적어도 일부는 여과된 유체에 존재하는 원하는 물질을 안정화하기 위해 냉동보존 유연한 용기에 제공될 수 있다.
본원에서 기술된 프로세싱로는 유연한 용기의 조직 샘플의 적어도 일부의 교반, 추출, 및 효소적 소화를 들 수 있다. 일부 경우에, 조직의 이런 프로세싱은 조직 샘플로부터 원하는 물질의 추출을 초래할 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤 림프구 (TIL)는 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 유연한 용기, 예컨대 백은 열-밀봉 가능한 물질을 포함할 수 있다.
조직 프로세싱 및 냉동보존 키트를 사용하는 조직으로부터의 추출은 원하는 물질의 분리를 초래할 수 있다. 특히, 종양 침윤 림프구 (TIL)와 같은 물질이 원하는 물질일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 세포 또는 세포 응집체의 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위한 자동화된 및/또는 반자동화된 과정에서 일회용일 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 백과 같은 냉동보존 키트에서 사용하기 위한 백은 일부 구체예에서 다중 과정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 수집 백은 생검 샘플 및/또는 고형 조직과 같은 조직 샘플의 프로세싱을 위한 별도의 구획을 생성하기 위해 상이한 위치에서 반복적으로 밀봉될 수 있다.
본원에 기술된 발병에 사용하기 위한 유연한 용기, 예컨대 백은 수집 백을 포함할 수 있고 냉동보존 백은 열가소성, 폴리올레핀 중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 공중합체와 같은 혼합물, 예를 들어, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물 (즉, OriGen Biomedical EVO 필름), EVA를 포함하는 물질, 및/또는 밀봉 가능한 플라스틱의 공압출 층과 같은 미리 결정된 물질로부터 만들어진 적어도 일부를 포함할 수 있다. 발명의 수집 백, 예컨대 조직 수집 백으로 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 및/또는 EVA를 포함하는 물질과 같은 미리 결정된 물질로부터 만들어진 조직을 수용하기 위한 백을 들 수 있다. 백에 사용하기 위한 물질은 특정 특성에 대해 선택될 수 있다. 구체예에서, 수집 백을 포함한 백은 실질적으로 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 블렌드로부터 만들어질 수 있다. 예를 들어, 수집 백 및/ 또는 관련된 튜빙과 같은 냉동보존 키트 구성요소에 대한 물질을 선택하기 위해 사용될 수 있는 관심 있는 특성은 열 밀봉에 관한 것일 수 있다.
주머니에 사용하기 위한 물질은 특정 특성 및/또는 선택된 특성, 예를 들어, 열 밀봉성과 같은 밀봉성, 가스 투과성, 유연성 예를 들어 저온 유연성, 탄력성 예를 들어 저온 탄력성, 내화학성, 광학적 선명도, 세포독성과 같은 생체적합성, 용혈 활성, 침출 저항성, 적은 미립자를 가지는 특성에 대해 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 물질은 백의 적어도 하나의 층을 형성하기 위하여 공압출된 물질에 사용하기 위한 특정 특성에 대해 선택될 수 있다. 층은 구성되었을 때 백의 내부 층이 상대적으로 생체적합성이도록, 즉 백의 내면 상의 물질이 안정적이고 백의 내용물로 침출되지 않도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 수집 백, 냉동보존 백, 및/또는 관련된 튜빙과 같은 키트 구성요소에 대한 물질을 선택하기 위해 사용될 수 있는 관심 있는 특성은 밀봉, 예를 들어 열 밀봉에 관한 것일 수 있다.
백, 예컨대 수집 백 및/또는 냉동보존 백, 및 임의의 관련된 튜빙은 일반적으로 깨끗하거나, 투명하거나, 반투명하거나, 원하는 임의의 색이거나, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 조직 수집 백 및/또는 튜빙은 일반적으로 폐쇄된 및/또는 밀봉된 혈액 및/또는 냉동보존 백 및 관련된 튜빙의 제작과 유사한 방식으로 제작될 수 있다. 발명의 튜빙은 한정하는 것은 아니지만 염화 폴리비닐 (PVC)을 포함한, 임의의 원하는 물질로부터 구성될 수 있다. 예를 들어, PVC는 PVC가 용접 및/또는 밀봉에 유리하기 때문에 원하는 물질일 수 있다.
일부 구체예에서, 수집 백의 적어도 하나의 단부는 조직을 수용하기 위해 개방될 수 있다. 특히, 구체예에서, 예를 들어 생검으로부터의 조직 샘플은 개방 단부, 예를 들어, 상부 단부를 통해 백에 배치될 수 있다. 어떤 경우에, 생검 샘플은 동물 (예컨대, 개 또는 고양이와 같은 가축) 또는 인간으로부터 암성 조직일 수 있다.
조직이 백에 배치된 후, 백은 밀봉될 수 있고, 그런 다음 프로세싱될 수 있다. 프로세싱로는 백에서 조직의 교반, 예컨대 부드러운 교반, 추출, 및/또는 효소적 소화를 들 수 있다. 조직 프로세싱 및 원하는 물질, 예컨대 종양 침윤 림프구 (TIL)의 추출은 폐쇄된 시스템에서 이루어질 수 있다. 유리한 또는 바람직한 구체예로는 조직이 수집되는 환자를 확인하기 위한 지표 및/또는 수집 백이 고정되고, 밀봉되며, 장치에 의해 작용되고, 및/또는 기구에서 적소에 부착되는 곳이 어디인지를 보여주기 위한 마크를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 백은 밀봉 가능한 물질로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 백은 한정하는 것은 아니지만 지방족 또는 반-방향족 폴리아미드 (예컨대, 나일론), 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA) 및 그것들의 혼합물, 열가소성 폴리우레탄 (TPU), 폴리에틸렌 (PE), 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물을 포함한 합성 중합체, 및/또는 중합체들의 조합과 같은 중합체를 포함한 물질로부터 형성될 수 있다. 백의 일부는 열, 무선 주파수 에너지, 고주파 (HF) 에너지, 유전 에너지(dielectric　energy)와 같은 에너지, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 방법으로 밀봉 및/또는 용접될 수 있다.
수집 백은 프로세싱 및/또는 분해 백으로서 사용될 수 있다. 수집 백은 약 4 cm 내지 약 12 cm 범위의 폭 및 약 10 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세싱에 사용하기 위한 수집 백은 약 7.8 cm의 폭 및 약 20 cm의 길이를 가질 수 있다. 특히, 백은 예를 들어, EVA 중합체 또는 그것의 혼합물, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물, 및/또는 하나 이상의 폴리아미드 (나일론)를 사용하여 열 밀봉 가능할 수 있다.
지표로는, 한정하는 것은 아니지만 코드, 문자, 단어, 명칭, 영숫자 코드, 숫자, 이미지, 바코드, 빠른 응답 (QR) 코드, 태그, 스마트 트래커 태그 또는 블루투스 트래커와 같은 트래커, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 지표를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 지표는 키트 구성요소의 표면 상에 인쇄되거나, 식각되거나, 및/또는 부착될 수 있다. 지표는 또한 부착제를 사용하여 백 상에 위치할 수 있는데, 예를 들어 스티커 또는 트래커가 백 상에 및/또는 다중 백 상에 배치될 수 있다. 수집 백 및/또는 냉동보존 키트는 숫자 코드 및/또는 QR 코드와 같은 다중 지표를 포함할 수 있다.
지표, 예를 들어 QR 코드, 스마트 태그와 같은 태그, 및/또는 트래커는 장치가 냉동보존 키트에서 수행되는 분해, 풍부화, 및/또는 안정화 과정의 유형에 다라 특정 프로그램을 작동하도록 장치의 프로세서를 지시하기 위해서뿐만 아니라 백 내의 샘플을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 동결의 속도 제어를 허용할 수 있는 상이한 유형의 배지, 예를 들어, 효소 배지, 종양 소화 배지 및/또는 냉동보존 배지가 이들 과정에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 자동화 장치에 의해 판독 가능할 수 있는 지표를 포함할 수 있다. 장치는 그런 후 그러한 장치에 삽입될 때 조직을 프로세싱하기 위한 특정한 완전 자동 방법을 실행할 수 있다. 발명은 특히 샘플 프로세싱, 특별히 자동화된 프로세싱에 유용하다. 일부 경우에, 본원에 기술된 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 세포 또는 세포 응집체의 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위한 자동화된 및/또는 반자동화된 과정에서 일회용일 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 백과 같은 냉동보존 키트에서 사용하기 위한 백은 일부 구체예에서는 다중 과정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 수집 백은 생검 샘플 및/또는 고형 조직과 같은 조직 샘플의 프로세싱을 위한 별도의 구획을 생성하기 위해 상이한 위치에서 반복적으로 밀봉될 수 있다.
추가로, 마크가 백이 밀봉되거나, 고정되거나, 및/또는 대상물에 부착되는 곳이 어디인지를 표시하기 위하여 백, 예컨대 조직 수집 백 상의 다양한 위치에 배치될 수 있다. 일부 구체예에서, 백이 밀봉되거나, 고정되거나, 및/또는 대상물, 예컨대 기구에 부착되는 곳이 어디인지를 보여주는 마크는 사용 전에 백 상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 마크는 제조 중에 백 상에 위치할 수 있다.
백의 조직 물질이 사용 중에 적절하게 처리될 수 있는 것을 보장하기 위해 포지셔너(positioner)가, 예를 들어, 기구 가까이에 위치하여 사용될 수 있다. 일부 시스템에서, 포지셔너는 자동화 시스템에서 본원에 기술된 백의 사용을 용이하게 할 수 있다. 특히, 포지셔너는 자동화된 시스템을 통해 백을 이동시키기 위해 사용될 수 있다.
지표, 예컨대 QR 코드의 사용은 주어진 과정을 통해 샘플을 따르는 것이 가능하도록 특정 샘플에 대한 과정 단계의 추적을 허용할 수 있다.
발명은 다음의 숫자가 매겨진 단락에서 논의되는 것과 같이 치료 세포 집단을 포함하며 제공한다:
따라서, 발명의 목적은 출원인이 권리를 유보하고 이로써 임의의 이전에 공지된 생성물, 과정, 또는 방법의 면책조항을 개시하도록 발명 내에 어떠한 이전에 공지된 생성물, 생성물의 제조 과정, 또는 생성물의 사용 방법을 포함하지 않는 것이다. 추가로 발명은 USPTO(35 U.S.C. §112, 1항) 또는 EPO(EPC 83조)의 서면 설명 및 실행 요건을 충족하지 않는 임의의 생성물, 과정, 또는 생성물의 제조 또는 생성물의 사용 방법을 발명의 범주 내에 포함하는 것을 의도하지 않아서, 출원인이 권리를 유보하고 이로써 임의의 이전에 기술된 생성물, 생성물의 제조 과정, 또는 생성물의 사용 방법의 면책조항을 개시하게 되는 것이 주지된다. 발명의 실시에서 53조(C) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 따르는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3 당사자의 선행 출원에서 출원인의 임의의 부여된 특허(들)의 대상인 임의의 구체예를 명시적으로 부인할 수 있는 모든 권리는 명시적으로 유보된다. 본원의 어떠한 것도 약속으로 해석되지 않을 것이다.
본 개시에서 및 특별히 청구범위 및/또는 단락에서 "포함하다", "포함된다", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 그 용어에 부여된 의미를 가질 수 있고; 예컨대, 그것들은 "포함하다", "포함된다", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"는 것과 같은 용어는 미국 특허법에서 그 용어에 부여된 의미를 가지며, 예컨대, 그것들은 분명하게 인용되지 않은 요소는 허용하지만, 선행 기술에서 발견되는 요소 또는 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 주는 요소는 배제한다.
이들 및 다른 구체예는 다음의 상세한 설명으로부터 개시되거나 명백하고 그 설명에 의해 포함된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불시에 사무국에 의해 제공될 것이다.
실시예에 의해 제공되며, 발명을 기술된 특정 구체예에만 제한하려고 의도하지 않은 다음의 상세한 설명은 첨부되는 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 고형 조직 물질의 분해 및 소화를 위한 유연한 용기의 개략도이다.
도 2a는 소화된 고형 조직 물질을 후속 모듈 또는 폐기물 용기로 지시하는 일련의 필터 모듈의 개략도이다.
도 2b는 소화 및 폐기 물질의 제거 후에 세포의 풍부화를 위한 유연한 용기의 개략도이다.
도 2c는 소화 및 폐기 물질의 제거 후에 세포의 풍부화를 위한 유연한 용기의 또 다른 구체예의 개략도이다.
도 3a는 고형 조직 물질의 분해 및/또는 세포의 풍부화 후에 세포의 안정화를 위한 유연한 용기의 개략도이다.
도 3b는 고형 조직 물질의 분해 및/또는 세포의 풍부화 후에 냉동보존을 통해 세포의 안정화를 위한 추가의 유연한 용기를 함유하는 유연한 용기의 또 다른 구체예의 개략도이다.
도 4는 무균 키트의 개략도이다.
도 5는 수초 내지 수시간의 범위인 다양한 분해 시간에 대해 분해 과정으로부터 얻어진 세포 집단에서 관찰된 배수 변화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 분해 및 안정화를 위해 사용된 과정의 모듈의 부분인 상이한 출발 용액을 위한 다중 유연한 용기를 사용하는 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법을 설명하는 도면이다.
도 7은 과정에 사용된 배지를 포함하는 유연한 용기가 무균성 프로세싱 키트의 모듈과 방법 사이에서 공유될 수 있는 방법을 설명하는 도면이다.
도 8은 TIL의 생성 방법의 일반적인 개요를 도시한다.
도 9는 종양 출발 물질의 수집 및 프로세싱의 개요를 도시한다.
도 10은 TIL 제조 과정의 개요를 도시한다.
도 11A는 조직 물질의 프로세싱 및 보관을 위한 키트의 구체예의 도면을 도시한다.
도 11B는 조직 물질의 프로세싱 및 보관을 위한 키트의 구체예의 도면을 도시한다.
도 11C는 조직 물질의 프로세싱 및 보관을 위한 키트의 구체예의 도면을 도시한다.
도 11D는 조직 물질의 프로세싱 및 보관을 위한 키트의 구체예의 도면을 도시한다.
도 12A는 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다.
도 12B는 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다.
도 12C는 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다.
도 12D는 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다.
도 12E는 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다.
도 13A는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 13B는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 13C는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 13D는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 13E는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 14는 수집 백의 구체예의 후면도를 도시한다.
도 15는 수집 백의 구체예의 측면도를 도시한다.
도 16A는 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 16B는 수집 백의 구체예의 저면도를 도시한다.
도 17A는 백이 밀봉된 가장자리를 갖는 경우의 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 부분적으로 개방된 조직 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 17B는 백이 밀봉된 가장자리를 갖는 경우의 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 개방된 조직 수집 백의 구체예의 저면도를 도시한다.
도 18A는 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 부분적으로 개방된 조직 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 18B는 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 완전히 개방된 조직 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 19A는 백이 미리 결정된 폭을 가진 밀봉된 가장자리를 갖는 경우의 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 부분적으로 개방된 조직 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 19B는 백이 미리 결정된 폭을 가진 밀봉된 가장자리를 갖는 경우의 발명의 프로세싱을 위해 그 안의 조직을 밀봉하기 위한 완전히 개방된 조직 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 20A는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 20B는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 20C는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 20D는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 20E는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 21A는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 21B는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 21C는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 21D는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 21E는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 22A는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 22B는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 22C는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 22D는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 23은수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 24는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 25는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 26은 튜빙 및 포트에 결합된 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 27A는 사용전 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 27B는 예를 들어, 백 내에 물질이 침착된 후, 밀봉된 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 28은 개방된 수집 백 및 냉동보존 백을 포함하는 위를 향한 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 29는 폐쇄되어야 하는 곳을 나타내는 수집 백 및 냉동보존 백을 포함하는 아래를 향한 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 30은 폐쇄된 수집 백 및 냉동보존 백을 포함하는 위를 향한 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 31은 폐쇄된 수집 백 및 냉동보존 백을 포함하는 아래를 향한 냉동보존 키트의 구체예의 측면도를 도시한다.
도 32는 냉동보존 키트의 구체예의 단면도를 도시한다.
도 33은 튜빙에 결합된 징후를 포함하는 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다.
도 34는 수집 백, 필터, 및 냉동보존 백을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 35는 수집 백, 필터, 및 냉동보존 백을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 36A는 수집 백, 필터, 및 냉동보존 백을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 36B는 사용 중에 수집 백의 표면 가까이에 위치한 막대뿐만 아니라 클램프, 힌지, 및 래치를 사용하여 고정된 수집 백의 구체예의 측면도를 도시한다.
도 36C는 수집 백 상에 위치한 클램프의 분해도를 도시한다.
도 37은 수집 백, 필터, 및 냉동보존 백을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 38은 수집 백, 필터, 및 냉동보존 백을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 39는 클램프에 의해 고정된 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 40은 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다.
도 41은 폐쇄된 샘플 용기 내의 개별 세포 또는 세포 클럼프로 조직의 분해를 위한 트레딩 장치(treading device)의 전면도를 도시한다.
도 42 및 도 43은 2개의 상이한 각각의 작동 위치에서 도 41의 장치를 도시하며; 도 44는 이전 도면에서 도시된 장치의 평면도를 도시한다.
도 45는 장치의 대체 구성의 또 다른 평면도를 도시한다.
도 46, 47 및 48은 도 41 내지 45의 장치와 함께 사용하기에 적합한 샘플 용기의 3개의 상이한 구성을 도시한다.
도 49는 사용을 위해 제조되는 샘플 백을 도시한다.
도 51a, 51b, 및 51c는 샘플 백을 밀봉하는 대체 방법을 도시한다.
도 52, 53 및 54는 사용을 위해 백을 제조하는 장치 및 기법을 도시한다.
도 55는 샘플 백 또는 용기를 트레딩 장치에 로딩하는 것을 도시한다.
도 56, 57 및 58은 분해된 샘플을 나누기 위한 장치를 도시한다.
도 59, 60 및 61은 샘플 또는 나누어진 샘플의 온도를 제어하기 위한 장치를 도시한다.
도 62 내지 64는 트레딩 장치의 추가의 구체예를 도시한다.
도 65는 종양 조직의 수집, 프로세싱 및 냉동보존을 위한 예시의 흐름 다이아그램이다.
도 66은 프로세싱되고 냉동보존된 종양 조직으로부터 TIL 제조를 위한 예시의 흐름 다이아그램이다.
도 67은 냉동보존되고 새롭게 분해된 세포 현탁액의 수율 (도 67A), 퍼센트 생존 능력 (도 67B), 및 퍼센트 CD3+ T 세포 (도 67C)를 비교하여 도시한다.
도 68A 및 68B는 상업적으로 이용 가능한 냉동보존제를 사용하여 냉동보존된 PBMC의 생존 능력을 비교하여 도시한다.
도 69는 소화된 후 4℃에서 10분 동안 물질을 보유한 후, 온도를 -1℃/분의 속도로 감소시키거나 또는 35℃로부터 -80℃로 직접적으로 -2℃/분의 속도로 감소시키는 프로토콜을 따라 냉동보존된 PBMC의 생존성을 비교하여 도시한다.
도 70은 4℃에서 10분 동안 물질을 보유한 후, 온도를 -1℃/분의 속도로 감소시키거나 또는 35℃로부터 -80℃로 직접적으로 -2℃/분의 속도로 감소시키는 프로토콜 후에 샘플 백으로부터 기록된 온도를 비교하여 도시한다.
도 71은 TIL077의 분해 및 냉동보존을 도시한다: (A) 분해기 속도 설정값; (B) 분해기 속도 기록; (C) 온도 설정값 (분해); (D) 냉동판 온도 기록 (분해); (E) 온도 설정값 (냉동보존); (F) 온도 기록 (냉동보존); (G) 설정값 냉각 속도; (H) 냉동판 냉각 속도 기록.
도 72는 TIL078의 Tiss-U-Stor 분해 및 냉동보존을 도시한다 (2개 백 중 하나): (A) 분해기 속도 설정값; (B) 분해기 속도 기록; (C) 온도 설정값 (분해); (D) 냉동판 온도 기록 (분해); (E) 온도 설정값 (냉동보존); (F) 온도 기록 (냉동보존); (G) 설정값 냉각 속도; (H) 냉동판 냉각 속도 기록.
도 73은 연속 과정에서 TIL078의 Tiss-U-Stor 분해 및 냉동보존을 도시한다: (A) 분해기 속도 설정값; (B) 분해기 속도 기록; (C) 온도 설정값 (분해 및 냉동보존); (D) 냉동판 온도 기록 (분해 및 냉동보존); (E) 냉각 속도 설정값 (분해 및 (냉동보존); (F) 냉동판 냉각 속도 기록 (분해 및 (냉동보존).
도 74는 종양 부담의 최상 전체 반응 및 퍼센트 변화를 보여주는 폭포 플롯을 도시한다. CR, 완전한 반응; PD, 진행성 질환; PR, 부분 반응; SD, 안정적인 질환. 종양 부담은 표적 병변의 직경의 합으로서 정의한다; 종양 부담의 변화는 기준선으로부터 기준선 이후 최하점까지의 변화로서 정의된다. 0의 최소 기준선 이후 SLD를 두 명의 CR 환자에서 사용하였는데, 그들은 CR이 평가되었을 때 방문시 기록된 표적 병변 척도를 갖지 않았다 (CT/MRI 스캔을 통해 질환 또는 전이가 관찰되지 않았음). PD의 최상 전체 반응을 보인 한 명의 대상체는 기록된 어떠한 치료 후 표적 병변 (새로운 병변의 관찰에 의해 측정된 진행)을 갖지 않았고 따라서 플롯에 제시되지 않았다.
도 75는 전체 생존 시간을 도시한다. (A) 21명의 치료된 환자 전부에서 전체 생존 (OS) 시간 중앙값은 21.3개월이었다. (B) 정량적 반응 데이터를 보인 15명의 환자의 OS 시간 중앙값은 16개월이었다. (C) 무응답자 (N = 7명)에 대한 OS 시간 중앙값은 6.5개월이었다. 응답자 (정량적 반응에 대해서만, N = 8명)에 대한 OS 시간 중앙값은 도달되지 않았다.
도 76은 제조된 TIL의 특징을 도시한다. (A) 전체 규모의 ITIL-168 GMP 실행의 TIL 성장외 단계 (단계 1) 중의 세포 수. (B) 전체 규모의 ITIL-168 GMP 실행의 TIL REP 단계 (단계 2) 중의 세포 수. (C) 전체 규모의 ITIL-168 GMP 실행 중에 퍼센트 생존 능력 (% 생존 가능한 CD3+ 세포).
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 숙련된 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
용어 "항-CD3 항체"는 항체 또는 그것의 변이체, 예컨대, 단클론성 항체를 나타내며 성숙한 인간 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시된 인간, 인간화된, 키메라, 쥐과 또는 포유류 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 뮤로모납(muromonab)으로도 알려져 있는 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3.엡실론으로도 알려져 있는 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체로는, 예를 들어, 오텔릭시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab), 및 비실리주맙(visilizumab)을 들 수 있다.
"항-종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료적 양"이 표시될 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 정도 또는 전이, 및 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 종양 침윤 림프구 (예컨대 이차 TIL 또는 유전자 변형된 세포독성 림프구)를 포함하는 제약학적 조성물은 104 내지 1011 세포/kg 체중 (예컨대, 105 내지 106, 105 내지 1010, 105 내지 1011, 106 내지 1010, 106 내지 1011, 107 내지 1011, 107 내지 1010, 108 내지 1011, 108 내지 1010, 109 내지 1011, 또는 109 내지 1010 세포/kg 체중)의 투여량 (이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)으로 투여될 수 있다고 말할 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전자 변형된 세포독성 림프구 포함함) 조성물은 또한 이들 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전자 변형된 세포독성 림프구 포함함)는 일반적으로 면역요법에서 알려져 있는 주입 기법을 사용함으로써 투여될 수 있다 (예컨대, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 참고). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 의학분야의 숙련된 사람에 의해 질환의 신호에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따른 치료를 조정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "공동 투여", "공동으로 투여하는", "함께 투여된", "함께 투여하는", "동시에", 및 "동시의"는 둘 다의 활성 제약학적 성분 및/또는 그것들의 대사산물이 동시에 대상체에게 존재하도록 대상체에게 둘 이상의 활성 제약학적 성분 (예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 복수의 TIL과 조합된 적어도 하나의 칼륨 채널 작용물질)의 투여를 포함한다. 공동 투여는 별도의 조성물로의 동시 투여, 별도의 조성물로 상이한 시간에서의 투여, 또는 둘 이상의 활성 제약학적 성분이 존재하는 조성물로의 투여를 포함한다. 별도의 조성물로의 동시 투여 및 두 가지 작용제가 모두 존재하는 조성물로의 투여가 바람직하다.
본원에서 사용되는 "세포화된 또는 세포화"는 고형 조직에 의해 일반적으로 다중 세포 계통/유형으로 구성된 다중세포 물질이 한정하는 것은 아니지만 하나의 세포를 포함하지만 매우 작은 수의 다양한 계통 또는 세포 유형의 다중 세포, 즉 T세포 클럼프 또는 세포 응집체일 수 있는 작은 수의 세포로 분해되는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "폐쇄된 시스템"은 외부 환경에 대해 폐쇄된 시스템을 나타낸다. 세포 배양 방법에 적절한 임의의 폐쇄된 시스템이 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 폐쇄된 시스템으로는, 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만 폐쇄된 G-Rex 용기 또는 세포 배양 백을 들 수 있다. 종양 분절이 폐쇄된 시스템에 첨가되면, 시스템은 TIL이 환자에게 투여될 준비가 될 때까지 외부 환경에 대해 개방되지 않는다. 유리한 구체예에서, 폐쇄된 시스템은 PCT 공보 번호 WO 2018/130845에서 개시된 시스템이다.
본원에서 사용되는 "냉동보존 배지들" 또는 "냉동보존 배지"는 세포의 냉동보존을 위해 사용될 수 있는 임의의 배지를 나타낸다. 그러한 배지로는 2% 내지 10% DMSO를 포함하는 배지를 들 수 있다. 예시의 배지로는 CryoStor CS10, HypoThermosol, Bloodstor BS-55뿐만 아니라 그것들의 조합을 들 수 있다.
용어 "냉동보존된 TIL"은 본원에서 일차, 벌크, 또는 팽창된 TIL (REP TIL)이 처리되고 약 -190℃ 내지 -60℃ 범위에서 보관되는 것을 의미한다. 냉동보존을 위한 일반적인 방법이 또한 실시예를 포함한 본원의 다른 곳에서 기술된다. 명료하게 하기 위해, "냉동보존된 TIL"은 일차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과 구별된다.
본원에서 사용되는 "고갈"은 원하는 세포를 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 표지화된 원치 않는 세포로부터 분리하는 부정적 선택 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "분해 또는 분해하다"는 고형 조직의 단일 세포 또는 작은 세포수 응집체로의 변형을 나타내며 여기서 회전 타원체(spheroid)로서의 단일 세포는 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 또는 그 이상의 범위의 직경을 가지며, 직경은 보다 일반적으로 7 내지 20 μm이다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 한정하는 것은 아니지만, 질환 치료를 포함하여 의도된 적용을 이루기에 충분한 본원에 기술된 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 나타낸다. 치료적 유효량은 의도된 적용에 따라 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 대상체 및 질환 상태 (예컨대, 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 또는 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응 (예컨대, 혈소판 부착의 감소 및/또는 세포 이동)을 유도할 용량에도 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 특정 화합물, 따라야 할 투약 요법, 화합물이 다른 화합물과 함께 투여될 것인지의 여부, 투여 시기, 그것이 투여되는 조직, 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용되는 "조작된"은 조직 유래 세포 기능을 그것의 원래 기능으로부터 그것의 궁극적인 유용을 위한 새로운 또는 개선된 기능을 가지도록 변경시키는 핵 물질 또는 인자의 첨가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "효소 배지"는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물과 같은 효소적 활성을 가지는 배지를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "여과물"은 필터, 메시 또는 막을 통과하는 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "유연한 용기"는 하나 이상의 상이한 유형의 필름을 가진 다중 포맷의 유연한 포장 시스템을 나타낸다. 각각의 필름 유형은 과정의 단계에 따라 멸균된 유체, 고형 조직 유래 세포 물질 및 용기 무결성의 물리적, 화학적, 및 기능적 특징을 보존하기 위해 특정 특징을 제공하도록 선택된다.
분야에서 또한 냉동보호제로서도 언급되는 "동결 용액" 또는 "냉동보존 용액"은 냉동보호 첨가제를 함유하는 용액이다. 이것들은 일반적으로 세포가 동결 중에 노출되는 물리적 스트레스를 동결 손상 (즉 얼음 형성으로 인한)을 최소화하기 위해 변형시키는 투과성, 무독성 화합물이며 가장 일반적으로 다음 중 하나 이상의 % 부피/부피이다: 다이메틸설폭사이드 (DMSO); 에틸렌 글리콜; 글리세롤; 2-메틸-2,4-펜탄다이올 (MPD); 프로필렌 글리콜; 수크로스; 및 트레할로스.
용어 "혈액암(hematological malignancy)"은 한정하는 것은 아니지만 혈액, 골수, 림프절, 및 림프계의 조직을 포함한, 조혈 및 림프양 조직의 포유류 암 및 종양을 나타낸다. 혈액암은 또한 "액체 종양"으로도 언급된다. 혈액암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 림프종 (CLL), 작은 림프구성 림프종 (SLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 단핵세포 백혈병 (AMoL), 호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종을 들 수 있다. 용어 "B 세포 혈액암"은 B 세포에 영향을 미치는 혈액암을 나타낸다.
용어 "IL-2" (본원에서 또한 "IL2"로도 언급됨)는 인터류킨-2로서 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 나타내며, 인간 및 포유류 형태, 그것들의 보존성 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러(biosimilar), 및 변이체를 포함한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-2는, 예컨대, Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79 (개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (SEQ ID NO: 3). 예를 들어, 용어 IL-2는 인간, 알데스류킨(aldesleukin)(PROLEUKIN, 일회용 바이알당 22 x 106 IU로 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능함)과 같은 IL-2의 재조합 형태, 뿐만 아니라 CellGenix, Inc., Portmouth, N.H., USA (CELLGRO GMP) 또는 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, N.J., USA (Cat. No. CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급된 재조합 IL-2 형태 및 다른 판매처로부터의 다른 상업적 동등물을 포함한다. 알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 가진 IL-2의 글리코실화되지 않은 인간 재조합 형태이다. 용어 IL-2는 또한 Nektar Therapeutics, South San Francisco, Calif., USA로부터 입수 가능한 페길화된 IL2 전구약물 NKTR-214를 포함한, 본원에 기술된 IL-2의 페길화된 형태를 포함한다. 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0328791 A1 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/065086 A1에서 기술된다. 발명에 사용하기에 적합한 콘쥬게이션된 IL-2의 대체 형태는 미국 특허 제 4,766,106호, 5,206,344호, 5,089,261호 및 4,902,502호에서 기술된다. 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제제는 미국 특허 제 6,706,289호에서 기술된다.
용어 "IL-4" (본원에서 또한 "IL4"로도 언급됨)는 Th2 T 세포에 의해 및 호산성 세포, 호염기성 세포, 및 비만 세포에 의해 생성되는 인터류킨 4로서 알려져 있는 사이토카인을 나타낸다. IL-4는 나이브 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. IL-4에 의해 활성화될 때, Th2 T 세포는 계속해서 양성 피드백 루프에서 추가적인 IL-4를 생성한다. IL-4는 또한 B 세포 증식 및 부류 II MHC 발현을 자극하며, B 세포로부터 IgE 및 IgG1 발현에 대한 부류 전환을 유도한다. 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4는 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, N.J., USA (Cat. No. CYT-211) 및 ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, Mass., USA (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco CTP0043)를 포함한 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
용어 "IL-7" (본원에서 또한 "IL7"로도 언급됨)은 간질 세포(stromal cell) 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 얻어질 수 있는, 인터류킨 7로서 알려져 있는 글리코실화된 조직-유래 사이토카인을 나타낸다. Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7은 T 세포의 발생을 자극할 수 있다. IL-7은 IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 사슬 수용체로 이루어진 헤테로다이머인 IL-7 수용체에 결합하며, 이것은 일련의 신호에서 흉선 내에서의 T 세포 발생 및 주변부 내에서의 생존에 중요하다. 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, N.J., USA (Cat. No. CYT-254) and ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, Mass., USA (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco PHC0071)를 포함한 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
용어 "IL-12" (본원에서 또한 "IL12"로도 언급됨)는 인터류킨-12로서 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 나타낸다. 인터류킨 (IL)-12는 대략적인 분자량에 대해 p35 및 p40으로 표시된 2개의 이황화-연결된 글리코실화된 단백질 하위단위로 구성된 분비된 헤테로다이머 사이토카인이다. IL-12는 주로 항원 제공 세포에 의해 생성되며 T 세포 또는 천연 살해 (NK) 세포의 표면에서 발현되는 2-사슬 수용체 복합체에 결합함으로써 세포-매개 면역을 유도한다. IL-12 수용체 베타-1 (IL-12Rpi) 사슬은 IL-12의 p40 하위단위에 결합하여, IL-12와 그것의 수용체 사이의 주된 상호작용을 제공한다. 그러나, 세포내 신호전달을 부여하는 것은 제2 수용체 사슬인 IL-12RP2의 IL-12p35 결찰이다. 항원 제공과 동시의 IL-12 신호전달은 인터페론 감마 (IFNy) 생성을 특징으로 하는, T 헬퍼 1 (Th1) 표현형을 향한 T 세포 분화를 발동시키는 것으로 여겨진다. Thl 세포는 일부 세포내 병원체에 대한 면역을 촉진하고, 보체-고정 항체 아이소타입을 생성하며, 종양 면역감시에 기여하는 것으로 여겨진다. 그러므로, IL-12는 숙주 방어 면역 메커니즘에 대한 중요한 구성요소인 것으로 여겨진다. IL-12는 또한 IL-23, IL-27, IL-35, IL-39를 포함하는 사이토카인의 IL-12 패밀리의 일부분이다.
용어 "IL-15" (본원에서 또한 "IL15"로도 언급됨)는 인터류킨-15로서 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 나타내며, 인간 및 포유류 형태, 그것들의 보존성 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러, 및 변이체를 포함한 IL-15의 모든 형태를 포함한다. IL-15는, 예컨대, Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32 (개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. IL-15는 β 및 γ 신호전달 수용체 하위단위를 IL-2와 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 분자 질량이 12.8 kDa인 114개 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유한 단일한, 비-글리코실화 폴리펩타이드 사슬이다. 재조합 인간 IL-15은 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, N.J., USA (Cat. No. CYT-230-b) 및 ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, Mass., USA (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. 34-8159-82)를 포함한 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
용어 "IL-18" (본원에서 또한 "IL18"로도 언급됨)은 인터류킨-15로서 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 나타낸다. 인터류킨-18 (IL-18)은 그것의 구조, 수용체 패밀리 및 신호 변환 경로로 인해 IL-1 사이토카인 패밀리에 속하는 전염증성 사이토카인이다. 관련된 사이토카인으로 IL-36, IL-37, IL-38을 들 수 있다.
용어 "IL-21" (본원에서 또한 "IL21"로도 언급됨)은 인터류킨-21로서 알려져 있는 다면발현성 사이토카인 단백질이며, 인간 및 포유류 형태, 그것들의 보존성 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러, 및 변이체를 포함한 IL-21의 모든 형태를 포함한다. IL-21은, 예컨대, Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95 (개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. IL-21은 주로 천연 살해 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 생성된다. 재조합 인간 IL-21은 분자 질량이 15.4 kDa인 132개 아미노산을 함유한 단일한, 비-글리코실화 폴리펩타이드 사슬이다. 재조합 인간 IL-21은 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, N.J., USA (Cat. No. CYT-408-b) 및 ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, Mass., USA (인간 IL-21 재조합 단백질, Cat. No. 14-8219-80)를 포함한 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
용어 "액체 종양"은 자연에서 유체인 세포의 비정상적인 덩어리를 나타낸다. 액체 종양 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 백혈병, 골수종, 및 림프종, 뿐만 아니라 다른 혈액암을 들 수 있다. 액체 종양으로부터 얻어진 TIL은 또한 본원에서 골수 침윤 림프구 (MIL)로서 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 "자성 입자"에서 "자성"은 기술분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 방법으로 제조될 수 있는 자성 입자, 특히 강자성 입자, 초상자성 입자 및 상자성 입자의 모든 하위유형을 나타낸다. "강자성" 물질은 자기장에 매우 민감하며 자기장이 제거될 때 자기 특성을 유지할 수 있다. "상자성" 물질은 단지 약한 자화율을 가지며 자기장이 제거될 때 그것의 약한 자성을 빠르게 상실한다. "초상자성" 물질은 자기장에 매우 민감하며, 즉, 그것은 자기장에 놓일 때 강력하게 자성외 되지만, 상자성 물질과 같이, 그것의 자성을 빠르게 상실한다.
본원에서 사용되는 "마커"는 특정 세포 유형에 의해 특이적으로 발현되는 세포 항원을 나타낸다. 우선적으로, 마커는 세포 표면 마커여서, 살아있는 세포의 풍부화, 분리 및/또는 검출이 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 "마커-결합 단편"은 세포의 원하는 표적 분자, 즉 항원에 우선적으로 결합하는 임의의 모이어티를 나타낸다. 용어 모이어티는, 예컨대, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 기술분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 생성될 수 있는 다클론성 또는 단클론성 항체를 나타낸다. 항체는 임의의 종, 예컨대 쥐과, 래트, 양, 인간의 것일 수 있다. 치료 목적으로, 만약 비-인간 항원 결합 단편이 사용되어야 한다면, 이것들은 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 항체는 또한 변형된 항체 (예컨대 올리고머, 환원된, 산화된 및 표지화된 항체)일 수 있다. 용어 "항체"는 온전한 분자 및 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일 사슬 항체를 모두 포함한다. 추가적으로, 용어 "마커-결합 단편"은 세포의 원하는 표적 분자에 우선적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이외의 임의의 모이어티를 포함한다. 적합한 모이어티로는, 제한 없이, 원하는 표적 분자에 결합하는 압타머로서 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 (Hermann and Pantel, 2000: Science 289: 820-825), 탄수화물, 렉틴 또는 임의의 다른 항원 결합 단백질 (예컨대 수용체-리간드 상호작용)을 들 수 있다.
"배지"는 세포 사멸을 감소시키기 위해 사용된 세포 배양, 세포 취급 및 안정화의 기술분야에서 알려져 있는 다양한 용액을 의미하며, 한정하는 것은 아니지만 다음 배지 중 하나 이상을 들 수 있다: 장기 보존 용액, 선택적 용해 용액, PBS, DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, 이스코브 배지, X-VIVOTM, 락테이트화된 링거액, 링거 아세테이트, 식염수, PLASMALYTETM 용액, 결정질 용액 및 IV 유체, 콜로이드 용액 및 IV 유체, 물 중의 5% 덱스트로스 (D5W), 하트만 용액(Hartmann's Solution). 배지는 예컨대 일차 인간 세포 배양 (예컨대 내피 세포, 간세포, 또는 각질형성세포를 위한) 또는 줄기 세포 (예컨대 수지상 세포 성숙화, 조혈 팽창, 각질형성 세포, 간엽 줄기 세포 또는 T 세포 팽창)를 위한 상기 언급된 배지 또는 특수 배지와 같은 표준 세포 배지일 수 있다. 배지는 기술분야에 잘 알려져 있는 보충물 또는 시약, 예컨대 알부민 및 수송 단백질, 아미노산 및 비타민, 항생물질, 부착 인자, 성장 인자 및 사이토카인, 호르몬, 대사 억제제 또는 가용화제를 가질 수 있다. 다양한 배지가 예컨대 ThermoFisher Scientific 또는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 이용 가능하다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "미세환경"은 전체적인 고형 또는 혈액학적 종양 미세환경 또는 미세환경 내 세포의 개발적인 하위세트를 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 종양 미세환경은 Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473에서 기재된 것과 같이, "세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외재성 매트릭스, 및 신생물 변형을 촉진하고, 종양 성장 및 침입을 지지하며, 종양을 숙주 면역으로부터 보호하고, 치료적 저항성을 조성하며, 우성 전이가 번성하기 위한 틈새를 제공하는 기계적 신호"의 복잡한 혼합을 나타낸다. 비록 종양이 T 세포에 의해 인식되어야 하는 항원을 발현하긴 하지만, 면역 체계에 의한 종양 제거는 미세환경에 의한 면역 억제로 인해 드물다.
본원에서 사용되는 용어 "음성적으로 분리된"은 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 결합된 세포의 활성 분리를 나타내며 이들 세포는 세포의 필요한 집단이 아니다.
본원에서 사용되는 "비-표지화된" 또는 "미접촉된"은 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 결합되지 않은 세포를 나타낸다. 비-표지화된, 미접촉된 세포 분획은 원하는 표적 세포를 함유한다.
본원에서 사용되는 "비-표적 세포"는 원치 않는 세포 유형을 제거하기 위해 사용된 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 특이적으로 결합되는 세포를 나타낸다.
"OKT-3" (본원에서 또한 "OKT3"으로도 언급됨)은 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시된 인간, 인간화된, 키메라, 또는 쥐과 항체를 포함한, 단클론성 항체 또는 그것의 바이오시밀러 또는 변이체를 나타내며, OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, Calif., USA) 및 뮤로모납 또는 그것들의 변이체, 보존성 아미노산 치환, 당형태, 또는 바이오시밀러와 같은 상업적으로 이용 가능한 형태를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "입자"는 콜로이드 입자, 마이크로스피어, 나노입자, 또는 비드와 같은 고체상을 나타낸다. 그러한 입자의 생성 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 입자는 자성 입자이거나 다른 선택적 특성을 가질 수 있다. 입자는 용액 또는 현탁액으로 있거나 또는 그것은 본 발명에서 사용 전에 동결건조 상태로 있을 수 있다. 동결건조된 입자는 그런 후에 편리한 완충액에 재구성된 후에 본 발명과 관련하여 프로세싱될 샘플과 접촉된다.
용어 "말초혈 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵세포를 포함한, 둥근 핵을 가진 말초혈 세포를 나타낸다. 바람직하게, 말초혈 단핵 세포는 방사선 조사된 동종 말초혈 단핵 세포이다. PBMC는 항원 제공 세포의 유형이다.
용어 "제약학적으로 허용되는 담체" 또는 "제약학적으로 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 비활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 제약학적 성분에 대한 그러한 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제가 활성 제약학적 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 발명의 치료 조성물에 그것의 사용이 고려된다. 추가적인 활성 제약학적 성분, 예컨대 다른 약물이 또한 기술된 조성물 및 방법에 포함될 수 있다.
용어 "집단 세포" (TIL 포함)는 본원에서 공통 특징을 공유하는 많은 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 일반적으로 l x l06 내지 l x l012의 범위의 수이며, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다.
본원에서 사용되는 "양성적으로 분리된"은 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 결합된 세포의 활성 분리를 나타내며 이들 세포는 세포의 필요한 집단이다.
본원에서 사용되는 "음성적으로 분리된"은 고체상에 결합된 하나의 마커-결합 단편에 의해 결합된 세포의 활성 분리를 나타내며 이들 세포는 세포의 필요한 집단이 아니다.
본원에서 사용되는 "순도"는 원래의 고형 조직으로부터 원하는 표적 집단 또는 집단들의 백분율을 나타낸다.
"급속한 팽창"은 일주일 동안 적어도 약 3-배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9-배), 보다 바람직하게는 일주일 동안 적어도 약 10-배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 800-, 또는 90-배), 보다 바람직하게는 일주일 동안 적어도 약 100-배 (또는 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 또는 900-배), 또는 가장 바람직하게는 일주일 동안 적어도 약 1000-배 (또는 2000-, 3000-, 4000-, 5000-, 6000-, 7000-, 8000-, 또는 9000-배)의 항원 특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 많은 급속 팽창 프로토콜이 하기에서 설명된다.
"재생 의약품(들)", "입양 세포 요법(들)" 또는 "첨단 치료 의약품(들)"은 다음 중 어느 하나에 의해 하나 이상의 물질의 치료 목적에 사용되는 세포 물질을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다: 세포 물질의 일부 또는 전부의 작용; 적용 후 포유류의 웰빙을 개선할 목적으로 세포 물질의 일부 또는 전부의 지지적 작용. 치료 세포는 이들 작용을 제공하기 위해 직접 사용되거나 또는 추가의 프로세싱, 팽창 및/또는 조작을 필요로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 "샘플"은 임의의 비율로 세포를 함유하는 샘플을 나타낸다. 우선적으로, 이들 세포는 생존할 수 있다. 일부 경우에, 이들 세포는 또한 후속적인 핵산 또는 단백질 추출을 위해 사용될 수 있는 고정된 또는 동결된 세포일 수 있다. 샘플은 동물, 특히 마우스, 래트, 또는 인간과 같은 포유류로부터 유래될 수 있다. 세포를 함유하는 임의의 압축 가능한 고형 조직이 사용될 수 있다. 발명은 주로 고체 종양 조직으로부터의 조혈 및 암 세포의 분리를 통해 예시된다. 그러나, 발명은 임의의 포유류 고형 조직으로부터의 광범위한 세포의 분리 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "고체상"은 또 다른 기질(들), 예컨대 입자, 형광단, 합텐 유사 비오틴, 중합체, 또는 배양 접시 및 미세역가 플레이트와 같은 더 큰 표면에 결합된 마커-결합 단편, 예컨대 항체의 결합을 나타낸다. 일부 경우에, 결합은, 예컨대 항원 결합 단편이 배양 접시의 더 큰 표면에 결합된다면, 항원 결합 단편의 직접 고정화를 초래한다. 다른 경우에, 이 결합은 간접 고정화를 초래하는데, 예컨대 자성 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 (예컨대 비오틴을 통해) 결합된 항원 결합 단편은, 상기 비드가 자기장에서 유지된다면 고정된다. 추가의 경우에 다른 분자에 대한 항원 결합 단편의 결합은 직접 또는 간접 고정화를 초래하지는 않지만 예컨대 마커-결합 단편이 화학적 또는 물리적 모이어티에 결합된 후 예컨대 FACS 분류, 또는 형광 현미경검사와 같은 유동 세포분석 방법을 통해 표지화된 세포 및 비-표지화된 세포의 식별을 허용한다면, 본 발명에 따르는 세포의 풍부화, 분리, 단리, 및 검출을 허용한다.
본원에서 사용되는 "고형 조직"은 그것의 삼차원, 즉 기하학적 바디로서 길이, 폭 및 두께에 의해 다수의 개별 세포 기반 단위의 크기보다 더 큰 동물 유래 포유류 고형 조직의 조각 또는 조각들을 나타내며 자주 조직의 구조를 구성하는 콜라겐 또는 유사한 매트릭스와 같은 결합 조직을 함유함으로써 상기 고형 조직은 튜브를 통해 흐를 수 없거나 또는 주사기 또는 유사한 작은 도관 또는 소켓(receptacle)에 의해 수집될 수 없고 500 μm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 1 cm, 2 cm, 3 cm, 4 cm, 5 cm, 10 cm, 20 cm, 30 cm,또는 그 이상의 범위의 치수를 가진다.
"고체 종양"은 일반적으로 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리를 나타낸다. 고체 종양은 양성(benign) 또는 악성일 수 있다. 용어 "고체 종양 암"은 악성, 신생물, 또는 암성 고체 종양을 나타낸다. 고체 종양 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 육종, 암종, 및 림프종, 예컨대 폐, 유방, 전립선, 결장, 직장, 및 방광의 암을 들 수 있다. 고체 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포) 및 암세포가 분산되어 있고 지지 미세환경을 제공할 수 있는 지지 간질 세포를 포함하는 상호의존적인 조직 구획을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 자궁경부암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 [HNSCC]을 포함함), 교모세포종, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 및 비-소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 고체 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포) 및 암세포가 분산되어 있고 지지 미세환경을 제공할 수 있는 지지 간질 세포를 포함하는 상호의존적인 조직 구획을 포함한다.
본원에서 "해동된 냉동보존된 TIL"은 이전에 냉동보존되었다가 나중에 한정하는 것은 아니지만 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 포함한, 실온 또는 그 이상의 온도로 복귀하도록 처리된 TIL을 의미한다.
용어 "치료", "치료하는", "치료하다", 등은 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 나타낸다. 효과는 완전히 또는 부분적으로 질환 또는 그것의 증상을 방지하는 면에서 예방적일 수 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 부분적인 또는 완전한 치유라는 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료"는 포유류에서, 특히 인간에서 질환의 어떠한 치료를 포함하며, (a) 질환에 걸릴 소인이 있지만 아직 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것의 방지; (b) 질환의 억제, 즉, 그것의 발생 또는 진행의 정지; 및 (c) 질환의 완화, 즉, 질환의 퇴행 유발 및/또는 하나 이상의 질환 증상의 완화를 포함한다. "치료"는 또한 질환 또는 상태의 부재시에도 약리적 효과를 제공하기 위하여 작용제의 전달을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "치료"는 질환 또는 상태의 부재시에, 예컨대, 백신의 경우에 면역 반응을 유도하거나 면역을 부여할 수 있는 조성물의 전달을 포함한다.
"종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"는 본원에서 원래 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동하는 백색 혈구로서 얻어지는 세포 집단을 의미한다. TIL로는, 한정하는 것은 아니지만, CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Thi 및 Thi 7 CD4+ T 세포, 천연 살해 세포, 수지상 세포, 및 Ml 대식세포를 들 수 있다. TIL은 일차 및 이차 TIL을 모두 포함한다. "일차 TIL"은 본원에서 개관된 것과 같이 환자 조직 샘플로부터 얻어지는 것이고 (때때로 "새롭게 수득된" 것으로 언급됨), "이차 TIL"은 본원에서 논의된 것과 같이, 한정하는 것은 아니지만 벌크 TIL 및 팽창된 TIL ("REP TIL" 또는 "후-REP TIL")을 포함한, 팽창된 또는 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. TIL 세포 집단은 유전자 변형된 TIL을 포함할 수 있다. TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 종양을 침윤하고 치료를 이루는 능력에 의해 기능적으로 규정될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현함으로써 범주화될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD62L, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가적으로 및 대안으로, TIL은 환자에게 재도입될 때 고체 종양을 침윤하는 능력에 의해 기능적으로 규정될 수 있다. TIL은 추가로 효능에 의해 특성화될 수 있다 - 예를 들어, TIL은 TCR 개입에 대한 반응으로 예를 들어, 약 50 pg/mL보다 큰, 약 100 pg/mL보다 큰, 약 150 pg/mL보다 큰, 또는 약 200 pg/mL보다 큰 인터페론 (IFN) 방출을 유발하거나, 또는 보다 바람직하게 개별 세포가 유동 세포분석에 의해 TCR 유도된 자극 후에 CD137, CD107a, INF-γ TNF-α, 및 IL-2에 대한 세포내 염색을 통해 효능이 있을 수 있다면 효능이 있거나 기능성인 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 "잔류물"은 필터, 메시 또는 막을 통과하지 못하는 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "궁극적 유용성"은 재생 의약품, 입양 세포 요법, ATMP, 진단적 시험관내 연구 또는 과학적 연구조사에서의 제조 또는 직접 사용을 나타낸다.
본 발명은 전이성 암 환자의 종양으로부터 분리될 수 있고, 동일한 암 환자로부터 생성되어 동일한 암 환자에게 복귀되는 자가 TIL을 포함한 종양 침윤 림프구 (TIL), 특히 미변형 TIL (UTIL)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 냉동보존된 TIL 또는 UTIL의 치료 집단을 분리하는 방법 및 본원에 기술된 방법에 의해 절제된 종양의 프로세싱을 위한 일회용 무균 키트를 포함하는 장치의 사용을 통해 얻어진 또는 얻을 수 있는 TIL 및 UTIL에 관한 것이다.
일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플 ("일차 TIL")로부터 얻어진 후 본원에 기술된 것과 같이 추가의 조작을 위해 더 큰 집단으로 팽창되고, 냉동보존되고, 본원에서 개관된 것과 같이 재자극되고 선택적으로 TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 파라미터에 대해 평가된다.
환자 종양 샘플은 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 일반적으로 외과적 절개, 바늘 생검 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단을 통해 얻어질 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 일차 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함한 임의의 고체 종양으로부터 유래될 수 있다. 종양 샘플은 또한 액체 종양, 예컨대 혈액암으로부터 얻어진 종양일 수 있다. 고체 종양은 한정하는 것은 아니지만, 유방, 난소, 자궁경부, 췌장, 전립선, 대장, 폐, 뇌, 신장, 위, 및 피부 암 (한정하는 것은 아니지만 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 및 흑색종을 포함함)을 포함한, 임의의 암 유형의 것일 수 있다. 일부 구체예에서, TIL은 악성 흑색종 종양으로부터 얻어지는데, 이것이 특히 높은 수준의 TIL을 가지는 것으로 기록되었기 때문이다.
생성은 일반적으로 2단계 과정을 포함한다. 단계 1에서, 초기 종양 물질이 해부되고, 분해 모듈을 가진 무균 키트에 배치되어, 효소적으로 소화 및/또는 단편화되고, 분해 모듈에서 종양이 균질화되어 단일 세포 현탁액이 제공된다. 균질화된 세포는 추가로 무균 키트 내에서 별도의 풍부화 모듈에서 정제되어 더 이상 필요하지 않은 시약; 세포 파편; 비-분해된 조직과 같은 구성요소들이 제거되며, 세포는 직접 냉동보존되어 단계 2가 필요할 때까지 무균 키트의 안정화 모듈에서 TIL 제조 및 보관을 위해 출발 물질이 안정화될 수 있다. 단계 2는 일반적으로 절제된 종양 출발 물질 중에서 TIL의 성장 (2주)과, 이어서 TIL 세포의 급속 팽창 과정 (급속 팽창 프로토콜 "REP" - 2주)을 포함한다. 최종 생성물은 세척되고 수득된 후 완충 식염수, 8.5% HAS 및 10% DMSO에 현탁되고 냉동보존되어 추가의 변형 없이 단일 용량으로서 주입되기 전에 해동되는 고체 무균성 생성물이 형성된다.
잠재적으로 치료적 활성에 기여하는 치료에 대한 3가지 별도의 요소가 있다. 핵심 요소는 TIL, 즉 종양-유래 T 세포로, 그것의 정상적인 기능의 일부로서 T 세포에 의해 활용된 다양한 방법에 의해 종양 세포를 표적으로 하여 제거할 수 있다. 이들 방법은 직접 방법 (즉 퍼포린-매개 세포독성) 및 간접 방법 (즉 사이토카인 생성)을 들 수 있다. 이들 방법 중 어느 것이 생체내 항-종양 효과에 가장 중요한지는 불분명하지만 마우스 모델은 인터페론 감마의 생성이 효과적인 치료법에 중요한 것을 시사한다. 치료법에 기여하는 2가지 다른 요소는 사전-조건화 화학요법 및 고용량 정맥내 IL-2이다. 이들 2가지 요소는 주입 후 환자에서: 초기에는 경합 및 조절 면역 세포를 제거하는 조건화 화학요법을 통해; 이어서 T 세포의 생존을 지지하는 IL-2 구성요소를 통해 T 세포의 생착을 지지함으로써 작용하는 것으로 여겨진다.
세포 요법 생성물의 구조는 성장 지지 세포 배양 배지 및 성장 인자 인터류킨-2 (IL-2)를 지지하는 T 세포에 의해 효소 소화된 종양 덩어리 중에서 직접 TIL을 성장시킴으로써 생성된다. 이것은 종양 특이적 T 세포가 종양 세포 혼합물 중에서 선택적으로 생존하고 성장할 수 있게 하는 한편, 종양 항원을 인식하지 못하는 T 세포는 자극되지 않을 것이고 선택적으로 상실될 것이다. 생성물은 자가 T-세포 기반 생성물을 포함하며 T 세포는 환자 자신의 암 조직으로부터 유래되어 빠르게 팽창되어 CD3 표면 마커에 의해 규정되는 바 순수한 T 세포 집단 및 T 세포가 형성된다.
간단히 설명하면, TIL, 특히 UTIL은 출발 물질로서 종양 생검을 사용하여 2단계 과정으로 생성될 수 있다: 단계 1 (일반적으로 2-3시간 동안 수행됨)은 해부, 효소적 소화 및 키트 및 반자동 장치의 사용을 통한 균질화를 사용한 종양 물질의 초기 수집 및 프로세싱로 단일 세포 현탁액을 생성하기 위한 것이며 그것은 키트의 안정화 모듈을 사용하여 직접 냉동보존되어 수일 또는 수년 후에 일어날 수 있는 후속 제조 및 단계 2를 위해 출발 물질을 안정화시킨다. 단계 2는 4주 동안 수행될 수 있고, 단계 1의 생성물의 해동으로 시작하여 종양 출발 물질 중에서 TIL의 성장 (약 2주)과 이어서 세포 및 따라서 용량의 양을 증가시키기 위한 TIL 세포의 급속 팽창 과정 (약 2주)이 있는 연속적인 과정일 수 있다. TIL, 특히 UTIL은 농축되고 세척된 후 세포의 액체 현탁액으로서 제제화된다. 무균성 약물 생성물은 백에 냉동보존되고 추가의 변형 없이 단일 용량으로서 정맥내 주입되기 전에 해동될 것이다.
한 구체예에서, 발명의 백은 수집 백 및/또는 냉동보존 백이다. 백 및 임의의 관련된 튜빙은 일반적으로 깨끗하거나, 투명하거나, 반투명하거나, 원하는 임의의 색이거나, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 조직 수집 백 및/또는 튜빙은 일반적으로 폐쇄된 및/또는 밀봉된 혈액 및/또는 냉동보존 백 및 관련된 튜빙의 제작과 유사한 방식으로 제작될 수 있다. 발명의 튜빙은 한정하는 것은 아니지만 염화 폴리비닐 (PVC)을 포함한, 임의의 원하는 물질로부터 구성될 수 있다. 예를 들어, PVC는 PVC가 용접 및/또는 밀봉에 유리하기 때문에 원하는 물질일 수 있다.
발명의 수집 백, 예컨대 조직 수집 백은 폴리올레핀 중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 비닐 아세테이트와 폴리올레핀 중합체 혼합물과 같은 공중합체 (즉, OriGen Biomedical EVO 필름), 및/또는 EVA를 포함하는 물질과 같은 미리 결정된 물질로부터 만들어진 조직을 받기 위한 백의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 백에 사용하기 위한 물질은 특정 특성 및/또는 선택된 특성들, 예를 들어, 열 밀봉성과 같은 밀봉성, 가스 투과성, 유연성 예를 들어 저온 유연성, 탄력성 예를 들어 저온 탄력성, 내화학성, 광학적 선명도, 세포독성과 같은 생체적합성, 용혈 활성, 침출 저항성, 적은 미립자를 가지는 특성에 대해 선택될 수 있다.
밀봉은 에너지, 예를 들어, 용접 지대를 생성하기 위해 열을 사용하는 중에 형성될 수 있다. 사용 중에 형성된 밀봉은 약 2.5 mm 내지 약 7.5 mm 범위의 폭을 가질 수 있다. 일반적으로, 밀봉(140)은 조직 물질이 백(140)에 배치된 후에 형성되며 약 5 mm의 폭을 가질 수 있다. 밀봉은 밀봉 박리 테스트 (즉, ASTM F88/F88M), 및/또는 파열 테스트 (즉, ASTM F1140/F1140M 또는 ASTM F2051/F2054M)를 사용하여 강도에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, 백 또는 유연한 용기는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 100 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 추가로 치료 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정될 수 있다. 백 또는 유연한 용기 구체예는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 75 뉴턴의 힘을 견디고 추가로 치료 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정되도록 구성될 수 있다.
밀봉 또는 용접이 백, 예를 들어, 수집 백 및/또는 냉동보존 백과 같은 유연한 용기 상에 형성될 때, 열 및/또는 압력을 백에 사용된 물질에 따라 미리 정해진 온도, 압력, 및 시간의 양에서 적용하기 위해 밀봉 장치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 열 밀봉기는 약 8초 동안 열 및 압력을 적용할 것을 필요로 할 수 있다. 8초 후, 열은 장치에서 꺼질 수 있지만, 압력은 추가로 2 내지 3초 동안 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 백은 약 10 cm 내지 약 50 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백은 약 15 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 약 18 cm 내지 약 22 cm 범위의 길이를 가질 수 있다.
튜빙의 일부가 용접될 수 있다. 용접 가능한 튜빙은 중합체 물질, 예를 들어, 염화 폴리비닐 (PVC)로부터 만들어질 수 있다.
한정하는 것은 아니지만 무바늘 밸브(needle free valve)를 포함하여, 밸브는 튜빙을 따라 지점에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 백은 약 10 cm 내지 약 40 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백은 약 15 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 약 18 cm 내지 약 22 cm 범위의 길이를 가질 수 있다.
냉동보존 백은 다이메틸 설폭사이드 ("DMSO")와 같은 냉동보호제를 사용하는 냉동보존에 적합할 필요가 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 백은 백이 약 5 ml 내지 약 45 ml 범위의 물질의 부피를 유지할 수 있도록 구성될 수 있다. 특히, 냉동보존 백은 약 10 ml 내지 약 35 ml 범위의 물질의 부피를 수용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 약 15 ml 내지 약 30 ml의 범위로 보관될 물질의 부피를 수용할 수 있는 냉동보존 백을 포함한다. 냉동보존 백은 원하는 미리 결정된 부피가 이루어지도록 하는 크기일 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 백은 약 4 cm 내지 약 11 cm 범위의 폭 및 약 10 cm 내지 약 18 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 백은 약 5.8 cm 내지 약 9.8 cm 범위의 폭 및 약 12 cm 내지 약 16 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 냉동보존 백의 구체예는 약 7.8 cm의 폭 및 약 14 cm의 길이를 가질 수 있다.
사용 전에, 냉동보존 키트 및/또는 그것의 특정 구성요소는 멸균될 수 있다. 백을 형성하기 위해 사용된 물질은 열 밀봉 가능할 수 있다. 백에 사용하기 위한 물질로는, 한정하는 것은 아니지만, EVA, 폴리아미드 (예컨대, 나일론), 및 그것들의 조합과 같은 중합체를 들 수 있다. 개방된 백은 밀봉 및/또는 클램프를 사용하여 백을 닫은 후 프로세싱 및/또는 분해에 사용될 수 있다.
필터는 인라인 필터, 혈액 필터, 예컨대 혈액 투여 필터, 생물학적 필터, 및/또는 인라인 클럼프 제거 필터일 수 있다. 필터는 원하는 물질을 형성하기 위하여 미리 결정된 크기 이상의 물질을 프로세싱된 조직으로부터 제거하기 위해 구성될 수 있다. 예를 들어, 조직의 덩어리는 분해된 조직으로부터 필터를 사용하여 분리될 수 있다. 특히, 여과된 후 튜빙에 진입하는 조직 조성물은 원하는 물질이 형성되도록 평균 약 200 μm 미만의 크기를 가지는 구성요소일 수 있다. 예를 들어, 원하는 물질은 약 170 μm 미만의 평균 크기를 가지는 TIL (종양 침윤 림프구)을 포함할 수 있다.
필터는 튜빙으로부터 진입하는 프로세싱된 조직 조성물이 풍부해져서 필터 후에 원하는 물질이 약 15 μm 내지 약 500 μm 범위의 크기를 가지는 구성요소를 가지는 안정화 요소의 방향으로 튜빙으로 흐르도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 필터는 여과된 후 안정화 요소의 방향으로 튜빙으로 진입하는 조직 조성물이 약 50 μm 내지 약 300 μm 범위의 크기를 가지는 구성요소를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 필터는, 구체예에서, 여과된 후 튜빙으로 진입하는 조직 조성물이 약 150 μm 내지 약 200 μm 범위의 크기를 가지는 구성요소를 갖도록 구성될 수 있다.
일부 구체예에서, 풍부화 요소의 필터는 원하는 물질을 형성하기 위하여 약 5 μm 내지 약 200 μm의 미리 결정된 크기 범위 밖에 있는 물질을 프로세싱된 조직으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 원하는 물질은 약 5 μm 내지 약 200 μm 범위의 평균 크기를 가지는 TIL을 포함할 수 있다. 밸브는 수집 백으로부터 미리 결정된 거리에 배치될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브는 수집 백으로부터 약 20 cm에 배치될 수 있다. 무바늘 밸브와 같은 밸브는 수집 백에 물질을 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 배지는 수집 백에 배지를 첨가하기 위하여 무바늘 밸브에 삽입될 수 있다. 밸브를 통해 제공될 물질로는, 예를 들어, 종양 소화 배지 및/또는 냉동보호제 또는 냉동보존 배지, 예컨대 DMSO 및/또는 그것의 용액, 예컨대 55% DMSO 및 5% 덱스트란 냉동보존 배지 (예컨대, BloodStor 55-5)를 들 수 있다.
주사기는 종양 소화 배지 및 55% DMSO 용액, 예컨대 각각 55% DMSO 및 5% 덱스트란 냉동보존 배지를 무바늘 밸브(290, 292)를 통해 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 프로세싱 중에 물질은 미리 결정된 시간에 냉동보존 키트에 선택적으로 제공될 수 있다. 추가로, 클램프가 제공된 물질의 흐름을 제어하기 위하여 사용될 수 있다. 종양 소화 배지 및/또는 냉동보호제, 예컨대 DMSO 용액과 같은 제공된 물질의 흐름을 제어하기 위해 사용될 수 있는 클램프는 수집 백, 필터, 및/또는 냉동보존 백과 같은 장치에 미리 결정된 시간에 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 그러한 밸브 뒤에는 냉동보존 키트에 대한 추가적인 구성요소 상에 용접될 공간을 허용하기 위해 미리 결정된 양의 튜빙이 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 밸프 뒤에 적어도 10 (10) cm의 튜빙이 다음 요소 앞에 위치할 수 있다. 튜빙(199)은 밀봉 가능하거나 및/또는 용접 가능할 수 있다. 예를 들어, 튜빙용 물질로는, 한정하는 것은 아니지만 PVC (염화 폴리비닐), 및/또는 기술분야에 알려져 있는 다른 물질을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 튜빙은 연결기에 맞추기 위한 크기일 수 있다. 예를 들어, 튜빙은 약 1.5 mm 내지 약 4.5 mm 범위의 내부 직경 및 약 2.1 mm 내지 약 6.1 mm 범위의 외부 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 키트의 구체예는 약 2.9 mm 내지 약 3.1 mm 범위의 내부 직경 및 약 4.0 mm 내지 약 4.2 mm 범위의 외부 직경을 가지는 튜빙을 포함할 수 있다. 냉동보존 키트(191)에 사용된 튜빙은 약 1 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가지는 개별 튜빙 요소로 길이가 달라질 수 있다.
클램프는 효소 배지 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 클램프는 원하는 여과 단계 전에 효소 배지 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 또 다른 클램프(198)는 냉동보호제의 필터로의 바람직하지 못한 이동을 억제 및/또는 방지한다.
특정 구체예에서 분해된 생성 물질이 적절하게 보관될 수 있는 것을 보장하기 위해 둘 이상의 백이 함께 결합될 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 조직, 예를 들어 고형 포유류 조직으로부터의 세포 및/또는 세포 응집체의 반자동 무균성 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위해 자동화 장치를 포함할 수 있다. 발명에 사용하기 위한 자동화 장치는 프로그래밍 가능한 프로세서 및 냉동보존 키트를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 키트는 일회용일 수 있다. 발명은 추가로 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 수집 백과 같은 백은 수집 키트에서 사용될 수 있다. 백은 샘플, 예컨대 조직 샘플의 첨가를 허용하는 개방 단부를 가진다. 연결기는 수집 키트에서 백을 튜빙에 결합시킬 수 있다. 튜빙 물질은 밀봉 가능하거나 및/또는 용접 가능할 수 있다. 예를 들어, 튜빙은 열, 무선 주파수, 등과 같은 에너지를 사용하여 밀봉될 수 있다. 튜빙 물질은 PVA로부터 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, 튜빙은 한정하는 것은 아니지만 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물을 포함하여 하나 이상의 배지 효소 용액의 첨가를 허용하기 위해 밸브에 결합될 수 있다. 예를 들어, 밸브는 무바늘 밸브일 수 있다. 냉동보존 키트에 사용된 튜빙은 약 3.0 mm 내지 약 5.0 mm 범위의 외부 직경을 약 2.0 mm 내지 약 4 mm 범위의 튜빙의 내부 직경과 함께 가지는 튜빙을 포함할 수 있다. 특히, 튜빙은 4.1+/-0.1 mm의 외부 직경 및 약 3.0+/-0.1 mm의 내부 직경을 가질 수 있다. 튜빙의 길이는 수집 키트의 구성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 수집 키트의 구체예로 약 10 cm 내지 약 20 cm 범위의 길이를 가지는 튜빙을 들 수 있다.
수집 키트의 일부 구체예에서 원형은 조직 및/또는 효소 배지의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위해 하나 이상의 클램프를 포함한다. 특히, 효소 배지 및/또는 조직은 여과 단계 전에 필터로 이동하는 것이 억제될 수 있다.
잠재적으로 치료적 활성에 기여할 수 있는 치료에 대한 3가지 별도의 요소가 있다. 핵심 요소는 TIL, 예컨대 UTIL로, 그것의 정상적인 기능의 일부로서 T 세포에 의해 활용된 다양한 메커니즘에 의해 종양 세포를 제거하는 잠재력을 가진다.
이들 메커니즘으로는: [a] 밀접한 개입에 의해 T 세포에 진입하여 세포 사멸을 유도하는 세포독소 (예컨대 퍼포린, 그랜자임, 및 그래뉼리신(granulysin))를 방출함에 의한; 및 [b] 세포자멸사를 유도하는 결합 FAS 리간드 매개 세포독성과 같은 T 세포와 표적 사이의 세포-표면 상호작용에 의한 직접 세포독성; 및 모집 능력을 가지며 이차 이펙터 세포가 사용되는 것을 자극하여 종양 세포 사멸을 유도하는 간접 방법 (예컨대 사이토카인 생성)을 들 수 있다.
TIL, 특히 UTIL은 자가 생성물이다; 따라서, 제조된 각각의 배치는 특정 환자에 대한 단일 용량을 제공한다. 하위 배치 또는 배치의 모음은 없다. 약물 생성물은 해동 후 단일 정맥내 주입을 위한, 8.5% 인간 혈청 알부민 및 10% DMSO를 포함한 125-270 mL의 식염수 기반 용액에 냉동보존된 T 세포 (5x109 to 5x1010)의 무균적으로 제조된 작은 배치이다.
본 발명에는 미국 특허 제 10,398,734호 ("'734 특허")와 비교하여 여러 장점이 있다. '734 특허의 제1 단게는 종양 벌크를 단편으로 변형시키고 그것으로부터 TIL을 배양하는 것이다. 대조적으로, 본 발명은 TIL을 종양으로부터 유리시키는데, 종양은 보존되고 무균 키트에서의 절개 후에 무균 조건 하에 분해되고, 그로부터 세포 현탁액에 제조되며, 결과적으로 생성된 TIL은 동결에 의해 냉동보존된다. 본 발명은 종양 내에 존재하는 다양성을 나타내는 다양한 TIL 집단을 제공한다. 그리고 그것들이 균질한 현탁액이기 때문에, 배양에서 팽창된 TIL은 다양성을 유지하여 종양 내에 상주하는 암세포의 다양한 집단을 해명할 가장 큰 기회를 제공할 것이다.
대조적으로, '734 특허의 제조 과정은 수송 중에 내부 세포 집단의 악화 및 프로세싱을 시작하기 전 임의의 추가 지연을 이미 경험한 조직의 단편으로 시작한다. 더불어, 제조에 사용된 TIL은 단지 조직 단편으로부터 팽창된 TIL일 것이고 내부에 유지되는 TIL이 아니어서, 결과적으로 생성된 세포 집단은 종양 환경의 전체 다양성을 반영하지 못할 수 있다.
또 다른 차이점은 본 발명의 과정에서 폐쇄된 제조 프로세싱로의 진입이 '734 특허의 과정에서보다 훨씬 빨리 일어나고 오염 기회가 더 적다는 것이다. 특히, 본 출원에서 종양 조직의 파괴는, '734 특허가 생물학적 안전성 캐비닛의 개방된 작업에서 발생하는 것으로서 기술하는 광범위한 단편화 과정보다는, 폐쇄된 프로세싱 시스템에서 일어난다.
본 발명에 대한 출발 물질이 무균 키트에서 무균성 조건 하에서 보존되기 때문에, 냉동보존된 종양 세포 현탁액에 대해 실행될 수 있는 전체 제조 과정은 높은 용량 및 효율로 예정되고 실행될 수 있다. 대조적으로, '734 특허는 냉동되지 않은 조직으로 시작하기 때문에, 단편화 및 "성장" 단계가 대기 상태로 실행되며 용량 활용의 효율이 더 낮다. '734 특허에서 이런 중간 동결 단계를 제거하면 전체적인 제조 과정을 단축시키지만, 전체 과정이 대기 상태로 작동되는 것을 의미하여, 어떠한 지연이 있을 수 없고 제조 중단 기간을 계획하는 것이 과정 중의 모든 제품이 완료되고 새로운 수술이 중단되어야 할 것을 필요로 할 것이기 때문에 제조 중단 시간이 '734 특허의 제조 시설에 상당한 영향을 나타내는 것을 의미한다.
본 출원의 과정의 장점은 절제된 종양 형태의 조직이 TIL 치료법을 필요로 하기 전에 수집되고, 수송되고, 프로세싱되며, 냉동보존될 수 있고 제조가 필요할 때까지 그리고 제조가 필요하면 무균 키트에 보관될 수 있어서 초기 단계 질환을 가진 환자가 대체 요법을 받으면서 수득되고 보관될 수 있다는 것이다. 따라서, 종양 수집 및 후속되는 제조의 시기 또는 지리적 위치에 영향이 거의 또는 전혀 없다. 반면에 '734 특허에서는, 이것은 가능하지 않으며 세포가 동결 및 유지되기 전에 의약품의 전체 제조가 발생해야 한다.
상기에서 언급된 것과 같이, 이것들은 25-200 x 106 ('734 특허) 대비 1-20 x 106 (본 발명)의, REP 배양을 시딩하기 위해 필요한 세포의 매우 상이한 수에서 반영되는 바, REP 배양이 시작될 세포의 상이한 집단을 생성할 매우 상이한 배양 과정이다. 본 발명에서 초기 TIL 팽창 중에 배양 시딩은 청크(chunk) (즉 신생 T 세포)로부터의 파생물에 대비히여 세포 현탁액 (즉 상주하는 세포와 신생 T 세포의 혼합물일 분해되고 냉동보존된 세포 중에서 성장하는 세포)을 사용하며; 이것은 REP가 신생 T 세포로 시딩되지 않는 것을 의미한다. 더불어, 본 발명은 고체 및 유연한 폐쇄된 용기를 둘 다 활용할 수 있고 유연한 용기는 '734 특허에서 정의된 청크의 수보다는 오히려 유래된 종양 현탁액의 양을 토대로 한 보다 최적의 환경을 가능하게 한다.
전이성 종양 물질은 외과 수술실 내에서 표준 외과 관행을 사용하여 외과적으로 제거된다. 분해 전에 관계 없는 물질 (즉 육안으로 규정된 비-종양 물질)은 제거되며 종양 물질은 멸균 백으로 옮겨진다.
다음이 종양 출발 물질 허용 테스트에 포함될 수 있다. 첫째, 공급원 조직이 종양 물질인 것이 확인된다. 둘째, 분해된 조직의 대표적인 샘플이 미생물 로드에 대해 평가되고 존재하는 항생물질 민감성이 규정되는 경우 (제조는 항생물질을 사용하는 위험 상태에서 수행될 수 있음) 최종 물질은 미생물 성장에 대해 음성이어야 한다. 셋째, TIL 및 종양 세포의 양 및 생존 능력이 유동 세포분석에 의해 평가될 수 있다.
발명의 방법은 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해하고 그로써 분해된 종양을 생성하는 단계를 포함하며, 절제된 종양은 만약 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해된 것이다. 유리한 구체예에서, 반자동 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서가 분해를 제어할 수 있어서 분해 유연한 용기 내의 표면이 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하는 것을 가능하게 한다 (예컨대, PCT 공보 번호 WO 2018/130845 참고). 분해 표면은, 예를 들어, 기계식 피스톤에 의해 제어될 수 있다.
효소적 소화를 위해, 세포 현탁액 (T 세포 및 종양 세포를 모두 함유함)이 절제된 전이성 종양으로부터 DNase 1과 콜라게나제 (유형 IV)의 효소 혼합물을 사용하여 생성된다. 반복된 기계적 압축의 조합으로 효소가 접근하기 위한 추가적인 표면이 노출되고 효소적 반응은 선택적인 냉동보존 전에 고형 조직을 세포 현탁액으로 바꾸는 과정을 가속화한다. 한 구체예에서 분해 단계의 완료시 DMSO 기반 냉동보호제가 속도 제어 동결 사이클 직전에 첨가된다. 일부 구체예에서, 고형 조직의 효소적 붕괴는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물과 같은 하나 이상의 배지 효소 용액의 선택 및 제공에 의해 이루어질 수 있다. 절제된 전이성 종양의 효소적 소화는 반자동 장치의 분해 유연한 용기에서 일어날 수 있다.
예를 들자면, 분해 과정에 효소적 소화가 보충되는 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 효소적 소화를 위한 배지 제제는 세포 대 세포 경계가 파괴되는 것을 유발하는 단백질 붕괴를 돕는 효소로 보충되어야 한다.
세포 배양 또는 세포 취급 기술분야에 알려져 있는 다양한 액체 제제가 세포 분해 및 고형 조직의 효소적 소화를 위해 사용된 액체 제제로서 사용될 수 있고, 한정하는 것은 아니지만 다음 배지 중 하나 이상을 포함한다: 장기 보존 용액, 선택적 용해 용액, PBS, DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, 이스코브 배지, XVIVOTM, AIM-VTM, 락테이트 첨가된 링거액, 링거 아세테이트, 식염수, PLASMALYTETM 용액, 결정질 용액 및 IV 유체, 콜로이드 용액 및 IV 유체, 물 중의 5% 덱스트로스 (D5W), Hartmann 용액DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, AIM-VTM, 이스코브 배지, XVIVOTM, 각각은 세포 회수 및 생존 또는 특정 세포 고갈을 돕기 위해 우태아 혈청, 인간 혈청 또는 혈청 대체물 또는 다른 영양소 또는 사이토카인과 같은 추가적인 세포 지지 인자로 선택적으로 보충될 수 있다. 배지는 상기 언급된 배지 또는 예컨대 일차 인간 세포 배양을 위한 (예컨대 내피 세포, 간세포 또는 각질 형성 세포를 위한) 또는 줄기 세포를 위한 (예컨대 수지상 세포 성숙화, 조혈 팽창, 각질 형성 세포, 간엽 줄기 세포 또는 T 세포) 특수 배지와 같은 표준 세포 배지일 수 있다. 배지는 기술분야에 잘 알려져 있는 보충물 또는 시약, 예컨대 알부민 및 수송 단백질, 아미노산 및 비타민, 금속 이온(들), 항생물질, 부착 인자, 탈착 인자, 계면활성제, 성장 인자 및 사이토카인, 호르몬 또는 안정화제를 가질 수 있다. 다양한 배지는 예컨대 ThermoFisher, Lonza, 또는 Sigma-Aldrich 또는 유사한 배지 제조사 및 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
효소적 소화에 필요한 액체 제제는 적어도 0.1 mM 내지 최대 50 mM로 존재하는 충분한 칼슘 이온을 가져야 하며 최적 농도 범위는 2 내지 7 mM, 이상적으로는 5 mM이다.
소화될 고형 조직은 분해 후에 킬레이트화제 EGTA 및 EDTA를 함유한 액체 제제로 세척되어 부착 인자 및 억제 단백질이 세척 전에 제거되고 효소적 소화 전에 EDTA 및 EGTA가 제거된다.
효소적 소화에 필요한 액체 제제는 효소 안정성 및 활성에 필요한 칼슘 이온을 제거함으로써 효소 활성을 심각하게 억제할 수 있는 최소 킬레이트화제 EGTA 및 EDTA로 보다 최적이 된다. 더불어, β-머캅토에탄올, 시스테인 및 8-하이드록시퀴놀린-5-설포네이트가 다른 알려져 있는 억제 물질이다.
해부, 효소적 소화 및 균질화를 사용한 종양 물질의 프로세싱로 TIL, 특히 UTIL의 단일 세포 현탁액이 생성되며, 그것은 TIL, 특히 UTIL의 제1 집단을 얻기 위한 IL-2에서의 TIL, 특히 UTIL의 세포 현탁액의 첫 번째 팽창을 통한 후속 프로세싱을 위해 출발 물질을 안정화시키기 위해 직접 냉동보존될 수 있다.
방법은 또한 분해된 종양, 예컨대 세포 현탁액을 냉동보존하는 단계를 포함한다. 분해된 종양을 냉동보존하는 단계는 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계를 수행하는 날과 같은 날에 수행되며, 절제된 종양은 만약 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해된 것이다. 예를 들어, 냉동보존은 종양의 분해 단계 후 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90분 후에, 또는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22시간 후에 수행된다. 반자동 장치의 분해 모듈에서 효소적 분해로부터 얻어진 단일 세포 현탁액으로서 분해된 종양의 냉동보존은 8℃ 내지 적어도 -80℃ 이하의 온도에서 현탁액을 냉각 및/또는 유지함으로써 수행된다. 분해는 5분 정도로 빠를 수 있지만 보통 45분 내지 1시간일 수 있고 냉동보존은 60분 또는 최대 150분으로 빠를 수 있다. 한 구체예에서, 방법은 냉동보존된 분해된 종양을 보관하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 기술되는 바, 장치는 냉동보존을 위한 적어도 하나의 세포 용기를 포함하고 용기는 탄력 있는 변형 물질로부터 제조된 유연한 용기이다. 장치의 이런 구체예에서, 최종 용기는 -20 to -190℃의 냉동고로 직접 옮겨지거나 또는 장치와 결합되어 있거나 별도로 공급된 속도 제어 동결 기구 (예를 들어 Planer Products 또는 Asymptote Ltd에 의해 제작됨)에 보다 최적으로 위치할 수 있고, 여기서 풍부해진 분해된 고형 조직 용기를 포함하기 위해 사용된 동결실 및 유연한 보관 용기(들)의 온도는: 저온 가스 (일반적으로 질소, 예를 들어 Planer 제품)를 주입함으로써; 또는 제어된 냉각 표면(들)으로부터 열을 제거함으로써 제어된다. 두 방법 모두 동결 용액 및 생성물의 원하는 생존 능력을 토대로 동결될 특정 세포(들)에 대해 필요한 속도로 동결 과정을 1℃ 미만 또는 보다 바람직하게는 0.1℃ 미만의 오차로 정확하게 제어하는 능력을 초래한다. 이런 냉동보존 과정은 이상적으로는 동결 용액의 용융 온도에 가능한 가까운 얼음 핵형성 온도를 고려해야 한다. 수성 용액에서의 결정 성장이 있은 후에, 물이 얼음으로서 시스템으로부터 제거되고, 잔류하는 비동결 용액의 농도가 증가한다. 온도가 낮아짐에 따라, 더 많은 얼음이 형성되어 잔류하는 비동결 분획이 감소하며 추가로 농도가 증가한다. 수성 용액에는 얼음이 농축된 수성 용액과 공존하는 큰 온도 범위가 존재한다. 결국 온도 감소를 통해 용액은 유리 전이 상태에 도달하고 그 지점에서 동결 용액 및 세포는 점성 용액으로부터 고체-유사 상태로 이동하며 이 온도 아래에서 세포는 추가의 생물학적 변화를 진행할 수 없고 따라서 필요할 때까지, 잠재적으로 수십년 동안 안정화된다.
얼음 핵형성 및 결정 성장은 동결 용액 및 세포 미세환경으로의 열의 방출을 포함하고 동결 유체가 상 변화를 겪는 한편 온도 변화에 저항하더라도 세포 및 동결 용액의 냉각을 유지하는 것이 바람직하다. 분해가 효소적 분해를 포함하는지의 여부, 및 주어진 효소, 효소 농도 및 조직 유형에 대한 효소적 소화의 최적 온도가 어떤지에 따라, 냉동보존이 시작하는 온도는, 제한 없이, 40℃, 39℃, 38℃, 37℃, 36℃, 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 및 20℃, 즉, 포유류 체온으로부터 실온까지의 범위의 온도를 포함하고, 추가로 제한 없이, 10℃, 8℃, 6℃, 5℃, 4℃, 3℃, 및 2℃와 같은 더 낮은 냉장 온도를 포함한다. 극저온 냉각을 위한 목표 온도는, 제한 없이, -60℃, -65℃, -70℃, -75℃, -80℃, -85℃, -90℃, 및 액체 질소 증기 저장 온도 (-195.79℃)로까지 더 낮은 온도뿐만 아니라 그 사이의 온도를 포함한다. 특정 구체예에서, 발명에 따라 사용된 방법 및 장치는 생리적 온도 또는 소화 온도로부터 냉동보관 온도까지의 시간을 최소화하기 위해 설계 또는 프로그래밍된다. 특정 구체예에서, 냉동보존을 위해 발명에 따라 사용된 방법 및 장치는, 배지가 결정화됨에 따라 세포를 포함한 환경에, 환경으로, 환경 주변에 또는 환경에서 열 방출이 최소화되거나 회피되는 조건 하에서 냉각을 위해 유리하게 설계되고 프로그래밍된다. 특정 구체예에서, 분해 온도로부터 극저온 목표 온도까지 연속적인 냉각을 위해 방법이 설계되고 및/또는 장치가 프로그래밍된다. 예시의 프로그래밍된 냉각 속도로는, 제한 없이, -0.5℃/분, -1℃/분, -1.5℃/분, -2℃/분, 또는 -2.5℃/분을 들 수 있다. 냉각 속도는 프로그램 목표이며 냉각 사이클 동안 달라질 수 있다. 냉각 속도는, 예를 들어 ± 0.1℃/분, ± 0.2℃/분, ± 0.3℃/분, ± 0.4℃/분, 또는 ± 0.5℃/분으로 달라질 수 있다. 발명의 구체예에서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1.5℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상체/환자에게 투여시 복제 사이클을 증가시킬 수 있는 신생(young) TIL을 얻는 것을 제공하며 그로써 오래된 TIL (즉, 대상체/환자에게 투여하기 전 더 많은 회기의 복제를 추가로 진행한 TIL)보다 추가적인 치료 이익을 제공할 수 있다. 신생 TIL의 특징은 문헌에, 예를 들어 Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); 및 Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)에 기재되어 있고, 이것들은 전부 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한된, 그러나 많은 수의 유전자 분절의 체세포성 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (연합), 및 C (불변)은 면역글로불린 및 T 세포 수용체 (TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내며 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 얻어진 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 얻어진 TIL은 새롭게 수득된 TIL 및/또는 그들이 제공하는 것과 다른 방법을 사용하에 제조된 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 얻어진 TIL은 새롭게 수득된 TIL 및/또는 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로 얻어진 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 구체예에서, 다양성은 T 세포 수용체. 일부 구체예에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 알파의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 베타의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현에 증가가 있다.
발명의 방법은 또한 TIL, 특히 UTIL의 제1 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 분해된 종양을 배양함으로써 제1 팽창을 수행하는 단계를 포함한다. 상기 기술된 단계로부터 결과적으로 생성된 세포는 종양 및 다른 세포보다 TIL의 성장에 유리한 조건 하에서 IL-2를 함유한 혈청에서 배양된다. 일부 구체예에서, 종양 소화물은 6000 IU/mL의 IL-2가 있는 비활성화된 인간 AB 혈청을 포함한 배지에서 2 mL 웰에서 인큐베이션된다. 이 일차 세포 집단은 수일의 기간, 일반적으로 3 내지 14일 동안 배양되어, 결과적으로 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108의 벌크 TIL 세포가 생성된다. 일부 구체예에서, 이 일차 세포 집단은 7 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 결과적으로 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포가 생성된다. 일부 구체예에서, 이 일차 세포 집단은 10 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 결과적으로 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포가 생성된다. 일부 구체예에서, 이 일차 세포 집단은 약 11일의 기간 동안 배양되어, 결과적으로 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포가 생성된다.
바람직한 구체예에서, TIL의 팽창은 하기 기술되는 초기 벌크 TIL 팽창 단계와, 이어서 하기 및 본원에서 기술된 제2 팽창 (급속 팽창 프로토콜 (REP) 단계 및 이어서 재자극 REP 단계를 포함함)을 사용하여 수행될 수 있다.
유리한 구체예에서, 냉동보존된 분해된 종양 조직은 해동되고 T 세포 배지 (다음의 첨가제 10% FBS 및 3000 IU/mL의 IL-2로 보충된, Immetacyte사 용으로 계약 제조된 T 세포 배양 배지)에서 1:9로 재현탁된 후 인라인 100-270 μm 필터를 통해 여과되고 50 mL 원심분리 튜브에서 원심분리된 후 20 mL에 재현탁된다. 샘플은 유동 세포분석적 분석을 위해 취해져서 HLA-A, B, C 및 CD58+, 및 DRAQ7- 세포의 수가 정량화될 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 대체 매뉴얼 (예컨대 한정하는 것은 아니지만 혈구계산기) 또는 한정하는 것은 아니지만 NucleoCounterTM; Guava®; 자동 혈액 분석 및 카운터; 한정하는 것은 아니지만 ScepterTM와 같은 피펫 기반 세포 카운터와 같은 대체 자동 총 생존 세포 계수 장치를 사용하여 시딩될 수 있다.
한 구체예에서, 재현탁된 냉동보존된 분해된 종양 조직은 종양 및 다른 세포보다 TIL의 성장에 유리한 조건 하에서 IL-2를 함유한 혈청에서 배양된다. 일부 구체예에서, 종양 소화물은 6000 IU/mL의 IL-2가 있는 비활성화된 인간 AB 혈청을 포함한 배지에서 (또는, 본원에서 개관된 일부 경우에, 인공 항원 제공 [aAPC] 세포 집단의 존재 하에) 2 mL 웰에서 인큐베이션된다. 이 일차 세포 집단은 수일, 일반적으로 10 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 결과적으로 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포가 생성된다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 중의 성장 배지는 IL-2 또는 그것의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, IL은 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)이다. 일부 구체예에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 20-30x106 IU/mg의 비활성을 가진다. 일부 구체예에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 20x106 IU/mg의 비활성을 가진다. 일부 구체예에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 25x106 IU/mg의 비활성을 가진다. 일부 구체예에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg 바이알에 대해 30x106 IU/mg의 비활성을 가진다. 일부 구체예에서, IL-2 스톡 용액은 4-8x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 가진다. 일부 구체예에서, IL-2 스톡 용액은 5-7x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 가진다. 일부 구체예에서, IL-2 스톡 용액은 6x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 IL-2를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-12, 약 400 IU/mL의 IL-12, 약 300 IU/mL의 IL-12, 약 200 IU/mL의 IL-12, 약 180 IU/mL의 IL-12, 약 160 IU/mL의 IL-12, 약 140 IU/mL의 IL-12, 약 120 IU/mL의 IL-12, 또는 약 100 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-12 내지 약 100 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-12 내지 약 100 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-12 내지 약 100 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-12를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 IL-12를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-12를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-18, 약 400 IU/mL의 IL-18, 약 300 IU/mL의 IL-18, 약 200 IU/mL의 IL-18, 약 180 IU/mL의 IL-18, 약 160 IU/mL의 IL-18, 약 140 IU/mL의 IL-18, 약 120 IU/mL의 IL-18, 또는 약 100 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-18 내지 약 100 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-18 내지 약 100 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-18 내지 약 100 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-18을 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 IL-18을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-18을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
또한 배양 배지로 고려되는 것은 인터류킨, 예컨대 한정하는 것은 아니지만, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21의 조합이다. IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21과 함께 다른 사이토카인, 예컨대 IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 또는 이것들의 조합도 또한 고려된다. 항체, 예컨대 Th2 차단 시약예컨대 한정하는 것은 아니지만, IL-4 (aIL4), 항-IL-4 (aIL4R), 항-IL-5R (aIL5R), 항-IL-5 (aIL5), 항-IL13R (aIL13R), 또는 항-IL13 (aIL13)이 또한 고려된다.
일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 1일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 3일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 4일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 5일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 6일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 7일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 8일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 9일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 10일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 11일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 12일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 13일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 1일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 2일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 3일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 4일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 5일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 6일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 7일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 8일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 9일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 10일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 11일 동안 진행될 수 있다.
일부 구체예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합이 제1 팽창 중에 조합으로서 사용된다. 일부 구체예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 그것들의 임의의 조합이 제1 팽창 중에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합이 제1 팽창 중에 조합으로서 사용된다.
일부 구체예에서, 제1 팽창은 폐쇄된 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템은 본원에 기술된 것과 같이, TIL 팽창을 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 구체예에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들면 G-REX-10 또는 G-REX-100이거나 또는 유리하게는 WO 2018/130845의 장치이다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
유리하게, 제2 TIL 집단으로서 언급된 제1 팽창으로부터 얻어진 TIL 집단은 제2 팽창 (때때로 REP로서 언급된 팽창을 포함할 수 있음)이 적용될 수 있다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 치료법에 사용될 경우에, 제1 TIL 집단 (때때로 벌크 TIL 집단으로서 언급됨) 또는 제2 TIL 집단 (일부 구체예에서 REP TIL 집단으로서 언급된 집단을 포함할 수 있음)은 팽창 전 또는 제1 팽창 후 제2 팽창 전에 적합한 프로세싱을 위해 유전자 변형이 적용될 수 있다.
렌티바이러스는 그것들이 분할 및 비분할 세포를 모두 변환시키는 능력으로 인해 효율적인 유전자 전달 비히클이다. 가장 철저하게 조사된 렌티바이러스 유전자 요법 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 타입 1로부터 유래된 것인 한편, HIV-2, SIV, 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스 (CAEV), 비스나 바이러스, 및 젬브라나병 바이러스 (JDV)를 포함한, 다른 영장류 및 비-영장류 렌티바이러스를 토대로 한 유전자 요법 벡터가 또한 개발되었다.
복제 결핍 바이러스 벡터는 잠재적으로 치명적인 바이러스로의 환자의 감염을 예방하는 데 필수적이다. 렌티바이러스 벡터는 보다 안전하고 보다 효율적이 되도록 개발되었다. 최근 제3 세대 벡터는 3가지 플라스미드 전체에서 도입유전자의 발현에 필수적인 나머지 유전자는 분할하면서 독성 및 병원성을 돕는 모든 부속 유전자를 제거하였다. 예컨대, 미국 특허 출원 공개 2006/0024274 참고.
EIAV 유전자 전달 벡터는 시험관내에서 증식 및 G1-정지된 세포를 형질도입하는데 효과적인 것으로 나타났다. Mitrophanous, et al., 1999. 비-영장류 렌티바이러스 벡터를 사용하는 신경계에 대한 안정적인 유전자 전달. Gene Ther. 6: 1808-1818; Olsen, J. C., 1998, 말 감염성 빈혈 바이러스로부터 유래된 유전자 전달 벡터. Gene Ther. 5 : 1481-1487; Olsen, J.C., 2001, EIAV, CAEV and Other Lentivirus Vector Systems, Somat Cell Mol Genet, Vol. 26, Nos. 1/6, 131-45.
Heemskerk, B. et al., 2008, 인터류킨-2를 분비하도록 유전자 조작된 종양-침윤 림프구를 사용하는 흑색종 환자에 대한 입양 세포 치료법. Human gene therapy, 19(5), 496-510에는 TIL 생존을 연장하기 위해 IL-2를 발현하도록 유전자 조작된 TIL이 기술되어 있다. 환자 TIL은 제1 팽창 중에 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV)를 토대로 한 레트로바이러스 벡터로 트랜스펙션된 후 제2 팽창되어 치료를 위해 충분한 수가 얻어졌다.
간단히 설명하면, 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 제어 하에 인간 IL-2 유전자의 cDNA 복사물을 가진 Moloney 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV)로부터 유래된 MFG 골격을 함유한 SBIL2 벡터가 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV) 엔벨로프 단백질을 제공하는 PG13 포장 세포주에서 슈도타이핑(pseudotyped )되었다. 통합된 레트로바이러스 IL-2 DNA의 3개의 복사물을 함유한 안정적인 생산자 클론 (PG13SBIL2#3)이 생성되었다. 임상 GMP-등급의 SBIL2 레트로바이러스 상층액은 인디애나 대학교 국립 유전자 벡터 연구소 (Indianapolis, IN)에 의해 제조되었다. TIL 형질도입을 위해, 6-웰 비-조직-배양 플레이트 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 레트로넥틴 (CH-296, 인산염 완충 식염수 [PBS] 중의 25 μg/ml, GMP 등급; Takara Bio, Otsu, Japan)으로 코팅하고, PBS-2% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 차단하고, 4시간 동안 해동된 SBIL2 바이러스 상층액 (5 ml/웰)으로 32℃ 및 10% CO2에서 사전로딩하였다. TIL은 3 ml/웰로 18-24시간 동안 37℃ 및 10% CO2에서 첨가되었고, 제2 세트의 SBIL2-로딩 플레이트로 옮겨져서 추가로 18-24시간 동안 배양된 후, TIL은 수득되고 신선한 배지에 재현탁되었다.
Zhang, L. et al., 2015, 전이성 흑색종의 면역요법을 위한 인터류킨-12를 암호화하는 유도성 유전자로 유전자 조작된 종양 침윤 림프구, Clinical Cancer Research 21(10), 2278-2288에는 종양 부위에서 IL-12를 선택적으로 분비하기 위해 유전자 조작된 TIL이 기술되어 있다. TIL은 활성화된 T 세포 (NFAT) 프로모터의 핵 인자에 의해 구동된 단일 사슬 IL12를 암호화하는 유전자를 운반하는 MSGV1 γ-레트로바이러스 벡터로 형질도입되었다.
MSGV-1은 쥐과 줄기 세포 바이러스 긴 말단 반복부를 이용하며 연장된 gag 영역 및 Kozak 서열을 함유하는 MSGV 벡터로부터 유래된다. 인간 단일 사슬 IL-12를 암호화하는 유전자는 IL-12 p40, 링커 G6S 및 NFAT 반응성 프로모터에 의해 구동된 IL-12 p35 순서로 합성되었고 5' LTR 방향과 반대로 MSGV-1 벡터에 삽입되었다. 고역가 PG13 세포 기반 생산자 세포주가 생성되었고 레트로바이러스 상층액은 우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준 (GMP) 조건 하에서 NCI 외과 지점 벡터 생산 설비 (Bethesda, MD)에 의해 제조되었다. 벡터 상층액은 임상 적용을 위한 재조합 감마-레트로바이러스 벡터의 생산에 대한 현재 요구되는 모든 미국 식품의약국 지침으로 테스트되고 통과하였다.
형질도입 과정은 종양-침윤 림프구 (TIL)를 30 ng/ml 항-CD3 mAb 오르토클론 OKT3 (Centocor Ortho Biotech, Raritan, NJ), 3000IU/ml 재조합 인간 IL-12 및 4 Gy 조사된 동종 PBMC 공급기 세포로 모든 TIL에 대해 200 공급기 세포의 비율로 자극함으로써 개시되었다. 세포는 형질도입을 위해 4일 및/또는 5일 째에 레트로넥틴 (CH-296; Takara Bio Inc., Otsu, Japan) 코팅된 비-조직 배양 6-웰 플레이트를 사용하여 수득되었다. 벡터 상층액은 2000 g에서 2시간 동안 32℃에서 원심분리에 의해 코팅된 플레이트 상에 "스핀 로딩"되었다. 레트로바이러스 벡터 상층액이 웰로부터 흡인되고 2x106 자극된 TIL 세포가 각 웰에 첨가된 후 1000 g에서 10분 동안 원심분리되었다. 플레이트는 37℃에서 밤새 인큐베이션되었고 세포는 두 번재 형질도입을 위해 다음날 수득되었다. 첫 번째 21명의 환자에 대한 세포는 2회의 형질도입을 받았다. 12명의 환자에 대한 세포는 단 한번의 형질도입을 받았다.
Jones, S. et al., 2009, 말초혈 림프구 및 종양 침윤 림프구의 형질도입에서 최적의 T 세포 수용체 유전자 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 설계. Human gene therapy, 20(6), 630-640에는 형질도입된 T 림프구에서 유전자를 발현하고 효과적인 항종양 T 세포를 구성하기 위하여 렌티바이러스 벡터에 사용하기 위한 프로모터의 개발이 기술되어 있다.
TIL은 외과적 표본으로부터 얻어졌다. PBL은 -180℃에서 보관된 동결된 스톡으로부터 해동되어 300 IU/ml로 AIM-V 및 인터류킨-2 (IL-2; Cetus, Emeryville, CA)의 배양에 넣어졌다. OKT3 자극을 위해, 세포는 처음에 항-CD3 항체, OKT3 (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ)이 있는 배지에 50 ng/ml로 넣어지거나, 또는 배양 배지를 처음 교환할 때 형질도입 후 OKT3 배지에 넣어졌다. PBL 또는 TIL의 형질도입을 위해, 1 x 106 세포가 바이러스 상층액 및 폴리브렌 (최종 농도, 8 μg/ml)이 들어 있는 24-웰 조직 배양-처리된 플레이트에 1 ml의 최종 부피로 조정되었다. 세포는 플레이트를 1.5시간 동안 1000 x g, 32℃에서 원심분리함으로써 형질도입되었다. 플레이트는 37℃, 보습 5% CO2 인큐베이터에 밤새 넣어졌고, 배지는 다음날 교체되었다. TIL은 이전에 기술된 것과 같이, OKT3 (50 ng/ml), IL-2 (5000 IU/ml), 및 3개의 상이한 도너로부터의 조사된 동종 말초혈 단핵 세포를 사용하여 급속 팽창 프로토콜 (REP)이 실행되었다 (TIL:공급기 비율, 1:100). REP 후 6일 후에, TIL은 기술된 것과 같이 형질도입되고 배양으로 복귀되었다.
Beane, J. D. et al., 2015, 전이성 흑색종의 치료를 위한 종양 침윤 림프구에서의 PD-1의 임상 규모 아연 핑거 뉴클레아제-매개된 유전자 편집. Molecular therapy: 23(8), 1380-1390에는 PD-1 특이적 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)-매개된 유전자 편집을 암호화하는 mRNA의 전기천공에 의한 PD-1의 임상 규모 유전자 편집이 기술되어 있다.
입양 세포 전달을 위한 충분한 수의 형질도입된 T 세포를 생성하기 위하여, TIL은 REP.46을 사용하여 증식하도록 유도되었다. 간단히 설명하면, 1 x 107 TIL이 1 x 109 동종, 조사된 (5,000 rad) 말초혈 단핵 세포 (PBMC)와 조합되고, 이들 세포는 30 ng/ml의 OKT3을 함유한 400 ml의 T 세포 배지에 현탁되었다. 세포는 G-Rex100 플라스크에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 5일 후, 200 ml의 배지가 흡인되었고 교체되었다. REP를 시작하고 7일 후, TIL이 수득되어 Hyclone 전기천동 완충액 (Hyclone Laboratories, Logan, UT)으로 2회 세척되었다. 그런 후 세포는 계수되었고 전기천공 완충액에 1 x 108/ml의 농도로 재현탁되었다. 그런 후 세포는 MaxCyte CL-2 프로세싱 어셈블리에 전달되고 120 μg/ml의 PD-1 ZFN mRNA (또는 GFP 트랜스펙션된 TIL/GFP에 대한 GFP mRNA)와 혼합되었다. 전기천공은 MaxCyte 프로토콜에 따라 수행되었다. 전기천공 후, TIL은 프로세싱 어셈블리로부터 T-175 플라스크로 전달되고 37℃에서 20분 동안 인큐베이터에 넣어졌다. 이 인큐베이션 단계 후에, TIL은 AIM-V 배지에 1 x 106/ml의 농도로 재현탁되었다. 그런 후 세포는 이전에 기술된 것과 같이 밤새 저온 인큐베이션을 위해 30℃에서 설정된 인큐베이터에 넣어졌다. 다음날, TIL은 37℃ 인큐베이터에 넣어졌고 REP 10일 (전기천공 후 3일)까지 방해받지 않은 채로 놓아두었다.
일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 얻어진 TIL은 선택을 위해 표현형이 지정될 때까지 보관된다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 얻어진 TIL은 보관되지 않고 직접 제2 팽창이 진행된다. 그러므로, 방법은 TIL, 특히 UTIL의 제1 집단을, TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 추가적인 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 얻어진 TIL은 제1 팽창 후 및 제2 팽창 전에 냉동보존된다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 3일, 4,일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 후에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 3일 내지 21일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 4일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 4일 내지 10일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 7일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 약 14일 후에 발생한다. 일부 구체예에서 REP 배양의 시딩은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일에 발생한다.
일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 1일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 TIL 팽창은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 3일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 4일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 5일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 6일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 7일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 8일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 9일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 10일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 11일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 12일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 13일 내지 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 14일 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 14일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 1일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 2일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 3일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 4일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 5일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 6일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 7일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 8일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 9일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 10일 내지 11일에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동된 후 11일에 발생한다.
일부 구체예에서, TIL은 제1 팽창 후 및 제2 팽창 전에 보관되지 않으며, TIL은 직접 제2 팽창으로 진행된다. 일부 구체예에서, 이행은 본원에 기술된 폐쇄된 시스템에서 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터의 TIL, TIL의 제2 집단은 이행 기간 없이 직접 제2 팽창으로 진행된다.
일부 구체예에서, 제1 팽창으로부터 제2 팽창으로의 이행은 폐쇄된 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템은 본원에 기술된 것과 같이 TIL 팽창을 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 구체예에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어 G-REX-10 또는 G-REX-100 또는 Xuri WAVE 생물반응기이다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
일부 구체예에서, TIL 세포 집단은 수득 및 초기 벌크 프로세싱 후에 수가 팽창된다. 이런 추가의 팽창은 본원에서 제2 팽창으로서 언급되며, 일반적으로 기술분야에서 급속 팽창 과정으로서 언급되는 것을 포함할 수 있다. 제2 팽창은 일반적으로 공급기 세포, 사이토카인 공급원, 항-CD3 항체, 가스 투과성 또는 가스 교환 용기를 포함한, 많은 구성요소를 포함하는 배양 배지를 사용하여 이루어진다.
일부 구체예에서, TIL의 제2 팽창 또는 제2 TIL 팽창은 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 알려져 있는 임의의 TIL 배양 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 7일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 8일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 9일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 10일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 11일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 12일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 TIL 팽창은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
구체예에서, 제2 팽창은 본 개시의 방법을 사용하여 가스 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-7 (IL-7) 또는 인터류킨-15 (IL-15); IL-12의 존재 하에 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 급속하게 팽창될 수 있다. 비-특이적 T 세포 수용체 자극으로는, 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 단클론성 항-CD3 항체 (Ortho-McNeil, Raritan, N.J. 또는 Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.로부터 상업적으로 이용 가능함) 또는 UHCT-1 (BioLeg단부, San Diego, Calif., USA로부터 상업적으로 이용 가능함)을 들 수 있다. TIL은 제2 팽창 중에, 벡터로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들)를 포함하여 하나 이상의 항원, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩타이드, 예컨대 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)을, 선택적으로 T 세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에 포함함으로써 시험관내에서 TIL의 추가의 자극을 유도하기 위하여 팽창될 수 있다. 다른 적합한 항원으로는, 예컨대, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그것들의 항원성 부분을 들 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원 제공 세포 상에 펄스된 암의 동일한 항원(들)로의 재자극에 의해 급속하게 팽창될 수 있다. 대안으로, TIL은 추가로, 예컨대, 예를 들어, 조사된, 자가 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다. 일부 구체예에서, 재자극은 제2 팽창의 일부로서 발생한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 조사된, 자가 림프구의 존재 하에 또는 조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2로 발생한다.
구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 IL-2를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 100 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 500 IU/mL, 약 600 IU/mL, 약 700 IU/mL, 약 800 IU/mL, 약 900 IU/mL, 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
구체예에서, 세포 배양 배지는 OKT3 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT3 항체를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합이 제2 팽창 중에 조합으로서 사용된다. 일부 구체예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21뿐만 아니라 그것들의 임의의 조합이 제2 팽창 중에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합이 제2 팽창 중에 조합으로서 사용된다. 일부 구체예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21뿐만 아니라 그것들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 제2 팽창은 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 공급기 세포를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 보충된 세포 배양 배지에서 발생한다. 일부 구체예에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 공급기 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC; 또한 항원 제공 공급기 세포로도 언급됨)를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 세포 배양 배지 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 공급기 세포 (즉, 항원 제공 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 발생한다.
일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 IL-15를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 IL-21을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 구체예에서 항원 제공 공급기 세포 (APC)는 PBMC이다. 구체예에서, 급속 팽창 및/또는 제2 팽창에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제공 세포의 비율은 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 구체예에서, 급속 팽창 및/또는 제2 팽창에서 TIL 대 PBMC의 비율은 1 대 50 내지 1 대 300이다. 구체예에서, 급속 팽창 및/또는 제2 팽창에서 TIL 대 PBMC의 비율은 1 대 100 내지 1 대 200이다.
구체예에서, REP 및/또는 제2 팽창은 150 mL의 배지에서 100- 또는 200-배 과잉량의 비활성화된 공극기 세포, 30 mg/mL의 OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL의 IL-2과 혼합되는 벌크 TIL이 들어 있는 플라스크에서 수행된다. 배지 교체는 세포가 대체 성장 챔버로 옮겨질 때까지 실시된다 (일반적으로 호흡을 통해 신선한 배지로 2/3 배지가 교체됨). 대체 성장 챔버는 G-REX 플라스크 및 아래에서 보다 자세하게 논의되는 가스 투과성 용기를 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 팽창 (REP 과정으로 언급되는 과정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의되는 것과 같이 7-14일로 단축된다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 11일로 단축된다.
구체예에서, REP 및/또는 제2 팽창은 T-175 플라스크 및 이전에 기술된 가스 투과성 백을 사용하여 (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) 또는 가스 투과성 배양기구 (G-Rex 플라스크)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 팽창 (급속 팽창으로서 언급된 팽창을 포함함)은 T-175 플라스크에서 수행되고, 150 mL의 배지에 현탁된 약 1x106 TIL이 각각의 T-175 플라스크에 첨가될 수 있다. TIL은 IL-2의 mL당 3000 IU 및 mL당 30 ng의 항-CD3이 보충된, CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양될 수 있다. T-175 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션될 수 있다. 배지의 절반은 mL당 3000 IU의 IL-2가 있는 50/50 배지를 사용하여 5일 째에 교환될 수 있다. 일부 구체예에서, 7일 째에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포가 3 L 백에 조합될 수 있고 5% 인간 AB 혈청 및 mL당 3000 IU의 IL-2와 함께 300 mL의 AIM V가 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가되었다. 각각의 백의 세포의 수가 매일 또는 또는 격일로 계수되었고 신선한 배지가 첨가되어 세포 수를 0.5 내지 2.0x106 세포/mL로 유지하였다.
구체예에서, 제2 팽창은 100 cm 가스 투과성 실리콘 바닥이 있는 500 mL 용량의 가스 투과성 플라스크 (G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, Minn., USA로부터 상업적으로 이용 가능함)에서 수행될 수 있고, 5x106 또는 10x106 TIL이 PBMC와 함께 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2 및 ml당 30 ng의 항-CD3 (OKT3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션될 수 있다. 5일 째에, 250 mL의 상층액이 제거되어 원심분리 병에 넣어져서 1500 rpm (491xg)에서 10분 동안 원심분리될 수 있다. TIL 펠릿은 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2가 있는 150 mL의 신선한 배지로 재현탁될 수 있고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 팽창될 때, 7일 째에 각각의 G-Rex 100의 TIL은 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁될 수 있으며 세포 현탁액은 3개의 100 mL 부분표본으로 나누어져 3개의 G-Rex 100 플라스크를 시딩하기 위해 사용될 수 있다. 그런 후 5% 인간 AB 혈청 및 mL당 3000 IU IL-2가 있는 150 mL의 AIM-V가 각각의 플라스크에 첨가될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션되고 4일 후 mL당 3000 IU IL-2가가 있는 150 mL의 AIM-V가 각각의 G-REX 100 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포는 배양 14일 째에 수득될 수 있다.
구체예에서, 제2 팽창 (REP로 언급된 팽창을 포함함)은 150 ml 배지에서 100- 또는 200-배 과잉의 비활성화된 공급기 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합되는 벌크 TIL이 있는 플라스크에서 수행된다. 일부 구체예에서, 배지 교체는 세포가 대체 성장 챔버로 옮겨질 때까지 실시된다. 일부 구체예에서, 배지의 2/3가 신선한 배지로의 호흡에 의해 교체된다. 일부 구체예에서, 대체 성장 챔버는 G-REX 플라스크 및 아래에서 보다 자세하게 논의되는 가스 투과성 용기를 포함한다.
구체예에서, 제2 팽창 (REP로 언급된 팽창을 포함함)이 수행되고 TIL이 우수한 종양 반응성에 대해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 기술분야에 알려져 있는 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0010058 A1에서 기술된 방법이 우수한 종양 반응성에 대해 TIL을 선택하기 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존 능력 검정은 제2 팽창 (REP로서 언급된 팽창을 포함함) 후에, 기술분야에 알려져 있는 표준 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립신 블루 추출 검정이 벌크 TIL의 샘플에 대해 실행될 수 있으며, 그것은 죽은 세포를 선택적으로 표지화하여 생존 능력 평가를 할 수 있게 한다. 일부 구체예에서, TIL 샘플은 계수되고 생존 능력은 Cellometer K2 자동 세포 카운터 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, Mass.)를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, TIL의 제2 팽창 (REP로 언급된 팽창을 포함함)은 T-175 플라스크 및 이전에 기술된 가스 투과성 백을 사용하여 (Tran K Q, Zhou J, Durflinger K H, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, 및 Dudley M E, Wunderlich J R, Shelton T E, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) 또는 가스 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 가스 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 제2 팽창은 T-175 플라스크에서 수행되며, 약 1x106 TIL이 약 150 mL의 배지에 현탁되고 이것이 각각의 T-175 플라스크에 첨가된다. TIL은 "공급기" 세포로서 조사된 (50 Gy) 동종 PBMC와 함께 1 대 100의 비율로 배양되며 세포는 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된, CM 및 AIM-V 배지 (50/50 배지)의 1 대 1 혼합물에서 배양되었다. T-175 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 배지의 절반이 5일 째에 3000 IU/mL의 IL-2가 있는 50/50 배지를 사용하여 교환된다. 일부 구체예에서, 7일 째에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포가 3 L 백에 조합될 수 있고 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2와 함께 300 mL의 AIM V가 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가된다. 각각의 백의 세포의 수가 매일 또는 또는 격일로 계수될 수 있고 신선한 배지가 첨가되어 세포 수가 0.5 내지 2.0x106 세포/mL로 유지될 수 있다.
일부 구체예에서, 제2 팽창 (REP로 언급된 팽창을 포함함)은 100 cm2 가스 투과성 실리콘 바닥이 있는 500 mL 용량의 플라스크 (G-Rex 100, Wilson Wolf)에서 수행되고, 약 5x106 또는 10x106 TIL이 조사된 동종 PBMC와 함께 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 1 대 100의 비율로 배양된다. G-Rex 100 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 5일 째에, 250 mL의 상층액이 제거되어 원심분리 병에 넣어져서 1500 rpm (491 g)에서 10분 동안 원심분리된다. 그런 후 TIL 펠릿은 3000 IU/mL의 IL-2가 있는 150 mL의 신선한 배지로 재현탁될 수 있고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 팽창되는 구체예에서, 7일 째에 각각의 G-Rex 100의 TIL은 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁되며 세포 현탁액은 3개의 100 mL 부분표본으로 나누어져 3개의 G-Rex 100 플라스크를 시딩하기 위해 사용된다. 그런 후 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2가 있는 150 mL의 AIM-V가 각각의 플라스크에 첨가된다. G-Rex 100 플라스크는 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션되고 4일 후 3000 IU/mL의 IL-2가가 있는 150 mL의 AIM-V가 각각의 G-REX 100 플라스크에 첨가된다. 세포는 배양 14일 째에 수득된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체가 한정되지만, 대다수의 유전자 분절의 체세포성 재조합에 의해 제조된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (연합), 및 C (불변)는 면역글로불린과 T 세포 수용체 (TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 얻어진 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성에서 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 제2 팽창으로 얻어진 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성에서 증가를 나타낸다. 일부 구체예에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 구체예에서, 다양성은 T 세포 수용체에 있다. 일부 구체예에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 알파의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, T 세포 수용체 (TCR) 베타의 발현에 증가가 있다. 일부 구체예에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현에 증가가 있다.
일부 구체예에서, 제2 팽창 배양 배지 (예컨대, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로서 언급됨)는 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제공 공급기 세포 (APC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 팽창은 폐쇄된 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템은 본원에 기술된 것과 같이 TIL 팽창을 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 구체예에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 G-REX-10 또는 G-REX-100 또는 유리하게는 WO 2018/130845의 장치이다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
구체예에서, 본원에 기술된 제2 팽창 과정,뿐만 아니라 REP로 언급된 것들)은 REP TIL 팽창 중에 및/또는 제2 팽창 중에 과잉의 공급기 세포를 필요로 한다. 많은 구체예에서, 공급기 세포는 건강한 혈액 기증자로부터의 표준 전혈 단위로부터 얻어진 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 피콜-파크(Ficoll-Paque) 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 얻어진다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 비활성화되고, REP 과정에 사용되어, 조사된 동종 PBMC의 복제 불능을 평가하기 위한 예시의 프로토콜을 제공한다.
일부 구체예에서, PBMC는 복제 불능인 것으로 여겨지며 만약 14일 째의 생존 세포의 총 수가 REP의 0일 째 및/또는 제2 팽창의 0일 째 (즉, 제2 팽창이 시작하는 날)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수보다 적으면 본원에 기술된 TIL 팽창 과정에 사용되는 것이 허용된다.
일부 구체예에서, PBMC는 복제 불능인 것으로 간주되며 만약 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된, 7일 및 14일 째의 생존 세포의 총 수가 REP의 0일 째 및/또는 제2 팽창의 0일 째 (즉, 제2 팽창이 시작하는 날)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가하지 않았다면 본원에 기술된 TIL 팽창 과정에 사용되는 것이 허용된다. 일부 구체예에서, PBMC는 30 ng/ml OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 구체예에서, PBMC는 복제 불능인 것으로 간주되며 만약 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된, 7일 및 14일 째의 생존 세포의 총 수가 REP의 0일 째 및/또는 제2 팽창의 0일 째 (즉, 제2 팽창이 시작하는 날)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가하지 않았다면 본원에 기술된 TIL 팽창 과정에 사용되는 것이 허용된다. 일부 구체예에서, PBMC는 5-60 ng/ml OKT3 항체 및 1000-6000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, PBMC는 10-50 ng/ml OKT3 항체 및 2000-5000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, PBMC는 20-40 ng/ml OKT3 항체 및 2000-4000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, PBMC는 25-35 ng/ml OKT3 항체 및 2500-3500 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 구체예에서, 항원 제공 공급기 세포는 PBMC이다. 일부 구체예에서, 항원 제공 공급기 세포는 인공 항원 제공 공급기 세포이다. 구체예에서, 제2 팽창에서 TIL 대 항원 제공 공급기 세포의 비율은 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 구체예에서, 제2 팽창에서 TIL 대 항원 제공 공급기 세포의 비율은 1 대 50 내지 1 대 300이다. 구체예에서, 제2 팽창에서 TIL 대 항원 제공 공급기 세포의 비율은 1 대 100 내지 1 대 200이다.
구체예에서, 본원에 기술된 제2 팽창 과정은 약 2.5x109 공급기 세포 대 약 100x106 TIL의 비율을 필요로 한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 제2 팽창 과정은 약 2.5x109 공급기 세포 대 약 50x106 TIL의 비율을 필요로 한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 제2 팽창 과정은 약 2.5x109 공급기 세포 대 약 25x106 TIL을 필요로 한다.
구체예에서, 본원에 기술된 제2 팽창 과정은 제2 팽창 중의 과잉의 공급기 세포를 필요로 한다. 많은 구체예에서, 공급기 세포는 건강한 혈액 기증자로부터의 표준 전혈 단위로부터 얻어진 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 피콜-파크 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 얻어진다. 구체예에서, 인공 항원 제공 (aAPC) 세포가 PBMC 대신 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 프로세싱을 통해 비활성화되고, TIL 팽창 과정에 사용된다.
구체예에서, 인공 항원 제공 세포가 PBMC에 대한 대체물로서, 또는 PBMC와 함께 제2 팽창에 사용된다.
본원에 기술된 팽창 방법은 일반적으로, 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2와 함께 배양 배지를 사용한다.
대안으로, 국제 공개 공보 WO 2015/189356 및 국제 공개 공보 WO 2015/189357 (분명하게 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 일반적으로 개관된 것과 같이 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합으로, 급속 팽창 및 또는 TIL의 제2 팽창을 위한 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하다. 그러므로, 가능한 조합으로는 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 들 수 있고, 후자는 많은 구체예에서 특별히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 림프구, 특히 본원에 기술된 것과 같이 T 세포의 생성에 특히 유리하다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 팽창 방법 (REP로서 언급된 것들 포함)에 사용된 배양 배지는 또한 항-CD3 항체를 포함한다. IL-2와 조합된 항-CD3 항체는 T 세포 활성화 및 TIL 집단에서의 세포 분열을 유도한다. 이런 효과는 전장 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편으로 볼 수 있으며, 일반적으로 전자가 바람직하다; 예컨대, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719 참고 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨).
기술분야에 숙련된 사람들에게 인정되는 바, 한정하는 것은 아니지만, 쥐과, 인간, 영장류, 래트, 및 개의 항체를 포함하여, 다양한 포유류로부터의 항-인간 CD3 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한, 발명에 사용될 수 있는 많은 적합한 항-인간 CD3 항체가 있다. 특정 구체예에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다 (Ortho-McNeil, Raritan, N.J. 또는 Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.로부터 상업적으로 이용 가능함).
제2 팽창 단계 후에, 세포가 수득될 수 있다. 일부 구체예에서 TIL은 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 팽창 단계 후에 수득된다. 일부 구체예에서 TIL은 2회의 팽창 단계 후에 수득된다.
TIL은 예를 들어 원심분리에 의한 것을 포함한, 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수득될 수 있다. TIL 수득 방법은 임의의 그러한 알려진 방법이 본 과정과 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, TIL은 자동 시스템을 사용하여 수득된다.
세포 수득기 및/또는 세포 프로세싱 시스템은 예를 들어, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, 및 Inotech Biosystems International, Inc를 포함한 다양한 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다. 임의의 세포 기반 수득기가 본 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 수득기 및/또는 세포 프로세싱 시스템은 막 기반 세포 수득기이다. 일부 구체예에서, 세포 수득은 세포 프로세싱 시스템, 예컨대 LOVO 시스템 (Fresenius Kabi사 제작)을 통해 이루어진다. 용어 "LOVO 세포 프로세싱 시스템"은 또한 멸균된 및/또는 폐쇄된 시스템 환경에서 스피닝 막 또는 스피닝 필터와 같은 막 또는 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌프질할 수 있어서, 연속적인 흐름 및 세포 프로세싱을 허용하여 상층액 또는 배양 배지를 펠릿화하지 않으면서 제거하는, 임의의 판매처에 의해 제작된 임의의 기구 또는 장치를 나타낸다. 일부 구체예에서, 세포 수득기 및/또는 세포 프로세싱 시스템은 폐쇄된, 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체-교환, 농축, 및/또는 다른 세포 프로세싱 단계를 수행할 수 있다.
일부 구체예에서, 수득은 폐쇄된 시스템 생물반응기로부터 수행된다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템이 본원에 기술된 TIL 팽창을 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 구체예에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 G-REX-10 또는 G-REX-100 또는 유리하게는 WO 2018/130845의 장치이다. 일부 구체예에서, 폐쇄된 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
세포는 환자에 대한 투여에 사용하기 위한 용기로 전달된다. 일부 구체예에서, 치료적으로 충분한 수의 TIL이 상기 기술된 팽창 방법을 사용하여 얻어진 후에, 그것은 환자에 대한 투여에 사용하기 위한 용기로 전달된다.
구체예에서, 본 개시의 APC를 사용하여 팽창된 TIL은 제약학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 구체예에서, 제약학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시의 PBMC를 사용하여 팽창된 TIL은 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 바람직하게 대략 30 내지 60분 지속되는 단일한 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여된다. 다른 적합한 투여 경로로는 복강내, 척수강내, 및 림프내를 들 수 있다.
구체예에서, 본 개시의 방법을 사용하여 팽창된 TIL은 제약학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 구체예에서, 제약학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시의 PBMC를 사용하여 팽창된 TIL은 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 바람직하게 대략 30 내지 60분 지속되는 단일한 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여된다. 다른 적합한 투여 경로로는 복강내, 척수강내, 및 림프내를 들 수 있다.
임의의 적합한 용량의 TIL이 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 특히 암이 흑색종인 경우 약 2.3x1010 내지 약 13.7x1010 TIL, 평균 약 7.8x1010 TIL이 투여된다. 구체예에서, 약 1.2x1010 내지 약 4.3x1010의 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 3x1010 내지 약 12x1010 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 4x1010 내지 약 10x1010 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 5x1010 내지 약 8x1010 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 6x1010 내지 약 8x1010 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 7x1010 내지 약 8x1010 TIL이 투여된다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 2.3x1010 내지 약 13.7x1010이다. 일부 구체예에서, 특히 암이 흑색종인 경우 치료적으로 효과적인 투여량은 약 7.8x1010 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 1.2x1010 내지 약 4.3x1010의 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 3x1010 내지 약 12x1010 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 4x1010 내지 약 10x1010 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 5x1010 내지 약 8x1010 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 6x1010 내지 약 8x1010 TIL이다. 일부 구체예에서, 치료적으로 효과적인 투여량은 약 7x1010 내지 약 8x1010 TIL이다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 수는 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010 2x1010 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 및 9x1013개이다. 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 수는 1x106 내지 5x106, 5x106 내지 1x107, 1x107 내지 5x107, 5x107 내지 1x108, 1x108 내지 5x108, 5x108 내지 1x109, 1x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 5x1012, 및 5x1012 내지 1x1013의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 농도는 예를 들어, 제약학적 조성물의 중량/중량, 중량/부피 또는 부피/부피 기준으로 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% 미만이다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 농도는 제약학적 조성물의 중량/중량, 중량/부피 또는 부피/부피 기준으로 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% 이상이다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 농도는 제약학적 조성물의 중량/중량, 중량/부피 또는 부피/부피 기준으로 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10%의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 농도는 제약학적 조성물의 중량/중량, 중량/부피 또는 부피/부피 기준으로 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9%의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 구체예에서, 발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 이상이다.
발명의 제약학적 조성물로 제공된 TIL은 광범위한 투여량 범위에 대해 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 주치의의 선호도 및 경험에 따라 달라질 것이다. 적절하다면 TIL의 임상적으로 확립된 투여량이 또한 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여된 제약학적 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유류, 장애 또는 상태의 중증도, 투여 속도, 활성 제약학적 성분의 소인 및 처방하는 의사의 재향에 다라 달라질 것이다.
일부 구체예에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 그러한 투여는 주사, 예컨대, 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 이상일 수 있다. 투약은 월 1회, 2주마다 1회, 주 1회, 또는 2일마다 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 한 계속될 수 있다.
일부 구체예에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 및 9x1013이다. 일부 구체예에서, TIL의 효과적인 투여량은 1x106 내지 5x106, 5x106 내지 1x107, 1x107 내지 5x107, 5x107 내지 1x108, 1x108 내지 5x108, 5x108 내지 1x109, 1x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 5x1012, 및 5x1012 내지 1x1013의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위 내에 있다.
TIL의 유효량은 비강내 및 경피 경로를 포함한, 유사한 이용성을 가진 작용제의 허용된 투여 방식 중 임의의 방식에 의해, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TIL, 특히 UTIL을 사용하는 진단 및 예측 검정을 수행하는 데 유용한 키트를 포함한다. 발명의 키트는 완충제, 사이토카인, 플라스크, 배지, 생성물 용기, 시약 및 지침을 포함한다.
종양으로부터 TIL 성장을 설정하고, 급속 팽창 과정을 설정하고, 조사된 PBMC 공급기가 팽창하지 않는 것과 정적 배양의 WAVE 생물반응기 (예컨대, https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/rocking-bioreactors/consumables-and-accessories/single-use-readytoprocess-wave-cellbag-bioreactors-p-00346#overview 참고)로의 전달 및 제형화 및 충전을 확인하기 위해 비제한적인 다중 단계 구체예가 아래에 제시된다.
단계 1 (0일)에서, 냉동보존된 분해된 종양 조직이 해동되고 10% FBS 및 3000 IU/mL IL-2가 보충된 T 세포 배양 배지에 1:9로 재현탁된 후 인라인 100-270 μm 필터를 통해 여과되고 50 mL 원심분리 튜브에서 원심분리된 후 20 mL에 재현탁된다. 샘플은 HLA-A, B, C 및 CD58+, 및 DRAQ7- 세포의 수를 정량화하기 위하여 유동 세포분석적 분석 SOP를 위해 채택된다.
단계 2에서, 세포 현탁액은 세포 배양 용기에서 항박테리아제 및 항진균제 (암포테리신 B & 겐타마이신)가 첨가되고 인터류킨-2 (IL-2) 1000IU/ml로 보충된 CM-T (10% 소 태아 혈청이 보충된 T 세포 배지)에 ≥0.25x106 내지 ≤0.75x106 HLA-A,B,C & CD58+ 및 DRAQ7- 세포/mL로 시딩된다. T 세포는 2주 기간에 걸쳐 CM-T에서 성장되며 5일부터 배지의 절반이 제거되고 10% 소 태아 혈청, 암포테리신 B & 겐타마이신 및 IL-2이 보충된 신선한 배지 CM-T로 교체된다. 이것은 세포가 ≤0.1x106 내지 2x106 CD45+ CD3+ 아넥신(Annexin)-V-ve DRAQ7-ve 세포/mL로 유지되는 것을 보장하기 위해 5 내지 10일 사이에 2/3일마다 반복된다. PH Eur 2.6.27에 의한 TIL 배양 상층액의 미생물 검사 테스트 (5-7일)는 미생물 성장이 없음을 확인시켜준다. 유동 세포분석 분석 (7-10일)으로 CD45+ CD3+ 아넥신-V- 및 DRAQ7- 세포의 농도를 정량화된다.
단계 3에서, 다중 동종 도너 (건강한 혈액 기증 유래된 버피 코트)로부터 피콜 (밀도 1.078 g/ml)로 4x109개의 조사된 PBMC (25 내지 50 Gy)가 분리된다. 유동 세포분석 분석으로 CD45+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포가 정량화된다. 조사된 PBMC의 미생물 검사 테스트로 미생물 성장이 측정된다.
단계 4에서, 급속 팽창 과정의 시작에 이용할 수 있는 TIL의 양이 정량화된다 (12일). 유동 세포분석 분석으로 CD45+ CD3+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포가 정량화된다.
단계 5에서, 공급기의 배양 혼합물 (조사된 피콜 분리된 PBMC)이 제조되고 폐쇄된 정적 세포 배양 백에서 ≥3 내지 ≤5x109 조사된 PBMC - CD45+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포, 7-9% 인간 AB 혈청, 2000 내지 4000 IU/mL IL-2 및 20 내지 40 ng/ml OKT-3 항체를 함유한 3 L의 T 세포 혼합 배지에서 성장된다.
단계 6에서, 공급기의 배양 혼합물의 대표적인 샘플 (조사된 피콜 분리된 PBMC)이 TIL을 첨가하기 전에 대조군 플라스크에 대해 채택된다.
단계 7에서, TIL이 REP 배양물에 첨가된다: ≥1 내지 ≤20x106 종양 유래 TIL - CD45+ CD3+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포.
단계 8에서, 정적 배양이 건식 인큐베이터에서 3.5 내지 6% 이산화탄소와 함께 6일 동안 35 내지 38.5℃에서 인큐베이션된다. CD45+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포의 수 및 생존 능력이 TIL이 없이 REP 혼합물을 함유하고 있는 대조군 플라스크 (단계 6에서 수집됨)에서 14 및 18일에 평가되어 조사된 공급기가 팽창하지 않은 것을 확실하게 한다. 유동 세포분석 분석으로 CD45+ 아넥신-V-, 및 DRAQ7- 세포가 정량화된다.
단계 9에서, WAVE 생물반응기 백이 1-2시간 동안 35 내지 38.5℃에서 3.5 내지 6% 이산화탄소와 함께 7-9% 인간 AB 혈청 및 2000 내지 4000 IU/mL IL-2가 보충된 1.7 L의 TCM으로 사전조건화된다.
단계 10에서, TIL은 WAVE 생물반응기 시스템으로 전달되어 팽창된다.
단계 11에서, 2000 내지 4000 IU/mL IL-2가 보충된 관류 공급 1 x TCM 10 L 백이 연결된다.
단계 12 (19-22일)에서, 19일과 22일 사이에 관류 속도가 조정된다.
단계 13 (24일)에서, 관류가 중단되고, 폐기물과 공급이 분리된다.
단계 14에서, TIL은 농축되고 세척된다.
단계 15에서, 최종 약물 제형이 125 내지 270 mL의 총 부피 범위의 주입 백에서 10% DMSO 및 8.5% HSA를 함유하고 있는 PBS에 현탁된 세포로 만들어진다.
단계 16에서, TIL을 함유한 최종 제품 백의 샘플이 QC 평가 및 보유 샘플을 위해 채택된다. 신선한 약물 제품의 QC 검정은 미생물 검사 테스트 및 색 및 시각적 입자 테스트를 포함한다. 보유 샘플은 세포 용량, 생존 능력 표현형 및 효능; 미생물 검사 및 내독소 분석을 위해 제조된다.
단계 17에서, 최종 제품 용기가 표지화되고 최종 제품 라벨과 중복된다.
단계 18에서, -1℃/분 내지 -60℃로 속도 제어 동결에 의해 냉동보존되고 < -130℃로 보관하기 위해 옮겨진다. 냉동보존된 약물 제품에 대한 QC 검정은 qPCR에 의한 미코플라즈마 테스트, T 세포 용량 및 생존 능력 테스트, 동역학 발색 LAL 테스트를 사용하여 측정되는 내독소 테스트 및 항-CD3 단편을 발현하는 세포주와 공동 배양 후 CD137+, IFN-γ+, TNFα+, 또는 CD107a+의 조합에 대해 CD2+ 발현 CD45+ DRAQ7-을 평가하는 효능 테스트를 포함한다.
표 1 - 정적 배양 백만을 사용하는 제조의 개요
CTU - TIL #
(성별)		 제1 팽창으로부터 유래된 종양 (x107) 제2 팽창에서의 생존 가능한 CD3+ 세포 (x107) 배수 팽창* 최종 이슈
생존 가능한 CD3+ (x1010)
1 (F) 2.1 1.5 690 1.0
3 (M) 3.8 2.0 1100 2.2
5 (M) 8.2 1.5 1281 2.0
평균±SD 6.0±2.2 1.7±0.23 1023±303 1.7±0.52
* - REP에서 사용된 최종 측정된 TIL / TIL과 동등함
표 2 - 관류 생물반응기를 사용하는 제조의 개요
CTU - TIL #
(성별)		 제1 팽창으로부터 유래된 종양 (x107) 제2 팽창에서의 생존 가능한 CD3+ 세포 (x107) 배수 팽창* 최종 이슈
생존 가능한 CD3+ (x1010)
12 (F) 5.4 2.0 1600 3.2
13 (M) 14.0 2.0 1010 2.02
14 (M) 5.8 2.0 2100 4.2
15(M) 5.1 2.0 3100 6.2
16 (M) 3.0 1.8 3000 5.4
19 (M) 7.6 2.0 3400 6.8
20 (M) 1.4 1.1 5409 5.95
21 (F) 1.4 1.4 3646 4.85
27(M) 5.1 2.0 1845 3.69
28 (F) 8.9 2.0 1590 3.18
32 (F) 34.0 2.0 1835 3.67
32 (F) N/A ** 2.0 1985 3.97
35 (M) 8.6 2.0 3125 6.25
36 (M) 3.2 1.6 2050 3.28
37 (F) 4.0 2.0 1265 2.53
38 (M) 0.55 0.32 3969 1.27
39 (M) 0.83 0.83 1398 1.16
40 (F) 1.4 0.71 7444 5.3
41 (M) 9.0 2.0 1555 3.11
42 (M) 9.8 2.0 1965 3.93
43 (F) 25.0 2.0 2310 4.62
47 (F) 2.67 2.0 1450 2.9
48 (F) 2.73 2.0 1865 3.73
51 (M) 4.1 2.0 1780 3.56
54 (M) 27.5 2.0 395 7.9
57 (M) 2.3 1.5 764 1.13
60 (F) 3.1 1.1 1486 1.56
63 (M) 0.84 0.89 5842 5.24
64 (M) 0.72 0.72 2993 2.14
67 (M) 0.38 0.37 7526 2.82
평균±SD 6.61±8.2 1.56±0.61 2650±1770 3.52±1.69
* - REP에서 사용된 최종 측정된 TIL / TIL과 동등함
** - 원래의 종양 유래 TIL를 사용하여 2회 치료된 환자
본 발명은 분해 시스템 또는 장치를 제공한다. 일부 구체예에서, 분해 장치는 조직의 개별 세포 또는 세포 클럼프로의 분해를 위한 트레딩 장치 형태이다. 일부 구체예에서, 분해 장치는 분해 과정 중에 열적 제어를 제공한다. 일부 구체예에서, 발명은 냉동보존 시스템 또는 장치를 제공한다. 일부 구체예에서, 분해 및 냉동보존을 위한 장치가 제공되고 열적 제어가 제공된다. 또 다른 측면으로, 발명은 발명의 분해/냉동보존 시스템 또는 장치에 하나 이상의 유연한 용기, 또는 분해, 냉동보존, 또는 분해 및 냉동보존 둘 다를 위해 적응된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하는 복수의 용기를 함유한 시스템을 제공한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 또는 복수의 용기는 상호연결되며 폐쇄된 시스템에서 사용하기에 적합하다. 상기 언급된 측면들은 본원에 첨부된 청구범위에서 표시된다. 본 발명의 더 많은 장점 및 이점은 발명의 실시예를 제공하는 사기의 상세한 설명의 관점에서 기술분야에 숙련된 사람에데 쉽게 나타날 것이다.
특정 구체예에서 분해기는 하나 이상의 이동 가능한 표면, 예를 들어 플레이트 및/또는 패들을 포함하며, 압축 및 전단력을 조직 샘플에 적용하도록 설계된다. 구체예에서, 소화기는 서로에 대해 이동할 수 있는 제1 표면 및 제2 표면을 포함한다. 특정 구체예에서, 표면은 샘플에 압력을 적용하기 위해 배치된 반대 표면이다. 구체예에서, 적어도 하나의 표면은 샘플에 압력을 적용하기 위해 표면 방향과 수직 방향으로 이동한다. 구체예에서, 표면은 평행하게 정렬되고 샘플이 반복적으로 압축된 후 주기적 방식의 표면 사이에서 이완되도록 반복된 또는 주기적 방식으로 함께 및 떨어져서 이동하도록 설계된다. 발명의 구체예에서, 샘플의 압축 및 이완은 샘플의 전단력을 초래한다.
구체예에서, 제1 및 제2 표면 중 하나는 정적으로 유지되는 한편 다른 표면은 이동한다. 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 표면이 둘 다 이동한다. 구체예에서, 조직 샘플은 조직 샘플 및 선택적으로 분해 유체 또는 용액을 함유한 유연한 및/또는 탄성 용기에 함유된다. 특정 구체예에서, 용기는 표면이 이동함에 따라 제1 및 제2 표면 사이의 부피 변화를 수용한다. 특정 구체예에서, 용기는 탄성이고 조직 샘플 및 분해 유체를 반대 표면의 범위 내에 국한시킨다. 특정 구체예에서, 용기는 유연하고 주변 공기 압력은 반대 표면의 범위 내에 조직 샘플 및 분해 유체의 한정을 보조한다. 특정 구체예에서, 공기 압력은 주변 압력이다. 특정 구체예에서, 공기 압력은 폐쇄하는 챔버에 적용되고 압력은 주변보다 더 크다.
특정 구체예에서, 분해 장치는 나란히 배치된 둘 이상의 반대 표면을 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나의 표면, 예를 들어 단일 플레이트는 세트에 공통이며, 선택적으로 고정적으로 유지되는 한편, 각 세트의 제2 표면은 나란히 위치하고 고정 플레이트에 반해 압력을 적용한다. 제2 표면은 트레딩 동작으로 압력을 교대로 적용할 수 있다. 특정한 그런 구체예에서, 조직 샘플 및 분해 유체를 정지 표면과 이동하는 표면 사이의 공간 내에 제한하는 한편 용기의 내용물이 이동하는 표면 사이에서 앞뒤로 흐르는 것을 허용하는 유연한 용기가 사용된다. 특정 구체예에서, 용기는 내용물의 그러한 앞뒤 이동을 제한 또는 방지하도록 적응된다. 구체예에서, 용기를 가로지르는 밀봉이 한 쪽에서 다른 쪽으로 내용물의 역 흐름을 차단한다. 또 다른 구체예에서, 용기를 가로지르는 배플이 다른 쪽으로 내용물의 흐름을 제한한다.
트레딩 표면은 임의의 적합한 메커니즘에 의해 작동될 수 있다. 본원에는 트레딩 표면을 유연한 용기에 대해 교대로 이동하도록 설계된 측방향 막대 시스템의 예가 장치(100)로서 개시된다. 트레딩 표면은 스프링으로 되어 있고, 스프링은 용기에 대해 트레딩 표면을 누르도록 설계된 한편 용기 두께와 용기의 입자 크기 변화의 변화를 허용한다. 특정 구체예에서, 스프링은 예압이 걸려 있다. 또한 본원에는 2개의 트레딩 표면을 특징으로 하는 캠 작동 설계의 예가 장치(200)로서 개시된다. 장치(200)에서, 예압된 스프링은 유연한 용기에 대해 트레딩 표면을 누르고 캠 메커니즘은 주기적으로 하나의 트레딩 표면을 들어올린 다음, 다른 트레딩 표면을 유연한 용기로부터 먼 곳으로 들어올린다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 로커 암(rocker arms) 또는 레버가 사용되어 트레딩 표면을 용기로부터 멀리 들어올린다. 또 다른 구체예에서, 트레딩 표면은 유압으로 올라가고 내려간다. 또 다른 구체예에서, 트레딩 표면은 공압적으로 올라가고 내려간다. (200) 장치에서, 2개의 트레딩 표면이 교대로 분해 용기에 접촉하는 한편, 특정 구체예에서, 작동 메커니즘은 시스템이 정지할 때를 포함해서 이동하는 표면이 전부 동시에 압력을 적용하는 것을 허용한다. 그러한 특징은 분해 과정의 단부에서 분해 용기의 내용물을 비우는데 유용하다. 예를 들어, 트레딩 표면은 중간 위치에 있거나 하나가 올라가고 다른 하나가 낮아지는 대신에, 트레딩 표면은 전부 분해 용기에 대해 낮아지고, 부착된 튜빙을 통해 내용물을 자내고, 선택적으로, 2차 수용 용기, 예를 들어 동결보존 용기에 여과된다.
본원에 예시된 완전히 폐쇄된 분해 및 냉동보존 시스템에서, 자동화된 분해 후 수동 여과 및 밀봉된 주사기 및 튜브 시스템에 의해 냉동 보존 용기 및 자동 냉동 보존으로 전달되는 특징이 있다. 유리하게, 분해된 종양 조직은 분해 용기로부터 냉동보존 용기로 수동으로 전달되는 한편, 분해 및 냉동보존 단계는 순차적으로 두 단계를 모두 관리하도록 프로그래밍된 동일한 자동화 장치에 의해 수행된다. 다른 구체예에서, 분해 과정은 종결시, 분해된 종양 조직이 자동으로 분해 용기로부터 냉동보존 용기로 이동하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 연결 튜브와 접촉하는 연동 펌프 및 밸브가 내용물의 흐름을 제어한다. 특정 구체예에서, 분해기의 트레딩 표면은 분해 용기 밖으로, 선택적으로 필터를 통해 내용물의 흐름을 제어하는 밸브인 냉동 보존 용기로 분해된 종양 용액을 밀거나 쥐어짜도록 배치된다. 그러한 구체예에서, 폐쇄된 시스템에서 물질의 임의의 전달과 함께 분해 및 냉동보존은 바람직하게 본원에 예시된 동일한 장치에 의해 제어되고 수행된다.
여러 개의 분해 시스템이 힘, 소화 시간, 및 속도 (RPM 또는 분당 사이클)를 포함한 변수와 관련하여 테스트되고 최적화되었다. 여러 조직 유형을 사용한 결과 및 예상은 최대 및 60 N을 초과하는 힘, 최대 및 60분을 초과하는 소화 시간, 및 최대 및 240 RPM을 초과하는 속도를 포함한 힘, 시간, 및 속도 변수의 조합에 대해 측정되었다. 발명의 특정 구체예에서, 힘은 20-200　N, 또는 30 - 120　N, 또는 30-90　N, 또는 40-60　N, 또는 10-20　N 또는 20-30　N, 또는 30-40　N, 또는 40-50　N, 또는 40-45　N, 또는 45-50　N, 또는 50-55　N, 또는 55-60　N, 또는 60-65　N, 또는 65-70　N, 또는 70-75　N, 또는 75-80　N이다. 전형적인 트레딩 피트는 약 20 내지 50 cm2의 표면적을 가진다. 30 cm2 트레딩 표면을 토대로, 트레딩 압력은 0.5 - 6.5 N/cm2, 또는 1 - 4 N/cm2, 또는 1 - 3 N/cm2, 또는 1 - 2　N/cm2, 또는 1.5 - 2.5　N/cm2, 또는 2 - 3　N/cm2, 또는 2.5 - 3.5　N/cm2, 또는 1.5　N/cm2 ± 0.5　N/cm2, 또는 2　N/cm2 ± 0.5　N/cm2, 또는 2.5　N/cm2 ± 0.5　N/cm2, 또는 3　N/cm2 ± 0.5　N/cm2, 또는 4　N/cm2 ± 0.5　N/cm2, 또는 5　N/cm2 ± 0.5　N/cm2이다. 공칭 압력은 압력 센서를 사용하여, 바람직하게 분해 용기의 두께를 보정하면서 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 분해 장치는 압력 센서를 포함한다. 발명의 특정 구체예에서, 소화 시간은 90분 이하, 또는 75분 이하, 또는 60분 이하, 또는 50분 이하, 또는 5-120분, 또는 15-100분, 또는 30-90분, 또는 40-60분, 또는 5-10분, 또는 10-20분, 또는 20-30분, 또는 30-40분, 또는 40-45분 또는 45-50분, 또는 50-60분, 또는 60-65분, 또는 65-70분, 또는 40분 ± 5분 또는 45분 ± 5분, 또는 50분 ± 5분, 또는 55분 ± 5분, 또는 60분 ± 5분, 또는 65분 ± 5분, 또는 70분 ± 5분이다. 특정 구체예에서, 분해 장치는 60-360 RPM에서 작동한다. 또는 120-340 RPM, 또는 180-300 RPM, 또는 210-270 RPM, 80-160 RPM, 또는 120-200 RPM, 또는 160-240 RPM, 또는 200-280 RPM, 또는 240-320 RPM, 또는 280-360 RPM, 또는 60 RPM ± 20 RPM, 또는 80 RPM ± 20 RPM, 또는 100 RPM ± 20 RPM, 또는 120 RPM ± 20 RPM, 또는 140 RPM ± 20 RPM, 또는 160 RPM ± 20 RPM, 또는 180 RPM ± 20 RPM, 또는 200 RPM ± 20 RPM, 또는 220 RPM ± 20 RPM, 또는 240 RPM ± 20 RPM, 또는 260 RPM ± 20 RPM, 또는 280 RPM ± 20 RPM, 또는 300 RPM ± 20 RPM, 또는 320 RPM ± 20 RPM, 또는 340 RPM ± 20 RPM, 또는 360 RPM ± 20 RPM에서 작동한다.
특정 구체예에서, 물리적 분해는 연속적이다. 특정 구체예에서, 물리적 분해는 주기적이거나 일회성이다. 예를 들어, 온도 증가가 분해 샘플에서 관찰되는 경우, 온도 증가를 감소시키거나 방지하기 위해 물리적 분해를 간단하게 둔화시키거나 정지하거나 또는 온도가 설정 점까지 평형화되도록 하는 것이 유리할 수 있다. 이론에 매이지 않으면서, 온도 증가는 분해 장치에 의한 샘플의 물리적 조작, 장치의 활성 트레딩 메커니즘으로부터의 열 전달, 감소된 물리적 접촉 또는 분해 과정이 활성인 동안 샘플로부터 냉장 유닛으로의 열 전달, 또는 다른 이유를 통해 일어날 수 있다. 특정 구체예에서, 주기적 또는 일시적인 분해는 분해 장치에 유리할 수 있다. 본원에 개시된 것과 같은 캠 구동 장치에서, 캠 메커니즘의 기대 수명은 때때로 캠 회전 방향을 주기적으로 반대로 하여 개선될 수 있고, 따라서 캠의 수명은 캠의 양쪽에 마모를 분산시켜서 연장된다. 발명의 구체예에서, 물리적 분해의 활성 주기는 제한 없이, 15-30초, 20-40초, 30-60초, 45-75초, 60-90초, 적어도 20초, 적어도 30초, 적어도 40초, 적어도 1분, 적어도 1.5분, 또는 적어도 2분을 포함한다. 비활성 기간은, 제한 없이, 1-10초, 10-20초, 20-30초, 30-40초, 40-60초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 60초, 90초, 120초, 또는 그 사이의 기간일 수 있다. 비활성 기간은 분해 장치가 방향을 바꾸기 위해 필요한 만큼 짧을 수 있다.
일부 구체예에서, 표면은 서로에 대해 측면으로 이동시키기 위해 배치된 반대 표면이다. 그러한 특정 구체예에서, 측면 운동은 선형 측면 운동을 포함한다. 그러한 특정 구체예에서, 측면 운동은 궤도 측면 운동을 포함한다. 특정 구체예에서, 선형 및 궤도 측면 운동이 모두 있다.
구체예에서, 반대 표면은 평평하다. 구체예에서, 적어도 하나의 표면은 볼록 영역을 포함하고 다른 표면에 대해 요동 운동으로 이동하도록 배치된다. 볼록 표면과 요동 운동의 한 측면은 연동과 같은 작용을 제공하는 것이다.
발명에 따르면, 표면의 움직임이 제어되며, 그러한 제어는 한정하는 것은 아니지만 속도, 샘플 압축, 시스템 압력, 지속 시간, 및 주기 빈도를 포함한 표면 이동의 하나 이상의 측면의 제어를 포함한다. 특정 구체예에서, 플레이트 이동의 하나 이상의 측면은 일정하다. 특정 구체예에서, 플레이트 이동의 하나 이상의 측면은 분해 상태에 좌우된다. 특정 구체예에서, 분해 상태는 분해 과정의 시간, 예컨대 초기, 중기, 후기, 또는 시간, 분 및 초로 측정된 보다 정확한 시간 주기와 같이 하나 이상의 미리 정의된 단계에 의해 정의된다. 특정 구체예에서, 분해 상태는 종양 조각의 크기 분포에 의해 정의된다. 예를 들어, 발명의 구체예에서, 압력은 종양 조작의 크기가 감소함에 따라 증가한다.
분해 장치 및 대체물의 예
도 41을 참조하면 폐쇄되고 적어도 초기에는 무균성인 일반적으로 평평한 측면 및 상대적으로 얇은 샘플 용기 백(10) 내에서 개별 세포 또는 세포 클럼프로 조직을 분해하기 위한 트레딩 장치(100)가 도시된다. 장치는 제어된 온도 비율 변화 냉동고, 해동기 또는 온열기, 예를 들어 Via FreezeTM으로서 알려져 있는 상업적으로 이용 가능한 냉동고, 또는 도 41에서 개략적으로 도시되고, 본원에서 일반적으로 냉동고(40)로서 기술된, 온도의 제어된 속도 변화를 제공하는 임의의 다른 장치와 같은 온도 제어 장치로 제거 가능하게 삽입될 수 있는 부품의 조립으로부터 형성된 하우징(110)을 포함한다. 실제로 하우징이 커버를 포함하겠지만, 그것은 도시되지는 않는다. 사용 중에 장치 및 백은 절개된 종양, 절개된 종양의 부분들 또는 바늘 생검 등과 같은 조직을 분해하고, 그런 후 결과적으로 생성된 세포 현탁액을, 백(10) 외부로 분해된 샘플을 이동할 필요 없이 후속 분석을 위해 냉동보존하기 위한 폐쇄된 시스템을 제공한다.
하우징(110)은 전기 모터 및 기어박스를 포함하는, 출력 속도가 10-300 rpm인 모터 장치(114)가 부착되는 섀시(112)를 가진다. 모터 및 기어박스(114)의 출력 샤프트는 연결봉(118)을 구동시키는 크랭크(116)를 가지며, 그것은 차례로 트레딩 메커니즘(120)에 회전할 수 있게 연결되고, 크랭크(116)의 각 회전에 대해 하나의 트레이 사이클, 즉 0.2초 내지 6초 사이의 트레딩 주기를 통해 제거될 수 있다. 보다 상세하게 이 트레딩 메커니즘은 2개의 반대방향으로 평행한 수평 막대(126 및 128)를 각각 회전 가능하게 장착하는 섀시(112)에 단단하게 장착된 2개의 공간을 두고 배치된 피봇(122 및 124)을 포함하는 평행사변형의 4개의 막대 연결을 가진다. 수평 막대의 각각은 피봇(122 및 124)의 각각의 측면에 최전 가능하게 연결되어, 함께 평행사변형 연결을 형성하는 2개의 평행한 트레딩 막대(130 및 132)를 가진다. 연결봉(118)은 수평 막대의 연장부에 편리하게 회전 가능하게 유지되어, 그 연장부의 이동이 트레딩 막대(130 및 132)의 주기적인 상하 동작(표시된 방향으로의)이 야기된다. 각각의 트레딩 막대(130 및 132)에는 풋 어셈블리(134 및 136)가 연결되어, 상기 언급된 주기적 이동에 의해 크랭크(116)의 이동과 함께 순차적 방식으로 상하로 움직일 것이다, 즉 한 개의 풋이 위로 올라가면 다른 하나는 아래로 내려가고 그 역도 마찬가지일 것이다.
풋 어셈블리(134 및 136)는 각각이 평평한 면의 밑판(138 및 140)을 포함하며 각각의 판은 각각 코일 금속 스피링(146)에 의해 상부 풋 프레임(142 및 144)에 스프링으로 장착되어 있다. 상기 기술된 배열에서, 또는 사용되는 경우 동등한 배열에서, 스프링(146)은 예압되어 있다. 이 경우 조합된 예압은 바람직하게 40-80 N, 보다 바람직하게 30-70 N이고, 각각의 풋에 대해 바람직하게 약 60 N이다. 조합된 스프링 비율은 이동 mm당 1-5 N, 바람직하게는 mm당 약 3 N이고, 의도된 풋 이동은 약 8-12 mm, 바람직하게는 약 10 mm이다. 더불어 각각의 풋의 표면적은 약 20 내지 50 cm2, 바람직하게 약 35 cm2인 것으로 의도된다. 이것은 백에 0 (풋이 백으로부터 떨어지거나 실질적으로 로딩이 없을 경우) 내지 최대 약 6 N/cm2 (약 9 psi)의 개념적 압력을 초래한다. 그러나, 백은 적어도 트레딩 과정을 시작할 때에슨 균질한 물질을 함유할 수 없는 것을 감안하면, 가해지는 힘이 집중될 곳에 물질 덩어리가 있을 것이고, 그로써 압력은 예를 들어 트레딩 과정의 끝을 향해 가해지는 백(10)의 최소 압력 저항을 제공하기 위해 이상적인 상황인 '개념적인' 것으로서 기술된다.
섀시의 바닥에는 유연한 백(10)을 위한 수용 영역(148)이 있고 인접한 수용 영역(148)은 열 전달 판(150)이다. 영역(148)은 섀시의 전방 (전방은 도 1에 도시되어 있음)을 통해 판(150) 위로 미끄러질 수 있는 샘플 프로세싱 백(10)을 들어오게 하기에 충분히 크다. 판은 그 위에 백(10)이 놓이는 상부 표면(151), 및 사용 중에 외부에서 영향을 받는 가열 또는 냉각에 대해 노출되는 하부 표면(152)을 포함한다. 상부 표면(151)은 일반적으로 각각의 풋의 밑판(138 및 140)에 평행하여서, 밑판은 일반적으로 표면(151)과 평행하게 이동한다. 다른 말로 하면, 평평한 밑판은 일반적으로 표면(151)과 수직 방향으로 이동하여, 메커니즘(120)에 미치는 상당한 측력(side forces)을 방지한다. 판(150)은 금속, 바람직하게 알루미늄 또는 구리 또는 금 또는 은으로부터, 또는 이들 금속을 함유한 합금으로부터 형성된다. 열 전도율은 20℃에서 측정되었을 때 바람직하게 100을 초과하며 보다 바람직하게 200 W/m K를 초과한다. 판(150) 물질의 두께는 약 3 mm 이하이며 낮은 열적 질량을 제공하므로 판의 반대쪽에서의 온도 변화를 따르기 위해 백(10)의 내용물의 더 빠른 반응을 제공한다.
도 42 및 43을 추가적으로 참조하면, 장치는 이 예에서 화살표 C로 표시되는 바 시계방향으로 크랭크(116)를 구동하기 위해 전류를 모터 장치(114)에 공급함으로써 작동된다. 크랭크는 연결봉(118)이 상기 기술된 트레딩 메커니즘(120)을 작동하게 한다. 메커니즘(120)에 최대 힘이 적용되는 경우에 크랭크의 스트로크의 상하는 각각의 풋 어셈블리(134 및 136)의 최하단 위치와 일치하는 것이 주지될 것이다. 풋 어셈블리는 샘플 백(10)을 마사지하기 위하여 순차적으로 화살표 U 및 D의 방향으로 상하로 이동하여, 백(10)의 내용물은 각각의 트레딩 풋으로부터 멀어지는 한 쪽으로 이동할 기회를 갖게 된다. 잠재적으로 백의 고형 조직 샘플이 트레딩 풋으로부터 멀리 이동할 수 있기 때문에, 그리고 각각의 풋의 밑판(138 및 140)이 스프링으로 하중되기 때문에, 스트로크의 바닥에 있을 때에도 발에 추가적인 탄력적 이동이 제공되면, 더 큰 조직 덩어리가 분해되도록 의도되는 경우 메커니즘이 움직이지 못하게 될 기회가 적어진다. 순차적인 트레딩 작용은 또한 백(10)이 파열되는 기회를 감소시킨다.
도 44는 상기 기술된 장치(100)의 평면도지만, 이 도면에서는 백(10)이 제자리에 없다. 특히, 풋 어셈블리(134 및 136)의 상대적인 나란한 위치를 볼 수 있는데, 이것들은 이격되어 있고 평면에서 보여지는 집합적 면적을 가지며, 이 면적은 평평하게 놓았을 때 백(10)의 면적과 거의 동일하지만, 백(10) 면적의 약 ±10%의 면적 차이가 실용성을 갖는다.
도 45는 상기 기술된 장치(100)와 구성적으로는 유사하지만, 이 대안에서 모터 장치(114)의 모터(113)가 90도 기어박스(115)를 사용함으로써 그것의 기어박스(115)의 출력 샤프트에 대해 횡으로 배열되어 있어서, 모터(113)가 장치(100')의 후벽을 지나 돌출되지 않게 되는 장치(100')의 또 다른 평면도를 도시한다. 그러므로 이 장치(100')는 필요하다면 더 작은 냉동고 부피에 맞춰질 수 있다.
상기 언급된 분해 프로세싱 중에, 풋 어셈블리(134 및 136)에 의해 가해지는 힘은 열 전달 판(150)에 의해 반응한다. 이것은 샘플 백(10)이 프로세싱 중에 판(150)의 접촉 표면(151)에 대해 눌러져서, 샘플 백(10)과 판의 표면(151) 사이에 양호한 표면 접촉이 제공되고, 따라서 개선된 열 에너지 전달이 제공되는 것을 의미한다.
도 46, 47 및 48은 상기 언급된 유연한 샘플 백(10)의 상이한 구체예를 도시한다. 사용 중에 백은 장치(100 또는 100')의 수용 영역(148)의 제자리로 미끄러졌고 언급된 2개의 풋(134 및 136) 아래에 놓인다. 그러므로, 백은 일반적으로 약 최대 12 mm 두께의 평평한 구성을 가지며, 그 안의 조직 샘플에 맞추기 위해 약간의 추가 조정사항을 가진다. 도 46으로부터 알 수 있는 것과 같이 백(10)의 한 구성은 중심 공동(12), 및 공동(12)으로 접근하기 위한 포트(16)을 형성하기 위하여 주변부(14)에서만 밀봉되는 플라스틱 물질로 된 2개 층으로부터 형성되는 것으로 나타난다. 백은 EVA로부터 형성될 수 있다. 사용 중에 포트(16), 또는 그것들 중 적어도 하나는 충분히 커서, 즉 직경이 약 10 mm 또는 그 이상이어서, 필요하다면 작은 조각으로 잘게 잘리고 주사기에 의해 백 공공(12)으로 통과하는 샘플을 수용하는 것이 바람직하다. 그러나, 또한 포트의 반대쪽에서 백의 단부에서의 소위 '지퍼 잠금' 접근을 포함하는 것이 가능하여서, 큰 조직 샘플이 백에 진입할 수 있고 그런 후에 백이 재밀봉된다. '지퍼 잠금'은 이음매를 만들기 위하여 한 번 이상 접혀질 수 있고, 탄력적인 채널 내부에서 또는 누출 기회를 줄이기 위하여 또 다른 클램프 또는 클램프(도시되지 않음)에 의해 접혀진 채로 유지될 수 있다. 백(10)은, 대안으로서, 개방되고 조직이 첨가될 수 있다. 백은 그런 후 제자리에 있는 그것의 내용물과 함께 열 밀봉될 수 있다. 백(10)은 사용 중인 장치에 백을 위치시키고 트레딩 중에 그것을 제자리에 유지하기 위해 모서리 구멍(18)을 포함한다. 도면이 하나의 공동(12)을 가진 백(10)을 도시하지만, 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개의 공동을 가진 백을 제공하는 것이 가능할 것이고, 복수의 공동은 각각이 신장 가능하며 초기에 개방된, 열 밀봉 가능한 단부, 및 그것의 다른 단부에서 분해 효소와 같은 시약의 도입을 위한, 및 분해가 완료되거나 실질적으로 완료되면 분해된 샘플을 철회하기 위한 밀봉 가능한 포트를 가진다.
도 47은 모서리 구멍(18)에 맞는 프레임 상에서 못(24)에 의해 위치 프레임(20)에 장착된 도 46의 백(10)을 도시한다. 프레임(20)은 장치(100/100') 내에서 백(10)을 제자리에 위치시키고 유지하는 대체 방법이다. 프레임(20)은 트레딩 중에 백을 제자리에 위치시키고 유지하기 위하여 장치와 협력하는 위치 구멍(22)을 포함한다. 프레임은 사용 중에 공동(12) 및 트레딩 풋(134 및 136)을 수용하기 위하여 내부 개방 창(26)을 가진다. 프레임(20)은 장치(100/100')의 안과 밖으로의 백(10)의 로딩 및 언로딩을 더 쉽게 만들어준다.
도 48은 프레임(20)의 구성과 각각 유사한 2개의 일반적으로 대칭인 절반을 가지는 대체 프레임(20')을 도시한다. 각각의 프레임 절반은 프레임(20')으로 성형된 유연한 쉘(30)을 추가적으로 가져서, 2개의 절반은 백(10)을 둘러싼 조개 껍질처럼 함께 모인다. 상부 및 바닥 유연한 쉘은 백(10)이 사용 중에 내부에서 파열되는 경우 제방으로서 작용한다. 이런 특징은 특히 감염 조직 샘플에 대해 유용하다.
제시되지는 않지만, 또 다른 구체예인 간단 백-인-백 배열은 누출을 함유하도록 사용될 수 있다. 또 다른 대안으로, 백은 탄력적인 (적어도 실온에서) 별도의 웰을 가진 베이스를 포함하여, 샘플의 부분표본이 전체 샘플을 사용하지 않고서, 예를 들어 아래에서 기술되는 것과 같이 동결 후에 제거될 수 있다. 대안으로, 밀봉 가능한 백은 샘플의 분리를 허용하는 부분으로 추가로 열 밀봉될 수 있다.
백(10)에 들어간 샘플의 프로세싱은 한 예로 WO2018/130845에 기재된 단계를 따를 수 있다. 이 배열에서 조직을 함유하고 있는 밀봉된 백 TO는 포트(16)를 통해 백에 도입된, 조직의 붕괴를 가속화하기 위한 콜라게나제 및 프로테아제와 같은 소화 효소를 함유할 수 있는 수성 용액에 현탁된다. 백은 여기서 판(150) 상에 위치하고, 예를 들어 외부 열원으로부터 대략 35°G로 가온되어 조직 소화율이 가속화된다. 여기서 제안된 한 가지 중요한 차이점은 단일 샘플 프로세싱 백이 사용되며, 소화 효소는 분해 전에 또는 분해 중에 백에 포트(16) 중 하나를 통해 도입될 수 있다는 것이다. 효소 작용을 위해 백에 원하는 온도를 제공하기 위하여 그것의 외부에서 판을 가열함으로써 열 에너지를 백에 도입하기 위해 열 전달 판(150)이 사용될 수 있다. 그 열은 편리하게 전기로 가열된 가온판, 또는 판(150) 내부에 또는 위에 있는 전기 가열 요소로부터 올 수 있다. 분해 작용의 양은 수많은 매개변수, 예를 들어 초기 조직 샘플의 크기, 밀도 및 탄력성에 따라 달라질 것이고, 그러므로 분해 시간 및 틀딩 속도는 유의하게 달라질 것이다. 너무 길거나 과도하게 격렬한 트레딩은 감소된 세포 생존 능력으로 이어질 수 있다. 그러므로, 모터 장치 속도 및 분해 기간이 중요하다. 이런 문제를 해결하기 위한 한 가지 옵션은 유사한 샘플을 분해하기 위해 필요한 시간 및 출력 속도를 포함하는 순람표(look-up table)에 따라 프로세싱 시간을 정하는 것이다. 또 다른 옵션은 분해 프로세싱을 수행하기 위해 필요한 시간이 경화함에 따라 순간 전류 또는 전기 에너지를 측정하거나, 또는 판(150) 또는 메커니즘의 또 다른 부분에 가해진 힘 또는 응력을 측정하고, 미리 결정된 한계값에 도달한 후 중단하여 샘플이 충분히 분해되었음을 나타내는 것이다. 전력/힘/응력이 감소함에 따라 분해는 완료에 더 가까워진다. 또 다른 옵션은 백을 통한 흡광도를 측정하는 것이다 - 흡광도가 클수록, 샘플은 분해를 완료하는 데 더 가까워진다. 분해가 완료되면 백 내용물은 전달되고, 관심 있는 세포 또는 다른 구성성분은 분리되어 장치(100/100')에서의 동결을 위해 신선한 백에 넣어질 수 있다. 대안으로, 그리고 바람직하게 전체 분해된 물질은 동결을 위해 백 및 장치에 남겨질 수 있다. 냉동보호제가 포트(16)를 통해 백에 도입된다.
본 발명의 방법과 WO2018/130845에 기재된 것 사이의 또 다른 차이점은 냉동보호제가 도입된 후, 백에 분해된 샘플 및 냉동보호제를 가진 장치가 장치에 장착되고(또는 남아 있고), 전체 장치가 상기 기술된 것과 같이 냉동고(40)에 장착되는 것이다. 냉동고의 바닥은 저온이며 따라서 열 에너지를 열 전달 판(150)을 통해 백(10)으로부터 끌어온다. 백이 냉각되는 동안 얼음의 형성을 제어하고 샘플의 과냉각을 방지하기 위하여, 그것은 분해에 대한 것보다 더 느린 속도지만, 얼음 핵형성을 제어하고 그로써 해동 후 세포의 생존 능력을 증가시키기 위하여, 상기 기술된 방식으로 풋(134 및 136)에 의해 마사지될 수 있다. 전기 에너지는 와이어 도체를 통해 모터 장치(114)에 공급되어 냉동고, 예컨대 냉동고(40) 내부에서 메커니즘(120)의 동작을 유지할 수 있다 (도 41).
장치는 냉동고로부터 제거 가능하기 때문에, 사용 후 세정이 더 쉽게 만들어진다.
사용을 위해 필요한 경우, 백(10)의 냉동된 분해된 샘플은 장치(100/100')에서 판(150)의 추가의 외부 가열에 의해, 및/또는 약 37℃에서 유지된 가온된 수조에 장치(100/100')를 부분적으로 침지함으로써 신속하게 해동되고, 냉동보호제가 제거될 수 있다. 각각의 경우에 백은 해동 중에 마사지될 수 있다. 만약 효소가 여전히 존재하면, 그것들 역시 필요에 따라, 예를 들어 여과에 의해 제거될 수 있다. 일반적으로, 그것은 냉동보존 중에 세포에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 못할 것인데, 그것의 작용이 저온에서는 정지되기 때문이다. 모든 과정 조작, 가온, 분해, 냉각, 동결 및 그런 후 해동은 동일한 밀봉된 유연한 백(10)에서 샘플로 일어나며, 단일 장치에서 수행될 수 있다. 이것은 시간 및 공간적으로 효율적일뿐만 아니라, 프로세싱 중에 샘플에게 일어난 모든 것, 예컨대 온도, 기간, 분해 속도, 동결 프로토콜을 포착하기 위한 단일한 기록을 가능하게 하며, 오류의 기회, 예컨대 프로세싱 기계간 제어되지 않은 환경에서 샘플이 너무 많은 시간을 보내는 것을 줄일 수 있게 한다.
조직 샘플 프로세싱 및 동결에 사용된 장치 및 기법의 보다 구체적인 예가 아래에서 제공된다.
도 49는 EVA 또는 PVG 필름과 같은 열가소성 물질로부터 형성되며 조직 샘플(T)을 수용하기 위한 개구부(11)를 가진 백(10)의 예를 도시한다. 백은 하나 이상의 분기(17), 압축 밸브(19), 및 루어형 연결기(15)를 포함하는, 하나 이상의 포트(16)에 부착된 튜빙(13)을 포함한다 (도 46). 도시된 단일 튜빙선은 단순히 예시적이다 - 백(10)은 다수의 포트(16)를 통해 연결된 추가의 평행한 튜빙을 포함할 수 있다.
조직(T)이 백(10)의 내부에 있게 되면, 개구부(11)는 도 50에서 폐쇄되고 밀봉되며, 동일한 도면에서 사슬 점선으로 개방 상태로 도시된 기계식 클램핑 밀봉(9)에 의해, 및/또는 도 51a에서 도시된 것과 같이 열 밀봉 기계(50)을 사용하는 열 밀봉에 의해 밀봉되어, 열 밀봉된 폐쇄 스트립 또는 스트립들 (예를 들어 복수의 평행한 스트립)(8)이 생성되며, 각각의 방법은 밀봉된 공동(12)을 형성한다 (도 46, 47 및 49).
백(10)을 밀봉하기 위한 대체 또는 추가적인 수단이 도 51b 및 51c에 도시된다. 도 51c에서 도시된 것과 같이, 밀봉부(8)에서 열 밀봉 후에 백(10)은 한 쌍의 스크류(66)에 의해 함께 힘을 받는 상부 막대(62) 및 하부 막대(64)를 포함하는 2개의 클램프(60)로 클램핑될 수 있다. 도 51b는 분해된 상태의 클램프(60)를 도시하지만, 사용 시에 스크류(66)는 백(10)의 삽입 전에 남아 있는 클램프로부터 완전히 제거될 필요는 없다. 상부 막대(62)는 테이퍼링 리세스(68)를 가지며, 클램핑될 때 상보적인 쐐기형 형성물(61)이 안착된다. 리세스 및 쐐기는 쐐기의 정점(65)에서 클램핑력을 집중시켜서, 평평한 클램핑 면에 의해 달성될 수 있는 것보다 정점에서 더 높은 클램핑력을 제공합니다. 더 많은 클램핑력을 위해, 정점(65)은 그것의 피크에 작은 채널(67)을 가지는데, 그것은 사용시 상부 막대에서 상보하는 융기 형성물(69)을 만나게 된다. 특정 구체예에서, 힘은 열 밀봉(8)에 대한 필요를 무효화하기에 충분한다. 특정 구체예에서, 예를 들어 분해기 외부에서 샘플 함유 백의 취급을 위해 열 밀봉 또는 다른 백 밀봉 메커니즘이 제공되는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 클램핑 장치는 밀봉의 무결성을 보장한다. 클램핑력은 쉽게 휘허지지 않는 상부 및 하부 막대의 두께 및 강성에 의해 추가로 향상되며, 따라서 스크류(66)에 의해 가해진 클램핑력이 유지된다. 도 51c는 클램핑된 상태에서의 클램프(60)를 도시한다. 돌출부(63)는 클램프의 이동을 억제하기 위하여 트레딩 장치(100/100' 또는 200)(하기에서 기술됨)의 특징과 만나고, 결국 트레딩 중에 백(10)을 클램핑한다. 클램프(60)의 외부 주변 및 높이는 샘플 수용 영역(148) (또는 도 62에서 (248) 그리고 다음)의 상보하는 부분에 맞춰질 정도의 크기 및 모양의 것이며, 따라서 트레딩 중에 클램핑된 백(10)의 추가 위치를 제공한다. 예시되지는 않았지만, 클램프(60)는 또한 도 47 및 48에 도시된 추가적인 프레임(20, 20')을 포함할 수 있어서, 클램프는 프레임의 한 단부에 단단하게 장착되고 포트(들)(16)(도 46 및 49)는 프레임의 다른 단부에서 지지된다.
도 52를 참조하면, 사용 중에, 밀봉된 후 소화 효소(E)는 예를 들어 효소를 분기 연결부(17)에 부착된 주사기(5)를 사용하여 백으로 사출함으로써 튜빙(13)을 통해 공동(12)에 도입될 수 있다. 백을 똑바로 세워놓은 방향으로 유지함으로써, 도 53에서 도시된 것과 같이 주사기(5)의 피스톤을 빼냄으로써 공기가 공동(12)으로부터 제거될 수 있다. 효소(E) 및 조직(T)의 초기 혼합은 도 54에서 도시된 것과 같이 수동으로 이루어질 수 있다.
그런 다음 분해를 위해 트레딩 장치(100)에 백(10)의 로딩이, 도 55에서 도시된 것과 같이, 프레임(20/20') 및 제방 덮개(30)가 있거나 없이 시작될 수 있다.
분해 과정은 그런 후 상기 기술된 것과 같이 일어난다. 수 분 내지 수 시간, 예를 들어 약 10분 내지 7시간, 바람직하게는 40분 내지 1시간이 걸릴 수 있는 완료 후, 분해된 액화된 샘플은 예를 들어 상기 기술된 백 세트를 사용하여 부분표본으로, 및 도 5에 도시된 것과 같이, 분기(17)에 연결된 추가의 샘플 부분표본 백(7)로 세분화될 수 있다. 그 경우 주사기(5)가 화살표(F)의 방향으로 백(10) 외부로 샘플을 끌어내기 위해 사용되고, 밸브(19a 및 19b)는 개방되고 샘플 부분표본 백(7)에 인접한 밸브(19c는 폐쇄된다. 충분한 샘플이 주사기(5)에 빠져나오면, 밸브(19b)는 폐쇄되고, 밸브(19a)는 개방된 채로 남아 있으며, 밸브(19c)는 개방된다. 그런 다음 주사기가 사용되어 도 57에서 화살표(F)의 방향으로 샘플 부분표본 백(7)으로 액체가 가압된다. 부분표본 백(7)의 튜빙(13)은 도 58에 도시된 클램프 열 밀봉기(55)에 의해 열 밀봉될 수 있다. 그 과정은 충분한 부분표본이 얻어질 때까지 또는 백에 더 이상 샘플이 남아 있지 않을 때까지 반복될 수 있다. 백은 이미 부분적으로 나누어져서 각각의 구획이 더 간단하게 밀봉될 수 있다.
상기에서 기술된 것과 같이, 샘플 백(10)은 트레딩 장치(100)에 남아 있을 수 있고 (도 55) 트레딩 장치는 그 후에 제어된 비율 온도 변화 장치, 이 경우 도 59에 도시된 냉동고(40)에 로딩될 수 있다. 그 기술로 트레딩이 동결 중에 계속해서 트레딩되어 얼음 결정이 형성되는 것을 억제할 수 있지만, 실제로는 백(10)이 동결 전에 제거된 후 냉동고(40)가 트레딩 중에 열 전달판을 통해 샘플만을 냉각시키기 위해 작용할 수 있다. 대안으로, 부분표본 샘플 백(7)이 전체 샘플 백(10) 대신 일어날 수 있다. 또 다른 대안으로, 도 60에서 도시된 것과 같이, 냉동고(40)의 상부에 트레딩 장치(100)를 그것의 뚜껑을 개방한 채로 장착시켜서 바닥(150)이 냉각되도록 함으로써 냉동고(40)가 미프로세싱 또는 프로세싱된 샘플을 4℃ 정도로 원활하게 냉각시키기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 대안으로, 도 61에서 도시된 것과 같이, 바닥(150)을 제거하고 뚜껑을 제자리에 둔 상태에서 그것을 냉동고에 넣는 것이 가능하다. 또 다른 대안으로, 도시되지 않았지만, 백(10, 또는 7)은 냉동고(40)에서 직접 동결될 수 있다.
발명은 상기 기술된 구체예에 한정되는 것으로 볼 수 없지만, 기술분야에 숙련된 사람에게 쉽게 드러나는 것과 같이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 달라질 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 트레딩 메커니즘은 그것이 미끄러지는 표면보다는 저온 상태에서 잼이 발생할 가능성이 더 적은 전체적으로 회전하는 기계적 상호연결을 제공하기 때문에 바람직하지만, 그 메커니즘은 둘 이상의 풋을 순차적으로 트레딩하기 위한 임의의 기계적으로 동등한 수단으로 대체될 수 있다. 기술된 평평한 풋은 롤러 풋으로 대체될 수 있고, 그 경우 트레딩 동작은 상하보다는 좌우로 움직인다. 기술된 트레딩, 또는 그것의 기계적 동등물은 분해를 최적화하고 세포 회복을 최대화하기 위해 초당 각 풋에 대해 바람직하게 2 또는 3개의 트레드 비율이며, 꾸준한 트레딩이지만, 트레딩은 상이한 세포 유형에 대해서는 더 빠르거나 더 느리거나, 또는 간헐적일 수 있다.
장치(100/100')가 냉동고에 배치되도록 의도되고 극저온 (예컨대 -80℃ 이하)이 적용되기 때문에, 중합체 부품은 저온에서 훨씬 더 단단해지므로 금속 부품, 특히 스프링(146)과 같은 부품의 사용이 바람직하다. 또한, 피스톤 및 실린더와 같이 꼭 맞는 부품은 매우 낮은 온도에서 끼이거나 맞지 않을 수 있으므로 기술된 메커니즘(120)과 같은 간단한 회전 가능한 연결이 바람직하다.
도 62, 63 및 64는 위에서 기술된 장치(100)와 크기 및 기능이 유사한 대체 트레딩 장치(200)를 도시한다. 장치(200)는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 특정 차이점을 갖는다.
도 62를 언급하면, 장치(100)와 장치(200) 사이의 기본적인 차이점은 장치(200)가 장치(100)의 메커니즘(120)과 상이한 트레딩 메커니즘(220)을 가진다는 것이다. 24 볼트 DC 전기 모터(213) (도 63)에 의해, 도 42 및 43에 도시된 동작과 유사한 주기적인 교대 트레이닝 동작으로 구동되는 2개의 트레딩 풋(234, 236)은 트레딩 동작의 속도를 모니터링하고 제어하기 위해 제어기(221)(도 63)에 피드백을 제공하는 회전 인코더를 갖는 전기 모터 장치(214)의 일부이다. 모터는 톱니형 벨트(222)를 통해 캠 샤프트(224)를 구동시킨다. 캠 샤프트는 180도로 오프셋된 한 쌍의 캠(230, 232)을 포함하며, 이 경우, 각각은 캠 팔로워의 단순한 조화 동작을 제공하기 위해 사이클로이드 형상으로 프로파일링된다. 각각의 캠은 캠의 프로파일을 압도하는 관련된 탄성 팔로워 휠(225, 227), 스프링 팔로워 캐리지(226, 228)와 힘을 전달하는 관계에 있는 팔로워 휠 액슬(221, 223)을 포함하는 캠 팔로워 어셈블리를 이동시키기 위해 작동할 수 있다. 각각의 캐리지(226, 228)는 선형 가이드(229)로 미끄러지며, 각각의 풋(234, 236)은 캐리지와 연결된다. 각각의 어셈블리는 각각의 캠이 리턴 스프링(231)의 가압력에 대항하여 모터에 의해 회전됨에 따라, 풋과 함께 트레딩 상태로부터 멀어져 캠 프로파일을 라이딩함에 따라 팔로워 휠 중 각각 하나에 의해 차례로 위쪽으로 힘을 받는다. 캠이 추가로 회전되고, 캠 프로파일이 물러남에 따라, 각각의 팔로워 어셈블리와 결부된 스프링(231)은 트레딩 힘으로 어셈블리와 풋을 아래쪽으로 가압한다.
그로써, 트레딩 힘은 구동 모터(1)의 동력이 아니라 결부된 팔로워 어셈블리 스프링(231)의 스프링 속도로 제한된다. 메커니즘은 풋을 위로 구동시키고 스프링은 풋을 다시 아래로 밀기 때문에 백에 적용된 힘은, 사용 시, 스프링에 의해 제한된다. 이것은 다음을 보장해준다:
a. 모터는 멈출 수 없고 (종양 크기 또는 질감과 관계 없음);
b. 샘플은 과도한 임으로 압축되지 않으며 백은 갈라지지 않을 것이며;
c. 백에 적용된 최대 압력은 백 제작 중에 테스트된 압력보다 낮고; 그리고
d. 아래에서 기술되는 것과 같이, 힌지 백 수용 영역(248)은 반드시 풋을 사전에 위치시킬 필요 없이 사용된 샘플 백 및 임의의 클램프를 수용할 수 있다. 달리 말하면, 힌지 샘플 영역(248)이 풋에 대해 폐쇄되고, 필요하다면 힌지 영역이 풋에 대해 폐쇄됨에 따라 임의의 샘플이 그 시간에 풋에 의해 압축될 수 있기 때문에, 풋은 백을 수용할 때 임의의 위치에 있을 수 있다.
또한 도 63 및 64를 참조하면, 장치(200)는 장치 하우징(210)으로부터 풋의 바닥과 트레딩 메커니즘(220)의 나머지 부분 사이의 유체 저항 및 더스트씰을 제공하는 2개의 풋(234, 236)의 상부 부분으로 연장된 유연한 밀봉 막(241)을 추가로 포함한다. 그 배열은 작동 중에 압축된 백이 찢어진다면 메커니즘 오염을 억제한다. 막(241)이 바람직하긴 하지만, 풋은 밀봉, 예컨대 백 영역(248)로부터 메커니즘(220)을 분할하는 파티션에 장착된 립실(lipped seals)에서 미끄러질 수 있어서, 필요하다면 메커니즘의 오염의 유사한 억제를 달성해야 한다.
장치(200)는 열 전달 판(150)과 동일한 기능을 수행하는 열 전달 판(250)을 추가로 포함한다. 그러나, 이 판(250)은 힌지(255)에서 하우징의 한 측면에 힌지 연결되어 있고 (도 64), 그로써 트레딩될 백의 삽입 및 제거가 더 쉬워진다 (도 46, 47 및 48에서 도시됨). 열 전달 판(250)은 판(250) 및 백 수용 영역(248)의 온도가 품질 제어를 위해 모니터링되고 제어기에 의해 기록되는 것을 허용하는 온도 센서(256)를 포함한다. 판(250)은 위에서 기술된 표면(151 및 152)과 동일한 기능을 하는 제1 및 제2 표면(251 및 252)을 가진다.
각각의 풋은 장치(200)의 열 전달 판(250)에 대해 높이가 조정될 수 있고 그것의 이동의 표시는 또한 제어기에 의해 모니터링된다. 그러므로, 로터리 엔코더가 모터가 돌고 있음을 표시할 수 있어도, 기계적인 고장, 예컨대 톱니형 벨트(222)의 고장은 여전히 제어기에 의해 감지될 수 있으며, 적합한 행동이 실행될 수 있다, 예컨대 경보가 울린다.
장치(200)는 장치(100)와 동일한 외부 치수를 가지며, 장치의 하우징(210)은 위에서 기술되고 도 61에 도시된 바와 같이 냉동기 뚜껑이 제자리에 있는 상태에서 속도 제어 냉동고(40) 내부로 미끄러지도록 의도된다.
편리를 위해, 상부, 하부, 상하와 같은 용어, 및 예컨대 풋, 트레드 및 트레딩과 같은 보다 묘사적인 용어는 도면에 도시된 발명을 기술하기 위해 사용되었지만, 실제로, 도시된 장치는 그런 용어가 예를 들어 그 새로운 방향에서 반전되거나 덜 설명적이 되도록 임의의 방식으로 배향될 수 있다. 그러므로, 방향에 대한 제한은 그러한 용어 또는 동등한 용어에 의해 해석되지 않아야 한다.
발명은 폐쇄된 유연한 백 (10)에서 조직 샘플의 개별 세포 또는 세포 클럼프로의 분해를 위한 장치(100/100')를 제공하며, 장치는 기계적 분해 메커니즘(120) 및 조직 샘플 백 수용 영역(148)을 포함하고, 상기 장치는 열 에너지를 영역(148)에 또는 영역(148)으로부터 전달하기 위한 열 전달 판 (150)을 추가로 포함하며, 판은 영역(148)에 인접한 제1 판 표면(151) 및 영역(148)으로부터 멀리 떨어진 곳에서 만나는 외부 열 영향에 노출된 반대쪽 표면(152)을 가진다.
수집 시점에서 종양 조직의 냉동보존은 종양 수집으로부터 제조를 분리하는 능력을 초래하였다. 이것은 UTIL 제조가 종양 소화물의 해동으로부터 최종 TIL 수득 세척, 의약품 제형, 충전, 라벨링 및 냉동보존에 이르기까지 단일 제조 과정으로서 계획될 수 있고 수행될 수 있음을 의미한다.
최종 제품의 냉동보존은 모든 방출 테스트가 조건화 화학요법 및 환자 치료 전에 수행되어 최종 제품 제조로부터 제외되는 것을 가능하게 하였다.
유동 세포분석은 제조된 제품을 특성화하고 정량화하기 위하여 사용되었다. TILd는 출발 물질의 대표적인 샘플의 병리 평가에 의해 전이성 종양으로부터 유래된 배양물인 세포 표면 마커 CD3을 발현하는 T 세포로서 정의된다. 생존 능력은 초기 세포 사멸 마커 아넥신-V 및/또는 생존 능력 염료 DRAQ7 (트립판 블루 또는 PI의 동등물)에 결합하지 않는 모든 CD3+ 세포의 백분율을 토대로 한다. 순도는 생존 가능한 조혈 세포 집단(CD45+, 아넥신-V-ve, 및 DRAQ7-ve) 내의 생존 가능한 T 세포(CD3+, 아넥신-V-ve, 및 DRAQ7-ve)의 백분율로서 정의된다.
급속 팽창 프로토콜 (REP) 전의 세포의 대부분은 CD3을 발현하는 T 세포이다. 연구뿐만 아니라 임상 배치에서 CD3+CD8+ 및 CD3+CD4+ TIL의 가변적인 분포가 관찰되며 이것들은 종양 반응성 세포를 함유하는 하위세트를 포함할 것이다. TIL이 항-CD3과 함께 REP에서 팽창됨에 따라, 최종 제품은 거의 배타적으로 생존 가능한 CD3+ T 세포를 함유한다 (>94%).
이론적으로, 최종 제품은 종양 세포를 여전히 함유할 수 있지만 이것은 T 세포 성장 및 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 강력하고 선택적으로 촉진하는 배양 조건으로 인해 매우 가능성이 희박하다. 수 백개의 TIL 주입의 임상 데이터는 세포학에 의해 종양 세포의 존재를 나타내지 않았다. 데이터를 대조하여 궁극적으로 사양을 설정하기 위하여, 원래 IPC 검정에서 조혈성이 아니며 암 바이오마커의 빈도에 대해서도 또한 테스트될 모든 생존 가능한 세포 물질을 확인하기 위한 테스트가 포함되었다.
TIL 세포 약물 제품은 8.5% 인간 혈청 알부민 및 10% DMSO를 함유하는 대략 125-270 mL의 완충된 등장성 식염수 중의 현탁액이다. 존재하는 세포의 수는 배양 조건 및 제조 재생성과 함께 각각의 개별 TIL 세포의 배양에서 팽창되는 능력에 의존한다.
표 3 - 예시의 약물 제품 조성
구성요소 양 (주입 백당) 기능
종양 유래 T 세포 5x109 내지 5x1010 CD45+, CD3+, 아넥신-V-, DRAQ7- 세포 활성
20% 인간 혈청 알부민 8.5% HSA 중량/부피 흡착 억제제
인산염 완충 식염수 125 내지 270 ml 등장성 희석제
DMSO 10% 부피/부피 냉동보호제
도 1을 참조하면 장치의 분해 모듈이 개시된다. 장치는 효소적 소화를 포함하는 구체예에서 분해 및 소화를 위한 유연한 용기(1a)를 포함할 수 있다. 개방 단부(1b)는 고체 종양 조직 물질의 용기(1a)로의 전달을 허용한다. 거는 구멍(hanging hole)(1c)은 용기(1a)가 수송 또는 사용 중에 매달리고 지지되도록 한다. 장치의 무균성 조건을 유지하기 위하여, 목표 열 용접 위치(1d)는 용기(1a)가 열 용접기(13c) 또는 다른 비슷한 수단을 사용하여 밀봉될 수 있게 한다. 용기(1a)는 도 2a-c 또는 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예로의 전달의 일부로서 발생할 수 있는 손실을 줄이기 위하여 용기(1a)의 내부 표면 상에 둥근 가장자리(1e)를 가질 수 있다. 튜빙(1f)은 배지(3a)가 멸균 필터(2a)를 통해 용기(1a)에 전달되는 것을 가능하게 한다. 멸균 필터(2a)는 배지(3a)의 전달을 용이하게 하기 위해 후속 모듈에서 밀봉의 천공을 허용하기 위한 스파이크를 포함한다. 튜빙(1g)은 소화 효소(3b)가 멸균 필터(2b)를 통해 용기(1a)에 전달되는 것을 가능하게 한다. 멸균 필터(2b)는 소화 효소(3b)의 용기(1a)로의 전달을 용이하게 하기 위해 밀봉의 천공을 허용하기 위한 스파이크를 포함한다. 특히 효소적 소화를 포함하는, 고체 종양 조직의 분해 후에, 분해된 혼합물은 인큐베이션 단계에 진입하기 전에 멸균 필터(4b)를 포함한 필터 장치(4a)를 통해 튜빙(1h) 밖으로 전달된다. 필터 장치 (4a)는 여과 과정의 유용성에 영향을 주는 일 없이 뒤틀림을 허용하도록 유연할 수 있다. 필터(4b)는 비-분해된 조직을 제거한다. 튜빙 클램프(5a)는 배지(3a)가 멸균 필터(2a)를 통해 유연한 용기(1a)에 진입하는 것을 허용한다. 효소적 소화를 포함한 구체예에서, 튜빙 클램프(5b)는 효소(3b)가 멸균 필터(2b)를 통해 유연한 용기(1a)에 진입하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5c)는 유연한 용기(1a)의 내용물이 필터 장치(4a)를 통해 도 2a-c 또는 도 3a 또는 도 3b에서 확인된 하나 이상의 예로 통과하는 것을 허용한다.
도 2a에 따르면, 멸균 필터(2c)는 분해된 종양 조직의 냉동보존에 요구되는 배지(3a) 및/또는 동결 용액(3c)의 도입을 허용한다. 필터(4d)는 세포/조직 클럼프의 추가적인 크기 분리에 필요할 수 있다. 필터(4d)는 여과 과정의 유용성에 영향을 주는 일 없이 뒤틀림을 허용하도록 유연할 수 있는 필터 장치(4c) 내에 포함된다. 구체예에서, 필터(4e)는 세포를 유지하기 위해 필요할 수 있지만, 배지 및 세포 단편이 세척되어 나가는 것을 허용한다. 필터(4d)는 유사하게 필터 장치(4c) 내에 포함된다. 구체예에서, 튜빙 클램프(5d)는 필터 장치(4a 및 4c)를 통과한 용기(1a)로부터의 물질이 용기(1a)로 되돌아가는 것을 방지하기 위해 제자리에 있다. 구체예에서, 튜빙 클램프(5e)는 필터 장치(4a, 4c, 및 4e)를 통과한 용기(1a)로부터의 폐기물이 페기물 용기(6a)에 진입하는 것을 허용하지만, 배지(3a 또는 3c)가 멸균 필터(2c)를 통해 진입하는 것을 중단하기 위해 제자리에 있다. 튜빙 클램프(5f)는 폐기물이 튜빙 클램프(5e)를 통해 폐기물 용기로 통과하기 전에 필터 장치(4a, 4c, 및 4e)를 통과한 용기(1a)로부터의 물질이 배지(3a 또는 3c)의 공급원으로 되돌아가거나 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예 중 하나로 전달되는 것을 중단시킨다. 폐기물이 고갈된 후에는, 튜빙 클램프(5e 및 5d)는 폐쇄되고 튜빙 클램프(5f)는 배지(3a 또는 3c)가 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예 중 하나로 필터(4e) 내의 세포를 전달하는 것을 허용한다. 폐기물 용기(6a)는 사용 및/또는 수송 중에 폐기물 용기(6a)를 지지하기 위한 거는 구멍을 가진다.
도 2b는 장치의 풍부화 모듈을 예시한다. 튜빙 클램프(5g)는 용기(1a)의 내용물이 필터 장치(4a)를 통해 풍부화 모듈의 유연한 용기(7a)에 진입하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5h)는 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(8a)를 통과하여, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편, 폐기물 및 파편이 풍부해진 세포가 개방된 튜빙 클램프(5i)를 통해 용기(7a)로 되돌아가기 전에 밸브(8c)에 의해 제어된 압력으로 필터(8b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5i)는 용기(7a)의 내용물이 개방된 튜빙 클램프(5h)를 통해 필터 장치(8a)를 통과하여, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 폐기물 및 파편이 풍부해진 세포가 용기(7a)로 되돌아가기 전에 밸브(8c)에 의해 제어된 압력으로 필터(8b)를 통해 통과하는 것을 허용한다. 세포 풍부화가 일어난 후에는, 튜빙 클램프(5h)는 폐쇄되고 튜빙 클램프(5j)는 개방되어 용기(7a)의 내용물이 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예 중 하나로 통과하는 것을 허용한다. 폐기물 용기(6a)는 사용 및/또는 수송 중에 폐기물 용기(6a)를 지지하기 위한 거는 구멍(6b)을 가진다. 풍부화 모듈의 용기(7a)는 사용 및/또는 수송 중에 용기(7a)를 지지하기 위한 거는 구멍(7b)을 가진다. 용기(7a)는 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예로의 전달의 일부로서 발생할 수 있는 손실을 줄이기 위하여 용기(7a)의 내부 표면 상에 둥근 가장자리(7c)를 가질 수 있다. 튜빙(7d)은 용기(7a)가 필터 장치(4a) 및 필터 장치(8a)를 통해 용기(1a)의 내용물을 수용하는 것을 허용한다. 튜빙(7e)은 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(8a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 풍부해진 세포가 개방된 튜빙 클램프(5i)를 통해 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(8c)에 의해 제어된 압력으로 필터(8b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 튜빙(7f)은 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(8a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 풍부해진 세포가 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(8c)에 의해 제어된 압력으로 필터(8b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다.
도 2c는 풍부화 모듈의 또 다른 구체예를 도시한다. 튜빙 클램프(5g)는 용기(1a)의 내용물이 필터 장치(4a)를 통해 유연한 용기(7a)로 진입하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5h)는 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(9a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편, 풍부해진 세포가 개방된 튜빙 클램프(5i)를 통해 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(9c)에 의해 제어된 압력으로 필터(9b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5i)는 용기(7a)의 내용물이 개방된 튜빙 클램프(5h)를 통해 필터 장치(9a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 풍부해진 세포가 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(9c)에 의해 제어된 압력으로 필터(9b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 세포 풍부화가 발생한 후, 튜빙 클램프(5h)는 폐쇄되고 튜빙 클램프(5j)는 개방되어 용기(7a)의 내용물이 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예 중 하나로 통과하는 것을 허용한다. 폐기물 용기(6a)는 사용 및/또는 수송 중에 폐기물 용기(6a)를 지지하기 위한 거는 구멍(6b)을 가진다. 풍부화 모듈의 용기(7a)는 사용 및/또는 수송 중에 용기(7a)를 지지하기 위한 거는 구멍(7b)을 가진다. 용기(7a)는 도 3a 또는 도 3b에 예시된 예로의 전달의 일부로서 발생할 수 있는 손실을 줄이기 위하여 용기(7a)의 내부 표면 상에 둥근 가장자리(7c)를 가질 수 있다. 튜빙(7d)은 용기(7a)가 필터 장치(4a) 및 필터 장치(9a)를 통해 용기(1a)의 내용물을 수용하는 것을 허용한다. 튜빙(7e)은 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(9a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 풍부해진 세포가 개방된 튜빙 클램프(5i)를 통해 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(9c)에 의해 제어된 압력으로 필터(9b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 튜빙(7f)은 용기(7a)의 내용물이 필터 장치(9a)를 통과하고, 세포를 보유하고 풍부화하는 것을 허용하는 한편 풍부해진 세포가 용기(7a)로 되돌아가기 전에 폐기물 및 파편이 밸브(9c)에 의해 제어된 압력으로 필터(9b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 통과하는 것을 허용한다. 필터 장치(9a)는 풍부해진 세포가 용기(7a)로 되돌아가기 전에 밸브(9c)에 의해 제어된 압력으로 폐기물 및 파편을 필터(9b)를 통해 폐기물 용기(6a)로 제거하기 위해 용기(7a)의 내용물의 여과를 용이하게 한다. 필터(9b)는 폐기물이 폐기물 용기(6a)에 도달하기 전에 용출되어야 하는 거리를 증가시키면서 개선된 필터(9b)의 수송 및 보관을 촉진하기 위하여 코일로 감겨질 수 있다.
도 3a는 안정화 모듈의 예를 도시한다. 튜빙 클램프(5k)는: 용기(1a)의 내용물이 도 1에 예시된 것과 같이 필터 장치(4a)를 통해, 또는 도 2a에 예시된 것과 같이 필터 장치(4c)를 통해; 또는 용기(7a)의 내용물이 도 2b에 예시된 것과 같이 필터 장치(8a)를 통해, 또는 도 2c에 예시된 것과 같이 필터 장치(9a)를 통해 안정화 모듈의 용기(10a)로 전달되는 것을 허용한다. 안정화 모듈의 용기(10a)는 사용 및/또는 수송 중에 용기(10a)를 지지하기 위한 거는 구멍(10b)을 가진다. 용기(10a)는 튜빙(10e 또는 10f) 외부로의 전달의 일부로서 발생할 수 있는 손실을 줄이기 위하여 용기(7a)의 내부 표면 상에 둥근 가장자리(10c)를 가질 수 있다. 튜빙(10e)은 용기(10a)의 내용물이 연결기(10h)를 통해 철회되는 것을 가능하게 한다. 튜빙(10f)은 용기(10a)의 내용물이 철회되는 것을 가능하게 하기 위해 무균성 커버(10g)를 통해 멸균 스파이크를 도입하는 것을 가능하게 하기 위한 유연한 막을 함유한다.
도 3b는 안정화 모듈의 또 다른 구체예를 도시한다. 튜빙 클램프(5l)는: 용기(1a)의 내용물이 도 1에 도시된 것과 같이 필터 장치(4a)를 통해, 또는 도 2a에 도시된 것과 같이 필터 장치(4c)를 통해; 또는 용기(7a)의 내용물이 도 2b에 도시된 것과 같이 필터 장치(8a)를 통해, 또는 도 2c에 도시된 것과 같이 필터 장치(9a)를 통해 안정화 모듈의 용기(11a)로 전달되는 것을 허용한다. 안정화 모듈의 용기(11a)는 사용 및/또는 수송 중에 용기(10a)를 지지하기 위한 거는 구멍(11b)을 가진다. 용기(10a)는 튜빙(11f) 외부로의 전달의 일부로서 발생할 수 있는 손실을 줄이기 위하여 용기(7a)의 내부 표면 상에 둥근 가장자리(10c)를 가질 수 있다. 튜빙 클램프(5m)는 배지(3c)가 멸균 필터(2c)를 통해 유연한 용기(11a)에 진입하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5n)는 튜빙 클램프(5o, 5p, 5q, 5r, 5s, 및 5t)의 개방된 또는 폐쇄된 상태에 따라 용기(11a)의 내용물이 냉동보존 용기(12a) 중 하나에 진입하는 것을 허용한다. 튜빙 클램프(5o, 5p, 5q, 5r, 5s, 및 5t)는 용기(11a)의 내용물이 냉동보존 용기(12a) 중 하나에 진입하는 것을 허용한다. 튜빙(11d)은 용기(11a)가: 도 1에 도시된 것과 같이 필터 장치(4a), 또는 도 2a에 도시된 것과 같이 필터 장치(4c)를 통해 용기(1a)의 내용물; 또는 용기(7a)의 내용물 도 2b에 도시된 것과 같이 필터 장치(8a)를 통해, 또는 도 2c에 도시된 것과 같이 필터 장치(9a)를 통해 용기(7a)의 내용물을 수용하는 것을 가능하게 한다. 튜빙(11e)은 냉동보존 배지(3c)가 용기(11a)로 전달되는 것을 허용한다. 튜빙(11f)은 용기(11a)의 내용물이 냉동보존 용기(12a)에 전달되는 것을 가능하게 하고, 거기에서 최종 분해된 UTIL 제품은 단일 세포 현탁액으로서 미래에 급속 팽창 과정에 사용하기 위해 보관된다. 냉동보존 용기(12a)는 냉동보존 용기(12a) 외부로의 TIL의 무균성 전달을 허용하기 위한 고정부(12b)를 가진다. 냉동보존 용기(12a)는 보관될 UTIL 세포 현탁액의 부치레 적합한 공간(12c)을 가진다. 냉동보존 용기(12a)는 또한 튜빙(11f)을 냉동보존 용기(12a)에 용접하기 위한 목표 위치(12d)를 가진다.
도 4는 장치 및 키트의 또 다른 예를 도시한다. 못(13a)은 배지(3a, 3b, 및 3c)가 매달리는 것을 허용한다. 못(13b)은 용기(1a)를 매달기 위한 중량 센서에 연결되며 사용된 구체예에 따라 하나 이상의 용기(7a, 10a, 및/또는 11a)를 포함할 수 있다. 중량 센서는 물질의 자동화된 프로세싱을 제어하기 위한 결정 단계를 정의하기 위해 사용된다. 열 용접기(13c)는 절제된 고체 종양 조직의 용기(1a)로의 오딥을 허용하는 목표 부위에서 용기(1a)를 밀봉하기 위해 사용될 수 있다. 분해 모듈(13d)은 분해를 가능하기 위해 폐쇄되고 잠금될 수 있는 개구부를 가지며 소화 효소가 고체 종양 조직의 분해를 위해 사용되는 소화를 가능하게 하기 위해 1℃의 허용 오차로 0℃ 내지 40℃가 되도록 온도를 제어할 수 있다. 분해 모듈(13d)은 또한 변화를 확인하기 위해 시간에 대한 광 분포의 변화를 결정함으로써 고형 조직 분해의 수준을 평가하고 이에 따라 몇 초에서 몇 시간의 기간에 걸쳐 발생하는 분해 과정의 완료를 확인하는 내장형 센서를 갖는다. 분해 모듈(13d)은 또한 용기(1a)와 직접 접촉하고 분해 모듈(13d) 엔클로저의 후면에 대해 밀어내는 분해 표면(13f)을 포함할 수 있고, 그것은 효소가 사용되는 분해 및 소화 중에 폐쇄되고 잠금될 수 있다. 최종 제형화 모듈(13e)은 사용된 구체예에 따라, 1℃의 허용 오차로 0℃ 내지 주변 환경 온도의 온도를 제어할 수 있는 용기(10a 또는 11a)의 온도 제어를 허용하는 엔클로저를 가진다. 튜빙 클램프(13g 및 13j)는 튜빙 로케이터(13i) 내에 배치된 입력 및 출력 포트로서 작용하며, 사용된 구체예에 따라 분해된 종양 생성물의 용기(1a, 10a, 또는 11a) 사이로의 수송을 용이하게 한다. 연동 튜빙 펌프(13h)는 유입 및 유출 포트로서 작용하는 튜빙 클램프(13g 및 13j) 사이에서 배지(3a 또는 3c)의 전달을 제어한다. 튜빙 밸브(13k)는 도 2b 및 2c에 도시된 풍부화 모듈에서 밸브(8c 및 9c)를 통해 압력을 제어하는 것을 보조한다. 못(13l)은 사용된 구체예에 따라 폐기물 용기(6a) 및/또는 냉동보존 용기(12a)의 매달림을 허용한다. 구체예는 또한 도 3b에 도시된 것과 같이 냉동보존 용기(12a)를 장치에 연결하기 위해 필요한 튜빙 용접기(13m)를 포함할 수 있다. 구체예는 또한 도 3b에 도시된 것과 같이 냉동보존 용기(12a)를 장치에서 연결을 중단하기 위해 필요한 튜빙 절단기(13n)를 포함할 수 있다. 속도 제어 냉각 모듈(13o)은 냉동보존 과정을 보조하기 위하여 8℃와 적어도 -80℃ 사이의 임의의 온도로 냉각하거나 유지할 수 있다.
발명의 방법은 다음 과정을 따라 예시된다. 방법의 본질적인 특징 외에, 본원에 열거된 다양한 선택적인 단계가 달성될 샘플화 유형 및 결과와 관련된 연관된 기술적 이점을 달성하기 위하여 독립적으로 조합될 수 있다고 분명하게 명시된다.
반자동 무균성 조직 프로세싱 방법은: 무균성 분해 조직 프로세싱 단계 및 하나 이상의 추가의 조직 프로세싱 단계 및 그것들의 관련된 조건을 무균성 프로세싱 키트 상의 디지털 태그 식별자로부터, 선택적으로 본원에 기술된 키트에 따라 자동적으로 측정하는 단계; 조직 샘플을 무균성 프로세싱 키트의 유연한 플라스틱 용기에 배치하는 단계; 및 하나 이상의 조직 프로세싱 단계를 분해 모듈; 선택적 풍부화 모듈; 및 안정화 모듈과 연통하고 제어함으로써 자동적으로 실행하여 조직 샘플을 프로세싱하는 단계를 포함한다.
본질적으로 과정은 생검/조직 샘플, 바람직하게는 절제된 종양을 수용할, 단부가 개방된 백 (분해 모듈의 일부인 제1 유연한 용기)을 취하는 것을 포함할 수 있으며, 백은 이미 하나 이상의 도관을 통해 도는 수동 작동자 제어된 무균성 연결을 통해 다음에 연결될 수 있다:
I. 소화 배지를 가지며 (분해 모듈의 일부인 제2 유연한 용기) 안정화 용액이 있거나 없는 (동일한 제2 유연한 용기는 또한 안정화 모듈의 일부임) 단일 용기
II. 소화 용액이 있는 한 용기 (분해 모듈의 일부인 제2 유연한 용기) 및 안정화 용액이 있는 또 다른 용기 (제4 유연한 용기은 안정화 모듈의 일부임)
생검 및 개방 단부 백의 밀봉에 추가하여 도관 또는 무균성 연결 (도관/포트, 청구범위 제1항)을 통해 첨가될 수 있는 소화 비재 및 프로세싱될 조직 물질.
조직이 이제 단일 또는 소수의 응집 세포 현탁액이 되는 소화 완료시, 세포는 단계 4 이전에 선택적으로 여과될 수 있다 (여과를 위한 선택적 풍부화 모듈은 샘플을 함유한 제1 유연한 용기를 포함하며 풍부해진 여과물을 수용하기 위한 제3 용기로 여과됨).
안정화 배지가 동일한 유연한 용기에 존재하지 않는 경우, 안정화 용액이 있는 용기는 부착된 도관을 열거나 수동 작동자 제어된 무균적 연결을 개방함으로써 추가되고 개방될 상기 연결은 두 경우 모두 과정이 계속되기 전에 안정화 용액이 첨가되는 것을 가능하게 한다.
원래의 유연한 용기의 또는 그 후에 다수의 보관 안정화 용기에 선택적으로 세분화될 수 있는 단일 또는 소수의 응집 세포 현탁액은 그것의 궁극적인 이용을 위한 제거, 수송, 보관 및 또는 사용되기 전에 장치 상에 안정적인 상태로 유지되고/거나 냉동보존될 것이다.
과정의 하나의 추가의 제한적인 예에서:
a) 필요한 조직 물질을 수집하기 위해 생검 또는 수술에 의한 조직 샘플의 수집 (발명의 일부가 아님)은 초기의 유연한 플라스틱 용기에 배치된다 (예컨대, 도 1, 용기(1a) 참고).
b) 배지 (예컨대 도 1, 배지(3a) 참고)는 분해 챔버로 전달되거나, 또는 한 예에서는 중량 센서 (예컨대 도 1, 모듈(13d)의 일부로서 (13b) 참고)와 같은 메커니즘이 고형 조직의 직접 작동자 유입 또는 무게 측정에 의해 측정된 첨가될 배지의 필요한 양을 평가하는 발명의 다음의 실시예 중 하나 이상을 사용하는 분해 전에 또한 분해 챔버로 진입하고 효소를 수집한다 (예컨대 도 1, 효소(3b) 참고).
c) 일회용 유연한 분해 용기, 고형 조직, 배지 및 한 예에서 효소는 최소 수 초 내지 최대 수 시간 동안 물리적 분해 과정 중에 조합되며, 시각적인 변화가 없을 때까지 고형 조직을 파괴하기에 필요한 최적 시간은 1 내지 10분이다 (도 5 및 표 1 참고). 분해 장치는 분해 모듈 내에서 분해하고 센서를 통해 피드백하기 위해 취해진 가변 속도 및 시간을 사용하여 조직을 압축하도록 설계된다(도 1, (13d) 참고).
d) 효소가 존재하는 한 구체예에서 이것은 30 내지 37℃의 최적 온도에서의 배양 주기를 필요로 하겠지만 적어도 1분 내지 수 시간 동안, 그러나 보다 바람직하게 15 내지 45분 동안 0℃ 내지 40℃로 낮을 수 있다.
e) 단계 c) 및 조직이 변화를 중단할 때까지 또는 참조 예가 액체 세포 현탁액으로 분해될 때까지 효소 단계 d)가 반복될 수 있는 구체예에서 어느 경우든지 분해 모듈에서 센서에 의해 첫 번째로 모니터링된다 (도 1, (13d) 참고).
f) 한 구체예에서 불완전하게 분해된 조직, 관련된 물질 및 불순물이 제거되고 다음 구체예 중 하나 이상을 사용하여 분해된 조직 및 배지를 통과시킴으로써 세포 현탁액의 풍부화를 가능하게 한다:
i. 적어도 >0.1 μm 내지 1000 μm이지만 가장 바람직하게 50 내지 250 μm 및 보다 바람직하게 100 μm 내지 200 μm의 구멍을 가진 하나 이상의 기계적 필터를 통한 직접 통과 (도 2a에 도시됨).
ii. 세포 정렬된 밀도 보유 용액이 있거나 없이 원심분리 및/또는 침강을 사용하는 밀도 기반 분리 (예컨대 Ficoll-paque GE Healthcare).
iii. 유체 흐름 및 흐름 방해 물질이 크기 및 모양을 토대로 세포 및 불순물의 분해 및 분획화를 향상시키는 유체역학적 여과
iv. 적용된 장 (예컨대 흐름, 전기, 중력, 원심분리 장)이 선택된 흐름에 대해 수직 또는 역방향으로 작용하는 장 흐름 분획화 (예컨대 접선 흐름 여과, 중공 섬유 흐름 여과, 비대칭 흐름 여과, 원심분리 흐름 여과). 그런 경우에: 힘에 대해 가장 반응성인 세포 또는 불순물은 흐름이 최저인 벽으로 구동되고 따라서 긴 보유 시간을 가지는 한편; 힘에 대해 가장 적게 반응하는 세포 또는 불순물은 흐름에 대해 층으로 남아 빠르게 용출된다 (도 2b 및 c에 도시된 접선 흐름 여과).
v. 입력 스트림에 대한 접선 경로에서 필요한 세포 또는 불순물을 구동하기 위해 세포 또는 불순물 집단에 조정되거나 조화된 하나 이상의 음향 주파수가 사용되는 음향 영동.
g) 한 구체예에서 분해된 풍부해진 조직 생성물은 다음과 같은신선한 배지 (배지(3a)를 사용하는 도 2a)에서 재현탁될 것이다:
i. 이전에 기술된 것과 같은 독립적인 표적화된 풍부화를 진행하기 위한 세포 풍부화 배지
ii. 직접 세포 배양 또는 저온 보관 배지 (예컨대 BioLife Solution으로부터의 HypoThermosol®)
h) g)에서 사용된 구체예에서 재현탁된 분해된 고체 조직 유래 생성물은 그것의 궁극적인 용도로 사용되기 전에 수 시간 내지 수 일 동안 보관을 위해 구체예의 최종 제품 용기 중 하나로 전달된다 (도 3a에 도시됨).
i) 그렇지 않으면 단계 f) 후에 분해된 고형 조직 유래 생성물이 분해된 고형 조직 유래 생성물의 보관을 위해 수 일 내지 수 년 동안 BioLife Solution으로부터의 CryoStor® 동결 용액과 같은 냉동보호제 (도 3b, 배지(3c)) 동결 용액에서 재현탁을 진행하는 구체예 적용 (도 3b에 도시됨)이 적용될 것이다.
j) 이 단계에서 분해된 고형 조직 유래 생성물은 동결 용액에 재현탁되고 (도 4, 모듈(13e)) 하나 이상의 유연한 냉동보존 용기(들)에 전달되며 (도 3a에 도시됨, 용기(12a)) 장치의 한 구체예에 속도 제어 동결 과정이 있다 (도 4, 모듈(13o)).
k) 그런 후에 백은 독립적인 보관 또는 분포를 위해 장치 및 무균성 프로세싱 키트로부터 분리될 수 있다.
추가의 구체예에서, 발명의 일회용 키트가 조직 샘플의 반자동 무균성 프로세싱을 위해 자동 장치와 함께 사용될 수 있다. 도 6 및 7은 발명의 일회용 키트를 도시한다.
도 6은 분해 및 안정화에 사용된 과정의 모델의 일부인 상이한 출발 용액에 대해 다중 유연한 용기를 사용하는 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법을 도시한다.
과정 단계 1 - 사용자는 장치에 로그인하여 사용될 자동 프로세싱 단계를 전달하기 위해 장치를 사용하여 무균 키트 상에서 태그를 스캐닝할 수 있다. 장치 프로세서는 태그를 인식하고 그 특정 키트에 관련된 특정 프로세싱 지침을 수행하기 위해 필요한 정보를 제공한다.
과정 단계 2 - 소화 배지 함유 유연한 백 (분해 모듈의 일부) 및 냉동/안정화 용액 함유 유연한 백 (안정화 모듈의 일부)은 각각 장치에 매달려 있거나 고정된다.
과정 단계 3 - 프로세싱용 생검 또는 조직 샘플은 개방된 단부를 통해 무균 키트의 유연한 용기 (두 모듈의 일부임)에 배치될 수 있다.
과정 단계 4 - 그런 후 샘플을 포함하는 유연한 용기는 개방된 단부 (초기 프로세싱 중 샘플을 첨가하기 위해 사용됨)를 폐쇄하기 위하여 열 용접을 사용하여 밀봉될 수 있다.
과정 단계 5 - 사용자는 그런 후 프로세서의 사용자 인터페이스와 상호작용하여 조직 샘플이 존재하는 것을 확인하고 필요하다면 임의의 추가 조직 물질 특정 정보에 진입할 수 있다.
과정 단계 6 - 소화 배지 및 냉동/안정화 용액 유연한 용기는 샘플을 하우징하는 유연한 용기와 연결되고, 그 후 그것은 자동 프로세싱을 위한 장치에 배치될 수 있다.
과정 단계 7 - 장치는 샘플의 분해 및 결과적으로 생성된 세포의 안정화/냉동보존을 수행하는 키트 정보에 따라 사이클을 실행한다.
과정 단계 8 - 안정화/냉동될 때 키트의 사용된 배지 및 냉동/안정화 용기는 연결이 중단되고 버려진다. 유연한 용기에서 단일 또는 다중 세포 용액으로 프로세싱된 조직은 그것의 궁극적인 사용 전에 보관 또는 수송 용기로 전달되기 전에 연결이 중단된다.
또 다른 구체예에서, 도 7은 무균성 프로세싱 키트의 모듈과 방법 사이에서 공유될 수 있는 과정에 사용된 배지를 포함하는 유연한 용기를 도시한다.
과정 단계 1 - 사용자는 장치에 로그인하여 사용될 자동 프로세싱 단계를 전달하기 위해 장치를 사용하여 무균 키트 상에서 태그를 스캐닝할 수 있다.
과정 단계 2 - 배지 및 냉동안정화 용액을 모두 포함하는 유연한 백 (분해/안정화 모듈의 일부)은 장치에 매달리거나 그렇지 않으면 고정된다.
과정 단계 3 - 프로세싱용 생검 또는 조직 샘플은 개방된 단부를 통해 무균 키트의 추가의 유연한 용기 (두 모듈의 일부임)에 배치될 수 있다.
과정 단계 4 - 그런 후 샘플을 포함하는 유연한 용기는 개방된 단부를 폐쇄하기 위하여 열 용접을 사용하여 밀봉될 수 있다.
과정 단계 5 - 사용자는 그런 후 프로세서의 사용자 인터페이스와 상호작용하여 조직 샘플이 존재하는 것을 확인하고 필요하다면 임의의 추가 조직 물질 특정 정보에 진입할 수 있다.
과정 단계 6 - 소화 배지 및 냉동/안정화 용액 유연한 용기는 샘플을 하우징하는 유연한 용기와 연결되고, 그 후 그것은 자동 프로세싱을 위한 장치에 배치될 수 있다.
과정 단계 7 - 장치는 샘플의 분해 및 선택적으로 냉동보존을 통해 결과적으로 생성된 세포의 안정화를 가능하게 하기 위해 순환된다.
과정 단계 8 - 동결/안정화가 완료될 때 사용자는 키트의 사용된 유연한 용기의 연결을 중단하고 폐기한다. 나머지 유연한 용기에서 단일 또는 다중 세포 용액으로 프로세싱된 조직은 그것의 궁극적인 사용 전에 보관 또는 수송 용기로 전달되기 전에 연결이 중단된다.
예를 들면, 분해 과정은 효소적 소화가 보충되는 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 효소적 소화를 위한 배지 제형은 단백질 붕괴를 도와서 세포 대 세포 경계가 위에서 기술된 것과 같이 붕괴되는 것을 유발하는 효소로 보충되어야 한다.
세포 배양 또는 세포 취급 기술분야에 알려져 있는 다양한 액체 제형: 한정하는 것은 아니지만, 다음의 배지: 기관 보존 용액, 선택적 용해 용액, PBS, DM EM, HBSS, DPBS, PM I, 이스코브 배지, XVIVOTM, AIM-VTM, 락테이트 첨가된 링거액, 링거 아세테이트, 식염수, PLASMALYTETM 용액, 결정질 용액 및 IV 유체, 콜로이드 용액 및 IV 유체, 물 중의 5% 덱스트로스 (D5W), 하트만 용액 DM EM, HBSS, DPBS, RPMI, AIM-VTM, 이스코브 배지, XVIVOTM 중 하나 이상은 고형 조직의 세포 분해 및 효소적 소화에 사용된 액체 제형으로서 사용될 수 있으며, 각각은 세포 회수 및 생존 또는 특정 세포 고갈을 보조하기 위하여 추가적인 세포 지지 인자, 예컨대 소 태아 혈청, 인간 혈청 또는 혈청 대체물 또는 다른 영양소 또는 사이토카인으로 추가로 보충될 수 있다. 배지는 상기 언급된 배지와 같은 표준 세포 배지 또는 예컨대 일차 인간 세포 배양 (예컨대 내피 세포, 간세포 또는 각질 형성 세포) 또는 줄기 세포 (예컨대 수지상 세포 성숙화, 조혈 팽창, 각질 형성 세포, 간엽 줄기 세포 또는 T 세포)를 위한 특수 배지일 수 있다. 배지는 기술분야에 잘 알려져 있는 보충물 또는 시약, 예컨대 알부민 및 수송 단백질, 아미노산 및 비타민, 금속 이온(들), 항생물질, 부착 인자, 탈착 인자, 계면활성제, 성장 인자 및 사이토카인, 호르몬 또는 가용화제를 가질 수 있다. 다양한 배지는 예컨대 ThermoFisher, Lonza 또는 Sigma-Aldrich 또는 유사한 배지 제조사 및 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다.
효소적 소화에 필요한 액체 제형은 적어도 0.1 mM 내지 50 mM, 2 내지 7 mM의 최적 범위, 이상적으로 5 mM로 존재하는 충분한 칼슘 이온을 가져야 한다.
소화될 고형 조직은 분해 후에 킬레이트화제 EGTA 및 EDTA를 함유하는 액체 제형으로 세척되어 효소적 소화 전에 부착 인자 및 억제 단백질이 제거될 수 있다.
효소적 소화에 필요한 액체 제형은 효소 안정성 및 활성에 필요한 칼슘 이온을 제거함으로써 효소 활성을 심각하게 억제할 수 있는 최소 킬레이트화제 EGTA 및 EDTA로 보다 최적화된다. 더불어, b-머캅토에탄올, 시스테인 및 8-하이드록시퀴놀린-5-설포네이트가 다른 알려져 있는 억제 물질이다.
바람직한 구체예에서 기술되는 것과 같이, 냉동보존을 위한 최종 세포 용기는 탄력 있는 변형 물질로부터 제조된 유연한 용기이다. 장치의 이 구체예에서 최종 용기는 -20 내지 -190℃의 냉동고로 직접 전달되거나, 또는 장치와 결합되어 또는 별도로 공급된 (예를 들어 Planer Products 또는 Asymptote Ltd에 의해 제조됨) 속도 제어 동결 장치에 최적으로 위치되며 여기서 풍부해진 분해된 고형 조직 용기를 함유하기 위해 사용된 동결 챔버 및 유연한 보관 용기(들)의 온도는 저온 가스 (보통 질소, 예를 들어 Planer 제품)를 주입하거나; 또는 제어된 냉각 표면(들)으로부터 열을 먼 곳으로 제거함으로써 제어된다. 두 방법 모두 1℃ 미만 또는 보다 바람직하게는 0.1℃ 미만의 오차로 특정 세포(들)가 동결 용액 및 제품의 원하는 생존 능력을 토대로 냉동되기 위해 필요한 속도로 동결 과정을 정확하게 제어하는 능력을 초래한다. 이런 냉동보존 과정은 이상적으로 동결 용액의 용융 온도까지 가능한 가까운 얼음 핵형성 온도를 고려해야 한다. 수성 용액에서의 결정 성장에 이어서, 물이 시스템으로부터 얼음으로서 제거되고, 잔류하는 비-동결 용액의 농도는 증가한다. 온도가 내려감에 따라 더 많은 얼음이 형성되고, 잔류하는 비-동결 분획은 감소하며 추가로 농도가 증가한다. 수성 용액에는, 얼음이 농축된 수성 용액과 공존하는 큰 온도 범위가 존재한다. 궁극적으로 온도 감소를 통해 용액은 동결 용액 및 세포가 점성 용액으로부터 고체 유사 상태로 이동하는 지점인 유리 전이 상태에 도달하고 이 온도 아래에서 세포는 더 이상 생물학적 변화를 진행할 수 없으므로 필요할 때까지 잠재적으로 수십년 동안 안정화된다.
본 발명의 방법에 의해 달성된 분해된 세포 생성물은 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 모든 방법에 다라 배양 및/또는 분석될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 TIL은 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 연구, 진단, 조직-은행, 바이오뱅크, 약물학적 또는 임상적 적용과 같은 후속 단계에 사용될 수 있다. 그런 후 TIL은 본 출원에 최적화된 배지, 예컨대 일반적으로 한정하는 것은 아니지만 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21과 같은 성장 인자를 함유한 T 세포 혼합 배지 (세포ular Therapeutics) 또는 항체로 코팅된 플레이트 또는 폴리스티렌 비드와 같은 자극 조건을 사용하여 배양될 수 있다. 본 발명에서 분리된 세포는 배양 용기에 시딩되었고 1 내지 40℃, 일반적으로 37℃의 온도에서 가습 분위기 (1-20%의 일반적으로 5% CO2, 80 내지 99%의 일반적으로 95% 공기)에서 수 주 동안과 같은 기술분야에 숙련된 사람에 의해 표준으로 사용된 과정을 사용하여 유지되었고 보충물은 10% FBS 및 3000 IU/mL IL-2로 보충될 수 있다.
풍부해진 TIL은 세포 배양 전 및/또는 후에 치료법, 예컨대 세포 요법, 또는 질환의 예방에 제약학적 조성물로서 사용될 수 있을 것이다. 제약학적 조성물은 가능하게는 치료적 유효량의 제약학적 조성물의 포유류에의 투여를 포함하여 포유류, 특히 인간에서의 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
그러한 TIL 배양물은 다양한 암의 치료를 위한 약물 제품으로서 제형화되는 것 외에, 예컨대 세포 기능, 종양 세포 사멸, 세포 신호전달, 바이오마커, 세포 경로, 핵산, 및 다른 도너, 조직, 세포 또는 핵산 상태를 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 세포 또는 조직 관련 인자를을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
질환은 임의의 질환일 수 있고, 고형 조직 유래 세포의 존재를 통해 및/또는 관련된 장소, 즉 종양 또는 질환 부위에 있는 관련된 세포의 농도의 증가를 통해 치료 및/또는 예방될 수 있다. 치료된 및/또는 예방적으로 치료된 질환은 임의의 장애, 예컨대 암 또는 퇴행성 장애일 수 있다. 치료는 풍부해진, 조작된 또는 팽창된 세포 또는 이것들의 임의의 조합의 이식일 수 있고 신체의 관련된 일부에 투여되거나 전신적으로 공급될 수 있다.
본 개시의 제약학적 조성물은 치료될 (또는 예방될) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정되겠지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기술된 것과 같이 발명은 조직, 특히 포유류 조직과 같은 물질의 수용, 프로세싱, 분류, 및/또는 분리를 허용하는 키트를 제공한다. 추가로, 발명은 유연한 용기, 예를 들어 백, 필터, 밸브, 브라켓, 클램프, 연결기, 및/또는 튜빙과 같은 도관와 같은 키트의 구성요소를 제공한다. 특히, 백은 냉동보존 키트의 다양한 구성요소 사이에 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 튜브 또는 튜빙의 섹션에 결합될 수 있다.
냉동보존 키트 및/또는 수집 백을 사용하여 세포로 조직을 프로세싱하는 것은 자동화된 및/또는 반-자동화 장치 및 방법을 포함할 수 있다.
더욱이, 기술분야에 통상적인 지식과 함께 본원에 기술된 백, 키트, 장치 및 과정을 사용함으로써, 본 개시의 추가의 구체예는 쉽게 확인될 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들은 공지된 변화를 쉽게 이해할 것이다.
디자인 특허 출원 일련 번호 29/740,293은 조직 수집에 적합한 조직 수집 백을 제공한다. 발명의 조직 수집 백의 상부는 조직, 예컨대, 조직 생검, 예컨대 동물 (예컨대, 개 또는 고양이와 같은 가축) 또는 인간 암성 조직을 수용하기 위해 개방된다. 조직 수집 백은 그 안에 수집된 조직과 함께 밀봉되어야 하며, 그렇게 밀봉된 그 안의 조직의 경우 그 안에서 프로세싱되어야 하고, 예컨대, 프로세싱은 교반 및/또는 압축, 예컨대 부드러운 교반 및/또는 압축, 및/또는 그 안에서 조직의 효소적 소화를 포함할 수 있다. 유리하게 원하는 물질, 예컨대 종양 침윤 림프구 (TIL)로부터의 그 안에서의 조직 프로세싱 및 추출은 폐쇄된 시스템에서 이루어질 수 있다. 유리한 또는 바람직한 구체예는 조직이 수집되는 환자 및/또는 수집 백이 교반을 적용하기 위하여 기구의 제자리에서 클램핑되거나 고정되는 곳을 보여주는 표시 및/또는 수집 백이 예컨대 열 밀봉 (프로세싱을 위한 기구의 일부일 수 있음)에 의해 밀봉될 수 있는 표시를 나타내기 위한 표시를 포함할 수 있다. 유리하게, 프로세싱의 적용 전에, 수집 백은 프로세싱을 위해 기구에 클램핑되거나 고정되고/거나 밀봉, 예컨대 열 밀봉된다. 특정 예시에서, 튜빙이 반드시 발명의 설계의 일부로 여겨지지는 않지만; 특정 구체예에서 발명의 설계의 일부로 여겨질 수 있음을 보여주기 위해 튜빙은 점선으로 또는 줄무늬로 보여질 수 있다. 점선 또는 줄무늬는 튜빙이 존재하거나 부재할 수 있고 하나 또는 둘 다 청구될 수 있는 것으로 해석되어야 한다, 즉 도면 전체에서 튜빙은 발명의 설계의 일부를 형성할 수 있다 (그리고 또한 반드시 발명의 설계의 일부가 아닐 수도 있다). 더불어, 특정 예시는 표시, 샘플이 얻어진 환자를 나타낼 수 있는 표시, 샘플이 얻어진 환자 및 조직 수집 백이 기구에 클램핑되거나 고정될 수 있는 장소를 나타낼 수 있는 표시, 및 샘플이 얻어진 환자 및 조직 수집 백이 기구에 클램핑되거나 고정될 수 있는 장소 및 조직 수집 백이 밀봉, 예컨대 열 밀봉될 수 있는 장소를 나타낼 수 있는 표시를 보이지 않지만, 발명의 설계는 그것의 다양한 변형을 포함할 수 있음, 예컨대, 발명의 설계는 샘플이 얻어진 환자 및 조직 수집 백이 기구에 클램핑되거나 고정될 수 있는 장소를 보여주는 표시 없이 조직 수집 백이 열 밀봉될 수 있는 장소를 나타낼 수 있는 표시를 포함할 수 있고; 발명의 설계는 조직 수집 백이 열 밀봉될 수 있는 곳을 나타낼 수 있는 표시 및/또는 조직 수집 백이 샘플이 얻어진 환자를 나타내는 표시 없이 기구에 클램핑되거나 고정될 수 있는 장소를 보여주는 표시를 포함할 수 있는 것이 이해되어야 한다 (환자 표시를 포함하여 조직 수집 백이 사용되는 동안 그 위에 각인될 수 있는 반면, 클램핑 또는 고정 또는 열 밀봉에 대한 표시는 사용 전에 조직 수집 백에 이미 있을 수 있다). 임의의 관련된 튜빙을 포함한 조직 수집 백은 일반적으로 깨끗하거나 투명하거나 반투명하거나 또는 임의의 원하는 색일 수 있다. 임의의 관련된 튜빙을 포함한 조직 수집 백은 일반적으로 폐쇄된 또는 밀봉된, 혈액 수집, 조직 배양, 바이오 프로세싱 또는 냉동보존 백 및 관련된 튜빙의 제조에 유리한 방식으로 제작될 수 있다. 발명의 관련된 튜빙은 임의의 원하는 물질로부터, 염화 폴리비닐 (PVC) 또는 원하는 물질로서 PVC를 포함하는 물질로 구성될 수 있는데 그것이 용접 및/또는 밀봉에 유리하기 때문이다. 조직을 수집하기 위한 발명의 조직 수집 백의 부분은 임의의 원하는 물질로부터, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 또는 원하는 물질로서 EVA를 포함하는 물질로 만들어질 수 있는데 그것이 열 밀봉에 유리하기 때문이다.
도 11A에 도시된 것과 같이, 조직을 처리하기 위한, 예를 들어, 조직의 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위한 키트(2)의 구체예가 도시된다. 처리될 조직으로는 고체 진핵생물, 특히 포유류 조직, 예컨대 샘플 및/또는 생검으로부터의 조직을 들 수 있다. 키트(2)로는 백(4, 6), 예컨대 수집 백(4) 및 냉동보존 백(6)과 같은 구성요소를 들 수 있다. 도 11A-D에 도시된 키트가 처리를 위한 자동 또는 반자동 장치에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 키트 구성요소로는 지표, 예컨대 코드, 문자, 단어, 명칭, 영숫자 코드, 숫자, 이미지, 바코드, 빠른 응답 (QR) 코드, 스마트 트래커 및/또는 블루투스 트래커와 같은 트래커, 무선 주파수 태그와 같은 태그, 및/또는 본 발명의 구체예에서 자동화 장치 내에서와 같은 자동 및/또는 반자동 처리 중에 스캐닝되고 인식될 수 있도록 다른 디지털로 인식 가능한 식별 태그를 들 수 있다. 예를 들어, 태그는 자동으로 처리되는 데 필요한 조건 및/또는 단계에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 백과 같은 키트 구성요소를 스캐닝하는 것은 추가적인 개입 및/또는 오염 없이 조직, 특히, 장치의 분해 요소에서 처리를 위해 수집 백에 배치되어 있는　조직　샘플을 처리하기 위해 키트와 함께 사용되는 것을 허용할 수 있다. 수집 백은 처리가 시작되기 전에 밀봉될 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 백은 처리가 시작되기 전에 열, 무선 주파수 에너지, 고주파 (HF) 에너지, 유전 에너지와 같은 에너지, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 방법을 사용하여 수동으로 및/또는 자동으로 밀봉될 수 있다.
일부 구체예에서, 가열 막대가 있는 열 밀봉기 (예컨대, Van der Staehl MS-350, Uline H-190 임펄스 밀봉기, 또는 기술분야에 알려져 있는 유사한 밀봉기)가 백에 밀봉을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 열 밀봉기를 사용할 때 약 100℃ 아래의 온도에서 약 0.8 바(bar) 내지 약 2.8 바 범위의 압력에서 밀봉을 형성하는 것이 유리할 수 있다. 이런 상승된 온도 및 압력은 약 8초 동안 적용될 수 있고 그 후에 온도는 감소될 수 있지만 압력은 일부 구체예에서 약 2 내지 3초 동안 계속 적용될 것이다. 온도, 압력, 및 시간에 대한 값은 백을 형성하는 물질, 특히 밀봉을 형성하는 물질의 제형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 밀봉기가 최소 약 3초 동안 약 210℉ (98.9℃)를 초과하는 온도에 도달한 후 가열 막대가 5초 동안 냉각되도록 허용된 후 가열 막대가 제거되기 위해 또 다른 물질이 필요할 수 있다.
밀봉된 물질의 배치는 형성된 밀봉의 강도에 중요할 수 있다. 예를 들어, 밀봉될 물질의 불완전한 밀봉, 접힘, 채널, 및/또는 갭은 밀봉의 강도를 감소시킬 수 있다.
밀봉은 밀봉 박리 테스트 (즉, ASTM F88/F88M), 및/또는 파열 테스트 (즉, ASTM F1140/F1140M 또는 ASTM F2051/F2054M)를 사용하여 강도에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, 백 또는 유연한 용기는 적절하게 밀봉된 경우 사용 중에 100 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 처리 및/또는 프로세싱을 위해 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 추가로 고정될 수 있다. 백 또는 유연한 용기 구체예는 적절하게 밀봉된 경우 사용 중에 75 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 처리 및/또는 프로세싱을 위해 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 추가로 고정될 수 있다.
도 11A에 도시된 것과 같이, 키트(2)는 수집 백(5)이 처리될 수 있는 분해 요소(4), 필터(9)가 위치할 수 있는 풍부화 요소(8), 및 냉동보존 백(7)이 원하는 물질을 보존하기 위해 사용되는 안정화 요소(6)를 포함한다. 키트(2)의 구성요소에서, 예컨대 수집 백(5)에서, 조직이 처리된다. 예를 들어, 수집 백(5)은 진핵 세포로부터 유래된 고형 조직의 분해를 위해 사용될 수 있다. 조직은 프로세싱 후에 결과적으로 생성된 조직의 대부분이 단일 세포 및/또는 작은 세포 수 응집물일 수 있도록 하는 방식으로 처리될 수 있다. 추가로, 프로세싱은 키트 및/또는 특히 수집 백에서 발생할 수 있다.
처리된 조직의 풍부화는 필터(9)의 풍부화 요소(8)에서 발생할 수 있다. 필터(9)는 튜빙(11)으로 진입하는 여과된 조성물 (즉, 원하는 물질)이 미리 결정된 크기를 갖는 구성요소를 가질 수 있도록 선택될 수 있다. 필터(9)는 튜빙(11)으로 진입하는 원하는 물질 조성물이 약 200 μm 미만의 평균 크기를 갖는 종양 침윤 림프구 (TIL)와 같은 구성요소를 가질 수 있도록 선택될 수 있다. 특히, 구체예에서 원하는 물질로는 약 170 μm 미만의 평균 크기를 갖는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 원하는 물질은 약 15 μm 내지 약 500 μm 범위의 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 필터(9)는, 구체예에서, 튜빙(11)으로 진입하는 조직 조성물이 약 200 μm 미만의 평균 크기를 갖는 종양 침윤 림프구 (TIL)와 같은 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다. 특히, 여과된 후 필터를 빠져나와 튜빙(11)으로 진입하는 원하는 물질은 약 170 μm 미만의 평균 크기를 갖는 구성요소를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 필터(9)는 튜빙(11)으로 진입하는 여과된 조성물이 약 50 μm 내지 약 300 μm 범위의 크기를 갖도록 구성된다. 예를 들어, 필터(9)는 구체예에서 튜빙(11)으로 진입하는 조직 조성물이 약 150 μm 내지 약 200 μm의 범위의 평균 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다.
도 11A에서 도시된 것과 같이, 조직을 처리하기 위한 시스템의 안정화 요소(6)는 보관 및/또는 수송을 위해 조직 조성물을 안정화하는 데 사용될 수 있는 곳인 냉동보존 백(7)이다.
도 11B는 밸브(12, 13)를 가지는 키트(2)를 도시한다. 밸브는 무바늘 밸브일 수 있다. 밸브(12, 13)는 종양 소화 배지와 같은 효소 배지, 냉동보호제, 및/또는 냉동보존 배지를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 밸브(12)는 효소 배지를 튜빙(10)에 제공하기 위해 사용될 수 있다. 효소 배지는 백(5)에서 조직의 프로세싱을 돕기 위해 수집 백(4)으로 이동할 수 있다.
밸브(13)는 DMSO 용액이 냉동보존 백(7)으로 이동하도록 DMSO 용액과 같은 냉동보호제를 튜빙(11)에 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, DMSO 용액과 같은 냉동보호제는 DMSO 용액 및 여과된 물질의 조합된 조성물이 냉동보존 백(7)에 진입하도록 튜빙(11)에 진입하는 여과된 물질과 혼합될 수 있다. 튜빙(11)에 진입하는 여과된 물질은 구성요소, 예컨대 미리 결정된 평균 크기를 갖는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 여과된 조성물 중의 구성요소의 평균 크기는 약 200 μm 미만일 수 있다.
일부 구체예에서, 도 11C에서 도시된 것과 같이, 키트(2)는 밸브(12, 13)를 통해 제공된 물질이 필터(9)로 흐르는 것이 억제되고/거나 방지되는 것을 보장하기 위해 필터(9) 주변에 클램프(14)를 포함한다. 밸브(13)는 냉동보호제가 필터(9)로부터 튜빙(11)에 진입하는 여과된 물질과 혼합할 수 있도록 냉동보호제를 튜빙(11)에 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 클램프(14)는 필터(9)의 방향으로 냉동보호제가 흐르는 것을 억제 및/또는 방지하기 위해 배치될 수 있다. 일부 구체예에서, 여과된 용액이 필터(9)로부터 흐르기 시작한 후 클램프(14)는 냉동보호제 및 여과된 물질의 조합된 조성물이 안정화 요소(6)에서 냉동보존 백(7)에 진입하도록 방출될 것이다. 튜빙(11)에 진입하는 여과된 물질은 구성요소, 예컨대 미리 결정된 평균 크기를 갖는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 여과된 조성물 중의 구성요소의 평균 크기는 약 200 μm 미만일 수 있다.
키트(2)의 구체예는 도 11D에서 도시된 것과 같이 냉동보존 백(7) 상에 포트(16)를 포함할 수 있다. 포트는 냉동보존 백(7)으로부터 물질을 첨가 및/또는 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 테스트 샘플은 냉동보존 백으로부터 제거될 수 있다.
도 12A는 키트에 사용하기 위한 백(22)의 구체예의 투시도를 도시한다. 백(22)은 연결기(24), 개방된 섹션(26), 밀봉된 섹션(21), 및 포지셔너(23)를 포함할 수 있다. 연결기(24)는 백(22)을 튜빙(25)에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 포지셔너(23)는 백(22)의 개구부일 수 있다.
백, 예컨대 수집 백 및/또는 냉동보존 백, 및 임의의 관련된 튜빙은 일반적으로 깨끗하거나, 투명하거나 반투명하거나, 임의의 원하는 색이거나, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 백, 예를 들어, 수집 백 및/또는 냉동보존 백, 및/또는 튜빙은 일반적으로 폐쇄된 및/또는 밀봉된 혈액 및/또는 냉동보존 백 및 관련된 튜빙의 제조와 유사한 방법으로 제작될 수 있다.
발명에 사용하기 위한 본원에 기술된 백으로는 수집 백 및 냉동보존 백을 들 수 있고 열가소성, 폴리올레핀 중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 공중합체와 같은 혼합물, 예를 들어, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물 (즉, OriGen Biomedical EVO 필름), EVA를 포함하는 물질, 및/또는 밀봉 가능한 플라스틱의 공압출 층과 같은 미리 결정된 물질로부터 만들어진 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
백에 사용하기 위한 물질은 특정 특성 및/또는 특성의 선택, 예를 들어, 열 용접으로 인한 열 밀봉성과 같은 밀봉성, 또는 무선 주파수 에너지의 사용, 가스 투과성, 유연성 예를 들어 저온 유연성 (예컨대, -150℃, -195℃에서의), 탄력성 예를 들어 저온 탄력성, 내화학성, 광학적 선명도, 세포독성과 같은 생체적합성, 용혈 활성, 침출 저항성, 적은 미립자를 가짐, 특정 가스에 대한 높은 전파율 (예컨대, Oxygen 및/또는 Carbon dioxide), 및/또는 규정 요구사항 준수에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 백에 사용된 물질은 ASTM D-638에 개관된 인장 강도에 대한 테스트 방법에 따라 테스트될 때 약 2500 psi (172 바)보다 큰 인장 강도를 가지는 것에 대해 선택될 수 있다. 특히, 유연한 용기, 예컨대 백의 구체예는 ASTM D-638에 개관된 인장 강도에 대한 테스트 방법에 따라 테스트될 때 약 2800 psi (193 바)보다 큰 인장 강도를 가지는 물질을 사용한다.
일부 구체예에서, 물질은 백의 적어도 하나의 층을 형성하기 위해 공압출된 물질에 사용하기 위한 특정 특성에 대해 선택될 수 있다. 층은 백의 내부 층이 구성될 때 상대적으로 생체적합성이 되고, 백의 내부 표면 상의 물질이 안정적이며 백의 내용물로 침출되지 않도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 수집 백, 냉동보존 백, 및/또는 관련된 튜빙과 같은 키트 구성요소에 대한 물질을 선택하기 위해 사용될 수 있는 관심 있는 특성은 밀봉, 예를 들어 열 밀봉에 관한 것일 수 있다.
밀봉은 밀봉 박리 테스트 (즉, ASTM F88/F88M), 및/또는 파열 테스트 (즉, ASTM F1140/F1140M 또는 ASTM F2051/F2054M)를 사용하여 강도에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, 백 또는 유연한 용기는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 100 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정될 수 있다. 백 또는 유연한 용기 구체예는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 75 뉴턴의 힘을 견디고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정되도록 구성될 수 있다.
백, 특히 수집 백 및/또는 보존용 백의 치수는 처리 및/또는 프로세싱을 수행하기 위해 사용된 장치에 대해 특정될 수 있다. 백 크기는 처리를 수행하기 위해 사용된 장치(들)의 구성 및/또는 크기를 토대로 조정되어야 한다. 백, 예를 들어, 포트, 연결기 등의 경계선 넘어 확장되는 임의의 구성요소의 배치 및/또는 크기에 특별한 주의가 기울여져야 한다. 포트와 같은 구성요소는 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치늬 작동을 간섭할 수 있다. 추가로, 특히 제조된 밀봉과 같은 밀봉된 재료와 관련하여 백의 두께가 기계의 요구 사항에 부합하도록 주의가 기울여져야 한다.
발명의 튜빙은 한정하는 것은 아니지만 염화 폴리비닐 (PVC)을 포함한 임의의 원하는 물질로부터 구성될 수 있다. 예를 들어, PVC는 PVC가 용접 및/또는 밀봉을 위해 유리하기 때문에 원하는 물질일 수 있다.
일부 구체예에서, 도 12A-12E, 13A-13E, 14, 20A-20E, 21A-21E, 22A-22D, 27A, 28, 33, 및 34에서 도시된 것과 같이, 수집 백의 적어도 하나의 단부는 조직을 수용하기 위해 개방될 수 있다. 특히, 구체예에서, 예를 들어 생검으로부터의 조직 샘플은 개방된 단부, 예를 들어, 상단을 통해 백에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 생검 샘플은 동물 (예컨대, 개 또는 고양이와 같은 가축) 또는 인간으로부터의 암성 조직일 수 있다.
도 12A에서 도시된 것과 같이, 백(22)은 조직 수집 백으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직이 백에 배치된 후, 백은 밀봉될 수 있고, 그런 후 프로세싱될 수 있다. 프로세싱은 교반, 예컨대, 부드러운 교반, 추출, 및/또는 백에서의 조직의 효소적 소화를 포함할 수 있다. 조직 프로세싱 및 그것으로부터 원하는 물질, 예컨대 종양 침윤 림프구 (TIL)의 추출은 폐쇄된 시스템에서 이루어질 수 있다. 유리한 또는 바람직한 구체예는 조직이 수집되는 환자를 나타내고/거나 수집 백이 기구의 제자리에서 클램핑되고, 밀봉되고, 장치에 의해 작용되고/거나, 고정되는 곳을 보여주기 위한 마크를 나타내기 위한 표시를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 백(22)은 밀봉 가능한 물질로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 백(22)은 한정하는 것은 아니지만 지방족 또는 반-방향족 폴리아미드 (예컨대, 나일론), 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA) 및 그것들의 혼합물, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물, 열가소성 폴리우레탄 (TPU), 폴리에틸렌 (PE)을 포함한 합성 중합체, 및/또는 중합체들의 조합과 같은 중합체를 포함한 물질로부터 형성될 수 있다. 백의 일부는 열, 무선 주파수 에너지, 고주파 (HF) 에너지, 유전 에너지와 같은 에너지, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 방법으로 밀봉 및/또는 용접될 수 있다.
수집 백은 프로세싱 및/또는 분해 백으로서 사용될 수 있다. 수집 백은 약 4 cm 내지 약 12 cm 범위의 두께 및 약 10 cm 내지 약 30 cm 범위의 폭을 가질 수 있다.
예를 들어, 프로세싱에 사용하기 위한 수집 백은 약 7.8 cm의 폭 및 약 20 cm의 길이를 가질 수 있다. 특히, 백은, 예를 들어, EVA 중합체 및 그것들의 혼합물, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물, 및/또는 하나 이상의 폴리아미드 (나일론)를 사용하여 열 밀봉 가능할 수 있다.
도 12A에서 도시된 것과 같이, 백(22)은 발명의 프로세싱을 위해 그 안에서 조직을 밀봉하기 위한 조직 수집 백으로서 사용될 수 있다.
도 12B는 조직 수집 백으로서 사용하기 위한 백(22)의 구체예의 투시도를 도시한다. 조직은 백에 밀봉된 후 프로세싱될 수 있다. 도 12B에 도시된 백(22)은 지표(27, 28), 예컨대 조직 샘플 또는 생검이 채취되거나 얻어진 환자를 식별할 수 있는 환자 식별자로 표시될 수 있다.
지표로는, 한정하는 것은 아니지만 코드, 문자, 단어, 명칭, 영숫자 코드, 숫자, 이미지, 바코드, 빠른 응답 (QR) 코드, 스마트 트래커 및/또는 블루투스 트래커와 같은 트래커, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 지표를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 지표는 키트의 구성요소의 표면에 인쇄되거나, 에칭되고/거나, 부착될 수 있다. 예를 들어, 지표는 도 12B에 도시된 키트의 적어도 하나의 구성요소의 표면 상에 직접 인쇄될 수 있다. 지표는 또한 접착제, 예를 들어, 스티커를 사용하여 백 상에 위치하거나 또는 트래커가 백 상에 및/또는 다중 백 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, 도 12B에서 도시된 것과 같이 백(22)은 다중 지표(28) (숫자 코드), (27) (QR 코드)를 포함한다.
도 12C는 조직 수집 백으로서 사용하기 위한 백의 투시도를 도시한다. 조직은 프로세싱을 위해 백(22)에 삽입될 수 있다. 지표는 조직 샘플 및/또는 생검이 채취되었거나 얻어진 환자를 식별할 수 있도록 사용될 수 있다. 도 12C에서 도시된 것과 같이, 지표(27, 28)는 QR 코드 및 과정에서 샘플을 추적하고, 샘플을 위치시키고, 및/또는 샘플의 상태를 추적하기 위해 사용된 식별 숫자를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 지표는 실험실의 주어진 임의의 위치에 샘플을 위치시키기 위해 사용될 수 있다. 지표는 사용 전에 및/또는 중에 백 상에 놓일 수 있는데, 예를 들어, 백이 샘플과 함께 사용하기 위해 취해졌기 때문에, 환자 지표는 백 상에 각인될 수 있다. 추가로, 백(22)은 마크(290)를 포함할 수 있다. 마크는 밀봉, 클램프, 및/또는 기구가 배치되어야 하는 곳을 보여주기 위해 사용될 수 있다.
지표, 예를 들어 QR 코드, 스마트 태그와 같은 태그, 및/또는 트래커는 백 내에서 샘플을 확인하기 위해서뿐만 아니라 장치가 냉동보존 키트에서 수행되는 분해, 풍부화, 및/또는 안정화 과정의 유형에 따라 특정 프로그램을 작동하도록 장치의 프로세서를 지시하기 위해 사용될 수 있다. 배지의 상이한 유형, 예를 들어, 동결의 속도 제어를 허용할 수 있는 효소 배지, 종양 소화 배지 및/또는 냉동보존 배지가 이들 과정에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 자동화 장치에 의해 판독 가능할 수 있는 지표를 포함할 수 있다. 장치는 그런 후 그러한 장치에 삽입되었을 때 조직을 프로세싱하기 위해 특정한 완전 자동화 방법을 실행할 수 있다. 발명은 특히 샘플 프로세싱, 특히 자동화된 프로세싱에 유용하다.
일부 경우에, 본원에 기술된 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 일회용일 수 있다. 냉동보존 키트 및/또는 그것의 구성요소는 세포 또는 세포 응집체의 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위해 자동화된 및/또는 반자동 과정에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 백과 같은 냉동보존 키트에 사용하기 위한 백은 일부 구체예에서 다중 과정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 수집 백은 생검 샘플 및/또는 고형 조직과 같은 조직 샘플의 프로세싱을 위한 별도의 구획을 생성하기 위해 상이한 위치에서 반복적으로 밀봉될 수 있다.
추가로, 마크가 백이 대상에 대해 밀봉되고, 클램핑되고, 및/또는 고정될 수 있는 곳을 나타내기 위해 백, 예컨대 조직 수집 백 상의 다양한 위치에 놓일 수 있다. 일부 구체예에서, 백이 대상, 예컨대 기구에 대해 밀봉되고, 클램핑되고, 및/또는 고정될 수 있는 곳을 보여주는 마크는 사용 전에 백 상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 마크가 제조 중에 백 상에 위치할 수 있다.
밀봉은 에너지, 예를 들어, 용접 지대를 생성하기 위해 열과 함께 사용 중에 형성될 수 있다. 사용 중에 형성된 밀봉은 약 2.5 mm 내지 약 7.5 mm 범위의 폭을 가질 수 있다. 일반적으로, 밀봉(140)은 조직 물질이 백(140)에 배치된 후에 형성되며 약 5 mm의 폭을 가질 수 있다.
밀봉은 밀봉 박리 테스트 (즉, ASTM F88/F88M), 및/또는 파열 테스트 (즉, ASTM F1140/F1140M 또는 ASTM F2051/F2054M)를 사용하여 강도에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, 백 또는 유연한 용기는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 100 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정될 수 있다. 백 또는 유연한 용기 구체예는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 75 뉴턴의 힘을 견디고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정되도록 구성될 수 있다.
밀봉 또는 용접이 백, 예를 들어, 수집 백 및/또는 냉동보존 백과 같은 유연한 용기 상에 형성될 때, 밀봉 장치가 열 및/또는 압력을 백에 사용된 물질에 따라 미리 정해진 온도, 압력, 및 시간의 양에서 적용하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 열 밀봉기는 약 8초 동안의 열 및 압력의 적용을 필요로 할 수 있다. 8초 후, 열은 장치에서 꺼지지만, 압력은 추가의 2 내지 3초 동안 적용될 수 있다.
도 12D는 발명의 프로세싱을 위해 그 안에서 조직을 밀봉하기 위한 조직 수집 백의 구체예의 투시도를 도시한다. 사용자가 사용 중에 환자를 쉽게 식별할 수 있도록 지표(27, 28)가 백(22) 상에 위치한다. 추가로, 이들 지표는 백의 물질을 확인하기 위해서뿐만 아니라 특정 처리 방법 중에 백의 물질에 대한 진행을 추적하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 백은 처리 중에 백에서 약 0.1 ml 내지 약 25 ml 범위의 배지의 부피 및 약 0.1 ml 내지 약 10 ml 범위의 조직의 부피를 유지한다. 치료 중에 백의 배지 부피 대 조직 부피의 비율은 약 1.0 내지 약 2.5의 범위에 있어야 한다. 일부 구체예에서, 배지 부피 대 조직 부피의 비율은 약 1.7 내지 약 2.3의 범위이다. 특히, 배지 부피 대 조직 부피의 비율은 약 2.0 내지 약 2.2이다.
도 12D에서 도시된 것과 같이, 마크(29)는 백(22)의 개방된 단부(26) 가까이에 위치한다. 사용 중에 마크(29)는 조직 샘플 및/또는 생검 샘플을 처리하기 위해 사용된 방법을 토대로 백 상에 위치할 수 있다. 마크를 사용 중에, 예를 들어, 사용되고 있거나 사용될 프로세싱 방법 및/또는 사용될 장치를 토대로 백 상에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 마크는 제조 중에 백 상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 밀봉 및/또는 클램핑의 위치에 대한 마크의 배치는 프로세싱 방법 및/또는 처리될 조직의 부피를 토대로 달라질 수 있다.
도 12E는 조직 수집 백의 투시도를 도시한다. 조직은 백(22) 프로세싱 시에 밀봉될 수 있다. 연결기(24)는 백에 대한 접근을 제공할 수 있다. 도시된 것과 같이 연결기(24)는 튜빙(25)을 사용하여 필터, 백, 등과 같은 다른 장치에 연결될 수 있다. 포트(20)는 사용 중에 백(22)으로부터 샘플을 취하고/거나 백(22)으로부터 물질을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
도 13A는 조직 수집을 위해 사용된 백의 전면도를 도시한다. 조직은 사용 중에 백 내에서 밀봉될 수 있다. 백(30)은 밀봉된 가장자리(31)를 가지도록 제조될 수 있다. 도 13A에서 도시된 것과 같이, 밀봉된 가장자리(31)는 3개의 가장자리에 위치할 수 있고 제4 가장자리는 개방된 섹션(36)을 포함할 수 있다.
백(30) 상의 포지셔너(33)는 백의 위치를 정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 포지셔너는 백이 사용 중에 적절하게 처리될 수 있음, 예를 들어, 기구에 근접하여 위치하는 것을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 일부 시스템에서, 포지셔너는 자동화 시스템에서 본원에 기술된 백의 사용을 용이하게 할 수 있다. 특히, 포지셔너는 자동화 시스템을 통해 백을 이동시키기 위해 사용될 수 있다.
도 13B에서 도시된 것과 같이, 백(30)은 샘플을 확인하기 위해 사용된 지표(36, 37), 예를 들어, 조직 샘플 또는 생검이 채취되거나 얻어진 환자를 식별하는 지표를 가질 수 있다. QR 코드와 같은 지표(37)의 사용은 주어진 과정을 통해 샘플을 따라가는 것이 가능하도록 특정 샘플에 대한 과정 단계를 추적하는 것을 허용할 수 있다.
도 13C는 조직 수집 백의 전면도를 도시한다. 조직은 백 내에서 밀봉될 수 있고 그 안에서 처리 및/또는 프로세싱될 수 있다. 백(30)은 샘플을 확인하기 위해 사용된 지표(36, 37), 예를 들어, 조직 샘플 또는 생검이 채취되거나 얻어진 환자를 식별하는 지표를 가질 수 있다. QR 코드와 같은 지표(37)의 사용은 주어진 과정을 통해 샘플을 따라가는 것이 가능하도록 특정 샘플에 대한 과정 단계를 추적하는 것을 허용할 수 있다. 포지셔너(33)가 처리를 위해 백(30)을 위치시키는 데 사용될 수 있다. 연결기(34)가 튜빙(35)을 통해 다른 장치에 조직, 처리된 조직, 등이 결합되는 것을 허용할 수 있다.
도 13D는 샘플을 확인하기 위해 사용된 지표(37, 38)를 가진 조직 수집 백의 전면도를 도시한다. QR 코드와 같은 지표(37)의 사용은 주어진 과정을 통해 샘플을 따라가는 것이 가능하도록 특정 샘플에 대한 과정 단계를 추적하는 것을 허용할 수 있다. 마크(39) 및/또는 포지셔너(33)는 프로세싱 및/또는 처리 중에 백의 위치 정하기를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 마크는 사용 중에 백이 위치, 밀봉 및/또는 클램핑되는 곳을 나타내기 위해 개방된 단부 가까이에 배치된다. 백(30)은 밀봉된 가장자리(31)를 가지도록 제조될 수 있다. 도 13D에서 도시된 것과 같이, 밀봉된 가장자리(31)는 3개의 가장자리에 위치할 수 있고 제4 가장자리는 개방된 섹션(36)을 포함할 수 있다.
도 13E는 조직이 그 안에 배치된 후 밀봉될 수 있는 조직 수집 백의 전면도를 도시한다. 연결기(34) 및 포트(32)는 백에 대한 접근을 제공할 수 있다. 하나 이상의 포트는 포트가 배지 및/또는 시약의 유입 및/또는 백으로부터 샘플의 추출을 허용하도록 수집 백 상에 위치할 수 있다.
도시된 것과 같이 연결기(34)는 튜빙(35)을 사용하여 필터, 백, 등과 같은 다른 장치에 결합될 수 있다. 마크 및 지표는 용도에 따라 백의 하나 이상의 측면에 배치될 수 있다. 특히, 도 13E에서 도시된 것과 같이, 포지셔너(33), 마크(39), 및/또는 지표(37, 38)는 교반, 예컨대 열 밀봉 (프로세싱을 위한 기구의 일부일 수 있음)에 의한 밀봉, 프로세싱용 물질의 첨가 및/또는 추출의 적용과 같은 프로세싱을 위해 백(30)의 위치를 정하기 위해 사용될 수 있다. 유리하게, 프로세싱의 적용 전에, 수집 백은 프로세싱을 위해 기구에 클램핑되거나 고정되고/거나 밀봉, 예컨대, 열 밀봉된다.
도 14는 조직 수집을 위한 백의 후면도를 도시한다. 특히, 백(40)은 그 안에 위치한 조직과 함께 밀봉되고 프로세싱될 수 있다. 밀봉은 개방된 단부(46) 가까이에 실질적으로 그것과 평행하게 위치할 수 있다. 도시된 것과 같이 연결기(44)가 필터, 백, 등과 같은 다른 장치에 튜빙(46)을 사용하여 연결될 수 있다. 백(40)은 밀봉된 가장자리(41)를 가지면서 제조될 수 있다. 도 14에서 도시된 것과 같이, 밀봉된 가장자리(41)는 3개의 가장자리에 위치할 수 있고 제4 가장자리는 개방된 섹션(46)을 포함할 수 있다. 포지셔너(43)는 제조된 밀봉된 가장자리(41)에 의해 둘러싸일 수 있다.
도 15는 백의 사용 중에 그 안에서 조직을 밀봉할 수 있고 조직의 프로세싱을 허용하는 조직 수집에 사용하기 위한 백(50)의 측면도를 도시한다. 백(50)은 연결기(52)에 의해 튜빙(54)에 결합될 수 있다.
도 16A는 밀봉되지 않은 조직 수집 백의 상면도를 도시한다. 백(60)은 밀봉된 부분(66) 및 개방된 부분(64)을 포함할 수 있다. 연결기(62)는 백(60)을 통해 볼 수 있다. 조직이 백에 위치한 후 백(60)의 개방된 부분이 밀봉될 수 있다.
도 16B는 프로세싱을 위해 그 안에서 조직을 밀봉하기 위한 밀봉된 가장자리(66)를 가지는 조직 수집 백(60)의 저면도를 도시한다. 연결기(62)는 백(60)에서 볼 수 있다.
도 17A는 부분적으로 개방된 백의 상면도를 도시한다. 백(70)은 밀봉된 부분(76) 및 개방된 부분(74)을 포함할 수 있다. 연결기(72)는 백(70)을 통해 볼 수 있다. 조직이 백에 위치한 후 백(70)의 개방된 부분이 밀봉될 수 있다.
도 17B는 프로세싱을 위해 그 안에서 조직을 밀봉하기 위한 조직 수집 백의 저면도를 도시한다. 연결기(72)는 백(70)에서 볼 수 있다.
도 18A는 부분적으로 개방된 백의 상면도를 도시한다. 조직은 백(80)의 개방된 단부(84)를 통해 삽입될 수 있다. 연결기(82)는 백(80)의 바닥에 위치한 것으로 도시된다.
도 18B는 조직의 수집 및/또는 프로세싱을 위해 완전히 개방된 백의 상면도를 도시한다. 백(80)의 개방된 단부(84)는 처리, 격리, 및/또는 분리와 같은 프로세싱을 위해 조직을 수용할 수 있다. 밀봉된 가장자리(86)는 제조 중에 생성될 수 있다.
도 19A는 백의 측면에 밀봉된 가장자리(96)를 가지는 부분적으로 개방된 백(90)의 상면도를 도시한다. 도시된 것과 같이, 조직은 백(90)의 개방된 단부(94)를 통해 삽입될 수 있다. 연결기(92)는 백(90)의 바닥에 위치한 것으로 도시된다.
도 19B는 백의 측면에 밀봉된 가장자리(96)를 가지는 조직의 수집 및/또는 프로세싱을 위한 완전히 개방된 백의 상면도를 도시한다. 백(90)의 개방된 단부(94)는 처리, 격리, 및/또는 분리와 같은 프로세싱을 위해 조직을 수용할 수 있다. 연결기(92)는 백(94)의 바닥에 위치한 것으로 도시된다.
도 20A-20E는 조직 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다. 도 20A에서 도시된 것과 같이, 밀봉된 가장자리(101) 및 개방된 단부(102)를 가진 백(100)은 튜빙(105) 및/또는 연결기(104)를 통해 장치(도시되지 않음)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 연결기(104)는 백(100)에 위치하지만 y-연결기(106)는 튜빙을 따라 위치할 수 있다. 도 20B는 사용자가 조직 샘플 또는 생검이 채취되었거나 얻어진 환자를 식별할 수 있도록 지표( 107, 108)를 포함한 백(100)의 추가의 구체예를 도시한다.
더불어, 마크(109) 및 지표(107, 108)를 포함하는 백(100)의 구체예가 도 20C에서 도시된다. 포지셔너(103)의 사용은 백 내에서 조직의 일관된 프로세싱을 허용하는 백의 일관된 위치 정하기를 허용할 수 있다. 지표(107, 108)는 샘플 및/또는 환자 정보로 샘플을 확인한다. 일부 경우에, 지표는 샘플, 예컨대 조직 샘플 및/또는 생검 샘플을 확인 및/또는 추적하기 위해 사용될 수 있다. 도 20D는 다중 지표(107, 108) 및 마크(109)를 가지는 백(100)을 도시한다. 마크는 백(100)이 밀봉되어야 할 위치를 보여줄 수 있다. 예를 들어, 마크(109)는 백(100)이 밀봉되고, 클램핑되고/거나, 또 다른 장치에 결합되어야 할 위치를 나타낼 수 있다. 밀봉에 대한 마크는 백의 개방 가장자리에 근접하게 위치할 수 있는데, 예를 들어, 그러한 마크는 개방 가장자리로부터 미리 결정된 거리에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서 밀봉에 대한 마크는 실질적으로 개방 가장자리에 평행할 수 있다. 도시된 것과 같이 백(100)은 연결기(104) 및 튜빙(105)을 포함할 수 있다.
도 20E에서 도시된 구체예에서, 백(100)은 포트(110) 및 연결기(104)를 포함한다. 포트는 샘플로부터 물질의 첨가 및/또는 물질의 제거를 허용할 수 있다. 예를 들어, 조직의 프로세싱 중에, 샘플은 프로세싱을 통해 다중 시점에서 채취될 수 있다. 추가로, 포트(110)는 배지의 및/또는 시약의 백(100)으로의 무균성 유입을 허용할 수 있다.
도 21A는 조직의 수집 및/또는 프로세싱을 위한 백(100)의 전면도를 도시한다. 조직은 개방된 단부(102)를 통해 백(100)에 배치될 수 있다. 연결기(104)는 백(100)을 튜빙(105), 및 클램프(112)와 결합시키기 위해 사용될 수 있다.
도 21B-21E는 백(100)의 추가의 구체예의 전면도를 도시한다. 도 21B-11D는 지표(107, 108) 및/또는 마크(109)를 포함하는 다양한 구성을 보여준다. 백은 코드, 문자, 단어, 명칭, 영숫자 코드, 숫자, 이미지, 바코드, 빠른 응답 (QR) 코드, 스마트 트래커 및/또는 블루투스 트래커와 같은 트래커, 및/또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 지표를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지표는 키트의 구성요소의 표면에 인쇄되거나, 에칭되고/거나, 부착될 수 있다. 지표는 또한 접착제, 예를 들어, 스티커를 사용하여 백 상에 위치하거나 또는 트래커가 백 상에 및/또는 다중 백 상에 배치될 수 있다. 수집 백 및/또는 냉동보존 키트는 숫자 코드 및/또는 QR 코드와 같은 다중 지표를 포함할 수 있다.
지표, 예를 들어 QR 코드, 스마트 태그와 같은 태그, 및/또는 트래커는 백 내에서 샘플을 확인하기 위해서뿐만 아니라 장치가 냉동보존 키트에서 수행되는 분해, 풍부화, 및/또는 안정화 과정의 유형에 따라 특정 프로그램을 작동하도록 장치의 프로세서를 지시하기 위해 사용될 수 있다.
도 21E는 물질의 수집, 프로세싱, 처리, 및/또는 분리를 위해 사용된 백(100)의 또 다른 구체예의 전면도를 도시한다. 처리될 조직은 백(100) 내에서 밀봉될 수 있다. 튜빙(105)은 백(100)을 연결기(104)를 통해 클램프(112)에 결합시킬 수 있다. 포트(114)는 벡(100)으로부터의 유입 및/또는 제거를 허용할 수 있다. 예를 들어, 포트는 배지 및/또는 시약의 샘플링 및/또는 유연한 용기, 예컨대 냉동보존 키트의 백으로의 무균성 유입을 허용할 수 있다.
도 22A는 프로세싱을 위해 그 안에서 조직을 밀봉하기 위한 밀봉된 가장자리(121)를 가진 조직 수집 백(120)의 또 다른 구체예의 전면도를 도시한다. 백(120)은 튜빙(125)에 결합된 포지셔너(123) 및 연결기(124)를 포함한다.
도 22B는 밀봉된 가장자리(121) 및 개방된 단부(122)를 가진 조직 수집 백(120)의 전면도를 도시한다. 지표(127, 128)는 그것들이 자동화된 시스템이 쉽게 접근할 수 있도록 백(120) 상에 위치할 수 있다. 개구부를 규정하는 포지셔너(123)는 밀봉된 가장자리(121)에 둘러싸일 수 있다. 지표는 조직 샘플 또는 생검이 채취되었거나 얻어진 환자를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
도 22C에서 도시된 것과 같이, 백(120)은 지표(127, 128) 및 마크(129)를 포함한다. 도 22D는 다중 마크(129)를 가진 수집 백(120)을 도시한다. 밀봉에 대한 마크는 백의 개방 가장자리에 근접하여 위치할 수 있다. 그러한 마크는 개방 가장자리로부터 미리 결정된 거리에 위치할 수 있다. 밀봉에 대한 마크는 일부 구체예에서 실질적으로 개방 가장자리에 평행할 수 있다.
도 23은 백(130)의 바닥이 연결기(134)로부터 나오는 튜빙(135)과 함께 페이지의 상부에 도시되도록 위치한 밀봉된 백(130)의 전면도를 도시한다. 백(130)은 백(130)의 밀봉된 부분(131) 상에 지표(137)를 포함한다. 밀봉된 부분 상의 지표는 백(130)의 밀봉 중에 및/또는 후에 위치할 수 있다. 일반적으로, 백은 조직이 제공된 후 밀봉된다. 백(130) 표면 상의 지표(138)는 바코드일 수 있다. 포지셔너(133)가 연결기(134)에 근접하여 위치할 수 있다.
백, 예컨대 수집 백 및/또는 냉동보존 백, 및 임의의 관련된 튜빙은 일반적으로 깨끗하거나, 투명하거나 반투명하거나, 임의의 원하는 색이거나, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 조직 수집 백 및/또는 튜빙은 일반적으로 폐쇄된 및/또는 밀봉된 혈액 및/또는 냉동보존 백 및 관련된 튜빙의 제조와 유사한 방법으로 제작될 수 있다. 발명의 튜빙은 한정하는 것은 아니지만 염화 폴리비닐 (PVC)을 포함한 임의의 원하는 물질로부터 구성될 수 있다. 예를 들어, PVC는 PVC가 용접 및/또는 밀봉에 유리하기 때문에 원하는 물질일 수 있다.
발명의 수집 백, 예컨대 조직 수집 백은 폴리올레핀 중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물 (즉, OriGen Biomedical EVO 필름)과 같은 공중합체, 및/또는 EVA를 포함하는 물질과 같이 미리 결정된 물질로부터 만들어진, 조직을 수용하기 위한 백의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 백에 사용하기 위한 물질은 특정 특성 및/또는 특성, 예를 들어, 열 밀봉성과 같은 밀봉성, 가스 투과성, 유연성 예를 들어 저온 유연성, 탄력성 예를 들어 저온 탄력성, 내화학성, 광학적 선명도, 세포독성과 같은 생체적합성, 용혈 활성, 침출 저항성, 적은 미립자를 가짐의 선택에 대해 선택될 수 있다.
도 24에서 도시된 것과 같이, 백(140)은 만약 마크를 포함한 영역이 밀봉된다면 구획(143)이 백(140)에서 형성될 수 있도록 배치된 다중 마크(141, 142)를 포함할 수 있다. 백(140)은 사용 중에 샘플에 대한 구획의 형성에 사용될 수 있는 백의 제조 중에 형성되는, 백의 제조 중에 형성된 사전 용접 섹션(145)을 가진다. 도 24는 다중 구획을 가지도록 형성될 수 있는 수집 백의 구체예를 도시한다. 각각의 구획은 다중 밀봉 및/또는 용접 (예컨대, 열 밀봉됨)의 배치에 의해 백에 형성될 수 있다. 예를 들어, 수집 백에 종양 현탁액에 배치된 후에 개방된 단부는 용접되어 폐쇄될 수 있고 용접 라인(142)과 같은 추가의 마크(141)가 열과 같은 에너지를 사용하여 용접되어 구획을 형성할 수 있다.
백(140) 상의 포지셔너(143)는 백이 기구, 예컨대 RF 열 밀봉기와 같은 밀봉 장치 및/또는 주사기와 관련하여 정확하게 위치되는 것을 보장한다.
밀봉은 에너지, 예를 들어, 용접 지대를 생성하기 위해 열과 함께 사용 중에 형성될 수 있다. 사용 중에 형성된 밀봉은 약 2.5 mm 내지 약 7.5 mm 범위의 폭을 가질 수 있다. 일반적으로, 밀봉(140)은 조직 물질이 백(140)에 배치된 후에 형성되며 약 5 mm의 폭을 가질 수 있다.
밀봉은 밀봉 박리 테스트 (즉, ASTM F88/F88M), 및/또는 파열 테스트 (즉, ASTM F1140/F1140M 또는 ASTM F2051/F2054M)를 사용하여 강도에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, 백 또는 유연한 용기는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 100 뉴턴의 힘을 견딜 수 있고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정될 수 있다. 백 또는 유연한 용기 구체예는 적절하게 밀봉되었을 때 사용 중에 75 뉴턴의 힘을 견디고 추가로 처리 및/또는 프로세싱을 위한 장치 내에 배치되었을 때 클램프로 고정되도록 구성될 수 있다.
백, 예를 들어, 수집 백 및/또는 냉동보존 백과 같은 유연한 용기 상에 밀봉 또는 용접이 형성될 때, 밀봉 장치가 열 및/또는 압력을 백에 사용된 물질에 따라 미리 정해진 온도, 압력, 및 시간의 양에서 적용하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 열 밀봉기는 약 8초 동안의 열 및 압력의 적용을 필요로 할 수 있다. 8초 후, 열은 장치에서 꺼지지만, 압력은 추가의 2 내지 3초 동안 적용될 수 있다.
일부 시스템에서, 포지셔너는 자동화된 시스템에서 본원에 기술된 백의 사용을 용이하게 할 수 있다. 그러므로, 백(140)에 배치된 조직은 별도의 구획(144, 146, 147)으로 나누어질 수 있다. 도시된 것과 같이, 각각의 구획(144, 146, 147)은 각각 포트(148, 149, 150)를 포함한다. 각각의 포트는 구획으로의 직접적인 접근을 허용할 수 있다. 이것은 샘플의 개별화된 첨가, 저장, 및/또는 테스트를 허용할 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 수집 백은 복잡한 샘플의 적합성 및/또는 미생물학적 특성에 대해 TIL의 저장 및 테스트를 용이하게 할 수 있다. 이런 유형의 테스트는 소량의 소화된 물질이 별도로 해동될 수 있도록 소량의 소화된 물질이 수집 백에 냉동되는 것을 필요로 할 수 있다. 일부 구체예에서, 도 24에 도시된 백(140)은 수집 백 및/또는 냉동보존 백으로서 사용될 수 있다.
도 25는 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다. 이 구체예에서, 수집 백(152)은 약 150 mm (즉, 15 cm)의 길이 및 약 90 mm (즉, 9 cm)의 폭을 가진다. 백(152)은 포지셔너(160)로서 작용하는 개구부를 포함한다. 하나 이상의 포지셔너가 백이 사용 중에 프로세싱 및/또는 처리를 위해 적절하게 위치된 것을 보장하기 위해 백의 방향을 제어하기 위해, 예를 들어, 기구에 근접하여 위치되도록 사용될 수 있다. 일부 시스템에서, 포지셔너는 자동화된 시스템에서 본원에 기술된 백의 사용을 용이하게 할 수 있다. 특히, 포지셔너는 자동화된 시스템을 통해 백을 이동시키기 위해 사용될 수 있다. 밀봉(156)은 약 5 mm이다. 밀봉은 에너지, 예를 들어, 용접 지대를 생성하기 위한 열을 사용하여 사용 중에 형성될 수 있다. 밀봉은 약 2.5 mm 내지 약 7.5 mm 범위의 폭을 가질 수 있다. 일반적으로, 밀봉(156)은 조직 물질이 백(152)에서 위치가 정해진 후 형성된다. 도 25에서 도시된 것과 같이, 백(152)은 백의 제조 중에 형성된 사전 용접된 섹션(158)을 가진다.
도 26에서 도시된 것과 같이, 수집 백은 튜빙 및 밸브에 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 백은 약 10 cm 내지 약 50 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백은 약 15 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 약 18 cm 내지 약 22 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 도 26에 도시된 백(162)은 약 20 cm의 길이를 가진다. 본원에 기술된 것과 같이 사용하기 위한 수집 백은 약 6.8 cm 내지 약 8.8 cm 범위의 폭을 가질 수 있다. 도 26에서 도시된 것과 같이, 수집 백(162)은 약 7.8 cm의 폭을 가진다. 한정하는 것은 아니지만 무바늘 밸브를 포함하여 밸브는 튜빙을 따르는 지점에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브(164)는 튜빙(166)에 의해 결합된 백(162)으로부터 대략 20 cm에 위치한다. 튜빙(166)은 또 다른 요소 또는 구성요소가 첨가되기 전에 무바늘 밸브(164)로부터 적어도 10 cm 정도 연장된다.
도 27A에서 도시된 것과 같이, 개방된 백(170)은 사용 전에 튜빙(172, 174, 176)에 결합된다. 백(170)은 밀봉 가능한 물질로부터 구성될 수 있다. 특히, 백은 열 밀봉기, 예를 들어, 벤치탑 열 밀봉 장치를 사용하여 밀봉될 수 있다. 튜빙의 일부, 예를 들어 튜빙(174)은 용접될 수 없다. 한정하는 것은 아니지만 무바늘 밸브를 포함하여 밸브는 튜빙을 따르는 지점에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브(178)는 튜빙(174, 176)의 단부에 위치한다.
일부 구체예에서, 백은 약 10 cm 내지 약 50 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백은 약 15 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 약 18 cm 내지 약 22 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 도 27A에서 도시된 백(170)은 약 20 cm의 길이를 가진다.
도 27B는 밀봉된, 예를 들어, 백 내에서 물질의 침착 후에 밀봉된 수집 백의 구체예의 전면도를 도시한다. 백(180)은 밀봉 가능한 물질로부터 구성된다. 특히, 백은 열 밀봉기, 예를 들어, 벤치탑 열 밀봉 장치를 사용하여 밀봉될 수 있다. 밀봉은 백의 가장자리에 근접하게 위치할 수 있고, 일부 경우에, 마크는 개방 가장자리로부터 미리 결정된 거리에 위치할 수 있다. 밀봉은 일부 구체예에서 실질적으로 개방 가장자리에 평행할 수 있다.
튜빙의 일부, 예를 들어 튜빙(182, 184, 186)은 용접될 수 있다. 용접 가능한 튜빙은 중합체 물질, 예를 들어, 염화 폴리비닐 (PVC)로부터 만들어질 수 있다.
한정하는 것은 아니지만 무바늘 밸브를 포함하여 밸브는 튜빙을 따르는 지점에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브(188)는 튜빙(184, 186)의 단부에 위치한다. 일부 구체예에서, 백은 약 10 cm 내지 약 40 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백은 약 15 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 백은 약 18 cm 내지 약 22 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 도 27A에서 도시된 백(180)은 약 20 cm의 길이를 가진다.
도 28에서 도시된 것과 같이, 위쪽을 향하는 냉동보존 키트의 구체예가 도시되며 개방된 백(190) 및 냉동보존 백(192)을 포함한다. 도시된 것과 같이 냉동보존 백(192)은 지표(193, 194)를 포함할 수 있다. 냉동보존 백은 다이메틸 설폭사이드 ("DMSO")와 같은 냉동보호제로의 냉동보존에 적합할 필요가 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 백은 백이 약 5 ml 내지 약 45 ml 범위의 물질의 부피를 유지하도록 구성될 수 있다. 특히, 냉동보존 백은 약 10 ml 내지 약 35 ml 범위의 물질의 부피를 수용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 약 15 ml 내지 약 30 ml 범위의 물질의 부피를 수용할 수 있는 냉동보존 백을 포함한다. 냉동보존 백(192)은 원하는 미리 결정된 부피가 달성되도록 하는 크기를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 백은 약 4 cm 내지 약 11 cm 범위의 폭 및 약 10 cm 내지 약 18 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 백은 약 5.8 cm 내지 약 9.8 cm 범위의 폭 및 약 12 cm 내지 약 16 cm 범위의 길이를 가질 수 있다. 특히, 도 28에서 도시된 냉동보존 백의 구체예는 약 7.8 cm의 폭 및 약 14 cm의 길이를 가질 수 있다.
사용 전에 냉동보존 키트 및/또는 그것의 특정 구성요소는 멸균될 수 있다. 예를 들어, 백(190, 192)은 멸균될 수 있다. 백(190, 192)을 형성하기 위해 사용된 물질은 열 밀봉 가능할 수 있다. 백에 사용하기 위한 물질로는, 한정하는 것은 아니지만 EVA, 폴리아미드 (예컨대, 나일론), 및 그것들의 조합과 같은 중합체를 들 수 있다. 개방된 백(190)은 밀봉 및/또는 클램프 (도시되지 않음)를 사용하여 백을 폐쇄한 후 프로세싱 및/또는 분해에 사용될 수 있다.
키트(191)는 추가로 밸브( 195, 196), 클램프(197, 198), 튜빙(199), 및 필터(200)를 포함한다. 필터(200)는 인라인 필터, 혈액 필터, 예컨대 혈액 투여 필터, 생물학적 필터, 및/또는 인라인 클럼프 제거 필터일 수 있다. 필터는 원하는 물질을 형성하기 위해 미리 결정된 크기 이상의 물질을 프로세싱된 조직으로부터 제거하기 위해 구성될 수 있다. 예를 들어, 조직 덩어리는 필터를 사용하여 분해된 조직으로부터 분리될 수 있다. 특히, 여과된 후에 튜빙에 진입하는 조직 조성물은 원하는 물질이 형성되도록 약 200 μm 미만의 평균 크기를 갖는 구성요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 원하는 물질은 약 170 μm 미만의 평균 크기를 갖는 TIL (종양 침윤 림프구)을 포함할 수 있다.
필터는 여과 후에 원하는 물질이 안정화 요소의 방향으로 튜빙으로 흐르도록 튜빙으로부터 진입하는 프로세싱된 조직 조성물이 약 15 μm 내지 약 500 μm 범위의 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 풍부해질 수 있게 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 필터는 여과된 후에 안정화 요소의 방향으로 튜빙에 진입하는 조직 조성물이 약 50 μm 내지 약 300 μm 범위의 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 필터는, 구체예에서, 여과된 후 튜빙에 진입하는 조직 조성물이 약 150 μm 내지 약 200 μm 범위의 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다.
일부 구체예에서, 풍부화 요소의 필터는 원하는 물질을 형성하기 위하여 약 5 μm 내지 약 200 μm의 미리 결정된 크기 범위 밖의 물질을 프로세싱된 조직으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 원하는 물질은 약 5 μm 내지 약 200 μm 범위의 평균 크기를 갖는 TIL (종양 침윤 림프구)을 포함할 수 있다. 밸브(195, 196)는 수집 백으로부터 미리 결정된 거리에 배치될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브(195)는 수집 백(190)으로부터 약 20 cm에 위치할 수 있다. 무바늘 밸브와 같은 밸브는 물질을 수집 백(190)에 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 배지는 배지를 수집 백(190)에 첨가하기 위하여 무바늘 밸브(195)에 삽입될 수 있다.
일부 구체예에서, 그러한 밸브 뒤에 냉동보존 키트에 대해 추가의 구성요소를 용접하기 위한 공간을 허용하기 위해 미리 결정된 양의 튜빙이 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 밸브 뒤에 적어도 10 (10) cm의 튜빙이 다음 요소 전에 위치할 수 있다. 튜빙(199)은 밀봉 가능하고/거나 용접 가능할 수 있다. 예를 들어, 튜빙에 대한 물질로는, 한정하는 것은 아니지만 PVC (염화 폴리비닐), 및/또는 기술분야에 알려져 있는 다른 물질을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 튜빙은 연결기에 맞추기 위한 크기일 수 있다. 예를 들어, 튜빙은 약 1.5 mm 내지 약 4.5 mm 범위의 내부 직경 및 약 2.1 mm 내지 약 6.1 mm 범위의 외부 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 키트의 구체예는 약 2.9 mm 내지 약 3.1 mm 범위의 내부 직경 및 약 4.0 mm 내지 약 4.2 mm 범위의 외부 직경을 가진 튜빙을 포함할 수 있다. 냉동보존 키트(191)에 사용된 튜빙은 길이가 다를 수 있고 개별 투빙 요소는 약 1 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가진다. 예를 들어, 도 28에서 도시된 것과 같이 개별 튜빙 요소의 길이는 약 5 cm 내지 약 20 cm로 다양할 수 있다.
도 28에서 도시된 클램프(197, 198)는 효소 배지 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 클램프(197)는 원하는 여과 단계 전에 효소 배지 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 클램프(198)는 냉동보호제의 필터로의 바람직하지 못한 이동을 억제 및/또는 방지할 수 있다.
도 29는 도 28에 도시된 키트(191)와 유사한 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시하지만, 키트(201)는 아래쪽을 향하고 있다. 도 29는 수집 백(202)이 폐쇄될 수 있는 위치를 도시한다.
도 30은 폐쇄된 수집 백(206) 및 냉동보존 백(208)을 포함하며 위쪽을 향하고 있는 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시한다. 일부 구체예에서, 냉동보존 백(208)은 배지 및/또는 시약의 샘플링을 허용하고, 냉동보존 백으로의 무균성 유입을 허용하는 포트(215, 216)를 포함할 수 있다. 냉동보존 키트(205)는 필터(214), 밸브(209, 210), 클램프(211, 212) 및 튜빙(222)을 포함할 수 있다.
필터(214)는 인라인 필터, 생물학적 필터, 혈액 필터, 예컨대 혈액 투여 필터, 및/또는 인라인 클럼프 제거 필터일 수 있다. 필터는 미리 결정된 크기 이상의 물질을 제거하기 위해 구성될 수 있다. 예를 들어, 조직 덩어리는 필터를 사용하여 분해된 조직으로부터 분리될 수 있다. 필터는 여과 후에 튜빙에 진입하는 조직 조성물이 약 15 μm 내지 약 500 μm 범위의 크기를 갖는 구성요소를 가질 수 있도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 필터는 여과된 후에 튜빙에 진입하는 조직 조성물이 약 50 μm 내지 약 300 μm 범위의 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 필터는, 구체예에서, 여과된 후에 튜빙에 진입하는 조직 조성물이 약 150 μm 내지 약 200 μm 범위의 평균 크기를 갖는 구성요소를 가지도록 구성될 수 있다. 특히, 여과된 후에 튜빙에 진입하는 조직 조성물은 약 170 μm 미만의 평균 크기를 갖는 구성요소를 가질 수 있다.
밸브(209, 210)는 수집 백으로부터 미리 결정된 거리에 배치될 수 있다. 예를 들어, 무바늘 밸브(209)는 수집 백(206)으로부터 약 20 cm에 위치할 수 있다. 무바늘 밸브와 같은 밸브는 물질을 수집 백(206)에 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 배지는 배지를 수집 백(206)에 첨가하기 위하여 무바늘 밸브(209)에 삽입될 수 있다.
일부 구체예에서, 그러한 밸브 뒤에 냉동보존 키트에 대해 추가의 구성요소를 용접하기 위한 공간을 허용하기 위해 미리 결정된 양의 튜빙이 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 밸브 뒤에 적어도 10 (10) cm의 튜빙이 다음 요소 전에 위치할 수 있다. 튜빙(222)은 밀봉 가능하고/거나 용접 가능할 수 있다. 예를 들어, 튜빙에 대한 물질로는, 한정하는 것은 아니지만 PVC 및/또는 기술분야에 알려져 있는 다른 물질을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 튜빙은 연결기에 맞추기 위한 크기일 수 있다. 예를 들어, 튜빙은 약 1.5 mm 내지 약 4.5 mm 범위의 내부 직경 및 약 2.1 mm 내지 약 6.1 mm 범위의 외부 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 냉동보존 키트의 구체예는 약 2.9 mm 내지 약 3.1 mm 범위의 내부 직경 및 약 4.0 mm 내지 약 4.2 mm 범위의 외부 직경을 가진 튜빙을 포함할 수 있다. 냉동보존 키트(205)에 사용된 튜빙은 길이가 다를 수 있고 개별 투빙 요소는 약 1 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가진다. 예를 들어, 도 30에서 도시된 것과 같이 개별 튜빙 요소의 길이는 약 5 cm 내지 약 20 cm로 다양할 수 있다.
도 30에서 도시된 클램프(211, 212)는 효소 배지 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 클램프(211)는 원하는 여과 단계 전에 배지 효소 용액 및/또는 소화된 조직의 필터로의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 클램프(212)는 냉동보호제의 필터로의 바람직하지 못한 이동을 억제 및/또는 방지할 수 있다.
도 31은 폐쇄된 수집 백(226) 및 냉동보존 백(228)을 포함하며 위쪽을 향하고 있는 냉동보존 키트의 구체예의 측면도를 도시한다. 냉동보존 백(228)은 포트(242)를 포함할 수 있다. 포트(242)는 냉동보존 백(228)에 대한 접근을 제공한다. 밸브(232, 238) 및 클램프(234, 236)는 필터(230) 주변에 위치할 수 있고 냉동보존 키트(224) 내에서 유체의 이동을 제어하기 위해 사용될 수 있다.
도 32는 냉동보존 키트의 구체예의 단면도를 도시한다. 밀봉된 백(226) 및 필터(230)를 볼 수 있다. 밀봉된 백(226)은 튜빙, 밸브, 및/또는 클램프를 사용하여 필터(230)에 결합될 수 있다.
도 33은 수집 백의 구체예의 상면도를 도시한다. 백(232)은 개방된 것으로 도시되며 지표(234, 236) 및 마크(238, 240)를 포함한다. 마크는 백의 부분이 어디서 밀봉되고/거나 클램핑되어야 할지를 보여주기 위해 사용될 수 있다. 밀봉에 대한 마크는 백의 개방 가장자리에 근접하여 위치할 수 있다. 그러한 마크는 개방 가장자리로부터 미리 결정된 거리에 위치할 수 있다. 밀봉에 대한 마크는 일부 구체예에서 실질적으로 개방 가장자리에 평행할 수 있다.
백(232)은 포지셔너(244) 및 연결기(246)를 포함한다. 연결기(246)는 백(232)를 튜빙(248)에 결합시킨다. 연결기(246)는 튜빙(248)이 클램프(254, 256) 및/또는 포트(258, 260)를 포함하는 튜빙(250, 252)으로 갈라지는 것을 허용할 수 있다.
도 34는 수집 백(264), 클램프(266, 268), 필터(270), 튜빙(272), 포트(274, 276), 밸브(278), 연결기(280), 및 냉동보존 백(282)을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다. 수집 백 및 관련된 튜빙은 적어도 약간의 EVA 물질을 사용하여 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 백 및/또는 튜빙은 EVA로부터 형성될 수 있다. 클램프(266, 268)는 핀치 클램프일 수 있다. 연결기(280)는 4-방향 연결기이고 필터(270)로부터 밸브(278), 예를 들어 무바늘 밸브까지 튜빙을 결합시키기 위해, 분만 아니라 냉동보존 백(282)에 결합된 튜빙까지 결합시키기 위해 사용될 수 있다.
도 35는 수집 백(284), 포트(286), 클램프(288, 296), 밸브(290, 292), 필터(298), 및 냉동보존 백(294)을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다. 도시된 것과 같이, 밸브(290, 292)는 프로세싱 중에 키트에서 사용하기 위해 물질을 수용할 수 있는 무바늘 밸브일 수 있다. 예를 들어, 밸브(290, 292)를 통해 제공될 물질로, 예를 들어, 종양 소화 배지 및/또는 냉동보호제 또는 냉동보존 배지, 예컨대 다이메틸 설폭사이드 ("DMSO") 및/또는 그것의 용액, 예컨대 55% DMSO 및 5% 덱스트란 냉동보존 배지 (예컨대, BloodStor 55-5)를 들 수 있다. 주사기(300, 302)는 종양 소화 배지 및 55% DMSO 용액, 예컨대 55% DMSO 및 5% 덱스트란 냉동보존 배지를 각각, 무바늘 밸브(290, 292)를 통해 제공하기 위해 사용될 수 있다. 프로세싱 중에 물질은 미리 결정된 시간에 냉동보존 키트에 선택적으로 제공될 수 있다. 추가로, 클램프가 종양 소화 배지 및/또는 냉동보호제와 같은 제공된 물질의 흐름을 제어하기 위해 사용될 수 있고, 예컨대 DMSO 용액은 수집 백, 필터, 및/또는 냉동보존 백과 같은 장치에 미리 결정된 시간에 제공될 수 있다.
도 36A는 소화기와 같은 장치에 고정될 수 있는 냉동보존 키트의 구체예의 전면도를 도시한다. 도시된 것과 같이 수집 백(304)은 사용 중에 브라켓(306)에 의해 적어도 부분적으로 폐쇄된다. 브라켓은 프로세싱이 효율적인 방식으로 발생할 수 있도록 수집 백(304)을 위치시킬 수 있다. 도 36A는 용접(310)을 가지며 사용 중에 용접(310)에 근접하여 클램프(312)를 사용하여 용접(310) 상의 압력을 감소시키는 수집 백(304)을 도시한다. 사용 중에 도입된 조직은 장치로부터 조직이 패들(314, 316)을 사용하여 처리될 수 있도록 실질적으로 고르게 수집 백(304)에 분포될 수 있다. 냉동보존 백(330)은 다중 섹션(332)을 가지며 각각은 자신만의 포트(334)를 가지고 있다.
도 36B에는 브라켓을 사용하여 고정된 수집 백의 구체예의 측면도가 도시된다. 브라켓(336)은 수집 백을 고정하기 위해 사용될 수 있다. 브라켓(336)은 힌지(338), 상부 측면(340), 바닥 측면(342), 클램프(344), 돌출부(346) 및 래치(348)를 포함한다. 사용 중에 클램프(3440는 수집 백 상의 용접과 근접하여 위치할 수 있다 (도 36A). 브라켓(336) 상의 돌출부(346)는 그것이 수집 백의 표면에 근접하게 위치하여 사용 중에 수집 백으로 돌출되도록 구성된다. 일부 구체예에서, 돌출부(346)는 사용 중에 조직 및/또는 배지의 이동을 감소 및/또는 억제할 수 있어서 조직의 프로세싱이 실질적으로 수집 백의 길이를 따라 유사한 것을 보장할 수 있다. 예를 들어, 돌출부는 그것이 패들 사이에서 조직의 미끄러짐을 감소 및/또는 억제하도록 구성될 수 있다 (도 36A에 도시됨). 브라켓(336)은 또한 수집 백이 고정되는 것을 보장하기 위해 래치(348)를 포함할 수 있다.
도 36C는 수집 백과 함께 사용하기 위한 릿지(350)를 포함하는 클램프(344)의 분해도를 도시한다. 특히, 사용 중에 클램프(344)는 용접 및/또는 밀봉 실패의 위험을 줄이기 위하여 수집 백 상의 용접에 근접하여 위치할 수 있다.
도 37 수집 백(354), 필터(356), 밸브(362, 364), 클램프(358, 360), 튜빙(368), 및 냉동보존 백(366)을 포함하는 냉동보존 키트의 구체예의 상면도를 도시한다. 냉동보존 키트(352)의 다양한 구성요소 간 튜빙 길이는 다양할 수 있다.
도 38은 수집 백(354), 필터(356), 밸브(362, 364), 클램프(358, 360), 튜빙(368), 및 냉동보존 백(366)을 포함하는, 아래쪽을 향하여 위치한 냉동보존 키트의 구체예의 도면을 도시한다.
둘 이상의 백이 함께 결합되어 분해된 생성 물질이 특정 구체예에 적절하게 보관될 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 조직, 예를 들어 고형 포유류 조직으로부터 세포 및/또는 세포 응집물의 반자동 무균성 분해, 풍부화, 및/또는 안정화를 위한 자동화 장치를 포함할 수 있다. 발명과 함께 사용하기 위한 자동화 장치는 프로그래밍 가능한 프로세서 및 냉동보존 키트를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 냉동보존 키트는 일회용일 수 있다. 무균 키트. 발명은 추가로 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 수집 백과 같은 백이 수집 키트에 사용될 수 있다. 백은 샘플, 예컨대 조직 샘플의 첨가를 허용하는 개방된 단부를 가진다. 연결기는 수집 키트에서 백을 튜빙에 결합시킬 수 있다. 튜빙 물질은 밀봉 가능하고/하거나 용접 가능할 수 있다. 예를 들어, 튜빙은 열, 무선 주파수, 등과 같은 에너지를 사용하여 밀봉될 수 있다. 튜빙 물질은 PVA로부터 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, 튜빙은, 한정하는 것은 아니지만 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물을 포함하여하나 이상의 배지 효소 용액의 첨가를 허용하기 위해 밸브에 결합될 수 있다. 예를 들어, 밸브는 무바늘 밸브일 수 있다.
냉동보존 키트에 사용된 튜빙은 약 3.0 mm 내지 약 5.0 mm 범위의 외부 직경을 가지는 튜빙과 약 2.0 mm 내지 약 4 mm 범위의 튜빙의 내부 직경을 가지는 튜빙을 포함할 수 있다. 특히, 튜빙은 4.1+/-0.1 mm의 외부 직경 및 약 3.0+/-0.1 mm의 내부 직경을 가질 수 있다. 튜빙의 길이는 수집 키트의 구성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 수집 키트의 구체예는 약 10 cm 내지 약 20 cm 범위의 길이를 가진 튜빙을 포함할 수 있다.
수집 키트의 일부 구체예에서 원형은 조직 및/또는 효소 배지의 이동을 억제 및/또는 방지하기 위하여 하나 이상의 클램프를 포함할 수 있다. 특히, 효소 배지 및/또는 조직은 여과 단계 전에 필터로 이동하는 것을 억제할 수 있다.
발명은 추가로 다음의 번호가 매겨진 단락에 의해 한층 더 기술된다:
1. 일회용 무균 키트로서: 고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수용 및 프로세싱을 위한 분해 모듈; 분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해된 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈 ; 및 분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하며, 상기 모듈의 각각은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하고; 그리고 상기 모듈의 각각은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는, 일회용 무균 키트.
2. 단락 1의 일회용 무균 키트로서, 하나 이상의 유연한 용기가 탄력 있는 변형 물질을 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
3. 단락 1 또는 2의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 하나 이상의 밀봉 가능한 개구부를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
4. 단락 3의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈의 유연한 용기는 열 밀봉 가능한 용접을 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 하나 이상의 유연한 용기는 내부적으로 둥근 가장자리를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
6. 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 그 안에서 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하기 위해 적응된 분해 표면을 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 풍부화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 세포화된 분해된 고형 조직의 잔류물을 보유하는 필터를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 안정화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 생존 가능한 세포를 용액 또는 냉동보존된 상태로 보관하기 위한 배지 제형을 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 키트는 디지털, 전자식 또는 전자기식 태그 지표를 추가로 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
10. 단락 9의 일회용 무균 키트로서, 태그 지표는 속도 제어 동결에 적합한 선택적 동결 용액을 포함하여, 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화 과정의 유형; 그런 과정에서 사용된 배지의 하나 이상의 유형을 규정하는 특정 프로그램에 관한 것인 일회용 무균 키트.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 동일한 유연한 용기는 하나 이상의 분해 모듈, 안정화 모듈 및 선택적 풍부화 모듈의 일부를 형성할 수 있는 것인 일회용 무균 키트.
12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈은 프로세싱될 조직을 수용하기 위한 제1 유연한 용기를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
13. 단락 1 내지 12 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈은 분해용 배지를 포함하는 제2 유연한 용기를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
14. 단락 1 내지 13 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 선택적 풍부화 모듈은 풍부해진 여과물을 수용하기 위한 제1 유연한 용기 및 제3 유연한 용기를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
15. 단락 1 내지 14 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 분해 모듈 및 안정화 모듈은 둘 다 제2 유연한 용기를 포함하고 제2 용기는 소화 배지 및 안정화 배지를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 안정화 모듈은 안정화 배지를 포함하는 제4 유연한 용기를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 하나의 일회용 무균 키트로서, 안정화 모듈은 또한 보관 및/도는 냉동보존을 진행하기 위한 제1 유연한 용기 및/또는 제3 유연한 용기를 포함하는 것인 일회용 무균 키트.
18. 포유류 세포 또는 세포 응집체의 무균성 분해, 안정화 및 선택적인 풍부화를 위한 반자동 과정에서의 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 따르는 일회용 무균 키트의 용도.
19. 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서; 및 단락 1 내지 17 중 어느 하나의 일회용 무균 키트를 포함하는, 포유류 고형 조직으로부터의 세포 또는 세포 응집체의 반자동 무균성 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화를 위한 자동화 장치.
20. 단락 19의 자동화 장치로서, 일회용 키트를 인식하기 위하여 무선 주파수 식별 태그 판독기를 추가로 포함하는 것인 자동화 장치.
21. 단락 19 또는 20의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 태글 통해 일회용 무균 키트를 인식할 수 있고 후속해서 분해, 풍부화 및 안정화 과정의 유형 및 그런 과정에 필요한 각각의 배지 유형을 규정하는 키트 프로그램을 실행하는 것인 자동화 장치.
22. 단락 19 내지 20 중 어느 하나의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및 안정화 모듈 중 하나 이상과 연통하여 그것을 제어하기 위해 적응된 것인 자동화 장치.
23. 단락 22의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직 물질의 물리적 및/또는 생물학적 붕괴를 가능하게 하기 위해 분해 모듈을 제어하는 것인 자동화 장치.
24. 단락 23의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직 물질의 물리적 및 효소적 붕괴를 가능하게 하기 위해 분해 모듈을 제어하는 것인 자동화 장치.
25. 단락 24의 자동화 장치로서, 고형 조직 물질의 효소적 붕괴는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 배지 효소 용액에 의해 이루어지는 것인 자동화 장치.
26. 단락 19 내지 25 중 어느 하나의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하는 분해 유연한 용기 내의 분해 표면을 제어하고, 선택적으로 분해 표면은 기계식 피스톤인 것인 자동화 장치.
27. 단락 19 내지 25 중 어느 하나의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 선택적으로 프로그래밍 가능한 온도를 사용하여 용기에 풍부해진 분해된 고형 조직을 냉동보존하기 위해 안정화 모듈을 제어하는 것인 자동화 장치.
28. 단락 19 내지 27 중 어느 하나의 자동화 장치로서 장치는 임의의 조합으로 하나 이상의 추가적인 구성요소를 추가로 포함하는 것인 자동화 장치: 분해된 고형 조직이 선택적 풍부화 모듈로 전달되기 전에 분해 과정이 분해 모듈에서 완료되었는지를 인식할 수 있는 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 결정하고 각각의 용기간 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기 내의 온도를 제어하기 위한 센서; 모듈의 각각의 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서; 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프; 풍부화 모듈 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서; 풍부화 모듈 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는 각각의 모듈의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프.
29. 단락 19 내지 28 중 어느 하나의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기가 제거될 때까지 안정화 모듈에서 최적의 보관 온도 범위를 유지하기 위해 적응되거나; 또는 제어된 동결 단계를 실행하는 것인 자동화 장치.
30. 단락 19 내지 29 중 어느 하나의 자동화 장치로서, further comprising a 사용자 인터페이스. 것인 자동화 장치.
31. 단락 23의 자동화 장치로서, 인터페이스는 사용자에서 매개변수를 입력하거나, 사전 프로그래밍된 단계를 확인하거나, 오류를 경고하거나, 또는 이것들의 조합을 안내하는 지침을 표시하기 위한 디스플레이 스크린을 포함하는 것인 자동화 장치.
32. 단락 19 내지 31 중 어느 하나의 자동화 장치로서, 자동화 장치는 이동하도록 적응된 것인 자동화 장치.
33. 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법으로서, 선택적으로 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 따르를 키트를 따라 무균성 프로세싱 키트와 관련된 디지털, 전자식 또는 전자기식 태그 지표로부터 무균성 분해 조직 프로세싱 단계 및 그것들의 관련된 조건을 자동으로 결정하는 단계; 조직 샘플을 무균성 프로세싱 키트의 분해 모듈의 유연한 플라스틱 용기에 배치하는 단계; 및 분해 모듈; 선택적 풍부화 모듈; 및 안정화 모듈과 연통하고 제어함으로써 하나 이상의 조직 프로세싱 단계를 자동으로 실행함으로써 조직 샘플을 프로세싱하는 단계를 포함하는 방법.
종양 물질의 수집, 냉동보존, 및 TIL 제조를 위한 과정
TIL 제조를 위한 출발 물질은 적격 환자로부터의 자가 TIL 및 종양 세포를 함유하는 분해된 및 냉동보존된 세포 현탁액이다. 종양 출발 물질의 수집 및 프로세싱을 위한 예시의 흐름도가 제공된다 (도 65).
종양은 수술로 절제된 후 트리밍되어 시각적인 괴사 조직, 시각적인 건강한 (비-암성) 조직, 지방 조직, 및 과다 혈액이 제거된다. 트리밍된 종양 무게는 2 그램 이상이어야 한다 (≥2 그램). 7 g이 넘게 측정된 종양은 보다 작은 부분으로 나누어지고 개별적으로 분해될 수 있다.
각각의 종양 단편은 배지, 콜라게나제 및 DNAse를 함유한 개별 멸균 백에 넣어진다. 예식의 시약은 다음의 표에 제시된다:
표 4 - 분해 배지
원료 물질 동물 / 인간 유래 공급처 이용 가능한 인증서
인산염 완충 식염수 없음 Life Technologies Ltd CoA
2 mM 염화 칼슘 없음 Sigma-Aldrich CoA
DNAse 1 (도나제 알파) 미국에서 승인된 의약 제품 Roche Products Ltd CoA
콜라게나제 유형 IV 소 Nordmark Arzneimittel GmbH &Co KG CoA, CoO, TSE/BSE 진술서
BloodStor 55-5
(55% DMSO)		 없음 BioLife Solution CoA
백은 그런 후 열 밀봉되고 그것의 내용물은 분해되어 종양 및 TIL을 함유한 균질한 세포 현탁액이 생성된다. 분해는 효소가 종양 조직으로 가로지르는 것을 보장하기 위해 한정된 기간에 걸쳐 규정된 압축 압력으로 규정된 수의 반복된 물리적 압축 사건을 전달하기 위해 프로그램을 작동시킴으로써 효소적 소화를 가속화하는 장치, 예컨대, 본원에 기술된 Tiss-U-Stor 장치에 의해 수행된다. 사이클의 횟수, 압력, 온도, 및 기간은 각각의 개별 종양에 대해 기록된다.
그런 후 균질화된 세포 현탁액은 200 μm 필터 (Baxter, RMC2159)를 사용하여 무균적으로 여과되고 여과물은 무균적으로 냉동보존 백으로 통과한다. BloodStor 55-5 (Biolife Solution, Bothell, WA)가 무균적으로 첨가되어 5% DMSO를 달성한다. 그런 후 세포 현탁액은 Tiss-U-Stor 장치를 사용하여 규정된 냉각 프로그램으로 냉동보존되고, 측정된 온도 프로파일은 각각의 종양 부분으로부터 유래된 각각의 개별 세포 현탁액에 대해 기록된다. 냉동보존된 세포 현탁액은 액체 질소의 증기 상에서 보관된다.
냉동보존된 세포 현탁액의 권장된 보관 조건은 ≤ -130℃이다.
세포 현탁액은 임상 현장으로부터 냉동보존 세포 현탁액이 ≤ -130℃에서 유지되는 것이 보장된 검증된 용기에 포장된 자격을 갖춘 택배 서비스를 통해 GMP 세포 요법 치료 제조 현장으로 수송된다.
(Tiss-u-Stor)
절제된 종양이 중량 및 조건에 대해 평가된다. 각각의 종양 단편에 대해, 관련없는 물질이 제거되고 단편의 무게가 측정된다. CS50N 백이 개방되고, 최대 약 7 g의 종양이 첨가된 후 백은 밀봉된다. 15 mL의 EDM 소화 배지가 ml EDM당 2 μl 겐타마이신/암포테리신이 있는 백에 무바늘 포트를 통해 주사기에 의해 첨가된 후 백으로부터 주사기로 공기가 제거된다.
분해 백의 종양 조직 및 분해 배지가 온조 제어된 조직 분해기에 배치된다. 온도는 주변 온도로부터 35℃로 1.5℃/분의 속도로 증가되고 총 약 45분 동안 35℃에서 유지되며 그 동안 분해기는 분당 240 사이클로 활동한다.
분해된 후 종양 물질은 인라인 필터를 통해 이차 동결 백으로 여과된다. 1.5 mL의 Blood stor (DMSO)가 무바늘 포트를 통해 주입되고 공기가 제거된다.
2 ml의 현탁액을 테스트를 위해 빼낸다.
선택적인 냉동보존을 위해, 냉동백이 동결 카세트에 로딩되고 동결 카세트는 Via 동결기에 배치된다. 그런 후 Via 동결기는 -80℃로, 바람직하게는 35℃로부터 직접 -80℃로, -2℃/분의 속도로 냉각된다.
동결된 냉동백은 그런 후 액체 질소 보관소로 전달된다.
TIL 제조
영국 (UK)에서 배양을 위해 사용된 자가 조직은 적절한 동의를 얻은 영국의 인체 조직 관리국(Human Tissue Authority), 신원 사슬, 관리 사슬에 의해 확립된 환자 치료를 위한 인간 조직 및 세포에 대한 품질 및 안전 보증 가이드, HTA-GD-20에 따라야 하며, 기증자 확인을 위한 심사는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, IV-1 & 2, HTLV-1 & 2, 및 매독에 대해 음성이어야 한다.
제조과정은 절제된 종양으로부터 유래된 TIL 및 종양 세포를 함유하는 냉동보존된 세포 현탁액으로부터의 파생물 및 팽창을 포함한다. 종양이 약 7 g보다 크면, 절제 과정으로 다중 냉동보존된 세포 현탁액이 생성되며, 여기서 각각의 세포 현탁액은 2 - 7 g 종양 단편으로부터 유래된다. 전형적으로, 1 TIL 파생물에 대해 단지 하나의 세포 현탁액이 해동될 필요가 있지만, 남아 있는 냉동보존된 세포 현탁액은 GMP 대조군에 남아 있으며 권장된 보관 조건 (액체 질소의 증기상)으로 유지된다.
특정 구체예에서 세포 현탁액은 분해 후, 냉동보존 전에 여과되었다. 예시의 제조 과정은 도 66에 도시된다. 예시의 제조 원료 물질은 다음의 표에 제공된다:
표 5 - 원료 물질 출처
원료 물질 인간 / 동물
유래		 공급처 이용 가능한 인증서
T 세포 배지 인간 및 동물 ThermoFisher Scientific CoA, CoO
소 태아 혈청 (FBS) 동물 Life Technologies CoA, CoO
겐타마이신 / 암포테리신　B, 500x 없음 Life Technologies CoA
IL-2 (알데스류킨) 이용할 수 없음 Clinigen CoA
인간 AB 혈청 인간 Valley Biomedical 기원이 있는 CoA
MACS GMP CD3 OKT3 항체 없음 Miltenyi Biotec CoA
조사된 버피 코트 인간 SNBTS CoA
인산염 완충 식염수 없음 Life Technologies CoA
알부민 (인간) 20% 인간 OctaPharma 기원이 있는 CoA
CryoSure-DMSO 없음 WAK - Chemie Medical GmbH CoA, TSE
T 세포 배지 (TCM)는 알부민 (인간), 인간 홀로 트랜스페린, 및 동물 기원의 콜레스테롤을 함유한다. 알부민 및 트랜스페린을 제조하기 위해 사용된 공급 혈장은 미국이 출처이며 기증자는 우발적 요인에 대해 테스트된다.
콜레스테롤은 호주/뉴질랜드에서 생산되는 양털 그리스로부터 공급되며, 그것은 보고된 전염성 해면상 뇌병증(TSE) 사례가 있는 국가의 반추 동물 기원 물질을 금지하는 USDA 규정을 준수한다.
소 태아 혈청 (FBS)은 보고된 전염성 해면상 뇌병증(TSE) 사례가 있는 국가의 반추 동물 기원 물질을 금지하는 USDA 규정을 준수하여 호주/뉴질랜드로부터 공급된다. FBS는 21 CFR 파트 113.47을 따라 테스트되며, 구체적으로: 블루텅 바이러스, 소 아데노바이러스, 소 파보바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 광견병 바이러스, 레오바이러스, 세포변성제, 혈액흡착제를 포함한다. FBS는 56℃에서 30분 동안 열 비활성화되며 삼중 0.1 μm 여과되어 두 가지 직교 바이러스 제거 단계를 제공한다.
인간 AB 혈청은 FDA 등록 시설 (1121958)인 Valley Biomedical로부터 공급된다. 각각의 도너 장치는 B형 간염 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 바이러스 (HBV) 핵산 증폭 테스트 (NAT), 항-인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 유형 1 및 2, HIV-1 NAT, 항-C형 간염 바이러스 (HCV), HCV NAT, 및 FDA 승인 방법에 의한 매독에 대한 테스트에 대해 테스트된다. 혈청은 56℃에서 30분 동안 열 비활성화되며 0.1 μm 여과된다.
조사된 버피 코트 공급, 제조, 배송 및 보관: 스코틀랜드 국립 수혈 서비스 (SNBTS)는 기증자를 선별하고, 혈액 구성요소를 수집하고, 버피 코트를 준비하고 조사헌다. SNBTS는 혈액, 혈액 구성요소 및 조직을 조달, 처리, 테스트, 보관 및 유통하기 위해 혈액, 안전 및 품질 규정(2005)에 따라 영국 인간 조직 관리국(면허 번호 11018)에 의해 라이센스가 부여된다.
건강한 기증자 선별은 기증자가 영국에 거주하는 것을 제외하고 미국연방규정집(CFR) 타이틀 21 파트 1271.75에 기술된 요구조건을 충족하거나 넘어선다. 이것은 산발성 크로이츠펠트-야콥병 (sCJD) 또는 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)의 이론적 위험을 나타내지만 영국은 강력한 국가 감시 프로그램을 보유하고 있다. 1990년 5월부터 2018년 12월 31일까지의 가장 최근의 연례 보고서(National CJD Research & Surveillance Unit, 2018)는, 영국의 sCJD 발병률이 소 해면상 뇌병증 (BSE)이 없는 국가를 포함하여 세계 다른 곳에서 관찰된 발병률과 비슷한 것을 확인시켜준다. 2017년부터 2020년 4월 5일까지 보고된 vCJD 사례는 없으며, 2012년 1월 1일 이후 전국적으로 2건의 사례만이 확인되었다 (NCJDRSU 월간 보고서, 2020). 이 엄격한 감시 네트워크는 2007년 이후 보고된 적이 없는 수혈 전파 vCJD 감염을 제거하였다 (National CJD Research & Surveillance Unit, 2018). 예시의 적격 기증자 검사 (표 7)는 21 CFR 파트 1271.85 요건을 충족하며 필요하지 않은 E형 간염 검사를 추가한다.
표 6 - 예시의 기증자 스크리닝 (NHSBT)
병원체 사양 요구조건
B, C 및 E형 간염 바이러스 검출되지 않음/음성 전부 기부
인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 유형 1 및 2 검출되지 않음/음성 전부 기부
매독균 검출되지 않음/음성 전부 기부
인간 T 림프친화 바이러스 (HTLV) 타입 1 및 2 검출되지 않음/음성 첫 번째 기부 및 선택된 후속 기부 중에서
말라리아 검출되지 않음/음성 기증자의 개별 상황에 따라 수행된 테스트
크루스파동편모충(T. cruzi) 검출되지 않음/음성 또는 IgG 양성
웨스트 나일 바이러스 검출되지 않음/음성
사이토메갈로바이러스 (CMV) 검출되지 않음/음성 또는 IgG 양성
라이센스를 받은 혈액 시설은 중증의 호중구 감소증이 있는 환자를 치료하기에 적합한 임상 등급의 조사된 버피 코트를 제조한다. 버피 코트를 제조하기 위하여, 혈액이 원심분리되어 3개의 층: 적혈구 층, 버피 코트 층 및 혈장 층이 형성된다. 10명의 기증자로부터의 버피 코트가 25 내지 50 Gy 방사선 조사로 조사되어 세포 성장이 정지된다. 임상 등급의 조사된 버피 코트는 제조되어 온도 모니터를 포함하여 제어된 온도 배송기를 사용하여 야간 택배에 의해 GMP 제조 시설로 배송된다. 배송은 제조 과정에서 사용 하루 전에 발생한다.
수령 후 버피 코트는 제조에 사용할 때까지 15 - 30℃에서 유지된다.
조사된 공급기 세포 제조
최대 10명의 고유한 공여자로부터의 버피 코트가 모아진 다음, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하기 위해 Ficoll 구배 밀도 원심분리에 의해 원심분리된다. 대략 4 x 109개의 생존 가능한 혈액 세포가 폐쇄된 정적 세포 배양 백에서 대략 8% 인간 AB 혈청, 3000 IU/mL IL-2 및 30 ng OKT-3이 보충된 TCM에 재현탁된다. PBMC는 사양에 따라 개봉된다.
표 7 - 동종 PBMC 재고 사양
속성 테스트 방법 허용 기준
외관 육안 검사 ID 표지
정체성 유동 세포분석 ≥85% 생존가능한 CD45+ 세포
생존 능력 유동 세포분석 보고서 결과
가치 있는 백혈구 총 함량 유동 세포분석 2 내지 4 x109
PBMC는 또한 멸균성 및 미코플라즈마에 대해 테스트된다. 출발 단계 3 (12일, 도 C) 직전, 배지, IL-2 및 OKT3을 포함한 제형화된 공급기 세포의 샘플이 제거된다. 이 샘플은 인큐베이션되고 13, 17 및 18에 공급기 세포가 팽창되지 않았는지를 확인하기 위해 분석된다.
인간 혈청 알부민 (HSA)으로도 알려져 있는 알부민 (인간)은 미국 기증자로부터 공급된다. 모든 혈장 기증은 개별적으로 테스트되며 HBsAg, 항-HIV 1, 항-HIV 2, 및 항-HCV 항체에 대해 비-반응성이다. 각각의 혈장 모음이 테스트되며 NAT에 의해 HBsAg, 항-HIV 1, 항-HIV 2, 및 HCV-RNA에 대해 음성으로 나타났다. HSA 제품은 미국 및 유럽 약전의 생산 및 테스트 기준을 충족시키는 GMP 규정에 따라 제조된다.
TIL 파생물
세포 현탁액은 10% FBS, 0.25 μg/mL 암포테리신 B와 10 μg/mL 겐타마이신 (Life Technologies, Grand Island, NY), 및 인터류킨-2 (IL-2; 알데스류킨) 3000 IU/mL (Clinigen, Nurnberg, Germany)이 보충된 TCM에서 대략 0.25 x 106 to 0.75 x 106 생존 가능한 세포/mL로 시딩되고 표준 세포 배양 조건 (37℃, 5% CO2)으로 배양된다.
5일 째에, 배지의 절반이 제거되고 10% FBS, 0.50 μg/mL 암포테리신 B, 20 μg/mL 겐타마이신 및 6000 IU/mL IL-2이 보충된 TCM으로 교체된다.
7일 째에, 만약 세포 농도가 > 1.5 x 106 생존 가능한 세포/mL이면, TIL 파생물 배양은 대략 0.1 x 106 내지 2.0 x 106 생존 가능한 세포/mL을 유지하기 위해 부피의 3배로 희석된다. 만약 세포 농도가 ≤1.5 x 106 생존 가능한 세포/mL이면, 배지의 절반이 교체된다. 어느 옵션에서든, 배지는 10% FBS, 0.50 μg/mL 암포테리신 B, 20 μg/mL 겐타마이신 및 6000 IU/mL IL-2로 보충된 TCM이다.
10일 째에, 만약 세포 농도가 > 1.5 x 106 생존 가능한 세포/mL이면, TIL 파생물 배양은 대약 0.1 x 106 내지 2.0 x 106 생존 가능한 세포/mL을 유지하기 위해 부피의 3배로 희석된다. 만약 세포 농도가 ≤1.5 x 106 생존 가능한 세포/mL이면, 배지의 절반이 교체된다. 어느 옵션에서든, 첨가된 배지는 10% FBS, 0.50 μg/mL 암포테리신 B, 20 μg/mL 겐타마이신 및 6000 IU/mL IL-2로 보충된 TCM이다.
TIL 활성화
TIL은 항-CD3 항체 (OKT3)를 사용하여 활성화되어 동종 말초혈 단핵 세포 (PBMC)로부터의 조사된 공급기 세포의 FC 수용체에 결합되었을 때 CD3 특이적 자극을 제공한다. 공급기는 첨가된 항-CD3 (OKT-3)을 지지하기 위해 추가적인 공자극의 천연 공급원을 제공한다.
12일 째에, TIL 파생물 단계 2로부터의 1 내지 20 x 106 생존 가능한 T 세포가 대략 30 ± 10 ng/mL OKT3, 대략 8% 인간 AB 혈청 및 3000 ± 1000 IU/mL IL-2를 사용하여 2.0 내지 4.0 x 109 생존 가능한 조사된 공급기 세포 (섹션 8.1.4.4)에 첨가된다. TIL 활성화 배양은 표준 세포 배양 조건에서 6일 동안 인큐베이션된다.
TIL 팽창
18일 째에, 활성화된 TIL은 대략 8% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL IL-2가 보충된 T 세포 배지를 함유한 생물반응기에 활성화된 TIL 세포 현탁액을 무균적으로 첨가함으로써 팽창을 계속한다.
19일 째에, TIL 팽창은 수득할 때까지 3000 IU/mL IL-2로 보충된 T 세포 배지의 연속적인 공급으로 제공된다.
TIL은 SEFIATM을 사용하여 세포를 세척함으로써 수득된다. 세포는 원심분리에 의해 농축된 후 1% 인간 혈청 알부민 (HSA)이 보충된 인산염 완충 식염수 (BSA)를 사용하여 2-4회 세척된다. 세포는 그런 후 PBS + 1% HSA에 대략 50-60 mL로 재현탁된다.
세척되고 농축된 세포는 냉동백에 무균적으로 전달되고 로트 개봉 테스트를 위해 일부가 제거되며 샘플이 보유된다. 냉동보호제가 첨가되어 PBS 중의 대략 10% DMSO 및 8.5% HSA에 재현탁된 ≥5 x 109 생존 가능한 세포의 제형화된 제품이 달성된다. 냉동백은 -80℃로 냉각된다.
TIL 제조 과정
다음의 표는 과정의 변동의 예를 제시한다.
표 8 - 제조 과정
과정 버전 v1.0 v1.1 v1.2 ITIL-168
종양 분해 수동 분해 수동 분해 Tiss-U-Stor 분해 Tiss-U-Stor 분해
출발 물질 신선한 냉동보존된 냉동보존된 냉동보존된
TIL 파생물 1-3주 1-3주 12일 12일
중간 보유 단계 냉동보존된 냉동보존된 적용할 수 없음 적용할 수 없음
TIL 회복 3일 3일 적용할 수 없음 적용할 수 없음
급속 팽창 단계 12일 12일 12일 12일
배양 팽창 0 - 2일 0 - 2일 적용할 수 없음 적용할 수 없음
최종 제품 신선한 신선한 냉동보존된 냉동보존된
다음의 표는 약물 제품 데이터를 보여준다.
Figure pct00001
냉동보존된 및 신선한 세포 현탁액을 비교하면, 대표적인 수율은 유사한 약물 물질 수율 (도 67A), 생존 능력 (도 67B), 및 퍼센트 T 세포 (도 67C)에 의해 입증되는 바 일관적이었다.
냉동보존의 최적화 - 종양 물질의 대리물로서, 분리된 PBMC는 Tiss-U-Stor 과정 및 물질을 사용하여 소화되었다. 상업적 냉동보존제 (CPA)가 해동 후 생존 능력을 최대화하는 시약을 결정하기 위해 다양한 조건에 걸쳐 평가되었다 (도 68). 2개의 CPA, Cryostor10 및 줄기 세포 뱅커 DMSO 유리의 해동 후 생존 능력은 비슷하였다. 그런 후 CryoStor 기반 DMSO를 DMSO 기반 냉동보존제인 Bloodstor 55-5, 및 더 높은 농도의 BloodStor 제품이 더 농축되어 더 작은 냉동백이 허용되기 때문에 선택되었다. 그런 후 물질을 4℃에서 10분 동안 유지한 다음, -1℃/분의 속도로 온도를 낮추거나 -2℃/분의 속도로 35℃에서 -80℃로 직접 감소시키는 프로토콜에 따라 냉동보존이 비교되었다. 해동 후 생존 능력은 사용된 2가지의 냉동보존 프로토콜 사이에서 유사하였다 (도 69).
냉각 중에, 얼음 핵형성은 열을 방출한다. 방출된 열이 용액을 따뜻하게 하는 것처럼 보이는 현상인 과냉각은 해동 후 회수율을 낮추는 것과 관련이 있다. 온도 데이터는 두 프로토콜을 모두 사용하여 냉동보존하는 동안 테스트 항목으로부터 기록되었다 (도 70). -1℃/분 프로토콜을 사용하는 2개의 독립적인 실행에서 과냉각이 관찰된 반면, -2℃/분 냉각 프로토콜은 한 번도 과냉각 사건이 기록되지 않았으며, 제2 독립적인 실행에서는 과냉각 사건이 대체 프로토콜에 비해 더 적은 열을 방출하는 것이 관찰되었다 (도 70).
냉동보존된 DP는 ≤-130℃에서 보관 및 수송을 위해 증기 상 LN2로 전달된다.
샘플 멸균성이 테스트되고 보유된 샘플은 Coolcell® (Biocision, Larkspur, CA)을 사용하여 -80℃에서 냉동된 후 보관 목적으로 증기 상 LN2로 전달된다.
비록 본 발명 및 그것의 장점이 상세하게 기술되었지만, 다양한 변화, 치환 및 변경이 첨부된 청구범위에서 정의된 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 만들어질 수 있는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 예시의 목적으로만 제공되며 어느 방식으로든 발명의 제한하려는 의도가 아닌 다음의 실시예에서 한층 더 예시될 것이다.
실시예
실시예 1
도 39는 사용 중의 백(400)의 구체예를 도시한다. 도시된 것과 같이, 백(400)은 클램프(402)와 같은 고정 요소에 의해 트레이(406)와 같은 장치(404) 내에 고정된다. 조직(408)은 백(400)의 투명한 측면을 통해 볼 수 있다. 튜빙(410)은 백(400)에 결합된다.
실시예 2
도 40은 본원에 기술된 발명에 사용하기 위한 백(420)의 구체예를 도시한다. 도시된 것과 같이, 백(420)은 장치 및 트레이(424)로부터의 고정 요소(422)에 의해 고정된다. 조직 물질(424)은 백(420)의 투명한 측면을 통해 볼 수 있다. 튜빙(426)은 백(420)에 결합된다. 도시된 것과 같이 트레이(406) 내에서의 백(400)의 위치는 고정 요소(428), 특히 테이프를 사용하여 추가로 고정된다. 조직(424)은 백(420)의 투명한 측면을 통해 볼 수 있다. 도 40에서 도시된 것과 같이, 백은 백의 내부 및/또는 조직(424)에 접근하기 위해 포트(430)를 포함할 수 있다.
실시예 3 - 분해 및 냉동보존
TIL075를 전이성 흑색종 종양 조각 (샘플)으로부터 제조하였다. 종양 샘플의 무게를 측정하고 다음과 같이 처리하였다. S1 = 1.4 g. S1을 자동화된 과정에 의해 분해하였다. S2 = 19.4 g. S2를 나누어 한 부분 (약 7.7 g)을 자동화된 과정에 의해 분해하고 제2 부분 (약 12g)을 수동으로 분해하였다.
수동 분해: 종양 샘플을 더 작은 2-4 mm3 조각으로 절단하여 항생물질과 함께 80 mL의 소화 배지를 함유하고 있는 병에 첨가하였다. 병을 쉐이커에 배치하고 밤새 (약 14시간) 37℃에서 분해시켰다. 그런 후 소화물을 넷웰(netwell) 및 100 μM 세포 여과기를 통해 팔콘 50 튜브로 여과하였다. 여과된 소화물의 10%를 멸균성 테스트를 위해 한 쪽에 놓아두었다. 나머지를 원심분리하고 12 mL의 CS10에 재현탁하고 12개의 냉동 바이알에 나누었다.
Tiss-U-Stor 분해: 2개의 CS50N 백을 멸균 가위로 개방하고, 포트 없이 단부를 절단하였다. S1 1.4 gm 샘플 및 7.7 gm 부분의 S2를 CS50N 백에 배치하고 백을 밀봉하였다. 15 mL의 분해 배지 및 30 μl의 항생물질을 조합하여 주사기를 사용하여 백의 무바늘 포트를 통해 각각의 밀봉된 백에 첨가하였다. 백을 ViaFreeze에 로딩된 조직 분해기에 전달하고 분해 프로토콜을 시작하였다. 분해 프로토콜은 주변 온도로부터 35℃로 1.5℃/분의 속도로 온도를 증가하고, 분해기가 활성인 동안 온도를 35℃에서 유지하여야 한다. 분해기 속도를 240 사이클/분으로 설정하였다. 그 후 ViaFreeze의 온도를 냉동보존 단계까지 35℃로 유지하였다.
백 설정은 인라인 필터를 통한 튜빙에 의해 이차 냉동백까지 직접적인 연결을 포함한다. CS50 백의 분해된 물질을 냉동백으로 여과하고 튜빙 연결을 밀봉하였다. 1.5 ml Blood-stor (DMSO)를 냉동백의 무바늘 포트를 통해 서서히 첨가하고, 백을 최적의 열 전달을 위해 설계된 카세트에 배치하여, 카세트를 분해기 대신 다시 ViaFreeze에 배치하였다.
분해 후 냉동보존 프로토콜을 시작하였다. 냉동 사이클은 ViaFreeze의 온도를 35℃로부터 -2℃/분으로 -80℃까지 내렸다. 냉동된 백을 액체 질소 보관소로 전달하였다.
실시예 4 - 분해 및 냉동보존
TIL077을 전이성 흑색종 종양 조각 (샘플)으로부터 제조하였다. 종양 샘플의 무게를 측정하고 다음과 같이 처리하였다. S1 = 4.6 g. S2 = 4.6 g.
Tiss-U-Stor 분해: 2개의 CS50N 백을 멸균 가위로 개방하고, 포트 없이 단부를 절단하였다. S1 = 4.6 gm 샘플 및 S2 = 4.6 gm 샘플을 CS50N 백에 배치하고 백을 밀봉하였다. 15 mL의 분해 배지 및 30 μl의 항생물질을 조합하여 주사기를 사용하여 백의 무바늘 포트를 통해 각각의 밀봉된 백에 첨가하였다. 백을 ViaFreeze에 로딩된 조직 분해기에 전달하고 분해 프로토콜을 시작하였다. 분해 프로토콜은 주변 온도로부터 35℃로 1.5℃/분의 속도로 온도를 증가하고, 분해기가 활성인 동안 온도를 35℃에서 유지하여야 한다. 분해기 속도를 240 사이클/분으로 설정하였다. 그 후 ViaFreeze의 온도를 냉동보존 단계까지 35℃로 유지하였다. 도 71은 분해 기록을 도시한다.
백 설정은 인라인 필터를 통한 튜빙에 의해 이차 냉동백까지 직접적인 연결을 포함한다. CS50 백의 분해된 물질을 냉동백으로 여과하고 튜빙 연결을 밀봉하였다. 1.5 ml Blood-stor (DMSO)를 냉동백의 무바늘 포트를 통해 서서히 첨가하고, 백을 최적의 열 전달을 위해 설계된 카세트에 배치하고, 카세트를 분해기 대신 다시 ViaFreeze에 배치하였다.
분해 후 냉동보존 프로토콜을 시작하였다. 냉동 사이클은 ViaFreeze의 온도를 35℃로부터 -2℃/분으로 -80℃까지 내렸다. 도 71은 분해 기록을 도시한다. 냉동된 백을 액체 질소 보관소로 전달하였다.
실시예 5 - 분해 및 냉동보존
TIL078을 전이성 흑색종 종양 조각 (샘플)으로부터 제조하였다. 종양 샘플의 무게를 측정하고 다음과 같이 처리하였다. S1 = 11 g. S2 = 2 g.
Tiss-U-Stor 분해: 2개의 CS50N 백을 멸균 가위로 개방하고, 포트 없이 단부를 절단하였다. 종양 물질을 나누어 6.4 gm의 샘플을 2개의 CS50N 백의 각각에 넣고 백을 밀봉하였다. 15 mL의 분해 배지 및 30 μl의 항생물질을 조합하여 주사기를 사용하여 백의 무바늘 포트를 통해 각각의 밀봉된 백에 첨가하였다. 백을 ViaFreeze에 로딩된 조직 분해기에 전달하고 분해 프로토콜을 시작하였다. 분해 프로토콜은 주변 온도로부터 35℃로 1.5℃/분의 속도로 온도를 증가하고, 분해기가 활성인 동안 온도를 35℃에서 유지하여야 한다. 분해기 속도를 240 사이클/분으로 설정하였다. 그 후 ViaFreeze의 온도를 냉동보존 단계까지 35℃로 유지하였다. 도 72는 냉동보존 기록을 도시한다.
백 설정은 인라인 필터를 통한 튜빙에 의해 이차 냉동백까지 직접적인 연결을 포함한다. CS50 백의 분해된 물질을 냉동백으로 여과하고 튜빙 연결을 밀봉하였다. 1.5 ml Blood-stor (DMSO)를 냉동백의 무바늘 포트를 통해 서서히 첨가하고, 백을 최적의 열 전달을 위해 설계된 카세트에 배치하고, 카세트를 분해기 대신 다시 ViaFreeze에 배치하였다.
분해 후 냉동보존 프로토콜을 시작하였다. 냉동 사이클은 ViaFreeze의 온도를 35℃로부터 -2℃/분으로 -80℃까지 내렸다. 도 72는 냉동보존 기록을 도시한다. 냉동된 백을 액체 질소 보관소로 전달하였다.
실시예 6 - 분해 및 냉동보존
TIL081을 전이성 흑색종 종양 조각 (샘플)으로부터 제조하였다. 소프트웨어를 단일 프로토콜에 분해 및 냉동보존을 포함하도록 엡데이트하였다. 도 73은 분해 및 냉동보존 기록을 도시한다. 선행 실시예에서처럼, 분해기는 약 53분 동안 활성이었다 (도 73A, 73B). 분해된 조직을 분해 백으로부터 필터를 통해 냉동백으로 전달하고 분해 과정을 시작한 시점으로부터 약 90분 내에 냉동보존을 위해 ViaFreeze로 복귀시키고 그때에 냉동 냉각을 시작하였다.
실시예 7 - 바이알로부터의 제조
표 9 - 세포 냉동보존 및 해동
시약/물질
시약 제조사 카탈로그 #
세포 유형에 따른 배지 NA NA
DPBS Sigma D8537-500ML
15 mL 원심분리 튜브 VWR 339650
Stripette 10mL Corning CLS4101
Stipette 25 mL Corning CLS4251
Stripette 5 mL Corning CLS4051
Tips 1000 μL 여과 StarLabs S1182-1730
트립판 블루 Sigma T8154-100ML
표 10 - 장비
설명 제조사 부품 # 시리즈 # / Asset#
파워펫 프로 1-100 mL VWR 452-8344 NA
피펫 ErgoOne 100-1000 μL Star Labs S7110-1000 NA
Megafuge 40R 원심분리기 Hereus 75004518 41536283
혈구계산기 Hawksley HC002 NA
수조 12L VWR 462-0557 BP1912001
IncuSafe CO2 인큐베이터 PHCBI MCO-170AIC-PE NA
냉동바이알을 액체 질소로부터 제거하고 세포 현탁액이 녹을 때까지 37℃ 수조에 넣었다. 세포 현탁액을 15 mL 팔콘에 넣고 상부를 PBS로 최대 10 mL로 채우고 400 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버렸다.
세포 배양을 위해, 세포 펠릿을 미리 온열해놓은 배지에, 처음에는 작은 부피, 즉 2 내지 3 mL로 재현탁하였다. 부착 세포주 (즉, 종양주, HEK 293s)를 다음의 표에 따라 배지와 함께 조직 플라스크에 첨가하였다. 비부착 세포주 (즉 T 세포, TIL, JurkaT 세포)를 mL당 0.5 내지 1x106 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플라스크를 가습 37℃ 인큐베이터에 넣고 배지를 2-3일마다 교체하였다.
표 11 - 상이한 용기에서 부착 세포를 위한 세포 시딩 밀도
용기/플라스크 유형 시딩 밀도 배지 부피e mL
24 웰 0.1 x 106 0.5 내지 1
6 웰 0.5 x 106 2 내지 4
T 25 0.7 x 106 4 내지 6
T 75 2.1 x 106 12 내지 15
T 150 4.4 x 106 25 내지 30
실시예 8 - 냉동보존된 분해된 종양으로부터의 제조.
제조 과정
출발 물질 해동
VIAThaw CB1000 해동 시스템을 사용하여 냉동 백에 보관된 냉동보존된 샘플의 가열을 제어하였다. 냉동보존된 세포 현탁액을 해동한 후, Life Technologies (Paisley, United Kingdom)사에 의해 제조된 T 세포 배지 (TCM)에 희석하였다. TCM은 80% 로즈웰 파크 메모리얼 연구소(Rosewll Park Memorial Institute, RPMI) 1640 배지 및 20% AIM V를 함유한다. 세포 현탁액을 70- 내지 100-μm 필터를 통해 여과하고 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿을 10% 조사된 소 태아 혈청 (FBS) (Life Technologies, Auckland, New Zealand)이 보충된 TCM에 재현탁하였다.
원래의 CS50 백의 분해된, 냉동보존된 종양 (약 16.5 ml)을 VIAThaw CB1000 해동 시스템의 해동 트레이에 넣고 약 0℃로 가온하였다.
실시예 9 - 효능
공동 배양 기반 효능 방법은 OKT3-발현 표적 세포주에 의해 활성화된 T 세포의 백분율을 정량화한다. 생체내에서 작용의 TIL 생성 메커니즘은 생체내에서 TIL에 결합하는 pMHC-HLA를 통한 TIL 펩타이드 제공을 포함한다. 효능 검정은 OCT3 항원 결합 도메인을 발현하는 K562 세포주와의 공동 배양에 의해 특이적으로 활성화될 때 총 생존 가능한 T 세포로 나누어진, CD137, IFN-γ, TNFα, 또는 CD107a 에 대해 양성인 생존 가능한 T 세포로서 정의된 강력한 T 세포의 백분율을 정량화한다. T 세포 효능을 정량화하기 위해 사용된 마커로는 DRAQ7, CD45, CD2, CD107a, CD137, TNF-α, 및 IFN-γ를 들 수 있다.
효능을 측정하기 위하여, ITIL-168 DS 세포를 3개 세포 주 중 하나를 사용하여 대략 5시간 동안 공동 배양한다: 조건 1 - 자극 없음 - 배경 세포 활성; 조건 2 - K562 세포주 - 배경 TCR-독립적인 반응성; 조건 3 - OKT-3에 대한 ScFv를 발현하는 K562 세포주 - TCR-유도된 T 세포 자극.
배양된 세포를 유동 세포분석에 의해 분석하고 4개의 활성화 마커 중 적어도 하나를 발현하는 T 세포를 정량화하기 위해 생존 가능한 백혈구 상에 게이팅된다.안정성 테스트를 위해, 냉동보존된 DP 세포를 해동하고, 세척하고, 밤새 정지시킨다.
ITIL-168 TCR 혀능을 다음과 같이 계산한다: 단계 1) 비-특이적 자극으로 인한 % 효능을 조건 2로부터 얻는다; 단계 2) CD3 특이적 및 비-특이적 자극으로 인한 % 효능을 조건 3으로부터 얻는다; 단계 3) CD3 특이적 자극으로 인한 % 효능을 조건 3 - 조건 2로서 계산한다.
조건 2 및 조건 3 둘 다에 대해, % 강력한 결과는 100%에서 CD137-/IFN-γ-/TNFα-/CD107a- (즉 배경)인 모든 T 세포의 백분율을 뺀 것이다. 이 집단은 적어도 하나의 마커를 생성하지 않는다.
실시예 10 - TIL 파생물 및 급속 팽창
TIL 제조 과정은 종양 절제, 분해, 냉동보존, 및 선택적 포장 및 배송 후에 시작된다. 배송 포장 및 종양 프로세싱 허브로부터 Instil사의 제조 시설로의 배송은 통제된 조건 하에 자격을 갖춘 발송인을 통해 이루어진다. 냉동보존된 종양 및 T 세포를 제어된 조건을 사용하여 해동하고, 80% 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지 및 20% AIM V로 구성되고, 10% FBS, 암포테리신 B, 겐타마이신, 반코마이신, 및 IL-2가 보충된 T 세포 배지 (TCM) (이하 ICMT로 언급함)에서 희석한다.
세포를 폐쇄된 백에서 원심분리에 의해 세척하고, ICMT에 재현탁하고 샘플을 취하여 세포를 계수한다. 세포 현탁액을 0.25 x 106 생존 가능한 세포/mL을 목표로 ICMT가 있는 배양 백에 시딩하고 제어된 조건 하에서 과정의 최대 8일까지 인큐베이션한다. 8일 째에, 샘플을 취하여 세포를 계수하고 동등한 부피의 ICMT를 배양 백에 첨가하고 제어된 조건 하에서 인큐베이션한다. 11일 째에, 세포를 계수하고 동등한 부피의 ICMT를 배양 백에 첨가하고 제어된 조건 하에서 인큐베이션한다. 13일 째에, 세포를 계수하고, TIL을 백에서의 원심분리에 의해 농축하여 1 x106 내지 20 x106 생존 가능한 T 세포를 제공한다.
또한 13일 째에, 1 x106 내지 20 x106 생존 가능한 파생된 TIL을 항-CD3 및 조사된 공급기 세포 (동종 PBMC)를 사용하여 8% 인간 AB 혈청 및 IL-2를 함유한 TCM (이하 WTCM으로 언급함)으로 활성화한다. TIL 활성화 배양을 정적 배양 백에서 제어된 조건 하에 최대 6일 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 19일 째에, 세포 계수를 수행하고 활성화된 TIL을 WTCM을 함유하고 있는 생물반응기에 시딩한다. 세포를 제어된 조건 하에 최대 6일 동안 인큐베이션한다. 20일 째에, TIL 팽창은 IL-2가 보충된 TCM의 연속 공급으로 수득 목표 용량이 과정의 27일 전에 또는 27일까지 이루어질 때까지 제공된다.
수득이 이루어진 후에는, 세포를 계수하고, 세척하고 1% 인간 혈청 알부민 (HSA)이 보충된 인산염 완충 식염수에서 원심분리함으로써 농축한다. 그런 후 약물 제품 (DP) 백 중의 TIL을 2-8℃로 냉각하고 16% HSA 및 20% DMSO를 함유한 냉동보호제로 1:1로 제형화하여 8.5% HSA 및 10% DMSO를 함유한 PBS 중에 DP의 최종 제형을 제공한다. 샘플 부피를 로트 개방 테스트, 참조 및 백업 샘플을 위해 제거한다.
제형화된 DP를 제품이 명시된 온도에 도달할 때까지 사전 규정된 프로그램을 사용하여 CRF에 냉동보존한다. 그런 후 냉동보존된 DP를 액체 질소 보관소로 전달한 후 투여를 위해 진료소로 ≤-130℃에서 수송한다.
표 12 - 장비
장비/공급 제조사 모델 또는 카탈로그 #
Leukosep 피콜 튜브 Greiner Bio-One Lrd 227288
PermaLife 세포 배양 백, 325 ml Origen Biomeical Inc PL325-2G
세포 배양 팽창 백 Charter Medical Ltd. EXP-1L
WAVE 10L 백 Cytiva 29-1084-43
CT800.1 Sefia 키트 Cytiva 20001
표 13 - 시약
시약 제조사 카탈로그 # 로트 # 유효기한 #
T 세포 배지 Life Technologies 04196658P 2021537 31.Aug.2020
감마-조사된 FBS Life Technologies 01190005H-RESERVE 2-2YBT2DS 2225231RP 31.May.2024
프롤류킨 제조사 바이알 (IL-2) Clinigen Group PLC Proleukin 801313T 31.Dec.2020
부분표본화된 Il-2 스톡 N/A N/A CTU-IL2/02/09/2019 31.Aug.2020
겐타마이신/암포테리신 용액 (500x) Life Technologies R01510 2217613 30.Mar.2021
반코마이신 제조사 바이알 Bowmed Ibisqus N/A 90260 28.Feb.2021
반코마이신 부??표본 (50 mg/ml) N/A N/A CTU-12-06-2020 28.Feb.2021
감마-조사된 인간 AB 혈청 Gemini Bio-Products LLC 100-812G H12Y00K 30.Sept.2020
OKT-3 제조사 바이알 (1 g/ml) Miltenyi Biotec Ltd 170-076-116 6200108211 17.Oct.2020
부분표본화된 OKT-3 N/A N/A CYU-OKT3/05/05/2020 17.Oct.2020
20% 인간 혈청 알부민 Nova Biologics Inc 68982-0633-02 M848B6661 27.Nov.2021
CryoSure DMSO WAK-Chemie Medical GmbH WAK-DMSO-50 USP8C1S 28.Feb.2022
실시예 11
본격적인 실행을 GMP 조건 하에서 수행하였다. 이들 실행에서 사용한 ITIL-168 과정은 냉동보존된 종양 소화물의 사용, TIL 파생물 단계 (단계 1)를 위한 0.25 x 106 생존 가능한 세포/mL 시딩의 목표, TIL 파생물로부터 TIL 급속 팽창 단계 (REP)로의 연속 프로세싱, 및 최존 제품의 자동화된 제형 및 최종 약물 제품의 냉동보존을 포함하였다.
ITIL-168은 적어도 하나의 선행 치료법으로부터 재발된 또는 난치성인 진행성 흑색종을 가진 성인 환자의 치료를 위한 종양 침윤 림프구 (TIL) 치료법이다. ITIL-168은 환자의 암 조직으로부터 분리되고 생체외 팽창되고 정맥내로 투여된 자가 T 세포의 단일 주입으로 구성된다. 과정 개선이 확인되었고 시간이 지남에 따라 실행되었으며, 개선된 과정은 ITIL-168로서 언급되었다. 아래의 표는 과정 및 실행의 변동을 요악한 것이다.
Figure pct00002
2개의 과정 개발 실행에서 사용된 ITIL-168 제조 과정의 개요를 표 15에 제시한다. 실행 1 (TIL065) 및 실행 2 (Biopartners 9251)로 표시된 2개의 과정 개발 실행을 GMP 조건 하에서 본격적으로 수행하고 환자로부터 모은 초과 종양과 공급업체인 Biopartners에서 공급한 종양을 각각 사용하였다.
이들 2개의 과정 개발 실행 중에, 바이오버든 및 최종 제품 멸균성, 내독소, 미코플라즈마 및 외관 테스트를 위한 과정내 테스트를, 이들 실행이 주로 제조 과정 성능 및 과정 개선 후 제품 품질을 평가하기 위해, 뿐만 아니라 과정 검증 실행 전 GMP 조건 하에서 제조 운영자에 대한 훈련성 실행으로서 작용하도록 의도된 것이기 때문에 수행하지 않았다.
Figure pct00003
Figure pct00004
TIL 파생물 및 REP를 실시예 10에서와 같이 표 12 및 표 13에 제시된 물질을 사용하여 수행하였다.
두 실행 (실행 1 및 실행 2)에 대해, 총 CD3+ 세포 계수를 배치 제조 기록 (BMR)에 따라, TIL 파생물 단계 또는 단계 1에 대해 1, 8, 11 및 13일 째에 수행하고, TIL 급속 팽창 단계 (REP) 또는 단계 2에 대해서는 13, 19, 22 및 25일 째에 수행하였다. 도 76A 및 76B는 각각 TIL 파생물 단계 (단계 1) 및 TIL REP 단계 (단계 2) 내내 2가지 실행에 대한 총 CD3+ 세포 수를 도시한다. 도 76B에 도시된 데이터는 두 실행에 대해 모두, > 1 x 1010 CD3+ 세포가 REP 단계의 끝에 이루어졌고 결과적으로 두 로트 모두 5 x 109 내지 5 x 1010 CD3+ 세포의 용량 허용 기준을 충족한 것을 입증한다.
생존 능력 (생존 가능한 CD3+ 세포의 백분율)을 또한 두 실행에 대해 모두 1, 8, 11, 13 및 25일 째에 측정하였다. 도 76C는 생존 능력이 제조 과정 중에 그리고 REP 단계의 끝을 향해가면서 증가하였고 두 실행 모두 >70%의 최종 제품 기준을 충족한 것을 보여준다.
2가지 실행에 대해, 급속 팽창 단계 (REP)에 대한 배수 팽창을 세포 수 데이터로부터 계산하였다. 추가적으로, 용량, 생존 능력, 효능, T 세포 표현형 및 T 세포 하위세트와 같은 최종 제품 품질을 또한 2개의 과정 개발 실행에 대해 평가하였다.
표 16에 나타낸 데이터는 과정 개선 후에, ITIL-168 제조 과정이 역사적인 과정과 유사하게 수행되고 사양 요구조건을 충족하는 최종 제품 품질 속성을 초래하는 것을 입증한다.
Figure pct00005
실시예 12 - 투여
치료법
대상체는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 림프구 고갈 화학요법(lymphodepleting chemotherapy) 처방을 받았다. 치료법은 조절 T 세포와 같은 억제 세포의 영향을 줄이고 림프구 성장 촉진 사이토카인 (예컨대, IL-7 및 IL-15)의 발현을 증가시키도록 설계된다. 수화 요법 (hydration regimen)은 림프구 고갈 화학요법 전과 도중에 시작하였다. 항미생물 및 항진균 예방을 림프구 고갈 화학요법을 시작하기 전에 시작하였다. 열 및 호중구 감소증을 평가하고 관리하였다. 비-스테로이드성 항-구토 요법을 림프구 고갈 화학요법 전에 시작하였고 필요에 따라 계속하였다.
림프구 고갈 화학요법을 다음과 같이 투여하였다. 투여된 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 용량을 기준선 방문시 측정한 체중의 평가를 토대로 계산하였다. 비만 환자 (체질량 지수 > 35)에서는, 실제 체중을 사용하였다. 사이클로포스파미드의 용량을 체중을 토대로 하고, 플루다라빈의 용량을 체표면적을 토대로 한다. 용량을 용량 밴딩(dose banding)에 대한 관행에 따라 올림 또는 내림할 수 있다. 다음의 표는 권장된 용량, 투여 경로, 주입 부피, 및 기간을 제시한다:
표 17 - 림프구 고갈 화학요법 처방
일 약물 용량 경로 투여
-7 플루다라빈 25 mg/m2 정맥내 대략 30분 동안 10-100 ml 0.9% NaCl로
사이클로포스파미드 60 mg/kg 정맥내 대략 1시간 동안 500ml 0.9% NaCl로
-6 플루다라빈 25 mg/m2 정맥내 대략 30분 동안 10-100ml 0.9% NaCl로
사이클로포스파미드 60 mg/kg 정맥내 대략 1시간 동안 500ml 0.9% NaCl로
-5 플루다라빈 25 mg/m2 정맥내 대략 30분 동안 10-100ml 0.9% NaCl로
-4 플루다라빈 25 mg/m2 정맥내 대략 30분 동안 10-100ml 0.9% NaCl로
-3 플루다라빈 25 mg/m2 정맥내 대략 30분 동안 10-100ml 0.9% NaCl로
-2 휴지 일
-1 휴지 일
표 18 - 플루다라빈 용량 조절
크레아티닌 제거율 (Cockcroft-Gault 식에 의해 측정됨) 플루다라빈 용량
>/= 70 mL/분 25 mg/m2
51-69 mL/분 20 mg/m2
대상체는 TIL 주입 전에 항히스타민제와 아세트아미노펜을 사전 투약하였다. 백의 내용물은 비-백혈구 고갈 필터 (예컨대 >/= 170 마이크론의 인라인/튜빙 필터)를 사용하여 주입하였다. 대상체는 주입 후 지원을 위해 최대 8 용량의 정맥내 IL-2를 받았다. IL-2를 0일에 시작하여 4일까지 계속되는 TIL 주입을 완료한 후 투여하였다.
실시예 13 - 치료 결과
전이성 피부 흑색종이 있는 총 44명의 환자가 종양 절제를 받았고 TIL 파생물 제조를 시작하였다 (단계 1). 44명의 환자 중에서, 42명의 개별 환자 로트가 단계 1을 완료하였고, 2명은 시도가 실패하였다. 31명의 환자 로트를 REP 제조에 대해 취하였다 (단계 2). 한 로트는 TIL 파생물 단계 1 제조를 실패하였고 성공적인 단계 2 제조를 가능하게 한 개정한 단계 1 제조 과정을 실행하였다. 환자를 계속해서 치료하였다. 나머지 12명의 로트를 다음의 이유로 REP의 개시에 선택하지 않았다: 8명은 TIL 치료법에 부적합하게 만드는 환자 상태의 병발적인 임상 악화로 인하였고, 2명의 환자는 다른 치료법에서 임상적인 개선으로 인해 더 이상 TIL을 필요로 하지 않았으며, 1명의 환자는 치료 자금을 확보할 수 없었으며, 1명의 로트는 절제된 표본에서 종양 조직의 부족으로 인해 제조에 실패하였다. 4명의 환자 로트를 성공적으로 제조하였지만, 환자는 TIL 요법에 임상적으로 부적합한 것으로 간주되어 치료를 받지 않았다.
절제된 44개 종양 중에서, 2개는 제조를 실패하였고, 95% 제조 성공률을 보였다. 27명의 환자를 표준 제조 과정을 활용하여 만들어진 TIL 제품으로 치료하였다. TIL 제조가 완료된 시점에서, 이들 환자 중 6명은 전체 치료 처방에 대해 임상적으로 부적합한 것으로 간주하였고 현저하게 낮은 용량의 조건화 화학요법 및 주입 후 IL-2를 받았으며 따라서 분석으로부터 배제시켰다. 표준 TIL 파생물 제조 단계 (단계 1)를 시작하기 위한 조건을 충족하지 못한 한 명의 환자는 종양 절제를 받았다. 그러므로, 매우 낮은 최종 세포 용량 (1.7 x 109)에도 불구하고, 급속 팽창 프로토콜 (단계 2) 및 최종 제품 제형화를 가능하게 할 수 있는 변형된 단계 1을 시작하였다. 이 제품은 변형된 제조 과정을 사용하여 생산되었고 저용량의 세포를 산출하였기 때문에, MS 라이센TM 과정을 나타내는 것으로 간주되지 않았으며 따라서 임상 데이터는 분석으로부터 배제하였다.
나머지 21명의 환자에 대한 인구 통계, 기준선 환자 특징, 치료 세부 사항 및 성향, 및 임상 효능 및 안전성 결과를 수집하고 분석하였다. 분석 마감일까지 이들 환자의 잠재적 추적 기간 중앙값은 TIL 주입 날짜로부터 52.2개월 (범위: 4.6, 98.8개월)이었다.
21명의 환자 중에서, 대부분 (71%)은 남성이었고, TIL 치료시점에서 연령 중앙값은 45세였다 (범위: 16, 68). 기준선에서, 모든 환자는 처음 흑색종을 진단받은 이후 39개월의 중앙값 (범위: 8, 177)을 가진 4기 전이성 피부 흑색종을 가졌다. 환자의 대다수(67%)는 TIL 치료 시점에서 기록된 뇌 전이가 있는 7명 (33%)을 포함하여 3개 이상의 질병 부위에서 병변이 보고되었다. 이전 전신 요법의 중앙값 수는 2 (범위: 1, 9)였다. 환자의 52%는 BRAF 돌연변이를 가졌으며, 그들은 모두 MEK 억제제가 있거나 없이 BRAF 억제제를 받았고 진행 중이었다. 2명의 환자를 제외한 모든 환자 (90%)는 적어도 하나의 이전 체크포인트 억제제를 갖고 있었고 12명 (57%)은 PD-1 억제제(니볼루맙(nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(pembrolizumab))를 받은 적이 있다. 추가적으로, 8명 (38%)은 순차적으로 제공된 이필리무맙(ipilimumab) 및 니볼루맙이나 펨브롤리주맙을 받았고 4명 (19%)은 이필리무맙과 니볼루맙을 동시에 받았다. TIL 생성을 위한 종양 절제 전에, 20명 (95%)은 흑색종이 재발되었거나 난치성 진행성 흑색종을 가졌고, 1명 (5%)은 견디지 못하여 TIL 치료법 전에 치료를 중단하였다.
TIL을 받기 직전에, 환자 중 10명 (48%)은 상승된 혈청 락토스 탈수소효소 (LDH) 수준을 가졌고 7명 (33%)은 정상 범위의 상한 (ULN)의 1 내지 2배 수준을 가졌으며 3명 (14%)은 ULN의 2배 이상을 가졌다. 표적 병변의 병변 치수의 합 (SLD)으로 측정된 기준선 종양 부담은 20명의 환자에 대해 이용 가능하였다; 기준선 SLD 중앙값은 100 mm 였다 (범위: 13, 281).
TIL 치료
전부 21명의 환자는 TIL 주입 전에 조건화 화학요법으로서 2 용량의 사이클로포스파미드 및 5 용량의 플루다라빈을 받았다. 주입된 TIL 세포의 총 수의 중앙값은 31.9 x 109였다 (범위: 7.9 x 109, 62.5 x 109). IL-2 용량의 총 수의 중앙값은 8이었다 (범위: 4, 11). 환자는 중앙값 10일 동안 병원에 남아 있었다 (범위: 7, 15). 3명 (14%)의 환자는 치료 기간 중에 ICU에 입원하였다.
TIL 치료 중에 임상적으로 유의미한 AE를 기록하였다. 조건화 화학요법 기간 중에 보고된 일반적인 AE (≥10%)는 호중구 감소증 (43%) 및 메스꺼움 (19%)을 포함하였고 이들 화학요법제의 부작용 프로파일과 대체로 일치한다.
TIL 주입 후 발병하는 일반적인 AE에는 혈소판 감소증 (62%), 발열 (57%), 경직 (43%), 빈맥 (29%), 호중구 감소증 (29%), 폐 부종 (24%), 혈관 누출 (24%), 발진 (19%), 심방세동 (14%), 심혈관 불안정 (14%), 흉부 감염 (14%), 부종 (14%)이 포함된다 (표 19). 이들 AE는 다른 TIL 시도에서 보고된 것들과 일치한다 (Dafni et al, 2019; Rohaan et al, 2018).
제조 과정이 단계 1에서 실패하였지만 변형된 제조 과정으로부터 생성된 제품으로 치료된 환자는 TIL 치료 후 6일 째에 신부전, 체액 과부하 및 패혈증 가능성에 의해 악화되는 광범위한 종양 부담으로 인해 사망하였다.
TIL 주입 후 발병된 AE (치료된 모든 대상체)
AE 기간 - n (%) 치료된 모든 대상체 (N=21명)
혈소판 감소증 13 (61.9)
발열 12 (57.1)
경직 9 (42.9)
호중구 감소증 6 (28.6)
빈맥 6 (28.6)
폐 부종 5 (23.8)
혈관 누출 5 (23.8)
발진 4 (19.0)
심방 세동 3 (14.3)
심혈관 불안정성 3 (14.3)
흉부 감염 3 (14.3)
부종 3 (14.3)
착란 2 ( 9.5)
저칼륨혈증 2 ( 9.5)
저혈압 2 ( 9.5)
신경학적 결함 2 ( 9.5)
신장 손상 2 ( 9.5)
호흡기 패혈증 2 ( 9.5)
발작 2 ( 9.5)
패혈증 2 ( 9.5)
백반증 2 ( 9.5)
체중 증가 2 ( 9.5)
천명 2 ( 9.5)
기침 1 ( 4.8)
설사 1 ( 4.8)
언어 장애 1 ( 4.8)
생착 증후군 1 ( 4.8)
환각 1 ( 4.8)
졸음증 1 ( 4.8)
PICC 라인 감염 1 ( 4.8)
흉막 삼출 1 ( 4.8)
폐렴 1 ( 4.8)
폐염 1 ( 4.8)
호흡기 문제 1 ( 4.8)
빈맥 1 ( 4.8)
치료 기간 중에 말초혈구 수를 측정하였다. 호중구, 혈소판, 림프구, 백혈구 수, 및 헤모글로빈에서의 감소 경향을 조건화 화학요법을 시작하는 시점에 관찰하였다. 혈액 세포 수 및 헤모글로빈 수준은 일반적으로 TIL 주입 후 1-4일 후에 그것들의 최저점에 도달하였다. 기준선 수준으로의 혈구 수 회복은 일반적으로 TIL 주입 날짜 후 대략 7일에 관찰되었다.
제조 과정의 최근 변경을 견고성을 개선하고 중앙 집중식 제조로 다기관 임상 시험을 가능하게 하기 위해 실행하였다. 이런 업데이트로, 소화된 종양 물질을 냉동보존하여 안정성을 연장시킨다. 중요하게, 선행 냉동보존으로 만들어진 제품으로 치료한 4명의 환자에서 관찰된 AE 프로파일은 시리즈로 치료된 다른 환자 (표 20) 및 다른 TIL 제품의 임상 시험에서 보고된 것과 대체로 일치하였다.
TIL 주입 후 발병된 AE (냉동 제품으로 치료된 대상체)
AE 기간 - n (%) 치료된 모든 대상체 (N=4명)
혈소판 감소증 4 (100)
발열 2 (50.0)
발진 2 (50.0)
경직 2 (50.0)
저혈압 1 (25.0)
신장 손상 1 (25.0)
혈관 누출 1 (25.0)
백반증 1 (25.0)
21명의 환자 중 15명이 표적 병변의 방사선학적 측정을 포함한 연속적인 CT 및/또는 MRI 스캔에 의해 질환 평가를 진행하였다. 이들 환자 중에서, 정량적 반응률 (반응 확인 불필요)은 CR을 달성한 환자 2명 (13%)과 PR을 달성한 환자 6명 (40%)을 포함하여 53%였다 (표 21).
최상의 전체 응답 요약 (효능 평가 분석 세트)
효능 평가 분석 세트 (N=15명)
최상의 전체 반응
완전한 반응 (CR) 2 (13.3)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 1.7, 40.5
부분 반응 (PR) 6 (40.0)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 16.3, 67.7
안정적인 질환 (SD) 3 (20.0)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 4.3, 48.1
진행성 질환 (PD) 4 (26.7)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 7.8, 55.1
반응률 (CR + PR) 8 (53.3)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 26.6, 78.7
질환 제어율 (CR + PR + SD) 11 (73.3)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 44.9, 92.2
정량적 및 정성적 반응 둘 다에 기초한 모든 환자를 포함하는 반응률은 CR을 달성한 3명 (14%) 및 PR을 달성한 9명 (43%)을 포함하여 57%였다. 2명의 추가 환자는 BRAF 억제제 다브라페닙(dabrafenib)에 대한 내성이 발생했으며 TIL 치료를 위해 의뢰되기 전에 치료 중 질병 진행을 경험하였다. 다브라페닙을 TIL 요법 직전에 중단하였고, 다브라페닙 중단에 수반되는 급속한 종양 성장을 방지하기 위해 TIL 이후 약 1-2주에 다시 시작하였다. 이들 2명의 환자 각각은 TIL 후 정성적 반응을 달성하였다 (지속적 CR 1개 및 PR 1개). 두 환자 모두 후속적으로 TIL 후 반응으로 다브라페닙을 한 번 중단하였다. 이들 두 환자 모두 다브라페닙에 불응성이 된 질병을 가지고 있었기 때문에, TIL 후 경험한 임상적 이점은 다브라페닙의 일시적인 재개가 아니라 TIL로 인한 것이라고 결론을 내리는 것이 합리적이다. 그러므로, 이들 환자를 반응자로서 포함하여 반응에 대한 민감도 분석을 수행하였다. 이 민감도 분석에서 응답률은 14/21 (67%)이었고 완전 응답자는 4명 (19%), 부분 응답자는 10명(48%)이었다 (표 22).
최상의 전체 응답 요약, 민감성 분석 (치료된 모든 대상체)
치료된 모든 대상체 (N=21명)
최상의 전체 응답
완전한 반응 (CR) 4 (19.0)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 5.4, 41.9
부분 반응 (PR) 10 (47.6)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 25.7, 70.2
안정적인 질환 (SD) 4 (19.0)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 5.4, 41.9
진행성 질환 (PD) 3 (14.3)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 3.0, 36.3
반응률 (CR + PR) 14 (66.7)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 43.0, 85.4
질환 제어율 (CR + PR + SD) 18 (85.7)
95% CI (클로퍼-피어슨 방법) 63.7, 97.0
응답은 일반적으로 연령, 질환 부위의 수, 이전 요법 라인의 수, 이전 BRAF 억제제, 이전 PD-1 억제제, 기준선 뇌 전이, 및 기준선 종양 부담을 포함하는 중요한 기준선 및 질환 특징에 의해 하위군에 걸쳐 일관되었다. 특히 ITIL-168과 가장 유사한 제조 과정으로 치료받은 4명의 환자에서 전체 반응률 (75%)과 CR률 (25%)이 더 넓은 집단과 일치하였다. CT 및/또는 MRI 스캔을 토대로 한 정량적 반응을 보인 15명의 환자 중에서, 14명은 상세한 종양 측정을 가졌고 기준선으로부터의 종양 감소의 최대 백분율을 폭포수 플롯으로 제시하였다 (도 74). 1명의 환자는 PD에 대해 최상의 전체 반응을 보였지만 치료 후 표적 병변 측정이 보고되지 않았으므로 (진행은 새로운 병변의 관찰에 의해 측정됨) 플롯에 제공하지 않았다.
정량적 반응 데이터 (N = 15명)당 무진행 생존 (PFS) 시간 중앙값은 6.7개월이었고, 분석 마감 시점에 어떠한 후속 요법 없이 4명의 환자가 진행 중인 반응 (2개의 CR 및 2개의 PR)을 가졌다. 양적 및 질적 반응 데이터 (N = 21명)를 토대로 한 PFS 시간 중앙값은 6.7개월이었고, 5명의 대상체는 어떠한 후속 요법 없이 지속적인 반응 (3개의 CR 및 2개의 PR)을 보였다. 21명의 치료된 환자 모두의 전체 생존 (OS) 시간 중앙값은 21.3개월이었다 (도 75A). 정량적 반응 데이터를 가진 15명의 환자의 OS 시간 중앙값은 16개월이었다 (도 75B). 그러나, 반응자에 대한 OS 시간 중앙값 (정량적 반응에 대해서만, N = 8명)은 도달하지 않은 반면, 무반응자 (N = 7명)에 대한 OS 시간 중앙값은 6.5개월이었다 (도 75C).
실시예 14 - 유전자 변형된 TIL
표 23 - 시약 및 장비
시약 제조사 카탈로그 #
15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브 Appleton Woods AB031
50 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브 Appleton Woods AB028
둘베코 인산염 완충 식염수 Sigma-Aldrich D8537-24X500ML
소 태아 혈청 (열 비활성화됨) Sigma-Aldrich F9665-500ML
TCM- CT4834/GIBCO CUSTOM P158718 Gibco
페니실린 - 스트렙토마이신 Sigma-Aldrich P0781-100ML
TC 6-웰 플레이트 StarLab CC7682-7506
멸균 1.5 mL 에펜도르프 StarLab S1615-5510
비-TC 평평 바닥 96-웰 플레이트 Falcon 353072
96 웰 U자형 바닥 플레이트 Falcon 351177
FACS 튜브 SLS 352063
TC 24-웰 플레이트 StarLab CC7682-7524
현탁 배양을 위한 마이크로플레이트, 96 웰, F자형 바닥 Grenier, Bio-One 655185
T 세포 TransACT (TM), 인간 Miltenyi 130-111-160
겐타마이신 암포테리신 Invitrogen (ThermoFisher Scientific) 10184583
프로류킨 (알데스류킨) IL-2 Novartis PL-00101/0936
Heraeus Megafuge 40R, 냉장, 원심분리 Thermo Scientific 75004518
IncuSafe CO2 인큐베이터 PHCBI MCO-170AIC-PE
NovoCyte 3005 유동 세포분석기 시스템 (CE-IVD) Agilent Technologies 2010064D
NovoExpress 소프트웨어 Agilent Technologies
종양 소화 냉동바이알을 액체 질소 보관소로부터 제거하여 37℃ 수조에서 세포 현탁액에 녹을 때까지 해동하였다 (D1). 세포 현탁액을 15 mL 팔콘으로 제거하고, 상부를 PBS로 최대 10 mL로 채우고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다.
세포 펠릿을 미리 온열해 놓은 적절한 T 세포 배지에 재현탁하고, 세포 계수를 수행하여 트립판 블루를 사용하여 생존 능력을 측정하였다. 세포를 mL당 1x106 세포의 밀도로 재현탁하였다.
활성화 없이 배양될 세포를 ml당 0.5x106 세포로 재현탁하고 2 ml (1x106 세포)을 IL-2 (3000 IU/mL)가 있는 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 넣었다. 세포를 IL-2 (3000 IU/mL)를 2-3일마다 첨가하여 형질유도할 때까지 가습 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.
D3 및 D4에서 형질도입될 세포의 경우, 세포의 활성화는 D1에서 발생한다. D7 및 D8에서 형질도입될 세포의 경우 세포의 활성화는 D5에 발생한다.
TIL 활성화의 경우, 0.5x106 세포/mL을 3000 IU/mL IL-2가 있는 24 웰 조직 배양 플레이트에 넣는다. 10 μL의 T 세포 TransACT (TM)를 TIL 현탁액의 1x106 세포당 첨가하고 (1:1 비율) 세포를 48시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
형질도입 제1일 (D3 또는 D7)
24 웰 플레이트로부터 세포를 수집하여 15 mL 팔콘 튜브에 넣고, 10 mL TCM으로 채우로 400 g에서 5분 동안 회전시킨다. 트립판 블루를 사용하여 세포를 계수하고 mL당 1x106 세포로 재현탁한다.
96 웰 평평 바닥 플레이트의 웰당 1x105 세포 (100 μL)를 각 형질도입 방법에 사용한다. 만약 24 웰 플레이트에서 형질도입을 한다면, 웰당 1x106 세포를 넣는다 (500 μL). 만약 6 웰 플레이트에서 형질도입을 한다면, 웰당 5x106 세포를 넣는다 (2 mL).
렌티바이러스 (MOI5) 및 IL-2 (3000 IU/mL)의 마스터 믹스를 TCM에 조건당 105 세포당 최종 100 μl로 (또는 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우 적절한 밀도 및 부피로) 재현탁함으로써 제조한다. 피펫팅 손실을 해결하기 위해 웰 수 +1에 대한 마스터믹스 부피를 제조한다.
NT 세포 (MOCK)의 경우 96 웰 평평 바닥 플레이트에서 100 μL당 TCM 및 IL-2 (3000 IU/mL)의 마스터 믹스를 제조한다. 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우, MOCK T 세포를 각각 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 500 μL 및 2 mL에 재현탁한다.
에펜도르프 또는 15 mL 팔콘 튜브 중의 세포로부터 상층액을 제거하고 조건에 따라 1x105 세포당 적절한 100 μL의 마스터 믹스에 (또는 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우 적절한 밀도 및 부피로) 세포를 재현탁한다.
각각의 조건에 적절하게 재현탁하고 세포를 비-TC 평평 바닥 96 웰, 24 웰 또는 6 웰에 각각 옮긴다.
96 웰 플레이트 형질도입에서 증발을 방지하기 위하여 200 μL PBS를 주변 웰에 첨가한다.
세포를 가습 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
형질도입 제2일 (D4 또는 D8)
96 웰 평평 바닥 플레이트에서 위아래로 재현탁함으로써 세포를 수집하고 96웰 U자형 바닥 플레이트로 옮긴다. (24 웰 또는 6 웰 플레이트로부터의 수집을 15 mL 팔콘에서 수행함). 플레이트를 400 g에서 5분 동안 회전시키고 세포를 TCM으로 세척한다.
각각의 형질도입 방법에 대해 96 웰 평평 바닥 플레이트의 웰당 1x105 세포 (100 μL)를 사용한다. 만약 24 웰 플레이트에서 형질도입을 한다면, 웰당 1x106 세포를 넣는다 (500 μL). 만약 6 웰 플레이트에서 형질도입을 한다면, 웰당 5x106 세포를 넣는다 (2 mL).
렌티바이러스 (MOI5) 및 IL-2 (3000 IU/mL)의 마스터 믹스를 TCM에 조건당 105 세포당 최종 100 μl로 (또는 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우 적절한 밀도 및 부피로) 재현탁함으로써 제조한다. 피펫팅 손실을 해결하기 위해 웰 수 +1에 대한 마스터믹스 부피를 제조한다.
NT 세포 (MOCK)의 경우 96 웰 평평 바닥 플레이트에 대해 100 μL당 TCM 및 IL-2 (3000 IU/mL)의 마스터 믹스를 제조한다. 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우, MOCK T 세포를 각각 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 500 μL 및 2 mL에 재현탁한다.
에펜도르프 또는 15 mL 팔콘 튜브 중의 세포로부터 상층액을 제거하고 조건에 따라 1x105 세포당 적절한 100 μL의 마스터 믹스에 (또는 24 웰 및 6 웰 플레이트의 경우 적절한 밀도 및 부피로) 세포를 재현탁한다.
각각의 조건에 적절하게 재현탁하고, 그에 따라 세포를 비-TC 평평 바닥 96 웰, 24 웰 또는 6 웰에 각각 옮긴다. 96 웰 플레이트 형질도입에서 증발을 방지하기 위하여 200 μL PBS를 주변 웰에 첨가한다. 세포를 가습 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
다음날 세포를 IL-2 (3000 IU/mL)가 있는 신선한 배지 중의 새로운 96 웰 둥근 바닥 플레이트, 24 웰 또는 6 웰 플레이트에 옮기고, 72시간 동안 가습 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
96 웰 플레이트에 대한 최종 부피는 웰당 200 μL이고; 24 웰 플레이트에 대한 최종 부피는 웰당 2 mL이며; 6 웰 플레이트에 대한 최종 부피는 웰당 5 mL이다. IL-2 (3000 IU/mL)는 2-3일마다 첨가한다.
세포를 D3+D4 형질도입의 경우 D8에서 및 D7+D8 형질도입의 경우 D12에서 형질도입 효율에 대해 염색한다.
TIL의 파생물
Mock 및 형질도입된 세포를 그것들을 REP에 배치할 때까지 96 웰 U자형 바닥 플레이트에서 유지한다.
세포 유지를 위해, 2-3일마다 배지의 절반을 신선한 TCM 및 IL-2 (3000 IU/mL)로 교체한다. 96 웰 플레이트의 경우 100 μl의 배지를 제거하고 200 μL의 최종 부피로 교체한다. 24 웰 플레이트의 경우 1 mL의 배지를 제거하고 2 mL의 최종 부피로 교체한다. 6 웰 플레이트의 경우 1 mL의 배지를 제거하고 2 mL의 최종 부피로 교체한다.
REP는 D13 (파생물의 12일)에 시작한다.
발명을 다음의 번호가 매겨진 단락에 의해 한층 더 기술한다:
1. 냉동보존된 미변형 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 분리하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계, 여기서 종양은 세포 현탁액이 냉동보존될 수 있도록 충분히 분해되는 것인 단계; (b) 분해된 종양을 단계 (a)와 동일한 날에 냉각시키거나 저온에서 유지함으로써 냉동보존하는 단계; (c) 선택적으로 냉동보존된 분해된 종양을 보관하는 단계; (d) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계; (e) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및 (f) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, 분해는 물리적 분해, 효소적 분해, 또는 물리적 및 효소적 분해를 포함하는 것인 방법.
3. 단락 1 또는 2의 방법으로서, 냉각은 제어된 속도에서 이루어지는 것인 방법.
4. 단락 3의 방법으로서, 속도 제어 동결은 약 -2℃/분으로 약 -60℃까지인 것인 방법.
5. 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 방법으로서, 분해된 종양은 세포화된 것인 방법.
6. 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 방법으로서, 분해된 종양은 정제된 것인 방법.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나의 방법으로서, 단일 세포 현탁액은 단계 (a) 후에 제공되는 것인 방법.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나의 방법으로서, UTIL의 제1 집단은 약 1-20 x 106 UTIL인 것인 방법.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (d)는 종양 출발 물질 외부에서 UTIL의 성장과 이어서 단계(e)에서 급속 팽창을 추가로 포함하는 것인 방법.
10. 단락 9의 방법으로서, 단계 (d)는 약 2주 동안 수행되고 단계 (e)는 약 2주 동안 수행되는 것인 방법.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 방법으로서 단계 (d) 및/또는 단계 (e)는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 이것들의 조합을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
12. 단락 1 내지 12 중 어느 하나의 방법으로서, UTIL의 제2 집단을 현탁시키는 단계 (g)를 추가로 포함하는 것인 방법.
13. 단락 12의 방법으로서, 현탁은 완충 식염수, 인간 혈청 알부민 및 다이메틸설폭사이드 (DMSO)에서 이루어지는 것인 방법.
14. 단락 1 내지 13 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (f)는 냉동보존하는 단계이고 UTIL을 해동하는 최종 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
15. 단락 14의 방법으로서, 해동된 UTIL은 더 이상의 변형 없이 단일 용량으로서 주입될 준비가 된 것인 방법.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어진 냉동보존된 미변형 종양 침윤 림프구 (UTIL)의 치료 집단.
17. 단락 16의 치료 집단으로서, 집단은 약 5x109 내지 5x1010의 T 세포를 포함하는 것인 치료 집단.
18. 단락 16 또는 17의 치료 집단의 냉동보존된 백.
19. 단락 18의 냉동보존된 백으로서 정맥내 주입에 사용하기 위한 것인 냉동보존된 백.
20. 단락 14 또는 15의 치료 집단 또는 단락 18 또는 19의 냉동보존된 백을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
21. 단락 20의 방법으로서, 암은 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 자궁경부암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)을 포함함), 폐암, 흑색종, 난소암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신장암 또는 신장 세포 암종인 것인 방법.
발명을 다음의 번호가 매겨진 단락에 의해 한층 더 기술한다:
1. 냉동보존된 미변형 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 분리하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계; (b) 절제된 종양을 일회용 무균 키트에 보관하는 단계, 여기서 무균 키트는: 고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈; 분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및 분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고, 각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및 각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계; (c) 절제된 종양을 분해 모듈에서 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계로, 절제된 종양은 만약 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해된 것인 단계; (d) 분해된 종양을 안정화 모듈에서 냉동보존하는 단계; (e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계; (f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여 UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계; (g) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하는 방법. 일부 구체예에서, 단계 a)는 선택적이다.
2. 단락 1의 방법으로서, 분해는 물리적 분해, 효소적 분해, 또는 물리적 및 효소적 분해를 포함하는 것인 방법.
3. 단락 1 또는 2의 방법으로서, 분해된 종양은 세포화되는 것인 방법.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 하나의 방법으로서, 단일 세포 현탁액은 단계 (c) 후에 제공되는 것인 방법.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, UTIL의 제1 집단은 약 1-20 x 106 UTIL인 것인 방법.
6. 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (e)는 절제된 종양 출발 물질의 외부에서 UTIL의 성장과 이어서 단계 (f)의 급속 팽창을 추가로 포함하는 것인 방법.
7. 단락 6의 방법으로서, 단계 (e)는 약 2주 동안 수행되고 단계 (f)는 약 2주 동안 수행되는 것인 방법.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (e) 및/또는 단계 (f)는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이것들의 조합을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
9. 단락 1 내지 7 중 어느 하나의 방법으로서, UTIL의 제2 집단을 현탁시키는 단계 (h)를 추가로 포함하는 것인 방법.
10. 단락 9의 방법으로서, 현탁은 완충 식염수, 인간 혈청 알부민, 및 다이메틸설폭사이드 (DMSO)에서 이루어지는 것인 방법.
11. 단락 1 내지 9 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 (g)는 냉동보존하는 단계이고 UTIL을 해동하는 최종 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
12. 단락 10의 방법으로서, 해동된 UTIL은 더 이상의 변형 없이 단일 용량으로서 주입될 준비가 된 것인 방법.
13. 단락 1 내지 11 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어진 냉동보존된 UTIL의 치료 집단.
14. 단락 13의 치료 집단으로서, 집단은 약 5x109 내지 5x1010의 T 세포를 포함하는 것인 치료 집단.
15. 단락 13 또는 14의 치료 집단의 냉동보존된 백.
16. 단락 15의 냉동보존된 백으로서 정맥내 주입에 사용하기 위한 것인 냉동보존된 백.
17. 단락 13 또는 14의 치료 집단 또는 단락 15 또는 16의 냉동보존된 백을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
18. 단락 17의 방법으로서, 암은 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 자궁경부암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)을 포함함), 폐암, 흑색종, 난소암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신장암 또는 신장 세포 암종인 것인 방법.
19. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 하나 이상의 유연한 용기는 탄력 있는 변형 물질을 포함하는 것인 방법.
20. 단락 1의 방법으로서, 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 하나 이상의 밀봉 가능한 개구부를 포함하는 것인 방법.
21. 단락 20의 방법으로서, 무균 키트의 분해 모듈의 유연한 용기는 열 밀봉 가능한 용접을 포함하는 것인 방법.
22. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 하나 이상의 유연한 용기는 내부적으로 둥근 가장자리를 포함하는 것인 방법.
23. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 분해 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 그 안에서 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하기 위해 적응된 분해 표면을 포함하는 것인 방법.
24. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 풍부화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 세포화된 분해된 고형 조직의 잔류물을 보유하는 필터를 포함하는 것인 방법.
25. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 안정화 모듈의 하나 이상의 유연한 용기는 생존 가능한 세포를 용액으로 또는 냉동보존된 상태로 보관하기 위한 배지 제형을 포함하는 것인 방법.
26. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트는 디지털, 전자식, 또는 전자기식 태그 식별자를 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 단락 26의 방법으로서, 태그 식별자는 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화 과정의 유형, 속도 제어 동결에 적합한 선택적 동결 용액을 포함한, 상기 과정에 사용된 배지의 하나 이상의 유형을 규정하는 특정 프로그램에 관련된 것인 방법.
28. 단락 1의 방법으로서, 동일한 유연한 용기는 분해 모듈, 안정화 모듈, 및 선택적 풍부화 모듈 중 하나 이상의 부분을 형성할 수 있는 것인 방법.
29. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 분해 모듈은 프로세싱될 조직을 수령하기 위한 제1 유연한 용기를 포함하는 것인 방법.
30. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 분해 모듈은 분해용 배지를 포함하는 제2 유연한 용기를 포함하는 것인 방법.
31. 단락 1의 방법으로서, 무군 키트의 선택적 풍부화 모듈은 풍부해진 여과물을 수령하기 위한 제1 유연한 용기 및 제3 유연한 용기를 포함하는 것인 방법.
32. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 분해 모듈 및 안정화 모듈은 제2 유연한 용기를 포함하고 제2 용기는 소화 배지 및 안정화 배지를 포함하는 것인 방법.
33. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 안정화 모듈은 안정화 배지를 포함하는 제4 유연한 용기를 포함하는 것인 방법.
34. 단락 1의 방법으로서, 무균 키트의 안정화 모듈은 또한 보관 및/또는 냉동보존을 진행하기 위한 제1 유연한 용기 및/또는 제3 유연한 용기를 포함하는 것인 방법.
35. 냉동보존된 미변형 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 분리하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계; (b) 절제된 종양을 프로그래밍 가능한 프로세서 및 일회용 무균 키트를 포함하는, 포유류 고형 조직으로부터의 세포 또는 세포 응집체의 반자동 무균성 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화를 위한 자동화 장치에 보관하는 단계로, 여기서 무균 키트는: 고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈; 분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및 분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고, 각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및 각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계; (c) 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계로, 절제된 종양은 만약 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해된 것인 단계; (d) 분해된 종양을 안정화 모듈에서 냉동보존하는 단계; (e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계; (f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여 UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계; (g) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하는 방법. 일부 구체예에서, 단계 a)는 선택적이다.
36. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치는 무균 키트의 인식을 위한 무선 주파수 식별 태그 판독기를 추가로 포함하는 것인 방법.
37. 단락 36의 방법으로서, 자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 태그를 통해 무균 키트를 인식할 수 있고 후속해서 분해, 풍부화, 및 안정화 과정의 유형, 및 속도 제어 동결에 적합한 선택적 동결 용액을 포함한, 상기 과정들에 필요한 각각의 배지 유형을 규정하는 키트 프로그램을 실행하는 것인 방법.
38. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈, 풍부화 모듈, 및/또는 안정화 모듈과 연통하고 그것을 제어하기 위해 적응되는 것인 방법.
39. 단락 38의 방법으로서, 자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈을 제어하여 고형 조직 물질의 물리적 및/또는 생물학적 붕괴를 가능하게 하는 것인 방법.
40. 단락 39의 방법으로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈을 제어하여 고형 조직 물질의 물리적 및 효소적 붕괴를 가능하게 하는 것인 방법.
41. 단락 40의 방법으로서, 고형 조직 물질의 효소적 붕괴는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 및 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 효소 용액에 의한 것인 방법.
42. 단락 35의 방법으로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하는 분해 유연한 용기 내에서 분해 표면을 제어하고, 선택적으로 분해 표면은 기계식 피스톤인 것인 방법.
43. 단락 35의 방법으로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기에 풍부해진 분해된 고형 조직을 냉동보존하도록 안정화 모듈을 제어하고, 선택적으로 프로그래밍 가능한 온도를 사용하는 것인 방법.
44. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치는 다음 중 하나 이상을 임의의 조합으로 추가로 포함하는 것인 방법: 분해된 고형 조직이 선택적 풍부화 모듈로 옮겨지기 전에 분해 과정이 분해 모듈에서 완료되었는지의 여부를 인식할 수 있는 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 결정하고 각각의 용기간 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서; 분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기 내의 온도를 제어하기 위한 센서; 모듈의 각 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서; 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프; 풍부화 모듈 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서; 풍부화 모듈 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는 각 모듈의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프.
45. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치의 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기가 제거될 때까지 안정화 모듈에서 최적의 보관 온도 범위를 유지하기 위해 적응되거나; 또는 제어된 동결 단계를 실행하는 것인 방법.
46. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치는 사용자 인터페이스를 추가로 포함하는 것인 방법.
47. 단락 46의 방법으로서, 인터페이스는 사용자에게 파라미터를 입력하거나, 사전 프로그래밍된 단계를 확인하거나, 오류를 경고하거나, 또는 이것들의 조합을 안내하는 지침을 표시하기 위한 디스플레이 스크린을 포함하는 것인 방법.
48. 단락 35의 방법으로서, 자동화 장치는 운반 가능하도록 적응되는 것인 방법.
49. UTIL의 치료 집단을 분리하기 위한 반자동 무균성 조직 프로세싱 방법으로서, (a) 무균성 프로세싱 키트와 관련된 디지털, 전자식, 또는 전자기식 태그 식별자로부터 무균성 분해 조직 프로세싱 단계 및 그것과 관련된 조건을 자동으로 결정하는 단계, 여기서 무균 키트는: 고형 포유류 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세싱을 위한 분해 모듈; 분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및 분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고, 여기서 각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및 각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계; (b) 대상체로부터 종양을 절제하는 단계; (c) 종양을 무균 키트의 분해 모듈의 유연한 플라스틱 용기에 넣는 단계; (d) 절제된 종양이 무균적으로 분해되고 그로써 분해된 종양이 생성되는 곳이며, 절제된 종양은 세포 손상 없이 냉동보존될 수 있다면 충분히 분해되는 것인 분해 모듈; 분해된 종양이 여과되어 분해된 고형 조직 물질이 제거되고 비-분해된 조직 및 여과물이 분리되는 것인 선택적 풍부화 모듈; 분해된 종양이 냉동보존되는 안정화 모듈과 연통하고 그것들을 제어함으로써 하나 이상의 조직 프로세싱 단계를 자동으로 실행함으로써 종양을 프로세싱하는 단계; (e) 분해된 종양을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계; (f) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로써 제2 팽창을 수행하여, UTIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및 (g) TIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하는 방법.
발명을 다음의 번호가 매겨진 단락에 의해 한층 더 기술한다:
1. 조직을 프로세싱하기 위한 유연한 용기로서, 밀봉 가능한 중합체로 만들어진 하나 이상의 층, 여기서 유연한 용기의 적어도 3개의 가장자리는 제조 중에 밀봉되는 것인 층; 사용 중에 그곳을 통해 조직 물질이 삽입되는 유연한 용기 상의 개방 가장자리; 및 튜빙을 통해 적어도 하나의 요소에 유연한 용기를 결합시키도록 구성된 하나 이상의 연결기를 포함하며; 개방 가장자리에 근접한 섹션은 조직 물질이 유연한 용기 내에 위치한 후에 밀봉되어 밀봉을 형성하는, 유연한 용기.
2. 단락 1의 유연한 용기로서, 밀봉은 개방 가장자리와 평행한 적어도 3 mm의 폭 영역을 포함하며 유연한 용기의 개방 가장자리로부터 떨어져 있는 것인 유연한 용기.
3. 단락 1의 유연한 용기로서, 돌출부를 가지며 밀봉에 근접하게 위치한 클램프를 추가로 포함하고 밀봉보다 유연한 용기의 개방 가장자리로부터 추가로 떨어져 있는 것인 유연한 용기.
4. 단락 3의 유연한 용기로서, 사용 중에 밀봉과 클램프의 조합은 유연한 용기에 적용된 100 N의 힘을 견딜 수 있도록 구성된 것인 유연한 용기.
5. 단락 3의 유연한 용기로서, 사용 중에 밀봉과 클램프의 조합은 유연한 용기에 적용된 75 N의 힘을 견딜 수 있도록 구성된 것인 유연한 용기.
6. 단락 1의 유연한 용기로서, 밀봉은 개방 가장자리와 평행한 적어도 5 mm 폭 영역을 포함하며 유연한 용기의 개방 가장자리로부터 떠러져 있는 것인 유연한 용기.
7. 단락 1의 유연한 용기로서, 유연한 용기는 조직 물질의 분해를 위해 사용되는 것인 유연한 용기.
8. 단락 1의 유연한 용기로서, 유연한 용기는 조직 물질의 분해, 분해된 조직 물질의 여과, 및 비-분해된 조직 및 여과물의 분리를 위해 사용되는 것인 유연한 용기.
9. 단락 1의 유연한 용기로서, 탄력 있는 변형 물질을 추가로 포함하는 것인 유연한 용기.
10. 단락 1의 유연한 용기로서, 하나 이상의 지표를 추가로 포함하는 것인 유연한 용기.
11. 단락 1의 유연한 용기로서, 하나 이상의 마크를 추가로 포함하는 것인 유연한 용기.
12. 단락 1의 유연한 용기로서, 밀봉은 미리 정해진 압력, 미리 정해진 온도, 및 미리 정해진 시간 프레임에서 작동하는 열 밀봉기를 사용하여 형성되는 것인 유연한 용기.
13. 단락 1의 유연한 용기로서 유연한 용기는 유연한 용기에 배치된 조직 물질을 기계적으로 부수는 장치와 함께 사용되도록 구성된 것인 유연한 용기.
14. 단락 1의 유연한 용기로서 유연한 용기는 조직 물질을 전단하도록 구성된 것인 유연한 용기.
15. 포유류 세포 또는 세포 응집체의 무균성 분해, 안정화 및 선택적 풍부화를 위한 반자동 또는 자동화된 과정에 사용하기 위한 단락 1에 따르는 유연한 용기의 용도.
16. 조직으로부터 원하는 물질의 추출을 위한 시스템으로서, 분해 유연한 용기; 안정화 유연한 용기; 및 조직의 공급원, 조직의 상태, 또는 식별자 중 적어도 하나를 제공할 수 있는 분해 유연한 용기 또는 안정화 유연한 용기 중 적어도 하나에 위치한 적어도 하나의 지표 태그를 포함하는 키트; 처리된 유체를 형성하기 위해 분해 유연한 용기에서 적어도 일부 조직을 처리할 수 있는 분해 요소; 원하는 물질을 형성하기 위해 처리된 유체의 적어도 일부를 풍부화할 수 있는 풍부화 요소; 안정화 유연한 용기에서 원하는 물질의 일부를 보관할 수 있는 안정화 요소; 및 조직의 공급원, 조직의 상태, 또는 식별자 중 적어도 하나를 제공할 수 있는 분해 요소 또는 안정화 요소 중 적어도 하나에 위치한 적어도 하나의 지표 태그 판독기를 포함하는, 시스템.
17. 단락 15의 시스템으로서 원하는 물질은 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 것인 시스템.
18. 단락 15의 시스템으로서 배지의 하나 이상의 유형은 분해 요소 및 안정화 요소에 의한 과정에 사용되는 것인 시스템.
19. 단락 15의 시스템으로서 속도 제어 동결을 할 수 있는 안정화 요소에서 사용하기 위한 냉동보존 배지를 추가로 포함하는 것인 시스템.
20. 단락 15의 시스템으로서, 분해 유연한 용기는 사용 중에 밀봉되는 개방 가장자리를 가진 분해 백을 포함하고 안정화 유연한 용기는 안정화 백인 것인 시스템.
21. 포유류 고형 조직으로부터의 세포 또는 세포 응집체의 반자동 무균성 분해 및/또는 풍부화 및/또는 안정화를 위한 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서; 및 분해 유연한 용기로서 단락 1 내지 15 중 어느 하나의 유연한 용기 중 적어도 하나를 포함하는 키트를 포함하는, 자동화 장치.
22. 단락 21의 자동화 장치로서, 지표 태그 판독기를 추가로 포함하는 것인 자동화 장치.
23. 단락 21의 자동화 장치로서, 키트의 구성요소를 인식하기 위한 무선 주파수 식별 태그 판독기를 추가로 포함하는 것인 자동화 장치.
24. 단락 21의 자동화 장치로서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 태그를 통해 키트의 구성요소를 인식할 수 있고 후속해서 분해, 풍부화 및 안정화 과정의 유형 및 그런 과정에 필요한 각각의 배지 유형을 규정하는 프로그램을 실행하는 것인 자동화 장치.
25. 단락 21의 자동화 장치로서 프로그래밍 가능한 프로세서는 자동화 장치의 분해 요소를 제어하여 분해 유연한 용기에서 고형 조직의 물리적 및/또는 생물학적 붕괴를 가능하게 하는 것인 자동화 장치.
26. 단락 25의 자동화 장치로서 프로그래밍 가능한 프로세서는 고형 조직을 기계적으로 부수고 전단하는 분해 유연한 용기에 근접한 분해 표면을 제어하고, 선택적으로 분해 표면은 기계식 피스톤인 것인 자동화 장치.
27. 단락 21의 자동화 장치로서 프로그래밍 가능한 프로세서는 자동화 장치의 분해 요소를 제어하여 분해 유연한 용기에서 고형 조직의 물리적 및 효소적 붕괴를 가능하게 하는 것인 자동화 장치.
28. 단락 27의 자동화 장치로서 고형 조직의 효소적 붕괴는 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 리버라제 HI, 펩신, 또는 그것들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 배지 효소 용액에 의해 이루어지는 것인 자동화 장치.
29. 단락 21의 자동화 장치로서 장치는 분해 요소; 풍부화 요소; 및 안정화 요소 중 적어도 2가지를 포함하고; 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 요소; 풍부화 요소; 및 안정화 요소 중 하나 이상과 연통하고 그것을 제어하기 위해 적응된 것인 자동화 장치.
30. 단락 29의 자동화 장치로서 프로그래밍 가능한 프로세서는 안정화 요소를 제어하여 냉동보존 용기에서 풍부해진 분해된 고형 조직을 냉동보존하고, 선택적으로 프로그래밍 가능한 온도를 사용하는 것인 자동화 장치.
31. 단락 29의 자동화 장치로서 장치는 다음의 추가 구성요소 중 하나 이상을 임의의 조합으로 추가로 포함하는 것인 자동화 장치: 분해된 고형 조직이 선택적 풍부화 요소로 옮겨지기 전에 분해 과정이 분해 요소에서 완료되었는지의 여부를 인식할 수 있는 센서; 분해 요소; 풍부화 요소; 및/또는 안정화 요소 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 측정하고 각각의 용기 사이에서 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서; 분해 요소; 풍부화 요소; 및/또는 안정화 요소 중 하나 이상의 용기 내에서 온도를 제어하는 센서; 요소의 각 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서; 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프; 풍부화 요소 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서; 풍부화 요소 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는 각 요소의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프.
32. 단락 29의 자동화 장치로서 프로그래밍 가능한 프로세서는 용기가 제거될 때까지 안정화 모듈에서 최적의 보관 온도 범위를 유지하기 위해 적응되거나; 또는 제어된 동결 단계를 실행하는 것인 자동화 장치.
33. 임의의 선행하는 단락의 자동화 장치로서, 사용자 인터페이스를 추가로 포함하는 것인 자동화 장치.
34. 단락 26의 자동화 장치로서, 인터페이스는 사용자에게 파라미터를 입력하거나, 사전 프로그래밍된 단계를 확인하거나, 오류를 경고하거나, 또는 이것들의 조합을 안내하는 지침을 표시하는 디스플레이 스크린을 포함하는 것인 자동화 장치.
35. 단락 21의 자동화 장치로서, 자동화 장치는 운반 가능하도록 적응된 것인 자동화 장치.
36. 자동 조직 프로세싱 방법으로서, 키트와 관련된 디지털, 전자식 또는 전자기식 태그 지표로부터 프로세싱 단계에 대한 조건 및 관련된 조건을 자동적으로 측정하는 단계; 키트의 유연한 용기에 조직 샘플을 배치하는 단계; 및 유연한 용기의 적어도 하나의 가장자리를 밀봉하는 단계; 지표와 연통하고 유연한 용기를 제어함으로써 하나 이상의 조직 프로세싱 단계를 자동으로 실행하여 조직 샘플을 프로세싱하는 단계; 및 프로세싱된 조직 샘플의 적어도 일부를 여과하여 여과된 유체를 생성하는 단계; 및 적어도 일부의 여과된 유체를 냉동보존 유연한 용기에 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
37. 단락 31의 방법으로서 프로세싱은 유연한 용기에서 조직 샘플의 적어도 일부의 교반, 추출, 및 효소적 소화를 포함하는 것인 방법.
38. 단락 31의 방법으로서 프로세싱은 유연한 용기에서 조직 샘플의 적어도 일부의 교반, 추출, 및 효소적 소화를 포함하고 원하는 물질의 추출을 초래하는 것인 방법.
39. 단락 31의 방법으로서 프로세싱은 유연한 용기에서 조직 샘플의 적어도 일부의 교반, 추출, 및 효소적 소화를 포함하고 종양 침윤 림프구 (TIL)의 추출을 초래하는 것인 방법.
40. 단락 31의 방법으로서 유연한 용기는 열-밀봉 가능한 물질을 포함하는 것인 방법.
41. 단락 31의 방법으로서 유연한 용기는 EVA, 비닐 아세테이트 및 폴리올레핀 중합체 혼합물, 또는 폴리아미드 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
* * *
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예를 상세히 설명하였지만, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명은 그것의 많은 명백한 변형이 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능하기 때문에 상기 설명에 기재된 특정 세부사항으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (87)

  1. 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단의 제조 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양 생성물을 생성하는 단계, 여기서 종양은 분해된 종양 생성물이 냉동보존될 수 있도록 충분히 분해되는 것인 단계;
    (b) 분해된 종양 생성물을 적합한 냉동보존 온도로 냉각시키는 단계;
    (c) 냉동보존된 분해된 종양 생성물을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 TIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
    (d) TIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
    (e) TIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하며;
    분해는 효소적 분해 및/또는 물리적 분해를 포함하고, 물리적 분해는 절제된 종양에 적용된 반복된 물리적 압력을 포함하며;
    단계 (a) 내지 (e)는 폐쇄된 시스템에서 수행되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회 적용되는 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분해된 종양 생성물은 단일 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양은 분해 전에 단편화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 효소적 소화에 적합한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 분해된 종양 생성물을 냉동보존 온도로 직접 냉각시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분해 기간은 90분 이하, 또는 75분 이하, 또는 60분 이하, 또는 50분 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 연속적이거나 적어도 1분의 기간에 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 침윤되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 분해된 종양 생성물을 일정한 비율로 온도를 감소시키도록 프로그래밍된 제어된 온도 장치에서 냉각시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 UTIL을 포함하거나 TIL은 MTIL을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제1 집단은 약 1-20 x 106 TIL인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 TIL을 성장시켜 제1 집단을 생성하는 것을 포함하고 단계 (d)의 제2 팽창은 급속 팽창을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 약 2주 동안 수행되고 단계 (d)는 약 2주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 단계 (d)에서 배양하는 단계는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이것들의 조합을 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양 조직을 분해 유체와 함께 유연한 용기에 배치하는 단계, 용기를 밀봉하는 단계, 종양 조직에 대해 물리적 및/또는 효소적 분해를 수행하는 단계, 및 분해된 종양 조직을 냉동보존하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 냉동보존된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단.
  19. 제18항에 있어서, 집단은 약 5x109 내지 5x1010의 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 집단.
  20. 제18항 또는 제19항의 치료 집단의 냉동보존된 백.
  21. 제20항에 있어서, 정맥내 주입에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 냉동보존된 백.
  22. 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단의 제조 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양 생성물을 생성하는 단계, 여기서 종양은 분해된 종양 생성물이 냉동보존될 수 있도록 충분히 분해되는 것인 단계;
    (b) 냉동보존된 분해된 종양 생성물을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 TIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
    (c) TIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
    (d) TIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계를 포함하며;
    분해는 효소적 분해 및/또는 물리적 분해를 포함하고, 물리적 분해는 절제된 종양에 적용된 반복된 물리적 압력을 포함하며;
    단계 (a) 내지 (d)는 폐쇄된 시스템에서 수행되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회 적용되는 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 분해된 종양 생성물은 단일 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양은 분해 전에 단편화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 효소적 소화에 적합한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 분해 기간은 90분 이하, 또는 75분 이하, 또는 60분 이하, 또는 50분 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 연속적이거나 적어도 1분의 기간에 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 침윤되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 분해된 종양 생성물을 일정한 비율로 온도를 감소시키도록 프로그래밍된 제어된 온도 장치에서 냉각시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 UTIL을 포함하거나 TIL은 MTIL을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제1 집단은 약 1-20 x 106 TIL인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 TIL을 성장시켜 제1 집단을 생성하는 것을 포함하고 단계 (c)의 제2 팽창은 급속 팽창을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 약 2주 동안 수행되고 단계 (c)는 약 2주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및/또는 단계 (c)에서 배양하는 단계는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이것들의 조합을 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양 조직을 분해 유체와 함께 유연한 용기에 배치하는 단계, 용기를 밀봉하는 단계, 종양 조직에 대해 물리적 및/또는 효소적 분해를 수행하는 단계, 및 분해된 종양 조직을 냉동보존하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 냉동보존된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단.
  39. 제38항에 있어서, 집단은 약 5x109 내지 5x1010의 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 집단.
  40. 제38항 또는 제39항의 치료 집단의 냉동보존된 백.
  41. 제40항에 있어서, 정맥내 주입에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 냉동보존된 백.
  42. 폐쇄된 시스템에서 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단의 제조 방법으로서,
    (a) (i) 절제된 종양을 냉동보존하고 냉동보존된 종양을 분해하거나, 또는
    (ii) 절제된 종양을 분해하고 분해된 종양을 냉동보존하거나, 또는
    (iii) 절제된 종양을 냉동보존하고 종양을 다수의 종양 단편으로 프로세싱하거나, 또는
    (iv) 절제된 종양을 다수의 종양 단편을 프로세싱하고 종양 단편을 냉동보존하는 단계,
    (b) 냉동보존된 분해된 종양 생성물을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 TIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
    (c) TIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
    (d) TIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 분해는 물리적 분해, 효소적 분해, 또는 물리적 및 효소적 분해를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 분해는 절제된 종양에 적용된 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회 적용되는 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 물리적 분해는 분쇄 및 전단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 냉동보존된 분해된 종양은 단일 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 효소적 소화에 적합한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 냉동보존 단계는 절제된 또는 분해된 종양을 직접 설정된 냉동보존 온도로 냉각시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 또는 분해된 종양을 일정한 비율로 온도를 감소시키도록 프로그래밍된 제어된 온도 장치에서 냉각시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 대상체로부터 절제된 종양 조직으로부터 TIL의 치료 집단을 분리하는 방법으로서,
    (a) 절제된 종양 조직을 프로그래밍 가능한 프로세서 및 폐쇄된 시스템을 포함하는 일회용 무균 키트를 포함하는 종양 조직의 반자동 무균성 분해를 위한 자동화 장치에 배치하는 단계로, 여기서 무균 키트는:
    종양 조직을 포함하는 물질의 수령 및 프로세상을 위한 분해 모듈;
    분해된 고형 조직 물질의 여과 및 비-분해된 조직 및 여과물의 분리를 위한 선택적 풍부화 모듈; 및
    분해된 생성 물질을 선택적으로 추가로 프로세싱 및/또는 보관하기 위한 안정화 모듈을 포함하고,
    각각의 모듈은 그 사이에서 조직 물질의 흐름을 가능하게 하기 위해 적응된 하나 이상의 도관에 의해 연결된 하나 이상의 유연한 용기를 포함하며; 및
    각각의 모듈은 배지 및/또는 시약의 하나 이상의 유연한 용기로의 무균성 유입을 허용하기 위해 하나 이상의 포트를 포함하는 것인 단계;
    (b) 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양을 생성하는 단계;
    (c) 분해된 종양 생성물을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 UTIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
    (d) UTIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
    (e) UTIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  53. 제32항에 있어서, 분해는 절제된 종양에 적용된 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회 적용되는 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양은 분해 전에 단편화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 조직은 침윤되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 90분 이하, 또는 75분 이하, 또는 60분 이하, 또는 50분 이하 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 후에, 방법은 안정화 모듈에서 분해된 종양을 냉동보존하는 단계인 (b')를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 단계 (b')는 분해된 종양 생성물을 냉동보존 온도로 직접 냉각시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 자동화 장치는 다음의 하나 이상을 임의의 조합으로 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    분해된 고형 조직이 선택적 풍부화 모듈로 옮겨지기 전에 분해 과정이 분해 모듈에서 완료되었는지의 여부를 인식할 수 있는 센서;
    분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기에 필요한 배지의 양을 결정하고 각각의 용기간 물질의 전달을 제어하기 위한 중량 센서;
    분해 모듈; 풍부화 모듈; 및/또는 안정화 모듈 중 하나 이상의 용기 내의 온도를 제어하기 위한 센서;
    모듈의 각 용기의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 기포 센서;
    유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 적어도 하나의 펌프, 선택적으로 연동 펌프;
    풍부화 모듈 내에서 압력을 평가하기 위한 압력 센서;
    풍부화 모듈 내에서 접선 흐름 여과 과정을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브; 및/또는
    각 모듈의 유입 및 유출 포트 사이에서 배지의 전달을 제어하기 위한 하나 이상의 클램프.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 프로그래밍 가능한 프로세서는 분해 모듈을 제어하여 고형 조직 물질의 물리적 및 효소적 붕괴를 가능하게 하고/하거나 프로그래밍 가능한 프로세서는 안정화 모듈을 제어하여 풍부해진 분해된 고형 조직을 용기에서 냉동보존하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회로 종양 조직을 반복적으로 부수고 전단하며, 안정화 모듈은 분해된 종양 조직을 -80℃ ± 10℃로 냉각시키고 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. TIL의 치료 집단을 분리하기 위하여 폐쇄된 시스템에서 사용하기에 적합한 유연한 용기로서, 조직을 프로세싱하기 위한 것이고:
    밀봉 가능한 중합체로 만들어진 하나 이상의 층, 여기서 유연한 용기의 적어도 3개의 가장자리는 제조 중에 밀봉되는 것인 층;
    사용 중에 그곳을 통해 조직 물질이 삽입되는 유연한 용기 상의 개방 가장자리; 및
    튜빙을 통해 적어도 하나의 요소에 유연한 용기를 결합시키도록 구성된 하나 이상의 연결기를 포함하며;
    개방 가장자리에 근접한 섹션은 조직 물질이 유연한 용기 내에 위치한 후에 밀봉되어 밀봉을 형성하는, 유연한 용기.
  65. 제64항에 있어서, 밀봉은 미리 정해진 압력, 미리 정해진 온도, 및 미리 정해진 시간 프레임에서 작동하는 열 밀봉기를 사용하여 형성되는 것을 특징으로 하는 유연한 용기.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 유연한 용기는 유연한 용기에 배치된 조직 물질을 기계적으로 분쇄하는 장치와 함께 사용되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 유연한 용기.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 유연한 용기는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회로 적용되는 반복된 물리적 압력에 적합한 것을 특징으로 하는 유연한 용기.
  68. 종양 조직으로부터 TIL을 추출하기 위한 시스템으로서,
    분해 유연한 용기;
    안정화 유연한 용기; 및
    조직의 공급원, 조직의 상태, 또는 식별자 중 적어도 하나를 제공할 수 있는 분해 유연한 용기 또는 안정화 유연한 용기 중 적어도 하나에 위치한 적어도 하나의 지표 태그
    를 포함하는 키트;
    처리된 유체를 형성하기 위해 분해 유연한 용기에서 적어도 일부 조직을 처리할 수 있는 분해 요소;
    원하는 물질을 형성하기 위해 처리된 유체의 적어도 일부를 풍부화할 수 있는 풍부화 요소;
    안정화 유연한 용기에서 원하는 물질의 일부를 보관할 수 있고 선택적으로 동결을 제어할 수 있는 안정화 요소; 및
    조직의 공급원, 조직의 상태, 또는 식별자 중 적어도 하나를 제공할 수 있는 분해 요소 또는 안정화 요소 중 적어도 하나에 위치한 적어도 하나의 지표 태그 판독기
    를 포함하는, 시스템.
  69. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 절제된 종양을 무균적으로 분해함으로써 분해된 종양 생성물을 생성하는 단계, 여기서 종양은 분해된 종양 생성물이 냉동보존될 수 있도록 충분히 분해되는 것인 단계;
    (b) 분해된 종양 생성물을 적합한 냉동보존 온도로 냉각시키는 단계;
    (c) 냉동보존된 분해된 종양 생성물을 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양함으로써 제1 팽창을 수행하여 TIL의 제1 집단을 생성하는 단계;
    (d) TIL의 제1 집단을 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제공 세포 (APC)와 함께 배양함으로서 제2 팽창을 수행하여, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계;
    (e) TIL의 제2 집단을 수득 및/또는 냉동보존하는 단계; 및
    (f) TIL의 제2 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
    분해는 효소적 분해 및/또는 물리적 분해를 포함하고, 물리적 분해는 절제된 종양에 적용된 반복된 물리적 압력을 포함하며;
    단계 (a) 내지 (e)는 폐쇄된 시스템에서 수행되는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 분해는 최대 6 N/cm2, 보다 바람직하게는 3 N/cm2에서 분당 120 내지 360회 적용되는 반복된 물리적 압력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 분해된 종양 생성물은 단일 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양은 분해 전에 단편화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 효소적 소화에 적합한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 분해된 종양 생성물을 냉동보존 온도로 직접 냉각시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 분해 기간은 90분 이하, 또는 75분 이하, 또는 60분 이하, 또는 50분 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 분해는 연속적이거나 적어도 1분의 기간에 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 침윤되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 분해된 종양 생성물을 일정한 비율로 온도를 감소시키도록 프로그래밍된 제어된 온도 장치에서 냉각시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 냉동보존 온도는 -80℃ ± 10℃이며 장치는 1℃/분 또는 1.5℃/분 또는 2℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 1℃/분 ± 0.5℃/분 또는 2℃/분 ± 0.5℃/분만큼 온도를 감소시키도록 프로그래밍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제69항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 UTIL을 포함하거나 TIL은 MTIL을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제69항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제1 집단은 약 1-20 x 106 TIL인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제69항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 TIL을 성장시켜 제1 집단을 생성하는 것을 포함하고 단계 (d)의 제2 팽창은 급속 팽창을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제69항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 약 2주 동안 수행되고 단계 (d)는 약 2주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제69항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 단계 (d)에서 배양하는 단계는 IL7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이것들의 조합을 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제69항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 절제된 종양 조직을 분해 유체와 함께 유연한 용기에 배치하는 단계, 용기를 밀봉하는 단계, 종양 조직에 대해 물리적 및/또는 효소적 분해를 수행하는 단계, 및 분해된 종양 조직을 냉동보존하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제69항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제2 집단은 약 5x109 내지 5x1010의 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제69항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 자궁경부암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)을 포함함), 폐암, 흑색종, 난소암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신장암 또는 신장 세포 암종인 것을 특징으로 하는 방법.
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