CN115997008A - 协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法 - Google Patents

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S·麦克赖德斯
K·兰兹
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Abstract

一种协调用于患者的扩增的细胞疗法产品的制造的方法，所述方法可以包括接受扩增用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求；产生与所述细胞订单请求相关联的患者特异性标识符或细胞订单标识符；以及从获自所述患者的实体肿瘤的至少一些起始扩增所述细胞疗法产品的过程。如果所述扩增细胞疗法产品的接受参数在扩增过程中的第一时间点之后的第二时间点不符合某些接受标准，那么基于第二时间点的接受参数来确定是否有可能从第一时间点使用细胞扩增技术重新执行所述细胞疗法产品的扩增。如果此类重新执行扩增是可能的，那么重新安排使用所述扩增的细胞疗法产品的患者治疗事件。

Description

协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月22日提交的美国临时申请号63/013,942、2021年3月2日提交的美国临时申请号63/155,711和2021年3月11日提交的美国临时申请号63/159,806的优先权，各案出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性转移来治疗大型、难治性癌症对于预后不良患者代表一种强大的治疗方案。Gattinoni等人,Nat.Rev.Immunol.2006,6,383-393。成功免疫疗法需要大量的TIL，而商业化需要强健并且可靠的工艺。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这对于它的实现是一项挑战。基于IL-2的TIL扩增和随后的“快速扩增过程”(REP)已因其速度和效率而成为TIL扩增的优选方法。Dudley等人,Science 2002,298,850-54；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-57；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-39；Riddell等人,Science 1992,257,238-41；Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42。REP可在14天期间导致1,000倍的TIL扩增，不过它需要大量过量(例如，200倍)的经照射的通常来自多个供体的同种异体外周血单核细胞(PBMC，还称为单核细胞(MNC))作为喂养细胞，还需要抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42。经历REP程序的TIL已在宿主免疫抑制后的黑素瘤患者中产生成功的过继性细胞疗法。
附图说明
图1示意性描绘使用过继性细胞疗法(使用TIL)治疗患者的各种阶段，包括用于制造同种异体TIL的各种步骤。
图2A显示用于TIL制造的GEN 3工艺的时间线。
图2B显示用于TIL制造的2A工艺与GEN 3工艺实施方案之间的比较。
图2C显示用于TIL制造的GEN 3实施方案、GEN 3.1工艺实施方案与GEN 3.1工艺的替代实施方案之间的比较。
图3A显示用于协调用于患者的TIL的制造的系统的方块图。
图3B根据一些实施方案绘示在市售软件平台上经合适修改或建立的系统300的组件的对象模式以及在那些平台内的那些标准物。
图3C-3E根据一些实施方案示意性绘示生物材料在制造设施处的制造工艺中的轨迹。
图3F根据制造工艺的一些实施方案(例如GEN 3工艺)示意性绘示从获得实体肿瘤到制造工艺到输注至患者体内的细胞疗法产品的旅程中维持COC和COI的过程。
图3G是根据一些实施方案的细胞疗法产品的标签的代表性图像。
图3H是表格，它显示根据一些实施方案在制造细胞疗法产品的过程期间所产生的各种类型的标签。
图3I和图3J是根据一些实施方案的成品标签的代表性图像。
图3K-3P是根据一些实施方案的肿瘤摘取表格的代表性屏幕截图图像。
图4A和图4B显示基于TIL制造工艺的成功确定患者治疗事件的安排的流程图。
图4C显示基于TIL制造工艺的成功确定患者治疗事件的安排的替代实施方案的流程图。
图5显示工艺2A(22天TIL制造工艺)的实施方案的图。
图6显示用于TIL制造的1C工艺与2A工艺实施方案之间的比较。
图7显示1C工艺时间线。
图8显示2A工艺实施方案的详细示意图。
图9显示提供步骤A至F的概览的示例性工艺2A图。
图10显示工艺1C和工艺2A的示例性实施方案的步骤A至F的比较表。
图11显示工艺1C实施方案与工艺2A实施方案的详细比较。
序列表简单说明
SEQ ID NO:1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是重组人IL-2蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为IL-2形式。
SEQ ID NO:6是内姆瓦卢金阿法(nemvaleukin alfa)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为IL-2形式。
SEQ ID NO:8为粘液素结构域多肽。
SEQ ID NO:9是重组人IL-4蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是重组人IL-7蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是重组人IL-15蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是重组人IL-21蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是IL-2序列。
SEQ ID NO:14是IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:15是IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:16是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO:17是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO:18是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO:19是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO:20是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO:21是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO:22是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO:23是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO:24是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO:25是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO:26是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO:27是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO:28是IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO:29是IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO:30是IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO:31是IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO:32是IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO:33是IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO:34是IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO:35是IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO:36是VL链。
SEQ ID NO:37是轻链。
SEQ ID NO:38是轻链。
SEQ ID NO:39是轻链。
SEQ ID NO:40是人4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是鼠科动物4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO:43是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO:44是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:45是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:46是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO:47是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO:48是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO:49是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:50是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:51是4-1BB促效剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:52是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO:53是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO:54是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:55是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:56是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO:57是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO:58是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO:59是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:60是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:61是4-1BB促效剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:62是TNFRSF促效剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO:63是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:64是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:65是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:66是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:67是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:68是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:69是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:70是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:71是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:72是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:73是TNFRSF促效剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO:74是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:75是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:76是TNFRSF促效剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:77是4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:78是4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:79是4-1BB促效剂抗体4B4-1-1型式1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:80是4-1BB促效剂抗体4B4-1-1型式1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:81是4-1BB促效剂抗体4B4-1-1型式2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:82是4-1BB促效剂抗体4B4-1-1型式2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:83是4-1BB促效剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:84是4-1BB促效剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:85是人OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86是鼠OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO:88是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO:89是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:90是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:91是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO:92是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO:93是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO:94是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:95是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:96是OX40促效剂单克隆抗体塔伏利西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:97是OX40促效剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO:98是OX40促效剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO:99是OX40促效剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:100是OX40促效剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:101是OX40促效剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO:102是OX40促效剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO:103是OX40促效剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO:104是OX40促效剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO:105是OX40促效剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO:106是OX40促效剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO:107是OX40促效剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO:108是OX40促效剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO:109是OX40促效剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:110是OX40促效剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:111是OX40促效剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO:112是OX40促效剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO:113是OX40促效剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO:114是OX40促效剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO:115是OX40促效剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO:116是OX40促效剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO:117是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:118是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:119是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO:120是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO:121是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO:122是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO:123是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO:124是OX40促效剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO:125是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:126是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:127是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO:128是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO:129是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO:130是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO:131是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO:132是OX40促效剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO:133是OX40配体(OX40L)氨基酸序列。
SEQ ID NO:134是OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:135是OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO:136是OX40促效剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:137是OX40促效剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:138是OX40促效剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:139是OX40促效剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:140是OX40促效剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:141是OX40促效剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:142是OX40促效剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:143是OX40促效剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:144是OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:145是OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:146是OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:147是OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:148是人源化OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:149是人源化OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:150是人源化OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:151是人源化OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:152是人源化OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:153是人源化OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:154是人源化OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:155是人源化OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:156是OX40促效剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:157是OX40促效剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:158是PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:159是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:160是PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:161是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:162是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:163是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:164是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:165是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:166是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:167是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:168是PD-1抑制剂派姆单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:169是PD-1抑制剂派姆单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:170是PD-1抑制剂派姆单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:171是PD-1抑制剂派姆单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:172是PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:173是PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:174是PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:175是PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:176是PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:177是PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:178是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:179是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:180是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:181是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:182是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:183是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:184是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:185是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:186是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:187是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:188是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:189是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:190是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:191是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:192是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:193是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:194是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:195是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:196是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:197是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:198是PD-L1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:199是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:200是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:201是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:202是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:203是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:204是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:205是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:206是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:207是PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:208是CTLA-4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:209是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:210是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:211是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:212是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:213是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:214是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:215是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:216是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:217是CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:218是CTLA-4抑制剂曲美木单抗(tremelimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:219是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:220是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:221是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:222是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:223是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:224是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:225是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:226是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:227是CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:228是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:229是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:230是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:231是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:232是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:233是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:234是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:235是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:236是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:237是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
具体实施方式
I.介绍
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞疗法已在宿主免疫抑制后的黑素瘤患者中产生成功的过继性细胞疗法。例如发现在一些情况下，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗尽通过消除调节T细胞和免疫系统的竞争元件(“细胞因子汇”)发挥增强治疗功效的关键作用。在一些情况下，ACT的功效可通过在输注TIL之前(例如在TIL输注之前28-25天)以非骨髓清除性化学疗法预处理接受ACT的患者来增加。也已经发现，在TIL输注之后的IL-2治疗方案可改善疗法成功的机会。这些输注前治疗和输注后治疗的时间安排和持续时间决定整个治疗方案的最终功效。
因此，各种治疗方案的安排取决于TIL制造工艺的时间安排和持续时间，所述TIL制造工艺本身是依赖于最终产物的接受参数。目前的输注接受参数依赖于TIL的组成的读数(例如，CD28、CD8或CD4阳性率)和扩增的TIL产品(本文中还称为REP产品)的扩增倍数和活力。REP产品的扩增倍数和活力进而取决于在扩增过程期间测量的各种参数。输注可接受的REP产品在输出和时间安排上的此类变化对运送肿瘤至制造设施的物流、转移REP产品和在TIL制造工艺期间各种患者治疗事件的安排造成挑战。
此外，各种参数诸如在TIL制造工艺的不同阶段期间的细胞活力和细胞计数决定后续阶段的持续时间，以使得在TIL制造工艺结束时获得可接受的活力、数值倍数和最终细胞计数。
此外，重要的是，从生物材料从患者去除的时间到其输注至患者体内的时间(包括整个TIL制造工艺)皆必须进行追踪，以避免制造延迟、材料的错贴标签和患者的错误鉴定，并且由此改善患者安全性。
本公开提供基于在制造工艺的不同阶段期间的各种测量参数通过动态安排各种患者治疗事件用于协调用于患者的扩增的细胞疗法产品的制造工艺和各种患者治疗事件的框架。
例如在一个实施方案中，用于协调用于患者的扩增的T细胞的制造的方法可以包括：通过计算接受细胞订单请求以扩增用于所述患者的T细胞；由所述计算装置产生与细胞订单请求相关联的患者特异性标识符或细胞订单标识符；和起始扩增T细胞的过程。扩增T细胞的过程可以包括在临床机构对患者执行程序以从患者获得T细胞并且将获得的T细胞转移至制造设施。在制造设施处接受获得的T细胞之后，由计算装置动态安排患者治疗事件。动态安排取决于后续获得的扩增T细胞的接受参数。使用细胞扩增技术从获得的T细胞的至少一些起始T细胞的扩增并且确定扩增T细胞的接受参数。
在另一实施方案中，用于协调用于患者的扩增的细胞疗法产品的制造的方法可以包括：由计算装置接受细胞订单请求以扩增用于所述患者的细胞疗法产品；由所述计算装置产生与细胞订单请求相关联的患者特异性标识符，包括细胞订单标识符；和起始扩增细胞疗法产品的过程。扩增细胞疗法产品的过程可以包括在临床机构对患者执行程序以从患者获得实体肿瘤并且将获得的实体肿瘤转移至制造设施。在制造设施处接受实体肿瘤之后，由计算装置动态安排患者治疗事件。动态安排取决于后续获得的扩增细胞疗法产品的接受参数。使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一些起始所述细胞疗法产品的扩增，并且确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数。确定扩增细胞疗法产品的接受参数是否符合在第一时间点和第二时间点的某些接受标准。如果第一时间点的接受参数符合接受标准，那么继续细胞疗法产品的扩增直至第二时间点。如果扩增细胞疗法产品的接受参数不符合第二时间点的接受标准，那么基于第二时间点的接受参数来确定从第一时间点使用细胞扩增技术重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是否可能。如果确定重新执行扩增是可能的，那么从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术由所述第二时间点获得的所述细胞疗法产品的至少一些重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增。估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间。基于所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间和在所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的输注之前或之后的患者治疗事件的时间安排重新安排所述患者治疗事件。从所述第一时间点完成所述细胞疗法产品的后续扩增。
本公开另外提供用于从生物材料从患者抽取的时间到其输注回患者的时间正确追踪生物材料的方法和系统。特别是，本文所公开的方法和系统促进维持生物材料的身份链和保管链。
例如在一个实施方案中，追踪患者的生物材料的方法可以包括接受制造用于患者的生物材料的细胞订单请求。在接受所述细胞订单请求时，计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的患者特异性标识符。患者特异性标识符可以包括患者标识符、细胞订单请求标识符、订单码和细胞订单批号中的一者或多者。接着在生物材料从临床机构(从患者抽取生物材料之处)运输到制造设施期间、在制造设施的制造工艺期间和在制造的生物材料从制造设施运输到临床机构(制造的生物材料所在处)和回到临床机构(制造的生物材料经输注至患者体内之处)期间使用患者特异性标识符追踪患者的生物材料。追踪可以包括由计算装置记录运输和制造工艺的各步骤的追踪事件。追踪事件的记录包含患者的生物材料的保管链。
除非另行定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常所了解的相同含义。本文所提及的所有专利和公布均以全文引用的方式并入。
术语“体内(in vivo)”是指发生在受试者体内的事件。
术语“体外(in vitro)”是指发生在受试者体外的事件。体外分析涵盖基于细胞的分析，其中采用活细胞或死细胞，并且也可涵盖其中不采用完整细胞的不含细胞的分析。
术语“离体(ex vivo)”是指涉及对从受试者的身体去除的细胞、组织和/或器官进行处理或执行程序的事件。适当地，所述细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗的方法返回受试者的身体。
术语“快速扩增(rapid expansion)”是指抗原特异性TIL的数目在一周期间增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，更优选地在一周期间增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或最优选地在一周期间增加至少约100倍。多种快速扩增方案概述于下文中。
本文中的“肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes)”或“TIL”意指最初获得时是白血球但离开受试者的血流并且迁移至肿瘤中的细胞群体。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀手细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代和次级TIL。“原代TIL”是那些如本文所概述的获自患者组织样品的细胞(有时称为“新鲜获得(freshly obtained)”或“新鲜单离(freshly isolated)”)，而“次级TIL”是任何经本文所述的扩增或增生的TIL细胞群体，包括但不限于主体TIL(bulkTIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞群体可以包括基因修饰的TIL。
本文中的“细胞群体(population of cells)”(包括TIL)意指一些共享共同特质的细胞。一般说来，群体的数目通常介于1×106至1×1010范围内，其中不同TIL群体包含不同数目。例如，原代TIL在IL-2存在下的初始生长导致大约1×108个细胞的主体TIL群体。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个用于输注的细胞的群体。在一些实施方案中，进行REP扩增以提供2.3×1010至13.7×1010个的群体。
本文中的“冷冻保存的TIL”意指在约-150℃至-60℃范围内处理和存储的不论是原代、主体或扩增(REP TIL)的TIL。冷冻保存的一般方法也描述于本文别处，包括实施例中。为了清晰起见，可将“冷冻保存的TIL”与可用作原代TIL来源的冷冻组织样品区别开。
本文中的“解冻的冷冻保存的TIL(thawed cryopreserved TIL)”意指先前经冷冻保存并且接着经处理以返回室温或更高温度的TIL群体，包括但不限于细胞培养温度或其中可将TIL施用于患者的温度。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(通过它们浸润肿瘤并且实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达一个或多个以下生物标志物来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外并且替代地，TIL可通过它们重新引入患者体内后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。
术语“冷冻保存培养基(cryopreservation media/cryopreservation medium)”是指任何可用于冷冻保存细胞的培养基。所述培养基可以包括包含7％至10％ DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及它们的组合。术语“CS10”是指获自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以其商品名称“
Figure BDA0004012625820000251
CS10”称呼。CS10培养基是无血清、不含动物组分的包含DMSO的培养基。
术语“中央记忆T细胞(central memory T cell)”是指T细胞子集，它们在人类中是CD45R0+并且组成性表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)。中央记忆T细胞的表面表型也包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中央记忆T细胞在TCR触发后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中央记忆T细胞主要位于血液中的CD4隔室中，并且在人类的淋巴结和扁桃腺中按比例富集。
术语“效应记忆T细胞(effector memory T cell)”是指人或哺乳动物T细胞的子集，如同中央记忆T细胞是CD45R0+，但已经失去组成性表达CCR7的能力(CCR7lo)并且表达CD62L的能力异质或低(CD62Llo)。中央记忆T细胞的表面表型也包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后快速分泌高水平的炎症性细胞因子，包括干扰素γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞主要位于血液中的CD8隔室中，并且在人类的肺、肝脏和肠中按比例富集。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
术语“密闭系统”是指与外界环境隔离的系统。任何适用于细胞培养方法的密闭系统皆可用于本发明方法。密闭系统包括例如但不限于密闭G容器。一旦将肿瘤区段添加至密闭系统后，所述系统即与外界环境隔离，直至准备将TIL施用于患者为止。
如本文所用，术语“片段化(fragmenting)”、“片段(fragment)”和“片段化的(fragmented)”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械片段化方法，诸如破碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“细针抽吸物(fine needle aspirate)”或FNA是指一种活组织检查程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不去除或切除肿瘤。在细针抽吸中，将中空针(例如25-18号)插入肿瘤中或含有肿瘤的区域中，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于如本文所述的进一步分析或扩增。使用FNA时，细胞被取出并且不保留组织细胞的组织学结构。FNA可包含TIL。在一些情况下，细针抽吸活组织检查是使用超声波引导的细针抽吸活组织检查针来执行。FNA针可购自Becton Dickinson,Covidien等。
术语“粗针活组织检查(core biopsy/core needle biopsy)”是指一种活组织检查程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不去除或切除肿瘤。在粗针活组织检查中，将中空针(例如16-11号)插入肿瘤中或含有肿瘤的区域中，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于如本文所述的进一步分析或扩增。进行粗针活组织检查时，细胞可在保留一些组织细胞的组织学结构的情况下被取出，因为如与FNA相比，具有较大的针大小。粗针活组织检查针通常具有能够保留肿瘤组织学结构的至少一些部分的规格大小。粗针活组织检查可包含TIL。在一些情况下，粗针活组织检查是使用可购自Bard Medical,Becton Dickinson等的活组织检查仪器、真空辅助粗针活组织检查仪器、立体定位引导粗针活组织检查仪器、超声波引导粗针活组织检查仪器、MRI引导粗针活组织检查仪器来执行。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核球。当用作抗原呈递细胞(PBMC是一种抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞是经照射的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”是指从外周血扩增的T细胞。在一些实施方案中，PBL是从供体的全血或单采产物分离。在一些实施方案中，PBL是通过T细胞表型(诸如CD3+CD45+的T细胞表型)的正向或负向选择从供体的全血或单采产物分离。
术语“抗CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人、人源化、嵌合或鼠科动物抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，还称为莫罗单抗。抗CD3抗体也包括UHCT1克隆，还称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(本文中还称为“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人、人源化、嵌合或鼠科动物抗体，并且包括市售形式，诸如OKT-3(30ng/mL,MACS GMP CD3 pure,Miltenyi Biotech,Inc.,SanDiego,CA,USA)和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖形式或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。能够产生OKT-3的杂交瘤寄存于美国菌种保存中心(American Type Culture Collection)，并且被指派ATCC登录号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也寄存于欧洲认证细胞培养中心(ECACC)，并且被指派目录号86022706。
表1.莫罗单抗的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820000281
术语“IL-2”(本文中还称为“IL2”)是指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括其人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖形式、生物类似物和变体。IL-2描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:3)。例如，术语IL-2涵盖IL-2的人重组形式，诸如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每个单次使用小瓶含22百万IU)，以及由CellGenix,Inc.,Portsmouth,NH,USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他市售等效物。阿地白介素(去丙氨酰基-1、丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量为大约15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:4)。术语IL-2也涵盖如本文所述的IL-2的聚乙二醇化形式，包括聚乙二醇化IL2前药贝加德卢金(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如SEQ ID NO:4所示的聚乙二醇化人重组IL-2，其中平均6个赖氨酸残基是经[(2,7-双{[甲基聚(氧基亚乙基)]氨甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基取代的N6)，其可获自Nektar Therapeutics,South SanFrancisco,CA,USA或可通过本领域中已知的方法制备，诸如国际专利申请公布号WO 2018/132496 A1的实施例19所述的方法或美国专利申请公布号US 2019/0275133 A1的实施例1所述的方法，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的贝加德卢金(NKTR-214)和其他聚乙二醇化IL-2分子描述于美国专利申请公布号US 2014/0328791 A1和国际专利申请公布WO 2012/065086 A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的缀合IL-2的替代形式描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是THOR-707，可获自Synthorx,Inc。THOR-707的制备和性质和适用于本发明的IL-2的另外的替代形式描述于美国专利申请公布号US 2020/0181220 A1和US 2020/0330601 A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是白细胞介素2(IL-2)缀合物，其包含：经单离和纯化的IL-2多肽；和结合至经单离和纯化的IL-2多肽的选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸位置的缀合部分，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，氨基酸位置是选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置是选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置是选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置是选自R38和K64。在一些实施方案中，氨基酸位置是选自E61、E62和E68。在一些实施方案中，氨基酸位置是E62。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、m-乙酰苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯硒烷基)丙酸或硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，IL-2缀合物相对于野生型IL-2多肽具有降低的对IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力。在一些实施方案中，降低的亲和力是对IL-2Rα的结合亲和力相对于野生型IL-2多肽降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施方案中，降低的亲和力是相对于野生型IL-2多肽约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或超过1000倍。在一些实施方案中，缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施方案中，缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，另外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物中的每一者独立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧基乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣类)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或它们的组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物中的每一者独立地包含PEG。在一些实施方案中，PEG是线性PEG或分支链PEG。在一些实施方案中，水溶性聚合物中的每一者独立地包含多醣。在一些实施方案中，多醣包含右旋糖苷、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基-淀粉(HES)。在一些实施方案中，水溶性聚合物中的每一者独立地包含聚糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物中的每一者独立地包含多胺。在一些实施方案中，缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，另外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质中的每一者独立地包含白蛋白、转铁蛋白或转甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，蛋白质中的每一者独立地包含Fc部分。在一些实施方案中，蛋白质中的每一者独立地包含IgG的Fc部分。在一些实施方案中，缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，另外的缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，多肽中的每一者独立地包含XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、类弹性蛋白多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，经单离和纯化的IL-2多肽通过谷氨酰化(glutamylation)加以修饰。在一些实施方案中，缀合部分直接结合至经单离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，缀合部分经由接头间接结合至经单离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，接头包含同型双官能接头。在一些实施方案中，同型双官能接头包含Lomant试剂二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)、3′3′-二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、二琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、己二亚胺酸二甲酯(DMA)、庚二亚胺酸二甲酯(DMP)、辛二亚胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫双丙酰亚胺酯(DTBP)、1,4-二-(3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二环氧甘油醚、己二酸二酰肼、卡肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′-对二氨基二苯基、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-乙烯-双(碘乙酰胺)或N,N′-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方案中，接头包含杂双官能接头。在一些实施方案中，杂双官能接头包含N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰氨基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(slAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)、羰基反应性和巯基反应性交联剂诸如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺-(4-叠氮基水杨酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3′-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺(4-叠氮基苯基)-1,3′-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺4-(对叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、对硝基苯基叠氮基丙酮酸酯(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰氨基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯基酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮基苯基乙二醛(APG)。在一些实施方案中，接头包含可裂解接头，任选地包含双肽接头。在一些实施方案中，双肽接头包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方案中，接头包含不可裂解接头。在一些实施方案中，接头包含顺丁烯二酰亚胺基，任选地包含顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方案中，接头还包含间隔子。在一些实施方案中，间隔子包含对氨基苄醇(PAB)、对氨基苄氧羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，另外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是本文所述的IL-2形式中的任一者的片段。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式如美国专利申请公布号US 2020/0181220 A1和美国专利申请公布号US 2020/0330601 A1所公开经聚乙二醇化。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是IL-2缀合物，其包含：包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)的IL-2多肽，共价附接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且参考SEQ ID NO:5内的氨基酸位置，AzK取代氨基酸位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72。在一些实施方案中，IL-2多肽相对于SEQ ID NO:5包含N端缺失一个残基。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链衔接，但保留与中间亲和力IL-2Rβ-γ信号传导复合物的正常结合。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是IL-2缀合物，其包含：包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)的IL-2多肽，共价附接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；并且参考SEQ ID NO:5内的氨基酸位置，AzK取代氨基酸位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是IL-2缀合物，其包含：包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)的IL-2多肽，共价附接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且参考SEQ ID NO:5内的氨基酸位置，AzK取代氨基酸位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是IL-2缀合物，其包含：包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)的IL-2多肽，共价附接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；并且参考SEQ ID NO:5内的氨基酸位置，AzK取代氨基酸位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是内姆瓦卢金阿法(还称为ALKS-4230(SEQ ID NO:6))，其可获自Alkermes,Inc。内姆瓦卢金阿法还称为人白细胞介素2片段(1-59)变体(Cys125>Ser51)，经由肽基接头(60GG61)融合至人白细胞介素2片段(62-132)，经由肽基接头(133GSGGGS138)融合至人白细胞介素2受体α链片段(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖基化；人白细胞介素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125(51)>Ser]-突变体(1-59)，经由G2肽接头(60-61)融合至人白细胞介素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)并且经由GSG3S肽接头(133-138)融合至人白细胞介素2受体α链(IL2R亚基α，IL2Rα，IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖形式α。内姆瓦卢金阿法的氨基酸序列在SEQ ID NO:6给出。在一些实施方案中，内姆瓦卢金阿法展现以下翻译后修饰：以下位置的二硫桥：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO:6的编号)，和以下位置的糖基化位点：N187、N206、T212(使用SEQ ID NO:6的编号)。内姆瓦卢金阿法的制备和性质以及适用于本发明的IL-2的另外的替代形式描述于美国专利申请公布号US 2021/0038684 A1和美国专利号10,183,979中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式具有SEQ ID NO:6给出的氨基酸序列或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是融合蛋白，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是融合蛋白，其包含与SEQID NO:7的氨基酸24-452具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的氨基酸序列或其变体、片段或衍生物。其他适用于本发明的IL-2形式描述于美国专利号10,183,979中，其公开内容以引用的方式并入本文中。任选地，在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是融合蛋白，其包含通过粘液素结构域多肽接头连接至第二融合搭配物的第一融合搭配物，其中第一融合搭配物是IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％氨基酸序列同一性的蛋白质并且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性，并且其中第二融合搭配物包含所有或一部分的包含Fc区的免疫球蛋白，其中粘液素结构域多肽接头包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中融合蛋白的半衰期相较于第一融合搭配物与第二融合搭配物在粘液素结构域多肽接头不存在下的融合有所改善。
表2.白细胞介素的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820000361
Figure BDA0004012625820000371
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子植入蛋白，其包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和植入至VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中抗体细胞因子植入蛋白优先扩增T效应细胞而非调节T细胞。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和植入至VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中IL-2分子是突变蛋白，并且其中抗体细胞因子植入蛋白优先扩增T效应细胞而非调节T细胞。在一个实施方案中，IL-2方案包含施用美国专利申请公布号US2020/0270334 A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)所述的抗体。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和植入至VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中IL-2分子是突变蛋白，其中抗体细胞因子植入蛋白优先扩增T效应细胞而非调节T细胞，并且其中抗体还包含选自由以下组成的组的IgG类别重链和IgG类别轻链：包含SEQ ID NO:39的IgG类别轻链和包含SEQ ID NO:38的IgG类型重链；包含SEQID NO:37的IgG类别轻链和包含SEQ ID NO:29的IgG类别重链；包含SEQ ID NO:39的IgG类别轻链和包含SEQ ID NO:29的IgG类别重链；和包含SEQ ID NO:37的IgG类别轻链和包含SEQ ID NO:38的IgG类别重链。
在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VH的HCDR1中，其中IL-2分子是突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VH的HCDR2中，其中IL-2分子是突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VH的HCDR3中，其中IL-2分子是突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VL的LCDR1中，其中IL-2分子是突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VL的LCDR2中，其中IL-2分子是突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段是植入至VL的LCDR3中，其中IL-2分子是突变蛋白。
IL-2分子的插入可以在CDR的N端区或在CDR的N端区附近、在CDR的中间区或在CDR的C端区或在CDR的C端区附近。在一些实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不使CDR序列移码。在一些实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换全部或部分的CDR序列。IL-2分子的置换可为CDR的N端区、在CDR的中间区或在CDR的C端区或在CDR的C端区附近。IL-2分子的置换可为少至CDR序列的一或两个氨基酸或整个CDR序列。
在一些实施方案中，IL-2分子是在无肽接头下直接植入至CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间无另外的氨基酸。在一些实施方案中，IL-2分子是通过肽接头间接植入至CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间有一个或多个另外的氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的IL-2分子是IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含美国专利申请公布号US 2020/0270334A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)的表1中的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含选自由SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25组成的组的HCDR1。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16组成的组的HCDR1。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含选自由SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26组成的组的HCDR2。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含选自由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27组成的组的HCDR3。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH区，和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链区，和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链区，和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链区，和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链区，和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链区。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含美国专利申请公布号2020/0270334A1的IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其变体、衍生物或片段或其保守氨基酸取代或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的蛋白质。在一个实施方案中，本文所述的抗体细胞因子植入蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体细胞因子植入蛋白具有比起野生型IL-2分子诸如但不限于阿地白介素或可相当的分子较长的血清半衰期。在一个实施方案中，本文所述的抗体细胞因子植入蛋白具有如表3所示的序列。
表3.示例性帕利珠单抗抗体-IL-2植入蛋白的序列。
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术语“IL-4”(本文中还称为“IL4”)是指称为白细胞介素4的细胞因子，它是通过Th2 T细胞和通过嗜酸性球、嗜碱性球和肥胖细胞产生。IL-4调节初始
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辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2T细胞。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在IL-4的活化下，Th2 T细胞随后以正反馈回路产生另外的IL-4。IL-4也刺激B细胞增生和II类MHC表达，并且诱导B细胞类型转换成表达IgE和IgG1。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-211)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号GibcoCTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:9)。
术语“IL-4”(本文中还称为“IL4”)是指称为白细胞介素4的细胞因子，它是通过Th2 T细胞和通过嗜酸性球、嗜碱性球和肥胖细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在IL-4的活化下，Th2 T细胞随后以正反馈回路产生另外的IL-4。IL-4也刺激B细胞增生和II类MHC表达，并且诱导B细胞类型转换成表达IgE和IgG1。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-211)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号GibcoCTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:5)。
术语“IL-7”(本文中还称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生性细胞因子，它可获自基质细胞和上皮细胞以及树突细胞。Fry和Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7可刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(由IL-7受体α和常见γ链受体组成的异二聚体)结合，其为对于T细胞在胸腺内的发育和在周边内的存活来说重要的一系列信号。适用于本发明的重组人类IL-7可购自多个供应商，包括ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-254)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:6)。
术语“IL-15”(本文中还称为“IL15”)是指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，并且包括IL-2的所有形式，包括其人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖形式、生物类似物和变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚基。重组人IL-15是含有114个氨基酸(和一个N端甲硫氨酸)的单一、非糖基化多肽链，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可购自多个供应商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQID NO:7)。
术语“IL-21”(本文中还称为“IL21”)是指称为白细胞介素-21的多效性细胞因子蛋白质，并且包括IL-21的所有形式，包括其人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖形式、生物类似物和变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-21主要由自然杀手T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是含有132个氨基酸的单一、非糖基化多肽链，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可购自多个供应商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,EastBrunswick,NJ,USA(目录号CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-21重组蛋白质，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:8)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，欲施用的本发明组合物的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和疾患的个体差异来确定。通常说明本文所述的包含肿瘤浸润性淋巴细胞(例如次级TIL或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011细胞/kg体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010细胞/kg体重)的剂量施用，包括在那些范围内的所有整数值。肿瘤浸润性淋巴细胞(在一些情况下包括基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以这些剂量施用多次。肿瘤浸润性淋巴细胞(在一些情况下包括基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)可使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。对特定患者来说的最佳剂量和治疗方案可轻易地由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病病征并且据此调整治疗加以确定。
术语“血液恶性病(hematological malignancy/hematologic malignancy)”或有相关含义的术语是指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液恶性病还称为“液体肿瘤”。血液恶性病包括但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性病”是指影响B细胞的血液恶性病。
术语“实体肿瘤”是指组织的异常集结粒，通常不含囊肿或液体区域。实体肿瘤可为良性或恶性。术语“实体肿瘤癌”是指恶性、肿瘤性或癌性实体肿瘤。实体肿瘤癌包括但不限于肉瘤、癌瘤和淋巴瘤，诸如肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体肿瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和有癌细胞分散其中并且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
术语“液体肿瘤”是指具流体本质的细胞的异常集结粒。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤以及其他血液恶性病。获自液体肿瘤的TIL在本文中还称为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤的TIL(包括在外周血循环的液体肿瘤)在本文中还称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用并且仅基于产生细胞的组织类型而不同。
如本文所用，术语“微环境”可指整个实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境是指“促进肿瘤转变、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫性影响、鼓励治疗抗性并且提供显性转移成长的生态位的细胞、可溶因子、信号传导分子、细胞外基质和机械刺激”的复杂混合物，如Swartz等人,Cancer Res.,2012,72,2473所述。虽然肿瘤表达出应被T细胞识别的抗原，但免疫系统因为微环境的免疫抑制作用而很少进行肿瘤清除。
如本文所用，术语“动态安排(dynamically scheduling/dynamic scheduling)”可指基于一个或多个后续事件的后果或结果建立事件发生的弹性安排。因此，事件(诸如患者治疗事件)的安排日期可基于在安排所述安排日期之后但在事件之前执行的一个或多个制造步骤的后果或结果发生动态改变。
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除性化学疗法预处理。在一些实施方案中，可提供TIL群体，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除性化学疗法预处理。在一个实施方案中，非骨髓清除性化学疗法是环磷酰胺60mg/kg/d共2天(TIL输注之前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d共5天(TIL输注之前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本发明的非骨髓清除性化学疗法和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时接受720,000IU/kg静脉内IL-2的静脉内输注至生理耐受。
实验发现指示，在肿瘤特异性T淋巴细胞的过继性转移之前的淋巴细胞耗尽通过消除调节T细胞和免疫系统的竞争元件(“细胞因子汇”)发挥增强治疗功效的关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的rTIL之前，对患者进行淋巴细胞耗尽步骤(有时还称为“免疫抑制性调理”)。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration/co-administering)”、“与......组合施用(administered in combination with/“administering incombination with)”、“同时”和“并用”涵盖施用两种或更多种活性药物成分(在本发明的一个优选实施方案中，例如至少一种钾通道促效剂与多个TIL的组合)至受试者，以使两种活性药物成分和/或它们的代谢物同时存在于受试者中。共同施用包括同时施用分开组合物、在不同时间施用分开组合物或施用其中有两种或更多种活性药物成分存在的组合物。同时施用分开组合物和施用其中有两种药剂存在的组合物是优选的。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于疾病治疗)的如本文所述的化合物或化合物组合的量。治疗有效量可依预期应用(体外或体内)或正在治疗的受试者和疾病病况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病病况的严重性或施用方式而异。所述术语也适用于将诱导靶标细胞中的特定反应(例如减少血小板粘着性和/或细胞迁移)的剂量。具体剂量将视所选的特定化合物、所遵循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间安排、其欲施用的组织和携带化合物的物理递送系统而异。
术语“治疗(treatment/treating/treat)”等是指获得所需药理学和/或生理学效应。所述效应可为预防性，也就是完全或部分预防疾病或其症状，和/或所述效应可为治疗性，也就是部分或完全治愈疾病和/或疾病带来的不良影响。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在受试者中发生，所述受试者可易发生所述疾病，但尚未诊断出患有所述疾病；(b)抑制疾病，即停止疾病的发展或进展；和(c)缓解疾病，即造成疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”也意图涵盖递送药剂以提供药理学效应，甚至在疾病或疾患不存在下。例如，“治疗”涵盖递送可在疾病病况不存在下诱发免疫反应或赋予免疫性的组合物，例如以疫苗为例。
当术语“异源性”用于指称核酸或蛋白质的部分时，指示所述核酸或蛋白质包含两个或更多个实际上彼此不具有相同关系的子序列。举例来说，所述核酸一般为重组产生的，具有两个或更多个来自不相关基因并且经排列以制造新的功能性核酸的序列，例如启动子来自一个来源并且编码区域来自另一来源，或编码区域来自不同来源。同样，异源性蛋白质指示所述蛋白质包含两个或更多个实际上彼此不具有相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在提及两个或更多个核酸或多肽时，术语“序列同一性(sequence identity)”、“同一性百分比(percent identity)”和“序列同一性百分比(sequence percentidentity)”(或其同义术语，例如“99％同一性”)是指当两个或更多个序列或子序列经比较和比对(需要时引入间隙)以达最高对应性并且不将任何保守氨基酸取代当作序列同一性的部分时，所述两个或更多个序列或子序列是相同或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可利用序列比较软件或算法测量，或通过目视检查测量。各种算法和软件是本领域中已知，可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。可确定序列同一性百分比的合适程序包括例如可获自美国政府的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)BLAST网站的BLAST程序套件。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN是用于比较核酸序列，而BLASTP是用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或MegAlign(可获自DNASTAR)是可用于比对序列的其他公开可得的软件程序。本领域技术人员可确定用于特定比对软件以求最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖但不限于包含与参考蛋白质、抗体或融合蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质、抗体或融合蛋白，所述不同之处在于在所述参考抗体、蛋白质或融合蛋白的氨基酸序列内或相邻的某些位置有一个或多个取代、缺失和/或添加。相较于参考抗体的氨基酸序列，变体的氨基酸序列中可包含一个或多个保守取代。保守取代可涉及例如类似地带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体、蛋白质或融合蛋白的抗原特异性结合的能力。术语变体也包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中的“肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes)”或“TIL”是指最初获得时是白血球但离开受试者的血流并且迁移至肿瘤中的细胞群体。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀手细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代和次级TIL。“原代TIL”是那些如本文所概述的获自患者组织样品(有时称为“新鲜获得”或“新鲜单离”)的TIL，而“次级TIL”是任何经本文所述的扩增或增生的TIL细胞群体，包括但不限于主体TIL、扩增的TIL(“REP TIL”)以及如本文中讨论的“reREP TIL”。reREP TIL可以包括例如第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如那些在图2A和/或图9步骤D中描述者，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(通过那些浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达一个或多个以下生物标志物来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外并且替代地，TIL可通过它们重新引入患者体内后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。TIL可进一步通过效力表征-例如，如果例如干扰素(IFN)释出大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，那么TIL可被认为有效。例如，如果干扰素(IFNγ)释出大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，那么TIL可被认为有效。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意图包括任何和所有溶剂、分散培养基、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂和惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑它在本发明的治疗组合物中的用途。另外的活性药物成分(诸如其他药物)也可并入所述的组合物和方法中。
术语“约”或“大约”意指在一个数值的具统计意义的范围内。此类范围可在给定数值或范围的一个数量级内，优选在50％以内，更优选在20％以内，更优选在10％以内，甚至更优选在5％以内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于特定研究系统，并且可被本领域技术人员轻易地了解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”意指尺寸、大小、制剂、参数、形状和其他量和特征并不精确而且不需要精确，但可视需要为近似值和/或较大或较小值，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等和本领域技术人员已知的其他因子。一般说来，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他量或特征皆为“约”或“大约”，无论是否如此明确说明。已注意到非常不同大小、形状和尺寸的实施方案可采用所述的安排。
当用于呈原始和修改形式的随附权利要求书中时，转折语“包含”、“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“由......组成(consisting of)”定义了权利要求的范围，即哪些未引述的附加权利要求要素或步骤(若有的话)被排除于权利要求的范围之外。术语“包含”意图为包括性或开放式并且不排除任何另外、未引述组件、方法、步骤或材料。术语“由......组成”排除任何不在权利要求中指明的组件、步骤或材料，并且在后者情况中排除与所指明的材料寻常相关的杂质。术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制在所指明的组件、步骤或材料和那些大体上不影响要求保护的发明的基本和新颖特征者。本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可在替代性实施方案中通过任何转折语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”更具体地定义。
II.TIL制造工艺(GEN3工艺的实施方案)
在不受任何特定理论限制下，据信如本发明方法所述的启动T细胞的活化的启动性第一次扩增，随后加强T细胞的活化的快速第二次扩增，允许制备保留“较年轻”表型的扩增的T细胞，并且因此预期本发明的扩增的T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞展现较高细胞毒性。特别是，据信如本发明方法所教导的通过暴露至抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和任选地抗原呈递细胞(APC)来预备T细胞的活化并且接着通过后续暴露至另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC来加强，限制或避免培养中T细胞的成熟，产生具有较不成熟表型的T细胞群体，所述T细胞较不因培养扩增而耗竭并且对癌细胞展现较高细胞毒性。在一些实施方案中，快速第二次扩增的步骤是分成以下多个步骤以达成培养规模纵向扩大(scaling up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约3至4天来执行快速第二次扩增，接着(b)实现小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)并且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤是分成以下多个步骤以达成培养规模横向扩大(scaling out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小规模培养中培养T细胞约3至4天来执行快速第二次扩增，接着(b)实现来自第一小规模培养中的T细胞转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在各第二容器中，经转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分是在第二小规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤是分成以下多个步骤以达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约3至4天来执行快速第二次扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的T细胞转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)的中，其中在各第二容器中，经转移至所述第二容器的来自小规模培养的T细胞部分是在较大规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤是分成以下多个步骤以达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约4天来执行快速第二次扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的T细胞转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)的中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自小规模培养的T细胞部分是在较大规模培养中培养约5天。
含有这些特征中的一些的示例性TIL工艺(称为工艺3，在本文中还称为GEN3)是描绘于图2A和图2C和/或图9中，并且本公开的这一实施方案的一些相较于工艺2A的优点是描述于图2B中。工艺3的两个实施方案显示于图2C中。工艺2A或Gen 2也描述于美国专利公布2018/.0280436中，其以全文引用的方式并入本文中。工艺3或Gen 3也描述于国际专利申请号PCT/US2019/059718(其以全文引用的方式并入本文中)以及本申请中所提供的图5、6、8、9、10和11中。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后执行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化已降低在或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后执行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化已降低在或约1％至100％范围内的百分比之后执行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化已降低在或约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％范围内的百分比之后执行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化已降低至少在或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％之后执行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增是在通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化已降低至多在或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后执行。
在一些实施方案中，通过启动性第一次扩增所实现的T细胞活化的降低是通过T细胞回应于抗原刺激所释出的干扰素γ的量的减少来确定。T细胞所释出的干扰素γ的水平相较于干扰素γ的初始或对照水平减少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和/或75％指示T细胞活化降低。T细胞所释出的干扰素γ的量减少至小于200pg/mL、小于250pg/mL、小于300pg/mL、小于350pg/mL、小于400pg/mL、小于450pg/mL、小于500pg/mL、小于550pg/mL、小于600pg/mL、小于650pg/mL、小于700pg/mL、小于750pg/mL、小于800pg/mL、小于850pg/mL、小于900pg/mL、小于950pg/mL或小于1000pg/mL指示T细胞活化降低。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在至多在或约7天或约8天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在至多在或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增是在至多在或约11天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增是在至多在或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增是在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在从在或约1天至在或约7天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在从在或约1天至在或约11天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在至多在或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在至多在或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或约11天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在从在或约1天至在或约8天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在从在或约1天至在或约9天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在8天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在9天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在从在或约1天至在或约7天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在从在或约1天至在或约9天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞的启动性第一次扩增是在7天的时间段内实施并且T细胞的快速第二次扩增是在9天的时间段内执行。
在一些实施方案中，T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，T细胞是骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。
在一些实施方案中，T细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方案中，T细胞获自罹患癌症的供体。
在一些实施方案中，T细胞是获自罹患癌症的患者所切除的肿瘤的TIL。
在一些实施方案中，T细胞是获自罹患血液恶性病的患者的骨髓的MIL。
在一些实施方案中，T细胞是获自来自供体的外周血单核细胞(PBMC)的PBL。在一些实施方案中，供体罹患癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体罹患肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤。一些实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方案中，供体罹患血液恶性病。
在本发明的某些方面，可使用熟练技术人员已知的多种技术，诸如FICOLL分离，从一单位的从受试者收集的血液获得免疫效应细胞(例如T细胞)。在一个优选的方面，来自受试者的循环血液中的细胞是通过单采获得。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核球、颗粒球、B细胞、其他有核白血球、红血球、和血小板。一方面，通过单采所收集的细胞可经洗涤以去除血浆部分并且任选地将细胞放置于适当缓冲液或培养基以供进行后续处理步骤。在一个实施方案中，细胞是经磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤。在一个替代性实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是所有的话)二价阳离子。一方面，T细胞是从外周血淋巴细胞分离，其中例如通过离心通过PERCOLL梯度或通过逆流离心淘析来溶解红血球并耗尽单核球。
在一些实施方案中，T细胞是从供体的全血或富含淋巴细胞的单采产物分离的PBL。在一些实施方案中，供体罹患癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体罹患肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤。一些实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方案中，供体罹患血液恶性病。在一些实施方案中，PBL是通过使用正向或负向选择方法从全血或富含淋巴细胞的单采产物单离，即，使用T细胞表型标志物例如CD3+CD45+取出PBL，或去除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施方案中，PBL是通过梯度离心单离。在单离来自供体组织的PBL后，PBL的启动性第一次扩增可根据本文所述的任何方法中的启动性第一次扩增步骤，通过将合适数目的经单离的PBL(在一些实施方案中，大约1×107个PBL)接种于启动性第一次扩增培养中来起始。
如本文中所讨论和大致概述的，TIL取自患者样品并且使用本文所述的TIL扩增过程操纵以在移植至患者中之前扩增它们的数目。在一些实施方案中，TIL任选地可如下文讨论经基因操纵。在一些实施方案中，TIL可在扩增之前或之后经冷冻保存。一旦解冻后，它们也可经再刺激以在输注至患者中之前增加它们的代谢。
在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，启动性第一次扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图2A步骤B所示的过程)缩短为1至8天并且快速第二次扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图2A步骤D所示的过程)缩短为1至9天。在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，启动性第一次扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图2A步骤B所示的过程)缩短为1至8天并且快速第二次扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图2A步骤D所示的过程)缩短为1至8天。在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，启动性第一次扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图2A步骤B所示的过程)缩短为1至7天并且快速第二次扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图2A步骤D所示的过程)缩短为1至9天。在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，启动性第一次扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图2A步骤B所示的过程)为1至7天并且快速第二次扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图2A步骤D所示的过程)是1至10天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)缩短为8天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是7至9天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是8天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是8至9天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)缩短为7天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是7至8天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)缩短为8天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是8天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是8天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是9天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是8天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是10天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是7天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是7至10天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是7天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是8至10天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)是7天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是9至10天。在一些实施方案中，启动性第一次扩增(例如，图2A步骤B所述的扩增)缩短为7天并且快速第二次扩增(例如，图2A步骤D所述的扩增)是7至9天。在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，启动性第一次扩增与快速第二次扩增(例如，如图2A步骤B和步骤D所述的扩增)的组合是14至16天。特别是，考虑本发明的某些实施方案包含启动性第一次扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原来活化。在某些实施方案中，如上文所述在启动性第一次扩增步骤中被活化的TIL是第一TIL群体，即，它们是原代细胞群体。
在一些实施方案中，TIL在第一次扩增之后并且在第二次扩增之前未进行存储，并且TIL直接进行第二次扩增(例如在一些实施方案中，在如图2A所示的从步骤B至步骤D的转变期间并未进行存储)。在一些实施方案中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自第一次扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二次扩增而无转变期。
在一些实施方案中，第一次扩增(例如根据图2A的步骤B)是在密闭系统生物反应器中执行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。
本文所提及的“步骤”名称A、B、C等参考图2A的非限制性实例并且参考本文所述的某些非限制性实施方案。下文和图2A中的步骤的顺序为示例性的并且本申请和本文所公开的方法考虑了步骤的任何组合或顺序以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.细胞活力分析
在启动性第一次扩增(有时称为初始主体扩增)之后可使用本领域中已知的标准分析来执行细胞活力分析。因此，在某些实施方案中，所述方法包括在启动性第一次扩增后执行细胞活力分析。在一些实施方案中，细胞活力分析可在第二次扩增之后(例如在REP之后)以及在最终收集之后执行。例如，可对主体TIL的样品进行台盼蓝排除分析，所述分析选择性标记死亡细胞并且允许活力评估。其他用于测试活力的分析可以包括但不限于阿尔玛蓝分析和MTT分析。
1.细胞计数、活力、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或活力。标志物(诸如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及任何其他本文所公开或描述者)的表达可通过流式细胞术使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)以抗体(例如但不限于可购自BD Bio-sciences(BDBiosciences,San Jose,CA)的那些)测量。细胞可使用抛弃式c-芯片血球计(VWR,Batavia,IL)手动计数并且活力可使用本领域中已知的任何方法(包括但不限于台盼蓝染色)来评估。细胞活力也可基于USSN15/863,634分析，其以全文引用的方式并入本文中。细胞活力也可基于美国专利公布号2018/0280436或国际专利公布号WO/2018/081473分析，两者皆出于所有目的全文并入本文中。
在一些情况下，主体TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可如下文所讨论进行REP并且接着冷冻保存。同样，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况中，主体或REP TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
III.TIL制造工艺(工艺2A的实施方案)
含有这些特征中的一些的示例性TIL工艺(称为工艺2A)描绘于图5中，并且本发明的这一实施方案的一些相较于工艺1C的差异和优点描述于图6以及图11中。工艺1C显示于图6、7和10中以供比较。工艺2A的实施方案显示于图6以及图5、9、10和11中。图10和11进一步提供示例性2A工艺与示例性1C工艺的比较。
如本文中所讨论，本发明可以包括关于再刺激冷冻保存的TIL的步骤，以增加它们的代谢活性和因此在移植至患者中之前的相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自患者样品并且经操纵以在移植至患者中之前扩增它们的数目。在一些实施方案中，TIL任选地可如下文讨论经基因操纵。
在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存。一旦解冻后，它们也可经再刺激以在输注至患者中之前增加它们的代谢。
在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，第一次扩增(包括称为REP前的过程以及图9步骤A所示的过程)缩短至3-14天并且第二次扩增(包括称为REP的过程以及图9步骤B所示的过程)缩短至7-14天。在一些实施方案中，第一次扩增(例如，图9步骤B所述的扩增)缩短至11天并且第二次扩增(例如，图9步骤D所述的扩增)缩短至11天，如实施例中所讨论并且显示于图5、6、8、9、10和11中。在一些实施方案中，如下文以及实施例和图式中详细讨论，第一次扩增与第二次扩增(例如，如图9步骤B和步骤D所述的扩增)的组合缩短为22天。
下文“步骤”名称A、B、C等参考图9并且参考本文所述的某些实施方案。下文和图9中的步骤的顺序为示例性的并且本申请和本文所公开的方法考虑了步骤的任何组合或顺序以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样品
一般说来，TIL最初获自患者肿瘤样品并且接着扩增成较大群体以进行如本文所述的进一步操纵，任选地经冷冻保存、如本文所概述的再刺激和任选地评估表型和作为TIL健康的指标的代谢参数。
患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由手术切除、细针活组织检查、粗针活组织检查、小活组织检查或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段。在一些实施方案中，使用多病灶取样。在一些实施方案中，手术切除、细针活组织检查、粗针活组织检查、小活组织检查或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段包括多病灶取样(即，从患者的一个或多个肿瘤部位和/或位置以及在相同位置或近距离的一个或多个肿瘤获得样品)。一般说来，肿瘤样品可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，诸如获自血液恶性病的肿瘤。实体肿瘤可为肺部组织。在一些实施方案中，有用的TIL获自非小细胞肺癌(NSCLC)。
一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器解剖被片段化成介于1至约8mm3之间的小块，并且约2至3mm3特别有用。在一些实施方案中，使用酶促肿瘤消化物由这些片段培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶促培养基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL的DNA酶和1.0mg/mL的胶原酶)中孵育，随后机械解离(例如使用组织解离器)而产生。肿瘤消化物可通过将肿瘤放入酶促培养基中并且机械解离肿瘤大约1分钟，随后在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环直至只有小组织块存在而产生。在这一过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量的红血球或死亡细胞，那么可使用FICOLL分支链亲水性多醣来执行密度梯度分离以去除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，诸如那些在美国专利申请公布号2012/0244133A1中描述者，其公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法均可用于本文所述的任何实施方案中的扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可以包括一种或多种解离(消化)酶，诸如但不限于胶原酶(包括胶原酶的任何掺合物或类型)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻璃酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳酶、木瓜凝乳酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白水解酶和它们的任何组合。
在一些实施方案中，解离酶是从冻干的酶重构。在一些实施方案中，冻干的酶是以一定量的无菌缓冲液(诸如HBSS)重构。
在一些情况下，胶原酶(诸如无动物1型胶原酶)是以10mL的无菌HBSS或另一缓冲液重构。冻干的原液酶的浓度可为2892PZ U/小瓶。在一些实施方案中，胶原酶是以5mL至15mL缓冲液重构。在一些实施方案中，在重构后，胶原酶原液的范围从约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZU/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶是以1mL的无菌HBSS或另一缓冲液重构。冻干的原液酶的浓度可为175DMC U/小瓶。在一些实施方案中，在重构后，中性蛋白酶原液的范围从约100DMC/mL至约400DMC/mL，例如约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I是以1mL的无菌HBSS或另一缓冲液重构。冻干的原液酶的浓度是4KU/小瓶。在一些实施方案中，在重构后，DNA酶I原液的范围从约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶原液是可变的并且可能需要测定浓度。在一些实施方案中，冻干的原液的浓度可经验证。在一些实施方案中，添加至消化混合液中的酶的最终量是基于所测定的原液浓度进行调整。
在一些实施方案中，酶混合物包括在约4.7mL的无菌HBSS中的约10.2-ul的中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL的胶原酶(1.2PZ/mL)和250-ul的DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指示，在一些实施方案中，TIL是衍生自实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化并且以全肿瘤进行酶促消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和玻璃酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和玻璃酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和玻璃酸酶的酶混合物中在37℃、5％ CO2下消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和玻璃酸酶的酶混合物中在37℃、5％ CO2、旋转下消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％ CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，全肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，肿瘤是以冻干的酶在无菌缓冲液中重构。在一些实施方案中，缓冲液是无菌HBSS。
在一些实施方案中，酶混合物包含胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是胶原酶IV。在一些实施方案中，胶原酶的工作原液是100mg/mL 10X工作原液。
在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作原液是10,000IU/mL 10X工作原液。
在一些实施方案中，酶混合物包含玻璃酸酶。在一些实施方案中，玻璃酸酶的工作原液是10-mg/mL 10X工作原液。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原酶、1000IU/mL DNA酶和1mg/mL玻璃酸酶。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原酶、500IU/mL DNA酶和1mg/mL玻璃酸酶。
一般说来，将收集到的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如解剖以及消化。在一些实施方案中，片段化是物理片段化。在一些实施方案中，片段化是解剖。在一些实施方案中，片段化是通过消化。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养。在一个实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养。
在一些实施方案中，当肿瘤是实体肿瘤时，在例如(如图1中所提供的)步骤A中获得肿瘤样品后，对肿瘤进行物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化发生在获得肿瘤之后并且不进行任何冷冻保存。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将10、20、30、40或更多个片段或块放入各容器进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将30或40个片段或块放入各容器进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将40个片段或块放入各容器进行第一次扩增。在一些实施方案中，多个片段包含约4至约50个片段，其中各片段具有约27mm3的体积。在一些实施方案中，多个片段包含约30至约60个片段，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个片段包含约4个片段。
在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段是通过锐器解剖获得。在一些实施方案中，肿瘤片段是介于约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段是介于约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段是约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段是约10mm3。在一些实施方案中，肿瘤是1-4mm x 1-4mm x 1-4mm。在一些实施方案中，肿瘤是1mm x 1mm x 1mm。在一些实施方案中，肿瘤是2mm x 2mm x 2mm。在一些实施方案中，肿瘤是3mm x 3mm x 3mm。在一些实施方案中，肿瘤是4mm x 4mm x 4mm。
在一些实施方案中，切除肿瘤以便最小化各块上的出血性、坏死和/或脂肪组织的量。在一些实施方案中，切除肿瘤以便最小化各块上的出血性组织的量。在一些实施方案中，切除肿瘤以便最小化各块上的坏死组织的量。在一些实施方案中，切除肿瘤以便最小化各块上的脂肪组织的量。
在一些实施方案中，执行肿瘤片段化以便维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀执行锯切动作的情况下执行肿瘤片段化。在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，肿瘤消化物通过在例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶的酶培养基中孵育，随后机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)而产生。在将肿瘤放入酶培养基后，可将肿瘤机械解离大约1分钟。接着可将溶液在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，并且接着再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再孵育30分钟后，可将肿瘤机械破坏第三次持续大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后，如果大块组织仍然存在，那么施加1或2次另外的机械解离至样品，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施方案中，在最终孵育结束时，如果细胞悬浮液含有大量的红血球或死亡细胞，那么可使用Ficoll来执行密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，将第一次扩增步骤之前收集到的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施方案中，细胞可在样品收集后任选地冷冻并且在进入步骤B描述的扩增之前冷冻存储，所述步骤B在下文中更详细描述并且在图9中例示。
1.胸腔积液T细胞和TIL
在一些实施方案中，样品是胸膜液样品。在一些实施方案中，用于根据本文所述的过程扩增的T细胞TIL的来源是胸膜液样品。在一些实施方案中，样品是胸腔积液衍生样品。在一些实施方案中，用于根据本文所述的过程扩增的T细胞或TIL的来源是胸腔积液衍生样品。参见例如美国专利公布号US 2014/0295426中所述的方法，该案出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可采用任何疑似和/或含有TIL的胸膜液或胸腔积液。此类样品可衍生自原发性或转移性肺癌，诸如NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，样品可为源自另一器官例如乳房、卵巢、结肠或前列腺的继发性转移性癌细胞。在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法的样品是胸膜渗出液。在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法的样品是胸膜漏出液。其他生物样品可以包括其他含有TIL的浆液，包括例如腹部的腹水或胰囊肿液。腹水和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺部皆具有间皮细胞系并且在恶性病中以相同情况在胸膜空间和腹部空间形成液体并且此类液体在一些实施方案中含有TIL。在一些实施方案中，其中本公开以胸膜液为例，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液执行相同方法以得到类似结果。
在一些实施方案中，胸膜液是呈未处理、直接从患者去除的形式。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未处理的胸膜液放入标准血液收集管(诸如EDTA或肝素管)中。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未处理的胸膜液放入标准
Figure BDA0004012625820000681
管(Veridex)中。在一些实施方案中，从患者收集之后立即将样品放入CellSave管以避免存活TIL的数目降低。如果留在未处理的胸膜液中，即使在4℃下，存活TIL的数目也可在24小时内降低至显著程度。在一些实施方案中，在从患者去除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内，将样品放入适当收集管中。在一些实施方案中，在4℃下从患者去除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内，将样品放入适当收集管中。
在一些实施方案中，可将来自所选受试者的胸膜液样品稀释。在一个实施方案中，稀释是1:10胸膜液对稀释剂。在另一实施方案中，稀释是1:9胸膜液对稀释剂。在另一实施方案中，稀释是1:8胸膜液对稀释剂。在另一实施方案中，稀释是1:5胸膜液对稀释剂。在另一实施方案中，稀释是1:2胸膜液对稀释剂。在另一实施方案中，稀释是1:1胸膜液对稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方案中，从患者收集和稀释之后立即将样品放入CellSave管中以避免存活TIL的降低，如果留在未处理的胸膜液中，即使在4℃下，存活TIL的降低也可在24至48小时内发生至显著程度。在一些实施方案中，在从患者去除和稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内，将胸膜液样品放入适当收集管中。在一些实施方案中，在4℃下从患者去除和稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内，将胸膜液样品放入适当收集管中。
在另一实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，胸膜液的这一预处理在其中胸膜液必须经冷冻保存以供运输至执行所述方法的实验室或供稍后分析(例如晚于收集后24至48小时)的情况下是优选的。在一些实施方案中，胸膜液样品是通过从受试者抽出胸膜液样品之后将其离心并且将离心分离物或集结粒再悬浮于缓冲液中来制备。在一些实施方案中，胸膜液样品进行多次离心和再悬浮，然后经冷冻保存以供运送或稍后分析和/或处理。
在一些实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的胸膜液样品是通过使液体经由含有已知并且基本上一致孔径以允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞的过滤器过滤来制备。在一些实施方案中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在另一实施方案中，孔直径可为5μM或超过5μM，并且在其他实施方案中为6、7、8、9或10μM中任一者。在过滤之后，可将由膜所保留的细胞(包括TIL)冲洗脱离膜至合适生理学上可接受的缓冲液中。以这种方式浓缩的细胞(包括TIL)接着可用于所述方法的接触步骤中。
在一些实施方案中，使胸膜液样品(包括例如未处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮细胞集结粒与差别性溶解存在于样品中的无核红血球的溶解试剂接触。在一些实施方案中，这一步骤是在其中胸膜液含有大量RBC的情况下在进一步处理步骤之前执行。合适溶解试剂包括单一溶解试剂或溶解试剂和淬灭试剂或溶解剂、淬灭试剂和固定试剂。合适溶解系统在市面上有售并且包括BD Pharm LyseTM系统(Becton Dickenson)。其他溶解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(Beckman Coulter,Inc.)或氯化铵系统。在一些实施方案中，溶解试剂可随主要需求为有效溶解红血球和保留胸膜液中的TIL和TIL的表型性质而异。除了采用单一溶解试剂之外，可用于本文所述的方法中的溶解系统可以包括第二试剂，例如在所述方法的剩余步骤期间淬灭或阻滞溶解试剂的效应者，例如StabilyseTM试剂(BeckmanCoulter,Inc.)。取决于溶解试剂的选择或所述方法的优选实施，也可采用常规固定试剂。
在一些实施方案中，如上文所述的未处理、经稀释或经多次离心或处理的胸膜液样品在经进一步处理和/或本文所提供的扩增之前是在约-140℃的温度下冷冻保存。
B.步骤B：第一次扩增
1.年轻TIL
在一些实施方案中，本发明方法提供获得年轻TIL，所述年轻TIL在施用于受试者/患者后能够增加复制周期并且因此相较于较老TIL(即在施用于受试者/患者之前已进一步经历更多次复制的TIL)可能提供另外的治疗益处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia等人,Scandinavian Journal of Immunology,75:157-167(2012)；Dudley等人,ClinCancer Res,16:6122-6131(2010)；Huang等人,J Immunother,28(3):258-267(2005)；Besser等人,Clin Cancer Res,19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人,J Immunother 32:415-423(2009)；Robbins等人,J Immunol 2004；173:7125-7130；Shen等人,J Immunother,30:123-129(2007)；Zhou等人,J Immunother,28:53-62(2005)；和Tran等人,JImmunother,31:742-751(2008)，所有文献皆以全文引用的方式并入本文中。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(接合区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生展现并且增加T细胞谱系多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL，展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL相较于新鲜收集的TIL和/或使用称为工艺1C的方法(如在图10所例示者)制备的TIL，展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，在第一次扩增中获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
在例如图9步骤A所述的解剖或消化肿瘤片段之后，在有利于TIL但不利于肿瘤和其他细胞的生长的条件下在含有IL-2的血清中培养所得细胞。在一些实施方案中，在2mL孔中的包含失活人AB血清和6000IU/mL IL-2的培养基中孵育肿瘤消化物。将这一原代细胞群体培养数天的时间段(通常3-14天)，导致通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将这一原代细胞群体培养7-14天的时间段，导致通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将这一原代细胞群体培养10-14天的时间段，导致通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将这一原代细胞群体培养约11天的时间段，导致通常约1×108主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一个优选实施方案中，TIL的扩增可使用如以下和本文所述的初始主体TIL扩增步骤(例如那些图9步骤B中所述者，其可以包括称为REP前的过程)执行，随后执行如以下步骤D和本文所述的第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后执行任选的冷冻保存，和随后执行如以下和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自这一过程的TIL可任选地表征如本文所述的表型特征和代谢参数。
在TIL培养起始于24孔板(例如使用Costar 24孔平底细胞培养板(CorningIncorporated,Corning,NY))的实施方案中，各孔可在含IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.,Emeryville,CA)的2mL完全培养基(CM)中接种1×106个肿瘤消化细胞或一个肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段介于约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM是由补充有10％人AB血清、25mM HEPES和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在培养起始于具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气烧瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)的实施方案中(图1)，各烧瓶在10-40mL的含IL-2的CM中装载10-40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤片段。G-Rex10和24孔板皆在37℃、5％ CO2的潮湿孵育箱中孵育，在培养起始后5天，将一半的培养基去除并置换成新鲜CM和IL-2，并且在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。
在制备肿瘤片段后，在有利于TIL但不利于肿瘤和其他细胞生长的条件下在含有IL-2的血清中培养所得细胞(即片段)。在一些实施方案中，在2mL孔中的包含失活人AB血清(或在一些如本文所概述的情况下，在aAPC细胞群体存在下)和6000IU/mL IL-2的培养基中孵育肿瘤消化物。将这一原代细胞群体培养数天的时间段(通常10-14天)，导致通常约1×108主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，在第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体。在一些实施方案中，所述IL是重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，用于1mg小瓶的IL-2原液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，用于1mg小瓶的IL-2原液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，用于1mg小瓶的IL-2原液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，用于1mg小瓶的IL-2原液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，IL-2原液具有4-8×106IU/mg的IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2原液具有5-7×106IU/mg的IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2原液具有6×106IU/mg的IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2原液是如实施例4所述来制备。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL的IL-2、约9,000IU/mL的IL-2、约8,000IU/mL的IL-2、约7,000IU/mL的IL-2、约6000IU/mL的IL-2或约5,000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL的IL-2至约5,000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在优选实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于1000与2000IU/mL之间、介于2000与3000IU/mL之间、介于3000与4000IU/mL之间、介于4000与5000IU/mL之间、介于5000与6000IU/mL之间、介于6000与7000IU/mL之间、介于7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL之间和介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体是莫罗单抗。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种TNFRSF促效剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF促效剂包含4-1BB促效剂。在一些实施方案中，TNFRSF促效剂是4-1BB促效剂，并且4-1BB促效剂是选自由乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白和它们的片段、衍生物、变体、生物类似物和组合组成的组。在一些实施方案中，TNFRSF促效剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成介于0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF促效剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成介于20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF促效剂之外，细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中一种或多种TNFRSF促效剂包含4-1BB促效剂。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，它被称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM是由补充有10％人AB血清、25mMHEPES和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在培养起始于具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气烧瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)的实施方案中(图1)，各烧瓶在10-40mL的含IL-2的CM中装载10-40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤片段。G-Rex10和24孔板皆在37℃、5％ CO2的潮湿孵育箱中孵育，在培养起始后5天，将一半的培养基去除并置换成新鲜CM和IL-2，并且在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。在一些实施方案中，CM是实施例中所述的CM1，参见实施例5。在一些实施方案中，第一次扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中发生。在一些实施方案中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，第一次扩增(包括例如那些在图9步骤B中所述者的过程，其可以包括那些有时称为REP前的过程)过程缩短至3-14天，如实施例和图式中所讨论。在一些实施方案中，第一次扩增(包括例如那些在图9步骤B中所述者的过程，其可以包括那些有时称为REP前的过程)缩短至7-14天，如图5、6、8、9、10和11所示，以及包括例如图9步骤B所述的扩增。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至10-14天，如图5、6、8、9、10和11所示。在一些实施方案中，第一次扩增缩短至11天，如图5、6、8、9、10和11所示，以及包括例如图9步骤B所述的扩增。
在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可包括在第一次扩增期间，包括例如在根据图9以及本文所述的步骤B工艺期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可包括在根据图9以及本文所述的步骤B工艺期间。
在一些实施方案中，第一次扩增(包括称为REP前的过程；例如根据图9的步骤B)过程缩短至3-14天，如图式中所讨论。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至7-14天，如图5、6、8、9、10和11所示。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至10-14天，如图5、6、8、9、10和11所示。在一些实施方案中，第一次扩增缩短至11天，如图5、6、8、9、10和11所示。
在一些实施方案中，第一次扩增(例如根据图9的步骤B)是在密闭系统生物反应器中执行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。
1.细胞因子和其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所知。
或者，使用细胞因子的组合以进行TIL的快速扩增和或第二次扩增是另外可能的，如同美国专利申请公布号US 2017/0107490 A1中所述的IL-2、IL-15和IL-21中的两种或更多种的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2或IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞产生，并且特别是如其中所述的T细胞。
在一个实施方案中，步骤B也可以包括添加OKT-3抗体或莫罗单抗至如本文中别处所述的培养基。在一个实施方案中，步骤B也可以包括添加4-1BB促效剂至如本文中别处所述的培养基。在一个实施方案中，步骤B也可以包括添加OX-40促效剂至如本文中别处所述的培养基。在其他实施方案中，添加剂诸如过氧化物酶体增生活化受体γ辅活化子I-α-促效剂(包括增生活化受体(PPAR)-γ促效剂，诸如四氢噻唑二酮化合物)可用于步骤B期间的培养基，如美国专利申请公布号US 2019/0307796 A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)所述。
C.步骤C：第一次扩增至第二次扩增的转变
在一些情况下，获自第一次扩增的主体TIL群体(包括例如获自例如图9所示的步骤B的TIL群体)可使用下文所讨论的方案立即进行冷冻保存。或者，获自第一次扩增的TIL群体(称为第二TIL群体)可进行第二次扩增(其可以包括有时称为REP的扩增)并且接着如下文所讨论进行冷冻保存。同样，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况中，第一TIL群体(有时称为主体TIL群体)或第二TIL群体(其在一些实施方案中可以包括称为REP TIL群体的群体)可在扩增之前或在第一次扩增之后并且在第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适治疗。
在一些实施方案中，获自第一次扩增(例如图9所示的步骤B)的TIL是经存储直至为了选择而分析表型。在一些实施方案中，获自第一次扩增(例如图9所示的步骤B)的TIL未进行存储并且直接进行第二次扩增。在一些实施方案中，获自第一次扩增的TIL在第一次扩增之后并且在第二次扩增之前未进行冷冻保存。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约3天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约4天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约4天至10天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约7天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的约14天。
在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的3天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的4天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的5天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的6天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的7天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的8天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的9天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的10天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的11天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的12天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的13天至14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的14天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的1天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的2天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的3天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的4天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的5天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的6天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的7天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的8天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的9天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的10天至11天。在一些实施方案中，从第一次扩增转变至第二次扩增发生在当片段化发生后的11天。
在一些实施方案中，TIL在第一次扩增之后并且在第二次扩增之前未进行存储，并且TIL直接进行第二次扩增(例如在一些实施方案中，在如图9所示的从步骤B至步骤D的转变期间并未进行存储)。在一些实施方案中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自第一次扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二次扩增而无转变期。
在一些实施方案中，从第一次扩增至第二次扩增的转变(例如根据图9的步骤C)是在密闭系统生物反应器中执行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。
D.步骤D：第二次扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群体在收集和初始主体处理(例如图9所示的步骤A和步骤B)和转变(称为步骤C)之后数目扩增。这种进一步扩增在本文中称为第二次扩增，其可以包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP；如图9步骤D所示的过程)的扩增过程。第二次扩增通常使用包含一些组分(包括喂养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。
在一些实施方案中，TIL的第二次扩增或第二TIL扩增(其可以包括有时称为REP的扩增；以及如图9步骤D所示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL烧瓶或容器来执行。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约14天。
在一个实施方案中，第二次扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图9步骤D所示的过程)来执行。例如，TIL可在白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增。非特异性T细胞受体刺激可以包括例如抗CD3抗体(诸如约30ng/ml的OKT3)、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)或UHCT-1(可购自BioLegend,San Diego,CA,USA)。TIL可通过在第二次扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括它们的抗原部分，诸如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原可任选地在T细胞生长因子诸如300IU/mL IL-2或IL-15存在下任选地从载体，诸如人白血球抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)表达。其他合适抗原可以包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或它们的抗原部分。TIL也可通过用脉冲至HLA-A2表达性抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激来快速扩增。或者，TIL可进一步用例如经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方案中，第二次扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下发生。
在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于1000与2000IU/mL之间、介于2000与3000IU/mL之间、介于3000与4000IU/mL之间、介于4000与5000IU/mL之间、介于5000与6000IU/mL之间、介于6000与7000IU/mL之间、介于7000与8000IU/mL之间或介于8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL之间和介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT3抗体。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可包括在第二次扩增期间，包括例如在根据图9以及本文所述的步骤D工艺期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可包括在根据图9以及如本文所述的步骤D工艺期间。
在一些实施方案中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递喂养细胞的经补充的细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二次扩增在经补充的细胞培养基中发生。在一些实施方案中，经补充的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递喂养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；还称为抗原呈递喂养细胞)。在一些实施方案中，第二次扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递喂养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一些实施方案中，抗原呈递喂养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL对PBMC和/或抗原呈递细胞的比率是约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL对PBMC的比率是介于1:50与1:300之间。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL对PBMC的比率是介于1:100与1:200之间。
在一个实施方案中，REP和/或第二次扩增是在烧瓶中执行，其中主体TIL与100或200倍过量的失活喂养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合。置换培养基(通常经由抽吸新鲜培养基来置换2/3培养基)直至细胞转移至替代性生长室。替代性生长室包括G-REX烧瓶和如下文更充分讨论的透气容器。
在一些实施方案中，第二次扩增(其可以包括称为REP过程的过程)缩短至7-14天，如实施例和图式中所讨论。在一些实施方案中，第二次扩增缩短至11天。
在一个实施方案中，REP和/或第二次扩增可使用T-175烧瓶和如先前所述的透气袋(Tran等人,J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42)或透气培养器皿(G-Rex烧瓶)来执行。在一些实施方案中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)是在T-175烧瓶中执行，并且可将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至各T-175烧瓶中。TIL可在CM和AIM-V培养基的1:1混合物中培养，所述混合物补充有每mL3000IU的IL-2和每ml 30ng的抗CD3。T-175烧瓶可在37℃下在5％ CO2中孵育。一半的培养基可在第5天使用含有每mL 3000IU的IL-2的50/50培养基交换。在一些实施方案中，在第7天可将来自两个T-175烧瓶的细胞组合于3L袋中并将300mL含有5％人AB血清和每mL3000IU的IL-2的AIM V添加至300ml的TIL悬浮液中。各袋中的细胞数目每天或每两天计算一次，并且添加新鲜培养基以保持细胞计数介于0.5与2.0×106个细胞/mL之间。
在一个实施方案中，第二次扩增(其可以包括称为REP的扩增，以及那些在图9步骤D中提及者)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气烧瓶(G-Rex 100，可购自WilsonWolf Manufacturing Corporation,New Brighton,MN,USA)中执行，5×106或10×106个TIL可与PBMC在400mL的补充有5％人AB血清、每mL 3000IU的IL-2和每ml 30ng的抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-Rex 100烧瓶可在37℃下在5％ CO2中孵育。在第5天，可取出250mL的上清液并放入离心瓶并且在1500rpm(491×g)下离心10分钟。可用150mL的含有5％人AB血清、每mL 3000IU的IL-2的新鲜培养基使TIL集结粒再悬浮，并添加回原始G-Rex 100烧瓶。当TIL在G-Rex 100烧瓶中连续扩增时，在第7天可将各G-Rex 100中的TIL悬浮于存在于各烧瓶中的300mL培养基中，并且可将细胞悬浮液分成可用于接种3个G-Rex 100烧瓶的3个100mL等分试样。接着可将150mL的含有5％人AB血清和每mL 3000IU的IL-2的AIM-V添加至各烧瓶。G-Rex 100烧瓶可在37℃下在5％ CO2中孵育，并且在4天之后可将150mL的含有每mL 3000IU的IL-2的AIM-V添加至各G-REX100烧瓶。可在培养的第14天收集细胞。
在一个实施方案中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)是在烧瓶中执行，其中主体TIL与100或200倍过量的失活喂养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合。在一些实施方案中，进行培养基置换直至细胞转移至替代性生长室。在一些实施方案中，通过抽吸新鲜培养基置换掉2/3的培养基。在一些实施方案中，替代性生长室包括G-REX烧瓶和如下文更充分讨论的透气容器。
在一个实施方案中，执行第二次扩增(包括称为REP的扩增)并且它还包含其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公布号2016/0010058A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)所述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
任选地，在第二次扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后可使用本领域中已知的标准分析来执行细胞活力分析。例如，可对主体TIL的样品进行台盼蓝排除分析，所述分析选择性标记死亡细胞并且允许活力评估。在一些实施方案中，TIL样品可使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)计数并确定活力。在一些实施方案中，活力是根据例如实施例15所述的细胞计数器K2Image Cytometer自动细胞计数器方案确定。
在一些实施方案中，TIL的第二次扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran KQ,Zhou J,Durflinger KH等人,2008,J Immunother.,31:742-751和Dudley ME,Wunderlich JR,Shelton TE等人2003,J Immunother.,26:332-342)或透气G-Rex烧瓶来执行。在一些实施方案中，第二次扩增使用烧瓶来执行。在一些实施方案中，第二次扩增使用透气G-Rex烧瓶来执行。在一些实施方案中，第二次扩增是在T-175烧瓶中执行，并且约1×106个TIL悬浮于150mL培养基中并且将其添加至各T-175烧瓶中。将TIL与作为“喂养”细胞的经照射(50Gy)的同种异体PBMC以1:100的比率培养，并且在补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养细胞。T-175烧瓶是在37℃下在5％ CO2中孵育。在一些实施方案中，在第5天使用含有3000IU/mL的IL-2的50/50培养基更换一半的培养基。在一些实施方案中，在第7天将来自2个T-175烧瓶的细胞组合于3L袋中，并将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL的IL-2的AIM-V添加至300mL的TIL悬浮液。各袋中的细胞数目可每天或每两天计算一次，并且可添加新鲜培养基以保持细胞计数介于约0.5与约2.0×106个细胞/mL。
在一些实施方案中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在500mL容量的具有100cm2透气硅底的烧瓶(G-Rex 100,Wilson Wolf)中执行(图1)，将约5×106或10×106个TIL与经照射的同种异体PBMC以1:100的比率在400mL的补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3的50/50培养基中培养。G-Rex 100烧瓶是在37℃下在5％ CO2中孵育。在一些实施方案中，在第5天取出250mL的上清液并放入离心瓶并且在1500rpm(491g)下离心10分钟。接着可用150mL的含有3000IU/mL的IL-2的新鲜50/50培养基使TIL集结粒再悬浮，并添加回原始G-Rex 100烧瓶。在其中在G-Rex 100烧瓶中连续扩增TIL的实施方案中，在第7天将各G-Rex100中的TIL悬浮于存在于各烧瓶中的300mL培养基中，并且将细胞悬浮液分成用于接种3个G-Rex 100烧瓶的三个100mL等分试样。接着将150mL的含有5％人AB血清和3000IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各烧瓶。G-Rex 100烧瓶在37℃下在5％ CO2中孵育，并且在4天之后将150mL的含有3000IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100烧瓶。在培养的第14天收集细胞。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(接合区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生展现并且增加T细胞谱系多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，在第二次扩增中获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细讨论的抗原呈递喂养细胞(APC)。
在一些实施方案中，第二次扩增(例如根据图9的步骤D)是在密闭系统生物反应器中执行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。
1.喂养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方案中，本文所述的第二次扩增程序(例如包括诸如那些在图9步骤D中所述者以及那些称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间需要过量的喂养细胞。在许多实施方案中，喂养细胞是获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离获得。
一般说来，同种异体PBMC是经由照射或热处理失活，并且用于REP程序，如实施例(特别是实施例14)所述，所述实施例提供用于评估照射同种异体PBMC的复制不能的示例性方案。
在一些实施方案中，如果第14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养中的初始活细胞数目，那么认为PBMC是复制不能并且接受其用于本文所述的TIL扩增程序。参见例如实施例14。
在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养中的初始活细胞数目增加，那么认为PBMC是复制不能并且接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下进行培养。参见例如实施例13。
在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养中的初始活细胞数目增加，那么认为PBMC是复制不能并且接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在5至60ng/ml OKT3抗体和1000至6000IU/ml IL-2存在下进行培养。在一些实施方案中，PBMC在10至50ng/ml OKT3抗体和2000至5000IU/ml IL-2存在下进行培养。在一些实施方案中，PBMC在20至40ng/ml OKT3抗体和2000至4000IU/ml IL-2存在下进行培养。在一些实施方案中，PBMC在25至35ng/ml OKT3抗体和2500至3500IU/ml IL-2存在下进行培养。
在一些实施方案中，抗原呈递喂养细胞是PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递喂养细胞是人工抗原呈递喂养细胞。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL对抗原呈递喂养细胞的比率是约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL对抗原呈递喂养细胞的比率是介于1:50和1:300之间。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL对抗原呈递喂养细胞的比率是介于1:100和1:200之间。
在一个实施方案中，本文所述的第二次扩增程序需要约2.5×109个喂养细胞对约100×106个TIL的比率。在另一实施方案中，本文所述的第二次扩增程序需要约2.5×109个喂养细胞对约50×106个TIL的比率。在另一实施方案中，本文所述的第二次扩增程序需要约2.5×109个喂养细胞对约25×106个TIL。
在一个实施方案中，本文所述的第二次扩增程序在第二次扩增期间需要过量的喂养细胞。在许多实施方案中，喂养细胞是获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。
一般说来，同种异体PBMC经由辐照或热处理失活，并且用于本文所述的TIL扩增程序，包括在图5、6、8、9、10和11中所述的示例性程序。
在一个实施方案中，在第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞来置换PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所知。
或者，使用细胞因子的组合以进行TIL的快速扩增和或第二次扩增是另外可能的，如同大致上在国际专利公布号WO 2015/189356和W国际专利公布号WO 2015/189357中概述的IL-2、IL-15和IL-21中的两种或更多种的组合，所述国际专利公布由此明确地以全文引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞产生，并且特别是如其中所述的T细胞。
3.抗CD3抗体
在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法(包括称为REP的那些，参见例如图9)中的培养基也包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合诱导TIL群体中的T细胞活化和细胞分裂。这种效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab’)2片段，前者通常是优选的；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，由此以全文引用的方式并入。
本领域技术人员应理解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠科动物、人、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在具体实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)。
E.步骤E：收集TIL
在第二次扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施方案中，在例如图9所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如图9所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。
TIL可以任何适当并且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法是本领域中众所周知的并且本过程可采用任何所述已知的方法。在一些实施方案中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自多个来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方案中，细胞收集是经由细胞处理系统诸如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可将包含细胞的溶液泵送通过无菌和/或密闭系统环境中的膜或过滤器(诸如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以在无需集结粒化下去除上清液或细胞培养基。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中执行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，收集(例如根据图9的步骤E)是在密闭系统生物反应器中执行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。
F.步骤F：最终制剂/转移至输注袋
在如图9以示例性顺序提供并且如以上和本文详细概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器以用于施用于患者。在一些实施方案中，一旦使用上述的扩增方法获得治疗学上足够数目的TIL后，将它们转移至容器以用于施用于患者。
在一个实施方案中，使用本公开的APC扩增的TIL是作为药物组合物施用于患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，T细胞是作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内。
1.药物组合物、剂量和给药方案
在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL是作为药物组合物施用于患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，T细胞是作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。
可施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是如果癌症是黑素瘤。在一个实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约7.8×1010个TIL，特别是癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的数目是约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一个实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的数目是在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013范围内。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的浓度是小于例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的浓度是大于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的浓度是在约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的药物组合物范围内。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的浓度是在约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的药物组合物范围内。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中所提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
在本发明的药物组合物中所提供的TIL在宽广剂量范围内有效。精确剂量将取决于施用途径、化合物的施用形式、待治疗的受试者的性别和年龄、待治疗的受试者的体重和主治医师的偏好和经验。适当时也可使用TIL的临床建立剂量。使用本文中的方法所施用的药物组合物的量(诸如TIL的剂量)将取决于正在治疗的人或哺乳动物、病症或疾患的严重性、施用速率、活性药物成分的部署和处方医师的考量。
在一些实施方案中，TIL可以单一剂量施用。此类施用可为注射，例如静脉内注射。在一些实施方案中，TIL可以多个剂量施用。给药可为每年1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。给药可为一个月一次、每二周一次、每周一次或每两天一次。TIL的施用可视需要继续进行。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量是约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量是在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量是在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量是在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg范围内。
有效量的TIL可以单一或多个剂量经由具有类似效用的剂的任何可接受的施用模式施用，包括鼻内和透皮途径、经由动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、表面、经由移植或经由吸入。
G.任选的细胞活力分析
任选地，在第一次扩增步骤B之后可使用本领域中已知的标准分析来执行细胞活力分析。例如，可对主体TIL的样品进行台盼蓝排除分析，所述分析选择性标记死亡细胞并且允许活力评估。其他用于测试活力的分析可以包括但不限于阿尔玛蓝分析和MTT分析。
1.细胞计数、活力、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或活力。标志物(诸如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及任何其他本文公开或描述者)的表达可通过流式细胞术使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)以抗体(例如但不限于可购自BD Bio-sciences(BD Biosciences,San Jose,CA)的那些)测量。细胞可使用抛弃式c-芯片血球计(VWR,Batavia,IL)手动计数并且活力可使用本领域中已知的任何方法(包括但不限于台盼蓝染色)来评估。
在一些情况下，主体TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可如下文所讨论进行REP并且接着冷冻保存。同样，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况中，主体或REP TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
2.细胞培养
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法可以包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一个实施方案中，扩增TIL数目使用不超过一种细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)。在这点上，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一个实施方案中，扩增TIL数目可包括频繁性不超过每三或四天一次地添加新鲜细胞培养基至细胞(还称为喂养细胞)。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基是未过滤的。使用未过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯乙醇(BME)。
在一个实施方案中，所述方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在其中含有细胞培养基的第一透气容器中培养肿瘤组织样品；获得来自肿瘤组织样品的TIL；在其中含有细胞培养基的第二透气容器中使用aAPC扩增TIL数目持续约14至约42天(例如约28天)的持续时间。
在一个实施方案中，TIL是在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，并且使用PBMC、使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括描述于美国专利申请公布号2005/0106717A1中的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，TIL是在透气袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如WAVE生物反应器系统，还称为Xuri细胞扩增系统W5(GEHealthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，所述袋的体积选自由约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L组成的组。在一个实施方案中，TIL可在G-Rex烧瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。此类实施方案允许细胞群体从约5×105细胞/cm2扩增至介于10×106与30×106细胞/cm2之间。在一个实施方案中，这一扩增是在不添加新鲜细胞培养基至细胞(还称为喂养细胞)的情况下进行。在一个实施方案中，此举未进行喂养，只要G-Rex烧瓶中的培养基位于约10cm的高度。在一个实施方案中，不进行喂养，但添加一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可呈推注形式添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法是本领域中已知的并且已用于扩增TIL，并且包括描述于美国专利申请公布号US 2014/0377739A1、国际专利公布号WO 2014/210036 A1、美国专利申请公布号us 2013/0115617 A1、国际专利公布号WO 2013/188427A1、美国专利申请公布号US 2011/0136228 A1、美国专利号US 8,809,050 B2、国际专利公布号WO 2011/072088 A2、美国专利申请公布号US 2016/0208216 A1、美国专利申请公布号US 2012/0244133 A1、国际专利公布号WO 2012/129201 A1、美国专利申请公布号US 2013/0102075 A1、美国专利号US 8,956,860 B2、国际专利公布号WO 2013/173835 A1、美国专利申请公布号US 2015/0175966 A1中的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35:283-292中。任选的TIL基因工程改造
在一些实施方案中，TIL任选地经基因工程改造以包括另外的功能性，包括但不限于高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系受限的细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
H.任选的TIL冷冻保存
如上文所讨论并且例示于如图9中所提供的步骤A至E，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的许多时刻。在一些实施方案中，在第二次扩增(例如根据图9步骤D所提供)后的扩增的TIL群体可经冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群体放入冷冻溶液(例如85％补体失活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将细胞溶液放入冷冻小瓶中并且存储在-80℃下24小时，任选地转移至气态氮冷冻器中进行冷冻保存。参见Sadeghi等人,ActaOncologica 2013,52,978-986。在一些实施方案中，TIL是冷冻保存于5％ DMSO中。在一些实施方案中，TIL是冷冻保存于细胞培养基加5％ DMSO中。在一些实施方案中，TIL是根据实施例8和9所提供的方法进行冷冻保存。
适当时，将细胞从冷冻器取出并在37℃水浴中解冻，直至大约4/5的溶液解冻。将细胞大致上再悬浮于完全培养基中并且任选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，解冻的TIL可经计数并且依本领域中已知的方式评估活力。
I.扩增的TIL的表型特征
在一些实施方案中，分析TIL在扩增后的许多表型标志物的表达，包括本文和实施例中所描述的那些。在一个实施方案中，检查一个或多个表型标志物的表达。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在步骤B的第一次扩增之后进行分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在步骤C的转变期间进行分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤C的转变期间和冷冻保存之后进行分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤D的第二次扩增之后进行分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤D的两次或更多次扩增之后进行分析。在一些实施方案中，标志物选自由以下组成的组：TCRab(即TCRα/β)、CD57、CD28、CD4、CD27、CD56、CD8a、CD45RA、CD8a、CCR7、CD4、CD3、CD38和HLA-DR。在一些实施方案中，标志物选自由以下组成的组：TCRab(即TCRα/β)、CD57、CD28、CD4、CD27、CD56和CD8a。在一个实施方案中，标志物选自由以下组成的组：CD45RA、CD8a、CCR7、CD4、CD3、CD38和HLA-DR。在一些实施方案中，检查一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四个标志物的表达。在一些实施方案中，检查各组中一个或多个标志物的表达。在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL维持HLA-DR、CD38和CD69表达中的一种或多种(即不展现统计学显著差异)。在一些实施方案中，解冻的TIL维持TIL的活化状态。
在一个实施方案中，测量一个或多个调节标志物的表达。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD137、CD8a、Lag3、CD4、CD3、PD-1、TIM-3、CD69、CD8a、TIGIT、CD4、CD3、KLRG1和CD154。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD137、CD8a、Lag3、CD4、CD3、PD-1和TIM-3。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD69、CD8a、TIGIT、CD4、CD3、KLRG1和CD154。在一些实施方案中，解冻的TIL相较于新鲜TIL降低调节分子表达。在一些实施方案中，解冻的TIL相较于新鲜TIL降低调节分子LAG-3和TIM-3的表达。在一些实施方案中，CD4、CD8、NK、TCRαβ表达无显著差异。在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL的CD4、CD8、NK、TCRαβ表达和/或记忆标志物无显著差异。在一些实施方案中，通过本文所提供的方法(如例如图9所例示者)产生的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL之间无CD4、CD8、NK、TCRαβ表达的显著差异。
在一些实施方案中，在任何步骤(包括上文所讨论或如例如图9所提供的那些)期间，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体、收集的TIL群体和/或治疗性TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ选择第一TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择第二TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择第三TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择收集的TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择治疗性TIL群体。
在一个实施方案中，在用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法中的任何步骤(a)至(f)期间，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或收集的TIL群体，所述方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而从所述患者所切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(b)转变至步骤(c)无需打开所述系统而发生；
(d)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体包含相对于所述第二TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中执行，并且其中从步骤(c)转变至步骤(d)无需打开所述系统而发生；
(e)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生。
在一个实施方案中，在用于治疗患有癌症的受试者的方法中的任何步骤(a)至(h)期间，并未执行基于CD4、CD8和/或NK、TCRαβ表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或收集的TIL群体，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而从受试者所切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(b)转变至步骤(c)无需打开所述系统而发生；
(d)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体包含相对于所述第二TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中执行，并且其中从步骤(c)转变至步骤(d)无需打开所述系统而发生；
(e)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)任选地使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(h)将治疗有效剂量的来自步骤(g)的所述输注袋的所述第三TIL群体施用于所述患者。
在一些实施方案中，记忆标志物是选自由CCR7和CD62L组成的组。
在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL的活力是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的TIL两者的活力是大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于98％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的产物两者的活力是大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％或大于90％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的产物两者的活力是大于86％。
在一个实施方案中，也可使用细胞因子释出分析来评估再刺激的TIL的细胞因子释出。在一些实施方案中，可评估TIL回应于OKT3刺激或与自体肿瘤消化物共培养的干扰素-7(IFN-7)分泌。例如，在采用OKT3刺激的实施方案中，充分洗涤TIL，并用1×105个细胞在0.2mL CM中在96孔平底板(用经磷酸盐缓冲生理盐水稀释的0.1或1.0μg/mL的OKT3预涂布)制备双重复孔。在过夜孵育之后，收集上清液并用ELISA(Pierce/Endogen,Woburn,MA)测量上清液中的IFN-7。对于共培养分析，将1×105个TIL细胞与自体肿瘤细胞(1:1比率)放入至96孔板中。在24小时孵育之后，收集上清液并且可通过例如ELISA定量IFN-7释出。
细胞表面生物标志物的流式细胞分析：将TIL样品等分用于细胞表面标志物的流式细胞分析，参见例如实施例7、8和9。
在一些实施方案中，评估TIL的各种调节标志物。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：TCRα/β、CD56、CD27、CD28、CD57、CD45RA、CD45RO、CD25、CD127、CD95、IL-2R-、CCR7、CD62L、KLRG1和CD122。在一些实施方案中，调节标志物是TCRα/β。在一些实施方案中，调节标志物是CD56。在一些实施方案中，调节标志物是CD27。在一些实施方案中，调节标志物是CD28。在一些实施方案中，调节标志物是CD57。在一些实施方案中，调节标志物是CD45RA。在一些实施方案中，调节标志物是CD45RO。在一些实施方案中，调节标志物是CD25。在一些实施方案中，调节标志物是CD127。在一些实施方案中，调节标志物是CD95。在一些实施方案中，调节标志物是IL-2R-。在一些实施方案中，调节标志物是CCR7。在一些实施方案中，调节标志物是CD62L。在一些实施方案中，调节标志物是KLRG1。在一些实施方案中，调节标志物是CD122。
在一个实施方案中，分析扩增的TIL的许多表型标志物的表达，包括本文和实施例中所描述的那些。在一个实施方案中，检查一个或多个表型标志物的表达。在一些实施方案中，标志物选自由以下组成的组：TCRab(即TCRα/β)、CD57、CD28、CD4、CD27、CD56、CD8a、CD45RA、CD8a、CCR7、CD4、CD3、CD38和HLA-DR。在一些实施方案中，标志物选自由以下组成的组：TCRab(即TCRα/β)、CD57、CD28、CD4、CD27、CD56和CD8a。在一个实施方案中，标志物选自由以下组成的组：CD45RA、CD8a、CCR7、CD4、CD3、CD38和HLA-DR。在一些实施方案中，检查一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四个标志物的表达。在一些实施方案中，检查各组中一个或多个标志物的表达。在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL维持HLA-DR、CD38和CD69表达中的一种或多种(即不展现统计学显著差异)。在一些实施方案中，解冻的TIL维持TIL的活化状态。
在一个实施方案中，测量一个或多个调节标志物的表达。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD137、CD8a、Lag3、CD4、CD3、PD1、TIM-3、CD69、CD8a、TIGIT、CD4、CD3、KLRG1和CD154。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD137、CD8a、Lag3、CD4、CD3、PD1和TIM-3。在一些实施方案中，调节标志物选自由以下组成的组：CD69、CD8a、TIGIT、CD4、CD3、KLRG1和CD154。在一些实施方案中，解冻的TIL相较于新鲜TIL降低调节分子表达。在一些实施方案中，解冻的TIL相较于新鲜TIL降低调节分子LAG-3和TIM-3的表达。在一些实施方案中，CD4、CD8、NK、TCRαβ表达无显著差异。在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL的CD4、CD8、NK、TCRαβ表达和/或记忆标志物无显著差异。
在一些实施方案中，记忆标志物是选自由CCR7和CD62L组成的组。
在一些实施方案中，新鲜TIL相较于解冻的TIL的活力是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的TIL两者的活力是大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于98％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的产物两者的活力是大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％或大于90％。在一些实施方案中，新鲜和解冻的产物两者的活力是大于86％。
在一个实施方案中，也可使用细胞因子释出分析来评估再刺激的TIL的细胞因子释出。在一些实施方案中，可评估TIL回应于OKT3刺激或与自体肿瘤消化物共培养的干扰素-7(IFN-7)分泌。例如，在采用OKT3刺激的实施方案中，充分洗涤TIL，并用1×105个细胞在0.2mL CM中在96孔平底板(用经磷酸盐缓冲生理盐水稀释的0.1或1.0μg/mL的OKT3预涂布)制备双重复孔。在过夜孵育之后，收集上清液并用ELISA(Pierce/Endogen,Woburn,MA)测量上清液中的IFN-7。对于共培养分析，将1×105个TIL细胞与自体肿瘤细胞(1:1比率)放入至96孔板中。在24小时孵育之后，收集上清液并且可通过例如ELISA定量IFN-7释出。
在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL、大于5000pg/106个TIL、大于7000pg/106个TIL、大于9000pg/106个TIL、大于11000pg/106个TIL、大于13000pg/106个TIL、大于15000pg/106个TIL、大于17000pg/106个TIL、大于19000pg/106个TIL、大于20000pg/106个TIL、大于40000pg/106个TIL、大于60000pg/106个TIL、大于80000pg/106个TIL、大于100000pg/106个TIL、大于120000pg/106个TIL、大于140000pg/106个TIL、大于160000pg/106个TIL、大于180000pg/106个TIL、大于200000pg/106个TIL、大于220000pg/106个TIL、大于240000pg/106个TIL、大于260000pg/106个TIL、大于280000pg/106个TIL、大于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于5000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于7000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于9000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于11000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于13000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于15000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于17000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于19000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于20000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于40000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于60000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于80000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于100000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于120000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于140000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于160000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于180000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于200000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于220000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于240000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于260000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于280000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于300000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL、大于5000pg/106个TIL、大于7000pg/106个TIL、大于9000pg/106个TIL、大于11000pg/106个TIL、大于13000pg/106个TIL、大于15000pg/106个TIL、大于17000pg/106个TIL、大于19000pg/106个TIL、大于20000pg/106个TIL、大于40000pg/106个TIL、大于60000pg/106个TIL、大于80000pg/106个TIL、大于100000pg/106个TIL、大于120000pg/106个TIL、大于140000pg/106个TIL、大于160000pg/106个TIL、大于180000pg/106个TIL、大于200000pg/106个TIL、大于220000pg/106个TIL、大于240000pg/106个TIL、大于260000pg/106个TIL、大于280000pg/106个TIL、大于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于5000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于7000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于9000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于11000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于13000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于15000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于17000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于19000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于20000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于40000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于60000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于80000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于100000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于120000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于140000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于160000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于180000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于200000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于220000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于240000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于260000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于280000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于300000pg/106个TIL颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。
在一些实施方案中，展现大于1000pg/ml至300000pg/ml或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于1000pg/ml、大于2000pg/ml、大于3000pg/ml、大于4000pg/ml、大于5000pg/ml、大于6000pg/ml、大于7000pg/ml、大于8000pg/ml、大于9000pg/ml、大于10000pg/ml、大于20000pg/ml、大于30000pg/ml、大于40000pg/ml、大于50000pg/ml、大于60000pg/ml、大于70000pg/ml、大于80000pg/ml、大于90000pg/ml、大于100000pg/ml或更多颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于1000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于2000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于3000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于4000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于5000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于6000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于7000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于8000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于9000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于10000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于20000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于30000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于40000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于50000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于60000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于70000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于80000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于90000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于100000pg/ml颗粒酶B的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于120000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于140000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于160000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于180000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于200000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于220000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于240000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于260000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于280000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。在一些实施方案中，展现大于300000pg/ml颗粒酶B分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)产生的TIL。
在一些实施方案中，本发明的扩增方法在体外产生相较于未扩增的TIL群体展现增加的颗粒酶B分泌的扩增的TIL群体，包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9中所提供的TIL。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少一倍至五十倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群体，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少一倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少两倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少三倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少四倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少五倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少六倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少七倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少八倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少九倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少十倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少二十倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少三十倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少四十倍。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL群体的颗粒酶B分泌相较于未扩增的TIL群体增加至少五十倍。
在一些实施方案中，表型特征是在冷冻保存之后进行检查。
J.扩增的TIL的代谢健康
再刺激的TIL的特征在于相较于新鲜收集的TIL和/或解冻后的TIL显著增强的基础糖酵解作用。在一个实施方案中，在任何步骤(包括上文所讨论或如例如图9所提供的那些)期间，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体、收集的TIL群体和/或治疗性TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第二TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第三TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择收集的TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择治疗性TIL群体。
在一个实施方案中，在用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法中的任何步骤(a)至(f)期间，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或收集的TIL群体，所述方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而从所述患者所切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(b)转变至步骤(c)无需打开所述系统而发生；
(d)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体包含相对于所述第二TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中执行，并且其中从步骤(c)转变至步骤(d)无需打开所述系统而发生；
(e)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生。
在一个实施方案中，在用于治疗患有癌症的受试者的方法中的任何步骤(a)至(h)期间，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或收集的TIL群体，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而从受试者所切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(b)转变至步骤(c)无需打开所述系统而发生；
(d)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体包含相对于所述第二TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中执行，并且其中从步骤(c)转变至步骤(d)无需打开所述系统而发生；
(e)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)任选地使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(h)将治疗有效剂量的来自步骤(g)的所述输注袋的所述第三TIL群体施用于所述患者。
通过本文所述的方法制备的TIL的特征在于相较于例如新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL显著增强的基础糖酵解作用。在一个实施方案中，在任何步骤(包括上文所讨论或如例如图9所提供的那些)期间，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体、收集的TIL群体和/或治疗性TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第二TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择第三TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择收集的TIL群体。在一些实施方案中，并未执行基于CD8表达选择治疗性TIL群体。在一个实施方案中，在任何步骤(a)至(h)期间，并未执行基于CD8表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或收集的TIL群体。
可评估用本公开的不同方法扩增的TIL的备用呼吸量(SRC)和糖酵解储备。Seahorse XF细胞粒线体压力测试使用靶向粒线体的电子传递链组分的呼吸调节剂，通过直接测量细胞的氧消耗速率(OCR)来测量粒线体功能。连续注射测试化合物(寡霉素、FCCP和毒鱼藤素与抗霉素A的混合物，描述于下文)以分别测量ATP产生、最大呼吸和非粒线体呼吸。接着使用这些参数和基础呼吸计算质子漏和备用呼吸量。各调节剂靶向电子传递链的特定组分。寡霉素抑制ATP合成酶(复合物V)并且在注射寡霉素后的OCR降低与细胞ATP产生有关的粒线体呼吸相关。羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)是一种解偶剂，它瓦解质子梯度并且破坏粒线体膜电位。结果，通过电子传递链的电子流未受抑制并且氧被复合物IV最大限度地消耗。接着，可使用FCCP刺激的OCR来计算备用呼吸量，它被定义为最大呼吸与基础呼吸之间的差异。备用呼吸量(SRC)是细胞对能量需求增加而作出反应的能力的量度。第三注射是毒鱼藤素(复合物I抑制剂)与抗霉素A(复合物III抑制剂)的混合物。这一组合关闭粒线体呼吸，因而能够计算由粒线体以外的过程驱动的非粒线体呼吸。在一些实施方案中，比较是针对例如新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL。
在一些实施方案中，代谢分析是基础呼吸。一般说来，第二次扩增TIL具有的基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约50％至约99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约60％至约99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约70％至约99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约80％至约99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约90％至约99％。在一些实施方案中，基础呼吸率是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约95％至约99％。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有的基础呼吸率与新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率并无统计学显著差异。在一些实施方案中，比较是针对例如新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL。
在一些实施方案中，代谢分析是备用呼吸量。一般说来，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有的备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL的基础呼吸率的约50％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约50％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约60％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约70％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL的基础呼吸率的约80％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约90％至约99％。在一些实施方案中，备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约95％至约99％。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有的备用呼吸量与新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率并无统计学显著差异。
一般说来，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有的备用呼吸量是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，所测量的代谢分析是糖酵解储备。在一些实施方案中，代谢分析是备用呼吸量。为了测量细胞(呼吸)代谢，用粒线体呼吸和糖酵解作用的抑制剂处理细胞，以确定由以下量度组成的TIL的代谢概括：基线氧化磷酸化(通过OCR测量)、备用呼吸量、基线糖酵解活性(通过ECAR测量)和糖酵解储备。代谢概括使用Seahorse组合粒线体/糖酵解作用压力测试分析(包括可购自
Figure BDA0004012625820001221
的试剂盒)执行，所述分析允许在阻断粒线体ATP产生时确定细胞执行糖酵解作用的能力。在一些实施方案中，使细胞处于葡萄糖饥饿，接着注射葡萄糖，随后注射压力剂。在一些实施方案中，压力剂是选自由寡霉素、FCCP、毒鱼藤素、抗霉素A和/或2-脱氧葡萄糖(2-DG)以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，寡霉素是以10mM添加。在一些实施方案中，FCCP是以10mM添加。在一些实施方案中，毒鱼藤素是以2.5mM添加。在一些实施方案中，抗霉素A是以2.5mM添加。在一些实施方案中，2-脱氧葡萄糖(2-DG)是以500mM添加。在一些实施方案中，测量糖酵解能力、糖酵解储备和/或非糖酵解酸化。一般说来，TIL具有的糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约50％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约60％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约70％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约80％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约90％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约95％至约99％。
在一些实施方案中，代谢分析是基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少7倍、至少八倍、至少九倍或至少十倍的基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加约两倍至约十倍的基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加约两倍至约八倍的基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加约三倍至约七倍的基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加约两倍至约四倍的基础糖酵解作用。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加约两倍至约三倍的基础糖酵解作用。
一般说来，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有的糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL的基础呼吸率的约50％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约60％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约70％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约80％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL的基础呼吸率的约90％至约99％。在一些实施方案中，糖酵解储备是新鲜收集的TIL的基础呼吸率的约95％至约99％。
颗粒酶B产生：颗粒酶B是TIL杀死靶标细胞的能力的另一种量度。还根据制造商的说明书使用人颗粒酶B DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)来评估如上文所述使用CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体再刺激的培养基上清液的颗粒酶B水平。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有增加的颗粒酶B产生。在一些实施方案中，第二次扩增TIL或第二次附加扩增TIL(例如图9步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)具有增加的细胞毒性活性。
在一些实施方案中，端粒长度可用作细胞活力和/或细胞功能的量度。在一些实施方案中，在本发明所产生的TIL中的端粒相较于使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL意外地具有相同长度。端粒长度测量：多种方法已用于测量基因组DNA和细胞学制剂的端粒长度。端粒限制片段(TRF)分析是测量端粒长度的黄金标准(de Lange等人,1990)。然而，TRF的重大限制在于需要大量DNA(1.5^g)。两种广泛用于测量端粒长度的方法，即荧光原位杂交(FISH；AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)和定量PCR可为本发明所采用。在一些实施方案中，如图9中所提供的步骤A最初收集的TIL与例如步骤D扩增的TIL之间并无端粒长度变化。
在一些实施方案中，TIL表达一种或多种选自由颗粒酶B、穿孔素和颗粒溶解素组成的组的标志物。在一些实施方案中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施方案中，TIL表达穿孔素。在一些实施方案中，TIL表达颗粒溶解素。
在一个实施方案中，也可使用细胞因子释出分析来评估再刺激的TIL的细胞因子释出。在一些实施方案中，可评估TIL的干扰素γ(IFN-γ)分泌。在一些实施方案中，IFN-γ分泌是通过ELISA分析来测量。在一些实施方案中，IFN-γ分泌是通过ELISA分析在快速第二次扩增步骤之后、在例如图2(特别是例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)提供的步骤D之后测量。在一些实施方案中，TIL健康是通过IFN-γ分泌来测量。在一些实施方案中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施方案中，采用IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过确定经CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的水平来测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ水平可使用测量IFN-γ释出来确定。在一些实施方案中，例如在图2(特别是例如图2A)中所提供的Gen 3工艺的步骤D的TIL相较于例如在图2(特别是例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9)中所提供的2A工艺的步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，测量离体TIL的IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL的IFN-γ，包括通过本发明方法(包括例如图2B方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于1倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于2倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于3倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于4倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于5倍的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/ml至约1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml、至少250pg/ml、至少300pg/ml、至少350pg/ml、至少400pg/ml、至少450pg/ml、至少500pg/ml、至少550pg/ml、至少600pg/ml、至少650pg/ml、至少700pg/ml、至少750pg/ml、至少800pg/ml、至少850pg/ml、至少900pg/ml、至少950pg/ml或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/ml的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/ml/5e5个细胞至约1000pg/ml/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml/5e5个细胞、至少250pg/ml/5e5个细胞、至少300pg/ml/5e5个细胞、至少350pg/ml/5e5个细胞、至少400pg/ml/5e5个细胞、至少450pg/ml/5e5个细胞、至少500pg/ml/5e5个细胞、至少550pg/ml/5e5个细胞、至少600pg/ml/5e5个细胞、至少650pg/ml/5e5个细胞、至少700pg/ml/5e5个细胞、至少750pg/ml/5e5个细胞、至少800pg/ml/5e5个细胞、至少850pg/ml/5e5个细胞、至少900pg/ml/5e5个细胞、至少950pg/ml/5e5个细胞或至少1000pg/ml/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/ml/5e5个细胞的IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍水平的TNF-α(即TNF-alpha)分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少1倍水平的TNF-α分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少2倍水平的TNF-α分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少3倍水平的TNF-α分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少4倍水平的TNF-α分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，相较于IFN-γ分泌能够降低至少5倍水平的TNF-α分泌的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α(即TNF-alpha)的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/ml/5e5个细胞至约10,000pg/ml/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，测量IFN-γ和颗粒酶B水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量颗粒酶B和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图2A和/或图2B和/或图2C和/或图9方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施方案中，根据TIL分析的生物发光重定向溶解分析(效力分析)，使用TIL与生物发光细胞系P815(克隆G6)的共培养分析来评估TIL溶解靶标细胞的细胞毒性潜力，所述生物发光重定向溶解分析以高度敏感剂量依赖性方式测量TIL细胞毒性。
在一些实施方案中，本发明方法提供使用如上文所述的方法来评估TIL活力的分析。在一些实施方案中，TIL的扩增如上文所讨论，包括例如图9所提供者。在一些实施方案中，TIL在评估活力之前经冷冻保存。在一些实施方案中，活力评估包括在执行第一次扩增、第二次扩增和附加第二次扩增之前解冻TIL。在一些实施方案中，本发明方法提供用于评估细胞增生、细胞毒性、细胞死亡和/或其他与TIL群体活力有关的术语的分析。活力可通过任何上述的TIL代谢分析以及本领域中已知用于评估细胞活力的任何方法来测量。在一些实施方案中，本发明方法提供用于评估细胞增生、细胞毒性、细胞死亡和/或其他与使用本文所述的方法(包括图9中所例示的那些)扩增的TIL的活力有关的术语的分析。
本发明还提供用于分析TIL活力的分析方法。在一些实施方案中，TIL相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有相等的活力。在一些实施方案中，TIL相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL具有增加的活力。本公开提供通过将肿瘤浸润淋巴球(TIL)扩增成较大TIL群体来分析TIL活力的方法，所述方法包括：
(i)获得先前已扩增的第一TIL群体；
(ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体；和
(iii)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第三TIL群体的数目高于所述第二TIL群体至少100倍，并且其中所述第二次扩增执行至少14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体包含相对于所述第二TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，并且其中所述第三群体进一步进行活力分析。
在一些实施方案中，所述方法还包括：
(iv)通过用另外的IL-2、另外的OKT-3和另外的APC补充所述第三TIL群体的细胞培养基来执行附加第二次扩增，其中所述附加第二次扩增执行至少14天以获得比起步骤(iii)所获得者较大的TIL群体，其中所述较大的TIL群体包含相对于所述第三TIL群体增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体，并且其中所述第三群体进一步进行活力分析。
在一些实施方案中，在步骤(i)之前，细胞是经冷冻保存。
在一些实施方案中，细胞在执行步骤(i)之前解冻。
在一些实施方案中，重复步骤(iv)一至四次以获得充足TIL用于分析。
在一些实施方案中，步骤(i)至(iii)或(iv)在约40天至约50天的时间段内执行。
在一些实施方案中，步骤(i)至(iii)或(iv)在约42天至约48天的时间段内执行。
在一些实施方案中，步骤(i)至(iii)或(iv)在约42天至约45天的时间段内执行。
在一些实施方案中，步骤(i)至(iii)或(iv)在约44天内执行。
在一些实施方案中，来自步骤(iii)或(iv)的细胞以类似于新鲜收集的细胞的水平表达CD4、CD8和TCRαβ。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方案中，PBMC是在步骤(iii)的第9至17天中任一天添加至细胞培养物中。
在一些实施方案中，在步骤(iv)的较大TIL群体中的效应T细胞和/或中央记忆T细胞相对于所述第三细胞群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现选自由以下组成的组的一种或多种特征：表达CD27、表达CD28、较长端粒、增加的CD57表达和降低的CD56表达。
在一些实施方案中，所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现增加的CD57表达和降低的CD56表达。
在一些实施方案中，APC是人工APC(aAPC)。
在一些实施方案中，所述方法还包括用包含编码高亲和力T细胞受体的核酸的表达载体转导第一TIL群体的步骤。
在一些实施方案中，转导步骤发生在步骤(i)之前。
在一些实施方案中，所述方法还包括用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的表达载体转导第一TIL群体的步骤，所述嵌合抗原受体包含与T细胞信号传导分子的至少一个胞内域融合的单链可变片段抗体。
在一些实施方案中，转导步骤发生在步骤(i)之前。
在一些实施方案中，分析TIL活力。
在一些实施方案中，在冷冻保存后分析TIL活力。
在一些实施方案中，在冷冻保存后和在步骤(iv)后分析TIL活力。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(接合区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生展现并且增加T细胞谱系多样性(有时称为多克隆性)的TIL的方法。在一些实施方案中，T细胞谱系多样性的增加是相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图9中体现的方法以外的方法)制备的TIL。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，在第一次扩增中获得的TIL展现增加的T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中、存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
根据本公开，一种用于分析TIL活力和/或施用于受试者的进一步用途的方法。在一些实施方案中，用于分析肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(i)获得第一TIL群体；
(ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体；和
(iii)通过对第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第三TIL群体的数目高于第二TIL群体至少50倍；
(iv)收集、洗涤和冷冻保存第三TIL群体；
(v)将冷冻保存的TIL存储在冷冻温度下；
(vi)解冻第三TIL群体以提供解冻的第三TIL群体；和
(vii)通过对第三群体的细胞培养基补充IL-2、OKT-3和APC来执行一部分解冻的第三TIL群体的附加第二次扩增持续至少3天的附加扩增时期(有时称为reREP时期)，其中执行第三次扩增以获得第四TIL群体，其中比较第四TIL群体中的TIL数目与第三TIL群体中的TIL数目以获得比率；
(viii)基于步骤(vii)中的比率确定解冻的TIL群体是否适用于施用于患者；
(ix)当步骤(viii)中的第四TIL群体中的TIL数目对第三TIL群体中的TIL数目的比率经确定大于5:1时，施用治疗有效剂量的解冻的第三TIL群体至患者。
在一些实施方案中，执行附加扩增时期(有时称为reREP时期)直至第四TIL群体中的TIL数目对第三TIL群体中的TIL数目的比率大于50:1。
在一些实施方案中，对治疗有效剂量为足够的TIL数目是约2.3×1010至约13.7×1010个。
在一些实施方案中，步骤(i)至(vii)在约40天至约50天的时间段内执行。在一些实施方案中，步骤(i)至(vii)在约42天至约48天的时间段内执行。在一些实施方案中，步骤(i)至(vii)在约42天至约45天的时间段内执行。在一些实施方案中，步骤(i)至(vii)在约44天内执行。
在一些实施方案中，来自步骤(iii)或(vii)的所述细胞以类似于新鲜收集的细胞的水平表达CD4、CD8和TCRαβ。在一些实施方案中，细胞是TIL。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，PBMC是在步骤(iii)的第9至17天中任一天添加至细胞培养物中。
在一些实施方案中，在步骤(iii)或(vii)的较大TIL群体中的效应T细胞和/或中央记忆T细胞相对于所述第三细胞群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现选自由以下组成的组的一种或多种特征：表达CD27、表达CD28、较长端粒、增加的CD57表达和降低的CD56表达。
在一些实施方案中，所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现增加的CD57表达和降低的CD56表达。
在一些实施方案中，APC是人工APC(aAPC)。
在一些实施方案中，用包含编码高亲和力T细胞受体的核酸的表达载体转导第一TIL群体的步骤。
在一些实施方案中，转导步骤发生在步骤(i)之前。
在一些实施方案中，用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的表达载体转导第一TIL群体的步骤，所述嵌合抗原受体包含与T细胞信号传导分子的至少一个胞内域融合的单链可变片段抗体。
在一些实施方案中，转导步骤发生在步骤(i)之前。
在一些实施方案中，在步骤(vii)后分析TIL活力。
本公开还提供用于分析TIL的其他方法。在一些实施方案中，本公开提供一种用于分析TIL的方法，所述方法包括：
(i)获得一部分的第一冷冻保存的TIL群体；
(ii)将所述部分的第一冷冻保存的TIL群体解冻；
(iii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养所述部分的第一TIL群体来执行第一次扩增持续至少3天的附加扩增时期(有时称为reREP时期)以产生第二TIL群体，其中比较来自第一TIL群体的所述部分与第二TIL群体以获得TIL数目的比率，其中第二TIL群体中的TIL数目对第一TIL群体的所述部分中的TIL数目的比率是大于5:1；
(iv)基于步骤(iii)中的比率确定第一TIL群体是否适用于治疗性施用于患者；
(v)当步骤(iv)中的第二TIL群体中的TIL数目对第一TIL群体中的TIL数目的比率经确定大于5:1时，确定所述第一TIL群体适用于治疗性施用。
在一些实施方案中，第二TIL群体中的TIL数目对第一TIL群体的所述部分中的TIL数目的比率是大于50:1。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据本文所提供的任何实施方案所述的方法，执行来自步骤(i)的整个第一冷冻保存的TIL群体的扩增。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用来自步骤(i)的整个第一冷冻保存的TIL群体至患者。
K.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用较少烧瓶并且允许成本降低。在一些实施方案中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统是本领域中众所周知的并且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
如FDA网站上所提供，使用无菌方法的密闭系统是已知的并且广为描述。参见https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm，如上文所提及并且提供于以下相关部分中。
介绍
无菌连接装置(STCD)在两段可相容管道之间产生无菌焊接。这一程序允许无菌连接多种容器和管直径。本指导描述使用这些装置的建议实践和程序。本指导并不涉及无菌连接装置制造商必须提交给FDA以获得上市批准或许可的资料或信息。也很重要的是应注意，使用经批准或许可的无菌连接装置来达成标签中未授权的目的，可造成所述装置依据联邦食品、药品和化妆品法(Federal Food,Drug,and Cosmetic Act)被视为搀假和品牌错误。
1.FDA建议
提议例行使用FDA许可的STCD的血液产品制造商应将关于此类用于的信息并入各血液产品的标准操作程序(SOP)手册。这些输入应包括记录保存、产品追踪、管焊接质量控制、软件和一次性用品批号(包括待添加的元件的来源)。质量控制程序应包括各焊接的完整性测试。
2.STCD的应用
用户应了解所述装置的使用可制造新产品或显著修改受监管产品的配置，而其安全性和功效未经证实。以应申请许可的“新产品”来说，除了提交SOP给FDA之外，还必须提交申请或补充申请。一般说来，涉及细胞组分的汇合或混合代表产品变更，需要提交许可证申请或补充申请并且需获得批准。此类申请和补充申请应含有制造程序的资料和说明，以证实“新产品”在整个建议的日期期限内用于其预期用途是安全并且有效的。
提供以下注解作为经FDA许可或批准的STCD的较常见用途的指导：
L.添加新针或较小针至血液收集组
在起始程序(全血收集、血小板分离或来源血浆收集)之前使用STCD添加针不应被视为打开功能密闭系统。如果在程序期间添加针，那么仅应使用经批准的STCD来焊接液体填充的管道。如果焊接完整性的测试令人满意，那么使用STCD不应被视为打开功能密闭系统。
在开放系统中制备的血小板单采应标记24小时过期，而在功能密闭系统中制备的血小板单采制剂应标记五天过期(参见Revised Guideline for Collection ofPlatelets,Pheresis,1988年10月7日)。
添加的管道和针的来源和规格应注明在血液中心的SOP和记录中。使用STCD添加针不表示许可机构需要预先批准的制造的主要变更。
M.使用STCD来制备组分
当STCD是用于附接附加组分制备袋时，应适当维持记录，以鉴定转移包的来源和血液单位编号和ABO/Rh的适当验证。所有血液和血液组分必须经适当标记(21CFR606.121)。
实施例：
●添加第四袋至全血收集三包以从新鲜冷冻血浆产生冷冻沉淀的AHF。
●连接添加剂溶液至红血球单位。
●添加经FDA许可用于制造组分的管线过滤器。
●添加第三存储容器至血小板单采线束。
●以上述用途来说，应开发程序并且维持记录，但被授权人无需得到FDA批准才能建立程序。
1.使用STCD来汇合血液产品
适当使用STCD汇合从全血收集制备的血小板可避免来自经常使用的穿刺针和埠口的潜在污染。在输血之前立即执行汇合是此类适当用途的实例。经汇合的血小板应在汇合之后不超过4小时施用(参见21CFR 606.122(l)(2))。
然而，汇合和后续存储可增加相较于施用随机供体单位的风险；如果一个受污染单位与其他单位汇合并在施用之前存储，那么所施用的总细菌接种液可因在另外体积中复制而增加。因此，提议使用STCD汇合和存储血小板超过4小时应有令人满意地探讨此类汇合是否与风险增加相关联的资料支持。
此类血小板汇合构成新产品的制造。
涉及血小板的汇合或混合被视为制造新产品，如果存储期超过四小时，那么需要提交许可证申请或补充申请并且需获得批准。
2.使用STCD来制备供小儿使用的等分试样和分装单位
如果满足以下条件，使用STCD制备的全血、红血球和新鲜冷冻血浆的小儿单位和分装单位不应被视为需要生物制剂许可证申请(BLA)补充的新产品：
制造商应具有原始(即未分装)产品的批准生物制剂许可证或许可证补充，包括批准所使用的各抗凝血剂。
配送之前应提交标签以供审查和批准。应在FDA表格2567标签和通告的传送(Transmittal of Labels and Circulars)的注解部分留下注解。
应使用批准用于存储所制备的组分的最终产品容器。
经许可制造的血小板必须含有至少5.5×(10)10个血小板(21CFR640.24(c))。经许可制造的血小板单采应含有至少3.0×(10)11个血小板(参见Revised Guideline for theCollection of Platelets,Pheresis,1988年10月7日)。
关于使用STCD从全血收集以及从通过自动化血液成分单采程序所制备的血浆和血小板制备分装产物所遵照的程序应包括以下说明：
●单采线束或收集容器将如何使用经FDA许可的STCD进行修改；
●分瓶血浆或全血产品的最小体积；
●分瓶血小板单采产物的体积和血小板浓度；
●产物的存储时间。产物应在经批准的容器中并且应与所述容器的标签上的存储时间一致；
●待用于在血液中心的记录中标记并且追踪分装产物的方法。
注意：用于标记等分试样的程序应清楚陈述于程序记录中，必要时所述程序记录应保持足以允许追踪并且召回所有组分。
3.在自动化血浆分离程序期间使用STCD来连接另外的生理盐水或抗凝血剂管线
应开发程序并且维持与仪器制造商的使用说明一致的记录，但被授权人无需得到FDA批准才能建立程序。
4.使用STCD来附接处理溶液
当使用STCD来附接处理溶液的容器至经洗涤或冷冻的红血球产物时，所得产物的日期期限是24小时，除非以许可证申请或补充申请的形式提供资料给CBER以支持较长日期期限(21CFR610.53(c))。豁免或修改必须得到CBER局长(21CFR 610.53(d))的书面批准。
5.使用STCD来添加经FDA许可的白血球减少过滤器
一些白血球减少过滤器并未整合附接至全血收集系统。使用STCD进行存储前过滤的程序应与过滤器制造商的使用说明一致。
在发送之前的白血球减少构成主要制造变更。因此，以使用STCD制备的新的白血球减少产物来说，制造商必须提交生物制剂许可证申请(21CFR 601.2)或事先批准补充申请给FDA(21CFR 601.12)。
使用STCD从血液产品容器去除样品以供测试(例如，使用STCD从血小板或血小板单采的容器获得血小板样品以供交叉配对)。
如果样品抽出后产物体积和/或细胞计数与原始标签或信息传单所陈述者不同，那么应修改产物标签以反映新的体积和/或细胞计数。例如，不可去除一单位的血小板的血小板计数减少至小于5.5×(10)10个血小板的样品(21CFR 640.24(c))。
6.FDA指导的附加信息
FDA指导提供关于向FDA提交申请和补充申请的规范以解决使用STCD的问题的常规指导以及特定信息和实施例。如果出现关于适当使用STCD的进一步问题，那么应向生物制剂评估研究中心的血液研究审查处(Office of Blood Research and Review,Centerfor Biologics Evaluation and Research)提出问题。
在一些实施方案中，密闭系统从获得肿瘤片段之时开始一直至TIL即将施用于患者或冷冻保存为止，仅使用一个容器。在一些使用两个容器的实施方案中，第一容器是密闭G容器，并且TIL群体在无需打开第一密闭G容器的情况下离心和转移至输注袋。在一些使用两个容器的实施方案中，输注袋是含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦添加了肿瘤样品和/或肿瘤片段，所述系统即可从外面紧密密封以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染侵袭。
在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在无微生物污染存在下和/或在微生物污染显著减少下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧分压各随细胞培养而异。因此，即使适用于细胞培养的培养基是循环的，所述密闭环境仍需要持续维持为适合TIL增生的最佳环境。为此，所需的是通过传感器监测密闭环境的培养液体内的pH、二氧化碳分压和氧分压物理因子，其信号用于控制安装在培养环境入口处的气体交换器，并且密闭环境的气体分压根据培养液体中的变化实时调整，以最佳化细胞培养环境。在一些实施方案中，本发明提供一种密闭细胞培养系统，它在密闭系统的入口处并入配备有监测装置的气体交换器，所述监测装置测量所述密闭环境的pH、二氧化碳分压和氧分压，并且通过基于来自所述监测装置的信号自动调整气体浓度来最佳化细胞培养环境。
在一些实施方案中，在密闭环境中的压力是经连续或间歇控制。即，在密闭环境中的压力可通过例如压力维持装置而异，因此确保空间适合TIL在正压状态下生长，或促进流体在负压状态下渗出并且因此促进细胞增生。此外，通过间歇性施加负压，有可能通过暂时性收缩密闭环境的体积而一致地并且有效地置换在密闭环境中循环的液体。
在一些实施方案中，用于TIL增生的最佳培养组分可经取代或添加，并且可添加包括诸如IL-2和/或OKT3的因子以及组合。
N.细胞培养
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法(包括上文所讨论以及图9中所例示的那些)可以包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基，如例如实施例21中所述。在一些实施方案中，在第一次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方案中，在第二次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方案中，在第一和第二次扩增中的培养基皆是无血清的。在一个实施方案中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)。在这点上，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一个实施方案中，扩增TIL数目可包括频繁性不超过每三或四天一次地喂养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基是未过滤的。使用未过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯乙醇(BME)。
在一个实施方案中，所述方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在其中含有细胞培养基的第一透气容器中培养肿瘤组织样品；获得来自肿瘤组织样品的TIL；在含有细胞培养基的第二透气容器中扩增TIL数目持续约7-14天(例如约11天)的时间段。在一些实施方案中，REP前是约7-14天，例如约11天。在一些实施方案中，REP是约7-14天，例如约11天。
在一个实施方案中，TIL是在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，并且使用PBMC、使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括那些描述于美国专利申请公布号2005/0106717A1者，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，TIL是在透气袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如WAVE生物反应器系统，还称为Xuri细胞扩增系统W5(GEHealthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，所述袋的体积选自由约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L组成的组。
在一个实施方案中，TIL可在G-Rex烧瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。此类实施方案允许细胞群体从约5×105细胞/cm2扩增至介于10×106与30×106细胞/cm2之间。在一个实施方案中，此举未进行喂养。在一个实施方案中，此举未进行喂养，只要G-Rex烧瓶中的培养基位于约10cm的高度。在一个实施方案中，不进行喂养，但添加一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可呈推注形式添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法是本领域中已知的并且已用于扩增TIL，并且包括描述于美国专利申请公布号US 2014/0377739A1、国际专利公布号WO 2014/210036 A1、美国专利申请公布号us 2013/0115617 A1、国际专利公布号WO 2013/188427 A1、美国专利申请公布号US 2011/0136228 A1、美国专利号US 8,809,050 B2、国际专利公布号WO 2011/072088 A2、美国专利申请公布号US 2016/0208216 A1、美国专利申请公布号US 2012/0244133 A1、国际专利公布号WO 2012/129201 A1、美国专利申请公布号US 2013/0102075 A1、美国专利号US 8,956,860 B2、国际专利公布号WO 2013/173835 A1、美国专利申请公布号US 2015/0175966 A1中的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35:283-292中。
O.任选的TIL基因工程改造
在一些实施方案中，TIL任选地经基因工程改造以包括另外的功能性，包括但不限于高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系受限的细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
P.任选的TIL冷冻保存
主体TIL群体或扩增的TIL群体任选地可经冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存是针对治疗性TIL群体。在一些实施方案中，冷冻保存是针对在第二次扩增后收集的TIL。在一些实施方案中，冷冻保存是针对图9的示例性步骤F中的TIL。在一些实施方案中，TIL在输注袋中冷冻保存。在一些实施方案中，TIL是经冷冻保存、然后放入输注袋中。在一些实施方案中，TIL是经冷冻保存并且不放入输注袋中。在一些实施方案中，冷冻保存使用冷冻保存培养基来执行。在一些实施方案中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。这通常可通过将TIL群体放入冷冻溶液(例如85％补体失活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将细胞溶液放入冷冻小瓶中并且存储在-80℃下24小时，任选地转移至气态氮冷冻器中进行冷冻保存。参见Sadeghi等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。
适当时，将细胞从冷冻器取出并在37℃水浴中解冻，直至大约4/5的溶液解冻。将细胞大致上再悬浮于完全培养基中并且任选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，解冻的TIL可经计数并且依本领域中已知的方式评估活力。
在一个优选实施方案中，TIL群体使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10,BioLife Solutions)进行冷冻保存。在一个优选实施方案中，TIL群体使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一个优选实施方案中，TIL群体使用1:1(体积:体积)比率的CS10和细胞培养基进行冷冻保存。在一个优选实施方案中，TIL群体使用约1:1(体积:体积)比率的CS10和细胞培养基进行冷冻保存，所述细胞培养基还包含另外的IL-2。
如上文步骤A至E中所讨论，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的许多时刻。在一些实施方案中，在根据步骤B的第一次扩增后的主体TIL群体或在一个或多个根据步骤D的第二次扩增后的扩增的TIL群体可经冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群体放入冷冻溶液(例如85％补体失活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将细胞溶液放入冷冻小瓶中并且存储在-80℃下24小时，任选地转移至气态氮冷冻器中进行冷冻保存。参见Sadeghi等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。
适当时，将细胞从冷冻器取出并在37℃水浴中解冻，直至大约4/5的溶液解冻。将细胞大致上再悬浮于完全培养基中并且任选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，解冻的TIL可经计数并且依本领域中已知的方式评估活力。
在一些情况下，步骤B的TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可进行步骤C和步骤D并且接着在步骤D后冷冻保存。同样，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况中，步骤B或步骤D的TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
Q.任选的细胞活力分析
任选地，在第一次扩增(有时称为初始主体扩增)之后可使用本领域中已知的标准分析来执行细胞活力分析。例如，可对主体TIL的样品进行台盼蓝排除分析，所述分析选择性标记死亡细胞并且允许活力评估。其他用于测试活力的分析可以包括但不限于阿尔玛蓝分析和MTT分析。
1.细胞计数、活力、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或活力。标志物(诸如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及任何其他本文公开或描述者)的表达可通过流式细胞术使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)以抗体(例如但不限于那些可购自BD Bio-sciences(BDBiosciences,San Jose,CA)者)测量。细胞可使用抛弃式c-芯片血球计(VWR,Batavia,IL)手动计数并且活力可使用本领域中已知的任何方法(包括但不限于台盼蓝染色)来评估。
在一些情况下，主体TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可如下文所讨论进行REP并且接着冷冻保存。同样，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况中，主体或REP TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
2.细胞培养
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法可以包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一个实施方案中，扩增TIL数目使用不超过一种细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)。在这点上，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一个实施方案中，扩增TIL数目可包括频繁性不超过每三或四天一次地喂养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基是未过滤的。使用未过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，在第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯乙醇(BME)。
在一个实施方案中，所述方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在其中含有细胞培养基的第一透气容器中培养肿瘤组织样品；获得来自肿瘤组织样品的TIL；在其中含有细胞培养基的第二透气容器中使用aAPC扩增TIL数目持续约14至约42天(例如约28天)的持续时间。
在一个实施方案中，TIL是在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，并且使用PBMC、使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括那些描述于美国专利申请公布号2005/0106717A1者，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，TIL是在透气袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如WAVE生物反应器系统，还称为Xuri细胞扩增系统W5(GEHealthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，所述袋的体积选自由约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L组成的组。
在一个实施方案中，TIL可在G-Rex烧瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。此类实施方案允许细胞群体从约5×105细胞/cm2扩增至介于10×106与30×106细胞/cm2之间。在一个实施方案中，此举未进行喂养。在一个实施方案中，此举未进行喂养，只要G-Rex烧瓶中的培养基位于约10cm的高度。在一个实施方案中，不进行喂养，但添加一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可呈推注形式添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法是本领域中已知的并且已用于扩增TIL，并且包括描述于美国专利申请公布号US 2014/0377739A1、国际专利公布号WO 2014/210036A1、美国专利申请公布号us 2013/0115617 A1、国际专利公布号WO 2013/188427A1、美国专利申请公布号US2011/0136228 A1、美国专利号US 8,809,050 B2、国际专利公布号WO 2011/072088 A2、美国专利申请公布号US 2016/0208216 A1、美国专利申请公布号US 2012/0244133A1、国际专利公布号WO 2012/129201 A1、美国专利申请公布号US 2013/0102075 A1、美国专利号US8,956,860 B2、国际专利公布号WO 2013/173835 A1、美国专利申请公布号US 2015/0175966 A1中的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35:283-292中。任选的TIL基因工程改造
在一些实施方案中，TIL任选地经基因工程改造以包括另外的功能性，包括但不限于高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系受限的细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
IV.治疗患者的方法
治疗方法始于初始TIL收集和TIL培养。此类方法皆已在本领域中由例如Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35(3):283-292描述，其以全文引用的方式并入本文中。治疗方法的实施方案是描述于以下所有章节，包括实施例。
根据本文所述的方法包括例如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如例如图2A和/或图9所示)产生的扩增的TIL可特定用于治疗癌症患者(例如，Goff等人,J.Clinical Oncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容所述)；其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，TIL是如先前所述从转移性黑素瘤的切除的沉积物生长(参见Dudley等人,J Immunother.,2003,26:332-342；其以全文引用的方式并入本文中)。新鲜肿瘤可在无菌条件下解剖。可收集代表性样品进行正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单一片段。在一些实施方案中，获得每个患者5、10、15、20、25或30个样品。在一些实施方案中，获得每个患者20、25或30个样品。在一些实施方案中，获得每个患者20、22、24、26或28个样品。在一些实施方案中，获得每个患者24个样品。样品可放入24孔板的个别孔中，维持于含有高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中并且监测肿瘤的破坏和/或TIL的增生。任何在处理后仍有活细胞的肿瘤均可如本文所述经酶消化成单一细胞悬浮液并且经冷冻保存。
在一些实施方案中，成功生长的TIL可经取样进行表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)并且当可用时针对自体肿瘤进行测试。如果过夜共培养产生干扰素-γ(IFN-γ)的水平＞200pg/mL并且为背景的两倍，那么TIL可被视为反应性。(Goff等人,J Immunother.,2010,33:840-847；其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，可选择具有自体反应性或足够生长模式的证据的培养物进行第二次扩增(例如根据图2A和/或图9步骤D提供的第二次扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二次扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在第二次扩增期间高增生)的扩增的TIL进行附加第二次扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在图2A和/或图9步骤D提供的第二次扩增期间的高增生)的TIL进行根据图2A和/或图9步骤D的附加第二次扩增。
在一些实施方案中，患者并不直接移入ACT(过继性细胞转移)，例如，在一些实施方案中，不立即利用在肿瘤收集和/或第一次扩增后的细胞。在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存并且在施用于患者之前2天解冻。在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存并且在施用于患者之前1天解冻。在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存并且在施用于患者之前立即解冻。
冷冻保存的输注袋TIL样品的细胞表型可通过流式细胞术(例如FlowJo)分析表面标志物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA(BD BioSciences)，以及通过本文所述的任何方法进行分析。可使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-γ上升可定义为＞100pg/mL并且高于血清IFN-γ的基线水平至少4倍或至少3倍或至少2倍或至少1倍。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞1000pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞200pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞250pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞300pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞350pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞400pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞450pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞500pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞550pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞600pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞650pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞700pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞750pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞800pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞850pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞900pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞950pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-γ上升是定义为＞1000pg/mL。
在一些实施方案中，通过本文所提供的方法(例如图2A和/或图9中例示的那些)产生的TIL提供TIL的临床功效的意外改善。在一些实施方案中，通过本文所提供的方法(例如图2A和/或图9中例示的那些)产生的TIL相较于通过除那些在本文中所述的方法以外的方法(包括例如除那些在图2A和/或图9例示的方法以外的方法)产生的TIL展现增加的临床功效。在一些实施方案中，除那些在本文中所述的方法以外的方法包括称为工艺1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方案中，增加的功效是通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量。在一些实施方案中，通过本文所提供的方法(例如图2A和/或图9中例示的那些)产生的TIL相较于通过除那些在本文中所述的方法以外的方法(包括例如除那些在图2A和/或图9例示的方法以外的方法，例如第1代工艺)产生的TIL展现类似的反应所需时间和安全性概括。
在一些实施方案中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过确定用通过本发明方法(包括例如那些在图2A和/或图9中所述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ的水平来测量。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，IFN-γ是在用通过本发明方法(包括例如那些在图2A和/或图9中所述的方法)制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中测量。在一些实施方案中，IFN-γ是在用通过本发明方法(包括例如那些在图2A和/或图9中所述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液中测量。在一些实施方案中，IFN-γ是在用通过本发明方法(包括例如那些在图2A和/或图9中所述的方法)制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中测量。
在一些实施方案中，通过本发明方法(包括那些在例如图2A和/或图9中所述的方法)制备的TIL相较于通过其他方法(包括未在图2A和/或图9中例示的那些，例如称为工艺1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用在本文中所提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图2A和/或图9体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
功效的量度可以包括疾病控制率(DCR)以及整体反应率(ORR)，如本领域中已知以及本文中所述。
A.治疗癌症的方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方案中，它们用于治疗成人患者或小儿患者的过度增生性病症，诸如癌症。它们也可用于治疗如本文和以下段落所述的其他病症。
在一些实施方案中，过度增生性病症是癌症。在一些实施方案中，过度增生性病症是实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，实体肿瘤癌选自由以下组成的组：肛门癌、膀胱癌、乳癌(包括三阴性乳癌)、骨癌、人乳突瘤病毒(HPV)造成的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经胚细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、宫颈腺鳞癌和宫颈腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食道胃缀合部癌症、胃癌、胃肠道癌、胃肠道基质瘤、神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、咽下癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑素瘤(包括葡萄膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤或虹膜黑素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括未分化甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方案中，过度增生性病症是血液恶性病。在一些实施方案中，血液恶性病选自由以下组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症是血液恶性病。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的TIL、MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述癌症是血液恶性病。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述癌症是血液恶性病。
在一个实施方案中，癌症是前述癌症之一，包括实体肿瘤癌和血液恶性病，所述癌症对至少一种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法或免疫疗法)的治疗呈现复发或难治性。在一个实施方案中，癌症是前述癌症之一，所述癌症对至少两种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)的治疗呈现复发或难治性。在一个实施方案中，癌症是前述癌症之一，所述癌症对至少三种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)的治疗呈现复发或难治性。
在一些实施方案中，癌症是微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌症。MSI-H和dMMR癌症和测试因此已描述于Kawakami等人,Curr.Treat.OptionsOncol.2015,16,30中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的TIL、MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述患者是人类。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的TIL、MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述患者是非人类。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的TIL、MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述患者是伴侣动物。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种或多种CCR的TIL、MIL或PBL来治疗癌症患者的方法，其中所述患者是灵长类动物、马、犬科动物或猫科动物。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症对BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗呈现难治性。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症对选自由威罗菲尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、恩考非尼(encorafenib)、索拉非尼(sorafenib)和其药学上可接受的盐或溶剂化物组成的组的BRAF抑制剂的治疗呈现难治性。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症对选自由曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、毕尼替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹马司替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)和其药学上可接受的盐或溶剂化物组成的组的MEK抑制剂的治疗呈现难治性。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症对选自由威罗菲尼、达拉菲尼、恩考非尼、索拉非尼和其药学上可接受的盐或溶剂化物组成的组的BRAF抑制剂和选自由曲美替尼、考比替尼、毕尼替尼、司美替尼、匹马司替尼、瑞法替尼和其药学上可接受的盐或溶剂化物组成的组的MEK抑制剂的治疗呈现难治性。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症是小儿癌症。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述癌症是葡萄膜黑色瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述葡萄膜黑色瘤是脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤或虹膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述小儿癌症是神经胚细胞瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述小儿癌症是肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述肉瘤是骨肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述肉瘤是软组织肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述软组织肉瘤是横纹肌肉瘤、尤文肉瘤或原始神经外胚层肿瘤(PNET)。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中所述小儿癌症是中枢神经系统(CNS)相关癌症。在一些实施方案中，小儿癌症对化学疗法的治疗呈现难治性。在一些实施方案中，小儿癌症对放射疗法的治疗呈现难治性。在一些实施方案中，小儿癌症对地努妥昔单抗(dinutuximab)的治疗呈现难治性。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中CNS相关癌症是神经管胚细胞瘤、松果体母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤或神经胶质母细胞瘤。
本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症的方法中，其中所述癌症对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前治疗呈现难治性或抗性。在一些实施方案中，患者是抗PD-1或抗PD-L1抗体的原发性难治性患者。在一些实施方案中，患者对抗PD-1或抗PD-L1抗体不显示先前反应。在一些实施方案中，患者对抗PD-1或抗PD-L1抗体显示先前反应，随后患者的癌症进展。在一些实施方案中，癌症对抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1或抗PD-L1抗体与至少一种化学治疗剂的组合呈现难治性。在一些实施方案中，先前化学治疗剂是卡铂、太平洋紫杉醇、培美曲塞和/或顺铂。在一些先前实施方案中，化学治疗剂是铂双重化学治疗剂。在一些实施方案中，铂双重疗法包含第一化学治疗剂和第二化学治疗剂，所述第一化学治疗剂选自由顺铂和卡铂组成的组，所述第二化学治疗剂选自由长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel))组成的组。在一些实施方案中，铂双重化学治疗剂是与培美曲塞组合。
在一些实施方案中，NSCLC是PD-L1阴性和/或是来自如本文中别处所述的罹患以<1％的肿瘤比例分数(TPS)表达PD-L1的癌症的患者。
在一些实施方案中，NSCLC对包含抗PD-1或抗PD-L1抗体和铂双重疗法的组合疗法呈现难治性，其中所述铂双重疗法包含：
i)选自由顺铂和卡铂组成的组的第一化学治疗剂，
ii)和选自由长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)组成的组的第二化学治疗剂。
在一些实施方案中，NSCLC对包含抗PD-1或抗PD-L1抗体、培美曲塞和铂双重疗法的组合疗法呈现难治性，其中所述铂双重疗法包含：
i)选自由顺铂和卡铂组成的组的第一化学治疗剂，
ii)和选自由长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)组成的组的第二化学治疗剂。
在一些实施方案中，NSCLC已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC已用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者未接受过治疗。在一些实施方案中，NSCLC未曾用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC未曾用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗但目前不再用所述化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者未接受过抗PD-1/PD-L1。在一些实施方案中，NSCLC患者具有低表达的PD-L1。在一些实施方案中，NSCLC患者的NSCLC未接受过治疗或是化学治疗剂治疗后但未接受过抗PD-1/PD-L1。在一些实施方案中，NSCLC患者未接受过治疗或接受过化学治疗剂治疗但未接受过抗PD-1/PD-L1治疗并且具有低表达的PD-L1。在一些实施方案中，NSCLC患者在基线处具有大型肿瘤。在一些实施方案中，受试者在基线处具有大型肿瘤并且具有低表达的PD-L1。在一些实施方案中，NSCLC患者不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者未接受过治疗或接受过化学治疗剂治疗但未接受过抗PD-1/PD-L1治疗并且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，患者在基线处具有大型肿瘤并且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者的NSCLC未接受过治疗或是化学疗法后(化学治疗剂后)但未接受过抗PD-1/PD-L1并且具有低表达的PD-L1和/或在基线处具有大型肿瘤。在一些实施方案中，当以横断面或冠状面测量的最大肿瘤直径大于7cm时，指示大型肿瘤。在一些实施方案中，当肿胀淋巴结的短轴直径为20mm或大于20mm时，指示大型肿瘤。在一些实施方案中，化学治疗剂包括NSCLC的标准照护治疗剂。
在一些实施方案中，PD-L1表达是由肿瘤比例分数分析。在一些实施方案中，罹患难治性NSCLC肿瘤的受试者具有<1％肿瘤比例分数(TPS)。在一些实施方案中，罹患难治性NSCLC肿瘤的受试者具有≥1％ TPS。在一些实施方案中，罹患难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在所述抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前分析。在一些实施方案中，罹患难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在所述抗PD-L1抗体治疗之前分析。
在一些实施方案中，通过本发明方法(包括例如图1中所述的那些)制备的TIL相较于通过其他方法(包括那些非在图1例示的方法，例如称为工艺1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的癌症治疗的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞谱系多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用在本文中所提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文所提供的那些方法以外的其他方法(包括例如除那些在图1体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
在一些实施方案中，PD-L1表达是通过使用如本文所述的一种或多种测试方法的肿瘤比例分数分析。在一些实施方案中，罹患NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％肿瘤比例分数(TPS)。在一些实施方案中，NSCLC肿瘤具有≥1％ TPS。在一些实施方案中，罹患NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前分析。在一些实施方案中，罹患NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在抗PD-L1抗体治疗之前分析。在一些实施方案中，罹患难治性或抗性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％肿瘤比例分数(TPS)。在一些实施方案中，罹患难治性或抗性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有≥1％TPS。在一些实施方案中，罹患难治性或抗性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前分析。在一些实施方案中，罹患难治性或抗性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且肿瘤比例分数是在抗PD-L1抗体治疗之前分析。
在一些实施方案中，NSCLC是展现肿瘤比例分数(TPS)或在抗PD-1或抗PD-L1疗法之前从患者采集的显示任何强度的PD-L1蛋白的部分或完全膜染色的活肿瘤细胞的百分比小于1％(TPS<1％)的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现选自由<50％、<45％、<40％、<35％、<30％、<25％、<20％、<15％、<10％、<9％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.9％、<0.8％、<0.7％、<0.6％、<0.5％、<0.4％、<0.3％、<0.2％、<0.1％、<0.09％、<0.08％、<0.07％、<0.06％、<0.05％、<0.04％、<0.03％、<0.02％和<0.01％组成的组的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现选自由约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％和约0.01％组成的组的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与1％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.9％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.8％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.7％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.6％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.5％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.4％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.3％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.2％之间的TPS的NSCLC。在一个实施方案中，NSCLC是展现介于0％与0.1％之间的TPS的NSCLC。TPS可通过本领域中已知的方法测量，诸如描述于Hirsch等人J.Thorac.Oncol.2017,12,208-222中的那些或在派姆单抗或其他抗PD-1或抗PD-L1疗法的治疗之前用于确定TPS的那些。也可使用经美国食品药物管理局批准用于测量TPS的方法。在一些实施方案中，PD-L1是胞外体PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1可见于循环肿瘤细胞上。
在一些实施方案中，部分膜染色包括1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。在一些实施方案中，完全膜染色包括大约100％膜染色。
在一些实施方案中，PD-L1测试可涉及测量PD-L1在患者血清中的水平。在这些实施方案中，测量患者血清中的PD-L1去除肿瘤异质性的不确定性和连续活组织检查的患者不适。
在一些实施方案中，相较于基线或标准水平上升的可溶性PD-L1与NSCLC的较差预后相关。参见例如Okuma等人,Clinical Lung Cancer,2018,19,410-417；Vecchiarelli等人,Oncotarget,2018,9,17554-17563。在一些实施方案中，PD-L1是胞外体PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1在循环肿瘤细胞上表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的受试者或患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的群体来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述受试者或患者具有以下至少一者：
预先确定的PD-L1肿瘤比例分数(TPS)<1％，
PD-L1的TPS分数为1％至49％，或
预先确定的一个或多个驱动突变不存在，
其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，并且其中所述方法包括：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自所述受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(b)转变至步骤(c)无需打开所述系统而发生；
(d)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面积的密闭容器中执行，并且其中从步骤(c)转变至步骤(d)无需打开所述系统而发生；
(e)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(h)施用来自步骤(g)的所述输注袋的治疗有效剂量的所述第三TIL群体至所述受试者或患者。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的群体来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述方法包括：
(a)测试患者的肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例分数(TPS)，
(b)测试患者的一个或多个驱动突变不存在，其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定患者的PD-L1的TPS分数为约1％至约49％并且确定患者也不具有驱动突变，
(d)通过将获自受试者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自所述受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(e)转变至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面积的密闭容器中执行，并且其中从步骤(f)转变至步骤(g)无需打开所述系统而发生；
(h)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(i)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(j)使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(k)施用来自步骤(g)的所述输注袋的治疗有效剂量的所述第三TIL群体至所述受试者或患者。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的群体来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述方法包括：
(a)测试患者的肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例分数(TPS)，
(b)测试患者的一个或多个驱动突变不存在，其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定患者的PD-L1的TPS分数为小于约1％并且确定患者也不具有驱动突变，
(d)通过将获自受试者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自所述受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(e)转变至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面积的密闭容器中执行，并且其中从步骤(f)转变至步骤(g)无需打开所述系统而发生；
(h)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(i)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(j)使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(k)施用来自步骤(g)的所述输注袋的治疗有效剂量的所述第三TIL群体至所述受试者或患者。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的群体来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述方法包括：
(a)测试患者的肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例分数(TPS)，
(b)测试患者的一个或多个驱动突变不存在，其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定患者的PD-L1的TPS分数为约1％至约49％并且确定患者也不具有驱动突变，
(d)通过将获自受试者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自所述受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(e)转变至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面积的密闭容器中执行，并且其中从步骤(f)转变至步骤(g)无需打开所述系统而发生；
(h)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(i)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(j)使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(k)施用来自步骤(g)的所述输注袋的治疗有效剂量的所述第三TIL群体至所述受试者或患者。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的群体来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述方法包括：
(a)测试患者的肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例分数(TPS)，
(b)测试患者的一个或多个驱动突变不存在，其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定患者的PD-L1的TPS分数为小于约1％并且确定患者也不具有驱动突变，
(d)通过将获自受试者的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自所述受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来执行第一次扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中执行，其中所述第一次扩增执行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目高于所述第一TIL群体至少50倍，并且其中从步骤(e)转变至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(g)通过对所述第二TIL群体的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来执行第二次扩增以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增执行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面积的密闭容器中执行，并且其中从步骤(f)转变至步骤(g)无需打开所述系统而发生；
(h)收集获自步骤(d)的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)转变至步骤(e)无需打开所述系统而发生；和
(i)将来自步骤(e)的收集的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)转移至步骤(f)无需打开所述系统而发生；
(j)使用冷冻保存工艺将来自步骤(f)的包含收集的TIL群体的所述输注袋冷冻保存；和
(k)施用来自步骤(g)的所述输注袋的治疗有效剂量的所述第三TIL群体至所述受试者或患者。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的如本文所述的治疗性TIL群体。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的如本文所述的TIL组合物。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得在分别施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体和TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案包括施用60mg/m2/天的剂量的环磷酰胺持续两天、随后施用25mg/m2/天的剂量的氟达拉滨持续五天的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改以便还包括用始于向受试者施用TIL细胞之后当天的高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟推注静脉内输注施用600,000或720,000IU/kg直至耐受为止。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是实体肿瘤。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌或肾细胞癌。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是黑素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)和胃肠道癌。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是黑素瘤。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是HNSCC。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是宫颈癌。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是NSCLC。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是神经胶质母细胞瘤(包括GBM)。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是胃肠道癌。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是高突变癌症。
在另一实施方案中，本发明提供所述用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，所述方法经修改使得所述癌症是小儿高突变癌症。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的治疗性TIL群体，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述治疗性TIL群体。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的TIL组合物，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得在向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案包括施用60mg/m2/天的剂量的环磷酰胺持续两天、随后施用25mg/m2/天的剂量的氟达拉滨持续五天的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改以便还包括用始于向患者施用TIL细胞之后当天的高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟推注静脉内输注施用600,000或720,000IU/kg直至耐受为止。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是实体肿瘤。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)、胃肠道癌、肾癌或肾细胞癌。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是黑素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶质母细胞瘤(包括GBM)和胃肠道癌。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是黑素瘤。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是HNSCC。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是宫颈癌。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是NSCLC。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是神经胶质母细胞瘤。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是胃肠道癌。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是高突变癌症。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，所述治疗性TIL群体或TIL组合物经修改使得所述癌症是小儿高突变癌症。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体于治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述治疗性TIL群体。
在另一实施方案中，本发明提供任何前述段落描述的TIL组合物于治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。
在另一实施方案中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物于治疗患者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案并且接着向所述受试者施用治疗有效剂量的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
1.基于驱动突变治疗癌症的方法
如本文所用，措辞“驱动突变(driver mutation)”和/或“可作用突变(actionablemutation)”和/或“致癌性驱动突变(oncogenic driver mutation)”是指一般被视为致癌性驱动因子(即癌症驱动因子或癌症诱导物)的突变。这些突变中的一者或多者的存在传统上被用作靶向疗法的靶标。通常，针对使用包括例如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的靶向治疗部分的治疗，检查和/或分析驱动突变。此类驱动突变在一些实施方案中可影响(impact/affect)对第一线治疗性治疗的反应。本文所述的TIL治疗方法和组合物对治疗有效，不论此类驱动突变存在或不存在于患者或受试者中。此类驱动突变可通过本领域中已知的任何方法进行测试和确定，包括全外显子组测序或靶向特定驱动突变的检测的方法。
在一些实施方案中，癌症是展现一个或多个驱动突变的存在或不存在的癌症。在一些实施方案中，癌症展现一个或多个驱动突变的存在。在一些实施方案中，癌症展现一个或多个驱动突变的不存在。在一些实施方案中，分析癌症的一个或多个驱动突变的不存在或存在。在一些实施方案中，一个或多个驱动突变不存在。在一些实施方案中，癌症治疗与一个或多个驱动突变的存在或不存在无关。在一些实施方案中，癌症展现选自由以下组成的组的一个或多个驱动突变：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20、KRAS突变、BRAF突变、BRAF V600E突变、BRAF V600K突变、BRAF V600突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变。在一些实施方案中，癌症展现<1％的PD-L1 TPS并且具有预先确定的一个或多个驱动突变的不存在。
在一些实施方案中，癌症是不适用于通过以下治疗的癌症：EGFR抑制剂、BRAF抑制剂、ALK抑制剂、c-Ros抑制剂、RET抑制剂、ERBB2抑制剂、BRCA抑制剂、MAP2K1抑制剂、PIK3CA抑制剂、CDKN2A抑制剂、PTEN抑制剂、UMD抑制剂、NRAS抑制剂、KRAS抑制剂、NF1抑制剂、MET抑制剂、TP53抑制剂、CREBBP抑制剂、KMT2C抑制剂、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1抑制剂、ATM抑制剂、SETD2抑制剂、FLT3抑制剂、PTPN11抑制剂、FGFR1抑制剂、EP300抑制剂、MYC抑制剂、EZH2抑制剂、JAK2抑制剂、FBXW7抑制剂、CCND3抑制剂和GNA11抑制剂。
在一些实施方案中，癌症展现<1％的PD-L1 TPS并且是不适用于通过以下治疗的癌症：EGFR抑制剂、BRAF抑制剂、ALK抑制剂、c-Ros抑制剂、RET抑制剂、ERBB2抑制剂、BRCA抑制剂、MAP2K1抑制剂、PIK3CA抑制剂、CDKN2A抑制剂、PTEN抑制剂、UMD抑制剂、NRAS抑制剂、KRAS抑制剂、NF1抑制剂、MET抑制剂、TP53抑制剂、CREBBP抑制剂、KMT2C抑制剂、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1抑制剂、ATM抑制剂、SETD2抑制剂、FLT3抑制剂、PTPN11抑制剂、FGFR1抑制剂、EP300抑制剂、MYC抑制剂、EZH2抑制剂、JAK2抑制剂、FBXW7抑制剂、CCND3抑制剂和GNA11抑制剂。
在一些实施方案中，癌症是NSCLC，并且EGFR突变导致肿瘤从NSCLC转变成小细胞肺癌(SCLC)。
在一些实施方案中，癌症(或其活组织检查)展现高肿瘤突变负荷(高TMB；>10mut/kb)和/或微卫星高不稳定性(MSI-高)。在一些实施方案中，癌症(或其活组织检查)展现高肿瘤突变负荷(高TMB；>10mut/kb)。在一些实施方案中，癌症(或其活组织检查)展现微卫星高不稳定性(MSI-高)。用于评估肿瘤突变负荷的方法和系统是本领域中已知的。此类方法和系统的示例性公开内容可见于美国专利号9,792,403、美国专利申请公布号US 2018/0363066 A1、国际专利申请公布号WO 2013/070634 A1和WO 2018/106884 A1，和Metzker,Nature Biotechnol.Rev.2010,11,31-46(其中每一者以引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，EGFR突变包括例如但不限于T790M、Ex19Del、L858R、外显子20插入、delE709-T710insD、I744_K745insKIPVAI、K745_E746insTPVAIK、E709X、E709K、E709A、外显子18缺失、G719X、G719A、G719S、L861Q、S768I、L747P、A763_764insFQEA、D770_N771insNPG、A763_764insFQEA、P772_H773insDNP外显子20插入、H773_V774insNPH外显子20插入、S768I、D770_N771insSVD、V769_D770InsASV、p.K745_E746insIPVAIK、p.K745_E746insTPVAIK、p.I744_K745insKIPVAI、D770_N771insNPG、P772_H773insPNP、A763_Y764insFQEA和/或EGFR激酶结构域重复(EGFR-KDD)。在一些实施方案中，EGFR突变选自由以下组成的组：T790M、Ex19Del、L858R、外显子20插入、delE709-T710insD、I744_K745insKIPVAI、K745_E746insTPVAIK、E709X、E709K、E709A、外显子18缺失、G719X、G719A、G719S、L861Q、S768I、L747P、A763_764insFQEA、D770_N771insNPG、A763_764insFQEA、P772_H773insDNP外显子20插入、H773_V774insNPH外显子20插入、S768I、D770_N771insSVD、V769_D770InsASV、p.K745_E746insIPVAIK、p.K745_E746insTPVAIK、p.I744_K745insKIPVAI、D770_N771insNPG、P772_H773insPNP、A763_Y764insFQEA和EGFR激酶结构域重复(EGFR-KDD)。
在一些实施方案中，EGFR突变是双重突变，包括但不限于L858R/T790M、Ex19Del/T790M、G719X/L861Q、G719X/S768I(或S768I/G719X)、S768I/L858R、L858R/E709A和/或E746_T751delinsA+T790M。在一些实施方案中，EGFR突变是选自由以下组成的组的双重突变：L858R/T790M、Ex19Del/T790M、G719X/L861Q、G719X/S768I(或S768I/G719X)、S768I/L858R、L858R/E709A和E746_T751delinsA+T790M。关于EGFR突变的另外的性质和方法提供于国际专利申请公布号WO 2010/020618 A1(其以引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方案中，ALK突变包括但不限于EML4-ALK变体1(AB274722.1；BAF73611.1)、EML4-ALK变体2(AB275889.1；BAF73612.1)、EML4-ALK变体3a(AB374361.1；BAG55003.1)、EML4-ALK变体3b(AB374362.1；BAG55004.1)、EML4-ALK变体4(AB374363.1；BAG75147.1)、EML4-ALK变体5a(AB374364.1；BAG75148.1)、EML4-ALK变体5b(AB374365.1；BAG75149.1)、EML4-ALK变体6(AB462411.1；BAH57335.1)、EML4-ALK变体7(AB462412.1；BAH57336.1)、KIF5B-ALK(AB462413.1；BAH57337.1)、NPM-ALK、TPM3-ALK、TFGXL-ALK、TEGL-ALK、TFGS-ALK、A11C-ALK、CLTC-ALK、MSN-ALK、TPM4-ALK、MYH9-ALK、RANBP2-ALK、AL017-ALK和CARS-ALK(参见例如Pulford等人,(2004)J.Cell.Physiol.199:330-358)。此外，熟练技术人员应理解ALK激酶变体可取决于介于ALK激酶与其融合搭配物之间的特定融合事件(例如EML4可融合至少外显子2、6a、6b、13、14和/或15)而产生，如例如Horn和Pao,J.Clin.Oncol.2009,27,4247-4253(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所述。
ALK突变的另外的实例描述于美国专利号9,018,230和9,458,508中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的ROS1突变是ROS1融合，其中包括ROS1蛋白(或编码它的多核苷酸)的激酶结构域的ROS1多肽的一部分融合至另一多肽(或编码它的多核苷酸)的所有或一部分并且其中所述第二多肽或多核苷酸的名称是命名于融合中。在一些实施方案中，ROS1突变经确定为ROS1融合蛋白(例如通过IHC)和/或ROS融合基因(例如通过FISH)和/或ROS1 mRNA(例如通过qRT-PCR)，优选地指示ROS1融合蛋白选自由以下组成的组：SLC34A2-ROS1(SLC34A2外显子13del2046和4融合至ROS1外显子32和34)、CD74-ROS1(CD74外显子6融合至ROS1外显子32和34)、EZR-ROS1(EZR外显子10融合至ROS1外显子34)、TPM3-ROS1(TPM3外显子8融合至ROS1外显子35)、LRIG3-ROS1(LRIG3外显子16融合至ROS1外显子35)、SDC4-ROS1(SDC4外显子2和4融合至ROS1外显子32和SDC4外显子4融合至ROS1外显子34)、GOPC-ROS1还称为FIG-ROS1(GOPC外显子8融合至ROS1外显子35和GOPC外显子4融合至ROS1外显子36)和G2032R还称为ROS1G2032R。
ROS1突变和ROS融合的附加公开内容已提供于美国专利申请公布号US 2010/0221737 A1、US 2015/0056193 A1和US 2010/0143918 A1，和国际专利申请公布号WO2010/093928 A1(其中每一者以引用的方式并入本文中)中。在一些实施方案中，RET突变是RET融合或点突变。
在一些实施方案中，RET点突变包括但不限于H6650、K666E、K666M、S686N、G691S、R694Q、M700L、V706M、V706A、E713K、G736R、G748C、A750P、S765P、P766S、E768Q、E768D、L769L、R770Q、D771N、N777S、V7781、Q781R、L790F、Y791F、Y791N、V804L、V804M、V804E、E805K、E806C、Y806E、Y806F、Y806S、Y806G、Y806C、E818K、S819I、G823E、Y826M、R833C、P841L、P841P、E843D、R844W、R844Q、R844L、M848T、1852M、A866W、R873W、A876V、L881V、A883F、A883S、A883T、E884K、R886W、S891A、R8970、D898V、E901K、5904F、S904C2、K907E、K907M、R908K、G911D、R912P、R912Q、M918T、M918V、M918L6、A919V、E921K、S922P、S922Y、T930M、F961L、R972G、R982C、M1009V、D1017N、V10416和M1064T。
在一些实施方案中，RET融合是RET与融合搭配物之间的融合，所述融合搭配物选自由以下组成的组：BCR、BCR、CLIP 1、KIFSB、CCDC6、PTClex9、NCOA4、TRIM33、ERC1、FGFRIOP、MBD1、RAB61P2、PRKARIA、TRIM24、KTN1、GOLGA5、HOOK3、KIAA1468、TRIM27、AKAP13、FKBP15、SPECCIL、TBL1XR1、CEP55、CUX1、ACBD5、MYH13、PIBF1、KIAA1217和MPRIP。
RET突变的附加公开内容已提供于美国专利号10035789中，其由此以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，BRAF突变是BRAF V600E/K突变。在其他实施方案中，BRAF突变是非V600E/K突变。
在一些实施方案中，非V600E/K BRAF突变是激酶活化突变、激酶损害突变或激酶未知突变和它们的组合。在一些实施方案中，激酶活化突变选自由R4621、1463S、G464E、G464R、G464V、G466A、G469A、N58 is、E586K、F595L、L597Q、L597R、L5975、L597V、A598V、T599E、V600R、K601E、5602D、A728V和它们的组合组成的组。在一些实施方案中，激酶损害突变选自由G466E、G466R、G466V、Y472C、K483M、D594A、D594E、D594G、D594H、D594N、D594V、G596R、T599A、5602A和它们的组合组成的组。在一些实施方案中，激酶未知突变选自由T4401、5467L、G469E、G469R、G4695、G469V、L584F、L588F、V600 K6OldelinsE、56051、Q609L、E611Q和它们的组合组成的组。在一些实施方案中，非V600E/K BRAF突变选自由D594、G469、K601E、L597、T599重复、L485W、F247L、G466V、BRAF融合、BRAF-AGAP3重排、BRAF外显子15剪接变体和它们的组合组成的组。
在一些实施方案中，Met突变包括点突变、缺失突变、插入突变、倒置、异常剪接、错义突变或基因放大，所述Met突变造成c-Met蛋白的至少一种生物活性增加、酪氨酸激酶活性诸如改善、受体同源物二聚化配体结合形成、增强本体和异二聚体等。Met突变可位于c-Met基因的任何部分。在一个实施方案中，突变是在通过c-MET基因编码的c-Met蛋白的激酶结构域中。在一些实施方案中，c-Met突变是在N375、V13、V923、R175、V136、L229、S323、R988、S1058/T1010和E168处的点突变。
在一些实施方案中，ERBB2突变是在ERBB2的氨基酸序列中的点突变。在一些实施方案中，ERBB2的点突变是造成氨基酸取代、造成mRNA剪接的点突变或是上游区中的点突变。其中所述突变包含造成选自由Q568E、P601R、I628M、P885S、R143Q、R434Q和E874K组成的组的至少一种氨基酸取代的核苷酸突变。
在一些实施方案中，ERBB2突变是ERBB2扩增。在一些实施方案中，ERBB2扩增包括选自由V659E、G309A、G309E、S310F、D769H、D769Y、V777L、P780ins、P780-Y781insGSP、V842I、R896C、K753E和L755S组成的组的点突变并且可通过聚合酶链反应或本领域中已知的其他测序技术来检测，诸如描述于Bose等人,Cancer Discov.2013,3(2),224-237和Zuo等人Clin Cancer Res.2016,22(19),4859-4869中的那些(其公开内容以引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，BRCA突变是BRCA1和/或BRCA2(优选地BRCA1)中和/或在一个或多个其他基因中的突变，所述一个或多个其他基因的蛋白产物与在DNA损害位点的BRCA1和/或BRCA2相关联，包括ATM、ATR、Chk2、H2AX、53BP1、NFBD1、Mre11、Rad50、Nibrin、BRCA1相关环结构域(BARD1)、Abraxas和MSH2。在这些基因的一者或多者中的突变可导致模拟在BRCA1和/或BRCA2中的突变的基因表达模式。
在某些实施方案中，BRCA突变包含非同义突变。在一些实施方案中，BRCA突变包含无义突变。在一些实施方案中，BRCA突变包含移码突变。在一些实施方案中，BRCA突变包含剪接突变。在一些实施方案中，BRCA突变是表达为突变体mRNA和最终突变体蛋白。在一些实施方案中，BRCA1/2蛋白具功能性。在其他实施方案中，BRCA1/2蛋白具有减少的活性。在其他实施方案中，BRCA1/2蛋白不具功能性。
如本文中有关取代所使用，有关突变的“＝”符号通常是指同义取代、沉默密码子和/或沉默取代。具体来说，同义取代(还称为沉默取代或沉默密码子)是指编码蛋白质的基因的外显子中的一个核苷酸碱基取代另一者，其中所产生的氨基酸序列未经修饰。这是因为遗传密码是经“简并”的事实，即一些氨基酸是由超过一个三碱基对密码子编码。由于给定氨基酸的一些密码子与编码相同氨基酸的其他密码子仅有一个碱基对的差异，因此通过一个替代碱基取代野生型碱基的点突变将导致在基因翻译期间相同氨基酸并入至伸长的多肽链中。在一些实施方案中，影响非编码DNA的同义取代和突变通常被视为沉默突变；然而，这些突变并非总是沉默的并且无任何影响。例如，同义突变可影响转录、剪接、mRNA转运和翻译，其中任一者可改变所得表型，使同义突变并非沉默的。tRNA对罕见密码子的底物特异性可影响翻译时间安排，并且进而影响蛋白质的共翻译折叠。这由已在许多物种中观察到的密码子使用偏好显现。非同义取代/突变导致可被任意归类为保守性(改变为具有类似物理化学性质的氨基酸)、半保守性(例如带负电改变为带正电氨基酸)或激进(极不同氨基酸)的氨基酸改变。在一些实施方案中，BRCA突变是BRCA1突变，其包括但不限于P871L、K1183R、D693N、S1634G、E1038G、S1040N、S694＝(＝：沉默密码子)、M1673I、Q356R、S1436＝、L771＝、K654Sfs*47、S198N、R496H、R841W、R1347G、H619N、S1533I、L30＝、A622V、Y655Vfs*18、R496C、E597K、R1443*、E23Vfs*17、L30F、E111Gfs*3、K339Rfs*2、L512F、D693N、P871S、S1140G、Q1240*、P1770S、R7＝、L52F、T176M、A224S、L347＝、S561F、E597*、K820E、K893Rfs*107、E962K、M1014I、R1028H、E1258D、E1346K、R1347T、L1439F、H1472R、Q1488*、S1572C、E1602K、R1610C、L1621＝、Q1625*、Q1625＝、D1754N、R1772Q、R1856*和它们的任何组合。
在一些实施方案中，BRCA突变是BRCA2突变，其包括但不限于V2466A、N289H、N991D、S455＝(＝：沉默密码子)、N372H、H743＝、V1269＝、S2414＝、V2171＝、L1521＝、T3033Nfs*11、K1132＝、T3033Lfs*29、R2842C、N1784Tfs*7、K3326*、K3326*、D1420Y、I605Yfs*9、I3412V、A2951T、T3085Nfs*26、R2645Nfs*3、S1013*、T1915M、F3090＝、V3244I、A1393V、R2034C、L1356＝、E2981Rfs*37、N1784Kfs*3、K3416Nfs*11、K1691Nfs*15、S1982Rfs*22和它们的任何组合。
在一些实施方案中，NRAS突变包括但不限于E63K、Q61R、Q61K、G12D、G13D、Q61R、Q61L、Q61K、G12S、G12C、G13R、Q61H、G12V、G12A、Q61L、G13V、Q61H、Q61H、G12R、G13C、Q61P、G13S、G12D、G13A、G13D、A18T、Q61X、G60E、G12S、Q61＝(＝：沉默密码子)、Q61E、Q61R、A146T、A59T、A59D、Q61＝、R68T、A146T、G12A、E62Q、G75＝、A91V和它们的任何组合。
E132K在一些实施方案中，PIK3CA突变包括取代突变、缺失突变和插入突变。在一些实施方案中，突变发生在PIK3CA的螺旋结构域和其激酶中。在其他实施方案中，在PIK3CA的P85BD结构域中。在一些实施方案中，PIK3CA突变是在外显子1、2、4、5、7、9、13、18和20中。在一些实施方案中，PIK3CA突变是在外显子9和20中。在其他实施方案中，PIK3CA突变是上文列出的任何突变的组合。这些外显子的任何组合可经测试，任选地联合测试其他外显子。突变的测试可沿着整个编码序列进行或可集中于已发现突变丛聚的区域中。特定突变热点发生在PIK3CA编码序列的核苷酸位置1624、1633、1636和3140处。
在一些实施方案中，PIK3CA突变的大小是小的，范围从1至3个核苷酸。在一些实施方案中，PIK3CA突变包括但不限于G1624A、G1633A、C1636A、A3140G、G113A、T1258C、G3129T、C3139T、E542K、E545K、Q546R、H1047L、H1047R和G2702T。
在一些实施方案中，MAP2K1突变是体细胞MAP2K1突变，任选地上调MEK1水平的MAP2K1突变。在一些实施方案中，MAP2K1突变是在与RAS/MAPK途径相关联的一个或多个基因中的突变，包含：HRAS、KRAS、NRAS、ARAF、BRAF、RAFl、MAP2K2、MAPKl、MAPK3、MAP3K3。在某些实施方案中，MAP2K1突变是在选自由RASA、PTEN、ENG、ACVRL1、SMAD4、GDF2或它们的组合组成的组的一个或多个基因中。
在一些实施方案中，MAP2K1突变包括但不限于P124S、Q56P、K57N、E203K、G237*、P124L、G128D、D67N、K57E、E102_I103del、C121S、K57T、K57N、Q56P、P124L、K57N、G128V、Q58_E62del、F53L、I126＝、I103_K104del和它们的任何组合。
在一些实施方案中，KRAS突变包含非同义突变。在一些实施方案中，KRAS突变包含无义突变。在一些实施方案中，KRAS突变包含移码突变。在一些实施方案中，KRAS突变包含剪接突变。在一些实施方案中，KRAS突变是表达为突变体mRNA和最终突变体蛋白。在一些实施方案中，经突变的KRAS蛋白具功能性。在其他实施方案中，经突变的KRAS蛋白具有减少的活性。在其他实施方案中，经突变的KRAS蛋白不具功能性。
在一些实施方案中，KRAS突变包括但不限于G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S、G12R、G13C、Q61H、A146T、Q61R、Q61H、Q61L、G13S、A146V、Q61K、G13R、G12F、K117N、G13A、G13V、A59T、V14I、K117N、Q22K、Q61P、A146P、G13D、L19F、L19F、Q61K、G12V、G60＝、G12＝、G13＝、A18D、T58I、Q61E、E63K、G12L、G13V、A59G、G60D、G10R、G10dup、D57N、A59E、V14G、D33E、G12I、G13dup和它们的任何组合，其中＝指示沉默编码。
在一些实施方案中，NF1突变包括取代突变、缺失突变、错义突变、异常剪接突变和插入突变。在一些实施方案中，NF1突变是功能丧失(LOF)突变。在一些实施方案中，NF1突变选自由以下组成的组：R1947X(C5839T)、R304X、外显子37突变、外显子4b突变、外显子7突变、外显子10b突变和外显子10c突变(例如1570G→T,E524X)。
在一些实施方案中，CDKN2A突变包括但不限于R24P、D108G、D108N、D108Y、G125R、P114L、R80*、R58*、H83Y、W110*、P114L、E88*、W110*、E120*、D108Y、D84Y、D84N、E69*、P81L、Q50*、L78Hfs*41、D108N、S12*、P48L、E61*、Y44*、E88K、R80*、D84G、L16Pfs*9、Y129*、D108H、A148T、A36G、A102V、W15*、H83R、A57V、E33*、D74Y、A76V、E153K、D74N、H83D、V82M、R58*、Y129*、E119*、Y44*、D74A、T18_A19dup、Y44Lfs*76、L32_L37del、V28_E33del、D14_L16del、A68T或它们的任何组合。
在一些实施方案中，PTEN突变包含非同义突变。在一些实施方案中，PTEN突变包含无义突变。在一些实施方案中，PTEN突变包含移码突变。在一些实施方案中，PTEN突变包含剪接突变。在一些实施方案中，经突变的PTEN是表达为mRNA和最终蛋白。在一些实施方案中，经突变的PTEN蛋白具功能性。在其他实施方案中，经突变的PTEN蛋白具有减少的活性。在其他实施方案中，经突变的PTEN蛋白不具功能性。在一些实施方案中，PTEN突变包括但不限于R130Q、R130G、T319*、R233*、R130*、K267Rfs*9、N323Mfs*21、N323Kfs*2、R173C、R173H、R335*、Q171*、Q245*、E7*、D268Gfs*30、R130Q、Q214*、R130L、C136R、Q298*、Q17*、H93R、P248Tfs*5、I33del、R233*、E299*、G132D、Y68H、T319Kfs*24、N329Kfs*14、V166Sfs*14、V290*、T319Nfs*6、R142W、P38S、A126T、H61R、F278L、S229*、R130P、G129R、R130Qfs*4、P246L、R130*、G165R、C136Y、R173C、I101T、Y155C、D92E、K164Rfs*3、N184Efs*6、G129E、R130G、G36R、F341V、H123Y、C124S、M35VG127E、G165E和它们的任何组合。
在一些实施方案中，TP53突变包括但不限于R175H、G245S、R248Q、R248W、R249S、R273C、R273H、R282W、C135Y、C141Y、P151S、V157F、R158L、Y163C、V173L、V173M、C176F、H179R、H179Y、H179Q、Y205C、Y220C、Y234C、M237I、C238Y、S241F、G245D、G245C、R248L、R249M、V272M、R273L、P278L、R280T、E285K、E286K、R158H、C176Y、I195T、G214R、G245V、G266R、G266E、P278S、R280K或它们的任何组合。在一些进一步实施方案中，TP53突变选自由以下组成的组：G245S、R249S、R273C、R273H、C141Y、V157F、R158L、Y163C、V173L、V173M、Y205C、Y220C、G245C、R249M、V272M、R273L和E286K。在一些实施方案中，TP53突变包括以上突变中的一者或多者。
在一些实施方案中，CREBBP突变包括但不限于R1446C、R1446H、S1680del、I1084Sfs*15、P1948L、I1084Nfs*3、？R386*、S893L、R1341*、P1423Lfs*36、P1488L、Y1503H、R1664C、A1824T、R1173*、R1360*、Y1450C、H2228D、S71L、P928＝、D1435N、W1502C、Y1503D、R483*、R601Q、S945L、R1103*、R1288W、R1392*、C1408Y、D1435G、R1446L、H1485Y、Q1491K、Q96*、L361M、L524Wfs*6、Q540*、Q1073*、A1100V、R1169C、C1237Y、R1347W、G1411E、W1472C、I1483F、P1488T、R1498*、Y1503F、Q1856*、R1985C、R2104C、S2328L、V2349＝、S2377L和它们的任何组合。
在一些实施方案中，KMT2C突变包括但不限于D348N、P350＝、R380L、C391*、P309S、C988F、Y987H、S990G、K2797Rfs*26、V346＝、R894Q、R284Q、S806＝、R1690＝、P986＝、A1685S、G315S、Q755*、R909K、T316S、S772L、G838S、L291F、P335＝、C988F、Q2680＝、E765G、K339N、Y816*、R526P、N729D、G845E、I817Nfs*11、G892R、C1103*、S3660L、F4496Lfs*21、G315C、R886C、D348N、S793＝、V919L、R2481S、R2884*、R4549C、M305Dfs*28、T316S、P377＝、I455M、T820I、S965＝、S730Y、P860S、Q873Hfs*40、R904*、R2610Q、R4478*和它们的任何组合。
在一些实施方案中，KMT2D突变包括但不限于L1419P、E640D、E541D、E455D、T2131P、K1420R、P2354Lfs*30、G2493＝、Q3612＝、I942＝、T1195Hfs*17、P4170＝、P1194H、G1235Vfs*95、P4563＝、P647Hfs*283、L449_P457del、P3557＝、Q3603＝、R1702*、P648Tfs*2、R5501*、R4198*、R4484*、R83Q、R1903*、,R2685*、R4282*、L5326＝、R5432W、R2734*、Q2800*、R2830*、Q3745dup、S4010P、R4904*、G5182Afs*61、R5214H、R1615*、Q2380*、R2687*、R2771*、V3089Wfs*30、Q3799Gfs*212、R4536*、R5030C、R5048C、R5432Q、A221Lfs*40、A476T、A2119Lfs*25、P2557L、R2801*、Q3913*、R4420W、G4641＝、R5097*和它们的任何组合。
在一些实施方案中，ARID1A突变包括但不限于，例如，受试者具有选自由C884*(*：无义突变)、E966K、Q1411*、F1720fs(fs：移码)、G1847fs、C1874fs、D1957E、Q1430、R1721fs、G1255E、G284fs、R1722*、M274fs、G1847fs、P559fs、R1276*、Q2176fs、H203fs、A591fs、Q1322*、S2264*、Q586*、Q548fs和N756fs组成的组的ARID1A的突变。
在一些实施方案中，RB1突变包括但不限于R320X、R467X、R579X、R455X、R358X、R251X、R787X、R552X、R255X、R556X、Y790X、Q575X、E323X、R661W、R579*、R455*、R556*、R787*、R661W、R445*、R467*、Q217*、Q471*、W195*、Q395*、I680T、E137*、R255*、Q344*、Q62*、E440K、A488V、P777Lfs*33、E322K、R656W、G617Rfs*36、C221*、E440*、Q93*、Q504*、E125*、S834*、E323*、Q685*、S829*、W516*、G435*、Q257*、E79*、S567L、V654M、V654Sfs*14、G100Efs*11、K715*和它们的任何组合。
在一些实施方案中，ATM突变是在ATM基因序列中的突变，包括但不限于10744A>G；10744A>G；11482G>A；IVS3-558A>T；146C>G；381delA；IVS8-3delGT；1028delAAAA；1120C>T；1930ins16；IVS16+2T>C；2572T>C；IVS21+1G>A；3085delA；3381delTGAC；3602delTT；4052delT；4396C>T；5188C>T；5290delC；5546delT；5791G>CCT；6047A>G；IVS44-1G>T；6672delGC/6677delTACG；6736dell 1/6749del7；7159insAGCC；7671delGTTT；7705del14；7865C>T；7979delTGT；8177C>T；8545C>T；8565T>A；IVS64+1G>T；和9010del28。
在本发明的一些实施方案中，当NCBI登录号NM_014159的mRNA序列的转录起始密码子位置设置为1，SETD2突变是编码SETD2蛋白的基因序列的改变。在一些实施方案中，第7558位置G(鸟嘌呤)是经T(胸腺嘧啶)取代，第4774位置C(胞嘧啶)是经T取代，第1210位置A(腺嘌呤)是经T取代，第4883位置T是经G取代，第5290位置C是置换成T，第7072位置C是置换成T，第4144位置G是经T取代，第1297位置C是置换成T，第755位置T是置换成G，第7261位置T是经G取代，第6700位置是置换成T，第2536位置C是经T取代，第7438位置C是置换成T取代或在位置3866插入A，在位置6712插入T，在位置7572插入T，缺失第913位置A，缺失第5619位置C，缺失碱基4603-4604，缺失第1碱基，缺失第1936位置C，缺失3094-3118碱基，在第5289位置插入A和缺失6323-6333碱基。
在一些实施方案中，FLT3突变包括但不限于(Q569_E648)ins、D835X、(Q569_E648)delins、(D835_I836)、D835Y、D835V、D835Y、D835H、T227M、I836del、N676K、D835E、Y597_E598insDYVDFREY、D835E、D835del、F594_D600dup、A680V、D839G、D96＝、D835H、V491L、D835E、Q989*、D835V、L561＝、I836del、P986Afs*27、D7G、D324N、S451F、D835N、L576P、Y597_E598insDVDFREY、V491L、N841T、D324N、Y572C、R595_L601dup、K663R、N676K、F691L、D835A、I836H、N841K、S993L、L832F、I836M、A66V和它们的任何组合。
在一些实施方案中，PTPN11突变包括但不限于c E76K、A72V、A72T、D61Y、D61V、G60V、E69K、E76G、G507V、S506L、G507A、T73I、E76A、E76Q、S506P、D61N、F71L、E76V、F71L、A72D、V432M、T472M、P495L、N58Y、F285S、S506A、S189A、A465T、R502W、G507R、T511K、D61H、D61G、G507E、G60R、G60A、Q514L、E139D、Y197*、N308D、Q514H、Q514H、N58S、E123D、L206＝、A465G、P495S、G507R和它们的任何组合。
在一些实施方案中，FGFR1突变包括但不限于N577K、K687E、N577K、D166del、T371M、R476W、T350＝、E498K、N577D、D683G、R87C、A154D、N303＝、A374V、D550＝、S633＝、V695L、G728＝、R765W、P803S、W19C、P56＝、R113C、V149I、S158L、D166dupR220C、N224Kfs*8、D249N、R281W、R281Q、A299S、S424L、S461F、S467F、R506Q和它们的任何组合。
在一些实施方案中，EP300突变包括但不限于D1399N、Y1414C、M1470Cfs*26、Y1111*、H2324Pfs*55、R1627W、N2209_Q2213delinsK、Q2268del、L415P、M1470Nfs*3、E1514K、C1201Y、P1452L、S952*、C1164Y、D1399Y、S507G、Q824*、D1507N、H2324Tfs*29、P925T、P1440L、W1466C、P1502L、A1629V、R1645*、N1700Tfs*9、P1869L、Q65*、A171V、R202*、R580Q、A627V、Q1082*、N1236Kfs*2、N1286S、R1312*、R1356*、C1385F、H1451L、R1462*、Y1467N、Y1467H、R1478H、R1627Q、R86*、R370H、R397*、R754C、P842S、I997V、E1014*和它们的任何组合。
在一些实施方案中，MYC突变包括但不限于E61T、E68I、R74Q、R75N、W135E、W136E、V394D、L420P、W96E、V325D、L351P、N端的41个氨基酸缺失的MYC蛋白(dN2MYC)、N26S、S161L、P74L、V7M、F153S、E54D、P246、L164V、P74S、A59V、T73I、P72T、T73A、H374R、P17S、T73N、S264N、P72S、Q52del、S21T、P74A、S107N、P75S、S77P、P261S、P74Q、S190R、A59T、F153C、P75H、T73I、S77F、N11S、S21N、P78L、P72L、N9K、S190N、S267F、T73P、P78S、G105D、S187C、L71M、Q10H、L191x、Q50x、L191F、R25K、F130L、Y27S、D195N、D2G、V20A、V6G、V20I、D2H、P75A、G152D、P74T、C40Y、E8K、Q48x和它们的任何组合。
在一些实施方案中，EZH2突变与改变的组蛋白甲基化模式相关联。在一些实施方案中，EZH2突变导致氨基酸Y641(相当于催化结构域Y646)转化成F、N、H、S或C，导致H3K27的超三甲基化和驱动淋巴瘤生成。在一些实施方案中，EZH2突变包括EZH2 SET结构域突变、过度表达EZH2、过度表达其他PRC2亚基、组蛋白乙酰基转移酶(HAT)的功能丧失突变和MLL2的功能丧失。EZH2 Y646突变杂合细胞导致H3K27相对于EZH2蛋白野生型(WT)纯合细胞或相对于Y646突变纯合细胞的超三甲基化。
在一些实施方案中，EZH2突变包括但不限于Y646F、Y646N、D185H、Y646F、Y646S、Y646H、R690H、Y646X、E745K、Y646C、V626M、V679M、R690H、R684H、A682G、E249K、G159R、R288Q、N322S、A692V、R690C、D730*(插入移码)、S695L、R684C、M667T、R288*、S644*、D192N、K550T、Q653E、D664G、R347Q、Y646C、G660R、R213C、A255T、S538L、N693K、I55M、R561H、A692V、K515R、Y733*、R63*、Q570*、Q328*、R25Q、T467P、A656V、T573I、C571Y、E725K、R16W、P577L、F145S、V680M、G686D、G135R、K634E、S652F、R298C、G648E、R566H、L149R、R502Q、Y731D、R313W、N675K、S652C、T374Hfs*3、N152Ifs*15、E401Kfs*22、K406Mfs*17、E246*、S624C、I146T、V626M、L674S、H694R、A581S和它们的任何组合。
在一些实施方案中，JAK2突变是在JAK2基因中的突变，包括但不限于T1923C突变与G1920T突变、G1920T/C1922T突变或G1920A突变的组合。在一些实施方案中，JAK2突变是包含一个或多个取代的突变体JAK2蛋白，所述一个或多个取代包括但不限于V617F、V617I、R683G、N542_E543del、E543_D544del、R683S、R683X、F537_K539delinsL(同框缺失)、K539L、N1108S、R1113H、R1063H、R487C、I540Mfs*3(缺失-移码)、R867Q、K539L、G571S、R1113C、R938Q、R228Q、L830*、E1080*、K539L、C618R、R564Q、D1036H、L1088S、H538Nfs*4、D873N、V392M、I682F、L393V、M535I、C618R、T875N、L611V、D319N、L611S、G921S、H538Y、S1035L和它们的任何组合。
在一些实施方案中，FBXW7突变是选自由W244*(*：终止密码子)、R222*、R278*、E192A、S282*、E113D、R465H/C、726+1G>A剪接、R505C、R479Q、R465C、R367*、R499Vfs*25(fs*：移码)、R658*、D600Y、D520N、D520Y和它们的任何组合组成的组的点突变。在进一步实施方案中，FBXW7突变是双突变或三突变，包括但不限于R479Q和S582L、R465H和S582L、D520N、D520Y和R14Q和R367*和S582L。
在一些实施方案中，CCND3突变包括但不限于S259A、R271Pfs*53(插入引起的移码)、E51*、Q260*、P199S、T283A、T283P、V287D、D286_T288del、R271Gfs*33、Q276*、R241Q、D238G、R33P、I290K、I290T、I290R、P267fs、P284S、P284L、P100S、E253D、S262I、R14W、R114L、D238N、A266E、R167W和它们的任何组合。
在一些实施方案中，GNA11突变包括但不限于Q209L、R183C、T257＝、R183C、G208Afs*16、Q209H、R183C、Q209P、Q209R、Q209H、？T96＝、R210W、R256Q、T334＝、G48D、S53G、Q209P、R213Q和它们的任何组合。在一些实施方案中，GNA11突变具有在外显子4中的两个突变，例如在V182中的突变和在T175中的突变或在外显子5中的一个或多个突变。
2.与PD-1和PD-L1抑制剂组合
在一些实施方案中，提供给癌症患者的TIL疗法可以包括单独治疗性TIL群体治疗或可以包括组合治疗，所述组合治疗包括TIL和一种或多种PD-1和/或PD-L1抑制剂。
程序性死亡1(PD-1)是由T细胞、B细胞、自然杀手(NK)T细胞、活化的单核球和树突细胞表达的288个氨基酸的跨膜免疫检查点受体蛋白质。PD-1(还称为CD279)属于CD28家族，并且在人类中由染色体2上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、跨膜区和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)的细胞内结构域组成。已知PD-1和其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受性中发挥关键作用，如Keir等人,Annu.Rev.Immunol.2008,26,677-704所述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(还称为B7-H1或CD274)和PD-L2(还称为B7-DC或CD273)在肿瘤细胞和基质细胞上表达，所述细胞可遭遇表达PD-1的活化的T细胞，导致T细胞的免疫抑制。PD-L1是由人染色体9上的Cd274基因编码的290个氨基酸的跨膜蛋白。使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1和其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用可克服免疫抗性，如最近的临床研究所示，诸如Topalian等人,N.Eng.J.Med.2012,366,2443-54中所述者。PD-L1在许多肿瘤细胞系上表达，而PD-L2大多在树突细胞和少数肿瘤细胞系上表达表达。除了T细胞(其在活化后诱导性表达PD-1)之外，PD-1也在B细胞、自然杀手细胞、巨噬细胞、活化的单核球和树突细胞上表达。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂可为本领域中已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。具体来说，它是以下段落更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。参考PD-1抑制剂的术语“抑制剂(inhibitor)”、“拮抗剂(antagonist)”和“阻断剂(blocker)”在本文中可互换使用。为了避免疑义，本文中提及的作为抗体的PD-1抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑义，本文中提及的PD-1抑制剂也可指小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
在一个优选实施方案中，PD-1抑制剂是抗体(即，抗PD-1抗体)、其片段(包括Fab片段)或其单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是多克隆抗体。在优选实施方案中，PD-1抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂与PD-1竞争结合和/或与PD-1上的表位结合。在一个实施方案中，抗体与PD-1竞争结合和/或与PD-1上的表位结合。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是以约100pM或更低的KD与人PD-1结合、以约90pM或更低的KD与人PD-1结合、以约80pM或更低的KD与人PD-1结合、以约70pM或更低的KD与人PD-1结合、以约60pM或更低的KD与人PD-1结合、以约50pM或更低的KD与人PD-1结合、以约40pM或更低的KD与人PD-1结合、以约30pM或更低的KD与人PD-1结合、以约20pM或更低的KD与人PD-1结合、以约10pM或更低的KD与人PD-1结合或以约1pM或更低的KD与人PD-1结合者。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是以约7.5×105l/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合、以约8×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合、以约9×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合、以约9.5×105l/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合或以约1×106 1/M·s或更快的k缔合与人PD-1结合者。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是以约2×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合或以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合者。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合、以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合或以约1nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合者。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗(以OPDIVO市售，Bristol-MyersSquibb Co.)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗是阻断PD-1受体的完全人IgG4抗体。在一个实施方案中，抗PD-1抗体是免疫球蛋白G4κ、抗(人CD274)抗体。纳武单抗经指派化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4，并且还称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武单抗的制备和性质描述于美国专利号8,008,449和国际专利公布WO2006/121168中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已描述于Wang等人,Cancer Immunol.Res.2014,2,846-56；Page等人,Ann.Rev.Med.,2014,65,185-202；和Weber等人,J.Clin.Oncology,2013,31,4311-4318中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗的氨基酸序列是如表18所示。纳武单抗具有位于22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”和360”-418”处的重链内二硫键；位于23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键；位于127-214'、127”-214”'处的重链-轻链间二硫键、位于219-219”和222-222”处的重链-重链间二硫键；和位于290、290”处的N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含由SEQ ID NO:158给出的重链和由SEQ IDNO:159给出的轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:158和SEQ IDNO:159所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ IDNO:159所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含纳武单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:160所示的序列并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:161所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:167所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与PD-1结合和/或与PD-1上的相同表位结合。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是药物主管机关参考纳武单抗所批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是纳武单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是纳武单抗。抗PD-1抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是纳武单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是纳武单抗。
表18.与纳武单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002021
Figure BDA0004012625820002031
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗无法切除或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗无法切除或转移性黑素瘤并且以每2周约240mg施用。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗无法切除或转移性黑素瘤并且以每4周约480mg施用。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗无法切除或转移性黑素瘤，并且以每3周约1mg/kg随后在同一天3mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每2周240mg或每4周480mg施用。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，纳武单抗是经施用用于黑素瘤的佐剂治疗。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用用于黑素瘤的佐剂治疗。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用用于黑素瘤的佐剂治疗。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约3mg/kg连同每6周约1mg/kg的伊匹单抗施用以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约360mg连同每6周1mg/kg的伊匹单抗和2周期的铂双重化学疗法施用以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg或每4周480mg施用以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约360mg连同每6周1mg/kg的伊匹单抗施用以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约3mg/kg随后在同一天约1mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每2周240mg施用以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约3mg/kg随后在同一天约1mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每2周240mg每4周480mg施用以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗经典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗经典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗经典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗复发或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗复发或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗复发或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗局部晚期或转移性泌尿上皮癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗局部晚期或转移性泌尿上皮癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗成人或小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗≥40kg的成人或小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗≥40kg的成人或小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约3mg/kg施用以治疗<40kg的小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约3mg/kg随后在同一天1mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每2周240mg施用以治疗≥40kg的成人或小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约3mg/kg随后在同一天1mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每4周480mg施用以治疗≥40kg的成人或小儿患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约1mg/kg随后在同一天3mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每2周240mg施用以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每3周约1mg/kg随后在同一天3mg/kg的伊匹单抗共4剂，接着每4周480mg施用以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每2周约240mg施用以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗是以每4周约480mg施用以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，纳武单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，纳武单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在另一实施方案中，PD-1抑制剂包含派姆单抗(以KEYTRUDA市售，Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)或其抗原结合片段、缀合物或变体。派姆单抗经指派CAS登记号1374853-91-4，并且还称为来伯里兹单抗、MK-3475和SCH-900475。派姆单抗具有免疫球蛋白G4、抗(人蛋白质PDCD1(程序性细胞死亡1))(人-小家鼠单克隆重链)与人-小家鼠单克隆轻链二硫化物的二聚体结构。派姆单抗的结构也可描述为免疫球蛋白G4、抗(人程序性细胞死亡1)；人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')-二硫化物与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)-双二硫化物。派姆单抗的性质、用途和制备描述于国际专利公布号WO 2008/156712 A1、美国专利号8,354,509和美国专利申请公布号US 2010/0266617 A1、US 2013/0108651 A1和US 2013/0109843 A2中，其公开内容以引用的方式并入本文中。派姆单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已描述于Fuerst,Oncology Times,2014,36,35-36；Robert等人,Lancet,2014,384,1109-17；和Thomas等人,Exp.Opin.Biol.Ther.,2014,14,1061-1064中。派姆单抗的氨基酸序列是如表19所示。派姆单抗包括以下二硫桥：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425和367”-425”和以下糖基化位点(N)：Asn-297和Asn-297”。派姆单抗是IgG4/κ同型，在Fc区具有稳定性S228P突变；在IgG4铰链区中插入这种突变防止一般在IgG4抗体中观察到的半分子的形成。派姆单抗在各重链的Fc结构域内的Asn297处经异质性糖基化，产生完整抗体大约149kDa的分子量。派姆单抗的优势糖形式是岩藻糖基化的无半乳糖双触角聚糖形式(G0F)。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含由SEQ ID NO:168给出的重链和由SEQ IDNO:169给出的轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:168和SEQ IDNO:169所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ IDNO:169所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含派姆单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:170所示的序列并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:171所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:177所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与PD-1结合和/或与PD-1上的相同表位结合。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是药物主管机关参考派姆单抗所批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是派姆单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是派姆单抗。抗PD-1抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是派姆单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是派姆单抗。
表19.与派姆单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002121
Figure BDA0004012625820002131
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且派姆单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且派姆单抗是以约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，其中派姆单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，其中派姆单抗是每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗NSCLC。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗NSCLC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗SCLC。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗SCLC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗HNSCC。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗HNSCC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗成人的经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约2mg/kg(至多200mg)施用以治疗小儿的经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗泌尿上皮癌。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗泌尿上皮癌。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌症。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗成人的MSI-H或dMMR癌症。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约2mg/kg(至多200mg)施用以治疗小儿的MSI-H或dMMR癌症。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷结直肠癌(dMMR CRC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗胃癌。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗胃癌。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗食道癌。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗食道癌。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗宫颈癌。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗宫颈癌。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗HCC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗成人的梅克尔细胞癌(MCC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗成人的MCC。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约2mg/kg(至多200mg)施用以治疗小儿的MCC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg连同每天两次口服阿西替尼(axitinib)5mg施用以治疗成人的RCC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗子宫内膜癌。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg连同每日一次口服乐伐替尼(lenvatinib)20mg施用以治疗不是MSI-H或dMMR的肿瘤子宫内膜癌。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗成人的高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗成人的TMB-H癌症。在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约2mg/kg(至多200mg)施用以治疗小儿的TMB-H癌症。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗cSCC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一些实施方案中，派姆单抗是以每3周约200mg施用以治疗三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，派姆单抗是以每6周约400mg施用以治疗TNBC。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一个实施方案中，如果患者或受试者是成人(即治疗成人适应症)，可采用每6周400mg的另外的投药方案。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始。在一些实施方案中，派姆单抗施用是在IL-2施用后1、2或3天开始。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用。在一些实施方案中，派姆单抗也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是市售抗PD-1单克隆抗体，诸如抗m-PD-1克隆J43(Cat#BE0033-2)和RMP1-14(Cat#BE0146)(Bio X Cell,Inc.,West Lebanon,NH,USA)。一些市售抗PD-1抗体是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是公开于美国专利号8,354,509或美国专利申请公布号2010/0266617 A1、2013/0108651 A1、2013/0109843 A2(其公开内容以引用的方式并入本文中)中的抗体。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是描述于美国专利号8,287,856、8,580,247和8,168,757和美国专利申请公布号2009/0028857 A1、2010/0285013 A1、2013/0022600 A1和2011/0008369 A1(其教导由此以引用的方式并入本文中)中的抗PD-1抗体。在另一实施方案中，PD-1抑制剂是公开于美国专利号8,735,553 B1(其公开内容以引用的方式并入本文中)中的抗PD-1抗体。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是匹利珠单抗(还称为CT-011)，它描述于美国专利号8,686,119(其公开内容以引用的方式并入本文中)中。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂可为小分子或肽或肽衍生物(诸如描述于美国专利号8,907,053；9,096,642和9,044,442和美国专利申请公布号US 2015/0087581中的那些)；1,2,4-噁二唑化合物和衍生物(诸如描述于美国专利申请公布号2015/0073024中的那些)；环状拟肽化合物和衍生物(诸如描述于美国专利申请公布号US 2015/0073042中的那些)；环状化合物和衍生物(诸如描述于美国专利申请公布号US 2015/0125491中的那些)；1,3,4-噁二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物(诸如描述于国际专利申请公布号WO 2015/033301中的那些)；基于肽的化合物和衍生物(诸如描述于国际专利申请公布号WO 2015/036927和WO 2015/04490中的那些)或基于巨环肽的化合物和衍生物(诸如描述于美国专利申请公布号US 2014/0294898中的那些)；其中每一者的公开内容由此以全文引用的方式并入。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是西米普利单抗(cemiplimab)，其可购自Regeneron,Inc。
在一个实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂可为本领域中已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、抗拮剂或阻断剂。具体来说，它是以下段落更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。参考PD-L1和PD-L2抑制剂的术语“抑制剂(inhibitor)”、“拮抗剂(antagonist)”和“阻断剂(blocker)”在本文中可互换使用。为了避免疑义，本文中提及的作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑义，本文中提及的PD-L1或PD-L2抑制剂可指化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方案中，本文所述的组合物、工艺和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂是小分子。在一个优选实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂是抗体(即，抗PD-1抗体)、其片段(包括Fab片段)或其单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂是多克隆抗体。在一个优选实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂与PD-L1或PD-L2竞争结合和/或与PD-L1或PD-L2上的表位结合。在一个实施方案中，抗体与PD-L1或PD-L2竞争结合和/或与PD-L1或PD-L2上的表位结合。
在一些实施方案中，本文中所提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具选择性，即所述化合物以大体上低于它们与其他受体(包括PD-L2受体)结合或相互作用的浓度与PD-L1结合或相互作用。在某些实施方案中，所述化合物与PD-L1受体结合的结合常数是与PD-L2受体结合的至少约2倍高浓度、约3倍高浓度、约5倍高浓度、约10倍高浓度、约20倍高浓度、约30倍高浓度、约50倍高浓度、约100倍高浓度、约200倍高浓度、约300倍高浓度或约500倍高浓度。
在一些实施方案中，本文中所提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具选择性，即所述化合物以大体上低于它们与其他受体(包括PD-L1受体)结合或相互作用的浓度与PD-L2结合或相互作用。在某些实施方案中，所述化合物与PD-L2受体结合的结合常数是与PD-L1受体结合的至少约2倍高浓度、约3倍高浓度、约5倍高浓度、约10倍高浓度、约20倍高浓度、约30倍高浓度、约50倍高浓度、约100倍高浓度、约200倍高浓度、约300倍高浓度或约500倍高浓度。
不受任何理论束缚，据信肿瘤细胞表达PD-L1并且T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞的PD-L1表达并非PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂功效所需。在一个实施方案中，肿瘤细胞表达PD-L1。在另一实施方案中，肿瘤细胞不表达PD-L1。在一些实施方案中，所述方法可以包括PD-1和PD-L1抗体的组合(诸如本文所述的那些)与TIL的组合。PD-1和PD-L1抗体和TIL的组合可同时或依序施用。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂是以约100pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约90pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约80pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约70pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约60pM或更低的KD、以约50pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约40pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合或以约30pM或更低的KD与人PD-L1和/或PD-L2结合者。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂是以约7.5×1051/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约8×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约9×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合或以约1×106 1/M·s或更快的k缔合与人PD-L1和/或PD-L2结合者。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂是以约2×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-L1或PD-L2结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.2×10-51/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-1结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-L1或PD-L2结合或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离与人PD-L1或PD-L2结合者。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂是以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合；或以约1nM或更低的IC50阻断人PD-1或阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合者。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是德瓦鲁单抗，还称为MEDI4736(它可由AstraZeneca plc.的子公司Medimmune,LLC,Gaithersburg,Maryland市售)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是公开于美国专利号8,779,108或美国专利申请公布号2013/0034559(其公开内容以引用的方式并入本文中)中的抗体。德瓦鲁单抗的临床功效已描述于Page等人,Ann.Rev.Med.,2014,65,185-202；Brahmer等人,J.Clin.Oncol.2014,32,5s(supplement,abstract 8021)；和McDermott等人,CancerTreatment Rev.,2014,40,1056-64中。德瓦鲁单抗的制备和性质描述于美国专利号8,779,108中，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的氨基酸序列是如表20所示。德瓦鲁单抗单克隆抗体包括位于22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429和371”-429'处的二硫键；和位于Asn-301和Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含由SEQ ID NO:178给出的重链和由SEQ IDNO:179给出的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:178和SEQID NO:179所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含德瓦鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:180所示的序列并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:181所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:180和SEQ ID NO:181所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与PD-L1结合和/或与PD-L1上的相同表位结合。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是药物主管机关参考德瓦鲁单抗所批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是德瓦鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是德瓦鲁单抗。
表20.与德瓦鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002271
Figure BDA0004012625820002281
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗，还称为MSB0010718C(可由MerckKGaA/EMD Serono市售)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和性质描述于美国专利申请公布号US 2014/0341917 A1中，其公开内容特别地以引用的方式并入本文中。阿维鲁单抗的氨基酸序列是如表21所示。阿维鲁单抗具有位于22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”和370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；位于22'-90'、138'-197'、22”'-90”'和138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；位于223-215'和223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；位于229-229”和232-232”处的重链-重链内二硫键(h 11,h 14)；位于300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合物双触角CHO型聚糖；和位于450和450'处的H CHS K2 C端赖氨酸截断。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含由SEQ ID NO:188给出的重链和由SEQ IDNO:189给出的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:188和SEQID NO:189所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ IDNO:189所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:190所示的序列并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:191所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:190和SEQ ID NO:191所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与PD-L1结合和/或与PD-L1上的相同表位结合。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是药物主管机关参考阿维鲁单抗所批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是阿维鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是阿维鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是阿维鲁单抗。
表21.与阿维鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002311
Figure BDA0004012625820002321
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗，还称为MPDL3280A或RG7446(以TECENTRIQ市售，Roche Holding AG的子公司Genentech,Inc.,Basel,Switzerland)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是公开于美国专利号8,217,149(其公开内容特别地以引用的方式并入本文中)中的抗体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是公开于美国专利申请公布号2010/0203056 A1、2013/0045200 A1、2013/0045201A1、2013/0045202 A1或2014/0065135 A1(其公开内容特别地以引用的方式并入本文中)中的抗体。阿特珠单抗的制备和性质描述于美国专利号8,217,149中，其公开内容以引用的方式并入本文中。阿特珠单抗的氨基酸序列是如表22所示。阿特珠单抗具有位于22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”和368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；位于23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；位于221-214'和221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；位于227-227”和230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11,h 14)；和位于298和298'处的N-糖基化位点(HCH2 N84.4>A)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含由SEQ ID NO:198给出的重链和由SEQ IDNO:199给出的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:198和SEQID NO:199所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ IDNO:199所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含阿特珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:200所示的序列并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:201所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:200和SEQ ID NO:201所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与PD-L1结合和/或与PD-L1上的相同表位结合。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是药物主管机关参考阿特珠单抗所批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是阿特珠单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是阿特珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是阿特珠单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是阿特珠单抗。
表22.与阿特珠单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002351
Figure BDA0004012625820002361
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括那些描述于美国专利申请公布号US 2014/0341917 A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)中的抗体。在另一实施方案中，也包括与任何这些抗体竞争与PD-L1结合的抗体。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是MDX-1105(还称为BMS-935559)，它公开于美国专利号US 7,943,743(其公开内容以引用的方式并入本文中)中。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利号US 7,943,743(其以引用的方式并入本文中)中的抗PD-L1抗体。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是市售单克隆抗体，诸如INVIVOMAB抗m-PD-L1克隆10F.9G2(目录#BE0101，Bio X Cell,Inc.，West Lebanon,NH,USA)。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是市售单克隆抗体，诸如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。一些市售抗PD-L1抗体是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，PD-L2抑制剂是市售单克隆抗体，诸如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2aκ同型(目录#329602Biolegend,Inc.，San Diego,CA)、σ抗PD-L2抗体(目录#SAB3500395，σ-Aldrich Co.，St.Louis,MO)或本领域技术人员已知的其他市售抗PD-L2抗体。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，所述方法还包括施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
3.与CTLA-4抑制剂的组合
在一些实施方案中，提供给癌症患者的TIL疗法可以包括单独治疗性TIL群体治疗或可以包括组合治疗，所述组合治疗包括TIL和一种或多种CTLA-4抑制剂。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)是免疫球蛋白超家族的成员并且在辅助T细胞的表面上表达。CTLA-4是CD28依赖性T细胞活化的负调节子并且充当适应性免疫反应的检查点。与T细胞共刺激蛋白CD28类似，CTLA-4结合抗原在细胞上呈现CD80和CD86。CTLA-4向T细胞递送抑制因子信号，而CD28递送刺激信号。针对人CTLA-4的人抗体已被描述为在许多疾病病况中的免疫刺激调节剂，诸如治疗或预防病毒和细菌感染和用于治疗癌症(WO 01/14424和WO 00/37504)。一些完全人抗人CTLA-4单克隆抗体(mAb)已经在用于治疗各种类型的实体肿瘤的临床试验中进行研究，包括但不限于伊匹单抗(MDX-010)和曲美木单抗(CP-675,206)。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂可为本领域中已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。具体来说，它是以下段落更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。参考CTLA-4抑制剂的术语“抑制剂(inhibitor)”、“拮抗剂(antagonist)”和“阻断剂(blocker)”在本文中可互换使用。为了避免疑义，本文中提及的作为抗体的CTLA-4抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑义，在本文中提及CTLA-4抑制剂也可指小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
用于本发明方法中的合适CTLA-4抑制剂包括但不限于抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹单抗)、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4纤连蛋白、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激活共刺激途径的CTLA-4抑制剂、PCT公布号WO 2001/014424中公开的抗体、PCT公布号WO 2004/035607中公开的抗体、美国公布号2005/0201994中公开的抗体和授予欧洲专利号EP 1212422 B1中公开的抗体(其中每一者的公开内容以引用的方式并入本文中)。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227和6,984,720；PCT公布号WO 01/14424和WO 00/37504；和美国公布号2002/0039581和2002/086014(其中每一者的公开内容以引用的方式并入本文中)中。可用于本发明方法中的其他抗CTLA-4抗体包括例如以下文献中公开的那些：WO 98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,J.Clin.Oncology,22(145):摘要编号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,CancerRes.,58:5301-5304(1998)和美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003和7,132,281(其中每一者的公开内容以引用的方式并入本文中)。
另外的CTLA-4抑制剂包括但不限于以下：任何能够破坏CD28抗原与其同源配体结合的能力、抑制CTLA-4与其同源配体结合的能力、经由共刺激途径放大T细胞反应、破坏B7与CD28和/或CTLA-4结合的能力、破坏B7活化共刺激途径的能力、破坏CD80与CD28和/或CTLA-4结合的能力、破坏CD80活化共刺激途径的能力、破坏CD86与CD28和/或CTLA-4结合的能力、破坏CD86活化共刺激途径的能力和破坏一般共刺激途径被活化的抑制剂。这必然包括CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的纤连蛋白；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的RNAi抑制剂(单股和双股)，以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂以约10-6M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低、10-12M或更低(例如介于10-13M与10-16M之间)或具有前述值中的任两者作为终点的任何范围内的Kd与CTLA-4结合。在一些实施方案中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂以不超过伊匹单抗10倍的Kd与CTLA-4结合。在一些实施方案中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂以约相同或小于伊匹单抗(例如低至多10倍或低至多100倍)的Kd与CTLA-4结合。在一些实施方案中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值分别高于伊匹单抗介导的对CTLA-4与CD80或CD86的结合的抑制不超过10倍。在一些实施方案中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值分别约相同或小于(例如低至多10倍或低至多100倍)伊匹单抗介导的对CTLA-4与CD80或CD86的结合的抑制。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂的用量足以抑制CTLA-4的表达和/或降低CTLA-4的生物活性达相对于合适对照至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如介于50％与75％、75％与90％或90％与100％之间。在一些实施方案中，CTLA-4途径抑制剂的用量通过减少CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合足以降低CTLA-4的生物活性达相对于合适对照至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于合适对照介于50％与75％、75％与90％或90％与100％之间。在评估或定量相关剂的效应的上下文中的合适对照一般是可相当的生物系统(例如细胞或受试者)，所述可相当的生物系统尚未以相关剂(例如CTLA-4途径抑制剂)暴露或处理(或已经以可忽略量暴露或处理)。在一些实施方案中，生物系统可充当其本身的对照(例如，可在以所述剂暴露或处理之前评估生物系统，并与在暴露或处理已开始或结束之后的状态比较)。在一些实施方案中，可使用历史对照。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(以Yervoy市售，Bristol-MyersSquibb Co.)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹单抗是指抗CTLA-4抗体，它是衍生自具有编码重链和轻链的人基因以产生功能性人谱系的转基因小鼠的完全人IgG 1κ抗体。伊匹单抗也可以其CAS登记号477202-00-9指称并且参考PCT公布号WO 01/14424，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。它作为抗体10DI公开。具体来说，伊匹单抗含有轻链可变区和重链可变区(具有包含SEQ ID NO:211的轻链可变区和具有包含SEQ ID NO:210的重链可变区)。伊匹单抗的药物组合物包括含有伊匹单抗和一种或多种稀释剂、媒剂或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹单抗的药物组合物的实例描述于国际专利申请公布号WO 2007/67959中。伊匹单抗可经静脉内(IV)施用。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含由SEQ ID NO:208给出的重链和由SEQ IDNO:209给出的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:208和SEQID NO:209所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ IDNO:209所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:210所示的序列并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:211所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与CTLA-4结合和/或与CTLA-4上的相同表位结合。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是药物主管机关参考伊匹单抗所批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是伊匹单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。伊匹单抗的氨基酸序列是如表23所示。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是伊匹单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是伊匹单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是伊匹单抗。
表23.伊匹单抗的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002421
Figure BDA0004012625820002431
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，伊匹单抗施用是在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗无法切除或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每3周约mg/kg最多4剂施用以治疗无法切除或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，伊匹单抗是经施用用于黑素瘤的佐剂治疗。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每3周约10mg/kg共4剂随后每12周10mg/kg达至多3年施用用于黑素瘤的佐剂治疗。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每3周约1mg/kg和在同一天随后立即3mg/kg的纳武单抗共4剂施用以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，在完成4剂的所述组合之后，可根据晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌的标准投药方案施用纳武单抗作为单一剂。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每3周约1mg/kg静脉内30分钟和在同一天随后立即3mg/kg的纳武单抗静脉内30分钟共4剂施用以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，在完成4剂的所述组合之后，根据微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌的标准投药方案所建议，施用纳武单抗作为单一剂。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每3周约3mg/kg静脉内30分钟和在同一天随后立即1mg/kg的纳武单抗静脉内30分钟共4剂施用以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，在完成4剂的所述组合之后，根据肝细胞癌的标准投药方案，施用纳武单抗作为单一剂。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每6周约1mg/kg连同每2周3mg/kg的纳武单抗施用以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每6周约1mg/kg连同每3周360mg的纳武单抗和2周期的铂双重化学疗法施用以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，伊匹单抗是以每6周约1mg/kg连同每3周360mg的纳武单抗施用以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，伊匹单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
曲美木单抗(还称为CP-675,206)是完全人IgG2单克隆抗体并且具有CAS编号745013-59-6。美国专利号6,682,736(以引用的方式并入本文中)公开曲美木单抗为抗体11.2.1。曲美木单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中给出。曲美木单抗已经在用于治疗各种肿瘤包括黑素瘤和乳癌的临床试验中进行研究；其中曲美木单抗是以每4或12周0.01和15mg/kg剂量范围作为单一剂量或多个剂量静脉内施用。在本发明提供的方案中，曲美木单抗是局部、特别是皮内或皮下施用。皮内或皮下施用的曲美木单抗的有效量一般是在每人5至200mg/剂量范围内。在一些实施方案中，曲美木单抗的有效量是在每人每剂量10至150mg/剂量范围内。在一些特定实施方案中，曲美木单抗的有效量是每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200mg/剂量。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含由SEQ ID NO:218给出的重链和由SEQ IDNO:219给出的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:218和SEQID NO:219所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ IDNO:219所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含曲美木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:220所示的序列并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:221所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:224所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与CTLA-4结合和/或与CTLA-4上的相同表位结合。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是药物主管机关参考曲美木单抗所批准的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是曲美木单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。曲美木单抗的氨基酸序列是如表24所示。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是曲美木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是曲美木单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是曲美木单抗。
表24.曲美木单抗的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002491
Figure BDA0004012625820002501
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，曲美木单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，曲美木单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，曲美木单抗施用是在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，曲美木单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施方案中，曲美木单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始。在一些实施方案中，曲美木单抗施用也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是来自Agenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗是完全人单克隆抗体。泽弗利单抗经指派化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9，并且还称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备和性质描述于美国专利号10,144,779和美国专利申请公布号US2020/0024350A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含由SEQ ID NO:228给出的重链和由SEQ IDNO:229给出的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:228和SEQID NO:229所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ IDNO:229所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含泽弗利单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:230所示的序列并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:231所示的序列或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示的序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示的序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示的序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示的序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示的序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有如SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233和SEQ ID NO:234所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代，和分别具有如SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236和SEQ ID NO:237所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域或它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体和任何前述抗体竞争与CTLA-4结合和/或与CTLA-4上的相同表位结合。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是药物主管机关参考泽弗利单抗所批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是泽弗利单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。泽弗利单抗的氨基酸序列是如表25所示。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或提交授权书的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体在与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中提供，其中所述参考药品或参考生物产品是泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物主管机关(诸如美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是泽弗利单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为还包含一种或多种赋形剂的组合物提供，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是泽弗利单抗。
表25.泽弗利单抗的氨基酸序列。
Figure BDA0004012625820002541
Figure BDA0004012625820002551
另外的抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659和ADG116，它们是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是以下专利公布中任一者公开的抗CTLA-4抗体：US 2019/0048096 A1；US 2020/0223907；US 2019/0201334；US 2019/0201334；US2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO2006/12168；和WO1997020574，其中每一者以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227和6,984,720；PCT公布号WO 01/14424和WO 00/37504；和美国公布号2002/0039581和2002/086014；和/或美国专利号5,977,318、6,682,736,7,109,003和7,132,281(其中每一者以引用的方式并入本文中)中。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是例如以下文献中公开的那些：WO 98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,10067-10071(1998)；Camacho等人,J.Clin.Oncol.,2004,22,145(摘要编号2505(2004)(抗体CP-675206)；或Mokyr等人,Cancer Res.,1998,58,5301-5304(1998)，其中每一者以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是如WO 1996/040915(以引用的方式并入本文中)中公开的CTLA-4配体。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是CTLA-4表达的核酸抑制剂。例如，抗CTLA-4RNAi分子可采用PCT公布号WO 1999/032619和WO 2001/029058；美国公布号2003/0051263、2003/0055020、2003/0056235、2004/265839、2005/0100913、2006/0024798、2008/0050342、2008/0081373、2008/0248576和2008/055443；和/或美国专利号6,506,559、7,282,564、7,538,095和7,560,438(以引用的方式并入本文中)中所述的分子的形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子采用欧洲专利号EP 1309726(以引用的方式并入本文中)中所述的双股RNAi分子的形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子采用美国专利号7,056,704和7,078,196(以引用的方式并入本文中)中所述的双股RNAi分子的形式。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是国际专利申请公布号WO 2004/081021(以引用的方式并入本文中)中所述的适体。
在其他实施方案中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子是美国专利号5,898,031、6,107,094、7,432,249和7,432,250和欧洲申请号EP 0928290(以引用的方式并入本文中)中所述的RNA分子。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用CTLA-4抑制剂的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)CTLA-4抑制剂。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)CTLA-4抑制剂和(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)CTLA-4抑制剂和(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
4.患者的淋巴细胞耗尽预处理
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的TIL之前经非骨髓清除性化学疗法预处理。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗已经非骨髓清除性化学疗法预处理的患者的癌症的TIL群体。在一个实施方案中，TIL群体是用于输注施用。在一个实施方案中，非骨髓清除性化学疗法是环磷酰胺60mg/kg/d共2天(TIL输注之前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d共5天(TIL输注之前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开的非骨髓清除性化学疗法和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时接受720,000IU/kg静脉内IL-2(阿地白介素，以PROLEUKIN市售)的静脉内输注至生理耐受。在某些实施方案中，TIL群体是与IL-2组合用于治疗癌症，其中IL-2在TIL群体之后施用。
实验发现指示，在肿瘤特异性T淋巴细胞的过继性转移之前的淋巴细胞耗尽通过消除调节T细胞和免疫系统的竞争元件(“细胞因子汇”)发挥增强治疗功效的关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前，对患者进行淋巴细胞耗尽步骤(有时还称为“免疫抑制性调理”)。
一般说来，淋巴细胞耗尽是使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)和其组合的施用达成。此类方法描述于Gassner等人,Cancer Immunol.Immunother.2011,60,75-85，Muranski等人,Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668-681，Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-5239，和Dudley等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-2357中，所有文献皆以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，氟达拉滨是以0.5μg/mL至10μg/mL的氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨是以1μg/mL的氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，氟达拉滨是以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35mg/kg/天施用2-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35mg/kg/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以25mg/kg/天施用4-5天。
在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/mL至10μg/mL的浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得1μg/mL的浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，环磷酰胺是以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方案中，环磷酰胺是经静脉内施用(即i.v.)。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以35mg/kg/天施用2-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250mg/m2/天i.v.施用4-5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250mg/m2/天i.v.施用4天。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过向患者一起施用氟达拉滨和环磷酰胺来执行。在一些实施方案中，氟达拉滨是以25mg/m2/天i.v.施用并且环磷酰胺是以250mg/m2/天i.v.施用4天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为60mg/m2/天的环磷酰胺共两天并且随后施用25mg/m2/天的剂量的氟达拉滨持续五天来执行。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为60mg/m2/天的环磷酰胺共两天和施用25mg/m2/天的剂量的氟达拉滨持续五天来执行，其中环磷酰胺和氟达拉滨两者皆在前两天施用，并且其中淋巴细胞耗尽总共执行五天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为约50mg/m2/天的环磷酰胺共两天和施用剂量为约25mg/m2/天的氟达拉滨共五天执行，其中环磷酰胺和氟达拉滨两者皆在前两天施用，并且其中淋巴细胞耗尽总共执行五天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为约50mg/m2/天的环磷酰胺共两天和施用剂量为约20mg/m2/天的氟达拉滨共五天执行，其中环磷酰胺和氟达拉滨两者皆在前两天施用，并且其中淋巴细胞耗尽总共执行五天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为约40mg/m2/天的环磷酰胺共两天和施用剂量为约20mg/m2/天的氟达拉滨共五天执行，其中环磷酰胺和氟达拉滨两者皆在前两天施用，并且其中淋巴细胞耗尽总共执行五天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为约40mg/m2/天的环磷酰胺共两天和施用剂量为约15mg/m2/天的氟达拉滨共五天执行，其中环磷酰胺和氟达拉滨两者皆在前两天施用，并且其中淋巴细胞耗尽总共执行五天。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽是通过施用剂量为60mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为25mg/m2/天的氟达拉滨共两天并且随后施用剂量为25mg/m2/天的氟达拉滨共三天来执行。
在一个实施方案中，环磷酰胺是与美司钠(mesna)一起施用。在一个实施方案中，美司钠是以15mg/kg施用。在一个实施方案中，当美司钠是经输注并且如果经连续输注时，美司钠可与环磷酰胺在大约2小时内输注(在第-5和/或-4天)，接着在与各环磷酰胺剂量同时开始的24小时内剩余的22小时以3mg/kg/小时的速率输注。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽包括始于向患者施用第三TIL群体之后当天使用IL-2疗法来治疗患者的步骤。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽包括始于向患者施用第三TIL群体当天使用IL-2疗法来治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽包括5天的预处理治疗。在一些实施方案中，天数指示为第-5至-1天或第0天至第4天。在一些实施方案中，所述方案包含在第-5和-4天(即第0和1天)的环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含在第-5和-4天(即第0和1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含在第-5和-4天(即第0和1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺是与美司钠一起施用。在一些实施方案中，所述方案还包含氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含在第-5和-1天(即第0至4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含在第-5和-1天(即第0至4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案包含施用剂量为60mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为25mg/m2/天的氟达拉滨共两天并且随后施用25mg/m2/天的剂量的氟达拉滨持续五天的步骤。
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案包含施用剂量为60mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为25mg/m2/天的氟达拉滨共两天并且随后施用剂量为25mg/m2/天的氟达拉滨共三天的步骤。
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表26施用。
表26.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002611
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表27施用。
表27.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002612
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表28施用。
表28.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002613
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表29施用。
表29.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002621
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表30施用。
表30.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002622
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表31施用。
表31.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002623
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表32施用。
表32.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002624
在一些实施方案中，非骨髓清除性淋巴细胞耗尽疗法是根据表33施用。
表33.示例性淋巴细胞耗尽和处理方案。
Figure BDA0004012625820002631
在一些实施方案中，与骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案的前述实施方案一起使用的TIL输注可为本文所述的任何TIL组合物，包括如本文所述的经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且也可以包括输注MIL和PBL来代替TIL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文所述的联合疗法(诸如PD-1和PD-L1抑制剂)。
5.IL-2方案
在一个实施方案中，IL-2方案包含高剂量IL-2方案，其中所述高剂量IL-2方案包含始于施用治疗性TIL群体的治疗有效部分之后当天静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体，其中阿地白介素或其生物类似物或变体是以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者身体质量)的剂量每八小时使用15分钟推注静脉内输注施用直至耐受为止，最多14剂。在休息9天之后，可重复这一安排再施用14剂，最多总共28剂。在一些实施方案中，IL-2是施用1、2、3、4、5或6剂。在一些实施方案中，IL-2是以最大剂量施用多达6剂。
在一个实施方案中，IL-2方案包含渐减IL-2方案。渐减IL-2方案已描述于O’Day等人,J.Clin.Oncol.1999,17,2752-61和Eton等人,Cancer 2000,88,1703-9中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，渐减IL-2方案包含在6小时内静脉内施用18×106IU/m2阿地白介素或其生物类似物或变体，随后在12小时内静脉内施用18×106IU/m2，随后在24小时内静脉内施用18×106IU/m2，随后在72小时内静脉内施用4.5×106IU/m2。这一治疗周期可每28天重复一次，最多四个周期。在一个实施方案中，渐减IL-2方案包含第1天18,000,000IU/m2，第2天9,000,000IU/m2，以及第3和4天4,500,000IU/m2。
在一个实施方案中，IL-2方案包含低剂量IL-2方案。可使用本领域中已知的任何低剂量IL-2方案，包括Dominguez-Villar和Hafler,Nat.Immunology 2000,19,665-673；Hartemann等人,Lancet Diabetes Endocrinol.2013,1,295-305；和Rosenzwaig等人,Ann.Rheum.Dis.2019,78,209-217(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所述的低剂量IL-2方案。在一个实施方案中，低剂量IL-2方案包含每24小时施用每m2 18×106IU的阿地白介素或其生物类似物或变体作为连续输注共5天，随后2-6天不使用IL-2疗法，任选地随后另外5天每24小时每m2 18×106IU的静脉内阿地白介素或其生物类似物或变体作为连续输注，任选地随后3周不使用IL-2疗法，之后可施用另外的周期。
在一个实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。在一个实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用贝加德卢金或其片段、变体或生物类似物。
在一个实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用THOR-707或其片段、变体或生物类似物。
在一个实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用内姆瓦卢金阿法或其片段、变体或生物类似物。
在一个实施方案中，IL-2方案包含施用植入至抗体主链上的IL-2片段。在一个实施方案中，IL-2方案包含施用与IL-2低亲和力受体结合的抗体细胞因子植入蛋白。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和植入至VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中抗体细胞因子植入蛋白优先扩增T效应细胞而非调节T细胞。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和植入至VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中IL-2分子是突变蛋白，并且其中抗体细胞因子植入蛋白优先扩增T效应细胞而非调节T细胞。在一个实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用抗体或其片段、变体或生物类似物，所述抗体包含选自由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:38组成的组的重链和选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39组成的组的轻链。
在一些实施方案中，本文所述的抗体细胞因子植入蛋白具有比起野生型IL-2分子诸如但不限于阿地白介素
Figure BDA0004012625820002651
或可相当的分子较长的血清半衰期。
在一些实施方案中，与骨髓清除性淋巴细胞耗尽方案的前述实施方案一起使用的TIL输注可为本文所述的任何TIL组合物，并且也可以包括输注MIL和PBL来代替TIL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文所述的联合疗法(诸如PD-1和PD-L1抑制剂)。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用IL-2方案的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)IL-2方案。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品和(ii)IL-2方案。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用IL-2方案和PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)IL-2方案和(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)IL-2方案和(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用CTLA-4抑制剂和IL-2方案的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)CTLA-4抑制剂和(iii)IL-2方案。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)CTLA-4抑制剂和(iii)IL-2方案。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用TIL方案的步骤，其中TIL方案包括经基因修饰以表达CCR的TIL产品，并且所述方法还包括施用IL-2方案、CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)IL-2方案、(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和(iii)CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)经基因修饰以表达CCR的TIL产品、(ii)IL-2方案、(iii)PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和(iv)CTLA-4抑制剂。
B.过继性细胞转移
过继性细胞转移(ACT)是一种有效的免疫疗法形式并且涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者。ACT是涉及体外鉴定具有抗肿瘤活性的淋巴细胞、体外大量扩增这些细胞和将它们输注至携带癌症的宿主的治疗方式。用于过继性转移的淋巴细胞可衍生自经切除的肿瘤的基质(肿瘤浸润性淋巴细胞或TIL)。用于ACT的TIL可如本文所述来制备。在一些实施方案中，TIL是根据例如图2A和/或图9描述的方法制备。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)、经混合的淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC)富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆，那么它们也可衍生自或来自血液。其中淋巴细胞源自待输注的携带癌症的宿主的ACT被称为自体ACT。美国专利公布号2011/0052530涉及一种用于执行过继性细胞疗法以促进癌症消退的方法，主要用于治疗罹患转移性黑素瘤的患者，该案以全文引用的方式并入本文中以用于这些方法。在一些实施方案中，TIL可如本文所述来施用。在一些实施方案中，TIL可以单一剂量施用。此类施用可为注射，例如静脉内注射。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多个剂量施用。给药可为每年1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。给药可为一个月一次、每二周一次、每周一次或每两天一次。TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的施用可视需要继续进行。
V.协调细胞扩增产物的制造和患者治疗事件
如本文中所讨论，从患者切除肿瘤至完成TIL制造的时间安排取决于数种因素而异，包括例如可获自患者的肿瘤的大小、在各种制造阶段结束时的细胞计数、执行各种制造阶段的天数等。因此，在安排各种患者治疗事件上需要一定程度的弹性。在一些实施方案中，患者治疗事件包括淋巴细胞耗尽。在一些实施方案中，患者治疗事件包括TIL输注。在一些实施方案中，患者治疗事件包括白细胞单采程序。在一些实施方案中，患者治疗事件包括施用IL-2方案。在一些实施方案中，患者治疗事件包括肿瘤切除。在一些实施方案中，患者治疗事件包括住院以进行手术后治疗。
本公开的一方面提供一种用于实施本文所公开的方法的系统。所述系统可以包括患者入口、制造入口、临床医师入口和物流入口。患者入口使患者或与患者相关联的人(例如照顾者、监护人或法定被授权人)(为了方便参考在本文中一起称为“患者”)得以存取与患者治疗事件的安排有关的信息。患者入口可要求患者提供验证信息以存取这一信息。患者入口也可允许患者编辑与患者有关的信息，例如地址或其他个人信息。
临床医师入口(还称为医院端界面)使门诊(即门诊人员)得以存取和/或编辑与患者、制造工艺、制造设施、物流提供者有关的信息以及与在门诊执行或待执行的各种患者治疗事件有关的信息。
制造入口与医院端界面和物流入口/物流界面通信以确定和传送与制造工艺和/或制造槽的可用性有关的信息。制造入口也使制造标签得以产生，所述制造标签包括本文所公开的各种制造步骤的更新的质量信息。
物流入口(本文中还称为物流界面)与制造入口和医院端界面通信，交换与材料(即实体肿瘤或制造的细胞疗法产品)在门诊与制造设施之间运输的安排有关的信息，包括例如制造安排、制造槽的可用性和患者治疗事件的安排以促进及时运输材料。
用于实施本文所公开的各种方法的系统可在计算系统上通过实施专有计算机程序或通过合适地修改市售软件平台(例如由Vineti、Salesforce.com、Salesforce HealthCloud、IQVIA、TracSel和SAP所提供者)来实施。
修改市售软件平台以便合适地实施系统并且执行一种或多种本文所公开的方法可造成平台执行并非其最初设计用于的工艺。换句话说，在一些实施方案中，修改可基于平台提供的各种工具的非常规用途。在一些实施方案中，用于实施本文所公开的各种方法的系统可以包括软件平台(诸如框架程序)，其整合使物流任务得以自动化的企业资源规划(ERP)系统和使制造任务得以自动化的制造执行系统(MES)。此类框架程序的实例描述于美国专利号7,343,605中，它以全文引用的方式并入本文中。
例如，连同MES应用，来自企业控制层级(企业资源规划层级)和来自自动化层级(控制层级)的应用也可经由框架程序整合并且经由工作站(例如在临床机构、制造设施或快递机构)监测或管理。因此，所述框架程序可形成用于整个患者治疗过程的整合平台，包括患者挂号、摘取肿瘤、运输肿瘤至制造设施、制造治疗性或扩增的细胞疗法产品、运输治疗性细胞疗法产品至临床机构、向患者施用疗法和后续患者治疗事件。来自企业控制层级、MES层级以及自动化层级的不同应用可通过所述框架程序在适配器和/或包装器的协助下简单并且具成本效益地整合。所述框架程序因此必须被视为中介软件平台和制造应用整合工具。终端用户(例如案例管理师)可经由工作站看见待监测的应用的个别状态并且也可存取所述应用的资料和方法。另外，终端用户可通过这一存取将应用彼此连接。
因此，所述框架程序首先使得达成来自不同企业层级的应用的垂直整合成为可能，其次所述框架程序使得在MES层级上的应用得以水平整合。
例如，允许信息存储在平台中的基于软件的案例物件是经存储的信息类型的整体定义。例如，在现成平台中基于软件的案例物件允许存储关于客户查询的信息。以此类物件来说，可有存储有关所述资料类型的具体案例的信息的多个记录。因此，案例记录存储有关个体的训练查询的信息并且另一案例记录存储有关另一个体的配置问题的信息。这些物件可定制以存储与例如患者、用于所述患者的患者治疗事件和对应安排有关的信息。
同样，在现成平台内提供的自动化行动(诸如通知和警示)和工作流程规则(诸如商业逻辑行动)可经修改以触发安排和过程步骤的变更，例如制造工艺变更和基于QA测试结果的制造安排、制造槽的可用性和患者治疗事件安排的后续变更。
在一些实施方案中，本文所公开的系统提供用于确定在制造工艺期间可能的失败点的质量保证特征，诸如美国专利号10,747,209和美国专利号7,799,273(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的那些。
在一些实施方案中，本文所公开的系统提供资料系统，所述资料系统经配置以维持在从获自患者的实体肿瘤(或其片段)制造最终细胞疗法产品的过程期间所建立的电子批次记录的完整性，诸如美国专利号8,491,839(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述的那些。在一些实施方案中，本文所公开的系统包括经调适用于细胞制造工艺的应用软件，其中所述细胞制造工艺产生扩增的细胞疗法产品，诸如T细胞的治疗性群体。所述应用软件是经配置以控制包括在用于细胞制造的密闭系统中的多个装置，诸如透气装置。
在一些实施方案中，本文所公开的系统整合应用软件和本文所公开的细胞制造方法，以提供由多个终端用户使用的全面验证和质量保证方案，由此分析并使用从系统汇总的资料以确定是否达成质量保证方案和验证方案。
在一些实施方案中，所述系统将应用软件应用于多个产品线和/或多个细胞制造设施，由此使用相同系统来监测和控制多个细胞制造线和多个产品线。
在一些实施方案中，所述系统将本文所述的方法实施至细胞制造工艺的细胞培养系统的批次最佳化中，由此随时间连续追踪由细胞培养系统汇总的资料并且使用所述资料分析细胞培养系统。此外，所述资料是经整合并且用于广泛分析细胞制造工艺的质量控制过程。
在一些实施方案中，本文所公开的系统使工作站的设计得以执行制造最终细胞疗法产品的过程的各种步骤。所述工作站可经配置以使与先前步骤相关联的资料得以验证以确保这些过程的完整性并且使补救措施得以进行(可能的话)。此类工作站设计的实例在美国专利号8,041,444(其以全文引用的方式并入本文中)中提供。
在一些实施方案中，本文所公开的系统通过提供存取各个制造商的可用制造安排使医院机构与各个制造商之间得以进行协调，所述各个制造商能够从在医院机构获得的实体肿瘤制造细胞疗法产品。使此类协调得以进行的系统的实例在美国专利8,069,071(其以全文引用的方式并入本文中)中提供。
在一些实施方案中，本文所公开的系统是基于基于云端的架构，所述架构使与细胞疗法产品的制造相关联的各个实体得以实时存取(在适当许可下)与制造和运送细胞疗法产品有关的信息。此类基于云端的架构的实例在美国专利号9,965,562(其以全文引用的方式并入本文中)中提供。
在一些实施方案中，本文所公开的系统使与从患者获得肿瘤、从所述获得的肿瘤制造细胞疗法产品和运送肿瘤和细胞疗法产品相关联的人员得以使用电子签章自行鉴定和验证以进行过程控制和批准，诸如美国专利申请公布号2004/0243260(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述。
在一些实施方案中，所述系统还可包括或在其中并入客户关系管理(CRM)子系统。CRM子系统可将与各当事人(例如医生、医院单位、护理师、收费员、商业联络人等)有关的信息归档。所述信息是以CRM子系统维持，如此得以在一个统一渠道中维持各当事人的单一观点，从而允许在所述系统内以遵守隐私的方式共享基于平台、对潜在客户和当事人的单一渠道观点。与各当事人之间的关系有关的信息可以分散式多重主控端、多重从属端或对等式情境通过去除个人可鉴定信息部分或完全匿名共享至一个或多个分散式从属端或对等CRM系统。此类CRM子系统的一个实例公开于美国专利申请公布号2014/0244351、美国专利号US 8,489,451和美国专利号US 9,342,292(其中每一者以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方案中，本文所述的系统可操作以提供包括中央事件处理子系统的网络，所述中央事件处理子系统用于接受、处理和路由由实时医疗事件和/或制造事件触发的消息。中央事件处理系统例如可鉴定与医疗事件相关联的患者信息并且将患者信息与健康规划、临床位置、TIL制造设施和/或物流提供者中的一者或多者匹配。在将医疗和/或制造事件与相关当事人匹配后，中央事件处理子系统可在触发事件的短时间期间内(例如几乎实时)将关于医疗和/或制造事件的至少一部分信息转发至一个或多个相关当事人。例如，基于与各相关当事人相关联的规则，中央事件处理系统可转发信息和/或发送警示或通知给相关当事人以使相关当事人知悉医疗事件。此类中央事件处理子系统的实例描述于美国专利申请公布号2014/0372147和美国专利号US 10,242,060(其中每一者以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方案中，本文所公开的系统可操作以选择用于癌症治疗方案的工作流程，所述癌症治疗方案包括患者治疗事件例如肿瘤切除、淋巴细胞耗尽、白细胞单采、TIL输注和/或IL-2方案或本文所公开的其他患者治疗事件。在选择工作流程后，所述系统可代替患者产生对应细胞输注疗法的采购单，其中对应细胞输注疗法的订单包括细胞订单请求和对应癌症治疗的指明治疗方案的需求中的至少一者。此类工作流程选择子系统的实例公开于美国专利申请公布号US 2014/0088985(其以全文引用的方式并入本文中)中。
在一些实施方案中，所述系统可以包括通话子系统，所述通话子系统可以包括服务需求验证，包括在与患者或患者代表进行文字或音频通信之前验证远端存取装置。在一些实施方案中，所述验证可通过自动验证远端存取装置或通过向患者(或代表)询问问题来完成。此类通话子系统和验证方法的实例公开于美国专利申请公布号US 2019/0026747(其以全文引用的方式并入本文中)中。
A.用于协调细胞扩增产物的制造的系统
本公开的实施方案包括一种方法和一种系统，所述方法和所述系统用于协调用于患者的细胞疗法产品(例如T细胞或TIL)的制造，并且基于制造工艺的各种阶段的进展和成功动态安排制造工艺的各种阶段以及各种患者治疗事件。
本文所述的方法和系统可进一步操作以提供优于现有系统的特定技术优点，包括在免疫疗法程序期间提供患者特异性生物样品的连续以及自动保管链和身份链，建立相关当事人(诸如患者、医师、制造商和其他医事人员)可使用的计算机化信息入口以快速理解和追踪免疫疗法程序的现行阶段和患者生物样品在程序期间的状态。缺乏维持保管链和身份链的能力导致在制造工艺期间的延迟，对于在对抗危及生命的疾病的患者来说可能极度严重。
本公开的实施方案使生物材料在制造工艺期间(包括QA、制造、释出测试和最终运输处理)的保管链和生物材料在最终产物递送过程期间(包括运输和递送至输注单位)的保管链得以维持。本公开的实施方案进一步使保管链与特定患者得以连续和固定关联，由此确保在所有制造阶段期间患者与生物材料之间的完整身份链。
COC和COI的维持是通过使生物材料从患者经由运送、制造工艺、运送和返回患者的整个旅程期间中的各事件与细胞订单标识符和患者特异性标识符(患者所独有)相关联并追踪整个旅程期间中的各事件来执行。
此外，本文所述的方法和系统可操作以整合和同步从患者获得活组织与制造工艺，以及提供审核从获得活组织至施用细胞疗法产品的各步骤和后续治疗事件的COC和COI的能力。
本文所述的方法和系统可进一步操作以协调从患者获得活组织、递送活组织至所选择的制造设施、在所选择的制造设施制造细胞疗法产品以及从制造设施递送细胞疗法产品至门诊以供患者治疗的物流。
图3A显示根据本公开的一个实施方案的用于协调用于患者的细胞疗法产品的制造的系统的方块图。在一些实施方案中，由图3A的组件执行的功能可整合至单一组件中。此外，在一些实施方案中，由图3A的一个或多个组件执行的功能也可由图3A的其他组件来执行。
参考图3A，系统300可以包括医院端界面110、事件调度器120、物流界面(本文中还称为快递入口)130和/或制造入口140。医院端界面110、事件调度器120、物流界面130和制造入口140中的每一者使用例如通讯网络诸如LAN、WAN(例如互联网)和/或细胞性网络与其他三者通信。
在一些实施方案中，医院端界面110、事件调度器120、物流界面130、制造入口140和对应模块(例如显示于图3中)在市售软件平台(例如由Vineti、Salesforce.com、Salesforce Health Cloud、IQVIA、TracSel和SAP所提供的那些)上经合适地修改或建立。
医院端界面110可与医院或其他负责施用患者治疗(例如提供本文所公开的癌症疗法)的机构相关联或可相互作用。在一些实施方案中，医院端界面110是与执行从患者获得实体肿瘤以及从实体肿瘤或其片段获得细胞疗法产品的程序的临床机构相关联。在一些实施方案中，临床机构的功能仅为获得实体肿瘤，而从实体肿瘤或其片段获得细胞疗法产品的过程可在制造设施处执行。
在一些实施方案中，医院端界面110是与向患者执行获自制造设施的扩增的细胞疗法产品的输注并且提供后续照护和/或任何先前或追踪治疗的医院相关联。医院或门诊的临床医师或雇员可经由医院端界面110与系统300相互作用。
在一些实施方案中，医院端界面110包括一个或多个计算装置，例如桌上型计算机、云端服务器、笔记型计算机、行动装置或任何其他计算装置，所述任何其他计算装置包括在处理器上执行并且与记忆体相互作用的硬体和软件模块。医院端界面110可经由有线或无线连接与计算装置连接，所述计算装置在医院或临床机构处操纵或与医院或临床机构相关联。
在一些实施方案中，医院端界面110可以包括追踪模块112，所述追踪模块经配置用于从患者抽取的时间到输注至患者体内的时间追踪来自患者的生物材料(例如来自患者的肿瘤、获自患者的T细胞、在T细胞扩增过程的各个阶段扩增的T细胞等)。
在一些实施方案中，当患者登记进行TIL输注治疗时，建立用于制造用于患者的扩增的细胞疗法产品的细胞订单请求并且产生与细胞订单请求相关联的细胞订单标识符。在一些实施方案中，采购单是根据细胞订单请求产生并且从医院机构上传至系统。在一些实施方案中，系统可以包括用于产生和/或上传采购单的界面。
此外，产生患者所独有的患者特异性标识符并与细胞订单标识符相关联。在一些实施方案中，患者特异性标识符可以包括例如带有连续后缀的患者ID#，其中所述后缀是按患者依序添加的单一字母(A至Z)。患者特异性标识符在系统中是独特的。在一些实施方案中，只有某些身份可看见患者特异性标识符(详细描述于本文别处)。在一些实施方案中，患者特异性标识符是打印在患者生物材料以及制造的生物材料的旅程中所打印的每张标签上。在一些实施方案中，患者特异性标识符对所有系统用户是只读的。换句话说，在一些实施方案中，患者特异性标识符一旦产生就无法编辑。
在一些实施方案中，细胞订单标识符可以包括信息，例如独特患者标识符、细胞订单标识符、订单码、细胞订单批号、在各个时间点的一个或多个接受参数的值、指示是否符合各个时间点的接受标准的一个或多个指标或它们的组合。
在一些实施方案中，在与患者相关联的任何生物材料(例如从患者抽取的实体肿瘤、其片段、从其中抽取的细胞疗法产品或从扩增细胞疗法产品所获得的扩增的细胞疗法产品)改变监管或进行处理时的各点扫描细胞订单标识符和患者特异性标识符。在从患者抽取的时间到输注至患者体内的时间的整个过程期间，各扫描可通过追踪模块112登入和验证。在整个过程期间的各步骤验证患者特异性标识符确保产物的身份链(COI)，而在整个过程期间的各步骤验证细胞订单标识符确保产物的保管链(COC)。与维持COI和COC有关的细节描述于本文别处。
在一些实施方案中，扫描信息是经由医院机构产生的采购单验证。例如，当制造设施接受运输物时，可扫描运输容器上的标签并且可以采购单验证标签上的信息以确保正确性。在一些实施方案中，将验证结果登入系统内。
应理解，虽然追踪模块112显示于图3A中并且如本文所述作为医院端界面110的一部分，但追踪模块112在一些实施方案中可作为具有处理器和记忆体的独立计算装置。同样，追踪模块112在一些实施方案中也可作为独立软件模块(例如存储在云端服务器)执行。
在一些实施方案中，医院端界面110可经由患者存取模块116提供有限存取给患者，使患者得以获得与治疗程序和对应安排有关的信息。患者存取模块116也可使患者得以提供与自己有关的信息(例如个人鉴定信息、保险信息和与其健康状况有关的信息)给临床医师。
医院端界面110还可包括摘取模块114，所述模块可操作以使临床机构的人员得以根据预定方案从患者获得实体肿瘤，并且输入与用于从患者获得实体肿瘤的程序有关的信息。在一些实施方案中，与用于获得实体肿瘤的程序有关的信息可经归档，如此得以进行事后审核以确保法规遵从性。
在一些实施方案中，摘取模块114可进一步使临床机构的人员得以提供有关实体肿瘤和用于从患者获得实体肿瘤的过程的信息给制造设施。在其中临床机构也可操作以从实体肿瘤获得细胞疗法产品的实施方案中，摘取模块114可使临床机构的人员得以提供有关获得的细胞疗法产品的信息给制造设施，例如用于获得细胞疗法产品的过程或程序和在获得的细胞疗法产品上实施的质量控制分析的结果。
在一些实施方案中，医院端界面110还可包括制造协调模块118。制造协调模块118可操作以使临床机构的用户得以获得与一个或多个制造设施有关的信息，例如一个或多个制造设施中的每一者的制造槽的可用性和可用的产能。制造协调模块118进一步使临床机构的用户得以协调保留选定制造设施的制造槽，并且经由物流界面130与物流提供者协调以安排获自患者的实体肿瘤、其片段或细胞疗法产品的运送。制造协调模块118进一步使临床机构的用户得以经由制造入口140获得与在制造工艺期间实施的制造工艺和/或质量控制分析有关的信息。
事件调度器120可操作以协调在临床机构和制造设施实施的各种活动的安排。此外或替代地，事件调度器120可提供与各种活动的安排有关的信息给物流提供者，以促进临床机构与制造设施(用于制造细胞疗法产品的机构，例如细胞疗法产品扩增在其中发生的机构)之间的细胞疗法产品的运送。如以下更详细描述地，基于在细胞疗法产品的制造期间所发生的不同事件，当其他事件应发生时，事件调度器是经配置以动态安排。
在一些实施方案中，事件调度器120包括计算装置122例如桌上型计算机、服务器、笔记型计算机、行动装置或任何其他计算装置，所述任何其他计算装置包括在处理器上执行并且与记忆体相互作用的硬体和软件模块。硬体和/或软件模块包括接受判定模块123和安排模块125。在一些实施方案中，计算装置122可为可经由医院界面110、制造入口140和物流界面130存取的云端服务器。事件调度器120可经由有线或无线连接与计算装置连接，所述计算装置在制造设施和/或医院机构处操纵或与制造设施和/或医院机构相关联。
应理解，虽然接受判定模块123显示于图3A作为事件调度器120的一部分，但接受判定模块123也可作为制造入口140的一部分执行。或者，接受判定模块123也可作为独立软件模块(例如托管在云端服务器上)执行。
物流界面或快递入口130可与物流提供者(例如快递服务或包裹处理服务)相关联或可相互作用。
在一些实施方案中，物流界面130包括一个或多个计算装置，例如桌上型计算机、云端服务器、笔记型计算机、行动装置或任何其他计算装置，所述任何其他计算装置包括在处理器上执行并且与记忆体相互作用的硬体和软件模块。物流界面130可经由有线或无线连接经由网络诸如互联网与计算装置连接，所述计算装置在物流提供者处操纵或与物流提供者相关联。
制造入口140可与制造扩增的细胞疗法产品的制造设施相关联。制造入口140可操作以使制造设施的人员得以控制和记录在制造扩增的细胞产物期间的各种过程，包括例如维持身份链和保管链、记录与在制造期间实施的质量控制分析有关的信息、记录各种过程之间的转变和在扩增过程期间提供细胞疗法产品的容器的标签。
在一些实施方案中，制造入口140包括一个或多个计算装置，例如桌上型计算机、云端服务器、笔记型计算机、行动装置或任何其他计算装置，所述任何其他计算装置包括在处理器上执行并且与记忆体相互作用的硬体和软件模块。制造入口140可经由有线或无线连接与计算装置连接，所述计算装置在制造设施处操作或与制造设施相关联。
在一些实施方案中，制造入口140包括标记模块142和COC/COI模块144。标记模块142可操作以使制造设施的人员得以产生在制造扩增的细胞疗法产品的工艺期间(本文中还称为扩增过程)携带细胞疗法产品的容器的标签。所述标签可以包括信息，例如患者特异性标识符、与处理容器和/或执行扩增过程的目前和/或先前步骤的人员有关的标识符、在先前步骤中执行的质量控制分析的结果、与产生标签的原因有关的原因码、以患者特异性标识符鉴定细胞疗法产品的条码或2D码(例如QR码)和其他合适信息。
COC/COI模块144可操作以使与制造设施相关联的用户得以在扩增过程期间维持产销监管审核链。COC/COI模块144可进一步操作以使与制造设施相关联的用户得以维持与扩增的细胞疗法产品相关联的患者的身份鉴定审核链。
图3B绘示在市售软件平台上经合适修改或建立的系统300的组件的对象模式(在那些平台内的那些标准物除外)。例如，市售软件平台可具有对应患者存取(包括例如患者标识符、患者接触信息、患者验证信息等)、治疗规划(包括例如患者治疗事件的初始安排)、临床医师存取(例如临床医师标识符和临床医师验证信息)和制造存取(例如制造设施的接触信息)的内置物件。
另一方面，物件(诸如从患者获得实体肿瘤的程序相关联的肿瘤摘取表格、包括与用于制造扩增的细胞疗法产品的工艺有关的信息和与所述获得的实体肿瘤如何处理有关的信息的制造订单、一个或多个制造设施的制造安排、得以审核完整工艺的标签审核轨迹)可定制以与内置物件交互，以便提供与系统300相关联的特定功能。
系统300中的定制物件和内置物件是经配置以彼此相互作用，如此得以经由从患者获得实体肿瘤到将扩增的细胞疗法产品输注至患者体内的所有事件维持和审核COC和COI。定制物件连同内置物件以及安排患者治疗事件和相关物流是基于制造工艺如何进展。
例如，在一些实施方案中，系统300可提供定制物件，诸如批次记录和标签审核轨迹。这些定制物件加上定制工作流程自动化和定制用户设置档提供市售软件平台原先并未设想于市售软件平台内的功能，例如维持COC/COI、审核能力、基于制造执行动态安排患者治疗事件、基于制造执行的标签产生和/或制造执行与摘取之间的相互作用。在制造工艺期间的肿瘤摘取程序、维持COC和COI和产生标签的定制物件与内置物件之间的相互作用的另外细节是提供于本文别处。
B.维持COC和COI的定制和内置物件之间的相互作用
图3C-3E根据本公开的一些实施方案绘示生物材料在制造设施的制造工艺中的轨迹。在一些实施方案中，起初当在临床机构获自患者的肿瘤样品经递送至制造设施时，扫描运输标签并且获自所述扫描的信息是与系统上的对应基于计算机物件相关联。所述信息可以包括但不限于细胞订单标识符、患者特异性标识符、肿瘤切除的时间、用于肿瘤切除的过程、在切除之后用于存储肿瘤的过程和待用于从肿瘤扩增细胞疗法产品的预期过程。一旦获自扫描的患者相关信息经制造设施分开接受(例如经由制造入口140)的细胞订单请求验证后，所述系统中指示肿瘤被制造设施接受并且保管链转移至制造设施。有关制造工艺中保管链和身份链如何维持的细节是描述于本文别处。
接着将肿瘤移送至质量检查。在质量检查期间，从扫描接受的肿瘤相关信息经进一步验证以确保肿瘤样品符合必需质量标准。在这一过程中验证的信息包括例如与用于肿瘤切除的过程和在切除之后用于存储和运输肿瘤的过程有关的信息。与用于肿瘤切除的过程有关的信息可以包括例如从肿瘤摘取表格处理的各种栏位，所述肿瘤摘取表格更详细描述于本文别处。一旦肿瘤被视为符合质量标准，扫描对应标签并更新对应物件。所述物件中包括的更新的信息可在整个系统中存取，所述系统包括例如医院机构以及物流提供者(本文中还称为快递机构)。在一些实施方案中，与医院机构和快递机构相关联的各种过程是基于更新的物件更新。
接着将肿瘤移送至制造。接着扫描第0天批次记录标签以验证适当肿瘤样品是经移送至制造并且待通过适当制造工艺处理。接着将肿瘤移送至适当烧瓶(所述烧瓶包括用于处理患者肿瘤的扩增过程的培养基和试剂)，并扫描烧瓶的标签。使用获自具有适当时间戳记的扫描的信息更新对应物件。
接着将第0天烧瓶手动移送至孵育室，从孵育室将其移送至制造室。在制造室中，再次扫描烧瓶标签并记录其中含有的信息。来自烧瓶标签的信息也用于确保遵守适当制造工艺。
在基于所遵照的特定制造工艺的第一必需时间量(例如图3C所示的11天)之后，接种烧瓶。在接种过程期间，可能需要将烧瓶从制造室取出。在这种情况下，扫描烧瓶标签并在烧瓶离开制造室之前和之后更新批次记录。在执行进一步过程之前匹配之前和之后扫描的信息。
在接种过程之后，将烧瓶再放回制造室。在接种过程之后再放回制造室之前和之后扫描烧瓶标签并更新批次记录。匹配之前和之后扫描的信息以验证使用正确烧瓶并且使用适当后续过程以进一步处理细胞疗法产品。
在第二必需时间量(例如图3C所示的第16天)之后，将来自经接种的烧瓶的细胞分装至多个袋(例如图3C所示的5袋)。在再放回制造室之前和之后扫描各袋的标签，并适当更新批次记录和对应物件。使用之前和之后扫描的信息以验证来自烧瓶的细胞是根据细胞订单请求分装并且使用适当制造工艺进一步处理袋。
在一些实施方案中，在第一和第二必需时间执行质量分析以确保制造工艺是根据细胞订单请求进行并且遵照预定安排。在此类实施方案中，质量控制分析的结果也可以包括在扫描信息中。在获得来自对应扫描的此类信息后，如果确定在对应时间点获得的细胞疗法产品的质量不符合某些质量标准，那么据此更新批次记录和对应物件。若有需要，也更新制造工艺的安排。在一些实施方案中，可向医院机构以及快递传达更新安排，以使适当更新医院机构和快递所待执行的对应过程的安排。何时和如何更新制造安排的细节是描述于本文别处。
接着在多个袋中(如安排或以合适修改的安排和/或中间步骤)继续制造工艺到预定终点。在一些实施方案中，将来自所述多个袋之一的细胞用于执行最终扩增的细胞疗法产品的质量分析。接着标记选自质量分析的袋以及含有待释出作为最终产物的细胞的袋，并扫描标签以更新批次记录和对应物件。
接着将待释出作为最终产物的袋输入至盒中并冷冻以供运送至医院机构。扫描盒标签并更新批次记录以及对应物件。接着扫描待用于执行质量控制分析的袋的标签，更新批次记录和对应物件，并将袋移送至质量控制站。在获得质量控制分析的结果后，扫描结果并更新批次记录和对应物件。
在一些实施方案中，可释出待释出作为最终产物的袋至快递(和最终医院机构)，但需警告袋中产物尚未经批准用于患者治疗，因为尚未取得质量分析的结果。在此类实施方案中，当获得质量分析的结果时实时更新对应物件，由此减少递送最终细胞疗法产品给患者的时间。
一旦质量分析的结果指示批准最终细胞疗法产品用于用于患者的治疗性用途，扫描所述盒并更新批次记录和对应物件。接着准备处理所述盒以供运送、交给物流提供者(即快递)并扫描，指示保管链已转移至快递。
快递接着将最终细胞疗法产品运送至医院机构，在所述处再次扫描标签以指示保管链已转移至医院机构。更新批次记录和对应物件以使制造设施和快递接到最终细胞疗法产品已递送至医院机构的通知。
C.在制造工艺期间标记细胞疗法产品并且维持保管链和身份链
图3F根据制造工艺的一些实施方案(例如GEN 2工艺或GEN 3工艺)绘示从获得实体肿瘤到制造工艺到输注至患者体内的细胞疗法产品的旅程中维持COC和COI的过程。在一些实施方案中，起初医院端界面110从医院的雇员(例如注册护士)接受有关患者的信息，所述医院与医院端界面110连接。有关患者的信息可以包括有关健康保险的信息、个人鉴定信息、健康相关信息、患者登记信息(例如受试者同意书)或任何其他可能有助于鉴定和照护患者的患者相关信息。
在医院的雇员(例如临床医师)确定患者是例如TIL输注疗法的候选者之后，患者可经由连接至医院端界面110的计算机提供同意书以接受TIL输注疗法。
医院的雇员接着可经由事件调度器120订购用于患者的TIL输注疗法。医院的收费部门雇员接着可经由物流界面130立下用于患者的TIL输注疗法的采购单。可传递TIL输注疗法单和采购单至医院端界面110。医院端界面110可确认接受所述单和采购单，以及在开立细胞订单请求至事件调度器120之前确认已完成患者登记和受试者同意。同样地，医院端界面可与保险提供者通信以通知已安排各种患者治疗事件并且也可提供患者治疗事件的安排给保险提供者以处理付款。
接着可使患者特异性标识符与细胞订单请求相关联并且在每个处理和/或运输步骤附接至与患者相关联的生物材料，如此得以如本文进一步所详述不中断追踪生物材料的保管链和身份链。也可将患者特异性标识符与患者以及用于施用不同患者治疗过程的治疗设备相关联以在整个治疗方案中追踪患者。
也可经由医院端界面110向保险提供者通信患者特异性标识符，如此得以在各种患者治疗事件之后处理付款。可进一步经由快递入口130向快递通信患者特异性标识符以使快递得以验证与所运送的生物材料相关联的患者的身份鉴定。
在本文所公开的各种实施方案中，安排模块125与医院端界面110、制造入口140或物流界面130之间与制造事件和/或患者治疗事件的安排有关的任何通信(不论是否变更)皆伴随与经处理和安排的细胞订单请求相关联的患者特异性标识符。此类包括患者特异性标识符的通信使医院端界面110、制造入口140和物流界面130得以正确处理、追踪和鉴定生物材料，由此避免错误鉴定生物材料或患者并且改善患者安全性。
此外，如本文详细解释的，患者特异性标识符是用于产生在扩增过程期间使用的容器的标签，如此得以在扩增过程中维持COC/COI并且得以事后审核法规遵从性。
在一些实施方案中，细胞订单标识符可以包括患者特异性标识符，所述细胞订单标识符也经结构化以用于追踪身份链/保管链以及用于追踪事件历史。在一些实施方案中，除了患者特异性标识符以外，细胞订单标识符可以包括数个标记或栏位，各对应来自经历处理步骤的患者的生物材料。图3G是根据一些实施方案的细胞疗法产品的标签的代表性图像。在一些实施方案中，标签包括细胞订单标识符350、2D码(例如QR码)362、原因栏位370和产物栏位380。细胞订单标识符350可以包括各种栏位，例如患者姓名354、患者特异性标识符352、患者出生日期(例如用于另外验证)356、医院相关患者标识符358和制造批号360。
因此，标签得以维持COI/COC并且也得以从在临床治疗中心切除肿瘤、运输肿瘤材料至制造设施、制造(包括测试所有正在加工中和成品样品)、运输药物产品至临床治疗中心和药物产品输注来追踪材料。
在一些实施方案中，可在从获得实体肿瘤到制造工艺到输注至患者体内的细胞疗法产品的旅程期间的不同时间点产生不同标签，诸如图3H中所说明的那些。在不同时间点产生的标签可以包括图3G所绘示的标签所包括的附加或不同信息。例如，在一些实施方案中，在细胞扩增过程期间产生并且经例如固定至在细胞扩增过程期间使用的容器的标签可以包括对应各个时间点的栏位和在个别时间点做出的扩增细胞疗法产品的接受参数是否符合某些接受标准的确定结果。
因此，在过程中的任何阶段，标签提供有关患者的信息(经由患者特异性标识符)，由此得以维持身份链和保管链。标签也可提供有关相关生物材料所经历的各种处理步骤的信息，出于例如审核目的提供保管链以及事件历史的记录。
系统300因此可经配置以在整个细胞疗法产品制造工艺和供应链中维持COI和COC。此外，系统300可经配置以包括符合21CFR第11部分,HIPAA(健康保险便利和责任法)和GDPR(一般资料保护法)规定和确保资料安全并且受到保护的保护措施。
为了限制和局限敏感资料的存取，系统300在一些实施方案中执行基于用户的作用和存取。在一些实施方案中，标签上可以包括在标签产生之时的时间戳记。
在一些实施方案中，经由追踪模块追踪的细胞订单标识符还可包括与例如各种运输/运送事件、各种制造工艺事件和/或治疗方案中的各个步骤相关联的标记或栏位。这些标记或栏位可未打印在标签上，但由追踪模块产生或附加，以追踪与患者相关联的生物材料以及追踪治疗的进展。在此类实施方案中，指示某一步骤的完成时间的时间戳记可与每一步骤的细胞订单标识符相关联或附加每一步骤的细胞订单标识符，其中给定标记或栏位是变更或更新的。应理解，包括在此类更新的细胞订单标识符中的信息也可用于动态重新安排患者治疗事件，如本文别处详细讨论。
1.在制造工艺期间标记细胞疗法产品
参考回图3F，在一些实施方案中，细胞订单标识符是打印在可读标签上并且与条码或QR码(或2D码)相关联，以允许从肿瘤切除到输注自体药物产品的适当验证身份鉴定。可将标签固定至与生物材料以及治疗方案相关联的物件。例如，可将包括患者特异性标识符的标签固定至从医院或临床机构携带经切除的肿瘤至TIL制造设施的容器、在各种制造步骤期间的TIL制造设备和容器、用于运输扩增TIL返回医院或临床机构的运输容器、与各种治疗事件相关联的设备或它们的任何组合。
例如，在一些实施中，患者可经由医院端界面110的患者存取模块116进入系统并且登记。在所述系统内登记并且捕获可追踪患者信息后，可由所述系统指派患者特异性标识符(COI编号)给患者。指派患者特异性标识符得以安排切除日期和制造槽。
安排所述系统内的制造槽触发细胞订单的产生并且指派制造单位的批号。
在肿瘤切除之前，临床机构可存取所述系统、确认正确患者鉴定并且产生肿瘤瓶标签和肿瘤运输罐标签。除了细胞订单标识符以外，标签还可以包括患者特异性标识符。在一些实施方案中，患者特异性标识符可为细胞订单标识符内的栏位。
在肿瘤切除之后，在追踪模块112处起始保管链。接着可将经标记的肿瘤瓶放入运输罐并交给快递以运送至制造单位。当快递验证运输罐标签上的细胞订单编号符合整合至系统300中的快递系统的运输单上的细胞订单编号时，保管链继续，由此提供在治疗中心与制造单位之间的肿瘤的实时追踪。
在递送肿瘤至制造单位后，所述系统内可产生递送证明。在接受肿瘤后，制造人员经由COC/COI模块144将制造批号输入至所述系统的制造模块140中。找出患者记录(可经由制造协调模块118取得)，将肿瘤瓶标签扫描至所述系统中以验证患者特异性标识符是与制造批号相关联。在验证后，COC转移至制造单位。
制造设施的人员可进入所述系统，其中标记模块142得以产生含有细胞订单请求的在制品(WIP)标签。为了促进事后记录审核，可将WIP标签固定至批次记录和细胞生长烧瓶。图3G是根据一个实施方案的WIP标签的代表性图像。图3H显示根据一个实施方案的不同WIP标签类型和包括在各种标签类型中的信息。
接着制造人员可在制造工艺期间的关键转变点扫描标签，以验证细胞生长烧瓶上的细胞订单标识符编号符合批次记录，确保在整个制造工艺维持COI。
此外，各质量控制(QC)样品将具有它自己的具有COI编号的标签，以确保所产生的结果接着连接至对应批次记录。在完成制造工艺后，标记模块142可产生成品标签。图3I和图3J是成品标签的实例。
如图3I-3J所示，这些成品标签含有独特患者鉴定，包括姓名354、出生日期(DOB)356和患者特异性标识符352。将成品标签固定至最终产物，并扫描批次记录和标签两者以确保在制造设施内的COI和完全保管链。
将成品放入具有相同细胞订单标识符(包括相符的患者特异性标识符)的运输罐、验证并且转移至快递以递送至治疗中心进行输注。接着快递可验证运输容器上的细胞订单标识符和患者特异性标识符符合快递系统中经由物流界面130接受的细胞订单和患者信息，由此提供在制造单位与治疗中心之间的各药物产品批次的几乎实时追踪。此时，COC从制造单位转移至快递。
快递递送成品至治疗中心以供输注至患者体内。快递可经由物流界面130起始递送证明(POD)，并且COC从快递转移至治疗中心。COI结束于在治疗中心输注产物至患者。
如本文中所讨论，在各处理步骤之后医院端界面110、事件调度器120、制造入口140与物流界面130之间通信患者特异性标识符确保所有关系人(例如临床机构、制造设施和物流提供者)接受生物材料的保管链以及身份链的记录，并且也接受生物材料所经历的各种处理步骤的记录。
因此，经由标签提供给实体肿瘤的患者特异性标识符和细胞订单请求得以追踪运输，以便维持患者安全性以及法规遵从性(例如FDA审核)所需的保管链和身份链。
2.在制造工艺发生变更的情况下的标签核对
一旦制造设施接受实体肿瘤，根据细胞订单请求起始细胞疗法产品的制造。例如可使用细胞扩增技术使用至少一部分的实体肿瘤制造细胞疗法产品。
在一些实施方案中，与制造设施相关联的计算机子系统例如标记模块142可造成待打印的第二标签与用于细胞扩增的一部分的实体肿瘤相关联。第二标签可以包括患者特异性标识符和细胞需求标识符。第二标签进一步得以追踪细胞疗法产品以维持保管链和身份链。
随后，在细胞疗法产品的制造期间，确定在各个时间点制造的细胞疗法产品的接受参数。接着在接受判定模块123中比较接受参数，以确定在特定时间点确定的接受参数是否符合对应时间点的接受标准。接受参数可通过本文所公开的任何合适方法或过程确定。此外，接受标准可为本文所公开的任何接受标准。
在一些实施方案中，确定接受参数和接受参数是否符合接受标准的结果可附加于如本文别处所公开的细胞订单标识符。在一些实施方案中，可基于确定接受参数是否符合(或不符合)接受标准的结果产生第三标签。
例如，如果第二时间点的接受参数不符合第二时间点的接受标准，那么产生在制造工艺期间所使用的容器的第三标签，所述第三标签包括“原因码”以传送第二时间点的接受参数不符合第二时间点的接受标准和为何不符合第二时间点的接受标准的信息。
另外，如果确定在第二时间点获得的细胞疗法产品可从在第二时间点之前的第一时间点再处理以适当获得符合第二时间点的接受标准的细胞疗法产品，那么第三标签可以包括例如本文别处所公开的新的或更新的细胞需求标识符的信息。在这种情况下，第三标签可另外包括“原因码”以传送关于为何第二时间点的接受标准和为何从第一时间点再处理细胞疗法产品是适当的的信息。
接下来，基于接受判定模块123所确定的是否符合一个或多个时间点的接受标准，用于细胞疗法产品的制造的制造安排经合适修改以产生如本文别处所讨论的更新的制造安排。此外，制造设施的制造槽的可用性也经合适修改以反映目前细胞疗法产品的制造安排的变更(若有的话)。接着可向计算装置传达所述制造设施的制造槽的经变更或更新的可用性。另外，患者治疗事件的初步安排也可基于更新的制造安排进行修改，并可向计算装置传达患者治疗事件的更新安排。
接着，根据更新的制造安排完成细胞疗法产品的制造。
在一些实施方案中，产生对应多个时间点中的每一者的制造标签，在所述多个时间点确定接受参数。各时间点的制造标签可以包括与制造的细胞疗法产品的质量相关联的更新的信息。更新的信息可以包括在对应时间点的接受参数和/或接受参数是否符合所述时间点的接受标准。
此外，在一些实施方案中，控制制造工艺的控制器可经配置以读取更新的制造标签和确定后续处理步骤。例如，如果在第二时间点的QA测试之后更新的制造标签指示细胞疗法产品不符合某些接受标准，但细胞疗法产品可从第一时间点再处理，那么控制器可造成制造工艺的合适变更。此外，也基于更新的标签上的信息做出制造安排的合适变更、制造槽的可用性和患者治疗事件的安排。本领域技术人员应理解更新的制造标签可以包括细胞订单标识符和患者特异性标识符加上与制造的细胞疗法产品的质量和促进身份链和保管链的原因码有关的信息。
本领域技术人员应进一步理解，可向医院端界面和物流界面传达由读取更新的制造标签所获得的与制造安排变更、制造槽的可用性和患者治疗事件安排有关的信息，以使对应计算装置得以对与那些实体相关联的个别安排做出对应变更。
D.以患者治疗事件协调细胞疗法产品的制造
图4A和图4B显示根据本公开的一个实施方案的用于协调用于患者的TIL的制造的方法的流程图。在一些实施方案中，图4A和图4B绘示的方法是在图3A中描绘的完整系统上实施，然而在一些实施方案中，图4A和图4B绘示的方法是通过图3A中描绘的系统的部分上实施。在一些实施方案中，事件调度器120接受(例如S305)来自医院端界面110的扩增用于患者的细胞疗法产品(例如T细胞)的细胞订单请求和与细胞订单请求相关联的患者特异性标识符。
在一些实施方案中，患者特异性标识符或替代地细胞订单标识符是通过事件调度器120(例如S310)而非追踪模块112产生。
细胞订单请求可以包括信息，例如患者鉴定信息、各种患者治疗事件的目标日期和/或最终扩增的TIL制造产物的目标参数。一旦接受细胞订单请求，事件调度器120可向医院端界面110传递确认，指示已接受对应患者特异性标识符的细胞订单请求。在其中患者特异性标识符是由事件调度器120产生的实施方案中，事件调度器120可传递指示已接受患者的细胞订单请求的确认并且提供患者特异性标识符或细胞订单标识符至医院端界面110。此外，事件调度器120可基于接受的细胞订单请求传递患者治疗事件的目标安排。
此外，事件调度器120可传递包括患者特异性标识符的起始请求(例如S315)至医院端界面110，例如临床机构，以对患者执行程序以从患者获得实体肿瘤并安排快递取货时间以将所述获得的实体肿瘤转移至制造设施。如本文中所讨论，所述程序可以包括但不限于用于从患者抽取一部分的肿瘤的肿瘤活组织检查。在一些实施方案中，事件调度器120可从使用医院端界面110的雇员接受程序日期。作为反应，事件调度器120可提示雇员视需要订购用品(例如肿瘤切除试剂盒、肿瘤运输容器或冷冻运输容器)并且使它们与患者特异性标识符相关联。
在执行获得实体肿瘤的程序并且运输实体肿瘤之后(例如S320)，一旦制造设施接受所述获得的实体肿瘤，安排模块125动态安排(例如S325)各种制造事件以及各种患者治疗事件，并使各事件与患者特异性标识符相关联。在一些实施方案中，安排模块125在接受获得的实体肿瘤之前例如在从医院端界面110接受有关从患者获得实体肿瘤的程序的安排信息后确定制造事件和患者治疗事件的安排，并使各事件与患者特异性标识符相关联。
各种制造事件的安排是与患者特异性标识符相关联并且可以包括执行各种制造步骤(例如图2A、图2B或图2C和/或图9所示的步骤A至F)的对应目标日期以及完成TIL制造工艺的对应目标日期。如本文中所讨论，各种制造步骤的目标日期可取决于多种因素，诸如所接受的肿瘤的大小、起始给定步骤之前的细胞计数、给定步骤结束时的数值倍数、在给定步骤期间达成某个数值倍数所需的天数和/或其他因素。
各种患者治疗事件的安排可以包括与患者特异性标识符相关联的各种患者治疗事件的目标日期，例如目标TIL输注日期、淋巴细胞耗尽日期、住院期、IL-2输注方案安排和/或其他类似治疗相关日期。如本文中所讨论，患者治疗事件的安排是依赖于制造事件的安排，并且特别是TIL制造完成日期。在一些实施方案中，可将各种患者治疗事件的安排连同患者特异性标识符传递至医院端界面110。
安排模块125经配置以基于不同制造步骤的进展和成功动态变更制造事件的安排以及患者治疗事件的安排。例如，取决于在不同步骤中与扩增细胞疗法产品相关联的接受参数是否符合某些接受标准，后续制造步骤的起始日期需要变更，其进而改变目标完成日期，并且因此需要使用例如图4B或图4C中描绘的方法来改变患者治疗事件的日期。
接受判定模块123确定与扩增细胞疗法产品相关联的接受参数是否符合某些接受标准。接受参数包括但不限于细胞计数、细胞活力、无菌性、支原体计数、CD3计数、CD5计数、干扰素γ(INF-γ)产生、内毒素分析结果、革兰氏染色分析结果等。取决于测量接受参数的步骤，这些接受参数中的一些或所有可需要符合接受标准。例如在第一初始扩增结束时(本文中还称为第一时间点)，例如从扩增起始开始11天，接受标准可在于细胞计数应为至少5×106个活细胞。在不同步骤中的接受标准也取决于用于执行扩增的过程(例如Gen 2、Gen3、Gen3.1等)。
因此，取决于用于执行扩增的过程，接受判定模块123可在扩增起始之后超过一个不同时间点确定接受参数是否符合某些接受标准。换句话说，接受判定模块123在各不同的规定时间点执行质量测试(本文中还称为QA测试)以确定接下来的行动方案，并且安排模块125基于获自接受判定模块123的QA测试的结果动态安排后续制造步骤和患者治疗事件。
表B提供用于测试Gen 2、类Gen 2和Gen 3工艺的最终产物的接受参数和接受标准的一个实例。
表B：
Figure BDA0004012625820002921
Figure BDA0004012625820002931
参考图4B，在一个实施方案中，在细胞疗法产品的扩增起始之后，接受判定模块123确定(例如S402)第一时间点的扩增的细胞疗法产品是否通过与第一时间点(例如在图2A和/或图9显示的步骤B之后)相关联的QA测试。在确定细胞未通过第一时间点的QA测试后(例如S404)，接受判定模块123确定细胞是否因为污染而未通过QA测试。如果细胞因为污染而未通过QA测试，那么检视可能终止的案例(例如S422)。
另一方面，如果细胞因为除污染以外的原因(例如因为低细胞计数或低活力)而未通过QA测试，取决于细胞未通过QA测试的原因，安排模块125可延长进行中步骤的时间，并检视最终收集结果(例如S408)。在一些实施方案中，所有后续制造步骤和患者治疗事件可因延长进行中步骤的时间而经重新安排。
或者，安排模块125可仅重新安排患者治疗事件，以便承担完成制造工艺的潜在延缓或承担制造的细胞疗法产品的潜在低温冷冻，从而允许完成制造和输注细胞疗法产品之间的时间差。应理解，在一些实施方案中，细胞疗法产品包含患者的T细胞。在一些实施方案中，细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。因此，为了简单起见，本文中的讨论可互换地指称细胞疗法产品为T细胞或TIL。
例如，在一些情况下，细胞疗法产品尽管未通过第一时间点的QA测试，但可通过最终QA测试。在这种情况下，审慎的做法是偏离制造事件和患者治疗事件的理想安排，并且延缓淋巴细胞耗尽直至执行最终QA测试以避免非必需的患者治疗。因此，取决于细胞未通过第一时间点的QA测试的原因，确定(S418)患者治疗事件的安排是否需要偏离患者治疗事件的理想安排。在确定患者治疗事件的安排需要偏离理想安排后，安排模块125可重新安排(即，延缓)(例如S420)淋巴细胞耗尽以及后续患者治疗事件，并且进一步任选地在完成制造工艺之后安排低温冷冻步骤。
参考回S402，如果细胞通过第一时间点的QA测试，那么不需要变更制造工艺或患者治疗事件的安排。接受判定模块123接着确定(例如S406)第二时间点的扩增的T细胞是否通过与第二时间点(例如在图2A和/或图9显示的步骤C或步骤D之后)相关联的QA测试。
如果细胞未通过第二时间点的QA测试，那么接受判定模块123确定(例如S404)细胞是否因为污染而未通过QA测试。如果细胞因为污染而未通过QA测试，那么检视可能终止的案例(例如S422)。
另一方面，如果细胞因为除污染以外的原因(例如因为低细胞计数或低活力)而未通过QA测试，取决于细胞未通过QA测试的原因，安排模块125可延长进行中步骤的时间，并检视最终收集结果(例如S408)。在一些实施方案中，所有后续制造步骤和患者治疗事件可因延长进行中步骤的时间而经重新安排。
或者，安排模块125仅重新安排患者治疗事件，以便承担完成制造工艺的潜在延缓或承担制造的TIL的潜在低温冷冻，从而允许完成制造和输注TIL之间的时间差。
例如，在一些情况下，细胞尽管未通过第二时间点的QA测试，但可通过最终QA测试。在这种情况下，审慎的做法是偏离患者治疗事件的理想预先决定的安排(本文中还称为黄金途径)，并且延缓淋巴细胞耗尽直至实施最终QA测试以避免非必需的患者治疗。因此，取决于细胞未通过第二时间点的QA测试的原因，安排模块125可重新安排(即，延缓)(例如S420)淋巴细胞耗尽以及后续患者治疗事件，并且进一步在完成制造工艺之后安排低温冷冻步骤。
在一些实施方案中，当细胞未通过第一或第二时间点的QA测试时，可更新患者特异性标识符以鉴定细胞未通过个别时间点的QA测试，并且医院端界面110和物流界面130接到患者(与患者特异性标识符相关联)的患者治疗事件可能需要取消或延缓的通知。当患者治疗事件的安排偏离预先决定的安排(例如黄金途径安排)并且患者治疗事件经重新安排时，医院端界面110和物流界面130接到已更新对应患者特异性标识符的安排的通知并且向医院端界面110和物流界面130传达更新安排。
此类通知使临床机构或医院得以合适调整患者治疗事件的各种安排以及做出与个别患者治疗事件所需的适当人员可用性和机构和设备可用性有关的必需物流安排。所述通知可另外促进医院或临床机构告知患者有关患者治疗事件的安排的变更。或者，事件调度器120和/或医院端界面110可与患者直接通信以通知患者有关患者治疗事件安排变更并使患者得以与医院或临床机构协调以根据变更的安排来安排患者治疗事件。
在一些实施方案中，医院端界面110可另外向保险提供者传达更新安排，以便可采取处理付款的适当措施。
同样，所述通知使物流提供者得以做出重新安排生物材料的运输的必需安排，例如安排适当运输盒和处理生物材料的适当人员的可用性。
参考回S406，如果细胞通过第二时间点的QA测试，那么安排模块125可维持患者治疗事件的安排。例如在一些实施方案中，安排模块125可向医院端界面110传达(例如S410)可基于预先决定的安排向患者施用淋巴细胞耗尽治疗，但需警告制造工艺仍可被延缓或可能无法产生所需最终产物的机率极低，但非绝无可能。此类通信在图4B中指明为“有风险的淋巴细胞耗尽”。在此类状况下不变更制造工艺或患者治疗事件的安排。
接受判定模块123接着确定(例如S412)第三时间点的扩增的T细胞是否通过与第三时间点(例如在图2A和/或图9显示的步骤D或步骤E之后)相关联的QA测试。
如果细胞通过第三时间点的QA测试，那么扩增的细胞被视为在目标TIL输注日期为释出就绪产物。安排模块125在这种情况下通知(例如S424)医院端界面110将以目标安排继续患者治疗事件。换句话说，不对安排做出变更。
另一方面，如果细胞未通过第三时间点的QA测试，那么执行产物影响评估(例如由施用所述治疗的医生或首席医疗官)(例如S414)以确定是否可提供扩增的细胞用于输注或终止治疗(取决于细胞未通过第三时间点的QA测试的原因)。如果在产物影响评估后，确定(例如S416)所述治疗可继续，但需警告可能有与继续以可用产物治疗相关联的某些风险，那么在无患者治疗事件的安排的任何变更下批准扩增的细胞释出(例如S424)。
参考图4C，在一个实施方案中，在细胞疗法产品的扩增起始之后，接受判定模块123确定(例如S402)第一时间点的扩增的细胞疗法产品是否通过与第一时间点(例如在图2A和/或图9显示的步骤B之后)相关联的QA测试。在确定细胞未通过第一时间点的QA测试后(例如S404)，接受判定模块123确定细胞是否因为污染而未通过QA测试。如果细胞因为污染而未通过QA测试，那么检视可能终止的案例(例如S422)。
另一方面，如果细胞因为除污染以外的原因(例如因为低细胞计数或低活力)而未通过QA测试，取决于细胞未通过QA测试的原因，安排模块125可延长进行中步骤的时间，并检视最终收集结果(例如S408)。在一些实施方案中，所有后续制造步骤和患者治疗事件可因延长进行中步骤的时间而经重新安排。
参考回S402，如果细胞通过第一时间点的QA测试，那么不变更制造工艺或患者治疗事件的安排。接受判定模块123接着确定(例如S406)第二时间点的扩增的T细胞是否通过与第二时间点(例如在图2A和/或图9显示的步骤C或步骤D之后)相关联的QA测试。
如果细胞未通过第二时间点的QA测试，那么接受判定模块123确定(例如S404’)细胞是否因为污染而未通过QA测试。如果细胞因为污染而未通过QA测试，那么检视可能终止的案例(例如S422)。
另一方面，如果细胞因为除污染以外的原因(例如因为低细胞计数或低活力)而未通过QA测试，那么接受判定模块123确定(例如S458)在第二时间点获得的细胞疗法产品是否具有足够质量，得以从第一时间点重新执行细胞制造工艺，以便导致细胞疗法产品在第二时间点具有符合第二时间点的接受标准的接受参数。这种确定可基于在第二时间点获得的细胞疗法产品的接受参数做出。例如，如果第二时间点的接受参数符合第二时间点除了总活细胞计数以外的所有接受标准，那么可行的做法是重新执行介于第一与第二时间点之间的细胞制造工艺以获得必需活细胞计数。
如果确定从第一时间点重新执行细胞制造工艺并不可行，那么检视可能终止的案例(例如S422)。
另一方面，如果确定重新执行介于第一与第二时间点之间的细胞制造工艺是可行的，那么安排模块125估算细胞制造工艺在重新执行介于第一与第二时间点之间的过程之后的完成时间(例如S460)。应理解，可基于在第二时间点获得的细胞疗法产品的接受参数估算重新执行介于第一与第二时间点之间的细胞制造工艺所需的时间。因此，完成用于制造细胞疗法产品的细胞扩增过程包括从第一时间点重新执行过程所需的时间可取决于在第二时间点获得的细胞疗法产品的接受参数。
接着，安排模块125可因从第一时间点重新执行细胞制造工艺而基于在第二时间点获得的细胞疗法产品的接受参数重新安排所有后续制造步骤和患者治疗事件。例如，安排模块125可重新安排患者治疗事件，以便承担完成制造工艺的延缓或承担制造的TIL的潜在低温冷冻，从而允许完成制造和输注TIL之间的时间差。
另一方面，如果在第二时间点获得的细胞疗法产品的接受参数符合所有接受标准，那么细胞制造工艺可如最初安排继续进行。
本领域技术人员应理解，即使在确定此类重新执行是可行的而从第一时间点重新执行细胞制造工艺之后，仍确定在重复的第二时间点(本文中还称为替代第二时间点)获得的细胞疗法产品的接受参数。接着，在继续细胞制造工艺通过第二时间点之前，再次确定重复第二时间点(它可能与细胞制造工艺中的原始第二时间点不同)的接受参数是否符合第二时间点的接受标准。
在一些实施方案中，继续的过程接着遵照如图4B显示的相同途径“B”。例如，在一些情况下，细胞尽管未通过第二时间点的QA测试，但可通过最终QA测试。在这种情况下，审慎的做法是偏离患者治疗事件的理想预先决定的安排(本文中还称为黄金途径)，并且延缓淋巴细胞耗尽直至实施最终QA测试以避免非必需的患者治疗。因此，取决于细胞未通过第二时间点的QA测试的原因，安排模块125可重新安排(即，延缓)(例如S420)淋巴细胞耗尽以及后续患者治疗事件，并且进一步在完成制造工艺之后安排低温冷冻步骤。
本领域技术人员应理解，当细胞制造工艺具有数个用于确定接受参数和那些接受参数是否符合那些对应时间点的接受标准的时间点时，可行的做法是从紧接的前一时间点重新执行细胞制造工艺的步骤。因此，术语“第一时间点”和“第二时间点”未必描述确定接受参数的数值第一和数值第二时间点。相反地，“第一时间点”是指细胞制造工艺中的一个时间点，如果后续时间点的接受参数不符合那一时间点的接受标准，那么从所述时间点重新执行细胞制造工艺的步骤是可行的。例如，在1C工艺(参见图6)中，第一和第二时间点可分别为第27天和第30天、分别为第30天和第36天或分别为第36天和第43天。同样，在2A工艺(参见图6)中，第一和第二时间点可分别为第11天和第16天或分别为第16天和第22天。
在一些实施方案中，当细胞未通过第一或第二时间点的QA测试时，可更新患者特异性标识符以鉴定细胞未通过个别时间点的QA测试，并且医院端界面110和物流界面130接到患者(与患者特异性标识符相关联)的患者治疗事件可能需要取消或延缓的通知。
由于如果从第一时间点重新执行细胞制造工艺是可行的，那么细胞疗法产品的制造安排可偏离理想安排，因此患者治疗事件的安排也偏离预先决定的安排(例如黄金途径安排)。因此，安排模块重新安排患者治疗事件，并且医院端界面110和物流界面130接到已更新对应患者特异性标识符的安排的通知。向医院端界面110和物流界面130传达更新安排。
如本文中所讨论，此类有关安排变更的通知使临床机构或医院得以合适调整患者治疗事件的各种安排。此外，可做出与个别患者治疗事件所需的适当人员可用性和机构和设备可用性有关的必需物流安排。所述通知可进一步促进医院或临床机构告知患者有关患者治疗事件的安排的变更。或者，事件调度器120和/或医院端界面110可与患者直接通信以通知患者有关患者治疗事件安排变更并使患者得以与医院或临床机构协调以根据变更的安排来安排患者治疗事件。
在一些实施方案中，医院端界面110可另外向保险提供者传达更新安排，以便可采取处理付款的适当措施。
同样，所述通知使物流提供者得以做出重新安排生物材料的运输的必需安排，例如安排适当运输盒和处理生物材料的适当人员的可用性。
在一些实施方案中，除非治疗终止，否则安排模块125与物流界面130通信以提供基于完成日期的提货单，所述完成日期基于各个时间点的QA测试的结果来确定。物流界面130接着与物流提供者(未图示)通信以做出及时收集和运输扩增的TIL至医院或临床机构以供后续患者治疗(例如输注)的合适安排。例如，在一些实施方案中，可要求物流提供者在安排的患者治疗事件的一定天数之前运输用于处理生物样品的特殊容器至医院或临床机构。
同样，如果确定扩增的细胞通过QA测试，那么安排模块125向医院端界面110传达安排的完成日期和患者治疗事件的安排(即更新安排)。另一方面，如果确定治疗是待终止的，那么安排模块125与医院端界面110通信：治疗是待终止的。
在一些实施方案中，在重新安排患者治疗事件后，将患者治疗事件的更新安排连同相关患者特异性标识符传递至医院端界面110。
在一些实施方案中，如果确定从第一时间点重新执行细胞制造工艺的步骤是可行的，那么可更新介于细胞订单标识符与患者特异性标识符之间的关联。例如，在确定从第一时间点重新执行细胞疗法产品的扩增是可行后，将细胞订单标识符与患者特异性标识符解关联。可产生与细胞订单请求相关联的新的细胞订单标识符并且患者特异性标识符是与新的细胞订单标识符相关联。在一些实施方案中，可基于在第二时间点确定的接受参数产生新的细胞订单标识符。在一些实施方案中，细胞订单标识符可以包括对应各时间点的栏位，在所述各时间点确定细胞疗法产品的接受参数。此外，在一些实施方案中，细胞订单标识符也可以包括确定接受参数是否符合接受标准的结果，包括例如哪些接受参数符合接受标准和接受参数的值。
在一些实施方案中，患者特异性标识符、新的细胞订单标识符和细胞疗法产品的扩增的估算完成时间被传递至医院端界面以使医院端界面得以追踪细胞疗法产品并使细胞疗法产品与患者相关联。
细胞订单标识符所包括的各种栏位可使安排模块125得以基于在各个时间点产生的更新或新的细胞订单标识符确定患者治疗事件的新安排以及与患者治疗事件相关联的运输和物流事件。接着，将新安排连同相关的患者特异性标识符传递至物流界面。也可将患者特异性标识符和更新或新的细胞订单标识符连同在一些实施方案中的新安排传递至物流界面，以便维持细胞疗法产品的保管链和身份链。
在一些实施方案中，如果确定重新执行细胞制造工艺的步骤并不可行(例如，因为第二时间点的接受参数不符合接受标准的某些阈值)，那么可取消第二时间点之后的患者治疗。在此类实施方案中，向医院端界面和物流界面传达患者治疗的取消。在一些实施方案中，在确定重新执行细胞制造工艺的步骤并不可行后，可销毁扩增的细胞疗法产品。例如，在如果无法重新执行细胞制造工艺的步骤则不可能获得活的扩增的细胞疗法产品的情况下，输注细胞疗法产品变得不可能。因此，继续第二时间点之后的患者治疗事件对患者(例如，不论就健康结果或就财务结果或两者来说)可能有害。此外，如果基于确定的第二时间的接受参数来确定无法进一步使用第二时间点的扩增的细胞疗法产品(例如，如果第二时间点的细胞疗法产品受到污染或不符合某些其他接受标准)，那么可销毁细胞疗法产品。在这种情况下，将细胞订单标识符与患者特异性标识符解关联。
E.协调制造设施之间的制造槽
在本公开的另一方面，公开一种制造用于患者的细胞疗法产品的方法。在一些实施方案中，所述方法包括接受制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求。所述细胞订单请求可由与临床机构相关联的计算装置接受。所述细胞订单请求可经由例如医院端界面110接受。在一些实施方案中，所述计算装置可在接受细胞订单请求时产生患者特异性标识符和细胞订单标识符，并使患者特异性标识符和细胞订单标识符与细胞订单请求相关联。
除了细胞订单请求之外，所述计算装置也可接受用于制造细胞疗法产品的多个制造设施的制造槽。例如，所述计算装置可经由例如互联网以通信方式耦合至多个制造设施相关联的计算机子系统，以使所述计算装置可回应于计算装置的查询接受与制造槽有关的信息。个别制造设施的制造槽可指示在所述制造设施处的设备和人员的可用性以使所述制造设施得以根据细胞订单请求制造细胞疗法产品。
所述计算装置可进一步接受用于以细胞疗法产品治疗患者的患者治疗事件的初步安排。所述初步安排可基于制造细胞疗法产品的理想安排来决定，假设细胞疗法产品符合如本文别处所讨论的制造工艺期间的各制造步骤中的QA标准。
在接受细胞订单请求、制造槽和患者治疗事件的初步安排后，所述计算装置可基于患者治疗事件的初步安排在安排用户界面中确定并且展示多个用于制造细胞疗法产品的可用制造槽。所述可用制造槽是基于多种因素来确定，例如临床机构的位置、个别制造设施的位置、在个别制造设施与临床机构之间运输细胞疗法产品的物流提供者的可用性、临床机构的临床人员可用性(以便执行与患者治疗事件相关联的必需治疗程序)和任何其他可影响在个别位置的细胞疗法产品的抵达时间安排和/或使用的因素。
接着由所述计算装置的操纵员或由所述计算装置自动选择一个可用制造槽。在选择可用制造槽后，实体肿瘤可例如在医疗机构通过执行适当程序从患者获得。所述程序可根据初步安排并且基于考虑到实体肿瘤至个别制造设施的运输时间安排和物流提供者的可用性的可用制造槽来执行。在一些实施方案中，所述计算装置可起始打印待与实体肿瘤相关联的第一运输罐标签(参见例如图3H第1行)。第一运输罐标签可以包括患者特异性标识符和细胞订单标识符。在一些实施方案中，第一标签可另外包括与临床机构、所选择的制造设施和物流提供者有关的信息。此外，第一产物标签(参见例如图3H第2行)将与产物容器相关联。第一产物标签的实例绘示于图3G中。
接着根据可用制造槽，将实体肿瘤转移至所选择的制造设施。本领域技术人员应理解，由于实体肿瘤包括活细胞，因此实体肿瘤抵达所选择的制造设施的时间安排应与制造槽的可用性小心协调，以使制造步骤可在可接受的时间窗内起始。因此，从临床机构转移实体肿瘤至所选择的制造应基于物流提供者的可用性以及其他可影响此类转移的因素小心协调。例如，可能有在一些情况下可预期的天气相关或交通延迟，因此转移安排可据此调整。在其他情况下，可能无法预见转移延迟。然而，即使在此类情况下，实体肿瘤从临床机构到所选择的制造设施的转移也可以其他合适方式协调。
F.肿瘤摘取方案
参考回图3A，系统300的医院端界面包括肿瘤摘取模块114，所述模块使临床机构的人员得以根据预定方案从患者获得实体肿瘤，并且输入与用于从患者获得实体肿瘤的程序有关的信息。
在一些实施方案中，摘取模块114包括由临床机构的人员使用的肿瘤摘取表格，以确保在从患者获得实体肿瘤(或其片段)并且准备将它运送至制造设施的过程期间遵照适当程序。图3K-3P是根据本公开的一些实施方案的肿瘤摘取表格的代表性屏幕截图。在一些实施方案中，肿瘤摘取表格可要求从患者获得肿瘤的技术人员输入与所执行的程序有关的信息。输入的信息可用于更新批次记录以供事后审核(若有必要)。
此外，由于包括在批次记录中的信息可在整个系统中存取(若有适当许可)，因此与获得肿瘤所遵照的过程有关的信息也可供制造设施的人员使用。在一些实施方案中，在制造设施处的人员可存取与获得肿瘤的过程有关的信息作为质量控制措施以确保制造设施接受的生物材料适合进一步处理。
在一些实施方案中，肿瘤摘取表格包括要求符合某些标准才让技术人员继续工艺后续步骤的智能表单特征。例如，可要求技术人员输入与工艺期间所使用的细胞培养基有关的信息(诸如到期日)，并且如果所述到期日是在当前日期之前，那么肿瘤摘取模块114可警示技术人员。另外，肿瘤摘取模块114不允许技术人员输入任何与工艺有关的进一步信息，由此迫使技术人员放弃所述工艺。
同样，肿瘤摘取表格可要求技术人员先执行某些步骤或程序，然后才能输入与后续步骤或程序有关的信息。因此，摘取模块114要求技术人员遵照特定方案，不得遗漏或跳过某些步骤。
在一些实施方案中，摘取模块114可要求肿瘤摘取表格先进行验证，然后才能向快递释出获得的肿瘤以运送至制造设施。所述验证要求的作用是防失败，以确保当获得肿瘤时遵照适当方案和程序。在一些实施方案中，摘取模块114可要求肿瘤摘取表格的验证者与肿瘤摘取表格输入信息者不是同一人。此类验证要求也确保适当法规遵从性。
G.患者支持服务
本公开的实施方案可进一步操作以使与患者或患者的代表(在本文中统称为患者)交互的患者支持服务得以支持旅行、健康管理、健康保险、给付和其他治疗相关服务。在一些实施方案中，所述患者支持服务可与通话界面和可存取(若有适当许可)制造工艺和COC/COI过程的角色(persona)交互。如本文所用，术语“角色”是指用户类型。给定角色对所述系统和所述系统内的信息具备某种程度的存取并且可存取某些功能。所述系统内的角色包括但不限于社区角色、组织摘取角色、制造商角色、患者支持角色、患者角色和健康系统用户角色。
社区角色涉及社区用户，其可存取向患者提供治疗程序的中心的人员。社区角色用户可以包括例如细胞疗法协调者、骨髓移植护理师、医院收费部门等。与社区角色用户相关联的功能包括但不限于新患者挂号、更新患者登记资料、建立和提交患者的TIL订单请求、安排或变更切除日期、检视黄金途径日期、检视最终产物递送日期、上传医院采购单、上传患者同意书、登记患者的患者支持选项、检视和更新照顾者记录、填写和提交肿瘤摘取表格供批准、批准肿瘤摘取表格、打印肿瘤摘取表格、上传肿瘤摘取表格和打印培养基瓶和肿瘤运输罐标签。
与制造商角色相关联的用户包括肿瘤接受人员、质量控制人员、制造工艺人员和最终产物包装人员。与制造商角色相关联的功能包括但不限于输入批号、检视可用和保留制造槽、打印和扫描工艺中、最终产物和运输标签。
与肿瘤摘取角色相关联的用户包括例如外科医师和骨髓移植护理师。与肿瘤摘取角色相关联的功能可以包括但不限于填写肿瘤摘取表格、提交肿瘤摘取表格供批准、批准肿瘤摘取表格、打印肿瘤摘取表格和上传肿瘤摘取表格。
患者支持角色的用户可以包括但不限于患者支持人员、患者咨询师、医院收费管理师、医院保险管理师等。与患者支持角色相关联的功能可以包括但不限于检视患者协助服务案例、上传档案至案例、标注案例、转移案例至案例管理师等。
在系统的一些实施方案中，某些角色可存取某些信息类型。在一些实施方案中，某些角色的用户只有当执行某些类型的功能而非执行其他类型的功能时才可存取信息。例如，在一些实施方案中，医院收费管理师和/或医院保险管理师可经由患者支持角色存取COC/COI和制造工艺信息，但患者咨询师无法看见。在一些实施方案中，执行例如安排患者治疗事件、在患者治疗事件安排过程中协助患者和/或协助患者交通的功能的患者支持人员可看见但无法编辑制造和COC/COI信息。
例如，在一些实施方案中，一种通过将获自患者的肿瘤的细胞群体扩增成细胞疗法产品来制造所述细胞疗法产品的方法可包括：
基于制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求，在制造设施处接受来自所述患者的细胞群体；
由计算装置产生患者特异性标识符，包括与所述细胞订单请求相关联的细胞订单标识符；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在所述制造设施处接受所述细胞群体之后，由所述计算装置安排患者治疗事件，
使用细胞扩增技术从所述细胞群体的至少一些起始所述细胞疗法产品的所述扩增，并且确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合与对应时间点相关联的接受标准，
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第一时间点符合所述接受标准的确定，使用所述细胞扩增技术从所述获得的细胞疗法产品的至少一些继续所述细胞疗法产品的所述扩增直至所述第二时间点，和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第二时间点不符合所述接受标准的确定：
基于所述第二时间点的所述接受参数，确定从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是否可行，
回应于所述重新执行是可行的确定，从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术由所述第二时间点获得的所述细胞疗法产品的至少一些重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增以获得所述细胞疗法产品，
从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，由所述计算装置估算所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间，和
由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且从所述第一时间点完成细胞疗法产品的后续扩增，
其中所述患者治疗事件的重新安排是基于所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间和在所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的输注之前或之后的患者治疗事件的时间执行，并且
提供患者支持服务，例如支持旅行、健康管理、健康保险、给付和其他治疗相关服务。
VI.进一步考虑
提供上述实施例以向本领域技术人员给出如何产生和使用本发明组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和说明，并且不意图限制被发明人视为他们的发明的发明的范围。用于进行本发明的上述模式的修饰是本领域技术人员显而易见的，意图在以下权利要求书的范围内。本说明书中所提及的所有专利和公布指示本发明所属领域中的技术人员的技能水平。
所有标题和章节名称仅用于清晰和参考目的，并且不应认为以任何方式限制本发明。举例来说，本领域技术人员应了解根据本文所述的本发明的精神和范畴在适当时组合来自不同标题和章节的各种方面的有用性。
本文所引用的所有参考文献由此以全文引用的方式并且出于所有目的并入本文中，其并入程度就如同各个别公布或专利或专利申请是出于所有目的特别地并且个别地指示以全文引用的方式并入一般。
本领域技术人员将显而易见，在不背离本申请的精神和范畴的情况下可对其进行许多修改和变化。本文所述的特定实施方案和实施例仅以实例方式提供，并且本申请将仅由随附权利要求书的术语以及权利要求书有权要求的等效物的全部范畴限制。
本公开的各方面的各种实施例出于方便描述为编号条款(1、2、3等)。这些是作为实施例提供，并且不限制主题技术。图式和参考编号的鉴定在下文中仅作为实例并且出于说明目的提供，并且所述条款不受那些鉴定的限制。
条款1.一种通过将获自患者的肿瘤的细胞群体扩增成细胞疗法产品来制造所述细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
基于制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求，在制造设施处接受来自所述患者的细胞群体；
由计算装置产生患者特异性标识符，包括与所述细胞订单请求相关联的细胞订单标识符；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在所述制造设施处接受所述细胞群体之后，由所述计算装置安排患者治疗事件，
使用细胞扩增技术从所述细胞群体的至少一些起始所述细胞疗法产品的所述扩增，并且确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合与对应时间点相关联的接受标准，
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第一时间点符合所述接受标准的确定，使用所述细胞扩增技术从所述获得的细胞疗法产品的至少一些继续所述细胞疗法产品的所述扩增直至所述第二时间点，和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第二时间点不符合所述接受标准的确定：
基于所述第二时间点的所述接受参数，确定从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是否可行，
回应于所述重新执行是可行的确定，从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术由所述第二时间点获得的所述细胞疗法产品的至少一些重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增以获得所述细胞疗法产品，
从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，由所述计算装置估算所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间，和
由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且从所述第一时间点完成细胞疗法产品的后续扩增，
其中所述患者治疗事件的重新安排是基于所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间和在所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的输注之前或之后的患者治疗事件的时间安排来执行。
条款2.如条款1的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
条款3.如条款1的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
条款4.如条款1的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
条款5.如条款1的方法，其中所述确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述获得的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款6.如条款5的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
条款7.如条款5的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
条款8.如条款5的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
条款9.如条款8的方法，其中确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
条款10.如条款9的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述扩增的细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述扩增的细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
条款11.如条款1的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
条款12.如条款1的方法，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
条款13.如条款1的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
条款14.如条款13的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款15.如条款13的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
条款16.如条款15的方法，所述方法还包括：
基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和
基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
条款17.如条款16的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
条款18.如条款17的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
条款19.如条款17的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和
基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
条款20.如条款17的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述某些接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
条款21.如条款20的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
条款22.如条款21的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
条款23.如条款22的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
条款24.如条款23的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
条款25.一种用通过如条款1的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述扩增细胞疗法产品治疗所述患者的方法。
条款26.一种制造用于患者的细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
在计算装置处接受制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求、在多个制造设施处用于制造所述细胞疗法产品的制造槽和用于以所述细胞疗法产品治疗所述患者的患者治疗事件的初步安排，其中在来自与个别制造设施相关联的制造商计算机子系统的所述计算装置处接受用于个别制造设施的所述制造槽；
基于所述患者治疗事件的初步安排，由所述计算装置在安排用户界面中确定和展示多个用于制造所述细胞疗法产品的可用制造槽；
在选择所述可用制造槽中的一者之后，根据所述患者治疗事件的初步安排和所述可用制造槽，在医疗机构对所述患者执行程序以从所述患者获得实体肿瘤；
根据所述可用制造槽，将所述获得的实体肿瘤转移至对应于所述可用制造槽的制造设施；
在所述制造设施处接受所述获得的实体肿瘤后，使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一部分起始所述细胞疗法产品的制造；
在所述细胞疗法产品的所述制造期间，确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述制造的细胞疗法产品的接受参数和所述接受参数是否符合与对应时间点相关联的接受标准，所述接受参数是基于与所述对应时间点相关联的分析的结果来确定；
基于在所述第一和所述第二时间点中的一者或两者是否符合所述接受标准，由所述计算装置修改用于制造所述细胞疗法产品的制造安排、对应于所述制造设施的制造槽和所述患者治疗事件的初步安排；和
如果在所述第一和所述第二时间点均符合所述接受标准，那么根据所述修改的制造安排完成所述细胞疗法产品的所述制造。
条款27.如条款26的方法，所述方法还包括将所述制造的细胞疗法产品转移至所述医疗机构。
条款28.如条款26的方法，所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，由所述计算装置产生与所述患者相关联的患者特异性标识符和所述细胞订单请求。
条款29.如条款28的方法，所述方法还包括由所述计算装置自动产生用于所述获得的实体肿瘤的容器的运输标签，所述运输标签包含所述患者特异性标识符、所述细胞订单请求、所述制造槽和对应于所述可用制造槽的所述制造设施。
条款30.如条款29的方法，所述方法还包括由所述计算装置自动产生用于所述获得的实体肿瘤的容器的制造标签，所述制造标签包含当所述制造标签产生时对应于用于制造所述细胞疗法产品的制造工艺的时间点、容器鉴定条码、所述患者特异性标识符、在所述时间点完成的制造步骤、与所述完成的工艺相关联的接受参数和在所述时间点执行的制造工艺。
条款31.如条款26的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
条款32.如条款26的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
条款33.如条款26的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
条款34.如条款26的方法，其中所述确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述接受的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款35.如条款34的方法，所述方法还包括：由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且完成细胞疗法产品的后续扩增，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
条款36.如条款34的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
条款37.如条款34的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
条款38.如条款37的方法，其中确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
条款39.如条款38的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
条款40.如条款26的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
条款41.如条款26的方法，所述方法还包括：由所述计算装置估算所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
条款42.如条款29的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
条款43.如条款42的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款44.如条款43的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
条款45.如条款44的方法，所述方法还包括：
基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和
基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
条款46.如条款45的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
条款47.如条款46的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
条款48.如条款47的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和
基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
条款49.如条款48的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
条款50.如条款49的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
条款51.如条款50的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
条款52.如条款51的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
条款53.如条款52的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
条款54.一种用通过如条款26的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述制造的细胞疗法产品治疗所述患者的方法。
条款55.一种用于制造细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
在制造设施处接受获自患者的实体肿瘤；
由计算装置产生用于制造容器的制造标签，所述制造容器待用于使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一部分制造所述细胞疗法产品的工艺，所述制造标签包含与所述患者、所述制造工艺和制造的细胞疗法产品的质量相关联的信息；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在医疗机构对所述患者执行程序以从所述患者获得实体肿瘤，
将所述获得的实体肿瘤转移至制造设施，
在所述制造设施处接受所述获得的实体肿瘤之后，由所述计算装置动态安排患者治疗事件，所述动态安排取决于随后获得的扩增细胞疗法产品的接受参数，
使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一些起始所述细胞疗法产品的扩增，并且确定在多个时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
执行质量控制分析以在所述多个时间点确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数；
在所述计算装置处接受所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数；
由所述计算装置产生对应于所述多个时间点中的每一者的更新的制造标签，所述更新的制造标签包含与制造的细胞疗法产品的质量相关联的更新的信息，所述更新的信息包含在对应时间点的所述接受参数；
由所述计算装置读取在所述多个时间点中的每一者的所述更新的制造标签；和
基于在所述多个时间点中的每一者从所述更新的制造标签读取的信息，完成所述细胞疗法产品的扩增。
条款56.如条款55的方法，所述方法还包括如果存在以下情况，那么由所述计算装置提供警告信号：
在所述更新的制造标签上针对后续制造步骤的与所述患者有关的信息不符合在所述制造标签上针对前一制造步骤的与所述患者有关的信息，或
在所述更新的制造标签上针对所述制造工艺中的给定时间点的接受参数不符合所述制造工艺中的所述时间点的接受标准，
其中所述接受参数包含活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果中的一者或多者。
条款57.如条款55的方法，其中与所述患者有关的信息包含患者特异性标识符和与制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求相关联的细胞订单标识符。
条款58.如条款55的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
条款59.如条款55的方法，其中所述制造标签包含条码，所述条码编码与所述患者、所述制造工艺和制造的细胞疗法产品的质量相关联的信息。
条款60.如条款56的方法，所述方法还包括根据所使用的所述细胞扩增技术和所述制造设施何时接受细胞订单请求来安排用于确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数是否符合在所述制造工艺期间的所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点。
条款61.如条款60的方法，所述方法还包括与物流界面整合，经由快递计算子系统接受快递状态信息(其中快递状态信息包括并且回应于接受所述快递状态信息)，基于所述确定的制造安排来确定用于运输所述制造的细胞疗法产品的运输安排，和产生用于含有所述制造的细胞疗法产品的运输容器的运输标签。
条款62.如条款60的方法，所述方法还包括基于所述确定的运输安排将运输请求传递至物流设施。
条款63.如条款60的方法，所述方法还包括在执行最终质量控制分析之前产生用于含有所述制造的细胞疗法产品的运输容器的运输标签，所述运输标签指示所述制造的细胞疗法产品是不可释出的，除非所述最终质量控制分析的结果指示所述对应接受参数符合所述对应接受标准。
条款64.如条款56的方法，所述方法还包括：
在确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准后，确定用于所述细胞疗法的所述制造的完成日期；
基于所述完成日期，由所述计算装置产生对应于所述细胞疗法产品用于治疗患者的用途的患者治疗事件的安排；
基于所述完成日期，向物流界面传递提货单；和
向医院端界面传递所述患者治疗事件的所述安排。
条款65.如条款55的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
条款66.如条款55的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
条款67.如条款55的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
条款68.如条款56的方法，其中所述确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述获得的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款69.如条款68的方法，所述方法还包括：由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且完成细胞疗法产品的后续扩增，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
条款70.如条款68的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
条款71.如条款68的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
条款72.如条款71的方法，其中确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
条款73.如条款72的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
条款74.如条款55的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
条款75.如条款55的方法，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
条款76.如条款57的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
条款77.如条款76的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
条款78.如条款76的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
条款79.如条款78的方法，所述方法还包括：基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
条款80.如条款79的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
条款81.如条款80的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
条款82.如条款80的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和
基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
条款83.如条款80的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述某些接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
条款84.如条款83的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
条款85.如条款84的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
条款86.如条款85的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
条款87.如条款86的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
条款88.一种用通过如条款55的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述扩增细胞疗法产品治疗所述患者的方法。

Claims (89)

1.一种通过将获自患者的肿瘤的细胞群体扩增成细胞疗法产品来制造所述细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
由计算装置接受扩增用于所述患者的所述细胞群体的细胞订单请求；
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的细胞订单标识符，包括患者特异性标识符；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在制造设施处接受所述细胞群体之后，由所述计算装置动态安排患者治疗事件，所述动态安排取决于随后获得的扩增细胞疗法产品的接受参数，
使用细胞扩增技术从所述获得的细胞群体的至少一些起始所述细胞疗法产品的扩增并且确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合某些接受标准，
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，完成细胞疗法的初始扩增，和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且完成细胞疗法产品的后续扩增，
其中所述重新安排所述患者治疗事件是基于所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的输注与在所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的所述输注之前或之后的患者治疗事件之间的临床确定的时间间隙来执行。
2.一种通过将获自患者的肿瘤的细胞群体扩增成细胞疗法产品来制造所述细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
基于制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求，在制造设施处接受来自所述患者的细胞群体；
由计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的细胞订单标识符，包括患者特异性标识符；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在所述制造设施处接受所述细胞群体之后，由所述计算装置安排患者治疗事件，
使用细胞扩增技术从所述细胞群体的至少一些起始所述细胞疗法产品的扩增，并且确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数是否符合与对应时间点相关联的接受标准，
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第一时间点符合所述接受标准的确定，使用所述细胞扩增技术从所述获得的细胞疗法产品的至少一些继续细胞疗法产品的所述扩增直至所述第二时间点，和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述第二时间点不符合所述接受标准的确定：
基于所述第二时间点的所述接受参数，确定从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是否可行，回应于所述重新执行是可行的确定，从所述第一时间点使用所述细胞扩增技术由所述第二时间点获得的所述细胞疗法产品的至少一些重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增以获得所述细胞疗法产品，从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，由所述计算装置估算所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间，和由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且从所述第一时间点完成细胞疗法产品的后续扩增，
其中所述患者治疗事件的所述重新安排是基于所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间和在所述扩增的细胞疗法产品在所述患者中的输注之前或之后的患者治疗事件的时间安排来执行。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
6.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述获得的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
7.如权利要求6所述的方法，其中患者治疗事件的所述重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
8.如权利要求6所述的方法，其中患者治疗事件的所述重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
9.如权利要求6所述的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
10.如权利要求9所述的方法，其中确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述扩增的细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述扩增的细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
12.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
13.如权利要求2所述的方法，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
14.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
16.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括：
基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和
基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
19.如权利要求18所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
20.如权利要求18所述的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
21.如权利要求18所述的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述某些接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
23.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
24.如权利要求23所述的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
26.一种用通过如权利要求1所述的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述扩增细胞疗法产品治疗所述患者的方法。
27.一种制造用于患者的细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
在计算装置处接受制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求、在多个制造设施处用于制造所述细胞疗法产品的制造槽和用于以所述细胞疗法产品治疗所述患者的患者治疗事件的初步安排，其中在来自与个别制造设施相关联的制造商计算机子系统的所述计算装置处接受用于所述个别制造设施的所述制造槽；
基于所述患者治疗事件的初步安排，由所述计算装置在安排用户界面中确定和展示多个用于制造所述细胞疗法产品的可用制造槽；
在选择所述可用制造槽中的一者之后，根据所述患者治疗事件的初步安排和所述可用制造槽，在医疗机构对所述患者执行程序以从所述患者获得实体肿瘤；
根据所述可用制造槽，将所述获得的实体肿瘤转移至对应于所述可用制造槽的制造设施；
在所述制造设施处接受所述获得的实体肿瘤后，使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一部分起始所述细胞疗法产品的制造；
在所述细胞疗法产品的所述制造期间，确定在第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点所述制造的细胞疗法产品的接受参数和所述接受参数是否符合与对应时间点相关联的接受标准，所述接受参数是基于与所述对应时间点相关联的分析的结果来确定；
基于在所述第一和所述第二时间点中的一者或两者是否符合所述接受标准，由所述计算装置修改用于制造所述细胞疗法产品的制造安排、对应于所述制造设施的制造槽和所述患者治疗事件的初步安排；和
如果在所述第一和所述第二时间点均符合所述接受标准，那么根据所述修改的制造安排完成所述细胞疗法产品的所述制造。
28.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括将所述制造的细胞疗法产品转移至所述医疗机构。
29.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，由所述计算装置产生与所述患者相关联的患者特异性标识符和所述细胞订单请求。
30.如权利要求29所述的方法，所述方法还包括由所述计算装置自动产生用于所述获得的实体肿瘤的容器的运输标签，所述运输标签包含所述患者特异性标识符、所述细胞订单请求、所述制造槽和对应于所述可用制造槽的所述制造设施。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括由所述计算装置自动产生用于所述获得的实体肿瘤的容器的制造标签，所述制造标签包含当所述制造标签产生时对应于用于制造所述细胞疗法产品的制造工艺的时间点、容器识别条码、所述患者特异性标识符、在所述时间点完成的制造步骤、与所述完成的工艺相关联的接受参数和在所述时间点执行的制造工艺。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
34.如权利要求27所述的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
35.如权利要求27所述的方法，其中所述确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述接受的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
36.如权利要求35所述的方法，所述方法还包括：由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且完成细胞疗法产品的后续扩增，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
38.如权利要求35所述的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
39.如权利要求38所述的方法，其中确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
41.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
42.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括：由所述计算装置估算所述细胞疗法产品的所述扩增的完成时间，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
43.如权利要求27所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
44.如权利要求43所述的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
45.如权利要求44所述的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
46.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括：
基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和
基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
47.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
48.如权利要求47所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
49.如权利要求48所述的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和
基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
50.如权利要求49所述的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
52.如权利要求51所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
53.如权利要求52所述的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
54.如权利要求53所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
55.一种用通过如权利要求27所述的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述制造的细胞疗法产品治疗所述患者的方法。
56.一种用于制造细胞疗法产品的方法，所述方法包括：
在制造设施处接受获自患者的实体肿瘤；
由计算装置产生用于制造容器的制造标签，所述制造容器待用于使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一部分制造所述细胞疗法产品的工艺，所述制造标签包含与所述患者、所述制造工艺和制造的细胞疗法产品的质量相关联的信息；
起始制造所述细胞疗法产品的工艺，所述工艺包括：
在医疗机构对所述患者执行程序以从所述患者获得实体肿瘤，
将所述获得的实体肿瘤转移至制造设施，
在所述制造设施处接受所述获得的实体肿瘤之后，由所述计算装置动态安排患者治疗事件，所述动态安排取决于随后获得的扩增细胞疗法产品的接受参数，
使用细胞扩增技术从所述获得的实体肿瘤的至少一些起始所述细胞疗法产品的扩增，并且确定在多个时间点所述扩增细胞疗法产品的接受参数，
执行质量控制分析以在所述多个时间点确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数；
在所述计算装置处接受所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数；
由所述计算装置产生对应于所述多个时间点中的每一者的更新的制造标签，所述更新的制造标签包含与制造的细胞疗法产品的质量相关联的更新的信息，所述更新的信息包含在对应时间点的所述接受参数；
由所述计算装置读取在所述多个时间点中的每一者的所述更新的制造标签；和
基于在所述多个时间点中的每一者从所述更新的制造标签读取的信息，完成所述细胞疗法产品的扩增。
57.如权利要求56所述的方法，所述方法还包括如果存在以下情况，那么由所述计算装置提供警告信号：
在所述更新的制造标签上针对后续制造步骤的与所述患者有关的信息不符合在所述制造标签上针对前一制造步骤的与所述患者有关的信息，或
在所述更新的制造标签上针对所述制造工艺中的给定时间点的接受参数不符合所述制造工艺中的所述时间点的接受标准，
其中所述接受参数包含活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果中的一者或多者。
58.如权利要求56所述的方法，其中与所述患者有关的信息包含患者特异性标识符和与制造用于所述患者的所述细胞疗法产品的细胞订单请求相关联的细胞订单标识符。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
60.如权利要求56所述的方法，其中所述制造标签包含条码，所述条码编码与所述患者、所述制造工艺和制造的细胞疗法产品的质量相关联的信息。
61.如权利要求57所述的方法，所述方法还包括根据所使用的所述细胞扩增技术和所述制造设施何时接受细胞订单请求来安排用于确定所述制造的细胞疗法产品的接受参数是否符合在所述制造工艺期间的所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括第一时间点和在所述第一时间点之后的第二时间点。
62.如权利要求61所述的方法，所述方法还包括与物流界面整合，经由快递计算子系统接受快递状态信息(其中快递状态信息包括并且回应于接受所述快递状态信息)，基于所述确定的制造安排来确定用于运输所述制造的细胞疗法产品的运输安排，和产生用于含有所述制造的细胞疗法产品的运输容器的运输标签。
63.如权利要求61所述的方法，所述方法还包括基于所述确定的运输安排将运输请求传递至物流设施。
64.如权利要求61所述的方法，所述方法还包括在执行最终质量控制分析之前产生用于含有所述制造的细胞疗法产品的运输容器的运输标签，所述运输标签指示所述制造的细胞疗法产品是不可释出的，除非所述最终质量控制分析的结果指示所述对应接受参数符合所述对应接受标准。
65.如权利要求57所述的方法，所述方法还包括：
在确定所述制造的细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准后，确定用于所述细胞疗法的所述制造的完成日期；
基于所述完成日期，由所述计算装置产生对应于所述细胞疗法产品用于治疗患者的用途的患者治疗事件的安排；
基于所述完成日期，向物流界面传递提货单；和
向医院端界面传递所述患者治疗事件的所述安排。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含T细胞。
67.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞疗法产品包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
68.如权利要求57所述的方法，其中所述患者治疗事件包括住院时间段、切除日期、淋巴细胞耗尽日期、向所述患者输注所述细胞疗法产品的输注日期和IL-2治疗日期中的一者或多者。
69.如权利要求57所述的方法，其中所述确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数是否符合所述接受标准包括在所述获得的细胞疗法产品的所述扩增的所述起始之后的多个时间点确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
70.如权利要求69所述的方法，所述方法还包括：由所述计算装置重新安排所述患者治疗事件并且完成细胞疗法产品的后续扩增，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数不符合所述接受标准的确定，重新安排所述患者治疗事件。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述患者治疗事件的重新安排包括回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述患者治疗事件。
72.如权利要求69所述的方法，其中回应于在所述多个时间点中的任一者所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数由于污染而不符合所述接受标准的确定，终止所述细胞疗法产品的后续扩增。
73.如权利要求72所述的方法，其中确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数包括活力、无菌性、细胞计数、支原体计数、CD3计数、内毒素分析结果和革兰氏染色分析结果的确定中的一者或多者。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括快速扩增步骤，并且
所述方法还包括：
确定所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数在所述快速扩增步骤之前是否符合所述接受标准；和
回应于所述扩增细胞疗法产品的所述接受参数符合所述接受标准的确定，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之前的日期安排淋巴细胞耗尽日期，在所述细胞疗法产品的所述制造完成之后的日期安排输注日期，并且在所述输注日期之后安排IL-2治疗日期。
75.如权利要求56所述的方法，其中所述细胞扩增技术包括在单一密闭容器生物反应器中培养所述细胞疗法产品。
76.如权利要求56所述的方法，其中估算从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增之后，所述细胞疗法产品的所述扩增的所述完成时间包括基于所述第二时间点的所述接受参数和与用于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增的细胞群体相关联的所述接受参数中的一者或两者，确定从所述第一时间点完成所述扩增过程所需的时间。
77.如权利要求58所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的细胞订单请求是由医院端界面接受，并且所述方法还包括在接受所述细胞订单请求后，向所述医院端界面传递已接受与所述患者相关联的所述细胞订单请求的确认，所述确认包括所述患者特异性标识符和所述细胞订单标识符中的一者或两者。
78.如权利要求77所述的方法，所述方法还包括根据所述细胞扩增技术和何时接受所述细胞订单请求来安排用于确定所述扩增细胞疗法产品的接受参数在所述细胞疗法产品的扩增期间是否符合所述接受标准的一组对应于多个时间点的日期，所述多个时间点包括所述第一和所述第二时间点。
79.如权利要求78所述的方法，所述方法还包括在重新安排所述患者治疗事件后，向所述医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的更新安排。
80.如权利要求79所述的方法，所述方法还包括：
基于所述完成时间，向物流界面传递与所述患者特异性标识符相关联的提货单；和
基于所述完成时间，向医院端界面传递与所述患者特异性标识符相关联的所述患者治疗事件的安排。
81.如权利要求80所述的方法，所述方法还包括：回应于从所述第一时间点重新执行所述细胞疗法产品的所述扩增是可行的确定：
由所述计算装置将所述细胞订单标识符与所述患者特异性标识符解除关联，和
由所述计算装置产生与所述细胞订单请求相关联的新细胞订单标识符并且使所述新细胞订单标识符与所述患者特异性标识符相关联。
82.如权利要求81所述的方法，其中扩增细胞疗法产品的所述细胞订单请求是从医院端界面接受，并且所述方法还包括向所述医院端界面传递包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符和所述细胞疗法产品的所述扩增的估算完成时间。
83.如权利要求82所述的方法，所述方法还包括：
基于所述患者治疗事件的所述重新安排，由所述计算装置产生与所述患者治疗事件相关联的运输和物流事件的新安排，和
基于运输和物流事件的所述重新安排，向物流界面传递与包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符相关联的运输和物流事件的所述新安排。
84.如权利要求81所述的方法，所述方法还包括：
由所述计算装置在确定接受参数是否符合所述某些接受标准的各时间点使所述患者特异性标识符与所述新细胞订单标识符相关联，所述新细胞订单标识符包括对应于各个别时间点和所述确定的结果的栏位。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述安排包括：
基于包括所述新细胞订单标识符的所述患者特异性标识符，由所述计算装置安排所述患者治疗事件。
86.如权利要求85所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可能的确定，由所述计算装置取消安排在所述第二时间点之后的所述患者治疗事件。
87.如权利要求86所述的方法，所述方法还包括向医院端界面和物流界面传递所述患者治疗事件的取消。
88.如权利要求87所述的方法，所述方法还包括回应于所述重新执行是不可行的确定，销毁所述扩增的细胞疗法产品并且将所述患者特异性标识符与所述细胞订单标识符解除关联。
89.一种用通过如权利要求56所述的方法根据所述重新安排的患者治疗事件获得的所述扩增细胞疗法产品治疗所述患者的方法。
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