JP2023554425A - 腫瘍浸潤リンパ球の処理 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離及び凍結保存し、治療用ＴＩＬ集団を産生するための方法を提供し、ＴＩＬ集団の増殖前の切除腫瘍の無菌脱凝集、濃縮、及び凍結保存のためのキット及び半自動デバイスの使用を介した方法を含む。本発明はまた、ＴＩＬ、例えば、ＵＴＩＬの増殖及び／又は安定化のための方法、ＴＩＬを伴う組成物、並びにＴＩＬを伴う治療方法を提供する。本発明は、腫瘍の半自動的な無菌組織処理を介して切除腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離、増殖、及び凍結し、それによって、治療用ＴＩＬ集団を産生するための方法及びデバイスを提供する。

Description

関連出願及び参照による組み込み
本出願は、両方が２０２０年１２月１８日に出願された米国特許出願第６３／１２７，６３９号及び同第６３／１２７，５８２号、並びに両方が２０２１年１２月１０日に出願された米国特許出願第６３／２８８，４０９号及び同第６３／２８８，４１４号に対する優先権を主張する。
２０１９年１２月２０日に出願された米国特許出願第６２／９５１，５５９号、２０２０年２月２７日に出願された米国特許出願第６２／９８２，４７０号、２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第２９／７４０，２９３号、２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第６３／０４７，４３１号、及び２０２０年１２月１８日に出願され、かつ２０２１年６月２４日にＷＯ２０２１／１２３８３２として公開されたＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３３１５を参照し、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２０１７年１月１３日に出願された英国特許出願第ＧＢ１７００６２１．４号、２０１８年１月１２日に出願された欧州特許出願第ＥＰ１８７０１７９１．８号、２０１８年１月１２日に出願され、２０１８年７月１９日にＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１３０８４５号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５００８８号、２０１９年１２月２０日に出願された米国特許出願第６２／９５１，５５９号を参照し、これらは、本明細書によって組み込まれる参照である。
２０１９年３月１日に出願された英国特許出願第ＧＢ１９０２７６３．０号、２０１９年３月２７日に出願された英国特許出願第ＧＢ１９０４２４９．８号、及び２０２０年２月２８日に出願され、２０２０年９月１０日にＷＯ２０２０／１７７９２０として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／００００５３号を参照する。
上述の出願、「Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、 ＷＯ２０１９／１４５７１１Ａ１ ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５０１８８、「Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、ＵＳＡ，ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５１７９０及び米国出願第６２／８７８，００１号、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ」、ＷＯ２０２０／１５２４５１、米国出願第６２／９５１，７７０号及びＧＢ１９００８５８．０、「Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＷＯ２０１７／１０３５９６Ａ１、米国出願第１６／０６１，４３５号、及び欧州特許公報第ＥＰ３３９０４３６号、並びに「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＷＯ２０１９／２４３８３５Ａ１ ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１７４５、また、それらにおいて、又はそれらの審査中に引用されている全ての文献（「出願引用文献）、並びに本明細書に引用又は参照されている全ての文献（「本明細書の引用文献」）、及び本明細書で引用されている文献で引用又は参照された全ての文献とともに、本明細書又は本明細書で参照によって組み込まれる任意の文献に記載される任意の製品のための任意の製造業者の説明書、説明、製品仕様、及び製品シートが、ここで参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、全ての参照される文書は、個々の文書が各々参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に参照により組み込まれる。
本発明は、腫瘍の半自動的な無菌組織処理を介して切除腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離、増殖、及び凍結し、それによって、治療用ＴＩＬ集団を産生するための方法及びデバイスを提供する。
Ｔ細胞は、骨髄に常駐する造血幹細胞に由来するが、その後、胸腺に移動し、胸腺内で成熟する。成熟過程の間、Ｔ細胞は、一連の選択事象を受け、それによって、Ｔ細胞の多様なレパートリーを生成する。次いで、これらの細胞は、末梢循環に放出され、適応免疫システムの一部として特定の機能を果たす。
Ｔ細胞は、細胞の均質な群ではないが、多くの系統から構成され、その主なタイプは、２つの更なる細胞マーカーの発現によって定義される。ＣＤ４発現Ｔ細胞は、概してヘルパー（Ｔｈ）と呼ばれ、細胞間接触によって、及びサイトカインと呼ばれるメディエーター分子の産生を通じて、免疫系の多くの機能を調整すると考えられる。ＣＤ８ Ｔ細胞は、細胞傷害性（Ｔｃ）と考えられ、標的細胞を直接死滅を実施する細胞であると考えられる。これらの活性は、全て、Ｔ細胞受容体／抗原／ＭＨＣ相互作用を通じて制御され、結果として、標的細胞上のペプチド／ＭＨＣの正常な認識時に、ＣＤ４及びＣＤ８細胞は、サイトカイン産生及び細胞傷害性活性を通じて協働して作用し、ウイルス感染及び腫瘍細胞を含む標的細胞を排除する。
Ｔ細胞は、無傷のタンパク質（抗原）を認識しないが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と呼ばれる特定のタンパク質によって標的細胞の表面上に提示される短いタンパク質断片に応答する。成熟過程の間、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子によって提示されるこれらの短いタンパク質（ペプチド）抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をその細胞表面上に発現する。したがって、正しいＭＨＣ分子と関連付けられた標的細胞の表面上に正しいペプチドが提示されるときのみ、Ｔ細胞は、そのエフェクター機能を活性化することになる。したがって、腫瘍特異的Ｔ細胞の頻度は腫瘍内で豊富であり、腫瘍特異的Ｔ細胞、すなわち、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の理想的な供給源となる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ａｐｒ １；７２（７）：１６４２－５０．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－２６１４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ６）。
当然ながら、これは非常に簡略化された考え方であり、Ｔ細胞機能の短い概要を表す。適応免疫応答は、単独では作用しないが、Ｔ細胞の必要な活性部位への効率的な輸送を促進し、正しい免疫応答が開始され、免疫応答が制御され、必要となった後に停止されることを確保するために、広範囲の免疫及び非免疫細胞との広範な相互作用を必要とする。したがって、製造されたＴＩＬが腫瘍に対する免疫応答を開始する患者においても、次いで、患者自身の免疫系及び腫瘍微小環境によって支持又は減衰され得る。
腫瘍特異的ＴＩＬは、原発がん又は転移性がんを有する患者の腫瘍から単離されたＴ細胞である。ほとんどのがん患者において、循環腫瘍特異的Ｔ細胞が血液中にほとんど検出されない。しかしながら、皮膚黒色腫などの特定のがんは、腫瘍成長の自然な経過中、特に腫瘍エリア内で、抗腫瘍活性を有するかなりの数のＴ細胞を誘導する能力を有するため、免疫原性であると考えられる（Ｍｕｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７ Ｆｅｂ １；１３８（３）：９８９－９５）。「腫瘍に特異的なＴ細胞として選択された」腫瘍反応性Ｔ細胞は、腫瘍材料から単離され、エクスビボで高い数に増殖され得る。報告によると、これらの細胞は、抗腫瘍反応性を含有しており、これは、患者への再注入時、腫瘍の破壊及び臨床的奏効を結果的にもたらし得る（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２ Ｏｃｔ ２５；２９８（５５９４）：８５０－４．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｓｅｐ １９）。その後の試験では、Ｔ細胞特性の重要性が確認され、「若い」急速に成長する細胞である「Ｙｏｕｎｇ ＴＩＬ」の有益性が確認され、それによって、細胞は、全く「特異性について選択されていない」ことが確認された。注目すべきことに、これは、ＴＩＬ又はＣＤ８選択ＴＩＬにおいて約５０％の優れた奏効率を生じさせる（Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｊａｎ；２９（１）：１４５－５４；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｄｅｃ １５；１６（２４）：６１２２－３１．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１０－１２９７．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊｕｌ ２８）。
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ａｐｒ １；７２（７）：１６４２－５０．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－２６１４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ６）は、末梢血中のＴ細胞と比較して、黒色腫特異的Ｔ細胞（既知のがん抗原に対して）が腫瘍内で濃縮されることを特定した。これは、単離されたＴＩＬ集団が、末梢血から単離され、ＩＬ２又は静脈内ＩＬ－２単独の同様のレベルで増殖したＴ細胞を使用した黒色腫患者における早期試験と比較して、腫瘍特異的Ｔ細胞が濃縮され、結果的に増強された抗腫瘍活性をもたらすことを支持する（ＬＡＫ ｃｅｌｌｓ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．１９９９ Ｄｅｃ；８４（１２）：１１１０－４９）。
米国特許第１０，３９８，７３４号は、ＴＩＬを増殖させ、治療用ＴＩＬ集団を産生するための方法に関する。’７３４特許の腫瘍はバルク腫瘍として出荷され、バルク腫瘍内のＴＩＬは、急速に酸素欠乏となり、経時的に進行性に悪化する。’７３４特許の腫瘍はまた、内部細胞集団が悪化した断片にも処理される。更に、製造に使用されるＴＩＬは、組織断片から増殖されたＴＩＬのみであり、内部に保持されたいかなるＴＩＬでもない。したがって、結果として生じる細胞集団は、腫瘍環境の完全な多様性を反映しない場合がある。
ＴＩＬを採取することは、培養及びＴＩＬ集団の増殖の前に、バルク腫瘍としての固形組織の無菌脱凝集を必要とする。固形組織の脱凝集中の状態及び細胞を採取するためにかかる時間は、最終細胞化材料の生存及び回収に実質的な影響を与える。従来的な方法を使用して得られる固形組織由来細胞懸濁液は、多くの場合、多種多様な異なる細胞タイプ、脱凝集培地、組織片、及び／又は流体を含む。これは、例えば、再生医療の製造、養子細胞療法、ＡＴＭＰ、診断的インビトロ研究、及び／又は科学研究の前に、細胞タイプの選択的標的化及び／又は単離の使用を必要とし得る。
現在、選択又は濃縮技術は、概して、サイズ、形状、密度、接着、強力なタンパク質間相互作用（すなわち、抗体－抗原相互作用）のうちの１つを利用する。例えば、いくつかの実例では、選択は、成長支持環境を提供することによって、及び半永久的又は永久的な、磁気又は非磁気の固相又は半固相基体への結合と関連付けられた培養条件又はより複雑な細胞マーカー相互作用を制御することによって行われ得る。
濃縮、単離、又は選択のために、任意の選別技術、例えば、親和性クロマトグラフィー、又は当該技術分野で既知の任意の他の抗体依存性分離技術が使用され得る。当該技術分野で既知の任意のリガンド依存性分離技術は、細胞の物理的特性に依存する陽性分離技術及び陰性分離技術の両方とともに使用され得る。特に強力な選別技術は、磁気細胞選別である。細胞を磁気的に分離する方法は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｌｌｐｒｏ Ｓｅａｔｔｌｅ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、又はＱｕａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。例えば、モノクローナル抗体は、Ｄｙｎａｌ Ｍ ４５０又は類似の磁気粒子のような磁気ポリスチレン粒子に直接結合され、例えば、細胞分離に使用され得る。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ技術は、カラムベースではなく、細胞が付着したこれらの磁気ビーズが、サンプルチューブ内の液相動態を享受し、磁気ラック上にチューブを配置することによって細胞が単離される。
試料からの細胞の濃縮、選別、及び／又は検出は、例えば、多糖類の有機コーティングを有するコロイド超常磁性微粒子と併せてモノクローナル抗体を使用することを含む（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。粒子（例えば、ナノビーズ又はマイクロビーズ）は、モノクローナル抗体に直接コンジュゲートされるか、抗免疫グロブリン、アビジン、若しくは抗ハプテン特異的マイクロビーズと組み合わせて使用されるか、又は選択的結合特性を有する他の哺乳類分子で被覆され得る。
上記に説明されるものなどの磁気粒子選択技術は、特定の表面マーカーに対して抗体又は他の部分を被覆した磁気ナノ粒子をインキュベートすることによって、細胞が陽性又は陰性分離されることを可能にする。これは、このマーカーを発現する細胞を磁気ナノ粒子に付着させる。その後、細胞溶液が、強い磁界の固形又は可撓性コンテナ内に配置される。このステップでは、細胞は、ナノ粒子（マーカーを発現する）に付着し、カラム上に留まるが、一方、他の細胞（マーカーを発現しない）は、流れ通る。この方法によると、細胞は、特定のマーカーに対して陽性又は陰性分離され得る。
陽性選択の場合、磁気カラムに付着した関心対象のマーカーを発現する細胞は、磁界からカラムを除去した後に、別個の容器に押し流される。
陰性選択の場合、使用される抗体又は選択部分は、関心対象ではない細胞上に存在することが知られている表面マーカーに向けられる。カラム上への細胞／磁気ナノ粒子溶液の適用後、これらの抗原を発現する細胞は、カラムに結合し、通過する画分は、それが関心対象の細胞を含有するため、収集される。これらの細胞は、ナノ粒子に結合された選択抗体又は部分によって非標識化されるため、それらは「非接触」である。公知の手動又は半自動の固形組織処理ステップは、労働集約的であり、当該技術分野の知識を必要とする。
加えて、材料が治療目的で使用される場合、処理は、細胞培養物の取り扱い中、厳格に制御された環境条件、例えば、脱凝集の一部として、若しくはその前の組織処理、酵素消化及び保存デバイスへの移送、又は脱凝集／細胞化及び生組織収率のためのインキュベーション条件を必要とする。典型的には、このプロセスは、同じ活動を安全かつ同時に汚染のリスクを最小化するために、複数の実験室及び組織処理機器の部品、並びに危険封じ込め又は組織処理施設の無菌環境のいずれか内に収容される臨界段階を含む科学技術の技能及び知識を有する人員を必要とする。
組織からの所望の産物の生存性及び回収は、細胞の組織収集、脱凝集、及び採取中の条件によって影響され得る。本発明は、上記に説明された満たされていない必要性を達成する該処理を行う装置／デバイスを含む、改善された組織処理を提供する必要性から発生する。
本出願におけるいずれの文書の引用又は識別も、かかる文書が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
米国特許第１０，３９８，７３４号明細書
Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ａｐｒ １；７２（７）：１６４２－５０．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－２６１４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ６ Ｍｕｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７ Ｆｅｂ １；１３８（３）：９８９－９５ Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２ Ｏｃｔ ２５；２９８（５５９４）：８５０－４．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｓｅｐ １９ Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｊａｎ；２９（１）：１４５－５４ Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｄｅｃ １５；１６（２４）：６１２２－３１．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１０－１２９７．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊｕｌ ２８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ａｐｒ １；７２（７）：１６４２－５０．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１１－２６１４．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ６ ＬＡＫ ｃｅｌｌｓ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．１９９９ Ｄｅｃ；８４（１２）：１１１０－４９
本発明は、治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＵＴＩＬ）集団を単離するための方法に関し、方法は、
（ａ）対象から腫瘍を切除すること、
（ｂ）切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、保存すること、
（ｃ）脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、最小限の細胞損傷で凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集すること、
（ｄ）安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施すること、
（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること、
（ｇ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することを含む。
脱凝集は、物理的脱凝集、酵素脱凝集、又は物理的及び酵素的脱凝集を含み得る。有利な実施形態では、脱凝集腫瘍は、細胞化又は精製される。
本発明では、相互接続され、特定の別個の機能を有するコンテナのセットは、処理するために、任意選択的に、脱凝集及び細胞化腫瘍を濃縮するが、安定化するために、無菌的閉鎖系を維持する。本質的に、本発明は、切除腫瘍の処理中に必要とされる時間及び汚染又はオペレータ曝露の危険性を最小化するための、急速滅菌前環境を提供する。
無菌キットは、閉鎖固形組織処理を可能にし、特に、プロセスが組織回収／精製部位内で実施され、その最終的な有用性について最終細胞処理の前に保存を必要とするときに、標準的な非閉鎖組織処理と比較して、最終細胞化産物の汚染の危険性を排除する。加えて、オペレータの安全性は、ウイルスなどの感染性生物を含有し得る、生物学的有害物質との直接接触の低減に起因して増大する。キットはまた、最終的に処理された細胞化材料の全部又は一部が、その究極の有用性のために処理される前に、輸送又は保存のいずれかのために安定化されることを可能にする。
本発明は、切除腫瘍が、切除時に、又は必要に応じて切除後に、細胞化腫瘍の回収手順又は生存率に影響せずに、処理されることを可能にすることになる。
いくつかの実施形態では、不要になった試薬、細胞片、非脱凝集腫瘍組織及び脂肪などの不純物を低減するための、物理的精製の形態を介した任意選択的な濃縮が採用され得る。無菌キットは、安定化前に、この目的のために、任意選択の濃縮モジュールを有し得る。単一細胞又は小細胞数の凝集体は、５μｍ未満の粒子及び流体、又は約２００μｍ以上の不完全に脱凝集された材料を除外することによって、脱凝集後の安定化のために濃縮され得るが、これは、組織及び脱凝集の効率に応じて変動することになり、組織特異的キットの形態の様々な実施形態は、組織又は脱凝集腫瘍の最終的な有用性に依存して採用され得る。
別の実施形態では、ステップ（ｃ）の後に単一細胞懸濁液が提供される。
別の実施形態では、第１のＵＴＩＬ集団は、１００万～２０００万個のＵＴＩＬ、２０００万～４０００万個のＵＴＩＬ、４０００万～６０００万個のＵＴＩＬ、６０００万～８０００万個のＵＴＩＬ、８０００万～１億個のＵＴＩＬ、１億～１億２５００万個のＵＴＩＬ、１億２５００万～１億５０００万個のＵＴＩＬ、１億５０００万～２億個のＵＴＩＬ、又は２億～２億５千万個のＵＴＩＬを含む、約１００万～２億５０００万個のＵＴＩＬを必要とする。
別の実施形態では、ステップ（ｅ）は、切除腫瘍出発材料からのＵＴＩＬの成長、その後のステップ（ｆ）の急速増殖を更に含み得る。
別の実施形態では、ステップ（ｅ）は、約２週間実施され得、ステップ（ｆ）は、約２週間実施され得る。
別の実施形態では、追加のステップ（ｈ）は、第２のＵＴＩＬ集団を懸濁させることを伴う。懸濁することは、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中であり得る。
本発明はまた、本明細書に開示される方法のいずれかによって得られた治療用凍結保存ＵＴＩＬ集団を含み得る。治療用集団は、約５×１０９～５×１０１０個のＴ細胞を含み得る。
本発明はまた、本明細書に開示される治療用集団の凍結保存バッグも包含する。凍結保存バッグは、静脈内注入で使用するためのものであり得る。
本発明はまた、本明細書に開示される治療用集団又は本明細書に開示される凍結保存バッグを投与することを含み得る、がんを治療するための方法も包含する。本発明はまた、がんの治療に使用するための本明細書に開示される治療用集団、医薬組成物、又は凍結保存バッグも包含する。がんは、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮細胞がん（ＨＮＳＣＣ）を含む、肺がん（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む）、黒色腫、卵巣がん、腎がん、又は腎細胞がんであり得る。
別の実施形態では、無菌キットの１つ以上の可撓性コンテナは、弾性変形可能な材料を含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナは、１つ以上の封止可能な開口部を含む。脱凝集モジュール及び／又は安定化モジュールの１つ以上の可撓性コンテナはまた、ヒートシール可能な溶着を含み得る。
別の実施形態では、無菌キットの１つ以上の可撓性コンテナは、内部に丸みを帯びた縁を含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナは、その中に固形腫瘍を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む。
別の実施形態では、無菌キットの濃縮モジュールの１つ以上の可撓性コンテナは、細胞化脱凝集固形腫瘍の保持物を保持するフィルタを含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールの１つ以上の可撓性コンテナは、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む。
別の実施形態では、無菌キットは、デジタル、電子、又は電磁タグ識別子を更に含む。タグ識別子は、脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスで使用される１つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連し得る。
別の実施形態では、同じ可撓性コンテナは、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの１つ以上の一部を形成し得る。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールは、処理される組織の受け取りのための第１の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールは、脱凝集のための培地を含む第２の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの任意選択の濃縮モジュールは、濃縮された濾液を受容するための第１の可撓性コンテナ及び第３の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第２の可撓性コンテナを含み、第２の可撓性コンテナは、消化培地及び安定化培地を含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールは、安定化培地を含む第４の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールはまた、保存する及び／又は凍結保存を受けるための第１の可撓性コンテナ及び／又は第３の可撓性コンテナを含む。
本発明はまた、治療用凍結保存ＴＩＬ集団を単離するための方法を提供し、方法は、
（ａ）対象から腫瘍を切除すること、
（ｂ）切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、保存すること、
（ｃ）脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、
（ｄ）安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施すること、
（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＴＩＬ活性化因子を用いて第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することを含む。
特定の非限定的な実施形態では、ＴＩＬ活性化因子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、又は人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、又は抗原断片、複合体、若しくは抗体を含む。
別の実施形態では、自動デバイスは、本発明の実施形態における自動デバイス内などの、自動処理中に、無菌キットがスキャンされ、認識され得るように、無菌キットの認識用の無線周波数識別タグリーダーを更に備える。極めて重要なことに、タグは、自動処理に必要な条件及びステップに関する情報を提供するため、キットを単純にスキャンすることによって、組織を処理するためにキットとともに使用される任意の自動システムは、更なる介入又は汚染なしで行われ得る。組織試料が脱凝集モジュールに配置されると、例えば、処理開始前に、手動又は自動で封止され得る。
自動デバイスのプログラム可能プロセッサはまた、タグを介して無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにコントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行し得る。自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／又は安定化モジュールと通信し制御するように適合可能である。換言すれば、キットは、そのようなデバイスに挿入されたときに腫瘍を処理するための特定の完全自動方法を実行するために使用される自動デバイスによって読み取り可能である。
自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び／又は生物学的分解を可能にし得る。この分解は、固形組織材料の物理的又は酵素的分解であり得る。固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の培地酵素溶液によるものであり得る。
別の実施形態では、プログラム可能プロセッサは、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御する。いくつかの実施形態では、脱凝集表面は、機械的ピストンによって制御される。
別の実施形態では、プログラム可能プロセッサは、安定化モジュールを制御して、コンテナ内の濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存する。これは、デバイスに挿入されるキットのタグを読み取ることによって決定される、プログラム可能な温度設定、条件を使用して達成され得る。
別の実施形態では、プロセスの異なる機能を行うために、デバイス及び／又はキットの追加の構成要素のうちの１つ以上が提供され、任意の組み合わせで利用可能であり得る。これは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための１つ以上の弁、並びに／又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための１つ以上のクランプを含み得る。
別の実施形態では、自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されるか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合される。これは、ＵＴＩＬが、安定化モジュールで使用されるタイプ又は安定化プロセスに応じて、最終的な利用の前に、短期間（数分から数日）保存されるか、又は長期間（数日から数年）保存されることを可能にする。
別の実施形態では、自動デバイスは、ユーザインターフェースを更に含む。インターフェースは、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含み得る。
別の実施形態では、自動デバイスは、輸送可能であるように適合され、したがって、ホイール、タイヤ、及び／又はハンドルなどの容易な操作性及び／又は補助動作を可能にする寸法を含み得る。
本発明はまた、治療用凍結保存ＵＴＩＬ集団を単離するための半自動無菌組織処理方法を提供し、方法は、
（ａ）無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定するステップであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、決定するステップ、
（ｂ）対象から腫瘍を切除するステップ、
（ｃ）無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に腫瘍を配置するステップ、
（ｄ）１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって腫瘍を処理するステップであって、
切除腫瘍が無菌脱凝集され、それによって、脱凝集腫瘍を産生し、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集モジュール、
脱凝集腫瘍が、脱凝集固形組織材料を除去し、非脱凝集組織及び濾液を分離するために濾過される、任意選択の濃縮モジュール、
脱凝集腫瘍が凍結保存される、安定化モジュールと通信し、それらを制御することによって、処理するステップ、
（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施するステップ、
（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生するステップ、
（ｇ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存するステップを含む。
バッグなどの可撓性コンテナは、組織材料を処理するために使用され得る。処理は、組織を分離又は破壊し得る処置を含み得、例えば、物理的破壊は、攪拌、例えば、穏やかな攪拌を使用して達成され得、生物学的及び／又は酵素的分解は、酵素消化、及び／又はバッグ内の組織材料の構成要素の抽出を含み得る。
組織を処理するためのバッグなどの可撓性コンテナは、製造中に封止される可撓性コンテナの少なくとも３つの縁、及び使用中に組織材料が挿入される可撓性コンテナ上の開放縁を有する、封止可能なポリマーから作製された１つ以上の層を含み得る。１つ以上のコネクタが、チューブを通して可撓性コンテナを少なくとも１つの要素に結合するために使用され得る。可撓性コンテナに組織が配置された後、開放縁に近接する可撓性コンテナの区分が、封止又は溶着されて、封止を形成し得る。封止は、少なくとも３ｍｍの幅を有し、開放縁と実質的に平行に位置付けられ、可撓性コンテナの開放縁から離隔され得る。いくつかの事例では、封止は、約５ｍｍよりも大きい幅を有し得る。例えば、バッグの開放縁に近接して位置付けられた少なくとも５ｍｍの封止を有するように、組織が内側に配置された後、バッグが封止され得る。封止は、開放縁に平行であり得、バッグの開放縁から離隔され得る。
可撓性コンテナは、突出部を有し、封止に近接して位置付けられ、可撓性コンテナの開口縁から封止よりも更に離隔されたクランプを使用して更に固設され得る。
いくつかの事例では、封止及び可撓性コンテナは、可撓性コンテナが、使用中に可撓性コンテナに適用される１００Ｎの力に耐え得るように構築される。そのような封止とともにクランプを使用することは、いくつかの事例で、使用される材料のタイプ及び／又は封止の構造に応じて、有利であり得る。したがって、バッグなどの可撓性コンテナの使用中、封止及びクランプの組み合わせは、可撓性コンテナに適用される１００Ｎの力に耐えることができ得る。
いくつかの事例では、封止及び可撓性コンテナは、可撓性コンテナが、使用中に可撓性コンテナに適用される７５Ｎの力に耐え得るように構築される。そのような封止とともにクランプを使用することは、いくつかの事例で、使用される材料のタイプ及び／又は封止の構造に応じて、有利であり得る。したがって、バッグなどの可撓性コンテナの使用中、封止及びクランプの組み合わせは、可撓性コンテナに適用される７５Ｎの力に耐えることができ得る。
可撓性コンテナは、組織材料の脱凝集などの処理中に組織を保持するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグなどの可撓性コンテナは、組織材料の脱凝集、脱凝集組織材料の濾過、並びに／又は非脱凝集組織及び濾液の分離に使用され得る。
バッグなどの可撓性コンテナは、弾性変形可能な材料から形成され得る。バッグなどの可撓性コンテナに使用するための材料は、限定されるものではないが、熱溶着に起因する密閉性などの密閉性、無線周波数エネルギーの使用、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性（例えば、－１５０℃又は－１９５℃）、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子、特定のガス（例えば、酸素及び／若しくは二酸化炭素）に対する高い透過速度、並びに／又は規制要件の遵守を含む、１つ以上の特性に対して選択され得る。
バッグなどの可撓性コンテナは、インジケータを含み得る。インジケータは、試料、試料が由来する患者を識別するために、及び／又は治療プロセスを通して特定の試料の進捗を追跡するために使用され得る。いくつかの事例では、インジケータは、試料の進捗を追跡するために自動又は半自動システムによってスキャンされ得る。
マークは、バックが配置されるべき場所、処置されるべき場所、封止されるべき場所、又は組織を含むバッグに対して講じられ得る任意の他の措置を識別するために、バッグなどの可撓性コンテナに使用され得る。各バッグは、封止のための複数のマークを含み得る。
バッグの開放端は、組織がバッグに挿入された後に封止され得る。任意のシールは、所定の圧力、所定の温度、及び所定の時間枠で動作する封止デバイス（例えば、ヒーターシーラー）を使用して形成され得る。
いくつかの事例では、バッグなどの可撓性コンテナは、脱凝集デバイスも含み得る脱凝集要素の一部として使用するための脱凝集コンテナとして使用され得る。いくつかの実施形態では、培地及び／又は酵素は、デバイスの脱凝集要素内のバッグに添加され得る。例えば、バッグは、可撓性コンテナ内に配置された組織材料を機械的に粉砕するデバイスとともに使用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグなどの可撓性コンテナ内の組織は、脱凝集中にせん断され得る。特に、可撓性コンテナは、組織材料をせん断するように構成され得る。
可撓性コンテナは、哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び／又は任意選択の濃縮のための半自動又は自動プロセスにおいて使用され得る。
組織からの所望の材料の抽出のためのキットは、少なくともいくつかの組織が処置されて処理された流体を形成する脱凝集要素と、所望の材料を形成するために処理された流体の少なくともいくつかを濃縮することができる濃縮要素（例えば、フィルタ）と、所望の材料の一部分を保存することができる安定化要素と、組織の供給源、プロセスに対する組織の状態、又は識別子のうちの少なくとも１つを提供することができる、脱凝集要素、濃縮要素、又は安定化要素のうちの少なくとも１つに位置付けられたインジケータタグと、を含み得る。
所望の材料は、特定のサイズの生物学的材料又は構成要素であり得る。例えば、所望の材料は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。
脱凝集要素及び安定化要素によって実施される様々なプロセスにおいて、異なるタイプの培地が使用され得る。例えば、凍結保存培地は、キットに提供され、コントロールレート凍結を行うために安定化要素で使用され得る。
脱凝集要素が第１の可撓性コンテナを含み得、安定化要素が第２の可撓性コンテナを含み得るデバイスで使用するためのキット。
哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化のための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び本明細書に説明される可撓性コンテナを含むキットを含み得る。自動デバイスは、インジケータタグリーダーを更に含み得る。例えば、インジケータタグリーダーは、任意の要素（例えば、キット中の組織材料の脱凝集、濃縮、又は安定化）に位置付けられ得る。
いくつかの事例では、自動デバイスは、キット内の可撓性コンテナ内の試料を認識する無線周波数識別タグリーダーを更に含み得る。
自動デバイスは、ＱＲコード（登録商標）などのインジケータタグを介して、バッグなどのキットの構成要素上に位置付けられたインジケータを認識することができるプログラム可能プロセッサを含み得る。どの試料がバッグの中にあるかを決定した後、プログラム可能プロセッサは、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプを定義するプログラムを実行し、それらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを提供する。
自動デバイスで使用するためのキットは、脱凝集可撓性コンテナ又はバッグを含み得る。プログラム可能プロセッサは、脱凝集要素及び脱凝集可撓性コンテナを制御して、固形組織の物理的及び／又は生物学的分解を可能にし得る。
プログラム可能プロセッサは、脱凝集可撓性コンテナに近接して位置付けられた脱凝集表面が、脱凝集可撓性コンテナ内の固形組織を機械的に粉砕及びせん断し得るように、自動デバイスの要素を制御し得、任意選択的に、脱凝集表面は、機械的ピストンである。
システムの脱凝集要素は、脱凝集可撓性コンテナ内の組織が固形組織の物理的及び酵素的分解を可能にするように、プロセッサによって制御され得る。コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される１つ以上の培地酵素溶液が、組織の酵素的分解を補助するために脱凝集可撓性コンテナに提供され得る。
システムは、脱凝集可撓性コンテナ及び安定化可撓性コンテナ並びにプログラム可能プロセッサを含むキットを含み得る。プログラム可能プロセッサは、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの１つ以上を制御するように適合され得る。
プログラム可能プロセッサは、安定化コンテナ内の濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存するために、安定化要素を制御し得る。いくつかの実施形態では、所定の温度がプログラムされ得る。
自動デバイスは、複数の組み合わせで追加の構成要素を含み得る。構成要素は、任意選択の濃縮要素への脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び／若しくは安定化要素のうちの１つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び／若しくは安定化要素のうちの１つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、要素内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮要素内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮要素内の接線流濾過プロセスを制御するための１つ以上の弁、並びに／又は各要素の入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための１つ以上のクランプを含み得る。
自動デバイスは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されるプログラム可能プロセッサを含み得る。一実施形態では、プログラム可能プロセッサは、制御された凍結ステップを実行し得る。
いくつかの事例では、自動デバイスは、ユーザインターフェースを含み得る。自動デバイスのインターフェースは、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含み得る。
本明細書に説明される自動デバイスは、輸送可能であるように適合され得る。
自動組織処理方法は、キットの構成要素と関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、処理ステップのための条件及び関連付けられた条件を自動的に決定することを含み得る。使用中に、組織試料が、少なくとも１つの開放縁を有するキットの可撓性コンテナに配置され得る。組織を可撓性コンテナ内に位置付けた後、開放端が封止され得る。使用中、組織は、インジケータと関連付けられた情報を通信し、可撓性コンテナの近くの条件及び／又は位置を制御することによって、１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって処理され得る。更に、キットへの材料の追加は、インジケータと関連付けられた情報に基づいて制御され得る。処理された組織の少なくともいくつかは、濾過された流体が生成されるように濾過され得る。濾過された流体の少なくともいくつかは、凍結保存可撓性コンテナに提供されて、濾過された流体中に存在する所望の材料を安定化し得る。
本明細書に説明される処理は、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み得る。いくつかの事例では、組織のこの処理は、組織試料から所望の材料の抽出を結果的にもたらし得る。例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、組織試料から抽出され得る。
本明細書に説明される方法で使用するためのバッグなどの可撓性コンテナは、ヒートシール可能な材料を含み得る。
凍結保存キットを使用した組織材料からの組織処理及び抽出は、所望の材料の単離を結果的にもたらし得る。特に、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの材料は、所望の材料であってもよい。
いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び／又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のための自動及び／又は半自動プロセスにおける単回使用であってもよい。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び／又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグなどの可撓性コンテナは、収集バッグを含み、凍結保存バッグは、熱可塑性、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、例えば、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド（すなわち、ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＥＶＯフィルム）などのコポリマーなどのブレンド、ＥＶＡを含む材料、及び／又は共押出された封止可能なプラスチック層を含み得る。本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）などの所定の材料及び／又はＥＶＡを含む材料から作製された組織を受容するためのバッグを含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性のために選択され得る。一実施形態では、収集バッグを含むバッグは、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドから実質的に作製され得る。例えば、収集バッグ及び／又は関連付けられたチューブなどの凍結保存キット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、ヒートシールに関連し得る。
バッグで使用するための材料は、特定の特性及び／又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの密閉性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
いくつかの実施形態では、材料は、バッグの少なくとも１つの層を形成するために、共押出材料で使用するための特定の特性のために選択され得る。層は、構築されたときに、バッグの内部層が比較的生体適合性である、すなわち、バッグの内面上の材料が安定し、バッグの内容物中に浸出しないように、構築され得る。
例えば、収集バッグ、凍結保存バッグ、及び／又は関連付けられたチューブなどのキット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、封止、例えば、ヒートシールに関連し得る。
収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び／又はチューブは、概して、閉鎖及び／又は封止された血液並びに／又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、ＰＶＣは、溶着及び／又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、収集バッグの少なくとも１つの端は、組織を受容するために開放され得る。特に、一実施形態では、例えば、生検からの組織試料は、例えば、上端などの開放端を通してバッグ内に配置され得る。いくつかの事例では、生検試料は、動物（例えば、イヌ又はネコなどの家畜）又はヒトからのがん性組織であってもよい。
組織がバッグ内に位置付けられた後、バッグが封止され、次いで、処理され得る。処理は、例えば、バッグ内の組織の攪拌、例えば、穏やかな攪拌、抽出、及び／又は酵素消化を含み得る。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの所望の材料の組織処理及び抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を識別するためのインジケータ、並びに／又は収集バッグがクランプされる、封止される、デバイスによって作用される、及び／若しくは器具の定位置に固定され得る場所を示すマークを含み得る。
いくつかの実施形態では、バッグは、封止可能な材料から形成され得る。例えば、バッグは、限定されるものではないが、脂肪族又は半芳香族ポリアミド（例えば、ナイロン）を含む合成ポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）及びそれらのブレンド、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのポリマー、並びに／又はポリマーの組み合わせを含む材料から形成され得る。バッグの部分は、熱、無線周波数エネルギー、高周波（ＨＦ）エネルギー、誘電体エネルギー、及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーで封止及び／又は溶着され得る。
収集バッグは、処理及び／又は脱凝集バッグとして使用され得る。収集バッグは、約４ｃｍ～約１２ｃｍの範囲の幅、及び約１０ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の幅を有し得る。例えば、処理で使用するための収集バッグは、約７．８ｃｍの幅及び約２０ｃｍの長さを有し得る。特に、バッグは、例えば、ＥＶＡポリマー若しくはそのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、並びに／又は１つ以上のポリアミド（ナイロン）を使用して、ヒートシール可能であり得る。
インジケータとしては、限定されるものではないが、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答（ＱＲ）コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）トラッカーなどのトラッカー、及び／又は当該技術分野で既知の任意のインジケータが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び／又は接着され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び／又は複数のバッグ上に配置され得る。収集バッグ及び／又は凍結保存キットは、数値コード及び／又はＱＲコード（登録商標）などの複数のインジケータを含み得る。
インジケータ、例えば、ＱＲコード（登録商標）、スマートタグなどのタグ、及び／又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び／又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。異なるタイプの培地が、これらのプロセスでは、例えば、酵素培地、腫瘍消化培地、及び／又はコントロールレート凍結を可能にし得る凍結保存培地に使用され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キット及び／又はその構成要素は、自動デバイスによって読み取り可能であり得るインジケータを含み得る。次に、デバイスは、そのようなデバイスに挿入されたときに、組織を処理するための特定の完全自動方法を実行し得る。本発明は、試料処理、特に自動処理において特に有用である。いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び／又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のための自動及び／又は半自動プロセスにおける単回使用であってもよい。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び／又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
更に、バッグが封止され、クランプされ、及び／又は物体に固定され得る場所を示すために、組織収集バッグなどの、バッグ上の様々な場所にマークが配置され得る。いくつかの実施形態では、バッグが、クランプされ、封止され、及び／又は器具などの物体に固定される場所を示すマークは、使用前にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、１つ以上のマークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。
位置決め部は、バッグ内の組織材料が使用中に適切に処置され得る、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するように使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。
ＱＲコード（登録商標）などのインジケータの使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。
本発明は、以下の番号付きの段落で論じられるように、治療用細胞集団を伴い、提供する。
段落１． 治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、
ａ）集団中のＴ細胞が、少なくとも２５％のエフェクターメモリー（ＥＭ）Ｔ細胞を含むか、若しくは集団中のＣＤ４ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のＥＭ ＣＤ４ Ｔ細胞を含むか、若しくは集団中のＣＤ８ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のＥＭ ＣＤ８ Ｔ細胞を含むか、又は
ｂ）集団中のＴ細胞が、少なくとも２０％のセントラルメモリー（ＣＭ）Ｔ細胞を含むか、若しくは集団中のＣＤ４ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のＣＭ ＣＤ４ Ｔ細胞を含むか、若しくは集団中のＣＤ８ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のＣＭ ＣＤ８ Ｔ細胞を含むか、又は
ｃ）集団中のＥＭ及びＣＭ Ｔ細胞の合わせた割合が、Ｔ細胞の少なくとも４０％を構成するか、若しくは集団中のＥＭ及びＣＭ ＣＤ４ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の少なくとも４０％を構成するか、若しくは集団中のＥＭ及びＣＭ ＣＤ８ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の少なくとも４０％を構成するか、又は
ｄ）ＵＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞の割合が、Ｔ細胞の１０％以下であるか、若しくは集団中のエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１０％以下であるか、若しくは集団中のエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１０％以下であるか、又は
ｅ）集団中の幹細胞メモリーＴ細胞の割合が、Ｔ細胞の１０％以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１０％以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１０％以下であるか、又は
ｆ）集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＴ細胞の合わせた割合が、Ｔ細胞の１５％以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１５％以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１５％以下である、治療用ＴＩＬ集団。
段落２ ＥＭ細胞が、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＯ＋、若しくはＣＣＲ７ｌｏ／ＣＤ６２Ｌｌｏ、若しくはＣＸ３ＣＲ１ｈｉ／ＣＤ２７ｌｏ、若しくはＣＤ１２７ｈｉ、若しくはＣＤ２７－／ＣＤ４５ＲＡ－によって特徴付けられるか、又はＣＭ細胞が、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋、若しくはＣＣＲ７ｈｉ／ＣＤ６２Ｌｈｉ、若しくはＣＸ３ＣＲ１ｌｏ／ＣＤ２７ｈｉ、若しくはＣＤ１２７ｈｉ、若しくはＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＡ－によって特徴付けられるか、又はエフェクター細胞が、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＯ－によって特徴付けられるか、又は幹細胞メモリー細胞が、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ－によって特徴付けられる、段落１に記載の治療用ＴＩＬ集団。
段落３． 治療用凍結保存非修飾（Ｕ）又は修飾（Ｍ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を単離するための方法であって、
（ａ）（ｉ）切除腫瘍を凍結保存し、凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
（ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
（ｉｉｉ）切除腫瘍を凍結保存し、腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
（ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、腫瘍断片を凍結保存して、精製された切除腫瘍産物を得ることと、
（ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団を産生することと、
（ｃ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することと、を含む、方法。
段落４．
（ａ’）対象から腫瘍を切除して、切除腫瘍を得ることを更に含む、段落３に記載の方法。
段落５． 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＣＤ４ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のエフェクターメモリー（ＥＭ）ＣＤ４ Ｔ細胞を含むか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＣＤ８ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のＥＭ ＣＤ８ Ｔ細胞を含むか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＴ細胞が、少なくとも２５％のＥＭ Ｔ細胞を含む、段落３又は４に記載の方法。
段落６． 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＣＤ４ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のセントラルメモリー（ＣＭ）ＣＤ４ Ｔ細胞を含むか、あるいは第１のＵＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＣＤ８ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のＣＭ ＣＤ８ Ｔ細胞を含むか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＴ細胞が、少なくとも２０％のＣＭ Ｔ細胞を含む、段落３又は４に記載の方法。
段落７ 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＥＭ及びＣＭ ＣＤ４ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を構成するか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＥＭ及びＣＭ ＣＤ８ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を構成するか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のＥＭ及びＣＭ Ｔ細胞の合わせた割合が、Ｔ細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を構成する、段落３又は４に記載の方法。
段落８． 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１０％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１０％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞の割合が、Ｔ細胞の１０％以下である、段落３又は４に記載の方法。
段落９． 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中の幹細胞メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１０％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ集団中の幹細胞メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１０％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中の幹細胞メモリーＴ細胞の割合が、Ｔ細胞の１０％以下である、段落３又は４に記載の方法。
段落１０． 第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ４ Ｔ細胞の１５％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の合わせた割合が、ＣＤ８ Ｔ細胞の１５％以下であるか、あるいは第１のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団又は第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーＴ細胞の合わせた割合が、Ｔ細胞の１５％以下である、段落３又は４に記載の方法。
段落１１ ＥＭ細胞が、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＯ＋、若しくはＣＣＲ７ｌｏ／ＣＤ６２Ｌｌｏ、若しくはＣＸ３ＣＲ１ｈｉ／ＣＤ２７ｌｏ、若しくはＣＤ１２７ｈｉ、若しくはＣＤ２７－／ＣＤ４５ＲＡ－によって特徴付けられるか、又はＣＭ細胞が、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋、若しくはＣＣＲ７ｈｉ／ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＣＸ３ＣＲ１ｌｏ／ＣＤ２７ｈｉ、若しくはＣＤ１２７ｈｉ、若しくはＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＡ－によって特徴付けられるか、又はエフェクター細胞が、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＯ－によって特徴付けられるか、又は幹細胞メモリー細胞が、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ－によって特徴付けられる、段落５～１０のいずれか１つに記載の方法。
段落１２． 脱凝集することが、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落３～１１のいずれか１つに記載の方法。
段落１３． 脱凝集腫瘍が、細胞化される、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
段落１４． 単一細胞懸濁液が、精製された切除腫瘍産物から得られ、ステップ（ｂ）で使用されるか、又はステップ（ａ）からの精製された切除腫瘍産物が、単一細胞懸濁液を含む、段落３～１３のいずれか１つに記載の方法。
段落１５． 第１のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団が、約１００万～２０００万個のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを含む、段落３～１４のいずれか１つに記載の方法。
段落１６． ステップ（ｂ）が、第１の集団を産生するためにＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを成長させることを含み、ステップ（ｃ）の第２の増殖ステップが、急速増殖を含む、段落１～１５のいずれか１つに記載の方法。
段落１７． ステップ（ｂ）が、約２週間実施され、ステップ（ｃ）が、約２週間実施される、段落１６に記載の方法。
段落１８． ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）で培養することが、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、又はそれらの組み合わせを添加することを含む、段落３～１７のいずれか１つに記載の方法。
段落１９．
（ｅ）第２のＵＴＩＬ又はＭＴＩＬ集団を懸濁させて、懸濁ＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを得ることを更に含む、段落３～１８のいずれか１つに記載の方法。
段落２０． 懸濁することが、緩衝生理食塩水、及び／又はヒト血清アルブミン、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む組成物中で行われる、段落１９に記載の方法。
段落２１．
（ｆ）懸濁ＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを凍結保存することを更に含む、段落１８又は１９に記載の方法。
段落２２．
第２のＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ集団の、又はそれらからの、又はそれら由来の凍結保存ＵＴＩＬ若しくはＭＴＩＬ、あるいは懸濁ＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを解凍して、解凍ＵＴＩＬ又はＭＴＩＬを得る最終ステップを更に含む、段落３～２１のいずれか１つに記載の方法。
段落２３． 解凍ＵＴＩＬ又はＭＴＩＬが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落２２に記載の方法。
段落２４． ＴＩＬが、非修飾又はＵＴＩＬである、段落３～２３のいずれか１つに記載の方法、又は段落１若しくは２に記載の治療用集団。
段落２５． ＴＩＬが、修飾又はＭＴＩＬである、段落３～２３のいずれか１つに記載の方法、又は段落１若しくは２に記載の治療用集団。
段落２６． ＴＩＬが、遺伝子操作方法によるＭＴＩＬである、請求項ｖのいずれか１つに記載の方法、又は段落１若しくは２に記載の治療用集団。
段落２７． ＴＩＬを遺伝子操作方法に供し、そこからＭＴＩＬを得ることを含むステップを含む、段落３～２３又は２６のいずれか１つに記載の方法。
段落２８． 遺伝子操作方法が、ＣＲＩＳＰＲ法、又はＴＡＬＥ若しくはＴＡＬＥＮ法、又は亜鉛フィンガー法、又はトランスフェクション法、又は形質導入法、又はトランスポゾンシステム法を含む、段落２６又は２７に記載の方法又は治療用集団。
段落２９． 段落３～２８のいずれか１つに記載の方法によって得られるか、又は得ることができる、段落１、２、又は２４～２８のいずれか１つに記載の治療用集団。
段落３０． 段落３～２８のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存ＵＴＩＬ集団。
段落３１． 段落３～２８のいずれか１つに記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存ＭＴＩＬ集団。
段落３２． 集団が、約５×１０９～約５×１０１０個のＴ細胞を含む、段落１、２、２４～２８、２９、３０、又は３１に記載の治療用集団。
段落３３． 段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、又は３２に記載の治療用集団を含む内容物を収容する凍結保存バッグ。
段落３４． バッグが、封止されている、段落３３に記載の凍結保存バッグ。
段落３５． 静脈内注入で使用するための段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグ、あるいは段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグを含むか、又は段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２に記載の治療用集団を含む内容物を収容する、静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器。
段落３６． 段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の薬学的に許容される賦形剤及び治療用集団、段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグの内容物、又は段落３５に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物を含む、医薬製剤。
段落３７． 患者又は対象におけるがんを治療するための方法であって、方法は、
（ｉ）段落３６の製剤、又は
（ｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団、又は
（ｉｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
（ｉｖ）段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
（ｖ）段落３５に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、又は
（ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のいずれか１つを含む薬剤の有効量を投与することを含み、
患者又は対象が、がんのために、及び／又は投与のために治療される必要がある、方法。
段落３８．
（ｉ）段落３６の製剤、又は
（ｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団、又は
（ｉｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
（ｉｖ）段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
（ｖ）段落３５に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物の使用であって、患者又は対象に薬剤を投与することを含み、薬剤が、
（ｉ）段落３６の製剤、又は
（ｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団、又は
（ｉｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
（ｉｖ）段落３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
（ｖ）段落３５に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物を含み、患者又は対象が、がんのために、及び／又は投与を受けるために治療される必要がある、使用。
段落３９． がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮細胞がん［ＨＮＳＣＣ］を含む）、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎がん、又は腎細胞がんである、段落３７又は３８に記載の方法又は使用。
段落４０． 患者又は対象が、ヒトである、段落３７又は３８に記載の方法又は使用。
段落４１． 患者又は対象が、非ヒト哺乳動物である、段落３７又は３８に記載の方法又は使用。
段落４２． 非ヒト哺乳動物が、霊長類、齧歯類、ラット、マウス、家畜化哺乳類、家畜化ネコ、家畜化イヌ、家畜化ウマ、モルモット、実験動物、又はコンパニオンアニマルである、段落４１に記載の方法又は使用。
段落４３． 患者又は対象が、二次性徴を有する成人又は個人である、段落３７～４２のいずれか１つに記載の方法又は使用。
段落４４． 患者又は対象が、二次性徴を有する成人でも、個人でもないか、又は子供であるか、若しくは身体的に成熟していない哺乳動物である、段落３７～４１のいずれか１つに記載の方法。
段落４５． 投与が、複数回実施されるか、又は時間経過にわたって複数回実施され、時間経過が、１週間であり、かつ投与が、１週間に２回、３回、４回、若しくは５回であるか、又は時間経過が、１か月であり、かつ投与が、１か月に２回、４回のうちの３回であるか、又は時間経過が、３か月、６か月、９か月、若しくは１２か月であり、かつ時間経過が、１か月に１回、若しくは週に１回である、及び／あるいは有効量が、先行段落のいずれかに列挙されるＴＩＬの量を含む、及び／あるいは投与が、静脈内である、段落３７～４４のいずれか１つに記載の方法又は使用。
段落４６． キットであって、
（ｉ）段落３６の製剤、又は
（ｉｉ）段落１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載の治療用集団、又は
（ｉｉｉ）請求項１、２、２４～２８、２９、３０、３１、若しくは３２のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
（ｉｖ）請求項３３若しくは３４に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
（ｖ）請求項３５に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物と、
賦形剤（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）を含有及び／又は混合するためのコンテナと、任意選択的に、混合及び／又は投与のための説明書と、を含む、キット。
したがって、本出願人が権利を留保し、これにより、あらゆる既知の製品、その製品を作製するプロセス、又はその製品を使用する方法の放棄を開示するように、いずれの既知の製品、プロセス、又は方法も本発明に包含しないことが本発明の目的である。本出願人が権利を留保し、これにより、あらゆる前述の製品、その製品を作製するプロセス、又はその製品を使用する方法の放棄を開示するように、本発明が、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の記載要件及び実施可能要件を満たさないいずれの製品、製品を作製するプロセス、又は製品を使用する方法も本発明の範囲内に包含することを意図しないことに更に留意されたい。本発明の実施に際して、ＥＰＣ第５３（ｃ）条並びにＥＰＣ第２８（ｂ）規則及び第２８（ｃ）規則に準拠することが有利であり得る。本出願の系統若しくは任意の他の系統における又は任意の第３者のあらゆる以前に申請された出願における出願人のあらゆる付与された特許の主題であるいずれの実施形態も明白に放棄する全ての権利が明白に留保される。本明細書のいかなる内容も保証と解釈されてはならない。
本開示において、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法におけるそれに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が、米国特許法におけるそれに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、明白に列挙されていない要素を考慮するが、先行技術で見つけられる要素又は本発明の基本的な特徴又は新規の特徴に影響を及ぼす要素を排除することに留意されたい。
これら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態に開示されているか、又はそれから明白であり、それらによって包含される。
特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含有する。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報の写しは、要求時、かつ必要な料金の支払い時に、特許庁によって提供されることになる。
以下の発明を実施するための形態は、一例として提示されており、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定するようには意図されておらず、添付図面と併せて最も良く理解され得る。
固形組織材料の脱凝集及び消化のための可撓性コンテナの概略図である。 消化された固形組織材料を、後続のモジュール又は廃棄物コンテナに向ける、一連のフィルタモジュールの概略図である。 廃棄物の消化及び除去後の細胞の濃縮のための可撓性コンテナの概略図である。 廃棄物の消化及び除去後の細胞の濃縮のための可撓性コンテナの別の実施形態の概略図である。 固形組織材料の脱凝集及び／又は細胞の濃縮後の細胞の安定化のための可撓性コンテナの概略図である。 固形組織材料の脱凝集及び／又は細胞の濃縮後の凍結保存を通じて細胞の安定化のための追加の可撓性コンテナへの接続を含有する可撓性コンテナの別の実施形態の概略図である。 無菌キットの概略図である。 数秒から数時間に及ぶ様々な脱凝集時間について、脱凝集プロセスから得られた細胞集団における観察された倍率変化を示す棒グラフである。 脱凝集及び安定化に使用されるプロセスのモジュールの一部である、異なる出発溶液用の複数の可撓性コンテナを使用する、半自動無菌組織処理方法を説明する図である。 プロセスで使用される培地を含む可撓性コンテナが、無菌処理キットのモジュールと方法との間でどのように共有され得るかを説明する図である。 ＴＩＬの生成のための方法の一般的な概要を図示する。 腫瘍出発材料の収集及び処理の概要を図示する。 腫瘍出発材料の収集及び処理の概要を図示する。 ＴＩＬ製造プロセスの概要を図示する。 組織材料を処理及び保存するためのキットの実施形態の図を示す。 組織材料を処理及び保存するためのキットの実施形態の図を示す。 組織材料を処理及び保存するためのキットの実施形態の図を示す。 組織材料を処理及び保存するためのキットの実施形態の図を示す。 収集バッグの実施形態の斜視図を示す。 収集バッグの実施形態の斜視図を示す。 収集バッグの実施形態の斜視図を示す。 収集バッグの実施形態の斜視図を示す。 収集バッグの実施形態の斜視図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の背面図を示す。 収集バッグの実施形態の側面図を示す。 収集バッグの実施形態の上面図を示す。 収集バッグの実施形態の底面図を示す。 バッグが封止された縁を有する、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための部分的に開放された組織収集バッグの実施形態の上面図を示す。 バッグが封止された縁を有する、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための開放された組織収集バッグの実施形態の底面図を示す。 本発明の処理のための、内部に組織を封止するための部分的に開放された組織収集バッグの実施形態の上面図を示す。 本発明の処理のための、内部に組織を封止するための完全に開放された組織収集バッグの実施形態の上面図を示す。 バックが所定の幅を有する封止された縁を有する、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための部分的に開放された組織収集バッグの実施形態の上面図を示す。 バックが所定の幅を有する封止された縁を有する、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための完全に開放された組織収集バッグの実施形態の上面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 チューブ及びポートに結合された収集バッグの実施形態の正面図を示す。 使用前の収集バッグの実施形態の正面図を示す。 例えば、バッグ内の材料の堆積後に封止された収集バッグの実施形態の正面図を示す。 開放された収集バッグ及び凍結保存バッグを含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。 閉鎖されるべき場所を示す収集バッグ及び凍結保存バッグを含む、下向きの凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。 閉鎖された収集バッグ及び凍結保存バッグを含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。 閉鎖された収集バッグ及び凍結保存バッグを含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の側面図を示す。 凍結保存キットの実施形態の端面図を示す。 チューブに結合された印を含む収集バッグの実施形態の上面図を示す。 収集バッグ、フィルタ、及び凍結保存バッグを含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。 収集バッグ、フィルタ、及び凍結保存バッグを含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。 収集バッグ、フィルタ、及び凍結保存バッグを含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。 クランプ、ヒンジ、及びラッチ、並びに使用中に収集バッグの表面に近接して位置付けられるバーを使用して固設された収集バッグの実施形態の側面図を示す。 収集バッグ上に位置付けられたクランプの分解図を示す。 収集バッグ、フィルタ、及び凍結保存バッグを含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。 収集バッグ、フィルタ、及び凍結保存バッグを含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。 クランプによって固設された収集バッグの実施形態の正面図を示す。 収集バッグの実施形態の正面図を示す。 閉鎖された試料コンテナ内の個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイスの正面図を示す。 ２つの異なるそれぞれの動作位置における図４１のデバイスを示す。 ２つの異なるそれぞれの動作位置における図４１のデバイスを示す。 上記の図に示されるデバイスの平面図を示す。 デバイスの代替的な構築の別の平面図を示す。 図４１～図４５のデバイスによる使用に好適な試料コンテナの３つの異なる構築を示す。 図４１～図４５のデバイスによる使用に好適な試料コンテナの３つの異なる構築を示す。 図４１～図４５のデバイスによる使用に好適な試料コンテナの３つの異なる構築を示す。 使用のために調製されている試料バッグを示す。 試料バッグを封止する代替的な方式を示す。 試料バッグを封止する代替的な方式を示す。 試料バッグを封止する代替的な方式を示す。 試料バッグを封止する代替的な方式を示す。 使用するためのバッグを調製するための装置及び技術を示す。 使用するためのバッグを調製するための装置及び技術を示す。 使用するためのバッグを調製するための装置及び技術を示す。 トレッディングデバイス内への試料バッグ又はコンテナの装填を示す。 脱凝集試料を分割するための装置を示す。 脱凝集試料を分割するための装置を示す。 脱凝集試料を分割するための装置を示す。 試料又は分割試料の温度を制御するための装置を示す。 試料又は分割試料の温度を制御するための装置を示す。 試料又は分割試料の温度を制御するための装置を示す。 トレッディングデバイスの更なる実施形態を示す。 トレッディングデバイスの更なる実施形態を示す。 トレッディングデバイスの更なる実施形態を示す。 腫瘍組織の収集、処理、及び凍結保存のための例示的なフロー図である。 処理及び凍結保存された腫瘍組織からのＴＩＬ製造のための例示的なフロー図である。 凍結保存脱凝集細胞懸濁液と新鮮な脱凝集細胞懸濁液との収率（図６７Ａ）、生存率（図６７Ｂ）、及びＣＤ３＋ Ｔ細胞率（図６７Ｃ）を比較する。 凍結保存脱凝集細胞懸濁液と新鮮な脱凝集細胞懸濁液との収率（図６７Ａ）、生存率（図６７Ｂ）、及びＣＤ３＋ Ｔ細胞率（図６７Ｃ）を比較する。 凍結保存脱凝集細胞懸濁液と新鮮な脱凝集細胞懸濁液との収率（図６７Ａ）、生存率（図６７Ｂ）、及びＣＤ３＋ Ｔ細胞率（図６７Ｃ）を比較する。 凍結保存されたＰＢＭＣの生存率を、市販の凍結保存物と比較する。 ４℃で１０分間材料を保持し、次いで、－１℃／分の速度で温度を低下させるか、又は－２℃／分の速度で３５℃から－８０℃まで直接低下させるプロトコルに従って、消化され、次いで、凍結保存されたＰＢＭＣの生存率を比較する。 ４℃で１０分間材料を保持し、次いで、－１℃／分の速度で温度を低下させるか、又は－２℃／分の速度で３５℃から－８０℃に直接低下させるプロトコルに従って、試料バッグから記録された温度を比較する。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７７の脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 ＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒの脱凝集及び凍結保存を図示する（１／２バッグ）。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集）、（Ｅ）温度設定点（凍結保存）、（Ｆ）温度記録（凍結保存）、（Ｇ）設定点冷却速度、（Ｈ）クライオプレート冷却速度記録。 連続プロセスにおけるＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒ脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集及び凍結保存）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集及び凍結保存）、（Ｅ）冷却速度設定点（脱凝集及び（凍結保存）、（Ｆ）クライオプレート冷却速度記録（脱凝集及び（凍結保存）。 連続プロセスにおけるＴＩＬ０７８のＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒ脱凝集及び凍結保存を図示する。（Ａ）脱凝集装置の速度設定点、（Ｂ）脱凝集装置の速度記録、（Ｃ）温度設定点（脱凝集及び凍結保存）、（Ｄ）クライオプレート温度記録（脱凝集及び凍結保存）、（Ｅ）冷却速度設定点（脱凝集及び（凍結保存）、（Ｆ）クライオプレート冷却速度記録（脱凝集及び（凍結保存）。 最良総合効果及び腫瘍量における変化率を示す、ウォーターフォールプロットを図示する。ＣＲ、完全奏効、ＰＤ、進行、ＰＲ、部分奏効、ＳＤ、安定。腫瘍量は、標的病変の直径の総和として定義される。腫瘍量の変化は、ベースラインからベースライン後の最低値までの変化として定義される。最小のベースライン後のＳＬＤは、ＣＲが評価された来院時に標的病変の測定値が報告されなかった（ＣＴ／ＭＲＩスキャンで疾患又は転移が観察されなかった）両方のＣＲ患者で、０を使用した。ＰＤの最良総合効果を有する１名の対象は、任意の治療後の標的病変の測定値が報告されず（新たな病変の観察によって決定される進行）、したがって、プロットには示されなかった。 全生存期間を図示する。（Ａ）全２１人の治療を受けた患者の全生存（ＯＳ）期間の中央値は、２１．３か月であった。（Ｂ）定量的奏効データを有する１５人の患者のＯＳ時間の中央値は、１６か月であった。（Ｃ）非奏効者（Ｎ＝７）のＯＳ時間の中央値は、６．５か月であった。奏効者のＯＳ時間の中央値（定量的奏効毎のみ、Ｎ＝８）には、到達しなかった。 全生存期間を図示する。（Ａ）全２１人の治療を受けた患者の全生存（ＯＳ）期間の中央値は、２１．３か月であった。（Ｂ）定量的奏効データを有する１５人の患者のＯＳ時間の中央値は、１６か月であった。（Ｃ）非奏効者（Ｎ＝７）のＯＳ時間の中央値は、６．５か月であった。奏効者のＯＳ時間の中央値（定量的奏効毎のみ、Ｎ＝８）には、到達しなかった。 全生存期間を図示する。（Ａ）全２１人の治療を受けた患者の全生存（ＯＳ）期間の中央値は、２１．３か月であった。（Ｂ）定量的奏効データを有する１５人の患者のＯＳ時間の中央値は、１６か月であった。（Ｃ）非奏効者（Ｎ＝７）のＯＳ時間の中央値は、６．５か月であった。奏効者のＯＳ時間の中央値（定量的奏効毎のみ、Ｎ＝８）には、到達しなかった。 製造されたＴＩＬの特徴を図示する。（Ａ）フルスケールのＩＴＩＬ－１６８ ＧＭＰランのＴＩＬ外殖段階（段階１）中の細胞数。（Ｂ）フルスケールのＩＴＩＬ－１６８ ＧＭＰランのＴＩＬ ＲＥＰ段階（段階２）中の細胞数。（Ｃ）フルスケールのＩＴＩＬ－１６８ ＧＭＰラン中の生存率（生存ＣＤ３＋細胞％）。 本発明のＴＩＬで治療された対象の臨床応答を図示する。ＴＩＬは、外殖及び増殖の前に、脱凝集腫瘍の凍結保存（左）又は非凍結保存（右）を用いて調製された。脱凝集腫瘍の凍結保存を含む特定の調製物もまた、急速増殖後に凍結保存された（青色の点）。ＣＲ：完全奏効、ＰＲ：部分奏効、ＳＤ：安定、ＰＤ：進行。 ＣＤ３リガンドを発現するＫ５６２細胞によるＴＩＬの活性化を図示する。ＴＩＬ０６５及びＢｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１の調製について、ベースライン活性（ＴＩＬ）、非トランスフェクトＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＮＴ）による活性化、及びＣＤ３リガンドＯＫＴ３を発現するトランスフェクトＫ５６２細胞による活性化が示されている。 ＴＩＬ０６５（図７９Ａ）及びＢｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１（図７９Ｂ）のＴＩＬ部分集団を図示する。ＣＤ４５－ＣＤ６２＋：ナイーブ細胞、ＣＤ４５－ＣＤ６２－：エフェクター（ＥＦＦ）、ＣＤ４５＋ＣＤ６２＋：セントラルメモリー（ＣＭ）、ＣＤ４５＋ＣＤ６２＋：エフェクターメモリー（ＥＭ）。 ＴＩＬ０６５（図７９Ａ）及びＢｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１（図７９Ｂ）のＴＩＬ部分集団を図示する。ＣＤ４５－ＣＤ６２＋：ナイーブ細胞、ＣＤ４５－ＣＤ６２－：エフェクター（ＥＦＦ）、ＣＤ４５＋ＣＤ６２＋：セントラルメモリー（ＣＭ）、ＣＤ４５＋ＣＤ６２＋：エフェクターメモリー（ＥＭ）。 ＣＤ４－ＣＤ８－、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋ＣＤ８＋亜集団を図示し、ＴＩＬの大部分が単一陽性ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞であることを示す。 非凍結保存（新鮮）又は凍結保存（凍結）腫瘍消化物から増殖したＴＩＬ調製物におけるＣＤ４又はＣＤ８細胞の割合を図示する。 各パネルの上から下に、非凍結保存（新鮮）及び凍結保存（凍結）ＴＩＬ調製における、エフェクター（ＥＦＦ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、及び幹細胞メモリー（ＳＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）部分集団を図示する。全ＴＩＬ（図７８Ａ）、ＣＤ４＋ＴＩＬ（図７８Ｂ）、ＣＤ８＋ＴＩＬ（図７８Ｃ）。 各パネルの上から下に、非凍結保存（新鮮）及び凍結保存（凍結）ＴＩＬ調製における、エフェクター（ＥＦＦ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、及び幹細胞メモリー（ＳＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）部分集団を図示する。全ＴＩＬ（図７８Ａ）、ＣＤ４＋ＴＩＬ（図７８Ｂ）、ＣＤ８＋ＴＩＬ（図７８Ｃ）。 各パネルの上から下に、非凍結保存（新鮮）及び凍結保存（凍結）ＴＩＬ調製における、エフェクター（ＥＦＦ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、及び幹細胞メモリー（ＳＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）部分集団を図示する。全ＴＩＬ（図７８Ａ）、ＣＤ４＋ＴＩＬ（図７８Ｂ）、ＣＤ８＋ＴＩＬ（図７８Ｃ）。 腫瘍バンキングを図示する。 リンパ球枯渇治療スキームの脱強化を図示する。 アジュバントＰＤ－１スキームに対して難治性の黒色腫対象を図示する。 皮膚黒色腫の設計及びスキームを図示する。 皮膚黒色腫スキームを図示する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
「抗ＣＤ３抗体」という用語は、抗体又はそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、成熟ヒトＴ細胞のＴ細胞抗原受容体のＣＤ３受容体に対して配向されるヒト、ヒト化、キメラ、マウス、又は哺乳動物抗体を含む。抗ＣＤ３抗体は、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３を含む。抗ＣＤ３抗体はまた、Ｔ３及びＣＤ３イプシロンとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含む。他の抗ＣＤ３抗体は、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブを含む。
「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び状態の個体差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に説明される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は、１０４～１０１１個の細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１、又は１０９～１０１０個の細胞／ｋｇ体重）の用量で投与され得、それらの範囲内の全ての整数値を含む。腫瘍浸潤リンパ球（いくつかの場合、遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球を含む）組成物もまた、これらの用量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（いくつかの場合、遺伝子的なものを含む）免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者の最適な用量及び治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
本明細書で使用される際、「併用」、「併用する」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与する」、「同時に」、及び「同時」という用語は、対象への２つ以上の活性医薬品成分（本発明の好ましい実施形態では、例えば、複数のＴＩＬとの組み合わせにおける少なくとも１つのカリウムチャネルアゴニスト）の投与を包含し、そのため、両方の活性医薬品成分及び／又はそれらの代謝物が対象内に同時に存在する。併用は、別個の組成物における同時投与、別個の組成物の異なる時点における投与、又は２つ以上の活性医薬品成分が存在する組成物における投与を含む。別個の組成物における同時投与、及び両方の薬剤が存在する組成物における投与が好ましい。
本明細書で使用される場合、「細胞化される又は細胞化」は、固形組織によって、複数の細胞系統／タイプから一般的に作製される多細胞材料が、１つの細胞に限定されないが、非常に少数の様々な系統又は細胞タイプの複数の細胞、すなわち、細胞塊又は細胞凝集体を含む、少数の細胞に分解される、脱凝集のプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖された系を指す。細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系が、本発明の方法とともに用いられ得る。閉鎖系としては、例えば、限定されるものではないが、閉鎖されたＧ－Ｒｅｘコンテナ又は細胞培養バッグが挙げられる。腫瘍セグメントが閉鎖系に追加されると、システムは、ＴＩＬが患者に投与される準備ができるまで外部環境に開放されない。有利な実施形態では、閉鎖系は、ＰＣＴ公開第２０１８／１３０８４５号に開示されているシステムである。
本明細書で使用される場合、「凍結保存培地」は、細胞の凍結保存に使用され得る任意の培地を指す。そのような培地は、２％～１０％のＤＭＳＯを含む培地を含み得る。例示的な培地としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ、Ｂｌｏｏｄｓｔｏｒ ＢＳ－５５、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書の「凍結保存ＴＩＬ」という用語は、一次、バルク、又は増殖（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかであるＴＩＬが、約－１９０℃～－６０℃の範囲で処置され、保存されることを意味する。凍結保存の一般的な方法はまた、実施例を含む、本明細書の他の箇所にも説明されている。明確にするために、「凍結保存ＴＩＬ」は、一次ＴＩＬの供給源として使用され得る凍結組織試料と区別可能である。
本明細書で使用される場合、「枯渇」は、固相に結合された１つのマーカー結合断片によって標識される望ましくない細胞から所望の細胞を分離する陰性選択のプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「脱凝集又は脱凝集する」は、単一細胞又は小細胞数の凝集体への固形組織の変換を指し、スフェロイドとしての単一細胞は、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ以上の範囲の直径を有し、これは、大抵７～２０μｍである。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患治療を含むがこれに限定されない、意図される用途に効果をもたらすのに十分である、本明細書に説明される化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）、又は治療される対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢、及び性別）、疾患状態の重症度、若しくは投与の様式に応じて変化し得る。用語はまた、標的細胞に特定の応答を誘導することになる用量（例えば、血小板の接着及び／又は細胞遊走の低減）にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、投与される組織、及び化合物が輸送される物理的送達システムに応じて変化することになる。
本明細書で使用される場合、「操作される」は、組織由来細胞機能をその本来の機能から変化させて、その最終的な有用性に対して新しい又は改善された機能を有するように変化させる、核酸材料又は因子のいずれかの追加を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素培地」は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物などの酵素活性を有する培地を指す。
本明細書で使用される場合、「濾液」は、フィルタ、メッシュ、又は膜を通過する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「可撓性コンテナ」は、１つ以上の異なるタイプのフィルムを有する複数のフォーマットの可撓性梱包システムを指す。各フィルムタイプは、プロセスのステップに応じて、滅菌流体、固形組織由来細胞材料、及びコンテナの完全性の物理的、化学的、及び機能的特徴を保持するための特定の特性を提供するように選択される。
当分野で抗凍結剤とも呼ばれる「凍結溶液」又は「凍結保存溶液」は、抗凍結添加剤を含有する溶液である。これらは、一般的に、凍結損傷（すなわち、氷の形成に起因する）を最小化するために、凍結中に細胞が曝露される物理的ストレスを修飾する、透過性かつ非毒性の化合物であり、最も一般的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、グリセロール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロピレングリコール、スクロース、及びトレハロースのうちの１つ以上の体積％である。
「血液悪性腫瘍」という用語は、限定されるものではないが、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含む、造血及びリンパ組織の哺乳動物がん及び腫瘍を指す。血液悪性腫瘍はまた、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響する血液悪性腫瘍を指す。
「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、ＩＬ－２の全ての形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に説明されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は、表２（配列番号３）に与えられる。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）などのＩＬ－２のヒトの組換え形態、並びにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）又はＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって商業的に供給される組換えＩＬ－２の形態、及び他のベンダーからの他の商業的均等物を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有するＩＬ－２の非グリコシル化ヒト組換え形態である。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、本明細書に説明されるＩＬ－２のペグ化形態も包含する。本発明における使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際特許出願公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号に説明される。本発明における使用に好適なコンジュゲートＩＬ－２の代替的な形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号、及び同第４９０２，５０２号に説明されている。本発明における使用に好適なＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に説明されている。
「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、Ｔｈ２ Ｔ細胞によって、並びに好酸球、好塩基球、及びマスト細胞によって産生されるインターロイキン４として知られるサイトカインを指す。ＩＬ－４は、Ｔｈ２ Ｔ細胞へのナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）の分化を制御する。Ｓｔｅｉｎｋｅ ａｎｄ Ｂｏｒｉｓｈ，Ｒｅｓｐｉｒ． Ｒｅｓ．２００１，２，６６－７０。ＩＬ－４による活性化時、Ｔｈ２ Ｔ細胞は、その後、ポジティブフィードバックループで追加のＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞の増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に好適な組換えヒトＩＬ－４は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－２１１）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む、複数の供給業者から市販されている。
「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）という用語は、間質細胞及び上皮細胞から、並びに樹状細胞から得られ得る、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指す。Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００２，９９，３８９２－９０４。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生を刺激し得る。ＩＬ－７は、胸腺内のＴ細胞の発生及び末梢内の生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ－７受容体アルファ及び共通ガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合する。本発明における使用に好適な組換えヒトＩＬ－７は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－２５４）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む、複数の供給業者から市販されている。
「ＩＬ－１２」（本明細書では「ＩＬ１２」とも称される）という用語は、インターロイキン－１２として知られるＴ細胞成長因子を指す。インターロイキン（ＩＬ）－１２は、２つのジスルフィド結合グリコシル化タンパク質サブユニットからなる分泌ヘテロ二量体サイトカインであり、それらのおよその分子量に対してｐ３５及びｐ４０と指定される。ＩＬ－１２は、主に抗原提示細胞によって産生され、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に発現される２鎖受容体複合体に結合することによって、細胞媒介性免疫を駆動する。ＩＬ－１２受容体ベータ－１（ＩＬ－１２Ｒｐｉ）鎖は、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２とその受容体との間の一次相互作用を提供する。しかしながら、細胞内シグナル伝達を付与するのは、第２の受容体鎖であるＩＬ－１２ＲＰ２のＩＬ－１２ｐ３５ライゲーションである。抗原提示と同時にＩＬ－１２シグナル伝達は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｙ）産生によって特徴付けられるＴヘルパー１（Ｔｈ１）表現型に向かってＴ細胞分化を引き起こすと考えられる。Ｔｈｌ細胞は、いくつかの細胞内病原体に対する免疫を促進し、補体固定抗体アイソタイプを生成し、腫瘍免疫監視に寄与すると考えられる。したがって、ＩＬ－１２は、防御免疫機構を宿主とする有意な構成要素であると考えられる。ＩＬ－１２は、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９も含むＩＬ－１２サイトカインファミリーの一部である。
「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、ＩＬ－１５の全ての形態を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００１，９７，１４－３２に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と、β及びγのシグナル伝達受容体サブユニットを共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、１２．８ｋＤａの分子量を有する１１４アミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４－８１５９－８２）を含む、複数の供給業者から市販されている。
「ＩＬ－１８」（本明細書では「ＩＬ１８」とも称される）という用語は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指す。インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）は、その構造、受容体ファミリー及びシグナル伝達経路に起因して、ＩＬ－１サイトカインファミリーに属する炎症促進性サイトカインである。関連サイトカインとしては、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８が挙げられる。
「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン－２１として知られる多面発現サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、ＩＬ－２１の全ての形態を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Ｓｐｏｌｓｋｉ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ． Ｄｉｓｃ．２０１４，１３，３７９－９５に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、ナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、１５．４ｋＤａの分子量を有する１３２アミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、Ｃａｔ．Ｎｏ．１４－８２１９－８０）を含む、複数の供給業者から市販されている。
「液体腫瘍」という用語は、本質的に流体である細胞の異常な質量を指す。液体腫瘍がんとしては、限定されるものではないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられる。液体腫瘍から得られたＴＩＬはまた、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「磁気粒子」における「磁気」は、磁性粒子の全てのサブタイプを指し、これは、当業者に周知の方法、特に強磁性粒子、超常磁性粒子、及び常磁性粒子で調製され得る。「強磁性」材料は、磁界に強く感受性であり、磁界が除去されたときに磁気特性を保持することができる。「常磁性」材料は、弱い磁気感受性のみを有し、磁界が除去されたとき、それらの弱い磁気力は迅速に失われる。「超常磁性」材料は、磁気的に感受性が高い、すなわち、それらは、磁界に配置されたときに強磁性となるが、常磁性材料のように、その磁気力は急速に失われる。
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、特定の細胞型によって特異的に発現される細胞抗原を指す。好ましくは、マーカーは、細胞表面マーカーであり、その結果、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施され得る。
本明細書で使用される場合、「マーカー結合断片」は、細胞の所望の標的分子、すなわち、抗原に優先的に結合する任意の部分を指す。部分という用語は、例えば、抗体又は抗体断片を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、当業者に周知の方法によって生成され得るポリクローナル又はモノクローナル抗体を指す。抗体は、任意の種、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトの抗体であってもよい。治療目的のために、非ヒト抗原結合断片が使用される場合、これらは、当該技術分野で公知の任意の方法でヒト化され得る。抗体はまた、修飾抗体（例えば、オリゴマー、還元、酸化、及び標識抗体）であってもよい。「抗体」という用語は、無傷の分子と、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体などの抗体断片との両方を含む。加えて、「マーカー結合断片」という用語は、細胞の所望の標的分子に優先的に結合する抗体又は抗体断片以外の任意の部分を含む。好適な部分は、限定なしで、所望の標的分子に結合するアプタマーとして知られるオリゴヌクレオチド（Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｎｔｅｌ，２０００：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：８２０－８２５）、炭水化物、レクチン、又は任意の他の抗原結合タンパク質（例えば、受容体－リガンド相互作用）を含む。
「培地」は、細胞培養、細胞死を低減するために使用される細胞の取り扱い及び安定化の当該技術分野で公知の様々な溶液を意味し、限定されるものではないが、以下の１つ以上の培地、臓器保存液、選択的溶解溶液、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ（商標）溶液、結晶性溶液及びＩＶ液、コロイド溶液及びＩＶ液、５％デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）、ハルトマン溶液が挙げられる。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養（例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト）又は幹細胞（例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはＴ細胞増殖）用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、抗生物質、接着因子、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、代謝阻害剤又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
本明細書で使用される場合、「微小環境」という用語は、全体として、又は微小環境内の細胞の個々の部分集団として、固形又は血液腫瘍微小環境を指し得る。腫瘍微小環境は、本明細書で使用される場合、Ｓｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，７２，２４７３に説明されるように、「細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び腫瘍の形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を育成し、優性転移が成長するための適所を提供する機械的合図」の複雑な混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスは稀である。
本明細書で使用される場合、「陰性分離」という用語は、固相に結合された１つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団ではない。
本明細書で使用される場合、「非標識」又は「非接触」は、固相に結合された１つのマーカー結合断片によって結合されない細胞を指す。非標識、非接触細胞画分は、所望の標的細胞を含有する。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」は、望ましくない細胞型を除去するために使用される固相に結合される１つのマーカー結合断片に特異的に結合される細胞を指す。
「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して向けられたヒト、ヒト化、キメラ、又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオ後続品又はそのバリアントを指し、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ ｐｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）及びムロモナブ若しくはバリアント、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、又はそのバイオ後続品などの市販形態を含む。
本明細書で使用される場合、「粒子」は、コロイド粒子、微粒子、ナノ粒子、又はビーズなどの固相を指す。そのような粒子の生成のための方法は、当該技術分野で周知である。粒子は、磁気粒子であってもよく、又は他の選択的特性を有してもよい。粒子は、溶液若しくは懸濁液中であってもよく、又は本発明における使用前に凍結乾燥状態であってもよい。次いで、凍結乾燥粒子は、本発明に関して処理される試料に接触する前に、簡便な緩衝液中で再構成される。
「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む丸い核を有する末梢血細胞を指す。末梢血単核細胞は、照射された同種末梢血単核細胞であることが好ましい。ＰＢＭＣは、抗原提示細胞の一種である。
「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むことが意図される。活性医薬品成分に対するそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来的な薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬品成分と互換性がない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬品成分もまた、説明される組成物及び方法に組み込まれ得る。
本明細書における「細胞集団」（ＴＩＬを含む）という用語は、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、概して、１×１０６～１×１０１２の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。
本明細書で使用される場合、「陽性分離」という用語は、固相に結合された１つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団である。
本明細書で使用される場合、「陰性分離」は、固相に結合された１つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団ではない。
本明細書で使用される場合、「純度」は、標的集団又は本来の固形組織からの所望の集団の割合を指す。
「急速増殖」は、１週間にわたって少なくとも約３倍（又は４、５、６、７、８、若しくは９倍）、より好ましくは、１週間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０、３０、４０、５０、６０、７０、８００、若しくは９０倍）、より好ましくは、１週間にわたって少なくとも約１００倍（又は２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００倍）、あるいは最も好ましくは１週間にわたって少なくとも約１０００倍又は２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、若しくは９０００倍）の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。いくつかの急速増殖プロトコルが以下に概説される。
「再生医療」、「養子細胞療法」、又は「先進療法医薬品」は、本明細書に互換的に使用され、適用後の哺乳動物の健康を改善することを目的とした、細胞材料の一部又は全部の作用、又は細胞材料の一部又は全部の支持作用のいずれかによって、１つ以上の哺乳動物の治療目的に使用される細胞材料を指す。治療用細胞は、直接的に使用され得るか、又はこれらの作用を提供するために更なる処理、増殖、及び／若しくは操作を必要とし得る。
本明細書で使用される場合、「試料」は、任意の比率で細胞を含有する試料を指す。好ましくは、これらの細胞は生存可能である。いくつかの事例では、これらの細胞はまた、その後の核酸又はタンパク質抽出に使用され得る固定又は凍結細胞であり得る。試料は、動物、特にマウス、ラット、又はヒトなどの哺乳動物からのものであってもよい。細胞を含有する任意の圧縮性固形組織が使用され得る。本発明は、主に、固形腫瘍組織からの造血及びがん細胞の単離を通して例示される。しかしながら、本発明は、任意の哺乳動物固形組織から幅広い細胞を単離するための方法に関する。
本明細書で使用される場合、「固相」は、別の基材、例えば、粒子、発蛍光団、ビオチンのようなハプテン、ポリマー、又は培養皿及びマイクロタイタープレートなどのより大きな表面に結合された、マーカー結合断片、例えば、抗体の結合を指す。いくつかの事例では、結合は、例えば、抗原結合断片が培養皿のより大きい表面に結合される場合、抗原結合断片の直接的な固定化を結果的にもたらす。他の場合、この結合は、間接的な固定化を結果的にもたらし、例えば、磁気ビーズに直接的又は間接的に（例えば、ビオチンを介して）結合された抗原結合断片は、該ビーズが磁界に保持される場合、固定化される。更なる場合、抗原結合断片の他の分子への結合は、直接的又は間接的な固定化をもたらさないが、例えば、マーカー結合断片が、化学的又は物理的部分に結合され、次いで、例えば、ＦＡＣＳ選別のようなフローサイトメトリー法、又は蛍光顕微鏡法を介して、標識細胞及び非標識細胞の識別を可能にする場合、本発明による細胞の濃縮、分離、単離、及び検出を可能にする。
本明細書で使用される場合、「固形組織」は、その三次元、すなわち、幾何学的本体としての長さ、幅、及び厚さが、複数の個々の細胞ベースの単位のサイズより大きく、多くの場合、組織の構造を構成するコラーゲン又は類似の基質などの結合材料を含有し、それによって、該固形組織が、チューブを通って流れることができないか、あるいはシリンジ又は類似の小さい導管若しくはレセプタクルによって収集されることができない、すなわち、５００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍの範囲の寸法を有する、動物由来哺乳動物固形組織片を指す。
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない、異常な組織の塊を指す。固形腫瘍は、良性である可能性も悪性である可能性もある。「固形腫瘍がん」という用語は、悪性、新生物、又はがん性固形腫瘍を指す。固形腫瘍がんとしては、限定されるものではないが、肺、乳房、前立腺、結腸、直腸、及び膀胱のがんなどの、肉腫、がん、及びリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（がん細胞）及びがん細胞が分散され、支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む、相互依存性の組織区画を含む。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞がん［ＨＮＳＣＣ］を含む）、神経膠芽腫、卵巣がん、肉腫、膵がん、膀胱がん、乳がん、三重陰性乳がん、及び非小細胞肺がんから選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（がん細胞）及びがん細胞が分散され、支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む、相互依存性の組織区画を含む。
本明細書における「解凍された凍結保存ＴＩＬ」とは、以前に凍結保存され、次いで、限定されるものではないが、細胞培養温度又はＴＩＬが患者に投与され得る温度を含む室温以上に戻るように処置されたＴＩＬの集団を意味する。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、並びに／又は疾患に起因する疾患及び／若しくは有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の観点で治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患の任意の治療をカバーし、（ａ）疾患に罹患しやすいが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象において疾患が発生することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症又は進行を停止すること、並びに（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと、及び／又は１つ以上の症状を緩和することを含む。「治療」はまた、疾患又は病態の非存在下であっても、薬理学的効果を提供するために、薬剤の送達を包含することを意味する。例えば、「治療」は、疾患状態の非存在下で免疫応答を誘発するか、又は免疫を付与することができる組成物の送達、例えば、ワクチンの場合を包含する。
本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れ、腫瘍へと移行した白血球として元々得られた細胞集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定されるものではないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈｉ及びＴｈｉ ７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、並びにＭｌマクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、一次及び二次ＴＩＬの両方を含む。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説される患者組織試料から得られるもの（「新鮮に採取された」と称される場合もある）であり、「二次ＴＩＬ」は、限定されるものではないが、バルクＴＩＬ及び増殖ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ＲＥＰ後 ＴＩＬ」）を含む、本明細書に論じられるように増殖又は急速に増殖した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤して治療に影響するその能力によって機能的にのいずれかで定義され得る。ＴＩＬは、概して、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上を発現することによって分類され得る。ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義され得る。ＴＩＬは、効力によって更に特徴付けられ得、例えば、ＴＩＬは、それらが産生するＴＣＲの関与に応答して、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）放出が、約５０ｐｇ／ｍｌ超、約１００ｐｇ／ｍｌ超、約１５０ｐｇ／ｍｌ超、若しくは約２００ｐｇ／ｍｌ超である場合、又はより好ましくは、個々の細胞が、フローサイトメトリーによるＴＣＲ誘導刺激後に、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＩＮＦ－γ ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２について細胞内染色を通じて有効性であり得る場合、効能があるか、又は機能的であると考えられ得る。
本明細書で使用される場合、「保持物」は、フィルタ、メッシュ、又は膜を通過しない材料を指す。
本明細書で使用される場合、「最終的な有用性」とは、再生医療、養子細胞療法、ＡＴＭＰ、診断的インビトロ研究又は科学研究の製造又は直接使用を指す。
本発明は、転移性がん患者の腫瘍から単離され得る、特定の非修飾ＴＩＬ（ＵＴＩＬ）における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に関し、これは、同じがん患者から生成され、かつ同じがん患者に戻された自己ＴＩＬを伴う。本発明はまた、治療用凍結保存ＴＩＬ又はＵＴＩＬ集団を単離するための方法、並びに本明細書に説明される方法によって切除腫瘍を処理するための単回使用の無菌キットを含むデバイスの使用を介して得られるか、又は得ることができるＴＩＬ及びＵＴＩＬに関する。
一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍試料から得られ（「一次ＴＩＬ」）、次いで、本明細書に説明される更なる操作のためにより大規模な集団に増殖され、凍結保存され、本明細書に概説されるように再刺激され、ＴＩＬヘルスの指標として表現型及び代謝パラメータについて任意選択的に評価される。
患者腫瘍試料は、当該技術分野で公知の方法を使用して、一般に、腫瘍及びＴＩＬ細胞の混合物を含有する試料を得るための外科的切除、針生検、又はその他の手段を介して得られ得る。概して、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤腫瘍、又は転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍からのものであってもよい。腫瘍試料はまた、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍などの液体腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定されるものではないが、乳房、卵巣、子宮頸部、膵臓、前立腺、結腸直腸、肺、脳、腎臓、胃、及び皮膚を含む任意のがんタイプ（限定されるものではないが、扁平上皮がん、基底細胞がん、及び黒色腫を含む）のものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、悪性黒色腫腫瘍が特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されているため、悪性黒色腫腫瘍から得られる。
産生は、一般に、２段階プロセスを伴う。段階１では、初期腫瘍材料が解剖され、脱凝集モジュールを有する無菌キット内に配置され、酵素的に消化及び／又は断片化され、脱凝集モジュール内の腫瘍を均質化して、単一細胞懸濁液を提供する。均質化された細胞は、もはや必要とされなくなった試薬、細胞片、非脱凝集組織などの構成要素を除去するために、別個の濃縮モジュール内の無菌キット内で更に精製され得るが、細胞は、ＴＩＬ製造のための出発材料を安定化し、段階２が必要とされるまで無菌キットの安定化モジュール内で保存するために直接凍結保存され得る。段階２は、概して、切除腫瘍出発材料からのＴＩＬの成長（２週間）、その後のＴＩＬ細胞の急速増殖プロセス（急速増殖プロトコル「ＲＥＰ」－２週間）を伴う。最終産物が、洗浄され、緩衝生理食塩水、８．５％のＨＡＳ、及び１０％のＤＭＳＯ中で懸濁する前に採取され、凍結保存されて、更なる修飾なしで単回投与として注入する前に解凍される固形無菌産物を形成する。
治療には、治療活性に潜在的に寄与する３つの別個の要素が存在する。コア要素は、ＴＩＬ、すなわち、腫瘍由来Ｔ細胞であり、これは、Ｔ細胞がその正常な機能の一部として利用される様々な方法によって、腫瘍細胞を標的化及び排除し得る。これらの方法は、直接的な方法（すなわち、ペルフォリン媒介性細胞傷害）及び間接的な方法（すなわち、サイトカイン産生）を含む。これらの方法のうち、インビボの抗腫瘍効果にとって最も重要なのがどちらであるかは不明であるが、マウスモデルは、インターフェロンガンマの産生が効果的な治療に重要であることを示唆している。療法に寄与する２つの他の要素は、コンディショニング前化学療法及び高用量静脈内ＩＬ－２である。これら２つの要素は、注入後の患者におけるＴ細胞の生着を支持することによって作用すると考えられ、最初に、競合及び制御する免疫細胞を除去するコンディショニング化学療法を経て、その後、Ｔ細胞の生存を支持するＩＬ－２構成要素が続く。
細胞療法産物の構造は、成長支持細胞培養培地及びＴ細胞支持成長因子インターロイキン－２（ＩＬ－２）によって、酵素消化された腫瘍塊から直接ＴＩＬを成長させることによって作り出される。これは、腫瘍特異的Ｔ細胞が、腫瘍細胞混合物から選択的に生存し、成長することを可能にするが、一方、腫瘍抗原を認識しないＴ細胞は、刺激されず、選択的に失われることになる。産物は、Ｔ細胞が患者の自身のがん組織に由来しており、急速に増殖してＣＤ３表面マーカーによって定義される純粋なＴ細胞集団及びＴ細胞を形成している、自己Ｔ細胞ベースの産物を含む。
簡潔には、ＴＩＬ、特にＵＴＩＬは、腫瘍生検を出発材料として使用して、二段階プロセスで産生され得る。段階１（概して２～３時間にわたって実施される）では、キット及び半自動デバイスの使用を介した解剖、酵素消化、及び均質化を使用した腫瘍材料の初回収集及び処理が行われ、単一細胞懸濁液を産生し、これは、キットの安定化モジュールを使用して直接凍結保存されて、後続の製造及び数日又は数年後に行われ得る段階２のための出発材料を安定化させ得る。段階２は、４週間にわたって実施され得、これは、段階１の産物の解凍及び腫瘍出発材料からのＴＩＬの成長（約２週間）から始まり、その後に細胞の量、ひいては用量を増加させるためのＴＩＬ細胞の急速増殖プロセス（約２週間）が続く、連続的プロセスであり得る。ＴＩＬ、特にＵＴＩＬは、液体細胞懸濁液として製剤化する前に濃縮され、洗浄され得る。無菌医薬品は、更なる修飾なしで単回投与として静脈内注入前に解凍されることになるバッグ内に凍結保存され得る。
一実施形態では、本発明のバッグは、収集バッグ及び／又は凍結保存バッグである。バッグ及び任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び／又はチューブは、概して、閉鎖及び／又は封止された血液並びに／又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、ＰＶＣは、溶着及び／又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのコポリマー（すなわち、ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＥＶＯフィルム）、並びに／又はＥＶＡを含む材料などの、所定の材料から作製された組織を受容するためのバッグの少なくとも一部分を含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性及び／又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの市場性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約２．５ｍｍ～約７．５ｍｍの範囲の幅を有し得る。概して、封止１４０は、組織材料がバッグ１４０内に配置された後で形成され、約５ｍｍの幅を有し得る。封止は、シールピール試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ８８／Ｆ８８Ｍ）、及び／又は破裂試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ１１４０／Ｆ１１４０Ｍ若しくはＡＳＴＭ Ｆ２０５１／Ｆ２０５４Ｍ）を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に１００ニュートンの力に耐え得、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に７５ニュートンの力に耐えて、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び／又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約８秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。８秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の２～３秒間圧力が適用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグは、約１０ｃｍ～約５０ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約１５ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約１８ｃｍ～約２２ｃｍの範囲の長さを有し得る。
チューブのうちのいくつかは、溶着可能であってもよい。溶着可能なチューブは、ポリマー材料、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）から作製され得る。
限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、約１０ｃｍ～約４０ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約１５ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約１８ｃｍ～約２２ｃｍの範囲の長さを有し得る。
凍結保存バッグは、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）などの抗凍結剤を用いた凍結保存に好適である必要があり得る。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、バッグが約５ｍｌ～約４５ｍｌの範囲の体積の材料を保持し得るように構築され得る。特に、凍結保存バッグは、約１０ｍｌ～約３５ｍｌの範囲の材料の体積を収容することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、約１５ｍｌ～約３０ｍｌの範囲で保存される材料の体積を収容し得る凍結保存バッグを含む。凍結保存バッグは、所望の所定の体積が達成されるようにサイズ決めされていてもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、約４ｃｍ～約１１ｃｍの範囲の幅、及び約１０ｃｍ～約１８ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、凍結保存バッグは、約５．８ｃｍ～約９．８ｃｍの範囲の幅、及び約１２ｃｍ～約１６ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、凍結保存バッグの一実施形態は、約７．８ｃｍの幅及び約１４ｃｍの長さを有し得る。
使用前に、凍結保存キット及び／又はその特定の構成要素は、滅菌され得る。バッグを形成するために使用される材料は、ヒートシール可能であり得る。バッグで使用するための材料としては、限定されるものではないが、ＥＶＡ、ポリアミド（例えば、ナイロン）、及びそれらの組み合わせなどのポリマーを含み得る。開放バッグは、封止及び／又はクランプを使用してバッグを閉鎖した後の処理及び／又は脱凝集に使用され得る。
フィルタは、インラインフィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、生物学的フィルタ、及び／又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所望の材料を形成するために、処理された組織から所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、所望の材料が形成されるように、約２００μｍ未満の平均サイズを有する成分を有し得る。例えば、所望の材料は、約１７０μｍ未満の平均サイズを有するＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を含み得る。
フィルタは、フィルタの後、所望の材料が、約１５μｍ～約５００μｍの範囲のサイズを有する成分を有する安定化要素の方向にチューブ内に流れるように、チューブから入る処理された組織組成物が濃縮され得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後に安定化要素の方向にチューブに入る組織組成物が、約５０μｍ～約３００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約１５０μｍ～約２００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、濃縮要素のフィルタは、処理された組織から、約５μｍ～約２００μｍの所定のサイズ範囲外の材料を除去して、所望の材料を形成し得る。例えば、所望の材料は、約５μｍ～約２００μｍの範囲の平均サイズを有するＴＩＬを含み得る。弁は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁は、収集バッグから約２０ｃｍに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグに添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグに添加するために、無針弁に挿入され得る。弁を介して提供される材料としては、例えば、腫瘍消化培地、並びに／又はＤＭＳＯなどの抗凍結剤若しくは凍結保存培地、並びに／又は５５％のＤＭＳＯ及び５％のデキストラン凍結保存培地（例えば、ＢｌｏｏｄＳｔｏｒ ５５－５）などのそれらの溶液が挙げられる。
シリンジは、無針弁２９０、２９２を通じて、それぞれ、５５％のＤＭＳＯ及び５％のデキストラン凍結保存培地などの、腫瘍消化培地及び５５％のＤＭＳＯ溶液を提供するために使用され得る。処理中、材料は、所定の時間に凍結保存キットに選択的に提供され得る。更に、クランプは、腫瘍消化培地などの提供される材料の流れを制御するために使用され得る、及び／又はＤＭＳＯ溶液などの抗凍結剤は、収集バッグ、フィルタ、及び／又は凍結保存バッグなどのデバイスに所定の時間に提供され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも１０ｃｍのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ１９９は、封止可能及び／又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、ＰＶＣ（ポリビニルクロリド）、及び／又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約１．５ｍｍ～約４．５ｍｍの範囲の内径、及び約２．１ｍｍ～約６．１ｍｍの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約２．９ｍｍ～約３．１ｍｍの範囲の内径を有し、約４．０ｍｍ～約４．２ｍｍの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット１９１で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約１ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有する。
クランプは、フィルタ内への酵素培地及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。例えば、クランプは、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への酵素培地及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。別のクランプ１９８は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び／又は防止する。
脱凝集産物材料が特定の実施形態では適切に保存され得ることを確保するために、２つ以上のバッグが一緒に結合され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、組織、例えば、固体哺乳動物組織からの細胞及び／又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のための自動デバイスを含み得る。本発明で使用するための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び凍結保存キットを含み得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キットは、単回使用であり得る。本発明は、半自動無菌組織処理方法に更に関する。
いくつかの実施形態では、収集バッグなどのバッグは、収集キットに使用され得る。バッグは、組織試料などの試料の添加を可能にする開放端を有する。コネクタは、収集キット内のチューブにバッグを結合し得る。チューブ材料は、封止可能及び／又は溶着可能であってもよい。例えば、チューブは、熱、無線周波数などのエネルギーを使用して封止され得る。チューブ材料は、ＰＶＡから作製され得る。
いくつかの実施形態では、チューブは、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物を含む、１つ以上の培地酵素溶液の添加を可能にするために弁に結合され得る。例えば、弁は、無針弁であり得る。凍結保存キットに使用されるチューブは、約２．０ｍｍ～約４ｍｍの範囲のチューブの内径を有する約３．０ｍｍ～約５．０ｍｍの範囲の外径を有するチューブを含み得る。特に、チューブは、４．１＋／－０．１ｍｍの外形及び約３．０＋／－０．１ｍｍの内径を有し得る。チューブの長さは、収集キットの構成に依存し得る。例えば、収集キットの実施形態は、約１０ｃｍ～約２０ｃｍの範囲の長さを有するチューブを含み得る。
収集キットのいくつかの実施形態では、プロトタイプは、組織及び／又は酵素培地の移動を阻害及び／又は防止するための１つ以上のクランプを含み得る。特に、酵素培地及び／又は組織は、濾過ステップの前にフィルタ内に移動するのを阻害され得る。
治療には、治療活性に潜在的に寄与し得る３つの別個の要素が存在する。コア要素は、Ｔ細胞がその正常な機能の一部として利用される様々な機序によって腫瘍細胞を排除する潜在性を有する、ＵＴＩＬなどのＴＩＬである。
これらの機序は、［ａ］緊密な関与によって標的細胞に入り、細胞死を誘発する、細胞死を誘導する、細胞毒素（例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシン）を放出することによる、並びに［ｂ］アポトーシスを誘導するＦＡＳリガンド媒介細胞傷害性を結合することなどのＴ細胞と標的との間の細胞表面相互作用による、直接的な細胞傷害性と、二次エフェクター細胞を動員及び刺激して、腫瘍細胞死に関与及びそれを誘導する能力を有する、間接的な方法（例えば、サイトカイン産生）を含む。
ＴＩＬ、特にＵＴＩＬは、自己産物であり、その結果、製造された各バッチは、指定された患者に単回投与を提供する。サブバッチ又はバッチのプーリングは存在しない。医薬品は、解凍後の単回静脈内注入に対し、１２５～２７０ｍＬの８．５％のヒト血清アルブミン及び１０％のＤＭＳＯを有する生理食塩水ベースの溶液中に凍結保存された、Ｔ細胞の小規模の無菌的に調製されたバッチ（５×１０９～５×１０１０）である。
本発明には、米国特許第１０，３９８，７３４号（「’７３４特許」）と比較して数個の利点がある。’７３４特許の最初のステップは、ＴＩＬが培養される断片に腫瘍バルクを形質転換することである。対照的に、本発明は、ＴＩＬを腫瘍から解放し、これは、細胞懸濁液が調製される無菌キット中の切除後の無菌条件下で保存及び脱凝集され、細胞懸濁液が調製され、結果的に得られたＴＩＬを凍結することによって凍結保存する。本発明は、腫瘍の内側に存在する多様性を表す多様なＴＩＬ集団を提供する。また、それらは均質な懸濁液であるため、培養物内で増殖されるＴＩＬは、その多様性を保持することになり、腫瘍内に存在する多様ながん細胞集団に対処する可能性が最も高い。
対照的に、’７３４特許の製造プロセスは、出荷中に内部細胞集団の劣化、及び処理開始前の任意の更なる遅延を既に経験している組織の断片を用いて開始する。加えて、製造に使用されるＴＩＬは、内部に保持されるいかなるＴＩＬでもなく、組織断片から増殖するＴＩＬのみとなり、その結果、結果的に得られる細胞集団は、腫瘍環境の完全な多様性を反映しない場合がある。
別の差異は、閉鎖された製造処理への進入は、’７３４特許のプロセスよりも本発明の過程においてはるかに早く起こり、汚染の可能性がより少ないことである。特に、腫瘍組織の崩壊は、’７３４特許が生物学的安全キャビネット内の開放動作で発生すると説明する広範な断片化プロセスではなく、本出願の閉鎖された処理系で発生する。
本発明の出発材料は、無菌キット内の無菌条件下で保存されるため、凍結保存腫瘍細胞懸濁液上で実行され得る完全な製造プロセスは、高容量及び高効率でスケジュールされ、実行され得る。対照的に、’７３４特許は、非凍結組織から始まるため、断片化及び「成長」ステップは、容量利用効率の低い待機ベースで実行される。’７３４特許において、この中間凍結ステップを除去すると、製造プロセス全体が短縮されるが、プロセス全体が待機ベースで実行されることを意味し、つまり、製造停止時間は、いかなる遅延も存在することができないため、’７３４特許の製造施設に重大な結果をもたらし、製造に必要な停止期間を計画することは、プロセス中の全ての産物が完了されること、及び新しい手術が停止されることを必要とすることになる。
本出願のプロセスの利点は、切除腫瘍の形態の組織が、ＴＩＬ療法の要件の前に収集され、輸送され、処理され、凍結保存され、そして製造が必要とされるまで、及び必要とされる場合、無菌キットに保存され得、それにより、初期ステージの疾患を有する患者が、代替療法を受けている間に採取され、保存され得ることである。結果として、腫瘍収集及びその後の製造のタイミング又は地理位置への影響はほとんど又は全くない。それに対して、’７３４特許では、これは不可能であり、細胞が凍結して保持され得る前に、医薬品の完全製造を行わなければならない。
上述のように、これらは、ＲＥＰ培養の播種に必要な非常に異なる数の細胞、１００～２０００万個（本発明）対２５００万～２億個（’７３４特許）に反映されるように、ＲＥＰ培養を開始するために異なる細胞集団を生成することになる、非常に異なる培養プロセスである。本発明では、初期ＴＩＬ増殖中、培養播種は、塊（すなわち、新生細胞）からの増殖に対して、細胞懸濁液（すなわち、常駐Ｔ細胞と新生Ｔ細胞との混合物となる、脱凝集細胞及び凍結保存細胞から外殖する細胞）を使用し、これは、ＲＥＰが新生Ｔ細胞と単に播種されるものではないことを意味する。加えて、本発明は、固形及び可撓性の閉鎖されたコンテナの両方を利用することができ、可撓性コンテナは、’７３４特許で定義されるようないくつかの塊ではなく、誘導される腫瘍懸濁液の量に基づいて、より最適な環境を可能にする］。
転移性腫瘍材料は、外科手術室内の標準的な外科診療を使用して外科的に除去される。脱凝集前に、異物が除去され（すなわち、肉眼的に定義される非腫瘍材料）、腫瘍材料が滅菌バッグに移される。
以下は、腫瘍出発材料受け入れ試験に関与し得る。第１に、ソース組織が腫瘍材料であることが確認される。第２に、脱凝集組織の代表的な試料が、微生物負荷について評価され、存在する場合、抗生物質感受性が定義される（製造は、抗生物質による危険性の下で実施され得る）が、最終材料は、微生物成長に対して陰性でなければならない。第３に、ＴＩＬ及び腫瘍細胞の量及び生存率が、フローサイトメトリーによって評価され得る。
本発明の方法は、対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生するステップを含み、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される。有利な実施形態では、半自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集可撓性コンテナ内の表面が固形組織を機械的に粉砕及びせん断することを可能にする脱凝集を制御し得る（例えば、ＰＣＴ公開第２０１８／１３０８４５号を参照されたい）。脱凝集表面は、例えば、機械的ピストンによって制御され得る。
酵素消化のために、細胞懸濁液（Ｔ細胞及び腫瘍細胞の両方を含有する）が、ＤＮａｓｅ１及びコラゲナーゼ（ＩＶ型）の酵素混合物を使用して、切除転移性腫瘍から生成される。繰り返される機械的圧迫の組み合わせは、酵素がアクセスするための追加の表面を露出し、酵素反応は、任意選択の凍結保存前に固形組織を細胞懸濁液に構成するプロセスを高速化する。１つの実施形態では、脱凝集ステップの完了時に、ＤＭＳＯベースの抗凍結剤が、コントロールレート凍結サイクルの直前に添加される。いくつかの実施形態では、固形組織の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの任意の混合物などの、１つ以上の培地酵素溶液の選択及び提供によるものであり得る。切除転移性腫瘍の酵素消化は、半自動デバイスの脱凝集可撓性コンテナ内で起こり得る。
例として、本発明の方法の別の実施形態では、脱凝集プロセスが酵素消化で補充される場合、酵素消化のための培地製剤は、細胞間境界を分解させるタンパク質分解を補助する酵素を補充されなければならない。
限定されるものではないが、以下の１つ以上の培地、臓器保存液、選択的溶解溶液、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地、ＸＶＩＶＯ（商標）、ＡＩＭ－Ｖ（商標）、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ（商標）溶液、結晶性溶液及びＩＶ液、コロイド溶液及びＩＶ液、５％デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）、ハルトマン溶液、ＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ－Ｖ（商標）、イスコフ培地、ＸＶＩＶＯ（商標）を含む、細胞培養又は細胞取り扱いの技術分野で公知の様々な液体製剤が、固形組織の細胞脱凝集及び酵素消化に使用される液体製剤として使用され得、各々は、追加の細胞支持因子、例えば、胎児仔血清、ヒト血清若しくは血清代替物、又は細胞回収及び生存若しくは特異的細胞枯渇を補助するための他の栄養素若しくはサイトカインを任意選択的に補充され得る。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養（例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト）又は幹細胞（例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはＴ細胞）用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、金属イオン、抗生物質、接着因子、脱接着因子、界面活性剤、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｎｚａ、若しくはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、又は類似の培地製造業者及び供給業者から市販されている。
酵素消化に必要な液体製剤は、少なくとも０．１ｍＭから最大５０ｍＭ、２～７ｍＭ、理想的には５ｍＭの最適範囲で存在する十分なカルシウムイオンを有していなければならない。
消化される固形組織は、酵素消化の前にＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを洗浄及び除去する前に、接着因子及び阻害タンパク質を除去するために、キレート剤ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡを含有する液体製剤による脱凝集後に洗浄され得る。
酵素消化に必要な液体製剤は、最小限のキレート剤ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡでより最適であり、これは、酵素安定性及び活性に必要なカルシウムイオンを除去することによって酵素活性を重度に阻害し得る。加えて、β－メルカプトエタノール、システイン及び８－ヒドロキシキノリン－５－スルホン酸塩は、他の既知の阻害物質である。
解離、酵素消化、及び均質化を使用した腫瘍材料の処理は、ＴＩＬ、特にＵＴＩＬの単一細胞懸濁液を産生し、これは、ＩＬ－２におけるＴＩＬ、特にＵＴＩＬの細胞懸濁液の第１の増殖を介して、後続の処理のための出発材料を安定化して、第１のＴＩＬ、特にＵＴＩＬ集団を得るために、直接凍結保存され得る。
方法はまた、脱凝集腫瘍、例えば、細胞懸濁液を凍結保存するステップを含む。対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生するステップを実施するのと同じ日に脱凝集腫瘍を凍結保存することが実施され、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される。例えば、凍結保存は、腫瘍を脱凝集するステップの２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、又は２２時間後に実施される。半自動デバイスの脱凝集モジュールにおける酵素脱凝集から得られた単一細胞懸濁液としての脱凝集腫瘍の凍結保存は、懸濁液を８℃～少なくとも－８０℃の温度で冷却又は維持することによって実施される。脱凝集は、５分程度の速さであるが、ほぼ通常４５分～１時間であり、凍結保存は、６０分～１５０分程度の速さであり得る。一実施形態では、方法は、凍結保存脱凝集腫瘍を保存することを含む。好ましい実施形態に説明されるように、デバイスは、凍結保存用の少なくとも１つの細胞コンテナを備え、コンテナは、弾性変形可能な材料から製造された可撓性コンテナである。デバイスのこの実施形態では、最終コンテナが、－２０～－１９０℃の冷凍庫に直接移されるか、又はデバイスと関連付けられるか、若しくは別個に供給される（例えば、Ｐｌａｎｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ又はＡｓｙｍｐｔｏｔｅ Ｌｔｄによって製造される）コントロールレート凍結装置内により最適に位置し、濃縮された脱凝集固形組織コンテナを含有するために採用された凍結チャンバ及び可撓性保管コンテナの温度は、低温ガス（通常、窒素、例えば、Ｐｌａｎｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を注入することによって、又は制御された冷却表面から熱を除去することによって、制御される。両方の方法は、凍結溶液及び産物の所望の生存率に基づいて、凍結される特定の細胞に必要な速度で、１℃未満又はより好ましくは０．１℃の凍結プロセスの誤差で正確に制御する能力を結果的にもたらす。この凍結保存プロセスは、氷核形成温度を考慮に入れなければならず、氷核形成温度は、理想的には、凍結溶液の融解温度に可能な限り近い温度である。水溶液中の結晶成長に続いて、水が氷として系から除去され、残留する非凍結溶液の濃度が増加する。温度が低下すると、より多くの氷が形成され、残留する非凍結画分が減少し、濃度が更に増加する。水溶液には、氷が濃縮水溶液と共存する、大きな温度範囲が存在する。最終的に、温度低下を通じて、溶液は、ガラス転移状態に到達し、その時点で、凍結溶液及び細胞は、粘性溶液から、この温度を下回る固体様状態に移動するが、細胞は、更なる生物学的変化を経ず、それゆえ、必要になるまで数十年間にわたって安定化される。
氷核形成及び結晶成長は、凍結溶液及び細胞微小環境への熱の放出を伴い、凍結流体が相変化を受けている間の温度変化に抵抗する場合でも、細胞及び凍結溶液の冷却を維持することが望ましい。脱凝集が酵素脱凝集を含むか否か、及び所与の酵素、酵素濃度、及び組織タイプに対する酵素消化の最適温度に応じて、凍結保存の開始時の温度は、限定なしで、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、及び２０℃、すなわち、哺乳動物の体温から室温までの範囲の温度を含み、限定されるものではないが、限定なしで１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、及び２℃などの冷凍温度を含む、室温を下回る温度を更に含む。極低温冷却のための標的温度は、限定なしで、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃、－８５℃、－９０℃、及びその間の温度、並びに液体窒素蒸気保管の温度（－１９５．７９℃）までの低温を含む。特定の実施形態では、本発明に従って使用される方法及びデバイスは、生理学的温度又は消化温度から凍結保存温度までの時間を最小化するように設計又はプログラムされる。特定の実施形態では、凍結保存のための本発明に従って使用される方法及び装置は、有利には、培地が結晶化する際に、細胞を含む環境に、環境内に、環境の周囲に、又は環境内における熱放出が最小化又は回避される条件下で冷却するために設計及びプログラムされる。特定の実施形態では、凍結保存のための本発明に従って使用される方法及び装置は、有利には、培地が結晶化する際に、例えば、培地の核形成及び結晶化が温度変化に抵抗する熱を放出する場合でも、凍結保存培地の所定の温度変化速度を維持することによって、細胞を含む環境に、環境内に、環境の周囲に、又は環境内における熱放出が最小化又は回避される条件下で冷却するために設計及びプログラムされる。特定の実施形態では、温度変化速度を調節又はプログラミングすることは、所定の温度変化速度を維持するために、凍結保存試料からの熱抽出速度を調節することを含む。特定の実施形態では、凍結保存試料の冷却速度は、凍結保存試料の温度を測定し、フィードバックプロセスによる相変化による熱抽出速度を調整することによって維持される。特定の実施形態では、凍結保存試料の冷却速度は、相変化を予測し、相変化の予想される時点における熱抽出速度を増加させることによって維持される。特定の実施形態では、脱凝集温度から極低温標的温度まで連続冷却するように方法が設計される、及び／又はデバイスがプログラムされる。例示的なプログラムされた冷却速度としては、限定なしで、－０．５℃／分、－１℃／分、－１．５℃／分、－２℃／分、又は－２．５℃／分が挙げられる。冷却速度は、プログラム標的であり、冷却サイクルにわたって変化し得る。冷却速度は、例えば、±０．１℃／分、±０．２℃／分、±０．３℃／分、±０．４℃／分、又は±０．５℃／分だけ変化し得る。本発明の一実施形態では、凍結保存温度は、－８０℃±１０℃であり、デバイスは、１℃／分、又は１．５℃／分、又は２℃／分、又は１℃／分±０．５℃／分、又は１．５℃／分±０．５℃／分、又は２℃／分±０．５℃／分だけ温度を低減するようにプログラムされる。
ＴＩＬの正確な制御された冷却が望ましいことは明らかであろう。したがって、ＴＩＬからの熱伝達の最適化された測定及び制御のために、表面対体積比を最適化し、カセットを用いて凍結保存コンテナを収容し、熱伝達を容易にし、温度センサを最適に位置決めすることが有利である。
凍結保存は、限定されるものではないが、ｉ）解凍及びＴＩＬ増殖によって後で使用するための処理された腫瘍試料の凍結保存、ｉｉ）腫瘍細胞の解凍及び使用によって後で使用するための処理された腫瘍試料の凍結保存、ｉｉｉ）後の解析のための処理された腫瘍試料の凍結保存、ｉｖ）解凍及びＲＥＰ増殖によって後で使用するためのＲＥＰ増殖前培養物の凍結保存、ｖ）解凍及びＲＥＰ増殖によって後で使用するためのＲＥＰ増殖前培養物の一部分（例えば、限定されるものではないが、ＲＥＰ前培養物からの所定の部分若しくは所定の量を上回る過剰な細胞）の凍結保存、ｖｉ）後続のＲＥＰ増殖前又はＲＥＰにおいて後で使用するためのＲＥＰ後培養物の凍結保存、又はｖｉｉ）解凍及び対象への投与によって後で使用するためのＲＥＰ後培養物の凍結保存を含む、ＴＩＬ製造全体を通して用いられ得る。
凍結保存ＴＩＬ中間体、産物、及び試料は、使用前に解凍時に洗浄され得る。特定の実施形態では、凍結保存腫瘍消化物が解凍され、成長培地中で希釈され、１回以上洗浄される。特定の実施形態では、洗浄は、遠心分離及び成長培地の変化を含む。特定の実施形態では、洗浄は、濾過及び成長培地の変化を含む。特定の実施形態では、洗浄培地が混合され、次いで、バッグ又は皿などの閉鎖されたＴＩＬコンテナから引き出され、新鮮な培地で交換される。洗浄は、ＴＩＬ、洗浄培地、並びにチューブ及び弁によって相互接続される他の構成要素用の閉鎖系又はコンテナで自動化され得る。
特定の実施形態では、ＴＩＬの割合、ＴＩＬ部分集団を増加させる。ＴＩＬ生存率、及び／又はＴＩＬ効力を増加させるために、解凍、希釈、及び任意選択の洗浄時に、凍結保存ＴＩＬは、製造の次のフェーズの前に培養物中で保持される。特定の実施形態では、保持時間は、ＣＤ３によって測定される総生存細胞又は増殖倍率を最大化するように選択される。特定の実施形態では、保持時間は、２～４時間、４～６時間、６～９時間、９～１２時間、１２～１８時間、又は１８～２４時間を含むか、又はそれらからなり得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルの増加が可能である、若いＴＩＬを得ることを提供し、そのため、古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドを更に経たＴＩＬ）よりも、追加的な治療上の利益を提供し得る。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ａｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７５：１５７－１６７（２０１２）、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６：６１２２－６１３１（２０１０）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８（３）：２５８－２６７（２００５）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９（１７）：ＯＦ１－ＯＦ９（２０１３）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２：４１５－４２３（２００９）、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３０：１２３－１２９（２００７）、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８：５３－６２（２００５）、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：７４２－７５１（２００８）に説明されており、それらの全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限定されるが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定常）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流用途を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を呈し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって得られるＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。一部の実施形態では、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に採取されたＴＩＬ及び／又は提供されるもの以外の他の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。一部の実施形態では、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に採取されたＴＩＬ及び／又はＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、第１の増殖で得られるＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／又はＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン重鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン軽鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現の増加が存在する。
本発明の方法はまた、ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＴＩＬ、特にＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施するステップを含む。上記に説明されるステップから結果的に得られる細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に好都合である条件下で、ＩＬ－２を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、不活化ヒトＡＢ血清を含む培地中の２ｍＬのウェルで、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いてインキュベートされる。この一次細胞集団は、ある日数、概して３～１４日間培養され、バルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、７～１４日間培養され、バルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、１０～１４日間培養され、バルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、約１１日間培養され、バルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を結果的にもたらす。
好ましい実施形態では、ＴＩＬの増殖は、以下及び本明細書に説明される初期バルクＴＩＬ増殖ステップ、続いて、以下及び本明細書に説明される第２の増殖（急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）ステップ、その後の再刺激ＲＥＰステップを含む）を使用して実施され得る。
有利な実施形態では、凍結保存脱凝集腫瘍組織が、解凍され、インラインの１００～２７０μｍフィルタを通る濾過、及び２０ｍＬの再懸濁前の５０ｍＬ遠心分離チューブ内の遠心分離前に、Ｔ細胞培地（以下の添加剤に１０％のＦＢＳ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＩｍｍｅｔａｃｙｔｅ用に製造されたＴ細胞培養培地契約）中で１：９で再懸濁される。ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＣＤ５８＋、並びにＤＲＡＱ７－細胞の数を定量化するために、フローサイトメトリー解析のために試料が採取され得る。いくつかの実施形態では、これは、代替的な手動（限定されるものではないが、血球細胞計など）、又は限定されるものではないが、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（商標）、Ｇｕａｖａ（登録商標）、自動血液解析及びカウンタ、限定されるものではないが、Ｓｃｅｐｔｅｒ（商標）などのピペットベースの細胞カウンタなどの、代替的な自動総生存細胞計数デバイスを使用して播種され得る。
一実施形態では、再懸濁された凍結保存脱凝集腫瘍組織は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に好都合である条件下で、ＩＬ－２を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、不活化ヒトＡＢ血清を含む培地中の２ｍＬのウェルで（又はいくつかの場合、本明細書に概説されるように、人工抗原提示［ａＡＰＣ］細胞集団の存在下で）、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いてインキュベートされる。この一次細胞集団は、ある日数、概して１０～１４日間培養され、バルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、第１の増殖中の成長培地は、ＩＬ－２又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、１ｍｇバイアルに対して２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、１ｍｇバイアルに対して２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、１ｍｇバイアルに対して２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、１ｍｇバイアルに対して３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２保存溶液は、６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１２を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１２を含む。
いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１８を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１８を含む。
いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
培養培地については、限定されるものではないが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１などの、インターロイキンの組み合わせも企図される。ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、又はそれらの組み合わせなどの他のサイトカインもまた、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１とともに企図される。限定されるものではないが、ＩＬ－４（ａＩＬ４）、抗ＩＬ－４（ａＩＬ４Ｒ）、抗ＩＬ－５Ｒ（ａＩＬ５Ｒ）、抗ＩＬ－５（ａＩＬ５）、抗ＩＬ１３Ｒ（ａＩＬ１３Ｒ）、又は抗ＩＬ１３（ａＩＬ１３）などの、Ｔｈ２ブロッキング試薬などの抗体も企図される。
いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、３日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、４日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、５日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、６日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、７日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、８日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、９日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１０日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１１日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１２日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１３日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、３日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、４日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、５日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、６日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、７日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、８日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、９日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１０日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１１日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１２日～１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、３日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、４日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、５日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、６日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、７日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、８日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、９日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１０日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１１日～１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、３日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、４日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、５日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、６日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、７日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、８日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、９日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１０日～１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１１日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、ＲＥＰ １０日目は、修飾又は操作されたＴＩＬに対するエレクトロポレーションの３日後である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが第１の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意の組み合わせが第１の増殖中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが第１の増殖中に組み合わせとして用いられる。
いくつかの実施形態では、第１の増殖は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、ＴＩＬ増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例示的なＧ－ＲＥＸ－１０若しくはＧ－ＲＥＸ－１００、又は有利にはＷＯ２０１８／１３０８４５のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
有利には、第２のＴＩＬ集団と称される、第１の増殖から得られたＴＩＬ集団は、第２の増殖（ＲＥＰとも称される増殖を含み得る）に供され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが療法で使用されることになる場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団とも称される）又は第２のＴＩＬ集団（いくつかの実施形態では、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、増殖前、又は第１の増殖後、かつ第２の増殖の前に、好適な治療のための遺伝子修飾に供され得る。
レンチウイルスは、分裂及び非分裂細胞の両方を形質導入するその能力に起因して、効率的な遺伝子導入ビヒクルである。レンチウイルス遺伝子療法ベクターの最も徹底的に調査されたものは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型に由来するが、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、カプリン関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ビスナウイルス、及びジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）を含む、他の霊長類及び非霊長類レンチウイルスに基づく遺伝子療法ベクターも開発されている。
複製欠損ウイルスベクターは、潜在的に致命的なウイルスを有する患者の感染を予防するために不可欠である。レンチウイルスベクターは、より安全かつより効率的になるように開発されてきた。最近の第３世代のベクターは、毒性及び病原性を補助する全てのアクセサリー遺伝子を除去したが、残りの遺伝子を分割し、これは、３つのプラスミドにわたる導入遺伝子の発現に重要である。例えば、米国特許公開第２００６／００２４２７４号を参照されたい。
ＥＩＡＶ遺伝子導入ベクターは、インビトロで増殖細胞及びＧ１停止細胞の形質導入に効果的であることが示された。Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９９． Ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： １８０８－１８１８、Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： １４８１－１４８７、Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．，２００１，ＥＩＡＶ，ＣＡＥＶ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏｓ．１／６，１３１－４５。
Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ，ｕｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２． Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，１９（５），４９６－５１０は、ＩＬ－２を発現してＴＩＬの生存を延長するように遺伝子操作されたＴＩＬを説明する。患者ＴＩＬを、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターを用いて第１の増殖中にトランスフェクトし、その後、治療に十分な数を得るために第２の増殖に続いた。
簡潔には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来のＭＦＧ骨格を、５’長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの制御下でヒトＩＬ－２遺伝子のｃＤＮＡコピーとともに含有する、ＳＢＩＬ２ベクターは、ＰＧ１３パッケージング細胞株においてシュードタイプ化され、これは、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）エンベロープタンパク質を提供する。統合されたレトロウイルスＩＬ－２ ＤＮＡの３つのコピーを含有した安定プロデューサークローン（ＰＧ１３ＳＢＩＬ２＃３）を生成した。臨床ＧＭＰグレードのＳＢＩＬ２レトロウイルス上清は、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって産生された。ＴＩＬ形質導入について、６ウェルの非組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＣＨ－２９６、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］中２５μｇ／ｍｌ、ＧＭＰグレード、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で被覆し、ＰＢＳ－２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロッキングし、３２℃かつ１０％のＣＯ２で、解凍されたＳＢＩＬ２ウイルス上清（５ｍｌ／ウェル）で４時間、プリロードした。ＴＩＬを、３７℃かつ５％のＣＯ２で１８～２４時間、３ｍｌ／ウェルで添加し、第２のＳＢＩＬ２装填プレートに移し、追加の１８～２４時間培養し、その後、ＴＩＬを採取し、新鮮な培地に再懸濁させた。
Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１（１０），２２７８－２２８８．は、腫瘍部位でＩＬ－１２を選択的に分泌するように遺伝子操作されたＴＩＬを説明している。ＴＩＬに、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーター、活性化Ｔ細胞プロモーターの核因子によって駆動される一本鎖ＩＬ－１２をコードする遺伝子を担持するＭＳＧＶ１ γ－レトロウイルスベクターを形質導入した。
ＭＳＧＶ－１は、マウス幹細胞ウイルス長い末端反復を利用するＭＳＧＶベクターに由来し、延長されたｇａｇ領域及びＫｏｚａｋ配列を含有する。ヒト一本鎖ＩＬ－１２をコードする遺伝子を、ＮＦＡＴ応答性プロモーターによって駆動され、ＭＳＧＶ－１ベクター内に５’ＬＴＲ方向に逆転して挿入された、ＩＬ－１２ ｐ４０、リンカーＧ６Ｓ、及びＩＬ－１２ ｐ３５の順序で合成した。高力価のＰＧ１３細胞ベースの産生細胞株が生成され、レトロウイルス上清が、適正製造規範（ＧＭＰ）条件下で、ＮＣＩ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって産生された。ベクター上清を試験し、臨床適用のための組換えガンマ－レトロウイルスベクターの産生について現在要求される全ての米国食品医薬品局のガイドラインに合格した。
形質導入手順は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂのＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）、３０００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－１２、及び４Ｇｙ照射同種ＰＢＭＣフィーダー細胞を、各ＴＩＬに対して２００個のフィーダー細胞の比率で刺激することによって開始された。細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＣＨ－２９６、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）被覆した非組織培養６ウェルプレートを使用して、４日目及び／又は５日目に形質導入のために採取した。ベクター上清を、２０００ｇで２時間、３２℃で遠心分離することによって、コーティングされたプレート上に「スピン装填」した。レトロウイルスベクター上清をウェルから吸引し、２×１０６個の刺激ＴＩＬ細胞を各ウェルに加え、続いて１０００ｇで１０分間遠心分離した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、細胞を２回目の形質導入のために翌日採取した。最初の２１人の患者の細胞は、２つの形質導入を受けた。１２人の患者の細胞は、１つのみの形質導入を受けた。
Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２０（６），６３０－６４０は、形質導入されたＴリンパ球に遺伝子を発現し、有効な抗腫瘍Ｔ細胞を構築するためのレンチウイルスベクターで使用するためのプロモーターの開発を説明している。
ＴＩＬを、外科標本から得た。－１８０℃で保存された凍結ストックからＰＢＬを解凍し、３００ＩＵ／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ及びインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｃｅｔｕｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）中で培養物に入れた。ＯＫＴ３刺激について、細胞は、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を５０ｎｇ／ｍｌで培地中に最初に配置したか、又は形質導入後、培養培地の初期交換時にＯＫＴ３培地中に配置した。ＰＢＬ又はＴＩＬの形質導入について、１×１０６個の細胞を、ウイルス上清及びポリブレン（最終濃度、８μｇ／ｍｌ）を用いて、２４ウェルの組織培養処理プレート中で１ｍｌの最終体積に調整した。細胞を、プレートの遠心分離によって、１０００×ｇ、３２℃で１．５時間形質導入した。プレートを３７℃の加湿された５％のＣＯ２インキュベーターに一晩配置し、培地を翌日に交換した。ＴＩＬは、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（５０００ＩＵ／ｍｌ）、及び３つの異なるドナーからの照射された同種末梢血単核細胞を使用して、上記に説明されたように急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）に供された（ＴＩＬ：フィーダー比、１：１００）。ＲＥＰの６日後、ＴＩＬは説明されるように形質導入され、培養物に戻された。
Ｂｅａｎｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃａｌｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＰＤ－１ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：２３（８），１３８０－１３９０は、ＰＤ－１特異的亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）媒介性遺伝子編集をコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるＰＤ－１の臨床スケール遺伝子編集を説明する。
養子細胞輸送のための十分な数の形質導入Ｔ細胞を生成するために、ＴＩＬは、ＲＥＰを使用して急速に増殖するように誘導された。４６ 簡潔には、１×１０７個のＴＩＬを、１×１０９個の同種の照射された（５，０００ｒａｄ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と組み合わせ、これらの細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を含有する４００ｍｌのＴ細胞培地中に懸濁した。細胞を、Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコ中で３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。５日後、２００ｍｌの培地を吸引し、交換した。ＲＥＰの開始後７日目に、ＴＩＬを採取し、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で２回洗浄した。次いで、細胞を計数し、１×１０８／ｍｌの濃度でエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をＭａｘＣｙｔｅ ＣＬ－２処理アセンブリに移し、１２０μｇ／ｍｌのＰＤ－１ ＺＦＮ ｍＲＮＡ（又はＧＦＰトランスフェクトＴＩＬ／ＧＦＰのＧＦＰ ｍＲＮＡ）と混合した。エレクトロポレーションを、ＭａｘＣｙｔｅのプロトコルに従って実施した。エレクトロポレーション後、ＴＩＬを処理アセンブリからＴ－１７５フラスコに移し、３７℃で２０分間インキュベーターに入れた。このインキュベーションステップの後、ＴＩＬを、１×１０６／ｍｌの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。次いで、細胞を、上記の説明のように一晩の低温インキュベーションのために、３０℃のインキュベーターセットに入れた。翌日、ＴＩＬを３７℃のインキュベーターに移し、ＲＥＰの１０日目（エレクトロポレーションの３日後）までそのまま放置した。
特定の実施形態では、フィーダー細胞は、複数のドナーからのＰＢＭＣのプールを含む。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、複数のドナーの血液試料のＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって得られたバフィーコート細胞（白血球）を含む。特定の実施形態では、複数のドナーのバフィーコート細胞を含むＰＢＭＣがプールされる。特定の実施形態では、プールされるドナー調製物の数は、２～１５以上であってもよく、ドナーの好ましい数は、５～１０、１０～１５、８～１２、又は９～１１である。特定の実施形態では、１０人のドナーからのＰＢＭＣがプールされる。
自動アフェレーシスプロセスを使用してＰＢＭＣを得ることにより、ＰＢＭＣの回復及び生存率が改善され、ドナーの数が低減され得ることが見出された。アフェレーシス産物、特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシスからの白血球を含む。好適なアフェレーシス産物を生成するための例示的な非限定的なシステムは、Ｓｅｆｉａ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｉｖａ）である。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、商業的に得られる。特定の実施形態では、複数のドナーのアフェレーシス産物を含むＰＢＭＣがプールされる。特定の実施形態では、プールされるドナー産物の数は、２～１５個以上とすることができる。より好ましい実施形態では、好ましいドナー数は、２～８、２～６、又は２～４人のドナーである。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、３人のドナーからのアフェレーシス産物を含む。
特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、凍結保存される。凍結保存は、事前スクリーニング及びＰＢＭＣ在庫維持を可能にし、ＴＩＬ製造に必要なドナー数を低減する。
脱凝集腫瘍組織が解凍される。いくつかの実施形態では、第１の増殖から得られたＴＩＬは、選択のために表現型が決定されるまで保存される。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬから得られたＴＩＬは、保存されず、第２の増殖に直接進む。したがって、方法は、追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＴＩＬ、特にＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生するステップを含む。いくつかの実施形態では、第１の増殖から得られたＴＩＬは、第１の増殖後、かつ第２の増殖前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約３日～２１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約４日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約４日～１０日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約７日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、ＲＥＰ培養の播種は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日後に起こる。
いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から３日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から４日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から５日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から６日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から７日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から８日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から９日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１０日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１１日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１２日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１３日～１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１４日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から２日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から３日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から４日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から５日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から６日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から７日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から８日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から９日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１０日～１１日後に起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から１１日後に起こる。
いくつかの実施形態では、第１の増殖からのＴＩＬ又はＴＩＬの一部分は、凍結保存される。特定の実施形態では、ＴＩＬは、２つ以上の部分に分割され、１つ以上の部分が第２の増殖に進み、１つ以上の部分が、後の第２の増殖で使用されるように凍結保存される。特定の実施形態では、第１の増殖の終了時に細胞数が決定され、それに応じて培養物が分割される。特定の実施形態では、第１の増殖からのＴＩＬの平均効力が決定され、それに応じて培養物が分割される。特定の実施形態では、所定の最小数又は最適な数のＴＩＬが第２の増殖に進み、残りのＴＩＬが凍結保存され、その後、解凍され、更なる第２の増殖で使用される。特定の実施形態では、残留ＴＩＬの数及び／又は活性に応じて、凍結保存ＴＩＬは、代替的に、第１の増殖に続いて第２の増殖に使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、第１の増殖後、かつ第２の増殖前に保存されず、ＴＩＬは、第２の増殖に直接進む。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に説明されるように、閉鎖系で起こる。いくつかの実施形態では、第１の増殖からのＴＩＬ、第２のＴＩＬ集団は、移行期間なしで、第２の増殖に直接進む。
いくつかの実施形態では、第１の増殖から第２の増殖への移行は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、ＴＩＬ増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０、Ｇ－ＲＥＸ－１００、又はＸｕｒｉ ＷＡＶＥバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、採取及び初期バルク処理後に数において増殖される。この更なる増殖は、本明細書では第２の増殖と称され、これは、概して、当該技術分野では、急速増殖プロセスと称される増殖プロセスを含み得る。第２の増殖は、概して、ガス透過性又はガス交換コンテナ中で、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含む、いくつかの構成要素を含む培養培地を使用して達成される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの第２の増殖又は第２のＴＩＬ増殖は、当業者に公知の任意のＴＩＬ培養フラスコ又はコンテナを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約７日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約８日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約９日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１０日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１１日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１２日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１３日～約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１４日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約７日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約８日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約９日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１０日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１１日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１２日～約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約７日～約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約８日～約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約９日～約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１０日～約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１１日～約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１２日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１３日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は、約１４日間にわたって継続することができる。
一実施形態では、第２の増殖は、本開示の方法を使用してガス透過性コンテナ内で実施され得る。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、又はインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）の存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激物には、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ（Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．）若しくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されているもの）又はＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）から市販されているもの）を挙げることができる。ＴＩＬを、任意選択的に３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又はＩＬ－１５などのＴ細胞増殖因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭのＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）などの、ベクターから任意選択的に発現され得る、がんの１つ以上の抗原を、エピトープなどのその抗原部分を含んで、第２の増殖中に含めることによって、インビトロでＴＩＬの更なる刺激を誘導するように増殖し得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、又はそれらの抗原部分が挙げられる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原での再刺激によって急速に増殖する場合もある。あるいは、ＴＩＬを、例えば、照射自己リンパ球又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２で更に再刺激することができる。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の増殖の一部として生じる。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、照射自己リンパ球の存在下で、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２を用いて生じる。
一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ－２を含む。
一実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが第２の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意の組み合わせが第２の増殖中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが第２の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、並びにそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、第２の増殖は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む補充された細胞培養培地中で行うことができる。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、補充された細胞培養培地で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ、抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（すなわち、抗原提示細胞）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。一実施形態では、急速増殖及び／又は第２の増殖におけるＴＩＬ対ＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞の比率は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。一実施形態では、急速増殖及び／又は第２の増殖におけるＴＩＬ対ＰＢＭＣの比率は、１対５０と１対３００との間である。一実施形態では、急速増殖及び／又は第２の増殖におけるＴＩＬ対ＰＢＭＣの比率は、１対１００と１対２００との間である。
一実施形態では、ＲＥＰ及び／又は第２の増殖は、バルクＴＩＬが、１５０ｍｌの培地において、１００倍又は２００倍を超える不活化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコ内で実施される。細胞が代替的な成長チャンバに移されるまで、培地交換が行われる（通常、新鮮な培地による呼吸作用を介した２／３の培地交換）。代替的な成長チャンバは、以下でより完全に論じられるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性コンテナを含む。
いくつかの実施形態では、第２の増殖（ＲＥＰプロセスと呼ばれるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で論じられるように、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、１１日に短縮される。
一実施形態では、ＲＥＰ及び／又は第２の増殖は、上記に説明されたＴ－１７５フラスコ及びガス浸透性バッグ（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８，３１，７４２－５１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６，３３２－４２）又はガス浸透性培養器（Ｇ－Ｒｅｘフラスコ）を使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の増殖（急速増殖と称される増殖を含む）は、Ｔ－１７５フラスコ内で実施され、１５０ｍＬの培地中に懸濁された約１×１０６個のＴＩＬが、各Ｔ－１７５フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、１対１のＣＭ及びＡＩＭ－Ｖ培地の混合物中で培養され、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を補充され得る。Ｔ－１７５フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換され得る。いくつかの実施形態では、７日目において、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞は、３Ｌのバッグ内で組み合わせられ得、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ Ｖが、３００ｍｌのＴＩＬ懸濁液に添加された。各バッグ内の細胞数を毎日又は２日毎に計数し、細胞数を０．５～２．０×１０６個の細胞／ｍＬに保つために新鮮な培地を添加した。
一実施形態では、第２の増殖は、１００ｃｍガス透過性シリコンボトムを有する５００ｍＬの容量のガス透過性フラスコ（Ｇ－Ｒｅｘ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍｉｎｎ．，ＵＳＡから市販）で実施され得、５×１０６個又は１０×１０６個のＴＩＬが、４００ｍＬの５０／５０培地中でＰＢＭＣを用いて培養され、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充され得る。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離され得る。ＴＩＬペレットは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な培地を用いて再懸濁され、元のＧ－Ｒｅｘ１００フラスコに再び添加され得る。ＴＩＬがＧ－Ｒｅｘ１００フラスコ中で連続的に増殖されるとき、７日目に、各Ｇ－Ｒｅｘ１００中のＴＩＬは、各フラスコ中に存在する３００ｍＬの培地中に懸濁され得、細胞懸濁液は、３つのＧ－Ｒｅｘ１００フラスコを播種するために使用され得る３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次いで、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各フラスコに添加され得る。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされ得、４日後、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコに添加され得る。細胞は、培養の１４日目に採取され得る。
一実施形態では、第２の増殖（ＲＥＰと称される増殖を含む）は、バルクＴＩＬが、１５０ｍｌの培地において、１００倍又は２００倍を超える不活化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコ内で実施される。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替的な成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の２／３は、新鮮な培地による呼吸作用によって交換される。いくつかの実施形態では、代替的な成長チャンバは、以下でより完全に論じられるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性コンテナを含む。
一実施形態では、第２の増殖（ＲＥＰと称される増殖を含む）が実施され、ＴＩＬが優れた腫瘍反応性のために選択されるステップを更に含む。当該技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８ Ａ１号に説明される方法は、優れた腫瘍反応性に対するＴＩＬの選択に使用され得る。
任意選択的に、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で公知の標準アッセイを使用して、第２の増殖（ＲＥＰ増殖と称される増殖を含む）の後に実施され得る。例えば、トリパンブルー排除アッセイが、死細胞を選択的に標識し、生存率評価を可能にする、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ試料が計数され、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動細胞カウンタ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して生存率が決定され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの第２の増殖（ＲＥＰと称される増殖を含む）は、上記に説明されるＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ Ｋ Ｑ，Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｄｕｒｆｌｉｎｇｅｒ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３１：７４２－７５１、及びＤｕｄｌｅｙ Ｍ Ｅ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ Ｊ Ｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ Ｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－３４２）又はガス透過性Ｇ－Ｒｅｘフラスコを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、フラスコを使用して実施される。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、ガス透過性Ｇ－Ｒｅｘフラスコを使用して実施される。いくつかの実施形態では、第２の増殖は、Ｔ－１７５フラスコ内で実施され、約１×１０６個のＴＩＬは、約１５０ｍＬの培地中に懸濁され、これは、各Ｔ－１７５フラスコに添加される。ＴＩＬは、１対１００の比率で、「フィーダー」細胞として照射された（５０Ｇｙ）同種ＰＢＭＣを用いて培養され、細胞を、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充された、ＣＭ及びＡＩＭ－Ｖ培地（５０／５０培地）の１対１の混合物で培養した。Ｔ－１７５フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、培地の半分は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して、５日目に交換される。いくつかの実施形態では、７日目において、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞は、３Ｌのバッグ内で組み合わせられ、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加される。各バッグ内の細胞数が毎日又は２日毎に計数され得、細胞数を約０．５～約２．０×１０６個の細胞／ｍＬに保つために新鮮な培地が添加され得る。
いくつかの実施形態では、第２の増殖（ＲＥＰと称される増殖を含む）は、１００ｃｍ２のガス透過性シリコンボトムを有する５００ｍＬの容量のフラスコ（Ｇ－Ｒｅｘ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）で実施され、約５×１０６個又は１０×１０６個のＴＩＬは、４００ｍＬの５０／５０培地中、１対１００の比率で、照射された同種ＰＢＭＣを用いて培養され、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充される。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離される。次いで、ＴＩＬペレットは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な５０／５０培地を用いて再懸濁され、元のＧ－Ｒｅｘ１００フラスコに再び添加され得る。ＴＩＬがＧ－Ｒｅｘ１００フラスコ中で連続的に増殖される実施形態では、７日目に、各Ｇ－Ｒｅｘ１００中のＴＩＬは、各フラスコ中に存在する３００ｍＬの培地中に懸濁され、細胞懸濁液は、３つのＧ－Ｒｅｘ１００フラスコを播種するために使用される３つの１００ｍＬアリコートに分割された。次いで、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各フラスコに添加される。Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコは、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートされ、４日後、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコに添加される。細胞は、培養の１４日目に採取される。
Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限定されるが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定常）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流用途を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を呈し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって得られるＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、第２の増殖で得られるＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／又はＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン重鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン軽鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現の増加が存在する。
いくつかの実施形態では、第２の増殖培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地とも称される）は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の増殖は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、ＴＩＬ増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０若しくはＧ－ＲＥＸ－１００、又は有利にはＷＯ２０１８／１３０８４５のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
一実施形態では、本明細書に説明される第２の増殖手順、及びＲＥＰと称される手順は、ＲＥＰ ＴＩＬ増殖中及び／又は第２の増殖中、過剰なフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健常血液ドナーからの標準的な全血単位から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準的な方法を使用して得られる。
一般に、同種ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかを介して不活性化され、ＲＥＰ手順で使用され、これは、照射同種ＰＢＭＣの複製不全を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１４日目の生存細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の増殖の０日目（すなわち、第２の増殖の開始日）に培養に入れられた初期生存細胞数未満である場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるＴＩＬ増殖手順における使用のために受け入れられる。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生存細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の増殖の０日目（すなわち、第２の増殖の開始日）に培養に入れられた初期生存細胞数から増加していない場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるＴＩＬ増殖手順における使用のために受け入れられる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生存細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の増殖の０日目（すなわち、第２の増殖の開始日）に培養に入れられた初期生存細胞数から増加していない場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるＴＩＬ増殖手順における使用のために受け入れられる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。一実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、１対５０と１対３００との間である。一実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬ対抗原提示フィーダー細胞の比率は、１対１００と１対２００との間である。
一実施形態では、本明細書に説明される第２の増殖手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞対約１００×１０６個のＴＩＬの比率を必要とする。別の実施形態では、本明細書に説明される第２の増殖手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞対約５０×１０６個のＴＩＬの比率を必要とする。更に別の実施形態では、本明細書に説明される第２の増殖手順は、約２５×１０６個のＴＩＬに対して約２．５×１０９個のフィーダー細胞を必要とする。
一実施形態では、本明細書に説明される第２の増殖手順は、第２の増殖中、過剰なフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健常血液ドナーからの標準的な全血単位から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準的な方法を使用して得られる。一実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が、ＰＢＭＣの代わりに使用される。
一般に、同種ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかを介して不活性化され、ＴＩＬ増殖手順で使用される。
一実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの交換として、又はＰＢＭＣとの組み合わせとして第２の増殖で使用される。
本明細書に説明される増殖方法は、概して、当該技術分野で公知のように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を有する培養培地を使用する。
あるいは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号に一般的に概説されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせで、ＴＩＬＳの急速増殖及び又は第２の増殖のためのサイトカインの組み合わせを使用することが、追加的に可能である。したがって、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、並びにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が挙げられ、後者は、多くの実施形態で特定の使用を見出す。サイトカインの組み合わせの使用は、特に、リンパ球、特にその中で説明されるＴ細胞の生成に好都合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明される増殖方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含む）はまた、抗ＣＤ３抗体も含む。ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３抗体は、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、完全長抗体、並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見られ、前者が概して好ましく、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５，１３５，１７１９を参照されたい。
当業者によって理解されるように、本発明における使用を見出すいくつかの好適な抗ヒトＣＤ３抗体が存在し、これは、限定されるものではないが、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ抗体を含む、様々な哺乳動物からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。特定の実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ、Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）。
第２の増殖ステップの後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の増殖ステップの後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、２つの増殖ステップの後に採取される。
ＴＩＬは、例えば、遠心分離によることを含む、任意の適切かつ滅菌された様式で採取され得る。ＴＩＬ採取のための方法は、当該技術分野で周知であり、任意のそのような公知の方法が本プロセスに用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動システムを使用して採取される。
細胞ハーベスター及び／又は細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースのハーベスターが、本方法で用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞ハーベスター及び／又は細胞処理システムは、膜ベースの細胞ハーベスターである。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造される）などの、細胞処理システムを介して行われる。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語はまた、滅菌及び／又は閉鎖系環境中のスピニング膜又はスピニングフィルタなどの膜又はフィルタを通して細胞を含む溶液をポンピングすることができ、ペレット化なしで上清又は細胞培養培地を除去するための連続的な流れ及び細胞処理を可能にする、任意の供給業者によって製造された任意の器具又はデバイスを指す。いくつかの実施形態では、細胞ハーベスター及び／又は細胞処理システムは、閉鎖滅菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施し得る。
いくつかの実施形態では、採取は、閉鎖系バイオリアクターから実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、ＴＩＬ増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０若しくはＧ－ＲＥＸ－１００、又は有利にはＷＯ２０１８／１３０８４５のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
細胞は、患者への投与で使用するためにコンテナに移される。いくつかの実施形態では、上記に説明される増殖方法を使用して治療上十分な数のＴＩＬが得られると、ＴＩＬは、患者への投与で使用するためにコンテナに移される。
一実施形態では、本開示のＡＰＣを使用して増殖されたＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して増殖されたＴＩＬは、当該技術分野で公知の任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは約３０～６０分持続する。他の好適な投与経路としては、腹腔内、くも膜下腔内、及びリンパ内が挙げられる。
一実施形態では、本開示の方法を使用して増殖されたＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して増殖されたＴＩＬは、当該技術分野で公知の任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは約３０～６０分持続する。他の好適な投与経路としては、腹腔内、くも膜下腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。
任意の好適な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与され、特に、がんが黒色腫である場合、平均で約７．８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約７．８×１０１０個のＴＩＬであり、特に、がんが黒色腫である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、６×１０６個、７×１０６個、８×１０６個、９×１０６個、１×１０７個、２×１０７個、３×１０７個、４×１０７個、５×１０７個、６×１０７個、７×１０７個、８×１０７個、９×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、５×１０８個、６×１０８個、７×１０８個、８×１０８個、９×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、３×１０９個、４×１０９個、５×１０９個、６×１０９個、７×１０９個、８×１０９個、９×１０９個、１×１０１０個、２×１０１０個、２×１０１０個、３×１０１０個、４×１０１０個、５×１０１０個、６×１０１０個、７×１０１０個、８×１０１０個、９×１０１０個、１×１０１１個、２×１０１１個、３×１０１１個、４×１０１１個、５×１０１１個、６×１０１１個、７×１０１１個、８×１０１１個、９×１０１１個、１×１０１２個、２×１０１２個、３×１０１２個、４×１０１２個、５×１０１２個、６×１０１２個、７×１０１２個、８×１０１２個、９×１０１２個、１×１０１３個、２×１０１３個、３×１０１３個、４×１０１３個、５×１０１３個、６×１０１３個、７×１０１３個、８×１０１３個、及び９×１０１３個である。一実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６個、５×１０６～１×１０７個、１×１０７～５×１０７個、５×１０７～１×１０８個、１×１０８～５×１０８個、５×１０８～１×１０９個、１×１０９～５×１０９個、５×１０９～１×１０１０個、１×１０１０～５×１０１０個、５×１０１０～１×１０１１個、５×１０１１～１×１０１２個、１×１０１２～５×１０１２個、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物のｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖにおいて、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、又は０．０００１％未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物のｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖにおいて、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％ １９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％ １８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％ １７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％ １６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％ １５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％ １４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％ １３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％ １２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％ １１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％ １０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％ ９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％ ８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％ ７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％ ６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％ ５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％超である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物のｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖにおいて、約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％、又は約１％～約１０％の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物のｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖにおいて、約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬは、幅広い用量範囲にわたって有効である。正確な用量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、並びに担当医の選好及び経験に依存することになる。ＴＩＬの臨床的に確立された用量もまた、適切な場合、使用され得る。ＴＩＬの用量などの本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、治療されるヒト又は哺乳動物、障害又は状態の重症度、投与速度、活性医薬品成分の性質、及び処方医師の裁量に依存することになる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば、静脈内注射によってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回以上であってもよい。用量は、月に１回、２週間に１回、週に１回、又は隔日でもよい。ＴＩＬの投与は、必要に応じた長さで継続することができる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、約１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、６×１０６個、７×１０６個、８×１０６個、９×１０６個、１×１０７個、２×１０７個、３×１０７個、４×１０７個、５×１０７個、６×１０７個、７×１０７個、８×１０７個、９×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、５×１０８個、６×１０８個、７×１０８個、８×１０８個、９×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、３×１０９個、４×１０９個、５×１０９個、６×１０９個、７×１０９個、８×１０９個、９×１０９個、１×１０１０個、２×１０１０個、３×１０１０個、４×１０１０個、５×１０１０個、６×１０１０個、７×１０１０個、８×１０１０個、９×１０１０個、１×１０１１個、２×１０１１個、３×１０１１個、４×１０１１個、５×１０１１個、６×１０１１個、７×１０１１個、８×１０１１個、９×１０１１個、１×１０１２個、２×１０１２個、３×１０１２個、４×１０１２個、５×１０１２個、６×１０１２個、７×１０１２個、８×１０１２個、９×１０１２個、１×１０１３個、２×１０１３個、３×１０１３個、４×１０１３個、５×１０１３個、６×１０１３個、７×１０１３個、８×１０１３個、及び９×１０１３個である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、１×１０６～５×１０６個、５×１０６～１×１０７個、１×１０７～５×１０７個、５×１０７～１×１０８個、１×１０８～５×１０８個、５×１０８～１×１０９個、１×１０９～５×１０９個、５×１０９～１×１０１０個、１×１０１０～５×１０１０個、５×１０１０～１×１０１１個、５×１０１１～１×１０１２個、１×１０１２～５×１０１２個、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
有効量のＴＩＬは、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所的、移植、又は吸入による、鼻腔内及び経皮経路を含む類似の有用性を有する薬剤の許容される投与モードのいずれかによって、単回又は複数回投与のいずれかで投与され得る。
本発明はまた、本発明のＴＩＬ、特にＵＴＩＬを使用する診断及び予後アッセイの実施に有用なキットも含む。本発明のキットは、緩衝液、サイトカイン、フラスコ、培地、産物コンテナ、試薬、及び説明書を含む。
腫瘍からのＴＩＬ成長、急速増殖プロセスのセットアップ、照射されたＰＢＭＣフィーダーが増殖していないことの確認、並びにＷＡＶＥバイオリアクター（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｕｓ／ｓｈｏｐ／ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ－ａｎｄ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ／ｒｏｃｋｉｎｇ－ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ／ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ－ａｎｄ－ａｃｃｅｓｓｏｒｉｅｓ／ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ－ｒｅａｄｙｔｏｐｒｏｃｅｓｓ－ｗａｖｅ－ｃｅｌｌｂａｇ－ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ－ｐ－００３４６＃ｏｖｅｒｖｉｅｗ）への静止培養物の移動、製剤化、及び充填をセットアップする非限定的な多段階実施形態が以下に提示される。
ステップ１（０日目）では、凍結保存脱凝集腫瘍組織が、解凍され、インラインの１００～２７０μｍフィルタを通る濾過、及び２０ｍＬの再懸濁前の５０ｍＬ遠心分離チューブ内の遠心分離前に、１０％のＦＢＳ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴ細胞培養培地中で１：９で再懸濁される。ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＣＤ５８＋、並びにＤＲＡＱ７－細胞の数を定量化するために、フローサイトメトリー解析ＳＯＰのために試料が採取される。
ステップ２では、次いで、細胞懸濁液が、細胞培養コンテナ内で、添加された抗微生物剤及び抗真菌剤（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ）並びにインターロイキン－２（ＩＬ－２）１０００ＩＵ／ｍＬを補充されたＣＭ－Ｔ（１０％ウシ胎児血清を補充されたＴ細胞培地）中に、≧０．２５×１０６～≦０．７５×１０６個のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＣＤ５８＋並びにＤＲＡＱ７－細胞／ｍＬで播種される。Ｔ細胞は、５日目からＣＭ－Ｔで２週間にわたって成長させられ、培地の半分が除去され、１０％ウシ胎児血清、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ、並びにＩＬ－２を補充された新鮮な培地ＣＭ－Ｔで交換される。これは、細胞が≦０．１ｘ１０６～２ｘ１０６個のＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ｖｅ ＤＲＡＱ７－ｖｅ細胞／ｍＬで維持されることを確保するために、５日目～１０日目に２／３日毎に繰り返される。ＰＨ Ｅｕｒ ２．６．２７によるＴＩＬ培養上清の微生物試験（５～７日目）は、微生物成長がないことを確認する。フローサイトメトリー解析（７～１０日目）は、ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞の濃度を定量化する。
ステップ３では、複数の同種ドナー（健常血液提供に由来するバフィーコート）からのＦｉｃｏｌｌ（密度１．０７８ｇ／ｍｌ）を用いて、４×１０９個の照射されたＰＢＭＣ（２５～５０Ｇｙ）を単離する。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ４５＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞を定量化する。照射されたＰＢＭＣの微生物試験は、微生物成長を決定する。
ステップ４では、急速増殖プロセスの開始に利用可能なＴＩＬの量が定量化される（１２日目）。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞を定量化する。
ステップ５では、フィーダーの培養混合物（照射されたｆｉｃｏｌｌ単離されたＰＢＭＣ）が調製され、閉鎖された静止細胞培養バッグ内で、≧３～≦５×１０９個の照射されたＰＢＭＣ－ＣＤ４５＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞、７～９％ヒトＡＢ血清、２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、並びに２０～４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３抗体を含有する３ＬのＴ細胞混合培地中でサプリメントで成長させられる。
ステップ６では、ＴＩＬを添加する前に、フィーダーの培養混合物（照射されたｆｉｃｏｌｌ単離されたＰＢＭＣ）の代表的な試料が、対照フラスコのために採取される。
ステップ７では、ＴＩＬがＲＥＰ培養物に添加される：≧１～≦２０ｘ１０６個の腫瘍由来ＴＩＬ－ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞。
ステップ８では、静止培養物が、乾燥インキュベーター中で、３．５～６％の二酸化炭素を用いて、３５～３８．５℃で６日間インキュベートされる。ＣＤ４５＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞の数及び生存率は、１４日目及び１８日目に、ＴＩＬなしのＲＥＰ混合物を含有する対照フラスコ（ステップ６で収集）で評価されて、照射されたフィーダーが増殖していないことを確認する。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ４５＋ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－、及びＤＲＡＱ７－細胞を定量化する。
ステップ９では、ＷＡＶＥバイオリアクターバッグが、３５～３８．５℃、３．５～６％の二酸化炭素、１．７ＬのＴＣＭで、１～２時間プレコンディショニングされ、ＴＣＭは、７－９％ヒトＡＢ血清及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されている。
ステップ１０では、ＴＩＬは、ＷＡＶＥバイオリアクターシステムに移され、増殖される。
ステップ１１では、２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充された灌流フィード１×ＴＣＭ １０Ｌバッグが接続される。
ステップ１２（１９～２２日目）では、１９日目～２２日目に灌流速度が調整される。
ステップ１３（２４日目）では、灌流が停止され、廃棄物及びフィードが接続解除される。
ステップ１４では、ＴＩＬが濃縮され、洗浄される。
ステップ１５では、最終製剤は、総容量範囲１２５～２７０ｍＬの輸血バッグ中に、１０％のＤＭＳＯ及び８．５％のＨＳＡを含有するＰＢＳ中に懸濁された細胞で作製される。
ステップ１６では、ＴＩＬを含有する最終産物バッグの試料が、ＱＣアッセイ及び保持試料のために取得される。新鮮な医薬品のＱＣアッセイとしては、微生物試験、並びに色及び可視粒子試験が挙げられる。保持試料は、細胞用量、生存率表現型及び効力、微生物試験及びエンドトキシン解析のために調製される。
ステップ１７では、最終産物コンテナが標識され、最終産物標識と重ね合わせられる。
ステップ１８では、－１℃／分～－６０℃でコントロールレート凍結による凍結保存、及び≦－１３０℃の保存への移送が存在する。凍結保存医薬品に対するＱＣアッセイとしては、抗ＣＤ３断片を発現する細胞株との共培養後のＣＤ１３７＋、ＩＦＮ－γ＋、ＴＮＦα＋、又はＣＤ１０７ａ＋の組み合わせについて、ＣＤ２＋発現ＣＤ４５＋ ＤＲＡＱ７－を評価するために、ｑＰＣＲによるマイコプラズマ試験、Ｔ細胞用量及び生存率試験、動態発色ＬＡＬ試験及び効力試験を使用して測定されるエンドトキシン試験が挙げられる。
本発明は、脱凝集システム又はデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、脱凝集デバイスは、個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイスの形態である。いくつかの実施形態では、脱凝集デバイスは、脱凝集プロセス中に熱制御を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存システム又はデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、脱凝集及び凍結保存のためのデバイスが提供され、熱制御が提供される。別の態様では、本発明は、１つ以上の可撓性コンテナ、又は本発明の脱凝集／凍結保存システム若しくはデバイスにおいて、脱凝集、凍結保存、若しくは脱凝集及び凍結保存の両方に適合された１つ以上の可撓性コンテナを含む複数のコンテナを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のコンテナ又は複数のコンテナは、相互接続され、閉鎖系における使用に好適である。上述の態様は、本明細書に添付される特許請求の範囲に表される。本発明の例を提供する以下の詳細な説明を考慮して、本発明のより多くの利点及び利益が、当業者に容易に明らかになるであろう。
特定の実施形態では、脱凝集装置は、１つ以上の可動表面、例えば、プレート及び／又はパドルを含み、組織試料に圧縮及びせん断力を加えるように設計される。一実施形態では、消化装置は、互いに移動することができる第１の表面及び第２の表面を含む。特定の実施形態では、表面は、試料に圧力を加えるように配設される対向する表面である。一実施形態では、表面のうちの少なくとも１つは、試料に圧力を加えるように、表面の方向に対して垂直な方向に移動される。一実施形態では、表面は、平行に整列され、試料が繰り返し圧縮され、次いで、表面間で周期的様式で弛緩されるように、繰り返し又は周期的様式で一緒に及び離れて移動するように設計される。本発明の実施形態では、試料の圧縮及び弛緩は、試料中のせん断力を結果的にもたらす。
一実施形態では、第１及び第２の表面のうちの１つは、他の表面が移動されている間、静止状態に保持される。別の実施形態では、第１及び第２の表面の両方が移動する。一実施形態では、組織試料は、組織試料、及び任意選択的に脱凝集流体又は溶液を収容する可撓性及び／又は弾性コンテナに収容される。特定の実施形態では、コンテナは、表面が移動する際に、第１の表面と第２の表面との間の体積の変化に対応する。特定の実施形態では、コンテナは、弾性であり、組織試料及び対向する表面の範囲内の脱凝集流体を閉じ込める。特定の実施形態では、コンテナは、可撓性であり、周囲の気圧は、対向する表面の範囲内の組織試料及び脱凝集流体の閉じ込めを支援する。特定の実施形態では、気圧は、大気圧である。特定の実施形態では、気圧は、包囲チャンバ内で加えられ、圧力は、周囲よりも大きい。
特定の実施形態では、脱凝集デバイスは、並んで配設された、対向する表面の２つ以上のセットを含む。いくつかのそのような実施形態では、１つの表面は、セットに共通であり、例えば、任意選択的に保持された単一のプレートであるが、一方、各セットの第２の表面は、並んで位置し、静止プレートに対して圧力を加える。第２の表面は、トレッディング運動で交互に圧力を加え得る。特定のそのような実施形態では、組織試料及び脱凝集流体を静止表面と移動表面との間の空間内に閉じ込めるが、一方で、コンテナの内容物が移動表面の間で前後に流れることを可能にする、可撓性コンテナが用いられる。特定の実施形態では、コンテナは、内容物のそのような前後の動きを制限又は防止するように適合される。一実施形態では、コンテナを横切る封止は、一方側から他方側への内容物の流れを遮断する。一実施形態では、コンテナを横切るバッフルは、一方側から他方側への内容物の流れを制限する。
トレッディング表面は、任意の適切な機構によって作動され得る。デバイス１００として、本明細書では、可撓性コンテナに対してトレッディング表面を交互に移動させるように設計された横方向バーシステムの一例が開示される。トレッディング表面は、ばね付きであり、ばねは、コンテナの厚さの変化及びコンテナ内の粒子サイズの変化を可能にしながら、コンテナに対してトレッディング表面を押し付けるように設計されている。特定の実施形態では、ばねは、予荷重される。また、デバイス２００として、本明細書では、２つのトレッディング表面を特徴とするカム作動設計の例が開示される。デバイス２００では、予荷重されたばねは、可撓性コンテナに対してトレッディング表面を押し、カム機構は、一方のトレッディング表面を周期的に上昇させ、次いで、他方を可撓性コンテナから遠ざける。別の実施形態では、１つ以上のロッカーアーム又はレバーが、コンテナからトレッディング表面を持ち上げるために用いられる。更に別の実施形態では、トレッディング表面は、油圧で上下する。更に別の実施形態では、トレッディング表面は、空気圧で上下する。２００デバイスでは、脱凝集コンテナに交互に接触する２つのトレッディング表面が存在するが、特定の実施形態では、作動機構は、システムが静止しているときを含めて、移動表面の全てが同時に圧力を加えることを可能にする。そのような特徴は、脱凝集プロセスの最後に、脱凝集コンテナの内容物を空にするのに有用である。例えば、中間位置に位置するか、又は１つが上昇し、かつ１つが下降するトレッディング表面の代わりに、トレッディング表面の全てが脱凝集コンテナに対して下降し、付着したチューブを通してその内容物を、任意選択的に濾過して、二次受容コンテナ、例えば、凍結保存コンテナに絞り出す。
本明細書に例示される完全閉鎖脱凝集及び凍結保存システムでは、特徴付けられた自動脱凝集、続いて、手動濾過、並びにシリンジ及びチューブの封止された系による、凍結保存コンテナ及び自動凍結保存への移送が存在する。有利には、脱凝集腫瘍組織は、脱凝集コンテナから凍結保存コンテナに手動で移送されるが、脱凝集及び凍結保存ステップは、両方のステップを順次管理するようにプログラムされた同じ自動デバイスによって実施される。他の実施形態では、脱凝集手順は、終結時に、脱凝集腫瘍組織が脱凝集コンテナから凍結保存コンテナに自動的に移動されるように設計される。特定の実施形態では、接続管に接触する蠕動ポンプ及び弁は、内容物の流れを制御する。特定の実施形態では、脱凝集装置のトレッディング表面は、脱凝集コンテナから脱凝集腫瘍溶液を、任意選択的にフィルタを通じて、凍結保存コンテナ、内容物の流れを制御する弁に押出すか、又は絞り出すように配設される。そのような実施形態では、閉鎖系における材料の任意の移送とともに、脱凝集及び凍結保存が、本明細書に例示されるのと同じデバイスによって制御及び実施されることが好ましい。
いくつかの脱凝集システムは、力、消化時間、及び速度（ＲＰＭ又はサイクル／分）を含む変数に関して試験され、最適化されている。最大６０Ｎ及びそれを上回る力、最大６０分及びそれを上回る消化時間、並びに最大２４０ＲＰＭ及びそれを上回る速度を含む、力、時間、及び速度の変数の組み合わせについて、いくつかの組織タイプを使用した結果及び推定が決定される。本発明の特定の実施形態では、力は、２０～１００Ｎ、又は３０～８０Ｎ、又は４０～６０Ｎ、又は１０～２０Ｎ、又は２０～３０Ｎ、又は３０～４０Ｎ、又は４０～５０Ｎ、又は４０～４５Ｎ、又は４５～５０Ｎ、又は５０～５５Ｎ、又は５５～６０Ｎ、又は６０～６５Ｎ、又は６５～７０Ｎ、又は７０～７５Ｎ、又は７５～８０Ｎである。典型的なトレッディング足は、約２０～５０ｃｍ２の表面積を有する。３０ｃｍ２のトレッディング表面に基づいて、トレッディング圧力は、０．５～６．５Ｎ／ｃｍ２、又は１～４Ｎ／ｃｍ２、又は１～３Ｎ／ｃｍ２、又は１～２Ｎ／ｃｍ２、又は１．５～２．５Ｎ／ｃｍ２、又は２～３Ｎ／ｃｍ２、又は２．５～３．５Ｎ／ｃｍ２、又は１．５Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２、又は２Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２、又は２．５Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２、又は３Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２、又は４Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２、又は５Ｎ／ｃｍ２±０．５Ｎ／ｃｍ２である。公称圧力が、圧力センサを使用して測定され得、好ましくは、脱凝集コンテナの厚さを補正する。特定の実施形態では、脱凝集デバイスは、圧力センサを組み込む。本発明の特定の実施形態では、消化時間は、９０分以下、又は７５分以下、又は６０分以下、又は５０分以下、又は５～１２０分、又は１５～１００分、又は３０～９０分、又は４０～６０分、又は５～１０分、又は１０～２０分、又は２０～３０分、又は３０～４０分、又は４０～４５分、又は４５～５０分、又は５０～６０分、又は６０～６５分、又は６５～７０分、又は４０分±５分、又は４５分±５分、又は５０分±５分、又は５５分±５分、又は６０分±５分、又は６５分±５分、又は７０分±５分である。特定の実施形態では、脱凝集デバイスが、６０～３６０ＲＰＭ、又は１２０～３４０ＲＰＭ、又は１８０～３００ＲＰＭ、又は２１０～２７０ＲＰＭ、又は８０～１６０ＲＰＭ、又は１２０～２００ＲＰＭ、又は１６０～２４０ＲＰＭ、又は２００～２８０ＲＰＭ、又は２４０～３２０ＲＰＭ、又は２８０～３６０ＲＰＭ、又は６０ＲＰＭ±２０ ＲＰＭ、又は８０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は１００ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は１２０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は１４０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は１６０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は１８０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は２００ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は２２０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は２４０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は２６０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は２８０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は３００ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は３２０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は３４０ＲＰＭ±２０ＲＰＭ、又は３６０ＲＰＭ±２０ＲＰＭで動作する。
特定の実施形態では、物理的脱凝集は、連続的である。特定の実施形態では、物理的脱凝集は、定期的又は一時的である。例えば、温度上昇が脱凝集試料で観察される場合、温度上昇を低減若しくは防止するか、又は温度が設定点に平衡化することを可能にするために、物理的脱凝集を一時的に減速又は停止することが有利であり得る。理論に拘束されるものではないが、温度上昇は、脱凝集デバイスによる試料の物理的操作、デバイスの能動的トレッディング機構からの熱伝達、脱凝集プロセスが有効である間、試料から冷凍ユニットへの低減された物理的接触又は熱伝達、又は他の理由を通じて発生し得る。特定の実施形態では、定期的又は一時的な脱凝集は、脱凝集デバイスに有益であり得る。本明細書に開示されるカム駆動デバイスでは、カム機構の寿命は、カム回転の方向を随時定期的に逆転させることによって改善され得、したがって、カムの両側に摩耗を分散させることによってカムの寿命を延長する。本発明の実施形態では、物理的脱凝集の活性期間は、限定なしで、１５～３０秒、２０～４０秒、３０～６０秒、４５～７５秒、６０～９０秒、少なくとも２０秒、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも１分、少なくとも１．５分、又は少なくとも２分を含む。非活性の持続時間は、限定なしで、１～１０秒、１０～２０秒、２０～３０秒、３０～４０秒、４０～６０秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、６０秒、９０秒、１２０秒、又はその間の持続時間であり得る。非活性の持続時間は、脱凝集デバイスが方向を逆転するために必要な程度に短くてもよい。
いくつかの実施形態では、表面は、互いに対して横方向に移動するように配設された対向する表面である。特定のそのような実施形態では、横方向運動は、直線の横方向運動を含む。特定のそのような実施形態では、横方向運動は、環状の横方向運動を含む。特定の実施形態では、直線及び環状の横方向運動の両方が存在する。
一実施形態では、対向する表面は、平坦である。一実施形態では、表面のうちの少なくとも１つは、凸状領域を含み、他の表面に対して揺動運動で移動されるように配設される。凸状表面及び揺動運動の一態様は、蠕動様作用を提供することである。
本発明によると、表面の移動は制御され、そのような制御は、限定されるものではないが、速度、試料圧縮、システム圧力、持続時間、及びサイクル頻度を含む、表面移動の１つ以上の態様の制御を含む。特定の実施形態では、プレート移動の１つ以上の態様は、一定である。特定の実施形態では、プレート移動の１つ以上の態様は、脱凝集の状態に依存する。特定の実施形態では、脱凝集の状態は、例えば、時間、分、及び秒で測定される早期、中期、後期、又はより精密な時間などの、１つ以上の所定の段階などの、脱凝集手順の時間によって定義される。特定の実施形態では、脱凝集の状態は、腫瘍片のサイズ分布によって定義される。例えば、本発明の実施形態では、圧力は、腫瘍片のサイズが低減するにつれて増加する。
脱凝集デバイスの例及び代替例
図４１を参照すると、閉鎖され、かつ少なくとも初期に無菌の略平坦で比較的薄い試料コンテナバッグ１０内の個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイス１００が示されている。デバイスは、例えば、Ｖｉａ Ｆｒｅｅｚｅ（商標）として知られる市販の冷凍庫、又は図４１に概略的に示され、概して冷凍庫４０として本明細書に説明される、温度のコントロールレート変化を提供する、コントロールレート温度変化冷凍庫、解凍器、又は加温器などの、温度制御されたデバイスに取り外し可能に挿入され得る部品のアセンブリから形成されたハウジング１１０を含む。実際には、ハウジングは、例示されていないカバーを含むことになる。使用において、デバイス及びバッグは、組織、例えば、切除腫瘍、切除腫瘍の一部、又は針生検などを脱凝集し、次いで、バッグ１０から脱凝集試料を移す必要性なしで、その後の解析のために結果的に得られた細胞懸濁液を凍結保存するために、閉鎖系を提供する。
ハウジング１１０は、１０～３００ｒｐｍの出力速度を有する電動モータ及びギヤボックスを含むモータユニット１１４を取り付けられるシャーシ１１２を有する。モータ及びギヤボックス１１４の出力シャフトは、結果的にトレッディング機構１２０に枢動可能に接続される接続ロッド１１８を駆動するクランク１１６を有し、クランク１１６の各回転毎に１回のトレッディングサイクルを通じて移動することになり、すなわち、トレッディングサイクルは、０．２～６秒である。より詳細には、このトレッディング機構は、２つの対向する平行な水平バー１２６及び１２８をそれぞれ枢動可能に装着するシャーシ１１２に堅固に装着された２つの離隔された枢動点１２２及び１２４を含む、平行四辺形の４つのバーリンケージを有する。水平バーの各々は、２つの平行なトレッディングバー１３０及び１３２を有し、枢動点１２２及び１２４の各側の１つが枢動可能に連結され、一緒に平行四辺形のリンケージを形成する。接続ロッド１１８は、上部水平バーの延長部に簡便に枢動可能に保持され、それにより、その延長部の移動が、トレッディングバー１３０及び１３２の周期的上下運動（示される配向の）を引き起こす。各トレッディングバー１３０及び１３２には、足アセンブリ１３４及び１３６が接続されており、上述の周期的運動によって、順次の様式で、クランク１１６の運動とともに上下に移動することになり、すなわち、一方の足が上昇するとき、他方が下降することになり、その逆も同様である。
足アセンブリ１３４及び１３６は、各々、平坦に面するソールプレート１３８及び１４０を含み、各プレートは、それぞれ、コイル状の金属ばね１４６によって、上部足フレーム１４２及び１４４にばね装着されている。上記に説明される配置、又は使用される場合、同等の配置では、ばね１４６は、予荷重される。この場合、合わせた予荷重は、各足に対して、好ましくは４０～８０Ｎ、より好ましくは３０～７０Ｎ、好ましくは約６０Ｎである。合わせたばね速度は、移動１ｍｍ当たり１～５Ｎ、好ましくは、約３Ｎ／ｍｍであり、意図される足の移動は、約８～１２ｍｍ、好ましくは、約１０ｍｍである。加えて、各足の表面積は、約２０～５０ｃｍ２、好ましくは約３５ｃｍ２であることが意図される。これは、ゼロ（足がバッグから持ち上げられるか、又は実質的に荷重がないとき）～最大約６Ｎ／ｃｍ２（約９ｐｓｉ）のバッグに対する想定圧力を結果的にもたらす。好ましい想定圧力は、約２Ｎ／ｃｍ２（約３ｐｓｉ）である。しかしながら、バッグが、少なくともトレッディングプロセスの開始時に、均質な材料を含有しない場合があることを考慮すると、加えられた力が週通することになる材料の塊が存在することになり、そのため、圧力は、例えば、トレッディングプロセスの終了に向かって及ぼされるバッグ１０の最小限の圧力抵抗を提供するために理想的な状況である「想定」として説明される。
シャーシの底部には、可撓性バッグ１０のための受容エリア１４８があり、受容エリア１４８に隣接しているのは、熱伝達プレート１５０である。エリア１４８は、シャーシの前面（図４１に示される前面）を介して、プレート１５０上に試料処理バッグ１０が摺動可能な余地があるように十分な大きさである。プレートは、バッグ１０が位置する上面１５１と、使用時に外部から影響を受ける加熱又は冷却に対して露出される下面１５２と、を含む。上面１５１は、各足のソールプレート１３８及び１４０と略平行であり、その結果、ソールプレートは、表面１５１と略平行に移動する。別の言い方をすると、平坦なソールプレートは、表面１５１に対して略垂直方向に移動し、これは、機構１２０上の顕著な横力を防止する。プレート１５０は、金属、好ましくはアルミニウム、銅、金若しくは銀、又はそれらの金属を含有する合金から形成される。熱コンダクタンスは、好ましくは１００を上回り、より好ましくは２０℃で測定される２００Ｗ／ｍ Ｋを上回る。プレート１５０の材料の厚さは、約３ｍｍ以下であり、低熱量を提供し、したがって、プレートの反対側の温度変化に追従するようにバッグ１０の内容物のより迅速な反応を提供する。
更に図４２及び図４３を参照すると、デバイスは、矢印Ｃによって示されるように、この例では時計回りに、モータユニット１１４に電流を供給して、クランク１１６を駆動することによって動作する。クランクは、接続ロッド１１８に、上記に説明されたトレッディング機構１２０を動作させる。機構１２０に最大の力が加えられる、クランクのストロークの上部及び底部は、各足アセンブリ１３４及び１３６の最下部の位置と一致することに留意されたい。足アセンブリは、矢印Ｕ及びＤの方向に上下に移動して、試料バッグ１０を順次揉み込み、その結果、バッグ１０の内容物は、それぞれのトレッディング足から離れて一方側に移動する機会を有する。バッグ内の潜在的固形組織試料が、トレッディング足から離れて移動し得るため、かつ各足のソールプレート１３８及び１４０がばねで荷重されており、足がそのストロークの底部にあるときでも、足への追加的な弾性移動の余裕があるため、より大きい組織塊が脱凝集されることが意図されるときに、機構が動かなくなる可能性が低い。順次のトレッディング動作はまた、バッグ１０の破裂の可能性を低減する。
図４４は、上記に説明されたデバイス１００の平面図であるが、この図では、バッグ１０は定位置にない。特に、離隔され、かつ平面で見た集合エリアを有する足アセンブリ１３４及び１３６の相対的に並んだ位置が見られ、このエリアは、平坦に置かれたときにバッグ１０のエリアとほぼ等しいが、バッグ１０のエリアのプラス又はマイナス約１０％のエリアにおける差異は、有用性を有する。
図４５は、上記に説明されたデバイス１００と構成が類似しているデバイス１００’の別の平面図を示すが、この代替例では、モータユニット１１４のモータ１１３は、モータ１１３がデバイス１００’の後壁１１１を越えて突出しないように、９０度ギヤボックス１１５の使用によって、そのギヤボックス１１５の出力シャフトに対して横方向に配置される。したがって、このデバイス１００’は、必要に応じて、より小さい冷凍庫容積に収まり得る。
上述の脱凝集処理の間、足アセンブリ１３４及び１３６によって及ぼされる力は、熱伝達プレート１５０によって反応される。これは、試料バッグ１０が、処理中にプレート１５０の接触表面１５１に対して押し付けられ、試料バッグ１０とプレートの表面１５１との間に良好な表面接触を提供し、結果として改善された熱エネルギー伝達を提供することを意味する。
図４６、図４７、及び図４８は、上述の可撓性試料バッグ１０の異なる実施形態を示す。使用中のバッグは、デバイス１００又は１００’の受容エリア１４８内で所定の位置に摺動され、上述された２つの足１３４及び１３６の下に位置する。したがって、バッグは、約１２ｍｍの厚さの略平坦な構造を有し、その中に組織試料を収めるように、ある程度の追加の順応性を有する。図４６から分かるように、バッグ１０の１つの構造は、外周部１４のみで封止されたプラスチック材料の２つの層から形成されて、中央空洞１２、及び空洞１２へのアクセスのためのポート１６を形成するように示されている。バッグは、ＥＶＡから形成され得る。使用時に、ポート１６、又はそれらのうちの少なくとも１つは、必要に応じて小片に刻まれ、かつシリンジによってバッグ空洞１２内に通過した試料を受け入れるのに十分な大きさ、すなわち、直径約１０ｍｍ以上であることが好ましい。しかしながら、大きい組織試料がバッグに入れられ得、かつバッグが再封止されるように、ポートの反対側のバッグの端にいわゆる「ジップロック（登録商標）」アクセスを含めることもできる。「ジップロック（登録商標）」は、継目を作製するために、１回以上にわたって折り畳まれ、弾性チャネルの内側に折り畳まれるか、又は別のクランプ（図示せず）によって保持されて、漏出の可能性を低減し得る。バッグ１０は、代替として、開放され得、組織が添加され得る。次いで、バッグは、その内容物が定位置にある状態でヒートシールされ得る。バッグ１０は、使用中のデバイス内のバッグを位置決めし、それを、トレッディング中に定位置に保持するための、カム開口１８を含む。図面は、１つの空洞１２を有するバッグ１０を示すが、２つ以上の空洞、例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つの空洞を有するバッグを提供することも可能であり、例えば、複数の空洞の各々が、細長く、初期に開放されたヒートシール可能な端と、その他端に脱凝集酵素などの試薬の導入のための、かつ脱凝集が完了又は実質的に完了すると、脱凝集試料を回収するための封止可能なポートと、を有する。
図４７は、カム開口１８内に収まるフレーム上のペグ２４によって位置決めフレーム２０内に装着された図４６のバッグ１０を示す。フレーム２０は、デバイス１００／１００’内でバッグ１０を定位置に位置決めして保持する代替的な方式である。フレーム２０は、トレッディング中にバッグを定位置に位置決めして保持するためにデバイスと協働する位置決め孔２２を含む。フレームは、滑らかに丸みを帯びた内側縁２３を有する内側開放窓２６を有し、使用時に空洞１２並びにトレッディング足１３４及び１３６を収容する。フレーム２０は、デバイス１００／１００’へのバッグ１０の装填及びそれらからの取り出しを容易にする。
図４８は、２つの略対称的な半分を有する代替的なフレーム２０’を示し、各半分がフレーム２０の構造と類似している。各フレーム半分は、フレーム２０’に成形された可撓性シェル３０を追加的に有し、それにより、２つの半分が、バッグ１０を包む二枚貝の殻のように一緒になる。上部及び底部の可撓性シェルは、バッグ１０の内側が使用時に破裂した場合に、堤防として作用する。この特徴は、感染性組織試料にとって特に有用である。
図示しない更に別の代替例では、単純なバッグインバッグ配置が、漏出を収容するように用いられ得る。更に別の代替例では、バッグは、例えば、以下に説明されるように凍結後、試料全体を使用せずに試料のアリコートを除去され得るように、弾性の（少なくとも室温で）別個のウェルを有する基部を含み得る。あるいは、封止可能なバッグは、試料の分離を可能にするために、複数の部分に更にヒートシールされ得る。
バッグ１０に入れられた試料の処理は、一例では、ＷＯ２０１８／１３０８４５に説明されるステップに主に従い得る。この配置では、組織を収容する封止バッグＴＯは、ポート１６を介してバッグ内に導入される組織の分解を加速するために、コラゲナーゼ及びプロテアーゼなどの消化酵素を含有し得る水溶液中に懸濁される。ここで、バッグが、プレート１５０上に配置され、例えば、外部熱源から約３５°Ｇに加温されて、組織消化速度を加速する。本明細書で提案される１つの重要な差異は、単一の試料処理バッグが用いられ、消化酵素は、脱凝集前又は脱凝集中にバッグ内のポート１６のうちの１つを通して導入され得ることである。熱伝達プレート１５０は、その下側でプレートを加熱して、酵素作用のためのバッグ内で所望の温度を提供することによって、熱エネルギーをバッグ内に導入するために使用され得る。その熱は、電気的に加熱された加温プレート、又はプレート１５０の中又は上における電気加熱要素から好都合にもたらされ得る。脱凝集作用の量は、多くのパラメータ、例えば、初期組織試料のサイズ、密度、及び弾性に依存することになり、それゆえ、脱凝集のための時間及びトレッディング速度は、顕著に変動することになる。長過ぎる、又は過度に激しいトレッディングは、細胞生存率の低下につながり得る。したがって、モータユニット速度及び脱凝集周期が重要である。この問題に対処する１つの選択肢は、類似の試料を脱凝集するために必要な時間及び出力速度を含むルックアップテーブルに従って処理を時間調整することである。別の選択肢は、脱凝集処理を実施するのに必要な経時的な瞬時電力又は電気エネルギーを測定すること、又はプレート１５０若しくは機構の別の部品に及ぼされる力若しくは応力を測定すること、及び所定の閾値に到達した後に停止して、試料が十分に脱凝集されたことを示すことである。電力／力／応力が低減するほど、脱凝集が完了に近い。別の選択肢は、バッグを通して光吸光度を測定することであり、吸光度が大きいほど、試料が脱凝集を完了するのに近い。脱凝集が完了すると、バッグの内容物が移送され得、細胞又は他の関心対象の構築物が分離され、デバイス１００／１００’内で凍結するために新鮮なバッグに戻され得る。あるいは、かつ好ましくは、脱凝集材料全体が、凍結するためにバッグ及びデバイス内に残され得る。抗凍結剤は、ポート１６を通してバッグ内に導入される。
本方法とＷＯ２０１８／１３０８４５に説明される方法との間の別の差異は、抗凍結剤が導入されると、バッグ内に脱凝集試料及び抗凍結剤を含むデバイスがデバイスに装着され（又は留まり）、デバイス全体が上記のように冷凍庫４０内に装着される。冷凍庫の基部は低温であり、そのため、熱伝達プレート１５０を介してバッグ１０から熱エネルギーを取り出す。氷の形成を制御し、バッグが冷却されている間の試料の過冷却を防止するために、バッグは、脱凝集よりも遅い速度ではあるが、上記に説明された様式で、足１３４及び１３６によって揉み込まれて、氷核形成を制御し、それにより、解凍後の細胞の生存率を高める。電気エネルギーは、冷凍庫、例えば、冷凍庫４０（図４１）の内側の機構１２０の運動を維持するように、ワイヤコンダクタを介してモータユニット１１４に供給され得る。
デバイスが冷凍庫から除去可能であるため、使用後の清浄化がより容易になる。
使用に必要とされるとき、バッグ１０内の凍結した脱凝集試料は、プレート１５０の更なる外部加熱によって、及び／又は約３７℃に維持された加温水浴にデバイス１００／１００’を部分的に浸漬することによって、デバイス１００／１００’内で急速に解凍され得、抗凍結剤が除去される。各場合で、バッグは、解凍中に揉み込まれ得る。酵素が依然として存在する場合、それらは、必要に応じて、例えば、濾過によって、除去され得る。一般的に、酵素は、低温でその作用が停止されるため、凍結保存中に細胞にほとんど又は全く影響しなかったことになる。全てのプロセス操作、加温、脱凝集、冷却、凍結、及びその後の解凍は、同じ封止された可撓性バッグ１０内の試料で行われ、単一のデバイスで実施され得る。これは、時間及び空間の効率性のみならず、単一のレコードが、プロセス、例えば、温度、持続時間、脱凝集速度、凍結プロトコル中に試料に起こった全ての事を補足することを可能にし、処理機械間で制御されていない環境で試料があまりにも多くの時間を費やすなどのエラーの機会を低減する。
組織試料処理及び凍結に使用される装置及び技術のより具体的な例が以下に与えられる。
図４９は、ＥＶＡ又はＰＶＧフィルムなどの熱可塑性材料から形成され、組織試料Ｔを受け入れるための開口部１１を有する、バッグ１０の例を示す。バッグは、１つ以上の分岐１７、圧縮弁１９、及び標準的なルアータイプコネクタ１５を含む１つ以上のポート１６（図４６）に取り付けられたチューブ１３を含む。示される単一のチューブラインは、単に例示に過ぎず、バッグ１０は、複数のポート１６を介して接続される追加の平行チューブを含み得る。
組織Ｔがバッグ１０の内側にあると、開口部１１は、図５０で閉鎖及び封止されて示され、同じ図に一点鎖線で開放されて示される機械クランプ封止９によって、及び／又は図５１ａに示されるヒートシール機械５０を使用するヒートシールによって封止されて、ヒートシールされた閉鎖片（例えば、複数の平行片）８を生成し得、各方法は、封止空洞１２を形成する（図４６、図４７、及び図４９）。
バッグ１０を封止するための代替的又は追加的手段が図５１ｂ及び図５１ｃに示される。図５１ｃに示されるように、封止８におけるヒートシール後のバッグ１０は、一対のねじ６６によって一緒に強制される上部バー６２及び底部バー６４を含む、２部品クランプ６０内でクランプされ得る。図５１ｂは、分解状態にあるクラップ６０を示すが、使用時に、ねじ６６は、バッグ１０の挿入前に残りのクランプから完全に取り外される必要はない。上部バー６２は、クランプされたときに相補的なくさび形状の形成部６１が位置するテーパ状の凹部６８を有する。凹部及びくさびは、くさび６５の頂点でクランプ力を集中させ、平坦なクランプ面によって達成され得るよりも高いクランプ力を頂点で提供する。更により多くのクランプ力について、頂点６５は、その頂上に小さいチャネル６７を有し、これは、上部バーにおいて、相補的な隆起形成部６９によって使用時に合致される。特定の実施形態では、力は、ヒートシール８の必要性を否定するのに十分である。特定の実施形態では、ヒートシール又は他のバッグ封止機構は、例えば、脱凝集装置の外側の試料含有バッグの取り扱いを提供するために望ましい。特定の実施形態では、クランプデバイスは、封止の完全性を確保する。クランプ力は、容易に曲がらない上部及び底部バーの厚さ及び剛性によって更に増強され、そのため、ねじ６６によって及ぼされるクランプ力を維持する。図５１ｃは、クランプ状態にあるクランプ６０を示す。突出部６３は、トレッディングデバイス１００／１００’又は２００の特徴と合致して（以下に説明されるように）、クランプの動き、結果としてトレッディング中のクランプされたバッグ１０の動きを阻害する。クランプ６０の外周及び高さは、試料受容エリア１４８（又は２４８ 図６２及び以下の項目）の相補的な部位に収まるサイズ及び形状であり、そのため、トレッディング中にクランプされたバッグ１０の更なる場所を提供する。例示されていないが、クランプ６０は、図４７及び図４８に示されるように、追加のフレーム２０、２０’も組み込み得、それにより、クランプは、フレームの一端に堅固に装着され、ポート１６（図４６及び図４９）がフレームの他端に支持される。
図５２を参照すると、使用時に、封止されると、消化酵素Ｅが、例えば、分岐接続１７に取り付けられたシリンジ５を使用して酵素をバッグ内に注入することによって、チューブ１３を介して空洞１２内に導入され得る。バッグを直立配向に保持することによって、空気は、図５３に示されるシリンジ５のピストンを引き込むことによって空洞１２から除去され得る。酵素Ｅ及び組織Ｔの初期混合は、図５４に示されるように手で行われ得る。
次いで、脱凝集のためのトレッディングデバイス１００内へのバッグ１０の装填は、図５５に例示されるように、フレーム２０／２０’及びバンディングカバー３０の有無のいずれかで、始まり得る。
次いで、脱凝集プロセスが、上記に説明されるように行われる。完了すると、数分～数時間、例えば、約１０分～７時間、好ましくは４０分～１時間かかり得るが、脱凝集液化試料は、例えば、上記に説明されるバッグセット、及び図５６に示されるように、ブランチ１７に接続された追加の試料アリコートバッグ７を使用して、アリコートに細分化され得る。その事例では、シリンジ５は、バッグ１０から矢印Ｆの方向に液化試料を取り出すために使用され、弁１９ａ及び１９ｂが開放され、試料アリコートバッグ７に隣接する弁１９ｃが閉鎖される。十分な試料がシリンジ５内に引き込まれると、弁１９ｂが閉鎖され、弁１９ａは開放したままであり、弁１９ｃは開放される。次いで、シリンジは、図５７の矢印Ｆの方向に液体を試料アリコートバッグ７内に押し込むために使用される。アリコートバッグ７のチューブ１３は、クランプヒートシール機械５５によってヒートシールされ得、図５８に示される。そのプロセスは、十分なアリコートが得られるまで、又は試料がなくなるまで繰り返され得、バッグは、既に部分的に分割されて、各区画の封止をより単純にし得る。
上記に説明されたように、試料バッグ１０は、トレッディングデバイス１００（図５５）に留まり得、次いで、トレッディングデバイスは、コントロールレート温度変化デバイス、この場合、図５９に示されるように冷凍庫４０に装填され得る。その技術は、トレッディングが凍結中に継続することを可能にするが、氷結晶形成を阻害するために、実際には、バッグ１０は、凍結する前に除去され得、次いで、冷凍庫４０が、トレッディング中に熱伝達プレートを通して試料を冷却するためだけに作用する。代替的に、アリコート試料バッグ７が、試料バッグ１０全体の代わりになり得る。別の代替例では、冷凍庫４０は、図６０に示されるように、冷凍庫４０の上部に蓋が開放され、そのため基部１５０が冷却される状態でトレッディングデバイス１００を装着することによって、約４℃まで未処理又は処理済み試料を穏やかに冷却するために使用され得る。別の代替例では、図６１に示されるように、冷凍庫の蓋が定位置にある状態で、基部１５０を取り出し、冷凍庫内にそれを配置することを可能にする。示されていない更に別の代替例では、バッグ１０又は７は、冷凍庫４０内で直接凍結され得る。
本発明は、上記の実施形態によって限定されているとはみなされないが、当業者にとって容易に明らかであるように、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更することができる。例えば、上記に説明されたトレッディング機構は、低温条件において摺動表面よりも動かなくなる可能性が低い、完全に枢動する機械的相互接続を提供するため好ましいが、その機構は、２つ以上の足を順次的にトレッディングするための任意の機械的に均等な手段で置き換えられ得る。説明される平坦な足は、トレッディング運動が、上下ではなく、左右であるローラー足と置き換えられ得る。説明されるトレッディング、又はその機械的均等物は、脱凝集を最適化し、細胞回収を最大化するために、好ましくは毎秒各足に対して２又は３回のトレッディング速度であり、定常的なトレッディングであるが、トレッディングは、異なる細胞型に対して、より速くてもよく、若しくはより遅くてもよく、又は断続的であってもよい。
デバイス１００／１００’は、冷凍庫内に置かれ、極端に低温（例えば、マイナス８０℃以下）に供されることが意図されるため、金属部品、特にばね１４６のような部品の使用は、ポリマー部品が低温ではるかに剛直になるため、好ましい。また、ピストン及びシリンダのような緊密に嵌合する部品は、非常に低温で動かなくなるか、又は嵌合不良となる場合があるため、説明される機構１２０のような単純な枢動可能なリンケージが好ましい。
図６２、図６３、及び図６４は、上記に説明されたデバイス１００とサイズ及び機能において類似した代替的なトレッディングデバイス２００を示す。デバイス２００は、以下でより詳細に説明される特定の差異を有する。
図６２を参照すると、デバイス１００とデバイス２００との間の主な差異は、デバイス２００がデバイス１００の機構１２０とは異なるトレッディング機構２２０を有することである。２つのトレッディング足２３４、２３６は、トレッディング運動の速度を監視及び制御するためのフィードバックをコントローラ２２１（図６３）に提供する回転エンコーダを有する電気モータユニット２１４の一部である２４ボルトＤＣ電気モータ２１３（図６３）によって、図４２及び図４３に示される運動に類似した、周期的交互トレッディング運動で駆動される。モータは、歯付きベルト２２２を介してカムシャフト２２４を駆動する。カムシャフトは、１８０度でオフセットされる一対のカム２３０、２３２を含み、この事例では、各々、カムフォロアの単純な調和運動を提供するために、サイクロイド形状で輪郭付けられる。各カムは、カムの輪郭の上に乗る関連付けられたエラストマーフォロアホイール２２５、２２７、ばね付きフォロアキャリッジ２２６、２２８と力伝達関係にあるフォロアホイール軸２２１、２２３を含むカムフォロアアセンブリを移動させるように動作可能である。各キャリッジ２２６，２２８は、線形ガイド２２９内で摺動し、それぞれの足２３４、２３６は、キャリッジに接続される。各アセンブリは、それぞれのカムが戻りばね２３１の付勢力に対してモータによって回転する際に、足と一緒に、カム輪郭をトレッディング状態から離れて乗るため、フォロアホイールのそれぞれの１つによって上向きに強制される。カムが更に回転し、カム輪郭が後退すると、各フォロアアセンブリと関連付けられたばね２３１は、トレッディング力によってアセンブリ及び足を押し下げる。
それによって、トレッディング力は、駆動モータの電源ではなく、関連付けられたフォロアアセンブリばね２３１のばね定数に制限される。１．バッグに加えられる力は、機構が足を上に駆動し、ばねがそれらを押し下げるため、使用時に、ばねによって制限される。これは、以下を確保する。
ａ．モータが失速することができない（腫瘍サイズ又は組織に関係なく）こと、
ｂ．試料が過剰な力で圧縮されず、バッグが裂けないこと、
ｃ．バッグに加えられる最大圧力が、バッグ製造中に試験された圧力よりも低いこと、及び
ｄ．以下に説明されるように、ヒンジ付きバッグ受容エリア２４８は、必ずしも足の事前位置決めをすることなく、試料バッグ及び使用される任意のクランプを受け入れることができること。言い換えると、ヒンジ付き試料エリア２４８が足に対して閉鎖されるため、足は、バッグを受け入れるときに任意の位置にあり得、必要に応じて、任意の試料は、その時点で、ヒンジ付きエリアが足に対して閉鎖されるため、足によって圧縮され得る。
また図６３及び図６４を参照すると、デバイス２００は、デバイスハウジング２１０から２つの足２３４、２３６の上部まで延在する可撓性封止膜２４１を更に含み、これは、足の裏とトレッディング機構２２０の残りの部分との間に耐油性及びダストシールを提供する。その配置は、圧縮バッグが稼働中に裂けた場合、機構の汚染を抑制する。膜２４１が好ましいが、足は、バッグエリア２４８から機構２２０を分割するパーティションに装着されたリップシールなどの封止において摺動し得、必要とされる場合、機構の汚染の類似の抑制を達成する。
デバイス２００は、熱伝達プレート１５０と同じ機能を果たす熱伝達プレート２５０を更に含む。しかしながら、このプレート２５０は、ヒンジ２５５（図６４）でハウジングの一方側にヒンジで連結され、その結果、踏まれるバッグの挿入及び除去（図４６、図４７、及び図４８に示される）がより容易になる。熱伝達プレート２５０は、品質管理のために、プレート２５０及びバッグ受容エリア２４８の温度がコントローラによって監視及び記録されることを可能にする温度センサ２５６を含む。プレート２５０は、上記に説明された表面１５１及び１５２と同じ機能を有する第１の表面２５１及び第２の表面２５２を有する。
各足は、デバイス２００の熱伝達プレート２５０に対して高さが調節可能であり、その動きの表示もコントローラによって監視される。したがって、モータが回っていることを回転エンコーダが示す場合でも、歯付きベルト２２２の故障などの機械的故障が、コントローラによって依然として検出され得、警報を鳴らすなどの好適な措置が実装され得る。
デバイス２００は、デバイス１００と同じ外部寸法を有し、デバイスのハウジング２１０は、上記に説明され、図６１に例示されるように、定位置に冷凍庫の蓋がある状態でコントロールレートフリーザー４０の内側で摺動することを意図される。
便宜上、上部、下部、上、及び下などの用語、並びに足、トレッド、及びトレッディングなどのより記述的な用語が、図面に示される本発明を説明するために使用されているが、実際には、示されるデバイスは、例えば、その新しい配向において、それらの用語が反転又はあまり記述的ではないものとなるように、任意の様式で配向され得る。したがって、そのような用語又は同等の用語によって配向に関する限定が解釈されるべきではない。
本発明は、閉鎖された可撓性バッグ（１０）内における個々の細胞又は細胞塊への組織試料の脱凝集のためのデバイス（１００／１００’）を提供し、デバイスは、機械的脱凝集機構（１２０）と、組織試料バッグ受容エリア（１４８）と、を含み、該デバイスは、熱エネルギーをエリア（１４８）に、又はそこから伝達するための熱伝達プレート（１５０）を更に含み、プレートは、エリア（１４８）に隣接する第１のプレート表面（１５１）と、エリア（１４８）から離れて面する外部の熱的影響に曝露される対向する表面（１５２）と、を有する。
収集時の腫瘍組織の凍結保存は、腫瘍収集から製造を分離する能力を結果的にもたらした。これは、ＵＴＩＬ製造が、腫瘍消化物の解凍から最終的なＴＩＬ採取洗浄、医薬品製剤、充填、ラベル貼り、及び凍結保存まで、単一の製造プロセスとして計画され、実施され得る。
最終産物の凍結保存は、コンディショニング化学療法の前に全てのリリース試験が実施され、患者の治療が、最終産物製造から外されることを可能にした。
フローサイトメトリーを使用して、製造された産物を特徴解析し、定量化した。ＴＩＬは、出発材料の代表的な試料の病理評価によって、転移性腫瘍に由来する培養物であった細胞表面マーカーＣＤ３を発現するＴ細胞として定義される。生存率は、早期細胞死マーカーＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ及び／又は生存率染料ＤＲＡＱ７（トリパンブルー又はＰＩに相当）に結合しない全てのＣＤ３＋細胞のパーセンテージに基づく。純度は、生存造血細胞集団（ＣＤ４５＋、Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ｖｅ、及びＤＲＡＱ７－ｖｅ）内の生存Ｔ細胞（ＣＤ３＋、Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ｖｅ、及びＤＲＡＱ７－ｖｅ）のパーセンテージとして定義される。
高速増殖プロトコル（ＲＥＰ）前の細胞の大部分は、ＣＤ３を発現するＴ細胞である。研究及び臨床バッチでは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬの変数分布が観察され、これらは、腫瘍反応性細胞を含有する部分集団からなることになる。ＴＩＬは、抗ＣＤ３を有するＲＥＰで増殖されるため、最終産物は、ほぼ排他的に生存可能なＣＤ３＋ Ｔ細胞（＞９４％）を含有する。
理論上、最終産物は、腫瘍細胞を依然として含有することができるが、これは、腫瘍細胞のＴ細胞成長及びＴ細胞媒介性死滅を強力かつ選択的に促進する培養条件に起因して非常に可能性が低い。数百回のＴＩＬ注入の臨床データは、細胞学による腫瘍細胞の存在を示さなかった。最終的に仕様を設定するためにデータを照合するために、造血系起源ＩＰＣアッセイではない全ての生存細胞物質を識別するための試験が組み込まれており、がんバイオマーカーの頻度についても試験することになる。
ＴＩＬ細胞医薬品は、８．５％ヒト血清アルブミン及び１０％のＤＭＳＯを含有する約１２５～２７０ｍｌの緩衝等張生理食塩水中の懸濁液である。存在する細胞の数は、培養条件及び製造再現性と併せて、培養で増殖される各個人のＴＩＬ細胞の能力に依存する。
図１を参照すると、デバイスの脱凝集モジュールが開示される。デバイスは、酵素消化を伴う一実施形態では、脱凝集及び消化のための可撓性コンテナ１ａを備え得る。開放端１ｂは、コンテナ１ａへの固形腫瘍組織材料の移動を可能にする。吊り下げ孔１ｃは、コンテナ１ａが吊り下げられ、輸送又は使用中に支持されることを可能にする。デバイスの無菌状態を維持するために、標的熱溶着場所１ｄは、熱溶着装置１３ｃ又は他の同等の手段を使用してコンテナ１ａが封止されることを可能にする。コンテナ１ａは、図２ａ～図２ｃ又は図３ａ若しくは図３ｂに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ１ａの内部表面上に丸みを帯びた縁１ｅを有し得る。チューブ１ｆは、培地３ａが、滅菌フィルタ２ａを介してコンテナ１ａに移されることを可能にする。滅菌フィルタ２ａは、培地３ａの移送を容易にするために、後続のモジュールで封止の穿刺を可能にするスパイクを含む。チューブ１ｇは、消化酵素３ｂが、滅菌フィルタ２ｂを介してコンテナ１ａに移されることを可能にする。滅菌フィルタ２ｂは、コンテナ１ａ内への消化酵素３ｂの移送を容易にするために、封止の穿刺を可能にするスパイクを含む。特に酵素消化を伴う固形腫瘍組織の脱凝集後、脱凝集混合物は、インキュベーションの段階に入る前に、滅菌フィルタ４ｂを含むフィルタユニット４ａを介して、チューブ１ｈから移される。フィルタユニット４ａは、濾過プロセスの有用性に影響せずに、変形を可能にするように可撓性であり得る。フィルタ４ｂは、非脱凝集組織を除去する。チューブクランプ５ａは、培地３ａが滅菌フィルタ２ａを介して可撓性コンテナ１ａに入ることを可能にする。酵素消化を伴う一実施形態では、チューブクランプ５ｂは、酵素３ｂが滅菌フィルタ２ｂを介して可撓性コンテナ１ａに入ることを可能にする。チューブクランプ５ｃは、可撓性コンテナ１ａの内容物が、フィルタユニット４ａを介して、図２ａ～図２ｃ、又は図３ａ若しくは図３ｂに識別される１つ以上の例に通過することを可能にする。
図２ａによると、滅菌フィルタ２ｃは、脱凝集腫瘍組織の凍結保存に必要な培地３ａ及び／又は凍結溶液３ｃの導入を可能にする。フィルタ４ｄは、細胞／組織塊の追加のサイズ分離に必要とされ得る。フィルタ４ｄは、濾過プロセスの有用性に影響せずに、変形を可能にするように可撓性であり得るフィルタユニット４ｃ内に包囲される。一実施形態では、フィルタ４ｅは、細胞を保持するのに必要とされ得るが、培地及び細胞断片が洗浄されることを可能にする。フィルタ４ｄは、同様にフィルタユニット４ｃ内に包囲される。一実施形態では、チューブクランプ５ｄは、フィルタユニット４ａ及び４ｃを通過した、コンテナ１ａからの材料が、コンテナ１ａに戻ることを停止するように定位置にある。一実施形態では、チューブクランプ５ｅは、フィルタユニット４ａ、４ｃ、及び４ｅを通過した、コンテナ１ａからの廃棄物が、廃棄物コンテナ６ａに入ることを可能にするが、滅菌フィルタ２ｃを介して培地３ａ又は３ｃが入ることを停止するように、定位置にある。チューブクランプ５ｆは、フィルタユニット４ａ、４ｃ、及び４ｅを通過した、コンテナ１ａからの材料が、チューブクランプ５ｅを介して廃棄物が廃棄物コンテナ６ａを通過する前に、培地３ａ又は３ｃの供給源に戻ること、又は図３ａ又は図３ｂに例示された例のうちの１つに移ることを停止する。廃棄物が枯渇すると、チューブクランプ５ｅ及び５ｄは、閉鎖され、チューブクランプ５ｆは、培地３ａ又は３ｃが、フィルタ４ｅ内の細胞を図３ａ又は図３ｂに例示される例のうちの１つに移すことを可能にする。廃棄物コンテナ６ａは、使用及び／又は輸送中に廃棄物コンテナ６ａを支持するための吊り下げ孔を有する。
図２ｂは、デバイスの濃縮モジュールを例示する。チューブクランプ５ｇは、コンテナ１ａの内容物が、フィルタユニット４ａを介して、濃縮モジュールの可撓性コンテナ７ａに入ることを可能にする。チューブクランプ５ｈは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット８ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ５ｉを介してコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁８ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ８ｂを通過することを可能にする。チューブクランプ５ｉは、コンテナ７ａの内容物が開放チューブクランプ５ｈを介してフィルタユニット８ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁８ｃによって制御される圧力によってフィルタ８ｂを通過することを可能にする。細胞濃縮が発生した後、チューブクランプ５ｈが閉鎖され、チューブクランプ５ｊが開放されて、コンテナ７ａの内容物が図３ａ又は図３ｂに例示された例のうちの１つに通過することを可能にする。廃棄物コンテナ６ａは、使用及び／又は輸送中に廃棄物コンテナ６ａを支持するための吊り下げ孔６ｂを有する。濃縮モジュールのコンテナ７ａは、使用及び／又は輸送中にコンテナ７ａを支持するための吊り下げ孔７ｂを有する。コンテナ７ａは、図３ａ又は図３ｂに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ７ａの内部表面上に丸みを帯びた縁７ｃを有し得る。チューブ７ｄは、コンテナ７ａが、フィルタユニット４ａ及びフィルタユニット８ａを介して、コンテナ１ａの内容物を受容することを可能にする。チューブ７ｅは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット８ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ５ｉを介してコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁８ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ８ｂを通過することを可能にする。チューブ７ｆは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット８ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁８ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ８ｂを通過することを可能にする。
図２ｃは、濃縮モジュールの別の実施形態を例示する。チューブクランプ５ｇは、コンテナ１ａの内容物が、フィルタユニット４ａを介して、可撓性コンテナ７ａに入ることを可能にする。チューブクランプ５ｈは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット９ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ５ｉを介してコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁９ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ９ｂを通過することを可能にする。チューブクランプ５ｉは、コンテナ７ａの内容物が開放チューブクランプ５ｈを介してフィルタユニット９ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁９ｃによって制御される圧力によってフィルタ９ｂを通過することを可能にする。細胞濃縮が発生した後、チューブクランプ５ｈが閉鎖され、チューブクランプ５ｊが開放されて、コンテナ７ａの内容物が図３ａ又は図３ｂに例示された例のうちの１つに通過することを可能にする。廃棄物コンテナ６ａは、使用及び／又は輸送中に廃棄物コンテナ６ａを支持するための吊り下げ孔６ｂを有する。濃縮モジュールのコンテナ７ａは、使用及び／又は輸送中にコンテナ７ａを支持するための吊り下げ孔７ｂを有する。コンテナ７ａは、図３ａ又は図３ｂに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ７ａの内部表面上に丸みを帯びた縁７ｃを有し得る。チューブ７ｄは、コンテナ７ａが、フィルタユニット４ａ及びフィルタユニット９ａを介して、コンテナ１ａの内容物を受容することを可能にする。チューブ７ｅは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット９ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ５ｉを介してコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁９ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ９ｂを通過することを可能にする。チューブ７ｆは、コンテナ７ａの内容物がフィルタユニット９ａを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ７ａに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁９ｃによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ６ａ内へフィルタ９ｂを通過することを可能にする。フィルタユニット９ａは、濃縮細胞がコンテナ７ａに戻る前に、弁９ｃによって制御される圧力によって、フィルタ９ｂを介して廃棄物培地及び破片を廃棄物コンテナ６ａ内に除去するために、コンテナ７ａの内容物の濾過を容易にする。フィルタ９ｂは、細胞培地の改善された精製のために、廃棄物が廃棄物コンテナ６ａに到達する前に溶出しなければならない距離を増加させるが、改善されたフィルタ９ｂの輸送及び保存を容易にするために、コイルに巻かれ得る。
図３は、安定化モジュールの例を例示する。チューブクランプ５ｋは、フィルタユニット４ａを介して図１に例示されるように、若しくはフィルタユニット４ｃを介して図２ａに例示されるようにコンテナ１ａの内容物が、又はフィルタユニット８ａを介して図２ｂに例示されるように、若しくはフィルタユニット９ａを介して図２ｃに例示されるようにコンテナ７ａの内容物が、安定化モジュールのコンテナ１０ａに移されることを可能にする。安定化モジュールのコンテナ１０ａは、使用及び／又は輸送中にコンテナ１０ａを支持するための吊り下げ孔１０ｂを有する。コンテナ１０ａは、チューブ１０ｅ又は１０ｆからの移送の一部として発生し得る損失を低減するために、コンテナ７ａの内部表面上に丸みを帯びた縁１０ｃを有し得る。チューブ１０ｅは、コンテナ１０ａの内容物がコネクタ１０ｈを介して引き込まれることを可能にする。チューブ１０ｆは、滅菌スパイクが無菌カバー１０ｇを介して導入されることを可能にして、コンテナ１０ａの内容物が引き込まれることを可能にする可撓性膜を含有する。
図３ｂは、安定化モジュールの別の実施形態を例示する。チューブクランプ５ｌは、フィルタユニット４ａを介して図１に例示されるように、若しくはフィルタユニット４ｃを介して図２ａに例示されるようにコンテナ１ａの内容物が、又はフィルタユニット８ａを介して図２ｂに例示されるように、若しくはフィルタユニット９ａを介して図２ｃに例示されるようにコンテナ７ａの内容物が、安定化モジュールのコンテナ１１ａに移されることを可能にする。安定化モジュールのコンテナ１１ａは、使用及び／又は輸送中にコンテナ１０ａを支持するための吊り下げ孔１１ｂを有する。コンテナ１０ａは、チューブ１１ｆからの移送の一部として発生し得る損失を低減するために、コンテナ７ａの内部表面上に丸みを帯びた縁１０ｃを有し得る。チューブクランプ５ｍは、培地３ｃが滅菌フィルタ２ｃを介して可撓性コンテナ１１ａに入ることを可能にする。チューブクランプ５ｎは、チューブクランプ５ｏ、５ｐ、５ｑ、５ｒ、５ｓ、及び５ｔの開放又は閉鎖状態に応じて、コンテナ１１ａの内容物が凍結保存コンテナ１２ａのうちの１つに入ることを可能にする。チューブクランプ５ｏ、５ｐ、５ｑ、５ｒ、５ｓ、及び５ｔは、コンテナ１１ａの内容物が、凍結保存コンテナ１２ａのうちの１つに入ることを可能にする。チューブ１１ｄは、コンテナ１１ａが、フィルタユニット４ａを介して図１に例示されるように、若しくはフィルタユニット４ｃを介して図２ａに例示されるようにコンテナ１ａの内容物を、又はフィルタユニット８ａを介して図２ｂに例示されるように、若しくはフィルタユニット９ａを介して図２ｃに例示されるようにコンテナ７ａの内容物を受容することを可能にする。チューブ１１ｅは、凍結保存培地３ｃがコンテナ１１ａ内に移されることを可能にする。チューブ１１ｆは、コンテナ１１ａの内容物が凍結保存コンテナ１２ａに移されることを可能にし、単一細胞懸濁液としての最終的な脱凝集ＵＴＩＬ産物が、急速増殖プロセスにおける将来の使用のために保存される。凍結保存コンテナ１２ａは、凍結保存コンテナ１２ａからのＴＩＬの無菌移送を可能にするための固定具１２ｂを有する。凍結保存コンテナ１２ａは、保存されるＵＴＩＬ細胞懸濁液の体積に好適である空間１２ｃを有する。凍結保存コンテナ１２ａはまた、チューブ１１ｆを凍結保存コンテナ１２ａに溶着するための標的場所１２ｄを有する。
図４は、デバイス及びキットの別の例を例示する。ペグ１３ａは、培地３ａ、３ｂ、及び３ｃが吊り下げられることを可能にする。ペグ１３ｂは、コンテナ１ａを吊り下げるための重量センサに接続され、利用される実施形態に応じて、コンテナ７ａ、１０ａ、及び／又は１１ａのうちの１つ以上を含み得る。重量センサは、材料の自動処理を制御する決定段階を定義するために使用される。コンテナ１ａ内への切除固形腫瘍組織の導入後に、熱溶着装置１３ｃが、コンテナ１ａを標的部位で封止するために使用され得る。脱凝集モジュール１３ｄは、脱凝集を可能にするために閉鎖及び係止され得る開口部を有し、消化酵素が固形腫瘍組織の脱凝集に使用される消化を可能にするために、温度を１℃の公差で０℃～４０℃であるように制御し得る。脱凝集モジュール１３ｄはまた、時間に対する光分布の変化を決定して、変化を識別し、それによって、数秒から数時間の期間にわたって発生する脱凝集プロセスの完了を識別することによって、固形組織分解のレベルを評価するための内蔵センサを有する。脱凝集モジュール１３ｄはまた、コンテナ１ａと直接接触し、脱凝集モジュール１３ｄの筐体の背面に押し付ける、脱凝集表面１３ｆを含み得、これは、酵素が利用される脱凝集及び消化の間に閉鎖及び係止され得る。最終製剤モジュール１３ｅは、利用される実施形態に応じて、コンテナ１０ａ又は１１ａのいずれかの温度制御を可能にする筐体を有し、これは、０℃～周囲環境温度の温度を１℃の公差に制御することができる。チューブクランプ１３ｇ及び１３ｊは、チューブロケータ１３ｉ内に配設されて、入力ポート及び出力ポートとして作用し、利用される実施形態に応じて、コンテナ１ａ、１０ａ、又は１１ａの間の脱凝集腫瘍産物の輸送を容易にする。蠕動チューブポンプ１３ｈは、入力及び出力ポートとして作用するチューブクランプ１３ｇと１３ｊとの間の培地３ａ又は３ｃの移送を制御する。チューブ弁１３ｋは、図２ｂ及び図２ｃに例示されるように、濃縮モジュール内の弁８ｃ及び９ｃを介して圧力を制御することを支援する。ペグ１３１は、利用される実施形態に応じて、廃棄物コンテナ６ａ及び／又は凍結保存コンテナ１２ａの吊り下げを可能にする。実施形態はまた、図３ｂに例示されるように、凍結保存コンテナ１２ａをデバイスに接続するのに必要なチューブ溶着装置１３ｍを含み得る。実施形態はまた、図３ｂに例示されるように、凍結保存コンテナ１２ａをデバイスに接続解除するためのチューブカッター１３ｎを含み得る。コントロールレート冷却モジュール１３ｏは、凍結保存プロセスを支援するために、８℃～少なくとも－８０℃の間の任意の温度で冷却又は維持することができる。
本発明の方法は、以下のプロセスに従って例示される。方法の本質的な特徴以外に、本明細書に列挙される様々な任意選択のステップが独立して組み合わせられて、達成されるサンプリングのタイプ及び結果と関連付けられた関連する技術的利点を達成し得ることが明確に記載されている。
半自動無菌組織処理方法は、任意選択的に本明細書に説明されるキットに従って、無菌処理キット上のデジタルタグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及び１つ以上の更なる組織処理ステップ、並びにそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、無菌処理キットの可撓性プラスチックコンテナ内に組織試料を配置することと、脱凝集モジュール、任意選択の濃縮モジュール、及び安定化モジュールと通信して制御することによって、１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、を含む。
本質的に、プロセスは、生検／組織試料、好ましくは、切除腫瘍を受容することになる開放端バッグ（脱凝集モジュールの一部である第１の可撓性コンテナ）を得ることを含み得、これは、以下のコンテナに、１つ以上の導管を介して既に接続されているか、又は手動オペレータ制御無菌接続を介して接続され得る。
Ｉ．消化培地（脱凝集モジュールの一部である第２の可撓性コンテナ）を有し、安定化溶液を有するか、又は有しない（安定化モジュールの一部でもある同じ第２の可撓性コンテナ）単一のコンテナ
ＩＩ．消化溶液を有する１つのコンテナ（脱凝集モジュールの一部である第２の可撓性コンテナ）、及び安定化溶液を有する別のコンテナ（安定化モジュールの一部である第４の可撓性コンテナ）
生検の追加及び開放端バッグの封止において、消化培地は、導管又は無菌接続（導管／ポート、請求項１）を介して追加され得、組織材料が処理される。
ここで、組織が単一又は少数の凝集細胞懸濁液である時点の消化の完了時、細胞は、任意選択的に、ステップ４の前に濾過され得る（濾過のための任意選択の濃縮モジュールは、試料を含有する第１の可撓性コンテナを含み、濃縮された濾液を受容するための第３のコンテナに濾過される）。
安定化培地が同一の可撓性コンテナ内に存在しない場合、安定化溶液を有するコンテナが、取り付けられた導管又は競合する手動オペレータ制御無菌接続を開放することによって追加され、開放される該接続は、両方の場合において、プロセスが継続する前に安定化溶液が追加されることを可能にする。
元の可撓性コンテナ内の、又は任意選択的に複数の保存安定化コンテナに細分化され得る、単一又は少数の凝集細胞懸濁液は、その後、デバイス上で安定状態に維持される、並びに／又は、除去、輸送、保存、及び／若しくはそれらの最終的な利用における使用の前に、凍結保存を受けることになる。安定化モジュールはまた、保存／凍結／保存で使用される第１又は第３のコンテナを含む。
プロセスの１つの更なる非限定的な例では：
ａ）必要な組織材料（本発明の一部ではない）を収集するための生検又は外科手術などの別個の手順による組織試料の採取は、初期可撓性プラスチックコンテナ（例えば、図１のコンテナ１ａ参照）内に配置される。
ｂ）本発明の以下の例のうちの１つ以上を使用する脱凝集前に、培地（例えば、図１の培地３ａ参照）が脱凝集チャンバ内に移されるか、又は一例では、酵素（例えば、図１の酵素３ｂ参照）を入れて収集することも行って、重量センサなどの機構（例えば、図１のモジュール１３ｄの一部としての１３ｂ参照）が、直接的なオペレータ入力又は固形組織の重量のいずれかによって決定される、追加する必要な培地の量を評価する。
ｃ）単回使用の可撓性脱凝集コンテナ、固形組織、培地、及び一例では、酵素は、物理的脱凝集プロセス中に、視覚的な変化がなくなるまで、固形組織を分解するのに必要な１～１０分の最適な時間を含む、最小で数秒間、最大で数時間、組み合わせられる（図５及び表１参照）。脱凝集デバイスは、脱凝集モジュール内のセンサ（図１、１３ｄ参照）を介して脱凝集及びフィードバックにかかる時間に応じて、可変の速度及び時間を使用して組織を圧縮するように設計される。
ｄ）酵素が存在する一実施形態では、これは、３０℃～３７℃の最適温度におけるインキュベーション期間を必要とするが、少なくとも１分～数時間の間、０℃～４０℃程度に低くてもよいが、より好ましくは１５～４５分である。
ｅ）ステップｃ、及び組織が変化を停止するか、又は参照例が液体細胞懸濁液に脱凝集されるかのいずれか一方が起こるまで、酵素ステップｄ）が繰り返され得る実施形態では、脱凝集モジュール脱凝集モジュールのセンサによって監視される（図１、１３ｄ参照）。
ｆ）一実施形態では、不完全に脱凝集された組織では、関連材料及び不純物が除去され、以下の実施形態のうちの１つ以上を使用して、脱凝集組織及び培地を通過させることによって細胞懸濁液の濃縮を可能にする。
ｉ． 少なくとも＞０．１μｍ～１０００μｍ、ただし、最も好ましくは５０～２５０μｍ、より好ましくは１００μｍ～２００μｍの孔を有する、１つ以上の機械的フィルタの直接通過（図２ａに例示される）。
ｉｉ． 細胞整列密度保持溶液（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を有するか、又は有していない、遠心分離及び／又は沈殿を使用する密度ベースの分離。
ｉｉｉ． 流体流と流れを遮る材料が、サイズ及び形状に基づいて細胞及び不純物の分解及び分画を増強する、流体力学的濾過
ｉｖ． 適用された場（例えば、流れ、電気、重力、遠心力）が、選択流（例えば、接線流濾過、中空繊維流濾過、非対称流濾過、遠心流濾過）に対して垂直又は逆方向に作用する、流動場分離法。その場合、力に最も応答する細胞又は不純物は、流れが最低、したがって長い保持時間である壁に駆動されるが、一方で、力に最も応答しない細胞又は不純物は、流れに対して層状のままであり、迅速に溶出する（図２ｂ及び図２ｃに例示される接線流濾過）。
ｖ．細胞又は不純物の集団に合わせて調整された、又はそれらと調和した１つ以上の音響周波数が、必要な細胞又は不純物を入力流への接線経路で駆動するために使用される、音響電気泳動。
ｇ）一実施形態では、脱凝集濃縮組織産物は、例えば、以下に挙げられる新鮮な培地中で再懸濁されることになる（培地３ａを使用する図２ａ）。
ｉ．上記に説明された、独立した標的化濃縮手順を実施するための細胞濃縮培地
ｉｉ．直接的な細胞培養又は低温保存培地（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製のＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）など）。
ｈ）ｇ）において採用された実施形態では、再懸濁された脱凝集固形組織由来産物が、その最終的な利用に使用される前の数時間から数日間の保存のために、実施形態の最終産物コンテナ（図３ａに例示される）のうちの１つに移される。
ｉ）そうでなければ、ステップｆ）の後、実施形態の適用（図３ｂに例示される）は、脱凝集固形組織由来産物が抗凍結剤（図３ｂ、培地３ｃ）中で再懸濁を受ける場合、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ製のＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）凍結溶液などの、脱凝集固形組織由来産物の数日から数年間の保存のための凍結溶液（図３ｂ、培地３ｃ）を適用することになる。
ｊ）この段階で、脱凝集固形組織由来産物は、凍結溶液（図４、モジュール１３ｅ）中に再懸濁され、１つ以上の可撓性凍結保存コンテナ（図３ａ、コンテナ１２ａに例示される）に移され、デバイスの一実施形態では、コントロールレート凍結プロセス（図４、モジュール１３ｏ）がある。
ｋ）その後、バッグは、独立した保存又は分布のために、デバイス及び無菌処理キットから分離され得る。
更なる実施形態では、本発明の使い捨てキットは、組織試料の半自動無菌処理のための自動デバイスとともに使用され得る。図６及び図７は、本発明の使い捨てキットを図示する。
図６は、脱凝集及び安定化に使用されるプロセスのモジュールの一部である、異なる出発溶液用の複数の可撓性コンテナを使用する、半自動無菌組織処理方法を図示する。
プロセスステップ１－ユーザは、デバイスにログインし、デバイスを使用して無菌キット上のタグをスキャンして、使用される自動処理ステップを転送する。デバイスプロセッサは、タグを認識し、その特定のキットに関連する特定の処理命令を実施するために必要な情報を提供する。
プロセスステップ２－消化培地収容可撓性バッグ（脱凝集モジュールの一部）及び凍結／安定化溶液収容可撓性バッグ（安定化モジュールの一部）は、各々、デバイスに吊り下げられるか、又は固設される。
プロセスステップ３－処理のための生検又は組織試料は、開放端を介して、無菌キットの可撓性コンテナ（両方のモジュールの一部）内に配置され得る。
プロセスステップ４－試料を含む可撓性コンテナは、次いで、開放端（初期処理中に試料を添加するために使用される）を閉鎖するために熱溶着を使用して封止され得る。
プロセスステップ５－次いで、ユーザは、プロセッサのユーザインターフェースと相互作用して、組織試料が存在することを確認し、必要に応じて、任意の更なる組織材料固有情報を入力し得る。
プロセスステップ６－消化培地及び凍結／安定化溶液の可撓性コンテナは、試料を収容する可撓性コンテナと接続され、その後、自動処理のためにデバイス内に配置され得る。
プロセスステップ７－デバイスは、試料の脱凝集及び結果として生じる細胞の安定化／凍結保存を行うキット情報に従ってサイクルを実行する。
プロセスステップ８－安定化／凍結されたとき、キットの使用済み培地及び凍結／安定化コンテナを接続解除して廃棄する。可撓性コンテナ内の単一又は複数の細胞溶液に処理された組織は、その最終的な利用の前に、保存又は輸送コンテナに移す前に接続解除される。
別の実施形態では、図７は、無菌処理キットのモジュールと方法との間で共有され得るプロセスで使用される培地を含む可撓性コンテナを図示する。
プロセスステップ１－ユーザは、デバイスにログインし、デバイスを使用して無菌キット上のタグをスキャンして、使用される自動処理ステップを転送する。
プロセスステップ２－培地及び凍結／安定化溶液の両方を含む可撓性バッグ（脱凝集／安定化モジュールの一部）が、デバイスに吊り下げられるか、又は別様に固設される。
プロセスステップ３－処理のための生検又は組織試料は、開放端を介して、無菌キットの更なる可撓性コンテナ（両方のモジュールの一部）内に配置され得る。
プロセスステップ４－試料を含む可撓性コンテナは、次いで、開放端を閉鎖するために熱溶着を使用して封止され得る。
プロセスステップ５－次いで、ユーザは、プロセッサのユーザインターフェースと相互作用して、組織試料が存在することを確認し、必要に応じて、任意の組織材料固有情報を入力し得る。
プロセスステップ６－消化培地及び凍結／安定化溶液の可撓性コンテナは、試料を収容する可撓性コンテナと接続され、その後、自動処理のためにデバイス内に配置され得る。
プロセスステップ７－デバイスが、任意選択的に凍結保存を介して、試料の脱凝集及び結果として生じる細胞の安定化を可能にするようにサイクルする。
プロセスステップ８－凍結／安定化が完了したとき、ユーザは、キットの使用済み可撓性コンテナを接続解除して廃棄する。残りの可撓性コンテナ内の単一又は複数の細胞溶液に処理された組織は、その最終的な利用の前に、保存又は輸送コンテナに移す前に接続解除される。
例として、本発明の方法の別の実施形態では、脱凝集プロセスが酵素消化で補充される場合、酵素消化のための培地製剤は、上記に説明されるように細胞間境界を分解させるタンパク質分解を補助する酵素を補充されなければならない。
限定されるものではないが、以下の１つ以上の培地、臓器保存液、選択的溶解溶液、ＰＢＳ、ＤＭ ＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＰＭ Ｉ、イスコフ培地、ＸＶＩＶＯ（商標）、ＡＩＭ－Ｖ（商標）、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ（商標）溶液、結晶性溶液及びＩＶ液、コロイド溶液及びＩＶ液、５％デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）、ハルトマン溶液、ＤＭ ＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ－Ｖ（商標）、イスコフ培地、ＸＶＩＶＯ（商標）を含む、細胞培養又は細胞取り扱いの技術分野で公知の様々な液体製剤が、固形組織の細胞脱凝集及び酵素消化に使用される液体製剤として使用され得、各々は、追加の細胞支持因子、例えば、胎児仔血清、ヒト血清若しくは血清代替物、又は細胞回収及び生存若しくは特異的細胞枯渇を補助するための他の栄養素若しくはサイトカインを任意選択的に補充され得る。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養（例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト）又は幹細胞（例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはＴ細胞）用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、金属イオン、抗生物質、接着因子、脱接着因子、界面活性剤、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｎｚａ、若しくはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、又は類似の培地製造業者及び供給業者から市販されている。
酵素消化に必要な液体製剤は、少なくとも０．１ｍＭから最大５０ｍＭ、２～７ｍＭ、理想的には５ｍＭの最適範囲で存在する十分なカルシウムイオンを有していなければならない。
消化される固形組織は、酵素消化の前にＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを洗浄及び除去する前に、接着因子及び阻害タンパク質を除去するために、キレート剤ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡを含有する液体製剤による脱凝集後に洗浄され得る。
酵素消化に必要な液体製剤は、最小限のキレート剤ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡでより最適であり、これは、酵素安定性及び活性に必要なカルシウムイオンを除去することによって酵素活性を重度に阻害し得る。加えて、ｂ－メルカプトエタノール、システイン及び８－ヒドロキシキノリン－５－スルホン酸塩は、他の既知の阻害物質である。
好ましい実施形態に説明されるように、凍結保存用の最終的な細胞コンテナは、弾性変形可能な材料から製造された可撓性コンテナである。デバイスのこの実施形態では、最終コンテナが、－２０～－１９０℃の冷凍庫に直接移されるか、又はデバイスと関連付けられるか、若しくは別個に供給される（例えば、Ｐｌａｎｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ又はＡｓｙｍｐｔｏｔｅ Ｌｔｄによって製造される）コントロールレート凍結装置内により最適に位置し、濃縮された脱凝集固形組織コンテナを含有するために採用された凍結チャンバ及び可撓性保管コンテナの温度は、低温ガス（通常、窒素、例えば、Ｐｌａｎｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を注入することによって、又は制御された冷却表面から熱を除去することによって、制御される。両方の方法は、凍結溶液及び産物の所望の生存率に基づいて、凍結される特定の細胞に必要な速度で、１℃未満又はより好ましくは０．１℃の凍結プロセスの誤差で正確に制御する能力を結果的にもたらす。この凍結保存プロセスは、氷核形成温度を考慮に入れなければならず、氷核形成温度は、理想的には、凍結溶液の融解温度に可能な限り近い温度である。水溶液中の結晶成長に続いて、水が氷として系から除去され、残留する非凍結溶液の濃度が増加する。温度が低下すると、より多くの氷が形成され、残留する非凍結画分が減少し、濃度が更に増加する。水溶液には、氷が濃縮水溶液と共存する、大きな温度範囲が存在する。最終的に、温度低下を通じて、溶液は、ガラス転移状態に到達し、その時点で、凍結溶液及び細胞は、粘性溶液から、この温度を下回る固体様状態に移動するが、細胞は、更なる生物学的変化を経ず、それゆえ、必要になるまで数十年間にわたって安定化される。
本発明の方法によって達成される脱凝集細胞産物は、当業者に公知の全ての方法に従って、培養及び／又は解析（特徴解析）され得る。
本明細書に開示される方法によって取得可能なＴＩＬは、当業者に公知の研究、診断、組織バンク、バイオバンク、薬理学的又は臨床用途などの、後続のステップに使用され得る。次いで、ＴＩＬは、本用途に最適化された培地、例えば、通常、限定されるものではないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などの成長因子、又は抗体でコーティングされたプレート若しくはポリスチレンビーズなどの刺激条件を含有する、Ｔ細胞混合培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用して培養物中に取り込まれ得る。本発明では、単離された細胞を培養コンテナ内に播種し、１～４０℃、通常３７℃の温度で、加湿雰囲気（１～２０％、通常５％のＣＯ２、８０～９９％、通常９５％の空気）などの当業者によって標準的に使用される手順を使用して数週間維持し、サプリメントが添加され、１０％のＦＢＳ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充され得る。
濃縮されたＴＩＬは、療法、例えば、細胞療法、又は疾患の予防における医薬組成物として、細胞培養の前及び／又は後に使用され得る。医薬組成物は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の治療及び／又は予防に使用され得、これは、哺乳動物への薬学的有効量の医薬組成物の投与を含む可能性がある。
そのようなＴＩＬ培養物は、様々ながんの治療のための医薬品として製剤化されることに加えて、例えば、細胞機能、腫瘍細胞死滅、細胞シグナル伝達、バイオマーカー、細胞経路、核酸、及びドナー、組織、細胞又は核酸の状態を識別するために使用され得る他の細胞又は組織関連因子を研究するために使用され得る。
疾患は、固形組織由来細胞の存在を通じて、及び／又は関連する場所、すなわち、腫瘍又は疾患の部位における関連する細胞の濃度を増加させることを通じて、治療及び／又は予防され得る、任意の疾患であり得る。治療及び／又は予防的に治療される疾患は、例えば、がん又は変性障害などの任意の障害であってもよい。治療は、濃縮細胞、操作細胞、若しくは増殖細胞、又はこれらの任意の組み合わせの移植であってよく、身体の関連する部位に投与されるか、又は全身的に供給され得る。
本開示の医薬組成物は、治療される（又は予防される）疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子によって決定されることになるが、適切な用量は、臨床試験によって決定され得る。
本明細書に説明されるように、本発明は、特に哺乳動物組織における組織などの材料の受け取り、処理、保存、及び／又は単離を可能にするキットを提供する。更に、本発明は、可撓性コンテナ、例えば、バッグ、フィルタ、弁、ブラケット、クランプ、コネクタ、及び／又はチューブなどの導管などの、キットの構成要素を提供する。特に、バッグは、凍結保存キットの様々な構成要素間の組織材料の流れを可能にするように適合された、１つ以上のチューブ又はチューブの区分に結合され得る。
凍結保存キット及び／又は収集バッグを使用した細胞への組織の処理は、自動及び／又は半自動のデバイス及び方法を含み得る。
更に、当該技術分野の通常の知識とともに本明細書に説明されるバッグ、キット、デバイス、及びプロセスを利用することによって、本開示の更なる実施形態が容易に識別され得る。当業者であれば、既知の変形を容易に理解するであろう。
意匠特許出願第２９／７４０，２９３号は、組織収集に好適な組織収集バッグを提供する。本発明の組織収集バッグの上部は、組織、例えば、動物（例えば、イヌ若しくはネコなどの家畜）又はヒトがん組織などの組織生検を受容するために開放されている。組織収集バッグは、その中に収集された組織を有して封止され、その中で処理される、その中にそのように封止された組織に対して、例えば、処理は、攪拌及び／若しくは圧縮、例えば、その中の組織の穏やかな攪拌及び／若しくは圧縮、並びに／又は酵素消化を含み得る。有利には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの所望の材料からの内部の組織処理及び抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を示すための印、及び／又は収集バッグが、攪拌を適用するための器具においてクランプ若しくは固定され得る場所を示すための印、及び／又は収集バッグが、例えば、ヒートシールによって封止され得る場所を示す印（処理のための器具の一部であり得る）を含み得る。有利には、処理の適用前に、収集バッグは、処理及び／又は封止、例えば、ヒートシールのために、器具にクランプ又は固定される。特定の例示では、チューブは、必ずしも本発明の設計の一部とみなされないことを示すために、点線又は点刻で示され得るが、特定の実施形態では、本発明の設計の一部とみなされてもよい。点線又は点刻は、チューブが存在してもよく、又は存在しなくてもよいと解釈され、一方又は両方として主張されてもよく、すなわち、図面全体を通して、チューブが本発明の設計の一部を形成してもよい（また、必ずしも本発明の設計の一部ではない場合もある）。加えて、特定の例示は、印なし、試料が得られた患者を示し得る印、試料が得られた患者及び組織収集バッグが器具にクランプ又は固定され得る場所を示す印、並びに試料が得られた患者、組織収集バッグが器具内にクランプ又は固定され得る場所、及び組織収集バッグが封止、例えば、ヒートシールされる場所を示し得る印を示すが、本発明の設計が、その変形例を含み得ること、例えば、本発明の設計は、試料が得られた患者及び組織収集バッグがヒートシールされ得る場所を示す印を含むが、組織収集バッグが器具にクランプ又は固定され得る場所を示す印なしでもよく、本発明の設計は、組織収集バッグがヒートシールされ得る場所を示し得る印、及び／又は組織収集バッグが器具内にクランプ若しくは固定され得る場所を示し得る印を含み得るが、試料が得られた患者を示す印なしでもよい（患者の印が、使用される際に組織収集バッグ上に印字され得、それに対して、クランプ若しくは固定、又はヒートシールに関する印が、使用開始前に組織収集バッグ上に既に存在し得る場合を含む）ことが理解されるべきである。任意の関連付けられたチューブを含む組織収集バッグは、略クリア、透明、若しくは半透明、又は望ましい任意の色とすることができる。任意の関連付けられたチューブを含む組織収集バッグは、概して、閉鎖又は封止された、血液収集、組織培養、バイオプロセス、又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似の方式で製作され得る。本発明における関連付けられたチューブは、溶着及び／若しくは封止に有利である所望の材料と同等の、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）又はＰＶＣを含む材料を含む、任意の所望の材料から構築され得る。組織を受容するための本発明の組織収集バッグの一部分は、ヒートシールに有利である所望の材料と同等の、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）又はＥＶＡを含む材料を含む、任意の所望の材料から作製され得る。
図１１Ａに示されるように、組織を処置する、例えば、組織の脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のためのキット２の実施形態。治療される組織は、固形真核性の、特に、試料及び／又は生検からの組織などの、哺乳動物組織を含み得る。キット２は、収集バッグ４及び凍結保存バッグ６などの、バッグ４、６などの構成要素を含む。図１１Ａ～図１１Ｄに図示されるキットは、治療のための自動又は半自動デバイスで使用され得る。
いくつかの実施形態では、キット構成要素は、本発明の実施形態における自動デバイス内などの自動及び／又は半自動治療中にスキャン及び認識され得るように、コード、文字、単語、名称、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイックレスポンス（ＱＲ）コード、スマートトラッカー及び／若しくはＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）トラッカーなどのトラッカー、無線周波数タグなどのタグ、並びに／又は他のデジタル認識可能な識別タグなどの、インジケータを含み得る。例えば、タグは、自動的に治療されるために必要な条件及び／又はステップについての情報を提供し得る。例えば、バッグなどのキット構成要素をスキャンすることは、キットとともに使用される自動システムが、更なる介入及び／又は汚染なしで組織を治療することを可能にし得る。特に、デバイスの脱凝集要素における治療のために収集バッグ内に配置された組織試料。収集バッグは、治療開始前に封止され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグは、治療開始前に、熱、無線周波数エネルギー、高周波（ＨＦ）エネルギー、誘電体エネルギー、及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーを使用して手動及び／又は自動で封止され得る。
いくつかの実施形態では、加熱バーのバーを有するヒートシーラー（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔａｅｈｌ ＭＳ－３５０、Ｕｌｉｎｅ Ｈ－１９０ Ｉｍｐｕｌｓｅ Ｓｅａｌｅｒ、又は当該技術分野で公知の類似のシーラー）は、バッグ上の封止を作成するために使用され得る。
特定の実施形態では、ヒートシーラーを使用するとき、それは、約１００℃未満、かつ約０．８ｂａｒ～約２．８ｂａｒの範囲の圧力で封止を形成するために有利であり得る。この上昇した温度及び圧力は、約８秒間適用され得、その後、温度は、低下し得るが、いくつかの実施形態では、圧力は、約２～３秒間適用され続ける。温度、圧力、及び時間の値は、バッグを形成する材料、特に封止を形成する材料の配合に基づいて変化することになる。例えば、別の材料は、シーラーが約２１０°Ｆ（９８．９℃）を上回る温度に最短で約３秒間で到達することを必要とし得、その後、加熱バーは、加熱バーを取り外す前に５秒間冷却することを可能にされ得る。
封止される材料の位置付けは、形成された封止の強度にとって重要であり得る。例えば、封止される材料の不完全な封止、折り目、チャネル、及び／又は間隙は、封止の強度を低減させ得る。
封止は、シールピール試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ８８／Ｆ８８Ｍ）、及び／又は破裂試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ１１４０／Ｆ１１４０Ｍ若しくはＡＳＴＭ Ｆ２０５１／Ｆ２０５４Ｍ）を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に１００ニュートンの力に耐え得、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に７５ニュートンの力に耐えて、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
図１１Ａに示されるように、キット２は、収集バッグ５が処理され得る脱凝集要素４、フィルタ９が位置し得る濃縮要素８、及び凍結保存バッグ７が所望の材料を保存するために使用される安定化要素６を含む。収集バッグ５などのキット２の構成要素では、組織が治療される。例えば、収集バッグ５は、真核細胞に由来する固形組織の脱凝集に使用され得る。組織は、処理後の結果として生じる組織の大部分が単一細胞及び／又は小数の細胞凝集体であり得るような様式で治療され得る。更に、処理は、特に、キット及び／又は収集バッグ内で行われ得る。
治療された組織の濃縮は、フィルタ９の濃縮要素８で行われ得る。フィルタ９は、チューブ１１に入る濾過された組成物（すなわち、所望の材料）が、所定のサイズを有する成分を有し得るように選択され得る。フィルタ９は、チューブ１１に入る所望の材料組成物が、約２００μｍ未満の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの成分を有し得るように選択され得る。例えば、一実施形態では、所望の材料は、約１７０μｍ未満の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、所望の材料は、約１５μｍ～約５００μｍの範囲内の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含み得る。例えば、フィルタ９は、一実施形態では、チューブ１１に入る組織組成物が、約２００μｍの平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。特に、濾過後にフィルタを出てチューブ１１に入る所望の材料は、約１７０μｍ未満の平均サイズを有する成分を有し得る。
いくつかの実施形態では、フィルタ９は、チューブ１１に入る濾過された組成物が、約５０μｍ～約３００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタ９は、一実施形態では、チューブ１１に入る組織組成物が、約１５０μｍ～約２００μｍの範囲の平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。
図１１Ａに示されるように、組織を治療するためのシステムの安定化要素６は、凍結保存バッグ７が保存及び／又は輸送のために組織組成物を安定化するために使用され得る場所にある。
図１１Ｂは、弁１２、１３を有するキット２を図示する。弁は、無針弁であってもよい。弁１２、１３は、腫瘍消化培地、抗凍結剤、及び／又は凍結保存培地などの、酵素培地を提供するために使用され得る。特に、弁１２は、酵素培地をチューブ１０に提供するために使用され得る。酵素培地は、収集バッグ４に移動して、バッグ５内に配置された組織の処理を補助し得る。
弁１３は、ＤＭＳＯ溶液が凍結保存バッグ７に移動し得るように、ＤＭＳＯ溶液などの抗凍結剤をチューブ１１に提供するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯ溶液などの抗凍結剤は、ＤＭＳＯ溶液と濾過された材料との合わせた組成物が凍結保存バッグ７に入るように、チューブ１１に入る濾過された材料と混合し得る。チューブ１１に入る濾過された材料は、所定の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、濾過された組成物中の成分の平均サイズは、約２００μｍ未満であり得る。
いくつかの実施形態では、図１１Ｃに示されるように、キット２は、弁１２、１３を通して提供される材料が、フィルタ９内に流れ込むのを阻止及び／又は防止されることを確保するために、フィルタ９の周りにクランプ１４を含む。弁１３は、抗凍結剤がフィルタ９からチューブ１１に入る濾過された材料と混合し得るように、チューブ１１に抗凍結剤を提供するために使用され得る。例えば、クランプ１４は、フィルタ９の方向に抗凍結剤の流れを阻止及び／又は防止するように位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、濾過された溶液がフィルタ９から流れ始めた後、クランプ１４は、抗凍結剤と濾過された材料との合わせた組成物が安定化要素６で凍結保存バッグ７に入るように解放されることになる。チューブ１１に入る濾過された材料は、所定の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、濾過された組成物中の成分の平均サイズは、約２００μｍ未満であり得る。
キット２の実施形態は、図１１Ｄに示されるように凍結保存バッグ７上のポート１６を含み得る。ポートは、凍結保存バッグ７から材料を添加及び／又は除去するために使用され得る。例えば、試験試料は、凍結保存バッグから除去され得る。
図１２Ａは、キットで使用するためのバッグ２２の実施形態の斜視図を示す。バッグ２２は、コネクタ２４、開放区分２６、封止区分２１、及び位置決め部２３を含み得る。コネクタ２４は、バッグ２２をチューブ２５に結合するために使用され得る。位置決め部２３は、バッグ２２の開口部であり得る。
収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。バッグ、例えば、収集バッグ及び／若しくは凍結保存バッグ、並びに／又はチューブは、概して、閉鎖及び／又は封止された血液並びに／又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。
本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、収集バッグを含み、凍結保存バッグは、熱可塑性、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、例えば、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド（すなわち、ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＥＶＯフィルム）などのコポリマーなどのブレンド、ＥＶＡを含む材料、及び／又は共押出された封止可能なプラスチック層を含み得る。
バッグに使用するための材料は、特定の特性及び／又は特性の選択、例えば、熱溶着に起因する密閉性などの密閉性、無線周波数エネルギーの使用、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性（例えば、－１５０℃又は－１９５℃）、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子、特定のガス（例えば、酸素及び／若しくは二酸化炭素）に対する高い透過速度、並びに／又は規制要件の遵守に対して選択され得る。例えば、バッグに使用される材料は、ＡＳＴＭ Ｄ－６３８に概説される引張強度の試験方法に従って試験されたとき、約２５００ｐｓｉ（１７２ｂａｒ）超の引張強度を有するように選択され得る。特に、バッグなどの可撓性コンテナの実施形態は、ＡＳＴＭ Ｄ－６３８に概説される引張強度の試験方法に従って試験されたとき、約２８００ｐｓｉ（１９３ｂａｒ）超の引張強度を有する使用材料を有する。
いくつかの実施形態では、材料は、バッグの少なくとも１つの層を形成するために、共押出材料で使用するための特定の特性のために選択され得る。層は、構築されたときに、バッグの内部層が比較的生体適合性である、すなわち、バッグの内面上の材料が安定し、バッグの内容物中に浸出しないように、構築され得る。
例えば、収集バッグ、凍結保存バッグ、及び／又は関連付けられたチューブなどのキット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、封止、例えば、ヒートシールに関連し得る。
封止は、シールピール試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ８８／Ｆ８８Ｍ）、及び／又は破裂試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ１１４０／Ｆ１１４０Ｍ若しくはＡＳＴＭ Ｆ２０５１／Ｆ２０５４Ｍ）を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に１００ニュートンの力に耐え得、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に７５ニュートンの力に耐えて、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、特に収集バッグ及び／又は保存バッグの寸法は、治療及び／又は処理を実施するために使用されるデバイスに固有であり得る。バッグサイズは、治療を実施するために使用されるデバイスの構成及び／又はサイズに基づいて調整されるべきである。バッグの境界を越えて延在する任意の構成要素、例えば、ポート、コネクタなどの配置及び／又はサイズには、特別な注意が払われるべきである。ポートなどの構成要素は、治療及び／又は処理を実施するために使用されるデバイスの動作と干渉し得る。更に、特に、製造された封止などの封止材料に関して、バッグの厚さが機械の要件と適合することを確保するように注意が払われるべきである。
本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、ＰＶＣは、溶着及び／又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、図１２Ａ～図１２Ｅ、図１３Ａ～図１３Ｅ、図１４、図２０Ａ～図２０Ｅ、図２１Ａ～図２１Ｅ、図２２Ａ～図２２Ｄ、図２７Ａ、図２８、図３３、及び図３４に図示されるように、収集バッグの少なくとも１つの端が、組織を受容するために開放され得る。特に、一実施形態では、例えば、生検からの組織試料は、例えば、上端などの開放端を通してバッグ内に配置され得る。いくつかの事例では、生検試料は、動物（例えば、イヌ又はネコなどの家畜）又はヒトからのがん性組織であってもよい。
図１２Ａに示されるように、バッグ２２は、組織収集バッグとして使用され得る。例えば、組織がバッグ内に位置付けられた後、バッグが封止され、次いで、処理され得る。処理は、例えば、バッグ内の組織の攪拌、例えば、穏やかな攪拌、抽出、及び／又は酵素消化を含み得る。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの所望の材料の組織処理及びそこからの抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を示すためのインジケータ、並びに／又は収集バッグがクランプされる、封止される、デバイスによって作用される、及び／若しくは器具の定位置に固定され得る場所を示すマークを含み得る。
いくつかの実施形態では、バッグ２２は、封止可能な材料から形成され得る。例えば、バッグ２２は、限定されるものではないが、脂肪族又は半芳香族ポリアミド（例えば、ナイロン）を含む合成ポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）及びそれらのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、ポリエチレン（ＰＥ）などのポリマー、並びに／又はポリマーの組み合わせを含む材料から形成され得る。バッグの部分は、熱、無線周波数エネルギー、高周波（ＨＦ）エネルギー、誘電体エネルギー、及び／又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーで封止及び／又は溶着され得る。
収集バッグは、処理及び／又は脱凝集バッグとして使用され得る。収集バッグは、約４ｃｍ～約１２ｃｍの範囲の幅、及び約１０ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の幅を有し得る。
例えば、処理で使用するための収集バッグは、約７．８ｃｍの幅及び約２０ｃｍの長さを有し得る。特に、バッグは、例えば、ＥＶＡポリマー及びそのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、並びに／又は１つ以上のポリアミド（ナイロン）を使用して、ヒートシール可能であり得る。
図１２Ａに図示されるように、バッグ２２は、本発明の処理のためにその中に組織を封止するための組織収集バッグとして使用され得る。
図１２Ｂは、組織収集バッグとして使用するためのバッグ２２の実施形態の斜視図を示す。組織は、バッグ内に封止され、次いで、処理され得る。図１２Ｂに示されるバッグ２２は、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別し得る患者識別子などのインジケータ２７、２８でマークされ得る。
インジケータとしては、限定されるものではないが、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答（ＱＲ）コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）トラッカーなどのトラッカー、及び／又は当該技術分野で既知の任意のインジケータが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び／又は接着され得る。例えば、インジケータは、図１２Ｂに示されるように、キットの少なくとも１つの構成要素の表面上に直接印刷され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び／又は複数のバッグ上に配置され得る。例えば、図１２Ｂに示されるように、バッグ２２は、複数のインジケータ２８（数字コード）、２７（ＱＲコード（登録商標））を含む。
図１２Ｃは、組織収集バッグとして使用するためのバッグの斜視図を示す。組織は、処理のためにバッグ２２に挿入され得る。インジケータは、組織試料及び／又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するために使用され得る。図１２Ｃに示されるように、インジケータ２７、２８は、プロセスにおいて試料を追跡する、試料を位置決めする、及び／又は試料の状態を追跡するために使用されるＱＲコード（登録商標）及び識別番号を含む。例えば、いくつかの実施形態では、インジケータは、実験室の任意の所与の位置で、試料を位置決めするために使用され得る。インジケータは、使用前及び／又は使用中にバッグ上に配置され得、例えば、バッグが試料とともに使用するために取り出されているときに、患者インジケータがバッグ上に印字されてもよい。更に、バッグ２２は、マーク２９を含み得る。マークは、封止、クランプ、及び／又は器具が位置付けられるべき場所を示すために使用され得る。
インジケータ、例えば、ＱＲコード（登録商標）、スマートタグなどのタグ、及び／又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び／又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。異なるタイプの培地が、これらのプロセスでは、例えば、酵素培地、腫瘍消化培地、及び／又はコントロールレート凍結を可能にし得る凍結保存培地に使用され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キット及び／又はその構成要素は、自動デバイスによって読み取り可能であり得るインジケータを含み得る。次に、デバイスは、そのようなデバイスに挿入されたときに、組織を処理するための特定の完全自動方法を実行し得る。本発明は、試料処理、特に自動処理において特に有用である。
いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び／又はその構成要素は、単回使用であり得る。凍結保存キット及び／又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のための自動及び／又は半自動プロセスで使用され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び／又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
更に、バッグが封止され、クランプされ、及び／又は物体に固定され得る場所を示すために、組織収集バッグなどの、バッグ上の様々な場所にマークが配置され得る。いくつかの実施形態では、バッグが、クランプされ、封止され、及び／又は器具などの物体に固定される場所を示すマークは、使用前にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、１つ以上のマークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約２．５ｍｍ～約７．５ｍｍの範囲の幅を有し得る。概して、封止１４０は、組織材料がバッグ１４０内に配置された後で形成され、約５ｍｍの幅を有し得る。
封止は、シールピール試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ８８／Ｆ８８Ｍ）、及び／又は破裂試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ１１４０／Ｆ１１４０Ｍ若しくはＡＳＴＭ Ｆ２０５１／Ｆ２０５４Ｍ）を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に１００ニュートンの力に耐え得、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に７５ニュートンの力に耐えて、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び／又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約８秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。８秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の２～３秒間圧力が適用され得る。
図１２Ｄは、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための組織収集バッグの実施形態の斜視図を示す。インジケータ２７、２８は、ユーザが使用中に患者を容易に識別し得るように、バッグ２２上に位置付けられる。更に、これらのインジケータは、バッグ内の材料を識別するために、及びバッグ内の材料に対する特定の治療方法の間の進捗を追跡するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、治療中にバッグ内に、約０．１ｍｌ～約２５ｍｌの範囲の培地の体積、及び約０．１ｍｌ～約１０ｍｌの範囲の組織の体積を保持する。治療中のバッグ内の組織の体積に対する培地の体積の比率は、約１．０～約２．５の範囲であるべきである。いくつかの実施形態では、組織の体積に対する培地の体積の比率は、約１．７～約２．３の範囲内である。特に、組織の体積に対する培地の体積の比率は、約２．０～約２．２の範囲内である。
図１２Ｄに示されるように、マーク２９は、バッグ２２の開口端２６に近接して位置付けられる。使用中、マーク２９は、組織試料及び／又は生検試料を治療するために使用される方法に基づいて、バッグ上に位置付けられ得る。マークは、例えば、使用されるか、若しくは使用されるべき処理方法、及び／又は使用される機器に基づいて、使用中にバッグ上に配置され得る。いくつかの実施形態では、マークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、封止及び／又はクランプの場所に対するマークの位置付けは、処理方法及び／又は治療される組織の体積に基づいて変化し得る。
図１２Ｅは、組織収集バッグの斜視図を示す。組織は、バッグ２２の処理に封止され得る。コネクタ２４は、バッグへのアクセスを提供し得る。示されるように、コネクタ２４は、チューブ２５を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに接続され得る。ポート２０は、使用中、バッグ２２から試料を採取する、及び／又はバッグ２２から材料を提供するために使用され得る。
図１３Ａは、組織収集に使用されるバッグの正面図を示す。組織は、使用中にバッグ内に封止され得る。バッグ３０は、封止された縁３１を有して製造され得る。図１３Ａに示されるように、封止された縁３１は、３つの縁上に位置し得、第４の縁は、開放区分３６を含み得る。
バッグ３０上の位置決め部３３は、バッグを位置付けるために使用され得る。例えば、１つ以上の位置決め部は、バッグが使用中に適切に処置され得る、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するように使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。
図１３Ｂに示されるように、バッグ３０は、試料、例えば、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するインジケータを識別するために使用されるインジケータ３６、３７を有し得る。ＱＲコード（登録商標）などのインジケータ３７の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。
図１３Ｃは、組織収集バッグの正面図を示す。組織は、バッグ内に封止され、その中で治療及び／又は処理され得る。バッグ３０は、試料、例えば、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するインジケータを識別するために使用されるインジケータ３７、３８を有し得る。ＱＲコード（登録商標）などのインジケータ３７の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。位置決め部３３は、治療のためにバッグ３０を位置付けるために使用され得る。コネクタ３４は、組織、治療された組織などが、チューブ３５を通じて他のデバイスに結合することを可能にし得る。
図１３Ｄは、試料を識別するために使用されるインジケータ３７、３８を有する組織収集バッグの正面図を図示する。ＱＲコード（登録商標）などのインジケータ３７の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。マーク３９及び／又は位置決め部３３は、処理及び／又は治療中にバッグの位置付けを制御するために使用され得る。使用中にバッグを位置付ける、封止する、及び／又はクランプする場所を示すために、開放端に近接して配置されるマーク。バッグ３０は、封止された縁３１を有して製造され得る。図１３Ｄに示されるように、封止された縁３１は、３つの縁上に位置し得、第４の縁は、開放区分３６を含み得る。
図１３Ｅは、組織が内部に配置された後に封止されることができる組織収集バッグの正面図を示す。コネクタ３４及びポート３２は、バッグへのアクセスを提供し得る。１つ以上のポートは、ポートが培地及び／若しくは試薬の入力並びに／又はバッグからの試料の抽出を可能にするように、収集バッグ上に位置付けられ得る。
示されるように、コネクタ３４は、チューブ３５を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに結合され得る。マーク及びインジケータは、使用に応じてバッグの１つ以上の側に配置され得る。特に、図１３Ｅの場合に示されるように、位置決め部３３、マーク３９、及び／又はインジケータ３７、３８は、攪拌の適用、例えば、ヒートシール（処理のための器具の一部であり得る）による封止、処理及び／又は抽出のための材料の添加などの処理のためにバッグ３０を位置付けるために使用され得る。有利には、処理の適用前に、収集バッグは、処理及び／又は封止、例えば、ヒートシールのために、器具にクランプ又は固定される。
図１４は、組織収集バッグの背面図を示す。特に、バッグ４０は、その中に位置付けられ、処理される組織を有して封止されることができる。封止は、開放端４６に近接して、かつそれに実質的に平行に位置付けられ得る。示されるように、コネクタ４４は、チューブ４６を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに接続され得る。バッグ４０は、封止された縁４１を有して製造され得る。図１４に示されるように、封止された縁４１は、３つの縁上に位置し得、第４の縁は、開放区分４６を含み得る。位置決め部４３は、製造された封止された縁４１によって取り囲まれ得る。
図１５は、内部に組織を封止し、バッグの使用中に組織の処理を可能にすることができる、組織収集で使用するためのバッグ５０の側面図を図示する。バッグ５０は、コネクタ５２によってチューブ５４に結合され得る。
図１６Ａは、封止されていない組織収集バッグの上面図を示す。バッグ６０は、封止された部分６６及び開放部分６４を含み得る。コネクタ６２は、バッグ６０を通して視認可能である。組織をバッグ内に配置した後、バッグ６０の開放された上部分が封止され得る。
図１６Ｂは、処理のために内部に組織を封止するための封止された縁６６を有する組織収集バッグ６０の底面図を示す。コネクタ６２は、バッグ６０上で視認可能である。
図１７Ａは、部分的に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ７０は、封止された部分７６及び開放部分７４を含み得る。コネクタ７２は、バッグ７０を通して視認可能である。組織をバッグ内に配置した後、バッグ７０の開放された上部分が封止され得る。
図１７Ｂは、処理のために内部に組織を封止するための組織収集バッグの底面図を示す。コネクタ７２は、バッグ７０上で視認可能である。
図１８Ａは、部分的に開放されたバッグの上面図を図示する。組織は、バッグ８０の開放端８４を通して挿入され得る。コネクタ８２は、バッグ８０の底部に位置付けられて示される。
図１８Ｂは、組織の収集及び／又は処理のための完全に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ８０の開放端８４は、治療、単離、及び／又は分離などの処理のための組織を受容し得る。封止された縁８６は、製造中に作成され得る。
図１９Ａは、バッグの側部上に封止された縁９６を有する、部分的に開放されたバッグ９０の上面図を図示する。示されるように、組織は、バッグ９０の開放端９４を通して挿入され得る。コネクタ９２は、バッグ９０の底部に位置付けられて示される。
図１９Ｂは、バッグの側部上に封止された縁９６を有する、組織の収集及び／又は処理のための完全に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ９０の開放端９４は、治療、単離、及び／又は分離などの処理のための組織を受容し得る。コネクタ９２は、バッグ９４の底部に位置付けられて示される。
図２０Ａ～図２０Ｅは、組織収集バッグの実施形態の正面図を示す。図２０Ａに示されるように、封止された縁１０１及び開放端１０２を有するバッグ１００は、チューブ１０５及び／又はコネクタ１０４を介してデバイス（図示せず）に接続され得る。例えば、コネクタ１０４は、バッグ１００内に位置付けられるが、一方で、ｙ－コネクタ１０６は、チューブに沿って位置付けられ得る。図２０Ｂは、ユーザが組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別し得るように、インジケータ１０７、１０８を含むバッグ１００の更なる実施形態を示す。
加えて、マーク１０９及びインジケータ１０７、１０８を含むバッグ１００の実施形態が図２０Ｃに図示される。位置決め部１０３の使用は、バッグ内の組織の一貫した処理を可能にする、バッグの一貫した位置付けを可能にし得る。インジケータ１０７、１０８は、試料及び／又は患者情報のいずれかで試料を識別する。いくつかの事例では、インジケータは、組織試料及び／又は生検試料などの試料を識別及び／又は追跡するために使用され得る。図２０Ｄは、複数のインジケータ１０７、１０８及びマーク１０９を有するバッグ１００を図示する。マークは、バッグ１００が封止されるべき場所を示し得る。例えば、マーク１０９は、バッグ１００が、封止される、クランプされる、及び／又は別のデバイスに結合されるべき場所を示し得る。封止するためのマークは、バッグの開口縁に近接して位置付けられ得、例えば、そのようなマークは、開口縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。示されるように、バッグ１００は、コネクタ１０４及びチューブ１０５を含み得る。
図２０Ｅに示される実施形態では、バッグ１００は、ポート１１０及びコネクタ１０４を含む。ポートは、材料の添加及び／又は試料からの材料の除去を可能にし得る。例えば、組織の処理中、試料は、処理全体を通して複数回採取され得る。更に、ポート１１０は、バッグ１００内への培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にし得る。
図２１Ａは、組織の収集及び／又は処理のためのバッグ１００の正面図を示す。組織は、開放端１０２を通してバッグ１００内に配置され得る。コネクタ１０４は、バッグ１００をチューブ１０５及びクランプ１１２に結合するために使用され得る。
図２１Ｂ～図２１Ｅは、バッグ１００の追加の実施形態の正面図を示す。図２１Ｂ～図１１Ｄは、インジケータ１０７、１０８及び／又はマーク１０９を含む様々な構成を示す。バッグは、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答（ＱＲ）コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）トラッカーなどのトラッカー、及び／又は当該技術分野で既知の任意のインジケータなどのインジケータを含み得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び／又は接着され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び／又は複数のバッグ上に配置され得る。収集バッグ及び／又は凍結保存キットは、数値コード及び／又はＱＲコード（登録商標）などの複数のインジケータを含み得る。
インジケータ、例えば、ＱＲコード（登録商標）、スマートタグなどのタグ、及び／又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び／又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。
図２１Ｅは、材料の収集、処理、治療、及び／又は分離に使用されるバッグ１００の別の実施形態の正面図を図示する。治療される組織は、バッグ１００内に封止され得る。チューブ１０５は、コネクタ１０４を通してバッグ１００をクランプ１１２に結合し得る。ポート１１４は、入力及び／又はバッグ１００からの除去を可能にし得る。例えば、ポートは、サンプリングを可能にする、及び／又は凍結保存キットのバッグなどの可撓性コンテナ内への培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にし得る。
図２２Ａは、処理のために内部に組織を封止するための封止された縁１２１を有する組織収集バッグ１２０の別の実施形態の正面図を示す。バッグ１２０は、チューブ１２５に結合された位置決め部１２３及びコネクタ１２４を含む。
図２２Ｂは、封止された縁１２１及び開放端１２２を有する組織収集バッグ１２０の正面図を示す。インジケータ１２７、１２８は、自動システムによって容易にアクセスされ得るように、バッグ１２０上に位置付けられ得る。位置決め部１２３を画定する開口部は、封止された縁１２１によって取り囲まれ得る。インジケータは、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するために使用され得る。
図２２Ｃに示されるように、バッグ１２０は、インジケータ１２７、１２８及びマーク１２９を含む。図２２Ｄは、複数のマーク１２９を有する収集バッグ１２０を図示する。封止のマークは、バッグの開放縁に近接して位置付けられ得る。そのようなマークは、開放縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。
図２３は、バッグ１３０の底部が、コネクタ１３４から出ているチューブ１３５とともにページの上部に示されるように位置付けられた、封止されたバッグ１３０の正面図を図示する。バッグ１３０は、バッグ１３０の封止された部分１３１上にインジケータ１３７を含む。封止された部分上のインジケータは、バッグ１３０の封止中及び／又は封止後に位置付けられ得る。一般的に、バッグは、組織が提供された後に封止される。バッグ１３０の表面上のインジケータ１３８は、バーコードであってもよい。位置決め部１３３は、コネクタ１３４に近接して位置付けられ得る。
収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び／又はチューブは、概して、閉鎖及び／又は封止された血液並びに／又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、ＰＶＣは、溶着及び／又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのコポリマー（すなわち、ＯｒｉＧｅｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＥＶＯフィルム）、並びに／又はＥＶＡを含む材料などの、所定の材料から作製された組織を受容するためのバッグの少なくとも一部分を含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性及び／又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの市場性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
図２４に示されるように、バッグ１４０は、マークを含むエリアが封止される場合、区画１４３がバッグ１４０内に形成され得るように配置される複数のマーク１４１、１４２を含み得る。バッグ１４０は、使用中に試料用の区画の形成に使用され得るバッグの製造中に形成される、予め溶着された区分１４５を有する。図２４は、複数の区画を有するように形成されることができる収集バッグの実施形態を図示する。各区画は、複数の封止及び／又は溶着（例えば、ヒートシールされた）の配置によってバッグ内に形成され得る。例えば、腫瘍懸濁液を収集バッグ内に配置した後、開放端は、溶着して閉じられてもよく、溶着線１４２などの追加のマーク１４１は、熱などのエネルギーを使用して、区画を形成するために溶着され得る。
バッグ１４０上の位置決め部１４３は、バッグが、ＲＦヒートシーラー及び／又はインジェクタのような封止デバイスなどの器具に対して正しく位置付けられることを確保する。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約２．５ｍｍ～約７．５ｍｍの範囲の幅を有し得る。概して、封止１４０は、組織材料がバッグ１４０内に配置された後で形成され、約５ｍｍの幅を有し得る。
封止は、シールピール試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ８８／Ｆ８８Ｍ）、及び／又は破裂試験（すなわち、ＡＳＴＭ Ｆ１１４０／Ｆ１１４０Ｍ若しくはＡＳＴＭ Ｆ２０５１／Ｆ２０５４Ｍ）を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に１００ニュートンの力に耐え得、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に７５ニュートンの力に耐えて、治療及び／又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び／又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び／又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約８秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。８秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の２～３秒間圧力が適用され得る。
いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。したがって、バッグ１４０内に配置された組織は、別個の区画１４４、１４６、１４７に分割され得る。示されるように、各区画１４４、１４６、１４７は、それぞれ、ポート１４８、１４９、１５０を含む。各ポートは、区画への直接的なアクセスを可能にし得る。これは、試料の個別の追加、バンキング、及び／又は試験を可能にする。例えば、封止された収集バッグは、複雑な試料の適合性及び／又は微生物学的特性に対するＴＩＬのバンキング及び試験を容易にし得る。このタイプの検査は、消化された材料の小さいアリコートが凍結されることを必要とし得るため、それにより、消化された材料の小さいアリコートは、別々に解凍され得る。いくつかの実施形態では、図２４に図示されるバッグ１４０は、収集バッグ及び／又は凍結保存バッグとして使用され得る。
図２５は、収集バッグの実施形態の正面図を示す。この実施形態では、収集バッグ１５２は、約１５０ｍｍ（すなわち、１５ｃｍ）の長さ、及び約９０ｍｍ（すなわち、９ｃｍ）の幅を有する。バッグ１５２は、位置決め部１６０として作用する開口部を含む。１つ以上の位置決め部が、バッグの配向を制御して、バッグが、使用中に処理及び／又は治療のために適切に位置付けられること、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するために使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。封止１５６は、約５ｍｍである。封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を使用して、使用中に形成され得る。封止は、約２．５ｍｍ～約７．５ｍｍの範囲の幅を有し得る。概して、封止１５６は、組織材料がバッグ１５２内に配置された後で形成される。図２５に示されるように、バッグ１５２は、バッグの製造中に形成される予め溶着された区分１５８を有する。
図２６に示されるように、収集バッグは、チューブ及び弁に結合され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、約１０ｃｍ～約５０ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約１５ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約１８ｃｍ～約２２ｃｍの範囲の長さを有し得る。図２６に示されるバッグ１６２は、約２０ｃｍの長さを有する。本明細書に説明される使用のための収集バッグは、約６．８ｃｍ～約８．８ｃｍの範囲の幅を有し得る。図２６に示されるように、バッグ１６２は、約７．８ｃｍの幅を有する。限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁１６４は、チューブ１６６によって結合されたバッグ１６２から約２０ｃｍに位置付けられる。チューブ１６６は、別の要素又は構成要素が追加される前に、少なくとも１０ｃｍにわたって無針弁１６４から延在する。
図２７Ａに図示されるように、開放バッグ１７０は、使用前にチューブ１７２、１７４、１７６に結合される。バッグ１７０は、封止可能な材料から構築され得る。特に、バッグは、例えば、ベンチトップヒートシールデバイスなどのヒートシーラーを使用して封止可能であり得る。チューブのうちのいくつか、例えば、チューブ１７４は、溶着不能であってもよい。限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁１７８は、チューブ１７４、１７６の端に位置付けられる。
いくつかの実施形態では、バッグは、約１０ｃｍ～約５０ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約１５ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約１８ｃｍ～約２２ｃｍの範囲の長さを有し得る。図２７Ａに示されるバッグ１７０は、約２０ｃｍの長さを有する。
図２７Ｂは、例えば、バッグ内の材料の堆積後に封止された収集バッグの実施形態の正面図を示す。バッグ１８０は、封止可能な材料から構築される。特に、バッグは、例えば、ベンチトップヒートシールデバイスなどのヒートシーラーを使用して封止可能であり得る。封止は、バッグの開口縁に近接して位置付けられ得、いくつかの事例では、マークは、開口縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止は、開口縁と実質的に平行であり得る。
チューブのうちのいくつか、例えば、チューブ１８２、１８４、１８６は、溶着可能であってもよい。溶着可能なチューブは、ポリマー材料、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）から作製され得る。
限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁１８８は、チューブ１８４、１８６の端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、バッグは、約１０ｃｍ～約４０ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約１５ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約１８ｃｍ～約２２ｃｍの範囲の長さを有し得る。図２７Ａに示されるバッグ１８０は、約２０ｃｍの長さを有する。
図２８に示されるように、凍結保存キットの実施形態は、上向きに示され、開放バッグ１９０及び凍結保存バッグ１９２を含む。示されるように、凍結保存バッグ１９２は、インジケータ１９３、１９４を含み得る。凍結保存バッグは、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）などの抗凍結剤を用いた凍結保存に好適である必要があり得る。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、バッグが約５ｍｌ～約４５ｍｌの範囲の体積の材料を保持し得るように構築され得る。特に、凍結保存バッグは、約１０ｍｌ～約３５ｍｌの範囲の材料の体積を収容することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、約１５ｍｌ～約３０ｍｌの範囲で保存される材料の体積を収容し得る凍結保存バッグを含む。凍結保存バッグ１９２は、所望の所定の体積が達成されるようにサイズ決めされていてもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、約４ｃｍ～約１１ｃｍの範囲の幅、及び約１０ｃｍ～約１８ｃｍの範囲の長さを有し得る。例えば、凍結保存バッグは、約５．８ｃｍ～約９．８ｃｍの範囲の幅、及び約１２ｃｍ～約１６ｃｍの範囲の長さを有し得る。特に、図２８に図示される凍結保存バッグの一実施形態は、約７．８ｃｍの幅及び約１４ｃｍの長さを有し得る。
使用前に、凍結保存キット及び／又はその特定の構成要素は、滅菌され得る。例えば、バッグ１９０、１９２は、滅菌され得る。バッグ１９０、１９２を形成するために使用される材料は、ヒートシール可能であり得る。バッグで使用するための材料としては、限定されるものではないが、ＥＶＡ、ポリアミド（例えば、ナイロン）、及びそれらの組み合わせなどのポリマーを含み得る。開放バッグ１９０は、封止及び／又はクランプ（図示せず）を使用してバッグを閉鎖した後の処理及び／又は脱凝集に使用され得る。
キット１９１は、弁１９５、１９６、クランプ１９７、１９８、チューブ１９９、及びフィルタ２００を更に含む。フィルタ２００は、インラインフィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、生物学的フィルタ、及び／又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所望の材料を形成するために、処理された組織から所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、所望の材料が形成されるように、約２００μｍ未満の平均サイズを有する成分を有し得る。例えば、所望の材料は、約１７０μｍ未満の平均サイズを有するＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を含み得る。
フィルタは、フィルタの後、所望の材料が、約１５μｍ～約５００μｍの範囲のサイズを有する成分を有する安定化要素の方向にチューブ内に流れるように、チューブから入る処理された組織組成物が濃縮され得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後に安定化要素の方向にチューブに入る組織組成物が、約５０μｍ～約３００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約１５０μｍ～約２００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、濃縮要素のフィルタは、処理された組織から、約５μｍ～約２００μｍの所定のサイズ範囲外の材料を除去して、所望の材料を形成し得る。例えば、所望の材料は、約５μｍ～約２００μｍの範囲の平均サイズを有するＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を含み得る。弁１９５、１９６は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁１９５は、収集バッグ１９０から約２０ｃｍに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグ１９０に添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグ１９０に添加するために、無針弁１９５に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも１０ｃｍのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ１９９は、封止可能及び／又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、ＰＶＣ（ポリビニルクロリド）、及び／又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約１．５ｍｍ～約４．５ｍｍの範囲の内径、及び約２．１ｍｍ～約６．１ｍｍの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約２．９ｍｍ～約３．１ｍｍの範囲の内径を有し、約４．０ｍｍ～約４．２ｍｍの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット１９１で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約１ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有する。例えば、図２８に図示されるように、個々のチューブ要素の長さは、約５ｃｍ～約２０ｃｍで変化し得る。
図２８に図示されるクランプ１９７、１９８は、フィルタ内への酵素培地及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。例えば、クランプ１９７は、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への酵素培地及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。クランプ１９８は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び／又は防止し得る。
図２９は、図２８に示されるキット１９１に類似した凍結保存キットの実施形態の上面図を示すが、キット２０１は、下向きである。図２９は、収集バッグ２０２が閉鎖され得る位置を図示する。
図３０は、閉鎖された収集バッグ２０６及び凍結保存バッグ２０８を含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグ２０８は、サンプリングを可能にし、凍結保存バッグ内への培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にするポート２１５、２１６を含み得る。凍結保存キット２０５は、フィルタ２１４、弁２０９、２１０、クランプ２１１、２１２、及びチューブ２２２を含み得る。
フィルタ２１４は、インラインフィルタ、生物学的フィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、及び／又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。フィルタは、フィルタ後にチューブに入る組織組成物が、約１５μｍ～約５００μｍの範囲のサイズを有する成分を有し得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約５０μｍ～約３００μｍの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約１５０μｍ～約２００μｍの範囲の平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、約１７０μｍ未満の平均サイズを有する成分を有し得る。
弁２０９、２１０は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁２０９は、収集バッグ２０６から約２０ｃｍに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグ２０６に添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグ２０６に添加するために、無針弁２０９に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも１０ｃｍのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ２２２は、封止可能及び／又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、ＰＶＣ、及び／又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約１．５ｍｍ～約４．５ｍｍの範囲の内径、及び約２．１ｍｍ～約６．１ｍｍの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約２．９ｍｍ～約３．１ｍｍの範囲の内径を有し、約４．０ｍｍ～約４．２ｍｍの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット２０５で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約１ｃｍ～約３０ｃｍの範囲の長さを有する。例えば、図３０に図示されるように、個々のチューブ要素の長さは、約５ｃｍ～約２０ｃｍで変化し得る。
図３０に図示されるクランプ２１１、２１２は、フィルタ内への酵素培地及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。例えば、クランプ２１１は、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への培地酵素溶液及び／又は消化された組織の移動を阻害及び／又は防止するために使用され得る。クランプ２１２は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び／又は防止し得る。
図３１は、閉鎖された収集バッグ２２６及び凍結保存バッグ２２８を含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の側面図を示す。凍結保存バッグ２２８は、ポート２４２を含み得る。ポート２４２は、凍結保存バッグ２２８へのアクセスを提供する。弁２３２、２３８及びクランプ２３４、２３６は、フィルタ２３０の周りに位置付けられ、凍結保存キット２２４内の流体の移動を制御するために使用され得る。
図３２は、凍結保存キットの実施形態の端面図を示す。封止されたバッグ２２６及びフィルタ２３０は視認可能である。封止されたバッグ２２６は、チューブ、弁、及び／又はクランプを使用してフィルタ２３０に結合され得る。
図３３は、収集バッグの実施形態の上面図を示す。バッグ２３２は、開放して示され、インジケータ２３４、２３６及びマーク２３８、２４０を含む。マークは、バッグの部分が封止及び／又はクランプされるべき場所を示すために使用され得る。封止のマークは、バッグの開放縁に近接して位置付けられ得る。そのようなマークは、開放縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。
バッグ２３２は、位置決め部２４４及びコネクタ２４６を含む。コネクタ２４６は、バッグ２３２をチューブ２４８に結合する。コネクタ２４６は、チューブ２４８が、クランプ２５４、２５６及び／又はポート２５８、２６０を含むチューブ２５０、２５２に分割することを可能にし得る。
図３４は、収集バッグ２６４、クランプ２６６、２６８、フィルタ２７０、チューブ２７２、ポート２７４、２７６、弁２７８、コネクタ２８０、及び凍結保存バッグ２８２を含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。収集バッグ及び関連付けられたチューブは、少なくともいくつかのＥＶＡ材料を使用して形成され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグ及び／又はチューブは、ＥＶＡから形成され得る。クランプ２６６、２６８は、ピンチクランプであってもよい。コネクタ２８０は、４方向コネクタであり、弁２７８、例えば、無針弁に、並びに凍結保存バッグ２８２に結合されたチューブにフィルタ２７０からのチューブを結合するために使用され得る。
図３５は、収集バッグ２８４、ポート２８６、クランプ２８８、２９６、弁２９０、２９２、フィルタ２９８、及び凍結保存バッグ２９４を含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。図示されるように、弁２９０、２９２は、処理中にキットで使用するための材料を受容することができる無針弁であり得る。例えば、弁２９０、２９２を介して提供される材料としては、例えば、腫瘍消化培地、並びに／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの抗凍結剤若しくは凍結保存培地、並びに／又は５５％のＤＭＳＯ及び５％のデキストラン凍結保存培地（例えば、ＢｌｏｏｄＳｔｏｒ ５５－５）などのそれらの溶液が挙げられる。シリンジ３００、３０２は、無針弁２９０、２９２を通じて、それぞれ、５５％のＤＭＳＯ及び５％のデキストラン凍結保存培地などの、腫瘍消化培地及び５５％のＤＭＳＯ溶液を提供するために使用され得る。処理中、材料は、所定の時間に凍結保存キットに選択的に提供され得る。更に、クランプは、腫瘍消化培地などの提供される材料の流れを制御するために使用され得る、及び／又はＤＭＳＯ溶液などの抗凍結剤は、収集バッグ、フィルタ、及び／又は凍結保存バッグなどのデバイスに所定の時間に提供され得る。
図３６Ａは、消化装置などのデバイスに固設されることができる凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。示されるように、収集バッグ３０４は、使用中に少なくとも部分的にブラケット３０６によって包囲される。ブラケットは、処理が効率的な様式で発生し得るように、収集バッグ３０４を位置付け得る。図３６Ａは、溶着３１０を有し、溶着３１０に対する圧力を低減するために使用中に溶着３１０に近接するクランプ３１２を利用する、収集バッグ３０４を図示する。使用中に導入される組織は、組織がデバイスからのパドル３１４、３１６を使用して治療され得るように、収集バッグ３０４内に実質的に均等に分布され得る。凍結保存バッグ３３０は、複数の区分３３２を有し、各々が、独自のポート３３４を有する。
ブラケットを使用して固設された収集バッグの実施形態の側面図が図３６Ｂに図示される。ブラケット３３６は、収集バッグを固設するために使用され得る。ブラケット３３６は、ヒンジ３３８、上側３４０、下側３４２、クランプ３４４、突出部３４６、及びラッチ３４８を含む。使用中、クランプ３４４は、収集バッグ上の溶着に近接して位置付けられ得る（図３６Ａ）。ブラケット３３６上の突出部３４６は、それが収集バッグの表面の近位に位置付けられ、使用中に収集バッグ内に突き出るように構築される。いくつかの実施形態では、突出部３４６は、組織の処理が収集バッグの長さに沿って実質的に同様であることを確保するために、使用中に組織及び／又は培地の移動を低減及び／又は阻害し得る。例えば、突出部は、パドル間の組織の摺動を低減及び／又は阻害するように構築され得る（図３６Ａに示される）。ブラケット３３６はまた、収集バッグが固設されていることを確保するためのラッチ３４８を含み得る。
図３６Ｃは、収集バッグとともに使用するための隆起３５０を含むクランプ３４４の分解図を示す。特に、使用中、クランプ３４４は、溶着及び／又は封止の不具合のリスクを低減するために、収集バッグ上の溶着に近接して位置付けられ得る。
図３７は、収集バッグ３５４、フィルタ３５６、弁３６２、３６４、クランプ３５８、３６０、チューブ３６８、及び凍結保存バッグ３６６を含む凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。凍結保存キット３５２の様々な構成要素間のチューブ長さは、変化し得る。
図３８は、収集バッグ３５４、フィルタ３５６、弁３６２、３６４、クランプ３５８、３６０、チューブ３６８、及び凍結保存バッグ３６６を含む、下向きに位置付けられた凍結保存キットの実施形態の図を示す。
脱凝集産物材料が特定の実施形態では適切に保存され得ることを確保するために、２つ以上のバッグが一緒に結合され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、組織、例えば、固体哺乳動物組織からの細胞及び／又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集、濃縮、及び／又は安定化のための自動デバイスを含み得る。本発明で使用するための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び凍結保存キットを含み得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キットは、単回使用無菌キットであり得る。本発明は、半自動無菌組織処理方法に更に関する。
いくつかの実施形態では、収集バッグなどのバッグは、収集キットに使用され得る。バッグは、組織試料などの試料の添加を可能にする開放端を有する。コネクタは、収集キット内のチューブにバッグを結合し得る。チューブ材料は、封止可能及び／又は溶着可能であってもよい。例えば、チューブは、熱、無線周波数などのエネルギーを使用して封止され得る。チューブ材料は、ＰＶＡから作製され得る。
いくつかの実施形態では、チューブは、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物を含む、１つ以上の培地酵素溶液の添加を可能にするために弁に結合され得る。例えば、弁は、無針弁であり得る。
凍結保存キットに使用されるチューブは、約２．０ｍｍ～約４ｍｍの範囲のチューブの内径を有する約３．０ｍｍ～約５．０ｍｍの範囲の外径を有するチューブを含み得る。特に、チューブは、４．１＋／－０．１ｍｍの外形及び約３．０＋／－０．１ｍｍの内径を有し得る。チューブの長さは、収集キットの構成に依存し得る。例えば、収集キットの実施形態は、約１０ｃｍ～約２０ｃｍの範囲の長さを有するチューブを含み得る。
収集キットのいくつかの実施形態では、プロトタイプは、組織及び／又は酵素培地の移動を阻害及び／又は防止するための１つ以上のクランプを含み得る。特に、酵素培地及び／又は組織は、濾過ステップの前にフィルタ内に移動するのを阻害され得る。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
段落１． 単回使用無菌キットであって、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、該モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、該モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、単回使用無菌キット。
段落２． １つ以上の可撓性コンテナが、弾性変形可能な材料を含む、段落１に記載の単回使用無菌キット。
段落３． 脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、１つ以上の封止可能な開口部を含む、段落１又は２に記載の単回使用無菌キット。
段落４． 脱凝集モジュールの可撓性コンテナが、ヒートシール可能な溶着を含む、段落３に記載の単回使用無菌キット。
段落５． １つ以上の可撓性コンテナが、内部に丸みを帯びた縁を含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落６． 脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、その中に固形組織を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落７． 濃縮モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、細胞化脱凝集固形組織の保持物を保持するフィルタを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落８． 安定化モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落９． キットが、デジタル、電子、又は電磁タグインジケータを更に含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１０． タグインジケータが、脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、それらのプロセスで使用される１つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連する、段落９の単回使用無菌キット。
段落１１． 同じ可撓性コンテナが、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの１つ以上の一部を形成し得る、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１２． 脱凝集モジュールが、処理される組織の受け取りのための第１の可撓性コンテナを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１３． 脱凝集モジュールが、脱凝集のための培地を含む第２の可撓性コンテナを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１４． 任意選択の濃縮モジュールが、濃縮された濾液を受容するための第１の可撓性コンテナ及び第３の可撓性コンテナを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１５． 脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第２の可撓性コンテナを含み、第２のコンテナが、消化培地及び安定化培地を含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１６． 安定化モジュールが、安定化培地を含む第４の可撓性コンテナを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１７． 安定化モジュールはまた、保存する及び／又は凍結保存を受けるための第１の可撓性コンテナ及び／又は第３の可撓性コンテナを含む、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
段落１８． 哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び任意選択の濃縮のための半自動プロセスにおける、先行段落のいずれかに記載の単回使用無菌キットの使用。
段落１９． 哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化のための自動デバイスであって、プログラム可能プロセッサと、段落１～１７のいずれかの単回使用無菌キットと、を備える、自動デバイス。
段落２０． 単回使用キットを認識する無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落１９に記載の自動デバイス。
段落２１． プログラム可能プロセッサが、タグを介して単回使用無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにそれらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行することができる、段落１９又は２０に記載の自動デバイス。
段落２２． プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び安定化モジュールのうちの１つ以上と通信し制御するように適合されている、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落２３． プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び／又は生物学的分解を可能にする、段落２２に記載の自動デバイス。
段落２４． プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び／又は酵素的分解を可能にする、段落２３に記載の自動デバイス。
段落２５． 固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される１つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落２４に記載の自動デバイス。
段落２６． プログラム可能プロセッサが、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落１９～２５のいずれか１つに記載の自動デバイス。
段落２７． プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化モジュールを制御して、濃縮された脱凝集固形組織をコンテナ内で凍結保存する、段落１９～２５のいずれか１つに記載の自動デバイス。
段落２８． デバイスは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための１つ以上の弁、並びに／又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための１つ以上のクランプの追加の構成要素のうちの１つ以上を任意の組み合わせで更に備える、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落２９． プログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落３０． ユーザインターフェースを更に備える、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落３１． インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落２３に記載の自動デバイス。
段落３２． 自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落３３． 半自動無菌組織処理方法であって、任意選択的に段落１～１７のいずれかに記載のキットに従って、無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、無菌処理キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に組織試料を配置することと、脱凝集モジュール、任意選択の濃縮モジュール、及び安定化モジュールと通信して制御することによって、１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、を含む、方法。
腫瘍材料、凍結保存、及びＴＩＬ製造の収集のための手順
ＴＩＬ製造のための出発材料は、適格患者からの自己ＴＩＬ及び腫瘍細胞を含有する、脱凝集され凍結保存された細胞懸濁液である。腫瘍出発材料の収集及び処理のための例示的なフロー図（図６５）が提供される。
腫瘍が外科的に切除され、次いで、トリミングされて、視認可能な壊死組織、視認可能な健常（非がん性）組織、脂肪組織、及び過剰な血液を除去する。トリミングされた腫瘍重量は、２グラム以上（≧２グラム）であるべきである。７ｇを超える重量の腫瘍は、より小さい部分に分割され、個別に脱凝集され得る。
各腫瘍断片は、培地、コラゲナーゼ、及びＤＮＡｓｅを含有する個々の滅菌バッグ内に配置される。例示的な試薬が以下の表に示される。
次いで、バッグがヒートシールされ、その内容物が脱凝集されて、腫瘍及びＴＩＬを含有する均質な細胞懸濁液を生成する。脱凝集は、腫瘍組織への酵素アクセスを確保し、それによって、酵素消化を加速するために、定義された持続時間にわたって定義された圧縮圧力で、所定の数の繰り返される物理的圧縮事象を引き渡すプログラムを実行する、本明細書に説明されるＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒデバイスなどのデバイスによって実施される。サイクル数、圧力、温度、及び持続時間は、各個々の腫瘍毎に記録される。
次いで、均質化された細胞懸濁液が、２００μｍのフィルタ（Ｂａｘｔｅｒ、ＲＭＣ２１５９）を使用して無菌濾過され、濾液が凍結保存バッグ中に無菌で通過する。ＢｌｏｏｄＳｔｏｒ ５５－５（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）が、５％のＤＭＳＯを達成するために無菌添加される。次いで、細胞懸濁液が、定義された冷却プログラムを有するＴｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒデバイスを使用して凍結保存され、測定された温度プロファイルが、各腫瘍部分に由来する各個々の細胞懸濁液について記録される。凍結保存細胞懸濁液は、液体窒素の気相中に保存される。
凍結保存細胞懸濁液の推奨保存条件は、≦－１３０℃である。
細胞懸濁液は、凍結保存細胞懸濁液が≦－１３０℃で維持されることを確保することが検証されたコンテナに包装された、資格要件を満たした宅配便によって、臨床現場からＧＭＰ細胞療法製造所に輸送される。
（Ｔｉｓｓ－ｕ－Ｓｔｏｒ）
切除腫瘍は、重量及び状態について評価される。各腫瘍断片について、異物が除去され、断片が計量される。ＣＳ５０Ｎバッグが開放され、最大約７ｇの腫瘍が添加され、次いで、バッグが封止される。１５ｍｌのＥＤＭ消化培地が、無針ポートを介してシリンジによって１ｍｌのＥＤＭ当たり２μｌのゲンタマイシン／アンホテリシンを伴ってバッグに添加され、その後、バッグからシリンジ内への空気の除去に続く。
脱凝集バッグ中の腫瘍組織及び脱凝集培地は、温度制御された組織脱凝集装置内に配置される。温度は、周囲温度から１．５℃／分の速度で３５℃まで上昇し、３５℃で合計約４５分間維持され、その間、脱凝集装置は、２４０サイクル／分でアクティブである。
脱凝集されると、腫瘍材料は、インラインフィルタを通して二次凍結バッグに濾過される。１．５ｍｌのＢｌｏｏｄ ｓｔｏｒ（ＤＭＳＯ）が無針ポートを介して注射され、空気が除去される。
試験のために、２ｍｌの懸濁液が引き込まれる。
任意選択の凍結保存について、凍結バッグが、凍結カセットに装填され、凍結カセットがＶｉａ ｆｒｅｅｚｅ内に配置される。次いで、Ｖｉａ ｆｒｅｅｚｅが、－８０℃、好ましくは、－２℃／分の速度で、３５℃から－８０℃まで直接的に冷却される。
次いで、凍結された凍結バッグが液体窒素倉庫に移される。
ＴＩＬ製造
英国（ＵＫ）で培養に使用される自己組織は、適切な同意、Ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ、Ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｃｕｓｔｏｄｙ、ドナーがＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１＆２、ＨＴＬＶ－１＆２、及びＳｙｐｈｉｌｉｓに対して陰性であることを確認するスクリーニングとともに、英国の人体組織管理庁によって確立されたＨＴＡ－ＧＤ－２０、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔに準拠するべきである。
製造は、切除腫瘍に由来するＴＩＬ及び腫瘍細胞を含有する凍結保存細胞懸濁液からの外殖及び増殖を伴う。腫瘍が約７ｇ超である場合、切除プロセスは、複数の凍結保存細胞懸濁液を生成し、各細胞懸濁液は、２～７ｇの腫瘍断片に由来する。典型的には、１つのＴＩＬ外殖のために１つの細胞懸濁液のみが解凍される必要があるが、一方で、残りの凍結保存細胞懸濁液は、ＧＭＰ管理下に留まり、推奨保存条件（液体窒素の気相）で保持される。
特定の実施形態では、細胞懸濁液は、脱凝集後、凍結保存前に濾過されている。例示的な製造手順が図６６に示される。例示的な製造原材料が、以下の表に提供される。
Ｔ細胞培地（ＴＣＭ）は、アルブミン（ヒト）、ヒトホロトランスフェリン、及び動物起源コレステロールを含有する。アルブミン及びトランスフェリンを製造するために使用されるソース血漿は、米国から調達され、ドナーは、外来性感染物質について試験される。
コレステロールは、オーストラリア／ニュージーランドを起源とするヒツジの毛皮から調達され、これは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の症例が報告された国からの反すう動物起源材料を禁止するＵＳＤＡ規制に準拠している。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、オーストラリア／ニュージーランドから調達され、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の症例が報告された国からの反すう動物起源材料を禁止するＵＳＤＡ規制に準拠している。ＦＢＳは、２１ＣＦＲパート１１３．４７に準拠して試験され、具体的には、ブルータングウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシＲＳウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、細胞変性剤、血液吸着剤を含む。ＦＢＳは、５６℃で３０分間、熱不活性化され、０．１μｍで三重濾過されて、２つの直交ウイルス除去ステップを提供する。
ヒトＡＢ血清は、ＦＤＡ登録施設（１１２１９５８）であるＶａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから調達される。各ドナーユニットは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸増幅試験（ＮＡＴ）、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型及び２型、ＨＩＶ－１ ＮＡＴ、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＣＶ ＮＡＴ、並びにＦＤＡ承認方法による梅毒の試験について試験される。血清は、５６℃で３０分間、熱不活性化され、０．１μｍで濾過される。
照射されたバフィーコートの調達、調製、出荷、及び保管：スコットランド国立輸血サービス（ＳＮＢＴＳ）は、ドナーをスクリーニングし、血液成分を収集し、バフィーコートを調製及び照射する。ＳＮＢＴＳは、血液、血液成分、及び組織を調達、処理、試験、保管、及び流通のために、Ｂｌｏｏｄ，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（２００５）に従って、英国の人体組織管理庁（ライセンス番号１１０１８）により認可されている。
健常ドナーのスクリーニングは、米国連邦規則集（ＣＦＲ）タイトル２１パート１２７１．７５に説明される要件を満たすか、又は超過し、ドナーが英国に居住していることは例外とする。これは、孤発性クロイツフェルト－ヤコブ病（ｓＣＪＤ）又はバリアントクロイツフェルト－ヤコブ病（ｖＣＪＤ）の理論上のリスクを提示するが、英国は、堅牢な国家監視プログラムを有する。１９９０年５月～２０１８年１２月３１日（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＣＪＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｕｎｉｔ，２０１８）を対象とした最新の年次報告書は、英国におけるｓＣＪＤの発生が、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない国を含む、世界の他の場所で観察されたものと同等であることを確認する。２０１７年～２０２０年４月５日まで、ｖＣＪＤの症例は報告されておらず、２０１２年１月１日以降、国内で識別された症例は２例のみであった（ＮＣＪＤＲＳＵ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ，２０２０）。この厳格な監視ネットワークは、輸血伝染したｖＣＪＤ感染を排除しており、２００７年以降は報告されていない（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＣＪＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｕｎｉｔ，２０１８）。例示的な適格ドナー検査（表７）は、２１ＣＦＲパート１２７１．８５の要件を満たし、必須ではないＥ型肝炎試験を追加する。
認可された血液施設は、重篤な好中球減少症の患者を治療するのに好適である臨床グレードの照射されたバフィーコートを調製する。バフィーコートを調製するために、血液が遠心分離されて、赤血球層、バフィーコート層、及び血漿層の３つの層を形成する。１０人のドナーからのバフィーコートが２５～５０Ｇｙの照射で照射されて、細胞成長を停止させる。臨床グレードの照射されたバフィーコートが調製され、温度モニターを含む制御された温度シッパーを使用して翌日宅配便によってＧＭＰ製造施設に出荷される。出荷は、製造プロセスで使用する１日前に行われる。
受け取り時に、バフィーコートは、製造で使用されるまで１５～３０℃で保持される。
照射されたフィーダー細胞調製
最大１０個の固有のドナーからのバフィーコートがプールされ、次いで、Ｆｉｃｏｌｌ勾配密度遠心分離によって遠心分離されて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取する。約４×１０９個の生存白血球が、閉鎖された静止細胞培養バッグ内で、約８％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇのＯＫＴ－３を補充したＴＣＭ中に再懸濁される。ＰＢＭＣは、仕様に従ってリリースされる。
ＰＢＭＣは、無菌性及びマイコプラズマについても試験される。ステップ３を開始する直前に（１２日目、図Ｃ）、培地、ＩＬ－２、及びＯＫＴ３を含む製剤化されたフィーダー細胞の試料が除去される。この試料は、１３日目、１７日目、及び１８日目にインキュベートされて解析され、フィーダー細胞が増殖しないことを確認する。
アルブミン（ヒト）は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）としても知られ、米国ドナーから調達される。全ての血漿献血は、個別に試験され、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＩＶ１、抗ＨＩＶ２、及び抗ＨＣＶ抗体に非反応性である。各血漿プールが試験され、ＮＡＴによってＨＢｓＡｇ、抗ＨＩＶ１、抗ＨＩＶ２、及びＨＣＶ－ＲＮＡに対して陰性であることが判明した。ＨＳＡ産物は、米国及び欧州薬局方の生産及び試験基準を満たすＧＭＰ規制に従って製造される。
ＴＩＬ外殖
細胞懸濁液は、１０％のＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を有する０．２５μｇ／ｍＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、及びインターロイキン－２（ＩＬ－２、アルデスロイキン）３０００ＩＵ／ｍＬ（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ、Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充されたＴＣＭ内に約０．２５×１０６～０．７５×１０６個の生存細胞／ｍＬで播種し、標準培養条件（３７℃、５％のＣＯ２）で培養される。
５日目に、培地の半分が除去され、１０％のＦＢＳ、０．５０μｇ／ｍＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ、及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴＣＭで交換される。
７日目に、細胞濃度が＞１．５×１０６個の生存細胞／ｍＬである場合、ＴＩＬ増殖培養物が、３倍の体積で希釈されて、約０．１×１０６～２．０×１０６個の生存細胞／ｍＬを維持する。細胞濃度が≦１．５×１０６個の生存細胞／ｍＬである場合、培地の半分が交換される。いずれの選択肢においても、培地は、１０％のＦＢＳ、０．５０μｇ／ｍＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ、及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴＣＭである。
１０日目に、細胞濃度が＞１．５×１０６個の生存細胞／ｍＬである場合、ＴＩＬ増殖培養物が、３倍の体積で希釈されて、約０．１×１０６～２．０×１０６個の生存細胞／ｍＬを維持する。細胞濃度が≦１．５×１０６個の生存細胞／ｍＬである場合、培地の半分が交換される。いずれの選択肢においても、追加される培地は、１０％のＦＢＳ、０．５０μｇ／ｍＬのＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ、及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴＣＭである。
ＴＩＬ活性化
ＴＩＬは、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を使用して活性化されて、同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの照射されたフィーダー細胞のＦＣ受容体に結合されたときにＣＤ３特異的刺激を提供する。フィーダーは、添加される抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）を支持するための追加の共刺激の天然源を提供する。
１２日目に、ＴＩＬ外殖ステップ２からの１～２０×１０６個の生存Ｔ細胞が、約３０±１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、約８％のヒトＡＢ血清、及び３０００±１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を使用して、２．０～４．０×１０９個の生存照射フィーダー細胞（セクション８．１．４．４）に添加される。ＴＩＬ活性化培養物が、標準細胞培養条件で６日間インキュベートされる。
ＴＩＬ増殖
１８日目に、活性化ＴＩＬは、約８％のヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴ細胞培地を含有するバイオリアクターに、活性化ＴＩＬ細胞懸濁液を無菌添加することによって、増殖し続ける。
１９日目に、ＴＩＬ増殖は、採取まで３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充されたＴ細胞培地の連続的な供給が提供される。
ＴＩＬは、ＳＥＦＩＡＴＭを使用して細胞を洗浄することによって採取される。細胞は、遠心分離により濃縮され、次いで、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、２～４回洗浄される。次いで、細胞がＰＢＳ＋１％のＨＳＡ中に約５０～６０ｍＬまで再懸濁される。
洗浄及び濃縮された細胞は、凍結バッグ内に無菌で移され、ロットリリース試験のために一部分が除去され、試料が保持される。医薬品（ＤＰ）を製剤化するために、次いで、ＴＩＬが、２～８℃に冷却され、例えば、１６％のＨＳＡ及び２０％のＤＭＳＯを含有する抗凍結剤を用いて１：１で製剤化して、ＰＢＳにおいて、約１０％のＤＭＳＯ及び８．５％のＨＳＡ中に懸濁された、≧５×１０９個の生存細胞の製剤化産物を達成する。ロットリリース試験のために一部分が除去され、試料が保持される。凍結バッグが－８０℃まで冷却される。
ＴＩＬ製造プロセス
以下の表は、プロセス変動の例を示す。
以下の表は、医薬品データを示す
凍結保存された細胞懸濁液及び新鮮細胞懸濁液を比較して、代表的な収率は、同様の原薬収率（図６７Ａ）、生存率（図６７Ｂ）、及びＴ細胞率（図６７Ｃ）として構成された。
凍結保存の最適化－腫瘍材料の代替として、単離されたＰＢＭＣを、Ｔｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒプロセス及び材料を使用して消化した。市販の凍結保存剤（ＣＰＡ）を、解凍後生存率が最大化された試薬を決定するために、様々な条件にわたって評価した（図６８）。２つのＣＰＡ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ１０、及び幹細胞バンカーＤＭＳＯを含まない解凍後の生存率も同様であった。次いで、ＣｒｙｏＳｔｏｒベースのＤＭＳＯを、ＤＭＳＯベースの抗凍結保存剤であるＢｌｏｏｄｓｔｏｒ ５５－５と比較し、より高度に濃縮されたＢｌｏｏｄＳｔｏｒ産物を、それが、より濃縮され、したがって、より小さい凍結バッグを可能にしたため、選択した。次いで、４℃で１０分間材料を保持し、次いで、－１℃／分の速度で温度を低下させるか、又は－２℃／分の速度で３５℃から－８０℃まで直接的に低下させるプロトコルに従って、凍結保存を比較した。解凍後の生存率は、使用された２つの凍結保存プロトコル間で同様であった（図６９）。
冷却中、氷核形成は熱を放出する。放出された熱が溶液を加温するように見える現象である過冷却は、より低い解凍後回収と関連付けられる。温度データは、両方のプロトコル（図７０）を使用して凍結保存中に試験物品から記録された。－１℃／分のプロトコルを使用して、両方の独立した実行で過冷却が観察されたが、一方で、－２℃／分の冷却プロトコルは、過冷却イベントを一度も記録せず、第２の独立した実行では、過冷却イベントは、代替的なプロトコル（図７０）に対して少ない熱を放出することが観察された。
凍結保存されたＤＰは、≦－１３０℃における保存及び輸送のために、気相ＬＮ２に移される。
試料の無菌性が試験され、保持された試料が、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ、Ｌａｒｋｓｐｕｒ，ＣＡ）を使用して－８０℃で凍結され、次いで、保存目的のために気相ＬＮ２に移される。
本発明はまた、腫瘍バンキングを包含する。本明細書で使用される場合、腫瘍バンキングは、将来のＴＩＬ製造で使用するために、患者からの腫瘍、又はその一部分を保存することに関する。有利には、腫瘍バンキングは、凍結保存を伴うが、腫瘍を保存する他の方法も企図されている。別の有利な実施形態では、腫瘍は、腫瘍バンクに保存される。有利には、凍結消化物が、後で使用するためにＣＯＩ／ＣＯＣを維持する、制御され検証された保管冷凍庫内に配置される。一実施形態では、腫瘍バンクは、多くの研究センター、特にがんセンターに位置し得る。腫瘍バンクは、公設又は私設であってもよい。理想的には、腫瘍は、患者の個人的使用のためのものである。
有利な実施形態では、腫瘍バンキングは、標準的なアジュバント療法に適格である患者に限定され得る。腫瘍は、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、及び最大約１０年にわたって保存され得る。別の実施形態では、患者は、切除後の標準的なアジュバント療法に適格でない場合であっても、腫瘍の消化及び保管のために支払いを行う選択肢を有する。
腫瘍は、患者の診断後にいつでも収集及びバンクされ得るが、腫瘍は、有利には、腫瘍切除及び生検（切除生検又はコア針生検中の、根治的外科的切除、腫瘍縮小（減量）処置など）のために、標準的な医学的に指示された時間に収集される。療法は、ネオアジュバント、アジュバント、局所的、限定的、又は全身的であり得、限定されるものではないが、化学照射（例えば、シスプラチン及び照射）、免疫療法（例えば、チェックポイント阻害（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４阻害）又はサイトカインアゴニスト（例えば、ＩＬ－２））、化学療法（例えば、カルボプラチン及びパクリタキセル）、又は標的化療法（例えば、ダブラフェニブ）を含む。療法は単独で又は組み合わせて投与される。
本発明はまた、リンパ球枯渇化学療法、コンディショニング、又はプレコンディショニング化学療法としても知られる、リンパ球枯渇の減少又は脱強化に関する。本明細書で使用される場合、リンパ球枯渇は、概して、ＴＩＬ療法などの本明細書に説明される療法の前に、Ｔ細胞を死滅させるための化学療法を受けることを伴う。それゆえに、リンパ球枯渇の減少又は脱強化は、本明細書に開示されるＴＩＬ療法のための追加のステップとして企図される。有利には、リンパ球枯渇は、ＴＩＬ採取後及びＴＩＬ注入前である。特に有利な実施形態では、リンパ球枯渇は、ＴＩＬ注入の約２０日、約１５日、約１０日、約５日、約３日、又は約１日前に起こる。特に有利な実施形態では、リンパ球枯渇は、ＴＩＬ注入の約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、又は約２日前に起こる。別の実施形態では、リンパ球枯渇は、ＴＩＬ注入の約７日～約３日前に起こる。更に別の実施形態では、リンパ球枯渇は、ＴＩＬ注入の約５日～約２日前に起こる。
有利には、リンパ球枯渇は、化学療法、照射、又はリンパ球標的化剤（抗体又はコンジュゲート抗体など）によるものである。リンパ球枯渇の増強を低下させることは、有利には、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンを伴う。具体的には、プラチナ剤及び／又はタキサンなどの、患者のための標準的な治療レジメンの一部として投与されることになる化学療法を含む、他の化学療法が企図される。一実施形態では、シクロホスファミドは、フルダラビンの前に投与され得る。有利な実施形態では、シクロホスファミドは、ＴＩＬ注入の約２０日、約１５日、約１０日、約５日、約３日、又は約１日前に投与され得る。特に有利な実施形態では、約３０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドは、ＴＩＬ注入の約７日前又は約６日前に投与され得る。別の有利な実施形態では、シクロホスファミドは、ＴＩＬ注入の約５日～約３日前に投与され得る。別の有利な実施形態では、シクロホスファミドは、ＴＩＬ注入の約５日～約３日前に投与され得る。約２０００、１５００、１０００、５００、２５０、又は１００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドが投与され得る。特に有利な実施形態では、約５００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドが、ＴＩＬ注入の約５日～約３日前に投与され得る。有利な実施形態では、フルダラビンは、ＴＩＬ注入の約７日又は約３日前に投与され得る。特に有利な実施形態では、約２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンは、ＴＩＬ注入の約７日又は約６日前に投与され得る。別の有利な実施形態では、フルダラビンは、ＴＩＬ注入の約５日～約３日前に投与され得る。別の有利な実施形態では、フルダラビンは、ＴＩＬ注入前のＴＩＬ注入の約２０日、約１５日、約１０日、約５日、約３日、又は約１日前に投与され得る。約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが投与され得る。特に有利な実施形態では、約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンは、ＴＩＬ注入の約５日～約３日前に投与され得る。
一般的に、コンディショニングは、ＴＩＬ投与の２週間以内であり得る。追加の化学療法が企図される場合、そのようなレジメンは、約２０、５０、６０、７５、１００、１２０ｍｇ／ｍ２のシスプラチン、約５０～２００ｍｇ／ｍ２のパクリタキセル、及び／又は約６０～１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルなどの、それらの化学療法の標準的な治療レジメンに類似することになる。例えば、これらのレジメンは、ＴＩＬ治療の１週間前まで、１日に投与され得る。
脱強化は、ＴＩＬ注入後のＩＬ－２の投与を更に含む。有利には、最大約８用量のＩＬ－２が企図される。ＩＬ－２の第１の用量は、ＴＩＬ注入後約９０分後に有利に企図されるが、ＩＬ－２の第１の用量は、ＴＩＬ注入後の約４～５時間、又はＴＩＬ注入後の最大約２４時間まで投与され得る。追加の用量は、用量間で約８時間、１２、１６、又は２４時間投与され得る。約８００，０００、７００，０００、６００，０００、５００，０００、４００，０００、３００，０００、２００，０００、又は１００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の用量が企図される。有利には、約６００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の用量が企図される。より高い用量は、静脈内投与されることが企図され、より低い用量は、皮下投与されることが企図される。
別の実施形態では、本発明は、例えば、ＴＩＬ注入の前又は後、－３日、－１日、０日、又は１日から始まって３週間毎に０．００６ｍｇ／ｋｇで投与され得る、例えば、ベンペガルデスロイキンなどのＩＬ－２に加えて、代替的なＩＬ－２アゴニストの使用を企図する。ＩＬ－１５及びペグ化バージョンを含むそのバリアントなどの他のリンパ球成長因子もまた、ＩＬ－２に加えて企図される。ＣＤ４／６、ＨＤＡＣｉ、及びＴＩＧＩＴ阻害剤もまた、企図される。
本発明はまた、アジュバント設定又はＰＤ－１再発性／難治性設定のいずれかで、ＴＩＬ療法にＰＤ－１阻害剤を追加することも企図する。
本発明はまた、ＴＩＬ注入後のＨＤ ＩＬ－２レジメンをＰＤ－１阻害剤の経過で置換することも企図している。
プログラム死１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、活性化単球、及び樹状細胞によって発現される２８８アミノ酸膜貫通免疫チェックポイント受容体タンパク質である。ＣＤ２７９としても知られるＰＤ－１は、ＣＤ２８ファミリーに属し、ヒトでは、２番染色体上のＰｄｃｄｌ遺伝子によってコードされる。ＰＤ－１は、イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリードメイン、膜貫通領域、及び免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）とを含む細胞内ドメインからなる。ＰＤ－１及びそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、Ｋｅｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００８，２６，６７７－７０４に説明されるように、免疫寛容において重要な役割を果たすことが知られている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞免疫反応を陰性に制御する阻害シグナルを提供する。ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１又はＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ又はＣＤ２７３としても知られる）は、腫瘍細胞及び間質細胞上で発現され、これは、ＰＤ－１を発現する活性化Ｔ細胞に遭遇し得、Ｔ細胞の免疫抑制につながる。ＰＤ－Ｌ１は、ヒト９番染色体上のＣｄ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤の使用によって、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断することは、Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ． Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２４４３－５４に説明されるものなどの、最近の臨床試験で実証されるように、免疫寛容を克服し得る。ＰＤ－Ｌ１は、多くの腫瘍細胞株上で発現されるが、一方で、ＰＤ－Ｌ２は、主に樹状細胞及び少数の腫瘍株上で発現される。Ｔ細胞（活性化後に誘導性にＰＤ－１を発現する）に加えて、ＰＤ－１はまた、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、活性化単球、及び樹状細胞にも発現される。
一実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、当該技術分野で公知の任意のＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－１ブロッカーであってもよい。特に、以下の段落でより詳細に説明されるＰＤ－１阻害剤又はブロッカーのうちの１つである。阻害剤、拮抗薬、及びブロッカーという用語は、ＰＤ－１阻害剤を参照して本明細書において互換的に使用される。疑義を避けるために記すと、抗体であるＰＤ－１阻害剤に対する本明細書の参照は、化合物若しくは抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、又はそれらのバイオ後続品を指し得る。疑義を避けるために付言すると、本明細書におけるＰＤ－１阻害剤への言及はまた、小分子化合物又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和化合物、水和物、共結晶、又はそのプロドラッグを指し得る。
好ましい実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、又はその単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１との結合について競合する、及び／又はＰＤ－１上のエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、ＰＤ－１との結合について競合する、及び／又はＰＤ－１上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１を約１００ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約９０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約８０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約７０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約６０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約５０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約４０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約３０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約２０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－１を約１０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、又はヒトＰＤ－１を約１ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、約７．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ－秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、約２×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．１×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．２×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．３×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．４×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．５×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．６×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．７×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．８×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．９×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約３×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約９ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約８ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約７ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約６ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約５ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約４ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約３ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約２ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するものである。
一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、当該技術分野で公知の任意のＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤、拮抗薬、又はブロッカーであってもよい。特に、以下の段落でより詳細に説明されるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤、拮抗薬、又はブロッカーのうちの１つである。阻害剤、拮抗薬、及びブロッカーという用語は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２阻害剤を参照して本明細書において互換的に使用される。疑義を避けるために記すと、抗体であるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤に対する本明細書の参照は、化合物若しくは抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、又はそれらのバイオ後続品を指し得る。疑義を避けるために付言すると、本明細書におけるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤への言及は、小分子化合物又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和化合物、水和物、共結晶、又はそのプロドラッグを指し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明される組成物、プロセス、及び方法は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、小分子である。好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、又はその単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合する、及び／又はＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合する、及び／又はＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ２受容体を含む他の受容体と結合又は相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ１と結合又は相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ１に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ２受容体に対するよりも、少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、又は約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ１受容体に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－Ｌ２阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ１受容体を含む他の受容体と結合又は相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ２と結合又は相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ２に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ１受容体に対するよりも、少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、又は約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ２受容体に結合する。
いかなる理論にも束縛されず、腫瘍細胞がＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞がＰＤ－１を発現すると考えられる。しかしながら、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１発現は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１阻害剤又はブロッカーの有効性に必要とされない。一実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現しない。いくつかの実施形態では、方法は、任意選択的にＴＩＬとの組み合わせにおいて、本明細書に説明されるものなどの、ＰＤ－１抗体とＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせを含み得る。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせ、及び任意選択的にＴＩＬの投与は、同時又は連続であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約１００ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約９０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約８０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約７０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約６０ｐＭ以下のＫＤ、約５０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約４０ｐＭ以下のＫＤで結合するか、又はヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２を約３０ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、約７．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ 秒以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、約２×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約２．１×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．２×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．３×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．４×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．５×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．６×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．７×１０５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、又は約３×１０ ５ １／秒以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約９ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約８ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約７ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約６ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約５ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約４ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約３ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、約２ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断若しくは阻害するか、又はヒトＰＤ－１を遮断するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣｓｏによるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断するものである。
抗ＰＤ－１治療薬としては、限定されるものではないが、ペムブロリズマブ（以前はＭＫ－３４７５又はラムロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ）、ＪＴＸ－４０１４、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、カムレリズマブ（ＳＨＲ１２１０）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２、ＷＢＰ－２８５）、ＩＮＣＭＧＡ０００１２（ＭＧＡ０１２）、ＡＭＰ－２２４、及び／又はＡＭＰ－５１４が挙げられる。
抗ＰＤ－Ｌ１治療薬としては、限定されるものではないが、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、ＫＮ０３５、ＡＵＮＰ１２、ＣＡ－１７０、及び／又はＢＭＳ－９８６１８９が挙げられる。別の実施形態では、ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標）（ダブラフェニブ）を用いた治療も企図される。
別の実施形態では、ＣＤ１５２（分化１５２のクラスター）阻害剤としても知られるＣＴＬＡ４又はＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）も企図される。一実施形態では、阻害剤は、Ｙｅｒｖｏｙというブランド名で販売されている、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂである。
別の実施形態では、単独、又は抗ＰＤ１治療剤及び／若しくは抗ＰＤ－Ｌ１治療剤と組み合わせにおける、ＭＥＫ阻害剤を用いた治療も企図される。
ＬＡＧ－３阻害剤であるレラチマブは、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブと併用するとき、フロントライン黒色腫の転帰を有意に改善する。別の実施形態では、単独、又は抗ＰＤ１治療剤及び／若しくは抗ＰＤ－Ｌ１治療剤との組み合わせにおける、ＬＡＧ－３阻害剤を用いた治療も企図される。一実施形態では、阻害剤は、リラトリマブである。
ＬＡＧ－３阻害剤は、概して、ＬＡＧ－３を阻害する化学薬品又は薬物である。それらは、いくつかのがんでは過剰活性であり得る、ＬＡＧ－３からの阻害シグナルを遮断するために使用され得る。それらは、未治療の進行性黒色腫の患者において、ＰＤ－１阻害剤と併用したとき、転帰を改善することが示されている。細胞は、ＬＡＧ－３（ＰＤ１を行うのと同じ）を上方制御するため、ＬＡＧ－３阻害剤、又はＰＤ－１阻害剤若しくはＰＤ－Ｌ１阻害剤を有するＬＡＧ－３阻害剤のいずれかとの組み合わせも企図される。
ＭＥＫ阻害剤は、一般に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ酵素ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２を阻害する化学薬品又は薬物である。それらは、いくつかのがんで過剰活性であることが多いＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすために使用され得る。
有利には、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）である。ＭＥＫ阻害剤はまた、コビメチニブ又はＳＬ５１８、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）又はセルメチニブであってもよい。
ＢＲＡＦ阻害剤は、腫瘍がＢＲＡＦ突然変異を有する人々において、転移性黒色腫の成長を縮小又は遅延させ得る薬物である。ＢＲＡＦ阻害剤には、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（Ｂｒａｆｔｏｖｉ（登録商標））を含む。
ＭＥＫ遺伝子は、ＢＲＡＦ遺伝子に対して密接な関係を有するため、ＭＥＫに標的化される薬物はまた、黒色腫をＢＲＡＦ突然変異で治療することを助け得る。ＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標））、コビメチニブ（Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（登録商標））、及びビニメチニブ（Ｍｅｋｔｏｖｉ（登録商標））が挙げられる。
最も一般的なアプローチは、ＭＥＫ阻害剤をＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせることである。この組み合わせは、どちらかの薬物のみの使用よりも効果的であることが示されている。一緒に使用されるとき、ＢＲＡＦ及びＭＥＫ阻害剤は、ＢＲＡＦ突然変異黒色腫を有する人々の大半において黒色腫を縮小させ得る。
組み合わせて投与されることが企図される他の薬剤としては、限定されるものではないが、ＩＬ－２バリアント（ベンペガルデスロイキンなど）、ＩＤＯ阻害剤、ＴＬＲ－９アゴニスト、及び抗ＧＩＴＲが挙げられる。ベンペガルデスロイキンは、ＴＩＬ注入の前又は後、－３日目、－１日目、０日目、又は１日目に開始して、３週間毎に０．００６ｍｇ／ｋｇで投与され得る。ＩＬ－１５及びそのバリアント（ペグ化バージョンを含む）、ＣＤ４／６、及びＨＤＡＣｉのような他の薬物も企図される。ＴＩＧＩＴ阻害剤も企図される。
治療用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも７．５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも５５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも６５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも８５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも９５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１６０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１７０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１８０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも１９０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２６０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２７０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２８０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも２９０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３６０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３７０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３８０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも３９０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４６０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４７０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４８０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも４９０ｍｇ／ｋｇ体重、及び少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、５００ｍｇ／ｋｇ体重以下である。当業者であれば、そのようなガイドラインは、例えば、抗体断片の使用、又は抗体コンジュゲートの使用において、活性薬剤の分子量に対して調整されることになることを理解するであろう。用量はまた、局所投与、例えば、鼻腔内投与、吸入など、又は全身投与、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内などのために変化し得る。有利には、用量は、約１～１０ｍｇ／ｋｇ（有利には約１ｍｇ／ｋｇ若しくは２ｍｇ／ｋｇ）、又は代替的に、必要に応じて、約２００ｍｇ～約２４０ｍｇの約２週間毎の頻度の固定用量であり得る。
数多くの抗がん剤及び療法が、本方法及び組成物との組み合わせに利用可能である。以下は、照射と併用され得る抗がん剤（抗腫瘍剤）の非網羅的リストである。アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクリニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロン酢酸塩、アミノグルテチミド、アムサクリ、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸、ビスナフィドジメチル硫酸塩、ビゼレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、ドロスタノロンプロピオン酸エステル、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン塩酸塩、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エチオダイズド油１１３１、エトポシド、エトポシドリン酸塩、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビンリン酸塩、フルオロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、金Ａｕ１９８、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、リュープロレリン酢酸塩、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、メイタンシン、メクロレチン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、ミトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフムゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、塩化ストロンチウムＳｒ８９、スロフェヌル、タリソマイシン、タキサン、タキソイド、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフム、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン塩酸塩、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストレン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビンデシン硫酸塩、ビネピジンスルファート、ビングリシナートスルファート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、ビンロシジンスルファート、ビンゾリジンスルファート、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩。
本発明はまた、腫瘍バンキングアジュバント療法、特にＰＤ－１阻害剤ベースのアジュバント療法に難治性の患者に対する腫瘍バンキングアジュバント療法も包含する。ペムブロリズマブなどのＰＤ－１阻害剤は、約３週間毎に投与され得、一般に、腫瘍切除から２週間以内に開始され、ＴＩＬ治療後１年、進行、又は約２年でＣＲまで継続される。有利には、約２００ｍｇのペムブロリズマブが３週間毎に投与されるか、又は約４００ｍｇのペムブロリズマブが６週間毎に投与される。リンパ球枯渇化学療法はまた、第２のＴＩＬ治療の約７～約３日前に企図される。化学療法は、－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２を伴い得る。ＴＩＬ治療は、単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬを伴い得る。約６００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２が、最大８用量の投与の間で約８、１２、又は１６時間企図される。ＴＩＬ注入後約９０分後に、ＩＬ－２の第１の投与が企図される。
本発明はまた、ＰＤ－１阻害剤をＴＩＬ療法に加えることも企図している。ペムブロリズマブなどのＰＤ－１阻害剤は、約３週間毎に投与され得、一般に、腫瘍切除から２週間以内に開始され、ＴＩＬ治療後１年、進行、又は約２年でＣＲまで継続される。有利には、約２００ｍｇのペムブロリズマブが投与される。リンパ球枯渇化学療法はまた、ＴＩＬ治療の約７～約３日前に企図される。化学療法は、－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２を伴い得る。ＴＩＬ治療は、単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬを伴い得る。約６００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２が、最大８用量の投与の間で約８、１２、又は１６時間企図される。ＴＩＬ注入後約９０分後に、ＩＬ－２の第１の投与が企図される。
本発明はまた、完全切除可能な疾患を有する外科手術候補に対するネオアジュバント設定（すなわち、根治的切除前）におけるＰＤ－１阻害剤の使用も企図する。ＴＩＬは、手術前に単独で、又は１つ以上のＰＤ－１阻害剤と組み合わせて使用され得る。
本発明はまた、ＴＩＬ注入に続く標準的に投与されるＨＤ ＩＬ－２レジメンをＰＤ－１阻害剤で置換することも企図している。ペムブロリズマブなどのＰＤ－１阻害剤は、約３週間毎に投与され得、一般に、腫瘍切除から２週間以内に開始され、ＴＩＬ治療後１年、進行、又は約２年でＣＲまで継続される。有利には、約２００ｍｇのペムブロリズマブが投与される。リンパ球枯渇化学療法はまた、ＴＩＬ治療の約７～約３日前に企図される。化学療法は、－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２を伴い得る。ＴＩＬ治療は、単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬを伴い得る。
例示的な研究は、安全性導入期で始まる。安全性導入期は、ＴＩＬ安全性の適格性基準を満たす進行固形腫瘍を有する３人の対象を評価する。安全性導入期事象（ＳＬＥ）は、スポンサー及び少なくとも１人の治験責任医師を含み得る安全性レビューチーム（ＳＲＴ）によって評価される。ＳＬＥの発生率は、研究の進行を決定する。最初の３人の対象がＳＬＥを経験しなかった場合、登録が拡大する。最初の３人の対象で１人の対象がＳＬＥを経験した場合、追加の３人の対象を治療するために、安全性導入期が拡大される。最初の３人の対象で２人以上の対象がＳＬＥを経験した場合、継続される研究の実施について更なる議論のために治験が停止される。
安全性導入期の完了後、疾患適応コホートが、各指標における安全性及び予備的ＴＩＬ有効性を更に評価するために、独立して開き、登録する。各疾患適応コホートは、独立に登録され、登録完了まで進行する。登録は、進行固形腫瘍を有する９人の対象が、約５×１０９個を超えるＴＩＬ細胞で治療されるまで継続し、安全性導入期中に投与された対象を含む。疾患適応コホートを、疾患適応を有する第９の対象が治療され、追跡されてから３か月後に発生する中間解析（ＩＡ）によって、又はその時点で、疾患適応で治療された９～約１５人の対象まで、更に拡大する決定がなされる。一次解析（ＰＡ）は、疾患適応コホートにおいて、最後の対象が治療されてから６か月後に行われ、６か月間続く。
第１のステップでは、スクリーニングは、同意から２０（２１）日以内である。第２のステップでは、腫瘍切除の登録は、同意から３０日以内である。第３のステップでは、ベースラインは、リンパ球枯渇（ＬＤ）化学療法から１０日以内である。第４のステップでは、約６０ｍｇ／ｋｇ×２日（－７日目及び－６日目）でシクロホスファミド、及び約２５ｍｇ／ｍ２×５日（－７日目～－３日目）でフルダラビンを伴い得るＬＤ化学療法を伴う。第５のステップでは、ＴＩＬ／ＩＬ－２の投与及び観察期間が企図され、ＴＩＬ投与後の１２時間間隔で、最大８回まで、忍容性に応じて、約５×１０９個のＴ細胞（０日目）及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）の約６００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＶ投与の最低用量で、ＴＩＬの単回ＩＶ投与を伴い得る。第６のステップでは、治療後の評価が、２８日目に企図される。第７のステップでは、約６週目に始まる、疾患評価及び生存期間が企図される。ＬＤ化学療法の投与における変化は、軸骨格又は骨盤骨格に対する放射線療法の既往歴に基づいて、又は研究医療モニターと議論された、対象に特異的な併存疾患に対して必要に応じて実施され得る。シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇの調整は、ＬＤ化学療法後のより急速な回復を確保にするために、３０ｍｇ／ｋｇまで低減され得る。第８のステップでは、治療の場合にＴＩＬ療法にもかかわらず疾患が安定化されるのみか、又は悪化する場合、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤の投与が行われる。
出願人は、ＴＩＬ治療後にＰＤ－１阻害剤を投与された６人の患者を有する：
●患者１： 進行に伴いイピリムバブを投与された。次いで、ペムブロリズマブを投与されて、良好な応答を有し、２年間の治療を完了した。
●患者２： ペムブロリズマブを投与され、応答なしで、その後追加の治療（標的化学療法）を受けた。
●患者３： ＴＩＬ後にダブラフェニブを投与され、その後、進行。その後、ニボルマブを投与され、安定した疾患を有し、ニボルマブを継続しながら放射線療法「３０Ｇｙから首節まで」を受けた（ニボルマブの開始後約６か月）。
●患者４： 事前ＴＩＬ Ｒｘダブラフェニブの再導入、次いで、ＴＩＬの第２の投与（これは再治療を伴う患者である）、ある程度の初期応答を伴い、次いで、ＰＤ－１阻害剤を投与され、次いで、ペムブロリズマブ／トラメチニブなどのＭＥＫ阻害剤治療を受け、次いで、おそらく応答なしで死亡した。
●患者５： 「全般的に更なる応答」を伴う初期ペムブロリズマブ。毒性に起因してペムブロリズマブの投与を中止し、間質性肺炎に起因してステロイドが必要となった。それ以降、疾患が、ゆっくりと進行している。進行している個々の病変に対する放射線療法を受けたが、更なる全身療法は受けなかった。
●患者６： 肺及び腹部転移の急速な進行。ペムブロリズマブＡ－症候性かつ軽度の放射線学的応答を開始した。新しい脳転移を有した。ペムブロリズマブを継続。
別の実施形態では、腫瘍切除の時期が企図され、一般に、ステージ２Ｂからステージ４の完全切除可能な黒色腫、又は切除の後、アジュバント療法（限定されるものではないが、ＮＳＣＬＣ又はＨＮＳＣＣなどの腫瘍）に続き得る他の腫瘍に適用されることになる。
腫瘍は、原発腫瘍の外科的切除の一部として切除される。対象は、アジュバント治療のための通例の抗ＰＤ－１療法を開始する。あるいは、患者は、前もって減量され、通例の抗ＰＤ－１療法を伴う全身療法に進み得る（例えば、減量され、その後、抗ＰＤ１ベース療法を受ける、腎がん、精巣がん、卵巣がん、リンパ腫、肉腫、副腎がん、内分泌系腫瘍、又は中枢神経系新生物を有する患者）。進行性疾患を発症した対象は、次いで、本発明のＴＩＬに製造された、その以前に消化及び凍結保存された腫瘍材料を有する。治療過程は、本明細書に説明される標準的な抗ＰＤ－１併用療法に従う。ベースライン、リンパ球枯渇、約５×１０９Ｔ細胞超のＴＩＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－２ ＰＤ－１後、最大１２か月間。
Ｃｒｅｅｌａｎ ＢらのＡＡＣＲ ２０２０のプレゼンテーション（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｓｔｒａｃｔｓｏｎｌｉｎｅ．ｅｏｍ／ｐｐ８／＃！／９０４５／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／１０７６３）による同様の設計が、本発明のために修正され得る。Ｃｒｅｅｌａｎらは、ＴＩＬ養子細胞療法が、患者の１０～１５％で持続的な完全応答を有する転移性黒色腫設定で以前に使用されてきたことを説明した。Ｃｒｅｅｌａｎらは、ＮＳＣＬＣ患者が、ＴＩＬと抗ＰＤ－１療法との併用によって「持続的な寛解も有し得る」と仮定した。
Ｃｒｅｅｌａｎの試験では、ＰＤ－１軸阻害剤への曝露歴のない２０人の患者が試験に登録され、２週間毎にニボルマブ２４０ｍｇを合計４用量投与される前に、切除された転移性病変からそれらのＴＩＬを採取した。１６人の患者がニボルマブにおける進行の証拠を示し、成長に応じて、２０～１００億個のＣＤ３＋細胞の用量で増殖した自己ＴＩＬの単回注入を受ける前の週に、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇの２回投与及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２の５回投与でリンパ球枯渇を受けた。次いで、インターロイキン（ＩＬ）－２がＴＩＬ注入後６日間、１８．０ｍｉＵ／ｍ２の初期用量で、１日目、２日目、及び３日目にそれぞれ６時間、１２時間、及び２４時間投与され、続いて３回の２４時間の期間にわたって４．５ ｍｉＵ／ｍ２が投与され、その後、患者は、２９日目から最大１年まで、４週間毎に維持ニボルマブ４８０ｍｇを投与された。
Ｃｒｅｅｌａｎらは、２人の完全奏効、１人の確認された部分奏効（ＰＲ）、１人の未確認の継続中のＰＲ、及び後続の新たな病変で進行した患者における２人の未確認のＰＲを含む、評価可能なＴＩＬ後のデータを有する１２人の患者の「多様な応答スペクトル」を説明した。残りの６人の患者は、全て進行性又は安定した疾患を有した。これは、２５％の客観的奏効率に変換された。Ｃｒｅｅｌａｎは、ＴＩＬ療法を最適化して「より多くの患者の奏効率を高める」ことの必要性を強調し、また、より迅速に産生し、有害事象を低減する方式を見つけることが、より利用しやすい選択肢になることを強調した。
別の実施形態では、ＰＤ－１ブロッカーへの曝露後に進行し、次いで、それらの完全切除中に以前に採取された組織から作製されたＴＩＬで治療される患者における有効性の初期の実証後（上記に説明されるとおり）、患者が完全切除を受け、次いで、ＰＤ１アジュバント単独又はＰＤ１プラスＴＩＬに無作為化される、完全に一対一のアジュバント研究も企図される。
ＮＳＣＬＣに対するアジュバント免疫療法の臨床試験表（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１９；１２：７３２９－７３３６）が以下に提示される。
略語：ＯＳ：全生存、ＰＦＳ：無増悪生存。
ネオアジュバント免疫チェックポイント阻害剤の臨床試験表（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１９；１２：７３２９－７３３６）が以下に提示される。
略語：ＭＰＲ、主要な病理学的奏効、ＰＣＲ：病理学的完全奏効。
本発明及びその利点が詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置き換え、及び変更を本明細書に加えることができることを理解されたい。
本発明は、以下の実施例で更に例示されており、これらの実施例は例示のみを目的としており、決して本発明を限定するようには意図されていない。
実施例１
図３９は、使用中のバッグ４００の実施形態を示す。図示されるように、バッグ４００は、トレー４０６などのデバイス４０４内のクランプ４０２などの固設要素によって固設される。組織４０８は、バッグ４００の透明な側部を通して視認可能である。チューブ４１０は、バッグ４００に結合される。
実施例２
図４０は、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグ４２０の実施形態を図示する。図示されるように、バッグ４２０は、デバイス及びトレー４２４からの固設要素４２２によって固設される。組織材料４２４は、バッグ４２０の透明な側部を通して視認可能である。チューブ４２６は、バッグ４２０に結合される。示されるように、トレー４０６内のバッグ４００の位置は、固定要素４２８、特にテープを使用して更に固設される。組織４２４は、バッグ４２０の透明な側部を通して視認可能である。図４０に示されるように、バッグは、バッグ及び／又は組織４２４の内部にアクセスするためのポート４３０を含み得る。
実施例３－脱凝集及び凍結保存
ＴＩＬ０７５を、転移性黒色腫腫瘍片（試料）から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。Ｓ１＝１．４ｇ。Ｓ１を、自動手順によって脱凝集した。Ｓ２＝１９．４ｇ。Ｓ２を分割し、１つの部分（約７．７ｇ）を自動手順によって脱凝集し、第２の部分（約１２ｇ）を手動で脱凝集した。
手動脱凝集：腫瘍試料を、より小さい２～４ｍｍ３の断片に切断し、抗生物質を含む８０ｍｌの消化培地を収容するボトルに添加した。ボトルを振盪機に配置し、３７℃で一晩（約１４時間）脱凝集した。次いで、消化物をネットウェル及び１００μＭ細胞ストレーナーを通してＦａｌｃｏｎ５０チューブに濾過した。濾過された消化物の１０％を無菌試験のために確保した。残りを遠心分離し、１２ｍｌのＣＳ１０中に再懸濁し、１２のクライオバイアルに分割した。
Ｔｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒ脱凝集：２つのＣＳ５０Ｎバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。Ｓ１ １．４ｇｍの試料及びＳ２の７．７ｇｍ部分をＣＳ５０Ｎバッグ内に配置し、バッグを封止した。１５ｍｌの脱凝集培地と３０ｕｌの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをＶｉａＦｒｅｅｚｅに装填されたＴｉｓｓｕｅ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｏｒに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から１．５℃／分の速度で３５℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、３５℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を２４０サイクル／分に設定した。ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度は、その後、凍結保存ステップまで３５℃のままであった。
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。ＣＳ５０バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。１．５ｍｌのＢｌｏｏｄ－ｓｔｏｒ（ＤＭＳＯ）を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにＶｉａＦｒｅｅｚｅに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度を３５℃から－２℃／分で－８０℃まで上昇させた。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例４－脱凝集及び凍結保存
ＴＩＬ０７７を、転移性黒色腫腫瘍片（試料）から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。Ｓ１＝４．６ｇ。Ｓ２＝４．６ｇ。
Ｔｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒ脱凝集：２つのＣＳ５０Ｎバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。Ｓ１＝４．６ｇｍの試料及びＳ２＝４．６ｇｍの試料をＣＳ５０Ｎバッグ内に配置し、バッグを封止した。１５ｍｌの脱凝集培地と３０ｕｌの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをＶｉａＦｒｅｅｚｅに装填されたＴｉｓｓｕｅ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｏｒに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から１．５℃／分の速度で３５℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、３５℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を２４０サイクル／分に設定した。ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度は、その後、凍結保存ステップまで３５℃のままであった。図７１は、脱凝集記録を示す。
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。ＣＳ５０バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。１．５ｍｌのＢｌｏｏｄ－ｓｔｏｒ（ＤＭＳＯ）を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにＶｉａＦｒｅｅｚｅに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度を３５℃から－２℃／分で－８０℃まで上昇させた。図７１は、凍結保存記録を示す。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例５－脱凝集及び凍結保存
ＴＩＬ０７８を、転移性黒色腫腫瘍片（試料）から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。Ｓ１＝１１ｇ。Ｓ２＝２ｇ。
Ｔｉｓｓ－Ｕ－Ｓｔｏｒ脱凝集：２つのＣＳ５０Ｎバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。腫瘍材料を分割し、６．４ｇｍの試料を２つのＣＳ５０Ｎバッグの各々の中に配置し、バッグを封止した。１５ｍｌの脱凝集培地と３０μｌの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをＶｉａＦｒｅｅｚｅに装填されたＴｉｓｓｕｅ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｏｒに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から１．５℃／分の速度で３５℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、３５℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を２４０サイクル／分に設定した。ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度は、その後、凍結保存ステップまで３５℃のままであった。図７２は、凍結保存記録を示す
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。ＣＳ５０バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。１．５ｍｌのＢｌｏｏｄ－ｓｔｏｒ（ＤＭＳＯ）を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにＶｉａＦｒｅｅｚｅに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ＶｉａＦｒｅｅｚｅの温度を３５℃から－２℃／分で－８０℃まで上昇させた。図７２は、凍結保存記録を示す。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例６－脱凝集及び凍結保存
ＴＩＬ０８１を、転移性黒色腫腫瘍片（試料）から製造した。ソフトウェアを更新して、単一のプロトコルに脱凝集及び凍結保存を含めた。図７３は、脱凝集及び凍結保存記録を示す。上記の実施例にあるように、脱凝集装置は、約５３分間アクティブであった。（図７３Ａ、図７３Ｂ）。脱凝集組織を、脱凝集バッグからフィルタを通して凍結バッグに移し、凍結冷却が開始された時点における脱凝集プロセスの開始から約９０分以内に凍結保存のためにＶｉａＦｒｅｅｚｅに戻した。
クライオバイアルを液体窒素から除去し、細胞懸濁液がちょうど溶解されるまで、３７℃の水浴中に配置した。細胞懸濁液を１５ｍＬのファルコン中に配置し、ＰＢＳで１０ｍＬまで満たし、４００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカンターに移した。
細胞培養について、細胞ペレットを、予め加温された培地中に、最初は小容量、すなわち、２～３ｍＬで再懸濁した。接着細胞株（すなわち、腫瘍株、ＨＥＫ２９３）を、以下の表に従って、培地を有する組織フラスコに添加した。非接着細胞株（すなわち、Ｔ細胞、ＴＩＬ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を、０．５～１×１０６個の細胞の密度でプレーティングした。フラスコを、加湿された３７℃のインキュベーター内に配置し、培地を２～３日毎に交換した。
実施例８－凍結保存脱凝集腫瘍からの製造。
製造プロセス
出発材料の解凍
ＶＩＡＴｈａｗ ＣＢ１０００ Ｔｈａｗｉｎｇシステムを使用して、凍結バッグに保存された凍結保存試料の加熱を制御した。凍結保存細胞懸濁液を解凍し、次いで、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）によって製造されたＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で希釈した。ＴＣＭは、８０％のＲｏｓｅｗｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地及び２０％のＡＩＭ Ｖを含有する。細胞懸濁液を７０～１００μｍのフィルタを通して濾過し、遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、１０％照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を補充されたＴＣＭ中に再懸濁した。
Ｏｒｉｇｉｎ ＣＳ５０バッグ中の脱凝集凍結保存腫瘍（約１６．５ｍｌ）を、ＶＩＡＴｈａｗ ＣＢ１０００ Ｔｈａｗｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの解凍トレー内に配置した。凍結バッグを約０℃に加温した。
実施例９－効力
共培養ベースの効力方法は、ＯＫＴ３発現標的細胞株によって活性化されたＴ細胞のパーセンテージを定量化する。インビボにおけるＴＩＬ産物の作用機序は、インビボでＴＣＲに結合するｐＭＨＣ－ＨＬＡを通したＴＩＬペプチド提示を伴う。効力アッセイは、ＯＣＴ３抗原結合ドメインを発現するＫ５６２細胞株との共培養によって特異的に活性化されたときに、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、又はＣＤ１０７ａのいずれかに対して陽性の生存Ｔ細胞を、総生存Ｔ細胞で除算して定義される、強力なＴ細胞のパーセンテージを定量化する。Ｔ細胞の効力を定量化するために使用されるマーカーとしては、ＤＲＡＱ７、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γが挙げられる。
効力を測定するために、ＩＴＩＬ－１６８ ＤＳ細胞が、以下の３つの細胞株のうちの１つを使用して約５時間共培養される：条件１－刺激なし－バックグラウンド細胞活性、条件２－Ｋ５６２細胞株－バックグラウンドＴＣＲ非依存反応性、条件３－ＯＫＴ－３に対するＳｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株－ＴＣＲ誘導Ｔ細胞刺激。
培養された細胞は、フローサイトメトリーによって解析され、生存白血球上でゲーティングされて、４つの活性化マーカーのうちの少なくとも１つを発現するＴ細胞を定量化する。安定性試験について、凍結保存ＤＰ細胞が解凍され、洗浄され、一晩静置される。
ＩＴＩＬ－１６８ ＴＣＲ効力は、以下のように計算される：ステップ１）非特異的刺激に起因する％効力が条件２から得られ、ステップ２）ＣＤ３特異的及び非特異的刺激に起因する％効力が条件３から得られ、ステップ３）ＣＤ３特異的刺激に起因する％効力が条件３－条件２として計算される。
条件２及び条件３の両方について、％効力の結果は、１００％から、ＣＤ１３７－／ＩＦＮ－γ－／ＴＮＦα－／ＣＤ１０７ａ－である全てのＴ細胞（すなわち、バックグラウンド）のパーセンテージを差し引いたものである。この集団は、少なくとも１つのマーカーを産生しない。
実施例１０－ＴＩＬ外殖及び急速増殖
ＴＩＬ製造プロセスは、腫瘍切除、脱凝集、凍結保存、並びに任意選択の梱包及び出荷の後に開始する。出荷梱包及び出荷は、制御された条件下で、資格要件を満たした荷主におけるＴｕｍｏｕｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ＨｕｂからＩｎｓｔｉｌの製造施設へのものであり得る。凍結保存腫瘍及びＴ細胞は、制御された条件を使用して解凍され、１０％のＦＢＳ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、及びＩＬ－２（本明細書ではＩＣＭＴと称される）を補充された、８０％のＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地、及び２０％のＡＩＭ Ｖから構成されるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で希釈される。
細胞は、閉鎖されたバッグ内で遠心分離することによって洗浄され、ＩＣＭＴ中に再懸濁され、試料は、細胞計数のために採取される。細胞懸濁液は、０．２５×１０６個の生存細胞／ｍＬを標的化するＩＣＭＴとともに培養バッグ内に播種され、プロセスの最大８日目まで、制御された条件下でインキュベートされる。８日目に、細胞計数のための試料が採取され、等量のＩＣＭＴが培養バッグに添加され、制御された条件下でインキュベートされる。１１日目に、細胞計数が行われ、等量のＩＣＭＴが培養バッグに添加され、制御された条件下でインキュベートされる。１３日目に、細胞計数が行われ、ＴＩＬが、バッグ内の遠心分離によって濃縮されて、１×１０６～２０×１０６個の生存Ｔ細胞を提供する。
また、１３日目に、８％ヒトＡＢ血清及びＩＬ－２（本明細書ではＷＴＣＭと称される）を含有するＴＣＭを有する抗ＣＤ３及び照射されたフィーダー細胞（同種ＰＢＭＣ）を使用して、１×１０６～２０×１０６個の生存成長ＴＩＬが活性化される。ＴＩＬ活性化培養物が、静止培養バッグ内で、制御された条件下で最大６日間インキュベートされる。インキュベーションの１９日目に、細胞計数が実施され、活性化されたＴＩＬが、ＷＴＣＭを含有するバイオリアクター内に播種される。細胞は、制御された条件下で最大６日間インキュベートされる。２０日目、ＴＩＬ増殖は、採取標的用量がプロセスの２７日目の前又はそれまでに達成されるまで、ＩＬ－２を補充されたＴＣＭの連続的な供給が提供される。
採取用量が達成されると、細胞が計数され、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で遠心分離によって洗浄及び濃縮される。次いで、医薬品（ＤＰ）バッグ中のＴＩＬが２～８℃に冷却され、１６％のＨＳＡ及び２０％のＤＭＳＯを含有する抗凍結剤を用いて１：１で製剤化されて、８．５％のＨＳＡ及び１０％のＤＭＳＯを含有するＰＢＳ中のＤＰの最終製剤を提供する。ロットリリース試験、参照試料、及びバックアップ試料のために、試料体積が除去される。
製剤化されたＤＰは、産物が指定された温度に到達するまで、予め定義されたプログラムを使用して、ＣＲＦ中で凍結保存される。次いで、投与のための≦－１３０℃におけるクリニックへの輸送前に、凍結保存ＤＰが液体窒素倉庫に移される。
実施例１１
ＧＭＰ条件下でフルスケール実行を実施した。これらの実行で使用されるＩＴＩＬ－１６８プロセスは、凍結保存腫瘍消化物、ＴＩＬ外殖段階（段階１）に対する０．２５×１０６個の生存細胞／ｍＬの播種の標的、ＴＩＬ外殖からＴＩＬ急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）への連続処理、並びに最終産物の自動製剤化及び最終医薬品の凍結保存を含んだ。
ＩＴＩＬ－１６８は、少なくとも１つの以前の療法ラインから再発したか、又は難治性である、進行黒色腫を有する成人患者の治療のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法である。ＩＴＩＬ－１６８は、患者のがん組織からエクスビボで単離及び増殖された自己Ｔ細胞の単回注入から構成され、静脈内に投与される。プロセスの改善は、経時的に識別され、実装されており、改善されたプロセスは、ＩＴＩＬ－１６８と呼ばれる。表は、プロセスの変形例及び実装を要約している。
２つのプロセス開発実行で使用されるＩＴＩＬ－１６８製造プロセスの概要が表１５に示される。実行１（ＴＩＬ０６５）及び実行２（Ｂｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１）と標識された２つのプロセス開発実行を、ＧＭＰ条件下でフルスケールで実施し、ベンダーであるＢｉｏｐａｒｔｎｅｒｓから調達した患者及び腫瘍からそれぞれ収集した過剰な腫瘍を使用した。
これら２つのプロセス開発実行の間、バイオバーデン及び最終産物の無菌性、エンドトキシン、マイコプラズマ、及び外観試験のプロセス内試験は、これらの実行が、プロセス改善後の製造プロセス性能及び産物品質の評価を主目的としており、プロセス検証実行前のＧＭＰ条件下で製造オペレータのための訓練実行として機能するため、実施されなかった。
ＴＩＬ外殖及びＲＥＰは、表１２及び表１３に示される材料を使用して、実施例１０にあるように実施された。
両方の実行（実行１及び実行２）について、総ＣＤ３＋細胞数を、バッチ製造記録（ＢＭＲ）に基づき、１日目、８日目、１１日目、及び１３日目にＴＩＬ外殖段階又は段階１に関して、並びに１３日目、１９日目、２２日目、及び２５日目に、ＴＩＬ急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）又は段階２に関して測定した。図７６Ａ及び図７６Ｂは、それぞれ、ＴＩＬ外殖段階（段階１）及びＴＩＬ ＲＥＰ段階（段階２）全体を通して２つの実行に対する総ＣＤ３＋細胞数を示す。図７６Ｂに示されるデータは、両方の実行について、＞１×１０１０個のＣＤ３＋細胞が、ＲＥＰ段階の終了までに達成され、その結果、両方のロットが、５×１０９～５×１０１０個のＣＤ３＋細胞の用量許容基準を満たすことを実証する。
生存率（生存ＣＤ３＋細胞のパーセンテージ）もまた、１日目、８日目、１１日目、１３日目、及び２５日目の両方の実行に対して測定された。図７６Ｃは、製造プロセス中及びＲＥＰ段階の終了に向かって生存率が増加し、両方の実行が、＞７０％の最終産物基準を満たしたことを示す。
急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）の増殖倍率を、２回の実行についての細胞数データから計算した。加えて、用量、生存率、効力、Ｔ細胞表現型、及びＴ細胞部分集団などの最終産物品質特性もまた、２つのプロセス開発実行について評価された。
表１６に提示されたデータは、プロセス改善の後、ＩＴＩＬ－１６８製造プロセスが過去のプロセスと同様に実施され、仕様要件を満たす最終産物品質特性を結果的にもたらすことを実証する。
Ｂｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１から調製されたＴＩＬ０６５及びＴＩＬの２つのＴＩＬ調製物を評価して、Ｔ細胞部分集団の相対的割合を決定した。ＴＩＬ０６５（図７９Ａ）及びＢｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ ９２５１（図７９Ｂ）ＴＩＬ調製物中のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方のうち、細胞は、主にセントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ４５＋ＣＤ６２＋）及びエフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ４５＋ＣＤ６２－）であった。図７９Ｃは、Ｔ細胞の大部分が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関与することを示す。
実施例１２－投与
療法
対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンのリンパ球枯渇化学療法レジメンを受けた。療法は、制御性Ｔ細胞などの抑制細胞の影響を低減し、リンパ球成長促進サイトカイン（例えば、ＩＬ－７及びＩＬ－１５）の発現を増加させるように設計される。リンパ球枯渇化学療法の前及びその間に、水和レジメンを開始した。抗微生物薬及び抗真菌薬の予防投与を、リンパ球枯渇化学療法を開始する前に開始した。発熱及び好中球減少を評価し、管理した。非ステロイド制吐療法を、リンパ球枯渇化学療法の前に開始し、必要に応じて継続した。
リンパ球枯渇化学療法を以下のように施した。投与されるシクロホスファミド及びフルダラビンの用量を、ベースラインビジットで取得された体重の評価に基づいて計算した。肥満対象（ボディマス指数＞３５）では、実際の体重を使用した。シクロホスファミドの用量は体重に基づき、フルダラビンの用量は体表面積に基づく。用量は、用量バンディングの慣行に従って、四捨五入され得る。以下の表は、推奨用量、投与経路、注入量、及び持続時間を示す。
対象は、ＴＩＬ注入前に抗ヒスタミン剤及びアセトアミノフェンを前投薬された。注入バッグの内容物を、非白血球枯渇フィルタ（例えば、＞／＝１７０ミクロンのインライン／チューブフィルタ）を使用して注入した。対象は、注入後の支援のために、最大８回の静脈内ＩＬ－２投与を受けた。ＩＬ－２は、０日目に開始し４日目まで継続するＴＩＬ注入の完了後に投与された。
実施例１３－治療結果
合計で４４人の転移性皮膚黒色腫患者が腫瘍切除、及びＴＩＬ外殖製造の開始を受けた（段階１）。これら４４人の患者のうち、４２人の個々の患者ロットが段階１を完了させ、２人の失敗した試行を伴った。３１人の患者ロットがＲＥＰ製造（段階２）に進んだ。１ロットがＴＩＬの外殖段階１の製造に失敗し、改訂された段階１製造プロセスを実装し、段階２製造の成功を可能にした。その後、患者は治療された。残りの１２ロットは、以下の理由により、ＲＥＰ開始のために選択されなかった：８ロットは、患者の状態の断続的な臨床的悪化に起因してＴＩＬ療法に不適合となり、２人の患者は、他の療法の臨床的改善に起因してＴＩＬがもはや不要となり、１人の患者は、治療のための資金を確保することができず、１ロットは、切除標本上の腫瘍組織の欠如に起因して、製造に失敗した。４つの患者ロットが製造に成功したが、患者は、ＴＩＬ療法に臨床的に不適合であるとみなされ、したがって、治療されなかった。
切除された４４個の腫瘍のうち、２個が製造に失敗し、９５％の製造成功率を得た。２７人の患者が、標準製造プロセスを利用して作製されたＴＩＬ産物で治療された。ＴＩＬ製造完了時に、これらの患者のうちの６人は、全治療レジメンに臨床的に不適合であるとみなされ、顕著に低い用量のコンディショニング化学療法及び注入後ＩＬ－２を受け、したがって、解析から除外された。１人の患者は、標準ＴＩＬ外殖製造ステップ（段階１）を開始する基準を満たさなかった腫瘍切除を受けた。したがって、非常に低い最終細胞用量（１．７×１０９）であるにもかかわらず、急速増殖プロトコル（段階２）及び最終産物製剤を可能にした修正段階１が開始された。この産物は、修正製造プロセスを使用して産生され、低用量の細胞が得られたため、ＭＳライセンスプロセスを代表するとはみなされず、したがって、臨床データは解析から除外された。
残りの２１人の患者の人口統計、ベースライン患者特性、治療の詳細及び処置、並びに臨床有効性及び安全性転帰を収集し、解析した。解析終了日までに、これらの患者の潜在的な追跡期間の中央値は、ＴＩＬ注入日から５２．２か月（範囲：４．６、９８．８か月）であった。
これら２１人の患者のうち、過半数（７１％）が男性であり、ＴＩＬ治療時の年齢中央値は４５歳であった（範囲：１６、６８）。ベースラインでは、全ての患者が、黒色腫の初回診断から中央値３９か月（範囲：８、１７７）で、ステージＩＶの転移性皮膚黒色腫を有していた。患者の過半数（６７％）が、４つ以上の疾患部位で報告された病変を有し、７人（３３％）がＴＩＬ治療時に脳転移が記録された。事前全身療法の中央値は、２（範囲：１、９）であった。患者の５２パーセント（５２％）がＢＲＡＦ突然変異を有し、その全員が、ＭＥＫ阻害剤の有無にかかわらず、ＢＲＡＦ阻害剤を受け、進行していた。２人を除く全ての患者（９０％）は、少なくとも１つの事前チェックポイント阻害剤を有し、１２人（５７％）がＰＤ－１阻害剤（ニボルマブ又はペムブロリズマブのいずれか）を受けていた。加えて、８人（３８％）がイピリムマブを受け、ニボルマブ又はペムブロリズマブのいずれかを順次投与され、４人（１９％）がイピリムマブ及びニボルマブを同時に受けた。ＴＩＬ産生のための腫瘍切除の前に、２０人（９５％）は、再発性又は難治性の進行性黒色腫を有し、１人（５％）は、耐容性に起因してＴＩＬ療法の前に治療を中止した。
ＴＩＬを受ける直前に、患者のうちの１０人（４８％）が血清ラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）値の上昇を示し、７人（３３％）が正常範囲上限（ＵＬＮ）の１～２倍、３人（１４％）がＵＬＮの２倍よりも高かった。標的病変の病変寸法（ＳＬＤ）の総和で測定されたベースライン腫瘍量は、２０人の患者で利用可能であり、ベースラインＳＬＤの中央値は、１００ｍｍ（範囲：１３、２８１）であった。
ＴＩＬ治療
全２１人の患者が、ＴＩＬ注入前に、コンディショニング化学療法として、２用量のシクロホスファミド及び５用量のフルダラビンを受けた。注入されたＴＩＬ細胞の総数の中央値は、３１．９×１０９個（範囲：７．９×１０９、６２．５×１０９）であった。ＩＬ－２投与の総数の中央値は、８（範囲：４、１１）であった。患者は、１０日間（範囲：７、１５）の中央値で入院した。治療期間中、３人（１４％）の患者がＩＣＵに入院した。
ＴＩＬ治療期間中に臨床的に有意なＡＥが報告された。コンディショニング化学療法期間中に報告された一般的なＡＥ（≧１０％）は、好中球減少（４３％）及び悪心（１９％）であり、これらの化学療法剤の副作用プロファイルと概ね一致している。
ＴＩＬ注入後に発症した一般的なＡＥとしては、血小板減少症（６２％）、発熱（５７％）、悪寒（４３％）、頻脈（２９％）、好中球減少（２９％）、肺水腫（２４％）、血管漏出（２４％）、発疹（１９％）、心房細動（１４％）、心臓血管の不安定性（１４％）、胸部感染（１４％）、及び浮腫（１４％）が挙げられる（表２１）。これらのＡＥは、他のＴＩＬ試験で報告されたものと一致している（Ｄａｆｎｉら、２０１９、Ｒｏｈａａｎら、２０１８）。
製造プロセスが段階１で失敗したが、修正製造プロセスから生成された産物で治療された患者は、腎不全、流体過剰、及び敗血症の可能性によって悪化した広範な腫瘍量に起因して、ＴＩＬ療法後６日目に死亡した。
治療期間中、末梢血数を測定した。好中球、血小板、リンパ球、白血球数、及びヘモグロビンの減少の傾向が、コンディショニング化学療法の開始時に観察された。血球数及びヘモグロビンレベルは、一般に、ＴＩＬ注入の１～４日後にそれらの最下点に達した。ベースラインレベルへの血球数回復は、概して、ＴＩＬ注入日の約７日後に観察された。
堅牢性を改善し、集中型製造による多施設臨床試験を可能にするために、製造プロセスにおける最近の変更が実装された。この更新では、消化された腫瘍材料は、安定性を延長するために凍結保存される。重要なことに、事前の凍結保存で作製された産物で治療された４人の患者において、観察されたＡＥプロファイルは、連続して治療された他の患者（表２２）、及び他のＴＩＬ産物の臨床試験で報告されたものと概ね一致していた。
２１人の患者のうちの１５人が、標的病変の放射線学的測定を含んだ連続ＣＴ及び／又はＭＲＩスキャンによる疾患評価を受けた。これらの患者のうち、定量的奏効率（奏効の確認は不要）は５３％であり、ＣＲを達成した２人（１３％）、ＰＲを達成した６人（４０％）を含む（表２３）。
定量的及び定性的奏効の両方に基づく全患者の奏効率は、ＣＲを達成した３人（１４％）及びＰＲを達成した９人（４３％）を含む５７％であった。２人の追加の患者が、ＢＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブに対する抵抗性を発現し、ＴＩＬ治療に参照される前に療法中に疾患進行を経験していた。ダブラフェニブは、ＴＩＬ療法の直前に中止され、多くの場合、ダブラフェニブの中断を伴う急速腫瘍成長を防止するために、ＴＩＬの約１～２週間後に再開された。これら２人の患者の各々は、ＴＩＬ後に定性的奏効を達成した（１人が持続性ＣＲ、１人がＰＲ）。両患者は、その後、ＴＩＬ後の奏効において、ダブラフェニブを１回中止した。これらの患者の両方がダブラフェニブに難治性となった疾患を有していたため、ＴＩＬ後に経験した臨床的利益が、ダブラフェニブの一時的な再開ではなくＴＩＬに起因したと結論付けることは妥当である。したがって、これらの患者を奏効者として含めて、奏効の感度解析を実施した。この感度解析では、奏効率は１４／２１（６７％）であり、完全奏効者４名（１９％）及び部分奏効者１０名（４８％）であった（表２４）。
奏効は、年齢、疾患部位数、事前療法ライン数、事前ＢＲＡＦ阻害剤、事前ＰＤ－１阻害剤、ベースライン脳転移、及びベースライン腫瘍量を含む、重要なベースライン及び疾患特性による部分集団間で概して一貫していた。特に、ＩＴＩＬ－１６８の製造プロセスに最も類似の製造プロセスで治療された４人の患者において、全体的な奏効率（７５％）及びＣＲ率（２５％）は、より広範な集団と一致していた。ＣＴ及び／又はＭＲＩスキャンに基づく定量的奏効を有する１５人の患者のうち、１４人は詳細な腫瘍測定値を有し、ベースラインからの腫瘍減少の最大パーセンテージをウォーターフォールプロットで提示した（図７４）。１人の患者は、ＰＤの最良総合効果を有したが、任意の治療後の標的病変の測定値が報告されず（新たな病変の観察によって決定される進行）、したがって、プロットには示されなかった。
定量的奏効データ当たりの無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値（Ｎ＝１５）は、６．７か月であり、解析終了時点では、４人の患者がいかなる後続治療もなしで、継続中の奏効（２人のＣＲ及び２人のＰＲ）を有していた。定量的及び定性的奏効データの両方に基づくＰＦＳ時間の中央値（Ｎ＝２１）は、６．７か月であり、５人の対象が、いかなるその後の療法もなしで、継続中の奏効（３人のＣＲ及び２人のＰＲ）を有していた。全２１人の治療を受けた患者の全生存（ＯＳ）期間の中央値は、２１．３か月であった（図７５Ａ）。定量的奏効データを有する１５人の患者のＯＳ時間の中央値は、１６か月であった（図７５Ｂ）。しかしながら、奏効者に対するＯＳ時間の中央値（定量的奏効のみ、Ｎ＝８）には到達しなかったが、非奏効者に対するＯＳ時間の中央値（Ｎ＝７）は、６．５か月であった（図７５Ｃ）。
実施例１４－凍結保存腫瘍消化物からのＴＩＬ
転移性黒色腫腫瘍を２１人の対象から切除し、脱凝集し、ＴＩＬを調製した。対象のうちの４人の脱凝集腫瘍組織を凍結保存し、次いで、ＴＩＬ調製前に解凍した。対象に注入し、応答転帰を評価した。臨床応答が図７７に図示される。表２５は、凍結保存ステップを受けなかったＴＩＬ調製物との脱凝集後の凍結保存を含んだＴＩＬ調製物に対する治療応答を提示する。
表２６は、ＴＩＬの調製及び投与前にＰＤ－１阻害剤による治療を受けた対象を表す表２５の応答の部分集団を示す。
表２７は、脱凝集後の凍結保存を含んだＴＩＬ調製物（凍結）対外殖及び増殖前に凍結保存ステップを受けなかったＴＩＬ調製物（新鮮）で治療された対象の人口統計を提示する。
表２８は、ＴＩＬ調製及び投与前にＰＤ－１阻害剤による治療を受けた対象の部分集団についての、脱凝集後の凍結保存を含んだＴＩＬ調製物対凍結保存ステップを受けなかったＴＩＬ調製物で治療された対象の人口統計を提示する。
表２９は、脱凝集後の凍結保存を含んだＴＩＬ調製物対凍結保存を受けなかったＴＩＬ調製物で治療された対象におけるＩＬ－２投与の人口統計を提示する。
表３０は、ＴＩＬ調製及び投与前にＰＤ－１阻害剤による治療を受けた対象の部分集団についての、脱凝集後の凍結保存を含んだＴＩＬ調製物対凍結保存を受けなかったＴＩＬ調製物で治療された対象におけるＩＬ－２投与の人口統計を提示する。
実施例１５－Ｔ細胞部分集団の特徴解析
固定可能な生存率染料ｅＦ４５０を使用した生／死の染色。ＴＩＬを２Ｘ ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１μＬの固定可能な生存率染料ｅＦ４５０を添加した。混合物をパルスボルテックスし、４℃で２０～３０分間インキュベートした。１０ｍｌのＰＥＦ（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５％のＦＣＳ）を添加し、細胞をペレットまで５００ｇ×３分間遠心分離した。上清を注ぎ出し、細胞を７５０μＬのＰＥＦ中に再懸濁した。染色のために４０μＬの細胞を１５ウェルに添加した。
抗体による細胞の表面染色。ウェルを、４℃で５分間、各ウェルに２μＬの抗ヒトＦｃＲを添加することによって遮断した。マスターミックスを、以下の抗体から作製した。ｉ． ＣＤ４５ＲＯ－ＦＩＴＣ（２μＬ／ウェル）、ｉｉ． ＣＤ８－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（０．５μＬ／ウェル）、ｉｉｉ． ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（２μＬ／ウェル）、ｉｖ． ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（２μＬ／ウェル）。６．５μＬの混合物をウェルの各々に添加した。２μＬの以下の抗体の各々を、示されるとおりに適切なウェルに添加した。
４℃で２０～３０分間のインキュベーション後、１５０μＬのＰＥＦを添加し、細胞をペレット細胞に遠心分離した（５００ｇ、３分、ＲＴ）。上清を除去し、細胞を１００μＬのＰＦＡ（４％）中に再懸濁し、１０分間、４℃でインキュベートした。ＰＦＡを除去し、細胞を１００μＬのＰＥＦ中に再懸濁し、解析まで４℃で保存した。
実施例１６
脱凝集後に凍結保存を受けたＴＩＬ調製物中のＴ細胞部分集団の相対的割合を、凍結保存されなかったＴＩＬ調製物中のＴ細胞部分集団と比較した。
エフェクター細胞及び幹細胞メモリー亜集団は、凍結保存されなかったＴＩＬ調製物と比較して、凍結保存を受けたＴＩＬ調製物の範囲にわたって実質的に低減された。総Ｔ細胞（図８１Ａ）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図８１Ｂ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（図８１Ｃ）について関係が観察された。
腫瘍消化物クライオバイアルを液体窒素倉庫から取り出され、細胞懸濁液がちょうど溶解されるまで、３７℃の水浴中で解凍される（Ｄ１）。細胞懸濁液が、１５ｍＬのファルコンに取り出され、最大１０ｍＬのＰＢＳで満たされ、４００ｇで５分間遠心分離され、上清がデカンターに移される。
細胞ペレットが、予め加温された適切なＴ細胞培地中に再懸濁され、細胞計数が、トリパンブルーを使用して生存率を決定するために実施される。細胞は、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁される。
活性化なしで培養される細胞は、０．５×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁され、２ｍｌ（１×１０６個の細胞）は、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を有する２４ウェル組織培養プレートのウェル中に配置される。細胞は、２～３日毎にＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）の添加による形質導入まで、加湿された３７℃インキュベーター中で培養される。
細胞のＤ３及びＤ４で形質導入される細胞に関して、細胞の活性化は、Ｄ１で起こる。細胞のＤ７及びＤ８で形質導入される細胞に関して、細胞の活性化は、Ｄ５で起こる。
ＴＩＬ活性化のために、０．５×１０６個の細胞／ｍＬが、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する２４ウェル組織培養プレート中に配置される。１０μＬのＴ細胞ＴｒａｎｓＡＣＴ（ＴＭ）が、ＴＩＬ懸濁液（１：１の比率）の１×１０６個の細胞毎に添加され、細胞は、３７℃のインキュベーター中で４８時間インキュベートされる。
形質導入初日（Ｄ３又はＤ７）
２４ウェルプレートから細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに収集し、１０ｍＬのＴＣＭで満たし、４００ｇで５分間スピンさせる。トリパンブルーを使用して細胞を計数し、１×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁する。
各形質導入法では、９６ウェル平底プレートで１×１０５個の細胞（１００μＬ）／ウェルが使用される。２４ウェルプレートに形質導入する場合、１×１０６個の細胞／ウェル（５００μＬ）を配置する。６ウェルプレートに形質導入する場合、５×１０６個の細胞／ウェル（２ｍＬ）を配置する。
最終の条件毎に１００μｌ／１０５個の細胞（又は２４ウェル及び６ウェルプレートに対する適切な密度及び体積）のＴＣＭ中に再懸濁することによって、レンチウイルス（ＭＯＩ５）及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のマスターミックスを調製する。分注損失を考慮するために、ウェルの数＋１についてマスターミックス量を調製する。
ＮＴ細胞（ＭＯＣＫ）について、９６ウェル平底プレート内で、１００μＬ毎にＴＣＭ及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のマスターミックスを調製する。２４ウェル及び６ウェルプレートについて、それぞれ、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を用いて、５００μＬ及び２ｍＬで、ＭＯＣＫ Ｔ細胞を再懸濁する。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ又は１５ｍＬのファルコンチューブ中の細胞から上清を除去し、条件に応じて、１×１０５個の細胞当たり、適切な１００μＬのマスターミックス（又は２４ウェル及び６ウェルプレートの適切な密度及び体積）中で細胞を再懸濁する。
各条件を適切に再懸濁し、細胞を、それに応じて、非ＴＣ平坦底の９６ウェル、２４ウェル、又は６ウェルのプレート上に移す。
９６ウェルプレートの形質導入では、蒸発を防止するために、周囲のウェルに２００μＬのＰＢＳを添加する。
加湿された３７℃のインキュベーター内で細胞を一晩インキュベートする。
形質導入２日目（Ｄ４又はＤ８）
９６ウェル平底プレートから上下に再懸濁して細胞を収集し、９６ウェルＵ底プレートに移す。（２４ウェル又は６ウェルプレートからの収集は、１５ｍＬのファルコンで実施される。） プレートを４００ｇで５分間スピンさせ、ＴＣＭで細胞を洗浄する。
各形質導入法では、９６ウェル平底プレートで１×１０５個の細胞（１００μＬ）／ウェルを使用する。２４ウェルプレートに形質導入する場合、１×１０６個の細胞／ウェル（５００μＬ）を配置する。６ウェルプレートに形質導入する場合、５×１０６個の細胞／ウェル（２ｍＬ）を配置する。
最終の条件毎に１００μｌ／１０５個の細胞（又は２４ウェル及び６ウェルプレートに対する適切な密度及び体積）のＴＣＭ中に再懸濁することによって、レンチウイルス（ＭＯＩ５）及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のマスターミックスを調製する。分注損失を考慮するために、ウェルの数＋１についてマスターミックス量を調製する。
ＮＴ細胞（ＭＯＣＫ）について、９６ウェル平底プレートに対して、１００μＬ毎にＴＣＭ及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のマスターミックスを調製する。２４ウェル及び６ウェルプレートについて、それぞれ、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を用いて、５００μＬ及び２ｍＬで、ＭＯＣＫ Ｔ細胞を再懸濁する。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ又はファルコンチューブ中の細胞から上清を除去し、条件に応じて、１×１０５個の細胞当たり、適切な１００μＬのマスターミックス（又は２４ウェル及び６ウェルプレートの適切な密度及び体積）中で細胞を再懸濁する。
各条件を適切に再懸濁し、細胞を、それに応じて、非ＴＣ平坦底の９６ウェル、２４ウェル、又は６ウェルのプレート上に移す。９６ウェルプレートの形質導入では、蒸発を防止するために、周囲のウェルに２００μＬのＰＢＳを添加する。加湿された３７℃のインキュベーター内で細胞を一晩インキュベートする。
翌日、細胞を新しい９６ウェル丸底プレート、２４ウェル又は６ウェルプレートに移し、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を有する新鮮な培地中で、加湿された３７℃のインキュベーターで７２時間インキュベートする。
９６ウェルプレートの最終体積は、２００μＬ／ウェルであり、２４ウェルプレートの最終体積は、２ｍＬ／ウェルであり、６ウェルプレートの最終体積は、５ｍＬ／ウェルである。ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）は、２～３日毎に添加される。
細胞は、Ｄ３＋Ｄ４形質導入についてはＤ８で、Ｄ７＋Ｄ８形質導入についてはＤ１２で、形質導入効率について染色される。
ＴＩＬの外殖
モック及び形質導入細胞は、９６ウェルＵ底プレートに、それらがＲＥＰ内に配置されるまで維持される。
細胞維持のために、２～３日毎に培地の半分が除去され、新鮮なＴＣＭ及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）で交換される。９６ウェルプレートの場合、１００μｌの培地を除去し、２００μＬの最終体積に交換する。２４ウェルプレートの場合、１ｍＬの培地を除去し、２ｍＬの最終体積に交換する。６ウェルプレートの場合、１ｍＬの培地を除去し、２ｍＬの最終体積に交換する。
ＲＥＰは、Ｄ１３（１２日間の外殖）から始まる。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
段落１． 治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＵＴＩＬ）集団を単離するための方法であって、（ａ）対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、細胞懸濁液が凍結保存され得るように、腫瘍が十分に脱凝集される、産生することと、低温に冷却又は維持することによってステップ（ａ）と同じ日に脱凝集腫瘍を凍結保存することと、（ｃ）凍結保存脱凝集腫瘍を任意選択的に保存することと、（ｄ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で脱凝集腫瘍を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することと、（ｅ）第１のＵＴＩＬ集団を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｆ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することと、を含む、方法。
段落２． 脱凝集が、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落１に記載の方法。
段落３． 冷却することが、コントロールレートである、段落１又は２に記載の方法。
段落４． コントロールレート凍結が、約－６０℃まで約－２℃／分である、段落３に記載の方法。
段落５． 脱凝集腫瘍が、細胞化される、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
段落６． 脱凝集腫瘍が、精製される、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
段落７． 単一細胞懸濁液が、ステップ（ａ）の後に提供される、段落１～６のいずれか１つに記載の方法。
段落８． 第１のＵＴＩＬ集団が、約１００万～２０００万個のＵＴＩＬである、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
段落９． ステップ（ｄ）は、腫瘍出発材料からのＵＴＩＬの成長、その後のステップ（ｅ）の急速増殖を更に含む、段落１～８のいずれか１つに記載の方法。
段落１０． ステップ（ｄ）が、約２週間実施され、ステップ（ｅ）が、約２週間実施される、段落９に記載の方法。
段落１１． ステップ（ｄ）及び／又はステップ（ｅ）が、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、又はそれらの組み合わせを添加することを更に含む、段落１～１０のいずれか１つに記載の方法。
段落１２． 第２のＵＴＩＬ集団を懸濁するステップ（ｇ）を更に含む、段落１～１１のいずれか１つに記載の方法。
段落１３． 懸濁することが、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる、段落１２に記載の方法。
段落１４． ステップ（ｆ）が、凍結保存することであり、ＵＴＩＬを解凍する最終ステップを更に含む、段落１～１３のいずれか１つに記載の方法。
段落１５． 解凍ＵＴＩＬが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落１４に記載の方法。
段落１６． 段落１～１５のいずれか１つに記載の方法によって得られた、治療用凍結保存未修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＵＴＩＬ）集団。
段落１７． 集団が、約５×１０９～５×１０１０個のＴ細胞を含む、段落１６に記載の治療用集団。
段落１８． 段落１６又は１７の治療用集団の凍結保存バッグ。
段落１９． 静脈内注入で使用するための、段落１８に記載の凍結保存バッグ。
段落２０． 段落１４若しくは１５の治療用集団、又は段落１８若しくは１９の凍結保存バッグを投与することを含む、がんを治療するための方法。
段落２１． がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮細胞がん（ＨＮＳＣＣ）を含む、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎がん、又は腎細胞がんである、段落２０に記載の方法。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
段落１． 治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＵＴＩＬ）集団を単離するための方法であって、（ａ）対象から腫瘍を切除すること、（ｂ）単回使用無菌キット内に切除腫瘍を保存することであって、単回使用無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、保存すること、（ｃ）脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、（ｄ）安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施すること、（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること、（ｇ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することを含む、方法。
段落２． 脱凝集が、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落１に記載の方法。
段落３． 脱凝集腫瘍が、細胞化される、段落１又は２に記載の方法。
段落４． 単一細胞懸濁液が、ステップ（ｃ）の後に提供される、段落１～３のいずれか１つに記載の方法。
段落５． 第１のＵＴＩＬ集団が、約１００万～２０００万個のＵＴＩＬである、段落１～４のいずれか１つに記載の方法。
段落６． ステップ（ｅ）は、切除腫瘍出発材料からのＵＴＩＬの成長、その後のステップ（ｆ）の急速増殖を更に含む、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
段落７． ステップ（ｅ）が、約２週間実施され、ステップ（ｆ）が、約２週間実施される、段落６に記載の方法。
段落８． ステップ（ｅ）及び／又はステップ（ｆ）が、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、又はそれらの組み合わせを添加することを更に含む、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
段落９． 第２のＵＴＩＬ集団を懸濁するステップ（ｈ）を更に含む、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
段落１０． 懸濁することが、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる、段落９に記載の方法。
段落１１． ステップ（ｇ）が、凍結保存することであり、ＵＴＩＬを解凍する最終ステップを更に含む、段落１～９のいずれか１つに記載の方法。
段落１２． 解凍ＵＴＩＬが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落１０に記載の方法。
段落１３． 段落１～１１のいずれか１つに記載の方法によって得られた治療用凍結保存ＵＴＩＬ集団。
段落１４． 集団が、約５×１０９～５×１０１０個のＴ細胞を含む、段落１３に記載の治療用集団。
段落１５． 段落１３又は１４の治療用集団の凍結保存バッグ。
段落１６． 静脈内注入で使用するための、段落１５に記載の凍結保存バッグ。
段落１７． 第１３項若しくは第１４項の治療用集団、又は第１５項若しくは第１６項の凍結保存バッグを投与することを含む、がんを治療する方法。
段落１８． がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮細胞がん［ＨＮＳＣＣ］を含む）、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎がん、又は腎細胞がんである、段落１７に記載の方法。
段落１９． 無菌キットの１つ以上の可撓性コンテナが、弾性変形可能な材料を含む、段落１に記載の方法。
段落２０． 無菌キットの脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、１つ以上の封止可能な開口部を含む、段落１に記載の方法。
段落２１． 無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性コンテナが、ヒートシール可能な溶着を含む、段落２０に記載の方法。
段落２２． 無菌キットの１つ以上の可撓性コンテナが、内部に丸みを帯びた縁を含む、段落１に記載の方法。
段落２３． 無菌キットの脱凝集モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、その中に固形腫瘍を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む、段落１に記載の方法。
段落２４． 無菌キットの濃縮モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、細胞化脱凝集固形組織の保持物を保持するフィルタを含む、段落１に記載の方法。
段落２５． 無菌キットの安定化モジュールの１つ以上の可撓性コンテナが、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む、段落１に記載の方法。
段落２６． 無菌キットが、デジタル、電子、又は電磁タグ識別子を更に含む、段落１に記載の方法。
段落２７． 無菌キットのタグ識別子が、脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスで使用される１つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連する、段落２６に記載の方法。
段落２８． 同じ可撓性コンテナが、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの１つ以上の一部を形成し得る、段落１に記載の方法。
段落２９． 無菌キットの脱凝集モジュールが、処理される組織の受け取りのための第１の可撓性コンテナを含む、段落１の方法。
段落３０． 無菌キットの脱凝集モジュールが、脱凝集のための培地を含む第２の可撓性コンテナを含む、段落１の方法。
段落３１． 無菌キットの任意選択の濃縮モジュールが、濃縮された濾液を受容するための第１の可撓性コンテナ及び第３の可撓性コンテナを含む、段落１の方法。
段落３２． 無菌キットの脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第２の可撓性コンテナを含み、第２のコンテナが、消化培地及び安定化培地を含む、段落１に記載の方法。
段落３３． 無菌キットの安定化モジュールが、安定化培地を含む第４の可撓性コンテナを含む、段落１に記載の方法。
段落３４． 無菌キットの安定化モジュールはまた、保存する及び／又は凍結保存を受けるための第１の可撓性コンテナ及び／又は第３の可撓性コンテナを含む、段落１に記載の方法。
段落３５． 治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球（ＵＴＩＬ）集団を単離するための方法であって、（ａ）対象から腫瘍を切除すること、（ｂ）プログラム可能プロセッサ及び単回使用無菌キットを含む、哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化のための自動デバイス内に切除腫瘍を保存することであって、単回使用無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、保存すること、（ｃ）切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、（ｄ）安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施すること、（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること、（ｇ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存することを含む、方法。
段落３６． 自動デバイスが、単回使用キットの認識のための無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落３５に記載の方法。
段落３７． 自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、タグを介して無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びに該プロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行することができる、段落３６に記載の方法。
段落３８． 自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び安定化モジュールのうちの１つ以上と通信し制御するように適合されている、段落３５に記載の方法。
段落３９． 自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び／又は生物学的分解を可能にする、段落３８に記載の方法。
段落４０． プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び／又は酵素的分解を可能にする、段落３９に記載の方法。
段落４１． 固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落４０に記載の方法。
段落４２． プログラム可能プロセッサが、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落３５に記載の方法。
段落４３． プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化モジュールを制御して、濃縮された脱凝集固形組織をコンテナ内で凍結保存する、段落３５に記載の方法。
段落４４． 自動デバイスは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び／若しくは安定化モジュールのうちの１つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための１つ以上の弁、並びに／又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための１つ以上のクランプのうちの１つ以上を任意の組み合わせで更に備える、段落３５に記載の方法。
段落４５． 自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、段落３５に記載の方法。
段落４６． 自動デバイスが、ユーザインターフェースを更に備える、段落３５に記載の方法。
段落４７． インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落４６に記載の方法。
段落４８． 自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、段落３５に記載の方法。
段落４９． 治療用凍結保存ＵＴＩＬ集団を単離するための半自動無菌組織処理方法であって、（ａ）無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定するステップであって、無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び／又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された１つ以上の導管によって接続された１つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、１つ以上の可撓性コンテナへの培地及び／又は試薬の無菌入力を可能にする１つ以上のポートを備える、決定するステップと、（ｂ）対象から腫瘍を切除するステップと、（ｃ）無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に腫瘍を配置するステップと、（ｄ）１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって腫瘍を処理するステップであって、切除腫瘍が無菌脱凝集され、それによって、脱凝集腫瘍を産生し、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集モジュール、脱凝集腫瘍が、脱凝集固形組織材料を除去し、非脱凝集組織及び濾液を分離するために濾過される、任意選択の濃縮モジュール、脱凝集腫瘍が凍結保存される、安定化モジュールと通信し、それらを制御することによって、処理するステップと、（ｅ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第１のＵＴＩＬ集団を産生することによって、第１の増殖を実施するステップと、（ｆ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて第１のＵＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生するステップと、（ｇ）第２のＵＴＩＬ集団を採取及び／又は凍結保存するステップと、を含む、方法。
実施例１８： プロセス最適化
プロセス改善運動の主な目的は、以下のように、プロセスの堅牢性の改善のための重点エリアを識別し、まず健常ドナーと設計空間を体系的に特徴付けて、腫瘍試料を保存することである。改善の重点エリアとしては、ＴＩＬ製品の製造の簡素化、主要なプロセス内ステップの密接化及び自動化、収穫、製剤化、及び凍結保存プロセス性能の改善、針の使用の低減、並びにリスク評価で識別された主要な潜在的故障モードへの対処が挙げられる。
優先事項としては、消化及び増殖の洗浄の自動化、培地の形成及び細胞密度、収穫洗浄の出力量の調整、培養バッグ（静止ＲＥＰ）の低減、カセットにおける凍結保存、フィーダー層に対するＰＢＭＣの凍結保存、及びＸｕｒｉ供給スケジュールの最適化が挙げられる。
１日目のＴＩＬ外殖の製造プロセス最適化は、Ｓｅｆｉａを介して閉鎖された自動プロセス、オペレータのばらつきの低減及び収率の向上、針の使用の低減、並びに１５の開放ステップを伴った。
１３日目の急速なポリクローナル増殖のための製造プロセス最適化（外殖採取／静止ＲＥＰ）は、Ｓｅｆｉａを介した閉鎖された自動洗浄プロセス、Ｓｅｆｉａを介したフィーダー層のための３人の健常ドナー（ＨＤ）照射ＰＢＭＣの閉鎖された自動洗浄、静止ＲＥＰ及び２４の開放ステップを開始する１－３ＬのＥＶＡ又はＥＸＰバッグを伴った。
フィーダー層としてのアフェレーシスからの凍結保存ＰＢＭＣの主要な利点は、ＴＩＬ産生ロット当たり１０人のバフィーコートドナーの要件に対して、平均して、３つのＴＩＬ産生ロットを支持した３人のアフェレーシスドナーのプールを結果的にもたらし、これが、１５，０００～２５，０００ドル／ロットを節約すること、バフィーコート又は全血製品よりもＧＭＰグレードのアフェレーシスのベンダーの数が多いこと、ＰＢＭＣ調製の外部委託により製造労力が減少したこと、凍結保存ＰＢＭＣによる事前スクリーニング及び材料の在庫の確立を可能にし、産生実行毎に識別される必要のあるドナーが減少したことである。
１９日目の急速なポリクローナル増殖のための製造プロセス最適化（動的ＲＥＰ）は、Ｗａｖｅ／Ｘｕｒｉに対して、１．５～２．５Ｌ ｗ．ｖ．、２．５～３．０Ｌ ｗ．ｖ．、３．０～３．５Ｌ ｗ．ｖ．、３．５～４．０Ｌ ｗ．ｖ．、４．０～４．５Ｌ ｗ．ｖ．、４．５～５．０Ｌ ｗ．ｖ．、５．０～６．０Ｌ ｗ．ｖ．、６．０～７．０Ｌ ｗ．ｖ若しくは７．０～８．０Ｌ ｗ．ｖ、又は３．０Ｌ ｗ．ｖ、３．２Ｌ ｗ．ｖ、３．４Ｌ ｗ．ｖ、３．６Ｌ ｗ．ｖ、３．８Ｌ ｗ．ｖ、４．０Ｌ ｗ．ｖ、４．２Ｌ ｗ．ｖ、４．５Ｌ ｗ．ｖ、４．７Ｌ ｗ．ｖ、若しくは５．０Ｌ ｗ．ｖを含む、１．５～７．５Ｌ ｗ．ｖ Ｗａｖｅ／Ｘｕｒｉ、Ｘｕｒｉのみに対して、Ｕｎｉｃｏｒｎ方法を介して手動設定又は自動設定、２又は３つの灌流（例えば、Ｄ２０－５００～１５００ｍＬ／日、Ｄ２２、１０００～３０００ｍＬ／日、Ｄ２４－１５００～４０００ｍＬ／日、Ｄ２０－１０００ｍＬ／日、Ｄ２２－２５００ｍＬ／日、又はＤ２０－８００ｍＬ／日、Ｄ２２－１６００ｍＬ／日、Ｄ２４－３２００ｍＬ／日）を伴い、これは、より良好なガス交換及び均一性のために、細胞増殖（代謝物）、及び５°～６°、若しくは６°～７°、若しくは７°～８°、若しくは８°～９°、又は５°、６°、７°、８°、若しくは９°の揺動角度を改善及び維持する。
２５～２７日目の産生細胞処理（採取及び製剤化）のための製造プロセス最適化は、収穫培地としての約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％のＨＳＡ＋ＰＢＳ、ＣＳ１０の重力ドレイン（約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、又は２５％、ＤＭＳＯ）、最終医薬品（ＤＰ）：（１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、又は５．０％のＨＳＡ＋１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８．０％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９．０％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９７％、９．８％、９．９％、又は１０．０％のＤＭＳＯ）、及びゼロの開放ステップを伴った。
Ｎ＝１腫瘍及び追加のＨＤ試料を用いた製造の実現可能性は、プロセスの堅牢性を示す。プロセス内洗浄回収、細胞収率、及び採取性能は、過去の範囲毎に許容可能であった。３時間のプロセス内製剤化後生存率は、９０％を上回ったままであった。方法は、堅牢性を高め、操作を簡略化する、いくつかの重要なプロセスの改善を提供した。特に、プロセスはより拡張性があり、商業運転により適している。
１日目のＴＩＬポリクローナル活性化において、ＴＩＬは、活性化誘導細胞死を介して枯渇され得、ＴＩＬは、腫瘍細胞との「共培養」によって優先的に刺激されない場合がある。出願人は、製品の品質に影響を与えるリスクを回避するために、ＴＩＬ外殖フェーズ中にポリクローナルＴ細胞活性化を排除することを提案している。
３日目及び４日目のＴＩＬ形質導入において、多量の非ＴＩＬが、Ｔｄ中に存在し得、培養中のＴＩＬ総生存細胞（ＴＶＣ）は、早期段階では大きなばらつきがある。出願人は、培養物がＴＭＥから回収され、Ｔ細胞が濃縮されたとき、外殖フェーズの後半にＴｄを実施することを提案している。
出願人は、効率的な形質導入のための活性化を必要としないプロセスの実現可能性を試験することを提案する。「活性化なし」プロセスの主な潜在的な利益としては、商品のコスト（ＣＯＧ）を低下させるプロセス簡素化、以前のプラットフォームとの類似度の拡大、プログラム間の知識の伝達及びブリッジングの容易化、プログラム間の製品品質変化の最小化、並びにプロセス改善及び短縮の促進が挙げられる。卵巣腫瘍消化物では、出願人は、「非活性化／早期ＴＤ」条件において、一貫して高い形質導入（ＴＤ）を見出した。
要約すると、一貫して高いＴＤは、「非活性化／早期ＴＤ」条件で観察され、全条件にわたってＲＥＰ中に細胞成長差は観察されず、ＣＤ４／ＣＤ８比率の間に差はなく、メモリー表現型の間に差はなかった。これまでのところ、その簡素化及び一貫性に起因して、提案されたプロセスは「非活性化／早期ＴＤ」である。
プロセス加速の主要な制約としては、外殖中のＴＩＬレパートリー及び機能性に対する潜在的な影響、ＲＥＰ中の外殖及びポリクローナル活性化の開始に対するウイルス形質導入のタイミング、同種ＰＢＭＣ（フィーダー層）と関連する不純物の除去、外殖中のＴＩＬ成長動力学の変動、及びＲＥＰ中の形質導入効率の正確性尺度（ＰＢＭＣからの同種Ｔ細胞は、試験方法の一部として除外されることができない）が挙げられる。目標は、プロセスの堅牢性又は製品品質をリスクに曝すことなく、フェーズ１のプロセスの加速を可能にすることである。
想定されたプロセス改善としては、形質導入の最適化、腫瘍及び外殖の特徴解析（機能横断的）、同種フィーダー細胞比率の低減、及びＲＥＰバイオリアクター最適化（倍加時間の増加）が挙げられる。目標は、ＣＯＧの低減、プロセス制御の向上、２０日間の製造プロセスを可能にすることである。他の改善としては、フィーダー層除去及び１４日間プロセスが挙げられ得る。
実施例１９： 腫瘍バンキング
図８２は、腫瘍バンキングを図示する。
スクリーニング＃１： ＴＩＬ製造の適合性について外科的切除前に腫瘍を評価し、パート１への登録を可能にする。
ＴＩＬ採取のための腫瘍切除：腫瘍は、患者の診断後の任意の時点で収集されるが、腫瘍は、一般に、ＳＯＣ腫瘍切除（根治的外科的切除又は外科的減量など）で採取されることになる。
ＳＯＣアジュバント療法又はＳＯＣ療法：療法は、アジュバント又は全身的であり、化学照射（例えば、シスプラチン及び照射）、チェックポイント阻害（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４阻害）、免疫療法（例えば、サイトカインアゴニスト（ＩＬ－２））、化学療法（例えば、カルボプラチン及びパクリタキセル）、又は標的療法（例えば、ダブラフェニブ）を含む。療法は単独で又は組み合わせて投与される。
スクリーニング＃２： ＴＩＬによる療法の適合性を確立する。
パート３への登録：ＩＴＩＬ－１６８製造は、適格性の確認後に開始する。
ＬＤ化学療法：－７日目及び－６日目にシクロホスファミド３０～６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２。
略語：ＩＣＦ、インフォームドコンセントフォーム、ＩＬ－２、インターロイキン－２、ＩＵ、国際単位、ＩＶ、静脈内、ＬＤ、リンパ球枯渇、Ｑ１２Ｈ、１２時間毎、ＴＩＬ、腫瘍浸潤リンパ球。
実施例２０： リンパ球枯渇の脱強化
図８３は、リンパ球枯渇治療スキームの脱強化を図示する。
スクリーニング：適格性を評価するために２１日間、登録に３０日間。
ベースラインビジット：ＬＤ化学療法の１０日以内に起こる。
ＬＤ化学療法：
コホート１： －７日目及び－６日目にシクロホスファミド３０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２。
コホート２： Ｄ－５～Ｄ－３にシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２、Ｄ－５～Ｄ－２にフルダラビン３０ｍｇ／ｍ２。
ＩＴＩＬ－１６８：単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬ。
ＩＬ－２： 忍容性に応じて最大８用量にわたって６００，０００ＩＵ／ｋｇ Ｑ１２Ｈ（±４時間）。ＩＴＩＬ－１６８注入後の≧９０分の初回投与。
略語：ＩＣＦ、インフォームドコンセントフォーム、ＩＬ－２、インターロイキン－２、ＩＵ、国際単位、ＩＶ、静脈内、ＬＤ、リンパ球枯渇、Ｑ３Ｍ、３か月毎、Ｑ６Ｍ、６か月毎、Ｑ１２Ｈ、１２時間毎、ＴＩＬ、腫瘍浸潤リンパ球。
実施例２１： アジュバントＰＤ－１に対して難治性の黒色腫対象
このコホートは、ＰＤ－１阻害を伴うアジュバント療法を受けているが、難治性が証明された対象を治療する。重要なことに、ＴＩＬ採取のための腫瘍は、ＳＯＣ外科的切除時に切除され、ＴＩＬ製造のために凍結保存される。
米国及び英国には、約２０のサイトが存在する
コホート１：ＰＤ－１阻害剤ベースのアジュバント療法に対して難治性である約１２～１５人の対象。
パート１：ステージＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、及びＩＶの皮膚黒色腫の完全切除（腫瘍消化及び凍結保存）。
パート２： 疾患再発までＰＤ－１阻害を伴う標準的な治癒アジュバント療法。
パート３： ＴＩＬ製造とともに開始したペムブロリズマブを最長２年間継続した。
パート１に４０人の対象を登録し、パート３に約１２～１５人の対象を登録及び治療することを想定する。
主要評価項目：治験責任医師の評価による全体的な奏効率（ＯＲＲ）。
スキームが図８４に提示される。
スクリーニング＃１： ＴＩＬ製造の適合性について外科的切除前に腫瘍を評価し、パート１への登録を可能にする。
ＳＯＣアジュバントＰＤ－１阻害：標準的な治癒アジュバント療法は、医師の裁量で投与される。
スクリーニング＃２： ＴＩＬ＋Ｐｅｍｂｒｏによる療法の適合性を確立する。
パート３への登録：３週間毎のペムブロリズマブ２００ｍｇ及びＴＩＬ製造を開始する。ペムブロリズマブは２年間継続する。
ＬＤ化学療法：－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２。
ＩＴＩＬ－１６８：単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬ。
ＩＬ－２： ６００，０００ＩＵ／ｋｇ Ｑ１２Ｈ（±４時間）最大８用量。ＩＴＩＬ－１６８注入後の≧９０分の初回投与。
略語：ＩＣＦ、インフォームドコンセントフォーム、ＩＬ－２、インターロイキン－２、ＩＵ、国際単位、ＩＶ、静脈内、ＬＤ、リンパ球枯渇、Ｑ１２Ｈ、１２時間毎、ＴＩＬ、腫瘍浸潤リンパ球。
実施例２２： 皮膚黒色腫の設計及びスキーム
このコホートは、皮膚黒色腫試験集団、ＰＤ－１後の進行、及び該当する場合にはＢＲＡＦ阻害を調査するが、ペムブロリズマブを治療レジメンに添加する。
約１５人の対象が登録され、治療されることを想定する。
主要評価項目：治験責任医師の評価による全体的な奏効率（ＯＲＲ）。
スキームが図８５に提示される。
スクリーニング：２１日間、登録まで３０日間
ペムブロリズマブ：３週間毎に２００ｍｇ、一般に、腫瘍切除の２週間以内に開始され、１２か月、進行、又はＴＩＬ治療の２年後のＣＲまで継続される。
ＬＤ化学療法：－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２。
ＩＴＩＬ－１６８：単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬ。
ＩＬ－２： ６００，０００ＩＵ／ｋｇ Ｑ１２Ｈ（±４時間）最大８用量。ＩＴＩＬ－１６８注入後の≧９０分の初回投与。
ペムブロリズマブ：３週間毎に２００ｍｇ、最長２年間継続する。
略語：ＩＣＦ、インフォームドコンセントフォーム、ＩＬ－２、インターロイキン－２、ＩＵ、国際単位、ＩＶ、静脈内、ＬＤ、リンパ球枯渇、Ｑ１２Ｈ、１２時間毎、ＴＩＬ、腫瘍浸潤リンパ球。
実施例２３： 皮膚黒色腫
このコホートは、皮膚黒色腫試験集団、ＰＤ－１後の進行、及び該当する場合にはＢＲＡＦ阻害を調査するが、ＩＬ－２の代わりにペムブロリズマブを治療レジメンに添加する。
約１５人の対象が登録され、治療されることを想定する。最初の８人の対象の後、ＨＤ ＩＬ－２のないｐｅｍｂｒｏ＋ＴＩＬが無益性評価に合格しない場合、登録は停止する。
主要評価項目：治験責任医師の評価による全体的な奏効率（ＯＲＲ）。
スキームが図８６に提示される。
スクリーニング：２１日間、登録まで３０日間
ペムブロリズマブ：３週間毎に２００ｍｇであるが、ＤＯでコーディネートされ（ＴＩＬ注入）、一般に、腫瘍切除の２週間以内に開始され、１２か月、進行、又はＴＩＬ治療の２年後のＣＲまで継続される。
ＬＤ化学療法：－７日目及び－６日目にシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ、－７日目～－３日目にフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２。
ＩＴＩＬ－１６８：単回ＩＶ注入として投与される≧５×１０９の生存ＴＩＬ。
ペムブロリズマブ：ＤＯにおいて３週間毎に２００ｍｇ投与され、最長２年間継続する。
略語：ＩＣＦ、インフォームドコンセントフォーム、ＩＬ－２、インターロイキン－２、ＩＵ、国際単位、ＩＶ、静脈内、ＬＤ、リンパ球枯渇、Ｑ１２Ｈ、１２時間毎、ＴＩＬ、腫瘍浸潤リンパ球。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
段落１． 組織を処理するための可撓性コンテナであって、封止可能なポリマーから作製された１つ以上の層であって、可撓性コンテナの少なくとも３つの縁が、製造中に封止されている、１つ以上の層と、組織材料が使用中に挿入される、可撓性コンテナ上の開放縁と、チューブを通して可撓性コンテナを少なくとも１つの要素に結合するように構成された１つ以上のコネクタと、を備え、開放端に近接する区分は、組織材料が可撓性コンテナ内に位置付けられて封止を形成した後に封止される、可撓性コンテナ。
段落２ 封止が、開放端に平行で、かつ可撓性コンテナの開放縁から離隔された少なくとも３ｍｍの幅のエリアを含む、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落３． 突出部を有し、封止に近接して位置付けられ、可撓性コンテナの開口縁から封止よりも更に離隔されたクランプを更に備える、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落４． 使用中に封止とクランプとの組み合わせが、可撓性コンテナに適用される１００Ｎの力に耐えるように構成されている、段落３に記載の可撓性コンテナ。
段落５． 使用中に封止とクランプとの組み合わせが、可撓性コンテナに適用される７５Ｎの力に耐えるように構成されている、段落３に記載の可撓性コンテナ。
段落６． 封止が、開放端に平行で、かつ可撓性コンテナの開放縁から離隔された少なくとも５ｍｍの幅のエリアを含む、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落７ 可撓性コンテナが、組織材料の脱凝集に使用される、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落８． 可撓性コンテナが、組織材料の脱凝集、脱凝集組織材料の濾過、並びに非脱凝集組織及び濾液の分離に使用される、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落９． 弾性変形可能な材料を更に含む、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１０． １つ以上のインジケータを更に含む、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１１． １つ以上のマークを更に含む、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１２． 封止が、所定の圧力、所定の温度、及び所定の時間枠で動作するヒートシーラーを使用して形成されている、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１３． 可撓性コンテナが、可撓性コンテナ内に配置された組織材料を機械的に粉砕するデバイスで使用されるように構成されている、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１４． 可撓性コンテナが、組織材料をせん断するように構成されている、段落１に記載の可撓性コンテナ。
段落１５． 哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び任意選択の濃縮のための半自動又は自動プロセスにおける、段落１に記載の可撓性コンテナの使用。
段落１６． 組織からの所望の材料の抽出のためのシステムであって、キットであって、脱凝集可撓性コンテナ、安定化可撓性コンテナ、及び組織源、組織の状態、又は識別子のうちの少なくとも１つを提供することができる、脱凝集可撓性コンテナ又は安定化可撓性コンテナのうちの少なくとも１つに位置付けられた少なくとも１つのインジケータタグを含む、キットと、脱凝集可撓性コンテナ内で少なくともいくつかの組織を治療して、処理された流体を形成することができる脱凝集要素と、処理された流体のうちの少なくともいくつかを濃縮して、所望の材料を形成することができる濃縮要素と、安定化可撓性コンテナ内に所望の材料の一部分を保存することができる安定化要素と、安定化要素における組織源、又は組織の状態のうちの少なくとも１つを提供することができる、脱凝集要素又は安定化要素のうちの少なくとも１つに位置付けられた少なくとも１つのインジケータタグリーダーと、を備える、システム。
段落１７． 所望の材料が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、段落１５に記載のシステム。
段落１８． １つ以上のタイプの培地が、脱凝集要素及び安定化要素によってプロセスで使用される、段落１５に記載のシステム。
段落１９． コントロールレート凍結することができる、安定化要素で使用するための凍結保存培地を更に含む、段落１５に記載のシステム。
段落２０． 脱凝集可撓性コンテナが、使用中に封止される開放端を有する脱凝集バッグを備え、安定化可撓性コンテナが、安定化バッグである、段落１５に記載のシステム。
段落２１． 哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び／又は濃縮及び／又は安定化のための自動デバイスであって、プログラム可能プロセッサと、脱凝集可撓性コンテナとして、段落１～１５のいずれかの可撓性コンテナのうちの少なくとも１つを含むキットと、を備える、自動デバイス。
段落２２． インジケータタグリーダーを更に備える、段落２１に記載の自動デバイス。
段落２３． キットの構成要素を認識する無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落２１に記載の自動デバイス。
段落２４． プログラム可能プロセッサが、タグを介してキットの構成要素を認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにそれらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するプログラムを実行することができる、段落２１に記載の自動デバイス。
段落２５． プログラム可能プロセッサが、自動デバイスの脱凝集要素を制御して、脱凝集可撓性コンテナにおける固形組織の物理的及び／又は生物学的分解を可能にする、段落２１に記載の自動デバイス。
段落２６． プログラム可能プロセッサが、脱凝集可撓性コンテナ内に位置付けられた固形組織を機械的に粉砕及びせん断する、脱凝集可撓性コンテナに近接する脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落２５に記載の自動デバイス。
段落２７． プログラム可能プロセッサが、自動デバイスの脱凝集要素を制御して、脱凝集可撓性コンテナにおける固形組織の物理的及び／又は酵素的分解を可能にする、段落２１に記載の自動デバイス。
段落２８． 固形組織の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される１つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落２７に記載の自動デバイス。
段落２９． デバイスが、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの少なくとも２つを備え、プログラム可能プロセッサが、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの１つ以上と通信して制御するように適合されている、段落２１に記載の自動デバイス。
段落３０． プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化要素を制御して、濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存コンテナ内で凍結保存する、段落２９に記載の自動デバイス。
段落３１． デバイスは、任意選択の濃縮要素への脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集要素で完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び／若しくは安定化要素のうちの１つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び／若しくは安定化要素のうちの１つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、要素内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも１つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮要素内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮要素内の接線流濾過プロセスを制御するための１つ以上の弁、並びに／又は各要素の入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための１つ以上のクランプの追加の構成要素のうちの１つ以上を任意の組み合わせで更に備える、段落２９に記載の自動デバイス。
段落３２． プログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化要素内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、段落２９に記載の方法。
段落３３． ユーザインターフェースを更に備える、先行段落のいずれかに記載の自動デバイス。
段落３４． インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落２６に記載の自動デバイス。
段落３５． 自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、段落２１に記載の自動デバイス。
段落３６． 自動組織処理方法であって、キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、処理ステップのための条件及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、組織試料をキットの可撓性コンテナ内に配置することと、
可撓性コンテナの少なくとも１つの縁を封止することと、インジケータと通信し、可撓性コンテナを制御することによって、１つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、処理された組織試料の少なくとも一部分を濾過して、濾過された流体を生成することと、濾過された流体の少なくとも一部を、凍結保存可撓性コンテナに提供することと、を含む、方法。
段落３７． 処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含む、段落３１に記載の方法。
段落３８． 処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み、所望の材料の抽出を結果的にもたらす、段落３１に記載の方法。
段落３９． 処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抽出を結果的にもたらす、段落３１に記載の方法。
段落４０． 可撓性コンテナが、ヒートシール可能な材料を含む、段落３１に記載の方法。
段落４１． 可撓性コンテナが、ＥＶＡ、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、又はポリアミドのうちの少なくとも１つを含む、段落３１に記載の方法。
＊＊＊
本発明の好ましい実施形態について詳細に説明したが、上の段落によって定義される本発明が、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく多くの明らかな変形が可能であるため、上の説明に記載される特定の詳細に限定されるものではないことを理解されたい。

Claims (48)

  1. 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を調製するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
    （ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
    （ｉｉｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｖ）バンクされた腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、
    前記腫瘍断片を凍結保存して、
    精製された切除腫瘍産物を得ることと、
    （ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＴＩＬ集団を産生し、任意選択的に、前記第１のＴＩＬ集団を凍結保存することと、
    （ｃ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＤＭＳＯを用いて、前記ＴＩＬを採取及び製剤化することと、を含む、方法。
  2. 前記ＴＩＬ製剤が、２．５％のＨＳＡ及び５％のＤＭＳＯを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記製剤化されたＴＩＬが、凍結保存される、請求項１に記載の方法。
  4. 製剤化することが、閉鎖系において、第２のＴＩＬ集団にＨＳＡ及びＤＭＳＯを添加することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって得られた治療用ＴＩＬ製剤。
  6. 対象を治療する方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって得られた治療用ＴＩＬ集団を投与することを含む、方法。
  7. 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を調製するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
    （ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
    （ｉｉｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｖ）バンクされた腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、
    前記腫瘍断片を凍結保存して、
    精製された切除腫瘍産物を得ることと、
    （ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｃ）前記第１のＴＩＬ集団のうちの全て又は一部分を凍結保存することと、
    （ｄ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を採取及び凍結保存することと、を含む、方法。
  8. 第１のＴＩＬ亜集団を、前記第１の亜集団を凍結保存せず、残りのＴＩＬを凍結保存せずに、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）に前進させることを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１のＴＩＬ集団のうちの全て又は一部分が、前記ＴＩＬを凍結保存する前、又は前記第２の増殖を実施する前に、洗浄及び／又は濃縮される、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記凍結保存された第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、前記第２のＴＩＬ集団を採取及び凍結保存することと、を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. アフェレーシスによって得られたＡＰＣを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＡＰＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ＰＢＭＣが、新鮮なＰＢＭＣ又は凍結保存されたＰＢＭＣを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記精製された切除腫瘍産物が、共刺激受容体を発現するように形質導入される、請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法によって得られた治療用ＴＩＬ産物。
  16. 別個の投与のために製剤化された少なくとも２つの治療用ＴＩＬ集団を含む、請求項１５に記載の治療用ＴＩＬ産物。
  17. 対象を治療する方法であって、請求項７～１６のいずれか一項に記載の方法によって得られた第１の治療用ＴＩＬ集団及び第２の治療用ＴＩＬ集団を投与することを含む、方法。
  18. 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を調製するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
    （ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
    （ｉｉｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｖ）バンクされた腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、
    前記腫瘍断片を凍結保存して、
    精製された切除腫瘍産物を得ることと、
    （ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｃ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びアフェレーシスによって得られた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）前記第２のＴＩＬ集団を採取及び凍結保存することと、を含む、方法。
  19. 前記ＡＰＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＡＰＣが、新鮮なＰＢＭＣを含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ＡＰＣが、凍結保存されたＰＢＭＣを含む、請求項１８に記載の方法。
  22. ステップＡＰＣが、２～１０人のドナー若しくは２～５人のドナー、又は３～４人のドナー、又は３人のドナーからのＰＢＭＣを含む、請求項１８に記載の方法。
  23. 治療用ＴＩＬ集団であって、前記治療用ＴＩＬ集団が、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法によって産生される、治療用ＴＩＬ集団。
  24. 対象を治療する方法であって、請求項１８～２２に記載の方法によって得られた治療用ＴＩＬ集団を投与することを含む、方法。
  25. 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を調製するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
    （ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
    （ｉｉｉ）切除腫瘍を凍結保存し、前記腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｖ）バンクされた腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、
    前記腫瘍断片を凍結保存して、
    精製された切除腫瘍産物を得ることと、
    （ｂ）前記精製された腫瘍産物を解凍及び洗浄することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を採取及び凍結保存することと、を含む、方法。
  26. ステップ（ｂ）が、凍結保存剤を除去することを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. ステップ（ｂ）が、２～４時間、又は４～６時間、又は６～９時間、又は９～１２時間、又は１２～１８時間、又は１８～２４時間の回収期間を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. ステップ（ｂ）が、前記ＴＩＬを形質導入して、共刺激受容体を発現させることを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 治療用ＴＩＬ集団であって、前記治療用ＴＩＬ集団が、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法によって産生される、治療用ＴＩＬ集団。
  30. 対象を治療する方法であって、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法によって得られた治療用ＴＩＬ集団を含む、方法。
  31. 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を調製するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）切除された凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
    （ｉｉ）切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
    （ｉｉｉ）前記凍結保存腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｉｖ）切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
    （ｖ）バンクされた腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、
    前記腫瘍断片を凍結保存して、
    精製された切除腫瘍産物を得ることと、
    （ｂ）前記精製された腫瘍産物を解凍及び洗浄することと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第１の増殖を実施して、第１のＴＩＬ集団を産生し、任意選択的に、前記第１のＴＩＬ集団を凍結保存することと、
    （ｄ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第２の増殖を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｅ）追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて前記第２のＴＩＬ集団を培養することによって第３の増殖を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｅ）前記第３のＴＩＬ集団を採取及び凍結保存することと、を含む、方法。
  32. ステップ（ｂ）が、凍結保存剤を除去することを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ステップ（ｂ）が、前記ＴＩＬを形質導入して、共刺激受容体を発現させることを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. ステップ（ｂ）が、前記第１の増殖前に、２～４時間、又は４～６時間、又は６～９時間、又は９～１２時間、又は１２～１８時間、又は１８～２４時間の回収期間を含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ステップ（ｂ）が、前記ＴＩＬを形質導入して、共刺激受容体を発現させることを含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第１のＴＩＬ集団を洗浄及び／又は濃縮することを含む、請求項３１～３５に記載の方法。
  37. 前記第２の増殖が、静止ＲＥＰを含み、前記第３の増殖が、静止ＲＥＰを含むか、又は前記第２の増殖が、静止ＲＥＰを含み、前記第３の増殖が、懸濁液ＲＥＰを含むか、又は前記第２の増殖が、懸濁液ＲＥＰを含み、前記第３の増殖が、静止ＲＥＰとして含むか、又は前記第２の増殖が、懸濁液ＲＥＰを含み、前記第３の増殖が、懸濁液ＲＥＰを含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 治療用ＴＩＬ集団であって、前記ＴＩＬ集団が、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法によって産生され、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＤＭＳＯを用いて製剤化されている、治療用ＴＩＬ集団。
  39. 前記ＴＩＬ製剤が、２．５％のＨＳＡ及び５％のＤＭＳＯを含む、請求項３８に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  40. 前記製剤化されたＴＩＬが、凍結保存されている、請求項３８又は３９に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  41. 対象を治療する方法であって、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団を投与することを含む、方法。
  42. リンパ球枯渇の脱強化を更に含む、請求項７、１７、２４、又は４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記リンパ球枯渇の脱強化が、ＴＩＬ採取後かつＴＩＬ注入前である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記第１のＴＩＬ集団が、凍結保存される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  45. ＰＤ－１阻害剤を添加することを更に含む、請求項６、１７、２４、又は４１のいずれか一項に記載の方法。
  46. ＩＬ－２が、投与されない、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＰＤ－１阻害剤が、ペムブロリズマブ（以前はＭＫ－３４７５又はラムロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ）、ＪＴＸ－４０１４、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、カムレリズマブ（ＳＨＲ１２１０）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２、ＷＢＰ－２８５）、ＩＮＣＭＧＡ０００１２（ＭＧＡ０１２）、ＡＭＰ－２２４、及び／又はＡＭＰ－５１４である、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. 前記ＰＤ－１阻害剤が、ペムブロリズマブである、請求項４７に記載の方法。
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