ES2859678T3 - Métodos para producir poblaciones enriquecidas de células T reactivas a tumores a partir de un tumor - Google Patents
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Abstract
Método para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente las células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; y (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para producir poblaciones enriquecidas de células T reactivas a tumores a partir de un tumor
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Antecedentes de la invención
La terapia celular adoptiva (ACT) que usa células T reactivas a tumores puede producir respuestas clínicas positivas en algunos pacientes con cáncer. Sin embargo, siguen existiendo varios obstáculos para el uso exitoso de la ACT en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades. Por ejemplo, es posible que las células T aisladas de un tumor no muestren una reactividad específica para tumor suficiente. Gros et al. (J. Immunother. 35(9):722-723 (2012)) describen que la selección de células T CD8 positivas para PD-1, LAG-3, TIM-3 y 4-1 BB en el hidrolizado de un tumor recién obtenido enriquece las células reactivas al melanoma. Por consiguiente, se necesitan métodos mejorados para obtener una población de células T reactivas a tumores a partir de los tumores.
Breve sumario de la invención
Una realización de la invención proporciona un método para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; y (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores.
Otra realización de la invención proporciona un método para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores; y (d) combinar la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores.
Otra realización de la invención proporciona una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores obtenida mediante un método que comprende: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; y (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores para su uso como medicamento.
Realizaciones adicionales de la invención proporcionan poblaciones de células relacionadas para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
La figura 1A es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD3+/CD8+ aisladas de muestras recién obtenidas de tumores de melanoma que expresan Pd-1, TiM-3, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD25, CD28, CD27 o CD70. Cada punto representa un tumor.
La figura 1B es un gráfico que muestra la expansión en veces del número de células CD8+ que se aislaron de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma (FrTu#1913), se clasificaron por la expresión de CD8, PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1BB, o la falta de expresión de PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1BB, después de la expansión in vitro (REP) durante 14 días.
Las figuras 2A-2E muestran la secreción de interferón (IFN)-gamma (pg/ml) (barras negras) o el porcentaje de células T efectoras (Teff) que expresan CD3, CD8 y 4-1BB (barras grises) por parte de las células CD8+ aisladas de una de las cinco muestras de tumor de melanoma diferentes (FrTu#1913 (A), FrTu#3550 (B), FrTu#3289 (C), FrTu#2448 (D) o FrTu#3713 (E)). Las células se clasificaron por la expresión de Cd8, PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1bB, o de la falta de expresión de PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1BB, y se expandieron in vitro durante 14 días. La secreción de interferón (IFN)-gamma y la expresión de 4-1BB se analizaron en el cocultivo con líneas celulares tumorales autólogas.
Las figuras 3A-3C muestran el porcentaje de lisis específica de las líneas celulares tumorales diana TC1913 (autóloga) (A), TC3289 (alógena) (B) o TC2448 (emparejado con HLA-A0201) (C) por parte de las células T CD8+ efectoras que se aislaron de la muestra de tumor de melanoma FrTu#1913 y se clasificaron por la expresión de CD8 (círculos blancos), PD-1 (círculos negros), TIM-3 (rombos negros), LAG-3 (triángulos negros) o 4-1BB (cuadrados negros) o la falta de expresión de PD-1 (círculos grises), TIM-3 (rombos grises), LAG-3 (triángulos grises) o 4-1BB
(cuadrados grises) a las razones efector:diana indicadas.
Las figuras 3D-3F muestran el porcentaje de lisis específica de las líneas celulares tumorales diana TC3713 (autóloga) (D), TC3550 (alógena) (E) o TC1379 (alógena) (F) por parte de las células T CD8+ efectoras que se aislaron de la muestra de tumor de melanoma FrTu#3713 (D-F) y se clasificaron por la expresión de CD8 (círculos blancos), PD-1 (círculos negros), TIM-3 (rombos negros) o 4-1BB (cuadrados negros) o la falta de expresión de PD-1 (círculos grises), TIM-3 (rombos grises) o 4-1BB (cuadrados grises) a las razones efector:diana indicadas.
La figura 4A muestra el reconocimiento de tumores autólogos de células aisladas de un tumor de melanoma (FrTu#3713), clasificadas por CD8+, PD-1+, PD-1-, 4-1BB+, 4-1BB-, 4-1BB+/PD-1-, 4-1BB+/PD-1+, 4-1BB7PD-1 o 4-1BB7PD-1- y expandidas in vitro durante 14 días. Se muestra el porcentaje de células CD3+ CD8+ que expresan 4-1BB tras el cocultivo con líneas celulares tumorales autólogas.
La figura 4B es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD3+CD8+ que expresan 4-1BB (barras grises) o secretan IFN-gamma (barras negras) después de aislarse de un tumor de melanoma (FrTu#3612). Las células se clasificaron por poblaciones CD8+, PD-1+, PD-1-, 4-1BB+/PD-1-, 4-1BB+/PD-1+, 4-1BBVPD-1+ o 4-1BB7PD-1, se expandieron in vitro durante 14 días y se muestra la secreción de IFN-gamma y la regulación por incremento de 4 1 BB tras el cocultivo con líneas celulares tumorales autólogas.
Las figuras 5A-5C muestran el porcentaje de lisis específica de las líneas celulares tumorales diana TC3713 (autóloga) (A), TC3550 (alógena) (B) y TC1379 (alógena) (C) por parte de las células efectoras CD8+ que se aislaron de un tumor de melanoma (FrTu#3713) y se clasificaron por poblaciones 4-IBB+/PD-1- (círculos)), 4-1BB+/PD-1 (cuadrados), 4-1BB7PD-1 (rombos) o 4-1BB7PD-1-(*) a las razones efector:diana indicadas, medidas por el ensayo de liberación de 51Cr.
La figura 6 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+ que expresan 4-1BB (barras grises) o secretan IFN-gamma (barras negras) que se aislaron de un tumor gastrointestinal (FrTu#3446b), se clasificaron por poblaciones Cd8+, PD-1+, pD-1-, TIM-3+, TIM-3', 4-1BB+ o 4-1BB' y se expandieron durante 21 días en cultivo. Se muestra la regulación por incremento de IFN-gamma y 4-1BB tras el cocultivo con líneas celulares tumorales autólogas.
Las figuras 7A y 7B son gráficos que muestran la frecuencia (%) de las secuencias de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena beta del TCR únicas de las células PD-1- clasificadas (2985 clonotipos de TCR) (A) o de las células PD-1+ clasificadas (805 clonotipos de TCR) (B) después de 14 días de expansión in vitro.
La figura 7C es un gráfico que muestra la frecuencia (%) de secuencias de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena beta de TCR únicas de células PD-1- clasificadas (círculos negros) o células PD-1+ clasificadas (círculos grises).
La figura 8 es un gráfico que muestra la frecuencia (%) de clonotipos de la cadena p de TCR en la población PD-1- o en la población PD-1+ que reconocen epítopos mutados p14ARF/p16INK4a (círculos negros) o HLA-A11mut (círculos grises) que se expresan específicamente por la línea celular tumoral autóloga y clonotipos con reactividad desconocida (círculos blancos).
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto que la selección de células CD8+ que también expresan los biomarcadores 4-1 BB (CD137) y PD-1 (CD279) enriquece las células T reactivas a tumores aisladas de muestras de tumor recién obtenidas. La selección de las células CD8+ que expresan PD-1 y 4-1BB enriquece ventajosamente un mayor número de células T reactivas a tumores en comparación con las células CD8+ que no expresan estos marcadores.
Con respecto a esto, una realización de la invención proporciona un método para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente las células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; y (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores. Los métodos de la invención permiten, ventajosamente, acortar el tiempo de cultivo in vitro de las células antes de administrar las células a un paciente posterior al método de la invención. Además, los métodos de la invención pueden proporcionar ventajosamente una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores que puede administrarse a un paciente posterior al método de la invención sin tener que examinar para detectar el reconocimiento de tumores autólogos.
El método puede comprender la obtención de una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor disociando la muestra de tumor para dar una suspensión celular de la que pueden seleccionarse poblaciones de células específicas. Los métodos adecuados para obtener una población
masiva de células T pueden incluir, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de disociar mecánicamente (por ejemplo, trocear) el tumor, disociar enzimáticamente (por ejemplo, digerir) el tumor y aspirar (por ejemplo, con una aguja).
La población masiva de células T obtenida de una muestra de tumor puede comprender cualquier tipo adecuado de células T. Preferiblemente, la población masiva de células T obtenida de una muestra de tumor comprende linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
Antes del método de la invención, la muestra de tumor puede obtenerse de cualquier mamífero. A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, los mamíferos del orden Lagomorpha, tales como los conejos; del orden Carnivora, incluidos felinos (gatos) y caninos (perros); del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos); o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Se prefiere que los mamíferos sean primates no humanos, por ejemplo, del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (humanos y simios). En algunas realizaciones, el mamífero puede ser un mamífero del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres. Preferiblemente, el mamífero es un primate no humano o un humano. Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.
El método comprende la selección específica de células T CD8+ que expresan 4-1BB y PD-1 a partir de la población masiva. En una realización preferida, el método comprende seleccionar células que también expresan CD3. El método puede comprender la selección específica de las células de cualquier manera adecuada. Preferiblemente, la selección se lleva a cabo usando citometría de flujo. La citometría de flujo puede llevarse a cabo usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La citometría de flujo puede emplear cualquier anticuerpo y tinción adecuados. Por ejemplo, la selección específica de CD3, CD8, 4-1BB o PD-1 puede llevarse a cabo usando anticuerpos anti-CD3, anti-CD8, anti-4-1BB o anti-PD-1, respectivamente. Preferiblemente, el anticuerpo se elige de forma que reconozca y se una específicamente al biomarcador concreto que se está seleccionando. El anticuerpo o los anticuerpos pueden conjugarse con una perla (por ejemplo, una perla magnética) o con un fluorocromo. Preferiblemente, la citometría de flujo es una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
La invención proporciona un método que comprende la selección específica de células T CD8+ que son 4-1BB+/PD-1+ a partir de la población masiva. Otro aspecto de la divulgación proporciona un método que comprende seleccionar específicamente células T CD8+ que son (i) LAG-3+/PD-1+, (ii) LAG-37PD-1 y/o (iii) LAG-3+/PD-1- a partir de la población masiva. Aún otro aspecto de la divulgación proporciona un método que comprende seleccionar específicamente células T CD8+ que son (i) TIM-3+/PD-1+, (ii) TIM-37PD-1 o (iii) TIM-3+/PD-1 a partir de la población masiva. Aún otro aspecto de la divulgación proporciona un método que comprende seleccionar específicamente células T CD8+ que son (i) TIM-3+/LAG-3+, (ii) TIM-37LAG-3+ o (iii) TIM-3+/lAg -3‘ a partir de la población masiva. Otro aspecto de la divulgación proporciona un método que comprende seleccionar específicamente células T c D8+ que son (i) 4-1BB+/LAG-3+, (ii) 4-1BB7LAG-3+ o (iii) 4-1BB+/LAG-3' a partir de la población masiva. Aún otro aspecto de la divulgación proporciona un método que comprende seleccionar específicamente células T CD8+ que son (i) 4-1BB+/TIM-3+, (ii) 4-1BB7TIM-3+ o (iii) 4-1BB+/TIM-3' a partir de la población general. En otro aspecto de la invención, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede comprender además la selección de células que también expresan CD3+.
En un aspecto de la divulgación, la selección específica puede comprender la selección específica de combinaciones de células CD8+ que expresan cualquiera de los marcadores descritos en el presente documento. Con respecto a esto, el método puede producir una población de células enriquecida en células reactivas a tumores que comprende una mezcla de células que expresan dos, tres, cuatro o más cualesquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento. En un aspecto de la divulgación, la selección específica comprende seleccionar específicamente cualquiera de las siguientes combinaciones de células (a) células PD-1+ y células 4-1BB+, (b) células PD-1+ y células LAG-3+, (c) células PD-1+ y células TIM-3+, (d) células 4-1BB+ y células LAG-3+, (e) células 4-1BB+ y células TIM-3+, (f) células LAG-3+ y células TIM-3+, (g) células PD-1+, células 4-1BB+ y células LAG-3+, (h) células PD-1+, células 4-1BB+ y células TIM-3+, (i) células PD-1+, células LAG-3+ y células TIM-3+, (j) células 4-1b B+, células LAG-3+ y células TIM-3+, y/o (k) células PD-1+, células 4-1BB+, células LAG-3+ y células TIM-3+. En otro aspecto de la divulgación, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede comprender además la selección de células que también expresan CD8+ y/o CD3+.
El método de la invención comprende separar las células seleccionadas de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores. Con respecto a esto, las células seleccionadas pueden separarse físicamente de las células no seleccionadas. Las células seleccionadas pueden separarse de las células no seleccionadas mediante cualquier método adecuado tal como, por ejemplo, clasificación. La separación de las células seleccionadas de las células no seleccionadas produce preferiblemente una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores.
Las poblaciones de células obtenidas mediante los métodos de la invención están ventajosamente enriquecidas en células T reactivas a tumores. Con respecto a esto, las poblaciones de células obtenidas mediante los métodos de la invención pueden comprender una mayor proporción de células T reactivas a tumores en comparación con las
poblaciones de células que no se han obtenido mediante la clasificación por expresión de 4-1BB y PD-1.
En una realización de la invención, el método comprende la obtención de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores sin examinar para detectar el reconocimiento de tumores autólogos. Con respecto a esto, los métodos de la invención proporcionan ventajosamente una población de células enriquecida en células que tienen reactividad tumoral sin tener que examinar las células para detectar el reconocimiento de tumores autólogos.
En una realización de la invención, el método no comprende la estimulación inespecífica de la población masiva de células T antes de seleccionar específicamente las células. Con respecto a esto, los métodos de la invención proporcionan ventajosamente una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores sin estimular inespecíficamente la población masiva de células T (por ejemplo, con anticuerpos anti-4-1BB, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD28).
En una realización de la invención, el método comprende además expandir el número de células T en la población de células enriquecida obtenida mediante los métodos de la invención in vitro. El número de células T puede aumentarse al menos unas 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 veces), más preferiblemente al menos unas 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 veces), más preferiblemente al menos unas 100 veces, más preferiblemente al menos unas 1.000 veces, o lo más preferiblemente al menos unas 100.000 veces. El número de células T puede expandirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los métodos a modo de ejemplo de expansión del número de células se describen en la patente estadounidense 8.034.334 y en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0244133.
En una realización de la invención, el método comprende además cultivar la población de células enriquecida obtenida mediante los métodos de la invención en presencia de uno cualquiera o más de TWS119, interleucina (IL)-21, IL-12, IL-15, IL-7, factor de crecimiento transformante (TGF) beta e inhibidor de AKT (AKTi). Sin restringirse a ninguna teoría particular, se cree que el cultivo de la población de células enriquecida en presencia de TWS119, IL-21 y/o IL-12 puede, ventajosamente, potenciar la reactividad antitumoral de la población de células enriquecida al prevenir o retardar la diferenciación de la población de células enriquecida.
En una realización de la invención, el método comprende además transducir o transfectar las células de la población enriquecida obtenida mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento con una secuencia de nucleótidos que codifica para una cualquiera o más de IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 y ARNip anti-PD-1.
En una realización de la invención, el método comprende además estimular la población de células enriquecida obtenida mediante los métodos de la invención con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas. La estimulación de la población de células enriquecida con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, la estimulación de la población de células enriquecida puede llevarse a cabo poniendo la población de células enriquecida físicamente en contacto con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas. Sin restringirse a ninguna teoría particular, se cree que la estimulación de la población de células enriquecida con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas puede, ventajosamente, potenciar la reactividad antitumoral de la población de células enriquecida.
El término “antígeno de cáncer”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, hidrato de carbono, etc.) expresada o sobreexpresada exclusiva o predominantemente por una célula tumoral o cancerosa, de manera que el antígeno está asociado al tumor o al cáncer. El antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células normales, no tumorales o no cancerosas. Sin embargo, en estos casos, la expresión del antígeno de cáncer por parte de las células normales, no tumorales o no cancerosas no es tan robusta como la expresión por parte de las células tumorales o cancerosas. Con respecto a esto, las células tumorales o cancerosas pueden sobreexpresar el antígeno o expresar el antígeno a un nivel significativamente mayor, en comparación con la expresión del antígeno por parte de las células normales, no tumorales o no cancerosas. Asimismo, el antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células de un estado de desarrollo o maduración diferente.
El antígeno de cáncer puede ser un antígeno expresado por cualquier célula de cualquier cáncer o tumor, incluyendo los cánceres y tumores descritos en el presente documento. El antígeno de cáncer puede ser un antígeno de cáncer de un solo tipo de cáncer o tumor, de manera que el antígeno de cáncer está asociado o es característico de un solo tipo de cáncer o tumor. Alternativamente, el antígeno de cáncer puede ser un antígeno de cáncer (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, el antígeno de cáncer puede ser expresado tanto por las células de cáncer de mama como de próstata y no ser expresado en absoluto por las células normales, no tumorales o no cancerosas. Los antígenos de cáncer a modo de ejemplo pueden incluir uno cualquiera o más de gp100, MART-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, NY-ESO-1, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-2 (VEGFR-2), HER-2, mesotelina y receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFR III).
Los métodos de la invención producen ventajosamente poblaciones de células enriquecidas en células T reactivas a
tumores. Las células T pueden ser reactivas a tumores de manera que reconocen, lisan y/o destruyen específicamente células tumorales. Con respecto a esto, una realización de la invención proporciona una población de células aislada o purificada enriquecida en células T reactivas a tumores obtenida mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento. La población de células aislada o purificada comprende una cualquiera o más de (a) células T CD8+/4-1BB+/PD-1+, en la que la población de células está enriquecida en células T reactivas a tumores. En otra realización de la invención, la población de células aislada o purificada comprende células T CDS+/4-1BB+/PD-1+. En otra realización de la invención, cualquiera de las poblaciones de células descritas en el presente documento puede ser también CD3+.
En un aspecto de la divulgación, la población de células aislada o purificada comprende una mezcla de células que expresan cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento. Por ejemplo, la población de células aislada o purificada puede comprender una combinación de (a) células PD-1+ y células 4-1BB+, (b) células PD-1+ y células LAG-3+, (c) células PD-1+ y células TIM-3+, (d) células 4-1BB+ y células LAG-3+, (e) células 4-1BB+ y células TIM-3+, (f) células LAG-3+ y células TIM-3+, (g) células PD-1+, células 4-1BB+ y células LAG-3+, (h) células PD-1+, células 4-1BB+ y células TIM-3+, (i) células PD-1+, células LAG-3+ y células TIM-3+, (j) células 4-1bB+, células LAG-3+ y células TIM-3+, y/o (k) células PD-1+, células 4-1BB+, células LAG-3+ y células TIM-3+. En otro aspecto de la divulgación, cualquiera de las poblaciones de células descritas en el presente documento puede ser también CD8+ y/o CD3+.
El término “aislado”, tal como se usa en este documento, significa que se ha retirado de su entorno natural. El término “purificado”, tal como se usa en este documento, significa que se ha aumentado su pureza, siendo “pureza” un término relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos el 50%, puede ser mayor del 60%, el 70% y el 80%, el 90% o puede ser del 100%.
Otra realización de la divulgación proporciona un método para administrar a un mamífero una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente células T CD8+ que expresan una cualquiera o más de TIM-3, LAG-3, 4-1BB y PD-1 de la población masiva; (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores; y (d) administrar la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores al mamífero. La obtención de una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor, la selección específica de células T CD8+ que expresan una cualquiera o más de TIM-3, LAG-3, 4-1BB y PD-1 de la población masiva, y la separación de las células seleccionadas de las células no seleccionadas para obtener una población de células pueden llevarse a cabo tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.
El método divulgado puede comprender además la administración al mamífero de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores. La población de células enriquecida en células T reactivas a tumores puede administrarse de cualquier manera adecuada. Preferiblemente, la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores se administra por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa.
La población de células enriquecida en células T reactivas a tumores de la invención puede incluirse en una composición, tal como una composición farmacéutica. Con respecto a esto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las poblaciones de células descritas en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización de la invención proporciona un método para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método: (a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor; (b) seleccionar específicamente células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva; (c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores; y (d) combinar la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores. La obtención de una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor, la selección específica de células T CD8+ que son 4-1BB+ (CD137)/PD-1+ (CD279) de la población masiva, y la separación de las células seleccionadas de las células no seleccionadas para obtener una población de células pueden llevarse a cabo tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.
El método puede comprender la combinación de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores. Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para la administración de células. Tales portadores farmacéuticamente aceptables los conocen bien los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso. Un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para las células inyectables puede incluir cualquier
portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente el 0,90% p/v de NaCI en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), disolución electrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), dextrosa a aproximadamente el 5% en agua o lactato de Ringer. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina sérica humana.
A efectos de la divulgación, la dosis, por ejemplo, el número de células de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores de la invención, administrada debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el mamífero durante un periodo de tiempo razonable. Por ejemplo, el número de células debe ser suficiente para unirse a un antígeno de cáncer, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un periodo de desde aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, de 12 a 24 horas o más, desde el momento de la administración. En determinadas realizaciones, el periodo de tiempo podría ser incluso más largo. El número de células se determinará, por ejemplo, por la eficacia de las células particulares y el estado del mamífero (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del mamífero (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.
Se conocen en la técnica muchos ensayos para determinar un número administrado de células de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores de la invención. A efectos de la divulgación, podría usarse un ensayo que comprende la comparación del grado de lisado de las células diana o de la secreción de una o más citocinas tales como, por ejemplo, IFN-y e IL-2, tras la administración de un número dado de dichas células a un mamífero entre un conjunto de mamíferos de los que se da a cada uno un número diferente de las células, para determinar un número inicial que debe administrarse a un mamífero. El grado de lisado de las células diana o de la secreción de citocinas tales como, por ejemplo, IFN-y e IL-2, tras la administración de un número dado de células, puede analizarse mediante métodos conocidos en la técnica. La secreción de citocinas tales como, por ejemplo, IL-2, también puede proporcionar una indicación de la calidad (por ejemplo, fenotipo y/o eficacia) de una preparación celular.
El número de células de la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores de la invención también se determinará por la existencia, la naturaleza y el grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de una población de células concreta. Normalmente, el médico responsable decidirá el número de células con el que se tratará a cada uno de pacientes individuales, teniendo en cuenta una serie de factores, tales como la edad, el peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el sexo, la vía de administración y la gravedad del estado que se está tratando. A modo de ejemplo, el número de células puede ser de aproximadamente 10 x 106 a aproximadamente 10 x 1011 células por infusión, de aproximadamente 10 x 109 células a aproximadamente 10 x 1011 células por infusión o de 10 x 107 a aproximadamente 10 x 109 células por infusión. Las poblaciones de células obtenidas mediante los métodos de la invención pueden, ventajosamente, permitir tratar o prevenir eficazmente el cáncer.
Se contempla que las poblaciones de células obtenidas mediante los métodos de la invención pueden usarse en métodos de tratamiento o prevención del cáncer. Con respecto a esto, la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero las composiciones farmacéuticas o las poblaciones de células obtenidas mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero. Otra realización de la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.
Los términos “tratar” y “prevenir”, así como las palabras que se derivan de los mismos, tal como se usan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o una prevención completos o al 100%. Más bien, existen grados variables de tratamiento o prevención que un experto en la técnica reconoce como un beneficio o efecto terapéutico potencial. Con respecto a esto, los métodos divulgados pueden proporcionar cualquier cantidad o nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método divulgado pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más estados o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, a efectos del presente documento, “prevención” puede abarcar el retraso de la aparición de la enfermedad, o de un síntoma o estado de la misma.
Para los fines de los métodos divulgados, en los que se administran poblaciones de células, las células pueden ser células que son alógenas o autólogas al mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas al mamífero.
Una realización de la divulgación comprende además someter el mamífero a linfodepleción antes de administrar cualquiera de las poblaciones de células enriquecidas obtenidas mediante cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento. Los ejemplos de linfodepleción incluyen, pero pueden no estar limitados a, quimioterapia de linfodepleción no mieloablativa, quimioterapia de linfodepleción mieloablativa, irradiación corporal total, etc.
Con respecto a los métodos divulgados, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluyendo cualquiera de los
sarcomas (por ejemplo, sarcoma sinovia!, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y rabdomiosarcoma alveolar), linfomas (por ejemplo, linfoma Hodgkin y linfoma no Hodgkin), carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de cabeza-cuello, cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de ano, canal anal o anorecto, cáncer de ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, de la vesícula biliar o de la pleura, cáncer de la nariz, de la cavidad nasal o del oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon (por ejemplo, carcinoma de colon), cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal (por ejemplo, tumor carcinoide gastrointestinal), cáncer de hipofaringe, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de intestino delgado, cáncer de partes blandas, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra la frecuencia de células CD3+/CD8+ en una muestra recién obtenida de hidrolizado de tumor de melanoma que expresa PD-1, TIM-3, LAG-3 o 4-1BB. Este ejemplo también demuestra que la coexpresión de 1) TIM-3 y PD-1, 2) LaG-3 y PD-1 y 3) LAG-3 y TIM-3 por las células T CD8+ aisladas de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma. Este ejemplo también demuestra la expresión de PD-1, TIM-3 o LAG-3 por células reactivas a MART-127-35.
Las suspensiones de células individuales obtenidas a partir de una digestión mecánica y enzimática de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma se descongelaron y reposaron durante la noche a 1 x 106 células/ml en ausencia de citocinas. Se tiñeron las células y se midió por citometría de flujo el porcentaje de células CD3+CD8+ que expresaban PD-1, TIM-3, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD25, CD28, CD27 o cD70. Los resultados se muestran en la figura 1A. Tal como se muestra en la figura 1A, las células CD3+/CD8+ de una muestra recién obtenida de hidrolizado de tumor pueden expresar PD-1, TIM-3, LAG-3 o 4-1BB.
En un experimento separado, se obtuvieron células a partir de muestras recién obtenidas de dos tumores de melanoma diferentes y se midieron la coexpresión de TIM-3 y PD-1, la coexpresión de LAG-3 y PD-1 y la coexpresión de LAG-3 y TIM-3 mediante citometría de flujo activada en células vivas y células CD3+ CD8+. Los resultados mostraron que los subconjuntos de células T CD8+ que se infiltran en los tumores de melanoma coexpresan 1) TIM-3 y PD-1, 2) LAG-3 y PD-1 y 3) LAG-3 y TIM-3.
En un experimento separado, se midió la expresión de PD-1, TIM-3 o LAG-3 en las células T reactivas a MART-127-35 mediante citometría de flujo activada en células vivas y células CD3+ CD8+ y se comparó con la de las células T CD3+ CD8+ que no eran reactivas a MART-127-35. Los resultados mostraron que las células reactivas a MART-127-35 que se infiltran en los tumores de melanoma expresan niveles más altos de PD-1, TIM-3 y LAG-3 en comparación con las células T CD3+ CD8+ que no eran reactivas a MART-127-35.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra un método para seleccionar específicamente las células CD3+ CD8+ que también expresan uno de los PD-1, TIM-3, LAG-3 y 4-1BB y para expandir el número de las células seleccionadas.
Se descongeló una suspensión de células individuales obtenida de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma (FrTu#1913) y se dejó reposar durante la noche en ausencia de citocinas, y luego se tiñó. Las células se clasificaron en las siguientes poblaciones CD3+ usando anticuerpos anti-CD3, anti-CD8, anti-PD-1, TIM-3, LAG-3 y 4-1 BB: CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+/LAG3+, CD8+/TIM-3+, CD8+/4-1BB+, CD8+/PD-1', CD8+/LAG3', CD8+/TIM-3' o CD8+/4-1BB' mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). A continuación, el número de células se expandió usando un protocolo de expansión rápida (alimentadores irradiados con un exceso de 200 veces, anti-CD330 ng/ml y 500 CU/ml de IL-2) y se midió la expansión en veces de las poblaciones aisladas. Los resultados se muestran en la figura 1B. Tal como se muestra en la figura 1B, se expandió el número de células CD8+ que también expresan uno de los PD-1, TIM-3, LAG-3 y 4-1BB.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra la reactividad in vitro de las células T aisladas de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma y clasificadas por la expresión de CD8 y uno de PD-1, LAG-3, TIM-3 y 4-1 BB.
La regulación por incremento de 4-1BB es un indicador de la estimulación de TCR. Se ha observado que después de la expansión del número de células T y en ausencia de estimulación de TCR, la expresión de 4-1BB se pierde. También se ha observado que después de que se expande el número de células y se cocultivan las células con una línea celular tumoral autóloga, las células T que habían perdido previamente la expresión de 4-1BB y que son estimuladas por la línea celular tumoral volverán a expresar 4-1 BB. Por consiguiente, la expresión de 4-1 BB se mide 24 horas después del cocultivo con el tumor autólogo como marcador de la estimulación de TCR contra la línea
celular tumoral autóloga.
Una suspensión de células individuales de una muestra recién obtenida de hidrolizado de tumor de melanoma (FrTu#1913) se dejó reposar durante la noche sin citocinas y se clasificó por las siguientes poblaciones: poblaciones CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+/LAG3+, CD8+/TIM-3+, CD8+/4-1BB+, CD8+/PD-1-, CD8+/LAG3-, CD8+/TIM-3- o CD8+/4-1BB-mediante FACS tal como se describe en el ejemplo 3. El número de células clasificadas se expandió in vitro durante 14 días. El día 14, las células se lavaron y se cocultivaron contra una línea celular tumoral autóloga (1 x 105 efectores: 1 x 105 células diana). La reactividad se evaluó cuantificando la liberación de IFN-gamma y el porcentaje de células CD8+ que expresaban 4-1BB 24 horas después del cocultivo con una línea celular tumoral autóloga (TC1913) y líneas celulares tumorales alógenas (Alo.). También se cuantificó el porcentaje de células CD8+ que reconocen un epítopo mutado específico (CDKn2A) al que se dirigen las células T, usando un tetrámero contra este epítopo concreto. Los resultados se muestran en las tablas 1 y 2 y en las figuras 2A-2E.
Tal como se muestra en las tablas 1 y 2, las células T aisladas de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma y clasificadas por la expresión de CD8 y uno de los PD-1, LAG-3, TIM-3 y 4-1BB tienen reactividad contra las líneas celulares tumorales autólogas tal como se mide mediante la secreción de IFN-gamma, la expresión de 4-1BB y el porcentaje de células que reconocen CDKn2A. Tal como se muestra en las figuras 2A-2E, las células T aisladas de cada una de las cinco muestras recién obtenidas diferentes de tumor de melanoma y clasificadas por la expresión de CD8 y uno de los PD-1, LAG-3, TIM-3 y 4-1BB tienen reactividad contra las líneas celulares tumorales autólogas tal como se mide mediante la secreción de IFN-gamma y la expresión de 4-1BB.
En un experimento separado, se aislaron células de dos muestras recién obtenidas independientes de tumor de melanoma (FrTu#1913 y FrTu#3713) y se clasificaron por la expresión de CD8 y la expresión de PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1BB tal como se describe en el ejemplo 3. El número de células clasificadas se expandió durante 14 días in vitro. El día 15, las líneas celulares tumorales diana (autólogas y alógenas) se marcaron con 51Cr y se cocultivaron durante 4 horas con células efectoras a las razones mostradas en las figuras 3A-3F. La liberación de 51Cr se determinó por triplicado mediante recuento gamma y el porcentaje de lisis específica se calculó usando la siguiente fórmula [(recuentos experimentales por minuto (cpm) - cpm espontáneos)/(cpm máximos - cpm espontáneos)] * 100. Los resultados se muestran en las figuras 3A-3F. Tal como se muestra en las figuras 3A-3f, las células clasificadas por la expresión de PD-1, LAG-3, TIM-3 o 4-1BB pudieron realizar lisado en líneas celulares tumorales autólogas.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra la reactividad de las células CD8+ aisladas de una muestra de tumor de melanoma y clasificadas por la expresión de 4-1BB y/o PD-1.
Las células se aislaron de muestras recién obtenidas de tumores de melanoma de 3 pacientes y se clasificaron por poblaciones CD3+/CDS+/4-1BB+/PD-T, CD3+/CD874-1BB7PD-1+, CD3+/CDS+/4-1BB7PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB7PD-1-, CD3+/CD8+/PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB+, CD3+/CD8+/PD-1 o CD3+/CD8+/4-1BB' mediante FACS. Las células clasificadas se cocultivaron con células tumorales autólogas y se midió la regulación por incremento de la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo. Para las tres muestras de tumor, los resultados mostraron que las células T que reconocen el tumor autólogo (tal como se mide mediante la regulación por incremento de la expresión de 4-1BB) pueden encontrarse en las células individuales positivas que expresan PD-1+ o 4-1BB+, pero la mayor frecuencia de células reactivas al tumor (tal como se mide mediante la regulación por incremento de 4-1BB) se encontró en la población que coexpresa tanto 4-1BB como PD-1 en la muestra recién obtenida de hidrolizado de tumor de melanoma.
En un experimento separado, se aislaron células de una muestra recién obtenida de tumor de melanoma (FrTu#1913), se clasificaron por poblaciones CD3+/CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB-/PD-1+ y CD3+/CD8+/4-1BB7PD-1' mediante FACS, y se establecieron clones a partir de las células clasificadas. Los clones se cocultivaron con líneas celulares tumorales autólogas, y se midió la regulación por incremento de la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo y se midió la secreción de IFN-gamma. Los resultados mostraron que la mayor frecuencia de clones reactivos a tumores (tal como se mide mediante la regulación por incremento de 4-1BB y la secreción de IFN-gamma) se encontró en la población que coexpresa tanto PD-1 como 4-1BB.
En un experimento separado, una suspensión de células individuales del tumor de melanoma FrTu#3713 se dejó reposar durante la noche sin citocinas y las células se clasificaron por poblaciones CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+PD-1', CD8+/4-1BB+, CD8-/4-1BB-, CD8+/4-1BB+/PD-T, CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD8+/4-1BB7PD-1 y CD8+/4-1BB7PD-1 mediante FACS. Una suspensión de células individuales del tumor de melanoma FrTu#3612 se dejó reposar durante la noche sin citocinas y las células se clasificaron por poblaciones CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+PD-1', CD8+/4-1BB+/PD-1-, CD8+/4-1BB+/PD-1 , CD8+/4-1BBVPD-1 y CD8+/4-1BB7PD-T mediante FACS. El número de células clasificadas se expandió durante 14 días in vitro. El día 14, las células se lavaron y se cocultivaron contra la línea celular tumoral autóloga (1 x 105 efectores: 1 x 105 células diana) y se evaluó la reactividad cuantificando el porcentaje de células CD8+ que expresan 4-1BB (FrTu#3612 y FrTu#3713) y/o la cantidad de secreción de IFN-gamma (FrTu#3612) 24 horas después del cocultivo. Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4B. Tal como se muestra en la figura 4A, las células clasificadas por la coexpresión de PD-1 y 4-1BB doblemente positivas mostraron niveles similares de regulación por incremento de 4-1BB a los demostrados por las células clasificadas basándose en la expresión de PD-1 o 4-1BB individualmente positiva. Tal como se muestra en la figura 4B, las células clasificadas para la coexpresión de PD-1 y 4-1BB doblemente positivas mostraron niveles similares de regulación por incremento de 4-1BB y de secreción de IFN-gamma que los demostrados por las células clasificadas basándose en la expresión de PD-1 individualmente positiva.
En un experimento separado, las células aisladas del tumor de melanoma FrTu#3713 se clasificaron por poblaciones CD8+/4-1BB+/PD-1 ■, CD8+/4-1BB+/PD-1 , CD8+/4-1BB7PD-1 y CD8+/4-1BB7PD-T mediante FACS. El número de células clasificadas se expandió durante 14 días in vitro. El día 15, las líneas celulares tumorales diana (autólogas y alógenas) se marcaron con 51Cr y se cocultivaron durante 4 horas con células efectoras en las proporciones indicadas en las figuras 5A-5C. La liberación de 51Cr se determinó por triplicado mediante recuento y y el porcentaje de lisis específica se calculó mediante la siguiente fórmula [(cpm experimentales - cpm espontáneos)/(cpm máximos
- cpm espontáneos)] * 100. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5C. Tal como se muestra en las figuras 5A-5C, las células clasificadas por la expresión de 4-1BB+ individualmente positiva, la expresión de PD-1 individualmente positiva o la expresión de 4-1BB+/PD-1+ doblemente positivas pueden realizar lisado de las células tumorales autólogas in vitro.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra la reactividad de las células CD8+ aisladas de una muestra de tumor del tracto gastrointestinal (GI) y clasificadas por la expresión de PD-1, TIM-3 o 4-1BB.
Una suspensión de células individuales de una muestra recién obtenida de tumor del tracto gastrointestinal (GI) (FrTu#3446b) se dejó reposar durante la noche sin citocinas y se clasificó según la expresión de PD-1, TIM-3 o 4-1BB mediante FACS. El número de células clasificadas se expandió in vitro durante 14 días. El día 14, las células se lavaron y se cocultivaron contra la línea celular tumoral autóloga (1 x 105 efectores: 1 x 105 células diana) y se evaluó la reactividad cuantificando la liberación de IFN-gamma y el porcentaje de células CD8+ que expresan 4-1BB 24 horas después del cocultivo. Los resultados se muestran en la figura 6. Tal como se muestra en la figura 6, las células que se clasificaron según la expresión de PD-1, TIM-3 o 4-1BB demostraron una mayor reactividad tumoral tal como se mide mediante la expresión de 4-1BB en comparación con aquellas poblaciones de células que carecían de expresión de PD-1, TIM-3 o 4-1BB, respectivamente. Aunque no se detectó la secreción de IFN-gamma, la regulación por incremento específica de 4-1BB indica que las células eran reactivas a tumores.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra que las células clasificadas como PD-1+ son más oligoclonales que las células PD-1' después de la expansión del número de células in vitro. Este ejemplo también demuestra que las células clasificadas como PD-1+ incluyen clones dirigidos a epítopos mutados expresados por el tumor autólogo después de que la expansión del número de células in vitro.
Una suspensión de células individuales de una muestra recién obtenida de hidrolizado de tumor de melanoma (FrTu#1913) se dejó reposar durante la noche sin citocinas y se clasificó según la expresión de PD-1 mediante FACS. El número de células clasificadas se expandió in vitro durante 14 días. El ARN de la cadena beta de TCR se extrajo usando un kit de aislamiento de ARN pMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Se realizó la síntesis de ADNc y 5'-RACE. Se introdujeron códigos de barras en los extremos del producto de PCR para la identificación de las muestras. Se lavó el producto de PCR y se cuantificó el tamaño de biblioteca. Se llevó a cabo secuenciación profunda (Illumina, Inc., San Diego, CA). Se determinó la frecuencia de cada secuencia única de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena beta de TCR en la población. Los resultados se muestran en las figuras 7A-7C. Tal como se muestra en las figuras 7A-7C, las células clasificadas como PD-1+ son más oligoclonales que las células PD-1-después de la expansión del número de células in vitro.
Los 20 clonotipos más frecuentes en la población PD-1+ se muestran en la figura 8. Tal como se muestra en la figura 8, los clonotipos de la cadena beta de TCR más frecuentes en las células clasificadas como PD-1+ después de la expansión del número de células se encontraron con una baja frecuencia en la fracción PD-1-. Tal como se muestra en la figura 8, los clones que reconocen epítopos mutados que son expresados por la línea celular tumoral autóloga se encontraron dentro de los 20 clones más frecuentes en la población PD-1+ y a una frecuencia muy baja en la población PD-1-. Estos resultados demuestran que los clones reactivos a tumores que se dirigen a los epítopos mutados expresaron inicialmente PD-1 en la muestra de tumor recién obtenida.
Claims (16)
- (1) expandir el número de células T en la población de células enriquecida obtenida en (c);
- (2) estimular la población de células enriquecida obtenida en (c) con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas; y/o(3) transducir o transfectar las células de la población enriquecida obtenida en (c) con una secuencia de nucleótidos que codifica para una cualquiera o más de IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 y ARNip anti-PD-1.
- 3. Método para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores, comprendiendo el método:(a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor;(b) seleccionar específicamente las células T CD8+ que son 4-1BB+/PD-1+ de la población masiva;(c) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores; y(d) combinar la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica que comprende una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores.
- 4. Método según la reivindicación 3, que comprende:(1) expandir el número de células T en la población de células enriquecida obtenida en (c);(2) estimular la población de células enriquecida obtenida en (c) con un antígeno de cáncer y/o con células tumorales autólogas; y/o(3) transducir o transfectar las células de la población enriquecida obtenida en (c) con una secuencia de nucleótidos que codifica para una cualquiera o más de IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 y ARNip anti-PD-1.
- 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores se obtiene sin examinar para detectar el reconocimiento de tumores autólogos.
- 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la población masiva de células T no se estimula inespecíficamente antes de (b).
- 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además cultivar la población de células enriquecida obtenida en (c) en presencia de uno cualquiera o más de TWS119, interleucina (IL-21), IL-12, IL-15, IL-7, factor de crecimiento transformante (TGF) beta e inhibidor de AKT (AKTi).
- 8. Población de células aislada o purificada, enriquecida en células T reactivas a tumores, obtenida mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 5-7.
- 9. Población de células enriquecida en células T reactivas a tumores obtenida mediante un método que comprende:(a) obtener una población masiva de células T a partir de una muestra de tumor;(b) seleccionar específicamente las células T CD8+ que son 4-1BB+/PD-1+ de la población masiva;yc) separar las células seleccionadas en (b) de las células no seleccionadas para obtener una población de células enriquecida en células T reactivas a tumores,para su uso como medicamento.
- 10. Población de células para su uso según la reivindicación 9, en la que la población de células enriquecida en células T reactivas a tumores se obtiene sin examinar para detectar el reconocimiento de tumores autólogos.
- 11. Población de células para su uso según la reivindicación 9 ó 10, en la que la población masiva de células T no se estimula inespecíficamente antes de (b).
- 12. Población de células para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende además expandir el número de células T en la población de células enriquecida obtenida en (c).
- 13. Población de células para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, que comprende además cultivar la población de células enriquecida obtenida en (c) en presencia de uno cualquiera o más de TWS119, interleucina (IL-21), IL-12, IL-15, IL-7, factor de crecimiento transformante (TGF) beta e inhibidor de AKT (AKTi).
- 14. Población de células para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende además estimular la población de células enriquecida obtenida en (c) con un antígeno tumoral y/o con células T tumorales autólogas.
- 15. Población de células para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, que comprende además transducir o transfectar las células de la población enriquecida obtenida en (c) con una secuencia de nucleótidos que codifica para una cualquiera o más de IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 y ARNip anti-PD-1.
- 16. Población de células enriquecida en células T reactivas a tumores obtenida mediante el método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 5-7, composición farmacéutica obtenida mediante el método reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, o población de células para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-15, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.
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