CN109790503A - 重力流式细胞培养装置、系统及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
通过培养基的连续重力流动而不使用机动化设备来培养悬浮和粘附细胞的多层细胞培养装置和系统最大程度地减少了细胞培养物的污染风险。多层细胞培养装置至少包括第一室和第二室，其被构造用于容纳流体并且是流体连接，使得第一室中的流体通过重力流动从第一室单向且连续地流动并进入到第二室中。多层细胞培养装置还可包括第三室，其被构造用于容纳流体并且定位在第二室的下方，使得第二室中的流体通过重力流动从第二室单向且连续地流动并进入到第三室中。还描述了使用这些装置和系统来培养细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月22日提交的系列号为62/398,266的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及连续重力流式细胞培养装置和系统，以及使用所述装置和系统来培养细胞的方法。
背景技术
提供营养物以及稀释培养中的细胞的废产物的一种方法是悬浮培养细胞。悬浮液中的细胞密度可以极高，但是为了获得高的细胞密度，可能需要混合、搅拌、振荡和/或气体鼓泡。这些行为可造成剪切力，其是对培养中的细胞通常有害的力。并不是所有的细胞类型均适于悬浮培养，因此可能需要采用微载体。所需的全部设备可占据大体积的占用空间，这可能受到可用空间的限制，并且使细胞与微载体分离也存在问题。
提供营养物及稀释培养中的细胞的废产物的另一种方法是在区室化容器中培养悬浮细胞，其中细胞在气体渗透性基材上生长并且/或者通过半透膜或透析膜而从培养基的大区室中分离出细胞。由于在透析膜的任意侧上形成的浓度梯度，营养物通过透析膜扩散向细胞，同时废物以相反的方向移动。由细胞产生的蛋白质产物仍保留在具有细胞的区室中，从而能够使重组蛋白浓缩。CELLine瓶(英特格拉生物科学公司，IntegraBiosciences)就是一种这样的容器。然而，这对于粘附细胞没有用处。
灌注是向培养中的细胞提供新鲜营养物的另一种方法。其涉及机械设备，例如循环泵。存在可获得的各种泵，其中注射泵和蠕动泵为大多数灌注细胞培养系统提供动力。和E-CubeTM系统是使用循环泵的灌注系统。
在一些情况中，培养基的初始引入，间歇式团注进料以及营养培养基和细胞的最终移除可通过管道利用重力发生，如在和容器中的那样。然而，这些容器的设计不能够随着时间连续进料。
对微孔板中的细胞进行进料的其他方法通过液体静压力发生。在这种系统中，第一孔比后续的孔处于更大的压力下，以形成通过“芯吸”材料的流，该流从进料孔出发，经由培养孔到达废物孔。这是操作FloWellTM板的方法。
在商业上未获得允许对培养中的细胞进行连续进料的简单、非机械化的方法的系统。这种类型的系统变得更有必要，因为几何结构能够使每平方厘米(例如作为球体)培养更多细胞变为可能，或者对于诸如T细胞之类的细胞类型，其变得更为必要，这些细胞类型基于单位细胞利用更大体积的营养物。为了例如满足T细胞的要求，或者满足使单位体积占用空间的细胞数增加的要求，将需要增大进料频率，这增加了细胞培养员的工作负担。每次干预还增加了细胞培养物受污染的风险。
发明内容
本文描述了通过培养基的连续重力流动而不使用机动化设备来培养悬浮和粘附细胞的多层细胞培养装置和系统，其最大程度地减小了细胞培养物的污染风险。下文还描述了使用这些装置和系统来培养细胞的方法。
在一个方面中，本公开提供了一种多层细胞培养装置，其包括：第一室以及位于第一室下方的第二室，所述第一室被构造用于容纳流体并且包含至少第一孔，所述第一孔用于引入流体或从第一室移除流体。第二室被构造用于容纳流体并且包含至少第一孔，所述第一孔用于引入流体或从第二室移除流体。第一室和第二室被构造成流体连接，使得第一室中的流体通过重力流动从第一室单向且连续地流到第二室中。
多层细胞培养装置还可包括第三室，其被构造用于容纳流体并且其位于第二室的下方。在该装置中，第三室包括用于引入流体或从第三室移除流体的至少第一孔，并且第二室和第三室被构造成流体连接，以使第二室中的流体通过重力流动从第二室单向且连续地流到第三室中。通常，第一室为进料室，第二室为培养室，第三室为废物室。第一室可以与第二室基本上平行。第二室可以与第三室基本上平行。第一室、第二室和第三室基本上可以彼此平行。在多层细胞培养装置中，流体在例如两天或更多天的时间内通过重力流动单向且连续地流动。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室和第二室中的至少一者包括通气口。在具有至少三个室的多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室、第二室和第三室中的至少一者包括通气口。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室还可包括细胞保留设备以用于防止第一室中的细胞进入第二室。类似地，第二室还可包括细胞保留设备以用于防止第二室中的细胞进入第三室。第一室可包含培养基和第一细胞群，第二室可包含培养基和第二细胞群。例如，第一细胞群可包括外周血单核细胞(PBMC)，而第二细胞群可包括T细胞。又例如，第一细胞群可包括成纤维细胞，而第二细胞群可包括干细胞。第二室可包括用于限制细胞的孔以用于球体细胞培养。在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第二室的至少一个内表面涂覆有某种材料，该材料防止细胞结合到该至少一个内表面。在另一个实施方式中，第二室具有基本上为平面的水平表面以用于支持贴壁依赖(attachment-dependent)细胞的生长。
在本文所述的多层细胞培养装置中，各室可以通过至少一个连接器(包括管道)流体连接。在这种实施方式中，第一盖可以覆盖用于引入流体或从第一室移除流体的所述至少第一孔，第一盖具有用于接收管道的第一端的至少第一接头，第二盖可覆盖用于引入流体或从第二室移除流体的所述至少第一孔，第二盖具有用于接收管道的第二端的至少第一接头。第一盖可包括用于从第一室排出气体的第二接头，第二盖可包括用于从第二室排出气体的第二接头。流量调节器可以操作性连接到管道。流量调节器可以例如为阀。在多层细胞培养装置的一个实例中，各室通过至少一个连接器流体连接，并且至少一个流量调节器(例如阀)操作性地连接到所述至少一个连接器。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，第二室包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔。可以例如夹住、关闭、覆盖或密封第二孔。每个第二孔可以操作性地连接到通气口。在一些实施方式中，第一室为袋子，并且第一室和第二室通过包含管道的连接器流体连接。流量调节器可以操作性连接到管道。在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第二室的第二孔操作性地连接到通气口。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室和第二室可以通过与第一室流体连接的套管以及与第二室流体连接的至少第一隔膜流体连接。在该实施方式中，对第一室和第二室进行定位，使得所述至少第一隔膜被套管穿透。在这样的实施方式中，第一室可包括第一端和第二端以及在该两端中的一端处的倾斜的内表面，该倾斜的内表面相对于该两端中的另一端处的内表面倾斜。在该实施方式中，倾斜的内表面和套管处于第一室的相对端处。第一室可包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，其被第一盖覆盖，第二室可包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔，其被第二盖覆盖。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室与第二室之间的表面具有设置在其中的孔，并且第一室与第二室通过设置在第一室与第二室之间的表面中的孔以及部分位于第一室的内部且延伸通过设置在第一室与第二室之间的表面中的孔的阀而流体连接。在这样的实施方式中，第一室可包括第一端和第二端以及在该两端中的一端处的倾斜的内表面，该倾斜的内表面相对于该两端中的另一端处的内表面倾斜。在该实施方式中，倾斜的内表面和设置在第一室与第二室之间的表面中的孔处于第一室的各相对端处。第一室可包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，其被第一盖覆盖，第二室可包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔，其被第二盖覆盖。在这样的实施方式中，第一盖和第二盖中的至少一者可包括用于从第一室和第二室中的至少一者排出气体的通气口。
在多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室可包括第一端和第二端以及在该两端中的一端处的倾斜的内表面，该倾斜的内表面相对于该两端中的另一端处的内表面倾斜。在该实施方式中，所述倾斜的内表面以及所述用于引入流体或从第一室移除流体的至少第一孔处于第一室的各相对端处。
第一室和第二室可以为烧瓶。在具有至少三个室的多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室、第二室和第三室可以为烧瓶。
多层细胞培养装置可通过例如注塑、吹塑、热成形、激光焊接、超声焊接、粘合剂结合、热结合等来制造或组装。
第一室和第二室可以集成在单个容器中。在具有至少三个室的多层细胞培养装置的一个实施方式中，第一室、第二室和第三室可以集成在单个容器中。
在另一个方面中，本公开提供了一种培养细胞的方法。所述方法包括将至少第一细胞群和组织培养基加入到本文所述的多层细胞培养装置中。
在另一个方面中，本公开提供了一种培养细胞的方法，所述方法包括将第一细胞群、第二细胞群和组织培养基加入到本文所述的多层细胞培养装置中。在一个实例中，第一细胞群为PBMC，第二细胞群为T细胞。在另一个实例中，第一细胞群或第二细胞群为形成球体的细胞。
除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。
如本文所使用的，术语“通气口”是指在室、容器等中的开口，气体通过该开口可进入或离开室、容器等。虽然其他流体(例如液体)能够通过通气口，但是通气口主要用于气体的传递。
术语“连接”和“连接器”意为进行连接、结合或链接的任意物质。
如本文所使用的，术语“阀”是指用于调节通过通道(例如通过孔、端口、通气口或管)的流体(液体、气体)的通过情况的装置。
术语“开放系统”意为当接触多层细胞培养装置的室时，直接向大气开放的系统。
如本文所使用的，术语“关闭系统”意为当接触多层细胞培养装置的室时，不直接向大气开放的系统。
术语“伪关闭系统”意为其中的室可通过向大气开放或不向大气开放来接触到的系统。
本文所用的术语“球体”是指包含许多聚集细胞的三维细胞簇。球体可以由不同细胞类型形成，包括原代细胞、细胞系和干细胞。
在使用时，第一室含有流体(例如培养基)，该流体向容纳在第二室中的细胞提供营养物。因此，第一室在本文中有时被称为“进料室”，而第二室在本文中有时被称为“培养室”。在一些实施方式中，第一(进料)室和第二(培养)室内均包含细胞。在装置包含第三室的那些实施方式中，该第三室通常含有废物流体，因此其在本文中有时被称为“废物室”。
虽然在实践或测试本发明中可使用类似于或等同于本文所述的装置、系统和方法，但下文描述了合适的装置、系统和方法。本文中提及的所有出版物、专利申请和专利通过参考的方式用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。下文论述的具体的实施方式仅是说明性的而不旨在起到限制作用。
附图说明
图1A示出了包含三个室、流量控制阀(流量调节器)的多层细胞培养装置的侧视示意图，以及流量控制阀的放大示意图。在该实施方式中，所述装置是关闭系统。
图1B示出了图1A的多层细胞培养装置的前视示意图。
图2示出了包含三个室、流量控制阀(流量调节器)的多层细胞培养装置的另一个实施方式的侧视示意图，以及流量控制阀的放大示意图。在该实施方式中，所述装置是关闭系统。在进料室中培养饲养细胞，并且在培养室中培养球体，所述培养室具有用于限制细胞进行球体细胞培养的孔，这些孔沿着培养室内部的底部设置。
图3示出了包含三个室、流量控制阀(流量调节器)以及作为进料室的袋子(在本文中称为“进料袋”)的多层细胞培养装置的另一个实施方式的侧视示意图。在该实施方式中，显示出在培养室中培养球体，所述培养室具有用于限制细胞进行球体细胞培养的孔，这些孔沿着培养室内部的底部设置。该装置是关闭系统。
图4示出了由传统的商购细胞培养容器组装的多层细胞培养装置的另一个实施方式的侧视示意图。该装置包括三个室并且是关闭系统。
图5示出了多层细胞培养装置的另一个实施方式的侧视示意图，其中，各室之间的流动通过套管发生，所述套管刺穿相邻室中的隔膜。该装置是开放系统。在该实施方式中，显示出在培养室中培养球体，所述培养室具有用于限制细胞进行球体细胞培养的孔，这些孔沿着培养室内部的底部设置。
图6示出了包含三个室和流量控制阀(流量调节器)的多层细胞培养装置的另一个实施方式的侧视示意图，并且例示了使各室通气的四种机构：1)与进料室流体连接的通气口，2)与进料室流体连接并且与其他室连接的(plumbed)通气口，3)设置在培养室的盖中的通气口和4)与盖或接头流体连接的通气口。
图7示出了图6的流量控制阀(流量调节器)的放大侧视示意图。在一个一般的实施方式中，转动阀以增加或减少该阀接合到下方室的顶部中的，进而减少或增加从一个室到下一个室的培养基的流量。
图8A示出了以内部通气为特征的多层细胞培养装置的另一个实施方式的前视示意图。图8B示出了图8A的一个替代性实施方式。
具体实施方式
本文描述了多层细胞培养装置，通过该装置，流体(例如培养基)通过重力流动而连续流动(“重力进料”)，这为培养在其中的细胞提供了连续进料。还描述了包含这些装置的细胞培养系统、使用这些系统和装置的培养细胞的方法以及制造这些装置的方法。本文所述的重力进料培养系统和装置提供了劳动力不那么密集的方法来向细胞给予新鲜培养基或经过调整的培养基，并且不需要机动化设备。本文所述的系统和装置可用于培养粘附细胞或悬浮(悬液)细胞，并且还可用于一起共同培养不同的细胞类型(例如两种或更多种不同的细胞类型或细胞群)(例如，同时允许物理分离各细胞类型或细胞群)。它们还可以用于通过饲养细胞进行的培养基调节。在一些实施方式中，所述装置可以组装成其中具有多个室(例如用于进料、培养、废物等)的集成单元，或者为单独的容器模块(例如进料模块、培养模块、废物模块等)。本文所述的系统和装置提供了堆叠的流通操作，其允许向培养装置中的细胞添加化学实体。在一些实施方式中，可以评估装置中的细胞[例如在动力学上评估生理学的改变(例如由于添加和/或移除化学实体所致)]。可以将本文所述的装置制造成开放系统、关闭系统或伪关闭系统。
本文所述的重力进料系统和装置能够连续或间歇地进料而无需外来设备或者在初始设置了培养装置和/或系统后侵入(进入)装置的各室。这些系统和装置具有灵活性、适应性和可变性，可满足大量用户需求。以各种布置连接(例如由使用者连接)并带有各种附件和修改形式的模块化系统在本文的范围内。以具有两个或更多个集成的室的单个装置来制造的装置也在本文的范围内。装置的内表面可以由任何合适的材料制造，包括惰性材料、低粘性或无粘性材料、气体渗透性或不可渗透性材料、透明或不透明材料等。在一些实施方式中(例如用于培养悬浮细胞、球体等的实施方式)，装置的一个或多个内表面可用某种材料来处理或涂覆，所述材料阻止或防止细胞与表面结合或增强细胞与表面的粘附。
在一些实施方式中，从一个室到下一个室的流量仅通过各个室的取向(例如相对高度/高)和尺寸(例如孔和/或连接器和/或接头的内直径)来控制。在其他实施方式中，使用一个或多个流量调节器(例如阀)来控制流动速率。在一些实施方式中，从一个室到下一个室的流量通过各室的取向(例如相对高度/高)与一个或多个流量调节器(例如阀)的组合来控制。范围不受流量调节器的类型(例如阀)或流量限制的手段限制。
下文描述的优选的实施方式例示了这些装置、系统和方法的适用性。然而，根据这些实施方式的描述，可以基于下文提供的描述构想和/或实践本发明的其他方面。
细胞培养方法
本文描述了涉及常规细胞培养技术的方法。此类技术一般是本领域已知的。培养来自细胞系、原代细胞或初次分离物样品的球体的方法在本领域是已知的，并且描述于例如第2015/0376566号、第2014/0322806号和第2009/0325216号美国专利申请公开中。培养悬浮细胞(例如T细胞)的方法在本领域也是已知的，并且描述于例如第8,034,334号美国专利以及第2016/0010058号、第2012/0244133号和第2006/0263881号美国申请公开中。所有这些参考文献都以参考的方式纳入本文中。
多层细胞培养装置
装置和系统包括两个或更多个(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)室，它们垂直布置(例如以不同的高度布置)并且串联连接[在某些实施方式中也可以使用并联连接(例如进料室向两个或更多个培养室提供流体)]，以提供从上游室到下游室的流。在一些实施方式中，设计(例如由制造商或使用者设计)或调整(例如由使用者调整)两个室的相对高度，以提供所需的流动速率或流动速率范围[例如，任选地，还可通过流量调节器(如阀)来调节]。仅相对于容纳细胞的室来设计或改变容纳液体的室的高度即可提供所需的流动速率。在一些实施方式中，各室彼此堆叠(之间具有或不具有空间)。在一些实施方式中，各室由支架、搁架系统或其他支承结构支承。各室可以在水平的x和/或y维度上对齐，但是在垂直的z维度上适当偏离，或者也可以在水平维度上偏离。图1-8描绘了本文所述的装置和系统的多个实施方式。
图1A和图1B分别示出了包含流量控制阀的作为关闭系统的三室重力进料培养装置(多层细胞培养装置)的侧视示意图和流量控制阀的放大示意图以及装置的前视示意图。如图1A和1B所示，多层细胞培养装置25的一个实施方式包括被构造用于容纳流体35的第一室1。第一室1包括至少第一孔，所述第一孔用于引入流体或从第一室1移除流体。该装置还包括位于第一室1下方的第二室2，所述第二室2被构造用于容纳流体35并且包含至少第一孔，所述第一孔用于引入流体或从第二室2移除流体。该装置还包括至少第一连接器，其与所述第一室1和第二室2的至少第一孔连接并且使第一室1和第二室2流体连接，以使第一室1中的流体35通过重力流动单向且连续地流动通过所述至少第一连接器并进入第二室2中。所述至少第一连接器，或者操作性地连接到所述至少第一连接器的流量调节器10，其被定位成促进重力流动并调节重力流动。在该实施方式中，所述至少第一连接器包括管道40。在第一室1上的接头30与第一室1上的所述至少第一孔配合，该接头30接收管道40的第一端，而在第二室2上的接头30与第二室2上的所述至少第一孔配合，该接头30接收管道40的另一端(第二端)。接头为促进流体传递(例如连续传递、恒速传递等)进入和/或离开孔或端口的任意结构。这样的结构包括，例如喷口、漏斗、口部、杆、喷嘴等。在一些实施方式中，接头的结构允许部件(例如阀、用于流体传递的导管等)接合到室。在一些实施方式中，接头30包括或连接到结构20(例如密封件、盖、罩、通气口、塞子、阀)以防止流体传递通过孔；这样的部件或结构可以是可逆的(例如，可以反复打开和关闭)或不可逆的(例如，仅可以打开或关闭一次)。流入孔中或从孔中流出的流量可以仅通过孔的尺寸以及室的取向和/或孔的任意侧上的环境来调节，或者可以通过一种或多种类型的流量调节器(例如流量阀)来调节，或者通过它们的组合来调节。在图1A中，流量调节器10操作性地连接到管道40，并且在该实施方式中，流量调节器10作为阀10示出。在该实施方式中，从一个室到下方的室的流量通过束缚管道40的阀10来调节或控制。
在图1A中，装置25包括第三室3，其被构造用于容纳流体并且其位于第二室2的下方。第三室3包括至少第一孔，所述第一孔用于引入流体或从第三室3移除流体。第二室2包括用于引入流体或从第二室2移除流体的第二孔，并且第二室和第三室通过包括管道40的第二连接器流体连接，以使第二室2中的流体通过重力流动单向且连续地流动通过所述第二连接器并进入第三室3中。第二连接器被定位成促进重力流动并且可以调节重力流动。在该实施方式中，包括管道40的第二连接器定位在与具有所述至少第一连接器的第二室2的一端相对的第二室2的一端处。在第二室2上的接头30与第二室2上的第二孔配合，该接头30接收管道40的第一端，而在第三室3上的接头30与第三室3上的所述至少第一孔配合，该接头30接收管道40的另一端(第二端)。流入孔中或从孔中流出的流量可以仅通过孔的尺寸以及室的取向和/或孔的任意侧上的环境来调节，或者可以通过一种或多种类型的流量调节器(例如流量阀)来调节，或者通过它们的组合来调节。
图1A还示出了定位在第二室2的内部中的细胞保留设备80，其用于防止第二室2中的细胞进入第三室3。细胞保留设备80适当地定位在第二室2的第二孔附近以保留细胞。细胞保留设备80的一个实例是堰。本文所述的多层细胞培养装置可以包括一个或多个堰，例如，其位于特定的室中以将液体限制在室的仅一部分中。在一些实施方式中，一旦室的体积超过了特定的高度，则堰破裂，液体流到堰的另一侧。在一些实施方式中，除非在过度填充的情况中，否则使用堰来防止液体流出。在其他实施方式中，堰防止悬浮细胞离开室，同时允许液体流出。在多层细胞培养装置仅具有第一室和第二室(即不具有第三室)的实施方式中，第二室可以包括细胞保留设备。
每个室包括用于引入或移除流体的至少一个孔，但是各室可包括两个或更多个(例如两个、三个、四个、五个)用于引入或移除流体的孔(例如进口和出口端口)。如图1A所示，第一室1具有另一个接头30，其与第一室1上的第二孔配合，该接头30显示为被结构20关闭或密封。类似地，第二室2显示为具有另一个接头30，其与第二室2上的第三孔配合，该接头30显示为被结构20(例如关闭部件)关闭或密封。与第一室1和第二室2一样，第三室3显示为具有与第三室3上的第二孔配合的另一个接头30。该接头30显示为被结构20关闭或密封。接头和孔可以被任意合适的结构(包括，例如塞子、通气口、夹具等)关闭、夹持、密封或覆盖。
图1B是装置25的前视图，该图示出了在第一室1和第二室2上的另外的孔31、33(用于引入或移除流体)。可以通过这些孔中的任意一个或多个将流体(例如细胞培养基)引入到第一室1、第二室2和第三室3。在第一室、第二室和第三室中的任意一者上的孔可以用于引入或移除细胞、培养基和/或样品。在一个实例中，第一室(进料室)可以具有另外的孔以用于向第一室(进料室)添加培养基。在一些实施方式中，通过使进料室而非培养室补充有培养基，可向系统添加另外的培养基而不会干扰在其中培养的细胞。在第一室上的这种另外的孔还可用于或者替代性地用于向第一室1添加饲养细胞(饲养层接种)。在一些实施方式中，第二室2(培养室)可以具有另外的孔、接头和连接器，其用于将第二室2连接到另外的进料和/或废物室，以及/或者连接到其他部件或容器(例如补充营养物供应容器、试验容器等)。在这样的实施方式中，特别是在使用饲养细胞来调节培养基的实施方式中，本文所述的多层细胞培养装置中可以包括另外的进料室。例如，在这样的装置中，初级进料室将未经调整的培养基传递到包含饲养细胞的次级进料室中，而次级进料室将经过调整的培养基传递到培养室中。
在本文所述的多层细胞培养装置中，各室可以被定向成使用于引进流体的孔(例如进口端口)位于室的上部(例如室的顶部)上。在一些实施方式中，具体的室的进口端口被构造或定位成将液体(培养基)输送到具体室的液线下方(例如，为了减少因滴下或溅起导致的液体破坏)。在一些实施方式中，对各室进行定向，以使用于移除具体室的流体的孔(例如出口端口)被构造或定位在具体室的下部(例如该室的底部)上。
图2示出了多层细胞培养装置25的一个实施方式，其具有另外的特征并且在第一室1和第二室2中共培养有两种细胞群。第一细胞群50(例如饲养细胞，如成纤维细胞)显示为在第一室1中，第二细胞群60(通常为第二种类型的细胞，例如干细胞)显示为在第二室2中。如果一些细胞类型(例如干细胞)接收经第二种细胞类型(例如成纤维细胞)调整过的培养基，则它们表现得更为真实。例如，将作为球体来培养的干细胞与成纤维细胞共培养，这是因为已经发现，当作为球体来培养时，间充质干细胞具有更优异的生理特性。在这样的实施方式中，在第二(培养)室内部的底表面模塑或浮雕出有益于球体形成的几何结构，或将这种几何结构附接到底表面。图2示出了在第二室2中的孔39，其用于限制细胞60进行球体培养。共培养细胞的另一个实例是使用PBMC来培养T细胞。在这样的实施方式中，第一细胞群50为PBMC，第二细胞群60为T细胞。
为了防止第一室1中的细胞50(第一细胞群)进入第二室2，第一室1可包括细胞保留设备。除了使用如上所述的堰，将悬浮细胞(例如T细胞)保留在培养室中的一个选项是在培养室中的所述至少第一孔(例如流出端口)上使用过滤器或筛。这样的过滤器防止悬浮细胞进入废物室(和废物流)。在进料室中培养有饲养细胞的一些实施方式中，使用组装在进料室的流出端口上的过滤器。在用嵌合抗原受体扩增T细胞的方法中有一个步骤，这种类型的装置对于该步骤是特别有用的。转导的T细胞的快速增殖可通过在同种异体照射的PBMC、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3,OKT3，一种免疫抑制剂)和白细胞介素2(IL2，一种细胞因子信号分子)的存在下培养转导的T细胞来诱导。在一些实施方式中，将PBMC、OKT3和IL2置于进料室中，并将T细胞置于培养室中。来自进料室的经过调整的培养基随着时间流到T细胞培养室中以促进增殖，并且废培养基流到废物室中。在图2所示的实施方式中，细胞保留设备23为覆盖第一室1中的所述至少第一孔的筛材料，使得第一室1中的细胞无法通过所述至少第一孔并且无法离开第一室1。
在图2所示的实施方式中，第一室1包含另外的孔和另外的接头30，其位于与具有所述至少第一孔的第一室1的一端相对的第一室1的一端处。在这样的实施方式中，该另外的孔和接头可用于向第一室1添加饲养细胞(即，饲养层接种)。
本文所述的多层细胞培养装置的各室(例如集成装置的各室，或作为模块化装置的各个室)可由任何合适的材料制成。在一些实施方式中，各室是硬面(刚性)、尺寸限定的容器，例如板、板和罩、瓶、管等。在各室由刚性材料制成的实施方式中，所述室因此具有刚性壁。在其他实施方式中，一个或多个室是软面(柔性)的可扩展容器，例如袋子。在通常的实施方式中，培养室是硬面容器，而进料室和/或废物室是软面或硬面的。在一些实施方式中，培养室是软面的，例如图3所示的实施方式。在图3所示的实施方式中，第一室4为由柔性材料制成的袋子(例如，该柔性材料不可渗透流体，但可渗透气体)。在该实施方式中，所述至少第一连接器与所述第一室4和第二室2的至少第一孔连接并且使第一室4和第二室2流体连接，以使第一室4中的流体35通过重力流动单向且连续地流动通过所述至少第一连接器并进入第二室2中，该至少第一连接器包括管道40。在第一室4上的接头30与第一室4上的所述至少第一孔配合，该接头30接收管道40的第一端，而在第二室2上的接头30与第二室2上的所述至少第一孔配合，该接头30接收管道40的另一端(第二端)。在该实施方式中，流量(例如培养基的流量)可以通过第二室2上方的袋(第一室4)的高度和/或利用流量调节器10(如流量控制阀)来控制。在图3所示的实施方式中，装置25包括第三室3(废物室)。在一些实施方式中，第三室(废物室)也可以为袋子。袋子可以由任何合适的柔性或挠性材料制成。在用于将悬浮细胞扩增到多个室中的多层细胞培养装置的一个实施方式中，进料袋(第一室)可位于容纳悬浮细胞的第二室的上方并与其流体连接，第二室位于至少第三室(例如第三、第四、第五、第六室等)的上方并与其流体连接。随着悬浮细胞在第二室中增殖，可操纵与第二室和第三室操作性连接的流量调节阀，以允许悬浮细胞流到第三室中。在该实施方式中，可以通过串联的另外的室使悬浮细胞的流动和扩增继续。
图4示出了伪关闭系统和多层细胞培养装置25的一个实施方式，其包含传统的细胞培养容器以及通过盖和接头附接到容器的管道。在这种实施方式中，所述至少第一连接器包括管道40、第一盖110和第二盖110，所述第一盖110覆盖用于引入流体或从第一室1移除流体的所述至少第一孔，并且所述第一盖110具有用于接收管道40的第一端的至少第一接头30，所述第二盖110覆盖用于引入流体或从第二室2移除流体的所述至少第一孔，并且所述第二盖110具有用于接收管道40的第二端的至少第一接头30。在该实施方式中，与第二室2和第三室3连接的第二连接器包括管道40、接头30以及在第三室3上的第三盖110，所述接头30在第二室2的一端处，该端与具有第二室2的所述至少第一孔的一端相对，并且该接头30接收管道40的一端，所述第三盖110覆盖第三室3的所述至少第一孔并且具有用于接收管道40的另一端的至少第一接头。在该实施方式中，装置25包括两个通气口过滤器70，一个位于第一室1的顶表面或壁上，另一个位于第二室2与第三室3之间。与第一室1连接的通气口过滤器70流体连接到第一室1的内部，并且允许气体排出第一室(以及排出装置25)。定位在第二室2与第三室3之间的通气口过滤器70可以同时流体连接到第二室2和第三室3的内部，以使气体在第二室2与第三室3之间流动。在其他实施方式中，不使用图4所示的通气口过滤器70，而是盖110可以包括通气口过滤器或其他通气材料或设备，或者可以使一个或多个接头30附接于通气口(例如结构20可以为通气口)。图4还示出了在第二室2中的细胞保留设备80，其适当地位于第二室2的第二孔附近以将细胞保留在第二室2中。虽然细胞保留设备80以堰示出，但是可以使用例如筛材料代替。该实施方式的另一个特征是第一室1，其包括第一端和第二端以及在该两端中的一端处的倾斜的内表面81，该倾斜的内表面81相对于该两端中的另一端处的内表面倾斜。倾斜的内表面81与用于引入流体或从第一室移除流体的至少第一孔处于第一室的各相对端处。第一室1的这种成角度的(倾斜的)内部促进了液体(培养基)流动(重力流动)通过用于引入流体或从第一室1移除流体的所述至少第一孔并进入所述至少第一连接器。
参考图5，所示的多层细胞培养装置25的实施方式为开放系统，其中在第一室1、第二室2与第三室3之间具有空间。这些空间通过结构85建立，其中的一个空间设置在第一室1与第二室2之间，其中的另一个空间设置在第二室2与第三室3之间。这些结构85可以由任意合适的材料制成，并且可以作为室的部件或附接于室的部分形成。各室之间的空间允许气体交换到容器中的气体渗透性下表面。在该实施方式中，所述至少第一连接器包括与第一室1流体连接的套管90以及与第二室2流体连接的至少第一隔膜91，第一室1和第二室2被定位成使所述至少第一隔膜91被套管90穿透。在该装置25中，将套管90设置在第一室1的下表面或壁中，并且其穿透或刺穿设置在第二室2的上表面或壁中或之上的隔膜91。液体(例如培养基)通过重力流动从第一室1流动通过套管90和隔膜91并流入第二室2中。第三室3具有设置在其上表面或壁上的套管90，其穿透或刺穿设置在第二室2的下表面或壁上的隔膜91。在一个替代性实施方式中，可以倒置这种布置，即，第三室3可以具有设置在其上表面或壁上的隔膜，该隔膜被设置在第二室2的底表面或壁上的套管穿透或刺穿。在任意一种布置中，液体通过重力流动从第二室2流到第三室3中。如该图所示，第一室1、第二室2和第三室3的所述至少第一孔被盖110覆盖。
在图5中，显示出通气口70位于第一室1的上表面或壁上或与其连接，该通气口70用于从第一室移除气体[以及从装置或系统(即所有的室)移除气体]。与本文所述的其他实施方式一样，不将通气口70定位在第一室1的上表面或壁上或者与之连接，而是可以在覆盖第一室1的所述至少第一孔的盖110中设置通气口过滤器。第一室1还显示出具有如图4所示的倾斜的内表面81。第二室2显示出具有容纳在孔(例如形成球体的几何结构)中的细胞60(例如球体)，以及用于防止细胞60进入第三室3的细胞保留设备80。
在一些实施方式中，各室包括一个或多个通气口，以允许吸收气体(例如空气)以及/或者从室和/或装置或系统排出气体(例如空气)。在一些实施方式中，当重力将液体从进料室汲取到培养室中时，替换进料室中的空气以防止进料室中的负压降低液体传递的速率[在软面进料室(例如袋子)的情况中，通常不需要为这个目的设置通气口]。进料室中的通气口允许将空气或其他气体[例如惰性气体(如氮气或氩气)等]吸到室中，以替代被传递出去的液体体积。类似地，当重力将液体从培养室汲取到废物室中时，需排掉废物室中的体积以防止废物室中的正压降低液体传递的速率[在软面废物室(例如袋子)的情况中，通常不需要为这个目的设置通气口]。废物室中的通气口允许空气或其他气体[例如惰性气体(如氮气或氩气)等]离开该室，以在将液体传递到该室中时，在该室中提供空间。通气口通常是允许空气或其他气体通过的开口(例如阀、开孔、覆盖有过滤器的孔、覆盖有气体渗透性膜的孔等)。开放和关闭系统可以具有通气口。在一些实施方式中，通气口被具有0.2微米孔的材料覆盖，以允许气体通过但不允许细菌通过。
通气口可以包含有助于气体传递和/或允许部件(例如阀、导管等)与通气口接合的结构(例如喷嘴、阀等)。
在一些实施方式中，通气口包括过滤器、筛网或物理屏障以防止将污染物引入到装置或系统中。
可获得使系统通气的各种机构。这样的机构包括，例如：1)孔(例如在室的顶部或上部上)，在一些实施方式中，其可以被通气口过滤器(例如类似于康宁公司的)覆盖；(2)在各体积之间延伸的导管(例如在各室之间，从外环境到室中，或其组合等)，所述导管在每个体积中具有开口；(3)位于室的盖中的覆盖有过滤器的开口，所述开口与盖的一侧偏离，并且所述盖被定向成使过滤器材料朝向顶部定位以防止润湿；(4)与每个室上的管道接头附接的通气口过滤器；等等。这些通气口实例并非限制性的。图6例示了使各室通气(从各室移除气体)以及从装置25排气(从装置25移除气体)的多个机构。用于通气的第一种机构为通气口70(例如在被通气口过滤器覆盖的室的项部或上部上的孔)，其显示出位于第一室1的上表面或壁上或与之连接。显示为操作性地连接到第一室1、第二室2和第三室3的另一种通气机构为导管92，其在各室之间延伸(穿过)，并且在每个室中具有开口(例如相连的(plumbed)通气口管)。第三种机构为设置在一个或多个盖110中的过滤器材料(例如，在室的盖中的覆盖有过滤器的开口，所述开口偏向盖的一侧，并且该盖被定向成使过滤器材料朝向顶部定位以避免润湿)。第四种机构是与第三室3上的接头30附接的结构20(通气口或通气口过滤器)。第一室1和第二室2可以另外或者替代性地具有这种接头/通气口布置。
在图6的装置25中，所述至少第一连接器包括流量控制阀93。在该实施方式中，第一室1包括其中设置有孔的刚性底表面或壁，第二室包括其中设置有孔的刚性顶表面或壁，使得底表面或壁的孔以及顶表面或壁的孔流体对齐并基本上垂直对齐，并且所述至少第一连接器包括阀93，该阀93部分定位在第一室1的内部并且延伸通过第一室1的底表面或壁的孔以及延伸通过第二室2的顶表面或壁的孔。第一室1中的液体(例如培养基)围绕阀93的尖端或下端100渗漏或通过，并进入到第二室2中。在该实施方式中，可以转动(旋转)阀93以增加或减少阀93接合到第二室2的顶表面或壁的孔中，进而增加或降低液体从第一室1流到第二室2中的流量(流动速率)。换言之，从第一室1流到第二室2中的液体的速率可以通过转动或旋转阀93来调节或控制，从而对液体围绕阀93的尖端100的渗漏进行控制，在所述尖端100处，阀93接触第二室2的上壁。图6的装置25还示出了具有倾斜的内表面81的第一室1。第二室2显示出具有容纳在孔(例如形成球体的几何结构)中的细胞60(例如球体)，以及用于防止细胞60进入第三室3的细胞保留设备80。如该图所示，第一室1、第二室2和第三室3的所述至少第一孔被盖110覆盖。图7是图6的流量控制阀93的放大侧视示意图。阀93显示为部分位于第一室1的内部，并且延伸通过第一室1的底表面或壁的孔，以及延伸通过第二室2的顶表面或壁的孔。第一室1中的液体35(例如培养基)显示为围绕阀93的尖端或下端100渗漏或通过，并进入到第二室2中。
在图8A和8B的实施方式中，示出了开放系统的多层细胞培养装置，其中第一室1、第二室2和第三室3被集成在单个容器(装置)中，并且是内部通气(在容器或装置中通气)。装置25具有第一室1、第二室2和第三室3，所述第一室1包括用于引入流体或从第一室1移除流体的至少第一孔，所述第二室2包括用于引入流体或从第二室2移除流体的至少第一孔，所述第三室3包括用于引入流体或从第三室3移除流体的至少第一孔。这些孔各自被盖110覆盖。在图8A和8B的装置25中，第一室1和第二室2各自具有垂直内壁130，对垂直内壁130进行定位，以在垂直内壁130与装置25的外表面或壁之间存在连续空间120，并且该连续空间120从第一室1垂直跨到第三室3。在图8A和8B中，在发生内部通气的连续空间120中示出了箭头。在图8A中，第一室1和第二室2显示为具有套管和隔膜以使第一室1、第二室2和第三室3流体连接。在图8B中，套管和隔膜使第一室1和第二室2流体连接。在该实施方式中，第二室2具有第二垂直内壁130，从而建立了垂直跨越第二室2和第三室3的空间120，并且该垂直内壁130起到堰的作用，以允许液体从第二室2流到第三室3，但防止第二室2中的细胞流到第三室3中。在系统为关闭系统的替代性实施方式中，第一室1、第二室2和第三室3的所述至少第一孔可以连接到管道(如图1A、1B、2、3、4所示的实施方式)。
本文所述的室和其他结构由任意合适的材料形成。优选地，用于接触细胞或培养基的材料可与细胞和培养基兼容。通常，包括室自身在内的部件由聚合材料形成，例如热塑性或热固性聚合物、或者玻璃。合适的聚合物材料的实例包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物和聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物等。
在一些实施方式中，一个或多个室(尤其是培养室)的内表面与细胞的粘附性低，或者对细胞是非粘附性的。室(或者其内表面)可以由低粘附性或非粘附性(非粘性)材料形成，或者可以涂覆有低粘附性或非粘附性材料。低粘附性或非粘附性材料的实例包括全氟化聚合物、烯烃或类似聚合物或者其混合物。其他实例包括琼脂糖、非离子水凝胶如聚丙烯酰胺、聚醚如聚环氧乙烷和多元醇如聚乙烯醇、或类似物质或者其混合物。在一些实施方式中，仅是用于细胞接触的室或室的部分是低粘附性或非粘附性表面。在其他实施方式中，所有室的表面均是低粘附性或非粘附性的。
各个室可以具有任何合适的尺寸。在一些实施方式中，基于具体用途选择室的尺寸。较大体积的进料和/或废物室可以用于较长的培养时间或需要更多次流体更换的培养物。较大体积的培养室可以用于较大的细胞数或用于需要较大的培养基体积的培养物。各室的示例性宽度、长度、高度、直径等包括1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm、15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm、30cm、31cm、32cm、33cm、34cm、35cm、36cm、37cm、38cm、39cm、40cm、41cm、42cm、43cm、44cm、45cm、46cm、47cm、48cm、49cm、50cm、51cm、52cm、53cm、54cm、55cm、56cm、57cm、58cm、59cm、60cm,以及其间任意合适的范围(例如(1-10cm、1-6cm或1-4cm的深度；6-40cm、8-30cm或10-20cm的长度；以及6-40cm、8-30cm或10-20cm的宽度)。
各个室可以具有任何合适的形状。在一些实施方式中，室的主体为大致呈矩形的盒子(例如允许具有圆化角)。在一些实施方式中，这种形状的改变发生在通气口、接头、连接器、孔、端口或其他特征的位置处。
在一些实施方式中，培养室包括孔(例如，呈阵列布置)，以用于如上所述培养细胞。孔可以具有任意合适的尺寸、形状和/或取向。在一些实施方式中，孔被构造用于3D细胞培养。在一些实施方式中，为了产生对细胞聚集的限制作用，使用的微孔几何结构与最大所需细胞聚集体的尺寸在直径上极相似(例如，相差在20％、15％、10％、5％、2％、1％的范围内，或其中的合适范围内)，但是深度至少是直径的1至2倍(例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 2.6、2.6、2.8、3.0、3.5、4.0,或其中的合适范围)。
存在许多不同的孔几何结构，这些孔几何结构可用于3D培养细胞，例如作为聚集体培养。在一些实施方式中，细胞聚集体是细胞簇，类胚体或球体。形成细胞聚集体的常见几何结构是在孔底圆化的微孔板上找到的半球。培养来自细胞系、初代培养或初次分离物样品的球体的方法在本领域是已知的，并且描述于例如第2015/0376566号、第2014/0322806号和第2009/0325216号美国专利申请公开中。在一些实施方式中，使用非粘性(非粘附性)表面来防止细胞附着于表面。在制造孔或室(例如，在微孔板中)之后，可以施加非粘性材料，或者孔或室材料可具有固有的非附着特性。
任何合适的尺寸可用于孔。用于聚集细胞培养技术的孔尺寸可以是微米级(例如，1mm至50mm)。“微孔”一般具有微米级尺寸(例如<1mm)，并且其也可用来使细胞作为聚集体生长。孔可以类似于“AggrewellsTM”(由Stem Cell技术公司销售)，其提供排列在标准格式微板孔底部，且直径为400或800微米的倒锥体形状的几何结构。用于使细胞以聚集体来生长的另一种几何结构是具有“微空间细胞培养”的“Elplasia”微孔板[可乐丽(Kuraray)]，这些板具有允许细胞聚集的，排列在标准格式微孔板的孔底部的直径为200微米的方形微孔。本领域知晓制造用于以聚集体来培养细胞的微孔的各种参数、尺寸和方法(例如，如第2004/0125266号美国公开；第2012/0064627号美国公开；第2014/0227784号美国公开；WO2008/106771中所述；所述文献的全部内容通过引用纳入本文)。第6,348,999号美国专利描述了微起伏元件以及它们是如何构造的，但是除了它们是作为聚合物透镜阵列外并没有陈述这些构造的目的。第5,151,366号、第5,272,084号和第6,306,646号美国专利描述了具有各种微起伏图案类型的容器，这些微起伏图案类型用于增加细胞附着在基材上的表面积，并且描述了制造培养图案的方法。
一些商购的孔几何结构有利于形成细胞聚集体，但不一定有利于“限制”。当聚集的细胞不受限制时，它们通常会生长至周围环境所允许的幅度。(取决于细胞类型，)直径大于150至400微米的细胞聚集体可以形成坏死中心。坏死发生是因为例如细胞质量限制了营养物扩散到聚集体的中心并且限制了代谢废物离开聚集体中心。在一些实施方式中，为了产生限制，使用的微孔几何结构与最大所需细胞聚集体的尺寸在直径上极相似(例如，相差在20％、15％、10％、5％、2％、1％的范围内，或其中的合适范围内)，但是深度至少是直径的1至2倍(例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.52.6、2.6、2.8、3.0、3.5、4.0,或其中的合适范围)。在一些实施方式中，限制孔几何结构还允许通过灌注或手动移液来更换液体培养基，而无需将细胞从限制孔中取出来。
如上所述，在一些实施方式中，室包括不止一个用于引入流体的孔(例如进口端口)和不止一个用于移除流体的孔(例如出口端口)。例如，使用包含多个出口端口的单个(例如大型)进料室来向多个(例如更小的)培养室提供培养基。或者，单个培养室具有连接到多个进料室的进口端口，所述多个进料室包含不同的培养基组分。在这样的实施方式中，随着时间调节从各种进料室出发的流动速率，以改变培养室中的细胞所接收到的培养基组成。串联、并联或其组合形式的各个室的任何附接组合在本文的范围内。
在一些实施方式中，流体通过两个室共用的壁中的空间而在各室之间通过。在一些实施方式中，流体通过正好配合的孔或端口而在各室之间通过(例如，在一个室上的孔或端口与另一个室的孔或端口正好对齐)。在一些实施方式中，孔或端口包括促进孔或端口正好配合的结构(例如，阳性附接结构和阴性附接结构)。在一些实施方式中，使用连接器或接头来稳固两个端口的配合。例如，连接器或接头可以在第一端附接于第一端口(例如出口端口)，在第二端附接于第二端口(例如进口端口)，并且输送流体(例如将液体从第一室输送到第二室)。连接器或接头可以通过任何合适的机构连接或附接到孔或端口。在一些实施方式中，连接器或接头是可拆卸的(例如，特别是在集成或模块化系统中)。在一些实施方式中，使用连接器或接头永久地连接两个孔或端口。在一些实施方式中，连接器或接头附接于孔或端口，在其他实施方式中，连接器或接头延伸通过或穿过孔或端口。
在一些实施方式中，通过一个或多个阀调节通过孔或端口和/或在各室之间的液体流量。在一些实施方式中，使用者可以通过调节一个或多个阀来选择适当的流动速率。在一些实施方式中，阀位于孔或端口中/上，或者附接于孔或端口。在其他实施方式中，阀位于连接器或接头中/上，或者附接于连接器或接头。在本文的实施方式中可以使用任何合适的阀类型。例如，非限制性的阀类型包括：球阀、盘形阀、止回阀、节流阀、隔膜阀、截止阀、针阀等。
在关闭或开放系统中，可以使用单个阀来调节整个系统的流量(但是在关闭系统中使用不止一个阀也在本文的范围内)。在一些实施方式中，每个位于各室之间的转换点由阀调节。
在一些实施方式中，室仅为封闭体积而没有除孔、端口、通气口等之外的任何特定结构特征。在其他实施方式中，室包括针对于该室的目的(例如进料、培养、容纳废物等)和/或系统的所需用途的结构特征。
本文描述了使用多层细胞培养装置来培养细胞的方法。一种培养细胞的通常方法包括至少将第一细胞群和组织培养基加入到本文所述的任何多层细胞培养装置中。在一些方法(例如共培养方法)中，另外向所述装置加入第二细胞群。例如，可以向所述装置加入第一PBMC群和第二T细胞群，并且在所述装置中进行培养。又例如，可以向所述装置加入第一成纤维细胞群和第二形成球体的细胞(例如干细胞)群，并且在所述装置中进行培养。在这些实施方式中，通常向第一室添加第一细胞群和培养基，并且向第二室添加第二细胞群和培养基。
制造多层细胞培养装置的方法
本文所述的多层细胞培养装置可以通过任何合适的方法制造，包括注塑、吹塑、热成形等。可以使用本领域已知的任何合适方法组装本文所述的装置。这样的方法包括激光焊接、超声焊接、热结合等。构造材料可以为适于细胞培养容器的任何材料，包括，例如热塑性聚合物、热固性聚合物、玻璃等。
其他实施方式
可以对装置、系统和方法步骤中的部分或全部进行任何改进。所有本文引用的参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用纳入本文。本文提供的任何和所有的实例，或者示例性语言(如，“例如”)的使用旨在阐明装置、系统和方法，而不是对本发明的范围进行限制，另有声明的除外。本文中关于装置、系统和方法的性质或益处或者优选实施方式的性质或益处的任何陈述均不旨在限制作用，并且所附权利要求书不应被视为受到此类陈述的限制。更一般地，说明书中的所有语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实践所述装置、系统和方法是必不可少的。根据申请原则，装置、系统和方法包括所附权利要求书中所述主题的所有修改和等同形式。例如，虽然图1-8的装置包括第三室，但是第三室是任选的，并且本文所述的装置可以不包括第三室。例如，使用者可以将第三室增加到具有第一室和第二室的本文所述的装置中。在一些实施方式中，各室由刚性材料制成，而在其他实施方式中，它们由柔性材料制成，并且在其他实施方式中，它们由刚性材料和柔性材料的组合制成。各室可以是部分或完全不可渗透性的。而且，装置、系统和方法涵盖所有可能的变化形式中的上述要素的任意组合，除非另有说明或者上下文明确禁止。
Claims (48)
1.一种多层细胞培养装置，其包括：
-第一室，其被构造用于容纳流体并且包括用于引入流体或从第一室移除流体的至少第一孔；和
-位于第一室下方的第二室，所述第二室被构造用于容纳流体并且包括用于引入流体或从第二室移除流体的至少第一孔，第一室和第二室被构造成流体连接，以使第一室中的流体通过重力流动从第一室单向且连续地流动并进入到第二室中。
2.如权利要求1所述的多层细胞培养装置，其还包括第三室，所述第三室被构造用于容纳流体并且其位于第二室的下方，所述第三室包括用于引入流体或从第三室移除流体的至少第一孔，第二室和第三室被构造成流体连接，以使第二室中的流体通过重力流动从第二室单向且连续地流动并进入到第三室中。
3.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，各室通过包含管道的至少一个连接器流体连接。
4.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，各室通过至少一个连接器流体连接，并且至少一个流量调节器操作性地连接到所述至少一个连接器。
5.如权利要求4所述的多层细胞培养装置，其中，所述至少一个流量调节器为阀。
6.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，第二室包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔。
7.如权利要求6所述的多层细胞培养装置，其中，所述第二孔是被夹住、关闭、覆盖或密封的。
8.如权利要求6所述的多层细胞培养装置，其中，使第二孔各自操作性地连接到通气口。
9.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室为袋子，并且第一室和第二室通过包括管道的连接器流体连接。
10.如权利要求9所述的多层细胞培养装置，其中，使流量调节器操作性地连接到管道。
11.如权利要求6所述的多层细胞培养装置，其中，使第二室的第二孔操作性地连接到通气口。
12.如权利要求3所述的多层细胞培养装置，其中，第一盖覆盖用于引入流体或从第一室移除流体的所述至少第一孔，第一盖具有用于接收管道的第一端的至少第一接头，第二盖覆盖用于引入流体或从第二室移除流体的至少第一孔，第二盖具有用于接收管道的第二端的至少第一接头。
13.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室和第二室通过流体连接到第一室的套管和流体连接到第二室的至少第一隔膜而流体连接，对第一室和第二室进行定位，使得所述至少第一隔膜被所述套管穿透。
14.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室与第二室之间的表面具有设置在其中的孔，并且第一室与第二室通过设置在第一室与第二室之间的表面中的孔以及部分位于第一室的内部且延伸通过设置在第一室与第二室之间的表面中的孔的阀而流体连接。
15.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括第一端和第二端以及在该两端的一端处的倾斜的内表面，所述倾斜的内表面相对于该两端的另一端处的内表面倾斜，其中，所述倾斜的内表面和用于引入流体或从第一室移除流体的所述至少第一孔位于第一室的各相对端处。
16.如权利要求13所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括第一端和第二端以及在该两端的一端处的倾斜的内表面，所述倾斜的内表面相对于该两端的另一端处的内表面倾斜，其中，所述倾斜的内表面和套管位于第一室的各相对端处。
17.如权利要求14所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括第一端和第二端以及在该两端的一端处的倾斜的内表面，所述倾斜的内表面相对于该两端的另一端处的内表面倾斜，其中，所述倾斜的内表面和设置在第一室与第二室之间的表面中的孔位于第一室的各相对端处。
18.如权利要求12所述的多层细胞培养装置，其中，第一盖包括用于从第一室排出气体的第二接头，第二盖包括用于从第二室排出气体的第二接头。
19.如权利要求13所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，其被第一盖覆盖，第二室包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔，其被第二盖覆盖。
20.如权利要求14所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包括用于引入流体或从第一室移除流体的第二孔，其被第一盖覆盖，第二室包括用于引入流体或从第二室移除流体的第二孔，其被第二盖覆盖。
21.如权利要求19所述的多层细胞培养装置，其中，第一盖和第二盖中的至少一者包括用于从第一室和第二室中的至少一者排出气体的通气口。
22.如权利要求20所述的多层细胞培养装置，其中，第一盖和第二盖中的至少一者包括用于从第一室和第二室中的至少一者排出气体的通气口。
23.如权利要求12所述的多层细胞培养装置，其中，使流量调节器操作性地连接到管道。
24.如权利要求23所述的多层细胞培养装置，其中，所述流量调节器为阀。
25.如权利要求1所述的多层细胞培养装置，其中，第一室还包括细胞保留设备以用于防止第一室中的细胞进入第二室。
26.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第二室还包括细胞保留设备以用于防止第二室中的细胞进入第三室。
27.如权利要求25或权利要求26所述的多层细胞培养装置，其中，第一室包含培养基和第一细胞群，第二室包含培养基和第二细胞群。
28.如权利要求27所述的多层细胞培养装置，其中，第一细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)，第二细胞群包括T细胞。
29.如权利要求27所述的多层细胞培养装置，其中，第一细胞群包括成纤维细胞，第二细胞群包括干细胞。
30.如权利要求1、2、25和26中任一项所述的多层细胞培养装置，其中，第二室包括用于限制细胞进行球体细胞培养的孔。
31.如权利要求1、2、25和26中任一项所述的多层细胞培养装置，其中，第二室的至少一个内表面涂覆有一种材料，该材料防止细胞结合到该至少一个内表面。
32.如权利要求1、2、25和26中任一项所述的多层细胞培养装置，其中，第二室具有基本为平面的水平表面以用于支持贴壁依赖细胞的生长。
33.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室为进料室，第二室为培养室，第三室为废物室。
34.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室基本上平行于第二室。
35.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第二室基本上平行于第三室。
36.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室、第二室和第三室基本上彼此平行。
37.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，流体在两天或更多天的时间内通过重力流动单向且连续地流动。
38.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室和第二室中的至少一者包括通气口。
39.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室、第二室和第三室中的至少一者包括通气口。
40.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室和第二室为烧瓶。
41.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室、第二室和第三室为烧瓶。
42.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，所述装置通过选自下组的方法来制造或组装：注塑、吹塑、热成形、激光焊接、超声焊接、粘合剂结合和热结合。
43.如权利要求1或权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室和第二室集成在单个容器中。
44.如权利要求2所述的多层细胞培养装置，其中，第一室、第二室和第三室集成在单个容器中。
45.一种培养细胞的方法，所述方法包括：至少将第一细胞群和组织培养基加入到如权利要求1、2、25和26中任一项所述的多层细胞培养装置中。
46.一种培养细胞的方法，所述方法包括：将第一细胞群、第二细胞群和组织培养基加入到如权利要求1、2、25和26中任一项所述的多层细胞培养装置中。
47.如权利要求46所述的方法，其中，第一细胞群为PBMC，第二细胞群为T细胞。
48.如权利要求46所述的方法，其中，第一细胞群或第二细胞群为形成球体的细胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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