ES2955959T3

ES2955959T3 - Un sistema de biorreactor y método del mismo

Info

Publication number: ES2955959T3
Application number: ES16790728T
Authority: ES
Inventors: Ravindrakumar Dhirubhai Patel
Original assignee: Omnibrx Biotechnologies Private Ltd
Current assignee: Omnibrx Biotechnologies Private Ltd
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2016-10-04
Publication date: 2023-12-11
Anticipated expiration: 2036-10-04
Also published as: FI3430119T3; MY197074A; GB2563794B; AU2016397306A1; GB2563794A; CA3017434A1; BR112018068711A2; EP3430119A1; WO2017158611A1; JP6840219B2; AU2016397306B2; US20180187139A1; SG11201807903TA; CN109196086A; IL261716A; PL3430119T3; KR102641877B1; EP3430119B1; BR112018068711B1; DK3430119T3

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de biorreactor y su método en el que la matriz de soporte (2) comprende al menos un eje central y una pluralidad de ejes periféricos que rodean radialmente el eje central. Se montan conjuntos de discos (11) a lo largo del eje definiendo vecindades interespaciales entre dos placas sucesivas. Por lo tanto, los discos montados en ejes periféricos giran dentro de la vecindad interespacial de los discos del eje central para garantizar una mezcla suficiente y evitar zonas fluídicas estancadas que se crean cuando los discos se montan muy separados entre sí en ejes. Además, una pluralidad de paletas deflectoras que están dispuestas axialmente a lo largo del eje central para redirigir el flujo de fluido en dirección sustancialmente coaxial hacia el interior del recipiente de cultivo y más específicamente hacia el eje central. Por lo tanto, el sistema de biorreactor proporciona un biorreactor escalable y desechable con una mezcla eficiente y condiciones homogéneas y, por lo tanto, respalda el crecimiento y el mantenimiento de alta densidad de células y otro material biológico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un sistema de biorreactor y método del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de biorreactor para procesar, propagar, cultivar, atrapar o encapsular el material biológico, células, productos químicos o enzimas, y a un método para las operaciones de tal sistema de biorreactor.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de biorreactores se usan cada vez más para la síntesis del material biológico. Entre ellos, la industria biofarmacéutica suele emplear líneas celulares de mamíferos para producir diversas proteínas recombinantes para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Se necesitan cultivos celulares de alta densidad y a gran escala para satisfacer las crecientes demandas del mercado. Para mejorar la economía del producto, la optimización de las condiciones del cultivo celular para maximizar las densidades de células viables y prolongar la vida útil del cultivo para aumentar los títulos del producto final, se convirtieron en los objetivos más importantes en el desarrollo de procesos a gran escala. La presión actual en la producción biotecnológica es por mayor velocidad, menores costos y más flexibilidad. Lo ideal es que una unidad de producción sea compacta (requiere menos inversión) y modular. La demanda de proteínas terapéuticas que se derivan de cultivos celulares de mamíferos continúa en crecimiento a medida que se aprueban productos más nuevos. Algunos de los productos más nuevos, tales como los anticuerpos y las proteínas de unión a receptores, deben administrarse en dosis más altas y esto requiere la producción de cantidades mayores que en el caso de los productos anteriores. En consecuencia, existe una necesidad continua de aumentar la productividad de los biorreactores de cultivo celulares de mamíferos con una inversión mínima en equipos adicionales.

Las células de mamíferos son el sistema de expresión preferido para producir proteínas recombinantes para uso humano por su capacidad para expresar una amplia variedad de proteínas con un perfil de glicosilación que se asemeja al de la proteína humana natural.

La producción en biorreactores agitados es relativamente sencilla de ampliar, pero requiere grandes volúmenes de cultivo (es decir, 10-20 m3) para compensar las densidades celulares relativamente bajas que se alcanzan. Típicamente, la densidad celular en cultivo en suspensión está entre 106 y 107 células*ml-1. En comparación con el cultivo en lotes en tanques agitados, se obtienen densidades celulares casi 10 veces mayores (es decir, 107-108 células*mM) se puede lograr en cultivos de perfusión en los que el medio se perfunde a una velocidad adecuada en un cultivo de volumen constante y las células se retienen en el biorreactor por diversos medios.

Adaptar la tecnología de biorreactor de tanque agitado para el cultivo celular es un ejercicio inútil porque el diseño exhibe velocidades de cizallamiento locales intrínsecamente altas en las células suspendidas, lo que hace que la ampliación sea muy difícil y además el período de tiempo que se requiere para la adaptación de la suspensión y la selección del clon deseado es contable para el establecimiento y la economía del proceso. Con los biorreactores discontinuos, las células se cultivan mediante el uso de biorreactores llenos de medio y se cosechan en lotes después de (por ejemplo) 8 a 21 días. Por el contrario, los biorreactores de perfusión implican cultivo, alimentación y extracción (cosecha) continuos de medios gastados, generalmente durante períodos mucho más largos, incluso meses. Las células se mantienen dentro de este último ya sea uniéndolas para crecer en fibras capilares u otras membranas o retenidas en el biorreactor a través del uso de sistemas especiales de filtración o separación.

Dada la relativa fragilidad de muchas células en cultivo, el diseño del reactor se convierte en una cuestión importante para mejorar la economía del proceso. Entre los requisitos de las células animales hacia el ambiente del cultivo, el estrés de cizallamiento hidrodinámico es un aspecto importante a considerar y disminuir tanto como sea posible. Por otro lado, debe proporcionarse una mezcla suficiente, por ejemplo, mediante un agitador, para mantener condiciones homogéneas dentro del biorreactor y distribuir rápidamente alimentaciones tales como base, medio en procesos continuos o agente antiespumante.

La mayoría de las células que se derivan de vertebrados, con excepción de las líneas celulares hematopoyéticas y algunas otras, dependen del anclaje y deben cultivarse en un sustrato adecuado que específicamente se trata para permitir la adhesión y propagación celular (es decir, tratado con cultivo de tejidos). Sin embargo, muchas líneas celulares también pueden adaptarse para cultivos en suspensión. De manera similar, la mayoría de las líneas celulares de insectos disponibles comercialmente crecen bien en cultivos en monocapa o en suspensión. La eficiencia del sistema de cultivo celular dependiente del anclaje se basa en aumentar el área superficial disponible mediante el uso de placas, espirales, cerámicas y microportadores. El matraz Roux, la botella giratoria, la unidad de bandejas múltiples, el cartucho de fibra hueca sintética, el sistema de cultivo Opticell, la película plástica, los reactores de lecho de perlas, los cultivos con microportadores, etc., son los diversos recipientes de cultivo usados actualmente. Todos los recipientes de cultivo anteriores proporcionan un aumento del área superficial debido al diseño del recipiente y al uso de múltiples unidades.

Para producir grandes cantidades de células no dependientes del anclaje, las células generalmente se cultivan en suspensión en un medio líquido nutritivo que se agita para garantizar que cada célula esté adecuadamente bañada en nutrientes y que los desechos metabólicos se eliminen de la célula. Una determina fracción de las células se destruye por impacto con el impulsor o por un alto cizallamiento. La cosecha de células de cultivos en suspensión convencionales requiere equipos complementarios especiales, como centrífugas o filtros microporosos. Además, la concentración de células por centímetro cúbico de líquido nutritivo es relativamente baja.

Informes recientes de estudios de mercado sobre capacidad y producción de fabricación biofarmacéutica, que muestran que las compañías biofarmacéuticas aumentaron uniformemente sus presupuestos en esencialmente todas las áreas relacionadas con el bioprocesamiento. Los datos de la encuesta también indican que los profesionales de la industria se impacientan ante una aparente falta de innovación en los equipos de bioprocesamiento, especialmente en las ofertas de biorreactores, y que gran parte de la industria sigue sin estar al tanto de los avances recientes en los biorreactores de perfusión.

Debido a una alta densidad celular, la productividad de los sistemas de perfusión puede ser hasta 10 veces mayor que la productividad de un biorreactor discontinuo comparable. En otras palabras, un 2 m3 de cultivo de perfusión sería aproximadamente equivalente a 20 m3 de cultivo discontinuo. Las desventajas del cultivo de perfusión incluyen su complejidad y posible dificultad de ampliación. Por ejemplo, los dispositivos de retención celular a gran escala para células en suspensión aún no son del todo satisfactorios.

Se han desarrollado varios tipos de sistemas de cultivo celular para mejorar el crecimiento de las células. Más abajo se proporciona la lista de dichas patentes y las limitaciones asociadas a las mismas. La patente británica núm.

1,097,669 describe un propagador de cultivo de tejidos que comprende un recipiente para el medio de crecimiento y una serie de placas espaciadas dispuestas como una pila sobre una rejilla dentro del recipiente. La pila de placas permanece estacionaria dentro del recipiente y la circulación necesaria del medio de crecimiento dentro del recipiente se logra por medio de una bomba de elevación de aire. En uso, el recipiente se llena hasta el grado requerido con medio de crecimiento inoculado con las células que se desean cultivar, que se dejan asentar en la superficie de las placas y la circulación requerida dentro del recipiente se produce mediante una bomba de elevación de aire o mediante agitación magnética o vibratoria. Biotec AB, de Suecia, ha propuesto un aparato modificado de este tipo, cuyo aparato comprende una pila de discos que se montan sobre un eje axial giratorio dentro de un recipiente cilíndrico. En uso, este aparato se coloca primero verticalmente, es decir, con el eje axial en ángulo recto con respecto a la superficie de trabajo, el recipiente es rellenado con medio nutritivo, las células se colocan en placas sobre las superficies del disco y luego el aparato se coloca en una posición horizontal, se retira aproximadamente la mitad del medio nutritivo del recipiente y se gira el eje y la pila de discos de modo que sólo la sección inferior de los discos pase en un momento dado a través del medio de crecimiento que se encuentra en el recipiente.

En la patente británica núm. 1,393,654, se propone una modificación adicional del aparato Biotec en la que la relación entre el diámetro del disco y el diámetro interno del recipiente es de 0,80:1 a 0,90:1 y además se prefiere que la distancia entre el borde de los discos y la pared interna del recipiente mida de 1/2 a 3/4 de pulgada (de 1,27 a 1,905 cm). También se prefiere que la relación entre el área superficial total de los discos y el volumen del recipiente sea de 5,5:1 a 6,0:1. En vista de la naturaleza del funcionamiento de este aparato y del aparato de Biotec, la rotación del eje debe ser lenta para minimizar las fuerzas de cizallamiento producidas sobre las células a medida que los discos giran dentro y fuera del medio de crecimiento. Se han sugerido velocidades de rotación del orden de 0,5 rpm como máximo práctico para este aparato. Con frecuencia se usan velocidades más bajas.

Weiss y Schleicher en la patente de Estados Unidos US3407120A inventaron un método y un aparato para cultivar células vivas, el aparato que comprende una pluralidad de placas espaciadas sobre las que las células pueden unirse y proliferar y que se dispone dentro de un recipiente o contenedor tipo tanque que contiene medio nutritivo. Se proporcionan medios para mezclar y oxigenar el medio. Las células pueden cultivarse dentro del aparato al plantar el medio con las células que se desean cultivar y oxigenar y hacer circular el medio hasta que se forme una monocapa de células sustancialmente confluente sobre la superficie de las placas.

En la patente de los Estados Unidos US3933585A de William J. McAleer el objetivo principal era aumentar el rendimiento y reducir los costos de producción mediante el aumento de la relación entre el área superficial o el área de cultivo celular y el volumen del medio para obtener el mayor rendimiento de células y vacuna en el volumen más pequeño. Su invención fue un avance adicional de la máquina multiplaca que produjo Biotic AB de Suecia. La relación entre área superficial y volumen cercana a 3,0 cm2/ml se logró en el aparato de Biotec. William J. McAleer había descubierto inesperadamente que se obtenían aumentos significativos en el rendimiento de células y vacunas mediante el uso de un dispositivo que tiene una relación de área superficial a volumen de aproximadamente 1,7 cm2/ml a aproximadamente 2,2 cm2/ml. También descubrió que pueden obtenerse rendimientos de células y vacunas que eran significativamente mayores que los rendimientos de células y vacunas que se producen mediante el uso de cualquiera de los dispositivos antes mencionados mediante el uso de propagadores de placas múltiples que tienen una relación crítica entre el diámetro de la placa y el diámetro interno del tanque, o que tengan una distancia crítica entre la periferia de las placas y la pared interior del tanque. Esta relación de diámetro crítica puede ser de aproximadamente 0,80 a aproximadamente 0,90, preferentemente de aproximadamente 0,82 a aproximadamente 0,84 en comparación con 0,96 en la unidad Biotec. Revelaron un propagador que comprende un tanque cilíndrico de acero inoxidable que tiene bridas en cada extremo del mismo.

En el tipo de aparato giratorio descrito anteriormente, la necesidad de mover el aparato de la vertical a la horizontal es una verdadera desventaja cuando se consideran aparatos de gran escala. La circulación del medio de crecimiento mediante el uso de una bomba de elevación de aire no puede realizarse eficientemente sin una formación de espuma inaceptable en el medio que puede requerir la adición de agentes antiespumantes que pueden influir negativamente en el crecimiento y el metabolismo de las células del cultivo de tejidos. Las velocidades de rotación lentas necesarias hacen que la mezcla de los constituyentes del medio de crecimiento añadidos subsecuentemente y otros reactivos sean ineficientes y tampoco puede hacerse fiable la medición continua de las condiciones dentro del recipiente, porque una mezcla deficiente dicta que el contenido del recipiente no puede funcionar como un sistema homogéneo.

En la patente de Estados Unidos US4343904A, Birch y otros, describieron un sistema de biorreactor en el que se cultivan células animales en un recipiente cilíndrico que se dispone verticalmente que contiene una pila de discos separados paralelos inclinados al menos 5° con respecto a la horizontal y que se montan en un eje axial giratorio. El recipiente está cerrado por una placa superior que tiene una pluralidad de entradas y una placa en la parte inferior con una salida, y contiene un circuito de bombeo externo para hacer circular el contenido del recipiente desde la parte inferior hasta la parte superior del recipiente. El crecimiento de las células se lleva a cabo al llenar sustancialmente el recipiente con una mezcla de células animales y medio de crecimiento, que permite que las células se asienten en las superficies del disco y luego al girar el eje axial a una velocidad de al menos 5 rpm mientras se hace circular continuamente el contenido del recipiente desde la parte inferior hasta la parte superior del recipiente. Este proceso y aparato proporciona una mezcla eficiente y garantiza un sistema homogéneo dentro del recipiente.

La invención divulgada en la patente de EE.UU núm. US5168058A se refiere al material de embalaje para uso en el cultivo de células dependientes de anclaje, que requieren una superficie sólida para la proliferación. El material de empaque de la invención se proporciona en forma de unidades de material en lámina curvado, unidades individuales que generalmente tienen un grosor de aproximadamente 0,05 mm a 0,25 mm, al ser las otras dimensiones del orden de uno a unos pocos milímetros como máximo. Pueden usarse varias formas, como rectángulos retorcidos, segmentos de cilindros, cintas convulsionadas, formas retorcidas, etc.

El sistema de cultivo celular Zellwerk con biorreactores Z®RP, desarrollado por GlenMills Inc., son fáciles de ensamblar y manipular. Suelen funcionar en modo de perfusión y albergan grandes cantidades de células en volúmenes muy pequeños. La pieza central es un eje giratorio que se acopla magnéticamente que se monta con el portador de células o tejido de elección que expone las células al medio y se superponen alternativamente. En un biorreactor Z®RP se pueden instalar desde discos Sponceram® altamente poroso hasta estructuras de implantes y todo tipo de soportes, que da lugar a una amplia variedad de opciones de cultivo. En todas las configuraciones se garantiza la mejor aireación y alimentación posibles. El suave movimiento de rotación estimula que las células y los tejidos se adhieran y proliferen rápidamente sin verse afectados por fuerzas de cizallamiento. Las poblaciones de células permanecen viables y expresan grandes cantidades de matriz extracelular. El cultivo tridimensional de alta densidad puede extenderse a muchos meses sin disminución de la viabilidad o la productividad de expresión. La cosecha de células adherentes se logra fácilmente mediante el empleo de programas de rotación específicos en combinación con soluciones de separación.

En respuesta a la falta de sistemas adecuados de expansión y recuperación a gran escala para células adherentes, PALL Life Sciences (desarrollado originalmente por ATMI Life Science) desarrolló un nuevo biorreactor 2-D, el Biorreactor Integrity™ Xpansion™ multiplaca que contiene una serie de discos o placas apilados que se montan verticalmente uno encima del otro y los medios líquidos fluyen a través del espacio interno creado por los discos apilados en un recipiente cilíndrico. Debido a su gran área superficial y diseño de placas múltiples, el sistema permite la producción de grandes cantidades de células en un proceso que se adapta fácilmente a los métodos tradicionales de matraz T o bandejas apiladas. El biorreactor Xpansion se diseñó para permitir el crecimiento de células adherentes en las mismas condiciones y superficies que en los matraces T. Las células se adhieren y crecen sobre las placas de poliestireno apiladas. El % de OD y el pH se controlan mediante el equilibrio del medio con una fase gaseosa donde se controla la concentración de O2 y CO2. Los gases se difunden a través de la pared de un tubo de silicio muy fino colocado en la columna central. La circulación del medio se genera mediante una bomba centrífuga que controla el régimen de flujo para adaptarlo a los requisitos de tensión de cizallamiento apropiados.

Un sistema de biorreactor que puede proporcionar una productividad extremadamente alta dentro de un tamaño compacto son los biorreactores de lecho compacto (PBR). Los lechos compactos se han usado ampliamente para el cultivo de perfusión de células de mamíferos inmovilizadas. Esta invención se centra en las perspectivas de los PBR como una posible herramienta de producción preferida en el futuro para fabricar productos derivados de cultivos celulares. PALL Life Sciences (desarrollado originalmente por ATMI Life Science) ha desarrollado biorreactores de lecho compacto iCELLis. Un elemento central de la tecnología del biorreactor iCELLis es el uso de un lecho fijo compacto, rellenado con macroportadores personalizados. Esta matriz está hecha de microfibras de poliéster de grado médico y proporciona una gran área superficial disponible para el crecimiento celular.

Excepto el avance en el logro de densidades de células más altas y un aumento en la productividad a través de mejores condiciones de mezcla, la transferencia de masa eficiente y la escalabilidad industrialmente adecuada de los sistemas se mantienen como un problema parcialmente sin resolver.

Es fundamental reconocer y satisfacer las demandas especiales del cultivo celular in vitro y, por lo tanto, es esencial diseñar un dispositivo novedoso para satisfacer estas necesidades. Estas demandas incluyen sensibilidad al cizallamiento de las células animales que se cultivan, uso de aireación sin burbujas, velocidad de consumo de oxígeno relativamente pequeña y facilidad de operación con reducción de las posibilidades de contaminaciones u otros errores de manipulación manual.

Por lo tanto, se necesita desesperadamente inventar un dispositivo y un método que se adapte al crecimiento de alta densidad de células que se cultivan dentro de un volumen de cultivo pequeño con una distribución eficiente de nutrientes y oxígeno dentro del recipiente de cultivo sin dañar las células por el fluido o el cizallamiento de la pala del impulsor y las burbujas de gas.

El documento GB 2058 131 A describe un aparato propagador de células de placas múltiples que comprende un recipiente cilíndrico que se dispone verticalmente cerrado por las placas de la parte superior y la parte inferior, una pluralidad de entradas en la placa de la parte superior que se comunican con el interior del recipiente y al menos una salida desde la placa de la parte inferior. Además, en el recipiente se dispone una pila de discos paralelos separados, cuyos discos se montan fijamente con respecto a un eje giratorio que se dispone axialmente. Los discos están inclinados en un ángulo de al menos 5° con respecto a la horizontal y se proporcionan medios para girar el eje dentro del recipiente. Además, se proporcionan medios para hacer circular el contenido del recipiente desde la parte inferior hasta la parte superior del recipiente.

El documento WO 2011/097566 A1 describe un sistema de biorreactor para fabricar y extraer un biomaterial deseado de un microorganismo mediante la fermentación del microorganismo en el biorreactor. El sistema incluye un recipiente de reactor horizontal, uno o más discos verticales que se montan de manera giratoria alrededor de un eje hueco, un motor para darle energía el eje y una o más boquillas pulverizadoras que se disponen para pulverizar el líquido requerido sobre los discos.

El documento US 2002/076815 A1 describe un biorreactor para mejorar el rendimiento de biomasa mediante el uso de un recipiente estéril cerrado que tiene un medio, dicho reactor comprende un eje central, una matriz de soporte que se orienta horizontalmente y que divide el recipiente en una cámara superior e inferior. Además, se monta un medio para agitar en el eje central y se ubica a una distancia predeterminada de la matriz de soporte para generar un flujo volumétrico del medio dirigido tanto radial como axialmente. Finalmente, se proporcionan al menos dos rociadores semicirculares que se ubican en las cámaras superior e inferior del recipiente a una distancia predeterminada de la matriz de soporte.

Finalmente, el documento US 5045470 A describe un aparato para cultivo sumergido de células de tejido en el que se suministra gas al medio de cultivo en un contenedor vertical esterilizable a través de un eje hueco giratorio que tiene una pluralidad de conjuntos de placas que se extienden radialmente desde las cuales el gas se descarga solo a lo largo de las superficies superiores de las cuchillas dentro de una caja que se forma por placas difusoras huecas separadas verticalmente que se conectan por postes huecos a través de los que se suministra gas a las placas difusoras y se carga en el medio nutritivo a través de partes porosas de la placa.

Objeto de la invención

El objeto principal de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que proporcione un biorreactor escalable, preferentemente desechable, con la capacidad de proporcionar una mezcla eficiente y una suspensión homogénea y, de esta manera, soporte el crecimiento y el mantenimiento de células y material biológico a alta densidad.

Otro objeto de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que proporcione sensibilidad al cizallamiento mediante conciliación sin rociado de gas de células animales que se cultivan dentro del recipiente de cultivo, aireación sin burbujas, velocidad de absorción de oxígeno relativamente pequeña y facilidad de operación con reducción de las posibilidades de contaminaciones u otros errores de manipulación manual.

Otro objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que proporcione un recipiente de cultivo desechable, estéril y listo para usar para reducir el costo de mano de obra y el tiempo de producción.

Otro objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que sea de construcción simple y reduzca la complejidad mecánica y de instrumentación y sea comercialmente escalable.

Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que permitan el alojamiento de una gran cantidad de área superficial dentro del pequeño volumen de cultivo que mantenga al mismo tiempo una mezcla eficiente y una homogeneidad de nutrientes dentro del recipiente de cultivo. Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que proporcione monitoreo y control en línea de variables del proceso como pH, oxígeno disuelto, temperatura, etc. Puede ser factible el muestreo en línea para medir los nutrientes, los productos metabólicos y la adición de alimento. Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo en donde el medio nutritivo que contiene dentro el recipiente de cultivo pueda intercambiarse, tomarse muestras o modificarse con o sin interrumpir el movimiento de la matriz de soporte.

Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que se usa para producir uno o más compuestos químicos.

Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que se usa para tratar el efluente de aguas de desecho y para la remediación del tratamiento de desechos de fluidos industriales.

Un objeto más de la presente invención es para proporcionar un sistema de biorreactor y método del mismo que se usa para el tratamiento enzimático de una variedad de sustratos y compuestos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1.

Además, como se reivindicó en la reivindicación 24, la invención se refiere a un método para la operación de tal sistema de biorreactor.

Breve descripción de las figuras

Los objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con las figuras adjuntas la figura en donde:

La Figura 1a ilustra una vista en perspectiva del sistema de biorreactor con un recipiente de cultivo que se orienta horizontalmente de acuerdo la presente invención.

La Figura 1b muestra una representación esquemática del sistema de biorreactor que se muestra en la Figura 1a.

La Figura 2a ilustra una representación esquemática de un sistema de biorreactor con un recipiente de cultivo que se orienta verticalmente de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2b ilustra una representación esquemática de un sistema de biorreactor con un recipiente de cultivo que se orienta verticalmente y un circuito de recirculación con medios de intercambio de gases.

La Figura 3 ilustra una vista en sección del recipiente de cultivo que se ilustra en la Figura 1 con la matriz de soporte cargada en su interior de acuerdo con la presente invención.

La Figura 4a y 4b ilustran una vista detallada del soporte del bastidor de trabajo cargado dentro de la matriz de soporte de acuerdo con la presente invención.

La Figura 4c ilustra una vista en perspectiva del mecanismo de accionamiento del eje de acuerdo con la presente invención.

La Figura 5 ilustra un arreglo de discos cargados a lo largo del eje de acuerdo con la presente invención.

La Figura 6 ilustra un arreglo de ejes centrales y periféricos cargados con discos de acuerdo con la presente invención.

La Figura 7a y 7b ilustran un arreglo de paletas deflectoras en diferentes formas geométricas que rodean ejes centrales y periféricos dentro de la matriz de soporte de acuerdo con la presente invención.

La Figura 8a a la 8f ilustran un arreglo de ejes centrales y periféricos en diferentes geometrías dentro de la matriz de soporte de acuerdo con la presente invención.

La Figura 9 ilustra una vista en sección del recipiente de cultivo con puerto y conductos adicionales de acuerdo con la presente invención.

La Figura 10a y 10b ilustran una vista en sección detallada y una vista en perspectiva de una matriz de soporte que se orienta horizontalmente y un recipiente de cultivo con elementos sensores de acuerdo con la presente invención.

La Figura 11a y 11b ilustran una vista en sección y un arreglo geométrico de los discos que se cargarán en los ejes.

La Figura 12a, 12b, 12c y 12d ilustran el uso de portadores de células disponibles comercialmente en forma de discos de acuerdo con la presente invención.

La Figura 13 ilustra el patrón de rotación y las direcciones de rotación de los discos cargados en los ejes central y periférico de acuerdo con la presente invención.

La Figura 14a y 14b ilustran una vista detallada del arreglo de paletas deflectoras lineales y torcidas en la matriz de soporte de acuerdo con la presente invención.

La Figura 14c ilustra una vista en perspectiva de paletas deflectoras retorcidas con anillo de montaje del difusor y contiene paletas impulsoras.

La Figura 15a, 15b y 15c ilustran una vista detallada de un recipiente de cultivo que se orienta verticalmente con medios de rotación magnética para la rotación del eje que se ubican en la parte inferior y medios de rotación del difusor para la placa de montaje del difusor ubicada en la parte superior del recipiente del mismo de acuerdo con la presente invención.

La Figura 16a, 16b y 16c ilustran una vista detallada de un recipiente de cultivo que se orienta verticalmente con medios de rotación magnéticos para la rotación del eje que se ubican en la parte superior y medios de rotación del difusor para la placa de montaje del difusor que se ubica en la parte inferior del recipiente del mismo de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Antes de explicar la presente invención en detalle, debe entenderse que la invención no se limita en su aplicación a los detalles de la construcción y arreglo de las piezas que se ilustran en las figuras adjuntas. La invención puede realizar otras modalidades, como se representa en diferentes figuras como se describió anteriormente, y de practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente descripción tiene el propósito de descripción y no de limitación.

Además, también debe entenderse que la frase como se usa en la presente, "material biológico" significa, pero no se limita a, cualquier partícula(s), sustancia(s), extracto(s), mezcla y/o ensamblaje derivado de o correspondiente a uno o más organismos, células y/o virus. Será evidente para un experto en la técnica que las células que pueden cultivarse en un sistema de gestión celular automatizado comprenden uno o más tipos de células que incluyen, pero no se limitan a, células animales, células de insecto, células de mamífero, células humanas, células transgénicas, células genéticamente modificadas, células transformadas, líneas celulares, células vegetales, células dependientes de anclaje, células independientes de anclaje y otras células que pueden cultivarse in vitro como se conoce en la técnica. El material biológico también puede incluir componentes adicionales para facilitar el análisis, tales como fluido (por ejemplo, agua), tampón, nutrientes de cultivo, sal, otros reactivos, colorantes, etc. En consecuencia, el material biológico puede incluir una o más células que se disponen en un medio de cultivo y/u otro medio fluido adecuado. Como se usa en la presente la frase, "Discos o placas" describe, pero no se limita a, cualquier material con forma geométrica que puede proporcionar un área superficial para la unión, atrapamiento o encapsulación de partículas como, pero no se limita a, células, proteínas y otras sustancias bioquímicas y químicas.

Como se usa en la presente, la frase "desechable" significa, pero no se limita a, cualquier material adecuado para el proceso, una vez usado para el fin, esencialmente descartado y no reusado para el mismo u otro fin. Como se usa en la presente, el término "material desechable o película desechable" se refiere a películas poliméricas, que incluyen, por ejemplo, películas poliméricas multicapa y películas termoplásticas fabricadas mediante el uso de un proceso de extrusión de película y/o de formación de espuma, tal como un proceso de extrusión de película fundida o de película soplada. Para los fines de la presente invención, el término incluye películas no porosas, así como también películas microporosas o macroporosas. Las películas pueden ser permeable o impermeable a los vapores y funcionar como barreras para líquidos y/o barreras para gases en condiciones normales de uso. Como se usa en la presente, el término "polímeros" o "material polimérico" incluye, pero no se limita a, homopolímeros, copolímeros, tales como, por ejemplo, copolímeros en bloque, de injerto, aleatorios y alternos, terpolímeros, etcétera y mezclas y modificaciones de los mismos. Además, a menos que se limite específicamente de cualquier otra manera, el término "polímero" incluirá todas las configuraciones geométricas posibles del material. Estas configuraciones incluyen, pero no se limitan a, simetrías isotácticas, sindiotácticas y atácticas. Los polímeros usados en la presente invención pueden ser naturales, sintéticos, biocompatibles y/o biodegradables. El término "polímero natural" se refiere a cualquier polímero que se produzca de forma natural, por ejemplo, seda, materiales a base de colágeno, quitosano, ácido hialurónico y alginato. El término "polímero sintético" significa cualquier polímero que no se encuentra en la naturaleza, incluso si los polímeros están hechos de biomateriales naturales. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, poliésteres alifáticos, poli(aminoácidos), copoli(éteres), polialquilenos, oxalatos, poliamidas, policarbonatos derivados de tirosina, poli(iminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, poliamidoésteres, polioxaésteres que contienen grupos amino, poli(anhídridos), polifosfacenos y sus combinaciones. El término "polímero biocompatible" se refiere a cualquier polímero que, cuando entra en contacto con las células, tejidos o fluidos corporales de un organismo, no induce efectos adversos tales como reacciones y/o rechazos inmunológicos y similares. El término "polímero biodegradable" se refiere a cualquier polímero que pueda degradarse en el ambiente fisiológico tal como mediante proteasas. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen colágeno, fibrina, ácido hialurónico, ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), policaprolactona (PCL), polidioxanona (PDO), carbonato de trimetileno (TMC), polietilenglicol (PEG), alginato, quitosano o mezclas de los mismos.

El término "materiales adecuados" incluye, pero no se limita a, películas, polímeros, polímeros termoplásticos, homopolímeros, copolímeros, copolímeros en bloque, copolímeros de injerto, copolímeros aleatorios, copolímeros alternos, terpolímeros, polímeros de metaloceno, telas no tejidas, fibras unidas por hilado, fibras fusionadas por soplado, fibras de policelulosa, fibras de poliéster, fibras de poliuretano, fibras de poliolefina, fibras de poliamida, fibras de algodón, fibras de copoliéster, espuma de células abiertas, poliuretano, cloruro de polivinilo, polietileno, metales, aleaciones, fibra de vidrio, vidrio, plástico (por ejemplo, polietileno (PE), polipropileno (PP), cloruro de polivinilo (PVC), tereftalato de polietileno (PET), polieteretercetona (PEEK) y politetrafluoroetileno (PTFE) y polifluoroalcoxi (PFA) derivados de los mismos), caucho, y combinaciones o mezclas de los mismos. Los polímeros rígidos adecuados incluyen, pero no se limitan a; policarbonato y poliestireno aprobados por USP Clase VI. Los polímeros flexibles adecuados incluyen, pero no se limita a, polietileno de baja densidad y copolímero de etileno/acetato de vinilo.

Por "cultivo celular" o "cultivo" se entiende el mantenimiento de células en un ambiente artificial in vitro. Debe entenderse, sin embargo, que el término "cultivo celular" es un término genérico y puede usarse para abarcar el cultivo no sólo de células individuales, sino también de tejidos, órganos, sistemas de órganos u organismos completos, para los que los términos "cultivo de tejidos", "cultivo de órganos", "cultivo de sistemas de órganos" o "cultivo organotípico" pueden en ocasiones usarse indistintamente con el término "cultivo celular'.

Por "cultivo" se entiende el mantenimiento de células in vitro bajo condiciones que favorecen el crecimiento, la diferenciación o la continuación de la viabilidad, en un estado activo o en reposo, de las células. En este sentido, "cultivo" puede usarse indistintamente con "cultivo celular" o cualquiera de sus sinónimos descritos anteriormente. Las frases "medio nutritivo", "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" se refieren a una solución nutritiva para el cultivo de células y pueden usarse indistintamente.

La presente invención proporciona un sistema, método y aparato de biorreactor para la manipulación de material biológico y/o soportar el cultivo a gran escala de células biológicas, mediante la propagación, cultivo, atrapamiento o encapsulación de células o material biológico directamente en discos que se disponen en la matriz de soporte contenida dentro del recipiente de cultivo.

Ahora, como se muestra en la primera modalidad ilustrada en la Figura 1, el sistema de biorreactor para cultivar células biológicas de acuerdo con la presente invención comprende principalmente un recipiente de cultivo (1) que se orienta horizontalmente y se equipa con un puerto de entrada (1a) para introducir medio nutritivo (de cultivo) y/o células biológicas y un puerto de salida (1b) para descargar el medio nutritivo (de cultivo) del recipiente (1), una matriz de soporte que se dispone longitudinalmente (2) en donde tiene lugar el proceso de cultivo dentro del interior del recipiente de cultivo (1) (que se muestra en la Figura 1 (b)) y ambos extremos están fijados de manera que el medio nutritivo se introduce a través del puerto de entrada (1a) dentro del recipiente de cultivo y después de fluir a través de la matriz de soporte (2) se descarga a través del puerto de salida (1b) desde el recipiente de cultivo (1), un medio de bombeo de fluido (3) para impulsar el medio nutritivo a través del recipiente (1), un módulo de intercambio de gas (4) para disolver gases y retirar gases de desecho del medio nutritivo y un conducto principal (5) conecta de manera fluida y externa dicho puerto de entrada (1a) y el puerto de salida (1b) para formar un circuito externo cerrado (mostrado por la flecha A) para la circulación del medio nutritivo y que se extiende a través del módulo de intercambio de gas (4) y los medios de bombeo de fluido (3). El circuito de recirculación (A) incluye esencialmente tubos de silicio, uno o más depósitos de fluido, uno o más medios de bombeo, uno o más módulos de intercambio de gases (4) para la transferencia efectiva de masa de gases entre el fluido de recirculación (fluido nutritivo) y la fase gaseosa. Está dentro del alcance de la presente invención emplear indicador y regulador de presión, fuentes de energía cinética para la rotación de discos cargados dentro de la matriz de soporte y medios difusores, uno o más elementos sensores, medios de control de proceso, bomba de velocidad variable y/o bomba de velocidad fija (no mostrado) en el sistema de recirculación de fluido. El fluido nutriente se descarga a través del puerto de salida de fluido (1b) y pasa desde los medios de intercambio de gases (4) a través de los medios de bombeo de fluido (3) y luego se alimenta al recipiente de cultivo (1) a través del puerto de entrada (1a) para formar un circuito cerrado de circulación (A) a través del conducto principal (5). Dicho medio de intercambio de gases (4) puede transferir oxígeno al medio nutritivo y retirar el dióxido de carbono.

Preferentemente, pueden usarse tramos cortos de tubo de silicio como conducto principal (5) para conectar los componentes del circuito de recirculación y a la entrada y salida del recipiente de cultivo. Estos tubos permiten el paso libre del fluido desde dentro y transfieren el fluido de un componente a otro. Pueden usarse tubos de silicio de diversas longitudes y diámetros en dependencia de la escala de operación y la naturaleza de la aplicación del proceso de acuerdo con la presente invención.

En otra modalidad de la invención, como se muestra en la Figura 2a y 2b, el sistema de biorreactor comprende principalmente un recipiente de cultivo (1) que se orienta verticalmente y que comprende un puerto de entrada (1a), un puerto de salida (1b), una matriz de soporte (2) que se dispone longitudinal y sustancialmente verticalmente dentro del interior del recipiente de cultivo (1) y ambos extremos del cual están fijados de manera giratoria de manera que el fluido se introduce a través del puerto de entrada (1a) dentro del recipiente de cultivo y después del flujo a través de la matriz de soporte (2) se descarga a través del puerto de salida (1b) desde el recipiente de cultivo (1) para llenar parcialmente el recipiente para crear un espacio superior superpuesto, un medio de bombeo de fluido (3), un medio de intercambio de gases (4) y un conducto principal (5) que conecta de manera fluida y externa dicho puerto de entrada (1a) y puerto de salida (1b) para formar un circuito externo cerrado (mostrado por la flecha A) para la circulación del medio nutritivo y que se extiende a través del módulo de intercambio de gases (4) y los medios de bombeo de fluido (3).

Ahora, como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4a a 4c, la matriz de soporte (2) comprende esencialmente una armazón de soporte (6) que tiene un centro hueco (6a) y radios (6b) extendidos radialmente desde el centro hueco (6a) para formar una placa circular interior (6c) y radios (6d) que se extienden radialmente desde la placa circular (6c) para formar un bastidor de soporte del difusor (6e) que tiene una pluralidad de muescas, dicha armazón de soporte (6) se asegura de manera giratoria con la pared interna del recipiente (1) y se ubica cerca de un extremo de dicho recipiente (1), un marco de montaje de eje (7) que se monta preferentemente en el otro extremo de dicho recipiente (1) que tiene un centro hueco (7a) y radios (7b) que se extienden radialmente desde dicho centro hueco (7a) para definir la placa exterior circular (7c), una placa de montaje del difusor (8) con centro hueco (8a) que tiene un diámetro sustancialmente similar al marco de soporte (6) y se ubica de manera giratoria cerca del marco de montaje del eje (7), al menos un eje central giratorio (9) que se extiende axialmente desde el centro hueco del marco de soporte (6), el marco de montaje del eje (7) y la placa de montaje del difusor (8), una pluralidad de ejes periféricos giratorios (10) (mostrados mediante líneas punteadas) que se montan radial y paralelamente con respecto al eje del eje central (9), cada uno de dichos ejes periféricos (10) está anclado en ambos extremos entre la placa circular interior (6c) y la placa circular exterior (7c) de manera que dicha pluralidad de ejes periféricos (10) rodea radialmente el eje central (9), una pluralidad de discos separados (11) que se montan longitudinalmente a lo largo de dicho eje central (9) y cada eje periférico (10) (mostrado en la Figura 5 y 6). Dicha armazón de soporte (6) tiene una resistencia a la tracción adecuada y soporta la rotación sustancialmente con baja fricción de dichos ejes. Los extremos del eje central (9) se extienden más a través del centro hueco hacia el extremo aguas arriba y aguas abajo del recipiente de cultivo (1).

Cabe señalar que, en la modalidad preferida de la presente invención, el sistema de biorreactor incluye seis ejes periféricos (10) que se disponen coaxialmente alrededor del eje central (9). Sin embargo, está dentro del alcance de la invención que también se puedan montar más o menos ejes periféricos en diferentes arreglos geométricos, como se ilustra en la Figura 8.

Referencia continua con la Figura 3 y la Figura 4a, para mejorar las condiciones de mezcla dentro del recipiente de cultivo (1), dicha matriz de soporte (2) también comprende una pluralidad de paletas deflectoras (medios difusores) (12) que se extienden a lo largo de la longitud axial del recipiente de cultivo (1) rodeando radialmente los ejes periféricos (10). Un extremo de cada paleta deflectora (12) está moldeado en la placa de montaje del difusor (8) y el otro extremo de cada paleta (12) es recibido por sus muescas correspondientes del bastidor de soporte del difusor (6e) de la armazón de soporte (6) en el lado opuesto, de esta manera rodea sustancialmente la pluralidad de ejes periféricos (10). Las paletas deflectoras (12) preferentemente tienen un ángulo sustancialmente de aproximadamente 45° desde la superficie exterior pericéntrica del bastidor de soporte del difusor (8). La rotación de dicho eje central (9) y los ejes periféricos (10) hace que giren los discos (11) montados a lo largo de la longitud de los ejes de los mismos y que giren las paletas deflectoras de difusión (12). Está dentro del alcance de la presente invención que, en caso de que no haya ejes periféricos que se ubican rodeando el eje central (9), luego los discos del eje central (11) están rodeados directamente por una o más paletas deflectoras como medios difusores (como se muestra en la figura 8a).

El recipiente de cultivo (1) de acuerdo con la modalidad preferida tiene preferentemente la forma de un contenedor cilíndrico cerrado que encierra sustancialmente la matriz de soporte (2). Aunque se ilustra con una forma generalmente cilíndrica, la forma del recipiente de cultivo (1) no está tan limitada, ya que se pueden proporcionar como recipientes de diversas formas (por ejemplo, paralelepípedos). Esencialmente, el recipiente de cultivo de la presente invención sirve como cámara de cultivo, ya sea cilindrica, rectangular o de cualquier otra forma que pueda ser fácil de manipular. Mientras está en operación, el recipiente de cultivo puede orientarse preferentemente a lo largo del eje horizontal; sin embargo, las orientaciones verticales y otras orientaciones axiales pueden adaptarse mejor de acuerdo con las demandas del proceso, como se analiza más adelante. Aunque en determinadas modalidades, la matriz de soporte (2) está sustancialmente encerrada por el recipiente (1), sin embargo, está dentro del alcance de la presente invención recubrir parcialmente dicha matriz de soporte (2) por el recipiente de cultivo (1). Además, también está dentro del alcance de la presente invención utilizar la matriz de soporte (2) que no está recubierta o no contenida dentro del recipiente de cultivo (1).

El sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención preferentemente en formato desechable como biorreactores estériles de un solo uso fabricados a partir de materiales poliméricos adecuados, tales como fluoropolímeros, polipropileno de alta densidad (HDPE) y plásticos de poliestireno especialmente tratados. En determinadas modalidades, una o más partes del sistema biorreactor pueden estar hechas de vidrio, acero inoxidable y/u otro material biocompatible.

Además, el recipiente de cultivo (1) de acuerdo con la presente invención está fabricado preferentemente a partir de una gran variedad de materiales adecuados que pueden resistir técnicas de esterilización, que incluyen, pero no se limitan a, plástico, metal, vidrio, cerámica y similares. El diámetro y la longitud del recipiente de cultivo dependen de las condiciones y la escala del proceso. El recipiente de cultivo, la matriz de soporte y otras piezas de contacto con el cultivo de acuerdo con la presente invención se fabrican preferentemente a partir de materiales esterilizables y libres de pirógenos, para reducir los riesgos asociados con la contaminación cruzada.

En una modalidad preferida, un recipiente de cultivo desechable (1) se fabrica a partir de material plástico rígido que es sustancialmente o totalmente transparente para permitir la inspección visual del contenido del recipiente antes y después de su uso y para explorar las condiciones internas durante el proceso cuando el biorreactor en operación. Todas las uniones de válvulas y conductos están sellados y filtrados para mantener todo el recipiente hermético al aire/líquido y a prueba de fugas. Se sellan varios paneles del recipiente entre sí para formar costuras herméticas al aire y al agua mediante técnicas de sellado con película plástica mediante el uso de calor, alta frecuencia de radio u otras técnicas. Luego, los conectores, tubos, filtros y cierres se unen al recipiente para crear la barrera de esterilidad. A continuación, el recipiente ensamblado puede esterilizarse, por ejemplo, mediante exposición del recipiente de cultivo individual a irradiación gamma, preferentemente entre 25 y 50 K gray. Los materiales adecuados para la construcción del recipiente de cultivo desechable incluyen películas plásticas de múltiples capas o de una sola capa, incluidas películas hechas de polietileno o fluoruro de polivinilideno (PVDF) con el grosor deseado de acuerdo con la idoneidad del proceso. Alternativamente, el recipiente puede comprender un contenedor relativamente rígido que se forma, por ejemplo, mediante moldeo por inyección de un plástico adecuado, tal como polietileno tereftalato glicol (PETG) o policarbonato y que puede estar o no soportado por estructuras auxiliares.

En otra modalidad, el recipiente de cultivo (1) está hecho preferentemente de material plástico rígido multicapa y el lado interior de la pared del recipiente está construido con una membrana/material permeable a los gases o parches de tubos sellados dentro del cuerpo del recipiente y, de esta manera, se puede incorporar una fuente adicional de intercambio de gases y transferencia de masa cuando el biorreactor está en operación. La pared del recipiente de plástico desechable puede comprender una estructura laminada multicapa. Pueden laminarse juntas una pluralidad de capas de diferentes materiales para proporcionar una función deseada. Pueden incluirse una o más capas barreras para gases formadas de un material tal como alcohol etilenvinílico (EVOH). Pueden proporcionarse adhesivos de coextrusión entre diferentes capas de materiales. La selección del material se basa en obtener suficiente resistencia para que la pared del recipiente contenga el volumen de fluido y el contenido que se va a llenar dentro del recipiente de cultivo. Se pueden proporcionar uno o más espacios de aire que tengan regiones unidas o no unidas en una película rígida compuesta o multicapa. Los canales de espacio de aire creados/moldeados de esta manera dentro de la pared del recipiente se extienden a lo largo de la pared cilíndrica del recipiente que cubre la matriz de soporte. Estos canales de espacio de aire están conectados colectivamente a la entrada de gas para llevar gases como aire, oxígeno, dióxido de carbono, nitrógeno, etc. al biorreactor y a una salida de gas para retirar gases como el dióxido de carbono producido por los microorganismos o las células. El flujo de gases deseados desde los canales de espacio de aire de la pared del recipiente proporciona medios adicionales para la transferencia de masa entre el fluido dentro del recipiente de cultivo y los gases. Un laminado multicapa preferido incluye una capa exterior de poliamida, un primer adhesivo de coextrusión, una capa de polietileno o mezcla de polietileno/copolímero, una segunda capa de unión, una capa de EVOH (barrera de gas), una tercera capa de unión, otra capa de polietileno o mezcla de polietileno/copolímero, un espacio de aire y luego una capa de contacto interna que comprende polietileno permeable a los gases o una capa de mezcla de polietileno/copolímero que incluye membranas de silicio.

También de acuerdo con otra modalidad, el recipiente de cultivo (1) puede estar hecho de, pero no se limita a, vidrio o cualquier otro material biocompatible y químicamente no reactivo, como cerámica, acero inoxidable y similares. En caso de que el recipiente de cultivo se vaya a usar como recipiente no desechable, la matriz de soporte (2) puede ensamblarse en el lugar manualmente o con el uso de máquinas automatizadas. Preferentemente, una o más partes de la matriz de soporte pueden ser desechables. Después de encerrar la matriz de soporte y el ensamble del recipiente de cultivo, el sistema de biorreactor puede esterilizarse mediante cualquier método de esterilización adecuado, preferentemente esterilización con vapor. Alternativamente, la matriz de soporte encerrada dentro del recipiente de cultivo puede estar en un formato desechable preenvasado en donde la matriz de soporte con recubrimiento exterior flexible puede disponerse dentro de un recipiente de cultivo no desechable. En este caso, el recubrimiento exterior de la matriz de soporte sirve como barrera de aislamiento y está hecha de cualquier tipo adecuado de cualquier material elástico, estirable, plegable y/o flexible y el recipiente de cultivo sirve como un contenedor de soporte que puede fabricarse con un material adecuado.

Como se ilustra en las Figuras 2a y 2b, para obtener el movimiento de rotación, el eje central (9) está acoplado mecánicamente para recibir energía cinética de una fuente de energía cinética (19). Aquí, se emplean uno o más medios de rotación magnéticos (13) para la rotación del eje y uno o más medios de rotación magnéticos para la rotación de los medios difusores para recibir energía cinética de una fuente de energía cinética externa como se muestra en la Figura 2. Sin embargo, dicha fuente de energía cinética incluye, pero no se limita a, un sello mecánico con motor, uno o más servos, pistones, solenoides, actuadores lineales o rotativos y medios electromagnéticos o magnéticos externos, o similares. Para facilitar la rotación suave de los ejes cargados, se montan medios para reducir las fuerzas de fricción en forma de cojinetes (no mostrados) en la armazón de soporte (6) en la unión de los extremos del eje y la armazón (6).

Dicho medio de rotación magnética (13) comprende un imán interno (no mostrado) que está conectado fijamente a al menos un extremo del eje central giratorio como se muestra en la Figura 2 y 3. El imán interno gira mediante la fuerza magnética ejercida por un mecanismo magnético externo, preferentemente. Por tanto, se produce la rotación de un imán externo que, a su vez, hace que gire el imán interno y, de esta manera, el eje giratorio. Puede implantarse un medio de rotación magnético operado eléctricamente que recubra externamente la pequeña porción del recipiente para dar aceleración magnética al imán interno. Este medio de rotación magnética elimina el uso de sello mecánico y, de esta manera, ofrece un nivel adicional de seguridad contra fuentes de contaminación extrañas. En otra modalidad de medios de rotación, el eje central (9) está conectado directamente a un motor que se ubica fuera del biorreactor a través de un eje de motor. Un eje del motor invade la pared del recipiente mediante el uso de un dispositivo de sellado mecánico y se emplea un sistema de transmisión para conectar el eje central con el eje del motor. Pueden emplearse otros mecanismos o combinaciones de mecanismos según la idoneidad del proceso y la economía.

Ahora la Figura 5 muestra un arreglo de disco sobre el eje central (9) y el eje periférico (10). De acuerdo con la Figura 5, los discos (permeables) (11) se montan central y longitudinalmente en cada eje mediante el mantenimiento del espacio predeterminado entre dos discos sucesivos (11) a través de un separador (no mostrado) para definir un espacio interespacial (11a). Dicho separador que se dispone entre los discos mantiene una separación sustancialmente equidistante entre los discos (11). Preferentemente, los separadores pueden hacerse de un material similar al que se usa para la construcción de discos (11) o los separadores pueden hacerse de caucho de silicio. La relación entre el diámetro del separador y el diámetro del disco debe optimizarse de acuerdo con la escala del proceso. Adicionalmente, como se describe en la Figura 11 (b), pueden emplearse otros medios para soportar y separar los discos; por ejemplo, pero no se limitan a, que cada disco tiene una cresta o separador formado integralmente durante su construcción en la porción central. Esta cresta o separador se apoya luego sobre los separadores de los discos inmediatamente adyacentes a él. La presencia de separadores cilíndricos entre cada disco asegura esencialmente que los discos que se montan en un eje estén en estado de separación durante toda la operación. Para maximizar la capacidad de carga de los discos del biorreactor y lograr la compacidad deseada de la matriz de soporte, puede ajustarse la relación entre el diámetro de los discos cargados en el eje central y el diámetro de los discos cargados en los ejes periféricos. Preferentemente, el diámetro de los discos cargados en ejes centrales es mayor que el diámetro de los discos que se montan en ejes periféricos para maximizar el entremezclado de los discos y ocupar eficientemente el espacio interespacial que se crea entre los discos del eje central por los discos cargados en ejes periféricos.

La Figura 6 representa el arreglo del disco cargado sobre los ejes periféricos (10) y el eje central (11) dentro de la matriz de soporte (2). De la figura. 6, se ve que la porción de cada disco (11) cargado en cada eje periférico se extiende parcialmente hacia el espacio interespacial (11a) del disco cargado en el eje central (9).

Los discos (11) de acuerdo con la presente invención están construidos preferentemente a partir de, pero no se limitan a, un material fibroso no tejido. La Figura 11 ilustra la geometría de los discos o placas (11) que esencialmente proporcionan el sustrato necesario para la unión celular y el crecimiento posterior. La unión celular puede ocurrir en cualquier lado del disco, proporcionando de esta manera un área superficial muy grande para la unión y el crecimiento de células dentro de un espacio o volumen pequeño. Típicamente, se observa una delgada monocapa o película del crecimiento celular en las superficies del disco y generalmente tiene un grosor de unos pocos |jm, por ejemplo 1 jm, a aproximadamente 1 mm, es decir, 100 jm. En el caso donde las aplicaciones exijan un crecimiento en estructura o multicapa de células, los discos (11) se moldean en la forma deseada y las superficies pueden crearse tratándolas física, química o biológicamente.

En otra modalidad como se describió en la Figura 12a a 12d, pueden usarse portadores de células (20) disponibles comercialmente, por ejemplo, discos FibraCel y portadores BioNOC-II, en donde el material portador se colocó o llenó entre bastidores de discos moldeados permeables a los fluidos (21). Después del empaque de portadores de células comerciales de diversos tamaños y formas, los bastidores de disco pueden fijarse en el eje central y en los ejes periféricos.

La Figura 11 ilustra otra modalidad de la geometría para discos (11) construidos a partir de una masa no tejida porosa y fibrosa de material plástico, preferentemente fibras de poliéster con soporte de poliestireno o polipropileno y, alternativamente, las superficies de los discos pueden recubrirse con macro o microportadores. En este caso, puede usarse cualquier matriz plástica abierta a células. Debe tenerse cuidado en la formación de la matriz plástica de que sea suficientemente porosa no sólo para permitir el flujo del medio nutritivo líquido a través de sus intersticios, sino también lo suficientemente porosa para permitir el libre paso de las células. De cualquier otra manera, pueden surgir dificultades en la propagación celular homogénea y el posterior crecimiento de las células o en la cosecha de células. Los discos (11) pueden tener cualquier tamaño de los poros y geometría adecuados y, además, se modifican mediante la inclusión de diversas estructuras, tal como un recubrimiento de polímero o microperlas, en las superficies. Alternativamente, o adicionalmente, algunas o todas las superficies de los discos se modifican o tratan química o biológicamente, para mejorar la efectividad general del proceso. El tamaño de los poros del material del disco puede variar de acuerdo con la demanda del proceso. Sin embargo, pueden proporcionarse perforaciones. En una modalidad alternativa, se crean agujeros o aberturas en los discos para mejorar las condiciones de mezcla dentro de la matriz de soporte. El patrón, la forma, el tamaño y el diámetro de estos orificios aumentan la escala de la turbulencia al crear un patrón de flujo que evita el estancamiento del área no homogénea entre los discos apilados estrechamente.

Además, dicho recipiente de cultivo (1) de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente uno o más conductos para la entrada del material biológico que incluyen células, medios de cultivo y otros alimentos y al menos un conducto para eliminar metabolitos de desecho y medios gastados.

Ahora, de acuerdo con la Figura 9, adicionalmente, dicho recipiente de cultivo (1) se configura para recibir adición y salida de medio, un conducto, un conducto de adición de base, una línea de muestreo, una línea de adición de inóculo/siembra y una línea para adición de medio de alimentación de nutrientes y respiraderos como se muestra por los números (14). Aunque los conductos se muestran que se disponen en una posición particular en las paredes del recipiente de cultivo (1) en la Figura 9, pueden disponerse en cualquier ubicación que se desee en el recipiente que hará que el fluido entre y salga del recipiente de cultivo y, de esta manera, el sistema de cultivo reciba una distribución homogénea de nutrientes y gases para mejorar el crecimiento de los organismos que crecen en la superficie de la matriz de soporte (2). Dichos conductos están hechos de un material adecuado, preferentemente del material que se usa para la construcción del recipiente de cultivo (1).

El recipiente de cultivo (1) también comprende uno o más puertos para llenar, añadir, airear, agregar y/o drenar componentes para reducir la cantidad de contacto humano con los diversos componentes (que pueden ser peligrosos, peligrosos y/o infecciosos) que van a mezclarse como parte de y durante la mezcla de dichos componentes. Los puertos adecuados incluyen no exclusivamente cualquier accesorio sanitario a prueba de fugas conocido en la técnica, tal como accesorios de compresión, estándar en oro o de tipo sanitario. Las uniones adecuadas incluyen no exclusivamente tuberías, tubos, mangueras, conjuntos de juntas huecas y similares. Adicionalmente, el recipiente puede equiparse preferentemente con uno o más puertos de entrada para las entradas de materia prima del proceso (por ejemplo: tampones de pH, glucosa, etc.).

El sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención se equipa adecuadamente con uno o más elementos sensores, preferentemente sensores preinsertados y precalibrados para medir la temperatura, el oxígeno disuelto, el pH, el dióxido de carbono disuelto, los metabolitos y similares dentro del recipiente de cultivo (1). Estos sensores son sensores electroquímicos tradicionales y/o sensores ópticos desechables y precalibrados. El recipiente de cultivo (1) comprende de esta manera una o más aberturas para sonda (15) (véase las Figuras 9, 10a, 10b) para sensores para medir el pH y/o el oxígeno disuelto y similares. En la modalidad preferida, se usan una o más sondas de oxígeno disuelto y sondas de pH que se extienden hasta los intersticios del recipiente de cultivo. También se proporcionan uno o más puertos de ventilación con filtro de ventilación para el escape del aire inicialmente presente en el recipiente de cultivo en el momento de llenar y cosechar el recipiente de cultivo.

Además, para mantener un volumen de líquido sustancialmente fijo en el biorreactor, el sistema de cultivo puede incluir además una celda de carga para un mantenimiento preciso del equilibrio de masa y/o una salida de desbordamiento que puede tener la forma de una tubería que se extiende hacia afuera desde el recipiente de manera que la porción del contenido del recipiente pueda retirarse para mantener el nivel de líquido deseado. Es esencial mantener un volumen constante de medio o fluido nutritivo para un ambiente de estado estable y permitir los procesos de perfusión para el sistema del biorreactor.

Para maximizar la eficiencia del sistema biorreactor de acuerdo con la presente invención, es conveniente controlar estrictamente la temperatura del proceso. Esto se puede lograr de varias maneras, una de las cuales implica el uso de una o más mantas térmicas. Alternativamente, puede proporcionarse un sistema de camisa de agua como parte de la pared del recipiente de cultivo. La pared del recipiente incluye de esta manera una camisa de agua que rodea la longitud del recipiente y unos conductos de entrada y salida para regular la temperatura del flujo de fluido a través de la camisa de agua. Alternativamente, para mantener la temperatura deseada del sistema de cultivo, el recipiente puede mantenerse/ubicarse dentro del área de temperatura controlada como dentro de una sala de incubación.

En referencia a las Figuras 3, 6 y 13, el arreglo de los ejes periféricos (10) alrededor del eje central (9) de manera que los discos (11) del eje periférico (10) al girar, invaden el espacio creado entre los discos (11) del eje central (9). Como se explica en la Figura 13, cuando seis ejes periféricos (10) rodean el eje central (9), a la vez en un plano geométrico, los discos cargados en tres ejes periféricos alternos invaden el espacio interespacial que se crea entre dos discos sucesivos del eje central. La rotación interespacial de los discos periféricos (11) desde los alrededores o espacio entre los discos sucesivos (11) (espacio interespacial) del eje central (9) crea una trayectoria de flujo del material o fluido biológico que asegura una mezcla suficiente y evita el estancamiento de zonas fluidas que pueden crearse cuando los discos se montan muy separados entre sí en los ejes. El patrón de flujo de fluido producido por la rotación de los discos (11) desde los ejes central (9) y periférico (10) hace que el sistema de biorreactor sea más eficiente y capaz de soportar altas densidades de células que los otros sistemas de cultivo celular convencionales, ya que todos los sistemas descritos en la técnica anterior sufren el problema de la condición no homogénea dentro del lecho de matriz y se observa que obtienen una mezcla ineficiente para la distribución de nutrientes y la transferencia de masa.

Como se representa en las Figuras 3 y 4, en la presente invención, para conectar y girar los ejes periféricos (10) con la rotación del eje central (9), preferentemente, el mecanismo de transmisión del eje (16) se usa como un sistema de correa de distribución y polea o un sistema de transmisión por engranajes (como se ilustra en la Figura 4 (c)). En la modalidad preferida, se usa el sistema de polea y correa de distribución en donde la polea impulsora se sitúa fijamente en el eje central y las poleas conducidas se fijan en los ejes periféricos. Pueden usarse otros mecanismos de accionamiento, como el sistema de fricción, el sistema de espuelas, el sistema de cadena y de rueda dentada, para accionar los ejes periféricos (10) junto con el eje central (9). En los sistemas de transmisión de ejes que se emplean en este documento, la velocidad de rotación de los ejes periféricos con respecto al eje central puede cambiarse mediante la variación del diámetro de la polea o las placas de engranaje.

En otra modalidad de la invención, se usa una pluralidad de bastidores de montaje de ejes (7) para mantener los ejes periféricos estacionarios en su ubicación fija en la armazón. El mecanismo de accionamiento del eje (16) se instala entre la pluralidad de bastidores de montaje del eje (7). Además, otra armazón de soporte (6) se monta fijamente a la pared del recipiente en el extremo distal y opuesto del recipiente con relación a la armazón de soporte (6) instalada anteriormente.

El arreglo, el escalado y los parámetros geométricos para la distancia de los ejes periféricos (10) al eje central (9), el diámetro y grosor de los discos, el diámetro pericéntrico de las paletas deflectoras, etc, están dictados por la escala y las condiciones del proceso. Es evidente que, como se explica, uno o más ejes periféricos también pueden montarse en diferentes arreglos geométricos y los bordes de los discos se extienden hasta el área interespacial de los discos que se montan en el otro eje como se muestra en la Figura 8. Sin embargo, en otra modalidad, puede disponerse un eje en la matriz de soporte (2) que se rodea por medios difusores de rotación.

Como se ilustra en las Figuras 6, 7, 11 y 13, el flujo de fluido que se dirige hacia adentro por las paletas deflectoras radiales (12) incidirá sobre los discos (11) que se montan en los ejes. En caso de múltiples ejes que se montan en la matriz de soporte como se ilustra en la Figura 3, los discos (11) que se montan en los ejes periféricos (10) inciden primero por el flujo de fluido hacia adentro que se crea por las paletas deflectoras giratorias (12). Por lo tanto, los discos (11) en el eje central (9) reciben una corriente de fluido nueva y rica en nutrientes cuando los discos entremezclados (11) de los ejes periféricos (10) giran desde el espacio interespacial de los discos del eje central (11).

Como se ilustra en las Figuras 7, cabe señalar que el tamaño y la forma de las paletas deflectoras (12) pueden personalizarse para generar diferentes patrones de flujo, en dependencia de la aplicación deseada. Las paletas deflectoras pueden ser sustancialmente planas como se muestra en la Figura 7(a), para un flujo de fluido tangencial máximo en dirección hacia adentro, o curvado y/o en ángulo como se muestra en la Figura 7(b) para proporcionar un grado e intensidad adicionales de flujo hacia adentro. Cuando la placa de montaje del difusor (8) gira, el arrastre del fluido que se genera por la rotación de las paletas deflectoras (12) crea el flujo hacia adentro de fluido necesario para crear una condición homogénea dentro de la matriz de soporte. Este movimiento hacia adentro del fluido logra rápidamente un tiempo de mezcla significativamente menor cuando las paletas deflectoras (12) se tuercen hasta cierto punto y el anillo de montaje del difusor (8) se construye para contener las paletas impulsoras como se describe en la figura 14 (c), en recipientes que se orientan verticalmente, las paletas deflectoras (12) se montan en un anillo de montaje del difusor (8) que tiene paletas impulsoras dispuestas radialmente (22) para crear un flujo ascendente hacia la dirección axial del recipiente, de manera que las paletas impulsoras (22) dispuestas radialmente evitan el asentamiento del material biológico, células biológicas, restos y otras partículas que se suspenden en la parte inferior del recipiente debido a la fuerza gravitacional. La rotación de las paletas impulsoras (22) junto con las paletas deflectoras (12) puede mejorar significativamente las condiciones de mezcla dentro del recipiente de cultivo que se orienta verticalmente. La Figura 14 representa el arreglo recto de las paletas deflectoras (12) en medios difusores (que se muestran en la Figura 14(a)), el arreglo torcido de las paletas deflectoras (12) que se muestran en la Figura 14(b)) y medios difusores con paletas impulsoras (22) que se montan dentro de la placa de montaje del difusor (8) (que se muestra en la Figura 14 (c)). Estos arreglos garantizan que cada ubicación de la matriz de soporte sea sustancialmente equivalente con respecto a la distribución de nutrientes, de manera que el fluido rico en nutrientes fluye a través de las proximidades interespaciales de los discos y también asegura un intercambio suficiente de aire o gases dentro de la matriz de soporte.

Dentro del alcance de la presente invención se proporcionan paletas deflectoras (12) en forma de espiral sobre medios difusores que se cargan fijamente en el eje central (9) de manera que la energía de rotación para los medios difusores se obtenga del flujo de fluido que fluye de un extremo a otro extremo del recipiente (1) y la rotación de medios difusores provoca que los ejes central y periférico giren sin medios de rotación externos. Por lo tanto, sin emplear ningún medio de rotación, se opera el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención.

En la modalidad preferida, la rotación de los discos (11) y las paletas deflectoras giratorias (12) está acoplada mecánicamente para recibir energía cinética de una fuente de energía cinética. De esta manera, la rotación de los discos (11) y las paletas deflectoras (12) se controla simultáneamente. Cuando los imanes internos (no mostrados) se montan en un brazo magnético que se monta fijamente en el eje central, el imán exterior se acciona por medios mecánicos, es decir, correas de motor. El movimiento del accionamiento magnético externo mantiene los imanes internos en movimiento y, de esta manera, proporciona movimiento de rotación a los ejes, discos (11) y paletas deflectoras (12) simultáneamente a una velocidad controlada. Los medios de rotación que se analizan en la presente descripción también pueden incluir un mecanismo para monitorear la velocidad de rotación de los discos y paletas deflectoras.

En otra modalidad preferida, se usan medios de rotación magnéticos separados para los discos (11) y para las paletas deflectoras (12). Los medios de rotación magnéticos para la rotación de los discos se montan fijamente en el eje central y los medios de rotación para las paletas deflectoras se montan en la placa de montaje del difusor. En el caso donde se usen medios de rotación separados para la rotación del disco y la rotación del deflector, la velocidad de rotación de los discos y la rotación de las paletas deflectoras pueden controlarse y medir independientemente.

En la modalidad preferida de la presente invención que se muestra en las Figuras 1 y 2 debido a que los discos están igualmente separados, el flujo de medio de cultivo líquido sobre cada placa es sustancialmente uniforme en todo el yacimiento cuando los discos que contienen parte de la matriz de soporte están completamente llenos con un medio. El flujo uniforme a través del yacimiento puede demostrarse fácilmente mediante principios hidrostáticos y el flujo uniforme a través de todas las placas puede demostrarse empíricamente mediante experimentos de dispersión de tinte3.

En caso de usar en aplicaciones de ingeniería de tejidos, los materiales adecuados para la construcción de discos también pueden incluir, pero no se limitan a, esponjas vegetales naturales o esponjas animales. Pueden utilizarse esponjas sintéticas hechas de poliuretano u otros materiales sintéticos que cumplan los criterios anteriores. Tales tejidos fibrosos, que tienen un diámetro de fibra promedio en la escala micrométrica o nanométrica, se han usado para fabricar estructuras tridimensionales complejas para usarse en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Estos andamios 2D y/o 3D pueden usarse en la construcción de matriz de soporte.

Durante la operación, el medio nutritivo se llena en el recipiente a través del conducto de adición de medio. Después del acondicionamiento adecuado del medio nutritivo, el material biológico se añade dentro del recipiente (1). Luego, dichos ejes centrales (9) y ejes periféricos (10) y paletas deflectoras (12) se hacen girar a determinada velocidad de rotación para proporcionar energía cinética a través de los medios de rotación magnéticos (13). Los parámetros fisiológicos que se relacionan con el proceso se controlan luego con el uso de elementos sensores y conductos adicionales con medios de bombeo. Aquí, se debe señalar que puede hacerse que el eje central (10) y el eje periférico (11) y las paletas deflectoras (12) giren a diferentes velocidades mediante el empleo de medios de rotación separados. La rotación interespacial de los discos periféricos (11) desde el espacio interespacial (11a) entre los discos sucesivos (11) del eje central (9) crea un patrón de flujo de fluido del material o fluido biológico que asegura una mezcla suficiente y evita el estancamiento de las zonas fluídicas pueden crearse cuando los discos se montan muy separados entre sí en el eje. El patrón de flujo de fluido que se produce por la rotación de los discos (11) desde el eje central (9) y los ejes periféricos (10) hace que el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención sea más eficiente y pueda soportar altas densidades celulares que los otros sistemas de cultivo celular convencionales, ya que todos los sistemas descritos en la técnica con anterioridad sufren el problema de la condición no homogénea dentro del lecho de matriz y se observa que obtienen una mezcla ineficiente para la distribución de nutrientes y la transferencia de masa. Dicho patrón de arreglo de rotación de los discos asegura la ausencia de zonas fluídicas no homogéneas y estancadas en las vecindades interespaciales (espacio) (11a) entre cada disco. Además, tal arreglo de rotación del disco no solo contribuye a una mezcla altamente eficiente, sino que, como ventaja adicional importante, facilita el drenaje del contenido del recipiente al vaciarlo, decantarlo o cosecharlo. Normalmente el medio tiende a mantenerse entre las placas mediante acción capilar, pero se ha descubierto que cuando las placas se entremezclan y giran, mejora la eficiencia del drenaje. Para el procesamiento de perfusión, se drena continuamente la cantidad calculada de volumen de fluido y se añaden fluidos o medio nuevo rico en nutrientes en el recipiente para mantener un volumen de fluido constante y lograr un estado de equilibrio estable del proceso. Una vez que se produce la cantidad deseada de producto, el contenido del recipiente se decanta o se cosecha y se almacena para su posterior procesamiento.

Dentro del alcance de la presente invención se utiliza una herramienta vibratoria o sonda de sonicación insertada en la matriz de soporte a través de la pared del recipiente de cultivo para aplicar de manera efectiva un movimiento vibratorio a las superficies de la matriz de soporte para separar de esta manera las células biológicas adheridas a las superficies de los discos o el ingrediente activo o partículas que recubren la superficie de los discos de la matriz de soporte.

Por tanto, la mezcla eficiente del contenido del recipiente de acuerdo con la presente invención garantiza que se consiga y mantenga un sistema homogéneo dentro del recipiente. Esta mezcla eficiente da como resultado una distribución rápida y completa de los constituyentes que se añaden al contenido del recipiente y garantiza que se puedan tomar fácilmente mediciones continuas y confiables de la composición y otras condiciones del medio de crecimiento, como resultado, es posible un control preciso del proceso mediante instrumentación completa. La velocidad y el grado de mezclado dentro del recipiente dependen de una combinación de velocidad de rotación de la pila de discos y la provisión de medios de bombeo auxiliares. La mezcla también puede mejorarse adicionalmente al aumentar la velocidad de rotación de los medios difusores y ajustar el ángulo de las paletas curvas. La influencia y la interrelación de la velocidad de rotación de la pila de discos y el grado de bombeo auxiliar del contenido del recipiente se pueden demostrar mediante la inyección en el recipiente de cultivo de una cantidad de colorante, al girar la pila de discos, al efectuar el bombeo auxiliar y determinar el tiempo necesario para una dispersión del 95 % del tinte en todo el contenido del recipiente. El patrón óptimo (por ejemplo, tamaño, forma y frecuencia) de discos, paletas difusoras y ejes periféricos será una función del tamaño del reactor (escala), la velocidad, la viscosidad y la naturaleza de la plataforma celular y su medio de crecimiento optimizado asociado. El patrón particular que proporciona una condición de mezcla óptima puede determinarse mediante estudios de análisis de elementos finitos (www.fluent.com) o mediante experimentos empíricos. Estos estudios generalmente incluyen estudios de mezcla en función del tiempo o del número de ciclos de agitación.

Además, para que cada disco (11) pueda proporcionar la máxima superficie de crecimiento posible, el espacio entre cada placa y el espacio entre las periferias exteriores de los discos (11) cargados en los ejes periféricos (10) y la pared interna del recipiente de cultivo pueden optimizarse y se dicta por las condiciones y la escala del proceso.

Uno o más yacimientos para contener los fluidos de proceso o el medio nutritivo se conectan al sistema del circuito de recirculación, preferentemente, antes de la entrada del recipiente de cultivo.

Además, en la modalidad preferida, la invención también utiliza un medio para la recirculación del medio a través de un cuerpo conector de bombeo, tal como una bomba de paletas, una bomba de diafragma o una bomba peristáltica o cualquier otro medio para la creación de flujo. Dentro del alcance de la presente invención se proporciona un sistema de recirculación que tenga un componente de recirculación parcial para perfundir el sistema de biorreactor con nutrientes frescos.

Otra característica clave del sistema biorreactor de acuerdo con la presente invención es su capacidad de unirse en secuencia, mediante la conexión de la salida de un aparato biorreactor a la entrada del siguiente aparato biorreactor más grande. Este tamaño secuencial de biorreactores permite usar de biorreactores desechables para todo el tren de siembras, así como también para la etapa de producción.

Al ampliar desde unidades pequeñas a unidades grandes, el dispositivo de la presente invención es escalable directa o linealmente de manera que las velocidades de difusión de intercambio de gases se mantienen simplemente al aumentar o mediante la incorporación de más membranas de intercambio de gases o ajustes en el módulo de intercambio de gases o en la pared del recipiente de cultivo. El aumento de escala se logra manteniendo el grosor y la altura de la matriz de soporte y el tamaño correspondiente de la cámara de cultivo, y mediante la expansión de la matriz de soporte a un tamaño de producción útil. La relación de aspecto (altura frente a diámetro del recipiente) y el tamaño de la matriz de soporte con respecto al recipiente de cultivo pueden optimizarse y dependen del proceso. La escalabilidad lineal reduce el tiempo de desarrollo de fabricación, lo que reduce significativamente los costos de desarrollo y el tiempo de comercialización.

Las características u operaciones de las modalidades de la presente invención se realizan mediante componentes de hardware específicos, que contienen lógica cableada para realizar las operaciones, o mediante cualquier combinación de componentes de procesamiento de datos programados y componentes de hardware específicos. Las modalidades de la invención pueden implementarse con o incluir software, hardware de procesamiento de datos, métodos implementados en el sistema de procesamiento de datos y diversas operaciones de procesamiento como se describe en la presente descripción.

Ahora, en la Figura 15a, 15b y 15c se representa otra modalidad del sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención. En esta modalidad, como se detalla en la Figura 15 (a), un recipiente (1) y una matriz de soporte (2) se orientan en configuración vertical. Cabe señalar que todos los componentes y su función y el funcionamiento completo del sistema de biorreactor se realizarán de la misma manera que se describió en la modalidad anterior con referencia a la Figura 1 a 14. En dicha modalidad, el recipiente (1) se llena parcialmente con el medio nutritivo de manera que todos los discos (11) del eje se hunden y giran dentro del medio. Dicha configuración define un espacio superpuesto (23) en el recipiente (1) donde se ubican los mecanismos de accionamiento del eje (16) y desde allí dicho eje central (9) y ejes periféricos (10) se extienden hacia el medio. Aquí, el recipiente (1) está equipado con un puerto de entrada de gas adicional (14) para inyectar aire, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases en el espacio superpuesto (23) y de esta manera proporcionar medios adicionales para la transferencia de masa. Aquí, los medios de rotación magnéticos (13) para la rotación de los discos que se ubican en la parte inferior del recipiente y los medios giratorios para paletas deflectoras junto con el anillo de montaje del difusor (8) que se ubican en la parte superior del recipiente de cultivo, como se muestra en la Figura 15 (a). El medio se descarga a través de la salida (1b) y luego se alimenta al recipiente (1) a través de la entrada (1a) que fluye desde el intercambiador de gas a través de los medios de bombeo. En esta modalidad, los medios de rotación magnética de la parte inferior (13) para la rotación de los discos también incluyen bastidores impulsores para evitar la sedimentación de células y otros restos en la superficie de la parte inferior del recipiente de cultivo (1).

En otra modalidad de la presente invención, como se muestra en las Figuras 16a, 16b y 16c, dicho mecanismo de accionamiento del eje (16) y los medios de rotación magnéticos (13) se montan dentro del espacio superpuesto (23). Las paletas deflectoras (12) montadas en el anillo de montaje del difusor moldeado (8) de paletas impulsoras se montan de forma giratoria en la parte inferior del recipiente de cultivo para evitar la sedimentación de células y otros restos en la superficie inferior del recipiente de cultivo. Además, como se muestra en la Figura 16 (a), en dicha modalidad, las placas de engranaje se utilizan para la rotación de los ejes central (9) y periférico (10). Aquí, la placa de engranajes montada en el eje central (9) puede denominarse placa de engranajes central (17) y las placas de engranajes montadas en los ejes periféricos (10) pueden considerarse placas de engranajes periféricas (18). Los dientes de la placa de engranaje central (17) se reciben en el espacio entre los dientes de las placas de engranaje periféricas (19) de manera que la rotación de la placa de engranaje central (17) hace girar las placas de engranaje periféricas (19) (consulte Figura 4(c)). Durante la operación, la placa de engranaje central gira mediante dichos medios de rotación magnéticos (13), de esta manera giran las placas de engranaje periféricas y, por tanto, sus correspondientes ejes periféricos (10). La velocidad de rotación del eje central (9) y los ejes periféricos (10) puede variarse al cambiar el diámetro de los dientes de la placa de engranaje central y de las placas de engranaje periféricas. Dentro del alcance de la presente invención se adapta dicho mecanismo de eje impulsor en modalidades anteriores. En esta modalidad, el anillo de montaje (8) del deflector moldeado de paletas impulsoras de la parte inferior incluye paletas o bastidores impulsores para evitar la sedimentación de células y otros restos en la superficie inferior del recipiente de cultivo (1).

Cabe señalar que la presente invención descrita con referencia a las modalidades que se mencionan anteriormente es particularmente para el cultivo celular eficiente de diversas células biológicas. Sin embargo, el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención también puede usarse en diferentes tipos de campos como se describe más abajo.

Está dentro del alcance de la presente invención configurar el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención para el tratamiento enzimático de una variedad de sustratos. Las enzimas se han usado a lo largo de la historia de la humanidad y hoy en día sus aplicaciones desempeñan un papel considerable en el corazón de los procesos biotecnológicos. Un gran número de estos procesos biotecnológicos requieren una inmovilización enzimática exitosa en términos de resistencia a las fugas, retención de la actividad enzimática como almacenamiento a largo plazo y estabilidad operativa en condiciones ambientales adversas, accesibilidad a los sustratos, catálisis rápida y, en general, alta densidad de inmovilización enzimática y orientación adecuada. Entre los diferentes métodos de inmovilización, es de particular interés la encapsulación de enzimas dentro de una membrana semipermeable del huésped o el atrapamiento en una matriz de red tal como hidrogeles y otros materiales poliméricos en forma de partículas, cápsulas, fibras, etc. El uso de las técnicas de encapsulación de enzimas que se mencionan anteriormente para crear o fabricar discos hace que dicho sistema de biorreactor pueda realizar un tratamiento enzimático eficiente de una variedad de sustratos. Debido a la condición homogeneizada dentro de la matriz de soporte, los sustratos pueden convertirse en producto u otro intermediario mediante la construcción de dichos discos (11) de manera que las enzimas, proteínas catalíticas o sitios activos de estas proteínas estén recubiertas, incrustadas o encapsuladas en las superficies de los discos. En este proceso, el sistema biorreactor y su componente funcionan de la misma manera como se describió en las modalidades mencionadas anteriormente.

Dentro del alcance de la presente invención configurar el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención para lograr una variedad de conversiones o reacciones químicas o bioquímicas mediante la construcción de dichos discos (11) de manera que una variedad de compuestos químicos, orgánicos o inorgánicos o sus grupos funcionales o activos Los sitios están recubiertos, incrustados o encapsulados en la superficie de los discos (11).

Además, para configurar el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención para el tratamiento de corrientes de efluentes y para una variedad de procesos de biorremediación, se construyen discos de gran tamaño a partir de material adecuado para soportar el crecimiento de microorganismos en las superficies para permitir el uso de un recipiente (1) de manera similar a contactores biológicos giratorios. La matriz de soporte (2) puede cubrirse parcial o sustancialmente por un recipiente y el reactor puede operar en condiciones ambientales abiertas. La duración y la eficiencia del proceso pueden mejorarse cuando el crecimiento excesivo de microbios en las superficies de los discos disminuye o se elimina cuando los discos (11) se giran entremezclados y los discos periféricos se giran cubriendo sustancialmente parcialmente el área interespacial entre los discos cargados en el eje central como se analizó anteriormente.

Además, el sistema de biorreactor de acuerdo con la presente invención también se configura para utilizarse como biofiltro o filtro químico que puede usarse para tratar o limpiar una variedad de mezclas gaseosas según los requisitos del proceso. Para ello, los discos están recubiertos con sustancias químicas, bioquímicas u organismos vivos y el fluido que fluye desde el puerto de entrada del recipiente (1) está en forma gaseosa y contiene gases residuales industriales u otras sustancias volátiles esenciales para eliminar de las mezclas de gases de entrada.

La presente invención se experimenta e ilustra con más detalle en el siguiente ejemplo. El ejemplo describe y demuestra modalidades dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1:

El experimento para medir los tiempos de mezclado para la agitación homogénea del material biológico se realizó en el recipiente rellenado con 1 L de medio de cultivo en el que se introdujeron agregados de células. Para ello, la relación altura/diámetro de dicho recipiente de cultivo se mantuvo en 1,80, el diámetro de cada disco se mantuvo preferentemente en 38 mm, el diámetro pericéntrico del eje periférico fue preferentemente de 50 mm, el diámetro pericéntrico de las paletas curvas fue de 85 mm y el ángulo de paletas curvas se mantuvo preferentemente a 40°. De acuerdo con las velocidades de rotación de las paletas y los discos de los ejes, se tomaron las siguientes lecturas en forma de tiempos de mezcla que representan una mezcla adecuada de los componentes en el recipiente. La técnica de decoloración del colorante es el método más simple y se usa principalmente para medir el tiempo de mezcla. Se realiza al añadir ácido (o base) a la solución a granel con uno o más indicadores de pH. La decoloración puede examinarse mediante observación visual. La evaluación del tiempo de mezcla es a menudo subjetiva debido a la observación visual a simple vista o imágenes de vídeo. El tiempo de mezcla se define como el intervalo de tiempo entre la adición de la fase dispersa y la desaparición de la última traza de color.

Ejemplo 2:

En otro experimento, dicho recipiente se rellenó con 10 L de medio de cultivo. Para ello, la relación altura/diámetro de dicho recipiente de cultivo se mantuvo en 1,85, el diámetro de cada disco se mantuvo preferentemente en 70 mm, el diámetro pericéntrico del eje periférico fue preferentemente de 96 mm, el diámetro pericéntrico de las paletas curvas fue de 178 mm y el ángulo de paletas curvas se mantuvo preferentemente a 40°. El procedimiento para medir los tiempos de mezcla para una mezcla adecuada se llevó a cabo de la misma manera como se describió en el ejemplo anterior al cambiar la velocidad de rotación de las paletas y discos y el flujo de recirculación del medio. Se obtuvieron los siguientes resultados.

Ejemplo 3:

El cultivo de células se llevó a cabo en un recipiente relleno con 100 L de medio de cultivo y se registraron los siguientes resultados. Para ello, la relación altura/diámetro de dicho recipiente de cultivo se mantuvo en 2,00, el diámetro de cada disco se mantuvo preferentemente en 160 mm, el diámetro pericéntrico del eje periférico fue preferentemente de 195 mm, el diámetro pericéntrico de las paletas curvas fue de 380 mm y el ángulo de paletas curvas se mantuvo preferentemente a 40°.

Observación:

A partir de los resultados antes mencionados, se observó que al aumentar las RPM de las paletas y el disco y el flujo de recirculación del medio en el conducto, los tiempos de mezclado se redujeron sustancialmente. Por tanto, mediante el uso de velocidades de rotación óptimas con el presente aparato simplifica enormemente el procedimiento para cultivar células en continuo y a gran escala. Dentro del alcance de la presente invención se mejora la mezcla al cambiar otros parámetros como la dimensión del recipiente, el ángulo de las paletas, etc.

Todos los métodos y aparatos que se describen y reivindican pueden realizarse y ejecutarse sin una experimentación excesiva a la luz de la presente descripción.

Lista numeral de referencia:

Recipiente de cultivo (1)

Puerto de entrada (1a)

Puerto de salida (1b)

Matriz de soporte (2)

Medios de bombeo (3)

Medios de intercambio de gases (4)

Conducto principal (5)

Circuito de recirculación (A)

Armazón de soporte (6)

Centro hueco (6a, 7a)

Radios (6b, 6d, 7b)

Placa circular interior (6c)

Bastidor de soporte del difusor (6e)

Bastidor de montaje del eje periférico (7)

Placa de montaje del difusor (8)

Eje central (9)

Eje periférico (10)

Disco (11)

Espacio interespacial (11a)

Paletas deflectoras (12)

Medios de rotación magnética (13)

Conductos (14)

Sensores (15)

Mecanismo de transmisión del eje (16)

Placa de engranaje central (17)

Placa de engranaje periférico (18)

Medios de energía cinética (19)

Portadores de células comerciales (20)

Bastidor de disco moldeado permeable a los fluidos (21)

Paletas impulsoras (22)

Espacio superpuesto (23)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de biorreactor para procesar, propagar, cultivar, atrapar o encapsular el material biológico, células, productos químicos o enzimas y que comprende:

al menos un recipiente de cultivo (1) en donde tiene lugar el proceso para cultivar células que se dispone para contener un medio fluido que tiene un puerto de entrada (1a) y un puerto de salida (1b) y contener al menos un conducto de entrada/salida de fluido (14) para el fin de suministrar fluido en el mismo y descargar fluido del mismo después de la terminación del proceso de cultivo para mantener el estado metabólico deseado del proceso de cultivo, que incluye el conducto de inoculación y el conducto de muestreo y contiene al menos un elemento sensor (15) para temperatura, presión, pH, oxígeno, dióxido de carbono y otros metabolitos importantes a medir y controlar durante el proceso, al menos un depósito de fluido para proporcionar una fuente de fluido de acuerdo con las necesidades del proceso, al menos un sistema de control de proceso para monitorear y controlar los parámetros del proceso durante el proceso de cultivo, una o más fuentes de energía cinética (19) para la rotación de ejes y medios difusores a través de los medios de rotación (13), uno o más elementos sensores de peso para una medición precisa del contenido de fluido y el volumen de fluido en el recipiente de cultivo del biorreactor (1), el recipiente de cultivo (1) está equipado con al menos un conducto de suministro de gases y un conducto de escape de gases o respiradero (reivindicación 6);

Al menos una matriz de soporte (2) construida a partir del material adecuado y contenida dentro del recipiente de cultivo (1), en donde dicha matriz de soporte (2) comprende al menos un eje central giratorio (9) que se extiende central y longitudinalmente dentro del recipiente (1), al menos un anillo de armazón de soporte (6) para ubicar de manera giratoria el eje central (9), al menos un bastidor de montaje de eje (6c), uno o más ejes periféricos giratorios (10) extendidos radial y paralelamente dentro del recipiente de cultivo (1) con respecto al eje central (9), una pluralidad de discos (11) separados apilados cargados central y longitudinalmente en el eje central (9) y los ejes periféricos (10) para proporcionar un sustrato para la unión celular y el crecimiento celular, una separador que se ubica entre dos discos sucesivos (11) para definir el espacio interespacial (11a), uno o más medios difusores para crear un flujo de fluido radial para mejorar la condición de mezcla dentro del recipiente (1) y preferentemente consisten en una o más paletas deflectoras giratorias (12) extendidas a lo largo de la longitud axial del recipiente de cultivo (1) para rodear radial y paralelamente los discos (11) cargados en los ejes central (9) y periférico (10) y que se montan en el anillo de montaje del difusor (8), uno o más medios de rotación (13) para la rotación del eje central (9), ejes periféricos (10) y medios difusores y un mecanismo de accionamiento del eje (16) para soportar una rotación suave del eje central (9) y los ejes periféricos (10); en donde los discos (11) cargados en los ejes periféricos (9) se extienden de manera parcial y giratoria hacia el espacio interespacial (11a) entre los discos cargados en el eje central (9), de esta manera invaden el espacio interespacial;

al menos un conducto de circuito de recirculación (5) que se conecta externa y fluídicamente entre dicho puerto de entrada (1a) y el puerto de salida (1b) para soportar la transferencia aséptica de fluidos hacia y desde el recipiente de cultivo (1) para crear un circuito de recirculación (A);

al menos un medio de bombeo de fluido (3) para crear el flujo de fluido deseado a través del circuito de recirculación (A) para el funcionamiento deseado del proceso instalado en el conducto del circuito de recirculación (5) y los medios de bombeo para transferir los fluidos, incluidos medios, alimentaciones, tampones y otras necesidades del proceso.

al menos un medio de intercambio de gases (4) instalado en el conducto del circuito de recirculación (5) para la transferencia eficiente de masa de fluidos de una fase a otra fase durante la circulación del fluido a través del circuito de recirculación (A).

2. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los discos (11) se construyen a partir de material poroso o fibroso para proporcionar un área superficial significativamente mayor y para soportar cultivos de células y tejidos en 2D o 3D.

3. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los discos (11) se construyen mediante el empaque de portadores de cultivo celular disponibles comercialmente u otros portadores de células de formas diferentes en contenedores con forma de discos.

4. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el disco (11) cargado en el eje central (9) está rodeado directamente por una o más paletas deflectoras (12) como paletas difusoras cuando no se ubican ejes periféricos alrededor del eje central (9).

5. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde más de seis ejes periféricos (10) se ubican alrededor del eje central (9) en diferentes diámetros pericéntricos sucesivos, de esta manera los discos cargados en tres ejes periféricos alternativos ocupan parcial y sustancialmente el espacio interespacial creado entre dos discos sucesivos cargados en el eje central (9) y los discos de los ejes periféricos más externos (10) invaden parcialmente el espacio interespacial (11a) entre los discos sucesivos de los ejes periféricos del círculo interno.

6. El sistema de biorreactor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la forma de las paletas deflectoras (12) es sustancialmente plana, para un flujo de fluido tangencial máximo.

7. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la forma de las paletas deflectoras es curva, retorcida y/o en ángulo, para proporcionar un flujo radial y axial adicional.

8. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los medios difusores se cargan fijamente en el eje central (9) y toman la energía de rotación de la rotación del eje central (9) y viceversa.

9. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los medios difusores se cargan de manera giratoria en el eje central (9) y obtienen la energía de rotación de los medios de rotación que se montan en los medios deflectores, de esta manera la velocidad de rotación de las paletas deflectoras (12) cargadas en el anillo de soporte del difusor (8) se controla de forma selectiva e independientemente de la rotación de los ejes.

10. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los medios difusores se cargan en el extremo aguas arriba del recipiente (1) de manera que las paletas deflectoras (12) se elevan radialmente desde el extremo aguas arriba hasta el extremo aguas abajo y rodean la matriz de soporte (2).

11. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde los medios difusores se cargan en el extremo aguas abajo del recipiente (1) de manera que las paletas deflectoras (12) se elevan radialmente desde el extremo aguas abajo hasta el extremo aguas arriba y rodean la matriz de soporte (2).

12. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde las paletas deflectoras (12) en los medios difusores tienen forma de espiral y se cargan fijamente en el eje central (9) de manera que la energía de rotación para los medios difusores se obtiene del flujo de fluido que fluye de un extremo al otro del recipiente (1) y la rotación de los medios difusores hace que los ejes central y periférico giren sin medios de rotación externos.

13. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la pared del recipiente de cultivo (1) se construye para acomodar los medios de intercambio de gases para una transferencia de masa directa y rápida entre fluidos que incluyen los gases oxígeno y dióxido de carbono.

14. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 13, en donde dichos medios de intercambio de gases incluyen un tubo de silicio permeable a los gases y/o membranas permeables a los gases.

15. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el recipiente de cultivo (1) se construye a partir de material no desechable y aloja una matriz de soporte desechable.

16. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el recipiente de cultivo (1) se construye a partir de material no desechable y aloja componentes de matriz de soporte no desechables.

17. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde uno o más componentes del sistema de biorreactor se construyen a partir de material polimérico adecuado, estable a la radiación gamma, de manera que el biorreactor se usa preesterilizado y como un sistema desechable de un solo uso.

18. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde uno o más componentes del sistema de biorreactor se construyen a partir de un material polimérico adecuado, estable a la esterilización por vapor, de manera que el biorreactor se usa después de la esterilización por vapor y como un sistema desechable de un solo uso.

19. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el recipiente de cultivo (1) se coloca sustancialmente horizontal mientras está en uso y durante la operación.

20. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el recipiente de cultivo (1) se coloca sustancialmente vertical mientras está en uso y durante la operación.

21. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el recipiente de cultivo (1) se coloca sustancialmente en ángulo o inclinado hasta determinado grado de acuerdo con las necesidades del proceso mientras está en uso y durante la operación.

22. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde dos o más recipientes de cultivo (1) se disponen en paralelo o en serie a lo largo de la trayectoria del fluido.

23. El sistema de biorreactor como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde se inserta una herramienta vibratoria o una sonda de sonicación en la matriz de soporte (2) a través de la pared del recipiente de cultivo para aplicar de manera efectiva un movimiento vibratorio a las superficies de la matriz de soporte (2) para separar de esta manera las células biológicas adheridas a las superficies de los discos o ingrediente activo o partículas que recubren la superficie de los discos de la matriz de soporte (11).

24. Un método para operar un sistema de biorreactor de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-23 para el cultivo de células biológicas que comprende las siguientes etapas;

A. añadir una cantidad de fluido (medio de cultivo) a un recipiente de cultivo (1);

B. añadir materiales al medio de cultivo para promover el crecimiento de las células biológicas;

C. iniciar el suministro de gas mediante el mecanismo de intercambio de gas (4) para una transferencia de masa eficiente de los gases del proceso hacia y desde el medio de cultivo;

D. añadir la cantidad deseada de células biológicas al recipiente (1) para sembrar el proceso de cultivo; E. iniciar el proceso de cultivo mediante la aplicación de una fuente de energía cinética a los medios de rotación (13) cargados en la matriz de soporte (2) para la rotación del eje y para la rotación de los medios difusores;

F. medir y controlar los parámetros de cultivo a un nivel óptimo mediante el uso de elementos sensores (15), medios de control de proceso, medios de bombeo y conductos que se proporcionan para la adición de fluidos de proceso a velocidad controlada;

G. recolectar parcialmente la corriente de producto (fluido) a una velocidad controlada desde el recipiente (1) a través del conducto de salida de fluido y añadir medio o fluidos frescos ricos en nutrientes a una velocidad controlada para mantener un volumen de fluido constante y lograr una operación en estado estable del proceso en modo perfusión de bioprocesamiento;

H. iniciar la cosecha del recipiente del biorreactor (1) cuando se produce la cantidad deseada de producto.

25. El método como se reivindicó en la reivindicación 24, en donde el material biológico, enzimas, proteínas catalíticas o sitios activos de proteínas recubren, se incrustan o se encapsulan en las superficies de dichos discos (11) y se realizan las etapas de la A a la H.

26. El método como se reivindicó en la reivindicación 24, en donde compuestos químicos, orgánicos o inorgánicos o sus grupos funcionales o sitios activos recubren, se incrustan o se encapsulan sobre las superficies de dichos discos (11) y se realizan las etapas de la A a la H.

27. El método como se reivindicó en la reivindicación 24, en donde se construyen discos de gran tamaño (11) a partir de material adecuado para soportar el crecimiento de microorganismos en las superficies para permitir el uso de un sistema de biorreactor para el tratamiento de corrientes de efluentes y para una variedad de procesos de biorremediación y se realizan las etapas de la A a la H.

28. El método como se reivindicó en la reivindicación 24, en donde se recubren dichos discos (11) con sustancias químicas, bioquímicas u organismos vivos y se hace fluir el fluido en forma gaseosa desde el puerto de entrada del recipiente que contiene gases de desechos industriales u otras sustancias volátiles esenciales a eliminar de los gases de entrada para hacer funcionar dicho reactor como biofiltro o filtro químico y tratar o limpiar una variedad de mezclas gaseosas de acuerdo con los requisitos del proceso y se realizan las etapas de la A a la H.