CN104704107B - 细胞培养方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明包括用于细胞培养的自动化设备。本发明涉及细胞培养方法和系统，其允许以控制的方式来更改培养物中细胞的密度和数量。具体地，本发明涉及一种迭代方法，其迭代步骤的数量根据培养期间所必需的对细胞密度和数量的需求而被更改。
Description
发明目的
本发明包括用于细胞培养的自动化设备(device)。本发明涉及细胞培养方法和系统，其允许以控制的方式来更改培养物中细胞的密度和数量。具体地，本发明涉及一种迭代方法，其迭代步骤的数量根据对培养期间必需的细胞密度和数量的需求而而更改。
发明背景
可以在现有技术水平中找到由公司诸如Caridian BCT、PAN-systech制造的自动化生物反应器，或者通用电气公司的“波动生物反应器(wave bioreator)”。
PAN-systech公司的国际专利申请WO 2010/121601 A2示出了用于多孔细胞培养的自动生物反应器。
然而，在现有技术水平中已知的设备和方法存在在某种意义上不够灵活的技术问题：它们不允许根据需要在一个和同一生物反应器内进行多重细胞扩增(multiples cellexpansions)，导致当进展到扩增过程时不能控制和准确更改细胞密度以及细胞的总数量，并且导致其中可以进行工作的狭窄数值范围。
这些限制使得用于细胞疗法的生物反应器的应用极其复杂。
发明描述
已经开发了根据权利要求1的细胞培养方法和根据权利要求10的细胞培养系统以解决现有技术水平中考虑的问题。从属权利要求对本发明的具体实施方式进行了限定。本发明的第一创造性方面包括所提到的细胞培养方法，并且特征在于其在这样的系统中实施，所述系统包括：
·至少一个适于培养细胞的设备(device)，该设备包括：
√至少一个生物反应器室，其包括至少一个适于细胞培养的内表面，
√流体入口-出口装置(means)，和
√与至少一个生物反应器室连接的至少一个前室，其包括用于引入细胞的入口，
并且特征在于，其包括下列步骤：
a)在最初的物化条件下以预先确定的液体量用培养基填充前室，
b)通过用于引入前室细胞的细胞入口将细胞引入，
c)将具有细胞的培养基传送至至少一个生物反应器室，
d)使细胞沉降并且使它们静置预定的时间，直到它们附着到至少一个适于细胞培养的内表面，所述内表面的物化性质使其以在一个或几个最初物化条件下有利于细胞附着的方式起作用，
e)通过设备和流体入口-出口装置循环培养基，
f)一旦获得细胞的目标数量或者在至少一个用于培养的生物反应器室中达到临界密度，则将培养基的至少一个最初物化条件改变为更改的物化条件，在该条件下细胞附着被阻止，以使在更改的物化条件下设备内剩余的量位于已用于细胞扩增的生物反应器室，
g)将具有细胞的培养基转移至前室，和
如果已经达到细胞的目标数量，则通过出口装置将额外量的培养基引入前室并且将具有悬浮细胞的培养基抽出，或者
如果没有达到细胞的目标数量，则将额外的培养基引入前室中并从步骤c)开始重复步骤。
本发明方法的目的是为了允许以控制的方式来更改培养物中细胞的密度和数量。具体地，本发明涉及这样的迭代方法，其迭代步骤的数量根据对培养期间必需的细胞密度和数量的需求而被更改。
具体地，该迭代方法以在设备的前室中引入培养基开始，以使培养基从至少一个生物反应器室中分离。然后将扩增的细胞对象引入，并随后通过前室与室之间的连接将由培养基和细胞形成的全部混合物转移至至少一个培养室。贯穿此文件，术语“细胞扩增”和“细胞培养”被理解为同义词。另一方面，当提到的是物化条件时，则指的是至少一个参数的具体条件，如温度、pH水平或者盐浓度等。
为了成功地进行细胞扩增过程，使细胞附着至细胞分裂过程开始的表面是方便的。为此，方法的下一个步骤包括使细胞停留(stand)，以便它们附着到在至少一个适于细胞培养的生物反应器室中设备内表面。该表面适合于根据最初物化条件中的至少一个数值，例如：温度、pH或盐浓度对于改变其细胞附着的适应性，是因为其制备的材料的性质，或者因为这样的事实：其用凝胶或者产物覆盖，性质随着至少一个所选的最初物化条件，例如温度而改变。选择培养基的至少一个最初物化条件，例如，第一温度T1，以便在该温度下内表面的特性使其允许细胞附着。
当细胞已附着至表面时，在最初的物化条件下开始培养基的连续流动。该连续流动以连续的和更新的方式为细胞提供了必需的营养物质，如氨基酸和维生素，以使生长速率是恒定并且最优的。因此，进行细胞扩增直到获得特定的细胞密度或者细胞的目标数量，其中培养的质量不是所必须的。
一旦已经获得细胞的该密度或该目标数量，则将培养基的最初物化条件中的至少一个改变为更改的物化条件，为了使适于细胞培养的表面具有允许细胞再次在培养基中悬浮的物化特性。
在非限制性实施方式中，改变至少一个物化条件的方法是在温度T1下将培养基的生物反应器室排空，然后在温度T2下用培养基将含有细胞的培养室充满。在具体的实施例中，在更改的物化条件下引入到每个室中的培养基的量是在过程开始时引入到每个室中的量。因而，在这些更改的物化条件下的细胞从适于细胞附着的表面脱离。然后，将具有悬浮细胞的液体培养基转移至前室。
一旦在更改的物化条件下的液体培养基和悬浮细胞处于前室中，则有两种选择：
·需要大量的细胞，在这种情况下更多的培养基被添加至前室，并且从步骤c)开始重复所有的步骤直到达到细胞的目标数量，或者
·已经达到细胞的目标数量，在这种情况下具有悬浮细胞的液体培养基从前室提取出。
所述方法提供了能够在整个方法中控制所要求的细胞的体内数量的技术优势和随后能够根据所应用方法的要求更改细胞的最终目标数量的多功能性。
在第二个创造性方面，本发明涉及细胞培养系统，其包括：
·至少一个适于培养细胞的设备，该设备包括：
√至少一个生物反应器室，其包括至少一个适于细胞培养的内表面，
√流体入口-出口装置，
√与至少一个生物反应器室连接的至少一个前室，其包括用于引入细胞的入口。
系统还能够以通用方式用于不同的用途，例如，通过交换可拆卸的设备——其中的每一个都适于其进行的工作的类型——用于细胞重编程序或者细胞扩增。
说明书(包括权利要求书、说明书和附图)中描述的所有特征都能够以任意组合方式进行组合，除了此类相互排斥的特征的组合。
附图说明
为了补充将在下面做出的说明并且为了根据其优选的实践实施方式来帮助更好地理解本发明的特征，附上一组附图作为所述说明的组成部分，在其中以说明性和非限制性特征描述了下述：
图1显示根据本发明所述的系统的实施方式。
图2.1、2.2、2.3和2.4显示根据应用于系统的具体实例的发明的方法的步骤顺序的具体实例。
图3显示具有用于细胞附着(39)的额外表面的生物反应器室(2)的具体实例。
发明详述
细胞培养系统
由本发明提出的细胞培养系统是这样的系统，其包括：
·至少一个适于培养细胞的设备(1)，该设备(1)包括：
√至少一个生物反应器室(2)，其包括至少一个适于细胞培养的内表面(22、3、39)，
√流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)，
√与至少一个生物反应器室(2)连接的至少一个前室(4)，其包括用于引入细胞的入口(5)。
该培养基包含在用于包含细胞培养基的室(7)中，所述室(7)维持在期望的压力条件、温度条件、pH条件、氧水平和二氧化碳水平。为此，在一个实施方式中，用于包含培养基的室(7)被提供有用于这些条件的传感器并且被连接至控制压力的氧气瓶、二氧化碳瓶、NaOH分配器、氮气瓶(所有这些连接都通过它们对应的阀)并且，在具体实例中，连接至允许改变温度——实施例中的具体物化条件——的热交换器(11)。
通过如下将用于包含细胞培养基的室(7)与设备(1)连接：用于运输培养基的至少一个导管(9)；用于运输气体的至少一个第二导管(10)，其进一步将气体进料系统(图1的实施方式中的N2)与设备(1)连接。在图1描述的实施例中，这些至少一个第一、第二运输导管(9、10)也具有用于控制培养基和气体的流动的阀；在其中改变的至少一个最初物化条件为温度的图1实施例中，用于控制培养基流动的阀之一允许在培养基的两个可选路径之间进行选择，其中一个路径在到达设备(1)之前通过热交换器(11)使调节其温度成为可能。
有利地，在根据本发明所述的系统的具体实施方式中，设备(1)是可拆卸的并且为系统提供了元件，该元件可以独自获得并且适于不同的细胞培养，如例如哺乳动物细胞、细菌细胞等。因此，根据要进行的方法，仅通过交换可拆卸设备(1)使设备适应系统用于不同目的。
细胞培养方法
本发明所提出的方法特征在于其在系统中实施，该系统包括：
·至少一个适于培养细胞的设备(1)，该设备(1)包括：
√至少一个生物反应器室(2)，其包括至少一个适于细胞培养的内表面(22、3、39)，
√流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)，
√与至少一个生物反应器室(2)连接的至少一个前室(4)，其包括用于引入细胞的入口(5)，
并且特征在于其包括下列步骤：
a)在最初的物化条件下以预定的液体量用培养基填充前室(4)，前室(4)被放置以使培养基不会传送至至少一个生物反应器室(2)，
b)通过用于引入前室(4)细胞的细胞入口(5)引入细胞，
c)将具有细胞的培养基传送至至少一个生物反应器室(2)，
d)使细胞沉降并且将它们静置预定的时间，直到它们附着到至少一个适于细胞培养的内表面，该内表面的物化性质使其以在几个最初的物化条件下有利于细胞附着的方式起作用，
e)使液体循环通过设备(1)和流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)直到获得细胞的目标数量或者直到达到填充有培养基的至少一个生物反应器室(2)中的临界密度，
f)一旦获得细胞的目标数量或者在至少一个用于培养的生物反应器室(2、2’、2”)中达到临界密度，则将培养基的至少一个最初物化条件改变为更改的物化条件，在该条件下细胞附着被阻止，以使在更改的物化条件下设备(1)内剩余的量位于已经用于细胞扩增的生物反应器室(2、2’、2”)，
g)将具有细胞的培养基传送至前室(4)，和
如果已经达到细胞的目标数量，则通过出口装置(24)将具有悬浮细胞的培养基取出，或者
如果没有达到细胞的目标数量，则将额外的培养基引入到前室(4)中并从步骤c)开始重复步骤。
在第一步骤中的实施方式中，只有一个用于细胞培养的生物反应器室(2)被填满。在具体实施例中，通过阀(13)将设备(1)的前室(4)用培养基填充，如图1和图2中所观察到的。在关闭该阀(13)之前，在前室(4)中累积的培养基的量通常是——但不总是——等于第一生物反应器室(2)的体积。在该实施例中，只有一个生物反应器室(2)在第一步骤中是填满的。在填充生物反应器室之前，通过用于引入细胞的入口(5)将细胞引入到前室(4)中以便它们在培养基中悬浮。
在图1的具体实施例中，通过移动设备(1)将具有悬浮细胞的培养基传送至第一生物反应器室(2)并且通过阀(15)引入氮气(因为其对于细胞是惰性的)。通过用于移动设备(1)的机构(16)来移动设备(1)。图1的具体实施例描述了具有三个生物反应器室(2、2’、2”)的设备(1)：
在具体实施例中，通过第二阀(14)将前室(4)与第一生物反应器室(2)连接，所述第二阀位于接近使室分开的前室的角落的壁部分。
在图2.2中所描述的具体实施例中，通过用于移动设备(1)的机构(16)，如图1所见，其在该具体实施方式中是能够转换旋转运动的发动机，使设备(1)的位置从水平改变为垂直，垂直位置被理解为即设备(1)的较长壁位于垂直方向，而水平位置被理解为即设备(1)的较长的壁位于水平方向。
第二阀(14)处于这样的位置，使得具有悬浮细胞的培养基在等于或大于阀的高度定位于前室(4)，从而能够通过相同的高度。为了便于流体培养基在前室(4)和生物反应器室(2)之间转移，在具体实施例中，前室(4)包括连接至氮气瓶的气体入口阀(15)和最后的生物反应器室(2”)—其在该实施例中为第三生物反应器室—包括第二气体出口阀(19)。因此，在此具体的情况下，通过注入氮气(因为其对于细胞是惰性的)促进具有悬浮细胞的培养基的转移。
一旦具有悬浮细胞的培养基已被传送至第一生物反应器室(2)，则在该具体实施例中，用来移动设备(1)的机构(16)使设备(1)移动到这样的位置使得在前室(4)与第一生物反应器室(2)之间的第二阀(14)在等于或大于具有悬浮细胞的培养基的高度，从而使培养基位于生物反应器室(2)而不会具有朝向前室(4)的漏出路径的可能性。此步骤显示在图2.3中。
在图3所示的实施方式中，生物反应器室(2)内部包括一系列用于细胞附着(39)的额外表面，其可以是球形或者管状等其他形状，以便对于培养有用的表面比生物反应器室(2)的适于细胞培养的内表面(22、3)允许的表面更大。在具体实施例中，用于细胞附着(39)的额外的表面具有多个生物分子，优选蛋白质、肽或包含在设备的至少一个内表面中的生物活性合成分子。
在具体实施方式中，为了使附着成为可能，用于细胞附着(39)的额外的表面和生物反应器室(2)的适于细胞培养的内表面(22、3)用随温度改变其物化性质的凝胶覆盖。在具体实施例中，此凝胶为聚(n-异丙基丙烯酰胺)。在37℃，此凝胶适于细胞附着并且允许细胞附着至被凝胶所覆盖的表面(3、22、39)便于细胞扩增。在具体实施例中，不使用凝胶，而生物反应器室(2)的适于细胞培养的内表面(3、22、39)适于根据温度改变其性质以允许细胞附着。
当细胞附着发生时，在这样的温度下新的培养基通过设备不断循环使得适于培养的内表面(3、22、39)维持在便于细胞附着的物化条件，在图1中显示的具体实施例中，通过前室(4)的培养基入口阀(13)进入和通过培养基出口阀(14、17、18、23)退出。有利地，通过使培养基连续流动，培养基被更新到细胞培养所需的条件。
在一个实施方式中，系统包括用于氧气浓度、二氧化碳浓度、pH和温度的传感器，其位于出口阀(17)之后用来在扩增过程期间控制这些变量的水平。
在如图1所描述的具体实施例中，包括光学控制系统(21)的控制单元(20)用于控制细胞的密度和数量，并且用于在达到细胞的目标数量时停止扩增。
在该实施方式中，在过程的该步骤中水平放置的设备(1)具有透明表面(22)；在该透明表面(22)下，其可以用凝胶覆盖并且在其上细胞可以因此在该步骤中进行附着和繁殖，设置测量细胞数量和细胞密度的至少一个显微镜。这些光学显微镜把该信息传送至控制单元(20)，因而该系统自动运行。
一旦已经获得细胞的目标数量或者细胞密度达到一个数值——根据该数值培养的质量低于所需的质量，则将以连续流动循环的培养基的物化条件改变为更改的物化条件，为此适于细胞培养的内表面(3、22、39)具有物化特性使得其允许细胞再次在培养基中悬浮。为此，一旦设备(1)已经获得更改的物化条件，例如温度T2，由于在该温度下流的进入，培养基的连续流动被停止并且使其位于设备(1)中直到细胞再次悬浮。具有悬浮细胞的液体培养基随后被转移至前室(4)。在图1的具体实施例中，当达到细胞的目标数量或者最大的密度时，通过具有光学控制系统(21)的控制单元(20)在图1所示的具体实施方式中进行自动检测，连续循环的培养基在温度T2下循环足够长以允许该温度在整个设备(1)中是一致的。在此温度下适于细胞培养的内表面(3、22、39)具有不适于细胞附着的物化性质，因而细胞再次悬浮，丧失其对附着表面或者适于培养的表面的附着。在具体实施例中，培养基从用于包含细胞培养基的室(7)的出口通过包括热交换器(11)的运输导管(9)；从而温度从T1变为T2。
在具体实施例中，温度T2为24℃，因为在该实施方式中所使用的聚(n-异丙基丙烯酰胺)凝胶起作用使得细胞附着无法在该温度下发生。
随后中断培养基的连续流动使得设备内剩余的量等于用于扩增的生物反应器室(2)的量，并使在温度T2下培养基的该全部量位于第一生物反应器室(2)。
当细胞已经被分离并且再次在培养基中悬浮时，则将具有悬浮细胞的培养基转移至前室。在图1、2.1、2.2、2.3和2.4的实施例中，在具体实施例中，设备(1)在用于移动设备(1)的机构(16)的帮助下以与图2.3的前述步骤的方向相反的方向进行旋转直到到达图2.4所示的位置，使得其处于垂直位置，其中第二阀(14)在同一水平或低于具有悬浮细胞的培养基。在该位置，并且在由用于气体——在具体实施例中，氮气——的进入和退出的气体进口和出口阀(15、19)引起的压力改变的帮助下，具有悬浮细胞的培养基被转移至前室(4)。
如果在用于获得较大数量的总细胞的第一室中进行培养，则培养的质量会由于大量细胞的累积、共享限制的生长表面而降低。根据本发明的迭代方法提供的优点在于：培养细胞的数量在所需更多细胞的范围内增加，而不是以密度为代价使得培养的质量受到负面影响。为此，第二生物反应器室(2’)被填满，导致根据本发明方法的新的迭代，这是由于还没有达到最终的细胞目标数量并且在第一生物反应器室(2)中扩增的细胞质量受到具有细胞的培养基所获得的密度的影响。本发明的实施方式描述如下：
用额外量的培养基填充前室(4)，所述培养基通过运输导管(9)从用于容纳细胞培养基的室(7)到达并通过阀(13)进入。此额外量的培养基具有通常等于第二生物反应器室(2’)中的体积。因此，在该实施方式的该步骤中，前室(4)中的培养基的总量等于第一生物反应器室(2)加上第二生物反应器室(2’)的能力总和。
第二阀(14)是处这样的位置使得具有悬浮细胞的培养基在等于或大于阀的高度位于前室(4)，从而能够通过相同的高度。为了便于流体培养基在前室(4)和生物反应器室(2)之间转移，在具体实施例中，前室(4)包括连接至氮气瓶的气体入口阀(15)。最后一个生物反应器室(2”)——其在该实施例中为第三生物反应器室——包括气体出口阀(19)。因此，在此具体情况下，通过注入氮气(因为其对于细胞是惰性的)促进具有悬浮细胞的培养基的转移。
在图1所示的实施方式中，生物反应器室(2、2’)通过允许培养基在它们之间通过的第三阀(18)而连通。在该具体实施方式的该步骤中，当所有的培养基都离开前室(4)时，生物反应器室(2、2’)被填满。
一旦具有悬浮细胞的培养基已被传送至第一生物反应器室(2)和第二生物反应器室(2’)，则用于移动设备(1)的机构(16)再次使设备(1)移动到一个位置使得前室(4)和第一生物反应器室(2)之间的第二阀(14)位于——在该具体实施例中——等于或者高于具有悬浮细胞的培养基的高度，从而使培养基位于生物反应器室(2、2’)而没有朝向前室(4)的漏出路径的可能性。
在具体实施方式中，第一生物反应器室(2)和第二生物反应器室(2’)具有一系列用于细胞附着(39)的额外表面，其可以是球形或者管状等其他形状，以便对于培养有用的表面比两个生物反应器室(2、2’)的适于细胞培养的内表面(3、22)允许的表面更大。在具体实施方式中，为了使附着成为可能，用于细胞附着(39)的额外的表面和生物反应器室(2、2’)的适于细胞培养的内表面(3、22)用凝胶覆盖，这改变了其作为具体的物化条件的性质，在该实施例中，温度发生变化。在具体实施例中，此凝胶为聚(n-异丙基丙烯酰胺)凝胶。在37℃，此凝胶使得其允许细胞附着至被凝胶覆盖的表面(3、22、39)，便于细胞分裂。在具体实施例中，不使用凝胶，而是生物反应器室(2、2’)的适于细胞培养的内表面(3、22、39)适于根据温度改变它们的性质以允许细胞附着。
当细胞附着发生时，新的培养基在一定温度下通过设备连续循环使得适于培养的内表面(3、22、39)维持在这样的物化条件，便于细胞附着，在图1所示的具体实施例中，通过前室(4)的培养基入口阀(13)进入和通过最后一个要填满的室(2”)的培养基出口阀(17)退出。有利地，通过使培养基连续流动，培养基被更新至细胞培养所需的条件。
在一个实施方式中，系统包括用于氧气浓度、二氧化碳浓度、pH和温度的传感器，其位于出口阀(17)之后用来在扩增过程期间控制这些变量的水平。
在如图1所描述的具体实施例中，包括光学控制系统(21)的控制单元(20)用于控制细胞的密度和数量，并且当达到目标水平时用于停止扩增。
在该实施方式中，在所述过程的该步骤中水平放置的设备(1)具有透明表面(22)；在该透明表面(22)下，其可以用凝胶覆盖并且在其上细胞可以因而在该步骤中进行附着和繁殖，设置测量细胞数量和细胞密度的一系列显微镜。这些光学显微镜把该信息传送至控制单元(20)，从而使该系统自动运行。
当达到密度—从该密度培养的质量不是期望的细胞或者期望细胞的数量—时，其在图1所示的具体实施方式中通过具有光学控制系统(21)的控制单元(20)进行自动检测，连续循环培养基使至少一个选出的最初的物化条件——在该实施例中，温度——的数值改变为足够长的温度T2以允许该温度在整个设备(1)中一致。在此温度下适于细胞培养的内表面(3、22、39)具有不适于细胞附着的物化性质，因而细胞再次悬浮，失去其对附着表面或者适于培养的表面的附着。在具体实施例中，培养基从用于包含细胞培养基的室(7)的出口经过，通过包括热交换器(11)的运输导管(9)；从而使温度从T1变为T2。
在具体实施例中，温度T1为37℃并且温度T2为24℃，因为在该实施方式中所使用的聚n-异丙基丙烯酰胺起作用使得其在37℃适于细胞附着并且使得其在24℃不适于细胞附着。
然后中断培养基的连续流动使得设备内剩余的量等于用于扩增的生物反应器室(2、2’)的量的总和，并使在温度T2下全部培养基的量位于这两个生物反应器室(2、2’)。
当细胞已经被分离并且再次在培养基中悬浮时，在图1的具体实施例中，设备(1)在用于移动设备(1)的机构(16)的帮助下旋转，使其位于垂直位置，如图2.4所示，其中第二阀(14)在同一水平或低于具有悬浮细胞的培养基。在该位置，在由用于气体——在具体实施例中，氮气——的进入和退出的入口-出口阀(15、19)引起的压力改变的帮助下，具有悬浮细胞的培养基被转移至前室(4)。
如果为了获得更多数量的总的细胞而在第一和第二室中进行培养，则培养的质量将会由于大量的细胞累积、共享一个并且相同的生长表面，而降低。根据本发明的迭代方法提供的优点在于：培养细胞的数量在所需更多细胞的范围内增加，而不是以密度为代价使得培养质量受到负面影响。为此，第三生物反应器室(2”)被填满，这导致根据本发明方法的新的迭代。该实施例中的步骤与上面描述的那些用于填充生物反应器室和用于填满两个生物反应器室的步骤相同，并且所有考虑的具体实施方式都是可适用的。具体地，在图1所示的实施方式中，通过允许培养基在它们之间通过的阀(18、23)，生物反应器室(2、2’、2”)相通。
在图1所示的包含三个生物反应器室的具体实施方式中，该第三生物反应器室(2”)对应于最后一个要被填满的生物反应器室，以使其包括气体出口阀(19)和培养基出口阀(17)。
在该具体实施方式中，当具有悬浮细胞的培养基以上面所描述的方式通过阀(14、18、23)被转移至前室(4)时，则无法在培养物的质量没有恶化的情况下进行细胞培养。
在图1的实施方式中，一旦通过成功地填满上述三个室而达到细胞的目标数量，则培养基由前室(4)向末端出口阀(24)转移以使培养基离开设备(1)。
在具体的实施方式中，从设备(1)转移的培养基通过过滤系统(25)，在其中细胞以下列方式从培养基分离：
在具体的实施方式中，过滤系统(25)包括用于包含液体培养基(如缓冲液)的室(26)，和位于所述用于包含液体的室和过滤系统(25)之间的导管(27)。该过滤系统(25)包括液体进口-出口装置和培养基进口-出口装置。在这两种情况中，在具体实施方式中进口-出口装置均为阀。在图1的具体实施方式中，培养基通过阀(28)进入过滤系统(25)和通过阀(32)退出过滤系统；液体依次通过阀(29)进入过滤系统(25)和通过阀(30)退出过滤系统。
过滤系统(25)内部包括过滤器(31)，在具体的实施方式中，过滤器(31)包括振动装置(37)。过滤器(31)使悬浮细胞保留在培养基中；在相应的具体实施方式中，通过由过滤器(31)中振动装置(37)引起的移动使细胞与过滤器(31)分离。在具体实施方式中，通过阀(29)进入过滤系统(25)的液体收集细胞以使细胞在液体中悬浮；在该具体实施方式中，液体—在具体实施方式中其为缓冲液—通过阀(30)退出过滤系统(25)。因此，具有特定细胞浓度(浓度C)的液体在所述阀(30)的出口被发现。在图1的具体实施方式中，培养基通过阀(32)退出过滤系统(25)，而没有悬浮细胞。
在具体实施方式中，系统包括灭菌系统(33)。具体地，在图1所示的具体实施方式中，灭菌系统(33)包括用于包含灭菌物质的室(34)、用于通过运输导管(9、10)抽送灭菌物质的泵(35)和调节灭菌物质进入到系统其余部分的阀(36)。
Claims (36)
1.细胞培养方法，特征在于其在系统中实施，所述系统包括：
·至少一个适于培养细胞的设备(1)，所述设备(1)包括：
√至少一个生物反应器室(2)，其包括至少一个适于细胞培养的内表面(3、22、39)，
√流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)，和
√与所述至少一个生物反应器室(2)连接的至少一个前室(4)，其包括用于引入细胞的入口(5)，
并且特征在于，其包括下列步骤：
a)在最初的物化条件下以预定量的液体用培养基填充所述前室(4)，
b)通过所述细胞入口(5)将细胞引入所述前室(4)，
c)使具有所述细胞的所述培养基从所述前室(4)传送至所述至少一个生物反应器室(2)，
d)使细胞沉降并且使它们静置预定的时间，直到它们附着到所述至少一个适于细胞培养的内表面(3、22、39)，所述内表面的物化性质使其以在一个或多个最初的物化条件下有利于细胞附着的方式起作用，
e)使培养基循环通过所述设备(1)和所述流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)，
f)一旦获得细胞的目标数量或者在所述至少一个用于培养的生物反应器室(2、2’、2”)中达到临界密度，则将所述培养基的至少一个最初物化条件改变为更改的物化条件，在更改的物化条件下细胞附着被阻止，以便在更改的物化条件下使所述设备(1)内剩余的量位于已经用于细胞扩增的所述生物反应器室(2、2’、2”)，
g)将具有所述细胞的所述培养基传送至所述前室(4)，和
如果已经达到所述细胞的目标数量，则通过出口装置(24)将具有所述细胞的所述培养基取出，或者
如果没有达到所述细胞的目标数量，则将额外的培养基引入所述前室并从步骤c)开始重复所述步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述至少一个被改变的最初物化条件为温度。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于，其包括通过适于控制所述设备(1)中进行的所述细胞培养的至少一个控制单元(20)来自动控制所述细胞的数量和/或密度。
4.根据权利要求3所述的方法，特征在于控制所述细胞数量和/或密度是通过包括光学控制系统(21)的控制单元(20)和通过包括在所述设备中的透明表面(22)进行，所述细胞数量的控制包括步骤：
·一旦所述培养基已经被传送至所述至少一个生物反应器室(2)，则定位所述设备(1)以使具有所述细胞的所述培养基位于所述透明表面(22)上，并且该透明表面(22)反过来安置在用于控制所述细胞数量和/或密度的所述光学控制系统(21)上。
5.根据权利要求1-2和4中任一项所述的方法，特征在于，其包括通过与所述系统连接的灭菌系统(33)将所述系统灭菌的步骤。
6.根据权利要求4所述的方法，特征在于，其包括通过与所述系统连接的灭菌系统(33)将所述系统灭菌的步骤。
7.根据权利要求1-2和4中任一项所述的方法，特征在于前室(4)和所述至少一个生物反应器室(2、2’、2”)之间的传递是通过压力进行的，以使所述培养基通过多个阀(14、18、23)。
8.根据权利要求4所述的方法，特征在于前室(4)和所述至少一个生物反应器室(2、2’、2”)之间的传递是通过压力进行的，以使所述培养基通过多个阀(14、18、23)。
9.根据前述权利要求1-2和4中任一项所述的方法，特征在于，在通过所述流体入口-出口装置(24)将具有所述细胞的所述培养基取出之后，所述细胞通过以下从所述培养基分离：
·液体培养基，其包含在室(26)中，
·至少一个连接至所述室(26)的过滤系统(25)，其包括：
√液体培养基入口-出口装置(29)，
√培养基入口-出口装置(28、32)，
√至少一个过滤器(31)，
并且特征在于实施以下步骤：
·将具有所述细胞的所述培养基引入所述过滤系统(25)，
·用所述至少一个过滤器(31)保留所述细胞，
·通过所述液体培养基入口-出口装置(29)将液体培养基引入所述过滤系统(25)，
以使所述细胞从所述培养基分离。
10.根据权利要求4所述的方法，特征在于，在通过所述流体入口-出口装置(24)将具有所述细胞的所述培养基取出之后，所述细胞通过以下方法从所述培养基分离：
·液体培养基，其包含在室(26)中，
·至少一个连接至所述室(26)的过滤系统(25)，其包括：
√液体培养基入口-出口装置(29)，
√培养基入口-出口装置(28、32)，
√至少一个过滤器(31)，
并且特征在于实施以下步骤：
·将具有所述细胞的所述培养基引入所述过滤系统(25)，
·用所述至少一个过滤器(31)保留所述细胞，
·通过所述液体培养基入口-出口装置(29)将液体培养基引入所述过滤系统(25)，
以使所述细胞从所述培养基分离。
11.根据权利要求9所述的方法，特征在于通过包括在所述过滤器中的至少一个振动装置(37)摇动所述过滤器，使所述细胞从所述过滤器分离。
12.根据权利要求10所述的方法，特征在于通过包括在所述过滤器中的至少一个振动装置(37)摇动所述过滤器，使所述细胞从所述过滤器分离。
13.根据权利要求1-2、4和10中任一项所述的方法，特征在于通过包括多个可拆卸设备的系统制备不同类型的培养物，这些设备中的每一个都使用至少一个适于待制备培养物类型的内表面。
14.根据权利要求4所述的方法，特征在于通过包括多个可拆卸设备的系统制备不同类型的培养物，这些设备中的每一个都使用至少一个适于待制备培养物类型的内表面。
15.根据权利要求9所述的方法，特征在于通过包括多个可拆卸设备的系统制备不同类型的培养物，这些设备中的每一个都使用至少一个适于待制备培养物类型的内表面。
16.细胞培养系统，其包括：
·至少一个适于培养细胞的设备(1)，所述设备(1)包括：
√至少一个生物反应器室(2)，其包括至少一个适于细胞培养的内表面(3、22、39)，
√流体入口-出口装置(13、14、15、17、18、19、23、24)，和
√至少一个前室(4)，其与所述至少一个生物反应器室(2)连接，包括用于引入细胞的入口(5)，和
控制单元(20)，所述控制单元(20)适合于进行根据权利要求1所述的细胞培养方法。
17.根据权利要求16所述的系统，特征在于，所述设备的所述内表面(3)中的至少一个是透明的，其形成透明表面(22)，并且所述控制单元(20)包括至少一个光学控制系统(21)以使根据权利要求3所述的方法被实施。
18.根据权利要求16至17任一项所述的系统，特征在于，其包括至少一个灭菌系统(33)。
19.根据权利要求16至17任一项所述的系统，特征在于，其包括：
·用于包含液体培养基的至少一个室(26)，
·至少一个过滤系统(25)，其包括：
√液体培养基入口-出口装置(29)，
√培养基入口-出口装置(28、32)，
√至少一个过滤器(31)，
·在所述用于包含液体培养基的室(26)和所述至少一个过滤系统(25)之间的用于运输液体培养基的装置(27)。
20.根据权利要求18所述的系统，特征在于，其包括：
·用于包含液体培养基的至少一个室(26)，
·至少一个过滤系统(25)，其包括：
√液体培养基入口-出口装置(29)，
√培养基入口-出口装置(28、32)，
√至少一个过滤器(31)，
·在所述用于包含液体培养基的室(26)和所述至少一个过滤系统(25)之间的用于运输液体培养基的装置(27)。
21.根据权利要求16和20任一项所述的系统，特征在于，其包括从所述前室(4)到所述生物反应器室(2)的入口-出口阀(14)和/或气体入口-出口阀(15、19)。
22.根据权利要求19所述的系统，特征在于，其包括从所述前室(4)到所述生物反应器室(2)的入口-出口阀(14)和/或气体入口-出口阀(15、19)。
23.根据权利要求16和20任一项所述的系统，特征在于，其包括用于在至少一个生物反应器室(2)中细胞附着的额外表面(39)。
24.根据权利要求19所述的系统，特征在于，其包括用于在至少一个生物反应器室(2)中细胞附着的额外表面(39)。
25.根据权利要求23所述的系统，特征在于，所述额外表面具有生物活性合成分子。
26.根据权利要求24所述的系统，特征在于，所述额外表面具有生物活性合成分子。
27.根据权利要求23所述的系统，特征在于，所述额外表面具有蛋白质或肽。
28.根据权利要求24所述的系统，特征在于，所述额外表面具有蛋白质或肽。
29.根据权利要求16和20任一项所述的系统，特征在于所述适合于细胞培养的至少一个内表面(22、3、39)用凝胶覆盖。
30.根据权利要求19所述的系统，特征在于所述适合于细胞培养的至少一个内表面(22、3、39)用凝胶覆盖。
31.根据权利要求29所述的系统，特征在于所述凝胶为聚(n-异丙基丙烯酰胺)水凝胶。
32.根据权利要求30所述的系统，特征在于所述凝胶为聚(n-异丙基丙烯酰胺)水凝胶。
33.根据权利要求19所述的系统，特征在于所述过滤系统(25)包括振动装置(37)。
34.根据权利要求20所述的系统，特征在于所述过滤系统(25)包括振动装置(37)。
35.根据权利要求16和20中任一项所述的系统，特征在于所述设备(1)是可拆卸的。
36.根据权利要求19所述的系统，特征在于所述设备(1)是可拆卸的。
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