CN106103684A - 细胞培养方法、以及细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养方法，在将细胞依次转移到多个培养容器而进行培养的情况下，能够降低污染的风险，并且减少培养容器内的细胞的残存，省略培养基的加温机构。多个培养容器(2a、2b、2c)具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，在第一容器(2a)中收容细胞悬浮液，将供给培养基的培养基容器(1)与培养容器使用管道(3)连接而开始细胞的培养，在第一容器中的培养结束后，将细胞悬浮液移送到与该容器连接的第二容器(2b)，从培养基容器向第一容器供给培养基，经过给定时间后，从第一容器向第二容器供给培养基，在第二容器中进行细胞的培养，在有下一个培养容器的情况下，对剩余的培养容器反复进行向下一个培养容器的细胞悬浮液的移送、向该培养容器的培养基的供给、从该培养容器向下一个培养容器的培养基的供给、以及下一个培养容器中的细胞的培养。

Description

细胞培养方法、以及细胞培养系统

技术领域

本发明涉及在人工的环境下培养细胞或组织、微生物等的细胞培养方法、以及细胞培养系统。

背景技术

近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫细胞疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。在这样的细胞培养中，随着培养基内的细胞密度变高，会引起增殖所必需的成分的枯竭、细胞自身的代谢产物的蓄积，增殖速度降低，细胞密度达到饱和。因此，在以一定程度的规模培养细胞的情况下，通常在以恰当地维持细胞密度的方式反复进行继代培养的同时进行培养。

在该继代培养时，有时将细胞从容量小的培养容器转移到容量更大的培养容器。例如，使用细胞培养孔板以达到适于培养的初期阶段的细胞密度的方式，与培养基一起将细胞加入各个孔中而开始培养，在孔内使细胞充分地增殖后转移到细胞培养烧瓶中，与细胞增殖匹配地追加培养基而进行培养。另外，在细胞增殖到一定量的时刻，转移到容量更大的袋等中，反复进行培养基的补给和继代培养，大量培养了细胞(例如参照专利文献1[0027]段等)。

另外，在使用被冷冻保存了的细胞时，还有如下的方法，即，在溶解而复苏后，为了恢复细胞本来的功能而使用孔板进行数日的培养(以下有时称作养生培养)，使细胞的功能恢复为本来的状态后转移到烧瓶中而进行培养(以下有时称作扩增培养)，其后，进行活化培养(例如参照专利文献2[0057]段等)。

但是，在这样的细胞培养中，在从孔板向烧瓶转移时需要反复进行几次移液操作，在每次继代培养中都需要将细胞移至新的烧瓶或袋等培养容器中，不仅操作烦杂，而且还有可能对细胞造成损伤。另外，还有污染的风险高的问题。

另一方面，在专利文献3及专利文献4中记载有可以降低污染的风险的细胞培养装置等。

即，专利文献3中，公开过如下的自动培养装置，即，在培养箱内设置气密性地形成的细胞的培养器，具备经由与培养器气密性地连接的送液管将培养基容器和清洗液容器和骨髄液容器的液体选择性地注入培养器的送液机构、和将培养器内的液体经由排液管排出的排液机构。此外公开过如下的技术，即，利用该构成，将与培养器粘附的干细胞选择性地分离后，将培养基注入培养器而培养干细胞，然后将分化培养用的培养基注入培养器而分化出目标的组织细胞。

另外，专利文献4中，公开过能够使用多个培养容器在密闭系统中进行附着细胞的继代培养的自动继代培养装置。具体而言，公开过如下的技术，即，在多个培养容器中，收容有培养基的培养基供给罐、收容有清洗液的清洗液供给罐、收容有剥离液的剥离液供给罐、和处理容器被连接，在处理容器内设有用于阻止细胞的通过的过滤器，在过滤器的表面会集细胞后，从过滤器的外侧供给培养基，利用培养基冲流细胞而移送。

现有技术文献

专利文献

【特許文献1】：日本特开2011－241159号公报

专利文献2：日本特开2013－215141号公报

专利文献3：日本特开2007－312668号公报

专利文献4：日本特开2005－198626号公报

发明内容

发明所要解决的问题

但是，这些细胞培养装置等在使用多个培养容器大量地培养细胞的情况下，不能说是最合适的细胞培养装置。

即，根据专利文献3的细胞培养装置，虽然可以用一个培养器来培养干细胞，并且使之分化出目标的组织细胞，然而并不能适用于为了大量地培养细胞而必需的继代培养等。

另外，就专利文献4的自动继代培养装置而言，虽然可以使用多个培养容器进行细胞的继代培养，然而是如下的构成，即，最先将用一个培养容器培养的细胞会集在过滤器的表面后，从过滤器的外侧供给培养基而将细胞移送到三个培养容器再次进行培养，将该再次培养的细胞会集在过滤器的表面后，从过滤器的外侧供给培养基而回收细胞的一部分或全部。就该培养装置而言，虽然可以对再次培养的细胞的一部分进行继代培养，然而无法对全部进行，因此对于细胞的大量培养而言不能说最佳，另外还有操作步骤烦杂的问题。此外在将细胞与培养基、清洗液一起流送而用过滤器截住后，进行向培养容器的移送、细胞的取出，因此有可能对细胞造成损伤。

另外，在使用多个培养容器进行细胞培养的情况下，以往在细胞的移送时，存在有在培养容器内残存有细胞的问题。若发生这样的培养容器内的细胞的残存，则无法利用全部的细胞，导致细胞的一部分废弃，因此细胞的增殖效率降低，从而成为重大的问题。

此外，细胞培养中所用的培养基若不在低温下保存，品质就会劣化，因此在使用前被冷却后保存。但是，由于细胞培养是在37℃左右进行，因此若将该被冷却了的培养基直接提供给封入有细胞和培养基的培养容器，就会有细胞的增殖效率降低的问题。

因而，以往例如像专利文献3的0018段中记载所示，通过利用加热器等加温机构将培养基加温后提供给培养容器，而解决这样的问题。

但是，若在细胞培养系统中设置加温机构，则构成会烦杂并且大型化，因此最好不设置加温机构。

本发明是鉴于上述的事情而完成的，其目的在于，提供一种细胞培养方法，其在使用多个培养容器进行细胞培养的情况下，能够降低污染的风险，并且在细胞的移送时能够减少培养容器内的细胞的残存，还能够省略培养基的加温机构，此外还提供一种细胞培养系统。

用于解决问题的方法

本发明的细胞培养方法是使用多个培养容器来培养细胞的细胞培养方法，采用了如下的方法，即，所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，在所述多个培养容器的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器与所述第一培养容器使用管道连接，并且依次使用管道使所述多个培养容器中的其他培养容器与所述第一培养容器连接，在所述第一培养容器中开始细胞的培养，所述第一培养容器中的培养结束后，从所述第一培养容器向与所述第一培养容器连接的第二培养容器移送含有经过培养的细胞的细胞悬浮液，然后从所述培养基供给容器向所述第一培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述第一培养容器向所述第二培养容器供给培养基，在所述第二培养容器中进行细胞的培养，所述第二培养容器中的培养结束后，在有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器的情况下，反复进行向所述下一个培养容器中的细胞悬浮液的移送、向所述培养结束了的培养容器中的培养基的供给、从所述培养结束了的培养容器向所述下一个培养容器中的培养基的供给、以及所述下一个培养容器中的细胞的培养，直至没有与所述培养结束了的培养容器连接的所述下一个培养容器为止。

另外，本发明的细胞培养系统是具备用于培养悬浮系的细胞的多个培养容器的细胞培养系统，采用了如下的构成，即，具备：培养基供给容器，其向所述多个培养容器供给培养基；和所述多个培养容器，它们是使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器；用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器；用于使细胞增殖的细胞培养中所用的一个或两个以上的扩增培养容器。所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，所述培养基供给容器、所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器被依照该顺序使用管道连接。

此外，本发明的细胞培养系统是具备用于培养贴壁系的细胞的多个培养容器的细胞培养系统，采用了如下的构成，即，具备：培养基供给容器，其向所述多个培养容器供给培养基；所述多个培养容器，它们是培养面积不同的培养容器，所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，在所述培养基供给容器处依照培养面积由小到大的顺序使用管道连接所述多个培养容器。

发明效果

根据本发明，在使用多个培养容器进行细胞培养的情况下，能够降低污染的风险，并且在细胞的移送时，能够减少培养容器内的细胞的残存，此外还能够省略培养基的加温机构。

附图说明

图1是表示本发明的第一实施方式的细胞培养系统的概略的说明图。

图2是表示本发明的第一实施方式的细胞培养系统的搅拌机构的概略的说明图。

图3是表示本发明的第一实施方式的细胞培养方法的一次培养工序的立体图。

图4是表示本发明的第一实施方式的细胞培养方法的细胞移送工序的立体图。

图5是表示本发明的第二实施方式的细胞培养系统的概略的说明图。

图6是表示本发明的第二实施方式的细胞培养系统的养生容器及保持件的概略的立体图。

图7是表示本发明的第三实施方式的细胞培养系统的概略的说明图。

图8是表示本发明的第四实施方式的细胞培养系统的概略的说明图。

具体实施方式

以下，在参照附图的同时，对本发明的实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统的优选的实施方式进行说明。

(第一实施方式)

首先，参照图1及图2，对本发明的第一实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统进行说明。

[细胞培养系统]

本实施方式的细胞培养系统如图1所示，具备：培养基供给容器1(以下有时称作培养基容器1)、多个培养容器2(一次培养容器2a、二次培养容器2b、三次培养容器2c)、和移送管道3(以下有时简称为管道(导管))。

在多个培养容器2中，分别具备一个用于与其他容器进行内容物的移送的端口，培养基容器1与多个培养容器2被使用管道连接。

根据本实施方式的细胞培养系统，由于可以使用这些的多个培养容器2，以封闭体系来进行细胞的继代培养，因此能够降低污染的风险。

另外，在使用本实施方式的细胞培养系统，结束某个培养容器2中的培养，在下一个培养容器2中进行培养时，通过在向该下一个培养容器2中注入培养基之前，向已经结束了培养的培养容器2中注入培养基并等待给定时间后，将培养基移送到其后进行培养的培养容器2中，就可以减少残存于结束了培养的培养容器2中的细胞，并且可以使移送到其后进行培养的培养容器2中的培养基的温度升高。因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

在以后的实施方式中也能够同样地获得这些效果。

[培养基供给容器]

培养基容器1是向培养容器供给用于培养细胞的培养基的容器，存放向多个培养容器2供给的培养基。为了供给相同的或不同的培养基，该培养基容器1也可以使用多个容器构成。

为了不使所存放的培养基的pH在培养期间中大幅度变化，培养基容器1优选具有对氧及二氧化碳的气体屏蔽性。这是因为，为了避免培养基中所含的高浓度的二氧化碳释放到空气中，培养基中的二氧化碳浓度降低，结果使得pH升高，最好尽可能减少二氧化碳从培养基容器1的内部向外部漏出。另外还因为最好防止培养基的氧化。

在培养基容器1中，具备一个端口，在该端口处连接移送管道3，经由该移送管道3与多个培养容器2连接。可以从该培养基容器1与培养细胞的增殖等匹配地使用泵向培养容器2供给培养基。

而且，培养基容器1在培养完结而变空后，可以作为废液回收容器(以下有时称作废液容器)使用。此外，通过从培养容器2将细胞悬浮液的上清液流送到作为废液容器的培养基容器1，能够浓缩培养容器2中的细胞悬浮液。而且，也可以将两个以上的培养基容器1连接，将一方作为废液容器使用，将另一方作为细胞回收容器使用，将经过浓缩的细胞悬浮液从培养容器2流送到培养基容器1而对细胞进行回收等。

[培养容器]

培养容器2是用于利用继代培养等使细胞增殖的容器，包含多个容器。图1的例子中，作为培养容器2，具备一次培养容器2a、二次培养容器2b、三次培养容器2c，设想为以该顺序进行细胞培养。而且，培养容器2的个数并不限定为三个，例如也可以设为两个，还可以设为四个或五个、或其以上。

为了可以有效地进行继代培养等，培养容器2的容量及培养面积优选为越是靠后连接的培养容器则越大。例如，作为二次培养容器2b，可以合适地使用一次培养容器2a的容量的2倍以上的培养容器，可以合适地使用一次培养容器2a的培养面积的1.5倍以上的培养容器。另外，作为三次培养容器2c，可以合适地使用二次培养容器2b的容量的10倍程度的培养容器，可以合适地使用二次培养容器2b的培养面积的6倍以上的培养容器。而且，一次培养容器2a、二次培养容器2b、三次培养容器2c的容量及培养容器的比率并不限定于这些。

本实施方式的细胞培养系统中，首先在一次培养容器2a中进行细胞培养后，将经过培养的细胞从一次培养容器2a移送到二次培养容器2b。然后将培养基从培养基容器1流加到一次培养容器2a。此后，在一次培养容器2a中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。作为该等待时间，虽然要依据培养基量和培养温度而定，然而例如可以设为5分钟到10分钟左右。然后将培养基从一次培养容器2a移送到二次培养容器2b。

另外，在从培养基容器1向一次培养容器2a的培养基的移送时，优选使移送速度比通常慢。作为该移送速度，例如优选设为通常的移送速度的5％～50％左右。具体而言，例如优选设为5mL/min～50mL/min，更优选设为10mL/min～30mL/min。通过像这样使培养基的移送速度比通常慢，就能够在移送到下一个进行培养的培养容器2(二次培养容器2b)之前，使培养基的温度升高。

另外，由于在将培养基移送到一次培养容器2a后移送到二次培养容器2b，因此可以将残存于一次培养容器2a中的细胞与培养基一起移送到二次培养容器2b。因此，能够减少结束了培养的培养容器2(一次培养容器2a)中的残存细胞。

另外，对于在二次培养容器2b中进行细胞培养后，也是同样地将经过培养的细胞从二次培养容器2b移送到三次培养容器2c，然后将培养基从培养基容器1流加到一次培养容器2a。此后，在一次培养容器2a中收容有培养基的状态下，保持原样地等待经过给定时间而使培养基温度升高，然后将培养基从一次培养容器2a移送到二次培养容器2b。此后，在二次培养容器2b中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间而使培养基温度升高，然后将培养基从二次培养容器2b移送到三次培养容器2c。

此时，由于将培养基移送到一次培养容器2a和二次培养容器2b后移送到三次培养容器2c，因此可以将残存于一次培养容器2a和二次培养容器2b中的细胞与培养基一起移送到三次培养容器2c。

而且，在二次培养容器2b中进行细胞培养后，可以仅向一次培养容器2a中流加培养基而使培养基温度升高后，将该培养基移送到三次培养容器2c，也可以仅向二次培养容器2b移送培养基而使培养基温度升高后，将该培养基移送到三次培养容器2c。另外，也可以向一次培养容器2a及二次培养容器2b两者中流加培养基而使培养基温度升高后，将这些培养基移送到三次培养容器2c。

如此所述，根据本实施方式的细胞培养系统，可以明显地减少培养容器内的细胞的残存，并且可以在使培养基的温度升高后移送到培养容器，从而能够进一步提高细胞的增殖效率。

这些的培养容器2是以软包材料作为材料而以袋状(bag型)形成，为了可以看到内容物，一部分或全部具有透明性。

另外，培养容器2需要具有细胞的培养所必需的透气性(氧及二氧化碳透过性)，优选在37℃、5％二氧化碳浓度的培养环境下使用。此外，为了实现高的细胞增殖效率，培养容器2优选具有低细胞毒性、低溶出性、以及辐射灭菌适应性。

作为满足这样的条件的培养容器2的材料，优选聚乙烯系树脂。作为该聚乙烯系树脂，可以举出聚乙烯、乙烯与α－烯烃的共聚物、乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、使用了乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物和金属离子的离聚物等。另外，也可以使用聚烯烃、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅酮树脂等。

培养容器2的形状没有特别限定，然而如图1所示，可以制成长方形，具备一个用于与其他容器移送内容物的端口。形成如下的构成，即，在该内容物的移送用的端口处，连接有移送管道3，经由该移送管道3，进行从培养基容器1向培养容器2的培养基的注入、以及从培养容器2向下一个培养容器2的培养基或细胞悬浮液的移送。

为了可以通过倾斜培养容器2，将内容物自然流送到下一个培养容器2，最好将该移送用端口配置于使培养容器2倾斜时处于下侧的位置。

另外，最后进行培养的培养容器2(通常是最后连接的培养容器2，图1中为三次培养容器2c)具备取样用的端口，在该端口处连接有取样管2c－1。取样管2c－1是出于对经过培养的细胞的状态进行确认等目的，为了从培养容器2中取出经过培养的细胞的一部分而使用的。对取样管2c－1的与培养容器2的端口相反一侧的自由端的头端部，实施二段密封，抽拉取样管2c－1，由此就可以使得从培养容器2到取样管2c－1内充满细胞悬浮液。此后，通过将取样管2c－1热封(热熔接)后切断，就能够在维持细胞培养系统的封闭体系的状态下对细胞进行取样。

而且，也优选在中间的培养容器2(图1中是二次培养容器2b)具备取样用的端口，在该端口连接取样管而进行细胞的取样。

培养容器2的四边被利用热封进行了密封。培养容器2的收容部的形状可以设为长方形，另外也优选如图1所示，以朝向端口逐渐变窄的方式构成。而且，培养容器2也可以是借助吹塑成形得到的一体成型袋。

[移送管道]

移送管道3将培养基容器1与多个培养容器2连接，由此就能够进行从培养基容器1向培养容器2的培养基的注入、以及多个培养容器2间的培养基或细胞悬浮液的移送。

在移送管道3的流路中适当地配置流路开闭机构和泵，利用流路开闭机构来控制送液流路。作为流路开闭机构，例如可以使用夹管阀或双向旋塞阀、三向旋塞阀等，没有特别限定。图1中，使用三向旋塞阀将培养基容器1与多个培养容器2连接，利用泵进行从培养基容器1向培养容器2的培养基的移送。另外，虽然在同图中，使用鲁尔接头进行了培养容器2(一次培养容器2a，二次培养容器2b)与移送管道3的连接和移送管道3之间的连接，然而也可以利用其他的方法进行连接。

移送管道3的材料只要与使用环境匹配地适当地选择即可，然而最好是透气性优异的材料。例如可以使用硅酮橡胶、软质氯乙烯树脂、聚丁二烯树脂、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、氯代聚乙烯树脂、聚氨酯系热塑性弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、苯乙烯系弹性体等。另外，作为苯乙烯系弹性体，例如可以使用SBS(苯乙烯·丁二烯·苯乙烯)、SIS(苯乙烯·异戊二烯·苯乙烯)、SEBS(苯乙烯·乙烯·丁烯·苯乙烯)、SEPS(苯乙烯·乙烯·丙烯·苯乙烯)等。

图1中，在移送管道3的安装有泵的部分使用了硅酮管道，在其他的部分使用了软质氯乙烯树脂管道。

[搅拌机构]

在使用培养容器2进行细胞培养时，为了使培养容器2的内容液中的细胞的分布、培养基的成分浓度均匀而维持良好的培养环境、促进细胞的增殖，优选设置在开始培养及供给培养基等时搅拌培养容器2的内容液的搅拌机构。而且，搅拌机构在以后的实施方式中也可以出于对培养容器的内容液进行搅拌等目的而使用。

此时，通过利用搅拌机构，重复进行使培养容器2向初期位置的上方移动的上动工序、和使培养容器2回到初期位置并且对回到初期位置的培养容器2施加振动的下动工序，就可以搅拌培养容器2的内容液。

而且，在重复进行上动工序和下动工序时，为了能够可靠地进行培养容器2的内容液的搅拌，可以根据需要在下动工序后设置间隔，经过给定的时间后重复进行上动工序。

通过如此操作，除了借助培养容器2的上下移动带来的内容液的搅拌以外，还利用下动工序中对培养容器2施加的振动使细胞在内容液中飞舞地扩散。由此，培养容器2的内容液在上下方向上也被高效地搅拌，减轻细胞在培养容器2的培养面滚落时的剪应力，在减少对细胞造成的损伤的同时，使培养容器2的内容液中的细胞的分布、培养基的成分浓度均匀而维持良好的培养环境，并且抑制细胞附着于容器内壁、或过度凝聚，从而可以促进细胞的增殖。此外，在所培养的细胞为贴壁系的细胞的情况下，也能够利用下动工序中对培养容器2施加的振动，促进细胞从培养容器2的培养面的剥离。

为了如上所述地搅拌培养容器2的内容液，作为搅拌机构，例如优选如图2所示，使用如下的装置，即，具备装载部4和凸轮机构，所述装载部4具有平板状的保持板41，在基台6上枢轴支撑所述保持板41的设于一个端缘的转动轴42，所述凸轮机构以保持板41作为从动件，培养容器2由装载部4保持，利用凸轮机构以转动轴42为中心使保持板41上下反复转动，并且通过将保持板41下动而抵接于基台6时产生的振动施加到培养容器2，来搅拌培养容器2的内容液。多个培养容器2可以分别由一个个保持板41保持，也可以由一个保持板41一并保持。

在这样的装置中，在上动工序中，由装载部4保持着的培养容器2随着利用凸轮机构使保持板41向上方转动，在向初期位置的上方移动的同时倾斜，由此在使用软包材料形成的培养容器2挠曲变形的同时，其内容液偏向转动轴42侧地流动(参照图2(a)～(e))。在下动工序中，保持板41达到最大倾斜角度θ_max后，向下方转动，与之相伴地培养容器2回到初期位置(参照图2(f)、(g))，而此时在培养容器2的内容液中产生摇荡，与此同时，因保持板41抵接于基台6时的冲击而产生的振动使得细胞在内容液中飞舞地扩散，培养容器2的内容液因此而受到搅拌。

在像这样搅拌培养容器2的内容液时，为了使对细胞造成的损伤更少，更加高效地搅拌培养容器2的内容液，优选使基台6上水平地支撑的保持板41缓慢地向上方转动，在保持板41达到最大倾斜角度θ_max后，利用下落使保持板41向下方转动，利用基台6承受下落的保持板41时产生的冲击，对培养容器2施加振动。虽然没有特别地图示，然而在对培养容器2施加因保持板41抵接于基台6时的冲击而产生的振动时，可以根据在更加高效地搅拌培养容器2的内容液的方面适于对培养容器2施加振动的位置，在基台6上设置与保持板41抵接的凸部。

另外，在利用下落使保持板41向下方转动时，例如可以利用具有轮廓为圆弧状的第一凸轮面51、和轮廓为直线状的第二凸轮面52的平板凸轮5来构成凸轮机构，恰当地设定凸轮面51、52的曲率、使平板凸轮5旋转的驱动轴53的位置及转速，利用第一凸轮面51使保持板41向上方转动，在切换为第二凸轮面52时使平板凸轮5离开保持板41(参照图2(f))，由此利用下落使保持板41向下方转动。

另外，也可以通过在切换为第二凸轮面52时使平板凸轮6仍旧接触保持板4，并且恰当地设定凸轮面51、52的曲率、驱动轴53的位置及转速，而不对培养容器2施加冲击地摇动培养容器2，轻缓地搅拌培养容器2的内容液。

而且，如前所述，培养容器2的形状可以制成长方形，保持板41的形状也是与培养容器2的形状匹配地设计，然而在将保持板41制成长方形的情况下，设置转动轴42的一个端缘可以短边侧，也可以是长边侧。

另外，在使悬浮系的细胞活化后将细胞从培养面剥离的情况下，或如前所述地将贴壁系的细胞从培养面剥离的情况下，也可以将这样的培养容器2的内容液的搅拌机构作为细胞剥离机构使用。

而且，虽然未图示，然而优选在细胞培养系统中，具备用于观察各培养容器2内的细胞、培养基的状态的观察装置。作为观察装置，例如可以使用包含CCD照相机、物镜、照明、以及信息处理装置等的装置。该情况下，可以从具有观察孔的水平地载放在装载台上的培养容器2的上方照射光，从观察孔的下方利用CCD照相机和物镜在给定的时机自动地拍摄培养容器2内的细胞等。此后，将所得的图像数据发送到信息处理装置，在信息处理装置中分析图像数据，可以算出培养容器2内的细胞数、细胞密度等。该设置对于以后的实施方式也相同。

[细胞培养方法]

下面，参照图1～图4对本实施方式的细胞培养方法进行详细说明。

本实施方式的细胞培养方法是使用多个培养容器来培养细胞的细胞培养方法，其特征在于，多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，在多个培养容器中的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将向多个培养容器供给培养基的培养基供给容器与第一培养容器使用管道连接，并且在第一培养容器处依次使用管道连接多个培养容器中的其他培养容器，在第一培养容器中开始细胞的培养，在第一培养容器中的培养结束后，从第一培养容器向与第一培养容器连接的第二培养容器移送含有经过培养的细胞的细胞悬浮液，然后从培养基供给容器向第一培养容器供给培养基，经过给定时间后，从第一培养容器向第二培养容器供给培养基，在第二培养容器中进行细胞的培养，在第二培养容器中的培养结束后，在有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器的情况下，反复进行向下一个培养容器的细胞悬浮液的移送、向结束了培养的培养容器的培养基的供给、从结束了培养的培养容器向下一个培养容器的培养基的供给、以及下一个培养容器中的细胞的培养，直至没有与结束了培养的培养容器连接的下一个培养容器。

具体而言，本实施方式的细胞培养方法可以采用如下的方法，即，具有：(1)容器连接工序、(2)一次培养工序、(3)细胞移送工序1、(4)培养基流加工序1、(5)二次培养工序、(6)细胞移送工序2、(7)培养基流加工序2、(8)三次培养工序、(9)取样工序、和(10)浓缩工序。

而且，在细胞培养系统中的培养容器2的个数为两个的情况下，可以省略(6)～(8)，并且在二次培养容器2b中具备取样管而进行(9)～(10)。另外，在细胞培养系统中的培养容器2的个数为四个以上的情况下，可以对四个以上的部分反复进行(6)～(8)。此外，也可以省略(9)及(10)。

(1)容器连接工序

首先，将本实施方式的细胞培养方法中所用的培养基容器1与多个培养容器2如图1所示地连接，构成封闭体系的细胞培养系统。

即，将培养基容器1、一次培养容器2a、二次培养容器2b、三次培养容器2c依照该顺序使用移送管道3连接。

此时，在一次培养容器2a中，收容含有进行培养的细胞和培养基的细胞悬浮液而连接。另外，向培养基容器1中填充用于向培养容器2供给的培养基而连接。将二次培养容器2b与三次培养容器2c保持为空地连接。在培养基容器1与培养容器2之间的移送管道3具备泵，利用该泵进行培养基的移送等。另外，可以在移送管道3上适当地具备三向旋塞阀，利用它们来控制送液流路。

另外，如图3所示，多个培养容器2被以越是与培养基容器1更近地连接的装置就处于相对越高的位置的方式配置。即，一次培养容器2a被配置于最高的位置，二次培养容器2b被配置于次高的位置，三次培养容器2c被配置于最低的位置。通过将培养容器2像这样配置，将一次培养容器2a如图4所示地倾斜，就能够将一次培养容器2a的内容液经由一次培养容器2a的下侧的端口和移送管道3，利用自然流送移送到二次培养容器2b。另外，虽然未图示，然而通过同样地倾斜二次培养容器2b，能够将二次培养容器2b的内容液经由二次培养容器2b的下侧的端口和移送管道3，利用自然流送移送到三次培养容器2c。而且，在图3、图4中，省略了搅拌机构。

另外，虽然未图示，然而优选将培养基容器1配置于与培养容器2相比相对较低的位置，例如可以配置于配置有培养容器的装载台13的下侧。由此，就能够防止培养基在意料之外地流入培养系统。

这样的多个培养容器2和培养基容器1的配置在以下的实施方式中也优选同样地采用。

此外，在本实施方式的细胞培养系统中，优选还具备用于计测载放有培养容器2的基台6的重量的计测机构。通过使用这样的计测机构，监测载放有培养容器2的基台6的重量的减少，就能够在产生从培养容器2中的漏液的情况下，检测出该情况。

(2)一次培养工序

若像这样构成细胞培养系统，则首先在一次培养容器2a中进行细胞培养。另外，与培养细胞的增殖等匹配地从培养基容器1使用泵向一次培养容器2a供给培养基。此时，优选使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。作为该移送速度，例如优选设为通常的移送速度的5％～50％左右，具体而言优选设为5mL/min～50mL/min，更优选设为10mL/min～30mL/min。

另外，在该一次培养工序中，为了使一次培养容器2a内的细胞分散，优选使用前述的搅拌机构，对一次培养容器2a反复施加振动，搅拌一次培养容器2a的内容液。优选对其他培养容器2也同样地进行这样的内容液的搅拌。

(3)细胞移送工序1

当一次培养容器2a内的细胞密度达到给定的细胞密度、一次培养工序结束时，继而从一次培养容器2a向二次培养容器2b进行培养细胞的移送。

此时，如图4所示，以使用于连接到二次培养容器2b的端口处于下侧的方式倾斜一次培养容器2a，将一次培养容器2a内的内容液(细胞悬浮液)向二次培养容器2b流送。由此，在一次培养容器2a中经过培养的细胞就被移送到二次培养容器2b。如此所述，在一次培养容器2a中经过培养的细胞被自然流送到二次培养容器2b，而在该流送结束的时刻，通常在一次培养容器2a中残存有细胞。

(4)培养基流加工序1

然后，从培养基容器1向一次培养容器2a中流加培养基。此时，优选与前述的一次培养工序中供给培养基的情况相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。

此后，在一次培养容器2a中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。作为该等待时间，例如优选设为2分钟到20分钟左右，更优选设为5分钟到10分钟左右。

然后，利用前述的搅拌机构，搅拌一次培养容器2a内的培养基。此后，从一次培养容器2a向二次培养容器2b移送培养基。

由此，例如可以在将培养基容器1中15℃以下的培养基的温度设为20℃以上后向二次培养容器2b移送。因此，低温的培养基不会被原样不变地向二次培养容器2b移送，从而能够抑制细胞的增殖效率因低温的培养基而降低。其后，培养基的温度自然升高到室温(例如37℃)。

另外，通过像这样将培养基移送到一次培养容器2a后移送到二次培养容器2b，就可以将残存于一次培养容器2a中的细胞与培养基一起移送到二次培养容器2b，从而能够减少细胞培养中的残存细胞。

(5)二次培养工序

当培养细胞及培养基被移送到二次培养容器2b时，即在二次培养容器2b中继续进行细胞的培养。另外，可以与培养细胞的增殖等匹配地从培养基容器1供给培养基，而此时也可以与培养基流加工序1相同地进行。

(6)细胞移送工序2

当二次培养容器2b内的细胞密度达到给定的细胞密度、二次培养工序结束时，继而从二次培养容器2b向三次培养容器2c进行培养细胞的移送。

此时，以使连接到三次培养容器2c的端口处于下侧的方式倾斜二次培养容器2b，将二次培养容器2b内的内容液(细胞悬浮液)向三次培养容器2c流送。由此，在二次培养容器2b中经过培养的细胞就被移送到三次培养容器2c。如此所述，在二次培养容器2b中经过培养的细胞被自然流送到三次培养容器2c中，而在该流送结束的时刻，通常在二次培养容器2b中残存有细胞。

(7)培养基流加工序2

然后，从培养基容器1向一次培养容器2a中流加培养基。此时，可以与培养基流加工序1相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。此后，与培养基流加工序1相同，在一次培养容器2a中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。

然后，在利用搅拌机构搅拌一次培养容器2a内的培养基后，将培养基从一次培养容器2a移送到二次培养容器2b。此后，在二次培养容器2b中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间而使培养基温度升高，然后利用搅拌机构搅拌二次培养容器2b内的培养基后，将培养基从二次培养容器2b移送到三次培养容器2c。

此时，由于是将培养基移送到一次培养容器2a和二次培养容器2b后移送到三次培养容器2c，因此可以将残存于一次培养容器2a和二次培养容器2b中的细胞与培养基一起移送到三次培养容器2c，从而能够明显地减少细胞培养中的残存细胞。

(8)三次培养工序

当培养细胞及培养基被移送到三次培养容器2c时，在三次培养容器2c中，继续进行细胞的培养。另外，可以与培养细胞的增殖等匹配地从培养基容器1供给培养基，而此时也可以与培养基流加工序2相同地进行。

而且，三次培养容器2c中的培养基量比一次培养容器2a、二次培养容器2b大，由变凉的培养基造成的影响比较小，因此可以将培养基向三次培养容器2c的移送速度设为通常的移送速度，例如可以设为100mL/min左右。

当培养基容器1的全部培养基被向培养容器2供给、培养基容器1变空时，可以将变空了的培养基容器1作为废液容器或细胞回收容器使用。

(9)取样工序

当三次培养容器2c中的细胞达到给定的细胞数或细胞密度时，即进行细胞的取样。而且，该取样工序也可以在扩增培养工序的途中进行。

此时，细胞的取样可以如下进行，即，通过抽拉取样管2c－1，而从三次培养容器2c向取样管2c－1内填充内容液，将取样管2c－1热熔接后切断。若如此操作，则可以在维持细胞培养系统的封闭体系的同时无菌地进行细胞的取样。

(10)浓缩工序

然后，从三次培养容器2c将内容液的上清液使用泵流送到作为废液容器的培养基容器1。由此，就可以提高三次培养容器2c内的内容液中的细胞密度，从而能够获得高浓度的细胞悬浮液。此后，可以从收容如此获得的高浓度的细胞悬浮液的三次培养容器2c中回收细胞。

如此所述，本实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统中，在向培养容器供给培养基时，向已经结束了培养的培养容器中注入培养基而经过给定时间后，将培养基移送到培养容器。因此，可以减少残存于结束了培养的培养容器中的细胞，并且可以在使培养基的温度升高后将培养基移送到培养容器，从而能够进一步提高细胞的增殖效率。

(第二实施方式)

下面，参照图5对本发明的第二实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统进行说明。

[细胞培养系统]

本实施方式的细胞培养系统是主要用于更加高效地培养淋巴细胞等悬浮系的细胞的系统，如图5所示，是多个培养基容器1和功能不同的多个培养容器被利用移送管道3连接的构成。这些的多个培养容器具备一个用于与其他容器进行内容物的移送的端口，培养基容器1与多个培养容器2被使用管道连接。

具体而言，本实施方式的细胞培养系统作为培养基容器1，具备培养基A供给容器1a和培养基B供给容器1b，并且作为多个培养容器，具备养生扩增培养容器20a(以下有时称作养生培养容器、或养生容器20a)、活化培养容器20b(以下有时称作活化容器20b)、以及扩增培养容器20c(以下有时称作扩增容器20c)，是将这些容器使用移送管道3连接的构成。

而且，多个培养容器并不限定于这三个，例如可以除去养生容器20a而设为活化容器20b和扩增容器20c这两个，另外也可以使用其他培养容器等而设为四个或五个、或其以上。

根据本实施方式的细胞培养系统，在养生容器20a中的培养结束、在活化容器20b中进行培养时，在向活化容器20b中注入培养基之前，首先向养生容器20a中注入培养基并等待给定时间后，向活化容器20b移送培养基，由此可以减少残存于养生容器20a中的细胞，并且可以使移送到活化容器20b的培养基的温度升高。另外，在扩增容器20c中进行培养时，在向扩增容器20c中注入培养基之前，向养生容器20a和/或活化容器20b中注入培养基并等待给定时间后，向扩增容器20c移送培养基，由此可以减少残存于养生容器20a和/或活化容器20b中的细胞，并且可以使移送到扩增容器20c的培养基的温度进一步升高。因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

[培养基供给容器]

培养基容器1是向培养容器供给用于培养细胞的培养基的容器，存放向养生容器20a、活化容器20b、以及扩增容器20c供给的培养基。

培养基容器1在图5中，由用于向养生容器20a和活化容器20b供给培养基A的培养基A供给容器1a、和用于向扩增容器20c供给培养基B的培养基B供给容器1b构成，在这一点上与第一实施方式不同。对于其他的方面可以设为与第一实施方式的培养基容器相同的构成。

[养生扩增培养容器]

养生容器20a是在用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的容器。即，对于从患者处刚刚采集的细胞、或冷冻保存后刚被解冻的细胞之类的因受到损伤而功能衰退的细胞，即使想要在原样不变的状态下使之活化也无法充分地进行，无法用于细胞的大量培养。因而，为了使这样的细胞增殖，要在细胞培养的初期的阶段进行在对该细胞进行养生的同时加以培养的培养工序(养生培养工序)，以恢复细胞本来的功能。此后，在细胞本来的功能恢复、细胞的增殖进行到一定程度后扩增培养面积，进行继续细胞的培养至达到给定的细胞密度的培养工序(扩增培养工序)。

养生容器20a是在这样的养生培养工序和扩增培养工序中所使用的培养容器，如图6所示，被与保持养生容器20a的保持件7一起使用。

养生容器20a是以软包材料作为材料以袋状(bag型)形成。所谓软包材料，是指对包装体赋予挠曲性及柔软性的包装材料。

另外，养生容器20a具有细胞培养所必需的透气性(氧及二氧化碳透过性)。由此，就可以以封闭体系(密闭系统)进行细胞培养。养生容器2优选在37℃、5％二氧化碳浓度的培养环境下使用。这对于活化容器20b、以及扩增容器20c也相同。

此外，为了可以看到内容物，养生容器20a的一部分或全部具有透明性。另外，养生容器20a优选具有低细胞毒性、低溶出性、以及辐射灭菌适应性。

作为满足这样的条件的养生容器20a的材料，优选聚乙烯系树脂。作为该聚乙烯系树脂，可以举出聚乙烯、乙烯与α－烯烃的共聚物、乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、使用了乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物与金属离子的离聚物等。另外，还可以使用聚烯烃、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅酮树脂等。

这样的养生容器20a的形状没有特别限定，然而例如可以制成长方形，在短边侧的一边具备一个端口，在该端口处连接有移送管道3。此外，经由该移送管道3，进行向活化容器20b的细胞悬浮液的移送、从培养基A供给容器1a向养生容器20a的培养基的流加、以及从养生容器20a向活化容器20b的培养基的移送。

另外，优选养生容器20a的四边被利用热封加以密封，并且养生容器20a内的收容部随着朝向移送管道3的安装部分而逐渐变窄。而且，养生容器20a也可以是借助吹塑成形得到的一体成型袋。

在保持养生容器20a的保持件7中，设有多个凹部701，具有底板70和侧板71，所述底板70保持养生容器20a的宽度方向中央部，所述侧板71被沿着底板70的两侧端缘设置而保持养生容器20a的宽度方向侧缘部，能够以其下端侧为轴转动，以便可以变为沿垂直或倾斜方向立起的状态、和与底板70水平地倒伏的状态。图6表示出将侧板71与底板70水平地倒伏的状态。而且，也可以将多个凹部701作为贯穿孔来构成。

为了将养生容器20a安装于保持件7中而保持，在保持件7的侧板71中，竖立设置有紧固构件。与此同时，在养生容器20a的四角，穿设有卡止于紧固构件的孔。由此，通过将养生容器20a的各孔卡止于各个紧固构件，而将养生容器20a安装于保持件7中，如图6所示，以侧板71与底板70水平地倒伏的状态的保持件7的几乎全面将养生容器20a保持。此后，随着从侧板71立起的状态转动为与底板70水平地倒伏的状态，养生容器20a的四角被牵拉，从而对养生容器20a施加张力。

即，在侧板71处于立起的状态时，保持于底板70上的养生容器20a因内容物的重量而部分落入凹部701内地挠曲，由此在养生容器20a的底面形成凹坑20a－1。此后，当侧板71转动而变为与底板70水平地倒伏的状态时，养生容器20a的宽度方向端缘部也与侧板71一起倒伏，与之相伴，养生容器20a的四角由紧固构件牵拉而施加张力，养生容器20a的挠曲被消除，形成于养生容器20a的底面的凹坑20a－1消失。

根据这样的养生容器20a，在细胞培养开始时，若在养生容器20a中收容含有细胞和培养基的细胞悬浮液，细胞就会向养生容器20a的底面沉降，而此时若事先将侧板71设为立起的状态，沉降的细胞就会会集在形成于养生容器20a的底面的凹坑20a－1中，细胞密度得到提高。

因此，在细胞培养开始时可以在提高了细胞密度的状态下进行培养，从而可以更加高效地恢复细胞本来的功能。具体而言，例如，在培养淋巴细胞等悬浮系细胞的情况下，因细胞会集在形成于养生容器20a的底面的凹坑20a－1中，而使细胞所生成的细胞因子等活化物质的浓度局部地提高，另外，因产生细胞间的相互作用，而能够在提高了细胞活性的状态下进行培养。

此后，通过对养生容器20a施加张力而消除挠曲，就可以在使形成于养生容器20a的底面的凹坑20a－1消失的同时，扩大养生容器20a内的培养面积。因此，可以不进行容器的转移地从养生培养工序迁移到扩增培养工序，从而能够实现对细胞的损伤的减少、污染的风险的降低。

另外，通过在细胞的增殖进行一定程度后扩大养生容器20a内的培养面积，可以在同一容器内维持合适的细胞密度的同时，高效地培养细胞。

因此，本实施方式的养生容器20a是可以特别合适地用于如下情况的容器，即，对于从患者处刚刚采集的细胞、或冷冻保存后刚被解冻的细胞之类的因受到损伤而功能衰退的细胞进行养生，在恢复细胞本来的功能的同时，高效地进行培养。

[活化培养容器]

活化容器20b是在为了使细胞活化的细胞培养中所用的容器。在活化容器20b内的底面上，抗CD3抗体等使细胞活化的物质被固相化，收容于活化容器20b中的细胞与该物质结合而被活化。抗CD3抗体可以适用于使淋巴细胞活化。

活化容器20b与养生容器相同，是以软包材料作为材料而以袋状(bag型)形成，为了可以看到内容物，一部分或全部具有透明性。另外，活化容器20b优选与养生容器20a相同，具有细胞培养所必需的透气性(氧及二氧化碳透过性)，具有低细胞毒性、低溶出性、以及辐射灭菌适应性。作为活化容器20b的材料，可以使用与养生容器20a相同的材料。

活化容器20b的形状没有特别限定，然而例如可以制成长方形，在短边侧的一边具备一个端口，在该端口处连接有移送管道3。此外，经由该移送管道3，进行向扩增容器20c的细胞悬浮液的移送、从培养基A供给容器1a或养生容器20a向活化容器20b的培养基的流加、以及从活化容器20b向扩增容器20c的培养基的移送。

另外，优选活化容器20b的四边被利用热封加以密封，并且活化容器20b内的收容部随着朝向移送管道3的安装部分而逐渐变窄。而且，活化容器20b也可以是借助吹塑成形得到的一体成型袋。

优选使活化容器20b的容量比养生容器20a的容量大，例如可以合适地使用养生容器20a的容量的2倍以上的容器。

[扩增培养容器]

扩增容器20c是在用于使细胞大量地增殖的细胞培养中所用的容器。

扩增容器20c的形状没有特别限定，然而例如可以制成长方形，在其一边具备一个用于与其他容器进行内容物的移送的端口，在该端口处连接有移送管道3。此外，经由该移送管道3，进行向作为废液容器的培养基容器1的上清液的移送、向作为回收容器的培养基容器1的细胞悬浮液的移送、从培养基B供给容器1b或养生容器20a或活化容器20b向扩增容器20c的培养基的流加。另外还具备用于连接取样管20c－1的端口。

扩增容器20c是为了使细胞大量地增殖而使用，因此优选使用容量大的容器，例如可以合适地使用活化容器20b的容量的10倍左右的容器。

关于本实施方式的细胞培养系统的扩增容器20c的其他方面可以设为与第一实施方式的培养容器2(三次培养容器2c)相同的构成。另外，移送管道3也可以设为与第一实施方式相同的管道。

[细胞培养方法]

下面，参照图5及图6，对本实施方式的细胞培养方法进行详细说明。

本实施方式的细胞培养方法的特征在于，在所培养的细胞为悬浮系的细胞的情况下，作为多个培养容器，使用用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器、用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、以及用于使细胞增殖的细胞培养中所用的扩增培养容器，在养生培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将培养基供给容器、养生培养容器、活化培养容器、和扩增培养容器依照该顺序连接，在养生培养容器中使受到损伤的细胞的功能恢复后，从养生培养容器向活化培养容器移送含有经过培养的细胞的细胞悬浮液，从培养基供给容器向养生培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从养生培养容器向活化培养容器供给培养基，在活化培养容器中进行细胞的培养，在活化培养容器中使细胞活化后，从活化培养容器向扩增培养容器移送含有经过活化的细胞的细胞悬浮液，从培养基供给容器向养生培养容器和/或活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从养生培养容器和/或活化培养容器向扩增培养容器供给培养基，在扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

具体而言，本实施方式的细胞培养方法可以采用如下的方法，即，具有：(1)容器连接工序、(2)养生培养工序、(3)扩增培养工序、(4)细胞移送工序1、(5)培养基流加工序1、(6)活化培养工序、(7)细胞移送工序2、(8)培养基流加工序2、(9)扩增培养工序、(10)取样工序、(11)浓缩工序。

而且，在连接使用两个以上的扩增容器20c的情况下，对各扩增容器20c的每一个反复进行(7)～(9)。另外，也可以省略(10)和(11)。本实施方式中，由于可以与第一实施方式相同地进行(10)和(11)，因此以下省略它们的说明。

(1)容器连接工序

首先，将本实施方式的细胞培养方法中所用的培养基容器1和多个培养容器2如图5所示地连接，构成封闭体系的细胞培养系统。

即，将培养基容器1、养生容器20a、活化容器20b、扩增容器20c依照该顺序使用移送管道3连接。

此时，在养生容器20a中，收容含有进行培养的细胞和培养基的细胞悬浮液而连接。另外，在培养基容器1当中，在培养基A供给容器1a中填充用于向养生容器20a及活化容器20b供给的培养基A，在培养基B供给容器1b中填充用于向扩增容器20c供给的培养基B而连接。将活化容器20b与扩增容器20c保持为空地连接。在培养基容器1与养生容器20a之间的移送管道3上具备泵，利用该泵进行培养基的移送等。另外，在移送管道3上适当地具备三向旋塞阀，利用它们可以控制送液流路。

(2)养生培养工序

若像这样构成细胞培养系统，则首先在养生容器20a中进行细胞培养，进行受到损伤的细胞的功能恢复。

此时，保持养生容器20a的保持件7被设为使侧板立起的状态而使用。养生容器20a内的底面因内容物的重量而部分地挠曲，形成了凹坑。此后，细胞被会集在该凹坑中，在细胞培养开始时可以以合适的细胞密度进行培养。

另外，与培养细胞的增殖等匹配地从培养基A供给容器1a使用泵向养生容器20a供给培养基A。此时，优选与第一实施方式相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。

在养生培养工序中，为了使养生容器20a内的细胞分散，优选使用第一实施方式中所述的搅拌机构，搅拌养生容器20a的内容液。另外，可以在后述的活化培养工序中对活化容器20b进行这样的培养容器的内容液的搅拌，优选在扩增培养工序中对扩增容器20c进行。而且，在后述的活化培养工序和扩增培养工序的说明中，省略了这样的培养容器的内容液的搅拌的说明。

(3)扩增培养工序

当受到损伤的细胞的功能恢复、细胞的增殖进行一定程度而结束养生培养工序时，继而进行增培养工序。

该工序中，如图6所示，将保持件7的侧板以水平地倒伏的状态展开，扩大养生容器20a的培养面积而进行培养。

此时，由保持件7保持的养生容器20a的四角被牵拉，因而被施加张力而消除挠曲，形成于养生容器20a内的底面的凹坑消失。因此，可以在养生容器20a中使细胞分散到整个底面，培养至达到给定的细胞密度。

在该工序中，也与培养细胞的增殖等匹配地从培养基A供给容器1a使用泵向养生容器20a供给培养基A。另外，此时也优选与第一实施方式相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。

(4)细胞移送工序1

当养生容器20a内的细胞密度达到给定的细胞密度、养生培养工序结束时，继而从养生容器20a向活化容器20b进行培养细胞的移送。

此时，以使用于连接到活化容器20b的端口处于下侧的方式倾斜养生容器20a，将养生容器20a内的内容液向活化容器20b流送。由此，在养生容器20a中经过培养的细胞就被移送到活化容器20b。如此所述，在养生容器20a中经过培养的细胞被向活化容器20b自然流送，而在该流送结束的时刻，通常在养生容器20a中残存有细胞。

(5)培养基流加工序1

然后，从培养基A供给容器1a向养生容器20a中流加培养基。此时，优选与第一实施方式相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。

此后，在养生容器20a中收容有培养基的状态下，与第一实施方式相同地保持原样地等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。

然后，利用前述的搅拌机构，搅拌养生容器20a的内容液。此后，将培养基从养生容器20a向活化容器20b移送。

通过像这样将培养基移送到养生容器20a后移送到活化容器20b，就可以将残存于养生容器20a中的细胞与培养基一起移送到活化容器20b，从而能够减少细胞培养中的残存细胞。

(6)活化培养工序

当向活化容器20b的培养细胞和培养基的移送结束时，即在活化容器20b中进行细胞的活化。在培养淋巴细胞的情况下，抗CD3抗体被固相化在活化容器20b内的底面，淋巴细胞因与该抗CD3抗体结合而被活化。

在活化培养工序中，也可以与培养细胞的增殖等匹配地向活化容器20b供给培养基。此时也优选与培养基流加工序1相同地进行培养基的流加。

(7)细胞移送工序2

当在活化容器20b中细胞被充分地活化、活化培养工序结束时，继而从活化容器20b向扩增容器20c进行培养细胞的移送。

此时，可以将前述的搅拌机构作为细胞剥离机构使用，对活化容器20b施加较强的振动，将与被固相化在培养面的抗体结合了的细胞从培养面剥离。

此后，以使用于连接到扩增容器20c的端口处于下侧的方式倾斜活化容器20b，将活化容器20b内的内容液向扩增容器20c流送。由此，在活化容器20b中经过培养的细胞就被移送到扩增容器20c。如此所述，在活化容器20b中经过活化的细胞被向扩增容器20c自然流送，而在该流送结束的时刻，通常在活化容器20b中残存有细胞。

(8)培养基流加工序2

然后，从培养基B供给容器1b向养生容器20a中流加培养基。此时也可以与培养基流加工序1相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。此后，与培养基流加工序1相同，在养生容器20a中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。

然后，在利用搅拌机构搅拌养生容器20a的内容液后，从养生容器20a向活化容器20b移送培养基。此后，在活化容器20b中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间而使培养基温度升高，然后利用搅拌机构搅拌活化容器20b的内容液后，从活化容器20b向扩增容器20c移送培养基。

此时，由于在将培养基移送到养生容器20a和活化容器20b后移送到扩增容器20c，因此可以将残存于养生容器20a和活化容器20b中的细胞与培养基一起向扩增容器20c移送，从而能够明显地减少细胞培养中的残存细胞。

(9)扩增培养工序

当向扩增容器20c的培养细胞和培养基的移送结束时，即在扩增容器20c中进行细胞的大量增殖。细胞的增殖被进行至扩增容器20c中的细胞数或细胞密度达到给定的大小。

与培养细胞的增殖等匹配地从培养基B供给容器1b使用泵向扩增容器20c供给培养基B。此时也可以与培养基流加工序2相同地进行培养基的流加。

当培养基B供给容器1b中的全部的培养基被向扩增容器20c供给，培养基B供给容器1b变空时，可以将变空了的培养基B供给容器1b作为废液容器或细胞回收容器使用。

如此所述，根据本实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统，在培养悬浮系的细胞的情况下，可以减少残存于培养结束了的培养容器中的细胞，并且可以在使培养基的温度升高后向培养容器移送培养基。因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

(第三实施方式)

下面，参照图7对本发明的第三实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统进行说明。

本实施方式是第二实施方式的变形例，本实施方式的细胞培养系统如图7所示，是培养基容器1、活化容器20b、扩增容器20c、和回收容器8被利用移送管道3连接了的构成。

即，本实施方式的细胞培养系统是从第二实施方式的细胞培养系统中省略了养生容器20a和培养基A供给容器1a、追加了回收容器8的构成。而且，本实施方式中，也可以具备多个回收容器8。

本实施方式的细胞培养方法中，不进行养生培养工序，而是从活化培养工序起开始细胞培养。此后，可以利用回收容器8，回收扩增容器20c的上清液、或从扩增容器20c回收细胞悬浮液。

对于其他的方面，可以设为与第二实施方式相同。

如此所述，根据本实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统，在培养不需要进行养生培养的悬浮系的细胞等情况下，可以减少残存于培养结束了的培养容器中的细胞，并且可以在使培养基的温度升高后向培养容器移送培养基。因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

(第四实施方式)

下面，参照图8，对本发明的第四实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统进行说明。

[细胞培养系统]

本实施方式的细胞培养系统是主要用于更加高效地培养成纤维细胞等贴壁系的细胞的系统，如图8所示，是如下的构成，即，废液回收容器12(以下有时称作废液容器12)、培养基容器1、清洗液供给容器9(以下有时称作清洗液容器9)、酶溶液供给容器10(以下有时称作酶容器10)、阻碍剂溶液供给容器11(以下有时称作阻碍剂容器11)、培养面积不同的多个培养容器2(一次培养容器2a，二次培养容器2b，三次培养容器2c)被使用移送管道3连接。以下，对于与第一实施方式相同的构成省略说明。

[清洗液供给容器]

清洗液容器9是向培养容器2供给清洗液的容器，如图8所示，在培养基容器1与一次培养容器2a之间使用管道连接。

清洗液是为了在向培养容器2内供给酶溶液之前，先冲掉残存于培养容器2内的培养基而使用的。

作为该清洗液，可以使用生理盐水、PBS(磷酸缓冲生理盐水)等通常所使用的清洗液。

[酶溶液供给容器]

酶容器10是向培养容器2供给用于从培养容器2内的底面剥离经过培养的细胞的酶溶液的容器。

酶溶液是当细胞在培养容器2的整个培养面增殖而结束培养容器2中的细胞培养时，在将经过培养的细胞移送到下一个培养容器2之前，为了将细胞从培养容器2内的底面剥离而使用的。作为该酶溶液，可以使用将贴壁系的细胞从容器内的底面剥离时通常能够使用的酶溶液，例如可以使用胰蛋白酶等蛋白酶。

[阻碍剂溶液供给容器]

阻碍剂容器11是向培养容器2供给用于阻碍上述酶溶液中的酶的活性的阻碍剂溶液的容器。

阻碍剂溶液是为了阻碍用于使细胞从培养容器2内的底面剥离的酶的活性而使用的溶液。作为该阻碍剂溶液，可以使用阻碍上述酶的活性时通常能够使用的溶液，例如可以使用胰蛋白酶抑制剂等蛋白酶抑制剂。而且，在可以利用培养基阻碍酶的活性的情况下，也可以在本实施方式的细胞培养系统中省略阻碍剂容器11。

[废液回收容器]

废液容器12是从培养容器2回收清洗液、酶溶液、阻碍剂溶液、以及培养基等废液的容器，可以利用泵经由移送管道3将它们回收。

[细胞培养方法]

下面，参照图8，对本实施方式的细胞培养方法进行详细说明。

本实施方式的细胞培养方法的特征在于，在所培养的细胞为贴壁系的细胞的情况下，作为多个培养容器，使用培养面积不同的培养容器，在多个培养容器中的培养面积最小的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，在向多个培养容器供给培养基的培养基供给容器处以培养面积由小到大的顺序连接多个培养容器，在第一培养容器中开始细胞的培养，在第一培养容器中的培养结束后，从第一培养容器向与第一培养容器连接的第二培养容器移送含有经过培养的细胞的细胞悬浮液，然后从培养基供给容器向第一培养容器供给培养基，经过给定时间后，从第一培养容器向第二培养容器供给培养基，在第二培养容器中进行细胞的培养，在第二培养容器中的培养结束后，在有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器的情况下，反复进行向下一个培养容器的细胞悬浮液的移送、向培养结束了的培养容器的培养基的供给、从培养结束了的培养容器向下一个培养容器的培养基的供给、以及下一个培养容器中的细胞的培养，直至没有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器。

具体而言，本实施方式的细胞培养方法可以具有：(1)容器连接工序、(2)一次培养工序、(3)培养基排出工序1、(4)清洗工序1、(5)细胞剥离工序1、(6)酶活性阻碍工序1、(7)细胞移送工序1、(8)培养基流加工序1、(9)酶等排出工序1、(10)培养基流加工序2、(11)二次培养工序、(12)培养基排出工序2、(13)清洗工序2、(14)细胞剥离工序2、(15)酶活性阻碍工序2、(16)细胞移送工序2、(17)培养基流加工序3、(18)酶等排出工序2、(19)培养基流加工序4、(20)三次培养工序。而且，在连接使用4个以上的培养容器2的情况下，作为四次培养以后的工序，对各培养容器2再反复进行(12)～(20)的工序。

(1)容器连接工序

首先，将本实施方式的细胞培养方法中所用的培养基容器1与多个培养容器2等如图8所示地连接，构成封闭体系的细胞培养系统。

具体而言，使用移送管道3将废液容器12、培养基容器1、清洗液容器9、酶容器10、阻碍剂容器11、一次培养容器2a、二次培养容器2b、三次培养容器2c连接。另外，分别向培养基容器1中填充用于向培养容器2供给的培养基，向清洗液容器9中填充清洗液，向酶容器10中填充酶溶液，向阻碍剂容器11中填充阻碍剂溶液并连接。将二次培养容器2b、三次培养容器2c、以及废液容器12保持为空地连接。在培养基容器1与培养容器2之间的移送管道3上具备泵，利用该泵进行培养基的移送等。另外，在移送管道3上恰当地具备三向旋塞阀，利用它们可以控制送液流路。

(2)一次培养工序

若像这样构成细胞培养系统，则首先在培养面积最小的一次培养容器2a中开始细胞培养。一次培养容器2中，进行细胞的一次培养。另外，与培养细胞的增殖等匹配地从培养基容器1使用泵向一次培养容器2a供给培养基。此时，优选与第一实施方式相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。

(3)培养基排出工序1

若细胞在一次培养容器2a的整个培养面增殖，则一次培养完结。此后，将培养中使用过的培养基用泵从一次培养容器2a移送到废液容器12而排出。

(4)清洗工序1

然后，从清洗液容器9将清洗液流送到一次培养容器2a，使用前述的搅拌机构搅拌一次培养容器2a内的清洗液后排出。

由此，就可以除去残存于一次培养容器2a中的培养基，在下一个细胞剥离工序1中向一次培养容器2a流送酶溶液时，能够防止酶的活性受培养基阻碍。

(5)细胞剥离工序1

然后，从酶容器10将酶溶液流送到一次培养容器2a，剥离贴附在一次培养容器2a内的底面的细胞。

此时，优选通过使用前述的搅拌机构搅拌一次培养容器2a的内容液来促进细胞的剥离。这样的使用了搅拌机构的细胞的剥离促进也可以同样地应用于二次培养容器2b及其以后所连接的其他培养容器。

(6)酶活性阻碍工序1

然后，从阻碍剂容器11将阻碍剂溶液流送到一次培养容器2a，阻碍一次培养容器2a内的酶活性。

(7)细胞移送工序1

然后，将被剥离出的细胞从一次培养容器2a向二次培养容器2b移送。

此时，通过以使用于与二次培养容器2b连接的端口处于下侧的方式倾斜一次培养容器2a，就可以将含有被剥离出的细胞的内容液从一次培养容器2a向二次培养容器2b自然流送。

而且，在将被剥离了的细胞从二次培养容器2b向三次培养容器2c移送的情况下也相同，可以通过以使用于连接到三次培养容器2c的端口处于下侧的方式倾斜二次培养容器2b而进行。

(8)培养基流加工序1

然后，从培养基容器1向一次培养容器2a中流加培养基。此时，优选与第一实施方式相同，使培养基的移送速度比通常慢，在使培养基的温度升高的同时进行移送。此后，在一次培养容器2a中收容有培养基的状态下，等待经过给定时间，由此使培养基温度升高。

然后，在利用搅拌机构搅拌一次培养容器2a的内容液后，将培养基从一次培养容器2a移送到二次培养容器2b。

通过像这样将培养基移送到一次培养容器2a后移送到二次培养容器2b，就可以在使培养基的温度升高后向二次培养容器2b供给，并且还可以减少一次培养容器2a中的残存细胞，因此能够进一步提高细胞的增殖效率。

(9)酶等排出工序1

在二次培养容器2b内，若细胞贴附于底面，则使用泵将酶溶液、阻碍剂溶液、以及培养基从二次培养容器2b排出到废液容器12。

(10)培养基流加工序2

然后，向二次培养容器2b再次供给培养基，而此时也优选与培养基流加工序1相同，从培养基容器1向一次培养容器2a中流加培养基，使培养基的温度升高后移送到二次培养容器2b。

由此，就可以在使培养基的温度升高后向二次培养容器2b供给，并且可以进一步减少一次培养容器2a中的残存细胞，从而能够进一步提高细胞的增殖效率。

(11)二次培养工序

利用以上的工序，在培养面积更大的二次培养容器2b中进行细胞培养。另外，与培养细胞的增殖等匹配地使用泵从培养基容器1向二次培养容器2b供给培养基。此时也优选与培养基流加工序1相同地进行培养基的流加。

此后，作为(12)培养基排出工序2～(19)培养基流加工序4的工序，进行与前述的(3)培养基排出工序1～(10)培养基流加工序2相同的工序。此时，优选与第一实施方式的培养基流加工序2相同地进行培养基的流加。

然后，在(20)三次培养工序中，在培养面积更大的三次培养容器2c中进行细胞培养，与培养细胞的增殖等匹配地使用泵从培养基容器1向三次培养容器2c供给培养基。此时也可以与第一实施方式的培养基流加工序2相同地进行培养基的流加。

此后，若细胞在三次培养容器2c的整个培养面增殖，则三次培养完结，能够从三次培养容器2c中回收大量地增殖了的培养细胞。

如此所述，根据本实施方式的细胞培养方法、以及细胞培养系统，在培养贴壁系的细胞的情况下，可以减少结束了培养的培养容器中残存的细胞，并且可以在使培养基的温度升高后向培养容器移送培养基。因此，能够进一步提高细胞的增殖效率。

以上，给出优选的实施方式而对本发明进行了说明，然而本发明并不限定于前述的实施方式，当然也可以在本发明的范围中实施各种变更。

例如，在前述的第二实施方式中，对使用养生容器20a、活化容器20b、以及扩增容器20c的例子进行了说明，然而可以使用功能不同的其他的多个容器，构成本发明的实施方式的细胞培养系统，或者对上述各实施方式的构成加以组合等，适当地进行变更。

产业上的可利用性

本发明可以在使用细胞的培养容器以封闭体系大量地培养细胞的再生医疗、抗体医药生产等中合适地利用。

虽然在上述部分详细地说明了几个本发明的实施方式和/或实施例，然而本领域技术人员很容易不实质性地脱离本发明的新的教导及效果地对这些作为例示的实施方式和/或实施例施加很多变更。因而，这些的很多变更包含于本发明的范围中。

对于该说明书中记载的文献及成为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全都引用到本文中。

符号的说明

1 培养基供给容器(培养基容器)，

1a 培养基A供给容器，

1b 培养基B供给容器，

2 培养容器，

2a 一次培养容器，

20a 养生扩增培养容器(养生培养容器，养生容器)，

20a－1 凹坑，

2b 二次培养容器，

20b 活化培养容器(活化容器)，

2c 三次培养容器，

2c－1 取样管，

20c 扩增培养容器(扩增容器)，

20c－1 取样管，

3 移送管道，

4 装载部，

41 保持板，

42 转动轴，

5 平板凸轮，

51 第一凸轮面，

52 第二凸轮面，

53 驱动轴，

6 基台，

7 保持件，

70 底板，

701 凹部，

71 侧板，

8 回收容器，

9 清洗液供给容器(清洗液容器)，

10酶溶液供给容器(酶容器)，

11 阻碍剂溶液供给容器(阻碍剂容器)，

12 废液回收容器(废液容器)，

13 装载台。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种细胞培养方法，其特征在于，使用多个培养容器来培养细胞，

所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

在所述多个培养容器的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，

将向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器与所述第一培养容器使用管道连接，并且依次使用管道将所述多个培养容器中的其他培养容器与所述第一培养容器连接，

在所述第一培养容器中开始细胞的培养，

所述第一培养容器中的培养结束后，从所述第一培养容器将含有经过培养的细胞的细胞悬浮液移送到与所述第一培养容器连接的第二培养容器，然后从所述培养基供给容器向所述第一培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述第一培养容器向所述第二培养容器供给培养基，在所述第二培养容器中进行细胞的培养，

所述第二培养容器中的培养结束后，在有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器的情况下，反复进行向所述下一个培养容器的细胞悬浮液的移送、向所述培养结束了的培养容器的培养基的供给、从所述培养结束了的培养容器向所述下一个培养容器的培养基的供给、以及所述下一个培养容器中的细胞的培养，直至没有与所述培养结束了的培养容器连接的所述下一个培养容器。

2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为悬浮系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用：

用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器、

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、以及

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的扩增培养容器，

在所述养生培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将所述培养基供给容器、所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器依照该顺序连接，

在所述养生培养容器中使受到损伤的细胞的功能恢复后，从所述养生培养容器将含有经过培养的细胞的细胞悬浮液移送到所述活化培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述养生培养容器向所述活化培养容器供给培养基，在所述活化培养容器中进行细胞的培养，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器和/或所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述养生培养容器和/或所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

3.根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述养生培养容器向所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

4.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为悬浮系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用：

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、以及

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的扩增培养容器，

在所述活化培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将所述培养基供给容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器依照该顺序连接，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

5.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为贴壁系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用培养面积不同的培养容器，

在所述多个培养容器中的培养面积最小的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，以培养面积由小到大的顺序将所述多个培养容器与向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器连接，在所述第一培养容器中开始细胞的培养。

6.根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于，

将酶溶液供给容器使用管道连接在所述培养基供给容器与所述第一培养容器之间，所述酶溶液供给容器向所述培养容器供给用于将经过培养的细胞从所述培养容器内的底面剥离的酶溶液，

从所述酶溶液供给容器向所述培养容器流送酶溶液，将经过培养的细胞从所述培养容器内的底面剥离，进行含有经过培养的细胞的细胞悬浮液的移送。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，

对于与所述培养基供给容器连接的第一培养容器、与所述第一培养容器连接的第二培养容器、此外在有其他所连接的培养容器的情况下还有这些其他培养容器，越是与所述培养基供给容器更近地连接的装置，则配置于相对越高的位置，

通过倾斜各个所述培养容器，而进行从所述培养容器向其后连接的培养容器的细胞悬浮液的移送。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，

在装载部处一个个地或一并地保持所述多个培养容器，所述装载部具有平板状的一个或两个以上的保持板，在基台上枢轴支撑所述保持板的设于一个端缘的转动轴，

通过以所述转动轴为中心使所述保持板向上方转动，而在将所述多个培养容器一个个地或同时地倾斜的同时，向初期位置的上方移动，

然后，通过以所述转动轴为中心使所述保持板向下方转动，在所述多个培养容器一个个地或同时地回到初期位置时使所述保持板抵接于所述基台，而产生对所述多个培养容器施加的振动。

9.一种细胞培养体系，其特征在于，是具备用于培养悬浮系的细胞的多个培养容器的细胞培养体系，

具备：

向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器、和

作为所述多个培养容器的、

用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器、

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的一个或两个以上的扩增培养容器，

所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

所述培养基供给容器、所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器被依照该顺序使用管道连接。

10.一种细胞培养体系，其特征在于，是具备用于培养贴壁系的细胞的多个培养容器的细胞培养体系，

具备向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器、和

作为所述多个培养容器的培养面积不同的培养容器，

所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

在所述培养基供给容器处依照培养面积由小到大的顺序使用管道连接所述多个培养容器。

11.根据权利要求9或10所述的细胞培养体系，其特征在于，

具备：

装载部，其具有平板状的一个或两个以上的保持板，在基台上枢轴支撑所述保持板的设于一个端缘的转动轴；和

凸轮机构，其以所述保持板作为从动件，

所述多个培养容器被一个个地或一并地由所述装载部保持，

通过利用所述凸轮机构以所述转动轴为中心使所述保持板向上下反复转动，并且对所述多个培养容器一个个地或同时地施加所述保持板下动而抵接于所述基台时产生的振动，来搅拌所述多个培养容器的内容液。

12.(追加)根据权利要求1～8中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，

所述多个培养容器的至少任意一个具备用于取出经过培养的细胞的一部分的取样用的端口，在所述取样用的端口处连接取样管，所述取样管的与所述取样用的端口相反一侧的末端被密封，

抽拉所述取样管，使细胞悬浮液从连接有所述取样管的培养容器填充到所述取样管内，

将所述取样管热焊接后切断。

13.(追加)根据权利要求9～11中任一项所述的细胞培养体系，其特征在于，

所述多个培养容器的至少任意一个具备用于取出经过培养的细胞的一部分的取样用的端口，在所述取样用的端口处连接取样管，所述取样管的与所述取样用的端口相反一侧的末端被密封。

Claims (11)

1.一种细胞培养方法，其特征在于，使用多个培养容器来培养细胞，

所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

在所述多个培养容器的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，

将向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器与所述第一培养容器使用管道连接，并且依次使用管道将所述多个培养容器中的其他培养容器与所述第一培养容器连接，

在所述第一培养容器中开始细胞的培养，

所述第一培养容器中的培养结束后，从所述第一培养容器将含有经过培养的细胞的细胞悬浮液移送到与所述第一培养容器连接的第二培养容器，然后从所述培养基供给容器向所述第一培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述第一培养容器向所述第二培养容器供给培养基，在所述第二培养容器中进行细胞的培养，

所述第二培养容器中的培养结束后，在有与培养结束了的培养容器连接的下一个培养容器的情况下，反复进行向所述下一个培养容器的细胞悬浮液的移送、向所述培养结束了的培养容器的培养基的供给、从所述培养结束了的培养容器向所述下一个培养容器的培养基的供给、以及所述下一个培养容器中的细胞的培养，直至没有与所述培养结束了的培养容器连接的所述下一个培养容器。

2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为悬浮系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用：

用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器、

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、以及

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的扩增培养容器，

在所述养生培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将所述培养基供给容器、所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器依照该顺序连接，

在所述养生培养容器中使受到损伤的细胞的功能恢复后，从所述养生培养容器将含有经过培养的细胞的细胞悬浮液移送到所述活化培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述养生培养容器向所述活化培养容器供给培养基，在所述活化培养容器中进行细胞的培养，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器和/或所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述养生培养容器和/或所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

3.根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述养生培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述养生培养容器向所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，从所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

4.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为悬浮系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用：

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、以及

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的扩增培养容器，

在所述活化培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，将所述培养基供给容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器依照该顺序连接，

在所述活化培养容器中使细胞活化后，从所述活化培养容器将含有经过活化的细胞的细胞悬浮液移送到所述扩增培养容器，从所述培养基供给容器向所述活化培养容器供给培养基，经过给定时间后，在培养基的温度升高到给定的值以上后，从所述活化培养容器向所述扩增培养容器供给培养基，在所述扩增培养容器中进行细胞的培养，使细胞增殖。

5.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，

在所培养的细胞为贴壁系的细胞的情况下，作为所述多个培养容器，使用培养面积不同的培养容器，

在所述多个培养容器中的培养面积最小的第一培养容器中收容含有细胞及培养基的细胞悬浮液，以培养面积由小到大的顺序将所述多个培养容器与向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器连接，在所述第一培养容器中开始细胞的培养。

6.根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于，

将酶溶液供给容器使用管道连接在所述培养基供给容器与所述第一培养容器之间，所述酶溶液供给容器向所述培养容器供给用于将经过培养的细胞从所述培养容器内的底面剥离的酶溶液，

从所述酶溶液供给容器向所述培养容器流送酶溶液，将经过培养的细胞从所述培养容器内的底面剥离，进行含有经过培养的细胞的细胞悬浮液的移送。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，

对于与所述培养基供给容器连接的第一培养容器、与所述第一培养容器连接的第二培养容器、此外在有其他所连接的培养容器的情况下还有这些其他培养容器，越是与所述培养基供给容器更近地连接的装置，则配置于相对越高的位置，

通过倾斜各个所述培养容器，而进行从所述培养容器向其后连接的培养容器的细胞悬浮液的移送。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，

在装载部处一个个地或一并地保持所述多个培养容器，所述装载部具有平板状的一个或两个以上的保持板，在基台上枢轴支撑所述保持板的设于一个端缘的转动轴，

通过以所述转动轴为中心使所述保持板向上方转动，而在将所述多个培养容器一个个地或同时地倾斜的同时，向初期位置的上方移动，

然后，通过以所述转动轴为中心使所述保持板向下方转动，在所述多个培养容器一个个地或同时地回到初期位置时使所述保持板抵接于所述基台，而产生对所述多个培养容器施加的振动。

9.一种细胞培养系统，其特征在于，是具备用于培养悬浮系的细胞的多个培养容器的细胞培养系统，

具备：

向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器、和

作为所述多个培养容器的、

用于使受到损伤的细胞的功能恢复的细胞培养中所用的养生培养容器、

用于使细胞活化的细胞培养中所用的活化培养容器、

用于使细胞增殖的细胞培养中所用的一个或两个以上的扩增培养容器，

所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

所述培养基供给容器、所述养生培养容器、所述活化培养容器、和所述扩增培养容器被依照该顺序使用管道连接。

10.一种细胞培养系统，其特征在于，是具备用于培养贴壁系的细胞的多个培养容器的细胞培养系统，

具备向所述多个培养容器供给培养基的培养基供给容器、和

作为所述多个培养容器的培养面积不同的培养容器，

所述多个培养容器分别具备一个用于与其他容器移送内容物的端口，

在所述培养基供给容器处依照培养面积由小到大的顺序使用管道连接所述多个培养容器。

11.根据权利要求9或10所述的细胞培养系统，其特征在于，

具备：

装载部，其具有平板状的一个或两个以上的保持板，在基台上枢轴支撑所述保持板的设于一个端缘的转动轴；和

凸轮机构，其以所述保持板作为从动件，

所述多个培养容器被一个个地或一并地由所述装载部保持，

通过利用所述凸轮机构以所述转动轴为中心使所述保持板向上下反复转动，并且对所述多个培养容器一个个地或同时地施加所述保持板下动而抵接于所述基台时产生的振动，来搅拌所述多个培养容器的内容液。