CN102086438A - 用于细胞或组织工程生物培养的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物反应器和方法，尤其涉及一种细胞生物学、组织工程学和医学中进行种子细胞培养或者细胞与生物材料复合培养的反应器和方法。用于细胞或组织工程生物培养的方法，该方法将细胞或组织工程生物培养原料置于U形底面、W形底面或V形底面的培养容器中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器环形摆动，所述的环形摆动为培养容器以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动。本发明还公开了上述方法的一种装置。本发明通过外部环摆提供的动力，可在较理想的传质条件下，减少细胞的损伤，提供较为均一的培养环境。

Description

用于细胞或组织工程生物培养的装置和方法

技术领域

本发明涉及一种生物反应器和方法，尤其涉及一种细胞生物学、组织工程学和医学中进行种子细胞培养或者细胞与生物材料复合培养的反应器和方法。

背景技术

组织工程学是应用工程学和生命科学的原理和方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学。这种生物性替代物的构建需要由生物材料、种子细胞及合适培养环境，而能够将三者联系在一起的就是生物反应器。

在组织工程领域中，用于构建组织工程组织或器官的种子细胞多为贴壁依赖性细胞，而种子细胞的来源往往是通过原代培养的细胞，基于安全的角度考虑，这些细胞不宜通过基因改造等方法以增强其体外的繁殖和扩增能力，其体外大规模培养及快速较为困难；因此，对于种子细胞的培养对生物反应器的要求比用于其它用途的动物细胞更强调培养环境的合适性，使得种子细胞不仅仅能够在反应器内得到大量的扩增，还对细胞的遗传稳定性有更严格的要求，以保证在用于细胞治疗时的安全性。同时，生物反应器还用于构建组织工程组织、器官替代物，其构建方法要求将细胞复合与支架上，然后置入生物反应器内进行培养。对不同的组织工程产品构建物，其培养要求的条件是各不相同，在组织工程皮肤的体外构建过程中，要求有一定时间的气液界面培养，以使得组织工程皮肤表面的角质细胞能够与空气接触而产生复层化，使组织工程皮肤的功能得到加强；因此，在不同组织工程中应用的生物反应器往往具有自身的一些特点。目前常用的生物反应器的类型主要有：

滚瓶Roller bottle：是生物制药的主要的反应器，包括免疫、分子生物学、病毒疫苗的生产，高密度的植物细胞培养，以及人类的肿瘤细胞培养等。这种原始的生物反应器构造简单，操作方便，也可以作为组织工程种子细胞扩增。这种以旋转提供动力的反应器可以改善横向的传质，但纵向的传质仍然不佳。而且对于组织工程产品的构建，尤其是组织工程皮肤的构建，因为无法放置支架，这种生物反应器是无能无力的。

机械搅拌式生物反应器：也就是通过机械桨的搅拌作用，增进反应器内部的传质，但是由于机械桨的剪切作用不可避免地导致细胞的损伤。这种生物反应器主要用于非组织工程种子细胞的扩增，由于其机械桨对细胞造成了损伤，因此，这种生物反应器产出的细胞用作细胞治疗时，其安全性仍然值得考虑；在组织工程构建物的培养中，需要将构建物悬置于培养液中，操作复杂。

旋转壁式生物反应器：1990年，Kleis等人首先研制了该种生物反应器，随后美国国家航空与宇宙航行局对此进行改进并应用发到组织培养领域。旋转壁式生物反应器可以分为水平旋转与垂直旋转两种。这种生物反应器将培养液及培养物共处于两个同轴的内外圆筒之间，在步进电机带动下一起绕水平轴作旋转运动，内、外圆筒可以同时或反方向旋转。圆筒刚开始转速较慢，随着培养物体积的增大动态地增加转速以用来抵抗细胞的沉降。内壁是透气、不透液的多孔疏水性半透膜以提供氧气及排出二氧化碳。这是一种无气泡模式扩散进行气体交换的水平式旋转细胞培养系统。由于反应器内的培养液随着壁而产生旋转，培养液之间没有明显的速度梯度，因此产生的剪切力非常小，适合不同类型的细胞生长。但是，由于气体是通过膜的弥散而传质，因此存在有气体的传质不足。此外，这种反应器的培养装置是特制的，不易拆洗，由于内外筒之间的间隙较小，不能放置大块的组织工程构建物，也难以用于组织工程种子细胞的扩增。

在组织工程中应用其他方面的生物反应器还包括中空纤维生物反应器、气升式生物反应器以及灌注式生物反应器等，其中中空纤维生物反应器利用了中空纤维的半透膜的作用，为细胞的三维生长提供了较为合适的环境，但是这种方式培养的细胞取出较为困难，因此主要用于人工肝生物反应器。气升式生物反应器由于气泡对细胞的损伤作用等因素，在其它组织工程中的应用并不多。

在生物反应器的传质动力方面，目前主要方式有搅拌式、旋转壁式、灌注式和气升式等。其中搅拌式生物反应器在传统的细胞培养中扮演了很重要的角色，但是在强化传质的搅拌过程中，不可避免地导致细胞的损伤。旋转壁式的生物反应器能够提供较小的剪切力，但存在着纵向传质较差等问题。而灌注式培养由于其剪切力较大，不能提供较为均一的培养环境，因此其在组织工程中的应用也受到了限制。由于动物细胞对培养基内的溶氧的要求比其它的需氧培养的微生物要低，因此，目前人们对通过外部搅拌而增强传质的方法逐渐产生了兴趣，其中有代表性的生物反应器有美国Wave Biotech公司生产的波浪式生物反应器和杭州安普生物工程有限公司生产的激流式生物反应器，这两种生物反应器都是应用摇床提供外部的上下往复运动或水平旋转提供动力，由于培养容器内部没有搅拌桨，因此，这两种生物反应器对细胞的损伤较小，都实现了细胞培养规模的放大。但是波浪式生物反应器在利用摇床提供的上下往复运动来增强传质，这种方式存在横向传质不足及在较大的波浪运动时，两端的细胞可与培养袋的壁产生碰撞，导致细胞的损伤；而激流式生物反应器利用摇床提供的水平旋转运动，加强了横向的传质，但在其底部的培养液仍然是水平的旋转，仍然存在纵向传质不良的缺陷；尤为重要的是，这两种生物反应器只能用于普通的动物细胞的扩增，尚无用于组织工程种子细胞的案例，也不能用于组织工程细胞支架复合物的构建，尤其是需要气液界面培养的组织工程皮肤的构建。二者均不能提供理想的气液双相的培养环境或气液界面的培养条件。

目前的组织工程构建物的培养，多是在实验室内进行的手工培养，将细胞支架复合物置于培养皿内培养，这种静态的培养方式存在明显的组织工程构建物内部的传质不良，构建物内部的氧含量低，与搅拌式生物反应器结合或使用灌流式生物反应器可以解决部分的传质问题，但对培养物内部氧含量的改善作用不大。

发明内容

为了解决上述的存在细胞或组织工程生物培养存在的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一种用于细胞或组织工程生物培养的装置。本发明的另外一个目的是提供一种用于细胞或组织工程生物培养的方法。该装置和方法提高了培养液内氧含量，减少了细胞的损伤，提供了较为均一的培养环境。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

用于细胞或组织工程生物培养的装置，该装置包括培养容器和驱动装置，所述的培养容器采用U形底面、W形底面或V形底面的培养容器，所述的驱动装置采用环形摆动动力系统，环形摆动动力系统包括托盘、底座、转盘和动力装置；所述的培养容器设置在托盘上，托盘的中央固定设置有球形关节，球形关节的球形头设置在底座的球形孔内；所述的转盘设置在托盘的下方由动力装置带动旋转，转盘的同一个圆周上设置有多个高度依次升降的支撑杆，支撑杆的上端与托盘相抵。

作为优选，所述的支撑杆的高度可调，托盘与水平面所成的角度为5～45°。

作为优选，所述的球形头的上方设置有压盖，压盖固定在底座上，压盖上方设有与托盘相连接的压力弹簧。这种结构用以保持其上方的托盘在摆动的时候不会产生转动。

作为优选，该装置还包括温控装置，所述的温控装置为恒温垫，恒温垫设置在托盘与培养容器之间。

作为优选，该装置还包括加液储液瓶和收液储液瓶；加液储液瓶连接设有加液管，加液管连接培养容器，加液管上设有加液蠕动泵；收液储液瓶连接设有出液管，出液管连接培养容器，出液管伸入培养容器的高低可调节，出液管上设有出液蠕动泵；加液储液瓶的进气口和收液储液瓶的气体出口分别设有空气过滤器。

作为优选，该装置还包括CO₂入口、氮气入口、O₂入口、气泵、空气过滤器、进气管和出气管，CO₂入口、氮气入口和O₂入口分别连接气泵，气泵连接空气过滤器，空气过滤器通过进气管连接培养容器；出气管设置在培养容器上，出气管设有空气过滤器。

作为优选，该装置还包括溶氧电极、pH电极和CO₂电极，溶氧电极、pH电极和CO₂电极插设在培养容器内。

本发明由于采用了上述的技术方案，优点是：在培养容器内没有搅拌桨等存在，培养容器内剪力分布均匀，容器内细胞受到损伤的可能性极小，可适用于各种类型的细胞培养，尤其适用于组织工程种子细胞和/或组织工程构建物的三维培养；同时，本生物反应器的培养容器在托盘上不产生旋转，使得在线的供液及供气变得十分容易，并且方便了培养时在线的监测。

为了实现和上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

用于细胞或组织工程生物培养的方法，该方法将细胞或组织工程生物培养原料置于U形底面、W形底面或V形底面的培养容器中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器环形摆动，所述的环形摆动为培养容器以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动。

用于细胞悬浮培养的方法，该方法将细胞培养原料置于U形或W形底的细胞培养容器中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器环形摆动，所述的环形摆动为培养容器以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动，上、下摆动的角度为5～30°。

用于组织工程生物培养的方法，该方法将组织工程生物培养原料置于V形底面的培养容器，中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器环形摆动，所述的环形摆动为培养容器以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动，上、下摆动的角度为15～45°。

本发明的环摆动力比现有的摇床更加稳定，而且可以提供不同的环摆角度及速度，有利于组织工程种子细胞的培养。在其上方，可以使用不同的形状的培养容器，与环形摆动的动力作用下，不仅有良好的横向传质，还有良好的纵向传质，通过培养液表面的波动可以增加培养液与空气的接触面积，还可以通过培养液对培养容器壁面的冲刷作用以提高培养液内氧含量。通过外部环摆提供的动力，可在较理想的传质条件下，减少细胞的损伤，提供较为均一的培养环境；其中使用U形底面及W形底面的培养容器适合与悬浮细胞的培养，在种子细胞扩增时，常常需要结合微载体使用，这时，选择W形底面的培养容器可以避免微载体的沉降。而在复合有细胞的组织工程产品构建时，则可选用V形底面的培养容器，并可选择气液双相或气液界面等方式的动力培养。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为U型底面的培养容器的结构示意图。

图3为W形底面的培养容器的结构示意图。

图4为V型底面的培养容器的结构示意图。

图5为球形头、压盖、底座和压力弹簧的结构示意图。

图6为利用本发明反应器与微载体培养技术结合培养人原代成纤维细胞图，图中为Cytodex I型微载体，表面负载人成纤维细胞(培养7天；40×)，环摆角度30°；环摆速度40转/分。

图7为本发明反应器中未使用载体的二维培养，HaCat细胞可分泌大量细胞外机制并形成三维结构(10×)。

图8为利用本发明反应器的液气双相培养方法培养的人工皮肤，背景为组织工程支架材料，表面为人角质细胞(40×)，可见角质细胞分布密集，比正常略小，并有复层化现象(V底培养)。

图9为人骨髓间充质干细胞与支架材料结合后培养一周后的电镜图，左为平皿静态培养，右为在环摆式生物反应器中培养(V底培养)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

实施例1

如图1所示的本发明用于细胞或组织工程生物培养的装置，该装置包括培养容器、驱动装置和在线供液、供气及监测系统。其中：

一、培养容器

在环摆的托盘上设计有具有U形、W形底面或V形底面的细胞培养容器10，可以使用玻璃、塑料、不锈钢等制成，优选聚丙烯塑料。在使用玻璃培养容器10结合微载体技术进行细胞培养时，需要将容器的内壁预先进行硅化。两种培养容器10的上方有一顶盖25，与其下方的容器密封，但可以拆卸，在顶盖的中央部分有开口，分别容纳加液管8、出液管9、出气管28、溶氧电极14、pH电极15、CO₂电极29等的进出。

如图2、图3所示，U形及W形底面的细胞培养容器10为具有圆弧形底面的一种容器。这种容器的底面没有死角，因此在培养液旋转时不会产生剧烈的应力改变，对细胞破坏作用最小；W形底面的培养容器的中央高凸，主要用于微载体培养时防止微载体沉降聚集。

如图3所示，V形培养容器10的底面呈V形。V形底面的设计主要是用来培养贴壁细胞及具有组织工程构建物的培养，尤其是需要有液气双相交替的培养。

本发明生物反应器的培养容器10是独立的一种结构，可以方便地进行拆卸、清洗及消毒，在进行组织工程细胞培养和/或组织工程构建物的培养时，优选使用一次性的培养容器，以避免交叉感染。本反应器的优点是：在培养容器内没有搅拌桨等存在，培养容器内剪力分布均匀，容器内细胞受到损伤的可能性极小，可适用于各种类型的细胞培养，尤其适用于组织工程种子细胞和/或组织工程构建物的三维培养；同时，本生物反应器的培养容器在托盘上不产生旋转，使得在线的供液及供气变得十分容易，并且方便了培养时在线的监测。

二、驱动装置

如图1所示，驱动装置为具有环摆动力的系统提供动力，驱动装置包括托盘17、底座18、转盘21和步进电机22，环形摆动是由一个托盘17所提供，此处所称托盘17可以是平的，也可以配合其上方的培养容器而制成其它的形状，培养容器10设置在托盘17上。托盘17的中央设有一个球形关节24与底座连接18，使得这个托盘17可以自由的摆动，在托盘17的下方设有四个不在同一水平面的、高度可以调节的支撑杆20，支撑杆20固定于底座18上其每个支撑杆20的上方都有一个滑轮19，支撑杆固定于其下方的转盘21上，转盘21与同定底座之间有滚动轴承26连接；由步进电动机22驱动转盘21，使转盘21产生转动，通过可调节支撑杆20上方的滑轮19在托盘17下方的滚动，将动力传递到其上方的托盘17，并使之产生环形的摆动。如图5所示，球形关节24的球形头的上方有压盖30，压盖30通过螺丝钉将球形头稳定于底座18上。压盖30的上方有与托盘17之间连接的压力弹簧31，这种结构用以保持其上方的托盘17在摆动的时候不会产生转动。

这种环形的摆动使得在其上方的培养容器10内的培养液13分别产生旋转流动、波浪式及旋转运动。这种动力作用在较低的速度及较大的摆动角度时，可以使得培养容器10内的液体呈现偏心的圆周式波浪式运动，同时又有上下方向的运动及转动，这种培养液13的运动方式有利于防止培养的细胞或结合有细胞的微载体聚集成团；而在较高的摆动速度及较小的摆动角度时，可以使培养容器10内的培养液13呈现旋转，并有上下的运动；这种运动方式实现了良好的培养容器10外部的搅拌作用，使容器内的培养液13既有旋转运动，又有上下的运动，既能通过液面表面积增加、液面的不断更新及对容器壁面的冲刷等作用增加培养液内的氧含量，还可通过旋转增加培养液内的传质，即能够增强横向的传质，又可以增强轴向纵向传质，在进行不同细胞培养时，可以通过环形摆动的角度和通过调整步进电动机22的速率对反应器的参数进行调整。

三、在线供液、供气及监测系统

如图1所示，在线供液系统主要指用于实现培养基及气体的在线更换，同时也用于培养时的细胞加入及取出。在线供液系统包括加液储液瓶12和收液储液瓶11，加液储液瓶12连接设有加液管8，加液管8连接培养容器13，加液管8上设有加液蠕动泵7；收液储液瓶11连接设有出液管9，出液管9连接培养容器13，出液管9伸入培养容器13的高低可调节，出液管9上设有出液蠕动泵27；加液储液瓶12的进气管和收液储液瓶11的出气管23分别设有空气过滤器5。加液储液瓶12的进气口有空气过滤器5将进入瓶内的空气过滤除菌，通过加液管8及加液蠕动泵7将培养基泵入培养容器10；而出液管9是将培养基通过出液蠕动泵27泵入收液储液瓶11；在培养容器10的顶盖上，置入到培养容器内出液管9的高低是可以调节的，用以控制气液双相培养及气液界面培养时的液面的高度；在收液储液瓶的顶盖上有收液灌气体出口23，并有空气过滤器5相连。

该生物反应器的气体控制系统包括一个CO₂入口1，一个氮气入口2和一个O₂入口3。这三种气体通过气体控制阀25控制，使得进入反应器容器10内的气体保持一定的比例。混合后的气体通过气泵4、空气过滤器5及进气管6进入培养容器10；通过带有空气过滤器5的出气管28移出培养容器10。该生物反应器的在线检测包括深入到培养基内的溶氧电极14及pH电极15和CO₂电极29。

实施例2

细胞的悬浮培养：细胞的悬浮培养可以是非贴壁依赖性细胞，也可以是贴壁依赖性细胞与微载体培养技术的结合。经过处理并灭菌的U形及W形底的细胞培养容器或其他培养容器及软垫安放于环摆托盘上，调节好支撑滑轮的高度使托盘的与水平面形成一定的角度，推荐5～30°，将需要培养的细胞调整好浓度后通过培养容器上盖的加液管将细胞加入到培养容器内，再加入一定量的培养基，然后连接好进液、出液、监控电极及气体进出的管道；开动步进电动机使托盘产生环转；如果采用的是微载体培养，开始环摆的速度较慢，推荐15～60转/分钟，随着细胞的生长可以逐渐增加环摆的速度，以保持微载体不至于沉降，同时增强了传质。对于培养基的更换推荐使用流加式；细胞的收集是通过出液管将培养的细胞或微载体细胞复合物收集在收液储液瓶内。在这种培养方式对细胞的损伤小，细胞培养过程简单而且容易控制，培养方式即可进行大规模的培养，又可以进行小规模的细胞培养，应用前景广阔。

实施例3

组织工程支架细胞复合物的培养：推荐选择V形底面的培养容器，在进行气液双相及气液界面培养时，可将旋转面的角度进一步增大到15～45°，并使V形培养容器的一侧的底边壁近似水平，培养液加入到能高于组织工程构建物1～5cm，并通过调节出液管的高低以控制液面的高度，慢速环形摆动托盘，优选0.2～12转/min，使培养液沿培养容器的底壁缓慢流动，这样在底壁上组织工程构建物就可以得到完全浸没式或气液双相的培养，调整容器的大小、培养液加入量及托盘的环摆速度就可以调整贴壁细胞培养时的气/液相时间的比例，或者调节成气液界面的形式。在完全的浸没式培养时，培养液的流动可增加构建物内部的传质，而在气液双相培养时，又可增加构建物内的含氧量，解决了组织工程构建物培养过程中内部传质不良及氧含量的问题，其组织工程构建物内部的氧含量优于旋转搅拌式及灌注式生物反应器。

Claims (10)

1.用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：该装置包括培养容器(13)和驱动装置，所述的培养容器(13)采用U形底面、W形底面或V形底面的培养容器(13)，所述的驱动装置采用环形摆动动力系统，环形摆动动力系统包括托盘(17)、底座(18)、转盘(21)和动力装置(22)；所述的培养容器(13)设置在托盘(17)上，托盘(17)的中央固定设置有球形关节(24)，球形关节(24)的球形头设置在底座(18)的球形孔内；所述的转盘(21)设置在托盘(17)的下方由动力装置(22)带动旋转，转盘(21)上设置有多个高度依次升降的支撑杆(20)，支撑杆(20)的上端与托盘(17)的下表面相抵。

2.根据权利要求1所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：支撑杆(20)的高度可调，托盘(17)与水平面所成的角度为5～45°。

3.根据权利要求1或2所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：球形关节(24)的球形头的上方设置有压盖(30)，压盖(30)固定在底座(18)上，压盖(30)上方设有与托盘(17)相连接的压力弹簧(31)。

4.根据权利要求1或2所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：该装置还包括温控装置，所述的温控装置为恒温垫(16)，恒温垫(16)设置在托盘(17)与培养容器(13)之间。

5.根据权利要求1或2所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：该装置还包括加液储液瓶(12)和收液储液瓶(11)；加液储液瓶(12)连接设有加液管(8)，加液管(8)连接培养容器(13)，加液管(8)上设有加液蠕动泵(7)；收液储液瓶(11)连接设有出液管(9)，出液管(9)连接培养容器(13)，出液管(9)伸入培养容器(13)的高低可调节，出液管(9)上设有出液蠕动泵(27)；加液储液瓶(12)的进气管和收液储液瓶(11)的气体出口(23)分别设有空气过滤器(5)。

6.根据权利要求1或2所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：该装置还包括CO₂入口(1)、氮气入口(2)、O₂入口(3)、气泵(4)、空气过滤器(5)、进气管(6)和出气管(28)，CO₂入口(1)、氮气入口(2)和O₂入口(3)分别连接气泵(4)，气泵(4)连接空气过滤器(5)，空气过滤器(5)通过进气管(6)连接培养容器(13)；出气管(28)设置在培养容器(13)上，出气管(28)设有空气过滤器(5)。

7.根据权利要求1或2所述的用于细胞或组织工程生物培养的装置，其特征在于：该装置还包括溶氧电极(14)、pH电极(15)和CO₂电极(29)，溶氧电极(14)、pH电极(15)和CO₂电极(29)插设在培养容器(13)内。

8.用于细胞或组织工程生物培养的方法，其特征在于：该方法将细胞或组织工程生物培养原料置于U形底面、W形底面或V形底面的培养容器(13)中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器(13)环形摆动，所述的环形摆动为培养容器(13)以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动。

9.用于细胞悬浮培养的方法，其特征在于：该方法将细胞培养原料置于U形或W形底的细胞培养容器(13)中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器(13)环形摆动，所述的环形摆动为培养容器(13)以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动，上、下摆动的角度为5～30°。

10.用于组织工程生物培养的方法，其特征在于：该方法将组织工程生物培养原料置于V形底面的培养容器(13)，中，采用环形摆动动力系统驱动培养容器(13)环形摆动，所述的环形摆动为培养容器(13)以中心为支点，同一圆周上的每个点依次上、下摆动，上、下摆动的角度为15～45°。

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