JP4833215B2 - 少なくとも一つのトレー状揺動プラットフォームを含むバイオリアクタアセンブリ - Google Patents
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Description
20世紀中、細胞培養は産業の規模にまで達した。酵素又は二次代謝産物を産生する微生物の増殖のための数10万リットルのステンレス鋼製の発酵容器さえ珍しくない。方法としては、バッチ、流加、連続又は半連続かん流がある。徐々に、より能力が試される培養物、たとえば哺乳動物、昆虫又は植物細胞が、高度に特化した培地を使用する発酵容器中での増殖に適合されてきた。これらの容器の設計は詳細が異なるが、いくつか共通の特徴を有している。容器の中に垂直に配置されたかく拌ブレードを回転させることによって細胞が懸濁状態に維持され、底部での空気、O2又はCO2の注入によってガス交換が促進される。培地の組成及びpHは、そのようなパラメータを調節するための連続的なモニタリング及び化学成分の注入によって調整することができる。
本発明は、2リットルから数千リットルまでの培養容積の同一条件下で線形のスケールアップを可能にする、使い捨てバックを波動かく拌と共に使用する最初のバイオリアクタを提供する。バイオリアクタのモジュール式でフレキシブルな設計が、一つの構造で異なるバッグの平行的な培養を可能にして、異なる培養及び培養条件を同時に稼働させることができるようにする。あるいはまた、一つのバッグを異なるコンパートメントに分割して、異なる条件を同時に稼働させることもできる。
本発明のバイオリアクタは、単一ユニット揺動バイオリアクタに対していくつかの利点を有する。一つの電気モータ・速度調整ユニットしか要らず、すべての揺動プラットフォームが同じ速度及び/又は揺動角度を有し、特に2個以上のプラットフォームが垂直又は略垂直な軸に沿って互いの上に配置される場合、アセンブリ全体が効率的な小さな設置面積しか要しない。小さな設置面積はまた、衛生上の理由から気密性にすることができ、温度制御することができる一つの部屋へのアセンブリ全体の容易な収容を可能にする。
本明細書及び請求の範囲において、明らかにそうではない場合を除き、単数形は複数の指示対象をも含む。断りない限り、本明細書で使用するすべての専門・技術用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
(a)増殖培地及び培養試料をバッグ、好ましくは少なくとも二つのバッグに導入するステップ、
(b)前記バッグを、本明細書に記載のバイオリアクタアセンブリの揺動プラットフォーム又はトレーに取り付け、おそらくはバッグをプラットフォーム上に分散させるステップ、
(c)プラットフォーム又はトレーを一つの自由度で揺動させて、それにより、バッグ中の液状媒体に波動を誘発するステップ
を含み、ステップ(a)及び(b)の順序を互換する、たとえば逆にすることができる方法に関する。そのようなものとして、本発明は、プラットフォームの揺動が、毎分約1〜60回、好ましくは毎分10〜45回、より好ましくは毎分20〜30回の範囲の所定の速度に設定されている上記方法に関する。好ましくは、プラットフォームの揺動は、バッグ中の液状媒体の波動を誘発し、持続させる。
(a)液状媒体及び少なくとも一つの他の成分を使い捨てバッグに導入するステップ、及び
(b)前記バッグを、本明細書に記載のバイオリアクタアセンブリの揺動プラットフォーム又はトレーに取り付けるステップ、及び
(c)プラットフォーム又はトレーを一つの自由度で揺動させて、それにより、バッグ中の液状媒体に波動を誘発するステップ
を含み、ステップ(a)及び(b)の順序を互換することができる方法に関する。
図1(正面図)及び図2(側面図)は、バイオリアクタアセンブリの一般的設計の好ましい実施態様を示す。使い捨てバッグのための全部で4×4個のユニットを保持する4個の揺動プラットフォーム(6)が、2個の垂直ポール(7)の間で、常に平衡状態にあるように、隣接プラットフォーム間の最大角度30°で互いの上に取り付けられている。周波数調整された1.5kWの電子モータ(1)が、取り付けられたギヤボックス(Z)とともに、リアクタフレームの上に配置されている。モータは、ギヤボックス(Z)を介して第一の連結棒(2)に接続され、この連結棒は、一定範囲の取り付け点を有して、それにより、モータの円運動を、すべてのプラットフォームの揺動角が10〜30°の範囲であるような方法で一つの平面における動きにする。揺動は、強力軸受けを含む3個の異なるバー又はタンブラ(2、3、5)を介して伝達される。バー(2)は、いくつかの位置でギヤボックスに取り付けることができ、それにより、プラットフォーム担持軸(4)を通過する水平軸に対して最大+15〜−15°の揺動角に効果的に影響を加える。タンブラ(3)中のプラットフォーム担持軸の中央軸受け(11)が、揺動プラットフォーム(6)を担持する軸(4)の軸受けの垂直に上に配置されている。アセンブリは、垂直ポール(7)と垂直ポールに取り付けられた支持ビーム(8)との間の水平ビーム(10)によって補剛されている。揺動は、接続軸(14)によってモータとは反対の側に伝達され、その側から、同様なバー及びタンブラのセットが動きをすべての揺動プラットフォームに伝達する。いずれの部材(7)及び(8)も床に固着されている。
実施例1:バイオリアクタへの応用
この実施例では、何種かの微生物を本発明のバイオリアクタで増殖させた。これら対象の培養微生物は、Rhizobium radiobacter(Young, J. M., Kuykendall, L. D., Martinez-Romero, E., Kerr, A. & Sawada, H. (2201). Int J Syst Evol Microbiol 51, 89-103; ATCC 19358)及びArthrobacter histidinolovans(Skerman, V. B. D., McGowan, V., and Sneath, P. H. A. (1980). (editors). Int. J. Syst. Bacteriol., 30, 225-420; ATCC 11442)であった。
大腸菌におけるタンパク質産生のためのバイオリアクタの使用を研究するため、大腸菌BL21(Al)(Novagen)を、pET−12a(Novagen)に基づく発現ベクタCM126−iMAb(ベクタはWO03050283に記載)で形質転換した。細胞を、電気穿孔によってベクタで形質転換し、振とうフラスコ中、37℃、225rpmで終夜増殖させた。その後、細胞を、バイオリアクタ上、30℃、40rpmで、70リットル(全容積)バッグ中、1リットルあたり50マイクロリットルの消泡剤204(Sigma)及びカルベニシリン(100マイクログラム/ml)で補足した3*TY培地(24g/lトリプトン、15g/l酵母抽出物、5g/l NaCl)を含有する培地35リットル中、OD0.1(600nm)で接種した。OD0.9(600nm)に達したところで、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド(IPTG)を0.2%アラビノーズとともに最終濃度1mMまで加えてタンパク質発現を開始させた。エアレーションポンプを使用して培養物を絶えずエアレーションした。IPTG添加の約4時間後に細胞を収穫し、中空糸技術を使用して濃縮し(400kDのカットオフで)、濃縮したペレットを使用まで−20℃で貯蔵した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、図5を参照)によってタンパク質発現を分析した。細胞の湿重量及び乾燥重量を測定し、全タンパク質発現量を計算した。使用したバクテリア誘導システムのせいで、培養物のODはあまり高くなかった。iMabタンパク質を発現する大腸菌細胞は、バイオリアクタ中で非常に効率的に、全タンパク質の40%の優れた発現レベルで増殖することが結論づけられた(図5を参照)。特に、さらなる最適化なしに35リットル量の培養物をバイオリアクタで容易に増殖させることができることは、優れたタンパク質発現と相まって、非常に有益である。
全培養物量: 35リットル
OD600nm: 7.6
細胞湿重量: 5.87g/l
細胞乾燥重量: 1.38g/l
全タンパク質: 0.69g/l
iMab発現: 全タンパク質の40%
iMab産生: 0.28g/l
35リットルバッチ中の全iMab: 9.8g
大腸菌におけるタンパク質発現のためのバイオリアクタの線形スケールアップ特性を研究するため、大腸菌BL21(DE3)(Novagen)を、pET−12a(Novagen)に基づく発現ベクタCM126−iMAb(WO03050283に記載)で形質転換した。細胞をベクタで電気穿孔し、4.5%(w/v)グルコース及び100マイクログラム/mlカルベニシリンで補足した3×SY培地(24g/lソイトン、15g/l酵母抽出物、5g/l NaCl)100mlを含有する振とうフラスコ中で増殖させた。培養物を37℃、225rpmでインキュベートした。線形スケールアップのために播種量を拡大するため、振とうフラスコ培養物を使用して、培地(振とうフラスコと同一)5リットルを含む13リットルバッグに接種した。OD1.5(600nm)に達したのち、この培養物を、中空糸技術により、400kDaの膜カットオフサイズ、3100cm2の表面積、14.5psiで180L/hのクロスフロー速度、10psiの膜間圧で濃縮した。
2 タイプ1連結棒
3 接続タンブラ
4 軸受けを通過するプラットフォーム担持軸
5 タイプ2連結棒
6 揺動プラットフォーム
7 垂直ポール
8 支持ビーム
9 開放したケーブル及び管溝
10 水平支持ビーム
11 接続軸の軸受け
12 覆いふた
13 インレー(省略可能)
14 接続軸
z ギヤボックス
Claims (20)
- リアクタフレーム及びリアクタフレームに取り付けられた少なくとも二つの揺動プラットフォームを含み、前記少なくとも二つのプラットフォームが、少なくとも2リットルの全体積を受けるように適合された少なくとも一つの使い捨てバッグを保持することができるバイオリアクタアセンブリであって、プラットフォームの動きが、運動サイクル中に前記プラットフォームの重量分布を概ね平衡状態に維持するように適合されており、
前記少なくとも二つの揺動プラットフォームが、垂直又は略垂直の軸に沿って互いの上に配置され、
垂直に隣り合うプラットフォームに相対する一つのプラットフォームが、同じ大きさではあるが反対の位相で動く
ことを特徴とするバイオリアクタアセンブリ。 - 前記少なくとも一つのプラットフォームそれぞれを水平軸に沿って一つの自由度で揺動させるための手段をさらに含む、請求項1記載のバイオリアクタアセンブリ。
- プラットフォームを揺動させるための手段が、プラットフォームを一つの自由度でプラットフォームの水平位置に対して−15°〜+15°の所定の角度範囲で揺動させるように適合されていることをさらに特徴とする、請求項1または2記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記揺動プラットフォームが少なくとも二つのコンパートメントに分割されていることができることをさらに特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記少なくとも一つのバッグが外部支持手段によってプラットフォーム上の定位置に維持されることをさらに特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記プラットフォームがトレーを含む、請求項1〜5のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記トレーが少なくとも一つのふたをさらに含むことをさらに特徴とする、請求項6記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記少なくとも一つの揺動プラットフォームそれぞれの奥行き(x)が約0.5m〜約1.2mの寸法を有することをさらに特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 前記少なくとも一つの揺動プラットフォームそれぞれの幅(y)が約0.4m〜8mの寸法を有することをさらに特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- リアクタフレームが、鋼、アルミニウム又はステンレス鋼からなる群より選択される材料でできていることをさらに特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- プラットフォームを揺動させるための前記手段が、周波数調整エレクトロモータ又は単一ステップレス電子モータを含むことをさらに特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 微生物、細胞又は有機体を培養するためにプラットフォームあたり約1〜24個の使い捨てバッグを含み、前記バッグそれぞれが約2〜500リットルの全容積を有する、請求項1〜11のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 培養バッグの深さ及び高さが一定である、請求項12記載のバイオリアクタアセンブリ。
- 使い捨てバッグ中で微生物、細胞又は有機体を平行培養する方法であって、
(a)増殖培地及び培養試料を少なくとも二つのバッグに導入するステップ、
(b)前記バッグを、請求項1〜13のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリの揺動プラットフォーム又はトレーに取り付けるステップ、及び
(c)プラットフォーム又はトレーを一つの自由度で揺動させて、それにより、バッグ中の液状媒体に波動を誘発するステップ
を含み、ステップ(a)及び(b)の順序を互換することができる方法。 - 前記細胞が、動物細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、魚類細胞、両生類細胞、ヒト細胞、節足動物細胞、海綿体細胞、環形動物細胞、昆虫細胞、線形動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母又は微生物細胞からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
- 前記細胞が、バクテリオファージをはじめとするウイルスの産生に使用される、請求項15記載の方法。
- 使い捨てバッグ中で成分を平行インキュベート又は均質化する方法であって、
(a)液状媒体及び少なくとも一つの他の成分を使い捨てバッグに導入するステップ、
(b)前記バッグを、請求項1〜13のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリの揺動プラットフォーム又はトレーに取り付けるステップ、及び
(c)プラットフォーム又はトレーを一つの自由度で揺動させて、それにより、バッグ中の液状媒体に波動を誘発するステップ
を含み、ステップ(a)及び(b)の順序を互換することができる方法。 - 前記少なくとも一つのプラットフォームそれぞれの揺動が、毎分約1〜60回の範囲の所定の速度に設定されている、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法。
- 混合、溶解、均質化、酵素インキュベートをはじめとするインキュベート、乳化及び/又は発酵のための、請求項1〜13のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリの使用。
- 微生物、細胞又は有機体の培養のための、請求項1〜13のいずれか1項記載のバイオリアクタアセンブリの使用。
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