NO860991L - Anordning for omroering av cellekulturer samt anvendelse derav. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte og anordning for dyrkning av cellekultur eller fermentering ved å opprettholde en celle eller immobilisert cellepopulasjon i et vekstmedium ved en ønsket inkuberingstemperatur; tilføre en forsiktig strøm av oksygeninneholdende gass som beveger seg oppover og sentralt gjennom vekstmediet for å føre cellene eller de immobiliserte celler oppover og hvorved medium fra øvre del av vekstmediet beveger seg nedover for å erstatte det fortrengte medium og derved gi god blanding med forsiktig aerering som holder cellene eller de immobiliserte celler i suspensjon og oppløst oksygenkonsentrasjon i mediet for å støtte cellevekst.

Description

ANORDNING FOR OMRØRING AV CELLEKULTURER SAMT

ANVENDELSE DERAV.

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte og en apparatur for omrøring av cellekulturer og fermentering. Apparaturen ifølge foreliggende oppfinnelses anvender trekk som gir optimal omrøring av cellene med minimal mekanisk skjærekraft. Dette oppnås ved å anvende en gass-strøm for å gi forsiktig aerering. Anordningen gir forsiktig omrøring uten behov for å anvende noen mekaniske deler som kan øde-legge cellene eller cellebærerene.

Fra US patent nr. 4.173.516; 4.259,449 og 4.311,798 er det kjent en fremgangsmåte og apparatur for å dyrke celler fra animalsk og humant vev. En beholder er anbrakt for å holde en næringsoppløsning hvor i cellene befinner seg. Ved å tilføre en strøm av oksygenholdig gass erholdes en sirkulær bevegelse av oppløsningen.

Dette kjente arrangement gir imidlertid ingen optimal om-røring med minimale mekaniske skjærekrefter. Målet for foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en forbedret bio-reaktormetode samt apparatur.

I henhold til oppfinnelsen o~ppnås dette ved holde en celle eller immobilisert cellepopulasjon i et vekstmedium ved en ønsket inkubasjonstemperatur;

frembringe en forsiktig strøm av oksygenholdig gass som beveger seg oppover og sentralt gjennom vekstmediet for å føre cellene eller de immobiliserte celler oppover og hvorved medium fra den øvre det av vekstmediet beveger seg nedover for å erstatte det forskjøvede medium og derved erholde god blanding med forsiktig aerering som holder cellene eller de immobiliserte celler i suspensjon og opprettholder oppløst oksygenkonsentrasjon i mediet for å støtte celleveksten og

høsting av celler eller medium etter behov.

Videre i henhold til oppfinnelsen har en apparatur for ut-førelse av denne metoden

et reaktorkommer anbrakt og konstruert for å holde levende celler i kultur innenfor et volum av kulturmedium hvor reaktorkommere består av et øvre kammer og et nedre kammer, hvor det øvre kammer er av større dimensjon enn det nedre kammer, og hvor øvre og nede kammeret er operativt sammenbundet ved innover skrånende sidevegger;

gassinntaksanordninger sentralt anbrakt innenfor nedre kammer hvorved oksygen inneholdende gass tilføres til det nedre kammer og bærer celler oppover til det øvre kammer og medium fra det øvre kammer beveger seg nedover over de skrånende vegger for å erstatte forskjøvet medium og derved gi en blanding til cellene med forsiktig aerering med et minimum av skjærekraft og gi oppløst oksygen i mediet for å støtte cellevekst og

lokkanordninger for å gi lufttett forsegling av det øvre kammer hvor lokkanordningen inneholder gassutførings-anordninger.

En foretrukket utførelsesform kan reaktoren være anbrakt inne i et flytende temperaturbad for å gi konstant temperatur under hele celle kultur dyrkingen.

Ytterligere utførelsesformer

muliggjør anvendelse av reaktoren enten i suspensjon eller cellebærekultur. Videre kan enheten enten anvendes som reaktor eller som fermentator og kan således anvendes for å dyrke eukaryotiske eller prokaryotiske celler.

Figur 1 viser en skjematisk forside tegning av en bioreaktor ifølge foreliggnede oppfinnelse med piler og små sirkler som angir det typiske strømningsmønster av cellene innenfor mediet som delvis fyller reaktoren. Figur IA er en skjematisk forside tegning av en alternativ utførelsesform av reaktoren ifølge foreliggende oppfinnelse hvor i dekselet til reaktoren er tilpasset for å gi en multihodet gel-ball markør for immobilisering av cellene som skal dyrkes. Likeledes er reaktoren ifølge denne ut-førelsesform utstyrt med et multiinntak ved bunnen av reaksjonskammeret for å tillate innføring eller uttak av forskjellige gass eller væskestrømmer under reaksjonsfor-løpet. Figur 2 er en grafisk fremstilling av en eukaryotisk cellekultur i en bioreaktor ifølge foreliggende oppfinnelse. Kurven gir en indikasjon på levedyktige celler funnet ved den passende fase av kulturen og en indikasjon på det totale antall produktenheter (human IL-2) dannet av cellene. Figur 3 viser en kurve som gir resultatene av en cellekultur med en murin mammarisk tumor celle linje tranfektert med gene for humant IL-2. Denne kultur anvendte alginat gel baller for å immobilisere cellene under dyrkingen. Aktivi-tetsverdier for humant IL- 2 funnet i kultur mediet på de angitter kulturdager er vist i kurven. Figur 4 er en sammenlingning mellom en Jurkat cellekultur som anvender enten konvensjonelle cellekultur teknikker, eller som anvender alginat immobiliserte celler dyrket i cellekultur i en bioreaktoutførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse. Kurven gir det totale antall levedyktige celler som ble funnet under dyrkingen.

Den nye reaktor / farmenteringsapparatur ifølge foreliggende oppfinnelse kan lettere forstås under henvisning til

Figur 1 i tegningene. Som det går fram av denne figur består reaktoren av to kammere; et øvre kammer 10 med relativt stor dimensjon og et nedre kammer 11 med relativt mindre dimensjon. Det øvre kammer virker som vekst kammer, mens det nedre kammer er angitt som blande kammer. En gass-inntakslinje 12 står i forbindelse via ventil anordning 13 til bunnen av blande kammeret 11. Ved anvendelse bobles luft, CC>2 eller andre passende gasser eller gass bland-inger forsiktig gjennom nedre ventil utstyrt med inntaks-anordninger 12. Etter som gassen stiger gjennom farmenter-ings eller celle kultur mediet 14 inneholdt i kammerene forskyver den væske i nedre del av kammer 11 og føres celler angitt av de små sirkler 15 oppover som indikert av de oppad pekende piler. Medium fra øvre del av reaktoren beveger seg nedover og strømmer over det skrånende gulv 16, for å erstatte det fortrengte medium ved bunnen av kammeret 11. Dette er indikert av de nedadgående piler i Figur 1. Passende gass strømnings hastighere for å oppnå den ønskede cellesuspensjon er i området fra ca. 10 til 300cc/min. fortrinnsvist fra ca. 25 til 50cc/min.

På denne måte settes det opp en syklisk bevegelse i det øvre reaktor kammer 10, som holder cellene eller cellebærerene i suspensjon. Dette holder også den oppløste oksygenkonsentras jon i mediet høyt nok for optimal cellevekst. I en foretrukket utførelsesform anvendes en gass bestående av luft med ca. 5% CO^-Tilføringen av denne lille mengde karbondioxsyd til innløps gassen hjelper til å opprettholde en passende pH i kultur mediet. Bare meget forsiktig bobling behøves for å fremskaffe løftet som er nødvendig for å holde cellene i suspensjon. Slik forsiktig bobling minimaliserer skjærekrefter og skumming av mediet ved medietoverflaten.

Størrelses dimensjoner som er angitt for kun illustrator-iske forhold, og er ikke kritisk begrenset. For større volumer kan diametern til øvre og nedre kammer økes proporsjonalt. Den totale høyde til reaktoren kan økes uten en forandring i diameter. For små cellekultur volumer kan dim-ensjonene til reaktoren settes ned proporsjonalt.

Reaktoren kan lages av glass, rustfritt stål eller annet passende materiale som ikke er toksisk for cellene og som ønskelig kan anvendes under sterilisering. På lignede måte lages reaktorlokket 17 fra tett plast som fortrinnsvis kan motstå steriliserings betingelser, så som autoklavering. Siden dette er en separat del kan den modifiseres for å gi anvendbarhet ved bruk av reaktoren som det vil gå fram ved ytterligere utføreslesformer av foreliggende oppfinnelse. Sterile betingelser opprettholdes av pakningen 18 som er laget av fleksibelt materiale, så som gummi, og er anbrakt ved basen av lokket. Dette materiale danner en forsegling med øvre del av reaktoren og kan spennes fast eller holdes ved hjelp av enhver passende anording, så som av en vekt på lokket. Reaktoren vist i Figu 1 holdes ved konstant inkuberingstemperatur ved anordninger vel kjent i faget, så som f.eks ved å føre en oppvarmet væske f.eks vann inn i det eksterne reaktorkammer 19, som omgir reaktoren via inntak 20. Sirkulering av oppvarmings væsken kan foretas ved hjelp av en ikke vist sirkulasjons varmepumpe. Varmevæsken sirkuleres ut av det omgivende kammer 19 ved hjelp av uttak 21, og kan resirkuliseres gjennom den eksterne pumpe og varmeanordning for å vende tilbake til systemet ved den ønskede temperatur. For de fleste cellekultur og fermenteringsanvendelser er den foretrukkede driftstemperatur 37° C. Det bør bemerkes at denne anvendelse av en ekstern varmekappe er valgfri. Oppvarming kan også oppnås ved fravær av jakken ved å plassere hele reaktoren i et inkubert kammer eller varmerom ved 37° C.

Før bruk er reaktoren og lokket fortrinnsvis dampsterilisert separat og aseptisk sammensatt eller dampsterilisert på stedet eller sterilt sammensatt ved å fylle de indre kammere og ledningene med passende steriliseringsmedia, så som 70% etanol eller 1% natriumhyproklorid oppløsning.

Oppbyggelse av overskytende gasstrykk unngås ved å anvende passende filtrerte - ( 0,22 um) luftelinje 22 i lokket 17. Lokket kan også være tilpasset for å inneholde inntak og utløps linjer for tilføring av medium. Alternativt er det mulig å anvende et multiport rør, som en del av innløpsan-ordninger 12, for å tillate ikke bare tilførsel av gass-strøm fra bunnen av reaktorkammeret men også medium og enhver ønsket oppløsning som kreves for å buffre eller opp rettholde pH ved ønskede nivå. Slike utførelses former er vist i Figur 1.

Bioreaktoren ifølge Figur 1 er spesielt anvendelig ved utføring av celle suspensjon ved fermentering. Ved en slik fremgangsmåte tilføres celler i vekstmedium ved en konsentrasjon på ca. 1 x 10 5 celler pr. ml. En blanding av 5% CC>2og 95% luft bobles forsiktig gjennom mediet.

Ved optimal celletetthet fjernes endel av mediet innehold-ene celler og ferskt vekstmedium uten celler tilsettes. Denne prosedyren opprettholder cellene i logaritmisk fase. Celler eller celleprodukt høstes kontinuerlig. Bioreaktoren var i stand til å opprettholde vekst og overlevelse av hybridoma cellelinjer (monoklonale antistoff produserende celler så som LI-8 som gir monoklonale antistoff mot leukocytte interferon) og celler som danner bioaktive proteiner så som KG-1 celler som danner interferon. Hver cellelinje holdt levedyktig over en forlenget tidsperiode og var i stand til å gi produkt som kan høstes fra cellemediet.

På lignede måte er det mulig å utnytte andre cellesystemer i forbindelse med reaktoren ifølge foreliggende forbindelse. Slike andre celler innebefatter Jurkat, en human T-celle derivert cellelinje som ved induksjon danner humant interleukin 2; Hela celler som er en human karsinom cellelinje som er transfektert med genet for humant interleukin 2, og C 1271, en murin mammarisk tumor som er transfektert med genet for humant interleukin 2. Andre cellesystemer, som kan anvendes i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, innebefatter transformerte mikroorganismer som inneholder gener for humane proteiner og som er i stand til å utskylle gen produktene i mediet. Slike celler innebefatter jern,

B. subtilis og lignende.

Andre cellesystemer krever fast støtte materiale for å vokse. Disse forankrings avhengige celler kan passende ble dyrket i kultur ved å anvende en modifikajon av foreliggende celle reaktor. Således i Figur IA er det vist en fermen tåtor / bioreaktor som gir en passende anordning for dyrkning av forankringsavhengige celler, og som ikke kan tilpasses for å vokse i suspensjon. I en slik utførelses-form kan øvre kammer og nedre kammer av reaktoren 30 og 31 henholdsvis være av samme dimensjoner og form som i reaktor kammeret beskrevet i Figur 1. Som ved tidligere fremstil-lingsform er de to kammere satt sammen ved hjelp av skrånende vegger 36. Dette letter sirkulasjon av celler eller cellebærere i medium med lav luftstrømning for å gi den krevede omrøring uten noen vesentlig skjærekraft.

Et multiventilrør 32 gir inngang for luft strømmen inntak av medium og enhver buffer for justering av pH. Strømmen inn passere gjennom ventil 33 til bunnen av blandekammer 31. Reaktoren er utstyrt med en valgfri temperaturkontroll-mantel 29, som inneholder væskeinntaksanordninger 40 og væskeuttaksanordninger 41. Medium kan kontenuerlig fjernes fra reaktoren ved hjelp av mediumutføringslinje 45, som strekker seg ned til øvre overflate av reaktormediet 34. En nettskjerm 35 er anbrakt ved utløpet for å forhindre til-stopning av uttaket av cellepartikler i suspensjon.

Forankrings avhengige celler som ikke kan tilpasses for å vokse i suspensjon kan dyrkes i reaktoren ifølge denne ut-førelsesform ved å så ut disse celler ved ca. 1 x 10~<*>celler pr. ml. i det øvre kammeret 30. Dette kammeret kan tilpasses for å inneholde anordninger som øker overflate arealet for festing. Slike anordninger kan innebefatte enhver komerisiell tilgjengelig mikrobærer, så som fornettede kjeramiske blokker, knipper av tynne fibere eller hule fibere eller andre anordninger som gir et passende substrat for at cellene skal feste seg og vokse. Reaktorsammenset-ningen er spesielt passende for mikorbærere på grunn av den lave skjærekraft og utmerkede omrøring frambrakt av luft-løftet. Anordninger som øker overflatearealet behøver en øket konsentrasjon av oppløst oksygen og konstant gjennom-strømning av friskt medium for å opprettholde levedyktighet av den tette cellekultur. Denne utførelsesform av reaktoren fremskaffer begge disse paramenter.

I den viste utførelsesform er festecellene tilpasset for å vokse i et semifast substrat så som natrium alginat; agar-ose; agar; karragenan; gelatin eller andre. Ved drift blandes en del av celle suspensjonen av cellelinjen som krever festing med to deler av en 1,5% alginatoppløsning (1% endelig). Blandingen blir så dryppet igjennom reaktor-kammerlokket 37 via inntak 43 og kapilærer 46 inn i reaktoren som inneholder en oppløsning av vanndis CaCl2(50mM). Kalsium oppløsningen sørger for å polymerisere alginatetog fange cellene i små kuler som indikert av 46. Disse gel kuler som innholder cellene renses fri for

CaCl2og resuspenderes i vekstmedium. Den fullstendige prosedyre som indikert kan utføres i en reaktor utstyrt som angitt med den modifiserte lokkform. Som i tidligere ut-førelsesf ormer holdes lokket lufttell med reaktorkammeret, ved hjelp av en gummipakning 38. Overflødig gasstrykk kan slippes ut gjennom utluftningslinjen 42. Om ønsket kan et passende filter anvendes for å opprettholde steriliteten av reaktoren.

Eksempler på en passende cellelinje som er festeavhengig er Hela celler som har blitt transfektert med et gen for humant interleukin 2. Hela-cellene ble dyrket i .12 dager før forsøket ble stoppet. Disse celler i dette demonstra-sjonsforsøket nådde en konsentrasjon 7 ganger høyere enn den som kan erholdes ved konvensjonelle cellekulturer. Interleukin 2 dannet av cellene ble målt over resultatene av ekperimentet er vist i figur 2. Som det fremgår ble interleukin 2 kontinuerlig frigitt i mediet som vist av søylene.

I en ytterligere demonstrasjon av fordelene ved å benytte den modifiserte bioreaktor i følge foreliggende oppfinnelse ble C1271 celler, en murin mammarisk tumor, som hadde blitt transfektert med et gen for humant interleukin 2, anvendt. Disse celler danner konstituetivt humant interleukin 2 . C1271 cellerble immobilisert ved en konsentrasjon på 4 x IO5 celler pr. ml. i 1% alginat som beskrevet ovenfor. Alginat gel kulene og bioreaktoren ble aerert med en 5%

Cc>2 og 95% luftblanding (v/v) og perfusert med vekstmedium ved konstant hastighet. De immobiliserte celler ble holdt i kultur i 14 dager. En konsentrasjon på 5000 enheter pr. ml. av interleukin 2 ble kontinuerlig oppsamlet i 7 dager fra vekstkulturmediet (figur 3). Dette er en 10 ganger økning i utbytte av IL-2 erholdt fra samme celler når de dyrkes i konvensjonell monolagskultur.

I enda en ytterligere utførelsesform av foreleggende oppfinnelse ble Jurkat celler forberedt i alginat kuler ident-isk til metoden anvendt ovenfor. Vekstmedium ble perfusert ved en hastighet på 0,5 ml. pr. minutt gjennom et multi-ventilrør 32. Resultater av eksperimentet er oppsummert i figur 4. Overlevelsen til Jurkat subkulturen ble opprett-holdt i 15 dager før avslutning av forsøket. Disse celler nådde en tetthet på ca. 8 x 10^ celler pr. ml. Lignende celler dyrket i en konvensjonell 1-liter spinner kultur nådde en tetthet på 2 x 10^ celler pr. ml. Celler i denne konvensjonelle kultur ble holdt overlevelsedyktige i kun 4 dager.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte ved dyrkning av cellekultur eller ved fermentering, karakterisert ved i kombina-sjon å holde en celle eller immobilisert cellepopulasjon i et vekstmedium ved en ønsket inkubasjonstemperatur; tilføre en forsiktig strøm av oksygenholdig gass som beveger seg oppover og sentralt gjennom vekstmediet for å føre cellene eller de immobiliserte celler oppover, hvorved mediet fra øvre del av vekstmediet beveger seg nedover for å erstatte det fortrengte medium for derved å erholde god blanding med forsiktig aerering og å holde cellene eller de immobiliserte celler i suspensjon samt opprettholde den oppløste oksygenkonsentrasjon i mediet for å støtte cellevekst høste cellene eller medium etter behov.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene er eukaryotiske eller prokaryotiske.

3. Fremgangsmåte ifølge frav 1, karakterisert ved at inkubasjonstemperaturen er ca. 37° C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene vokser i suspensjon.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene er forankringsavhengige og er støttet av mikrobærere.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikrobærerene består av gel-kuler for å immobilisere cellene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved gass-strømmen bestpr av ca. 5% CO^ og 95% luft.

8. Anordning for å utføre fremgangsmåten ifølge krav 1-7, karakterisert ved at den består av: et reaktorkammer anbragt og konstruert for å holde levende celler i kultur i et volum av kulturmedium, hvor reaktorkammeret består av et øvre kammer og et nedre kammer og hvor øvre og nedre kammer er operativt sammen-koblet via innover skrånende sidevegger; gassinntaksanordninger sentralt anbragt i nedre kammer hvorved.oksygeninneholdene gass tilføres nedre kammer og fører celler oppover til øvre kammer, og hvor medium fra øvre kammer beveger seg nedover over de skrånende, vegger og erstatter fortrengt medium for derved å gi en blandevirkning til cellene med forsiktig aerering med minimal skjærekraft og tilføre oppløst oksygen til mediet for å støtte cellevekst; og lokkanordning som gir lufttett forsegling med øvre kammer, hvor lokkanordningen inneholder gassut-taksanordninger.

9. Anordning ifølge krav 8, karakterisert , ved at reaktorkammeret ligger inne i en temperatur-kontroll-mantel-ånordning med væske-inntaks- og væskeuttaksanordninger.

10. Anordning ifølge krav 8, karakterisert v e d at lokket er anbragt og konstruert for å gi en anordning for å danne mikrobærere for celleimmobilisering.

11. ' Anordning ifølge krav 10, karakterisert ved at ganninntaksanordningen består av et fler-åpnings-pH-justerende opplø sning.

12. Anordning ifølge krav 10, karakterisert ved at lokkanordningen innebefatter en medium-uttaks-anordning og en gass-utfø rings-anordning.