WO2020141236A1 - Biorreactor y procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes que emplea el biorreactor - Google Patents

Biorreactor y procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes que emplea el biorreactor Download PDF

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Mercedes VILA JUÁREZ
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Biotech Foods S.L.
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    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Definitions

  • Bioreactor and adherent cell culture production procedure using the bioreactor are Bioreactor and adherent cell culture production procedure using the bioreactor.
  • the present invention refers to a bioreactor (also called a Kruter), of special application in biochemical processes in which cellular or microbial systems are used for the production of biological products. It also refers to a method of producing adherent cell cultures, especially for the formation of tissues and cultured meat, which uses said bioreactor.
  • Bioreactors have multiple applications, such as the food and fermentation industries, waste treatment, and many biomedical facilities.
  • a heater is a tank within which organic reactions are carried out, providing a suitable environment for various microorganisms under the required conditions. It must allow controlling the temperature by heat or cold, controlling the pH, aeration ranges, nutrient content, etc.
  • a bioreactor is a container in which a chemical process is carried out that involves organisms or biochemically active substances derived from said organisms. This process can be aerobic or anaerobic.
  • These bioreactors are commonly cylindrical, ranging in size from a few milliliters to cubic meters, and are usually made of stainless steel.
  • a bioreactor can also be a device or system used to grow cells or tissues in cell culture operations. These devices are under development for use in tissue engineering. In general terms, a bioreactor seeks to maintain certain favorable environmental conditions (pH, temperature, oxygen concentration, etc.) for the organism or chemical being grown.
  • the types of heaters available on the market have a number of common components and characteristics: the tank must be designed to work aseptically for many days with minimal energy consumption
  • bioreactors are widely used for the cultivation of microorganisms (bacteria, fungi, cells, etc.), both on a laboratory scale and on an industrial scale. Its design is normally a tank stirred by mechanical devices, either by rotating blades or by column bubbling. And the cultures of microorganisms in suspension are carried out.
  • Cell suspensions consist of free cells and cell aggregates distributed in a moving medium.
  • Another example is the iCELLis® bioreactor, a fixed bed system for the growth of adherent cells.
  • the object of the present invention is, therefore, to provide a bioreactor that allows adherent cells to be grown simply and efficiently, so that it is productive on a large scale, especially for the production of tissue and cultured meat.
  • the invention provides a bioreactor, comprising a container with a lid, and further comprising a support inside which protrudes at least one tray that supports a three-dimensional polymer-based element located thereon, such that when the bioreactor is filling with the culture medium the at least one tray and the polymer-based three-dimensional element are surrounded by the culture medium.
  • the invention also provides a method of producing adherent cell cultures, which employs said bioreactor, and which comprises the following steps:
  • the cells to be sown are inoculated onto the polymer-based three-dimensional element, and - the culture is left in the bioreactor so that cell proliferation occurs.
  • the configuration of the bioreactor allows proliferated adherent cells to achieve their functions of extracellular matrix growth and tissue formation in a way more similar to the processes performed in vivo, and making the corresponding procedure more productive. In this way, the tissues formed have a high protein value.
  • Figure 1 shows a view of a bioreactor of the invention showing the support and the trays.
  • Figure 2 shows the assembly formed by the support, the trays, the rings and the polymer-based three-dimensional elements of the bioreactor of the invention.
  • Figure 3 shows the assembly of figure 2, to which air bubble generators have been added under each tray.
  • FIG 1 shows a view of a bioreactor 1 of the invention obtained from a commercial or traditional bioreactor.
  • the conventional bioreactor comprises a container 2 with a lid 3.
  • a support 4 has also been included inside it, in which trays 5 can be placed.
  • the bioreactor 1 has three trays 5, which can be made of stainless steel. The number of trays 5 can increase or decrease depending on the needs and size of the bioreactor 1.
  • each tray 5 supports a three-dimensional element 6 with a polymeric base located on it, that is to say, these trays 5 suppose support places for three-dimensional elements 6 (three-dimensional matrices) that act as growth "scaffolds" for adherent cells.
  • These “scaffolds” can be hydrogel-type polymer-based three-dimensional structures 6, on which the cells can be seeded by inoculation from outside the bioreactor 1 with a needle and leave in culture until the proliferation achieved is the desired one.
  • the trays 5 and the polymer-based three-dimensional elements 6 are surrounded by the culture medium.
  • the support 4 can be suspended from the lid 3 of the bioreactor 1, in such a way that once the bioreactor 1 is closed, the trays 5 and the three-dimensional elements 6 of polymer base are submerged in the culture medium.
  • the support 4 can protrude perpendicularly from the cover 3.
  • the support 4 can also be supported on the base of the bioreactor 1 independent of the cover
  • the trays 5 can be drilled through a series of through holes, to allow a better flow of liquid throughout the bioreactor 1.
  • the bioreactor 1 can include rings 7 for holding the polymer-based three-dimensional elements 6 ("scaffolds"), which also protrude from the support 4 in a parallel position with respect to a corresponding tray 5, so that the polymer-based three-dimensional element 6 is located between the corresponding tray 5 and the corresponding ring 7.
  • sinaffolds polymer-based three-dimensional elements 6
  • the support 4 can include several profiles or support rods on which the trays 5 and rings 7 rest. On these profiles it is possible to include electrical contacts 8 capable of being supplied with direct or alternating current. This direct or alternating current, which can be of the order of microamps, facilitates and increases cell proliferation.
  • the bioreactor 1 may also additionally include an air bubble generator 9 under each tray 5.
  • the cell culture production procedure, which employs a bioreactor 1, comprises the following steps:
  • the support 4 with the at least one tray 5 of the bioreactor 1 with the polymer-based three-dimensional element 6 is immersed in the culture medium, - the cells to be sown on the three-dimensional element 6 are inoculated from the outside of the bioreactor 1 polymer-based, and
  • Said procedure may additionally comprise a step of stimulating cell proliferation consisting of supplying the electrical contacts 8 of the support 4 of the bioreactor 1 with direct or alternating current.
  • said method may additionally comprise a cell proliferation stimulation step consisting of producing air bubbles under each tray 5 by means of the air bubble generators 9.
  • the invention is of special application to the cultivation of animal muscle cells for the production of cultured meat, but it is not only limited to this application or to this type of adherent cells.

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Abstract

Biorreactor y procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes que emplea el biorreactor. El biorreactor (1) comprende un recipiente (2) con una tapa (3), y comprende adicionalmente en su interior un soporte (4) del que sobresale al menos una bandeja (5) que soporta un elemento tridimensional (6) de base polimérica situado sobre ella, de tal modo que cuando el biorreactor (1) es llenado con un medio de cultivo la al menos una bandeja (5) y el elemento tridimensional (6) de base polimérica están rodeados por el medio de cultivo. El procedimiento comprende los siguientes pasos: - el soporte (4) con la al menos una bandeja (5) del biorreactor (1) con un elemento tridimensional (6) de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo, - desde el exterior del biorreactor (1) se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional (6) de base polimérica, y - se deja el cultivo en el biorreactor (1) de modo que se produce la proliferación celular.

Description

DESCRIPCIÓN
Biorreactor y procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes que emplea el biorreactor.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un biorreactor (también denominado termentador), de especial aplicación en procesos bioquímicos en los que se emplean sistemas microbianos o celulares para la producción de productos biológicos. También se refiere a un procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, en especial para la formación de tejidos y carne cultivada, que emplea dicho biorreactor. Antecedentes de la invención
Los biorreactores tienen múltiples aplicaciones, como las industrias de la alimentación y fermentación, el tratamiento de residuos y muchas instalaciones biomédicas.
Un termentador es un tanque dentro del cual se llevan a cabo reacciones orgánicas, proporcionando un ambiente adecuado para varios microorganismos bajo las condiciones requeridas. Debe permitir controlar la temperatura por calor o frío, controlar el pH, rangos de aireación, contenido de nutrientes, etc.
Los biorreactores comunes son en general recipientes o sistemas que mantienen un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Estos biorreactores son comúnmente cilindricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos, y son usualmente fabricados en acero inoxidable.
Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) para el organismo o sustancia química que se cultiva.
Los termentadores industriales a gran escala se construyen con acero inoxidable. Un termentador de este tipo es un cilindro cerrado por arriba y por abajo, en el que se han adaptado varios tubos y válvulas. También se utilizan otros materiales, y existe una tendencia a utilizar plásticos de un solo uso; sin embargo, los altos costes en consumibles sólo se justifican si el producto obtenido tiene un alto valor en el mercado (por ejemplo: anticuerpos, vacunas, proteínas terapéuticas, etc. obtenidas mediante el cultivo de células de mamíferos e insectos).
Para un buen diseño de termentador se debe cumplir con dos requisitos fundamentales: mantener un medio homogéneo sin zonas muertas y a la vez transferir oxígeno al medio empleando el mínimo de energía posible.
En el diseño de un termentador se deben considerar los siguientes aspectos: mezclado y patrones de flujo
configuración geométrica y tipo de reactor
transferencia de oxígeno a lo largo de todo el tanque
mínimo consumo de energía.
Los tipos de termentadores disponibles en el mercado presentan una serie de componentes y características comunes: el tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante muchos días consumo mínimo de energía
contar con un sistema de control de pH
sistema de toma de muestra
sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir necesidades metabólicas de microorganismos
control de temperatura
evaporación mínima
debe ser versátil (diversas aplicaciones o procesos)
superficies del tanque internas deben ser lisas
materiales económicos
servicio adecuado de repuestos para el termentador tipo de antiespumante.
El uso de biorreactores está ampliamente extendido para el cultivo de microorganismos (bacterias, hongos, células, etc.), tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Su diseño, normalmente es de tanque agitado mediante dispositivos mecánicos ya sea mediante palas giratorias o mediante burbujeo columna. Y se realizan los cultivos de microrganismos en suspensión. Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento.
Esto supone un problema cuando las células que se quieren crecer son células denominadas como“adherentes”. Estas células, como lo son las células musculares o epiteliales, necesitan de una superficie para poder crecer y proliferar, con lo que las soluciones que aportan los biorreactores que mantienen las células en suspensión no son adecuadas para ellas. En los biorreactores solo es posible crecer microorganismos que sean capaces de proliferar en suspensión.
Para poder crecer estas células adherentes, se han propuesto y comercializado varias propuestas:
Biorreactores de cama fija, en los que la superficie disponible para que estas células puedan proliferar colonizando el área disponible en el fondo del vaso es muy limitada.
Frascos de cultivo estáticos dentro de una estufa de C02; de la misma manera siguen siendo poco productivos y limitados por la superficie bidimensional disponible.
El avance más significativo para crecer células adherentes ha sido la propuesta de utilizar micro-esferas suspendidas en la solución de los fermentadores/biorreactores tradicionales, de tal manera que se consiga aumentar la superficie especifica que estas células pueden encontrar dentro de la suspensión y donde pueden anclarse para crecer y proliferar.
Otro ejemplo es el biorreactor iCELLis®, un sistema de cama fija para el crecimiento de células adherentes.
Sumario de la invención El objeto de la presente invención es, por tanto, proporcionar un biorreactor que permita poder crecer células adherentes de manera sencilla y eficaz, de tal modo que sea productivo a gran escala, en especial para la producción de tejidos y de carne cultivada.
La invención proporciona un biorreactor, que comprende un recipiente con una tapa, y que comprende adicionalmente en su interior un soporte del que sobresale al menos una bandeja que soporta un elemento tridimensional de base polimérica situado sobre ella, de tal modo que cuando el biorreactor es llenado con un medio de cultivo la al menos una bandeja y el elemento tridimensional de base polimérica están rodeados por el medio de cultivo.
La invención también proporciona un procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, que emplea dicho biorreactor, y que comprende los siguientes pasos:
- el soporte con la al menos una bandeja del biorreactor con un elemento tridimensional de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo,
- desde el exterior del biorreactor se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional de base polimérica, y - se deja el cultivo en el biorreactor de modo que se produce la proliferación celular.
La configuración del biorreactor permite que las células adherentes proliferadas consigan realizar sus funciones de crecimiento de matriz extracelular y formación de tejidos de una manera más similar a los procesos realizados in vivo, y que el procedimiento correspondiente resulte más productivo. De esta manera los tejidos formados tienen alto valor proteínico.
Otras realizaciones ventajosas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de las figuras
A continuación, se describirá una realización ilustrativa, y en ningún sentido limitativa, del objeto de la presente invención, haciendo referencia a los dibujos que se acompañan, en los cuales: La figura 1 muestra una vista de un biorreactor de la invención que muestra el soporte y las bandejas.
La figura 2 muestra el conjunto formado por el soporte, las bandejas, los anillos y los elementos tridimensionales de base polimérica del biorreactor de la invención.
La figura 3 muestra el conjunto de la figura 2, al que se le han añadido generadores de burbujas de aire debajo de cada bandeja.
Descripción detallada de la invención
La figura 1 muestra una vista de un biorreactor 1 de la invención obtenido a partir de un biorreactor comercial o tradicional. El biorreactor convencional comprende un recipiente 2 con una tapa 3. En el biorreactor 1 de la invención se ha incluido adicionalmente en su interior un soporte 4 en el que se pueden colocar unas bandejas 5. En la realización de las figuras 1 , 2 y 3, el biorreactor 1 tiene tres bandejas 5, que pueden realizarse en acero inoxidable. El número de bandejas 5 puede aumentar o disminuir en función de las necesidades y el tamaño del biorreactor 1. En las figuras 2 y 3 se observa que en el biorreactor 1 de la invención cada bandeja 5 soporta un elemento tridimensional 6 de base polimérica situado sobre ella, es decir, estas bandejas 5 suponen lugares de soporte para elementos tridimensionales 6 (matrices tridimensionales) que actúan como“andamios” de crecimiento para las células adherentes.
Estos“andamios” pueden ser estructuras tridimensionales 6 de base polimérica de tipo hidrogel, sobre el que las células pueden ser sembradas mediante una inoculación desde el exterior del biorreactor 1 con una aguja y dejar en cultivo hasta que la proliferación conseguida sea la deseada.
Cuando el biorreactor 1 es llenado con un medio de cultivo las bandejas 5 y los elementos tridimensionales 6 de base polimérica se encuentran rodeados por el medio de cultivo. El soporte 4 puede encontrarse suspendido de la tapa 3 del biorreactor 1 , de tal manera que una vez que se cierra el biorreactor 1 las bandejas 5 y los elementos tridimensionales 6 de base polimérica se encuentran sumergidos en el medio de cultivo. En una realización, el soporte 4 puede sobresalir perpendicularmente de la tapa 3.
El soporte 4 también puede apoyarse sobre la base del biorreactor 1 independiente de la tapa
3.
Las bandejas 5 pueden estar horadadas mediante una serie de orificios pasantes, para permitir un flujo mejor de líquido a lo largo de todo el biorreactor 1.
En las figuras 2 y 3 se observa que el biorreactor 1 puede incluir anillos 7 de sujeción de los elementos tridimensionales 6 de base polimérica (“andamios”), que sobresalen asimismo del soporte 4 en una posición paralela con respecto a una bandeja 5 correspondiente, de modo que el elemento tridimensional 6 de base polimérica se encuentra situado entre la bandeja 5 correspondiente y el anillo 7 correspondiente.
El soporte 4 puede incluir varios perfiles o vástagos de apoyo sobre los que se apoyan las bandejas 5 y los anillos 7. Sobre estos perfiles es posible incluir unos contactos eléctricos 8 susceptibles de ser alimentados con corriente continua o alterna. Esta corriente continua o alterna, que puede ser del orden de microamperios, facilita y aumenta la proliferación celular
Esta proliferación celular aumentada es debida a que, en superficies y ambientes polarizados, las proteínas se concentran más por atracción electrostática y las células tienen más nutrientes disponibles para sus actividades metabólicas. Las pruebas realizadas han permitido obtener incrementos en dicha proliferación de 7 veces con respecto al sistema sin el estímulo de la corriente continua.
El biorreactor 1 también puede incluir adicionalmente un generador 9 de burbujas de aire debajo de cada bandeja 5. La capacidad de modificar el tamaño y la frecuencia de burbujeo de aire mediante la introducción de generadores 9 de burbujas (“spargers”) debajo de cada bandeja 5, ejerce un estímulo mecánico en los“andamios” con la presión de estas pequeñas burbujas. Esta modificación está orientada a simular los movimientos de contracción/extensión de los musculares para así favorecer las similitudes con la proliferación in vivo. El procedimiento de producción de cultivos celulares, que emplea un biorreactor 1 comprende los siguientes pasos:
- el soporte 4 con la al menos una bandeja 5 del biorreactor 1 con el elemento tridimensional 6 de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo, - desde el exterior del biorreactor 1 se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional 6 de base polimérica, y
- se deja el cultivo en el biorreactor 1 de modo que se produce la proliferación celular.
Dicho procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en alimentar con corriente continua o alterna los contactos eléctricos 8 del soporte 4 del biorreactor 1.
Asimismo, dicho procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en producir burbujas de aire debajo de cada bandeja 5 mediante los generadores 9 de burbujas de aire.
La invención es de especial aplicación al cultivo de células de músculo animales para la producción de carne cultivada, pero no solo está limitada a esta aplicación ni a este tipo de células adherentes.
Aunque se han descrito y representado unas realizaciones del invento, es evidente que pueden introducirse en ellas modificaciones comprendidas dentro del alcance del mismo, no debiendo considerarse limitado éste a dichas realizaciones, sino únicamente al contenido de las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Biorreactor (1 ), que comprende un recipiente (2) con una tapa (3), caracterizado por que comprende adicionalmente en su interior un soporte (4) del que sobresale al menos una bandeja (5) que soporta un elemento tridimensional (6) de base polimérica situado sobre ella, de tal modo que cuando el biorreactor (1 ) es llenado con un medio de cultivo la al menos una bandeja (5) y el elemento tridimensional (6) de base polimérica están rodeados por el medio de cultivo.
2.- Biorreactor (1 ) según la reivindicación 1 , en el que el soporte (4) se encuentra suspendido de la tapa (3).
3.- Biorreactor (1 ) según la reivindicación 2, en el que el soporte (4) sobresale perpendicularmente de la tapa (3).
4.- Biorreactor (1 ) según la reivindicación 1 , en el que el soporte (4) está apoyado en la base del biorreactor (1 ).
5.- Biorreactor (1 ) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la al menos una bandeja (5) está horadada mediante una serie de orificios pasantes.
6.- Biorreactor (1 ) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente al menos un anillo (7) que sobresale del soporte (4), de modo que cada anillo (7) está dispuesto paralelamente a una bandeja (5) correspondiente, estando el elemento tridimensional (6) de base polimérica situado entre la bandeja (5) correspondiente y el anillo (7) correspondiente.
7.- Biorreactor (1 ) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte (4) comprende una serie de contactos eléctricos (8) susceptibles de ser alimentados con corriente continua.
8.- Biorreactor (1 ) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un generador (9) de burbujas de aire debajo de cada bandeja (5).
9.- Procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, que emplea un biorreactor (1) según la reivindicación 8, que comprende los siguientes pasos:
- el soporte (4) con la al menos una bandeja (5) del biorreactor (1) con el elemento tridimensional (6) de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo, - desde el exterior del biorreactor (1) se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional (6) de base polimérica, y
- se deja el cultivo en el biorreactor (1 ) de modo que se produce la proliferación celular.
10.- Procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en alimentar con corriente continua los contactos eléctricos (8) del soporte (4) del biorreactor (1).
11 Procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, según la reivindicación 9 o 10, que comprende adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en producir burbujas de aire debajo de cada bandeja (5) mediante los generadores (9) de burbujas de aire.
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