MXPA06005543A - Sistema para cultivo celular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un nuevo aparato para desarrollar celulas o microorganismos, donde la camara de cultivo esta parcialmente llena con el medio de cultivo liquido y las celulas. El mecanismo de induccion de onda levanta entre el 5 y el 50% de la longitud de la camara de cultivo. El mezclado y la aireacion se logran introduciendo de manera intermitente las ondas desde un extremo del biorreactor hasta el otro. Como el diseno de la invencion es muy simple, es posible manufacturarlo con material plastico flexible y usar el aparato como un sistema desechable. Ademas, este principio de mezclado/aireacion minimiza los danos a las celulas que se deben usualmente al esfuerzo cortante y a las burbujas pequenas. Dado que el mecanismo de induccion de onda es muy simple, permite aumentarlo a escala, desde una escala pequena hasta una grande. Este sistema de cultivo a gran escala, eficiente y desechable, puede reducir grandemente los costos de produccion.

Description

as to the applicant's entitlement to claim the priority ofthe HU, 1E, ÍS, 1T, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR), earlier application (Rule 4.17(iii¡) for the following desigOAP1 patent (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN, GQ, GW, nations AE, AG, AL AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW, ML, MR, NE, SN, TD, TG) BY, BZ CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, — of inventorship (Rule 4.17(iv))for US only EC, EE, EG, ES, Fl, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, Published: IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, — with intemational search report LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NA, NI, NO, NZ, — before the expiration of the time limit for amending the OM, PG, PH, PL, PT, RO, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SY, claims and to be republished in the event of receipt of TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VC, VN, YU, ZA, amendments ZM, ZW, ARIPO patent (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), Eurasian patent (AM, For two-letter codes and other abbreviations, refer to the "GuidAZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), European patent (AT, ance Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the begin-BE, BG, CH. CY, CZ, DE, DK, EE, ES, Fl, FR, GB, GR, ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazelte.

SISTEMA PARA CULTIVO CELULAR Campo de la invención. La presente invención se refiere al campo del cultivo celular. Consiste en un sistema de cultivo líquido, para desarrollar células en general y células de plantas en particular. Este sistema de cultivo se basa en el principio de una onda que proporciona agitación, que ofrece un mezclado conveniente, y aireación al cultivo celular contenido en una bolsa de plástico desechable. Este sistema de cultivo a gran escala, eficiente y desechable, puede reducir grandemente los costos de producción.

Entorno de la invención. Los sistemas de cultivo convencionales generalmente están compuestos de un contenedor rígido (vidrio o acero inoxidable) que tiene medios para airear y mezclar el contenido del cultivo (aspersor de aire, impelente) . Estos sistemas son complejos, y el equipo usual y las instalaciones de soporte asociados con el bioproceso aséptico son extremadamente caros, debido a que la producción, a gran escala se basa en recipientes de acero inoxidable, esterilizados in si tu . Más del 60% de los ' costos de producción se debe a los costos fijos: los altos costos de . capital del " equipo ' de fermentación, la depreciación, el interés y los costos del capital. Los costos de operación también son, altos, debido a la baja producción y a las necesidades de limpieza y esterilización del biorreactor después de cada ciclo de cultivo. En la aplicación industrial particular de cultivos de células de planta, se han utilizado diferentes sistemas de cultivo muy conocidos tales como el tanque agitado o los reactores de elevación de aire. A pesar de muchos esfuerzos para comercializar los metabolitos de plantas, se ha logrado poco éxito' comercial. Una razón de ello es la baja productividad a pesar de la posibilidad de obtener un contenido más alto del compuesto deseado que en la planta completa (ácido rosmarínico, shiconina, etc.), hasta del 20.% del peso seco. La restricción principal que conduce a una baja productividad, sigue siendo el bajo rango de desarrollo (por debajo de 0.7 día-1, menos 20 h doble tiempo) comparado con las bacterias. El usar cultivo dosificado en el fermentador industrial significa operar no más de 10-20 corridas por año con los cultivos de células de planta, en instalaciones de costo muy alto. Esto significa que el cuello de botella para una producción industrial es más bien económico que biológico.

Para resolver estos problemas y disminuir los costos de producción, recientemente aparecieron nuevas tecnologías basadas en el uso de diversas bolsas plásticas desechables en lugar del fermentador de acero inoxidable. Estos nuevos sistemas que usan bolsas plásticas desechables preestériles son promisorios porque disminuyen la inversión de capital, dado que el plástico es un material de bajo costo y además eliminan la limpieza, la esterilización, la validación y el mantenimiento del equipo, que consumen . tiempo y costos. También permiten más flexibilidad en eí proceso, que puede ser operado por personas no experimentadas en la técnica, que no requieren un proceso largo de entrenamiento/aprendizaje y/o experiencia, ya que las bolsas se proporcionan preestériles. Además, el uso de medios de agitación no invasivos permite minimizar la • complejidad mecánica y la posibilidad de contaminación. En estos sistemas la aireación se hace con entrada y burbujeo de aire usual asumiendo la aireación/agitación y el mezclado de la masa, ün reactor puede consistir de un revestimiento de bolsa plástica asperjado con gas en un tanque con una placa frontal que tiene capacidades para la • inoculación y remoción de la muestra de medio. Las bolsas plásticas cónicas desechables producidas por Osmotec son para uso en pequeña escala (pocos litros) , usando burbujas de aire para la aireación a través de una entrada. La Patente US No. 6,432,698 también describe un biorreactor desechable para cultivar "microorganismos o células, que comprende un burbujeador de gas que genera burbujas de gas para mezclar y proporcionar los gases, parecido al biorreactor de elevación de aire, excepto en que está hecho de' material plástico. En ' estas invenciones,, las burbujas pequeñas pueden ser dañinas para las células sensibles, incrementar la formación de espuma y la adhesión de las células a la pared, y/o quitar algunos gases útiles del medio de cultivo (etileno para las células de planta, por ejemplo) .

Para minimizar el daño a las células y mejorar el desarrollo y la productividad celulares, se han propuesto diferentes sistemas de aireación/mezclado libres - de burbujas, en los aparatos desechables. Por ejemplo, otra sugerencia es usar bolsas plásticas permeables al gas, agitadas con un sistema mecánico o no agitadas de ningún modo: en la Patente US No. 5,057,429, una bolsa permeable al gas es girada o sacudida para difundir el oxígeno y los nutrientes hacia las células animales. En la Patente US No. 5,225,346 también se describe una bolsa estática r permeable al gas. Hasta ahora, no hay desarrollo industrial de esos sistemas de cultivo, principalmente porque, por una parte, hay una dificultad para aumentar a escala un aparato de agitación externo, y por la otra, por los problemas debidos al suministro insuficiente "de oxígeno a las células en una bolsa estática que contiene varios litros de medio de cultivo. En la Patente WO 00/66706, la agitación se realiza por oscilación en torno de un eje de oscilación de un bastidor del reactor. En la "Solicitud de Patente de - invención FR-A--2519020", también es una oscilación en torno de un eje de oscilación lo que permite la agitación. El eje puede ser puesto en la parte central del dispositivo, o en una de las extremidades. Wave Biotech (Singh V, Patente US No. 6,190,913) también ha desarrollado un sistema que usa una bolsa inflada colocada en un mecanismo basculante - que - mueve la bolsa introduciendo un movimiento parecido a una onda al líquido en ella contenido. El mecanismo basculante limita el tamaño del tanque, porque esta agitación mecánica necesita equipo complejo para lograr volúmenes altos de cultivo; en efecto, el mecanismo de inducción de ondas soporta toda la cámara de cultivo. En la Patente FR-A- ' 2519020, el volumen del cultivo es sólo a escala de laboratorio (2.5 litros) y limitado a 200 litros en la Patente WO 00/66706. En la Patente US 6,190,913, se reivindican volúmenes usados de desde 100 ml hasta 500 L. En estas tres Patentes, la cámara de cultivo completa bascula periódicamente de un lado al otro, generando presión muy alta en cada lado, lo que es incompatible con un crecimiento a gran escala.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de cultivó celular eficiente y de bajo costo vía un aparato desechable, que es más fácil de aumentar a escala que la mayoría de los sistemas de cultivo 5 desechables ya descritos.

Descripción de la invención. La presente invención se refiere a un aparato de cultivo celular que comprende una cámara de cultivo 10. flexible, y un mecanismo de inducción de onda, donde el mecanismo de inducción de onda se levanta entre el 5 y el 50% de la longitud de la cámara de cultivo.

También se refiere al uso de un aparato así para 15 cultivar células de planta, células animales, o . microorganismos.

Breve descripción de los dibujos. La Figura 1 es una vista en perspectiva del 0 aparato. La Figura 2 es una vista lateral del aparato.

La Figura 3 es una representación esquemática de la formación de ondas, moviendo hacia arriba y hacia abajo 5 el mecanismo de inducción dé onda.

La Figura 4 muestra la ..cinética de desarrollo de células de soya cultivadas en el Sistema para cultivo celular, el frasco de Erlenmeyer y el reactor de tanque agitado, expresada en g de peso fresco por litro.

La Figura 5 muestra la- cinética de desarrollo de células de soya cultivadas en el Sistema para cultivo celular, el frasco de Erlenmeyer y el reactor de tanque agitado, expresada en g de peso seco por litro.

Descripción detallada de la invención. El presente dispositivo ' proporciona un sistema simple para cultivar células vivas. Consiste de dos componentes: una cámara de cultivo desechable y un mecanismo de inducción de onda. El mecanismo de inducción de onda se levanta entre el 5 y el 50% de la longitud de la cámara de cultivo .

Una bolsa de plástico inflada, flexible y desechable, constituye preferiblemente la cámara de cultivo. Esta bolsa de plástico está parcialmente llena con medio de cultivo líquido y con células, que se mezclan y oxigenan debido a un movimiento de onda. De esta forma, la superficie del medio es continuamente renovada y puede realizarse la aireación libre de burbujas que no es dañina para las células. El mover hacia arriba y hacia abajo al menos un extremo de la bolsa plástica con un mecanismo simple, causa la inducción del movimiento de onda. Este mecanismo de inducción de onda consiste de una pequeña placa que es elevada periódicamente con un motor o empujador mecánico unido a un cronómetro. Este simple mecanismo de inducción de onda permite aumentar a escala con facilidad.

Dado que la presente invención es desechable y eficiente a gran escala, es un buen sistema alternativo para disminuir los costos de producción en las aplicaciones . industriales. Además, este sistema desechable permite flexibilidad en el proceso y disminuye el tiempo muerto, ya que no se requiere limpieza, mantenimiento o validación como en los dispositivos tradicionales de acero inoxidable.

Este sistema de cultivo puede ser aplicado para • células de planta, cultivos de células animales o cultivos de. microorganismos, con una escalada muy fácil a partir de una bolsa pequeña hasta una grande, ya que el mecanismo de inducción de onda es muy simple. El proceso permite producir metabolitos de novo, biotransformación, proteínas recombinantes, o multiplicar la línea embriogénica de células de planta a través de cultivo por partida, partida de alimentación o cultivo continuo, así como cualquier otro uso que pudiera ser obvio para la persona experimentada. 5 Un diseño básico de la invención se muestra en la.

Figura 1 (visto en perspectiva) , y en la Figura 2 (vista lateral) . El biorreactor está compuesto de diferentes partes, que comprenden al menos una cámara de cultivo (1) hecha de un material tal como, por ejemplo, hojas plásticas 10 flexibles biocompatibles selladas a lo largo de sus bordes (2), para crear un interior. Dado que la presente invención se basa en el principio de una onda que proporciona agitación, la segunda parte esencial es el mecanismo de inducción de onda (7), que puede consistir de una placa 15 colocada justo por debajo de al menos un extremo de la cámara de cultivo, por ejemplo, o de cualquier otro medio apropiado que jale hacia arriba el extremo de la cámara de cultivo. El mecanismo de inducción de onda también puede consistir de una placa que se mueva hacia arriba y hacia 20. abajo en la parte media, o en cualquier otra parte, de la cámara de cultivo.

En una representación preferible de la presente invención, la cámara de cultivo es una bolsa hecha de 25 polipropileno flexible, por sus propiedades de ser sellable y capaz de ser sometido a la autoclave, de modo que puede ser esterilizada en la autoclave- de un laboratorio pequeño o por cualquier otro medio muy conocido en la técnica. Sin embargo, también son adecuados otros tipos de materiales plásticos, tal como el polietileno entre otros, y pueden usarse otras clases de técnicas de esterilización.

En una representación preferible de la invención, el material flexible, biocompatible, a prueba de agua, es sellado por calor a lo largo de sus bordes (2), por ejemplo con un sellador de impulso térmico. Sin embargo también pueden usarse otras técnicas de sellado, de acuerdo con los métodos muy conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, soldadura por onda ultrasónica o de radio. Otros tipos de plásticos, que no requerirán sellado, pueden ser manufacturados de distinta manera, tal como por ejemplo inyección de molde.

La bolsa tiene preferiblemente una forma de almohada, pero pueden usarse otras formas, y las dimensiones pueden variar para satisfacer las necesidades de los usuarios. En la presente invención, la bolsa que forma, la cámara de cultivo puede tener una superficie cuadrada, rectangular, oval, circular o trapezoidal. Sin embargo, para mejorar la eficiencia del método y el aparato de la invención son preferibles las formas rectangulares. Las dimensiones particularmente preferibles de la bolsa son 3.20 m de ..largo y 0.9 m de ancho para 100 litros de cultivo, o 3 m de largo y 0.3 m de ancho para 25 litros. Sin embargo, la longitud puede ser de hasta 10 m y mayor, y la presente invención permite tener desde 1 litro hasta varios cientos de litros, tal como 100, 300, 500, 1000 L o más de medio de cultivo .

En la representación preferible, al menos dos tubos, conectados del lado superior de la cámara de cultivo, pueden asegurar la renovación del oxígeno; el primero (3) proporciona la entrada de aire (aire comprimido u otros gases, de acuerdo con las necesidades del cultivo) , y el segundo ventila los gases de escape (4) . En la representación más preferible, estos dos tubos están equipados con filtros para prevenir la contaminación portada por el aire, por ejemplo, con filtros de 0.22 µm. Otro medio para proporcionar el suministro de oxígeno y la eliminación de los gases producidos por el cultivo, consiste en proporcionar, en al menos una parte de la superficie superior de la bolsa, una membrana permeable al gas . Esta membrana debe tener una permeabilidad al gas y una superficie suficientes para asegurar una buena oxigenación del cultivo. La membrana puede, por ejemplo, ser sellada o soldada a la bolsa. Estas membranas deben ser preferiblemente impenetrables por, el líquido, el vapor de agua y los contaminantes . 5. Además, en el diseño básico que se muestra en la Figura 1, al menos otros dos tubos pueden ser conectados a la cámara de cultivo. Uno (5) está conectado en' el lado superior de la bolsa, para llenar el biorreactor con un inoculum suspendido en el medio de cultivo fresco 0 esterilizado. El otro (6) está conectado en el lado . inferior de la bolsa, para extraer muestras o cosechar el cultivo . Estos tubos están hechos preferiblemente (pero no limitados a ello) de silicona sometible a la autoclave, con una relación, de diámetro interior/diámetro exterior de 8/12 mm; pero esta relación puede cambiarse, por supuesto, para satisfacer las necesidades del operador.

La segunda parte esencial del sistema de cultivo es el mecanismo de inducción de onda (7). Co o se muestra en la Figura 2, este mecanismo está hecho, entre otras cosas, de una placa pequeña y colocada preferiblemente justo por debajo de un extremo de la cámara de cultivo, - pero esa placa puede ser colocada bajo el punto medio de la cámara de cultivo, o bajo cualquier otra parte de la cámara de cultivo. En una representación preferible, el- ancho de la placa es igual al ancho de la cámara de cultivo y la longitud de la placa es de- entre 5 y 50%, más preferiblemente de 8 a 20% de la longitud de la cámara de cultivo. Al moverse hacia arriba y hacia abajo a través de un ángulo de desde Io hasta 90°, preferiblemente de 1 a 45°, más preferiblemente de 1° a 25°, la pequeña placa induce una onda (8) en el cultivo líquido (9), que proporciona tanto el mezclado como la oxigenación del cultivo. Dado que la bolsa está inflada, permite que la onda se propague a lo largo de la cámara de cultivo (10) . En una representación preferible, la altura del medio de cultivo es del 10 al 30% de la altura de la cámara de cultivo inflada. Sorprendentemente, cuando la onda llega al extremo opuesto (11) , regresa al punto inicial -(12) sin romperse. Entonces, el mecanismo crea de nuevo (13) un impulso. Para mejorar el regreso de la onda, también es posible elevar ligeramente el extremo opuesto.

La placa pequeña del mecanismo de inducción de onda puede ser elevada periódicamente con un brazo motorizado o con un empuj ador mecánico, pero pueden elegirse otras clases de equipo. Este equipo está preferiblemente conectado a un cronómetro, para elegir la frecuencia más apropiada de inducción de la onda.

Cuarído se usa una cámara de cultivo- muy larga para un volumen grande de cultivo* por ejemplo de arriba de cien litros, es posible colocar un mecanismo de inducción de onda en cada extremo de la cámara de cultivo. En este caso, el mecanismo de inducción de onda levanta - alternativamente entre el 5 y el 50%, o más preferiblemente entre el 7 y el 20%, de la longitud de la cámara de cultivo.

La presente invención se basa en el hecho de que la inducción de las ondas proporciona el mezclado y la - aireación libre de burbujas del cultivo líquido. La transferencia de oxígeno se hace por la difusión desde el aire del espacio de la cabeza hasta el cultivo líquido, y proporciona el desarrollo sin esfuerzo cortante.

Este sistema de cultivo es fácil de operar, ya ' que tanto la cámara de cultivo como los medios de agitación son simples. El escalado también es fácil de lograr, a partir de volúmenes pequeños - hasta varios cientos de litros, ya que el mecanismo de inducción de onda no soporta toda la cámara de cultivo, sino que sólo tiene que levantar al menos un extremo de la cámara de cultivo.

Preferiblemente, la cámara de cultivo se llena con las células y el medio de cultivo a un rango de llenado de 20 a 80%, más preferiblemente de 20 a 40%.

Ejemplo. El siguiente ejemplo es ilustrativo de algunos de los productos y métodos para hacer los mismos, que caen dentro de la competencia de la presente invención. No debe considerarse, de ninguna manera, limitativo de la , invención. Pueden hacerse cambios y modificaciones con respecto de la invención. Esto es, la persona experimentada reconocerá muchas variaciones en estos ejemplos para cubrir un amplio rango de fórmulas, ingredientes, procesamientos y mezclas, para ajustar racionalmente los niveles naturalmente ocurrentes de los compuestos de la invención para una variedad de aplicaciones. .

Ejemplo: comparación del crecimiento con cultivos de células de soya. La capacidad de la invención para desarrollar células de soya se ha demostrado usando cultivos por partida. Esta es comparable, o mejor, que en el frasco de Erlenmeyer o en el biorreactor de tanque agitado, aún a escala mayor.

Se iniciaron cepas de cultivo de tejido de Glycine max (L.) Merr., a partir de diferentes cultivos en medio.de Gamborg et al. (1968), .suplementados con 20 g.L-1 de sacarosa, 7 g.L-1 de agar (bacto-agar Difco) y 1 g.L-1 de ácido 2, 4-diclorofenoxiacético. El pH se ajustó a 5.8 5 antes de someter a la autoclave (30 min a 115°C) . Una cepa (13406, cv. saetilla de Maple) fue transferida a un medio líquido (el mismo medio que para los cultivos de tejidos sin agar y 30 g.L"1 de sacarosa), y subcultivada en frasco de Erlenmeyer de 250 mL (3 g.L-1 de peso fresco con 100 mL 10 de medio) cada dos semanas, en las mismas condiciones que la colección de cultivo de tejidos. Los frascos de Erlenmeyer se colocan en un agitador orbital a 100 rpm (diámetro de agitación de 20 mm) . 15 Un biorreactor de tanque agitado de 14 L (New Brunswick Scientific) con dos rotores de seis aspas planas, se usa con los mismos medio de cultivo y condiciones de temperatura y pH arriba mencionados. El biorreactor que contiene 9 L de medio fresco se somete a la autoclave 40 20. min a 115°C. Las células de soya de catorce días de edad se filtran de dos frascos de Erlenmeyer de ÍL (500 ml de medio) . Se pusieron 300 g de peso fresco en 1 L de medio fresco en un tanque estéril con una salida específica para ser conectada asépticamente al biorreactor para la 5 inoculación. Se ajustó la velocidad 'del agitador a 100 rpm.

El oxígeno ' disuelto se mantiene al 30% aumentando o disminuyendo el rango del flujo de aire, usando un biocontrolador equipado con una sonda de oxígeno esterilizable (Ingold) y un medidor de gasto de masa.

Un sistema para cultivo de células (como el anteriormente descrito) se llena con 10 L de células de soya en medio de cultivo fresco (30 g/L de peso fresco) . La temperatura ambiente se regula a 25°C y se genera una onda cada 4 segundos (programando el mecanismo de inducción de ondas como se mencionó arriba) .

Mediciones del desarrollo: Se toman muestras de la masa de cultivo en algunos periodos específicos de desarrollo de los frascos, del biorreactor de tanque agitado y del sistema para cultivo de células, y se mide el volumen de la muestra . Luego las células se remueven del cultivo líquido por filtración y se pesan (peso fresco) . Un alícuota de esta biomasa se coloca en un cuarto de secado a 100°C durante 24 horas, y luego se pesa con precisión (peso seco) .

El ejemplo muestra que el sistema a escala de 10 L para cultivo de células parece proporcionar un ambiente amable a las células, comparable con los frascos y mejor que el reactor de tanque agitado. Los daños a las células son limitados y las transferencias de masa y gas son eficientes en las condiciones de operación.

Como ya se mencionó arriba, la presente invención proporciona numerosas ventajas, que a su vez son las llaves para los beneficios económicos: B proporciona un ambiente amable para el desarrollo de las células de planta, a es fácil escalarlo, u es desechable, a es fácil de operar.

Claims (9)

RE IVINDICACIONES

1.- Aparato para cultivo de células, que comprende: -una . cámara de cultivo flexible, y -un mecanismo de inducción de onda, donde el mecanismo de inducción de onda levanta entre el 5 y el 50% de la longitud de la cámara de cultivo. - . .

2. Aparato de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 1, donde el sistema de inducción de onda mueve desde el 8 hasta el 20% del área de la superficie de la parte inferior de la cámara de cultivo.

3. Aparato de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, donde el mecanismo de inducción de onda mueve parte de la parte inferior de la cámara de cultivo hasta un ángulo de 1 a 90°, preferiblemente de 1 a 25°.

4. Aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la cámara de cultivo comprende medios para circular el aire tales como un tubo o una membrana permeable al aire .

5. Aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el mecanismo de inducción de onda levanta alternativamente entre el 5 y el 50% de la longitud de la cámara de cultivo.

6. Aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la cámara de cultivo es una bolsa plástica flexible.

7. Aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el rango de llenado de la cámara de cultivo es del 10 al 80%, preferiblemente del 20-40%.

8. Uso de un aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para cultivar células de planta, células animales, o microorganismos.

9. Uso de un aparato de cultivo de células de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde las células son células productoras de biomasa, células embriogénicas de planta, metabolitos, metabolitos secundarios de planta y/o moléculas recombinantes.