CN1882681A - 细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生长细胞或微生物的新的装置，其中所述培养腔部分填充液体培养基和细胞。波诱导机械装置举起培养腔长度的5到50％。通过诱导从生物反应器的一端到另一端的间歇波实现混合和通气。由于本发明的设计非常简单，因此可以用柔性塑料材料制造它和用此装置作为一次性系统。此外，此种混合/通气原理将通常由于剪切力和小气泡引起的细胞损伤降到最小。由于波诱导机械装置非常简单，所以允许容易且有效地从小规模到较大规模的放大。此种大规模、有效且一次性的培养系统可以很大地降低生产成本。

Description

细胞培养系统

发明领域

本发明涉及细胞培养领域。它由一般用于生长细胞和特别是植物细胞的液体培养系统组成。此培养系统基于提供波搅拌的原理，所述提供波搅拌对一次性塑料袋中含有的细胞培养物提供方便的混合和通气。此种大规模、有效和一次性的培养系统可以大大降低生长成本。

发明背景

常规的培养系统一般由具有用于通气和混合培养内容物的工具(空气分布器、叶轮)的坚硬容器(玻璃或不锈钢)组成。此类系统是复杂的，因为大规模的生产基于不锈钢容器、原位灭菌，所以通常的设备和与防腐生物工艺相关的支持设施极端昂贵。60％以上的生产成本是由于固定成本：发酵装置的高资本成本、折旧、利息和资本消耗。由于产量低和每次培养周期后需要清洗和灭菌生物反应器，所以运行成本也高。

在植物细胞培养的特定工业应用中，已使用了不同的公知的培养系统诸如搅动槽或气升式反应器。尽管对商业化植物代谢物做了许多努力，但是很少达到了商业成功。一个原因是虽然可能获得高于整个植物中所希望的化合物(迷迭香酸、紫草宁等)的含量(达干重的20％)，但是生产力低。导致生产力低的主要限制为与细菌相比，植物细胞的低生长率(低于每天0.7，min 20h加倍时间)。在工业发酵罐中分批培养表示在极高成本设施中用植物细胞培养每年运行不超过10-20次。这表示工业生产的瓶颈是经济瓶颈而不是生物瓶颈。

为了克服此类问题和降低生产成本，最近出现了基于使用多种一次性塑料袋代替不锈钢发酵罐的新技术。用预先灭菌的一次性塑料袋的此类新系统是有前景的，原因是由于塑料是低成本材料，而且它们不需要费时和费成本的清洗、灭菌、设备的验证和维修，所以它们降低了资本投资。由于提供的塑料袋是预先灭菌的，所以它允许通过不需要长时间培训/学习过程和/或经验的非本领域技术人员操作，因此在该过程中它具有更大的灵活性。此外，使用非侵入性搅拌工具允许降低机械复杂性和污染的可能性。此类系统中的通气用通常的进气和起泡进行通气/搅拌和大批混合。反应器可以由槽中具有气体喷雾器塑料袋垫圈和有接种和除去培养基样品能力的磁头板组成。Osmotec生产的一次性圆锥形塑料袋用于小规模使用(几升)，通过进气口用气泡通气。美国专利号6,432,698也描述了培养微生物或细胞的一次性生物反应器，所述一次性生物反应器除了在这里用塑料材料制备外，接近气升式生物反应器，包含用于混合和提供气体气泡的的空气起泡器。在此类发明中，小气泡对敏感细胞可以是有害的，增加了泡沫形成和细胞与壁的粘附，和/或从培养基中剥夺了一些有用的气体(例如用于植物细胞的乙烯)。

为将细胞损伤降到最小和改善细胞生长和生产力，提出了在此类一次性装置中的不同的无气泡的通气/混合系统。例如，另一建议是用机械系统搅拌或根本不搅拌的可通过气体的塑料袋：在美国专利号5,057,429中，将气体可透过的塑料袋旋转或振动使氧气和营养物扩散到动物细胞。美国专利号5,225,346中也描述了静止的气体可透过的袋子。至今对此类培养系统没有进行工业研发，一方面是因为扩大外部搅拌装置是困难的，另一方面是由于在含有几升培养基的静止袋子中向细胞供应的氧气不充足的问题。在WO 00/66706中，通过围绕反应器框架的振动轴振动进行搅拌。在《demande de brevet d’invention FR-A-2519020》中，也是围绕允许搅拌的振动轴振动。此轴可以置于设备的中央或置于一端。Wave Biotech(SinghV，美国专利号6,190,913)也研发了用置于摇动机械装置上的膨胀袋子系统，所述机械装置移动袋子使其中含有的液体进行波样运动。因为此种机械搅拌需要复杂的设备以达到大体积的培养，摇动机械装置限制了槽的大小；实际上波诱导机械装置支持了全部的培养腔。在FR-A-2519020中，培养体积仅仅在实验室规模(2.5升)，在WO 00/66706中限制在200升。在US 6,190,913中，要求保护从100ml至500L的使用体积。在所有此三个专利中，整个培养腔周期性的从一侧向另一侧摇动，产生对每侧的非常高的压力，这对大规模培养是不适合的。

本发明的目的是通过一次性装置提供有效和低成本的细胞培养系统，所述一次性培养装置比已经描述的大部分一次性培养系统更易于放大。

发明概述

本发明涉及包含柔性培养腔和波诱导机械装置的细胞培养装置，其中波诱导机械装置举起培养腔长度的5到50％。

本发明也涉及此种装置培养植物细胞、动物细胞或微生物的用途。

附图简述

图1为装置的透视图。

图2为装置的侧视图。

图3为通过上下移动波诱导机械装置的波形成的图示。

图4显示细胞培养系统、锥形瓶和搅拌槽反应器中培养的大豆细胞的生长动力学，表示为每升g鲜重。

图5显示细胞培养系统、锥形瓶和搅拌槽反应器中培养的大豆细胞的生长动力学，表示为每升g干重。

发明详述

本装置提供了用于培养活细胞的简单系统。它由两种组分组成：一次性培养腔和波诱导机械装置。此波诱导机械装置举起培养腔长度的5到50％。

便宜的、柔韧的和一次性膨胀塑料袋优选组成培养腔。此塑料袋部分填充液体培养基和细胞，由于波运动，对所述液体培养基和细胞进行混合和充氧。这样，培养基的表面连续更新，发生对细胞无害的无气泡通气。用简单的机械装置上下运动塑料袋的至少一端引起诱导波运动。此波诱导的机械装置由用与定时器连接的发动机或者活塞周期性升高的小板组成。此种简单的波诱导机械装置允许容易地放大。

因为本发明是一次性的和在大规模上是有效的，所以它是在工业应用中降低生产成本的好的备选系统。此外，因为不需要像传统不锈钢设备中的清洗、维修或验证，所以此种一次性系统允许方法的灵活性和降低了失效时间。此培养细胞可以用于植物细胞、动物细胞培养或微生物培养，由于波诱导机械装置非常简单，从小袋到大袋的放大是非常容易的。此方法允许通过分批培养、补料分批培养或连续培养允许重头产生代谢物、生物转化、重组蛋白质或繁殖胚胎发生的植物细胞系以及对技术人员显然的任意其它用途。

本发明的基本设计在图1(透视图)和图2(侧面图)中显示。生物反应器由不同部分组成，其包含由诸如，例如沿着边缘(2)密封的柔韧生物相容塑料布的材料制成的至少一个培养腔(1)，以产生内部。由于本发明基于提供波的搅拌原理，所以第二个基本部分是波诱导机械装置(7)，所述波诱导机械装置可以由例如，在培养腔至少一端以下放置的板或如拉起培养腔一端的系统的任意其它适当工具组成。波诱导机械装置也可以由在培养腔的中央部分或任意其它部分上下运动的板组成。

在本发明优选的实施方案中，培养腔由具有可密封和可高压灭菌性质的柔韧聚丙烯制成的袋子，因此它可以用小实验室高压灭菌器或通过本领域公知的其它方法灭菌。然而其它类型的塑料材料诸如聚乙烯也是合适的，可以使用其它类型的灭菌技术。

在本发明优选的实施方案中，柔韧生物相容的防水材料沿着它们的边缘(2)例如，用热脉冲密封器热密封。然而根据本领域公知的方法，也可以使用其它的密封技术，包括但不限于超声或无线电波焊接。可以不同的方式例如模注射制备不需要密封的其它类型的塑料。

袋子优选枕头形状但可以用其它形状，尺寸可以变化以适合使用者的需要。在本发明中，形成培养腔的袋子可以具有正方形、长方形、椭圆形、圆形或梯形表面。然而长方形优选地用于改进本发明的方法和装置的效率。袋子的特别优选的尺寸对于100升培养物为长3.20m，宽0.9m或对于25升培养物为长3m和宽0.3m。然而，长度可达10m和10m以上，本发明允许从1升至几百升，诸如100、300、500、1000L或更多培养基。

在优选的实施方案中，连接到培养腔的上侧的至少两个管子可以保证氧气更新；第一个(3)提供了进气(根据培养需要的压缩空气或其它气体)，第二个(4)排泄废气。在最优选的实施方案中，此两个管子装备了过滤器例如，0.22μm过滤器以防止空气传播的污染。提供氧气供应和排除通过培养产生的气体的另一方法是至少在袋子的上表面部分提供气体通透膜。此膜必须具有气体通透性和足可保证培养的良好充氧的表面。此膜可以例如密封或焊接在袋子上。此膜必须优选不通透液体、水蒸气和污染物。

此外，在图1显示的基本设计中，至少两个其它管子可以连接在培养腔上。一个(5)连接在袋子的上部以用悬浮在新鲜无菌培养基中的接种物填充生物反应器。另一个(6)与袋子的下侧连接以收取样品或收获培养物。这些管子优选(但不限于)由可高压灭菌的硅酮制备，内径/外径的比率为8/12mm，但此比率当然可以改变以适合操作人员的需要。

培养系统的第二个基本部分为波诱导机械装置(7)。如图2显示地，此装置在由小板制成，其优选正好置于培养腔的至少一端，但所述板可以置于培养腔的中间点，或置于所述培养腔的任意其它部分。在优选的实施方案中，板的宽度与培养腔的宽度相等并且板的长度为培养腔长度的5到50％，更优选8到20％。通过上下运动1°至90°，优选1至45°，最优选1°至25°角，小板在液体培养物(9)中诱导波(8)，其提供培养物的混合和充氧。由于袋子是膨胀的，它允许波在培养腔(10)中扩散。在优选的实施方案中，培养基的高度为膨胀的培养腔高度的10至30％。令人惊奇地是当波到达相反端(11)时，它在起始点(12)返回而不受破坏。然后，机械装置再次产生脉冲(13)。为改善波地返回，轻微举起相反端也是可能的。

用机动化臂或用活塞但也可以选择其它类型装置可以将波诱导机械装置的小板周期性升高。此装置优选与定时器连接，以选择波诱导的更合适的频率。

当非常长的培养腔用于大体积，例如几百升以上的培养时，也可以将波诱导机械装置置于培养腔的每一端。在此种情况下波诱导机械装置交替举起培养腔长度的5到50％或更优选7到20％。

本发明基于波诱导提供液体培养物混合和无气泡通气的事实。通过从顶部空间空气扩散到液体培养物进行氧转移和提供无剪切力的生长。

由于培养腔和搅动方法简单，因此此种培养系统易于操作。由于波诱导机械装置不支持整个培养腔但仅仅需要举起培养腔的至少一端，因此容易实现从小体积到几百升的放大。

优选地，培养腔以20至80％，最优选20至40％的填充率填充细胞和培养基。

实施例：

以下实施例为在本发明范围内一些产品和制备所述产品的方法的示例。不将该实施例认为是以任意方式限制本发明。可以对本发明进行改变和修改。即，技术人员将认识到这些实施例的许多变化以覆盖宽范围的配方、成分、加工和混合物以对多种应用合理地调节本发明的化合物的天然存在的水平。

实施例：与大豆细胞培养物生长的比较

本发明生长大豆细胞的能力用分批培养得到证实。甚至在较大规模时，这比得上或好于锥形瓶或搅动槽生物反应器。

Glycine max(L.)Merr.的组织培养株最初来自用Gamborg等人的培养基(1968)培养的不同品种，所述培养基添加20g.L^-1蔗糖、7g.L^-1琼脂(bacto-agar Difco)和1mg.L^-12，4-二氯苯氧乙酸。将pH调整到5.8，然后高压灭菌(115℃，30分钟)。将一株(13406，cv.Maple arrow)转移到液体培养基中(与无琼脂和30g.L^-1蔗糖的组织培养物相同的培养基)，在组织培养中心相同的条件下，每两周在250mL锥形瓶(100mL培养基具有3g.L^-1鲜重)中传代培养。将锥形瓶置于100转/分钟(振动直径20mm)的定轨摇床上。

用与以上谈及的相同的培养基和温度和pH条件，使用具有六个平叶片叶轮的14L搅动槽生物反应器(New Brunswick Scientific)。将含有9L新鲜培养基的生物反应器在115℃高压灭菌40分钟。将十四日龄大豆细胞从两个1L锥形瓶(500ml培养基)中过滤。将300g鲜重的大豆细胞放到无菌槽的1L新鲜培养基中，所述无菌槽具有与生物反应器无菌连接用于接种的特定输出装置。将搅拌器速度调整到100转/分钟。用装备可灭菌氧探针(金)和质量流速计的生物传感器，通过升高或降低空气流速将溶解氧维持在30％。

细胞培养系统(如以前描述地)填充新鲜培养基中的10L大豆细胞(30g/L鲜重)。将室温调节到25℃，每4秒产生波(通过编程如以上谈及的波诱导机械装置)。

生长测定：在特定生长期从烧瓶、搅动槽生物反应器和细胞培养系统取培养批的样品并测定样品体积。然后通过过滤将细胞从液体培养物中除去并称重(鲜重)。将此生物量的等分试样置于100℃的干燥室24小时，然后精确称重(干重)。

此实施例显示10L规模的细胞培养系统似乎对细胞提供了温和的环境，比得上烧瓶并且好于搅动槽反应器。细胞损伤是有限的，在操作条件下质量和气体转移是有效的。

如以上已经谈及地，本发明提供了许多优点，所述优点又是经济利益的关键：

它提供了生长植物细胞的温和环境

容易放大

它是一次性的

它易于操作

Claims (9)

1.细胞培养装置，其包含

-柔性培养腔，和

-波诱导机械装置，

其中所述波诱导机械装置举起培养腔长度的5到50％。

2.根据权利要求1的细胞培养装置，其中所述波诱导系统移动培养腔下面部分表面面积的8至20％。

3.根据权利要求1或权利要求2的细胞培养装置，其中所述波诱导机械装置将培养腔的下面部分移动1至90°，优选1至25°的角度。

4.根据任一前述权利要求的细胞培养装置，其中所述细胞培养腔包含循环空气的装置，诸如管或空气可透过的膜。

5.根据任一前述权利要求的细胞培养装置，其中所述波诱导机械装置交替举起培养腔长度的5到50％。

6.根据任一前述权利要求的细胞培养装置，其中所述培养腔为柔性塑料袋。

7.根据任一前述权利要求的细胞培养装置，其中所述培养腔填充率为10至80％，优选20-40％。

8.根据任一前述权利要求的细胞培养装置的用途，用于培养植物细胞、动物细胞或微生物。

9.根据任一前述权利要求的细胞培养装置的用途，其中所述细胞产生生物量细胞、胚胎发生的植物细胞、代谢物、次生植物代谢物和/或重组分子。

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