CN101151361B - 包括至少一个盘式摇床的生物反应器组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括一反应器支架的生物反应器组合，该组合允许相同培养条件下培养体积由两升线性放大到数千升。本发明生物反应器包括至少一个摇床，该摇床可容纳至少一个一次性袋，所述一次性袋可容纳总量至少两升的物质。所述至少一个摇床为盘形，可引起袋内液体的波浪式运动。所述至少一个摇床安装在所述反应器支架上，彼此垂直叠放。摇动中，摇床重量分布大致平衡。本发明还涉及所述生物反应器组合的使用方法。

Description

包括至少一个盘式摇床的生物反应器组合
背景技术
细胞培养在二十世纪已达到产业规模。几十万升的不锈钢发酵罐也属平常，它们常被用于培养微生物以生产酶或次级代谢物。相关方法包括分批培养、补料-分批培养、连续培养或半连续培养。逐渐地，人们开始对更难培养的培养物，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞进行适应发酵罐中生长的改造，并用高度特化的培养基进行培养。除了细节上的差异，这些发酵罐具有多项共同特征。垂直安装于发酵罐内的搅拌桨通过转动保持细胞处于悬浮状态，从发酵罐底部通入空气、O2或CO2来促进气体交换。培养基的组成和pH等参数可通过连续监测和补注各化学组分来调节。
这样的设计存有不少缺点：搅拌桨产生的剪切力和小气泡的空蚀效应(cavitation)会对某些敏感细胞类型或生物体造成损害。而且，为了避免交叉污染，在停产间期必须对这些培养罐进行彻底清洗，这很费时，而且，不同的培养物需用不同的清洗方案。而且，搅拌式发酵罐必须由熟练工来操作。各种规格的搅拌式发酵罐其成本都很高昂，因此，都被长时间反复使用，这加大了因机械故障引起感染的危险性。最重要的是，在研究或小试规模对搅拌式发酵罐进行的培养条件优化不能线性地放大到产业化规模的生产。随着规模扩大，流体动力、通气、泡沫和细胞生长特性会发生一定数量级的改变。与此相关的各种现有手册、科技文献和专利都表明：细胞培养由试验向生产的放大需要相当的专业知识和具体的方案调试(例如，K van′t Riet，J Tramper 1991 Basic Bioreactor Design，MarcelDekker Publ.)。对某些脆弱的细胞类型或生物来说，既使采用更柔和的搅拌技术，例如气升式发酵罐，仍不能采用大规模搅拌式发酵罐来培养。
鉴于这些缺点，开发出了一次性发酵罐。一次性发酵罐的例子之一是波浪式搅拌(wave agitation)式系统，它至少部分解决了上述缺陷。例如，采用例如Singh(US 6,544,788)和
Figure G200580031898820070327D000011
(WO00/66706)设计的设备，既使脆弱如CHO细胞(Pierce，2004，Bioprocessing J.，3：51-56)、杂交瘤细胞(Ling等，2003，BiotechnProg.，19：158-162)和昆虫细胞(Weber等，2002，Cytotechn，38：77-85)的细胞也可用固定于摇床上的密封塑料袋来培养(Singh，1999，Cytotechn，30：149-158)。也在波浪搅拌式一次性袋中成功培养了锚定依赖性细胞和病毒(Singh，1999Cytotechn 30：149-158)。这些一次性组件比较便宜，因单次使用而降低了感染风险，而且不需要内置的搅拌装置，因为摇床引起了液相内的波浪式运动，促进了气体交换。这一原理无法扩大到例如生产用发酵罐的数十万升规模，目前只可见于1-500L(总袋容积)的培养(Wave Biotechnology AG，Switzerland，Wave BiotechInc.，USA)。但是，不同袋子内的流体动力状况是不同的，因为深度和高度不同。所以，如果采用这些袋子，放大过程中的每一步都需要优化。
发明内容
本发明首次提供了一种允许在相同条件下由两升培养体积线性放大到数千升的生物培养器，它采用一次性口袋和波浪式搅拌。本发明生物反应器的模块化、灵活设计允许不同口袋在同一装置内的平行培养，由此可同时进行不同培养物和不同培养条件的培养。或者，也可将同一口袋分隔成不同的区室，从而同时进行不同培养条件的培养。
本发明生物反应器的设计满足了对一次性发酵罐的需求，由其是对可放大、波浪式搅拌培养系统的需求。本发明生物反应器的基本样式具有至少一个平台或盘。如果有多个平台或盘，这些平台和盘可依次层叠。这些盘可以可调的角度和可调的循环速度(cycling speed)摇晃。垂直设计大大缩减了占地空间(footprintspace)。
本发明生物反应器通过首次提供线性放大设计消除了生物样品放大的常见问题。所有培养袋的深度和高度由其是高深比保持不变，由此确保所有规格培养袋内波浪式搅拌的流体动力状况都相同。所以，小袋内的优化状态可立即复制到哪怕最大的培养袋中。而且，本发明生物反应器提供了这样的独特可能，即平行进行许多小量培养以鉴定适合某新细胞系或适合某种新生物化合物生产的最佳培养基条件。相同的条件可运用于实际规模的生产环境。
本发明生物反应器适用于孵化或培养各种细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、病毒、微载体培养物、酵母、细菌、种子培养物等。而且，它还可以培养更复杂的体系，例如多细胞体系或器官。采用一次性培养袋的模块化设计还可实现不同条件下的细胞孵化和培养，所述不同条件包括但不限于有氧条件和缺氧条件。而且，如果采用黑色培养袋就可以进行暗光条件下的培养，采用透明培养袋则可选择日光或特定波长的光照。
本发明生物反应器还可用于要求均匀搅拌以免沉淀的其它过程，例如分离过程。通常，可在不可采用搅动或鼓泡等其它混合手段时采用波浪式搅拌。此类过程的例子是本领域所熟知的，包括溶解、均质化、包括酶法孵育在内的孵育、分离(例如亲和性分离)、乳化和发酵。而且，对这些过程而言，采用一次性培养袋的模块化设计可使得这些过程在不同条件下运行，例如高氧压力或低氧压力、缺氧条件和惰性气体等。
最重要的是，采用一次性培养袋的模块化设计使得在所述过程进行中条件可变，由此可形成精密运行的过程。
优点
本发明生物反应器与单个单元式摇床生物反应器相比具有许多优点。本发明生物反应器只需要一个电动马达和调速单元，所有摇床的速度和和/或摇动角度都相同，整个组合实际占地小，尤其是多个平台垂直或接近垂直地依次叠放时。占地少便于将整个组合安置在一个房间内，这个房间则可以是气密防菌的或温控的
如本发明某优选实施例所示，本发明组合的平行设计可提供例如16个单元，每单元总容积为70L，这样的平行设计具有大容积单一单元生物培养器所不可及的优点。首先，完成对单个单元的培养条件优化后无需为了放大再进行任何改变，而这曾是业内熟知的生物反应器本身扩大时面临的难题。在本发明生物反应器内，可通过增加叠放的平台数量或通过加宽组合来实现规模放大。
除了可线性放大之外，平行单元设计还降低了培养失败的风险，由此提高了整体生产可靠度。这一点在某些时候尤其重要，例如当采用很难培养的生物时，仍有不明生物学因素可能阻碍生产时，或者由于培养基要求复杂、存在细胞内感染原或机械故障而经常发生感染的时候。
平行设计的另一优点在于能够直接在生产规模优化或试验培养条件。本发明优选实施方式之一在一次运行中试验16种，或者略加改变的32种或48种甚至64种不同的培养条件，不改变波浪式运动的形式，因而也不改变摇动生物反应器的流体动力学和气体交换特征，采用本发明，影响培养条件的参数在放大前只需优化一次。而且，本发明可平行进行不同细胞系的培养，例如，各自生产不同的重组蛋白。
本发明生物反应器组合被设计成可支持一次性培养袋，将本发明组合与一次性培养袋组合具有更多优点。与玻璃或不锈钢发酵罐相比，生产间期的下线时间(down-time)，即清洁除菌所需的时间显著减少。与传统发酵罐管理者相比，对于操作者的专业水平要求降低。而且，采用一次性培养袋消除了交叉感染，降低了生产运行期间或间期内质控检验要求。
附图简述
图1-4显示了本发明的部分装置。
图1：优选实施方式的前侧
图2：优选实施方式的侧面
图3：微型生物反应器
图4：平台形状
图5：显示iMab表达的聚丙烯酰胺凝胶
图6：线性扩大的4个培养袋中的相对光密度
图7：细胞干重，t＝960分钟时由一式两份的最终样品测得
图8：最终培养样品(t＝960分钟)的SDS-PAGE分析。凝胶以考马斯亮蓝染色
发明描述
在本说明书和其后的权利要求书中，文中虚指的“一个”或“一种”以及“这个”包括复数含义，除非另有特别声明。除非特别定义，文中所有科技术语的含义与本领域技术人员的普遍认知相同。
本发明生物培养器组合包括一个反应器支架和安装于该反应器支架上的至少一个摇床平台(6)，所述平台能够安放(hold)至少一个一次性培养袋，所述培养袋可容纳至少2L或5L的总体积。如果采用多个摇床，它们沿垂直轴(v)依次叠放(见图1、2和3)，或沿近垂直轴叠放(无图)。或者，所述一个以上平台可彼此对置于同一水平面上。所述生物培养器组合可取多种构型。反应器支架包括垂直立柱(7)，支撑轴(8)，一根或多根横梁(10)，开口槽(9)和/或一个地台。本文中，且就优选实施方式之一而言，根据图中的相对位置，显示的一个生物反应器组合具有前侧(图1和3，前视图)，背面和两个侧面。图2显示了一张优选实施方式之一的侧视图。优选实施方式之一中，摇床(6)安装在两根垂直立柱(7)之间。可通过在垂直立柱(7)之间加装一根或多根水平梁(10)来加固所述组合。可在组合的一侧或双侧面将支撑轴(8)与垂直立柱(7)接装。可将垂直立柱(7)和/或支撑轴(8)固定在地板上，它们的强度应足以承载该组合的重量且最好不会引起震颤。也可将或再将生物反应器的垂直立柱(7)和/或支撑轴(8)固定到一牢固的地台上。另一实施方式中，垂直立柱是通过天花板固定的。本领域技术人员显而易见的是，在垂直立柱(7)、支撑轴(8)和/或地台下安装轮子就可将本发明组合制成可移动的。此外，所述组合还可以具有一个或多个开口的槽，用于安放试管等。所述生物反应器的空间尺寸没有限定，根据使用者的需要而定。例如，反应器支架的尺寸取决于摇床的尺寸。反应器支架可用各种合适的材料制成以承载包括培养袋和袋内物在内的生物反应器组合总重和摇振产生的力，此类材料是本领域技术人员所熟知的。例如，所述生物反应器可用芳族聚酰胺纤维或碳纤维之类轻材料制成，但优选钢、铝或不锈钢等材料。
生物反应器组合的每个摇床被调节成绕水平轴、同一自由度(翘动)摇动，例如图2所示。转动轴是一轴承配合轴(4)，摇床(6)就由该轴安装在反应器支架上，例如与垂直立柱(7)接装。较好的是，摇床的翘动在培养袋内引起并维持波浪式运动。因此，本发明涉及本文所述的一生物反应器组合，它还包括令各摇床运动的装置。每个所述摇床都能够沿一水平轴、进行同一自由度的摇动，摇床的摇动引起培养袋内液体流动并形成波浪式运动。令摇床运动的装置可包括一电动马达(1)，齿轮箱(Z)和将马达的转动转化为摇床的翘动的传动系统(2、3、4、5、11)。较好的是，马达(1)安装在反应器支架上，例如安装在支架顶部，例如装在垂直立柱(7)或水平梁(10)上。另一实施方式中，马达(1)不装在反应器支架上而只是通过传动系统与反应器支架相连。例如，出于无菌、安全或维修等考虑，可将马达放在地上和/或放在另一房间内，即不与反应器支架同处一室，例如在反应器支架和摇床所在房间的外面。所以，本发明生物反应器组合的特点还在于：所述令摇床摇动的装置包括一电动马达(1)，例如调频电动马达或单相无级变速(singlestepless)电动马达，例如调频1.5kW电动马达。调频电动马达，又称AC变频驱动器(VFD)或DC变速驱动器(VSD)，可购自ABB(瑞士)、Siemens(德国)、Lenze(德国)和Fincor(美国)等制造商。马达(1)通过齿轮箱(Z)与第一连杆(2)相连。第一连杆(2)可具有一系列与齿轮箱(Z)中齿轮接触的接触点，从而将马达的转动转换为同平面内的来回运动，例如传送给振荡的水平轴。较好的是，摇床的运动角度为360度到+10至+30度与-10至-30度之间，更好的是，+15度至-15度之间。因此，本发明涉及本文所述的一种生物反应器组合，其特征还在于：令每一摇床摇动的装置能够让每一摇床在一预定角度内进行同一自由度的摇动，所述预定角度为相对于摇床所在水平面-15度至+15度之间。
本文所述的一个完整运动周期指驱动轴转满一周，这一周的转动可能由连接电动马达的齿轮箱传输出去，这一周的转动使得摇床从任意起始位置上一下一回上或者下一上一回下至回到起始位置。马达的圆周运动由三根不同的连杆或转臂(2、3、5)通过重型轴承(heavy duty bearings)转换为摇床的摇动。一型连杆(2)可在多个位置与齿轮箱(Z)接装，从而能够影响摇动角度，例如限制在+15度至-15度之间。与连接转臂(3)相连的连接轴承(11)可位于带动摇床(6)的轴承(4)的正上方。马达(1)的转动可由连接轴(14)传递给反应器支架的两侧，由此避免扭转。显然，在转动传递给两侧的情形中，两侧具有相似例如相同的传递系统。因此，对本领域技术人员来说显而易见的是，摇床以活动方式与反应器支架装配。换言之，摇床能够以同一自由度作相对于反应器支架的运动。
摇床摇动的速度和幅度经控制和调节，为引发培养基波浪式运动或生物反应提供最适条件。摇床来回摇动的角度可方便地通过例如以下手段加以调节，例如改变一型连杆(2)与齿轮箱(Z)内齿轮的连接点，改变齿轮箱内齿轮的直径和连接点，或改变连杆(2)的长度。
另一实施方式中，所述生物反应器组合的特征在于：摇动摇床的装置能够在运动周期内保持摇床重量分布大致平衡。因为摇床是由马达的圆周运动驱动的，所有摇床动量之和必为360度或其倍数。这意味着可将两个摇床安装成具有约180度的运动相差，三个摇床则可安装成具有约120度的相差，即各摇床分别处于运动周期的0度、120度和240度。例如，不难理解，如果采用五个摇床，三个摇床的动量和约为360度，另两个的动量和也为360度。或者，五个摇床彼此间的相差都是72度，即各摇床分别处于运动周期的0度、72度、144度、216度和288度。这是为了保持系统平衡。例如，如果第一摇床翘动+15度，第二摇床则翘动-15度，当第一摇床向下运动到-15度时，第二摇床正好向上运动到+15度，与第一摇床幅度相同、相位相反。显然，较好的是摇床具有相同或大致相同的重量分布和重心。
或者，也可通过各摇床运动周期的随机分布来保持摇床在运动周期内的大致平衡。如果反应器支架上装有5个以上摇床，摇床的随机运动亦即摇床的动量彼此不同，这可能保持生物反应器的平衡。本领域技术人员可以看出，可以对反应器支架进行加固以防失衡。
另一实施方式中，所述摇动摇床的装置能够中止任一摇床的摇动而保持其它摇床继续摇动。
可将摇床(6)安装在轴承配合轴(4)上，轴(4)则可安装在垂直立柱(7)上。所述至少一个摇床依次层叠。轴承配合轴(4)沿垂直轴(V)对齐。摇床(6)上可固定安放一次性培养袋。本发明生物反应器组合包括2至20个摇床，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16或20个摇床，彼此沿垂直轴叠放。
或者，所述至少一个摇床可以成对地彼此对置地位于两根或两根以上垂直或接近垂直的垂直立柱上。
对所述至少一个摇床的尺寸没有严格限制。较好的是，摇床的尺寸能够经受培养袋内的波浪式运动。因此，本发明涉及一种如本文所述的生物反应器组合，其特征在于，摇床(6)或摇盘的深度(x)为0-5m，以约0.5-1.2m为佳，约0.85m更好，例如83cm。摇床(6)或摇盘的宽度(y)约为0.4-8m，以约3m为佳。就此而言，深度(x)指摇床前面至背面的距离，而宽度(y)指摇床一个侧面到相对的另一个侧面的距离。摇床具有下表面和基本平整的上表面。培养袋放在摇床的上表面。
摇床可包含多个亦即至少两个空间意义上的区域或区室。各区室可独立定址以便选择性地固定至少一个培养袋。相邻区室之间应避免接触。所述区室可以呈矩形，也可是其它任何合适的独立形式。因此，本发明涉及本文所述的组合，其中的摇床分多个区室。
本发明具体涉及这样一种生物反应器组合，它包括反应器支架和安装在所述反应器支架上的至少一个摇床，所述至少一个摇床能够安放至少一个一次性培养袋，所述培养袋能够接受总量至少2L的物质，所述组合的特征在于，所述至少一个摇床类似盘形，这样，摇床的运动引起培养袋内液体运动并形成波浪式运动。
摇床的上表面可具有垂直于该上表面的向上凸起，摇床的外周边上也可具有这样的凸起。这些凸起形成盘样结构，例如宽约74cm、深约83cm、高约20cm(的盘)。所以，本发明涉及一种本文所述的组合，其中的摇床形似盘状。这样的盘样形状或结构利于摇动过程中培养袋的定位。显而易见的是，所述盘样结构可分成多个区室。因此，本发明涉及一种生物反应器组合，其特征还在于，所述盘形或类盘形结构包括至少一个内置件(insert)。所述内置件将所述盘分成多个区室，并协助摇动期间一次性培养袋的定位。
每个摇床可至少容纳一个培养袋。显然，如果缩小培养袋的尺寸，则各摇床可容纳一个以上培养袋。例如，本发明生物反应器组合每个摇床可容纳约1-24个培养袋，优选每个摇床容纳1、2、3、4、6、8、9、12、15、16、18、20或24个培养袋。
较好的是，所述培养袋是一次性的。可通过进气和限制出气向袋内加压。袋内可以是相对于环境压力超压的。最大超压取决于各培养袋的强度，原则上没有限制。
加压后培养袋的形式决定了袋内液体可在摇床改变翘动方向时形成适当的翻滚式波浪。大多数情况下，加压后的培养袋为扁球形。培养袋的合适形式可由摇床来决定，即可以是盘样形状的(见图4)。虽然图4所示摇床具有直边，本发明摇床也可以是曲边的。
如果培养袋对于摇床来说略微嫌大且培养袋将取摇床那样的方形，则可在摇床内沿其前边和后边放置嵌条(13)以使培养袋呈合适的曲线形状，这将改变翻滚波浪的流体动力学特征。
或者，支持波浪式运动的培养袋的合适形式可以因培养袋本身的特质而形成。前后呈圆形的加压后培养袋可在摇床改变摇动方向时引起合适的翻滚式波浪。
支持培养袋合适形式的另一方法是加强培养袋袋体周围的搭接边使之不膨胀或尽可能不膨胀，或者利用外部装置，例如在培养袋的上方安装一个外部支持机构，例如夹子或硬性的盖子(12)。所述盖子有助于防止培养袋移位。而且，盖子会对培养袋施加一个向下的力，使得培养袋成为能够使得液体随摇动而波浪式运动的形状。因此，本发明涉及一种组合，其特征还在于所述盘还具有至少一个盖子。
硬盖(12)上可开缝，例如宽约5cm的缝隙，由此可将管接头密封地接入一次性培养袋。用于培养基输入、接种、进气、出气、取样和传感器(如有必要)的一次性管件可用标准接头例如常用的luer锁与位于开口槽(9)并与所需泵管件、监测设备或下游加工装置相连的管件相连。另一实施方式中，摇床有一孔，例如位于摇床前侧并从摇床上表面通至下表面的孔，管件通过该孔与其它机构连接，这样便于在摇床前侧下倾而培养袋也跟着下倾时收获培养物。
每个培养袋的总容积约为2-500L，以约5-300L为佳，20-200L更好，50-100L还要好，约70L最好。或者，也可以是两个35L的培养袋，或3个20L的培养袋。本发明中，培养袋的总容积为液体培养基的体积加上顶部充气体积。
适用于本发明所述生物反应器组合的无菌一次性培养袋来源广泛。这包括无菌空袋或预装了无菌干粉培养基的培养袋或预装了无菌液体培养基的培养袋。这些培养袋可根据管接头的设置和尺寸方便地向提供者定制(例如美国的CambrexInc.，美国的Stedium，美国的Millipore，瑞士的Wave Biotechnology)。一次性培养袋材料的选择取决于培养要求，可选自最简单的PE塑料薄膜或PE/PP复合薄膜至不同原料(PE/PP/EVA/尼龙等)的层合塑性材料等多种材料，所选材料最内侧的薄膜不得与袋内物质发生化学相互作用，例如不得有塑料软化剂渗入培养基，不得有激素类物质被薄膜吸收，它们必需是无热原的。所述薄膜可常规热合密封，长度和宽度应与摇床上的单元尺寸相配。培养袋可在注册10.000级(class 10.000)清洁房内制造，并在使用前进行渗漏检测，例如用经认证的ASTM-F2095-01试验检查(FDA联邦注册记录)。
本发明的培养袋特别适合于微生物、细胞或小生物的维持、生长或培养。所以，本发明涉及一种在一次性培养袋内培养微生物、细胞或生物体的方法。具体地说，本发明涉及一种在一次性培养袋内进行微生物、细胞或生物体平行培养的方法，所述方法包括：
(a)将生长培养基和培养物样品导入培养袋，以至少两个培养袋为佳，
(b)将所述培养袋安放在本发明所述生物反应器组合的摇床或摇盘上，可将多个培养袋分散安放在摇床上，
(c)以同一自由度摇动摇床或摇盘，由此引起培养袋内液体培养基的波浪式运动；
其中，步骤(a)和(b)的次序可互换。
因此，本发明涉及一种以上所述的方法，其中，摇床以预定速度摇动，所述速度约1-60次/分钟(rocks per minute)，以10-45次/分钟为佳，20-30次/分钟更好。较好的是，摇床的摇动在培养袋内引起并维持液体培养基波浪式地运动。
被培养的细胞可以是且不限于来自动物、哺乳动物、禽类、爬行类、鱼类、两栖类、人类、节肢动物、环节动物、昆虫、海绵动物(sponges)、线虫类、植物、真菌、酵母或微生物。不难看出，本发明方法涉及用于生产病毒(包括噬菌体)的细胞。
本发明生物反应器适用于孵育或培养各种细胞，例如但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、病毒、微载体培养物、酵母、细菌、种子培养物等。而且，它还可用于培养更复杂的体系，例如多细胞体系或器官。采用一次性培养袋的模块化设计可实现不同条件下的细胞孵育和培养，所述条件包括但不限于有氧条件和缺氧条件。
所述生物反应器还可用于要求将多组分混合均匀的其它过程。通常，可在不可采用例如搅动或鼓泡等其它混合手段时采用摇动。此类过程是本领域熟知的，包括溶解、均质化、例如酶法孵育的孵育、例如亲和性分离的分离、乳化和发酵。所以，本发明涉及在一次性袋内平行进行组分孵育或均质化的方法，包括：
(a)将液体介质和至少一种其它组分导入一次性袋内，
(b)将所述袋子安放在本发明所述生物反应器组合的摇床或摇盘上，
(c)以同一自由度摇动摇床或摇盘，由此引起袋内液体介质的波浪式运动；
其中，步骤(a)和(b)的次序可互换。
采用一次性袋的模块化设计使得这些过程可在不同条件下运行，例如施以高氧压或低氧压，缺氧条件，惰性气体等。
最重要的是，采用一次性袋的模块化设计允许条件在这些过程运行期间是可变的，由此使得精密过程的发生成为可能。
整个生物反应器组合可搭建在一温控舱内以便对培养基进行加热或冷却，或者，可为摇床配置各种平面、恒温加热元件或加热垫，并将培养袋放置在所述加热元件或加热垫上面。可将温控舱制成气密型的，但是，为安全计，必需能够允许在发生病原菌生长时进行熏蒸消毒。
最后一实施方式中，本发明涉及前文所述生物反应器组合用于培养的用途，较佳的是用于微生物、细胞或生物体平行培养的用途。
本领域技术人员不难看出，根据不同的需求，所述生物反应器组合可构建和重建成多种样式。
本发明反应器组合与已知生物反应器的主要区别特征在于，本发明反应器组合允许由约2L小量向500L大量的线性放大，无需再就每一新的培养体积进行优化。
以下是对优选实施方式的详细描述，是为阐述而非限定本发明。
优选实施方式描述
图1(前视图)和图2(侧视图)勾勒出本发明生物反应器组合总体构思的一种优选实施方式。总共具有4×4个用于容纳一次性培养袋的单元的4个摇床(6)安装在两根垂直立柱(7)之间，所述摇床依次叠放从而使得它们始终处于平衡位置，相邻摇床之间的最大角度为30度。调频1.5kW电动马达(1)和与之相连的齿轮箱(Z)放置在反应器支架的上方。所述马达通过齿轮箱(Z)与第一连杆(2)相连，所述第一连杆(2)具有一系列接触点从而可使马达的圆周运动转换为如下所述的共平面运动：所有摇床的摇动角介于10-30度之间。运动由三根不同的包含重型轴承的连杆或摇臂(2、3、5)传递。连杆(2)可在数个位置与齿轮箱相连，从而能影响到运动角度，所述角度限于相对于一水平轴的+15度至-15度之间，所述水平轴沿摇床的安装轴(4)穿过。摇臂(3)内摇床安装轴(11)的中心轴承位于轴(4)轴承的正上方，轴(4)即摇床(6)所在轴。所述组合利用垂直立柱(7)之间的横梁(10)和与垂直立柱接装的支撑轴(8)来加固。摇动通过连接轴(14)传至与马达所在位置相对的另一侧，相似的一组连杆和摇臂将运动从那里传给所有摇床。立柱(7)和支撑轴(8)固定在地面上。
摇床(6)安装在轴承配合轴(4)上，用于安放一次性培养袋，摇床深83cm高20cm。较好的是，摇床具有盘样形状，如图4所示，这样，摇床的摇动可引起袋内液体发生波浪式运动。摇床宽度取决于单个摇床上要放置的一次性培养袋的个数和摇床的长度。实施例之一中，单元宽度为74cm，包括4个单元的摇床总宽度为300cm(见图2)，可容纳80cm宽90cm深的培养袋。将一次性培养袋放入安置单元后，在它们上面加一个硬盖(12)，盖上开有约5cm宽的缝以便管接头密封地接入一次性袋内。用于培养基输入、接种、进气、出气、取样和监测传感器(如有必要)的一次性管件用标准接头与位于开口槽(9)内的其它管件相连，所述其它管件则与所需泵、监测设备或下游加工装置相连。摇床底面上还有一个孔，管件通过该孔进行连接，方便在培养袋所在侧下倾时收获培养物。通过进气和限制出气对一次性培养袋加压，当盖子(12)固定到位后，加压后培养袋的形似压扁的气球。
图1和2中的图例：
1)无级变速电动马达
2)一型连杆
3)连接摇臂
4)穿过轴承的摇床安装轴
5)二型连杆
6)摇床
7)垂直立柱
8)支撑轴
9)开口的缆线及管件槽
10)水平支撑梁
11)连接轴的轴承
12)盖子
13)嵌条(可选)
14)连接轴
Z)齿轮箱
实施例
实施例1：生物反应器的用途
本实施例中，用本发明生物反应器培养了数种微生物。这些微生物是放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)(Young，J.M.，Kuykendall，L.D.，Martinez-Romero，E.，Kerr，A & Sawada，H.(2001)，Int J Syst Evol Microbiol 51：89-103；ATCC19358)和节杆菌(Arthrobacter histidinolovans)(Skerman，V.B.D.，McGowan，V.，和Sneath，P.H.A.(1980)，Int.J.Syst Evol Microbiol，30，225-420；ATCC 11442)。
用本发明生物反应器培养放射型根瘤菌，将其培养在5L培养袋内，袋内装有0.8L添加了50μl/L消泡剂204(Sigma)的0.5*LB培养液(含2.5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.5g/L的NaCl)，29℃，20rpm。用空气泵，在连续通气的情况下培养。培养物接种密度为OD1.3(600nm)，种子是29℃、225rpm摇瓶过夜(约24小时)培养物。培养期间，通过在不同时刻检测光密度(OD)来监测培养物密度，以此作为微生物生长情况的表征。
类似地，在本发明生物反应器内培养节杆菌Arthrobacter histidinolovans，将其培养在5L培养袋内，袋内装有0.8L添加了50μl/L消泡剂204(Sigma)的0.5*LB培养液，29℃，20rpm。用空气泵，在连续通气的情况下培养。培养物接种密度为OD1.0(600nm)，种子是29℃、225rpm摇瓶过夜(约24小时)培养物。培养期间，通过在不同时刻检测光密度(OD)来监测培养物密度，以此作为微生物生长情况的表征。
放射型根瘤菌和节杆菌培养物的结果均示于表1。从该表中可明显看出，本发明生物反应器非常适于培养这两种类型的细菌。
表1：放射型根瘤菌和节杆菌Arthrobacter histidinolovans培养物的光密度
Figure G200580031898820070327D000121
Figure G200580031898820070327D000131
实施例2：iMAb蛋白在大肠杆菌内的表达
为了检验本发明生物反应器用于在大肠杆菌内生产蛋白质的用途，用表达载体CM 126-iMAb转化大肠杆菌E.coli BL21 BL21(Al)(NOVAGEN)(关于载体的记载参见WO03050283，衍生自pET-12a(NOVAGEN))。用电穿孔法以所述载体转化细胞，37℃、225rpm摇瓶培养过夜。然后，按OD0.1(600nm)将细胞接种到35L培养基中，培养基含添加了50μl/L消泡剂204(Sigma)和卡宾西林(carbinicilline)(100μg/ml)的3*TY培养基(24g/L胰蛋白胨，15g/L酵母提取物，5g/L的NaCl)，所述培养在生物反应器上，在70L(总容积)的培养袋内进行，30℃，40rpm。当OD(600nm)达到0.9时，加入异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)至1mM终浓度，同时加入0.2％阿拉伯糖，由此启动蛋白质表达。用空气泵向培养物内连续通气。添加IPTG后约4小时，收获细胞，并用中空纤维技术(截留值400KD)浓缩，将浓缩物保存于-20℃待用。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，图5)分析蛋白质表达。称量细胞湿重和干重，计算蛋白质表达总量。由于所用细菌诱导系统的原因，培养物的OD值并不很高。据判断，表达iMab蛋白的大肠杆菌细胞在本发明生物反应器内的培养效率非常高，表达水平优异，达总蛋白的40％(图5)。尤其是，可在生物反应器上进行35L培养物的培养，无需再进行优化，如此的便利加上优异的蛋白质表达效率是极其有益的。
培养细节如下：
总培养体积：        35L
OD600nm：           7.6
细胞湿重：          5.87g/L
细胞干重：          1.38g/L
总蛋白：            0.69g/L
iMab表达：          总蛋白的40％
iMab产量：          0.28g/L
35L培养中的总iMab： 9.8g
实施例3：线性放大
为了检验用所述生物反应器进行大肠杆菌内蛋白质生产的线性放大特征，用表达载体CM126-iMAb(参见WO03050283，衍生自pET-12a(NOVAGEN))转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen)。用电穿孔法以载体转化细胞，细胞摇瓶培养于添加了4.5％(w/v)葡萄糖和100μg/ml卡宾西林的100ml 3xSY培养基中(24g/L大豆蛋白胨，15g/L酵母提取物，5g/L的NaCl)。培养条件为37℃，225rpm。
为了扩大种子体积以备线性放大，将摇瓶培养物接种到13L的培养袋中，袋内含5L培养基(与摇瓶中的一样)。当OD(600nm)达到1.5时，用中空纤维技术浓缩培养物，膜的截留值为400kDa，表面积为3100cm2，14.5psi压力下的横向流速为180L/h，跨膜压力为10psi。
线性放大实验测试用培养袋的容积为3、8、12和40L。每个培养袋的充满率都是50％。培养袋长度都相同。通过改变培养袋的宽度令各袋内液体高度相同。相同的长度和液体高度有助于确保所有袋内波浪式运动相同。
向培养袋内加入0.2μm经过滤除菌的3xSY培养基，培养基中添加了50μl/L消泡剂204(Sigma)和100μl/ml卡宾西林。接种前，将培养袋预热至37℃。将浓缩细胞接种到袋内，起始OD为0.1。细胞培养条件如下：37℃，摇动角12°，摇动速度40次/分钟。用空气(20％O2，80％N2)气缸(air cylinder)向培养物内连续通气，速度为每10L培养基每分钟1L。在以下时刻从袋中取样：接种后0、105、235、325和960分钟。测定采得样品的OD(600nm)和pH(见图6和表2)。接种后980分钟收获细胞。对最后样品，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白质表达分析(图8)。称量细胞干重两次，计算总蛋白表达(图7)。
表2：不同时刻取自培养袋1至4的样品的pH
Figure G200580031898820070327D000141
在所有时刻，四袋内的OD值都相近(图6)。直至t＝325分钟时，OD值都几乎重合，但是在最后一个时刻有些差异，这些差异与体积无关(最大差异为20％)。据表2显示，全程的培养物pH都很接近。在最后的时间点pH差异不超过0.2。
由四袋最终样品测得干重(图7)所得的平均干重约为775mg/L培养体积。各份最终样品的干重几乎相同，差异在10％以内。图8所示iMab表达分析与前述OD、pH和干重检测结果的一致。据凝胶显示，四袋内iMAb蛋白质表达几乎相同，估计约为大肠杆菌总蛋白的25％，这表明采用本发明生物反应器进行扩大培养时具有线性特征。

Claims (35)

1.一种生物反应器组合，包括反应器支架和安装在该支架上的至少两个摇床，所述至少两个摇床上能够安置至少一个一次性袋，所述袋可容纳总量至少2L的物质，所述摇床的运动能在运动周期内维持所述摇床的重量分布大致平衡，其中，两个摇床安装成具有180度的运动相差，三个摇床安装成具有120度的运动相差，五个摇床安装成具有72度的运动相差，或五个摇床中的三个摇床安装成具有120度的运动相差，另两个摇床安装成具有180度的运动相差，并且，摇床具有相同或大致相同的重量分布和重心。
2.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述摇床沿垂直或接近垂直的轴依次层叠。
3.如权利要求1或2所述的生物反应器组合，还具有令摇床绕水平轴以同一自由度摇动的装置。
4.如权利要求3所述的生物反应器组合，所述令摇床摇动的装置使摇床按预定角度以同一自由度摇动，所述预定角度为相对于摇床水平位置的-15°至+15°。
5.如权利要求3所述的生物反应器组合，所述摇床分为至少两个区室。
6.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述至少一个袋由外部支持机构固定在位。
7.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述摇床包括盘，所述盘包含至少一个内置件。
8.如权利要求7所述的生物反应器组合，所述盘还包括至少一个盖子。
9.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述摇床的深度(x)为0.5-1.2m。
10.如权利要求9所述的生物反应器组合，所述摇床的深度(x)为0.85m。
11.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述摇床的宽度(y)为0.4-8m。
12.如权利要求11所述的生物反应器组合，所述摇床的宽度(y)为3m。
13.如权利要求1所述的生物反应器组合，所述反应器支架的材料选自钢或铝。
14.如权利要求13所述的生物反应器组合，所述反应器支架的材料是不锈钢。
15.如权利要求3所述的生物反应器组合，所述令摇床摇动的装置包括调频电动马达或单相无级变速电动马达。
16.如权利要求1所述的生物反应器组合，每个摇床放有1-24个用于培养细胞的一次性培养袋，各培养袋的总容积为2-500L。
17.如权利要求1所述的生物反应器组合，每个摇床放有1-24个用于培养微生物的一次性培养袋，各培养袋的总容积为2-500L。
18.如权利要求16或17所述的生物反应器组合，培养袋的高深比保持不变。
19.一种在一次性培养袋内平行培养细胞的方法，包括以下步骤：
(a)将生长培养基和培养物样品导入至少两个培养袋，
(b)将所述培养袋安放在权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合的摇床或摇盘上，
(c)以同一自由度摇动摇床或摇盘，引起袋内液体的波浪式运动；步骤(a)和步骤(b)的次序可互换。
20.如权利要求19所述的方法，所述细胞选自：动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
21.如权利要求20所述的方法，所述动物细胞选自：哺乳动物细胞、禽类细胞、爬行类细胞、鱼类细胞、两栖类细胞、节肢动物细胞、海绵动物细胞、环节动物细胞、线虫细胞。
22.如权利要求21所述的方法，所述哺乳动物细胞是人细胞。
23.如权利要求20所述的方法，所述微生物细胞是真菌细胞。
24.如权利要求23所述的方法，所述真菌细胞是酵母。
25.如权利要求21所述的方法，所述节肢动物细胞是昆虫细胞。
26.如权利要求20所述的方法，所述细胞用于生产病毒。
27.如权利要求20所述的方法，所述细胞用于生产噬菌体。
28.一种在一次性培养袋内平行培养微生物的方法，包括以下步骤：
(a)将生长培养基和培养物样品导入至少两个培养袋，
(b)将所述培养袋安放在权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合的摇床或摇盘上，
(c)以同一自由度摇动摇床或摇盘，引起袋内液体的波浪式运动；步骤(a)和步骤(b)的次序可互换。
29.一种在一次性袋内平行进行物质孵育或均质化的方法，包括以下步骤：
(a)将液体介质和至少一种其它组分导入一次性袋内，
(b)将所述袋子安放在权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合的摇床或摇盘上，
(c)以同一自由度摇动摇床或摇盘，引起袋内液体介质的波浪式运动；其中，步骤(a)和(b)的次序可互换。
30.如权利要求19-29中任一项所述的方法，每个摇床按照预定速度摇动，所述预定速度为1-60次/分钟
31.如权利要求30所述的方法，所述预定速度为10-30次/分钟。
32.权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合用于混合、溶解、均质化、孵育、乳化和/或发酵的用途。
33.如权利要求32所述的用途，所述孵育是酶法孵育。
34.权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合用于培养细胞的用途。
35.权利要求1-18中任一项所述生物反应器组合用于培养微生物的用途。
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