CN101316925B - 细胞培养方法以及进行该方法的设备 - Google Patents

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Abstract

包括具有顶盖(19)的培养容器(2)的细胞培养设备(1)，其中，第一区(3)用于将基本不含细胞的培养基在内部转移到第二细胞培养区(5)，第三区(4)和第四区(6)用于转移基本不含细胞的培养基。第三区(4)位于第二区(5)之内和第一区(4)之外，而第四区(6)是所述第二区(5)之外的区域。所有区域由培养基连通。该设备还包括能够使培养基循环从底部到顶部通过培养区(5)的培养基循环装置。

Description

细胞培养方法以及进行该方法的设备
本发明涉及通过包括以下部件的设备培养细胞：
-具有顶盖顶盖的培养容器，其中设置有至少一个第一区和至少一个第二区，所述第一区是基本不含任何细胞的培养基的转移区，而所述第二区是细胞培养区，所述第一区位于第二区内部，
-使培养基循环通过培养区的循环培养基的装置，所述培养区包括底壁和顶壁，各壁具有能够转移基本不含细胞的培养基的开口。
这种培养设备是已知的，例如可从专利US 5 501 971中得知，该专利描述了一种培养容器，其中在内部培养基转移管道之外设置有培养区。细胞被置于外部培养区内，其类型为含有载体的篮子，培养基通过该培养区从顶部向底部流动。然后从培养区底部回收培养基，培养基在培养基循环设备的作用下通过上述管道进入培养容器顶部，然后再通过培养区。专利US 5 507 971描述了一些替代方案，但培养基总是从顶部到底部通过培养区。
这种设备的一个缺点是，它不适用于所有类型的细胞培养。实际上，这种设备仅设计用于在固定床或紧密填充床的微载体上培养细胞，绝对不适合悬浮液或流化床中的微载体上培养细胞。实际上，在专利US 5 501 971的设备中，不含载体或微载体的悬浮液中的细胞或非固定载体上的细胞有在重力作用下沉降并聚集在培养区底部的趋势，并且，由于培养基从上到下流经该培养区，更加重了这种细胞聚集在培养区底部。因此，细胞层层堆叠并相互接触，从而使细胞无法充分获取该区域中的物。
在专利US 5 501 971的反应器中，当在非固定载体或微载体上培养非常脆弱而几乎经不起任何应力的细胞时，细胞会经受重力、培养基向下流动以及载体重量的作用，这会极大损害培养物的存活率。此外，对于专利US 5 501 971的生物反应器而言，采用悬浮培养是难以想像的，因为悬浮的细胞决不能经历细胞和细胞接触。实际上，如果存在这种接触，细胞之间便会形成蛋白质键并聚集。这种聚集导致细胞由于缺乏氧气和养料而死亡。
本发明的目的是减轻现有技术的缺点，方法是获得一种培养设备，该设备同时培养悬浮液中的细胞和载体或微载体上的依赖于贴壁的细胞，并能确保对细胞的应力最小同时防止细胞聚集在培养区底部。
为解决该问题，本发明提供了如本文开始时提到的设备，其特征在于，该设备还包括至少一个第三区和至少一个第四区，这两个区都是基本不含细胞的培养基转移区，所述第三区是所述第二区之内和所述第一区之外的区域，而所述第四区是是所述第二区之外的区域，所述第三区与第一和第二区培养基连通，而所述第四区经培养基循环装置与第二区(培养区)和第一区(培养基转移区)培养基连通，且培养基循环装置能够使培养基在所述第二培养区内从底部循环到顶部。
所述第四区更具体包括一定体积的由生物反应器环境大气构成的气体，并且还构成该培养基的氧合区。
因此，从底部到顶部通过第一培养基转移区的培养基到达第一培养基转移区顶部并溢入与第一区培养基连通的第三区，培养基在循环装置、重力以及连通容器效应的作用下向下流动，通过第二培养区底壁上的培养基通道开口，然后又在连通容器效应或培养基循环装置或者这两者的作用下向上流向培养区顶部，之后又溢入经循环装置与第一培养基转移区连通的第四培养基转移区。培养基循环装置之后又立即使培养基到达第一培养基转移区顶部并重新开始循环。因此，得益于培养基的流动部分抵消了重力作用，培养区内的细胞便可随培养基从底部流向顶部。流动使单独的细胞或微载体上的细胞在培养区内更好地分散并降低了对它们的有害应力。
当使用术语“载体或微载体上的细胞”时，必需理解，所述载体可以在固定或填充床内、或在流化床内。
同样，当使用术语“细胞培养物”或“细胞”时，必需理解，尤其是当提及动物细胞时，它可以指病毒产物、蛋白质或其他重组产品、细胞代谢物、组织细胞培养物(可能在三维载体上)、干细胞或者细菌或酵母。
本领域技术人员将容易理解，载体或微载体上的细胞受填充的影响小于无载体或无微载体的悬浮液中的细胞，在固定床中尤其如此，尽管如此，技术人员仍旧容易发现培养区内这样的流动方向对于培养物氧合和营养物分布的优势。实际上，已经众所周知细胞培养的关键步骤是培养容器的设计。培养容器的设计必需满足无新鲜培养基无法到达或者细胞会发生聚集的死角；细胞直接与培养基接触而非相互接触对于它们的繁殖和/或生产代谢也是非常有利的。
因此，本发明提供了一种适合悬浮培养物和载体或微载体上的培养物的灵活设备，该设备通过降低重力对细胞的影响并防止出现新鲜培养基无法到达或者细胞会发生聚集的死角，能够降低对细胞施加的应力并能够防止细胞在培养区的特定区域内聚集。此外，对于悬浮培养应用，本发明的设备能够使细胞良好分散，这一方面是利用朝上的液流，另一方面是利用仍旧施加在细胞上的部分重力。
术语“具有供基本不含细胞的培养基通过的开口的底壁”必需理解为是设置在培养区底部的壁，它可以设置在培养区底部或界定所述培养区的垂直壁的较低部位，且能允许培养基通过但不允许微载体或载体上甚至悬浮液中的细胞通过。类似地，“具有供基本不含细胞的培养基通过的开口的顶壁”可以是具有上述相同特征的设置在培养基顶部或界定培养区的垂直壁顶部的壁。
从第一区溢入第三区的培养基可自然从第一区的壁顶部溢出，并通过这种方式到达第三区或者可经安置在第一培养基转移区顶部或底部的开口或管道溢出。培养基以相同方式从第二区溢入第四区。
有利地，培养基循环装置由设置在所述培养设备底部的离心泵构成，包括至少一个能够围绕基本位于中心的旋转轴(真实的或虚拟的)旋转的磁力设备、至少一个培养基入口和至少一个培养基出口，所述循环装置被设计成将培养基吸入由磁力设备旋转形成的虹吸管并将培养基推向置于所述磁力设备外部区域内的培养基出口，所述离心泵由旋转磁力马达驱动，所述马达使培养基产生循环，而不与设备外部连通，以及至少一个设计成能引导培养基通过所述出口朝容器顶部推进的导向装置。
现有常规生物反应器的一个缺点是，它们利用叶片或螺旋搅拌系统使培养容器内的培养基均质化，无法提供足够的循环。在这种情况下，生物反应器包括具有两片易碎机械垫片(例如由昂贵的碳化硅制成)并穿过生物反应器顶盖顶盖的主轴。通过生物反应器的顶盖会造成严重的污染风险和明显的坍塌风险。
其他类型的生物反应器包括培养基的外部循环。培养基经蠕动泵或类似系统通过管道。显然，这种方法尽管能部分防止直接污染但具有其他缺点。它无法适用于长期培养。实际上，这种类型的泵中使用的管道在长期培养期间容易磨损，它还涉及密封和污染的问题。
上述培养基循环还导致了出现“喷泉”效应的技术难题。因此不足以使液流以非常低的压降穿过培养区，还需要同时维持培养容器内的水平差异。实际上，将液体带向第一培养基转移区顶部是一个关键步骤，但确保培养基不过度聚集在第四区底部也是一个关键步骤。如果培养基聚集在第四培养区底部，溢出效应将被降低，且培养基从第一培养基转移区到第三培养基转移区以及然后到第二培养区和最终进入第四培养基转移区的循环将不是最佳的。
因此，本发明的循环装置将包括围绕基本位于中心的旋转轴旋转的磁力设备以及培养基入口和出口。
在小规模培养时，例如，磁力设备将是简单的磁力棒，它由外部磁铁驱动，能提供0.6-6升/分钟(即1-10毫升/秒)的流速。由于培养基循环系统不与外部连通而是由培养容器外部的设备驱动，因此便不存在污染风险。根据本发明也可考虑蠕动泵，但优选用于短期培养。
在大规模培养时，磁力设备将是磁化马达，其流速在例如10和200升/分钟之间，尤其为20-150升/分钟，优选为25-100升/分钟。
在一具体的实施方式中，本发明所述的设备包括一系列模块，各模块包括所述第一区、所述第二区、所述第三区和所述第四区，且其中，所述一系列模块中的相邻模块由培养基连通，各模块的所述第一区和所述第四区直接或间接与所述循环装置连通。
该实施方式能够获得特别灵活的设备并能够将规模放大至100升体积。
通常，放大是生产重组产品、病毒、细胞代谢物或其他产品或细胞培养物中的一个复杂步骤，因为采用以常规方式提供的区域时，无论是否提供氧气或营养物，这种放大通常都会产生问题。在上述实施方式中，培养设备包括一系列例如叠放或并置的相邻模块。培养基穿过其他培养模块从第一培养模块的第四区到达培养基循环装置。本发明考虑了各种类型的预定体积的模块。例如，500毫升或5升的模块，其体积从500毫升到5升，包括该范围内或涵盖该范围的所有体积。因此，对于3升的培养物将使用6个500毫升的模块。例如，可将6个模块叠放在足够大的容器中或者可使各模块相连通以形成所述容器。
在文献US 5 501 971的反应器中，如果需要培养体积为3升，则需要培养区的高度为H。在该专利中，到达培养区底部的培养基被几乎耗尽，尤其就氧而言。此外，专利US 5 501 971的作者考虑在培养区顶部和底部放置氧传感器并给反应器环境过度供氧。不幸的是，由于这会使培养区顶部细胞的细胞成分氧化并随后造成细胞死亡，因此绝对不推荐这种类型的过度氧合。此外，当专利5 501 971的作者考虑放大时，由于无法再调节高度就必需考虑宽度。显然，占地面积很快便无法控制。精通本领域的技术人员将了解，占地面积是一个关键参数，尤其对于绝尘室而言，绝尘室的效率是根据要处理以获得无菌空气的空气体积来计算的，这种类型的空气处理非常昂贵。要处理的空气体积是将“绝尘室”的高度乘以生物反应器、其装备以及培养设备操作人员的占地面积得到的。
因此，根据要获得的产率，通过使用叠放或并置的模块可减小占地面积。此外，其中的培养基在再次接触生物反应器周围空气之前必须过滤的培养体积被相当程度地降低。在我们之前的例子中，将该体积除以6。
根据一个有利的实施方式，因此还需要提供一种具有预定高度的可高压灭菌的空培养容器(用玻璃或不锈钢制成)或空的一次性培养容器，在该容器底部包括培养基循环装置。然后则足以在该容器的培养基循环结构上放置数量为N的模块并再用配套的顶盖密封容器。此时，无论培养物为5升或50升，容器体积都是相同的。
由于特别经济，该实施方式对于设施不多的实验室特别有利。实际上，如果将提供的容器设计成要培养35升，则仅需要5升或10升的培养模块，例如在上述培养基循环装置上放置一个或两个5升的培养模块就足够了。由于对于5-35升之间的任何培养昂贵的部分总是相同的，因此大大降低了开销。
此外，无论是培养5升或35升或更大体积，占地面积将是相同的，放大时不涉及处理更大体积的空气。此外，模块内各次传递之间的培养基实际上是与反应器内的环境空气接触，因此放大时遇到的问题被大大降低了。
如前所述，培养基循环装置由于对于本发明所述的设备具有特殊的价值因此特别有效。因此，各模块内的流速是相同的，在输出水平上也是相同的，按照本发明提高规模也不会造成问题。
在一个特别有利的实施方式中，循环装置被限定在底部模块中，所述底部模块与至少一个第一培养基转移区和至少一个第四培养基转移区直接或间接培养基连通。
由于存在一些无法清洁到的区域，培养基循环装置通常是存在交叉污染或外部污染风险的区域，因此，例如将底部模块插入简单的玻璃容器将特别有利，但不限于此。这样的底部模块与培养模块是适配的，能够使所有存在模块的第一培养基转移区与培养基循环装置的培养基出口之间的培养基连通，并能够使所有存在的培养模块的所有第四区与培养基循环装置的培养基入口之间直接或间接培养基连通，即可通过或不通过其他模块。
该设备优选还包括顶部模块，所述顶部模块至少包括顶盖。可将这种顶部模块设计成能隔绝上述的叠加。
在一个有利的实施方式中，至少一个第四区包括至少一个基本垂直或倾斜的流动壁。
这种流动壁的存在减少了从第二培养区溢入第四培养基转移区期间可能出现的泡沫。实际上，在没有这种流动壁时，从第二区到第四区的培养基流动是湍流，这样必然会形成不希望的泡沫。需要指出的是，由于培养基富含蛋白质，因此在许多培养方法中泡沫形成都是一个主要问题。搅拌富含蛋白质的液体通常都会出现泡沫。因此湍流会有同样的后果，这就是为什么本发明包括能降低流动紊流的所述流动壁是有利的。
此外，这种第四培养基转移区也是培养基与本发明所述设备的环境大气相接触的区域。存在流动壁能促进这种接触，从而通过增加气-液接触面的面积而改善氧在环境大气和培养基之间的交换。
有利地，为使膜稳定，也可以在培养基中加入添加剂以改变水的流变学特性，这样的添加剂包括表面活性剂、普流罗尼(Pluronic)F68、甘油、季铵以及能改变培养基流变学特性的任何其他添加剂。
在一个特别优选的实施方式中，基本垂直或倾斜的流动壁包含亲水膜。
实际上，如果流动壁不是或者不包含亲水表面，则在其表面获得培养基膜是非常困难的。此外，常规壁上形成的膜是不稳定的。因此，用亲水膜覆盖流动壁就能实现海绵的作用，自然可使培养基均匀地扩散和流动。因此，培养基膜与环境大气之间的接触面被大大增加，这使得氧合作用可与高细胞密度相匹配。所得总氧气转移的系数约为103-102s-1。
在具有培养模块的实施方式中，如果一些或所有的第四区包括具有亲水膜的流动壁，则气-液交换将被进一步改善。因此，即便是一系列中的最后一个模块也有氧合培养基供应。在具有培养基循环的现有技术的一些情况中，当进行培养时，例如体积为200升，培养基循环末端的细胞相对氧气供应不足，且生物反应器内的细胞生长不是均匀的。
在本发明所述的设备中，不存在氧气供应不足的区域或死角。
在一个有利的实施方式中，本发明所述的设备包括至少一个气体入口开口和一个气体出口开口。
培养容器优选包括至少一个气体入口开口和一个气体出口开口。这样可以使本发明所述设备的环境大气富含氧气，例如，当细胞消耗氧气时。还可以给环境大气提供其他气体，例如加入CO2以改变pH，或者细胞培养时通常采用的任何其他气体。出口开口能够防止压力过大并排出氧浓度低的气体或仅仅是环境大气中的部分气体，从而降低本发明所述设备的环境压力。同时，当需要略微过压时这种气体出口是能够关闭或“关小”的。
气体入口设置在培养容器的第一、第二、第三或第四区或与它们相连。第一和第四区是优选的区域。第三培养基转移区不易受气-液接触影响，而培养容器的第二区是细胞培养容器，其中，直接的气-液接触将会有使细胞组分氧化的风险，这是不利的。
有利地，气体入口开口与至少一个第四培养基转移区相连。
由于第四培养基转移区在最后气-液接触最大，它还作为氧合区(有或没有流动壁)，因此在最后使其直接接收加入的新鲜气体以促进培养基的氧合是有利的。此外，溢入该第四区的培养基是被细胞消耗完全的培养基，因此部分氧气被消耗，还可能需要改变pH，因此使气体(氧气、空气、CO2或其他气体)进入该第四培养区以便提高任何调节或氧合作用或pH改变的功效是有利的。
在一具体的实施方式中，气体入口与分布管相连。
在一具体的实施方式中，本发明能够使气泡在本发明所述的设备内有效分散。通过浸入第一、第二、第三和第四培养基转移区培养区内的分布器可有效实现气泡的分散(大泡或微泡，根据应用而定)。优选地，通过埋入第一或第四培养基转移区培养基内的分布器可有效实现气泡的分散。
在一具体的实施方式中，培养容器的顶盖与所述至少一个第二培养区顶壁的至少一部分相连。
这种特别优选的实施方式使取样得以简化从而使污染风险最小化。尤其在微载体上培养期间，取样通常不是没有任何风险的步骤。为测量细胞密度，现有方法非常有限，且这些方法既不十分可靠又复杂。因此，测量细胞密度的最好方法是对载体取样并在显微镜下观察它们，有可能在染色之后观察。
实际上，在常规的生物反应器中，尤其是专利US 5 501 971的生物反应器中，由于培养区顶壁不是简单能打开的，因此取样是不可能的或有严重的污染风险。实际上，用户需要打开培养容器顶盖，这种顶盖通常又大又重因此很难在无菌环境下移动它，然后要托住顶盖，通常是固定于托板或用于升起培养基因此又重又大的其他设备，并且他需要确保他不会接触任何内容物并用一只手托住以免污染。然后，他必须用另一只手打开培养区顶壁并用另一只手托住它。然后，他必须通过第三只手中的夹钳对一种或多种载体取样以便能够估算细胞密度。这就需要有第二个用户或者他的右手需要非常灵巧。
本发明将顶盖固定于培养区的顶壁从而大大简化了这一步骤；所需做的一切只是简单地抬起顶盖顶盖，培养区顶壁也同时升起，并放入无菌夹钳或诸如吸液管之类的取样工具对一种或多种载体取样以便估算细胞密度。接触未灭菌对象的风险以及污染的风险被大大降低。
有利地，在某些实施方式中，本发明所述的设备还包括设计成用来加热转移的培养基的加热装置。这种加热装置宜设置在第四培养基转移区或培养基循环装置上。当然，第一区也可包含这种加热装置。
加热装置可以是电子元件、电线圈或是通常用于细胞培养领域的任何其他加热装置，例如恒温控制的双层夹套。
实际上，在大或超大规模培养中，将本发明所述的设备放在恒温控制的设备或房间内通常不容易。因此，本发明通过直接放置加热设备以恒温控制培养基并在培养容器内提供均匀的温度从而解决了这一问题。优选地，本发明所述的设备提供了没有任何不均匀加热点的培养基加热。
在某些实施方式中，本发明所述的设备包括测量培养参数的传感器，所述传感器与培养基接触。培养参数中包括溶解氧分压、pH、温度、光密度、某些营养物的浓度，如乳酸盐、铵、碳酸盐、葡萄糖或者例如可能影响细胞密度的任何代谢产物或要被代谢的物质。
根据本发明可以考虑使用这些参数的调节回路(regulation loop)。例如，这些调节回路能够根据现有溶解氧分压或被细胞消耗的溶解氧的量调节被注入气体环境中的氧气的量。可根据传感器获得的pH值或这种类型的培养中通常采用的其他调节类型来注入CO2。
优选将传感器安置在至少一个第四区的底部。第四培养基转移区也是安置传感器的优选区域，这是由于该区域的培养基来自所通过的培养区，因此该处的传感器获得的值能准确代表细胞消耗。
有利地，所述传感器是一次性光学传感器，前提是它能够将代表待测参数的光信号通过所述培养容器发射到位于所述设备之外的光信号接收器。
在特别优选的实施方式中，本发明所述的设备包括一系列模块，各培养模块在其顶部具有第一固定装置并在其底部具有第二固定装置，其中，所述底部模块还在其顶部具有第一固定装置且所述顶部模块还在其底部具有第二固定装置，所述第一固定装置和所述第二固定装置为互补的固定装置，从而产生从底部到顶部为底部模块、至少一个培养模块和顶部模块的叠放顺序。
有利地，所述第一和所述第二固定装置包括以气密和液密方式产生所述叠放顺序的装置。
实际上，根据本发明，可能设计一系列模块，各模块的壁将构成培养容器的壁。然后再将这一系列培养模块与包括循环装置的底部模块和包括顶盖的顶部模块装配起来。这些模块形成的组合件从而构成培养设备。根据所需培养体积，可将N个模块装在一起以形成具有高度H的专有培养设备。
在一个非常具体的实施方式中，本发明所述的设备是一次性设备。
目前存在许多在小规模和大规模细胞培养时能得到极好结果的生物反应器。不幸的是，这些生物反应器在清洁、灭菌、操作、安放和占地方面花费较高。实际上，在生产临床批次或感兴趣的药物产品时，必须将生物反应器放置在无菌绝尘室内。一个500升的生物反应器要求绝尘室的体积超过其自身体积的20倍。绝尘室的标准为装备的占用体积，这就是说，如果装备的占地面积为1m2，由于地表面至上的空气体积都要处理，则要处理的空气体积将是(1m2+使用者所需的表面积)×绝尘室的高度。此外，生物反应器和所占据的房间都需要的灭菌、消毒、洗涤、清洁等步骤是众多昂贵又繁复的过程，这在劳动和产品安装方面带来了巨大花销。这就是为什么主要在药物、生物和生化实验室以及绝尘室中每天越来越多地使用通常体积较小、不需要洗涤、清洁、灭菌和消毒的一次性设备。
使常规生物反应器可重复使用的另一种解决方案是，例如，在通过能重复产生波运动的搅拌平台搅拌的一次性无菌容器，例如WAVE生物反应器中培养。不幸的是，这种生物反应器存在放大问题，因为500升的容器(这是搅拌平台上可放置的最大容器)将占据很大地面，这使得绝尘室空气处理花费无法估算，此外这种容器的操作、取样和放置培养参数传感器也十分困难。
还有其他解决方案，如叫做“旋转器”的搅拌式一次性烧瓶。这些烧瓶也不可能放大规模，且这些烧瓶的氧转移低且在搅拌期间会对细胞产生应力。
还可以在
Figure S2006800441417D00102
或
Figure S2006800441417D00103
系统中培养。这种系统难以调节且体积庞大。此外，它们的氧转移弱并需要大体积的培养箱。放大又一次是繁复的。
还已知系统。这种系统基于将细胞固定在填充于培养区内的多孔基质中。培养基在较低区域装有可压缩的风箱。培养基被升高并交替落下以使基质浸入培养基然后使基质暴露于环境空气。
不幸的是，该系统的放大也很困难。难以调节和测量培养参数。此外，细胞在首先遇到下落培养基边缘、干燥、以及之后的上升培养基边缘时其表面会承受拉伸应力，这对于细胞生长是有害的。
总之，目前还不没有在绝尘室和实验室中易于使用的适合大规模和小规模培养的一次性细胞培养系统。
因此，本发明获得了一种非常创新的解决方案，它解决了这些缺点中的极大部分，其方法是通过获得出乎意料的系统，该系统可在小规模和大规模使用，适合在悬浮液中、载体上或微载体上培养，搅拌后能使培养基均匀而不存在死角或细胞聚集的区域。此外，由于不存在中央主轴，污染风险非常低或者甚至不存在。
实际上，本发明所述的设备具有上述常规生物反应器的所有优点，并且是一次性的。本发明所述的设备由基于离心泵的与外界没有任何接触的培养基循环装置通过磁力搅拌。加热装置，例如电线圈，也为培养基提供均匀加热且不与外界接触。
此外，如上所述，在特别优选的方式中，本发明所述的培养设备包括传感器，所述传感器是设计成将代表待测参数的光信号通过所述培养容器发射到位于所述设备之外的光信号接收器的一次性光学传感器。
因此，还测量了本发明所述设备壁上的培养参数，且这不需要与外界接触，与穿过经典生物反应器顶盖顶盖的溶解氧或pH探针不同，后者有无法彻底清洁这些穿过开口的探针的风险和由于缺乏密封而带来污染的风险。
传感器可安置在本发明所述设备的底部或顶部，或者这两者。当传感器位于顶部和底部时，通过与细胞数相关或不相关的简单数学差分操作就能够连续测量细胞呼吸。
附带权利要求提到了该设备的其他实施方式。
本发明的另一个目的是本发明所述培养设备在悬浮液中、微载体上或载体上进行细胞培养中的应用。实际上，当将本发明所述的设备用于在载体或微载体上培养时，载体或微载体被限制在所述第二培养区。当该设备被用于悬浮细胞培养时(因此没有载体或微载体)，具有开口的壁是培养基可渗透但细胞无法渗透的膜。该膜的孔径是所有尺寸的函数。本发明还涉及本发明所述培养设备在生产重组产品、病毒、代谢物等中的应用。
重组产品是指药物学研究感兴趣的蛋白质、治疗或预防性分子、抗体、质粒、或者能够由培养细胞产生的任何其他分子，这种生产可通过分泌或在胞内产生。
本发明还涉及在具有培养基循环的培养容器内培养细胞的方法，所述方法包括：
-将培养基引入培养基循环装置，
-从所述培养基循环装置中排出培养基，
-将培养基向上转移到转移区的至少一次第一次转移，
-将培养基转移到第二细胞培养区的至少一次第二次转移。
该方法的特征在于，它还包括：
-所述第一次培养基转移之后的将培养基转移至第三培养基转移区的至少一次第三次培养基转移，此次转移通过从第一培养基转移区溢出到第三培养基转移区而进行，
-所述第二次培养基转移之后的将培养基转移至第四培养基转移区的至少一次第四次培养基转移，此次转移通过从第二培养区溢出到第四培养基转移区而进行，
且所述第二次培养基转移是将培养基向下转移。
如上所述，不同于专利US 5 501 971的培养方法，培养基向上穿过培养区，这能够防止细胞在培养区底部聚集并降低细胞上的压力。因此，本发明的培养方法是一种特别具有新颖性的方法，它在培养时没有死角且没有任何细胞聚集区，能够以非常高的效率培养。
有利地，该方法还包括在一次或多次所述转移过程中氧合培养基。
优选在一次或多次所述转移期间通过直接气-液接触进行所述氧合。
在一具体的实施方式中，所述氧合是在第四次培养基转移过程中进行的，所述第四次培养基转移是使所述培养基沿流动壁流动。
在该方法一个有利的实施方式中，为使膜稳定，也可以在培养基中加入添加剂以改变水的流变学特性，这样的添加剂包括表面活性剂、普流罗尼F68、甘油、季铵以及能改变培养基流变学特性的任何其他添加剂。
同样有利地，所述培养基流动是沿亲水壁流动。
附带权利要求提到了本发明所述方法的其他实施方式。
通过以下描述、本发明的非限制性具体实施方式以及附图，本发明的其他特征、细节和优点将更加显而易见。
图1是本发明所述培养设备是轮廓图。
图2是培养基循环装置一种变化形式的轮廓图。
图3是包括若干连续培养区、尤其适合放大的本发明所述培养设备的轮廓图。
图4高度概括了图3的一种变化形式。
图5是限定本发明所述设备优选实施方式的培养基循环装置的底部模块底部的横截面图。
图6是图5所示限制培养基循环装置的底部模块底部的顶视图。
图7是限制本发明所述设备优选实施方式的循环装置的底部模块顶部的横截面图。
图8是限制图7所示设备的循环装置的底部模块顶部的顶视图。
图9是通过模块集合，尤其是一次性模块集合产生的本发明所述培养设备的横截面图。
图10是图9的分解图。
在这些图中，参考符号指代相同或类似的元件。
由图1可见，培养设备1包括基本垂直且呈圆柱形的培养容器2，尽管本发明也考虑了其他形式，例如任何棱柱形，优选规则的棱柱形。培养容器包括至少四个相互连通的区域。从容器中央向外侧，该容器包括第一区3，第三区4a、4b，第二区5和第四区6。
含有经孵育的细胞的区域用字母C表示，而培养基用字母M表示。
培养容器2在其底部包括培养基循环装置。在该优选的实施方式中，培养基循环装置由围绕中央旋转轴8(真实的或虚拟的)旋转的磁力设备7，如磁力棒7构成，其第一端位于顶部啮合装置9内，而其第二端位于底部啮合装置10内。磁力棒由图中未显示出的位于培养容器2之外的旋转磁力驱动马达驱动。循环装置包括至少一个培养基入口11。培养基入口11包括至少一个第一端，该端是培养基流动的转向挡板12。磁力棒的功能是作为离心泵，也就是说培养基在磁力棒产生的培养基移动作用下吸入相对中心的区域并围绕中心点向外推进。培养基转向挡板12引导培养基位于磁力棒相对中心的区域，以使培养基被吸入其中然后向外推进。
有利地，入口位于相同的平面(星形)且入口11的数目能使它们的位置对称出现。更具体地说，如果有三个入口，则宜使它们相互之间隔开约120°，如果入口的数目等于4，则入口之间相隔的角度约等于90°，如果入口的数目等于10，则以约等于36°的间隔角度设置入口。
培养基循环装置还包括至少一个培养基出口13。培养基出口13宜位于在培养基在磁力棒离心作用下推进的位置上。
有利地，出口13的数目将使它们的位置对称出现。更具体地说，如果有三个出口，则宜使它们相互之间隔开约120°，如果出口的数目等于4，则出口之间相隔的角度约等于90°，如果出口的数目等于10，则以约等于36°的间隔角度设置出口。
优选地，出口不位于与入口相同的水平面上。培养容器的底部包括至少一个与所述至少一个出口13相邻的培养基导向装置14，该装置能引导培养基朝上向培养容器2顶部推进。
培养容器2的第一区3基本位于中心区域并且是培养基转移区。第一区3包括基底部分3a和圆柱部分3b。基底部分3a的直径小于培养容器2的直径。基底部分3a与所述培养基循环装置的至少一个培养基出口13培养基连通。基底部分3a在第一区3的顶部缩小成直径小于基底部分3a的圆柱部分3b。顶部圆柱部分3b包括与所述第一培养基转移区的基底部分3a直接培养基连通的外壁。
第三区4位于第一培养基转移区3之外，是培养基转移区。第三区还包括实质上基底部分4a(以套管形式)和基本呈圆柱形的顶部4b。
第三培养基转移区4的基本上圆柱形的部分4b实质上与第一培养基转移区3的实质上圆柱形部分3b同心，且这两个部分培养基连通。培养基连通是通过开口或管子、通过溢出(如图所示)、或能够实现这种连通的任何其他可能方法实现的。
第二区5是有或没有载体或微载体的细胞培养区。第二区5也是套管形式，其中心为第一和第三培养基转移区3和4。
第二区5包括底壁15和顶壁16，各壁15和16具有能够转移培养过的基本不含细胞的培养基的开口17。第二培养区5通过允许培养基通过的底壁15中的开口17与第三培养基转移区4的相对基底部分4a培养基连通。
第四区6是培养基转移区，它位于第二培养区5之外但在培养容器2之内。第四区6与第二培养区5培养基连通。它还通过所述至少一个入口11与培养基循环装置培养基连通。培养基连通是通过开口或管子、通过溢出、或通过能够实现这种连通的任何其他可能方法实现的。
这里描述的具体实施方式包括基本呈圆柱形的培养容器，但也可考虑其他实施方式，如前所述，例如基本棱柱形的容器，优选规则的棱柱形。显然也可以具有不同的培养基和培养基转移区。它们也可以是棱柱形的，优选规则的棱柱形，也可以是任何形状组合。此时，术语“套管”的横截面必须与棱柱的横截面类似。
当操作培养基循环装置时，培养基通过所述至少一个出口13离开，当有若干出口时则通过各个出口13离开，并在导向装置14的作用下转向，终止于第一培养基转移区3的实质上基底部分3a。第一培养基转移区3的结构以及泵的输出要求培养基流向第一培养基转移区3的基本上圆柱形部分3b。当培养基到达实质上圆柱形部分3b的壁顶部时就溢入第三培养基转移区4。
培养基M的循环方向在图中用箭头显示。
对于精通本领域的技术人员显而易见的是，在这个具体实施方式，出于效率和流速的原因，第一培养基转移区3的实质上圆柱形部分3b的壁的高度小于第三培养基转移区4的壁，但容易理解的是，第一培养基转移区3的实质上圆柱形部分3b的壁也可以高于第三培养基转移区4的实质上圆柱形部分4b的壁。
因此，培养基在泵所赋予的流速和重力作用下从第三培养基转移区4向下流向实质上圆柱形部分4a并到达第三培养基转移区4的实质上基底部分4b。培养基然后在泵所赋予的流速作用下通过连通的容器向上流动并到达第二培养区5顶部。培养基经第二培养区5底壁15中的允许基本不含细胞的培养基17通过的开口从第三培养基转移区4到达第二培养区5。
如上所述，可根据培养类型确定培养基能通过的开口17的大小。如果培养物中不含载体，则具有开口17的壁15或16将是孔径小于细胞直径的多孔膜。如果在微载体或载体上培养，则开口17的大小将小于微载体或载体的大小。
当培养基的流动边缘到达第二培养区5的壁的顶部时就溢入第四培养基转移区6。自然，如果存在开口或管道，则必须理解，当培养基的流动边缘到达开口或管道时就流入第四区6。
在本发明特别优选的实施方式中，第四培养基转移区6包括倾斜壁18，当培养基从第二区5进入第四区6时可在该壁上流动。倾斜壁优选包含亲水膜以改善所示倾斜壁18上的膜形成。膜必须优选是以尽可能防止泡沫形成。为使膜稳定，也可以在培养基中加入添加剂以改变水、尤其是培养基的流变学特性，这样的添加剂包括表面活性剂、普流罗尼F68、甘油、季铵以及能改变培养基流变学特性的任何其他添加剂。
例如，亲水膜将是由聚氧化乙烯构成的膜。
倾斜壁上的膜形成是一个重要步骤，因为它允许“薄膜”上发生氧合。实际上，相对于第四培养基转移区内的培养基量，气体体积较大并能促进交换。此外，倾斜壁上形成膜能增加气-液接触表面积。
由图1可见，培养容器优选包括具有至少一个气体入口开口20和至少一个气体出口开口21的顶盖19。气体入口开口20宜设置在此以便与第四培养基转移区6直接连通。在一些变化形式中，在培养容器2的垂直壁上或在培养容器2的底部宜具有气体入口开口20，也就是说气体能通过开口20穿过培养容器2上与顶盖19相对的壁，可用管子代替这种开口20以在液面以上开口(见图9)。
该实施方式中，顶盖19由固定装置22固定到第二培养区5的顶壁16。在变化方式中，顶盖19可以是第二培养区5顶壁16的一个整合部分，当培养容器2的顶盖19升高时该部分打开。用这种方式容易取得含或不含载体的细胞样品以便例如估算细胞密度、细胞结构以及反映培养物健康的细胞的其他物理特性。实际上，将这两者相连就能够简单地通过升高培养容器2的顶盖19来打开培养室5。
当悬浮培养时，使多孔膜与具有开口17的第二培养区5的顶壁16相连是有益的，这样的组合件能够提高顶盖/膜组合件的刚性以便取样。
图2例举了培养基循环装置的磁力设备的一种变化形式。这里的磁力棒7具有螺旋形状。具有基本位于中心的旋转轴8的磁力设备7的设计实质上将取决于培养物的体积。实际上，对于小体积的培养物，本发明用一个简单的小棒如磁力芯片就能够循环培养基。对于大体积的培养物，本发明考虑使用磁力马达，该磁力马达也由外部马达驱动，例如养鱼池中使用的马达，它能使培养基高速循环。
根据本发明，还考虑使用气泡发生设备(未显示)，根据生成气泡的大小更通常被称为“分布器”或“微分布器”。
有利地，当将采用气泡时，气泡发生设备例如管子的穿孔端被浸入第四培养基转移区底部的培养基中或被浸入第一培养基转移区。当选择这种类型的氧合时，通常还可以在薄膜上连续氧合，这就可以降低气体流速和形成较少气泡，从而减少泡沫形成。此时，还可以在培养容器的顶盖或在培养容器的垂直壁上提供两个气体入口。此外，还可以考虑将气泡发生设备仅作为救急过程并仅在需要时使用。
培养设备还包括一系列培养参数传感器23，例如用于测量溶解氧分压pO2、pH酸度、温度、混浊度、光密度、葡萄糖、CO2、乳酸盐、铵以及通常用来监测细胞培养的任何其他参数。这些传感器优选是不需要将培养容器内侧与其外侧相连的光学传感器。这些传感器23的优选位置是临界位置，也就是说将它们放在靠近培养容器2的壁、与培养基M接触是有利的，并优选将它们放置在战略位置，如放在培养基M在穿过细胞之前或紧接之后所通过的区域。
实际上，出于上述简便和经济的原因，本发明尤其考虑制造一种一次性生物反应器。因此，这就是为什么要减少培养容器内侧和外侧的连接。此外，本发明的生物反应器还考虑制造特别可靠的生物反应器，其中，由于是一次性的因此污染风险被大大降低。
由图3可见，本发明所述的设备还考虑了模块设计，其包括可培养较大体积的一系列模块。例如，采用这种类型的模块设计，通过使用非常有限数量的标准模块可实现约500毫升到100升的培养体积。
根据本发明，考虑了提供一系列可置于在具有培养基循环装置和顶盖顶盖19的标准培养容器2内，在第一培养基转移区3周围“滑动”的模块。
在一种特别灵活的变化形式中，本发明开始于获得固定系统，该系统包括各种标准模块。这些标准模块是，例如，要被放置在组合件底部的循环装置模块、一个或多个培养模块以及顶盖模块。根据本发明，模块彼此夹紧，例如通过液体和气体宜不能渗透的快速连接件，此外也可考虑其他固定这些模块的方法。
因此，根据培养类型和所需体积，用户将能够从他的储备中取出包括培养基循环装置的底部模块，他还可以根据所需的培养体积从中取出一定数目的培养模块，然后再取出与顶盖相对应的顶部模块。然后，以无菌方式封装所有这些模块，他只需要将它们拆开并将一个夹在另一个上面即可。叠加物可形成“一次性生物反应器”或者可将叠加物放在合适的容器中。
因此，图3例举了本发明所述模块型培养设备的一个实施方式。
培养设备1包括培养容器2，培养容器2包括与图1中详细解释的那些循环装置的培养基循环装置。包括循环装置的底部模块m0可固定于培养容器2的底部或者可滑入培养容器2(已经描述过该实施方式)以便能够安放它并使用另一个模块进行另外的培养并因此防止交叉污染。
底部模块m0包括循环装置。如图1所示，这些循环装置包括围绕中央旋转轴8旋转的磁力设备7，其第一端位于顶部啮合装置9内，而其第二端位于底部啮合装置10内。循环装置包括至少一个培养基入口11。培养基循环装置还包括至少一个培养基出口13。
培养容器的底部模块m0包括至少一个邻近所述至少一个出口13的培养基导向装置14，该导向装置能够指导培养基朝上向培养容器2顶部推进。
培养容器2包括一系列培养模块(m1，m2，...，mn)，在该实施方式中，它们是一个叠一个的。还可以预计，可以简单地使它们相互相邻，也就是说并排放置。在图3所示的实施方式中，通过快速连接件24或夹子将各模块相互夹住。
各培养模块m1，m2，...，mn包括第一区3、第二区4、第三区5和第四区6。3、4、5、6这些区域各自具有与图1所示相同的功能。
此外，使各模块包括与各培养模块的第四区6连通的气体或气体混合物入口(未显示)也是有利的。容器也可包括过量气体或气体混合物的出口作为其一部分(未显示)。例如，气体入口开口可存在于培养容器2的底部，也就是说气体通过贯穿培养容器2的与顶盖3相对的壁上的开口经过，且这种开口20由管子提供以在模块m1的液面上方开口(见图9)。因此，气体混合物到达该模块的第四培养基转移区6。放在模块m1上的模块m2也可包括能使培养模块m1第四区6中存在的气体混合物与模块m2的第四区6连通的管道。因此使这种管道通过模块m2的底壁是有利的。
在某些实施方式中，为长期培养，用新鲜培养基代替部分培养基或加入营养物是有益的。因此，底部模块m0则可包括营养物入口(未显示)。同样有利地，培养容器在培养基循环装置中可包括培养基出口(未显示)以防止溢出。
在类似的方式中，培养容器2包括具有顶盖19的顶部模块，有利地是，它可通过固定装置22与具有培养基通过开口17的顶壁16相连以简化从固定在其上的模块mn中取样，如图1所示。
此外，在各培养模块中提供培养参数传感器也是有利的。也可以仅在一个或几个培养模块的所有区域中或在底部模块中提供传感器。
在图3所示的实施方式中，培养基以以下方式循环。为简便说明，我们将仅采用两个培养模块m1和m2以及底部模块m0，但可以肯定的是，本发明所述培养设备可包括非常多数量的培养模块。
在底部模块m0中，培养基经所述至少一个出口13(当存在若干出口时则通过各个出口13)从培养基循环装置M推进，并在导向装置14的作用下转向。它终止于第一培养基转移区3的实质上基底部分3a。该实施方式的实质上基底部分3a是所有培养模块共有的区域，在所示实施方式中，它位于底部模块中。当将培养模块层叠或并置时这是有效的。
本发明所述设备第一培养基转移区3以及泵输出的结构要求培养基直接流向第一模块m1第一培养基转移区3的实质上圆柱形部分3b，流向第二模块m2第一培养基转移区3的实质上圆柱形部分3b。
该实施方式中，模块装配形成包括实质上圆柱形部分3b的巨大的第一培养基转移区3。
当培养基到达第二培养模块m2实质上圆柱形部分3b的壁的顶部时，则溢入第二培养模块m2的第三培养基转移区4。
培养基M的循环方向用箭头表示。
因此，培养基在泵赋予的流速和重力下，朝向第二培养模块m2第三培养基转移区4底部，在第二培养模块m2实质上圆柱形部分4a中向下流，并到达第二培养模块m2第三培养基转移区的实质上基底部分4b。然后，培养基在连通容器效应和泵所赋予的流速作用下向上流动并到达第二培养模块m2第二培养区5的顶部。培养基从第二培养模块m2第三培养基转移区4经第二培养模块m2底壁15上的允许基本不含细胞的培养基17通过的开口到达第二培养模块m2第二区5。
当培养基流动边缘到达第二培养模块m2第二培养区5外壁的顶部时，就溢入第二培养模块m2的第四培养基转移区6。显然，如果培养区5的该外壁上存在开口或管道，则必须理解，当培养基流动边缘到达该开口或管道时，它会流入第二培养模块m2的第四区6。
在本发明特别优选的实施方式中，第二培养模块m2的第四培养基转移区6包括倾斜壁18，当培养基从第二培养模块m2的第二区5进入第二培养模块m2的第四区6时能在该壁上流动。倾斜壁优选包含亲水膜以促进所述倾斜壁18上的膜形成。膜必须优选是以尽可能防止泡沫形成。为使膜稳定，也可以在培养基中加入添加剂以改变水的流变学特性，如上所述。
然后，第二培养模块m2第四培养基转移区6中的培养基通过管道或通过第二培养模块m2第四培养基转移区6的壁的顶部(D)溢入第一培养模块m1的第三培养基转移区4。
因此，培养基在泵赋予的流速和重力下，从第一培养模块m1第三培养基转移区4，在第一培养模块m1实质上圆柱形部分4a中向下流动，到达第一培养模块m1第三培养基转移区的实质上基底部分4b。然后，培养基在连通容器效应和泵所赋予的流速作用下向上流动并到达第一培养模块m1第二培养区5的顶部。培养基从第一培养模块m1第三培养基转移区4经第一培养模块m1底壁15上的允许基本不含细胞的培养基17通过的开口到达第一培养模块m1第二区5。
当培养基流动边缘到达第一培养模块m1第二培养区5的壁的最高点时，就溢入第一培养模块m1的第四培养基转移区6。显然，如果该壁上存在开口或管道，则必须理解，当培养基流动边缘到达该开口或管道时，它会流入第一培养模块m1的第四区6。
第一培养模块m1的第四培养基转移区6包括倾斜壁18，当培养基从第一培养模块m1的第二区5进入第一培养模块m1的第四区6时能在该壁上流动。如上所述，倾斜壁上可以具有亲水膜。
然后，培养基经入口(管道)11返回到底部模块m0和培养基循环装置，也就是说第一培养模块m1第四培养基转移区6中存在的培养基通过管道或通过第一培养模块m1第四培养基转移区6的壁的顶部溢入管道11，管道11终止于构成本发明所述底部模块m0培养基循环装置的所述离心泵形成的虹吸管的基本位于中心的区域。
在图4中高度示意表示并在图9中详细表示的该实施方式的一个变化形式中，叠放的模块m构成培养容器。在图4所示的这种变化形式中，例如，可存在三种类型的模块：底部模块m0，包括四个区域的模块m1、m2，...，n，以及顶部模块mx(未显示)。底部模块m0或基底模块m0包括培养基循环装置和装配装置，装配装置被设计成与四区域模块m1，2，...，n的第一装配装置24a啮合，如上所述，并构成容器的底部。顶部模块mt被设计成与四区域模块m1，2，...，n的第二装配装置24b啮合。被底部模块m0啮合的四区域模块m1，2，...，n与被顶部模块mt啮合的模块可以是相同的，或者，被底部模块m0啮合的四区域模块m1，2，...，n可以是一系列四区域模块m1，2，...，n中的第一个，而被顶部模块mt啮合的模块因此可以是一系列四区域模块m1，2，...，n中的第二个。
这种变化形式以与图3所述相同的方式发挥作用。
图5和6显示了底部模块m0基底部分中的一半。图5为横截面图，图6为顶视图。由图可见，培养基被设计成通过在图中用字母x表示的基本中心区域中的至少一个入口进入底部模块。磁力设备7的旋转轴通过该真实或虚拟的中心x。当循环装置运作时，磁力设备7围绕其旋转轴旋转，其旋转产生将培养基吸入培养基循环装置的虹吸管。磁力设备旋转的区域由挡板或壁25限定。该实施方式中显示了两个挡板，但挡板的数目可以更多，如3、4、5、6、8、10，等等。挡板将优选是对称放置在其周围的。
挡板25之间的间隙13是培养基出口开口。实际上，培养基被磁力设备旋转形成的虹吸管吸入，同时，培养基通过挡板之间的开口13朝挡板25界定区域之外推出。尽管显示了两个挡板25，因此在该实施方式中有两个培养基出口开口，但挡板的数目可以更多，例如3、4、5、6、8、10，等等。由于挡板宜对称设置，因此培养基出口13的位置也宜对称设置。当培养基被出口13推出时就离开实质上的循环区域27。
该实施方式中，底部模块m0的基底部分具有基本为呈管状的开口20，该开口允许例如气体或气体混合物和新鲜培养基进入，排出气体或气体混合物，排出培养基，等等。
此外，凹槽31是为从外部接触这些开口20提供的，它使这些开口能够与气体或气体混合物、新鲜培养基等的供给相连。
图7是本发明所述底部模块m0的顶部的横截面图，图8是该部分的顶视图。顶部包括基本呈管形的培养基入口开口11。这些入口开口11引导来自本发明所述设备1第四培养基转移区6的培养基进入磁力设备旋转形成的虹吸管。当磁力设备旋转时，位于图5和6所示基本呈圆周区域27内的培养基进入穿孔26，所述穿孔26与管道28连通，使排出的培养基到达与本发明所述设备第一培养基转移区3、尤其与第一培养基转移区的实质上呈管状的部分培养基连通的区域。
图7描绘的顶部是设计成放置在图5所示底部上的部件。显然，这种底部模块m0也可用其他方式获得，但出于制造简单的原因，在该实施方式中它是分可连接在一起的两个部分制造的。此外还可发现，顶部和底部优选在图5和7所示的凹槽29处以密封方式相连。
本申请的培养基循环装置的所有例子也可以不同方法制造。不言而喻的是，制造限定或不限定在底部模块内的培养基循环装置各种实施方式的所有方法都包括在要求保护的范围之内。
图9是本发明所述设备一个特别有益的实施方式的横截面视图，而图10是同一实施方式的分解横截面视图。分解图能更加清楚地理解本发明的特殊实践和发明点。
因此将同时描述这两幅图。如所示，本发明所述设备从底部到顶部由夹在一起的以下部件的叠层构成：
·底部模块m0的底部(m0a)，其中包括由挡板25限定的磁力设备旋转的区域。该图中可见的挡板25之间的间隙13是培养基出口开口。这是由于培养基被磁力设备旋转形成的虹吸管吸入，培养基通过挡板25之间的开口13朝挡板25界定区域的外侧27(基本为环状区域)推出，
·底部模块m0的顶部(m0b)，其包括基本呈管形的培养基入口开口11。这些入口开口11引导来自本发明所述设备1第四培养基转移区6的培养基进入磁力设备7旋转形成的虹吸管。当磁力设备旋转时，位于基本呈圆周区域27内的培养基进入穿孔26，所述穿孔26与管道28连通，使排出的培养基到达与本发明所述设备第一培养基转移区3、尤其与第一培养基转移区的实质上呈管状的部分培养基连通的区域30，
·第一培养模块m1，如图3的解释中详细解释，
·第二培养模块m2(见图3)，
·具有凹槽33的顶部模块，其包括埋入培养基内的光学传感器23，具有与第二培养模块m2第二培养区5顶壁16的16a部分相连的固定装置22的顶盖19。
如图4、9和10所示，所有模块包括固定装置24a和24b。各模块包括若干固定装置，根据所需的装配可使用或不使用这些装置，但使用这种装置能够获得可与其他培养模块以及与底部模块或顶部模块装配的单一培养模块。这些固定装置是，例如，具有环形密封的同心圆环，细胞培养领域熟知的快速连接件，螺丝钉和锯齿，或可用来装配本发明的这些模块的任何其他设备。
在该实施方式中，底部模块m0的基底部分与基本呈管形的开口20相连，此时能通过该开口引入气体或气体混合物。气体入口开口20与管道32相连，管道32终止于培养基平面之上，从而使气体或气体混合物至少能够到达本发明所述培养设备1的第四培养基转移区6。本发明所述培养设备1第四培养基转移区6的所有环境大气通过类似管道32相连，从而使气体混合物能够到达顶部。这在具有在高度上可叠加的模块的设备中特别有利，所述高度可以非常高，从而可通过反应器底部提供气体。
在一种变化形式中，基底部分包括气体或气体混合物进料管以便为装有磁力设备的区域提供气态物质。采用这种方法，磁力设备的旋转使进入的气体搅拌起来，同时培养基运动促进氧气溶解。过量的气体也被搅拌并以小气泡的形式继续向上移动。这种变化也适用于图1所示的实施方式。
此外，凹槽31是为从外侧接触这些开口20而提供的，从而使得可将这些开口与气体、气体混合物、新鲜培养基等的供给相连。
模块m0的顶部m0b是设计成被固定装置28夹紧并被底部模块m0底部m0a的环状密封34密封的元件。
显然，本发明不限于上述实施方式，可对其做出许多修饰而不背离权利要求的范围。
例如，图1所示的本发明所述设备也可包括营养物进料口，它可位于穿过顶盖的管道内或穿过本发明所述设备一个壁的管道内。同样，本发明所述设备或者模块或各个四区域模块的第一或第四区内也可存在加热装置。可能的话，本发明所述设备还可包括若干培养基循环装置，例如若干离心泵。
组件列表：
1.培养设备
2.培养容器
3.第一培养基转移区
3a.第一培养基转移区基底部分
3b.第一培养基转移区的顶部圆柱部分
4.第三培养基转移区
4a.第三培养基转移区的基底部分
4b.第三培养基转移区的圆柱形顶部
5.第二培养区
6.第四培养基转移区
7.磁力设备
8.中央旋转轴
9.顶部啮合装置
10.底部啮合装置
11.培养基入口
12.转向挡板
13.培养基出口
14.培养基导向装置
15.第二培养区的底壁
16.第二培养区的顶壁
17.第二培养区顶壁和底壁内的开口
18.倾斜壁
19.培养容器顶盖
20.气体入口开口
21.气体出口开口
22.将顶盖固定于第二培养区顶壁的装置
23.传感器
24.装配装置
24a.第一装配装置
24b.第二装配装置
25.底部模块的挡板或壁
26.底部模块中的穿孔
27.实质上的循环区域
28.管道
29.环状密封的凹槽
30.与第一培养基转移区培养基连通的区域
31.连接开口20的凹槽
32.气体给料管道
33.顶盖中放置传感器的凹槽
34.环状密封
m0＝底部模块
m1至mn＝培养模块
mt＝顶部模块
M＝培养基
C＝细胞
D＝第四培养区的顶壁

Claims (15)

1.一种细胞培养设备(1)，所述设备包括：
-具有顶盖(19)的培养容器(2)，其中设置有至少一个第一区(3)和至少一个第二区(5)，所述第一区(3)是不含任何细胞的培养基的转移区，而所述第二区(5)是细胞培养区，所述第一区(3)位于第二区内部，
-使培养基通过第二区(5)循环的循环培养基的装置，所述第二区(5)包括底壁(15)和顶壁(16)，其中各壁(15，16)具有能够转移不含细胞的培养基的开口(17)，其特征在于：
-它还包含至少一个第三区(4)和至少一个第四区(6)，这两个区都是不含细胞的培养基的转移区，所述第三区(4)是所述第二区(5)之内和所述第一区(3)之外的区域，而所述第四区(6)是所述第二区(5)之外的区域，其中所述第三区(4)与第一区(3)和第二区(5)培养基连通，且其中所述第四区(6)经培养基循环装置与第二区(5)和第一区(3)培养基连通，从容器中央向外侧，该容器包括第一区(3)，第三区(4)，第二区(5)和第四区(6)，其特征还在于，
-培养基循环装置能够使培养基在所述第二区(5)内从底部循环到顶部。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述第三区(4)适合使培养基从第一区(3)溢出到第三区(4)，所述第一区(3)具有将培养基传递到第三区(4)的入口的出口。
3.如权利要求1或2所述的设备，其特征在于，所述第三区(4)是位于所述第二区(5)之内并在所述第一区(3)之外的区域，而所述第四区(6)是位于所述第二区(5)之外的区域。
4.如权利要求1所述的设备(1)，其包括一系列培养模块(m1，...，mn)，各模块包括所述第一区(3)、所述第二区(5)、所述第三区(4)和所述第四区(6)，其中，所述一系列培养模块中的相邻模块由培养基连通，且各模块的所述第一区(3)和所述第四区(6)直接或间接与所述循环装置连通。
5.如权利要求1所述的设备(1)，其特征在于，所述循环装置被限定在底部模块(m0)内，所述底部模块(m0)与至少一个第一区(3)和至少一个第四区(6)直接或间接培养基连通。 
6.如权利要求1所述的设备(1)，还包括顶部模块(mt)，所述顶部模块(mt)至少包括顶盖(19)。
7.如权利要求1所述的设备(1)，其特征在于，所述至少一个第四区(6)包括至少一个垂直或倾斜的流动壁(18)。
8.如权利要求7所述的设备(1)，其特征在于，所述垂直或倾斜的流动壁(18)包含亲水膜。
9.如权利要求1所述的设备(1)，还包括至少一个气体入口开口(20)和一个气体出口开口(21)。
10.如权利要求1所述的设备(1)，其特征在于，培养容器(2)的顶盖(19)与至少一个第二区(5)所述顶壁(16)的至少一部分相连。
11.如权利要求4所述的设备(1)，其特征在于，各培养模块(m0，...，mn)在其顶部包括第一固定装置(24a)并在其底部包括第二固定装置(24b)，其中，所述底部模块(m0)在顶部(m0b)还包括第一固定装置(24a)且所述顶部模块(mt)在其底部还包括第二固定装置(24b)，其中所述第一固定装置(24a)和所述第二固定装置(24b)为互补的固定装置，从而产生从底部到顶部为底部模块(m0)、至少一个培养模块(m0，...，mn)和顶部模块(mt)的叠放顺序。
12.如权利要求1所述的设备(1)在细胞培养中的应用。
13.一种在具有培养基循环的权利要求1所述的细胞培养设备内培养细胞的方法，所述方法包括：
-将培养基(M)引入培养基循环装置，
-从所述培养基循环装置中排出培养基(M)，
-将第一培养基向上转移到第一区(3)的至少一次第一次培养基(M)转移，
-将培养基(M)转移到第二区(5)的至少一次第二次转移，
其特征在于，所述方法还包括：
-所述第一次培养基转移之后的将培养基转移至第三区(4)的至少一次第三次培养基转移，此次转移通过从第一区(3)溢出到第三区(4)而进行，
-所述第二次培养基转移之后的将培养基转移至第四区(6)的至少一次第四次培养基转移，此次转移通过从第二区(5)溢出到第四区(6)而进行，且所述第二次培养基转移是将培养基向下转移。 
14.如权利要求13所述的培养细胞的方法，还包括在一次或多次所述转移期间氧合培养基。
15.如权利要求13或14所述的培养方法，其特征在于，所述氧合是在第四次培养基转移期间进行的，所述第四次培养基转移是使所述培养基(M)沿流动壁(18)流动。 
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