CN113717853A - 细胞培养装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养装置及其方法。本发明提供了用于制备和培养细胞的装置，包括至少具有用于导出入培养基和细胞的入口和出口的透气腔室，以及放置在透气腔室末端的生长基质，用于锚定或嵌入的细胞。本发明还提供了一种简单而有效的细胞培养方法，通过将细胞培养装置与部分填充的培养基一起缓慢地水平旋转，使其在透气腔室中水平旋转，以便能够间歇地暴露或浸没生长基质，从而获得较佳生长效果。

Description

细胞培养装置及其方法

技术领域

本发明涉及用于在体外生长动物细胞和/或组织培养物的装置和方法，更具体地，本发明涉及具有透气腔室的细胞培养装置以及使用该细胞培养装置的细胞培养方法。

背景技术

多年来，已经广泛地开发了用于细菌、酵母和霉菌生长的细胞培养方法，所有这些细菌、酵母和霉菌通常具有坚固的细胞壁和/或额外的细胞材料，因此更具弹性。这些微生物细胞的结构弹性是促成针对这些类型的细胞的高效细胞培养过程发展迅速的关键因素。例如，大多数细菌细胞可以使用剧烈搅拌、培养物搅拌和气体喷射技术在非常大量的液体培养基中生长，以在生长过程中实现良好的通气，同时保持可行的培养。

相反，用于培养诸如真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和/或组织细胞的技术更加困难和复杂，因为这些细胞比微生物细胞更脆弱并且在生长过程中具有更多的营养和氧气需求，条件复杂且难以维护。此外，动物细胞和/或哺乳动物细胞不能承受由于空气或气态混合物(例如含有氧气、氮气和二氧化碳的混合物)的流入而产生的过大紊流和/或剪切力，微生物细胞则较容易耐受该紊流和/或剪切力。另外，任何动物细胞都不能直接暴露于气体中，大多数动物细胞只能利用培养基中的溶解氧。与微生物细胞相比，动物细胞和哺乳动物细胞更容易受到空气和气体流入的破坏，因此导致细胞死亡率增加。用于细胞培养的细胞培养装置通常具有内部运动部件，例如叶轮，这些部件使细胞承受很高的流体剪切力，从而导致细胞损伤，有时甚至导致细胞死亡，进而导致培养物活力低下，以及降低蛋白质和/或细胞副产物的生产。同样，利用其他类型的机械零件，以剧烈的空气运动或突然的液体运动作为实现细胞悬浮和/或适当通气的机制的细胞培养装置，可能会损坏细胞并阻碍细胞和组织的生长，进而导致细胞副产物产生的减少，例如病毒、抗体和蛋白质。

主要功能是用于研究的细胞培养装置，其中包括使大量细胞生长以提纯微量的活性物质，包括但不限地，包括细胞分泌到生长培养基中的蛋白质或抗体。由于需要在实验室中培养真核细胞、原核细胞、动物细胞和/或哺乳动物细胞，因此细胞培养装置和培养设备已成为研究和生产用于生产活性蛋白的细胞的重要工具。

本领域已知许多用于小规模和大规模的细胞培养方法。对于较小规模的细胞培养，多年来已经开发了许多容器。例如，细胞培养皿代表一种类型的培养容器。细胞培养皮氏培养皿通常由一个底盘和一个可移动的盖子组成，该底盘包含生长培养基。尽管可移动的盖子为培养物提供了便利的途径，但是由于在培养过程中重复去除盖子而使微生物经常并容易污染细胞。实际上，污染是细胞和组织培养技术成功与否的主要挑战之一。

为了克服培养皿的污染，开发了培养瓶。培养瓶通常具有培养室(烧瓶)，位于烧瓶一端的小管状开口和相应的盖。这种设计会将细胞暴露于灰尘、细菌、酵母和其他污染物的可能性降至最低，可参考美国专利号5,235,038、美国专利号4,334,028号、美国专利号4,851,351号和美国专利号5,398,837。尽管培养瓶是对培养皿的改进，但它们并未完全解决污染问题。另外，培养皿或培养瓶均不能为细胞提供适当的通气。此外，培养瓶中可用的生长表面积不足，就像培养皿中那样。因此，使用该技术限制了扩大培养过程。

开发用于细胞和组织培养的另一种技术是滚瓶。滚瓶已经在本领域中广泛使用了很多年。尽管它们相对于培养皿和烧瓶具有一些优势，例如更大的表面积可用于细胞附着和生长，但它们仍无法弥补所有缺陷，尤其是在扩大规模方面，可参考美国专利号5,527,705和美国专利号4,962,033。

而且，尽管与培养瓶和培养皿相比，滚瓶的表面积更大，但是由于与细胞的粘附表面不一定比培养瓶和培养皿大，也不是按比例扩大，所以通常认为滚瓶的表面积并不足够细胞培养物的生长。通过为每个滚瓶提供更大的表面积，已经进行了一些努力来改进滚瓶，例如美国专利号5,010,013描述了一种具有增加的表面积用于细胞附着的滚瓶，使用波纹状通道添加到滚瓶的内表面区域以增加细胞附着的能力。然而，典型的滚瓶仅提供约850-1700cm²的表面积用于培养细胞，仍然需要多个滚瓶来扩大生产。尽管用大量的滚瓶进行培养的自动化可以节省时间和劳力投资，但是这些操作通常是昂贵的并且是限制性的。

上述的细胞培养设备，如培养皿、组织培养瓶和滚瓶，即使使用起来非常简单，但它们都利用了设备本身的表面，并且仅一部分培养基可以填充到设备中以进行氧气转移。因此，空间利用率差，并且还需要大量的劳动来进行操作。在该应用领域中仍然需要用于实验室或大规模细胞培养的简单但节省空间的细胞培养装置。

除了流体动力剪切力和表面积限制的问题外，细胞和组织培养技术固有的中心问题是在生长的培养物中获得并维持足够的氧合。在本领域中众所周知，原核细胞、真核细胞，包括动物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母和霉菌，都具有一个主要的限速步骤，即氧气质量转移。

氧代谢对于大多数原核细胞和真核细胞的代谢功能是必不可少的，除了各种真核微生物例如酵母的某些发酵型代谢。特别地，利用哺乳动物和动物细胞培养技术，在快速细胞分裂的早期阶段，氧通量尤其重要。当细胞悬浮时，每个细胞的氧气利用率最高。随着细胞聚集和分化，对氧气的需求减少。一些哺乳动物和动物细胞是依赖锚定的，需要表面生长，而其他哺乳动物和动物细胞是不依赖锚定的，并且可以在液体环境中生长，而与细胞的类型无关。但是，这些细胞都需要在介质中溶解氧。然而，在细胞培养的后期阶段，既有依赖锚定的细胞又有独立的细胞，随着每单位体积细胞数量的增加，大量氧气传质的需求再次增加。

传统上，至少对于不依赖于锚定的细胞，通过机械搅拌方法和将气体喷射到培养物中来满足对氧气的增加的需求。然而，如所讨论的，气体的搅拌和喷射都可能导致细胞的损坏，从而降低了培养物的活力以及细胞和/或组织培养物的总体效率和生产率。此外，用气体直接喷射细胞和组织培养物可导致产生泡沫，这也不利于细胞生存。

本领域中已经进行了一些尝试以解决细胞培养期间的氧合问题，例如美国专利号5,153,131，涉及没有混合叶片的细胞培养装置容器。取而代之的是，空气通过进气通道，穿过支撑板构件穿过滤网，并穿过楔入在容器壳体两侧之间的可渗透平板的膜。然后，由于壳体两侧之间的浓度梯度，氧气穿过膜扩散到培养室中。

然而，此类型的细胞培养装置具有许多缺点。特别地，氧气可以在整个盘状膜上扩散的速率是一个重要的限制，它限制了培养室的大小。平盘膜的另一个缺点是其弯曲设计成在培养室内引起混合，这可能导致细胞死亡。混合效应是被描述为对整个培养基中的空气分配至关重要的一个特征，但是，它也会趋于在腔室内产生剪切力，同样可能对细胞有害，即使提供了足够的气体交换来维持生长。当设计细胞培养装置或培养容器时，较大细胞结构的限制是一个重大而现实的限制。

克服迄今描述的缺陷的尝试的实施例是由气体可渗透材料制成细胞培养装置，例如美国专利号5,702,941，标题为“气体可渗透细胞培养装置和使用方法”，涉及水平旋转的容器，并且该容器至少部分地由可渗透气体的材料组成，与培养基的气体交换旨在直接通过构成容器壁的气体可渗透材料发生。

然而，由于气体交换取决于气体可渗透表面积的量，因此容器的尺寸范围仍然受到限制。随着容器表面积的增加，培养基的体积和数量也会增加。容器的优选尺寸被限制在直径一英寸至六英寸之间，其宽度优选地被限制在四分之一英寸至一英寸之间。这样的尺寸限制不适用于生长三维细胞聚集体和组织和/或任何扩大规模的生产。

类似地，美国专利号5,449,617，标题为“用于细胞培养的培养容器”，涉及水平旋转的容器。该容器通过透析膜分成细胞培养室和营养培养基储库，容器壁中使用气体可渗透的材料，以使细胞培养室中的气体交换。但容器的设计并未使细胞培养室内的紊流最小化，相反，混合是保持透析膜湿润的必不可少的步骤。此外，没有考虑使用该容器来生长任何种类的细胞聚集体或组织。

另一解决方案是开发不需要清洁或灭菌并且仅需要最小的验证工作的柔性的一次性塑料容器，例如美国专利号5,523,228描述了一种水平旋转的柔性、一次性且可透气的细胞培养室。细胞培养室由融合在一起的两片塑料制成。除接缝之外，腔室的边缘用作与水平旋转的驱动装置的附接点。细胞培养室由透气材料制成，并安装在水平旋转的磁盘驱动器上，该磁盘驱动器将支撑柔性细胞培养室，而不会阻塞膜表面上的气流。因此，将细胞培养室放置在培养箱中，并根据袋的渗透系数通过控制培养箱中的气压来控制氧的转移。袋子的旋转有助于混合袋子中的内容物，并增强整个袋子中的气体传输。然而，细胞培养室没有支撑装置，并且当放大时曝气表面积不能与体积成比例，因此其被限制为小体积。此外，细胞培养室是柔性的，并且难以作为实验室工具来操作。通过透气膜的氧气转移将在膜和培养基之间建立一个有毒的氧气层。如果在培养过程中没有混合或混合不良，也将形成边界以限制氧气的转移。这些缺点都存在于系统中，在该系统中培养基完全充满而没有任何气态的顶部空间。

持续需要开发具有与现有设备的简单连接的轻型、预灭菌的一次性细胞培养装置。操作员只需很少的操作培训，即可提供成功的细胞培养所需的必要的气体转移和营养混合。

鉴于细胞和组织培养技术在生物技术研究、药物研究、患者护理及学术研究中的重要性，并且鉴于描述的现有技术中存在的缺陷、障碍和局限性，本发明克服了障碍并弥补了在现有技术中存在的缺陷，通过教导和公开一种用于细胞和组织培养的方法和装置，该方法和装置满足了对培养细胞和组织的新颖方法和装置的长期需求，该方法和装置更可靠、更简单、更有效、更不麻烦、成本更低、劳动强度更低，消除了透气膜层和培养基之间的氧气边界，能够在没有氧气供应限制的情况下以高密度生长3D细胞，能够增加细胞活力并从细胞中产生更高的细胞副产物产量。

发明内容

细胞培养技术中仍然存在一些障碍尚未解决。细胞和/或组织培养中的最大障碍之一是所采用的装置和/或方法难以在提供足够的氧气和避免伤害细胞这两者之间取得平衡。哺乳动物细胞培养中的另一个障碍是，需要相对大量的接种物来开始培养。

为此，一方面，本发明提供了一种细胞培养装置，其中，所述细胞培养装置包含：

具有至少一开口端的透气腔室以容纳培养基；

密封件，可拆卸地安装于所述开口端；以及

生长基质，设置于所述透气腔室中。

另一方面，本发明还提供了一种用以旋转本发明所述的细胞培养装置的装置，其中，所述用以旋转细胞培养装置的装置包含：

马达；

保持器，用以保持所述细胞培养装置；以及

轴，该轴连接于所述马达与所述保持器之间，所述马达驱动所述轴以旋转所述细胞培养装置。

此外，本发明还提供了一种本发明所述的细胞培养装置的培养方法，其中，所述培养方法包含：

将细胞和培养基部分填充到所述透气腔室中以覆盖所述生长基质；

将所述透气腔室上下旋转，以使所述生长基质从培养基中暴露出来；以及

将所述透气腔室上下旋转，以使所述生长基质浸没在培养基中。

具体而言，本发明包括细胞培养装置及其使用方法。具有本发明特征的细胞培养装置包括半刚性的透气腔室，该透气腔室包含入口和/或出口或盖，以及至少一个放置在该容器的一端或两端的细胞生长基质，该透气腔室由硅橡胶制成，该硅橡胶具有足够的厚度，优选为0.5至2mm，该厚度可以自身静置而无需额外的支撑。对于实验室使用，将入口和出口替换为更便于实验室操作的盖。为了更安全和无污染地运行，至少设计一个入口和一个出口来代替盖子。不需要空气过滤器，因为容器本身已经是气体可渗透的，从而允许氧气和二氧化碳传递和平衡。细胞生长基质，或称为细胞培养基质或细胞培养载体，放置在透气腔室的一端或两端。细胞培养基质是多孔的，并且可以是片状，多片或设置在安装在透气室的一端或两端的篮子中的多个圆盘。

对于细胞培养，将腔室固定在水平旋转的夹具或由马达驱动的平台上；连接马达的电源，以使夹具或平台沿顺时针和/或逆时针方向移动；时序控制器控制平台在一端停止并保持一段时间，然后再转回或保持转向另一端。该运动可以一直沿顺时针方向进行，但在设定的时间段内在顶端和底端位置停止；也可以顺时针旋转并在一端停止一段设定的时间，然后逆时针旋转并在另一端停止一段设定的时间。

本发明中的细胞培养方法包括以下步骤：制备具有单个中空内部容积的无菌透气腔室，将细胞生长基质安装在该透气腔室的一端或两端，通过盖子或通过部分填充气体可渗透腔的入口，最多能够在旋转过程中完全暴露出细胞生长基质，将细胞悬浮液放入该透气腔室中以将细胞分布在细胞生长基质上，并将该透气腔室固定在平台上，连接动力以驱动马达并使平台和细胞培养装置旋转运动，设置定时控制以使一种细胞培养底物浸没或暴露一段时间，以使细胞锚定在细胞生长基质上或嵌入细胞生长基质中，保持顺时针/逆时针运动，直到细胞锚定在生长基质上和/或嵌入细胞生长底物，设置定时控制以使一种细胞培养底物被浸没或暴露一段时间，以完成营养物交换或控制气相和液相的营养物供应，并保持平台顺时针/逆时针运动。其中，将细胞培养底物浸没在一端，然后旋转至另一端后暴露，周期性地重复上述步骤，从设置时间控制到结束过程，以在培养期间维持合适的连续细胞培养条件。

本发明提供了一种用于培养细胞的新颖方法，以解决关于有效氧/营养物转移、最小的代谢产物废物积累、气泡和/或因注入气体而产生的剪切力的最大障碍。培养可最大程度地增加细胞粘附力，增加空气与空气接触的表面积，并在本发明装置中的介质时起静态混合器的作用。

本发明提供了一种可靠、简单、廉价和有效的方法，用于培养细胞和/或组织并收获其产生的细胞产物，例如原核细胞、真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞，从而连续供应，向细胞提供氧气和营养。本发明的方法通过在培养期间提供足够的氧气来减少废物积累，帮助去除培养期间过量的二氧化碳，以简单、可靠、廉价和有效的方式帮助稳定培养环境，帮助防止由空气引起的对细胞的有害影响。本发明的方法可以降低动物细胞培养中通常需要的初始接种密度，并且还可以消除最初由于接种密度低而在初始生长期期间的滞后阶段。而且，本发明教导并公开了在培养过程中有效去除二氧化碳并稳定pH的新方法。本发明提供了一种更容易和更方便的方法来生产和收获分泌的细胞产物，例如蛋白质、抗生素、来自细胞或组织培养物的任何细胞和/或组织产物的方法。

细胞培养装置包括透气容器和至少一个细胞生长基质，所述至少一个细胞生长基质允许气体在细胞培养装置中所包含的细胞环境与其中的细胞的培养箱的气氛之间快速且均匀地转移气体。

通过使细胞培养装置适于具有更高的细胞培养密度的3D细胞培养来提供细胞培养方法。提供一种简单但有效的细胞培养方法，其是通过将气体培养装置与部分填充的培养基水平地缓慢旋转，使其在透气容器中水平旋转，从而在细胞培养过程中实现高效的氧气传输速率和二氧化碳平衡速率。

以下结合附图的实施例来解释本发明的目的、技术内容、特征和成就。

附图说明

图1和图2示出了组装前后的本发明第一实施例的细胞培养装置侧视图。

图3和图4示出了组装前后的本发明第二实施例的细胞培养装置侧视图。

图5和图6示出了组装前后的本发明第三实施例的细胞培养装置侧视图。

图7和图8示出了组装前后的本发明第四实施例的细胞培养装置侧视图。

图9和图10示出了组装前后的本发明第五实施例的细胞培养装置侧视图。

图11和图12示出了组装前后的本发明第六实施例的细胞培养装置侧视图。

图13和图14示出了组装前后的本发明第七实施例的细胞培养装置侧视图。

图15示出了本发明第八实施例的细胞培养装置侧视图。

图16和图17示出了用于驱动本发明细胞培养装置旋转的第一实施例和第二实施例的装置立体图。

图18、图19和图20示出了如何旋转细胞培养装置的装置立体图。

图21示出了用于驱动细胞培养装置的本发明的第三实施例的装置立体图。

图22、图23和图24示出了在不同旋转状态的本发明的透气性细胞培养装置的侧视图。

图25示出了本发明第九实施例的细胞培养装置侧视图。

图26和图27示出了组装前后的本发明第十实施例的细胞培养装置侧视图。

图中，11：本发明细胞培养装置；12：培养基；22,22’：内螺纹；23,23’：外螺纹；33：狭窄部分；34：构件；35：标记；37：固定部；101：透气腔室；102,102’：盖；103,103’：刚性颈部或刚性管；104：生长基质支架；105：生长基质；106：楔形环；107：顶部开口；108,108’：管；109,109’：配件；111：第一开口端；112：第二开口端；113：封闭端；201：马达；202,202'，302：装置；203：夹具或保持器或平台；204：轴；205,205’：承轴。

具体实施方式

本发明提供了一种用于培养细胞的装置和方法，实施方案可用于培养不同的多样性细胞，例如真核和原核细胞，特别是动物细胞和/或哺乳动物细胞。更特别地，锚定依赖性动物细胞。

本发明的细胞培养装置包括具有至少一个开口端的透气腔室，在该至少一个开口端可拆卸地安装有密封件，并且在该透气腔室中设置有生长基质，密封件是盖或基质支架，并且生长基质是盘状或带状的多孔性基质。下面描述不同实施例中的细胞培养装置的详细部分。

图1和图2示出了组装前后的本发明第一实施例的细胞培养装置侧视图。该细胞培养装置包括透气腔室101，该透气腔室101优选为具有第一开口端111和第二开口端112的瓶形室。密封件可以包括可拆卸地安装在第一开口端111处的盖102。生长基质支架104和生长基质105可拆卸地安装在透气腔室101的第二开口端112。生长基质105是多孔片或盘，其由模制在生长基质支架104中的楔形环106固定。生长基质支架104的顶部是开放的，用于细胞培养期间的培养基以及气体的转移和交换。透气腔室101优选地由硅橡胶制成，该硅橡胶可以在0.5mm至2mm，更优选地0.5至1mm，其在一定厚度下是半刚性的，并且其可以静止而无需额外的支撑装置。透气腔室101由盖102封闭，为了使盖102与透气腔室101气密，将具有外螺纹23的刚性颈部或刚性管103可拆卸地安装在透气腔室101上以与盖102的内螺纹22接合。硅橡胶已被证明是用于气体交换膜的良好材料，硅橡胶可以通过注射成型经济地制造成任何期望的形状，硅橡胶可以多种厚度，形状和特定的气体渗透性商购获得，与通常用于细胞培养的培养基相比，它具有较高的抗撕裂性和良好的耐化学性，因此也特别易于处理。可以理解的是，在硅橡胶足够硬以进行加工的情况下，用于接合的螺纹可以直接在透气腔室101的开口端上制成。

继续参考图1和图2，透气腔室101可以容纳培养基12，并且液相的培养基12可以被封闭在组装后的细胞培养装置11的透气腔室101内。培养基12不会完全充满在透气腔室101中，从而为气体留有少量空间。由于细胞培养装置11的气体渗透性，气体可以进入和渗透到透气腔室101中。

图3和图4示出了组装前后的本发明第二实施例的细胞培养装置侧视图。与第一实施例相比，刚性管103除了具有用于与盖102的内螺纹22接合的外螺纹23的一部分之外，还提供了狭窄的部分以插入到透气腔室101的第一开口端111中并且提供了宽的部分以倚靠在透气腔室101的第一开口端111上。此外，透气腔室101优选地由硅橡胶制成，其厚度为0.5至2mm，更优选地为0.5至1mm，其在一定厚度下可以是半刚性的并且可以静止不动，不需要额外的支撑手段。

图5和图6示出了组装前后的本发明第三实施例的细胞培养装置侧视图。该细胞培养装置包括具有第一开口端111和第二开口端112的透气腔室101，其中具有螺纹的盖102可拆卸地安装在第一开口端111，以及具有螺纹22'的另一个盖102'和生长基质105可拆卸地安装在透气腔室101的第二开口端112。生长基质105是多孔片或盘，其通过模制在另一个盖102'中的楔形环106固定。为了确保盖102、102'是气密的，具有外螺纹23、23'的刚性颈部103、103'在顶部和底部开口端均可拆卸地安装在透气腔室101上，以便接合和固定带有内螺纹22、22'的盖102、102'。

图7和图8示出了组装前后的本发明第四实施例的细胞培养装置侧视图，以及图9和图10示出了组装前后的本发明第五实施例的细胞培养装置侧视图。该细胞培养装置11包括具有第一开口端111和第二开口端112的透气腔室101，其中，在该第一开口端111可拆卸地安装有盖102，并且在透气腔室101的第二开口端112可拆卸地安装有生长基质支架104和生长基质105，生长基质105是设置在生长基质支架104中的多孔基质的多个盘或条，例如BioNOC II载体(中国台湾CESCO Bioengineering Co.,Ltd)。生长基质支架104是具有顶部开口107的筐，该顶部开口107用于在操作期间转移和交换培养基和空气。透气腔室101由具有螺纹的刚性盖102封闭，为了确保盖102是气密的，将具有外螺纹23的刚性颈部或刚性管103可拆卸地安装在透气腔室101上，以便与盖102接合并固定。

图11和图12示出了组装前后的本发明第六实施例的细胞培养装置侧视图，以及图13和图14示出了组装前后的本发明第七实施例的细胞培养装置侧视图。该细胞培养装置包括具有第一开口端111和封闭端113的透气腔室101，其中在第一开口端111可拆卸地安装有盖102，并且在第一开口端111可拆卸地安装有生长基质支架104和生长基质105，生长基质105是设置在生长基质支架104中的多孔基质的多个盘或条，例如BioNOC II载体(中国台湾CESCO Bioengineering Co.,Ltd)。生长基质支架104是筐，其具有顶部开口107，用于在操作期间转移和交换培养基和空气。透气腔室101由刚性盖102封闭。为了将盖102固定为气密，将具有外螺纹的刚性颈部或刚性管103可拆卸地安装在透气腔室101上，以便与盖102接合并固定，亦可选用其他设计来固定盖，例如法兰(Flange)。

因此，硅橡胶的透气腔室对于使用者在细胞培养期间的透视是有益的，以供使用者从透气腔室的外部观察在透气腔室中的生长基质和培养基。可以理解的，生长基质可设置在透气腔室内的合适位置，在该位置处、生长基质可反复地浸入或暴露于透气腔室内的培养基中。

图15示出了本发明第八实施例的细胞培养装置侧视图，特别是用于密闭操作。该细胞培养装置包括具有封闭端113和第一开口端111的透气腔室101，其中，多个具有管108、108'的开口可拆卸地安装在透气腔室101的封闭端113，这些管108、108'的开口被诸如鲁尔(Leur)接头的配件109、109'封闭。生长基质支架104和生长基质105可拆卸地安装在透气腔室101的第一开口端111处，生长基质105是多孔基质的多个盘或条，例如BioNOC II载体(中国台湾CESCO Bioengineering Co.,Ltd)，其被设置在生长基质支架104中，生长基质105也可以是多孔基质片，生长基质支架104是具有顶部开口107的筐，该顶部开口107用于在操作期间转移和交换培养基和空气。

图16和图17示出了用于驱动本发明细胞培养装置旋转的第一实施例和第二实施例的装置立体图。分别在图16和图17中示出的装置202、202'包括至少一个夹具或保持器或平台203，其被设置成保持细胞培养装置，并且夹具或保持器或平台203通过轴204和轴承205被连接至马达201，马达201可以是双向步进马达。图18、图19和图20示出了如何旋转细胞培养装置的装置立体图，装置202的马达可以顺时针或逆时针缓慢地旋转直到达到180度的角度，然后以间隔时间停止并保持细胞培养装置11，定时控制器(未示出)用于控制间隔时间。然后，装置202的马达再次逆时针或顺时针缓慢旋转直到达到180度角，然后再次停止并以间隔时间保持细胞培养装置，角度并非必要达到180度，而是暴露和浸没生长基质是确定最小旋转角度的目标。

图21示出了用于驱动细胞培养装置的本发明的第三实施例的装置立体图，其中装置302包括多个夹具或保持器203，每一多个夹具或保持器203设置为保持细胞培养装置，夹具或保持器203通过轴204和轴承205、205'连接到马达201，优选地是双向步进马达。马达201顺时针或逆时针缓慢旋转直到达到180度角，然后以一定间隔停止并保持细胞培养装置。定时控制器(未示出)用于控制间隔时间。然后，马达201再次逆时针或顺时针缓慢旋转直到达到180度角，然后再次停止并以间隔时间保持细胞培养装置。角度并非必要达到180度，而是使生长基质105暴露和浸没(可参考图1)是确定最小旋转角度的目标。旋转速度为小于10每分钟转速(rpm)，或者大于0且不大于2每分钟转速(rpm)，优选为大于且不大于1每分钟转速(rpm)。直立位置和底部向下位置的间隔时间为小于60分钟，优选为10分钟。因此，装置302执行细胞培养装置的旋转过程，并且该旋转过程包括顺时针或逆时针旋转细胞培养装置，并在两个旋转步骤之间使细胞培养装置保持静止维持一时间间隔。

图22、图23和图24示出了在不同旋转状态的本发明的透气性细胞培养装置的侧视图，作为所有设计的实例，其中在培养基12中将被部分地填充在透气腔室101中，在开始时，生长基质105例如位于透气腔室101的底部并且浸没在培养基12中，当旋转透气腔室101并且生长基质105处于顶部位置时，使细胞生长基质105完全暴露出培养基12。

如图18和图22所示，在将细胞培养装置安装在驱动装置上并开始旋转之后，将透气腔室101顺时针或逆时针旋转，其中透气腔室101的一部分暴露于气相，另一部分浸没到液相的培养基12中。透气腔室101保持连续地顺时针或逆时针旋转(图23所示的中间状态)，直到生长基质105到达气体渗透性较高端的生长基质105的顶部位置(图24所示)。因此，透气腔室101从培养基中出来并暴露于气相环境。然后上下颠倒旋转透气腔室101以将生长基质105浸没在培养基12中。透气腔室101中的部分填充的培养基12可用于通过旋转部分液体填充的透气腔室101来略微去除具有气相顶部空间的液体，从而消除氧气和二氧化碳转移的边界效应。透气腔室101中的大量培养基还可以用于使生长基质105暴露于气相并提高氧气和二氧化碳的气体传输速率。通过这种特殊的设计和机理，可以进一步加快氧气和二氧化碳的传输速率，并且可以达到高密度细胞培养的效果，而无需剧烈搅拌和/或鼓泡。

图25示出了本发明第九实施例的细胞培养装置侧视图，透气腔室101可以提供狭窄部分33以用于安装用于驱动的装置202(图16所示)的夹具。附加构件34可以安装在狭窄部分33上以用于支撑。构件34可以是透明的而不妨碍可见度。在构件34上可能存在一些用于液位对准的标记35。可选地，用于液位对准的标记35可以直接附接到透气腔室101的壁的适当位置上。

图26和图27示出了组装前后的本发明第十实施例的细胞培养装置侧视图。除第九实施例中的狭窄部分33之外，透气腔室101更包括在透气腔室101的封闭端处的固定部37。此外，在透气腔室101的壁上形成有标记35，透气腔室101的壁是足够透明的以让用户能够看到透气腔室101中的培养基的水平。可以将一片生长基质105放入并透过固定部分37安装于透气腔室101中，透气腔室101底部的封闭端足够透明，以使使用者能够看到片状的生长基质105。

本发明涉及用于培养细胞和/或组织并收获由其培养的细胞产生的细胞产物的可靠、简单、廉价、一次性、无菌和有效的方法。更具体地说，本发明提供了一种新颖的方法，用于有效地培养任何细胞，无论是真核、原核、哺乳动物还是动物，其中确保细胞生长所需的氧气和营养素都容易获得而不会引起细胞损伤。此外，本发明的方法防止或大大减少了代谢产物废物的积累，避免在生长的培养物中引入剪切力，并保护细胞免于直接暴露于气泡和气体。更进一步，本发明提供了一种用于更容易和更方便的方法用于生产和收获分泌的细胞产物，例如来自细胞或组织培养物的蛋白质、抗体。

利用本发明细胞培养装置培养VERO细胞，一种用于病毒表达的常见细胞株。第一步是打开由硅橡胶制成的透气容器(总体积为60毫升(mL))的盖子，在其中装入约20片BioNOC II(约1.5毫升(mL))并固定在透气容器的底端，然后将1×10⁷数量的VERO细胞和50毫升培养基引入容器中，盖上盖子并确保其不漏气，确保在颠倒容器后将载体暴露于气态顶空，将透气性容器安装在容器上将夹子设置在设备上，将转速设置为0.3rpm，顶部间隔时间为10秒，底部间隔时间为10秒，然后开始培养。装置将透气性容器顺时针旋转0.3rpm，直到达到180度角，直到透气性容器上下颠倒并暴露出载体，然后保持10秒钟，然后设备将透气性容器逆时针旋转0.3rpm。直到达到180度角，直到透气容器直立并且载体浸没在培养基中为止，在开始另一个循环之前，在该位置再保持10秒。培养3天后，通过用取样的载体估计细胞数，细胞密度达到3.891×10⁷，培养6天后，细胞密度达到7.91×10⁷，并且在显微镜下观察时，载体充满了细胞。

上面描述的实施例仅是本发明的技术精神和特征的示例，并且旨在使本领域技术人员能够理解本发明并实践本发明，由本发明的精神做出的等同改变或修改，仍应包括在本发明的专利范围内。

Claims (17)

1.一种细胞培养装置，其特征在于，所述细胞培养装置包含：

具有至少一开口端的透气腔室以容纳培养基；

密封件，可拆卸地安装于所述开口端；以及

生长基质，设置于所述透气腔室中。

2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，其中所述密封件包含一盖及一刚性颈部或刚性管，以及该刚性颈部或该刚性管可拆卸地安装于所述开口端以与所述盖接合。

3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，其中所述生长基质是盘状、片状或条状的多孔基质。

4.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，其中所述透气腔室具有二开口端。

5.如权利要求4所述的细胞培养装置，其特征在于，其中二密封件可拆卸地分别安装于所述二开口端，以及其中所述二密封件之一包含盖或基质支架用以固定所述生长基质。

6.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，其中所述透气腔室更包含封闭端。

7.如权利要求6所述的细胞培养装置，其特征在于，其更包含筐设置于所述封闭端以固定所述生长基质。

8.如权利要求6所述的细胞培养装置，其特征在于，其中所述透气腔室更包含位于所述封闭端的固定部用于固定所述生长基质。

9.如权利要求6所述的细胞培养装置，其特征在于，其于所述封闭端还包含一开口，该开口与一管连接，其中该管通过配件关闭或打开。

10.一种用以旋转如权利要求1所述的细胞培养装置的装置，其特征在于，所述用以旋转细胞培养装置的装置包含：

马达；

保持器，用以保持所述细胞培养装置；以及

轴连接于所述马达与所述保持器之间，所述马达驱动所述轴以旋转所述细胞培养装置。

11.如权利要求10所述的装置，其特征在于，其更包含时序控制器连接于所述马达，用以控制所述细胞培养装置的旋转过程。

12.一种如权利要求1所述的细胞培养装置的培养方法，其特征在于，所述培养方法包含：

将细胞和培养基部分填充到所述透气腔室中以覆盖所述生长基质；

将所述透气腔室上下旋转，以使所述生长基质从培养基中暴露出来；以及

将所述透气腔室上下旋转，以使所述生长基质浸没在培养基中。

13.如权利要求12所述的培养方法，其特征在于，其更包括使所述透气腔室在旋转步骤之间保持静止维持时间间隔。

14.如权利要求13所述的培养方法，其特征在于，其中所述时间间隔少于60分钟。

15.如权利要求12所述的培养方法，其特征在于，其中旋转速度大于0，以及不大于2每分钟转速。

16.如权利要求12所述的培养方法，其特征在于，其中旋转速度小于10每分钟转速。

17.如权利要求12所述的培养方法，其特征在于，其中将细胞和培养基部分填充包括将细胞和培养基先混合再部分填入所述透气腔室中，或是将培养基先部分填入所述透气腔室中再将细胞放入所述透气腔室中。

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