MX2008004419A - Metodo de cultivos celulares y dispositivo para implementar este - Google Patents

Abstract

Dispositivo de cultivo celular (1) que comprende un recipiente de cultivo (2) provisto con una cubierta (19) en la cual existe una primera zona (3) para transferir medio de cultivo esencialmente libre de células, interna a una segunda zona de cultivo celular (5), una tercera (4) y una cuarta zona (6) para transferir el medio libre de cultivo esencialmente libre de células. La tercera zona (4) es interna a la segunda zona (5) y externa a la primera zona (4) y la cuarta zona (6) es una zona externa a la segunda zona (5). Todas las zonas están en comunicación de medio. El dispositivo también comprende medios de circulación del medio de cultivo, que permiten la circulación del medio de cultivo a través de la zona de cultivo (5) de arriba hacia abajo.

Description

MÉTODO DE CULTIVOS CELULARES Y DISPOSITIVO PARA IMPLEMENTAR ESTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el cultivo de células por medio de un dispositivo que comprende: recipiente de cultivo provisto con una cubierta, en el cual se sitúa al menos una primera zona y al menos una segunda zona, siendo la primera zona una zona de transferencia del medio de cultivo esencialmente libre de células y siendo la segunda zona una zona de cultivo celular, estando la primera zona integrada a la segunda, - medios para hacer circular el medio de cultivo, permitiendo la circulación del medio de cultivo a través de la zona de cultivo, comprendiendo la zona de cultivo una pared inferior y una pared superior, estando cada una provistas con orificios que permiten la transferencia de medio de cultivo esencialmente libre de células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ese dispositivo de cultivo es conocido, por ejemplo de la patente US 5 501 971 la cual describe un recipiente de cultivo en el cual se sitúa una zona de cultivo externa a un conducto de transferencia de medio interno. Las células se sitúan en la zona de cultivo externa, la cual es una clase de canasta que comprende soportes, y el medio de cultivo fluye de arriba hacia abajo a través de esta zona de cultivo. A continuación, el medio es recuperado en la parte inferior de la zona de cultivo, retirada por medio de un dispositivo de circulación de medio a través del conducto mencionado anteriormente hacia una parte superior del recipiente de cultivo y entonces pasa nuevamente a través de la zona de cultivo. La patente US 5 507 971 describe varias alternativas, pero el medio siempre pasa a través de la zona de cultivo de arriba hacia abajo. Una desventaja de ese dispositivo es que no está adaptado para todos los tipos de cultivo celular. En realidad, este dispositivo está diseñado únicamente para el cultivo celular sobre microsoportes en un lecho fijo o empaquetado, y es absolutamente inadecuado para cultivos celulares en suspensión o sobre microsoportes en un lecho fluidizado. En realidad, en un dispositivo de la patente US 5 501 971, las células en suspensión sin soporte o microsoportes o soportes no inmovilizados tienden la tendencia a sedimentar y acumularse en el fondo de la zona de cultivo puesto que se someten a gravedad y, cuando el flujo de medio a través de e'sta zona de cultivo toma el lugar de arriba hacia abajo, esta acumulación en la zona de cultivo es mayor. En consecuencia, las células se empaquetan una encima de otra y están en contacto entre sí y los nutrientes en esta zona ya no son accesibles a las células . En el reactor de la patente US 5 501 971, en el caso de cultivos, sobre soportes o microsoportes no inmovilizados, de células que son de especies frágiles que resisten poco esfuerzo, las células son sometidas al efecto de la gravedad, al flujo descendente del medio y al peso de los soportes, lo cual daña enormemente la sobrevivencia del cultivo. Además, una aplicación del cultivo en suspensión es inconcebible en el biorreactor de la patente US 5 501 971 puesto que las células en suspensión pueden bajo algunas circunstancias someterse al contacto célula a célula. En realidad, si esos contactos están presentes, las células crean enlaces de proteína entre ellas y se agregan. Esa agregación crea células muertas a través de la carencia de oxígeno y nutrientes.

LA INVENCIÓN El objetivo de la invención es mitigar las desventajas de la técnica anterior procurando un dispositivo de cultivo que haga posible cultivar tanto células en suspensión como células dependientes del anclaje sobre soportes o microsoportes, asegurando a la vez un esfuerzo mínimo sobre las células y previniendo esta acumulación de células en el fondo de la zona de cultivo. Para resolver este problema, se proporciona un dispositivo como el indicado al inicio de este texto, de acuerdo a la invención, caracterizado porque también comprende al menos una tercera y al menos una cuarta zona, siendo ambas zonas de transferencia de medio de cultivo esencialmente libre de células, siendo la tercera zona una zona interna a la segunda zona y externa a la primera zona y siendo la cuarta zona una zona externa a la segunda zona, estando la tercera zona en comunicación de medio con la primera y segunda zonas y estando la cuarta zona en comunicación de medio con la segunda zona (la zona de cultivo) y con la primera zona (la zona de transferencia de medios) vía los medios de circulación del medio de cultivo, y porque los medios de circulación del medio de cultivo permiten la circulación del medio de cultivo de abajo hacia arriba en la segunda zona de cultivo. La cuarta zona encierra de manera más particular un volumen de gas que consiste de la atmósfera ambiental del biorreactor y también puede constituir una zona de oxigenación para este medio de cultivo. En consecuencia, el medio que pasa a través de la primera zona de transferencia de medio de abajo hacia arriba alcanza la parte superior de la primera zona de transferencia de medio y se desborda hacia la tercera zona, la cual está en comunicación lineal con la primera zona, el medio influye hacia abajo, sometido al flujo impuesto por los medios de circulación, a la gravedad y al efecto de los recipientes en comunicación, pasa a través de los orificios de paso de medio en la pared inferior de la segunda zona de cultivo, a continuación se desplaza hacia arriba nuevamente hacia la parte superior de la zona de cultivo por el efecto de los recipientes en comunicación por un efecto debido a los medios de circulación de medio, o por ambos, y entonces se desborda hacia la cuarta zona de transferencia de medio, la cual está en comunicación con la primera zona de transferencia de medio vía los medios de circulación. Los medios de circulación toman una vez más el medio hacia la parte superior de la primera zona de transferencia de medio y comienza nuevamente el ciclo. En consecuencia, las células que se sitúan en la zona de cultivo desplazadas a su través de abajo hacia arriba por el medio de cultivo se benefician de un efecto de la gravedad parcialmente contrarrestado por el flujo del medio. El flujo permite una mejor dispersión de las células o sobre microsoportes en la zona de cultivo y entonces se reduce el esfuerzo peligroso. Cuando son usados los términos células sobre soportes o sobre microsoportes, debe comprenderse que los soportes pueden estar en un lecho fijo o empaquetado o en un lecho fluidizado.

De igual modo, cuando se usen los términos "cultivo celular" o "células", deberá comprenderse en particular que se requieren las células animales, ya sea para la producción viral, de proteínas u otros productos - recombinantes, metabolitos celulares, un cultivo de células tisulares (posiblemente sobre soportes tridimensionales), células no diferenciadas o bacterias o levaduras. Será fácilmente comprendido por el experto en la técnica que las células sobre soportes o microsoportes sufren menos empaquetamiento, en particular en el caso de un lecho fijo, que las células en suspensión sin soportes o sin microsoportes, pero no obstante observarán fácilmente la ventaja en la oxigenación del cultivo y en la nutrición del mismo esa dirección de flujo dentro de la zona de cultivo. En realidad, es bien sabido que el diseño de recipientes de cultivo es un paso clave en el cultivo celular. El diseño de esos debe ser tal que no existan áreas muertas, no suministradas con medio fresco, o en las cuales las células se acumulen; también es muy ventajoso que las células se encuentren en contacto directo con el medio de cultivo más que entre sí para su metabolismo de reproducción y/o producción. En consecuencia la invención proporciona un dispositivo flexible adaptado para cultivos en suspensión y cultivos sobre soportes o microsoportes, el cual permite una reducción en los esfuerzos aplicados a las células y que evita la acumulación de células en una zona particular de la zona de cultivo, reduciendo el efecto de la gravedad que es ejercido sobre las células y evitando la presencia de zonas muertas no suministradas con medio fresco o en las cuales las células puedan acumularse. Además, para la aplicación de cultivo en suspensión, el dispositivo de acuerdo a la invención permite una buena dispersión de células en virtud de, por un lado, el flujo hacia arriba y por el otro, la gravedad la cual es aún parcialmente aplicada a las células. Los términos "pared inferior provista con orificios para el paso de medio esencialmente libre de células" deberá tomarse en el sentido de una pared situada en la parte inferior de la zona de cultivo, la cual puede situarse en el fondo de la zona de cultivo o en la parte inferior de una pared vertical que delimite la zona de cultivo y que permita que el medio de cultivo pase y no las células o microsoportes o soportes aún en suspensión. De manera similar, la pared superior provista con orificios para el paso de medios esencialmente libre de células puede ser una pared situada en la parte superior de la zona de cultivo o en una parte superior de la pared vertical que delimite la zona de cultivo con características idénticas a aquellas descritas anteriormente.

Naturalmente el medio que se desborda de la primera zona hacia la tercera zona puede desbordarse sobre la parte superior de las paredes de la primera zona y de esta manera alcanzar la tercera zona o puede desbordarse vía un orificio o tubo instalado en la parte superior o inferior de la primera zona de transferencia de medio. Lo mismo se aplica al medio que se desborda de la segunda zona hacia la cuarta zona. De manera ventajosa, los medios de circulación de medios de cultivo consisten de una bomba centrífuga situada en una parte inferior del dispositivo de cultivo, que comprende al menos un dispositivo magnético que gira alrededor de un eje de rotación sustancialmente central (real o virtual) , al menos una entrada y al menos una salida para al medio de cultivo, siendo los medios de cultivo proporcionados para succionar el medio en un sifón creado por una rotación del dispositivo magnético y para impulsar el medio hacia la descarga del medio de cultivo colocada en una zona externa al dispositivo magnético y en esa bomba centrífuga es accionado por un motor magnético giratorio proporcionado para efectuar una circulación del medio sin comunicación con el exterior del dispositivo, y al menos un dispositivo guía, diseñado para guiar el medio de cultivo impulsado a través de la salida hacia la parte superior del recipiente.

Una desventaja del biorreactor convencional existente es que está provisto con un sistema de agitación de paletas o tornillo para proporcionar la homogenización del medio de cultivo dentro del recipiente de cultivo sin necesariamente proporcionar una circulación adecuada. En este caso, el biorreactor comprende un eje provisto con revestimientos mecánicos frágiles dobles, por ejemplo hechos de carburo de silicio caro y que pasa a través de la cubierta del biorreactor. Este paso a través de la cubierta del biorreactor es un riesgo serio de contaminación y un riesgo significativo de fallas. Otros tipos de biorreactor comprenden una circulación externa del medio de cultivo. El medio pasa a través de un tubo a través de una bomba peristáltica o un sistema similar. Obviamente, esta solución, aunque evita parcialmente contaminadores directos, tiene otra desventaja. No es aplicable a cultivos de vida prolongada. En realidad, los tubos usados en este tipo de bomba son sometidos a desgaste durante cultivos de vida prolongada, lo cual también implica problemas de sellado y contaminación . El medio de circulación como se describió anteriormente también da lugar a la dificultad técnica de lograr un efecto de "fuente". Por lo tanto no es suficiente hacer que el líquido fluya a través de la zona de cultivo a una caída de presión muy baja, también es necesario mantener una diferencia en el nivel dentro del recipiente de cultivo simultáneamente. En realidad, llevar el líquido hacia la parte superior de la primera zona de transferencia de medio es un pase clave, pero también asegurar que el medio no se acumule excesivamente en el fondo de la cuarta zona también. Si el medio de cultivo se acumula en el fondo de la cuarta zona de cultivo, el efecto de desbordamiento se reducirá y la circulación cíclica del medio de la primera zona de transferencia del medio a la tercera zona de transferencia de medio y entonces hacia la segunda zona de cultivo y finalmente hacia la cuarta zona de transferencia de medio no será óptima. En consecuencia, los medios de circulación de acuerdo a la invención, comprenderán un dispositivo magnético que gire alrededor de un eje de rotación sustancialmente central, y una entrada y salida del medio de cultivo. Para cultivos a pequeña escala, el dispositivo magnético será por ejemplo una barra magnética simple, accionada por un imán externo, que da velocidades de flujo de 0.6 a 6 1/min (es decir de 1 a 10 ml/seg). Debido a esto, no existe riesgo de contaminación puesto que el sistema de circulación de medio no se comunica con el exterior sino que es accionado por un dispositivo externo o recipiente de cultivo. También puede ser contemplada una bomba peristáltica de acuerdo a la invención, pero preferiblemente para cultivos de corta duración. Para cultivos a gran escala, el dispositivo magnético será un rotor magnetizado con una velocidad de flujo de entre por ejemplo 10 y 200 1/min, en particular de 20 a 150 1/min y preferiblemente de 25 a 100 ml/min. En una modalidad particular, el dispositivo de acuerdo a la invención comprende una serie de módulos, comprendiendo cada módulo la primera zona, la segunda zona, y la cuarta zona, y en el cual los módulos adyacentes tienen una serie de módulos que están en comunicación del medio, estando la primera zona y la cuarta zona en comunicación con los medios de circulación, directa o indirectamente. Esta modalidad hace posible obtener un dispositivo particularmente flexible y permite un incremento en el escalamiento hasta un volumen de 100 litros. Generalmente, el escalamiento es un paso complejo en la producción de productos recombinantes, virus, metabolitos celulares u otros en el cultivo de células puesto que el escalamiento generalmente da lugar a problemas como zonas suministradas de manera mediocre, ya sea con oxígeno o con nutrientes. En la modalidad descrita anteriormente, el dispositivo de cultivo comprende una serie de módulos adyacentes, por ejemplo apilados y yuxtapuestos. De la cuarta zona del módulo de cultivo, el medio de cultivo alcanza los medios de circulación de medio pasando a través de los otros módulos de cultivo. La invención contempla varios tipos de módulos de volumen predeterminado. Por ejemplo, módulos de 500 ml o 5 litros, que tienen un volumen de 500 ml a 5 litros, incluyendo todos los volúmenes comprendidos dentro del intervalo o marco de alcance. En consecuencia, para un cultivo de 3 litros, serán usados 6 módulos de 500 ml . Por ejemplo, seis módulos serán apilados en un recipiente suficientemente grande o por medios de módulos que puedan ser interconectados para formar el recipiente. En el caso del rector del documento US 5 501 971, si se requiere un volumen de cultivo de 3 litros, será necesaria una zona de cultivo de altura H. El medio que alcance el fondo de la zona de cultivo en esta patente está particularmente agotado, en particular con respecto al oxígeno. Además, los autores de la patente US 5 501 971 contemplan colocar un detector de oxígeno en la parte superior de la zona de cultivo y en el fondo de esta última y sobrealimentan el ambiente del reactor con oxígeno. Desafortunadamente este tipo de sobreoxigenación no es absolutamente recomendable puesto que produce una oxidación de los componentes celulares de las células de la parte superior de la zona de cultivo y conlleva la muerte celular. Además, cuando los autores de la patente 5 501 971 contemplan el escalamiento ascendente, este es en términos del ancho que se lleva a cabo puesto que los términos de altura no son ya posibles. De manera natural, el espacio ocupado sobre el piso se vuelve rápidamente incontrolable. Como es sabido por el experto en la técnica, el espacio de piso es un parámetro crítico, especialmente en salas blancas donde las eficiencias se calculan de acuerdo al volumen de aire a ser tratado para obtener aire estéril, siendo su tipo de tratamiento muy caro. El volumen de aire a ser tratado es obtenido multiplicando por la altura de la "sala blanca" la superficie del piso ocupado por el biorreactor, su equipo, y las personas que manejen el dispositivo de cultivo. En consecuencia, a través del uso de módulos apilados o yuxtapuestos, de acuerdo a los rendimientos a ser logrados, el espacio de piso se reduce. Además, el volumen de cultivo a través del cual el medio de cultivo debe perforar antes de estar nuevamente en contacto con el aire del ambiente del biorreactor se reduce apreciablémente. En el caso de nuestro ejemplo previo, el volumen se divide en 6. De acuerdo a una modalidad ventajosa, se proporciona también un diseño de recipiente de cultivo vacío, que puede ser colocado en un alto clave, con una altura predeterminada (hecho de vidrio o acero inoxidable) o un recipiente de cultivo desechable vacío, que comprende, los medios de circulación de medio en el fondo del recipiente. Será suficiente colocar un número N de módulos requeridos del recipiente por encima de los medios de circulación de medios y cerrar el recipiente nuevamente por medio de una cubierta adaptada. En este caso, si para un cultivo de 5 litros o 50 litros, el tamaño del recipiente sigue siendo el mismo. Esta modalidad puede ser particularmente ventajosa para laboratorios que tengan pocos medios puesto que es particularmente barata. En realidad, si el recipiente suministrado es diseñado para un cultivo de 35 litros y se requiere un cultivo de solo 5 litros o 10 litros, es suficiente colocar, por ejemplo encima de los medios de circulación del medio de cultivo, uno o más módulos de cultivo de 5 litros. Esto reduce particularmente la cantidad de inversión puesto que la parte cara siempre sigue siendo la misma para cualquier cultivo de 5 a 35 litros . Además, si ' para un cultivo d 5 litros o 35 litros o aún más, la superficie del piso será la misma, y el escalamiento no implica ningún volumen mayor de aire a ser tratado. Además, a través del hecho de que el medio está, entre cada paso en un módulo, en contacto con un aire del ambiente en el reactor, el problema de escalamiento se reduce en gran medida. Como se mencionó previamente los medios de circulación del medio son particularmente efectivos para cubrir intervalos de valores adaptados al dispositivo de acuerdo a la invención. En consecuencia, la velocidad de flujo en cada módulo es idéntica y, a nivel producido, el incremento en la escala tampoco es un problema de acuerdo a la invención. En una modalidad particularmente ventajosa, los medios de circulación se confinan en un módulo base, estando el módulo base en comunicación de medio con al menos una primera zona de transferencia de medio y al menos una cuarta zona de transferencia de medio, directa o indirectamente . Puesto que los medios de circulación de medio son con frecuencia zonas que presentan riesgo de contaminación cruzada o contaminación externa a través de la presencia de algunas zonas no accesibles para la limpieza, procurar un módulo base que pueda por ejemplo, sin limitarse sin embargo a esto, ser insertado en un recipiente de vidrio simple es particularmente ventajoso. Este módulo base se adaptada a los módulos de cultivo, permitiendo la comunicación de medio entre la primera área de transferencia de medio de todos los módulos presentes en la salida de medio de los medios de circulación de medio y permitiendo la comunicación de medio entre todas las cuartas zonas de todos los módulos de cultivo presentes y la entrada de medio de cultivo hacia los medios de circulación de medio, directa o indirectamente, es decir, pasando a través de otro módulo o no. El dispositivo preferiblemente también comprende un módulo superior, comprendiendo el módulo superior al menos una cubierta. Este módulo superior puede ser diseñado para cerrar la superposición mencionada anteriormente. En una modalidad ventajosa, al menos una cuarta zona comprende al menos una pared de flujo sustancialmente vertical o inclinada. La presencia de esta pared de flujo reduce la formación de espuma que aparecerá durante el desbordamiento de la segunda zona de cultivo hacia la cuarta zona de transferencia de medio. En realidad, sin esta pared de flujo, el flujo de medio de la segunda a la cuarta zona sería un flujo turbulento, lo cual necesariamente tendría como consecuencia una formación indeseable de espuma. Deberá establecerse que la formación de espuma es un problema mayor en muchos métodos de cultivo puesto que el medio de cultivo es rico en proteína. Agitar un fluido rico en proteína siempre causa la aparición de espuma. En consecuencia, un flujo turbulento tendría esta misma consecuencia, y esto es por lo que, de manera ventajosa, la invención comprende la pared de flujo para reducir la turbulencia de flujo. Además, esta cuarta zona de transferencia de medio es también una zona en la cual el medio está en contacto con la atmósfera del ambiente del dispositivo de acuerdo a la invención. La presencia de la pared de flujo mejora este contacto y por lo tanto el intercambio de oxígeno entre la atmósfera del ambiente y el medio de cultivo, incrementando el área superficial de contacto gas-líquido. De manera ventajosa, para estabilizar la película, también es posible agregar aditivos al medio de cultivo para modificar las propiedades reológicas del agua como los aditivos incluidos en el grupo que consiste de tensoactivos, Pluronic F68, glicerina, amonios cuaternarios y cualesquier otros aditivos para modificar las propiedades reológicas del medio de cultivo. En una modalidad particularmente preferida, la pared de flujo esencialmente vertical o inclinada comprende una membrana hidrofílica. En realidad, si la pared de flujo no es o no comprende una superficie hidrofílica, puede ser muy difícil obtener una película de medio sobre esta superficie. Además, la película, cuando se forma sobre una pared convencional, es inestable. En consecuencia, cubriendo la pared de flujo con una membrana hidrofílica que juegue el papel de una esponja, el medio se dispersa naturalmente y fluye uniformemente. En consecuencia, la superficie de contacto entre la película de medio y la atmósfera ambiente mejora en gran medida, lo cual permite la oxigenación compatible con altas densidades celulares. Los coeficientes de transferencia total de oxígeno obtenidos son de aproximadamente 10"3 a aproximadamente 10~2s"1. Si, en la modalidad con módulos de cultivo, algunas o todas de las cuartas zonas comprenden una pared de flujo con una membrana hidrofílica, los intercambios gas-líquido mejoran aún más. En consecuencia, aún el último módulo en la serie es suministrado con un medio oxigenado. En algunos casos de la técnica anterior con circulación de medio, cuando es producido con cultivo, por ejemplo con un volumen de 200 litros, las células en el extremo del medio de circulación son relativamente no suministradas y el crecimiento celular no es homogéneo en el biorreactor. En el dispositivo de acuerdo a la invención, este no es el caso; no existen zonas no suministradas o muertas. En una modalidad ventajosa, el dispositivo de acuerdo a la invención comprende al menos un dispositivo de entrada de gas y un orificio de salida de gas. El recipiente de cultivo preferiblemente comprende al menos un orificio de entrada de gas y un orificio de salida de gas. De esta manera, es posible enriquecer la atmósfera del ambiente del dispositivo de acuerdo a la invención con oxígeno, por ejemplo, puesto que el oxígeno es consumido por las células. También es posible suministrar al ambiente de la atmósfera con otros gases, por ejemplo agregando C02 para modificar el pH, o cualesquier otros gases usados de manera general en cultivos celulares. El orificio de salida hace posible evitar excesos de presión y descargar el gas con un bajo contenido de oxígeno o simplemente parte del gas de la atmósfera ambiental para reducir la presión ambiente del dispositivo de acuerdo a la invención. También, se hacen provisiones para poder cerrar o "estrangular" esta salida de gas en el caso donde sea deseable una ligera sobrepresión. La entrada de gas puede ser colocada o conectada a la primera, a la segunda, a la tercera o a la cuarta zona del recipiente de cultivo. Siendo la primera y cuarta zonas las preferidas. La tercera zona de transferencia de medio no es muy accesible para contactos gas-líquido y la segunda' zona del recipiente de cultivo es el recipiente de cultivo celular, en el cual el contacto directo gas-líquido podría presentar riesgo de oxidación de los componentes celulares, lo cual no es deseable. De manera ventajosa, el orificio de entrada de gas está conectado a al menos una cuarta zona de transferencia de medio. Debido a que la cuarta zona de transferencia de medio también sirve como una zona de oxigenación puesto que es en esta última que los contactos gas-líquido son mayores, con o sin una pared de flujo, es ventajoso que esta sea la última que reciba directamente la adición de gas fresco para promover la oxigenación del medio. Además, el medio de cultivo que se desborda hacia esta cuarta zona es el medio usado por la células, y por lo tanto parte del oxígeno es consumido, también puede ser necesaria una modificación al pH y por lo tanto una ventaja que el gas (oxígeno, aire, C02 u otros) entre a través de esta cuarta zona de cultivo para incrementar la eficiencia de cualquier regulación u oxigenación o modificación de pH. En una modalidad particular, la entrada de gas se conecta a un tubo de rocío. La invención, en una modalidad particular, proporciona una dispersión de burbujas de gas a efectuarse dentro del dispositivo de acuerdo a la invención. La dispersión de burbujas puede ser afectada por un dispositivo de rocío inmerso en el medio de cultivo en la primera, segunda, tercera y cuarta zonas de transferencia de medio (burbujas grandes o microburbujas, de acuerdo a la aplicación). La dispersión de burbujas será efectuada preferiblemente por un dispositivo de rocío inmerso en el medio de cultivo en la primera o cuarta zonas de transferencia de medio. En una modalidad particular, la cubierta del recipiente de cultivo se conecta a al menos parte de la pared superior de al menos una segunda zona de cultivo. Esta modalidad particularmente preferida permite la toma simplificada de muestras, lo cual minimiza riesgos de contaminación. Particularmente durante el cultivo sobre microsoportes, la toma de muestras no es en gran medida un paso sin ningún riesgo. Para medir la densidad celular, hasta ahora existen solo unos cuantos medios, los cuales también no son muy confiables y tediosos. En consecuencia los mejores medios para medir la densidad celular es muestrear soportes y observarlos bajo el microscopio, posiblemente después de una coloración. En realidad, en biorreactores convencionales, y en particular el biorreactor de la patente US 5 501 971, tomar muestras es imposible debido a que la pared superior de la zona de cultivo no puede ser abierta simplemente o representa un serio riesgo de contaminación. En realidad, el usuario deberá abrir la cubierta del recipiente de cultivo, la cual con frecuencia es voluminosa y pesada y por lo tanto difícil de mover en un flujo estéril, y entonces sujeta la cubierta, generalmente fija a una paleta u otro dispositivo para elevar el medio y por lo tanto pesado y voluminoso y se asegurará de que no toque nada y la sujete en una mano para no contaminar esta. A continuación, con la ' otra mano, debe abrir la pared superior de la zona de cultivo y mantener esta en la otra mano. Entonces, por medio de una pinza o una tercera mano, el debe muestrear uno o más soportes para poder evaluar la densidad celular. Esto requiere la presencia de un segundo usuario o habilidad impresionante. La invención simplifica de manera general este paso de toma de muestras procurando una cubierta fija a la pared superior de la zona de cultivo; todo lo que se necesita hacer entonces es levantar ligeramente la cubierta, elevando la pared superior de la zona de cultivo simultáneamente, e introducir una pinza estéril o una herramienta de muestreo como una pipeta o similar, para muestrear uno o más soportes para evaluar la densidad celular. El riesgo de tocar un objeto no estéril y el riesgo de contaminación se reducen en gran medida. De manera ventajosa, en ciertas modalidades, el dispositivo de acuerdo a la invención también comprende medios de calentamiento, diseñados para calentar el medio de cultivo transferido. Esos medios de calentamiento pueden situarse, de manera ventajosa, en la cuarta área de transferencia de medio o en los medios de circulación de medio. Naturalmente, la primera zona también puede comprender estos medios de calentamiento. Los medios de calentamiento pueden ser un elemento eléctrico, una bobina eléctrica o cualesquier otros medios de calentamiento generalmente usados en el campo del cultivo celular, como por ejemplo una camisa doble controlada termostáticamente . En realidad, durante un cultivo a escala grande o muy grande, no siempre es fácil colocar el dispositivo de acuerdo a la invención en un dispositivo o sala controlada termostáticamente. En consecuencia, la invención resuelve este problema colocando directamente medios de calentamiento para controlar el medio de cultivo termostáticamente y también dar una temperatura uniforme a través del recipiente de cultivo. Preferiblemente, el dispositivo de acuerdo a la invención proporciona un calentamiento del medio sin ningún punto de sobrecalentamiento . En ciertas modalidades, el dispositivo de acuerdo a la invención comprende detectores para medir los parámetros de cultivo, estando los detectores en contacto con los medios de cultivo. Los parámetros de cultivo significan, entre otras cosas, la presión parcial del oxígeno disuelto, el pH, la temperatura, la densidad óptica, ciertas concentraciones de nutrientes, como lactato, amonio, carbonatos, .glucosa o cualquier producto metabólico o producto a ser metabolizado que pudiera por ejemplo reflejar la densidad celular. También se contempló de acuerdo a la invención usar circuitos de regulación de acuerdo a esos parámetros. Esos circuitos de regulación modulan bien por ejemplo, la cantidad de oxígeno a ser inyectada en la atmósfera gaseosa de acuerdo al valor de la presión parcial de oxígeno disuelto presente o la cantidad de oxígeno disuelto consumido por las células. Podría inyectase C02 de acuerdo al valor del pH obtenido por los detectores o cualquier otro tipo de regulación generalmente usada en este tipo de cultivo. Los detectores se arreglan preferiblemente en una parte inferior de al menos una cuarta zona. La cuarta zona de transferencia del medio es una zona preferible para la colocación de los detectores puesto que los valores obtenidos por estos últimos son claramente representativos del consumo celular puesto que esta zona tiene el medio que proviene de la zona de cultivo que pasa a través de ésta. De manera ventajosa, los detectores son detectores ópticos desechables, proporcionados para transmitir una señal óptica que representa los parámetros a ser medidos a través del recipiente de cultivo a un receptor de señales ópticas, externo al dispositivo. En una modalidad particularmente preferida, el dispositivo de acuerdo a la presente invención comprende una serie de módulos, cada módulo de cultivo comprende en su parte superior primeros medios de fijación y en su parte inferior segundos medios de fijación, en los cuales el módulo base también comprende en una parte superior primeros medios de fijación y el módulo superior también comprende en su parte inferior segundos medios de fijación, siendo los primeros medios de fijación y los segundos medios de fijación complementarios a los medios de fijación para producir una secuencia apilada de la parte inferior a la parte superior de un módulo base, al menos un módulo de cultivo y un módulo superior. De manera ventajosa, el primero y segundo medios de fijación comprenden medios para producir la secuencia apilada en una forma hermética a los gases y líquidos. En realidad, de acuerdo a la invención, es posible diseñar una serie de módulos, donde la pared de cada módulo constituye a parte de la pared del recipiente de cultivo. A continuación, es suficiente montar esta serie de módulos de cultivo con un módulo base que comprenda los medios de circulación de un módulo superior que comprenda la cubierta. El montaje formado por esos módulos constituiría entonces el dispositivo de cultivo. De acuerdo al volumen de cultivo necesario, un número N de módulos se colocarían juntos para construir el dispositivo de cultivo propio con una altura H. En una modalidad muy particular, el dispositivo de acuerdo a la invención es un dispositivo desechable. Actualmente existe una cantidad de biorreactores los cuales dan excelentes resultados de cultivo celular a escala pequeña y grande. Desafortunadamente, esos biorreactores son caros en términos de limpieza, esterilización, trabajo, ubicación y espacio ocupados. En realidad, en particular, para la producción de lotes clínicos de productos de interés farmacéutico, es esencial que los biorreactores sean colocados en salas blancas estériles. Un biorreactor de 500 litros ocupa más de veinte veces su volumen en una sala blanca. El criterio de la sala blanca es el volumen usado por la instalación, es decir, si la instalación ocupa 1 m2 de superficie de piso, el volumen de aire a ser tratado será (1 m2 más el área de superficie necesaria para el usuario) multiplicada por la altura de la sala blanca puesto que el volumen de aire por encima de la superficie del piso también es tratada. Además, los protocolos de esterilización como asepsia, lavado, sanitización, etc., los cuales son pasos requeridos para un biorreactor y para la sala ocupada, son protocolos extensos y tediosos los cuales imponen enormes costos ambos con respecto al trabajo e instalación de los productos. Es por esto, principalmente en laboratorios farmacéuticos, biológicos y bioquímicos y en salas blancas, que se está incrementando cada vez más hoy en día el uso de equipo desechable, generalmente menos voluminoso, que no requiere limpieza, sanitización, esterilización y asepsia. Existen solución alternativas de los biorreactores convencionales reutilizables, por ejemplo se conoce el cultivo en un recipiente estéril desechable el cual es agitado por una placa de agitación que reproduce un movimiento ondular, por ejemplo el biorreactor WAVE® desafortunadamente, ese biorreactor presenta el problema de escalamiento puesto que un recipiente de 500 litros, para que pueda ser dimensionada la placa de agitación, tiene una enorme superficie de piso la cual tiene un costo de tratamiento del aire de la sala blanca que es imposible de asumir, sin mencionar la dificultad de manejar esos recipientes, tomar muestras y colocar detectores de los parámetros de cultivo. Existen otras soluciones, como matraces desechables con agitación conocidos como "centrífugas". El escalamiento de esos matraces también es imposible y los matraces tienen una baja transferencia de oxígeno así como esfuerzo sobre las células durante la agitación. También existe el cultivo en un sistema CELLCUBE® o CELLFACTORY®. Ese sistema es difícil de regular y es voluminoso. Además, las transferencias de oxígeno son pobres y requieren incubadores de gran tamaño. Una vez más, el escalamiento es tedioso. También se conoce el sistema BELLOCELL®. Este sistema se basa en inmovilizar células en una matriz porosa, las cuales se empaquetan en una zona de cultivo. El medio es una zona inferior provista con fuelles compresibles. El medio sube y baja alternativamente para sumergir las matrices en el medio y entonces exponerlas al aire del ambiente. Desafortunadamente, el escalamiento de este sistema también es difícil. Es difícil regular y medir los parámetros de cultivo. Además, las células experimentan esfuerzos de tensión sobre su superficie, siendo expuestas primero que todo a un borde de medio descendente, secado, y entonces un borde de medio ascendente, lo cual es dañino para su crecimiento. En resumen, actualmente no existe un sistema de cultivo celular desechado adaptado para cultivo a escala grande y pequeña que sea fácil de usar, tanto en una sala blanca como en el laboratorio.

La invención por lo tanto procura una solución muy innovadora la cual resuelve una mayor parte de esas desventajas procurando un sistema inesperado, aplicable a escala pequeña y grande, adecuada para cultivar en suspensión, sobre soportes o sobre microsoportes, la agitación del cual da homogeneidad en el medio del cultivo sin zonas muertas ni zonas de acumulación de células. Además, los riesgos de contaminación debido a la ausencia de un eje central son particularmente bajos, o aún inexistentes. En efecto, el dispositivo de acuerdo a la invención es un dispositivo el cual presenta todas las ventajas de los biorreactores convencionales, como se mencionó aquí anteriormente, aunque son desechables. El dispositivo de acuerdo a la invención se agita magnéticamente por medio de medios de circulación basados en una bomba centrífuga, los cuales no tienen ningún contacto con el exterior. Los medios de calentamiento, por ejemplo, una bobina eléctrica, también dan un calentamiento homogéneo del medio sin tener contacto con el exterior. Además, como se mencionó anteriormente, en una forma particularmente preferida, el dispositivo de cultivo de' acuerdo a 'la invención comprende detectores los cuales son detectores ópticos desechables, diseñados para transmitir una señal óptica que representa el parámetro a ser medido a través del recipiente de cultivo a un receptor de señales ópticas, externo al dispositivo. En consecuencia, los parámetros de cultivo también se miden a través de una pared del dispositivo de acuerdo a la invención y no implica ningún contacto con el exterior, a diferencia del oxígeno disuelto o las sondas de pH que pasan a través de la cubierta de los biorreactores clásicos, que presentan un riesgo de pobre limpieza en esos orificios de paso de la zona y de contaminación a través de la ausencia de un sello. Los detectores pueden situarse en la parte inferior del dispositivo de acuerdo a la invención o en la parte superior o ambas. Cuando los detectores están presentes en las partes superior e inferior, esto hace posible, por una operación de la diferencia matemática simple, a o nada o no con el número de células, hacer una medición continúa de la respiración de la célula. Otras modalidades del dispositivo se indican en las reivindicaciones acompañantes. Otro objetivo de la invención es el uso del dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención para cultivo celular en suspensión sobre microsoportes o soportes. En realidad, cuándo el dispositivo de acuerdo a la invención es usado en cultivo en soportes o microsoportes, los soportes o microsoportes son confinados en la segunda zona de cultivo. Cuando el dispositivo es usado para el cultivo celular en suspensión, y por lo tanto sin soportes o microsoportes, la pared provista con un orificio es una membrana permeable al medio pero no permeable a las células. El tamaño de los poros de esta membrana es una función de todos los tamaños. La invención también se relaciona con el uso del dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención para producir productos recombinantes, virus, metabolitos y similares. Productos recombinantes significa proteínas de interés para investigación en el sector farmacéutico, moléculas terapéuticas o profilácticas, anticuerpos, plásmidos o cualquier otra molécula que pueda ser producida por células en cultivo, ya sea que esta sea una producción por secreción o producción intracelular. La invención también se relaciona con un método de cultivo de células en un recipiente de cultivo con circulación del medio de cultivo, que comprende: - introducción de medio de cultivo en medios de circulación del medio de cultivo, - descarga del medio de cultivo de los medios de circulación del medio de cultivo, - al menos una primera transferencia del medio de cultivo a una primera zona de transferencia hacia arriba del medio de cultivo, - al menos una segunda transferencia del medio de cultivo hacia la segunda zona de cultivo celular. Este método se caracteriza porque comprende también: - al menos una tercera transferencia del medio de cultivo después de la primera transferencia del medio de cultivo en una tercera zona de transferencia del medio de cultivo, por desbordamiento de la primera zona de transferencia de medio de cultivo a la tercera zona de transferencia de medio de cultivo, - al menos una cuarta transferencia del medio de cultivo posterior a la segunda transferencia del medio de cultivo en una cuarta zona de transferencia del medio de cultivo, por desbordamiento de la segunda zona de cultivo en la cuarta zona de transferencia de medio de cultivo, y porque la segunda transferencia de medio de cultivo es una transferencia de medio de cultivo hacia abajo. Como se mencionó anteriormente, a diferencia del método de cultivo de la patente US 5 501 971, el medio de cultivo se desplaza a través de la zona de cultivo hacia arriba, lo cual evita la acumulación de células en el fondo de la zona de cultivo y reduce las fuerzas de presión sobre las células. El método de cultivo de acuerdo a la invención es por lo tanto un método particularmente innovador, el cual permite cultivar sin una zona muerta y sin algún lugar donde las células se acumulen permitiendo a la vez cultivar a una muy alta eficiencia. De manera ventajosa, el método también comprende la oxigenación del medio de cultivo durante una o más de las transferencias. La oxigenación preferiblemente ocurre a través de un contacto gas líquido directo durante una o más de las transferencias . En una modalidad particular, el oxígeno es acarreado durante la cuarta transferencia del medio de cultivo, siendo la cuarta transferencia del medio de cultivo un flujo del medio de cultivo a lo largo de una pared de flujo. En una modalidad ventajosa, el método para estabilizar la película, proporciona la adición de aditivos al medio de cultivo para modificar las propiedades reológicas del agua como los aditivos incluidos en el grupo que consiste de tensoactivos, Pluronic F68, glicerina, amonios cuaternarios, y otros aditivos para modificar las propiedades reológicas del medio de cultivo. También, de manera ventajosa, el flujo del medio de cultivo es un flujo a lo largo de una pared hidrofílica. Otras modalidades del método de acuerdo a la invención se indican en las reivindicaciones acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras características, ventajas y detalles de la invención se volverán más claros a la luz de la siguiente descripción, de una modalidad particular no limitante de la invención, aunque refiriéndose a la vez a las figuras 1 a acompañantes. La Figura 1 es un diagrama que esboza un dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención. La Figura 2 es un diagrama que esboza una variante de los medios de circulación de medios. La Figura 3 es un diagrama que esboza un dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención que comprende varias zonas de cultivo sucesivas, particularmente adaptadas para el escalamiento. La Figura 4 ilustra una variante altamente esquemática de la Figura 3. La Figura 5 es un corte transversal de una parte inferior del módulo base que confina los medios de circulación de medio de una modalidad preferida del dispositivo de acuerdo a la invención. La Figura 6 es una vista desde arriba de la parte inferior del módulo base que confina los medios de circulación de medio como se ilustra en la Figura 5. La Figura 7 es un corte transversal de una parte superior del módulo base que confina los medios de circulación de la misma modalidad preferida del dispositivo de acuerdo a la invención. La Figura 8 es una vista desde arriba de una parte superior del módulo base que confina los medios de circulación del dispositivo como se ilustra en la Figura 7. La Figura 9 es un corte transversal de un dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención producido por un montaje de módulos, en particular módulos desechables. La Figura 10 es una vista del despiece de la Figura 9.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN En las figuras 1 a 10, el mismo o un signo de referencia similar ha sido asignado al mismo o un elemento análogo. Como puede observarse en la Figura 1, el dispositivo de cultivo 1 comprende un recipiente de cultivo sustancialmente vertical y cilindrico 2, aunque también pueden ser contempladas otras formas de acuerdo a la invención, por ejemplo cualquier forma prismática, preferiblemente regular. El recipiente de cultivo comprende al menos cuatro zonas en comunicación entre sí. Del centro del recipiente hacia el exterior, el recipiente comprende una primera zona 3, una tercera zona 4a, 4b, una segunda zona 5 y una cuarta zona 6. La zona que comprende células ha sido rayada y comprende la letra C mientras que el medio es mostrado por la letra M. El recipiente de cultivo 2 comprende medios de circulación de medio en su parte inferior. Los medios de circulación de medio están, en esta modalidad preferida, compuestos de un dispositivo magnético 7, por ejemplo una barra magnética 7 que gira alrededor de un eje de rotación central 8, real o virtual, un primer extremo el cual se aloja en medios de acoplamiento superiores 9 y un segundo extremo del cual se aloja en medios de acoplamiento inferiores 10. La barra magnética es impulsada por un motor de accionamiento magnético giratorio externo al recipiente de cultivo 2 y el cual no se muestra aquí. Los medios de circulación comprenden al menos una entrada de medio 11. La entrada de medio 11 comprende al menos un primer extremo, el cual finaliza en un deflector de desviación 12 para el flujo de medio. La barra magnética funciona como una bomba centrífuga, es decir que el medio succionado hacia una zona relativamente central por el movimiento del medio creado por la barra y el medio es impulsado hacia fuera con respecto al punto central. El deflector de desviación de medio 12 guía un medio en la zona relativamente central de la barra, de modo que el medio sea succionado ahí y entonces impulsado hacia fuera. De manera ventajosa, las entradas están en el mismo plano (configuración en estrella) y el número de entradas 11 será un número tal que sus posiciones exhiban simetría. De manera más particular, si se consideran tres entradas, es ventajoso para ellas que cada una esté separada entre sí por un ángulo de aproximadamente 120°, si el número de entradas es igual a 4, las entradas estarán separadas entre sí por un ángulo sustancialmente equivalente a 90°. Si el número de entradas es igual a 10, las entradas serán colocadas con un ángulo de separación aproximadamente igual a 36°. Los medios de circulación de medio también comprenden al menos una salida de medio 13. La salida de medio 13 se sitúa, de manera ventajosa en el punto donde el medio es impulsado por el efecto centrífugo de la barra magnética . De manera ventajosa, el número de salidas 13 será un número tal que sus posiciones exhibirán simetría. De manera más particular, si se consideran tres salidas es ventajoso que cada una de ellas esté separada entre sí por un ángulo de aproximadamente 120°. Si el número de salidas es igual a cuatro, las salidas estarán separadas entre sí por un ángulo sustancialmente equivalente a 90°, si el número de salidas es igual a 10, las salidas serán depositadas con un ángulo de separación de aproximadamente 36°. Preferiblemente, las salidas no se sitúan en el mismo plano horizontal que las entradas. La parte inferior del recipiente de cultivo comprende al menos un medio guía de medio 14, adyacente a al menos una salida 13, los cuales guían el medio de cultivo impulsado hacia la parte superior del recipiente de cultivo 2. La primera zona 3 del recipiente de cultivo 2 es una zona sustancialmente central y es una zona de transferencia de medio. La primera zona 3 comprende una parte basal 3a y una parte cilindrica 3b. El diámetro de la parte basal 3a es menor que el diámetro del recipiente de cultivo 2. La parte basal 3a está en comunicación de medio con al menos una salida de medio 13 de los medios de circulación de medio. La parte basal 3a está reducida en la parte superior de la primera zona 3 hacia un cilindro 3b, un diámetro menor que el de la parte basal 3a. La parte cilindrica superior 3b comprende una pared externa y está en comunicación directa de medio con la parte basal 3a de la primera zona de transferencia de medio. La tercera zona 4 es una zona de transferencia de medio, externa a la primera zona de transferencia de medio 3. La tercera zona también comprende una parte sustancialmente basal 4a (en forma de un manguito) y una parte superior sustancialmente cilindrica 4b. La parte sustancialmente cilindrica 4b de la tercera zona de transferencia de medio 4 es esencialmente concéntrica con la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3 y esas dos partes están en comunicación de medio. La comunicación de medio se logra por medio de un orificio o un tubo, por desbordamiento (como se muestra en la Figura 1) o cualesquier otros medios posibles para lograr esta comunicación. La segunda zona 5 es una zona de cultivo celular, con o sin soportes o microsoportes. La segunda zona 5 está también en forma de un manguito, en el centro del cual se encuentran la primera y tercera zonas de transferencia de medio 3 y . La segunda zona 5 comprende una pared inferior 15 y una pared superior 16, estando provista cada pared 15 y 16 con orificios 17 que permiten la transferencia de un medio de cultivo esencialmente libre de células. La segunda zona de cultivo 5 está en comunicación de medio con la parte relativamente basal 4a de la tercera zona de transferencia de medio 4 por medio de orificios 17 en la pared inferior 15 que permiten que pase el medio. La cuarta zona 6 es una zona de transferencia de medio, externa a la segunda zona de cultivo 5 pero interna al recipiente de cultivo 2. La cuarta zona 6 está en comunicación de medio con la segunda zona de cultivo 5. También está en comunicación de medio con los medios de circulación de medio, vía al menos una entrada 11. La comunicación de medio se logra por medio de un orificio o un tubo, por desbordamiento o por cualesquier otros medios posibles para lograr esta comunicación. La modalidad particular descrita aquí comprende un recipiente de cultivo sustancialmente cilindrico, pero también pueden ser contempladas otras modalidades, como se mencionó anteriormente, por ejemplo un recipiente sustancialmente prismático, preferiblemente regular. Obviamente, este es también el caso con las diferentes zonas de transferencia de medio y cultivo. Ellas también pueden ser prismáticas, preferiblemente regulares, siendo posible cualquier combinación de formas. En este caso, el término manguito debe ser contemplado como una envoltura con una sección transversal similar a la sección transversal del prisma contemplado. Cuando los medios de circulación de medio estén en operación, el medio los abandona a través de al menos una salida 13, cuando existen varias de ellas, a través de varias salidas 13, y es desviado por los medios guía 14, finalizando en la parte sustancialmente basal 3a de la primera zona de transferencia de medio 3. La estructura de la primera zona de transferencia de medio 3 y la salida de la bomba requieren que el medio sea dirigido hacia la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3. Cuando alcance la parte superior de la pared de la parte sustancialmente cilindrica 3b, se desborda hacia la tercera zona de transferencia de medio . La dirección de circulación del medio M es mostrada por las flechas en las Figuras 1, 3 y 9. Está claro para el experto en la técnica que, en esta modalidad particular, la pared de la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3 es menos alta que la pared de la tercera zona de transferencia de medio 4 por razones de eficiencia y velocidad de flujo, pero comprenderá fácilmente que la pared de la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3 también puede ser más alta que la pared de la parte sustancialmente cilindrica 4b de la tercera zona de transferencia de medio 4. El medio es por lo tanto sometido a una velocidad de flujo impuesta por la bomba y a la gravedad, es dirigido hacia abajo desde la tercera zona de transferencia de medio 4 que corre hacia abajo de la parte sustancialmente cilindrica 4a y alcanza la parte sustancialmente basal 4b de la tercera zona de transferencia de medio 4. A continuación el flujo de medio tiene una dirección ascendente a través de un efecto de los recipientes en comunicación con la velocidad de flujo impuesto de la bomba y alcanza la parte superior de la segunda zona de cultivo . El medio alcanza la segunda zona de cultivo 5 desde la tercera zona de transferencia de medio 4 vía los orificios del pasaje de medio sustancialmente libre de células 17 y la pared inferior 15 de la segunda zona de cultivo 5. Como ya se mencionó anteriormente, los orificios de paso de medio 17 se dimensionan de acuerdo al tipo de cultivo. Si el cultivo es un cultivo sin soporte, la pared 15 o 16 que comprende orificios 17 será una membrana porosa donde el tamaño de poro es menor que el diámetro de las células. Si el cultivo es sobre microsoportes o sobre soportes, el tamaño de los orificios 17 será menor que el tamaño de los microsoportes o soportes. Cuando el frente de flujo de medio alcanza la parte superior de la pared de la segunda zona de cultivo 5, se desborda hacia la cuarta zona de transferencia de medios 6. Naturalmente, si están presentes orificios o un tubo, debe comprenderse que, cuando el frente de flujo de medio alcanza el orificio o tubo, éste fluye hacia la cuarta zona 6. En la modalidad particularmente preferida de la invención, la cuarta zona de transferencia de medio 6 comprende una pared inclinada 18 sobre la cual fluye el medio cuando pasa de la segunda zona 5 a la cuarta zona 6. La pared inclinada preferiblemente comprende una membrana hidrofílica para mejorar la formación de la película sobre la pared inclinada 18. La película debe preferiblemente ser laminar para evitar tanto como sea posible una formación de espuma. Para estabilizar la película, también es posible agregar aditivos al medio de cultivo para modificar las propiedades reológicas del agua, en particular el medio de cultivo, como los aditivos incluidos en el grupo que consiste de tensoactivos, Pluronic F68, glicerina, amonios cuaternarios y cualesquier otros aditivos para modificar las propiedades reológicas del medio de cultivo. La membrana hidrofílica será por ejemplo una membrana que consista de polioxietileno. La formación de la película sobre la pared inclinada es un paso importante puesto que permite la oxigenación sobre la "película delgada". En realidad el volumen gaseoso con respecto a la cantidad de medio en esta cuarta zona de transferencia de medio es grande y mejora los intercambios. Además, la formación de la película sobre una pared inclinada incrementa el área de la superficie de contacto gas-líquido. Como puede observarse en la figura 1, el recipiente de cultivo preferiblemente comprende una cubierta 19 a través de la cual pasa al menos un orificio de entrada de gas 20 y al menos un orificio de salida de gas 21. El orificio de entrada de gas 20 está situado preferiblemente para comunicarse directamente con la cuarta zona de transferencia de medios 6. En algunas variantes, puede ser preferible que el orificio de entrada de gas 20 esté presente sobre la pared vertical del recipiente de cultivo 2 o en el fondo del recipiente de cultivo 2, es decir para que el gas pase por medio de un orificio 20 a través de la pared del recipiente de cultivo 2 opuesta a la cubierta 19, para que este orificio 20 sea provisto con un tubo para que finalice por encima del nivel del líquido (véase la figura 9) . En esta modalidad, la cubierta 19 es fijada por medios de fijación 22 a la pared superior 16 de la segunda zona de cultivo 5. En variantes, la cubierta 19 puede hacerse parte integral de la pared superior 16 en la segunda zona de cultivo 5, abriéndose esta parte cuando la cubierta 19 del recipiente de cultivo 2 se levante. De esta manera, es fácil retirar una muestra de células con o sin soportes por ejemplo para evaluar la densidad celular, la estructura de las células y otras características físicas de las células que reflejen la salud del cultivo. En realidad, la conexión de dos hace posible abrir el compartimiento de cultivo 5 simplemente levantando la cubierta o tapa 19 del recipiente de cultivo 2. En el caso de cultivo en suspensión, sería ventajoso conectar una membrana porosa a la pared superior 16 provista con orificios 17 de la segunda zona de cultivo 5, este montaje, puede mejorar la rigidez del montaje de cubierta/membrana para tomar muestras. La Figura 2 ilustra una variante del dispositivo magnético de los medios de circulación de medio. Aquí la barra magnética 7 tiene la forma de una hélice. El diseño del dispositivo magnético 7 con un eje de rotación sustancialmente central 8 dependerá esencialmente del volumen de cultivo. En realidad, para cultivos pequeños, la invención demuestra disposición una barra más simple, como un microcircuito magnético para hacer circular el medio. Para volúmenes grandes, la invención contempla un rotor magnético, también accionado por un motor externo, por ejemplo rotores como los usados en acuarios los cuales permiten velocidades de circulación de medias a altas. También puede, de acuerdo a la invención, contemplarse el uso de dispositivos productores de burbujas (no mostrados) , más comúnmente referidos como "aspersores" o "microaspersores" de acuerdo al tamaño de la burbuja producida. De manera ventajosa cuando sean usadas burbujas, el extremo perforado del dispositivo productor de burbujas, por ejemplo del tubo, será sumergido en el medio en el fondo de la cuarta zona de transferencia de medio o en la primera zona de transferencia de medio. Cuando se elija este tipo de oxigenación, siempre es posible también continuar la oxigenación sobre la película delgada, lo cual hace posible reducir el flujo de gas y formar menos burbujas y por lo tanto reducir la formación de espuma. En este caso, se hacen las provisiones para tener dos entradas de gas en la cubierta del recipiente de cultivo o en la pared vertical de este último. Además, también es posible contemplar que el dispositivo de producción de burbujas esté presente únicamente como un procedimiento SOS, y usado únicamente cuando sea necesario. El dispositivo de cultivo también comprende una serie de detectores de parámetro de cultivo 23, por ejemplo para la presión parcial de oxígeno disuelto p02, acidez, pH, temperatura, turbidez, densidad óptica, glucosa, C02, lactato, amonio y cualquier otro parámetro normalmente usado para verificar cultivos celulares. Esos detectores son preferiblemente detectores ópticos los cuales no requieren conexiones entre el interior del recipiente de cultivo y el exterior del mismo. La posición preferida de esos detectores 23 es una posición crítica dado que es ventajoso que se sitúe cerca de la pared del recipiente de cultivo 2, para que ellos estén en contacto con el medio M y preferiblemente en posiciones estratégicas, como en la zona a través de la cual el medio M pasa antes de que pase a través de las células o justo después. En efecto, la invención contempla procurar particularmente un biorreactor desechable por todas las razones de simplicidad y economía mencionadas anteriormente. En consecuencia, es por esto que las conexiones entre el interior y el exterior del recipiente de cultivo han sido reducidas. Además, el biorreactor de acuerdo a la invención también contempla procurar un biorreactor particularmente confiable en el cual los riesgos de contaminación sean particularmente bajos por ser desechable . Como puede observarse en la Figura 3, el dispositivo de acuerdo a la invención también contempla un diseño modular el cual comprende una serie de módulos para cultivos a un gran volumen. Por ejemplo, con este tipo de diseño modular, se contemplaron volúmenes de cultivo de alrededor de 500 ml hasta 100 litros, por ejemplo a través del uso de un número muy limitado de módulos estándar. De acuerdo a la invención se contempló proporcionar una serie de módulos que puedan "deslizarse" alrededor de la primera zona de transferencia de medio 3 para colocarse en un recipiente de cultivo estándar 2 que comprende medios de circulación de medio y una cubierta o tapa 19. En una variante particularmente flexible, la invención procura un sistema de montaje el cual comprende varios módulos estándar. Esos módulos estándar son por ejemplo un módulo de medios de circulación a ser colocado en el fondo del montaje, uno o más módulos de cultivo y un módulo de cubierta. De acuerdo a la invención, aunque pueden ser contemplados otros medios para fijar esos módulos, los módulos serán sujetados entre sí, por ejemplo, por medio de conectores rápidos perfectamente impermeables desde el punto de vista de líquidos y gases. En consecuencia, de acuerdo al tipo de cultivo y el volumen requerido, el usuario podrá tomar de ese patrón un módulo base que comprenda los medios de circulación de medio, también tomará del mismo número de módulos de cultivo que requiera de acuerdo al volumen de cultivo requerido y entonces tomará un módulo superior correspondiente a la cubierta o tapa. A continuación, todos esos módulos son empaquetados en forma estéril, el únicamente necesitará desempaquetarlos y "sujetarlos" uno encima del otro. El apilamiento puede formar el "biorreactor desechable" o puede ser colocado en un recipiente apropiado. La Figura 3 ilustra por lo tanto una modalidad del dispositivo de cultivo modular de acuerdo a la invención. El dispositivo de cultivo 1 comprende un recipiente de cultivo 2 el cual comprende medios de circulación de medio como aquéllos explicados con detalle en la Figura 1. El módulo base m0 que comprende los medios de circulación puede ser fijado al fondo del recipiente de cultivo 2 o también puede deslizare hacia al recipiente de cultivo 2 (la modalidad descrita) para poder eliminar este y para usar otro o para otro cultivo y así evitar contaminaciones cruzadas. El módulo base m0 comprende los medios de circulación. Como en la Figura 1, esos medios de circulación comprenden un dispositivo magnético 7, que gira alrededor de un eje de rotación central 8, un primer extremo del cual se aloja en medio de acoplamiento superior 9 y un segundo extremo el cual se aloja en medios de acoplamiento inferiores 10. Los medios de circulación comprenden al menos una entrada de medio 11. Los medios de circulación de medio también comprenden al menos una salida de medio 13. El módulo base m0 del recipiente de cultivo comprende al menos unos medios guía de medio 14 adyacentes a al menos una salida 13, los cuales guían el medio de cultivo impulsado hacia la parte superior del recipiente de cultivo 2.

El recipiente de cultivo 2 comprende una serie de módulos de cultivo (mi, m2, ... , mn) los cuales, en esta modalidad, se apilan uno encima de otro. También podría contemplarse que estén simplemente adyacentes entre sí, es decir colocados lado a lado. En la modalidad ilustrada en la Figura 3, los módulos son sujetados entre sí por medio de conectores rápidos 24 o pinzas. Cada módulo de cultivo mi, m2, ... , mn comprende una primera 3, una segunda 4, una tercera 5 y una cuarta zona 6. Esas zonas 3, 4, 5, 6 tienen cada una la misma función que se mencionó en la Figura 1. Además, puede ser ventajoso que cada módulo comprenda una entrada de gas o mezcla de gas (no ilustrada) en comunicación con la cuarta zona 6 de cada módulo de cultivo. El recipiente también puede comprender por su parte una salida para el exceso de gas o mezclas de gas (no ilustrada) . Por ejemplo, el orificio de entrada de gas puede estar presente en el fondo del recipiente de cultivo 2, es decir que el gas pase por medio de un orificio a través de la pared del recipiente de cultivo 2 opuesta a la cubierta 3 y este orificio 20 está provisto con un tubo para finalizar por encima del nivel de líquido (véase la Figura 9) del módulo mi. En consecuencia, la mezcla gaseosa alcanza la cuarta zona de transferencia de medio 6 de este módulo. El módulo m2 colocado encima del módulo mi también puede comprender un tubo que permita que la mezcla gaseosa presente en la cuarta zona 6 del módulo de cultivo mi se comunique con la cuarta zona 6 del módulo m2. Este tubo pasa por lo tanto, de manera ventajosa, a través de la pared inferior del módulo m2. En ciertas modalidades, para cultivo de larga duración, puede ser ventajoso reemplazar parte de medio de cultivo con medio fresco o llevar a cabo una adición de nutriente. En consecuencia, el modulo base m0 puede comprender entonces una entrada de nutriente (no ilustrada) . También, de manera ventajosa, el recipiente de cultivo puede comprender, en los medios de circulación de medio, una salida de medio (no ilustrada) para evitar el desbordamiento . En una forma similar, el recipiente de cultivo 2 comprende un módulo superior que comprende una cubierta 19, conectada de manera ventajosa a una pared superior 16 provista con orificios de pasaje de medio 17 por medios de fijación 22 para simplificar la toma de muestras en el módulo mn situado encima, como en la Figura 1. Además, también pueden ser proporcionados, de manera ventajosa, detectores de parámetros de cultivo en cada módulo de cultivo. También es posible proporcionar detectores solo en uno o varios módulos de cultivo en todas las zonas o en el módulo base.

En la modalidad ilustrada en la Figura 3, el medio circula de la siguiente manera. Para simplificar la explicación, usaremos únicamente dos módulos de cultivo mi y m2 y un módulo base m0, pero es cierto que el dispositivo de cultivo de acuerdo a la invención puede comprender un número muy grande de ellas. En el módulo base m0, el medio es impulsado de vlos medios de circulación de medio M vía al menos una salida 13, cuando existen varios de ellos, a través de las diferentes salidas 13 y es desviado por los medios guía 14. Finaliza en la parte sustancialmente basal 3a de la primera zona de transferencia de medio 3. La parte sustancialmente basal 3a de esta modalidad es una zona común a todos los módulos de cultivo y, en la modalidad ilustrada, se sitúa en el módulo base. Esto es válido si los módulos de cultivo son apilados o yuxtapuestos. La estructura de la primera zona de transferencia de medio 3 del dispositivo de acuerdo a la invención y la salida de la bomba requiere que el medio sea dirigido hacia la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3 del primer módulo mi, hacia la parte sustancialmente cilindrica 3b de la primera zona de transferencia de medio 3 del segundo módulo m2. En esta modalidad, es el montaje de los módulos el que crea una primera zona de transferencia de medio grande 3 que comprende una parte sustancialmente cilindrica 3b. Cuando el medio alcanza la parte superior de la pared de la parte sustancialmente cilindrica 3b del segundo módulo de cultivo m2, se desborda hacia la tercera zona de transferencia de medio 4 del segundo módulo de cultivo m2. La dirección de circulación del medio M es mostrada por flechas. El medio es por lo tanto sometido a la velocidad de flujo impuesta por la bomba y a la gravedad, es dirigido hacia el fondo de la tercera zona de transferencia de medio 4 del segundo módulo de cultivo m2, fluyendo hacia abajo, hacia la parte sustancialmente cilindrica 4a del segundo módulo de cultivo m2, y alcanza la parte sustancialmente basal 4b de la tercera zona de transferencia de medio del segundo módulo de cultivo m2. A continuación, el flujo de medio tiene una dirección ascendente a través de un efecto de los recipientes en comunicación y a través de la velocidad de flujo impuesta de la bomba y alcanza la parte superior de la segunda zona de cultivo 5 del segundo módulo de cultivo m2. El medio alcanza la segunda zona 5 del segundo módulo de cultivo m2 desde la tercera zona de transferencia de medio 4 del segundo módulo de cultivo m2 vía orificios para el paso de medios sustancialmente libre de células 17 de la pared inferior 15 del segundo módulo de cultivo m2. Cuando el frente de flujo de medio alcanza la parte superior de la pared externa de la segunda zona de cultivo 5 del segundo módulo de cultivo m2, se desborda hacia la cuarta zona de transferencia de medio 6 del segundo módulo de cultivo m2. Naturalmente, si están presentes orificios o un tubo en esta pared externa de la zona de cultivo 5, es necesario comprender que, cuando el frente de flujo de medio alcance el orificio o tubo, fluye hacia la cuarta zona 6 del segundo módulo de cultivo m2. En la modalidad particularmente preferida de la invención, la cuarta zona de transferencia de medio 6 del segundo módulo de cultivo m2 comprende una pared inclinada 18 sobre la cual fluye un medio cuando pasa de la segunda zona 5 del segundo módulo de cultivo m2 a la cuarta zona 6 del segundo módulo de cultivo m2. La pared inclinada preferiblemente comprende una membrana hidrofílica para mejorar la formación de la película sobre la pared inclinada 18. La película debe preferiblemente ser laminar para evitar tanto como sea posible la formación de espuma. Para estabilizar la película, también es posible agregar aditivos al medio de cultivo para modificar las propiedades reológicas del agua, como se mencionó anteriormente. A continuación, el medio de cultivo presente en la cuarta zona de transferencia de medio 6 del segundo módulo de cultivo m2 se desborda ya sea a través de un tubo o sobre la parte superior (D) de la pared de la cuarta zona de transferencia de medio 6 del segundo módulo de cultivo m2 hacia la tercera zona de transferencia de medio 4 del primer módulo de cultivo mi. El medio es por lo tanto sometido a la velocidad de flujo impuesta por la bomba y a la gravedad, es dirigido hacia abajo desde la tercera zona de transferencia de medio 4 del primer módulo de cultivo mi, fluyendo hacia abajo, hacia la parte sustancialmente cilindrica 4a del primer módulo de cultivo mi, y alcanza la parte sustancialmente basal 4b de la tercera zona de transferencia de medio del primer módulo de cultivo mi. A continuación, el flujo de medio tiene una dirección hacia arriba a través de un efecto de los recipientes en comunicación y a través de la velocidad de flujo impuesta por la bomba y alcanza la parte superior de la segunda zona de cultivo 5 del primer módulo de cultivo mi. El medio alcanza la segunda zona 5 del primer módulo de cultivo mi de la tercera zona de transferencia de medio 4 del primer módulo de cultivo mi vía orificios para el paso de medio sustancialmente libre de células 17 en la pared inferior 15 del primer módulo de cultivo mi. Cuando el frente de flujo de medio alcanza la cumbre de la pared la segunda zona de cultivo 5 del primer módulo de cultivo mi, se desborda hacia la cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mi. Obviamente, si están presentes orificios o un tubo en esta pared, debe comprenderse que, cuando el frente del flujo de medio alcance el orificio o tubo, fluye hacia la cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mi. La cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mi también puede comprender una pared inclinada 18 sobre la cual el medio fluye cuando pasa de la segunda zona de cultivo 5 del primer módulo de cultivo mi a la cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mi. La pared inclinada es posiblemente provista con una membrana hidrofílica como anteriormente. A continuación, el medio retorna al módulo base m0 y hacia los medios de circulación de medio a través de la entrada (tubo 11) . Es decir que el medio de cultivo presente en la cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mi se desborda ya sea vía un tubo o sobre la parte superior de la pared de la cuarta zona de transferencia de medio 6 del primer módulo de cultivo mx en un tubo 11 el cual finaliza en una zona sustancialmente central de un sifón creado por la bomba centrífuga que constituye los medios de circulación de medio de acuerdo a la invención del módulo base m0. En una variante de esta modalidad, ilustrada de manera altamente esquemática en la Figura 4 y con detalle en la Figura 9, los módulos apilados m constituyen el recipiente de cultivo. En esta variante de la Figura 4, pueden existir por ejemplo tres tipos de módulos, por ejemplo módulos base m0, módulos mi, m2, ..., n que comprende las cuatro zonas y un módulo superior mx (no mostrado) . El módulo base m0 o módulo basal mo comprende medios de circulación de medio y medios de montaje, está diseñado para acoplarse a los primeros medios de montaje 24a de un módulo de cuatro zonas mi, m2, ... , n como se mencionó anteriormente y constituye el fondo del recipiente. El módulo superior mt está diseñado para acoplarse a los segundos medios de montaje 24b de un módulo de cuatro zonas mi, m2, ..., n- El módulo de cuatro zonas mi, m2, ... , n acoplado por el módulo base m0 puede ser el mismo que se acopló al módulo superior m o al módulo de cuatro zonas mx, m2, ... , n acoplado por un módulo base m0 puede ser el primero de una serie de módulos de cuatro zonas mi, m2, ..., „ y el acoplado por el módulo superior mt es en consecuencia el segundo módulo de cuatro zonas en la serie de módulos de cuatro zonas mi, m2, ..., n. Esta variante funciona de la misma manera como se explicó con detalle para la Figura 3.

Las Figuras 5 y 6 ilustran la mitad de la parte basal del módulo base m0. La Figura 5 es una vista en corte transversal y la Figura 6 es una vista desde arriba. Como puede observarse, el medio está diseñado para introducir el módulo base a través de al menos una entrada en un área sustancialmente central representada por la letra x en las Figuras 6 y 8. El eje de rotación del dispositivo magnético 7 pasa a través de este centro x, ya sea real o virtual. Cuando los medios de circulación están en operación, el dispositivo magnético 7 está en rotación alrededor de su eje de rotación, la rotación del mismo crea un sifón el cual succiona el medio dentro de los medios de circulación de medio. La zona en la cual el dispositivo magnético está en rotación es confinada por deflectores o paredes 25. En esta modalidad han sido mostrados dos deflectores, pero su número puede ser mucho mayor, por ejemplo 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Los deflectores se colocarán preferiblemente simétricamente sobre la circunferencia definida por la totalidad de estos. Los espacios 13 entre los deflectores 25 son orificios de salida de medio. En realidad, el medio succionado por el sifón creado por la rotación del dispositivo magnético y el medio es expulsado hacia el exterior de la zona delimitada por los deflectores 25, a través de los orificios 13 entre los deflectores. Puesto que han sido mostrados dos deflectores 25, existen dos orificios de salida de medio en esta modalidad pero su número puede ser mucho mayor, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Puesto que los deflectores son colocados, de manera preferible simétricamente, la ubicación de las salidas de medio 13 también es, de manera ventajosa, simétrica. Cuando el medio es expulsado por las salidas 13, finaliza en la zona esencialmente circular 27. En esta modalidad, la parte basal del módulo base m0 tiene en ésta orificios 20, sustancialmente de forma tubular, los cuales son orificios que permiten por ejemplo la introducción de gas o mezcla de gas y medio fresco, descarga de gas o mezcla de gas, drenado de medio, etc. Además, se proporciona una cavidad 31 para tener acceso a esos orificios 20 desde el exterior, lo cual hace posible conectar esos orificios a un suministro de gas o mezcla de gas, medio fresco, etc. La Figura 7 es una vista en corte de la parte superior del módulo base m0 de acuerdo a la invención y la Figura 8 es una vista desde arriba de esta misma parte. La parte superior comprende sustancialmente orificios de entrada de medio de forma tubular 11. Esos orificios de entrada 11 guían el medio proveniente de la cuarta zona de transferencia de medios 6 del dispositivo de acuerdo a la invención 1 en el sifón creado por la rotación del dispositivo magnético. Cuando el dispositivo magnético está en rotación, al menos situado en la zona esencialmente circunferencial 27 descrita en las Figuras 5 y 6 entra en la perforación 26, estando la perforación 26 en comunicación con los conductos 28 que permiten que el medio expulsado alcance una zona 30 en comunicación de medio con la primera zona de transferencia de medio 3 del dispositivo de acuerdo a la invención, en particular con la parte esencialmente tubular de la primera zona de transferencia de medio. La parte superior descrita en la Figura 7 es un elemento diseñado para ser colocado sobre la parte inferior descrita en la Figura 5. Naturalmente, este módulo base m0 también podría ser obtenido de otra manera, pero por razones de simplicidad de producción ha sido producido para esta modalidad en dos partes que pueden ser conectadas juntas. Como puede observarse además, la parte superior y la parte inferior son conectadas juntas en una forma preferiblemente sellada en las cavidades 29 ilustradas en las dos Figuras 5 y 7. Todas las ilustraciones de medios de circulación de medio de la presente solicitud también pueden ser producidas de varias formas. No es necesario decir que todas las formas para producir las diferentes modalidades de los medios de circulación de medio, confinados o no en el módulo base, se incluyen en el alcance de protección reclamado. La figura 9 muestra una vista en corte transversal de una modalidad particularmente ventajosa del dispositivo de acuerdo a la invención, aunque la figura 10 es una vista en corte transversal del despiece de la misma modalidad. La vista del despiece da una comprensión clara de la particularidad práctica y el aspecto inventivo de la presente invención. En consecuencia las dos figuras 9 y 10 serán comentadas al mismo tiempo. Como puede observarse, el dispositivo de acuerdo a la invención consiste, de abajo hacia arriba, de una pila sujetada de • la parte inferior del módulo base m0(m0a)que comprende una zona en la cual el dispositivo magnético está en rotación, la cual está confinada por deflectores 25. El espacio 13 entre los deflectores 25 visible en estas figuras 9 y 10 es un orificio de salida de medio. Esto se debe a que el medio es succionado por el sifón creado por la rotación del dispositivo magnético y el medio es expulsado hacia la salida 27 (zona esencialmente circular) de la zona delimitada por los deflectores 25 a través de los orificios 13 entre los deflectores 25, • la parte superior del módulo base mo(m0b)que comprende orificios de entradas de medios de forma sustancialmente tubular 11. Esos orificios de entrada 11 guían el medio proveniente de la cuarta zona de transferencia de medio 6 del dispositivo de acuerdo a la invención 1 en el sifón creado por la rotación del dispositivo magnético 7. Cuando el dispositivo magnético está en rotación, el medio situado en la zona esencialmente circular 27 entra a la perforación 26, estando la perforación 26 en comunicación con los conductos 28 permitiendo que el medio expulsado alcance una zona 30 en comunicación de medio en la primera zona de transferencia de medio 3 del dispositivo de acuerdo a la invención, en particular con la parte esencialmente tubular de la primera zona de transferencia de medio, • un primer módulo de cultivo mi como se explicó con detalle en la explicación de la figura 3, • un segundo módulo de cultivo m2 (véase la figura 3) , • un módulo superior que comprende una cavidad 33 provista con el detector óptico 23 inmerso en el medio de cultivo, una cubierta 19 que comprende medios de fijación 22 conectados a una parte 16a de la parte superior 16 de la segunda zona de cultivo 5 del segundo módulo de cultivo m2. Todos los módulos comprenden medios de fijación 24a y 24b como se ilustra esquemáticamente en las figuras 4, 9 y 10. Cada módulo comprende varios de esos, los cuales, de acuerdo al montaje requerido, serán usados o no, pero esto hace posible obtener un solo módulo de cultivo el cual puede ser montado con otro módulo de cultivo y otro módulo base o el módulo superior. Esos medios de fijación son por ejemplo dos círculos concéntricos provistos con un sello circular, conectores rápidos bien conocidos en la técnica del cultivo celular, un método de tornillo o una sierra o cualquier otro dispositivo para montar esos módulos de acuerdo a la invención. En esta modalidad, la parte basal del módulo base m0 se une con los orificios 20 sustancialmente en forma tubular los cuales son orificios que permiten en este caso la introducción de gas o mezcla de gas. El orificio de entrada de gas 20 se conecta a un tubo 32 el cual finaliza por encima del nivel del medio de cultivo, permitiendo que el gas o mezcla de gas alcance al menos una cuarta zona de transferencia de medios 6 del dispositivo de cultivo 1 de acuerdo a la invención. Todas las atmósferas ambiente de la cuarta zona de transferencia de medio 6 del dispositivo 1 de acuerdo a la invención se conectan por tubos similares 32, de modo que la mezcla de gas pueda alcanzar la parte superior. Esto es particularmente ventajoso en un dispositivo con módulos apilables para una altura que pueda elevarse muy alto para proporcionar un suministro gaseoso a través del fondo del reactor. En una variante, la parte basal comprende un tubo de alimentación de gas o mezcla de gas para llevar la sustancia gaseosa a la zona en la cual se sitúa el dispositivo magnético. De esta manera, el gas entrante es agitado por la rotación del dispositivo magnético y la disolución de oxígeno es mejorada por el movimiento del medio. El exceso de gas también es agitado y se mueve hacia arriba nuevamente en forma de burbujas pequeñas. Esta variante también es aplicable a la modalidad ilustrada en la figura 1. Además, se proporciona una cavidad 31 para tener acceso a esos orificios 20 desde el exterior, lo cual hace posible conectar esos orificios a un suministro de gas, mezcla de gas, medio fresco, etc. El mob de la parte superior del módulo m0 es un elemento diseñado para ser sujetado en virtud de los medios de fijación 28 y sellado en virtud del sello circular 34 sobre la parte inferior de base m0a del módulo base m0. Naturalmente la presente invención no se limita a las modalidades descritas anteriormente y pueden hacerse modificaciones a ésta sin apartarse del alcance de las figuras 1 a 10 acompañantes. Por ejemplo, el dispositivo de acuerdo a la invención descrito en la figura 1 también puede comprender una alimentación de nutrientes, ya sea en un tubo a través de la cubierta, o un tubo a través de las paredes del dispositivo de acuerdo a la invención. De igual modo, los medios de calentamiento también pueden estar presentes en la primera o cuarta zona del dispositivo de acuerdo a la invención o de un módulo o cada módulo de cuatro zonas. Posiblemente, el dispositivo de acuerdo a la invención también puede comprender varios medios de circulación de medio, por ejemplo, varias bombas centrífugas.

Lista de componentes: 1. dispositivo de cultivo 2. recipiente de cultivo 3. primera zona de transferencia del medio de cultivo 3a parte basal de la primera zona de transferencia del medio de cultivo 3b parte cilindrica superior de la primera zona de transferencia del medio de cultivo 4. tercera zona de transferencia del medio de cultivo 4a parte basal de la tercera zona de transferencia del medio de cultivo 4b parte cilindrica superior de la tercera zona de transferencia del medio de cultivo 5. segunda zona de cultivo 6. cuarta zona de transferencia del medio de cultivo . dispositivo magnético 8. eje de rotación central 9. medios de acoplamiento superior 10. medios de acoplamiento inferior 11. entrada de medio 12. deflector de diversión 13. salida de medio 14. medios guía de medio 15. pared inferior de la segunda zona de cultivo 16. pared superior de la segunda zona de cultivo 17. orificios sobre la pared superior e inferior de la segunda zona de cultivo 18. pared inclinada 19. cubierta del recipiente de cultivo 20. orificio de entrada de gas 21. orificio de salida de gas 22. medios para fijar la cubierta en la pared superior de la segunda zona de cultivo 23. detectores 24. medios de un montaje 24a. primeros medios de montaje 24b. segundos medios de montaje 25. deflectores o paredes del módulo base 26. pasaje en el módulo base 27. zona esencialmente circular 28. conductos 29. cavidades para el sello circular 30. zona en comunicación en medio de la primera zona de transferencia del medio de cultivo 31. cavidad de acceso a los orificios 20 32. tubo de alimentación de gas 33. cavidad en la cubierta para los detectores 34. sello circular m0 = módulo base mi... a mn = módulos de cultivo mt = módulo superior M = medio de cultivo C = células D = parte superior de la pared de la cuarta zona de cultivo

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Dispositivo de cultivo celular que comprende: - un recipiente de cultivo provisto con una cubierta, donde se sitúa al menos una primera zona y al menos una segunda zona, donde la primera zona es una zona de transferencia para medios de cultivo que no contiene esencialmente células y la segunda zona es una zona de cultivo celular; -medios de circulación de medios de cultivo, permitiendo la circulación del medio de cultivo a través de la zona de cultivo, comprendiendo la zona de cultivo una pared inferior y una pared superior, donde cada pared esta provista con orificios que permiten la transferencia del medio de cultivo esencialmente libre de células, caracterizado porque: - también comprende al menos una tercera y al menos una cuarta zona, donde ambas zonas de transferencia de medio de cultivo están esencialmente libres de células, donde la tercera zona está en comunicación en el medio con la primera y segunda zonas y donde la cuarta zona está en comunicación de medio con la segunda zona (la zona de cultivo) y con la primera zona (la zona de transferencia de medio) vía medios de circulación de medios de cultivo, y porque - los medios de circulación de medios de cultivo permiten la circulación del medio de cultivo de la parte inferior a la parte superior en la segunda zona de cultivo.
2. 2. Dispositivo según la reivindicación 1, donde la tercera zona está adaptada de modo que el medio de cultivo se desborda de la primera zona de transferencia del medio de cultivo a la tercera zona de transferencia del medio de cultivo.
3. 3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2, donde la tercera zona es una zona interna a la segunda zona y externa a la primera zona y la cuarta zona es una zona externa a la segunda zona.
4. 4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los medios de circulación de medio de cultivo consisten de una bomba centrífuga situada en una parte inferior de un dispositivo de cultivo, que comprende al menos un dispositivo magnético capaz de girar alrededor de un eje de rotación sustancialmente central, al menos una entrada y al menos una salida del medio de cultivo, donde los medios de circulación están diseñados para succionar el medio en un sifón creado por la rotación del dispositivo magnético y para impulsar el medio hacia la salida del medio de cultivo colocado en una zona externa al dispositivo magnético y porque la bomba centrífuga es accionada por un motor magnético giratorio diseñado para producir una circulación del medio sin comunicación con el exterior del dispositivo, y al menos medios guía, proporcionados para guiar el medio de cultivo impulsado a través de la salida hacia la parte superior del recipiente.
5. 5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una serie de módulos de cultivo (mi,..., mn) comprendiendo cada módulo la primera zona, la segunda zona, la tercera zona y la cuarta zona, y donde los módulos adyacentes en la serie de módulos de cultivo están en comunicación de medio, y la primera zona y la cuarta zona del módulo están en comunicación con los medios de circulación, directa o indirectamente.
6. 6. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde los medios de circulación que están confinados en un módulo base (m0) , y donde el módulo base (m0) está en comunicación de medio con al menos una primera zona de transferencia de medio y al menos una cuarta zona de transferencia de medio, directa o indirectamente .
7. 7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, que también comprende un módulo superior (mt) , comprendiendo el módulo superior (mt) al menos la tapa o cubierta .
8. 8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde al menos una cuarta zona comprende al menos una pared de flujo esencialmente vertical o inclinada.
9. 9. Dispositivo según la reivindicación 8, donde la pared de flujo esencialmente vertical o inclinada comprende una membrana hidrofílica.
10. 10. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que también comprende al menos un orificio de entrada de gas y un orificio de salida de gas.
11. 11. Dispositivo según la reivindicación 10, donde el orificio de entrada de gas se comunica con al menos una cuarta zona de transferencia de medio.
12. 12. Dispositivo según la reivindicación 10 u 11, donde el orificio de entrada de gas está conectado a un tubo aspersor.
13. 13. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la tapa o cubierta del recipiente de cultivo está conectada a al menos parte de la pared superior de al menos la segunda zona de cultivo.
14. 14. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que también comprende medios de calentamiento, proporcionados para calentar el medio de cultivo transferido (M) .
15. 15. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que también comprende detectores para medir parámetros de cultivo, donde los detectores están en contacto con el medio de cultivo (M) .
16. 16. Dispositivo según la reivindicación 15, donde los detectores son detectores ópticos desechables, proporcionados para transmitir una señal óptica que represente parámetros para ser medidos a través del recipiente de cultivo en un receptor de señales ópticas, externo al dispositivo.
17. 17. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, donde cada módulo de cultivo (mo, . • . , mn) comprende en su parte superior primeros medios de fijación y en su parte inferior segundos medios de fijación, donde el módulo base (m0) también comprende en una parte superior (mob) primeros medios de fijación y un módulo superior (mt) también comprende en su parte inferior segundos medios de fijación, y donde los primeros medios de fijación y los segundos medios de fijación son medios de fijación complementarios para producir una secuencia apilada de abajo hacia arriba de un módulo base (mo) , al menos un módulo de cultivo (mi, ... , mn) y un módulo superior (mt) .
18. 18. Dispositivo según la reivindicación 17, donde el primer y segundo medios de fijación comprenden medios para producir la secuencia apilada en una forma hermética a gases y líquidos.
19. 19. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, el cual es un dispositivo desechable.
20. 20. Uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para cultivo celular.
21. 21. Uso según la reivindicación 20 para cultivar células sobre un microsoporte en un lecho fijo o lecho fluidizado.
22. 22. Uso según la reivindicación 20 para cultivar células en suspensión.
23. 23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 para producir productos recombinantes, virus, metabolitos y similares. 2 . Método para cultivar células en un recipiente de cultivo con circulación de medio de cultivo, que comprende: - introducción de medio de cultivo (M) en los medios de circulación del medio de cultivo, - descargar el medio de cultivo (M) de los medios de circulación del medio de cultivo, - al menos una primera transferencia de medio de cultivo (M) hacia una primera zona de transferencia hacia arriba del medio de cultivo, - al menos una segunda transferencia del medio de cultivo (M) hacia una segunda zona de cultivo celular, caracterizado porque también comprende: - al menos una tercera transferencia del medio de cultivo posterior a la primera transferencia del medio de cultivo en una tercera zona de transferencia del medio de cultivo, por desbordamiento de la primera zona de transferencia de medio de cultivo a la tercera zona de transferencia de medio de cultivo, - al menos una cuarta transferencia del medio de cultivo posterior a la segunda transferencia del medio de cultivo en una cuarta zona de transferencia del medio de cultivo, por desbordamiento de la segunda zona de cultivo en la cuarta zona de transferencia de medio de cultivo, y porque la segunda transferencia de medio de cultivo es una transferencia de medio de cultivo hacia abajo. 25. Método para cultivar células según la reivindicación 24, que también comprende la oxigenación del medio de cultivo durante una o más de las transferencias. 26. Método según la reivindicación 24 ó 25, donde la oxigenación ocurre por contacto directo de gas-líquido durante una o más de las transferencias. 27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde la oxigenación se lleva a cabo durante la cuarta transferencia del medio de cultivo, y donde la cuarta transferencia del medio de cultivo es un flujo del medio de cultivo (M) a lo largo de una pared de flujo. 28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde el flujo del medio de cultivo (M) es un flujo a lo largo de una pared hidrofílica.