KR101353633B1 - 세포 배양 방법 및 세포 배양 실행 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뚜껑 (19)이 구비된 배양 용기 (2)를 포함하는 세포 배양 장치 (1)에 관한 것으로, 여기에 제2 세포 배양 지대 (5) 내측에 있는 세포가 없는 배지를 이동시키기 위한 제1 지대 (3), 및 세포가 없는 배지를 이동시키기 위한 제3 (4) 및 제4 지대 (6)가 있다. 상기 제3 지대 (4)는 상기 제2 지대 (5) 내측에 있으면서 상기 제 1 지대 (3) 외측에 있고, 상기 제4 지대 (6)는 상기 제2 지대 (5) 외측에 있는 지대이다. 모든 지대들은 배지를 교환한다. 또한, 상기 장치는 배양 배지를 상기 배양 지대 (5)를 통해 하부에서 상부로 순환시킬 수 있는 배양 배지 순환 수단을 포함한다.

배양 배지, 배양 배지 순환 수단, 배양 용기, 뚜껑, 오리피스

Description

세포 배양 방법 및 세포 배양 실행 장치{METHOD OF CELL CULTURES AND DEVICE FOR IMPLEMENTING IT}

본 발명은 다음을 포함하는 장치에 의한 세포 배양에 관한 것이다:

- 뚜껑이 구비된 배양 용기 (culture vessel), 여기에 적어도 하나의 제1 지대 (first zone) 및 적어도 하나의 제2 지대 (second zone)가 위치하고, 상기 제1 지대는 세포가 없는 배양 배지 (culture medium)용 이동 지대 (transfer zone)이고, 상기 제2 지대는 세포 배양 지대이고, 상기 제1 지대는 상기 제2 지대 내측에 있고;

- 상기 배양 지대를 통해 배양 배지를 순환시키는 배양 배지 순환 수단, 여기서 상기 배양 지대는 하부 벽 (bottom wall) 및 상부 벽 (top wall)을 포함하며, 상기 각 벽은 세포 없는 배양 배지의 이동이 가능하도록 하는 오리피스 (orifice)를 구비하고 있다.

이러한 배양 장치는 예를 들어, 내부 배지 이동 도관 (transfer conduit) 외측에 있는 배양 지대에 위치한 배양 용기를 기재한, 미국특허 제US5 501 971호에 공개되어 있다. 세포는 외측 배양 지대에 놓이고, 이 배양 지대는 담체 (carrier)를 포함하는 바구니 (basket) 종류이고, 배양 배지는 이 배양 지대를 통해 상부에서 하부로 흐른다. 그런 후, 배지는 상기 배양 지대의 하부에서 회수되어, 상기 언급된 도관을 통해 배양 순환 장치에 의해 배양 용기의 상부로 끌어 올려져, 상기 배양 지대를 다시 통과한다. 상기 미국특허 제US5 501 971호가 몇 가지 대안들을 기술하고 있지만, 배지는 항상 상부에서 하부로 배양 지대를 통과한다.

이러한 장치의 단점으로는, 모든 종류의 세포 배양에 적용될 수 없다는 것이다. 사실상, 이러한 장치는 오로지 고정 (fixed) 또는 밀집 (close-packed) 상 (bed)의 미립담체 (microcarrier)에서의 세포 배양을 위해서만 설계된 것으로, 유동상 (fluidised bed)의 미립담체 또는 현탁액에서의 세포 배양에는 전혀 적합하지 않다. 실제로, 상기 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 장치에서, 담체 또는 미립담체 또는 비-고정화 (non-immobilised) 담체가 없는 현탁액에서의 세포는 중력에 의해 침전되어 세포 지대 하부에 축적되는 경향이 있고, 상기 배양 지대를 통한 배지의 흐름이 상부에서 하부로 일어남에 따라, 상기 배양 지대 하부에서의 세포 축적이 더 커진다. 그 결과, 세포가 서로의 상부에 채워지고, 서로 접촉하게 되어, 상기 지대의 영양분 (nutriment)이 세포에 접근하기가 매우 어려워진다.

상기 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 반응기 (reactor)에서, 스트레스 (stress)를 거의 견디지 못하는 약한 종 (species)인 세포를 비-고정화 담체 또는 미립담체에서 배양할 경우, 세포가 중력의 영향, 배지의 하향 (descending) 흐름 및 담체의 무게의 영향을 받게 되는데, 이로서 배양액의 생존율이 크게 손상된다. 또한, 현탁액에서의 배양은 상기 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 생물반응기 (bioreator)에서는 도저히 불가능한데, 이는 현탁액에서의 세포가 어떠한 상황에서도 세포 대 세포로 접촉할 수 없기 때문이다. 실제로, 만일 이러한 접촉이 존재한다면, 세포들이 그들 사이의 단백질 결합을 만들고 응집시킨다. 이러한 응집은 산소 및 영양분의 결핍을 통해 세포사 (cell death)를 야기한다.

본 발명의 목적은, 현탁액에서의 세포 및 담체 또는 미립담체에서의 부착-의존성 세포 (anchorage-dependent cell) 둘 다를 배양할 수 있으면서도, 세포에 스트레스를 최소화하고 배양 지대 하부에서 세포들의 축적을 방지하는 배양 장치를 획득함으로써 선행 기술의 단점을 완화시키기 위한 것이다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에 따라 제공된 장치는 다음과 같은 특징을 지닌다: 각각 세포가 없는 세포 배양 배지 이동 지대인 적어도 하나의 제3 지대 및 적어도 하나의 제4 지대를 포함하고, 상기 제3 지대는 상기 제2 지대 내측에 있는 지대이면서 상기 제1 지대 외측에 있는 지대이고, 상기 제4 지대는 상기 제2 지대 외측에 있는 지대이고, 배양 배지 순환 수단을 통해, 상기 제3 지대는 상기 제1 및 제2 지대와 배지를 교환하고, 상기 제4 지대는 상기 제2 지대 (배양 지대) 및 제1 지대 (배지 이동 지대)와 배지를 교환하고, 상기 배양 배지 순환 수단은 상기 제2 배양 지대의 하부로부터 상부로 배양 배지를 순환시킬 수 있다.

특히, 상기 제4 지대는 생물반응기의 대기 (ambient atmosphere)를 이루는 기체를 포함하고, 배양 배지를 위한 산소화 (oxygenation) 지대를 구성할 수 있다.

따라서, 하부에서 상부로 제1 배지 이동 지대를 통과하는 배지가 제1 배지 이동 지대 상부에 도달하여, 상기 제 3 지대로 넘쳐 상기 제1 지대와 배지를 교환하게 되고, 배지가 상기 순환 수단에 의해 가해진 흐름, 중력 및 연통관 (communicating vessel) 효과에 의해 아래로 흘러, 상기 제2 배양 지대의 하부 벽에 있는 배지-통로 오리피스를 통과하고, 다시 연통관 효과 또는 상기 배지 순환 수단에 의한 효과, 또는 둘 다에 의해 배양 지대 상부를 향해 위로 올라간 후, 상기 순환 수단을 통해 제4 배지 이동 지대로 흘러넘쳐 제1 배지 이동 지대와 교류하게 된다. 그런 다음 다시 한번, 상기 배지 순환 수단이 배지를 상기 제1 배지 이동 지대 상부로 끌어올려 순환 사이클 (cycle)이 재개된다. 그 결과, 배양 배지에 의해 하부에서 상부로 이동한, 배양 지대에 있던 세포들은, 배지의 흐름에 의해 부분적으로 반작용하는 중력 효과로부터 이득을 얻는다. 이러한 흐름을 통해, 상기 배양 지대에서 미립담체 상의 세포 또는 단독 세포를 더 잘 분산시켜서, 상기 세포들에게 해로운 스트레스가 줄어든다.

상기 용어, "담체 또는 미립담체 상의 세포"가 사용될 때, 상기 담체는 고정 또는 충전 (packed) 상 또는 액체 상에 있을 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.

마찬가지로, 상기 용어 "세포 배양" 또는 "세포"가 사용될 때, 특히 바이러스성 생산물, 단백질 또는 다른 재조합 생산물, 세포 대사물 (cellular metabolite), 조직 세포 [삼차원 (three dimensionl)의 담체 상에서 가능] 배양, 줄기 세포 또는 박테리아 또는 효소 배양액의 동물 세포를 의미하는 것으로 이해되어야만 한다.

당업자는, 담체 또는 미립담체 상의 세포가, 특히 고정상의 경우에, 담체 또는 미립담체가 없는 현탁액에서의 세포보다 덜 충전된다는 것을 쉽게 이해할 것이며, 덜 충전됨에도 불구하고, 배양액의 산소화 및 배양액의 영양화 면에서 상기 배양 지대 내에서의 흐름 방향과 같은 이점을 쉽게 알 수 있다. 실제로, 이러한 배양 용기의 설계가 세포 배양에서 중요한 단계인 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 설계는, 새로운 배지가 공급되지 않거나 세포들이 축적될 사각 지대 (dead area)가 없으며; 세포들이 그들의 재생산 및/또는 생산 대사 (metabolism)를 위해 서로 접촉하기보다는 차라리 배양 배지와 직접적으로 접촉하게 하는 매우 이로운 점이 있다.

따라서, 본 발명은 현탁액의 배양액 및 담체 또는 미립담체 상의 배양액에 알맞은 플렉서블 (flexible) 장치를 제공하며, 이 장치를 통해, 세포에 부가되는 스트레스를 줄이고, 세포 상에 가해진 중력 효과를 줄임으로써 배양 지대의 특정지대에서의 세포 축적을 방지하고, 새로운 배지가 공급되지 않거나 세포가 축적될 수 있는 사각 지대의 존재를 방지할 수 있다. 또한, 현탁액 배양에 적용시, 본 발명에 따른 상기 장치는, 한편으로는 상향 흐름 및 다른 한편으로는 세포에 여전히 일부 적용된 중력에 의해 세포를 잘 분산시킬 수 있다.

상기 용어 "세포가 없는 배지의 통로인 오리피스가 구비된 하부 벽"은 상기 배양 지대의 하부에 위치한 벽을 의미하여야만 하는데, 상기 벽은 배양 지대의 하부 또는 상기 배양 지대의 경계를 정하는 수직 벽 하부에 위치할 수 있고, 배양 배지를 통과시킬 수 있으나, 미립담체 또는 담체 상의 세포 또는 심지어 현탁액에서의 세포는 통과시키지 않는다. 이와 비슷하게, 세포가 없는 배지의 통로인 오리피스가 구비된 상부 벽은 상기 배양 지대 상부 또는 상기 설명된 것과 동일한 특징을 지닌 상기 배양 지대의 경계를 정하는 수직 벽 상부에 위치한 벽일 수 있다.

당연히, 제1 지대에서 제3 지대로 넘쳐흐르는 배지는 상기 제1 지대의 벽 상부 너머로 흘러넘쳐, 이런 방법으로 상기 제3 지대에 도달할 수 있거나, 상기 제1 배지 이동 지대의 상부 또는 하부에 설치된 오리피스 또는 관 (tube)을 통해 흘러넘칠 수 있다. 이러한 방법이, 제2 지대에서 제4 지대로 넘쳐흐르는 배지에도 동일하게 적용된다.

바람직하게는, 상기 배양 배지 순환 수단은 상기 배양 장치 하부에 위치한 원심 펌프 (centrifugal pump)로 이루어져, 실질적으로 중심인 회전 축 (central rotation axis)(실제 또는 가상) 주위를 회전하는 적어도 하나의 자기 장치 (magnetic device), 적어도 하나의 배양 배지용 입구 (inlet) 및 출구 (outlet)를 포함하고, 상기 순환 수단은 상기 자기 장치의 회전에 의해 만들어진 사이펀 (siphon)에서 배지를 빨아들이고, 상기 자기 장치 외측에 있는 지대에 놓인 배양 배지 출구쪽으로 배지를 내보내기 위해 제공되고, 상기 원심 펌프는 회전 자기 모터 (rotary magnetic motor)에 의해 가동되어, 상기 장치 외부 (outside)와 교류하지 않는 배지의 순환을 달성시키며, 상기 출구를 통해 내보내진 배양 배지를 상기 용기 상부쪽으로 안내하기 위해 설계된 적어도 하나의 안내 장치 (guidance device)를 포함한다.

종래의 생물반응기의 단점은, 그것이 적당한 순환을 반드시 제공하지도 않으면서, 배양 용기 내 배양 배지의 균질화 (homogenisation)를 위해 블레이드 (blade) 또는 스크류 (screw) 교반 (agitation) 시스템을 구비한다는 것이다. 이 경우, 상기 생물반응기는, 예를 들어 값비싼 실리콘 카바이드 (silicon carbide)로 만들어진 이중의 약한 기계 라이닝 (mechanical lining)을 구비하고, 상기 생물반응기의 뚜껑을 통과하는 스핀들 (spindle)을 포함한다. 상기 생물반응기의 뚜껑을 통과하는 통로는 심각한 오염 (contamination) 위험성 및 중대한 고장 (breakdown) 위험이 있다.

생물반응기의 다른 유형은 배양 배지의 외부 순환을 포함한다. 배지가 연동 펌프 (peristaltic pump) 또는 유사한 시스템을 통해 파이프 (pipe)를 통과한다. 분명한 것은, 비록 이러한 해결안이 직접적인 오염을 부분적으로 예방할 수 있더라도, 또 다른 단점을 갖는다는 것이다. 이러한 유형의 생물반응기는 장기간 (long-life) 배양에는 적용할 수 없다. 실제로, 이러한 유형의 펌프에 사용된 파이프는 장기간 배양하는 동안 마모되어, 또한 실링 (sealing) 및 오염 문제를 포함한다.

또한 상기 설명된 배지 순환은, "분수 (fountain)" 효과를 얻는 데 기술적 어려움을 야기한다. 따라서, 액체가 상당한 저압 강하 (low pressure drop)에서 상기 배양 지대를 통해 흐르도록 하기에는 충분하지 못하고, 또한 동시에 상기 배양 용기 내부의 수위 (level) 차이를 유지하는 것이 필요하다. 실제로, 액체를 제1 배지 이동 지대 상부쪽으로 이르게 하는 것이 중요한 단계이지만, 또한 확실하게 배지가 제4 지대 하부에서 지나치게 축적되지 않도록 해야 한다. 만일 배양 배지가 상기 제4 지대 하부에 축적되면, 오버플로우 (overflow) 효과가 감소하고, 상기 제1 배지 이동 지대에서 상기 제3 배지 이동 지대를 거쳐 상기 제2 배양 지대를 지나 마지막으로 상기 제4 배지 이동 지대로 흐르는 배지의 주기적 순환이 최적화되지 않을 것이다.

결과적으로, 본 발명에 따른 순환 수단은 실질적으로 중심인 회전 축 주위를 회전하는 자기 장치, 및 배양 배지 입구 및 출구를 포함할 것이다.

소규모의 배양을 위해, 상기 자기 장치는 외부 자기 (external magnet)에 의해 가동되는 단순한 자기 막대 (magnetic bar)일 수 있으며, 이로 인해 예를 들어, 유속 (flow rate) 0.6 내지 6 l/min (즉, 1 내지 10 ml/sec)을 얻는다. 이로써, 상기 배지 순환 시스템이 외부와 교류하지 않지만, 상기 배양 용기 외측에 있는 장치에 의해 가동되기 때문에 오염 위험성이 없다. 또한, 연동 펌프가 본 발명에 따라 고려될 수 있지만, 이것은 단기간 배양에 바람직하다.

대규모의 배양을 위해, 상기 자기 장치는 예를 들어, 10 내지 200 l/min, 특히 20 내지 150 l/min 및 바람직하게는 25 내지 100 l/min의 유속을 지닌 자화된 로터 (magnetised rotor)일 것이다.

구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 장치는 상기 제1 지대, 상기 제2 지대, 상기 제3 지대 및 상기 제4 지대를 각각 포함하는 일련의 모듈들 (modules)을 포함하는데, 상기 일련의 모듈들에서 인접 모듈들이 배지를 교환하고, 상기 모듈 각각의 제1 지대 및 제4 지대가 상기 순환 수단과 직접 또는 간적접으로 교류한다.

이러한 실시예를 통해, 특히 플렉서블 장치를 얻는 것이 가능하고, 최대 용량 100리터까지 규모 (scale)를 증가시킬 수 있다.

일반적으로, 상기 규모 확장 (scaling up)은 세포 배양에서 재조합 생산물, 바이러스, 세포 대사물 또는 다른 것들을 생산하는 데 있어 복잡한 단계인데, 이는 상기 규모 확장이 일반적으로 산소든 영양분이든, 보통의 방식으로 제공된 지대에 문제를 일으키기 때문이다. 상기 설명된 실시예에서, 상기 배양 장치는, 예를 들어 적층 (stacked) 또는 병치된 (juxtaposed) 일련의 인접 모듈들을 포함한다. 제1 배양 모듈의 제4 지대로부터, 배양 배지는 다른 배양 모듈을 통과하여 상기 배지 순환 수단에 도달한다. 본 발명은 소정의 용량을 지닌 다양한 유형의 모듈을 고려한다. 예를 들어, 500ml 내지 5리터의 모듈은 500ml 내지 5리터 범위의 용량을 갖는다. 그 결과, 3리터의 배양액을 위해서는 500ml의 모듈 6개가 사용될 것이다. 예를 들어, 6개의 모듈은 충분히 큰 용기 내에 적층되거나 또는 상호연결되어 상기 용기를 형성할 수 있는 모듈 수단에 의해 적층될 것이다.

상기 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 반응기의 경우, 만일 3리터 용량의 배양액이 필요하다면, 배양 지대 높이 H가 필요할 것이다. 상기 특허에서, 배양 지대 하부에 도달한 배지는, 특히 산소와 관련하여 사실상 다 없어진다. 또한, 상기 미국특허 제US5 501 971호의 발명자는 상기 배양 지대 상부 및 하부에 산소 센서 (oxygen sensor)를 위치시키는 것을 고려하고, 상기 반응기 주위에 산소를 과잉공급한다. 유감스럽게도, 이러한 유형의 과잉-산소화는 절대로 추천되지 않는데, 그 이유는, 이것이 상기 배양 지대 상부에서 세포의 세포 구성성분 산화 (oxidation)를 야기해, 그 결과 세포사 (cell death)가 일어나기 때문이다. 또한, 상기 미국특허 제US5 501 971호의 발명자는 규모 확장을 고려할 때, 높이를 확장하는 것이 불가능하기 때문에, 넓이를 확장하였다. 당연히, 바닥 (floor) 위 공간이 순식간에 통제 불가능하게 된다. 당업자에게 알려진 대로, 바닥 공간은 특히, 무균실 (white room)에서의 임계 매개변수 (critical parameter)인데, 이 무균실에서의 효율성 (efficiency)은 무균 공기 (sterile air)를 얻기 위해 처리될 공기량 (air volume)에 따라 계산되고, 이러한 유형의 공기 처리는 비용면에서 매우 비싸다. 처리될 공기량은, "무균실" 높이를 상기 생물반응기, 그것의 장비, 및 상기 배양 장치의 취급자가 차지하는 바닥 표면적과 곱해서 얻어진다.

그 결과, 얻고자하는 수율 (yield)에 따라 적층 또는 병치된 모듈을 사용함으로써, 상기 바닥 공간이 줄어든다. 또한, 배양 배지가 상기 생물반응기의 대기와 다시 한번 접촉하기 전에 스며들어야만 하는 배양액 용량이 상당히 감소한다. 본 발명의 이전 실시예의 경우, 상기 용량이 6으로 나뉜다.

따라서, 바람직한 일 실시예에 따른 장치는, 배양 용기 하부에 배지 순환 수단을 포함하며, 소정의 높이를 지닌 고압멸균가능 (autoclavable)한 빈 배양 용기 (유리 또는 스테인리스 스틸로 만들어짐) 또는 빈 일회용 (disposable) 배양 용기를 설계하도록 만들어진다. 그런 다음, 상기 배지 순환 수단 위에 상기 용기에 필요한 N개의 모듈을 배치하고, 개조된 뚜껑으로 상기 용기를 다시 밀폐시키는 것으로 충분할 것이다. 이 경우, 5리터의 배양액이든 또는 50리터의 배양액이든, 상기 용기의 크기는 동일하다.

이 실시예는 특히 비용이 저렴하기 때문에, 수단 (means)이 거의 없는 실험실에서 바람직할 수 있다. 만일 공급된 용기가 35리터의 배양액 용으로 설계되었으나, 단지 5리터 또는 10리터의 배양액이 필요하다면, 예를 들어, 상기 배양 배지 순환 수단 위에 5리터짜리의 배양 모듈을 하나 이상 두는 것으로 충분하다. 이로써 특히, 비용이 많이 드는 부분은 5 내지 35리터의 배양액 중 어느 것에 대해서도 항상 동일하기 때문에 투자금을 줄인다.

또한, 배양액이 5리터 또는 35리터 또는 그 이상이든, 상기 바닥면은 동일할 것이므로, 상기 규모 확장은 처리될 공기의 양이 증가되는 것과 관련이 없다. 또한, 배지가 모듈에 있는 각각의 통로들 사이에서, 상기 반응기의 주위 온도와 접촉한다는 사실로 인해, 규모 확장시 문제들이 크게 줄어든다.

상기 언급된 대로, 상기 배지 순환 수단은 특히, 본 발명에 따른 장치에 특히 적용된 값의 범위를 감당할 수 있어 효과적이다. 따라서, 각각의 모듈에서의 유속은 동일하고, 산출 수위 (output level)에서의 규모 확장 또한, 본 발명에 따른 문제가 아니다.

특히 바람직한 실시예에서, 상기 순환 수단은 베이스 (base) 모듈에 포함되며, 상기 베이스 모듈은 적어도 하나의 제1 배지 이동 지대 및 적어도 하나의 제4 배지 이동 지대와 직접 또는 간접적으로 배지를 교환한다.

상기 배지 순환 수단은 종종 세척을 위해 일부 접근하기 어려운 지대를 통해 교차 오염 (cross contamination) 또는 외부 오염 위험성을 나타내는 지대이기 때문에, 이에 한정되지 않지만 예를 들어, 단순한 유리 용기에 삽입될 수 있는 베이스 모듈을 획득하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 베이스 모듈은 배양 모듈에 적용되어, 존재하는 모든 모듈의 제1 배지 이동 지대와 상기 배지 순환 수단의 배지 출구 사이, 및 존재하는 모든 배양 모듈의 모든 제4 지대와 상기 배지 순환 수단으로 들어가는 배양 배지 입구 사이에서 직접적 또는 간접적인 배지 교환이 일어날 수 있으며, 즉 이것은 또 다른 모듈을 관통한다고 말하거나 그렇지 않을 수도 있다.

또한, 상기 장치가 헤드 모듈 (head module)을 포함하고, 상기 헤드 모듈이 적어도 뚜껑을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 헤드 모듈이 상기 언급된 중첩 (superimposition)을 없애도록 설계될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 제4 지대가 적어도 하나의 실질적으로 수직 또는 경사진 흐름 벽 (flow wall)을 포함한다.

이러한 흐름 벽의 존재로 인해, 상기 제2 배양 지대에서 상기 제4 배지 이동 지대로 넘쳐흐르는 동안 나타날 수 있는 거품 (foam) 형성이 줄어든다. 실제로, 이러한 흐름 벽이 없다면, 상기 제2 지대에서 상기 제4 지대로의 배지 흐름은 소용돌이 (turbulent) 흐름이 될 것이고, 그 결과 바람직하지 못한 거품 형성이 반드시 일어날 것이다. 배양 배지는 단백질이 풍부하기 때문에, 거품 형성이 많은 배양 방법에서 큰 문제라는 것이 언급되어야 한다. 단백질이 풍부한 액체를 교반하면 항상 거품이 형성된다. 따라서, 소용돌이 흐름이 이와 동일한 결과를 가질 것이고, 이러한 이유로, 본 발명은 상기 흐름 소용돌이를 줄이기 위한 상기 흐름 벽을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제4 배지 이동 지대는, 배지가, 본 발명에 따른 장치의 대기와 접촉하는 지대이다. 상기 흐름 벽의 존재로 인해, 이러한 접촉이 향상되고, 따라서, 기체-액체 접촉 표면적을 증가시켜, 대기와 배양 배지 사이의 산소 교환이 향상된다.

바람직하게는, 필름 (film)을 안정화시키기 위해, 계면활성제 (surfactant), 플루로닉 (Pluronic) F68, 글리세린 (glycerrine), 사차 암모늄 및 배양 배지의 유동학적 특성을 변경시키기 위한 다른 첨가제로 이루어진 그룹에 포함된 첨가제들을 배양 배지에 첨가하여, 물의 유동학적 (rheological) 특성을 변경시킬 수 있다.

특히 바람직한 실시예에서, 기본적으로 수직 또는 경사진 흐름 벽이 친수성 막 (hydrophilic membrane)을 포함한다.

만일 흐름 벽이 친수성 표면이 아니거나, 이를 포함하지 않는다면, 상기 표면에서 배지의 필름을 얻기가 매우 힘들 수 있다. 또한, 상기 필름은 종래의 벽에 형성될 때, 불안정하다. 그 결과, 스펀지 (sponge) 역할을 수행하는 친수성 막으로 상기 흐름 벽을 덮음으로써, 배지가 자연스럽게 퍼지고 균등하게 흐른다. 따라서, 배지의 필름과 대기 사이의 접촉면이 크게 향상되어, 높은 세포 밀도에서도 적합한 산소화가 가능하다. 획득된 산소의 총 이동 계수 (coeffficient)는 약 10^-3 내지 10^-2 S^-1이다.

배양 모듈에 관한 실시예에서, 만일 상기 제4 지대 일부 또는 전부가 친수성 막을 지닌 흐름 벽을 포함한다면, 기체-액체 교환이 더 향상된다. 따라서, 심지어 일련의 모듈 중 마지막 모듈에도 산화된 배지가 공급된다. 배지 순환과 관련한 선행 기술의 일부 경우에, 예를 들어, 용량 약 200리터의 배양액이 생산될 때, 상기 배지 순환 말단에서는 세포가 비교적 충분치 못하게 공급되고, 세포 성장이 생물반응기에서 균일하지 않는다.

본 발명에 따른 장치에서, 공급부족한 또는 사각 지대가 존재할 경우는 없다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 장치는 적어도 하나의 기체 입구 오리피스 및 하나의 기체 출구 오리피스를 포함한다.

상기 배양 용기가 적어도 하나의 기체 입구 오리피스 및 하나의 기체 출구 오리피스를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 방법으로, 예를 들어 세포에 의해 산소가 소모될 때 본 발명에 따른 장치의 대기를 산소가 풍부해지도록 하는 것이 가능하다. 또한, 다른 기체, 예를 들어 pH를 변경하기 위한 CO₂, 또는 세포 배양에 일반적으로 사용된 다른 기체를 첨가하여 대기에 다른 기체를 공급하는 것이 가능하다. 상기 출구 오리피스는, 과압 (overpressure)을 방지하고, 본 발명에 따른 장치의 대기압 (ambient pressure)을 감소시키기 위해 상기 대기의 기체 일부 또는 저농도 산소를 지닌 기체를 방출하는 것이 가능하도록 한다. 또한, 상기 장치는 약간의 과압이 필요한 경우 상기 기체 출구를 차단 또는 "조일 (strangle)" 수 있도록 만들어진다.

상기 기체 입구는 상기 배양 용기의 제1, 제2, 제3 또는 제4 지대에 놓이거나 그것들에 연결될 수 있다. 상기 제1 및 제4 지대가 우선적인 지대이다. 상기 제3 배지 이동 지대는 그다지 기체-액체 접촉에 접근가능하지 않으며, 상기 배양 용기의 제2 지대는 세포 배양 용기이므로, 여기서의 직접적인 기체-액체 접촉은 세포 구성성분의 산화라는 바람직하지 못한 위험성을 나타낼 수 있다.

상기 기체 입구 오리피스가 적어도 하나의 제4 배지 이동 지대에 연결된 것이 바람직하다.

또한, 상기 제4 배지 이동 지대는, 흐름 벽이 있든지 없든지 간에, 기체-액체 접촉이 가장 큰 지대에 있기 때문에 산소화 지대 역할을 하고, 이로 인해, 그것이 배지 산소화를 촉진하기 위해 새로운 기체가 직접적으로 첨가되는 지대가 되는 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 제4 지대로 넘쳐흐르는 배양 배지는 세포에 의해 다 사용된 배지이고, 따라서, 산소 일부가 소모되어, 또한 pH 변경이 필요할 수 있고, 그러므로 조절 또는 pH의 산소화 또는 변경의 효율을 증가시키기 위해, 기체 (산소, 공기, CO₂ 등)가 상기 제4 배양 지대를 통해 들어가는 것이 바람직하다.

특정 실시예에서, 상기 기체 입구는 스파저관 (sparger tube)에 연결된다.

특정 실시예에서, 기체 기포 (gaseous bubble)의 분산이 본 발명에 따른 장치 내에서 이뤄지도록 한다. 제1, 제2, 제3 및 제4 배지 이동 지대의 배양 배지에 잠긴 (immersed) 스파저에 의해 상기 기포 분산이 달성될 수 있다 (본 출원에 따른, 큰 기포 또는 미세기포). 상기 기포의 분산이 제1 또는 제4 배지 이동 지대의 배양 배지에 잠긴 스파저에 의해 달성되는 것이 바람직할 것이다.

특정 실시예에서, 상기 배양 용기의 뚜껑이 적어도 하나의 제2 배양 지대의 적어도 상부 벽 일부에 연결된다.

특히 바람직한 실시예에서, 오염 위험성을 최소화하기 위해 샘플을 간단히 채취할 수 있다. 특히, 미립담체에서 배양하는 동안, 샘플을 채취하는 것이 일반적으로 어떠한 위험도 없는 단계는 아니다. 현재의 세포 밀도 측정 방법은 단지 몇 개에 불과한 데다, 신뢰할 만하지 못하고 복잡하다. 따라서, 세포 밀도를 측정하는 최고의 방법은 담체를 샘플링 (sampling)하고 그것들을 착색한 후, 현미경으로 관찰하는 것이다.

종래의 생물반응기에서, 특히 상기 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 생물반응기에서, 배양 지대의 상부 벽이 간단히 열릴 수 없기 때문에, 샘플 채취는 불가능하거나 심각한 오염 위험성을 나타낸다. 사용자가, 종종 크고 무거운 배양 용기의 뚜껑을 열어야만 하므로 무균 상태의 흐름으로 이동하는 것이 어려우며, 일반적으로 블레이드 또는 배지를 올리기 위한 다른 장치에 고정되어 무겁고 용량이 큰 뚜껑을 잡아야 하기 때문에, 사용자는 확실히, 어떤 것도 건드리지 않고, 그것을 오염시키지 않기 위해 한 손에 그것을 잡아야만 한다. 그런 후, 다른 한 손으로는 상기 배양 지대의 상부 벽을 열고 그것을 잡아야만 한다. 그런 다음, 제3의 손을 빌려 클램프 (clamp)로, 세포 밀도를 측정할 수 있도록 하기 위해 하나 이상의 담체를 샘플링해야만 한다. 이로써, 또 다른 사용자나 매우 뛰어난 손재주가 필요하다

본 발명은, 배양 지대의 상부 벽에 고정된 뚜껑을 조달하여 샘플 채취 단계를 상당히 단순화하고; 단지 필요한 것은, 상기 뚜껑을 약간 들어올림으로써 상기 배양 지대의 상부 벽이 동시에 올라가, 무균 클램프 또는 세포 밀도를 측정하기 위해 하나 이상의 담체를 샘플링하기 위한 피펫 (pipette) 등과 같은 샘플링 도구를 삽입하는 것이다. 비-무균 (non-sterile) 물건을 건드릴 위험성 및 오염 위험성이 상당히 줄어든다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 장치는 또한, 이동된 배양 배지를 가열하기 위해 설계된 가열 수단 (heating mean)을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 가열 수단은 제4 배지 이동 지대 또는 배지 순환 수단에 위치하는 것이 바람직할 수 있다. 당연히, 제1 지대 또한 이러한 가열 수단을 포함할 수 있다.

상기 가열 수단은 전기 소자 (electrical element), 전기 코일 (electrical coil) 또는 예를 들어, 자동온도조절 (thermostatically controlled)된 이중 피복물 (double jacket)과 같은 세포 배양 분야에서 일반적으로 사용된 다른 가열 수단일 수 있다.

실제로, 큰 또는 매우 큰 규모의 배양 동안, 본 발명에 따른 장치를 자동온도조절된 장치 또는 방 (room)에 놓는 것이 항상 쉬운 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해, 배양 배지를 자동온도조절하고 심지어 상기 배양 용기 전체에 균일한 온도를 공급하기 위해 가열 수단을 직접 놓는다. 본 발명에 따른 장치가, 과열 지점 없는 배지의 가열을 제공하는 것이 바람직하다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 장치는 배양 매개변수를 측정하기 위한 센서를 포함하고, 상기 센서는 배양 배지와 접촉한다. 배양 매개변수는, 용존 산소 (dissolved oxygen) 분압 (partial pressure), pH, 온도, 흡광도 (optical density), 락테이트 (lactate), 암모늄, 카보네이트 (carbonate), 포도당 또는 예를 들어 세포 밀도를 반영할 수 있는 대사된 (metabolized) 대사산물 (metabolic product) 또는 생성물과 같은 영양분의 농도를 의미한다.

본 발명에서, 이러한 매개변수에 따른 조절 루프 (regulation loop)를 사용하는 것 또한 고려될 수 있다. 이러한 조절 루프는 예를 들어, 존재하는 용존 산소 분압 값 또는 세포에 의해 소모된 용존 산소량에 따라 기체 대기로 주입될 산소량을 조절할 것이다. 이것은 센서 또는 이러한 유형의 배양에서 일반적으로 사용된 다른 유형의 조절에 의해 획득된 pH 값에 따라 CO₂를 주입할 수 있다.

상기 센서가 적어도 하나의 제4 지대의 하부에 배열되는 것이 바람직하다. 상기 제4 배지 이동 지대가 그것을 통과하는 배양 지대로부터 나오는 배지를 갖기 때문에, 센서에 의해 획득된 값이 세포 소모를 분명히 대표하므로, 상기 제4 배지 이동 지대는 센서를 위치시키기에 바람직한 지대이다.

상기 센서는, 상기 배양 용기를 통해 측정될 매개변수를 나타내는 광신호 (optical signal)를, 상기 장치 외부에 있는 광신호 수신기 (optical signal receier)에 전달하기 위해 제공된 일회용 광센서 (optical sensor)인 것이 바람직하다.

특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 장치는 일련의 모듈을 포함하고, 각각의 배양 모듈은 그것의 상부에서 제1 고정 수단 (fixing mean)과 그것의 하부에서 제2 고정 수단을 포함하는데, 여기서 상기 베이스 모듈 또한 상부에서 제1 고정 수단을 포함하고, 상기 헤드 모듈은 그것의 하부에서 제2 고정 수단을 포함하고, 상기 제1 고정 수단과 제2 고정 수단은 상보적 고정 수단으로서, 베이스 모듈, 적어도 하나의 배양 모듈 및 헤드 모듈의 하부에서 상부로 적층 구조 (stacking sequence)를 제공한다.

상기 제1 및 제2 고정 수단이 기체- 및 액체 밀폐 방식 (tight manner)으로 상기 적층 구조를 만들기 위한 수단을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 일련의 모듈 각각의 벽이 배양 용기의 벽 일부를 구성하도록 설계하는 것이 가능하다. 그런 다음, 상기 일련의 배양 모듈들을 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 및 뚜껑을 포함하는 헤드 모듈을 갖도록 조립하는 것으로 충분하다. 그런 후, 이러한 모듈에 의해 형성된 조립체가 상기 배양 장치를 구성할 것이다. 필요한 배양액 용량에 따라, N개의 모듈들이 함께 피트 (fit)되어, 높이 H를 갖는 그 자체의 배양 장치를 구성할 것이다.

매우 특정한 실시예에서, 본 발명에 따른 장치는 일회용 장치이다.

현재, 소규모 및 대규모로 뛰어난 세포 배양 결과를 낳는 생물반응기가 많이 존재한다. 하지만, 이러한 생물반응기는 세척, 멸균, 노동력, 차지하는 공간 및 위치 면에서 비용이 많이 든다. 특히 약학적 대상의 임상 배치 (clinical batch) 또는 생성물을 생산하기 위해서는, 생물반응기가 무균실에 놓일 필요가 있다. 500리터의 생물반응기는 무균실에서 그것의 부피보다 20배 이상을 차지한다. 상기 무균실 기준은 설비장치에 의해 사용된 부피이다. 즉, 만일 상기 장치가 바닥면의 1m₂를 차지한다면, 상기 바닥면 위 공기의 부피 또한 처리될 것이기 때문에, 처리될 공기의 부피는 상기 무균실 높이로 곱해진 (사용자에게 필요한 표면적 + 1m₂) 것이 될 것이다. 또한, 생물반응기 및 위치하는 방 (room) 둘 다에 필요한 단계인 멸균, 무균, 세척, 살균 등의 프로토콜은 노동력 및 제품의 설치 면에서 엄청난 비용을 부과하는 비싸고 복잡한 프로토콜이다. 이러한 이유로, 주로 약학, 생물학 및 생화학 실험실과 무균실에서, 세척, 살균, 멸균 및 무균이 필요하지 않으면서 일반적으로 용량이 작은 일회용 장비의 사용이 점점 증가하고 있다.

재사용가능한 종래의 생물반응기에 대한 대안책으로, 예를 들어 파형 운동 (wave movement)을 재생하는 교반 플레이트 (stirring plate)에 의해 교반되는 일회용 무균 용기, 예를 들어 웨이브(WAVE)® 생물반응기에서의 배양이 알려져 있다. 하지만, 이러한 생물반응기는 규모 확장 문제를 갖고 있는데, 이는 상기 교반 플레이트가 만들어질 수 있는 크기의, 500리터의 용기는, 상기와 같은 용기를 취급하고, 샘플을 채취하고 배양 매개변수 센서를 배치시키는 데 따른 어려움을 굳이 언급하지 않더라도, 거대한 바닥면을 가져 측정불가능한 무균실 공기 처리 비용이 드는 문제점이 있다.

"스피너 (spinner)"라 불리는 교반된 일회용 플라스크 (flask)와 같은 다른 해결책이 존재한다. 하지만, 이러한 플라스크의 규모 확장은 불가능하고, 상기 플라스크는 교반하는 동안 세포에 스트레스를 줄 뿐만 아니라, 산소 이동이 낮다.

또한, 셀큐브 (CELLCUBE)® 또는 셀팩토리 (CELLFACTORY)® 시스템에서의 배양법이 존재한다. 하지만, 이러한 시스템은 조절이 어렵고 용량이 크다. 또한, 산소 이동이 빈약하고, 크기가 큰 배양기 (incubator)를 필요로 한다. 더욱이, 규모 확장이 어렵다.

벨로셀 (BELLOCELL)®시스템 또한 알려져 있다. 이 시스템은 다공질 매트릭스 (porous matrices)에서 세포를 고정시키는 데 바탕을 두는데, 상기 매트릭스는 배양지대에서 채워진다. 배지는 압축가능한 벨로우즈 (bellows)가 구비된 하부 지대 (lower zone)에 있다. 배지는 배지에 매트릭스를 담그고 그것들을 대기에 노출시키기 위해 교대로 상승 및 하강한다.

하지만, 이 시스템의 규모 확장 또한 어렵다. 배양 매개변수를 조절하고 측정하는 것 또한 어렵다. 더욱이 세포가, 하강 배지 끝 (falling medium edge)에 노출되고, 건조된 후, 상승 배지 끝 (rising medium edge)에 노출되어 그들 표면에서 긴장 스트레스 (tension stress)를 받아, 그들의 성장을 방해한다.

요약하면, 현재 무균실 및 실험실 둘 다에서 사용하기가 편리한 대규모 및 소규모 배양에 적합한 일회용 세포 배양 시스템이 존재하지 않는다.

따라서, 본 발명은 매우 혁신적인 해결책을 마련하였는데, 즉, 담체 또는 미립담체, 또는 현탁액에서의 배양에 적합하며, 소규모 및 대규모로 적용가능한, 예상치 못한 시스템을 획득함으로써, 상기 단점들의 많은 부분을 해결하고, 이러한 장치의 교반을 통해 사각 지대나 세포 축적 지대 없이 배양 배지의 균질성을 획득한다. 또한, 중심 스핀들 (central spindle)의 부재로 인해 오염 위험성이 특히 낮거나, 심지어 전혀 존재하지 않는다.

사실, 본 발명에 따른 장치는, 상기 언급된 종래의 생물반응기의 모든 장점을 나타내면서도 일회용인 장치이다. 본 발명에 따른 장치는, 외부와 전혀 접촉하지 않고 원심 펌프에 기초를 둔 배지 순환 수단에 의해 자기적 (magnetically)으로 교반된다. 예를 들어, 전기 코일과 같은 가열 수단 또한 외부와 접촉하지 않고 배지를 균일하게 가열할 수 있다.

더욱이, 상기 언급된 대로, 특히 바람직한 방식에서, 본 발명에 따른 배양 장치는, 상기 배양 용기를 통해 측정될 매개변수를 나타내는 광신호를 상기 장치 외부에 있는 광신호 수신기에 전달하도록 설계된 일회용 광센서를 포함한다.

따라서, 상기 배양 매개변수는 본 발명에 따른 장치의 벽을 통해 측정되고, 이는 상기 pH 프로브 (probe) 또는 용존 산소가 종래의 생물반응기 뚜껑을 통과하여, 이들 프로브 통로 오리피스가 덜 세척될 위험성과 실링 (seal) 부족으로 인한 오염 위험성을 나타내게 되는 것과 달리, 외부와의 접촉과 관련이 없다.

상기 센서는 본 말명에 따른 장치의 하부 또는 상부 또는 둘 다에 위치할 수 있다. 상기 센서가 상부 및 하부에 존재할 때, 세포 수와 관련하거나 관계없이 단순한 수리적 차이 연산 (mathematical difference operation)에 의해, 세포 호흡 (cell respiration)을 계속적으로 측정할 수 있게 된다.

상기 장치의 다른 실시예는 첨부된 청구항에 나와 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 미립담체 또는 담체 상의 현탁액에서 세포를 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 장치의 용도이다. 본 발명에 따른 장치가 담체 또는 미립담체에서의 배양에 사용될 때, 상기 담체 또는 미립담체는 상기 제2 배양 지대에 포함되어 있다. 상기 장치가 담체 또는 미립담체 없이 현탁액 세포 배양을 위해 사용될 때, 오리피스가 구비된 벽은 세포엔 비투과적이지만 배지엔 투과적인 막이다. 이러한 막의 기공 크기는 전체 크기의 함수 (function)이다. 또한 본 발명은 재조합 생성물, 바이러스, 대사물 등을 생산하기 위한 본 발명에 따른 배양 장치의 용도에 관한 것이다.

재조합 생성물은, 약학 분야의 연구 대상인 단백질, 치료 또는 예방 분자, 항체, 플라스미드 (plasmide), 또는 분비 (secretion) 생산 또는 세포내 생산이든, 배양 세포에 의해 생산될 수 있는 다른 분자를 의미한다.

또한, 본 발명은 다음을 포함하는, 배양 배지의 순환으로 배양 용기에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다:

- 배양 배지 순환 수단으로 배양 배지를 도입하는 단계

- 상기 배양 배지 순환 수단으로부터 배양 배지를 방출하는 단계

- 제1 배양 배지 상향 이동 지대로의 배양 배지의 적어도 하나의 제1 이동 단계; 및

- 제2 세포 배양 지대로의 배양 배지의 적어도 하나의 제2 이동 단계.

이러한 방법은 다음을 포함하는 특징을 지닌다:

- 제1 배양 배지 이동 지대에서 제3 배양 배지 이동 지대로 넘쳐흐르는, 상기 제3 배양 배지 이동 지대로의 상기 제1 배양 배지 이동에 뒤이은 적어도 하나의 제3 배양 배지의 이동 단계; 및

- 제2 배양 지대에서 제4 배양 배지 이동 지대로 넘쳐흐르는, 상기 제4 배양 배지 이동 지대로의 상기 제2 배양 배지 이동에 뒤이은 적어도 하나의 제4 배양 배지의 이동 단계, 여기서 상기 제2 배양 배지 이동은 하향 배양 배지 이동이다.

상기 언급된 미국특허 제US5 501 971호에 기재된 배양 방법과 달리, 본 발명에 따른 배양 배지는 배양 지대를 통해 위쪽으로 이동하여, 상기 배양 지대 하부에서의 세포 축적을 예방하고 상기 세포에 대한 압력 힘 (pressure force)을 줄인다. 따라서, 본 발명에 따른 배양 방법은, 사각 지대 없이, 매우 높은 효율로 배양을 허용하면서 세포가 축적되는 지점 (place) 없이 배양할 수 있는 매우 혁신적인 방법이다.

또한, 상기 방법이 하나 이상의 상기 이동 동안 배양 배지의 산소화를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 산소화가 하나 이상의 상기 이동 동안 직접적인 기체-액체 접촉을 통해서 일어나는 것이 바람직하다.

특정 실시예에서, 상기 산소화는 상기 제4 배양 배지 이동 동안 수행되고, 상기 제4 배양 배지 이동은 배양 배지가 흐름 벽을 따라 흐르는 것이다.

바람직한 실시예에서, 상기 방법은 필름을 안정시키기 위해, 계면활성제, 플루로닉 F68, 글리세린, 사차 암모늄 및 배양 배지의 유동학적 특성을 변경시키기 위한 다른 첨가제로 이루어진 그룹에 포함된 첨가제들을 배양 배지에 첨가하여, 물의 유동학적 특성을 변경시키는 단계를 제공한다.

또한, 배양 배지의 흐름이 친수성 벽을 따라 흐르는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시예는 첨부된 청구항에 나와있다.

본 발명의 따른 특징, 세부사항 및 장점들은 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 제한하지 않는 실시예와 함께 다음의 상세한 설명에서 더욱 명확해질 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 배양 장치의 개략도이다.

도 2는 변형된 배지 순환 수단의 개략도이다.

도 3은 특히 규모 확장에 적합한 몇 개의 연속 배양 지대를 포함하는 본 발명에 따른 배양 장치의 개략도이다.

도 4는 도 3의 변형 실시예를 매우 개략적으로 도시한다.

도 5는 본 발명에 따른 장치의 바람직한 실시예의 배지 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 하부의 횡단면도이다.

도 6은 도 5에 도시된 것과 같은 배지 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 하부의 평면도이다.

도 7은 본 발명에 따른 장치의 동일한 바람직한 실시예의 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 상부의 횡단면도이다.

도 8은 도 7에 도시된 것과 같은 장치의 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 상부의 평면도이다.

도 9는 모듈, 특히 일회용 모듈의 조립체에 의해 생산된 본 발명에 따른 배양 장치의 횡단면도이다.

도 10은 도 9의 분해도이다.

< 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 >

1. 배양 장치

2. 배양 용기

3. 제1 배양 배지 이동 지대

3a. 제1 배양 배지 이동 지대 바닥부

3b. 제1 배양 배지 이동 지대 원통 상부

4. 제3 배양 배지 이동 지대

4a. 제3 배양 배지 이동 지대 바닥부

4b. 제3 배양 배지 이동 지대 원통 상부

5. 제2 배양 지대

6. 제4 배양 배지 이동 지대

7. 자기 장치

8. 중심 회전축

9. 상부 결합 수단

10. 하부 결합 수단

11. 배지 입구

12. 전환 조절벽

13. 배지 출구

14. 배지 안내 수단

15. 제2 배양 지대 하부 벽

16. 제2 배양 지대 상부 벽

17. 제2 배양 지대 상부 및 하부 벽의 오리피스

18. 경사진 벽

19. 배양 용기 뚜껑

20. 기체 입구 오리피스

21. 기체 출구 오리피스

22. 제2 배양 지대 상부 벽에 뚜껑을 고정시키는 수단

23. 센서

24. 조립 수단

24a. 제1 조립 수단

24b. 제2 조립 수단

25. 베이스 모듈의 벽 또는 조절벽

26. 베이스 모듈의 천공

27. 본질적으로 원형인 지대

28. 도관

29. 원형 실(seal)용 리세스

30. 제1 배양 배지 이동 지대와 배지를 교환하는 지대

31. 오리피스로의 접근 리세스

32. 기체 공급 관

33. 센서용 뚜껑의 리세스

34. 원형 실(seal)

m₀ = 베이스 모듈

m₁... 내지 m_n = 배양 모듈

m_t = 헤드 모듈

M = 배양 배지

C = 세포

D = 제4 배양 지대의 벽 상부

도면에서 동일한 또는 유사한 참조 부호는 동일한 또는 유사한 구성요소에 해당한다.

도 1에 도시된 대로, 배양 장치 (1)는, 비록 다른 형태도 본 발명에 따라 고려될 수 있지만, 실질적으로 수직 및 원통형의, 예를 들면 각주형 (prismatic shape), 바람직하게는 정 (regular) 각주형의 배양 용기 (2)를 포함한다. 상기 배양 용기는 서로 교류하는 적어도 4개의 지대를 포함한다. 상기 용기의 중앙에서 외부를 향하여, 상기 용기가 제1 지대 (3), 제3 지대 (4a, 4b), 제2 지대 (5) 및 제4 지대 (6)를 포함한다.

세포를 포함하는 지대는 해치 (hatch)되었고 글자 "C"로 표시되는 반면, 배지는 글자 "M"으로 표시된다.

상기 배양 용기 (2)는 그것의 바닥부에 배지 순환 수단을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 배지 순환 수단은 자기 장치 (7), 예를 들어 중심 회전 축 (8) 주위를 실제 또는 가상으로 회전하는 자기 막대 (7)로 이루어지고, 그것의 제1 끝단 (end)은 상부 결합 수단 (top engagement means)(9)에 수용되고, 그것의 제2 끝단은 하부 결합 수단 (bottom engagement means)(10)에 수용된다. 상기 자기 막대는 상기 배양 용기 (2) 외측에 있는 회전 자기 구동 모터 (rotary magnetic drive motr)[미도시]에 의해 가동된다. 상기 순환 수단은 적어도 하나의 배지 입구 (11)를 포함한다. 상기 배지 입구 (11)는, 배지 흐름을 위한 전환 조절벽 (diversion baffle)(12)에서 끝나는 적어도 하나의 제1 끝단을 포함한다. 상기 자기 막대는 원심 펌프로서 기능하는데, 즉 배지가 상기 막대에 의해 만들어진 배지 이동에 의해 상대적으로 중심인 지대로 빨려들어가고, 상기 중심점 (central point)에 대해 외부로 내보내진다. 상기 배지 전환 조절벽 (12)은 배지를 상기 막대의 상대적으로 중심인 지대로 안내하여, 배지가 그것 안으로 빨려들어간 후, 외부로 내보내진다.

상기 입구 (11)는 동일한 면 [별 (star) 형태]에 있고, 입구 (11) 개수 (number)는 그들의 위치가 대칭 (symmetry)을 보여줄 정도의 수 (number)인 것이 바람직할 것이다. 더 바람직하게는, 만일 입구가 3개라면, 그들 각각이 약 120˚의 각도로 서로 이격되는 것이 바람직하고, 만일 입구가 4개라면, 그들은 거의 90˚의 각도로 서로 이격될 것이고, 만일 입구가 10개라면, 그들은 약 36˚의 분리각도 (separation angle)로 배열될 것이다.

또한, 상기 배지 순환 수단이 적어도 하나의 배지 출구 (13)를 갖는다. 상기 배지 출구 (13)는, 배지가 상기 자기 막대의 원심 효과에 의해 내보내지는 지점 (point)에 위치하는 것이 바람직하다.

상기 출구 (13)의 개수는 그들의 위치가 대칭을 보여줄 정도의 수 (number)인 것이 바람직할 것이다. 더 바람직하게는, 만일 출구가 3개라면, 그들 각각이 약 120˚의 각도로 서로 이격되는 것이 바람직하고, 만일 출구가 4개라면, 그들은 거의 90˚의 각도로 서로 이격될 것이고, 만일 출구가 10개라면, 그들은 약 36˚의 분리각도로 배열될 것이다.

상기 출구가 상기 입구와 동일한 수평면에 위치하지 않는 것이 바람직하다. 상기 배양 용기의 하부는, 상기 적어도 하나의 출구 (13)에 인접한 적어도 하나의 배지 안내 수단 (guiding mean)(14)을 포함하고, 이 안내 수단은 배양 배지를 상기 배양 용기 (2)의 상부쪽으로 보내지도록 안내한다.

상기 배양 용기 (2)의 제1 지대 (3)는 실질적으로 중심인 지대이면서 배지 이동 지대이다. 상기 제1 지대 (3)는 바닥부 (basal part)(3a) 및 원통부 (cylindrical part)(3b)를 포함한다. 상기 바닥부 (3a)의 직경은 상기 배양 용기 (2)의 직경보다 작다. 상기 바닥부 (3a)는 상기 배지 순환 수단의 적어도 하나의 배지 출구 (13)와 배지를 교환한다. 상기 바닥부 (3a)는 상기 제1 지대 (3)의 상부에서 바닥부 (3a)보다 직경이 작은 원통부 (3b)로 감소된다. 상기 상부 원통부 (3b)는 외벽 (external wall)을 포함하고, 상기 제1 배지 이동 지대의 바닥부 (3a)와 배지를 직접적으로 교환한다.

제3 지대 (4)는 상기 제1 배지 이동 지대 (3) 외측에 있는 배지 이동 지대이다. 또한, 상기 제3 지대는 실질적으로 바닥부 (4a)[슬리브 (sleeve) 형태] 및 실질적으로 원통 상부 (4b)를 포함한다.

상기 제3 배지 이동 지대 (4)의 실질적으로 원통부 (4b)는 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 원통부 (3b)와 기본적으로 중심이 같고, 이러한 두 지대는 배지를 교환한다. 이러한 배지 교환은, 오리피스 (orifice) 또는 관 (tube), 오버플로잉 (overflowing)[도면에 도시된 대로], 또는 이러한 교환을 달성하기 위한 다른 가능한 수단을 통해 달성된다.

제2 지대 (5)는 담체 또는 미립담체가 있는 또는 그것들이 없는 세포 배양 지대이다. 또한, 상기 제2 지대 (5)는 슬리브 형태이고, 그것의 중앙에 상기 제1 배지 이동 지대 (3) 및 제3 배지 이동 지대 (4)가 있다.

상기 제2 지대 (5)는 하부 벽 (15) 및 상부 벽 (16)을 포함하는데, 각각의 하부 벽 (15) 및 상부 벽 (16)은, 반드시 세포가 없는 배양 배지를 이동시킬 수 있게 하는 오리피스 (17)가 구비된다. 상기 제2 배양 지대 (5)는, 배지의 이동을 허용하는 하부 벽 (15)에 있는 오리피스 (17)를 통해 상기 제3 배지 이동 지대 (4)의 상대적 바닥부 (4a)와 배지를 교환한다.

제4 지대 (6)는 상기 제2 배양 지대 (5) 외측에 있으면서 상기 배양 용기 (2) 내측에 있는 배지 이동 지대이다. 상기 제4 지대 (6)는 상기 제2 배양 지대 (5)와 배지를 교환한다. 또한, 상기 제4 지대 (6)는, 상기 적어도 하나의 입구 (11)를 통해 상기 배지 순환 수단과 배지를 교환한다. 상기 배지 교환은, 오리피스 또는 관, 오버플로잉, 또는 이러한 교환을 달성하기 위한 다른 가능한 수단을 통해 달성된다.

본 명세서에 설명된 특정 실시예는 실질적으로 원통형 배양 용기를 포함하지만, 상기 언급된 것과 같은 다른 실시예, 예를 들어 실질적으로 각주형 용기, 바람직하게는 정각주형 용기가 고려될 수 있다. 상기 배양 용기는 분명히 다양한 배지 및 배양 이동 지대를 지닌다. 또한, 상기 배양 용기는 각주형, 바람직하게는 정각주형일 수 있고, 어떤 형태의 결합도 가능하다. 이 경우, 상기 용어 "슬리브"는 구상한 각주의 단면 (cross-section)과 유사한 단면을 지닌 엔벨로프 (envelope)로 구상되어야만 한다.

상기 배지 순환 수단이 작동할 때, 배지는 상기 적어도 하나의 출구 (13)를 통해 상기 배지 순환 수단을 떠나고, 다양한 출구 (13)가 있어 이를 통해 상기 안내 수단 (14)에 의해 전환될 때, 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 바닥부 (3a)에서 끝난다. 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 구조 및 상기 펌프의 출력 (output)으로, 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 원통부 (3b)쪽으로 배지가 향하도록 한다. 배지가 상기 실질적으로 원통부 (3b)의 벽 상부에 도달할 때, 상기 제3 배지 이동 지대 (4)로 넘쳐흐른다.

배지 (M)의 순환 방향이 도면에서 화살표로 표시된다.

이러한 특정 실시예에서, 효율성 및 유속을 이유로, 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 원통부 (3b) 벽이, 상기 제3 배지 이동 지대 (4)의 벽보다 높지 않다는 것은 당업자에게 분명하지만, 또한 상기 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질 적으로 원통부 (3b) 벽이 상기 제3 배지 이동 지대 (4)의 실질적으로 원통부 (4b) 벽보다 높을 수 있다는 것도 당업자는 쉽게 알 수 있다.

따라서, 배지는 상기 펌프에 의해 가해진 유속 및 중력에 영향받고, 상기 실질적으로 원통부 (4b) 아래로 흐르는 제3 배지 이동 지대 (4)로부터 아래쪽으로 향하여, 상기 제3 배지 이동 지대 (4)의 실질적으로 바닥부 (4a)에 도달한다. 그런 다음, 배지는 상기 펌프에 의해 가해진 유속에 의해 연통관 효과를 통해 상승 방향으로 흘러, 상기 제2 배양 지대 (5)의 상부에 도달한다. 배지가 오리피스 (17)를 통해 상기 제3 배지 이동 지대 (4)에서 상기 제2 배양 지대 (5)에 도달하는데, 상기 오리피스 (17)는 상기 제2 배양 지대 (5)의 하부 벽 (15)에서 세포가 실질적으로 없는 배지의 통로이다.

상기 언급됐듯이, 배지 통로 오리피스 (17)는 배양의 유형에 따라 크기가 달라진다. 만일 배양물이 담체가 없는 배양물이라면, 오리피스 (17)를 포함하는 벽 (15) 또는 (16)은 다공성 막 (porous membrane)일 것이고, 여기서 기공의 크기는 세포의 직경보다 작다. 만일 배양이 미립담체 또는 담체에서 이뤄진다면, 상기 오리피스 (17)의 크기는 상기 미립담체 또는 담체의 크기보다 작을 것을 것이다.

배지의 흐름 끝이 상기 제2 배양 지대 (5)의 벽 상부에 도달할 때, 제4 배지 이동 지대 (6)로 넘쳐흐른다. 당연히, 만일 오리피스 또는 관이 존재한다면, 배지의 흐름 끝이 상기 오리피스 또는 관에 도달할 때, 그것이 상기 제4 지대 (6)로 흐르다는 것이 이해되어야만 한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 제4 배지 이동 지대 (6)는 경사 진 벽 (18)을 포함하는데, 배지가 상기 제2 지대 (5)에서 상기 제4 지대 (6)로 통과할 때 상기 벽 위로 흐른다. 상기 경사진 벽 (18)은, 그 위에서 필름 형성을 향상시키기 위해 친수성 막을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 필름은, 가능한 기포 형성을 막기 위해 얇은 판 (laminar)인 것이 바람직하다. 상기 필름을 안정시키기 위하여, 계면활성제, 플루로닉 F68, 글리세린, 사차 암모늄 및 배양 배지의 유동학적 특성을 변경시키기 위한 다른 첨가제로 이루어진 그룹에 포함된 첨가제를 배양 배지에 첨가하여, 물, 특히 배양 배지의 유동학적 특성을 변경시킬 수 있다.

상기 친수성 막은 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (polyoxyethylene)으로 이루어진 막일 것이다.

상기 경사진 벽 위의 필름 형성은, 그것이 "얇은 막 (thin film)"에서의 산소화를 허용하기 때문에 중요한 단계이다. 실제로, 상기 제4 배지 이동 지대에서 배지의 양에 대한 기체량은 크고 배지 교환을 향상시킨다. 또한, 경사진 벽 위의 필름 형성은 기체-액체 접촉 표면적을 증가시킨다.

도 1에 도시된 대로, 상기 배양 용기는, 적어도 하나의 기체 입구 오리피스 (20) 및 적어도 하나의 기체 출구 오리피스 (21)가 통과하는 뚜껑 (19)을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 기체 입구 오리피스 (20)는, 상기 제4 배지 이동 지대 (6)와 직접적으로 교류하도록 위치하는 것이 바람직하다. 일부 변형 실시예에서, 상기 기체 입구 오리피스 (20)가 상기 배양 용기 (2)의 수직 벽 또는 상기 배양 용기 (2)의 하부에 존재하는 것이 바람직할 것이고, 즉 기체가 오리피스 (20)를 통해 상기 뚜껑 (19)과 마주보는 상기 배양 용기 (2)의 벽을 통과하고, 상기 오리피스 (20)는 액체 수위 (liquid level) 위로 말단을 갖는 관을 구비하는 것이 바람직하다 (도 9 참조).

이 실시예에서, 상기 뚜껑 (19)은 고정 수단 (22)에 의해 상기 제2 배양 지대 (5)의 상부 벽 (16)에 고정된다. 변형 실시예에서, 상기 뚜껑 (19)은 상기 제2 배양 지대 (5)의 상부 벽 (16)의 일체부 (integral part)로 만들어질 수 있고, 상기 배양 용기 (2)의 뚜껑 (19)이 들어올려질 때, 상기 일체부가 열린다. 이런 방법으로, 예를 들어 세포 밀도, 세포 구조 및 배양액의 건강 상태를 반영하는 세포의 다른 물리적 특성을 평가하기 위해 담체와 함께 또는 그것들 없이 세포 샘플을 평가하는 것이 쉽다. 실제로, 이 두 개를 함께 연결함으로써, 단지 상기 배양 용기 (2)의 뚜껑 (19)을 올리는 것으로 상기 배양 격실 (compartment)(5)을 열 수 있다.

현탁액에서 배양하는 경우, 다공성 막을 상기 제2 배양 지대 (5)의 오리피스 (17)가 구비된 상부 벽 (16)에 연결하는 것이 바람직할 수 있고, 이러한 조립을 통해, 샘플을 채취하기 위한 뚜껑/막 조립체의 경직성 (rigidity)을 개선할 수 있다.

도 2는 상기 배지 순환 수단의 자기 장치의 변형 실시예를 도시한다. 자기 막대 (7)는 나선 (helix) 형태를 갖는다. 실질적으로 중심인 회전 축 (8)과 자기 막대 (7)의 설계는 기본적으로 상기 배양액 용량에 의존할 것이다. 실제로, 용량이 작은 배양액의 경우, 본 발명은, 배지를 순환시키기 위한 자기 칩 (magnetic chip)과 같은 단순한 막대를 사용할 수 있도록 설계한다. 용량이 큰 배양액의 경우, 본 발명은 외부 모터, 예를 들어, 높은 배지 순환률을 허용하는 수족관 (aquarium)에서 사용되는 것과 같은 로터 (rotor)에 의해 가동되는 자기 로터 (magnetic rotor) 을 고려한다.

또한, 본 발명에 따라, 기포 생산 장치 (미도시), 더 일반적으로, 생산된 기포의 크기에 따라 "스파저 (sparger)" 또는 "마이크로스파저 (microsparger)"라 불리는 장치를 사용하는 것이 고려될 수 있다.

기포가 사용될 때, 상기 기포 생산 장치, 예를 들면 관의 관통 끝단 (pierced end)이 상기 제4 배지 이동 지대의 하부 또는 상기 제1 배지 이동 지대에 있는 배지에 잠길 것이다. 이러한 유형의 산소화가 선택될 때, 얇은 필름에서 산소화가 계속될 수 있으며, 이것이 기체의 흐름을 줄이고 기포를 덜 형성함으로써, 거품 형성을 줄일 수 있다. 이러한 경우, 상기 장치는 상기 배양 용기의 뚜껑 또는 배양 용기의 수직 벽에 두 개의 기체 입구를 갖도록 구성된다. 또한, 상기 기포 생산 장치가 오로지 위급한 상황 시의 대응방법으로만 존재하고 오직 필요시에만 사용되도록 고안될 수 있다.

또한, 상기 배양 장치는 예를 들어, 용존 산소 분압 pO2, 산도 pH, 온도, 혼탁 (cloudiness), 흡광도, 포도당, CO2, 락테이트, 암모늄 및 세포 배양을 모니터하기 위해 일반적으로 사용된 다른 매개변수에 대한 일련의 배양 매개변수 센서 (23)를 포함한다. 이러한 센서는, 상기 배양 용기의 내부와 그것의 외부 사이에 연결 부위가 필요없는 광센서인 것이 바람직하다. 이러한 센서 (23)의 바람직한 위치는, 이 위치에서 상기 센서가 상기 배양 용기 (2)의 벽에 가깝게 위치하고, 바람직하게는, 배지 (M)가 세포를 통과하기 전 또는 바로 그 후에 상기 배지 (M)가 통과하는 지대에 있는 전략적 위치 (strategic position)에서 배지 (M)와 접촉하는 임 계 (critical) 위치인 것이 바람직하다.

사실상, 본 발명은 상기 언급된 모든 간소함 및 경제성을 이유로 일회용 생물반응기를 마련할 것을 고려한다. 따라서 이러한 이유로, 상기 배양 용기의 내부와 외부 사이의 연결 부분이 줄어든다. 또한, 본 발명에 따른 생물반응기는, 일회용이기 때문에 오염 위험성이 특히 낮은 믿을만한 생물반응기를 획득하는 것을 고려한다.

도 3에 도시된 대로, 본 발명에 따른 장치는 또한 큰 용량의 배양액에 대해 일련의 모듈들을 포함하는 모듈러 (modular) 설계를 고려한다. 예를 들어, 이러한 유형의 모듈러 설계에 따라, 매우 제한된 수의 표준 모듈들을 사용하고도, 약 500ml 내지 100리터의 배양액 용량을 고안할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 제1 배지 이동 지대 (3) 주위를 "슬립(slipped)"하여, 배지 순환 수단과 뚜껑 (19)을 포함하는 표준 배양 용기 (2)에 놓일 수 있는 일련의 모듈들을 제공하도록 고안된다.

특히 바람직한 변형 실시예에서, 본 발명은 다양한 표준 묘듈들을 포함하는 마운팅 시스템 (mounting system)을 마련할 것을 계획한다. 예를 들면, 이러한 표준 모듈들은, 상기 조립체 하부에 놓이는 순환 수단 모듈, 하나 이상의 배양 모듈 및 뚜껑 모듈이다. 본 발명에 따라, 비록 이런 모듈을 고정하는 다른 수단이 고려될 수 있지만, 상기 모듈들은, 예를 들어 액체 및 기체 측면에서 완전히 불투과성인 급속 커넥터 (rapid connector)에 의해, 서로 클램프 (clamp)될 것이다.

따라서, 배양액의 유형 및 필요한 용량에 따라, 사용자는 상기 장치에서 배 지 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈을 빼낼 수 있을 것이고, 또한 그것으로부터 필요한 배양액 용량에 따라 필요한 수만큼의 배양 모듈들을 빼낸 후, 뚜껑에 해당하는 헤드 모듈을 꺼내야만 할 것이다. 그런 다음, 이러한 모든 모듈들이 무균 방식으로 묶이기 때문에, 사용자는 단지 그것들을 풀러, 하나 위에 다른 하나를 차곡차곡 "고정 (clip)" 시킬 필요가 있을 것이다. 상기 적층 (stacking)이 "일회용 생물반응기"를 형성할 수 있거나 적당한 용기에 놓일 수 있다.

그러므로, 도 3은 본 발명에 따른 모듈러 배양 장치의 일 실시예를 도시한다.

상기 배양 장치 (1)는, 도 1에 상세히 설명된 것과 같은 배지 순환 수단을 포함하는 배양 용기 (2)를 포함한다. 상기 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈 (m₀)은 상기 배양 용기 (2) 하부에 고정되거나, 상기 배양 용기 (2)(서술된 실시예) 내로 슬라이드 (slid)되어, 그것을 배치하고 또 다른 배양을 위해 또 다른 모듈을 사용할 수 있게 하여, 교차 오염을 막을 수 있다.

상기 베이스 모듈 (m₀)은 상기 순환 수단을 포함한다. 도 1에 도시된 대로, 이러한 순환 수단은 중심 회전 축 (8) 주위를 회전하는 자기 장치 (7), 상부 결합 수단 (9)에 수용된 제1 끝단, 및 하부 결합 수단 (10)에 수용된 제2 끝단을 포함한다. 상기 순환 수단은 적어도 하나의 배지 입구 (11)를 포함한다. 또한, 상기 배지 순환 수단은 적어도 하나의 배지 출구 (13)를 포함한다.

상기 배양 용기의 베이스 모듈 (m₀)은 상기 적어도 하나의 출구 (13)에 인접 한 적어도 하나의 배지 안내 수단 (14)을 포함하고, 이 안내 수단이 배양 배지를 상기 배양 용기 (2)의 상부쪽으로 보내지도록 안내한다.

상기 배양 용기 (2)는, 본 실시예에서 적층된 일련의 배양 모듈들 (m₁, m₂, ..., m_n)을 포함한다. 또한, 이 모듈들은 단순히 서로 인접하도록 고안, 즉 나란히 (side by side) 놓일 수 있다. 도 3에 도시된 실시예에서, 모듈들은 급속 커넥터 (24) 또는 클립에 의해 서로 클램프된다.

각각의 배양 모듈 (m₁, m₂, ..., m_n)은 제1 지대 (3), 제2 지대 (4), 제3 지대 (5) 및 제4 지대 (6)를 포함한다. 상기 지대 (3), (4), (5) 및 (6)들은 각각 도 1에 언급된 것과 동일한 기능을 갖는다.

또한 각각의 모듈이, 각각의 배양 모듈의 제4 지대 (6)와 교류하여 기체 또는 기체 혼합물 입구 (미도시)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 상기 용기는 잉여 기체 (excess gas) 또는 기체 혼합물용 출구 (미도시)를 그것의 일부로 포함할 수 있다. 예를 들면, 기체 입구 오리피스가 상기 배양 용기 (2) 하부에 존재할 수 있는데, 즉 기체가 오리피스를 통해 뚜껑 (3)과 마주보는 배양 용기 (2)의 벽을 통과하고, 이 오리피스 (20)는 모듈 (m₁)의 액체 수위 [도 9 참조] 위로 말단을 이루도록 한 관이 구비된다. 그 결과, 기체 혼합물이 이 모듈의 제4 배지 이동 지대 (6)에 도달한다. 또한 상기 모듈 (m₁) 위에 놓인 모듈 (m₂)은, 상기 배양 모듈 (m₁)의 제4 지대 (6)에 존재하는 기체 혼합물을, 상기 모듈 (m₂)의 제4 지대 (6) 와 교류시킬 수 있는 관을 포함할 수 있다. 따라서, 이 관이 상기 모듈 (m₂)의 하부 벽을 통과하는 것이 바람직하다.

특정 실시예에서, 장기간의 배양 동안, 일부 배양 배지를 새로운 배지로 대체하거나, 영양분 추가를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 베이스 모듈 (m₀)은 영양분 입구 (미도시)를 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 상기 배양 용기가 상기 배지 순환 수단에서, 오버플로잉 (overflowing)을 막기 위한 배지 출구 (미도시)를 포함할 수 있다.

유사한 방식으로, 상기 배양 용기 (2)는, 도 1에 있는 것과 같이, 상부에 놓인 모듈 (m_n)에서의 샘플 채취를 단순화하기 위해, 고정 수단 (22)을 통해, 배지 통로 오리피스 (17)가 구비된 상부 벽 (16)과 바람직하게 연결된 뚜껑 (19)을 포함하는 헤드 모듈을 포함한다.

또한 바람직하게는, 배양 매개변수 센서가 각각의 배양 모듈에 제공될 수 있다. 모든 지대 또는 베이스 모듈에 있는 단 하나의 배양 모듈 또는 여러 개의 배양 모듈들에 센서를 제공하는 것이 가능하다.

도 3에 도시된 실시예에서, 배지가 다음의 방식으로 순환한다. 간단히 설명하기 위해, 오직 두 개의 배양 모듈 (m₁)과 (m₂) 및 베이스 모듈 (m₀)을 사용할 것이지만, 본 발명에 따른 배양 장치가 매우 많은 모듈들을 포함할 수 있다는 것이 분명하다.

상기 베이스 모듈 (m₀)에서, 배지는 상기 적어도 하나의 출구 (13)를 통해 배지 순환 수단 (M)으로부터 내보내지고, 몇 개의 출구가 있을 때는, 이러한 다양한 출구 (13)를 통해 안내 수단 (14)에 의해 전환된다. 이것은 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 바닥부 (3a)에서 끝난다. 본 실시예의 실질적으로 바닥부 (3a)는 모든 상기 배양 모듈들에 공통적인 지대이고, 본 실시예에 도시된 것처럼 베이스 모듈에 놓인다. 상기 배양 모델이 적층되거나 병치되는지는 중요하지 않다.

본 발명에 따른 장치의 제1 배지 이동 지대 (3)의 구조 및 펌프 출력으로, 배지가 상기 제1 모듈 (m₁)의 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 원통부 (3b)쪽으로, 상기 제2 모듈 (m₂)의 제1 배지 이동 지대 (3)의 실질적으로 원통부 (3b)쪽으로 향하게 된다.

본 실시예에서, 이것은 실질적으로 원통부 (3b)를 포함하는 넓은 제1 배지 이동 지대 (3)를 만드는 모듈들의 조립이다.

배지가 제2 배양 모듈 (m₂)의 실질적으로 원통부 (3b) 벽 상부에 도달할 때, 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제3 배지 이동 지대 (4)로 넘쳐흐른다.

배지 M의 순환 방향은 화살표로 나타낸다.

따라서, 배지는 상기 펌프에 의해 가해진 유속과 중력에 영향받고, 제2 배양 모듈 (m₂)의 실질적으로 원통부 (4b) 아래로 흐르며, 제2 배양 모듈 (m₂)의 제3 배지 이동 지대 (4) 하부쪽으로 향하고, 제2 배양 모듈 (m₂)의 제3 배지 이동 지대의 실질적으로 바닥부 (4a)에 도달한다. 그런 다음, 배지는 상기 펌프에 의해 가해진 유속 및 연통관 효과를 통해 상승 방향으로 흘러, 제2 배양 모듈 (m₂)의 제2 배양 지대 (5)의 상부에 도달한다. 상기 배지는, 제2 배양 모듈 (m₂) 하부 벽 (15)의 실질적으로 세포가 없는 배지 통로 오리피스 (17)를 통해, 제2 배양 모듈 (m₂)의 제3 배지 이동 지대 (4)로부터 제2 배양 모듈 (m₂)의 제2 지대 (5)에 도달한다.

배지의 흐름 끝이 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제2 배양 지대 (5)의 외벽 상부에 도달할 때, 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 배지 이동 지대 (6)로 넘쳐흐른다. 당연히, 만일 오리피스 또는 관이 상기 배양 지대 (5)의 외벽에 존재한다면, 배지의 흐름 끝이 상기 오리피스 또는 관에 도달할 때, 그것이 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 지대 (6)로 흐른다는 것이 이해되어야만 한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 배지 이동 지대 (6)는 경사진 벽 (18)을 포함하는데, 배지가 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제2 지대 (5)에서 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 지대 (6)로 통과할 때 상기 벽 위로 흐른다. 상기 경사진 벽 (18)은, 그 위에서 필름 형성을 향상시키기 위해 친수성 막을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 필름은, 가능한 거품 형성을 막기 위해 얇은 판인 것이 바람직하다. 상기 필름을 안정시키기 위하여, 상기 언급된 것과 같은 첨가제들을 배양 배지에 첨가하여, 물의 유동학적 특성을 변경시킬 수 있다.

그런 후, 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 배지 이동 지대 (6)에 존재하는 배양 배지가 관을 통해, 또는 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제4 배지 이동 지대 (6)의 벽 상부 (D) 넘어로 흘러넘쳐, 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제3 배지 이동 지대 (4)로 들어간다.

따라서, 배지는, 상기 펌프에 의해 가해진 유속과 중력에 영향받고, 제1 배양 모듈 (m₁)의 실질적으로 원통부 (4b) 아래로 흐르며, 제1 배양 모듈 (m₁)의 제3 배지 이동 지대 (4)로부터 아래로 향하고, 제1 배양 모듈 (m₁)의 제3 배지 이동 지대의 실질적으로 바닥부 (4a)에 도달한다. 그런 다음, 배지는 상기 펌프에 의해 가해진 유속 및 연통관 효과를 통해 상승 방향으로 흘러, 제1 배양 모듈 (m₁)의 제2 배양 지대 (5) 상부에 도달한다. 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 하부 벽 (15)에 있는 세포가 없는 배지 통로 오리피스 (17)를 통해, 배지가 제1 배양 모듈 (m₁)의 제3 배지 이동 지대 (4)로부터 제1 배양 모듈 (m₁)의 제2 지대 (5)에 도달한다.

배지의 흐름 끝이 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제2 배양 지대 (5) 벽 정상에 도달할 때, 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)로 넘쳐흐른다. 분명히, 만일 오리피스 또는 관이 이 벽에 존재한다면, 배지의 흐름 끝이 상기 오리피스 또는 관에 도달할 때, 그것이 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)로 흐른다는 것이 이해되어야만 한다.

상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)는 경사진 벽 (18)을 포함할 수 있는데, 배지가 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제2 배양 지대 (5)에서 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)로 통과할 때 상기 벽 위로 흐른다. 상기 경사진 벽은, 상기와 같은 친수성 막이 구비되는 것이 가능하다.

그런 다음, 배지는 입구 (파이프)(11)를 통해, 상기 베이스 모듈 (m₀) 및 배지 순환 수단으로 돌아가고, 즉 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)에 존재하는 배양 배지가 관을 통해, 또는 상기 제1 배양 모듈 (m₁)의 제4 배지 이동 지대 (6)의 벽 상부 넘어로 흘러넘쳐, 파이프 (11)로 들어가서, 베이스 모듈 (m₀)의 본 발명에 따른 배지 순환 수단을 구성하는 상기 원심 펌프에 의해 만들어진 사이펀 (siphon)의 실질적으로 중심인 지대에서 끝난다.

상기 실시예의 변형 실시예에서, 도 4에서는 매우 개략적으로 도 9에서는 자세히 도시된 대로, 적층된 모듈들 (m)이 배양 용기를 구성한다. 도 4의 변형 실시예에서, 예를 들어 4개의 지대들 및 헤드 모듈 (m_x)[미도시]을 포함하는, 3가지 종류의 모듈들, 베이스 모듈 (m₀), 모듈들 (m₁, m₂, ..., _n)이 존재할 수 있다. 상기 베이스 모듈 (m₀) 또는 바닥 모듈 (m₀)은 배지 순환 수단 및 조립 수단 (assembly means)을 포함하고, 상기 설명된 것과 같은 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)의 제1 조립 수단 (24a)과 결합하고, 상기 용기의 하부를 구성하도록 설계된다. 상기 헤드 모듈 (m_t)은 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)의 제2 조립 수단 (24b)과 결합하도록 설계된다. 상기 베이스 모듈 (m₀)에 의해 결합된 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)은, 헤드 모듈 (m_t)에 의해 결합된 것과 동일할 수 있거나, 상기 베이스 모듈 (m₀)에 의해 결합된 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)은, 일련의 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)에서 첫 번째 제4 지대일 수 있고, 그 결과 상기 헤드 모듈 (m_t)에 의해 결합된 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)은, 상기 일련의 4개 지대들의 모듈들 (m₁, ₂, ..., _n)에서 두 번째 제4 지대일 수 있다.

이 변형 실시예는 도 3에서 상세히 설명된 것과 동일한 방법으로 기능한다.

도 5 및 6은 상기 베이스 모듈 (m₀)의 바닥부 절반을 도시한다. 도 5는 단면도이고, 도 6은 평면도이다. 도시된 대로, 배지가 도면에서 "x"로 표시된 실질적으로 중심인 지역에서 적어도 하나의 입구를 통해 베이스 모듈로 들어가도록 설계된다. 상기 자기 장치 (7)의 회전 축이 실제 또는 가상의 상기 중심 "x"를 통과한다. 상기 순환 수단이 작동할 때, 상기 자기 장치 (7)가 그것의 회전 축 주위를 회전하고, 그것의 회전이, 상기 배지 순환 수단 내에서 배지를 빨아들이는 사이펀을 만든다. 상기 자기 장치가 회전하는 지대는 조절벽 또는 벽 (25)으로 둘러싸인다. 이 실시예에서, 두 개의 조절벽이 도시되었으나, 그들의 개수는 더 많이, 예를 들면 3, 4, 5, 6, 8, 10 등일 수 있다. 상기 조절벽이 본 명세서 전체에 의해 정의된 상 황에서 대칭적으로 배치되는 것이 바람직할 것이다.

상기 조절벽 (25)들 사이의 공간 (13)은 배지 출구 오리피스이다. 실제로, 배지가 자기 장치의 회전에 의해 만들어진 사이펀에 의해 빨아들여져, 상기 조절벽들 사이의 오리피스 (13)를 통해, 조절벽 (25)들에 의해 경계가 정해진 지대 외부쪽으로 방출된다. 두 개의 조절벽 (25)이 도시되었기 때문에, 본 실시예에서 두 개의 배지 출구 오리피스가 있지만, 그들의 개수는 더 많이, 예를 들면 3, 4, 5, 6, 8, 10 등일 수 있다. 상기 조절벽이 대칭적으로 배치되는 것이 바람직한 것처럼, 상기 배지 출구 (13)도 대칭적으로 배치되는 것이 바람직하다. 배지가 상기 출구 (13)에 의해 방출됐을 때, 원형 지대 (27)에서 끝난다.

이 실시예에서, 상기 베이스 모듈 (m₀)의 바닥부는 그것 내에 오리피스 (20)를 갖는데, 이 오리피스는 실질적인 관 형태로, 예를 들어 기체, 기체 혼합물, 새로운 배지의 공급, 기체 또는 기체 혼합물의 방출, 배지의 제거 등을 허용하는 형태의 관이다.

또한, 리세스 (recess)(31)는 외부로부터 상기 오리피스 (20)에 접근하기 위해 제공되며, 상기 오리피스에 기체 또는 기체 혼합물, 새로운 배지 등을 공급시킬 수 있다.

도 7은 본 발명에 따른 베이스 모듈 (m₀)의 상부의 단면도이고, 도 8은 이와 동일한 부분의 평면도이다. 상기 상부는 실질적인 관-형태의 배지 입구 오리피스 (11)를 포함한다. 이 입구 오리피스 (11)는, 본 발명에 따른 장치 (1)의 제4 배지 이동 지대 (6)로부터 들어오는 배지를 상기 자기 장치의 회전에 의해 만들어진 사이펀으로 안내한다. 상기 자기 장치가 회전할 때, 도 5 및 6에 도시된 원형 지대 (27)에 위치한 배지가 천공 (perforation)(26)으로 들어가고, 상기 천공 (26)은, 도관 (28)과 교류하여, 방출된 배지를 본 발명에 따른 장치의 제1 배지 이동 지대 (3), 특히 상기 제1 배지 이동 지대의 관형부 (tubular part)와 배지를 교환하는 지대 (30)에 도달시킬 수 있다.

도 7에 도시된 상부는, 도 5에 도시된 하부에 배치되도록 설계된 소자 (element)이다. 당연히, 이 베이스 모듈 (m₀) 또한 또 다른 방법으로 획득될 수 있지만, 생산의 단순화를 이유로, 함께 연결될 수 있는 두 부분 (parts)으로 본 실시예에서 생산된다. 또한, 도시된 대로, 상기 상부와 하부는 도 5 및 7에 도시된 리세스 (29)에서 바람직한 실링 (sealed) 방식으로 함께 연결된다.

또한, 본 출원서에 도시된 모든 배지 순환 수단은 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 상기 베이스 모듈에 포함되거나 또는 그렇지 않은 상기 배지 순환 수단의 다양한 실시예를 만들기 위한 모든 방법들이 본 발명의 청구 범위 내에 포함된다는 것은 당연하다.

도 9는 본 발명에 따른 장치의 특히 바람직한 실시예의 단면도인 반면, 도 10은 상기 동일한 실시예의 분해도이다. 상기 분해도는 특히 본 발명의 실용성 및 진보성을 명확히 이해시키는 데 도움이 된다.

따라서, 상기 두 개의 도면은 동시에 설명될 것이다. 도시된 대로, 본 발명 에 따른 장치는 하부에서 상부까지 다음의 클램프된 적층으로 이루어진다:

- 자기 장치가 조절벽 (25)에 둘러싸여 회전하는 지대를 포함하는 베이스 모듈 (m₀)(m_0a)의 하부. 이 도면에 도시된 조절벽 (25)들 사이의 공간 (13)은 배지 출구 오리피스이다. 이것은, 배지가 상기 자기 장치의 회전에 의해 만들어진 사이펀에 의해 빨아들여지고, 상기 조절벽 (25)들 사이의 공간 (13)을 통해 상기 조절벽 (25)들에 의해 경계가 정해진 지대의 외부 (원형 지대)(27)쪽으로 방출되기 때문이다;

- 실질적인 관 형태의 배지 입구 오리피스 (11)를 포함하는 베이스 모듈 (m₀)(m_0b)의 상부. 이 입구 오리피스 (11)는, 본 발명에 따른 장치 (1)의 제4 배지 이동 지대 (6)로부터 들어오는 배지를 상기 자기 장치 (7)의 회전에 의해 만들어진 사이펀으로 안내한다. 상기 자기 장치가 회전할 때, 원형 지대 (27)에 위치한 배지가 천공 (26)으로 들어가고, 상기 천공 (26)은 도관 (28)과 교류하여, 방출된 배지를 본 발명에 따른 장치의 제1 배지 이동 지대 (3), 특히 상기 제1 배지 이동 지대의 관형부와 배지를 교환하는 지대 (30)에 도달시킬 수 있다;

- 도 3의 설명에서 자세히 설명된 것과 같은 제1 배양 모듈 (m₁);

- 제2 배양 모듈 (m₂)[도 3 참조]; 및

- 배양 배지에 잠긴 광센서 (23)가 구비된 리세스 (33), 상기 제2 배양 모듈 (m₂)의 제2 배양 지대 (5)의 상부 벽 (16) 부분 (16a)에 연결된 고정 수단 (22)을 포함하는 뚜껑 (19)을 포함하는 헤드 모듈.

모든 모듈들은 도 4, 9 및 10에 개략적으로 도시된 것과 같은 고정 수단 (24a) 및 (24b)을 포함한다. 각각의 모듈은 이러한 고정 수단 몇 개를 포함하며, 필요한 조립 형태에 따라 상기 고정 수단이 사용되거나 사용되지 않을 수 있지만, 이를 통해 또 다른 배양 모듈과 베이스 모듈 또는 헤드 모듈 둘 다와 조립될 수 있는 단일 배양 모듈을 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 이러한 고정 수단들은, 원형 실 (seal), 세포 배양 기술에서 잘 알려진 급속 커넥터, 스크류 피치 (screw pitch) 및 세레이션 (serration) 또는 본 발명에 따른 상기 모듈들을 조립하기 위한 다른 장치가 구비된 두 개의 동심원 (concentric circle)이다.

이 실시예에서, 상기 베이스 모듈 (m₀)의 바닥부는, 기체 또는 기체 혼합물의 공급을 허용하는 실질적인 관 형태의 오리피스 (20)와 결합한다. 상기 기체 입구 오리피스 (20)는 관 (32)에 연결되는데, 이 관 (32)의 끝은, 상기 기체 또는 기체 혼합물을 본 발명에 따른 배양 장치 (1)의 적어도 하나의 제4 배지 이동 지대 (6)에 도달시킬 수 있는 배양 배지 수위 위에 도달한다. 본 발명에 따른 장치 (1)의 제4 배지 이동 지대 (6)의 모든 대기가 유사한 관 (32)에 의해 연결되어, 그 결과 상기 기체 혼합물이 상부에 도달할 수 있다. 이것은 상기 반응기 하부를 통해 기체를 공급하기 위해 매우 높게 높여야 하는 높이로 적층될 수 있는 모듈을 지닌 장치에서 매우 바람직하다.

변형 실시예에서, 상기 바닥부는, 상기 자기 장치가 위치한 지대로 기체상 물질 (gaseous substance)을 가져오기 위한 기체 또는 기체 혼합물 공급 관 (feed tube)을 포함한다. 이런 방법으로, 들어오는 기체가 상기 자기 장치의 회전에 의해 교반 (stir)되고, 산소 용해가 배지의 이동에 의해 향상된다. 또한, 잉여 기체가 교반되고, 작은 기포 형태로 다시 위로 움직인다. 이 변형 실시예는 또한, 도 1에 도시된 실시예에 적용될 수 있다.

또한, 리세스 (31)는 외부로부터 상기 오리피스 (20)에 접근하기 위해 제공되고, 기체, 기체 혼합물, 새로운 배지 등을 공급하도록 상기 오리피스에 연결될 수 있다.

모듈 (m₀)의 상부 몹 (mob)은 상기 고정 수단 (28)에 의해 죄어지고, 상기 베이스 모듈 (m₀)의 하부 (m_0a)에 있는 원형 실 (34)에 의해 실링되도록 설계된 소자이다.

본 발명이 상기 설명된 실시예들에 한정되지 않고, 이하의 청구 범위를 벗어남이 없이 많은 변경 실시예가 본 발명에 만들어질 수 있다는 것은 당연하다.

예를 들어, 도 1에 도시된 본 발명에 따른 장치는 또한, 뚜껑을 통과하는 관, 또는 본 발명에 따른 장치의 벽 가운데 하나를 통과하는 관을 통한 영양분 공급을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 가열 수단 또한 본 발명에 따른 장치, 또는 하나의 모듈 또는 각각의 4개 지대 모듈의 제1 또는 제4 지대에 존재할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 장치가 몇몇 배지 순환 수단, 예를 들어 몇 개의 원심 펌프를 포함할 수 있다.

Claims (26)

1. 세포 배양 장치 (1)에 있어서,

   - 적어도 하나의 제1 지대 (3) 및 적어도 하나의 제2 지대 (5)가 위치하고, 상기 제1 지대 (3)는 배양 배지의 이동 지대이며 세포 배양 지대가 아니고, 상기 제2 지대 (5)는 세포 배양 지대인, 뚜껑 (19)이 구비된 배양 용기 (2);

   - 상기 배양 지대 (5)를 통해 배양 배지를 순환시키는 배양 배지 순환 수단을 포함하며,

   상기 배양 지대 (5)는 배양 배지를 이동시키고 세포는 이동시키지 않는 오리피스 (17)가 구비된 하부 벽 (15) 및 상부 벽 (16)을 포함하고,

   상기 장치가 적어도 하나의 제3 (4) 및 적어도 하나의 제4 지대 (6)를 포함하고, 상기 두 지대 모두 배양 배지 이동 지대이며 세포 배양 지대가 아니고, 상기 제3 지대 (4)는 상기 제1 (3) 및 제2 지대 (5)와 배지를 교환하고, 상기 제4 지대 (6)는 상기 배양 배지 순환 수단을 통해 상기 제2 지대 (5)[배양 지대 (5)] 및 상기 제1 지대 (3)[배지 이동 지대 (3)]와 배지를 교환하고, 상기 배양 배지 순환 수단은 상기 제2 배양 지대 (5)에서 배양 배지를 하부에서 상부로 순환시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
2. 제 1항에 있어서, 배양 배지가 상기 제1 배양 배지 이동 지대 (3)에서 제3 배양 배지 이동 지대 (4)로 넘쳐흐르도록, 상기 제3 지대 (4)가 배치된 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
3. 제 1항에 있어서, 상기 제3 지대 (4)가 상기 제2 지대 (5) 내측에 있으면서 상기 제1 지대 (3) 외측에 있는 지대이고, 상기 제4 지대 (6)가 상기 제2 지대 (5) 외측에 있는 지대인 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
4. 제 1항에 있어서, 각각 상기 제1 지대 (3), 상기 제2 지대 (5), 상기 제3 지대 (4) 및 상기 제4 지대 (6)를 포함하는 일련의 배양 모듈들 (m₁, .., m_n)을 포함하는 세포 배양 장치 (1)에 있어서,

   상기 일련의 배양 모듈들에서 인접 배양 모듈들이 배지를 교환하고, 모듈 각각의 상기 제1 지대 (3) 및 제4 지대 (6)가 상기 순환 수단과 직접 또는 간접적으로 교류하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
5. 제 1항에 있어서, 상기 순환 수단이 베이스 모듈 (m₀)에 포함되고, 상기 베이스 모듈 (m₀)이 상기 적어도 하나의 제1 배지 이동 지대 (3) 및 적어도 하나의 제4 배지 이동 지대 (6)와 직접 또는 간접적으로 배지를 교환하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
6. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제4 지대 (6)가 적어도 하나의 수직 또는 경사진 흐름 벽 (18)을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
7. 제 5항에 있어서, 각각의 배양 모듈 (m₀, .., m_n)이 그것의 상부에서 제1 고정 수단 (24a) 및 그것의 하부에서 제2 고정 수단 (24b)을 포함하고, 또한 상기 베이스 모듈 (m₀)이 상부 (mob)에서 제1 고정 수단 (24a)을 포함하고, 상기 장치가 헤드 모듈 (m_t)을 포함하고, 상기 헤드 모듈 (m_t)이 그것의 하부에서 제2 고정 수단 (24b)을 포함하고, 상기 제1 고정 수단 (24a) 및 상기 제2 고정 수단 (24b)이 베이스 모듈 (m₀), 적어도 하나의 배양 모듈 (m₀, .., m_n) 및 헤드 모듈 (m_t)의 하부에서 상부로 적층 구조를 만들기 위한 상보적인 고정 수단인 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치 (1).
8. 삭제
9. - 배양 배지 순환 수단으로 배양 배지 (M)를 도입하는 단계;

   - 상기 배양 배지 순환 수단으로부터 배양 배지 (M)를 방출하는 단계;

   - 제1 배양 배지 상향 이동 지대 (3)로 배양 배지 (M)의 적어도 하나의 제1 이동 단계; 및

   - 제2 세포 배양 지대 (5)로 배양 배지 (M)의 적어도 하나의 제2 이동 단계를 포함하는, 배양 배지 순환을 이용한 배양 용기 (2)에서의 세포 배양 방법에 있어서,

   - 제1 배양 배지 이동 지대 (3)에서 제3 배양 배지 이동 지대 (4)로 넘쳐흐르는, 상기 제3 배양 배지 이동 지대 (4)로의 상기 제1 배양 배지 이동 단계에 뒤이은 적어도 하나의 제3 배양 배지의 이동 단계; 및

   - 제2 배양 지대 (5)에서 제4 배양 배지 이동 지대 (6)로 넘쳐흐르는, 상기 제4 배양 배지 이동 지대 (6)로의 상기 제2 배양 배지 이동 단계에 뒤이은 적어도 하나의 제4 배양 배지의 이동 단계를 포함하고,

   여기서 상기 제2 배양 배지 이동이 하향 배양 배지 이동인 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
10. 제 9항에 있어서, 하나 이상의 상기 이동 단계 동안 배양 배지의 산소화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제

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