JP2001504692A

JP2001504692A - 細胞培養インキュベーター

Info

Publication number: JP2001504692A
Application number: JP52153898A
Authority: JP
Inventors: エイ．ゴフィ，ランダル
Original assignee: ジーンスパンコーポレイション
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2001-04-10
Also published as: US5882918A; AU733636B2; WO1998020106A1; CA2270557A1; US5958763A; AU5094798A; EP0937136A1; CN1235634A

Abstract

(57)【要約】細胞培養インキュベーターはインキュベーション部および制御部に分割されたチャンバーを有する。インキュベーション部は細胞培養容器を含むように適合される。細胞培養容器撹拌機はインキュベーターの制御部に配置され、細胞培養容器撹拌機とチャンバーのインキュベーション部との間の連結により、細胞培養容器の攪拌を引き起こす。チャンバーの制御部の加熱器は外部環境からの空気を加熱し、チャンバーのインキュベーション部に加熱空気を輸送する。壁はチャンバーをインキュベーション部分と制御部に分割する。加熱器は、インキュベーション部で汚染を低減させるように、チャンバーのインキュベーション部に正圧を供与する強制空気加熱器であり得る。栄養およびガス循環システムは、チャンバーのインキュベーション部で細胞培養容器と連絡する。栄養およびガス循環システムは、チャンバーのインキュベーション部の外部のガス源を含み、管は、ガス源、チャンバーのインキュベーション部の細胞培養容器、および栄養媒体の間に連絡を提供する。チャンバーのインキュベーション部の開口部のフィルタは、管と連絡して、外部環境に通気される前に、細胞培養容器から発するガスから汚染物を除去する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞培養インキュベーター本願は、1995年８月８日に出願された係属中の出願Serial No．08/512,546号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、作業環境において特殊無菌状態またはバイオハザード特性の無い、実験室作業台上での潅流細胞培養プロセスの操作のためのインキュベーター機器に関する。加えて、本発明は、潅流ベースのおよび非潅流ベースの細胞培養プロセスを混合する手段を提供する。さらに、制御されたＣＯ₂雰囲気および所用温度（例えば、３７℃）を達成するための手段は、潅流、混合培養、および静的培養が提供される。加えて、本発明は、比較的高速度で混合している間に、付着性細胞のマイクロキャリアへの付着性を向上させる、ポリアニオン媒体添加剤の使用に関連し、また、潅流培養システムにおけるインビボ様の条件を容易にすることにより、他の利点を供与する。発明の背景細胞培養の標準的実施ではＣＯ₂インキュベーターを採用し、静的培養プロセスで必要とされるガス状雰囲気および温度制御を提供する。これらのプロセスは、マルチウエルプレート、培養皿、フラスコなどの使用を含む。比較的大型サイズの標準ＣＯ2インキュベーター（幅19in．(48.2cm)x高さ26in．(66cm)x深さ19i n．(48.2cm）の内部作業容積を備える）は、ポンプおよびローラーミルのような潅流および混合機器を採用する小規模プロセスに順応するように使用されてきた。ＣＯ₂インキュベーターのこのような使用は、大いに不便であることに加えて、実質的な資本出資およびスペースの利用を必要とする。処理効率上の観点から、Ｏ2／ＣＯ2含有ガスが直接的手段により培養細胞に供与される潅流細胞培養プロセスは選択の方法である。多様なコスト高で扱いにくい複雑な機器システムが、潅流システムおよび混合／攪拌培養システムを作動させるように開発されてきた。性能改良のこのようなシステムを利用して達成され得るが、これらシステムが専用の、どちらかといえば柔軟性に劣る機器になるのは回避し難い。また、これら独立機器の故障率は比較的高くなる傾向にある。故障の主たる原因は、媒体レザーバを加熱するために典型的に利用される、高温プレートの誤動作である。設定点を超過するうえに、長期間実験において温度を正確に制御する能力の欠如といった加熱器のユーザーからの報告はまれではない。中でも最も重要な点は、機器類が極度にユーザーに不親切であり、技術専門家を介在させることなく一連の完全な手順を完全に行うために、数年の経験を要することが多いということである。細胞培養システムにおけるインビボ様の条件を生み出すことは、積年の取り組みである。潅流システムおよび混合／攪拌システムは特に問題がある。なぜなら、細胞は、正常ならばインビボで経験しないような運動に関連する共用力および他の影響に曝されるからである。付着因子および細胞外マトリクス成分は、ここ 20年で採用が増加し続けているが、主として経済的理由により、研究上の興味対象となっている。一般的用途を有する、廉価な細胞培養媒体添加剤が必要とされている。このような分子は以下の３つの要件を満たす。１）非選択的方法で細胞接着性を向上させ、その結果、混合／攪拌が大規模培養システムにおいて効率的に進み得るようにすべきである、２）培養中の細胞の扱い（例えば、遺伝子の形質転換）が妨げられることなく進められなければならない、３）組織中で見いだされる細胞環境に近い培養条件が促進されるべきである。定義ＣＯ₂：細胞培養栄養媒体における重炭酸塩緩衝と組み合わせた、ｐＨを維持するための二酸化炭素ガスインキュベーター：細胞のための培養環境を設けるように設計された機器Ｏ₂：生体細胞が呼吸をするのに必要な、酸素ガス HPBr：高性能（中空繊維）バイオリアクタ、すなわち、例えば、媒体を供給する中央二方向中空繊維束、および、細胞培養に必要な酸素を供給する外側繊維束領域を有する、潅流細胞培養装置 cpm：１分間の装置の120度の（例えば）完全な二方向部分回転数である、１分あたりのサイクルリポフェクション：正に荷電したリポソームを形成する陽イオン脂質により媒介される宿主細胞に外来ＤＮＡを導入することトランスフエクション：宿主細胞のゲノムに組み込むことができない外来ＤＮＡが宿主細胞に導入されるプロセス発明の要旨細胞培養インキュベーターは、インキュベーション部と制御部に分割されるチャンバーを有する。インキュベーション部は、細胞培養容器を含むように適用される。細胞培養容器撹拌機は、インキュベーターの制御部に配置され、細胞培養容器撹拌機とチャンバーのインキュベーション部の間の連結は、培養容器の攪拌を引き起こす。チャンバーの制御部中の加熱器は、外部環境からの空気を加熱し、そして加熱空気をチャンバーのインキュベーション部に輸送する。壁はチャンバーをインキュベーション部と制御部に分割する。加熱器は正圧をチャンバーのインキュベーション部に供与してインキュベーション部の汚染を低減する、強制空気加熱器であり得る。栄養およびガス循環システムは、チャンバーのインキュベーション部中の細胞培養容器と連絡している。栄養およびガス循環システムは、チャンバーのインキュベーション部の外側のガス源を含み、管は、ガス源、チャンバーのインキュベーション部の細胞培養容器、および栄養媒体の間の連絡を提供する。チャンバーのインキュベーション部の開口部のフィルターは管と連絡し、外部環境に通気する前に、細胞培養容器から発するガスから汚染物を除去する。本発明は、潅流混合静的細胞培養プロセスに適合するように設計された、小型（small foot-print）ベンチトップインキュベーション部機器を提供する。潅流プロセスに適合させるために、本発明は、可変形状の無菌の使い捨ての管のセットと共に使用するための蠕動ポンプを装備する。管セットはレザーバから栄養媒体を循環させる手段を提供する。Ｏ₂／ＣＯ₂含有ガスが事前混合ガスのシリンダーから供給され、そして無菌／バイオハザードの懸念は、一連の計画的に配置された0.22μｍの疎水性ディスクフィルターにより対処される。管のセットの設計により、ガスの閉ループ再循環が可能になり、必要に応じて、規定されたガス混合物の補助的な供給が、培養プレート、フラスコなどを含み得るチャンバーを経由して廃棄可能な流れに送達され得る。あるいは、ガス流管セットは、ローラーボトル培養などに無菌の規定されたＯ₂／ＣＯ₂ガス混合物を供給するように改変され得る。大気条件に関して正圧に維持される、サーモスタット制御の再循環空気により、温度はインキュベーターの作動容積中で維持される。本発明は、培養フラスコまたはボトルのような、潅流容器または他のバッチ培養容器のいずれかを混合する手段をさらに提供する。適度な数の培養皿またはフラスコが同一条件で培養されるように、インキュベーターの作業容積中には十分な空間が設けられるが、これは、プロセスの開発およびスケールアップ活動において重要となり得る。従って、対照または接種物膨張でさえも、並列に培養され得る。それに加えて、本発明は、混合および攪拌しながら、足場依存性細胞のマイクロキャリアへの付着性を向上させるための細胞培養媒体添加剤として、コンドロイチン硫酸（タイプＣ）を使用することを提供する。＜図面の簡単な説明＞本発明の上述の局面および付随する利点の多くは、添付の図面と共に考慮したとき、下記の詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるので、より容易に理解される。図１は、本発明の細胞培養インキュベーターを例示する、部分的破断斜視図である。図２は、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバーの第１のモジュラー構成要素の斜視図である。図３は、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバーの第２のモジュラー構成要素の斜視図である。図４は、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバーの第３のモジュラー構成要素の斜視図である。図５は、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバーの第４のモジュラー構成要素の斜視図である。図６は、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバーを形成する、図２から図５の４つの構成要素の間の相互関係の展開斜視図である。図７は、本発明の細胞培養インキュベーターの破断正面図である。図８は、本発明の細胞培養インキュベーターの破断図である。図９は、本発明の細胞培養インキュベーターの破断図である。図10は、本発明の細胞培養インキュベーターの撹拌機アセンブリの詳細側面図である。図10Ａは、本発明の細胞培養インキュベーターの撹拌機アセンブリのクランク、カム、およびロッドの詳細図である。図11は、本発明の細胞培養インキュベーターについての、栄養およびガス循環システムの連続バッチ処理の概略図である。図12は、本発明の細胞培養インキュベーターについての、栄養およびガス循環システムの連続処理の概略図である。図13は、本発明の細胞培養インキュベーターについての、栄養およびガス循環システムの補助ガス供給の概略図である。図14は、3C11ハイブリドーマ細胞によるＩｇＧ１モノクローナル抗体の蓄積産物に関する本発明の細胞培養インキュベーターにおける細胞攪拌の効果のグラフである。図15は、3C11ハイブリドーマ細胞生存率および倍増に対する、本発明の細胞培養インキュベーターにおける細胞攪拌の効果の棒グラフである。好ましい実施態様の詳細な説明本発明の細胞培養インキュベーターは、図１に示すように、壁８によりインキュベーション部４および制御部６に分割されたチャンバー２から構成される。図２から図６に最もよく示されるように、チャンバー２は４個のモジュラー構成要素10、12、14および16から構成される。モジュラー構成要素10、12、14および 16は、アクリルなどのような合成ポリマーから構成されるのが好ましく、かつ、ガスケットを組にして、モジュラー構成要素10、12、14および16の支持重量がそれらを連結するようにすることにより、一緒に連結されるのが好ましい。図６に示されるように、モジュラー構成要素10、12、14および16の連結が、経済的かつ便利な方法で、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバー２を形成する。図１、図７、図８、および図９を参照すると、本発明の細胞培養インキュベーターのチャンバー２は、細胞培養の培養を最適に容易にする４つの基本的なシステム、すなわち、温度調節システム、媒体循環システム、ガス流システム、および培養攪拌システム、である。温度調整システム温度調整システムは、外部環境からの空気がチャンバー２の制御部６に入ることを可能にする入り口18を含む。最適には、改善された無菌性が所望される場合、例えば、0.22Tmの多孔性のフィルタ19は空気入り口18に隣接して設置され得て、チャンバー２の制御部６に入る大気が汚染物を含有しないことを確実にする。一旦、空気入り口18を介してチャンバー２の制御部６に空気が入ると、空気は高温ボックス入り口22を通って高温ボックス20へと通過する。高温ボックス20内には、高温ボックス20内の空気の熱力学的エネルギーを増大させる強制空気加熱器 21が配置される。加熱器21は、壁８に搭載されるのが好ましいが、加熱空気に壁８を通過させ、続いて、培養容器28（HPBr中空繊維装置のような）配置されるインキュベーション部４内へと送り込む。均衡を維持するために、最初に加熱されてから制御部６からインキュベーション部４へと送り込まれた、現時点では冷えた空気の一部は、高温ボックス20中の戻り開口部24を壁８のインキュベーション部空気出口26へと接続するコンジット23を経由して制御部６の高温ボックス20へと再循環される。インキュベーション部空気出口26を経由して制御部６に戻らないインキュベーション部４の加熱空気は、モジュラー構成要索10、12、14、および16の間の間隙を通って外部環境へと排出される。従って、最小限の圧力上昇しか有さない実質的に開放した層流システムが提供される。この態様で、セットポイントに対する、正確かつ安定した温度制御と組み合わせた迅速な温度反応が達成される。大気圧に関連するチャンバー２のインキュベーション部４における僅かに正の圧力が、チャンバー２のインキュベーション部４に入る大気中空気から汚染物の可能性を低減するのが好ましい。上述の正確かつ安定した温度制御を確保するために、Connecticut州Stamf ordのOmega Engineering Incorporatedにより製造されたモデル番号CN76120のような温度制御器29、すなわち、アラーム装備の１パルス出力マイクロプロセッサが採用され得る。これに加えて、チャンバー２のインキュベーション部４内部には、上記温度制御器29にフィードバックを供与し、かつ、例えば、TEFLON(米国D elaware州WilmingtonのDuPont De NeMoursの登録商標)などで絶縁するのが好ましい、例えば、Connecticut州StamfordのOmega Engineering Incorporatedが製造したモデル番号5TC-TT-T-24-36の熱電対30が配置されるのが好ましい。要約すると、上記の温度調節システムは、制御部４中で低温の環境を維持しながら、所望の熱力学的エネルギーがインキュベーション部６に供給されることを可能にし、その結果、その中の電気的構成要素および機械的構成要素が、熱力学に基づく疲労および損傷を受けないようにする。培養攪拌システム図１、図７、図９、図10、および図10Ａに最も良く示されるように、本発明の培養攪拌システムは、モーター台36に配置され、かつ、駆動ロッド38にモーター台36を貫通させるモーター34を含む。駆動ロッド38はクランク40に固定的に接続され、クランク40は、図10Ａに示されるように、タイロッド44によりカム42に接続される。クランク40およびカム42それぞれの回転の軸からオフセットされた旋回点41および43でクランク40とカム42の両方にロッド44が旋回自在に接続され、その結果、駆動ロッド38およびクランク40の360度回転が、例えば、カム42の120 度にわたる二方向部分回転を引き起こすようにすることに留意すべきである。カム42は、軸台48により支持される軸46に固定的に装着される。上記要素の全てがチャンバー２の比較的より低温の制御部６内部に完全に配置され、ただし、チャンバー２の制御部６とチャンバー２のインキュベーション部４の両方をつなぐ軸46、および、チャンバー２のインキュベーション部４内に配置される軸台48のうちのいくつかを例外とすることに、留意することが重要である。また、チャンバー２のインキュベーション部４の内部には、軸46にクレードル52を接続するクレードルサポート50が配置される。クレードル 52には、セル培養容器28が配置される。動作中は、タイロッド44によるカム42とクランク40との相互接続によりカム42および軸46のおよそ120度の二方向部分回転へと変換される、駆動ロッド38およびクランク40の360度回転により、クレードル52および細胞培養容器28でのおよそ120度の二方向部分回転は、細胞培養容器28内部の適切な細胞培養攪拌を果たし得る。モーター34は、静止、ロー(12±3 epm）、ミディアム（30±3epm）、およびハイ（60±3epm）の４つの設定を有するのが好ましい。上記実施態様は360度回転から120度二方向部分回転への変換を採用しているが、360度全部はもちろん、他の度数成分の部分回転、軸往復運動、垂直往復運動、またはこれらの組み合わせが採用されてもよい。細胞培養攪拌の期間中は、細胞培養において前駆賦活媒体成分を採用する事がしばしば望ましい。攪拌期間中にキャリア表面（例えば、マイクロキャリア）への付着を向上させるために足場依存性細胞が培養される場合は、媒体成分としてコンドロイチン硫酸（タイプＣ）が採用されるのが好ましい。コンドロイチン硫酸（タイプＣ）の好ましい濃度範囲は、分子量に依存する。しかし、約4,000ダルトンの平均分子量において、好ましい濃度は、約0.005mMから0.5mMの範囲にある。媒体循環システムおよびガス流システム媒体循環システムおよびガス流システムは、本発明の２つの別個のかつ分離したシステムであるが、それらは、明瞭にするために、採用されるプロセスのタイプまたは図11、図12、および図13に示されるような補助機能の存在に依存している各分割部分と協同して論じられる。例えば、図11は連続バッテプロセスで使用される媒体循環システムおよびガス流システムの両方を示し、図12は連続プロセスにおける媒体循環システムおよびガス流システムを示し、そして図13 は補助ガス供給を採用する、媒体循環システムおよび補助ガス供給を示す。まず、連続バッチプロセスを採用する本発明のための媒体循環システムおよびガス流システムを示す図11を参照すると、ガス流システムは、例えば空気中で約 10％のＣＯ₂の、圧力弁56を有し、かつ、例えば約５psi(34.5KPa)で加圧ガスを供給するガス源54を含む。次に、ガス流システムでは、加圧ガスは流量計58を通過するが、これは、例えば、モデル番号H-32013-01（Illinois州Vernon Hillsの Cole Parmer Instrument Companyが製造する、アルミニウム製またはステンレス鋼製の１分間あたり50ミリリットルの流量計）であればよい。オプションのチェック弁およびオプションの流量制限器（図12に示されるような）は流量計58と連結して細胞培養容器28内のガスの背圧を設定する。採用された場合、チェック弁は、例えば、約0.5psi〜1.0psl(3.45KPa〜6.89KPa）の最大圧力を超過するのを阻止するように選択される。細胞培養容器28に入る前に、ガスは圧力ゲージ60を通過して細胞培養容器28中の背圧が測定され、次に、疎水性フィルタ62を通過するが、これは約0.22μｍの多孔性を有するフィルタであることが好ましい。入り口64に入り、細胞培養容器28に注入した後で、ガスは出口66を出て背圧バルブ68 および凝縮器70を通って流れる。凝縮器70は、ガス流システムおよび媒体循環システムのラインを形成するのが好ましいプラスティック製管のじゃ管セクションであるのが好ましい。より好ましくは、凝縮器70はガラス製またはプラスティック製のビーズまたは粒を含み、細胞培養容器28中のガスが同伴する水蒸気の圧縮度を最大限にする。次にガスは、約0.22μｍの好ましい多孔性を有する別な疎水性フィルタ72を通過し、次いで、媒体レザーバ74のへッドスペースに入り、この方法では、好ましくは、ガスは所望のｐＨの媒体を保持するガスを含む。続いてガスは、チャンバー２のインキュベーション部４からその中のガス換気開口を通って、約0.22μｍの多孔性を有するのが好ましい疎水性フィルタ75を通過した後で、外部環境へと排出される。連続バッチプロセスの媒体循環システムにおいて、媒体レザーバ74からの媒体はポンプ76を通過し、これは、Illinois州BarringtonのBarnat Company、Gilmon t Instrumentが製造する１分あたり200サイクルのモーターを備えた嬬動ポンプモデル番号15PBであることが好ましい。ポンプ76を通過した後で、媒体は、栄養が培養に提供される細胞培養容器28の入り口78に入る。続いて使用された媒体は、それが媒体レザーバ74に戻る細胞培養容器28の出口80を通過する。長期細胞培養手順における媒体レザーバ74の周期的変化は、連続バッチプロセスとしてこのプロセスを規定する。連続プロセスを採用する本発明のための媒体循環システムおよびガス流システムを示す図12を参照すると、ガス流システムはガス源82（例えば、約５psi(34.5 KPa)の空気中に約10％のＣＯ₂）を含み、これは流量計84と連絡する（例えば、モデル番号H-32013-01（Illinois州Vermons HillsのCole Parmer Instrument Co mpanyが製造する、アルミニウム製およびステンレス鋼製の１分あたり50ミリリットルの流量計））。約0.22μｍの多孔性を有するのが好ましい疎水性フィルタ 86は、流量計84からガスを受ける。次にガスはチェック弁88を通って流れるが、これは、流量計84およびガス流制限器94（後述）と連結して、細胞培養容器28の背圧を所定のレベルに設定する。チェック弁88は、例えば、約0.5psi〜1.0psl(3 .45KPa〜6.89KPa)の最大圧を超過するのを阻止するように選択される。入り口90 に入り、かつ、細胞培養容器28を注入した後で、ガスは出口92を出て、流量制限器94を通り、凝縮器96へと流れ込む。凝縮器96は、ガス流システムおよび媒体循環システムのラインを形成するのが好ましいプラスティック管類と同一材料から作られるのが好ましい、プラスティック管のじゃ管セクションであるのが好ましい。最も好ましくは、凝縮器96は、細胞培養容器28中のガスが同伴する水蒸気の圧縮度を最大限にするように、ガラスまたはプラスティックのビーズまたは粒を含む。次に、ガスは媒体レザーバ98のへッドスペースに流れ込み、この方法で、好ましくは、ＣＯ₂を含有するガスが媒体の所望のｐＨを維持する。次にガスは、チャンバー２のインキュベーション部４からその中のガス換気開口を通って、約0.22μｍの多孔性を有するのが好ましい疎水性フィルタ100を通過した後で、外部環境に排出される。連続プロセスの媒体循環システムにおいて、新鮮な媒体はポンプ102から媒体レザーバ98に注入される一方で、媒体レザーバ98からの消費媒体はライン104を介して外部環境へと放出される。ライン104を通過する消費媒体の量は、ポンプ1 02により媒体レザーバ98の閉システムへと汲み入れられる新鮮な媒体の量に直接比例する。ポンプ102は、Illinois州BarringtonのBarnat Company、Gilmont Ins trumentが製造する、１分あたり200サイクルのモーターを装備する蠕動ポンプ、モデル番号15PBであるのが好ましい。ポンプ106は同様の製品であり、これは、媒体レザーバ98から媒体を取り入れ、栄養が培養に供与される細胞培養容器28の入り口108に媒体が入るようにする。続いて、消費媒体は、それが媒体レザーバ9 8に戻る細胞培養容器28の出口110を通過し、外部環境への放出のためのライン10 4を通過する。補助ガス供給を採用する本発明のための媒体循環システムおよびガス流システムを示す図13を参照すると、図12で使用された同一参照番号である図13で使用された同一参照番号は、図12で示されるのと同一要素のことである。補助ガス供給が採用される図13の実施態様は、図12の連続プロセスの実施態様とは異なるが、図12におけるポンプ102（新鮮な媒体を供給する）およびライン104（外部環境に消費媒体を排出し、これは図12の連続プロセスの実施態様においては媒体レザーバ98に相互接続されている）は、図13の補助ガス供給実施態様には存在しない。その代わり、図13の補助ガス供給実施態様において、分岐器112は媒体レザーバ9 8に入る凝縮器96からのガス流の一部を分岐させ、また、その代わりに、ガスのこの部分をチャンバー114を介して流れへと方向づけるが、このチャンバーは、例えば、培養プレートのような静的培養容器を含むように設計される。チャンバー114を通る流れに培養を注入した後で、ガスは、最初に疎水性フィルタ100を通過した後で最終的に外部環境に抜ける、媒体レザーバ98からのガス流ラインを接続させる分岐器116を経由して、チャンバー114を出る。培養例ガス流システム・ラインおよび媒体循環システム・ラインからなる無菌管セットは、組み立てられ、生物学的フード（hood）における標準的無菌手順を採用する、栄養媒体レザーバ74および98と統合される。大気条件の下で実験室作業台上の対応する機器取り付け具に接続される全ての取り付け具をカバーして、アルコール・スワブが設置される。全アセンブリは本発明の細胞培養インキュベーターに輸送される。アルコール・スワブは、管セット取り付け具からアルコール・スワブを迅速に除去する前に、また、論理的に連続して接続を完了する前に、機器取り付け具を殺菌するために採用される。機器設定（すなわち、媒体循環率およびガス流量）が選択され、そして管セットは或期間（例えば、８時間〜24時間）の間、漏れ検査が行われる。経費を最小限にするために、リン酸塩緩衝生理食塩液（PBS）が、この段階で、媒体の代わりに推奨される。しかし、この決定は、上記工程および手順を反復する前に、機器が解体され、媒体レザーバボトルの内容物が変更されなければならないことに影響する。比較的ユーザーの使い勝手を考慮した動作手順のために、経費節約は、汚染の著しい危険を伴わない努力を正当化して余りあることが多い。ガス源54 および82はいつでも変更され得る。大半の細胞培養手順のための薦められる組成範囲は、ＣＯ₂／空気の割合にして５％〜10％である。HPBrデバイスであれば、細胞培養容器28における酸素供給繊維内が水浸しになることを回避するためにガス流が停止された場合、媒体循環は中断されねばならない。本発明は、定期的にオペレータが介入（例えば、サンプルを採ったり、または、消費媒体を取り替えるなど）するだけで、長期間の培養を維持する。細胞とマイクロキャリア（足場依存性細胞の付着のための）が、針の付いた皮下シリンジにより細胞培養容器28に導入される。同様に、細胞および上澄みの（すなわち、使用済み媒体の）サンプルは、第２のシリンジから新鮮な媒体を空のシリンジに移すことにより、細胞培養容器28から周期的に除去され得る。チャンバー２のインキュベーション部４のドアを開けたままでサンプリングする間、温度制御器29はオフ状態に切り替えられる。消費媒体を周期的に取り替えるために、管セットは切り離され、アルコール・スワブが切り離された全ての取り付け具を覆って配置される。生物学的フードの下で、媒体は交換され、長期細胞培養プロセスは遅延なく再開される。実施例Ｉ本発明は細胞培養容器28としてHPBrデバイスを採用し、図11の構成に従って組み立てられる。細胞培養容器28は3.5x10⁸の生育可能な3C11ハイブリドーマ細胞が接種され、以下の細胞培養媒体内で12日〜15日の間、培養される。すなわち、４ｍＭのＬ-グルタミン、１ｍＭのグルタミン酸、2.5ｍＭの安息香酸塩緩衝液（安息香酸および安息香酸ナトリウムの等モル比からなる）、および20％の牛胎児血清を含有するDMEM。２リットル分のこの媒体を１日〜７日の間で使用し、７日目に新鮮な媒体と置換した。約7.0〜7.4の間のｐＨを実験の間中維持し、媒体を 100mL/分で再循環した。10％の割合のＣＯ₂／空気のガス混合物を63mL(stp)/分の流量で使用し、1.0psiより小さい背圧を実験の間中、維持した。４種の細胞培養容器28はこの方法で組み立てられ、各々を12日〜15日の期間を通して、以下の一定回転速度を利用した。すなわち、１）静止、２）12±３cpm 、３）30±3cpm、および４）60±3cpm。ｔルを１時間（土日を除く毎日）静置した後で、セルを潅流条件の下で培養した17ｍＬ容積〜10ｍＬの上澄みを採取した。上澄みサンプルを、それらがELISA法によりＩｇＧ１モノクローナル抗体濃度判定に必要とされるまで、−20℃で貯蔵した。12日〜15日の培養期間の完了時には、無菌空気との細胞／上澄み混合物を排出することにより、全ての細胞を細胞培養容器28から回収した（すなわち、95％を越えた）。最後に、細胞培養容器28 を新鮮な媒体で２回フラッシュした。図14および図15は、抗体生成および細胞生存率の両方に関する回転速度の効果を表示する。60cpmは生産性の劇的増大を生じる結果となり、一連の実験中で生存可能な細胞の正味増大はなかったことが明らかである。生体分子生成の場合、 60cpmが好ましい。細胞培養プロセスの目標が生存可能細胞を費やして収穫をあげることである場合、より低いcpm値（すなわち、30cpm、12cpm、または静止していさえする）が好ましい。実施例ＩＩ一連の４つのリポフェクションベース（lipofection-based）の遺伝子トランスフェクション実験を、HPBrデバイスが細胞培養容器である、本発明の細胞培養インキュベーター中で行った。制御実験を、インキュベーター中の複数ウエル・プレート中で行ったそれ自体の制御と並列に実行した。プレート実験 SW480 P3（ATCC♯CCL228）結腸癌細胞を６ウエル（すなわち、１ウエルあたりに1x106生存可能セル）でプレートとした。13個のウエルをこの方法でプレートした。合計30ｍＬを作るために、26.4ｍＬのRPMI媒体、４ｍＬのＬ−グルタミン、3.0mLの牛胎児血清、および10μｇ／ｍＬのゲンタマイシンからなる、３ｍＬのストック溶液を各ウエルが含有した。細胞を、トランスフェクションの前に24 時間、10％のＣＯ₂を含むＣＯ₂インキュベーターで37℃で培養した。トランスフエクション手順は、１ｍＬのOPTI-MEM媒体中で先の媒体を置換し、かつ、陽イオン剤液（DMRIE/DOPE）とプラスミドＤＮＡ（VR1412)の混合物を添加することにより行われたが、これらは両方ともCalifornia州SanDiegoのVical ，Inc．によるものである。0.99のモル比（すなわち、40μＬの液体：10μｇのＤＮＡの比）の2.0ｍＬに希釈されたOPTI-MEMを各ウエルに適用した。これらプレートを、４時間、インキュベーションした。４時間後、熱不活性化された牛胎児血清に12.0μＬのゲンタマイシンを加えたものを各ウエルに添加した。後続の13日間、１ウエルからの細胞の全てをトリプシン処理し、計数し、βガラクトシターゼ・レポータ遺伝子判定の分解したサンプルとして２x10⁴を維持する。残余のウエルを、ＤＮＡ含有OPTI-MEMを除去せずに、１ｍＬの先に規定されたRPMI媒体で隔日ごとに栄養補給した(トランスフェクションの24時間後に開始)。 13日の期間の終わりに、分解質サンプルをクルルフェノールのレッド・ベース手順を介してβガラクトシダーゼについて評価した（これらを、ＵＶ可視分光測光器を用いて定量化した）。HPBr デバイス実験４種のβガラクトシダーゼのレポータ遺伝子トランスフェクション実験を、以下に文献を付した差違を除いて、６ウエルプレートに対して上述されたものと均等なプロトコルを備えるHPBr型デバイスである、４つの細胞培養容器28で行った。この手順の全ての特徴を、「１細胞あたり」を基準に調節した。しかし、HPBr デバイスの特徴である細胞培養の潅流モード（すなわち、連続栄養補給）のせいで、手動による周期的栄養補給の必要は無かった。LouisのSigmaによる）を、マイクロキャリア粒あたり約10細胞を有するように、リン酸塩緩衝塩酸生理食塩水で事前膨潤した後、細胞培養容器28の側部ポートヘ導入し、1x10⁷SW480生存可能セルに注入した。表Ｉは接種およびポスト・トランスフェクション直後の24時間の異なる媒体条件をリスト化する。それはまた、この研究で採用された回転パラメータを同定する。0.1ｍＭのコンドロイチン硫酸塩（タイプＣ）をラン番号２、３および４についてのOPTI-MEMトランスフェクション媒体に含んだ。再循環OPTI-MEM媒体をトランスフェクションにより置換したが、細胞を含む区画中の媒体は置換しなかった。細胞／上澄みの毎日のサンプル（約1.5ｍＬ）を各細胞培養容器28から取り出し、等量の新鮮な媒体を、それを置換するのに使用した。細胞計数および生存可能性を判定し、2x10⁷生存可能性細胞を分解し、そしてβガラクトシダーゼ判定のために維持した。表ＩＩはプレート制御を伴う４種の潅流デバイス実験を比較するデータを含む。本発明の細胞培養インキュベーターにおいて作動されたHPBr型細胞培養容器28 は拡大遺伝子トランスフェクションおよび細胞の栄養補給に対して採用され得るが、これらは治療的応用例を有していてもよい。このシステムはまた人工器官として利用され得て、インビボの無傷器官からバイオプシーを取る処理と同じ方法で、外来遺伝子の長期発現が容易にかつ現実的に研究され得る。この特定の例では、デバイスは充実性腫瘍モデルとして採用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ【要約の続き】境に通気される前に、細胞培養容器から発するガスから汚染物を除去する。

Claims

【特許請求の範囲】１．連続細胞培養インキュベーターであって、インキュベーション部（4）および制御部（6）に分割されるチャンバー（2）であって、該インキュベーション部が汚染物の進入を阻止するために雰囲気よりも十分に高い圧力に維持される、チャンバーと、該インキュベーターの該制御部（6）に配置されるモーター（34）と、該チャンバーの該インキュベーション部（4）における細胞培養容器（28）であって、該容器はモーター（34）と機械的に連絡しており、該モーター（34）は、該モーターが活動するとき、該容器(28)の長手方向軸の周囲の該容器（28）の二方向部分回転運動を促す、容器と、該インキュベーション部の温度センサー（30）であって、該センサーは加熱空気源（20）、および加熱空気源のための制御器（29）と電気的に連絡しており、該加熱空気源および該制御器は該インキュベーターの該制御部（6）に配置される、センサーと、栄養循環システムおよびガス循環システムであって、各々が該細胞培養容器（ 28）と連絡している、システム、を備える、インキュベーター。２．前記加熱空気源が、前記インキュベーション部の汚染物を低減するように、前記チャンバーの前記インキュベーション部（4）に正圧を供与する強制空気加熱器（21）を備える、請求項１に記載のインキュベーター。３．前記チャンバーの前記制御部（6）と外部環境との間に挿入され、該チャンバーの該制御部に入る空気から汚染物を除去するフィルタ（19）をさらに備える、請求項１に記載のインキュベーター。４．細胞培養インキュベーターであって：インキュベーション部（4）および制御部（6）に分割されるチャンバーであって、該制御部は該インキュベーション部（4）に配置される温度センサー（30 ）と電気的に連絡する加熱器（21）を有し、該加熱器（21）は外部環境から該インキュベーション部に加熱空気を供給して、該インキュベーション部で所定温度を維持し、前記インキュベーション部は細胞培養容器（28）を含み、細胞培養容器はガスおよび栄養を供給するためのシステムと流体連絡しており、かつ該細胞培養容器はモーター（34）に連結され、該モーターは該容器の長手方向軸の周囲に容器に二方向部分回転を付与し、該モーターが活動状態になると、その内容物を攪拌するチャンバー、を備える、インキュベーター。５．前記チャンバーの前記制御部（6）と外部環境の間にフィルタ（19）をさらに備え、該フィルタは該チャンバーの該制御部に供与される空気から汚染物を除去して、前記インキュベーション部に無菌環境を提供する、請求項４に記載のインキュベーター。６．前記チャンバーを前記インキュベーション部（4）および前記制御部（6）に分割する壁（8）であって、該壁はそこに開口部（26）を有する、壁と、前記加熱器（21）を含み、前記加熱器を該制御部の残余部分から単離するハウジング（20）と、該チャンバーの該インキュベーション部(4)から該チャンバーの該制御部(6)の該ハウジングへと空気を再循環させるための、該壁（8）の該開口部（26）に該ハウジングを接続するコンジット（23）、をさらに備える、請求項４に記載のインキュベーター。７．前記加熱器（21）は、前記インキュベーション部の汚染を低減するように、前記チャンバーの前記インキュベーション部（4）に正圧を供与する強制空気加熱器である、請求項４に記載のインキュベーター。８．温度制御細胞培養インキュベーターであって：インキュベーション部（4）および制御部（6）に分割されるチャンバー（2）であって、該インキュベーション部は、長手方向軸を有する中空繊維潅流細胞培養容器（28）を含む、チャンバーと、該チャンバーの該インキュベーション部で該中空繊維潅流細胞培養容器（28）と連絡する栄養循環システムと、該中空繊維潅流細胞培養容器と連絡しているガス循環システムと、該インキュベーション部で所定の温度を維持するための、加熱空気に加圧する制御された源（20）と、細胞培養容器の長手方向軸の周囲で二方向部分回転運動を機械的に伝えるモーター（34）、を備える、インキュベーター。９．前記ガス循環システムが、前記チャンバーの前記インキュベーション部の外部のガス源（54）、および、該チャンバーの該インキュベーション部（4）で前記中空繊維潅流細胞培養容器（28）と該ガス源とを連絡させる管を備える、請求項８に記載のインキュベーター。 10．前記チャンバーの前記制御部と前記外部環境との間にフィルターをさらに備え、前記フィルターは前記チャンバーの該制御部に供与された空気から汚染物を除去し、前記インキュベーション部中で無菌環境を提供する、請求項８に記載のインキュベーター。 11．前記チャンバーを前記インキュベーション部および前記制御部に分割する壁であって、そこに開口部を有する、壁と、制御された加熱空気源を含む該制御部中のハウジングであって、上記制御部の残余部分から分離されたハウジングと、コンジットであって、該ハウジングを該壁の該開口部に接続して、該チャンバーの該インキュベーション部から該チャンバーの該制御部中の該ハウジングへ空気を再循環させる、コンジット、をさらに備える、請求項８に記載のインキュベーター。 12．前記加熱空気源が、前記インキュベーション部で汚染を低減するために前記チャンバーの前記インキュベーション部に正圧を供与する強制空気加熱器（21）を備える、請求項８に記載のインキュベーター。 13．前記チャンバーの前記制御部（6）と外部環境との間にフィルタ（19）をさらに備え、該フィルタは該チャンバーの該制御部に供与される空気から汚染物を除去して、前記インキュベーション部中で無菌環境を提供する、請求項８に記載のインキュベーター。 14．モジュラー細胞培養インキュベーターであって： a) 平面状矩形ベース（16）と、 b) 該ベースから垂直方向に延び、該ベースを横断して延びる寸法を有する下部端縁を有する、分割平面状矩形壁（8）と、 c) 直角に接続している１対の矩形壁、および該１対の壁の間で延びる矩形の部分天井部を備え、天井部の長いほうの端縁は該１対の壁のうちの一方の上部端に接続され、天井部の短い方の端縁は該１対の壁の他方の上部端に接続される、第１のコーナーセグメント（10）と、 d) 直角に接続している第２の１対の平面状矩形壁を備え、該壁の一方が他方よりも小さい表面面積を有する第２のコーナーセグメント（12）と、 e) 矩形平面状ルーフ部品により接続された間隔を設けた２つの平面状矩形側壁、および矩形平面状背面部品からなる矩形ケージ（14）とを、連動する関係で備え、該ベース、該分割壁、該第１のコーナーセグメント、該第２のコーナーセグメント、および該ケージが協同して、該分割壁（8）により分離された２個の区画（4、6）を備える矩形の細胞培養インキュベーター（2）を形成する、インキュベーター。 15．前記ベース（16）、前記第１のコーナーセグメント（10）、前記第２のコーナーセグメント（12）、および前記ケージ（14）の間の接続が、前記モジュラー細胞培養インキュベーター内部の包囲雰囲気圧を越える圧力の達成を許容する、請求項14に記載のモジュラー細胞培養インキュベーター。 16．前記ベース（16）、前記第１のコーナーセグメント（10）、前記第２のコーナーセグメント（12）、および前記ケージ（14）が透明なプラスチック材料から構成される、請求項14に記載のモジュラー細胞培養インキュベーター。