BRPI0616924B1

BRPI0616924B1 - Dispositivo de cultura de células e método de cultura de células em um recipiente de cultura com circulação de meio de cultura

Info

Publication number: BRPI0616924B1
Application number: BRPI0616924-4A
Authority: BR
Inventors: Jose Antonio Castillo Fernandez
Original assignee: Artelis S A
Priority date: 2005-10-04
Filing date: 2006-10-03
Publication date: 2015-08-11
Also published as: EP1931761A1; JP2009509559A; US20120171764A1; CN101316925B; AU2006298724B2; US8137959B2; CN102994384A; AU2006298724A1; BRPI0616924A2; BE1016793A4; CA2624729A1; IL190546A0; CN101316925A; EP1931761B1; MY157374A; IL190546A; KR20080071980A; US20140162363A1; WO2007039600A1; KR101353633B1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPO- SITIVO DE CULTURA DE CÉLULAS E MÉTODO DE CULTURA DE

CÉLULAS EM UM RECIPIENTE DE CULTURA COM CIRCULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA". [001] A presente invenção refere-se à cultura de células por meio de um dispositivo compreendendo: - um recipiente de cultura proporcionado com um invólucro, em que está situado pelo menos uma primeira zona e pelo menos uma segunda zona, a referida primeira zona sendo uma zona de transfe- rência para o meio de cultura essencialmente livre de células e a refe- rida segunda zona sendo uma zona de cultura de células, a referida primeira zona estando externa à segunda, - meios de circular o meio de cultura, permitindo a circula- ção do meio de cultura através da zona de cultura, a referida zona de cultura compreendendo uma parede inferior e uma parede superior, cada parede sendo proporcionada com orifícios permitindo uma trans- ferência de meio de cultura essencialmente livre de células. [002] O referido dispositivo de cultura é conhecido, por exemplo, a partir da patente U.S. 5.501.971, a qual descreve um recipiente de cultura em que está situada uma zona de cultura externa a um dueto interno de meio de transferência. As células estão situadas na zona de cultura externa, a qual é uma espécie de cesta compreendendo veícu- los, e o meio de cultura flui do topo para a base através da referida zo- na de cultura. A seguir, o meio é revestido na parte inferior da zona de cultura, é utilizado por meio de um dispositivo de circulação de meio de cultura através do acima mencionado dueto em uma porção superi- or do recipiente de cultura e então passa novamente através da zona de cultura. A patente U.S. 5.507.971 descreve várias alternativas, mas o meio de cultura sempre passa através da zona de cultura do topo para a base. [003] Um inconveniente dos referidos dispositivos é que ele não está adaptado a todos os tipos de cultura de células. Na verdade, o referido dispositivo é projetado apenas para a cultura de células em microveículo s em um leito fixo ou compactado, e não é adequado, em absoluto, para a cultura de células em suspensão ou em microveículo s em um leito fluidizado. Na verdade, no dispositivo da patente U.S. 5.501.971, as células em suspensão sem veículos, ou microveículo s ou em veículos não imobilizados, possuem a tendência a sedimentar e a acumular na base da zona de cultura uma vez que estão sujeitas à gravidade, enquanto o fluxo do meio de cultura através da referida zo- na de cultura ocorre do topo para a base, a referida acumulação de células na base da zona de cultura é a maior. Consequentemente, as células são acondicionadas uma sobre a outra e estão em contato uma com a outra e os nutrimentos dentro da referida zona não estão muito acessíveis para as células. [004] No reator da patente U.S. 5.501.971, no caso das culturas, em veículos não imobilizados ou microveículo s, de células as quais são espécies frágeis que suportam poucos esforços, as células são submetidas ao efeito da gravidade, ao fluxo descendente do meio de cultura e ao peso dos veículos, o qual danifica enormemente a sobre- vivência da cultura. Além do mais, uma aplicação para a cultura em suspensão é inconcebível no biorreator da patente U.S. 5.501.971 uma vez que as células em suspensão não podem, sob nenhuma circuns- tância, serem submetidas ao contato célula a célula. Na verdade, se o referido contato estiver presente, as células criam ligações protéicas entre si e se agregam. A referida agregação causa a morte das células pela falta de oxigênio e de nutrimento. [005] O objetivo da presente invenção é abrandar os inconveni- entes do método anterior pela obtenção de um dispositivo de cultura tornando possível cultivar ambas as células em suspensão, as células que dependem de ancoragem em veículos ou microveículo s enquanto assegura um esforço mínimo sobre as células e previne a referida acumulação de células na base da zona de cultura. [006] Para resolver o referido problema, um dispositivo como o indicado no início do referido texto, é proporcionado de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo fato de que o mesmo também compreende pelo menos uma terceira e pelo menos uma quarta zona, ambas sendo zonas de transferência de meio de cultura essencial- mente livres de células, a referida terceira zona sendo a zona interna à referida segunda zona e externa à referida primeira zona e a referida quarta zona sendo a zona externa à referida segunda zona, a referida terceira zona sendo em uma comunicação de meio com a primeira e a segunda zona, e a referida quarta zona estando em comunicação de meio com a segunda zona (a zona de cultura) e com a primeira zona (a zona de transferência de meio de cultura) via os meios de circula- ção do meio de cultura, e de modo que os meios de circulação do meio de cultura permitem a circulação do meio de cultura de baixo pa- ra cima na referida segunda zona de cultura. [007] A referida quarta zona mais particularmente encerra um vo- lume de gás consistindo na atmosfera ambiente do biorreator e pode também constituir uma zona de oxigenação para o referido meio de cultura. [008] Consequentemente, o meio de cultura, o qual passa atra- vés da primeira zona de transferência de meio de cultura de baixo para cima, alcança o topo da primeira zona de transferência de meio de cul- tura e se descarrega na terceira zona, a qual está em comunicação de meio com a primeira zona, o meio de cultura flui para baixo, sujeita ao fluxo imposto pelos meios de circulação, aos efeitos da gravidade e dos recipientes comunicantes, passa através do orifício de passagem do meio de cultura na parede inferior da segunda zona de cultura, a seguir sobe novamente pelo trajeto na direção do topo da zona de cul- tura pelos efeitos dos recipientes comunicantes ou pelos efeitos dos meios de circulação do meio de cultura, ou por ambos, e então se descarrega na quarta zona de transferência do meio de cultura, a qual está em comunicação com a primeira zona de transferência do meio de cultura pela via dos meios de circulação. Os meios de circulação do meio de cultura então tomam novamente o meio de cultura o topo da primeira zona de transferência de meio de cultura e o ciclo recomeça.

Consequentemente, as células que estavam situadas na zona de cul- tura se deslocaram de baixo para cima pelo meio de cultura se benefi- ciam dos efeitos da gravidade, neutralizada em parte pelo fluxo do meio de cultura. O fluxo permite uma melhor dispersão de células so- zinhas ou em microveículo s na zona de cultura e os esforços prejudi- ciais para elas são reduzidos. [009] Quando os termos células em veículos ou em microveículo s são usados, deve ser entendido que os veículos podem estar em um leito fixo ou compactado ou em um leito fluidizado. [0010] Do mesmo modo, quando os termos "cultura de células" ou "células" são usados, deve ser entendido em particular que se faz refe- rência a células de animais, quer seja para a produção viral, de proteí- nas ou de outros produtos de recombinação, metabolitos celulares, uma cultura de células de tecidos (possivelmente em veículos de três dimensões), células de haste ou bactérias ou fermentos. [0011] Será mais facilmente compreendido por aqueles versados na técnica que células em veículos ou microveículo s sofrem menos na compactação, em particular no caso de um leito fixo, do que células em suspensão sem veículos ou sem microveículo s, mas não obstante verão facilmente a vantagem na oxigenação da cultura e em na nutri- ção da referida direção de fluxo dentro da zona de cultura. Na verda- de, é sabido que o projeto do recipiente de culturas é uma etapa chave na cultura de células. O projeto dos referidos recipientes deve ser tal que não haja áreas mortas, não supridas por meio de cultura fresco, ou em que as células se acumulem; é também muito vantajoso para as células estarem em contato direto com o meio de cultura ao invés de estar em contato uma com a outra para a sua reprodução e/ou meta- bolismo de produção. [0012] A presente invenção fornece um dispositivo flexível adapta- do às culturas de suspensão e às culturas sobre veículos ou em mi- croveículo s, as quais permitem uma redução no esforço aplicado às células e previnem a acumulação de células em uma zona particular da zona de cultura, pela redução do efeito da gravidade que é exercido nas células e prevenindo a presença de zonas mortas não fornecidas com meios de cultura frescos ou nos quais as células podem acumu- lar. Além do mais, para a aplicação em culturas em suspensão, o dis- positivo de acordo com a presente invenção permite uma boa disper- são de células por virtude de, por um lado, o fluxo de baixo para cima e, por outro lado, a gravidade que é ainda parcialmente aplicada às células. [0013] Os termos "parede inferior proporcionada com orifícios para a passagem de um meio de cultura essencialmente livre de células" devem ser tomados como significando uma parede situada na base da zona de cultura, a qual pode estar situada na parte de baixo da zona de cultura ou na parte mais baixa da parede vertical delimitando a refe- rida zona de cultura e que permite o meio de cultura passe e não as células em microveículo s ou veículos ou mesmo em suspensão. De modo similar, a parede superior proporcionada com orifícios para a passagem de um meio de cultura essencialmente livre de células pode ser uma parede situada no topo da zona de cultura ou na porção supe- rior da parede vertical delimitando a zona de cultura com característi- cas idênticas àquele descrito acima. [0014] Naturalmente o meio de cultura que se descarrega da pri- meira zona para a terceira zona pode se descarregar sobre o topo das paredes da primeira zona e no referido caminho alcança a terceira zo- na ou pode se descarregar via um orifício ou tubo instalado no topo ou porção da base da primeira zona de transferência de meio de cultura. O mesmo se aplica ao meio de cultura que se descarrega da segunda zona dentro da quarta zona. [0015] De forma vantajosa, os meios de circulação do meio de cul- tura consistem em uma bomba de centrifugação situada em uma por- ção da base do referido dispositivo de cultura, compreendendo pelo menos um dispositivo magnético girando sobre uma linha central de rotação substancialmente central (real ou virtual), pelo menos uma en- trada e pelo menos uma saída para o meio de cultura, os referidos meios de circulação sendo proporcionado para sugar o meio de cultura em um sifão criado por uma rotação do dispositivo magnético e para propelir o meio de cultura na direção da descarga do meio de cultura localizada na zona externa ao referida dispositivo magnético e na refe- rida bomba de centrifugação é conduzido por um motor magnético gi- ratório proporcionado para efetuar a circulação de meio de cultura sem comunicação com o exterior do dispositivo, e pelo menos um dispositi- vo de guia, projetado para guiar o meio de cultura propelido através da referida saída na direção do topo do recipiente. [0016] Um inconveniente do biorreator convencional existente é que eles são proporcionados com um sistema de agitação de lâmina ou de parafuso para fornecer a homogeneização do meio de cultura dentro do recipiente de cultura sem necessariamente proporcionar a circulação adequada. No referido caso, o biorreator compreende um eixo proporcionado com forros mecânicos frágeis duplos, por exemplo, fabricado com dispendioso carboneto de silício e que passa através do revestimento do biorreator. A referida passagem através do revesti- mento do biorreator é um sério risco para a contaminação e um risco significativo de avaria. [0017] Outros tipos de biorreator compreendem uma circulação externa do meio de cultura. O meio de cultura passa através uma tubu- lação através uma bomba peristáltica ou um sistema semelhante. Ob- viamente, a referida solução, embora em parte impedindo contamina- ções diretas, tem um outro inconveniente. Não é aplicável para cultu- ras de longo prazo. Na verdade, as tubulações usadas no referido tipo de bomba sejam sujeitas ao desgaste durante culturas de longa vida, a qual também envolve problemas de selagem e contaminação. [0018] A circulação do meio de cultura como descrito acima tam- bém causa uma dificuldade técnica de conseguir um efeito de "fonte".

Consequentemente, não basta fazer o líquido fluir através da zona de cultura em uma gota de pressão muito baixa, é também necessário manter uma diferença de nível dentro do recipiente de cultura simulta- neamente. Na verdade, trazendo o líquido na direção do topo da pri- meira zona de transferência de meio de cultura é uma etapa chave, mas também assegura que o meio de cultura não se acumule excessi- vamente na base da quarta zona também. Se o meio de cultura se acumula na base da quarta zona de cultura, o efeito de descarga será reduzido e a circulação cíclica do meio de cultura da primeira zona de transferência de meio de cultura para a terceira zona de transferência do meio de cultura e então à segunda zona de cultura e finalmente dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura não será a melhor. [0019] Consequentemente, os meios de circulação de acordo com a presente invenção irão compreender um dispositivo magnético gi- rando em torno de um eixo de rotação substancialmente central, e uma entrada de meio de cultura e saída. [0020] Para culturas de pequena escala, o dispositivo magnético irá, por exemplo, seja uma barra magnética simples, conduzida por um ímã externo, tendo recursos para taxas de fluxo de 0,6 a 6 L/min (quer dizer, 1 a 10 mL/seg). Por causa do referido, não há risco de contami- nação uma vez que a circulação do sistema do meio de cultura não se comunica com o exterior, mas é conduzido por um dispositivo externo ao recipiente de cultura. Uma bomba peristáltica pode também ser prevista de acordo com a presente invenção, mas preferencialmente para culturas de curta duração. [0021] Para culturas de larga escala, o dispositivo magnético será um rotor magnetizado com uma taxa de fluxo de entre, por exemplo, 10 e 200 L/min, em particular de 20 a 150 L/min e preferivelmente de 25 a 100 L/min. [0022] Em uma modalidade particular, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende uma série de módulos, cada módulo compreendendo a referida primeira zona, a referida segunda zona, a referida terceira zona e a referida quarta zona, e em que os módulos adjacentes na referida série de módulos estão em comunicação de meio, a referida primeira zona e a referida quarta zona de cada módulo estando em comunicação com os referidos meios de circulação, direta ou indiretamente. [0023] A referida modalidade torna possível obter um dispositivo particularmente flexível e permite um aumento na escala até um volu- me de 100 litros. [0024] De modo geral, o aumento de escala é uma etapa comple- xa na produção de produtos de recombinação, vírus, metabólitos de células ou outros ou na cultura de células uma vez que o referido au- mento de escala de modo geral causa problemas com zonas supridas de maneira medíocre, quer seja com oxigênio ou com nutrimentos. Na modalidade descrita acima, o dispositivo de cultura compreende uma série de módulos adjacentes, por exemplo, empilhados ou justapostos.

Da quarta zona do primeiro módulo de cultura, o meio de cultura al- cança os meios de circulação do meio de cultura passando através dos outros módulos de cultura. A invenção prevê vários tipos de módu- lo de volume pré-determinado. Por exemplo, módulos de 500 ml_ ou de 5 litros, dotados de um volume de 500 ml_ a 5 litros, incluindo todos os volumes compreendidos dentro da faixa ou limitando a faixa. Conse- quentemente, para uma cultura de 3 litros, 6 módulos de 500 ml_ serão usados. Por exemplo, seis módulos serão empilhados tanto em um recipiente suficientemente largo ou por meio de módulos que podem ser interconectados de modo a formar o referido recipiente. [0025] No caso do reator do documento dos E.U.A. 5.501.971, se um volume de cultura de 3 litros é necessário, uma altura H da zona de cultura será necessária. O meio de cultura que alcança a base da zona de cultura na referida patente está praticamente esgotado, em particular com relação ao oxigênio. Além disso, os autores da patente U.S. 5.501.971, contemplam colocar um sensor de oxigênio no topo da zona de cultura e na base deste último e sobreprover o ambiente do reator com oxigênio. Infelizmente, o referido tipo de superoxigenação não é recomendado, em absoluto, uma vez que o referido produz uma oxidação de componentes celulares das células no topo da zona de cultura e a morte da célula se segue. Além do mais, quando os autores da patente 5.501.971, contemplaram o aumento da escala, é nos ter- mos da largura que o referido é realizado uma vez que em termos de altura não é mais possível. Naturalmente, o espaço ocupado no assoa- lho torna-se rapidamente incontrolável. Como é conhecido para aque- les versados na técnica, o espaço é um parâmetro crítico, especial nos espaços brancos onde as eficiências são calculadas de acordo com o volume de ar a ser tratado de modo a obter ar estéril, o referido tipo de tratamento de ar sendo muito caro. O volume de ar a ser tratado é ob- tido pela multiplicação pela altura do "espaço branco" a superfície no assoalho ocupado pelo o biorreator, seu equipamento, e pessoas ma- nuseando o dispositivo de cultura. [0026] Consequentemente, através o uso de módulos empilhados ou justapostos, de acordo com rendimentos a ser conseguidos, o es- paço é reduzido. Além do mais, o volume de cultura através do qual o meio de cultura deve filtrar-se antes de uma vez novamente estar em contacto com o ar ambiente do biorreator é apreciavelmente reduzido.

No caso de nosso exemplo anterior, o volume é dividido por 6. [0027] De acordo com uma modalidade vantajosa, a provisão con- sequentemente é feita para projetar um recipiente autoclávico, vazio, de cultura com uma altura predeterminada (feita de vidro ou de aço inoxidável) ou recipiente de cultura vazio ou descartável, compreen- dendo os meios de circulação do meio de cultura na base do recipien- te. Bastará então posicionar o número N de módulos exigidos no reci- piente acima dos meios de circulação do meio de cultura e fechar o recipiente novamente por meio de um revestimento adaptado. No refe- rido caso, seja para uma cultura de 5 litros ou de 50 litros, o tamanho do recipiente permanece o mesmo. [0028] A referida modalidade pode ser particularmente vantajosa para laboratórios dotados de poucos meios uma vez que é particular- mente barata. Na verdade, se o recipiente fornecido é projetado para uma cultura de 35 litros e a cultura necessária é de apenas 5 litros ou 10 litros, é o bastante colocar, por exemplo, sobre os meios de circula- ção do meio de cultura, um ou dois módulos de culturas de 5 litros. O referido particularmente reduz a quantidade de investimento uma vez que a parte dispendiosa sempre permanece a mesmo para qualquer cultura de 5 a 35 litros. [0029] Além do mais, seja para uma cultura de 5 litros ou de 35 litros ou mesmo mais, a superfície do assoalho será a mesma, e o aumento da escala não envolve qualquer volume de ar maior a ser tra- tado. Além do mais, pelo fato do meio de cultura estar, entre cada pas- sagem em um módulo, em contato com o ar ambiente no reator, os problemas de aumento da escala são grandemente reduzidos. [0030] Como mencionado previamente, os meios de circulação do meio de cultura são particularmente eficazes, cobrindo escalas dos valores particularmente adaptados ao dispositivo de acordo com a pre- sente invenção. Consequentemente, a taxa de fluxo em cada módulo é idêntica e, no nível em que se dá a saída, o aumento na escala tam- bém não é um problema de acordo com a presente invenção. [0031] Em uma modalidade particularmente vantajosa, os meios de circulação são confinados em um módulo de base, o referido módu- lo de base estando em comunicação de meio com pelo menos uma primeira zona de transferência de meio de cultura e pelo menos uma quarta zona de transferência do meio de cultura, direta ou indiretamen- te. [0032] Uma vez que os meios de circulação do meio de cultura estão frequentemente em zonas que apresentam riscos de contamina- ção cruzada ou contaminação externa, através da presença de algu- mas zonas que não estão acessíveis para a limpeza, obter um módulo de base que pode, por exemplo, sem, no entanto, estar sendo limitado a isso, ser inserido em um simples recipiente de vidro é particularmen- te vantajoso. O referido módulo de base é adaptado aos módulos de cultura, permitindo a comunicação de meio de cultura entre a primeira área de transferência do meio de cultura de todos os módulos presen- tes e a saída do meio de cultura dos meios de circulação do meio de cultura e permitindo a comunicação do meio de cultura entre todas as quartas zonas de todos os módulos de cultura presentes e a entrada do meio de cultura nos meios de circulação do meio de cultura, direta ou indiretamente, ou seja, passando através de outro módulo ou não. [0033] O dispositivo preferivelmente também compreende um mó- dulo principal, o referido módulo principal compreendendo pelo menos o revestimento. O referido módulo principal sendo capaz de ser proje- tado interromper a superimposição mencionada acima. [0034] Em uma modalidade vantajosa, pelo menos uma quarta zo- na compreende pelo menos uma parede de fluxo substancialmente vertical ou inclinada. [0035] A presença da referida parede de fluxo reduz a formação de espuma, a qual pode aparecer durante a descarga da segunda zona de cultura para a quarta zona de transferência do meio de cultura. Na verdade, sem a referida parede de fluxo, o fluxo de meio de cultura da segunda para a quarta zona seria um fluxo turbulento, o qual teria ne- cessariamente como sua consequência uma indesejável formação de espuma. Deve ser apontado que a formação de espuma é um proble- ma grave em muitos métodos da cultura uma vez que o meio de cultu- ra é rico em proteínas. Agitar um fluido rico em proteína sempre causa o aparecimento de espuma. Consequentemente, um fluxo turbulento teria o referido mesmo efeito, e é por isso que, de forma vantajosa, a invenção compreende a referida parede de fluxo para reduzir o a tur- bulência do fluxo. [0036] Além do mais, a referido quarta zona de transferência do meio de cultura é também a zona em que o meio de cultura está em contato com a atmosfera ambiente do dispositivo de acordo com a presente invenção. A presença da parede de fluxo melhora o referido contato e em consequência as trocas de oxigênio entre a atmosfera ambiente e o meio de cultura, pelo aumento da área de superfície do contato entre gás e líquido. [0037] De forma vantajosa, a fim estabilizar a película, é também possível adicionar aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modi- ficar as propriedades reológicas da água, os referidos aditivos incluí- dos no grupo consistindo de surfactantes, Pluronic F68, glicerina, cá- tions quaternários de amônio e qualquer outro aditivo para modificar as propriedades reológicas do meio de cultura. [0038] Em uma modalidade particularmente preferida, a parede de fluxo essencialmente vertical ou inclinada compreende uma membrana hidrófila. [0039] Na verdade, se a parede de fluxo não é ou não compreen- de a superfície hidrófila, pode ser muito difícil obter uma película de meio de cultura na referida superfície. Além do mais, a película, quan- do é formada em uma parede convencional, é instável. Consequente- mente, revestindo-se a parede de fluxo com a membrana hidrófila, a qual desempenha a função de uma esponja, o meio de cultura é natu- ralmente espalhado e flui de maneira uniforme. Consequentemente, o contato superfície entre a película de meio de cultura e a atmosfera ambiente é melhorado extremamente, o que permite uma oxigenação compatível com densidades altas de célula. Os coeficientes totais de transferência de oxigênio obtidos estão em torno de 10"3 a em torno de 10'2 s\ [0040] Se, na modalidade com módulos de cultura, algumas ou todas as quartas zonas compreendem uma parede de fluxo com uma membrana hidrófila, as trocas de gás-líquido são melhoradas ainda mais. Consequentemente, mesmo o último módulo na série é forneci- do com um meio de cultura oxigenado. Em alguns casos do método anterior com circulação de meio de cultura, quando a cultura é produ- zida, por exemplo, com um volume de 200 litros, as células no final da circulação do meio de cultura estão relativamente mal supridas e o crescimento da célula não é homogêneo no biorreator. [0041] No dispositivo de acordo com a presente invenção, o referi- do não ocorre; não existem zonas mal supridas ou mortas. [0042] Em uma modalidade vantajosa, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um orifício de entrada de gás e um orifício de saída de gás. [0043] O recipiente de cultura preferivelmente compreende pelo menos um orifício de entrada de gás e um orifício de saída de gás. Da referida forma, é possível enriquecer a atmosfera ambiente do disposi- tivo de acordo com a presente invenção com oxigênio, por exemplo, enquanto o oxigênio é consumido pelas células. É possível também suprir a atmosfera ambiente com outros gases, por exemplo, adicio- nando C02 com o objetivo de modificar o pH, ou qualquer outro gás de modo geral usado em cultura de células. O orifício de saída torna pos- sível prever pressões excessivas e descarregar o gás com o baixo conteúdo de oxigênio ou simplesmente parte do gás da atmosfera am- biente com o objetivo de reduzir a pressão ambiente do dispositivo de acordo com a presente invenção. Também, a provisão é feita para que se possa bloquear ou "estrangular" a referida saída de gás no caso de um pequeno aumento de pressão ser desejável. [0044] A entrada de gás pode ser situada ou conectada à primeira, à segunda, à terceira ou à quarta zona do recipiente de cultura. A pri- meira e quarta sendo zonas preferenciais. A terceira zona de transfe- rência do meio de cultura não é muito acessível para o contato entre gás e líquido e a segunda zona do recipiente de cultura é o recipiente de cultura da célula, em que o contato direto entre gás e líquido pode apresentar um risco de oxidação dos componentes da célula, o que não é desejável. [0045] De forma vantajosa, o orifício de entrada de gás is conecta- do a pelo menos uma quarta zona de transferência do meio de cultura. [0046] Pelo fato da quarta zona de transferência do meio de cultu- ra também servir como uma zona de oxigenação, uma vez que é nes- sa última que se dá o contato entre gás e líquido da melhor forma, com ou sem a parede de fluxo, é vantajosa que seja essa última a receber a adição de gás fresco com o objetivo de promover a oxigenação do meio de cultura. Além do mais, o meio de cultura que se descarrega na referida quarta zona é o meio de cultura usado pelas células, e em consequência parte do oxigênio é consumido, pode também ser ne- cessária a modificação para o pH e é em consequência uma vantagem para o gás (oxigênio, ar, C02 ou outro) entrar através a referida quarta zona de cultura com o objetivo de aumentar a eficiência de qualquer regulação ou oxigenação ou modificação de pH. [0047] Em uma modalidade particular, a entrada de gás está co- nectada a um tubo pulverizador. [0048] A invenção, em uma modalidade particular, proporciona a dispersão das bolhas gasosas a ser efetuada dentro do dispositivo de acordo com a presente invenção. A dispersão de bolhas pode ser efe- tuada por um pulverizador imerso no meio de cultura na primeira, se- gunda, terceira e quarta zona de transferência do meio de cultura (bo- lhas grandes ou microbolhas, de acordo com a aplicação). A dispersão de bolhas será preferivelmente efetuada por um pulverizador imerso no meio de cultura na primeira ou quarta zona de transferência do meio de cultura. [0049] Em uma modalidade particular, o revestimento do recipiente de cultura é conectado a pelo menos parte da referida parede superior de pelo menos uma segunda zona de cultura. [0050] A referida modalidade particularmente preferida permite a coleta simplificada de amostras, o que minimiza o risco de contamina- ção. Particularmente durante culturas em microveículo s, a coleta de amostras não é, de modo geral uma etapa sem qualquer risco. Para medir a densidade da célula, existem atualmente poucos meios, os quais também são muito fastidiosos e não muito confiáveis. Conse- quentemente, o melhor meio de medir a densidade da célula tirando amostras de veículos e as observando sob o microscópio, possivel- mente após a coloração. [0051] Na verdade, em biorreatores convencionais, e em particular no biorreator da patente U.S. 5.501.971, a coleta de amostras é do mesmo modo impossível pelo fato da parede superior da zona de cul- tura não puder ser simplesmente aberta ou isso representar um sério risco de contaminação. Na verdade, o usuário deve abrir o revestimen- to do recipiente de cultura, que é frequentemente volumoso e pesado e em consequência difícil de mover em um fluxo estéril, e então segu- rar o revestimento, de modo geral fixado a uma lâmina ou outros dis- positivos para erguer o meio de cultura e em consequência é pesado e volumoso, e ele deve assegurar-se de que não tocou em nada e deve segurar em uma das mãos apenas para que não haja contaminação. A seguir, com a outra mão, ele deve abrir a parede superior da zona de cultura e segurá-la coma outra mão. Então, por meio de uma braçadei- ra em uma terceira mão, deve retirar amostras de um ou vários veícu- los a fim poder avaliar a densidade da célula. Isto exige a presença de um segundo usuário ou uma destreza impressionante. [0052] A presente invenção em muito simplifica a referida etapa da coleta de amostras pela obtenção de um invólucro fixo a parede supe- rior da zona de cultura; tudo que deve ser feito a seguir é suspender ligeiramente o revestimento, a parede superior da zona de cultura se levanta simultaneamente, e introduzir uma braçadeira estéril ou uma ferramenta da amostragem tal como uma pipeta ou um similar para um ou várias preparação de amostras de veículos com o objetivo de avali- ar a densidade da célula. Os riscos de tocar em um objeto que não esteja esterilizado e os riscos de contaminação são grandemente re- duzidos. [0053] De forma vantajosa, em certas modalidades, o dispositivo de acordo com a presente invenção também compreende um meio de aquecimento, projetado para aquecer o meio de cultura transferido. O referido meio de aquecimento pode, de forma vantajosa, estar situado na quarta área de transferência do meio de cultura ou nos meios de circulação do meio de cultura. Naturalmente, a primeira zona pode também compreender o referido meio de aquecimento. [0054] O meio de aquecimento pode ser um elemento elétrico, uma bobina elétrica ou qualquer outro meio de aquecimento de modo geral usado no campo de cultura de células, tal como, por exemplo, um revestimento duplo termostaticamente controlado. [0055] Na verdade, durante culturas de larga ou muito larga esca- la, não é sempre fácil colocar o dispositivo de acordo com a presente invenção em um dispositivo ou espaço termicamente controlado. Con- sequentemente, a presente invenção resolve o referido problema atra- vés da colocação direta do meio de aquecimento com o objetivo de controlar o meio de cultura termostaticamente e para suportar uma temperatura por igual no recipiente de cultura. Preferivelmente, o dis- positivo de acordo com a presente invenção proporciona um aqueci- mento do meio de cultura sem qualquer ponto de sobreaquecimento. [0056] Em certas modalidades, o dispositivo de acordo com a pre- sente invenção compreende sensores para medir os parâmetros da cultura, os referidos sensores estando em contato com o meio de cul- tura. Os parâmetros da cultura significam, entre outras coisas, a pres- são parcial do oxigênio dissolvido, o pH, a temperatura, a densidade óptica, certas concentrações de nutrimentos, os referidos lactato, amônio, cabonatos, glicose ou qualquer produto metabólico ou produto a ser metabolizado que possa, por exemplo, refletir a densidade da célula. [0057] Pode também ser contemplado, de acordo com a presente invenção, o uso de circuitos de regulagem de acordo com os referidos parâmetros. Os referidos circuitos de regulagem iriam, por exemplo, modular a quantidade de oxigênio a ser injetada dentro da atmosfera gasosa de acordo com o valor da pressão parcial de oxigênio dissolví- do presente ou a quantidade de oxigênio dissolvido consumido pelas células. É possível injetar C02 de acordo com o valor de pH obtido pe- los sensores ou qualquer outro tipo de regulação de modo geral usada no referido tipo de cultura. [0058] Os sensores são preferivelmente arranjados na porção da base de pelo menos uma quarta zona. A quarta zona de transferência do meio de cultura é uma zona preferencial para o posicionamento dos sensores uma vez que os valores obtidos por esse último são clara- mente representativos do consumo da célula, uma vez que a referida zona é dotada de um meio de cultura vindo da zona de cultura pas- sando através de si. [0059] De forma vantajosa, os referidos sensores são sensores óticos descartáveis, proporcionados para a transmissão de sinais óti- cos representando os parâmetros a serem medidos através do referido recipiente de cultura para um receptor de sinal ótico, externo ao referi- do dispositivo. [0060] Em uma modalidade particularmente preferida, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende uma série de módu- los, cada módulo de cultura compreende em sua porção superior um primeiro meio de fixação e em sua porção da base um segundo meio de fixação, em que o referido módulo de base também compreende, na porção superior, um primeiro meio de fixação e o referido módulo principal também compreende em sua porção da base um segundo meio de fixação, o referido primeiro meio de fixação e o referido se- gundo meio de fixação sendo complementares para a produção de uma sequência de empilhamento da parte inferior para o topo de um módulo de base, pelo menos um módulo de cultura e um módulo prin- cipal. [0061] De forma vantajosa, os referidos primeiro e segundo meios de fixação compreendem meios para a produção da referida sequência de empilhamento de modo justo entre gás e líquido. [0062] Na verdade, de acordo com a presente invenção, é possível projetar uma série de módulos onde a parede de cada módulo irá constituir parte da parede do recipiente de cultura. A seguir, é suficien- te montar as referidas séries de módulos de cultura com um módulo de base compreendendo os meios de circulação e um módulo principal compreendendo o revestimento. O conjunto formado pelos referidos módulos irá então constituir o dispositivo de cultura. De acordo com o volume de cultura necessário, um número N de módulos seria ajustado junto para construir seu próprio dispositivo de cultura com a altura H. [0063] Em uma modalidade muito particular, o dispositivo de acor- do com a presente invenção é um dispositivo descartável. [0064] Existe hoje em dia uma quantidade de biorreatores que for- necem excelentes resultados de cultura de células em pequena e grande escala. Infelizmente, os referidos biorreatores são dispendio- sos em termos de limpeza, esterilização, trabalho, locação e espaço ocupado. Na verdade, em particular para a produção de conjuntos clí- nicos ou produtos de interesse farmacêutico, é essencial que os bior- reatores sejam colocados em espaços brancos estéreis. Um biorreator de 500 litros ocupa mais de vinte vezes o seu volume em um espaço branco. O critério do espaço branco é o volume usado por uma insta- lação, ou seja, se a instalação ocupa 1 m2 de superfície do piso, o vo- lume de ar a ser tratado será de (1 m2 mais a área de superfície ne- cessária para o usuário) multiplicada pela altura do espaço branco uma vez que o volume de ar acima da superfície do assoalho também deve ser tratado. Além do mais, a esterilização, assepsia, lavagem, sanitização, etc., protocolos que são etapas exigidas tanto para um biorreator quanto para o espaço ocupado, são protocolos demorados e fastiosos impõem enormes custos tanto com relação ao trabalho quan- to em relação à instalação de produtos. Por essa razão é que, princi- palmente em laboratórios farmacêuticos, biológicos e bioquímicos e em espaços brancos, os equipamentos descartáveis, de modo geral menos volumosos, e que não exigem limpeza, sanitização, esteriliza- ção e assepsia, estão cada vez mais em uso. [0065] Existem soluções alternativas para reutilizar biorreatores convencionais, por exemplo, a cultura é disposta em um recipiente es- téril descartável que seja agitado por uma placa de agitação que re- produz um movimento de onda, por exemplo, o biorreator WAVE®. In- felizmente, o referido biorreator apresenta um problema de aumento da escala, uma vez que um recipiente de 500 litros, tanto que a placa de agitação pode ser feita sob medida, tem uma superfície enorme de assoalho que demanda um tratamento de ar do quarto branco cujo custo é impossível supor, sem mencionar a dificuldade de manusear os referidos recipientes, a coleta de amostras e a colocação dos sen- sores de parâmetros da cultura. [0066] Outras soluções existem, como garrafas descartáveis agi- tadas chamadas de "giradores". O aumento de escala destas garrafas é igualmente impossível e as garrafas têm baixa transferência do oxi- gênio assim como causam esforço das células durante a agitação. [0067] Também existem culturas em sistemas como CELLCUBE® ou CELLFACTORY®. O referido sistema é difícil de regular e é volu- moso. Além do mais, as transferências de oxigênio são deficientes e exigem incubadoras de grande tamanho. Mais uma vez, o aumento da escala é fastioso. [0068] O sistema BELLOCELL® é também conhecido. O referido sistema é baseado na imobilização de células em matrizes porosas, que são embaladas na zona de cultura. O meio de cultura está em uma zona mais baixa proporcionada com foles compressíveis. O meio de cultura sobe e desce alternadamente com o objetivo de submergir as matrizes no meio de cultura e então expo-las ao ar ambiente. [0069] Infelizmente, o aumento da escala do referido sistema tam- bém é difícil. É difícil regular e medir os parâmetros da cultura. Além do mais, as células estão submetidas a esforços de tensão em sua super- fície, sendo expostas antes de mais nada a um limite médio em queda, à secagem, e então a uma limite média em aumento, que é prejudicial a seu crescimento. [0070] Em suma, não existem no presente momento sistemas descartáveis de cultura de células adaptados para a cultura em larga e pequena escala que são mais fáceis de usar, ambas em um espaço branco e em laboratório. [0071] A presente invenção, em consequência, obtém uma solu- ção muito inovadora, a qual resolve uma maior parte destes inconveni- entes obtendo um sistema inesperado, aplicável em pequena e em larga escala, adequado para cultura em suspensão, em veículos ou em microveículo s, cuja agitação sustenta a homogeneidade do meio de cultura sem zonas mortas ou zonas de acumulação de células.

Além do mais, os riscos de contaminação por causa da ausência de um eixo central são particularmente baixos, ou mesmo não-existentes. [0072] Na verdade, o dispositivo de acordo com a presente inven- ção é um dispositivo que apresenta todas as vantagens dos biorreato- res convencionais, como mencionado aqui previamente, enquanto é descartável. O dispositivo de acordo com a presente invenção é agita- do magneticamente por meios de circulação de meio de cultura base- ados em uma bomba de centrifugação, que não é dotada de qualquer contato com o exterior. O meio de aquecimento, por exemplo, uma bo- bina elétrica, também tem recursos para o aquecimento homogêneo do meio de cultura sem ser dotado de contato com o exterior. [0073] Adicionalmente, como mencionado acima, de modo particu- larmente preferencial, o dispositivo de cultura de acordo com a presen- te invenção compreende sensores óticos descartáveis, projetados para transmitir um sinal ótico representando o parâmetro a ser medido atra- vés do recipiente de cultura para o receptor de sinal ótico, externo ao referido dispositivo. [0074] Consequentemente, os parâmetros da cultura são também medidos através de uma parede do dispositivo de acordo com a pre- sente invenção e o referido não envolve qualquer contato com o exte- rior, ao contrário das sondas de oxigênio dissolvido ou de pH que pas- sam através do revestimento de biorreatores clássicos, apresentando um risco de limpeza deficiente nas referidas sondas e orifício de pas- sagem e de contaminação através falta de um selo. [0075] Os sensores podem ser situados na base do dispositivo de acordo com a presente invenção ou na porção superior ou em ambas.

Quando os sensores estão presentes no topo e nas bases, o referido torna possível, por uma simples operação de diferença matemática, referente ou não a um número de células, fazer a medição contínua da respiração celular. [0076] Outras modalidades do dispositivo estão indicadas nas rei- vindicações dependentes. [0077] Outro objetivo da invenção é o uso do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção para a cultura de células em sus- pensão em microveículo s ou em veículos. Na verdade, quando o dis- positivo de acordo com a presente invenção é usado em cultura em veículos ou microveículo s, os veículos ou microveículo s são confina- dos na referida segunda zona de cultura. Quando o dispositivo é usa- do para a suspensão de cultura de células e, em consequência sem veículos ou microveículo s, a parede proporcionada com um orifício é uma membrana permeável ao meio de cultura, mas não permeável para as células. O tamanho dos poros da referida membrana é em função de todos os tamanhos. A presente invenção também se refere ao uso do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção para a produção de produtos recombinados, vírus, metabolitos e que tais. [0078] Os produtos de recombinação significam proteínas do inte- resse para a pesquisa no setor farmacêutico, as moléculas terapêuti- cas ou profiláticas, os anticorpos, os plasmídeos ou toda e qualquer outra molécula capaz de ser produzida por células em cultura, seja a produção pela secreção ou pela produção intracelular. [0079] A presente invenção também se refere a um método de cul- tivo de células em um recipiente de cultura com circulação do meio de cultura, compreendendo: - introdução de meio de cultura em meios de circulação do meio de cultura, - descarga de meio de cultura dos referidos meios de circu- lação de meio de cultura, - pelo menos uma primeira transferência de meio de cultura em um primeiro meio de cultura acima da zona de transferência, - pelo menos uma segunda transferência de meio de cultura em uma segunda zona de cultura de células. [0080] O referido método é caracterizado pelo fato de que ele também compreende: - pelo menos uma terceira transferência de meio de cultura subsequente à referida primeira transferência de meio de cultura em uma terceira zona de transferência de meio de cultura, pelo transbor- damento da primeira zona de transferência de meio de cultura para a terceira zona de transferência de meio de cultura, - pelo menos uma quarta transferência de meio de cultura subsequente à referida segunda transferência de meio de cultura em uma quarta zona de transferência de meio de cultura, pelo transbor- damento da segunda zona de cultura dentro da quarta zona de transfe- rência de meio de cultura, e assim a referida segunda transferência de meio de cultura é uma transferência de meio de cultura de cima para baixo. [0081] Como mencionado acima, ao contrário do método de cultu- ra da patente U.S. 5.501.971, o meio de cultura se desloca através da zona de cultura de baixo para cima, o que previne a acumulação de células na base da zona de cultura e reduz as forças de pressão nas células. O método de cultura de acordo com a presente invenção é, em consequência, um método particularmente inovador que permite o cultivo sem uma zona morta e sem qualquer lugar onde as células se acumulam enquanto permite o cultivo com alta eficiência. [0082] De forma vantajosa, o método também compreende uma oxigenação do meio de cultura durante uma ou mais das referidas transferências. [0083] A referida oxigenação preferivelmente ocorre através de contato direto entre gás e líquido durante uma ou mais das referidas transferências. [0084] Em uma modalidade particular, a oxigenação é realizada durante a quarta transferência de meio de cultura, a referida quarta transferência de meio de cultura sendo um fluxo do referido meio de cultura ao longo da parede de fluxo. [0085] Em uma modalidade vantajosa, o método, com o objetivo de estabilizar a película, proporciona a adição de aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modificar as propriedades reológicas da água, tais como os aditivos incluídos no grupo que consiste em surfac- tantes, Pluronic F68, glicerina, cátions quaternários de amônio e qual- quer outro aditivo para modificar as propriedades reológicas do meio de cultura. [0086] Também de forma vantajosa, o fluxo do meio de cultura é um fluxo ao longo de uma parede hidrófila. Outras modalidades do mé- todo de acordo com a presente invenção estão indicadas nas reivindi- cações dependentes. [0087] Outras características, detalhes e vantagens da presente invenção irão aparecer mais claramente à luz das descrições a seguir, em particular de modalidade não-limitantes da invenção, ao referir os desenhos de acompanhamento. [0088] A figura 1 é um diagrama traçado de um dispositivo de cul- tura de acordo com a presente invenção. [0089] A figura 2 é um diagrama traçado de uma variação dos meios de circulação do meio de cultura. [0090] A figura 3 é um diagrama traçado de um dispositivo de cul- tura de acordo com a presente invenção compreendendo várias e su- cessivas zonas de cultura, particularmente adaptadas para o aumento da escala. [0091] Afigura 4 ilustra de modo altamente esquemático uma vari- ação da figura 3. [0092] A figura 5 é uma seção transversal de uma porção da base do módulo de base que confina os meios de circulação do meio de cul- tura da modalidade preferida do dispositivo de acordo com a presente invenção. [0093] A figura 6 é uma vista superior da porção da base do módu- lo de base que confina os meios de circulação do meio de cultura co- mo ilustrado na figura 5. [0094] A figura 7 é uma seção transversal da porção superior do módulo de base que confina a circulação dos meios da mesma moda- lidade preferida do dispositivo de acordo com a presente invenção. [0095] A figura 8 é uma vista superior da porção superior do módu- lo de base que confina a circulação dos meios do dispositivo como ilustrado na figura 7. [0096] A figura 9 é uma seção transversal do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção produzido por um conjunto de módulos, em particular módulos descartáveis. [0097] Afigura 10 é uma vista explodida da figura 9. [0098] Nos desenhos, um símbolo de referência igual ou similar é usado para um elemento igual ou análogo. [0099] Como pode ser visto na figura 1, o dispositivo de cultura 1 compreende um recipiente de cultura substancialmente vertical e cilín- drico 2, apesar de outras formas também serem previstas de acordo com a presente invenção, por exemplo, qualquer forma de prisma, pre- ferivelmente regular. O recipiente de cultura compreende pelo menos quatro zonas em comunicação uma com a outra. Do centro do recipi- ente na direção do exterior, o recipiente compreende uma primeira zo- na 3, uma terceira zona 4a, 4b, uma segunda zona 5 e uma quarta zo- na 6. [00100] A zona compreendendo células foi esboçada e compreende a letra C enquanto o meio de cultura é mostrado pela letra M. [00101] O recipiente de cultura 2 compreende meios de circulação de meio de cultura em sua porção da base. Os meios de circulação do meio de cultura são, na referida modalidade preferencial, compostos de um dispositivo magnético 7, por exemplo, uma barra magnética 7 em rotação em torno de um eixo de rotação central 8, real ou virtual, a primeira terminação da qual está abrigada em meios de engate supe- riores 9 e a segunda terminação está abrigada em meios de engate inferiores 10. A barra magnética é conduzida por um motor de movi- mentação magnética giratório externo ao recipiente de cultura 2 e o qual não está mostrado aqui. Os meios de circulação compreendem pelo menos uma entrada de meio de cultura 11. A entrada de meio de cultura 11 compreende pelo menos uma primeira terminação a qual termina em um defletor de desvio 12 para o fluxo de meio de cultura. A barra magnética funciona como uma bomba de centrifugação, ou seja, o meio de cultura é sugado em uma zona relativamente central pelo movimento do meio de cultura criado pela barra e o meio de cultura é propelido para fora com relação a um ponto central. O defletor de des- vio de meio de cultura 12 guia o meio de cultura na zona relativamente central da barra de modo que o meio de cultura é sugado e propelido então para fora. [00102] De forma vantajosa, as entradas estão no mesmo plano (configuração estrela) e o número de entradas 11 será um número tal que seu posicionamento irá exibir simetria. Mais particularmente, se 3 entradas são consideradas, é vantajoso que cada uma esteja separa- da da outra por um ângulo de aproximadamente 120°, se o número de entradas for igual a 4, as entradas serão separadas uma da outra por um ângulo substancialmente equivalente a 90°, se o número de entra- das for igual a 10, as entradas serão dispostas com um ângulo de se- paração aproximadamente igual a 36°. [00103] Os meios de circulação do meio de cultura também com- preendem pelo menos uma saída de meio de cultura 13. A saída de meio de cultura 13 é de forma vantajosa situada no ponto onde o meio de cultura é propelido pelo efeito de centrifugação da barra magnética. [00104] De forma vantajosa, o número de saídas 13 será um núme- ro tal que seu posicionamento irá exibir simetria. Mais particularmente, se 3 saídas são consideradas, é vantajoso que cada uma esteja sepa- rada da outra por um ângulo de aproximadamente 120°, se o número de saídas for igual a 4, as saídas serão separadas uma da outra por um ângulo substancialmente equivalente a 90°, se o número de saídas for igual a 10, as saídas serão dispostas com um ângulo de separação aproximadamente igual a 36°. [00105] Preferivelmente, as saídas não estão situadas no mesmo plano horizontal que as entradas. A porção da base do recipiente de cultura compreende pelo menos um meio de guia do meio de cultura 14, adjacente à referida pelo menos uma saída 13, o qual guia o meio de cultura propelido na direção do topo do recipiente de cultura 2. [00106] A primeira zona 3 do recipiente de cultura 2 é a substanci- almente central zona e é a zona de transferência do meio de cultura. A primeira zona 3 compreende uma parte básica 3a e uma parte cilíndri- ca 3b. O diâmetro da parte básica 3a é menor do que o diâmetro do recipiente de cultura 2. A parte básica 3a está em comunicação de meio com a referida pelo menos uma saída de meio de cultura 13 dos meios de circulação do meio de cultura. A parte básica 3a é reduzida na porção superior da primeira zona 3 a um cilindro 3b com um diâme- tro menor do que a parte básica 3a. O topo da parte cilíndrica 3b com- preende uma parede externa e está em direta comunicação do meio de cultura com a parte básica 3a da referida primeira zona de transfe- rência de meio de cultura. [00107] A terceira zona 4 é a zona de transferência do meio de cul- tura, externa para a primeira zona de transferência de meio de cultura 3. A terceira zona também compreende substancialmente uma parte básica 4a (na forma de uma bucha) e uma porção superior cilíndrica 4b. [00108] A parte substancialmente cilíndrica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 é essencialmente concêntrica com a parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 e as referidos duas partes estão em comunicação de meio. A comunicação do meio de cultura é alcançada por meio de um orifício ou um tubo, pelo transbordamento (como mostrado na figu- ra) ou quaisquer outros meios possíveis para alcançar a referida co- municação. [00109] A segunda zona 5 é uma zona de cultura de células, com ou sem veículos ou microveículo s. A segunda zona 5 é também em forma de bucha, no centro da qual estão a primeira e terceira zonas de transferência dos meios de cultura 3 e 4. [00110] A segunda zona 5 compreende uma parede inferior 15 e uma parede superior 16, cada parede 15 e 16 sendo proporcionada com orifícios 17 permitindo uma transferência de meio de cultura es- sencialmente livre de células. A segunda zona de cultura 5 está em comunicação de meio com a parte relativamente básica 4a da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 por meio de orifícios 17 na parede inferior 15 permitindo que o meio de cultura atravesse. [00111] A quarta zona 6 é a zona de transferência do meio de cultu- ra, externa à segunda zona de cultura 5, mas interna ao recipiente de cultura 2. A quarta zona 6 está em comunicação de meio com a se- gunda zona de cultura 5. Está também em comunicação de meio com os meios de circulação do meio de cultura, pela via da referida pelo menos uma entrada 11. A comunicação do meio de cultura é alcança- da por meio de um orifício ou um tubo, pelo transbordamento ou por quaisquer outros meios possíveis para alcançar a referida comunica- ção. [00112] A modalidade particular descrita aqui compreende um reci- piente de cultura substancialmente cilíndrico, mas outras modalidades podem também ser previstas, como mencionado previamente, por exemplo, um recipiente substancialmente prismático, preferivelmente regular. Obviamente, o referido também ocorre com os vários meios de cultura e zona de transferências de cultura. Eles podem também ser prismático, preferivelmente regulares, qualquer combinação de forma- tos sendo possível. No referido caso, o termo bucha deve ser previsto como um envelope com uma seção transversal similar para uma seção transversal do prisma previsto. [00113] Quando os meios de circulação do meio de cultura estão em operação, o meio de cultura os deixa através da referida pelo me- nos uma saída 13, quando não há várias delas, através das várias sa- ídas 13, e é desviado pelos meios de guia 14, termina na parte subs- tancialmente básica 3a da primeira zona de transferência de meio de cultura 3. A estrutura da primeira zona de transferência de meio de cul- tura 3 e a saída da bomba requer que o meio de cultura esteja direcio- nado na direção a parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zo- na de transferência de meio de cultura 3. Quando ela alcança o topo da parede da parte substancialmente cilíndrica 3b, ela se descarrega dentro da terceira zona de transferência do meio de cultura 4. [00114] A direção de circulação do meio de cultura M é mostrada pelas setas nas figuras. [00115] É evidente para aqueles versados na técnica, na referida modalidade particular, que a parede da parte substancialmente cilíndri- ca 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 é mais baixa do que a parede da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 por razões de eficiência d de taxa de fluxo, mas será facil- mente entendido que a parede de a parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 pode tam- bém ser mais alta do que a parede da parte substancialmente cilíndri- ca 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura 4. [00116] O meio de cultura está, em consequência, sujeito à taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado de cima para baixo a partir da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 correndo a parte substancialmente cilíndrica 4a e alcança a parte substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura 4. A seguir o fluxo de meio de cultura é dotado de uma dire- ção de subida através do efeito dos recipientes comunicantes pela ta- xa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5. O meio de cultura alcança a segunda zona de cultura 5 a partir da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 pela via dos orifícios para a passagem de meio de cultura substancialmente livre de células 17 na parede inferior 15 da segunda zona de cultura 5. [00117] Como já foi mencionado acima, os orifícios de passagem do meio de cultura 17 são dimensionados de acordo com o tipo de cul- tura. Se a cultura é uma cultura sem veículo, a parede 15 ou 16 com- preendendo os orifícios 17 será uma membrana porosa onde o tama- nho do poro é menor do que o diâmetro das células. Se a cultura está em um microveículo ou em veículos, o tamanho dos orifícios 17 será menor do que o tamanho dos microveículo s ou veículos. [00118] Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede da segunda zona de cultura 5, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6. Naturalmente, se existem orifícios presentes ou se há um tubo, deve ser entendido que, quando o limite de fluxo do meio de cultura alcança o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona 6. [00119] Na modalidade particularmente preferencial da invenção, a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 compreende uma parede inclinada 18 em que o meio de cultura flui quando ele passa da segunda zona 5 para a quarta zona 6. A parede inclinada preferivel- mente compreende uma membrana hidrófila com o objetivo de melho- rar a formação da película na referida parede inclinada 18. A película deve, preferivelmente, ser laminar com o objetivo de prevenir, tanto quanto for possível, a formação de espuma. Com o objetivo de estabi- lizar a película, é possível também adicionar aditivos ao meio de cultu- ra com o objetivo de modificar as propriedades reológicas da água, particularmente do meio de cultura, tais aditivos incluindo o grupo con- sistindo de surfactantes, Pluronic F68, glicerina, cátions quaternários de amônio e qualquer outro aditivo para modificar as propriedades reo- lógicas do meio de cultura. [00120] A membrana hidrófila irá, por exemplo, ser uma membrana consistindo de polioxietileno. [00121] A formação da película na parede inclinada é uma etapa importante uma vez que ela permite a oxigenação em "película fina".

Na verdade, o volume de gás em relação à quantidade de meio de cul- tura na referida quarta zona de transferência do meio de cultura é mai- or e melhora as trocas. Além do mais, a formação da película em uma parede inclinada aumenta a área de superfície de contato entre gás e líquido. [00122] Como pode ser visto na figura 1, o recipiente de cultura pre- ferivelmente compreende um invólucro 19 através do qual passam pe- lo menos um orifício de entrada de gás 20 e pelo menos um orifício de saída de gás 21. O orifício de entrada de gás 20 está preferivelmente situado de modo a se comunicar diretamente com a quarta zona de transferência do meio de cultura 6. Em algumas variações, pode ser preferível que o orifício de entrada de gás 20 esteja presente na pare- de vertical do recipiente de cultura 2 ou na base do recipiente de cultu- ra 2, ou seja, o gás passa pelo meio de um orifício 20 através da pare- de do recipiente de cultura 2 oposta ao revestimento 19, e pelo o refe- rido orifício 20 para proporcionar um tubo com o objetivo de terminar acima do nível de líquido (vide a figura 9). [00123] Na referida modalidade, o revestimento 19 é afixado por meios de fixação 22 para a parede superior 16 da segunda zona de cultura 5. Em algumas variações, o revestimento 19 pode ser feito co- mo parte integral da parede superior 16 da segunda zona de cultura 5, a referida parte se abrindo quando o revestimento 19 do recipiente de cultura 2 é erguido. Da referida forma, é mais fácil retirar uma amostra com ou sem veículos para, por exemplo, avaliar a densidade da célula, a estrutura das células e outras características físicas da célula que refletem a qualidade da cultura. Na verdade, conectando os dois juntos é possível abrir o compartimento da cultura 5 simplesmente levantando o revestimento 19 do recipiente de cultura 2. [00124] No caso de cultura em suspensão, pode ser vantajosa co- néctar uma membrana porosa para a parede superior 16 proporciona- da com orifícios 17 da segunda zona de cultura 5, o referido conjunto pode melhorar a rigidez do conjunto revestimento/membrana para a coleta de amostras. [00125] Afigura 2 ilustra uma variação do dispositivo magnético dos meios de circulação do meio de cultura. Aqui, a barra magnética 7 possui a forma de uma hélice. O projeto do dispositivo magnético 7 com um eixo de rotação substancialmente central 8 irá depender, es- sencialmente, do volume da cultura. Na verdade, para culturas meno- res, a invenção é capaz de fazer uso de uma simples barra tal como uma placa magnética para circular o meio de cultura. Para volumes maiores, a invenção prevê um rotacionador magnético, também guiado por um motor externo, por exemplo, os rotores como esses usados nos aquários que mantém elevada a taxa de circulação média. [00126] Também é possível, de acordo com a presente invenção, ser prevista usando dispositivos de produção de bolhas (não mostra- do), mais conhecidos como "pulverizadores" ou "micropulverizadores" de acordo com o tamanho de bolha produzida. [00127] De forma vantajosa, quando as bolhas serão usadas, a terminação perfurada do dispositivo de produção de bolhas, por exem- plo, do tubo, será imersa no meio de cultura na base da quarta zona de transferência do meio de cultura ou na primeira zona de transferên- cia do meio de cultura. Quando o referido tipo de oxigenação é esco- lhido, é sempre também possível continuar a oxigenação em película fina, a qual torna possível reduzir o fluxo de gás e formar menos bo- lhas e, em consequência, reduzir a formação de espuma. No referido caso, Neste caso, a provisão é feita igualmente para ter duas entradas do gás na tampa do recipiente de cultura ou na parede vertical desse último. Além do mais, é igualmente possível prever que o dispositivo da produção de bolha esteja presente unicamente como um procedi- mento de SOS, e usado unicamente quando necessário. [00128] O dispositivo de cultura também compreende uma série de sensores de parâmetro de cultura 23, por exemplo, para a pressão parcial do oxigênio dissolvido p02, acidez pH, temperatura, opacidade, densidade ótica, glicose, C02, lactato, amônio e quaisquer outros pa- râmetros normalmente usados para monitorar as culturas celulares. Os referidos sensores são preferivelmente sensores óticos que não exi- gem conexões entre o interior do recipiente de cultura e o seu exterior. A posição preferencial dos referidos sensores 23 é uma posição crítica em que é vantajoso estar situada perto da parede do recipiente de cul- tura 2, para que estejam em contato com o meio de cultura M e prefe- rivelmente em posições estratégicas, como na zona através da qual o meio de cultura M passa antes - ou logo após - de passar através das células. [00129] De fato, a invenção contempla particularmente obter biorre- ator descartável para todas as razões de simplicidade e economia mencionadas previamente. Consequentemente, é por isso que as co- nexões entre o interior e o exterior do recipiente de cultura foram redu- zidas. Além disso, o biorreator de acordo com a presente invenção também prevê obter um biorreator particularmente confiável em que os riscos de contaminação são particularmente baixos por ser descartá- vel. [00130] Como pode ser visto na figura 3, o dispositivo de acordo com a presente invenção também prevê um projeto modular que com- preende uma série de módulos para culturas em volumes maiores. Por exemplo, com o referido tipo de projeto modular, volumes de cultura de em torno de 500 mL a 100 litros são, por exemplo, previstos, através do uso de um número muito limitado dos módulos padrão. [00131] De acordo com a presente invenção é previsto proporcionar uma série de módulos que podem ser "deslizados" em torno da primei- ra zona de transferência do meio de cultura 3 para ser colocada em um recipiente de cultura padrão 2 compreendendo meios de circulação de meio de cultura e um invólucro 19. [00132] Em uma variação particularmente flexível, a invenção busca obter um sistema de montagem em que compreenda vários módulos padrão. Os referidos módulos padrão são, por exemplo, um módulo de meio de circulação a ser localizado na base do conjunto, um ou mais módulos de cultura e um módulo de invólucro. De acordo com a pre- sente invenção, apesar de outros meios de fixação, os referidos módu- los podem ser previstos, os módulos serão presos um no outro, por exemplo, por meio de conectores rápidos perfeitamente impermeáveis a líquido e gás. [00133] Consequentemente, de acordo com o tipo de cultura e o volume desejado, o usuário será capaz de retirar de sua pilha um mó- dulo de base compreendendo os meios de circulação do meio de cul- tura, ele também tem que retirar daí o número de módulos de cultura que ele precisa de acordo com o volume necessário de cultura e então retirar um módulo principal correspondente ao revestimento. A seguir, todos os referidos módulos são embalados de modo estéril, ele preci- sará apenas desembalar e unir uns com os outros. A célula pode for- mar o "biorreator descartável" ou pode ser colocada em um recipiente adequado. [00134] Afigura 3 em consequência ilustra uma modalidade do dis- positivo de cultura modular de acordo com a presente invenção. [00135] O dispositivo de cultura 1 compreende um recipiente de cul- tura 2 a qual compreende os meios de circulação de meio de cultura como aqueles explicados em detalhes na figura 1. O módulo de base m0 compreendendo os meios de circulação pode ser fixado para a par- te de baixo do recipiente de cultura 2 ou pode também ser deslocado dentro do recipiente de cultura 2 (a modalidade descrita) com o objeti- vo de ser capaz de descartá-lo e usar um ao outro para a cultura e as- sim prevenir contaminações cruzadas. [00136] O módulo de base m0 compreende os meios de circulação.

Como na figura 1, os referidos meios de circulação compreendem um dispositivo magnético 7, girando em torno de um eixo de rotação cen- tral 8, a primeira terminação é abrigada em meios de encaixe superio- res 9 e a segunda terminação é abrigada em meios encaixe inferiores 10. Os meios de circulação compreendem pelo menos uma entrada de meio de cultura 11. Os meios de circulação do meio de cultura também compreendem pelo menos uma saída de meio de cultura 13. [00137] O módulo de base m0 do recipiente de cultura compreende pelo menos um meio de guia do meio de cultura 14 adjacente à referi- da pelo menos uma saída 13, a qual guia o meio de cultura propelido na direção do topo do recipiente de cultura 2. [00138] O recipiente de cultura 2 compreende uma série de módu- los de cultura (m-ι, m2, ..., mn) que são, na referida modalidade, empi- lhados um sobre o outro. Também pode ser previsto que sejam sim- plesmente adjacentes um ao outro, ou seja, colocados lado a lado. Na modalidade ilustrada na figura 3, os módulos unidos um ao outro por meio de conectores rápidos 24 ou clipes. [00139] Cada módulo de cultura m-ι, m2, ..., mn, compreende a pri- meira 3, a segunda 4, a terceira 5 e a quarta zona 6. As referidas zo- nas 3, 4, 5, 6 possuem as mesmas funções mencionadas na figura 1. [00140] Além do mais, pode ser vantajosa para cada módulo com- preender uma entrada de gás ou de mistura de gases (não ilustrado) em comunicação com a quarta zona 6 de cada módulo de cultura. O recipiente pode também compreender para sua parte uma saída para o excesso de gás ou mistura de gases (não ilustrado). Por exemplo, o orifício de entrada de gás pode estar presente na base do recipiente de cultura 2, ou seja o gás passa por meio de um orifício através da parede do recipiente de cultura 2 oposta ao revestimento 3 e o referido orifício 20 é proporcionado com um tubo de modo a terminar acima do nível de líquido (vide a figura 9) do módulo mn. Consequentemente, a mistura gasosa alcança a quarta zona de transferência do meio de cul- tura 6 do referido módulo. O módulo m2 localizado acima do módulo mn pode também compreender um tubo que permite que a mistura ga- sosa presente na quarta zona 6 do módulo de cultura mn se comuni- que com a quarta zona 6 do módulo m2. O referido tubo, em conse- quência, de forma vantajosa passa através da parede inferior do mó- dulo m2. [00141] Em certas modalidades, para culturas de longa duração, pode ser vantajoso substituir parte do meio de cultura com meios de cultura frescos ou adicionar nutrimentos. Consequentemente, o módu- lo de base m0 pode então compreender uma entrada de nutrimento (não ilustrado). Também de forma vantajosa, o recipiente de cultura pode compreender, nos meios de circulação do meio de cultura, uma saída de meio de cultura (não ilustrado) com o objetivo de prevenir o transbordamento. [00142] De modo similar, o recipiente de cultura 2 compreende um módulo principal compreendendo um invólucro 19, de forma vantajosa conectado a uma parede superior 16 proporcionado com orifícios de passagem de meio de cultura 17 por meio da fixação 22 com o objetivo de simplificar a coleta de amostras no módulo mn, situado acima, co- mo na figura 1. [00143] Além do mais, de forma vantajosa sensores de parâmetro de cultura pode também ser proporcionados em cada módulo de cultu- ra. É possível também proporcionar sensores em apenas um ou diver- sos módulos de cultura em todas as zonas ou no módulo de base. [00144] Na modalidade ilustrada na figura 3, o meio de cultura cir- cula da seguinte maneira. Para simplificar a explicação, vamos usar apenas dois módulos de cultura m-ι, e m2. e um módulo de base m0, mas é certo que o dispositivo de cultura de acordo com a presente in- venção pode compreender um grande número deles. [00145] No módulo de base m0, o meio de cultura é propelido dos meios de circulação do meio de cultura M via a referida pelo menos uma saída 13, quando há várias delas, através das várias saídas 13 e é desviado pelos meios de guia 14. Termina em uma parte substanci- almente básica 3a da primeira zona de transferência de meio de cultu- ra 3. A parte substancialmente básica 3a da referida modalidade é uma a zona comum a todos os módulos de cultura e, na modalidade ilus- trada, está situada no módulo de base. O referido é valido sejam os módulos de cultura empilhados ou justapostos. [00146] A estrutura da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção e a saída da bomba requerem que o meio de cultura esteja direcionado na dire- ção da parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de trans- ferência de meio de cultura 3 do primeiro módulo m-ι, na direção da parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do segundo módulo m2. [00147] Na referida modalidade, é a montagem dos módulos que cria uma grande primeira zona de transferência de meio de cultura 3 compreendendo a parte substancialmente cilíndrica 3b. [00148] Quando o meio de cultura alcança o topo da parede da par- te substancialmente cilíndrica 3b do segundo módulo de cultura m2, ele se descarrega dentro da terceira zona de transferência do meio de cul- tura 4 do segundo módulo de cultura m2. [00149] A direção de circulação do meio de cultura M é mostrada por setas. [00150] O meio de cultura está, em consequência, sujeito à taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado na dire- ção da base da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do segundo módulo de cultura m2, fluido para baixo na parte substancial- mente cilíndrica 4a do segundo módulo de cultura m2, e alcança a par- te substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura do segundo módulo de cultura m2. A seguir, o fluxo de meio de cultura sobe pelo efeito dos recipientes comunicantes e pela taxa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5 do segundo módulo de cultura mn. O meio de cultura al- cança a segunda zona 5 do segundo módulo de cultura m2 da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do segundo módulo de cul- tura m2 via os orifícios para a passagem de meio de cultura substanci- almente livre de células 17 da parede inferior 15 do segundo módulo de cultura m2. [00151] Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede externa da segunda zona de cultura 5 do segundo módulo de cultura m2, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferên- cia do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2. Natural- mente, se orifícios ou tubos estiverem presentes na referida parede da zona de cultura 5, torna-se necessário entender que, quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona 6 do segundo módulo de cultura m2. [00152] Na modalidade particularmente preferencial da invenção, a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2 compreende uma parede inclinada 18 em que o meio de cultura flui quando passa da segunda zona 5 do segundo módulo de cultura m2 para a quarta zona 6 do segundo módulo de cultura m2. A parede inclinada preferivelmente compreende uma membrana hidrófila com o objetivo de melhorar a formação de uma película na referida parede inclinada 18. A película deve preferivelmente ser laminar com o objetivo de prevenir tanto quanto for possível a formação de espuma.

Com o objetivo de estabilizar a película, é possível também adicionar aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modificar as proprieda- des reológicas da água, como mencionado antes. [00153] A seguir, o meio de cultura presente na quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2 se descarrega através a tubo ou sobre o topo (D) da parede da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cul- tura m2 dentro da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do primeiro módulo de cultura m-|. [00154] O meio de cultura está, em consequência, sujeito a uma taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado de cima para baixo a partir da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do primeiro módulo de cultura m-ι, descendo a parte subs- tancialmente cilíndrica 4a do primeiro módulo de cultura m-ι, e alcança a parte substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura do primeiro módulo de cultura m-ι. A seguir, o fluxo de meio de cultura sobe pelo efeito dos recipientes comunicantes e pela taxa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura m-ι. O meio de cultura alcança a segunda zona 5 do primeiro módulo de cultura m1 da tercei- ra zona de transferência do meio de cultura 4 do primeiro módulo de cultura m-ι via os orifícios para a passagem de meio de cultura subs- tancialmente livre de células 17 na parede inferior 15 do primeiro mó- dulo de cultura m-|. [00155] Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura m-ι, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-ι. Obviamente, se existem orifícios ou um tubo presente na referida parede, deve ser entendido que, quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-|. [00156] A quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do pri- meiro módulo de cultura m-ι pode também compreender uma parede inclinada 18 em que o meio de cultura flui quando passa da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura m-ι para a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-ι. A parede inclinada é possivelmente proporcionada com uma mem- brana hidrófila como acima. [00157] A seguir, o meio de cultura retorna para um módulo de base m0 e para os meios de circulação do meio de cultura através da entra- da (tubulação) 11, ou seja, o meio de cultura presente na quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-i se descarrega via um tubo ou sobre o topo da parede da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-i em uma tubulação 11 que termina em uma zona substancialmente central de um sifão criado pela referida bomba de centrifugação que constitui os meios de circulação do meio de cultura de acordo com a presente invenção do módulo de base m0. [00158] Em uma variação da referida modalidade, ilustrada de mo- do altamente esquemático na figura 4 e em detalhes na figura 9, o em- pilhamento de módulos m constitui o recipiente de cultura. Na referida variação da figura 4, pode existir, por exemplo, três tipos de módulo, módulo de bases m0, módulos m-ι, m2, ..., n compreendendo as quatro zonas e um módulo principal mx, (não mostrado). O módulo de base m0 ou basal m0 compreende os meios de circulação de meio de cultura e o conjunto de meios, é projetado para encaixar o primeiro conjunto de meios 24a de um módulo de quatro zonas m-ι, 2, ■ ■·, n como expli- cado acima, e para constituir a base do recipiente. O módulo principal mx é projetado para encaixar o segundo conjunto de meios 24b de módulo de quatro zonas m-ι, 2, ■ ■·, η· O módulo de quatro zonas m-ι, 2, ...,n encaixado pelo módulo de base mO pode ser o mesmo que aquele encaixado pelo módulo principal mx, ou pelo módulo de quatro zonas m-i, 2, ■■■, n encaixado pelo módulo de base m0 pode ser o primeiro em uma série de módulos de quatro zonas m-ι, 2, neo módulo encaixa- do pelo módulo principal mt é consequentemente, o segundo módulo de quatro zonas na referida série de módulos de quatro zonas m-ι, 2, n. [00159] A referida variante funciona da mesma forma que aquela explicada acima em detalhes para a figura 3. [00160] As figuras 5 e 6 ilustram a metade da parte básica do mó- dulo de base m0. A figura 5 é uma seção transversal e a figura 6 é uma vista superior. Como pode ser visto, o meio de cultura é projetado para entrar no módulo de base através da pelo menos uma entrada em uma área substancialmente central representada pela letra x nas figuras. O eixo de rotação do dispositivo magnético 7 passa através do referido centro x, seja ele real ou virtual. Quando os meios de circulação estão em operação, o dispositivo magnético 7 está em rotação em torno de seu eixo de rotação, a rotação cria um sifão que suga o meio de cultu- ra dentro dos meios de circulação do meio de cultura. A zona em que o dispositivo magnético está em rotação é confinada pelos defletores ou paredes 25. Na referida modalidade, dois defletores foram mostrados, mas seu número pode ser muito maior, por exemplo 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Os defletores serão preferivelmente dispostos simetricamente na circunferência definida por sua totalidade. [00161] Os espaços 13 entre os defletores 25 são saídas de meio de cultura. Na verdade, o meio de cultura é sugado pelo sifão criado pela rotação do dispositivo magnético e o meio de cultura é expelido na direção do exterior da zona delimitada pelos defletores 25, através dos orifícios 13 entre os defletores. Uma vez que dois defletores 25 foram mostrados, há duas saídas de meio de cultura na referida moda- lidade mas seu número pode ser muito maior, por exemplo 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Como os defletores estão preferivelmente dispostos simetri- camente, as localizações do meio de cultura saídas 13 são também de forma vantajosa dispostas simetricamente. Quando o meio de cultura é expelido pelas saídas 13, ele termina na zona essencialmente circular 27. [00162] Na referida modalidade, a parte básica do módulo de base mO é dotada de orifícios 20, substancialmente tubulares em formato, que são orifícios permitindo, por exemplo, a introdução de gás ou de mistura de gases, meios de cultura frescos, descarga de gás ou mistu- ra de gás, retirados do meio de cultura, etc. [00163] Além do mais, um recesso 31 é proporcionado para aces- sar os referidos orifícios 20 do exterior, o que torna possível conectar os referidos orifícios a suprimentos de gás ou de mistura de gases, meios de cultura frescos, etc. [00164] A figura 7 é uma vista em seção da porção superior do mó- dulo de base m0 de acordo com a presente invenção e a figura 8 é uma vista superior da mesma parte. A porção superior compreende substancialmente orifício de entrada em formato tubular de meio de cultura 11. Os orifícios 11 guiam o meio de cultura vindo da quarta zo- na de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo de acordo com a presente invenção 1 no sifão criado pela rotação do dispositivo mag- nético. Quando o dispositivo magnético está em rotação, o meio de cultura situado na zona essencialmente circunferencial 27 descrita nas figuras 5 e 6 entra na perfuração 26, a referida perfuração 26 estando em comunicação com os dutos 28 permitindo que o meio de cultura expelido alcance a zona 30 em comunicação de meio com a primeira zona de transferência do meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção, em particular com a parte essencialmente tubular da primeira zona de transferência de meio de cultura. [00165] A porção superior descrita na figura 7 é um elemento proje- tado para ser disposto na porção da base descrita na figura 5. Natu- ralmente, o referido módulo de base m0 pode também ser obtido de outro modo, mas para simplificar a produção ele foi produzido para a referida modalidade em duas partes que podem ser conectadas. Como pode ser visto mais adiante, a porção superior e a porção da base es- tão conectado de modo preferencialmente selado nos recessos 29 ilus- trados nas figuras 5 e 7. [00166] Todas as ilustrações de meios de circulação de meio de cul- tura da presente aplicação podem também ser produzidos de várias formas. Não é preciso dizer que todas as formas para a produção das várias modalidades dos meios de circulação do meio de cultura, confi- nados ou não no módulo de base, estão incluídas no âmbito de prote- ção reivindicado. [00167] Afigura 9 é uma seção transversal de uma modalidade par- ticularmente vantajosa do dispositivo de acordo com a presente inven- ção, enquanto a figura 10 é uma vista de seção explodida da mesma modalidade. A vista explodida proporciona um claro entendimento dos aspectos práticos e inventivos da presente invenção. [00168] Consequentemente, as dois figuras serão comentadas ao mesmo tempo. Como pode ser visto, o dispositivo de acordo com a presente invenção consiste, de baixo para cima, de uma pilha compac- tada de [00169] a porção da base do módulo de base m0 (m0a) compreen- dendo a zona em que o dispositivo magnético está rotação, o qual está confinado pelos defletores 25. O espaço 13 entre os defletores 25 visí- veis na figura é um orifício de saída de meio de cultura. Isso se dá porque o meio de cultura é sugado pelo sifão criado pela rotação do dispositivo magnético e o meio de cultura é expelido na direção do ex- terior 27 (zona essencialmente circular) da zona delimitada pelos defle- tores 25 através dos orifícios 13 entre os defletores 25, [00170] a porção superior do módulo de base m0(m0b) compreen- dendo uma entrada substancialmente tubular de meio de cultura 11. As entradas 11 guiam o meio de cultura vindo da quarta zona de transfe- rência do meio de cultura 6 do dispositivo de acordo com a presente invenção 1 no sifão criado pela rotação do dispositivo magnético 7.

Quando o dispositivo magnético está em rotação, o meio de cultura situado na zona essencialmente circular 27 entra na perfuração 26, a referida perfuração 26 estando em comunicação com os dutos 28 permitindo que o meio de cultura expelido alcance a zona 30 em co- municação de meio com a primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção, em parti- cular com a parte essencialmente tubular da primeira zona de transfe- rência de meio de cultura, [00171] um primeiro módulo de cultura m-ι como explicado em deta- lhes na explanação da figura 3, [00172] um segundo módulo de cultura m2 (vide a figura 3), [00173] um módulo principal compreendendo um recesso 33 pro- porcionado com um sensor ótico 23 imerso no meio de cultura, um in- vólucro 19 compreendendo um meio de fixação 22 conectado a uma parte 16a da parede superior 16 da segunda zona de cultura 5 do se- gundo módulo de cultura m2. [00174] Todos os módulos compreendem um meio de fixação 24a e 24b como ilustrado esquematicamente nas figuras 4, 9 e 10. Cada módulo compreende vários desses, que, de acordo com conjunto exi- gido, serão usados ou não, mas o referido torna possível obter um módulo de cultura único que pode ser montado tanto com outro módu- lo de cultura e quanto com o módulo de base ou o módulo principal. Os referidos meios de fixação são, por exemplo, dois círculos concêntri- cos proporcionados com um selo circular, conectores rápidos bem co- nhecidos no método de cultura de células, um parafuso e uma serra- ção ou quaisquer outros dispositivo para a montagem dos referidos módulos de acordo com a presente invenção. [00175] Na referida modalidade, a parte básica do módulo de base m0 é ligada com orifícios 20 substancialmente tubulares que são orifí- cios permitindo no referido caso a introdução de gás ou mistura de ga- ses. O orifício de entrada de gás 20 está conectado a um tubo 32 que termina acima do nível do meio de cultura, permitindo que o gás ou a mistura de gases alcance pelo menos a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo de cultura 1 de acordo com a pre- sente invenção. Todas as atmosferas ambientes da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo 1 de acordo com a presente invenção são conectadas por tubos similares 32 de modo que a mistura de gases pode alcançar o topo. É particularmente vantajoso em um dispositivo com módulos empilháveis que a altura que pode ser alcançada seja bem alta para proporciona o suprimento de gás através da base do reator. [00176] Em uma variação, a parte básica compreende um tubo de alimentação de gás ou mistura de gases para trazer a substancia ga- sosa para dentro da zona em que o dispositivo magnético está situado.

Da referida forma, o gás que entra é agitado pela rotação do dispositi- vo magnético e a dissolução de oxigênio é melhorada pelo movimento do meio de cultura. O excesso de gás é também agitado se move de baixo para cima novamente na forma de pequenas bolhas. A referida variante é também aplicável para a modalidade ilustrada na figura 1. [00177] Além do mais, um recesso 31 é proporcionado para aces- sar os referidos orifícios 20 a partir do exterior, o que torna possível conectar os referidos orifícios ao suprimento de gás, mistura de gases, meios de cultura frescos, etc. [00178] A porção superior m0b do módulo m0 e um elemento proje- tado para ser agarrado pelo meio de fixação 28 e selado por um selo circular 34 na porção da base mOa do módulo de base mo. [00179] Naturalmente, a presente invenção não está de nenhum modo limitada às modalidades descritas acima e muitas modificações podem ser feitas sem prejuízo do âmbito das reivindicações dependen- tes. [00180] Por exemplo, o dispositivo de acordo com a presente in- venção descrito na figura 1 pode também compreender um alimenta- dor de nutrimento, tanto em um tubo através do revestimento, ou um tubo através das paredes do dispositivo de acordo com a presente in- venção. Da mesma forma, o meio de aquecimento pode também estar presente na primeira ou na quarta zona do dispositivo, de acordo com a presente invenção, ou de um módulo ou cada em módulo de quatro zonas. Possivelmente, o dispositivo de acordo com a presente inven- ção pode também compreender vários meios de circulação de meio de cultura, por exemplo, várias bombas de centrifugação.

Claims

1. Dispositivo de cultura de células (1) caracterizado por compreender: um recipiente de cultura (2) fornecido com uma cobertura (19), no qual se encontra situado pelo menos uma primeira zona (3) e, pelo menos, uma segunda zona (5), onde a referida primeira zona (3) é uma zona para transferir o meio de cultura essencialmente livre de células e a referida segunda zona (5) é uma zona para a cultura de células, meios de circulação do meio de cultura permitindo a circu- lação do referido meio de cultura através da referida segunda zona (5), a referida segunda zona (5) sendo compreendida de uma parede de fundo (15) e uma parede de topo (16), sendo que cada parede (15, 16) é proporcionada com orifícios (17) permitindo a transferência do meio de cultura essencialmente livre de células; o referido dispositivo compreende ainda pelo menos uma terceira (4) e pelo menos uma quarta zona (6), em que onde ambas as zonas (4, 6) são essencialmente livre de células e onde a referida ter- ceira zona (4) está em comunicação com o meio da referida primeira zona (3) e referida segunda zona (5) e onde a referida quarta zona (6) está em comunicação com o meio da referida segunda zona (5) e da referida primeira zona (3) via meios de circulação de meio de cultura, e em que, a terceira zona (4) é uma zona interna à referida segunda zona (5) e externa à referida primeira zona (3) e a referida quarta zona (6) é uma zona externa à referida segunda zona (5), e em que, os referidos meios de circulação de meio de cultura permi- tem a circulação do meio de cultura a partir do fundo para o topo na referida segunda zona (5), e em que, o recipiente de cultura é arranjado de tal forma que o meio de cultura transborda da referida primeira zona (3) para a referida ter- ceira zona (4), e transborda da referida segunda zona (5) para a refe- rida quarta zona (6).

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma série de módulos de cultura (m-i, mn), cada módulo compreendendo a referida primeira zona (3), a referida segunda zona (5), a referida terceira zona (4) e a referi- da quarta zona (6), e em que os módulos adjacentes na referida série de módulos de cultura estão em um meio de comunicação, e a referida primeira zona (3) e a referida quarta zona (6) de cada módulo estando em comunicação com os referidos meios de circulação.

3. Dispositivo (1), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os meios de circulação são confinado em um módulo base (m0), e onde o referido módulo base (m0) estando em um meio de comunicação com pelo menos uma primeira zona de transferência de meio (3) e pelo menos uma quarta zona de transfe- rência de meio (6).

4. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um módulo dianteiro (mt), o referido módulo dianteiro (mt) compreendendo pelo menos uma cobertura (19).

5. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma quarta zona (6) compreende pelo menos uma parede essencial- mente vertical ou de fluxo inclinado (18).

6. Dispositivo (1), de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizado pelo fato de que a referida parede de fluxo essencialmente ver- tical ou inclinada (18) compreende uma membrana hidrófila.

7. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um orifício de entrada de gás (20) e um orifício de saída de gás (21).

8. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cobertura (19) do re- cipiente de cultura (2) é conectada a pelo menos parte da referida pa- rede de topo (16) de pelo menos uma segunda zona de cultura (5).

9. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 2 a 8, caracterizado pelo fato de que cada módulo de cultura (m0, mn), compreende em sua parte de topo um primeiro meio de fixação (24a) e em sua parte de fundo um segundo meio de fixação (24b), em que o referido módulo de base (m0) ainda compreende em uma parte de topo (mob) um primeiro meio de fixação (24a) e o referi- do módulo dianteiro (mt) compreende ainda em sua parte de fundo um segundo meio de fixação (24b), onde o referido primeiro meio de fixa- ção (24a) e o referido segundo meio de fixação (24b) são meios de fixação complementares para produzir uma sequência de empilhamen- to a partir do fundo para o topo de um módulo de base (m0), pelo me- nos um módulo de cultura (m0, mn) e um módulo dianteiro (mt).

10. Método de cultura de células em um recipiente de cultu- ra (2) com circulação de meio de cultura, caracterizado por compreen- der as seguintes etapas: introduzir o meio de cultura (M) nos meios de circulação de meio de cultura, descarregar o meio de cultura (M) a partir dos referidos meios de circulação de meio de cultura, pelo menos uma primeira transferência de meio de cultura (M) para dentro do primeiro meio de cultura acima de uma primeira zona (3), pelo menos uma segunda transferência de meio de cultura (M) para dentro de uma segunda zona (5) para a cultura de células, pelo menos uma terceira transferência de meio de cultura subsequente à referida primeira transferência de meio de cultura em uma terceira zona (4) para a cultura de células ao sobrefluir a partir da primeira zona (3) para a terceira zona (4), pelo menos uma quarta transferência de meio de cultura subsequente à referida segunda transferência de meio de cultura em uma quarta zona (6), ao sobrefluir a partir da segunda zona (5) para dentro da quarta zona (6), e em que a referida segunda transferência de meio de cultura é uma transferência de meio de cultura descenden- te.

11. Método de cultura de células, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a oxige- nação do meio de cultura durante uma ou mais das referidas transfe- rências.

12. Método de cultura, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a oxigenação é realizada durante a quarta transferência de meio de cultura, e onde a referida quarta trans- ferência de meio de cultura sendo um fluxo do referido meio de cultura (M) ao longo da parede de fluxo (18).