DE2940446C2 - Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen - Google Patents

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Die Vermehrung bestimmter tierischer Zellen in Gefäßen mit einem größerem Volumen als 3 Liter wurde bisher durch das Problem der Sauerstoffversorgung behindert. Ganz gleich, ob diese Zellen in der Kulturlösung des Fermentors schweben oder ob sie an den Oberflächen des Fermentorgefäßes anwachsen, von einem gewissen Verhältnis A/V an stagniert das Wachstum (wobei A = Fläche für die Sauerstoffdiffusion aus der Gasphase ii, die ^^e'öste Phase und V = Fermentationsvolumen bedeuten).

Die Vermehrung von beispielsweise insektenzellen in größerer Menge ist eine der Voraussetzungen für eine Massenproduktion von Insektenviren, die in neuerer Zeit zunehmend genauer untersucht werden. Gerade über die Gruppe der zu den Insektenviren gehörenden Baculoviren sind in verschiedenen Arbeitsgruppen seit einigen Jahren Forschungsprojekte in Angriff genommen worden, weil diese Viren evtl. als biologische Insektizide mit Spezies-spezifischer Wirkung eingesetzt werden können. Die Produktion der Baculoviren in Zellkulturen würde die Möglichkeit eröffnen, jederzeit unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen standardisierte Viruspräparate für den Einsatz in der Schädlingsbekämpfung herstellen zu können. Die Vermehrung von Insektenzellen in Suspensionskulturen als Substrat für die Virusvermehrung in größerem Umfang ist also hierfür eine wichtige Voraussetzung.

Die Vermehrung von Insektenzellen in Suspensionskulturen kann — wie bei Vertebratenzellen — in geschüttelten Gefäßen, in sog. »Roller«-Flaschen, in »Spinner«-Flaschen oder in ähnlichen Gefäßen erfolgen. Meistens ist die »Massenproduktion« aber

1. begrenzt durch die Größe der Gefäße, die handlich und manipulierbar bleiben müssen, und

2. durch den mit zunehmendem Nährmedium-Volumen relativ schlechter werdenden OrPartialdruck im Nährmedium.

In der Regel reicht die in einem geschlossenen Gefäß über dem Nährmedium befindliche Luft nur für eine gegrenzte Zeit aus, um im Nährmedium den Sauerstoff zu ersetzen, der durch die sieh vermehrenden Zellen verbraucht wird. Es kommt dann zur Sauerstoffverarmung im Nährmedium und als Konsequenz davon zur

Verminderung der Zellvermehrung und zum vermehrten Absterben von Zellen. Aus diesem Grunde ist für größere Nährmediumvolumina neben mechanischer Umwälzung des Nährmediums auch das Einblasen von steril gefilterter Luft in Form von fein verteilten Luftblasen eine notwendige und gängige Methode geworden. Damit wird der Sauerstoffgehalt des Nährmediums angereichert.

Dieses in der Fermentationstechnik gängige Verfahren, die Sauerstoffdiffusionsrate durch Einblasen von entkeimter Luft in die Kulturlösung zu steigern, versagt hier aus mehreren Gründen.

Bei diesem Verfahren wird durch eine oder mehrere Öffnungen im Luftzuführungsrohr unterhalb des Flüssigkeitsspiegels erreicht, daß die Luft in Form von B'asen zur Oberfläche hin aufperlt. Je mehr Blasen dabei aus einem Liter Luft entstehen, dest größer ist die Phasengrenzfläche Luft/Flüssigkeit Die Blasengröße und Blasenzahl läßt sich nur in Grenzen variieren.

Sind die Öffnungen und damit die Blasen zu groß, vereinigen diese sich möglicherweise noch vor Erreichen des Flüssigkeitsspiegels. Sind die Öffnungen sehr klein, um viele kleine Blasen zu erzeugen, so besteht die Gefahr des Zuwachsen der Öffnungen. Außerdem ist die Herstellung sehr vieler und sehr kleiner Öffnungen ein technisches Problem.

Daher muß man von einer mittleren Blasenzahl und Blasengröße und dawit von einer unbefriedigenden Phasengrenzfläche ausgehen.

Die Phasengrenzfläche wird nachträglich dadurch auf das geforderte Maß gebracht, daß die Blasen mittels eines Rührwerks zerteilt und über das Volumen der Kulturlösung im Fermentor verteilt werden. Die damit verbundenen Druck- und Zugkräfte (Schubspannungen und Scherkräfte) schädigen tierische Zellen vielfach so stark, daß sie absterben können.

Außerdem enthalten die Kulturflüssigkeiten Mindestmengen von Kälberserum oder anderen eiweißhaltigen Nährmedien, so daß das Lufteinblasen zu einer unerträglichen Schaumbildung führt, .''ie den Versuchsablauf außerordentlich stark stören und behindern kann.

Weiter treten zusätzliche Scherk^räfte auf, wenn die Gasblasen an der Grenzfläche (Kulturflüssigkeit/Gasraum) zerplatzen. Auch diese Kräfte schädigen die Zellen, so daß das Verhältnis von intakten zu geschädigten und abgestorbenen Zellen immer ungünstiger wird, obwohl die Gesamtzahl noch zunehmen kann.

Im Falle einer notwendigen stärkeren Luft-(Sauerstoff-)Zufuhr, d. h. bei zunehmender Menge an Luftblasen, steigt somit die Anzahl an geschädigten und absterbenden Zellen, was nicht nur der erstrebten Zellvermehrung entgegenläuft, sondern auch zunehmend zur Anreicherung von toxischen Zcll-Zerfallprodukten führt. Diese können die Zellvermchrung zusätzlich beeinträchtigen. Außerdem haben Messungen in Spinner-Gefäßen von mehreren Litern ergeben, daß ab einer Nährmediummenge von etwa 3 Litern der O₂-Gehalt im Nährmedium auch durch stärkeres Einblasen von Luft nicht mehr auf einem Niveau gehalten werden kann, das für normal proliferierende Zellen erforderlich wäre.

Wird die Oberfläche, an denen animale Zellen bestimmter Zellstämme bevorzugt wachsen, künstlich vergrößert, indem man z. B. den Fermenterinhalt mit Kunststoffkügelchen füllt, die dann in der Kulturlösung schweben oder sedimentieren, treten beim Lufteinblasen und Rühren noch größere Probleme auf, da die

Kugeln gegen die Rührblätter und/oder gegeneinander stoßen, so daß die schädigenden Scherkräfte und Schaumbildung vorhanden sind.

Die Konstanthaltung des pH-Wertes, der Kultivierungstemperatur und der Nährmediumqualität (durch Zugabe frischen Nährmediums) ist zwar wichtig, doch ist der begrenzende Faktor für die Volumina der Fermentationsgefäße der im Nährmedium gelöste Sauerstoff.

Zu betonen sei noch, daß zwar auch die mechanische Umwälzung durch ein Rührwerk standardisiert vorgenommen werden muß (ca. 70 Umdrehungen/Minute), daß aber die Verarmung an O2 von Nährmediumkompartimenten durch die mechanische Umwälzung nicht beseitigt wird.

Die DE-OS 24 31 450 betrifft ein Verfahren zur in-vitro-Fortpflanzung oder in vitro-Erhaltung von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) eine Suspension von Zellen in einem Zellenkulturmedium mit einer Wand einer nicht-toxischen sauerstoffdurchlässigen Hohlfasermembrane in Be rührung gebracht wird, wobei die Zellen an diese Wand der Hohlfasermembrane gebunden werden.

b) die gegenüberliegende Wand der Membrane mit intermittierenden Stoßen eines gasförmigen Sauerstoffträgers in Berührung gebracht wird, wobei der Durchgang des Sauerstoffes durch die Membrane bewirkt und der Sauerstoff mit den an der anderen Seite der Membrane gebundenen Zellen in Berührung gebracht wird und gleichzeitig die Zellen in einem Zellenkulturmedium unter Zellenwachstums- oder Zellenerhaltungs-Bedingungen von pH und Temperatur inkubiert werden und der Sauerstoff in einer solchen Konzentration zugeführt wird, die ausreicht, um den maximalen Sauerstoffbedarf zu überschreiten und um aerobe Bedingungen zu schaffen.

Bei diesem Verfahren werden die Zellen an die Wand einer Hohlfas rmembran gebunden und der Sauerstoff kommt durch die Hohlfasermembran mit den daran gebundenen Zellen in Berührung. Als Materialien für die Hohlfasermembranen, an die die Zellen gebunden werden, werden auf S. 13/14 der DE-OS 24 31450 Polyolefine wie Polyacrylnitril und Polystyrol, polyionische Polymerisate, Polykohlenhydraie wie Cellulose und Cellulosederivate, beispielsweise Celluloseester. Polypeptide wie Collagen, S'likonkautschukpoiymerisate, Fluorkohlenwasserstoffpolymerisate usw. genannt. Hier wird dem Fachmann die Lehre gegeben, daß die genannten Materialien dazu geeignet sind, daß Zellen auf ihnen gebunden werden können, um sie dem Verfahreii der DEOS 24 31 450 zugänglich zu machen.

Ganz im Gegenteil dazu hat die vorliegende Erfindung das Ziel, ein Anwachsen oder Anbinden der Zellen an Membranen zu verhindern. Nur wenn auf permeablen Membranen aus gasdurchlässigem synthetischem Material fast kein Zellwachstum stattfindet, läßt sich eine ausreichende Sauerstoffzuführung gewährleisten. Durch die Offenbarung der DE-OS 24 31 450 wird der Durchschnittsfachmann gerade davon abgehalten, die dort befindlichen Materialien zu verwenden, da dort das Anwachsen oder Binden der Zellen auf der Membran gerade gewünscht wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, die Sauerstoffversorgung eier Zellen sicherzustellen, ohne die oben aufgezählten gravierenden Nachteile des Lufteinblasens in Kauf r ehmen zu müssen.

Bei der Lösung der Aufgabe der Erfindung muß außerdem sichergestellt werden, daß die erforderliche Mikro- und Makrodurchmischung des Fermentorinhalts (Kulturflüssigkeit) erhalten bleibt. Das heißt, es muß gewährleistet bleiben, daß pro Volumen vom Liter- bis zum μ-Litermaßstab immer gleich viel Zellen, Nährmedium und Sauerstoff vorhanden sind. Unter Mikrodurchmischung wird die Durchmischung in Zellumgebung von 1 — 10 Zelldurchmessern und unter Makrodurchmischung die Durchmischung des ganzen Gefäßes verstanden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es möglich ist, den für die Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen zum Stoffwechsel erforderlichen Sauerstoff allein über permeable Membranen zuzuführen, ohne das Einperlen von Luftblasen oder sonstige Sauerstoffzufuhr nach den bekannten Verfahren zu benötigen. Beim Verfahren .<jemäß der Erfindung werden nicht nur die Scherkräfte vermieden, die beim Fiblasen von Luft entstehen, sondern es findet auch keif ic Pcfrfiurfibiiduiig statt und Probleme der Dimensionierung der Öffnungen für die Luftblasen lallen fort.

Darüber hinaus ist ein ganz wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung darin zu sehen, daß es mit dem Verfahren gemäß der Erfindung erstmals möglich ist, Züchtungen von tierischen Zellen und insbesondere von Insektenzellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen durchzuführen, deren Volumen die bisher üblichen Volumina in Flaschen oder sonstigen Gefäßen bei weitem überschreiten. So ist es z.B. möglich, in Suspensionskulturvolumina von 10 Litern und mehr zu arbeiten, wobei sich die Zellen optimal vermehren. Auch Volumina von 15, 20 oder mehr Litern sind ohne weiteres mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung realisierbar, was bisher nicht möglich war. Selbst Volumina von 50 und sogar 100 Litern sind nicht ausgeschlossen.

Der Sauerstoff diffundiert durch die aus Kunststoff bestehenden permeablen Membranen, wnbei es wesentlich it. daß die Zellen nicht auf dem Kunststoff wachsen, weil sonst die Sauerstoffzufuhr verringert und schließlich unterbrochen würde. Daher ist er. wesentlich, daß das zu verwendende Material einerseits gasdurchlässig, d. h. sauerstoffdurchlässig und andererseits so beschaffen ist, daß auf ihm kein Zellwachstum oder Anwachsen von Zellen stattfindet. Zumindest sollte sichergestellt werden, daß das Zellwachstum auf dem Material, aus dem die permeablen Membranen bestehen, nur so wenig erfolgt, daß die nötige Sauerstoffversorgung des Systems nicht gestört wird.

Geeignete Kunststoffe für die permeablen Membranen si'.J z. B. die Silikonkunststoffe oder Silikon-beschichtete Kunststoffe. Als Kunststoffe kommen außerdem andere verfügbare Kunststoffe infrape, wobei jedoch darauf zu achten ist, daß tierische Zellen nicht auf den sauerstoffpcrmeablen Kunststoffen anhaften und auf ihnen wachsen können. Silikonfolie und .Silikonschläuche huDen eine Oberfläche, auf der sich Zellen nicht oder nur sehr schwer festsetzen können, Daher ist Silikonkunststoff ein bevorzugtes MiMe. ial.

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß das Material und die geometrische Ausbildung der Kunststoffmembranen sowie ihre konstruktive Einfügung in die Fermentationsgetäße den üblichen biotechnologischen Forderungen angepaßt sein müssen.

Als Sauerstoffauelle kommt iiblicherwrisr Luft

infrage. Eis kann jedoch auch ein Luft/Sauerstoff-Gemisch verwendet werden. Auch ist es möglich, ein Sauerstoff/Stiekstoff-Gemisch zu verwenden.

Die Verwendung von ausschließlich pcrmeablen Membranen zur Zuführung des Sauerstoffs in die Kulturbrühe hat den weiteren Vorteil, daß eine Filterwirkung durch die Membran eintritt, wodurch ciie in der Luft enthaltenen Keime zurückgehalten werden.

Es versteht sich von selbst, daß bei der Durchführung des Fermentationsverfahrens gemäß der F.rfindung die gesamte Apparatur und die verwendeten Ktilturflüssigkcitcn steril gemacht sind

Die l-'orm der pcrmeablen Membran kann beliebig sein, muß jedoch so gewählt werden, dall eine ausreichende Sauerstoffdiffiision /ur Versorgung des /elKmffw echsels möglich ist und die Anordnung die /eihermchrung nicht ston. AK geeignet haben sich als permeable Membranen /. H solche aus Silikongummi erwiesen, /um Beispiel kann man einen Silikongumm¹-Schiaucii um einen T-agcr. der sich im i ermeniationsge fait befindet, wickeln. Als Träger bieten sich normalerweise z. I) Wärmeaustauscher an.

Die r.rfindung wird nachstehend anhand der AbbilduiiL'en und der Aiisfüiirungsbeispiele weiter erläutert.

A hb. I zeigt ein I ermentationsgefäH fur die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung bei der /iichinng von Insekten/eilen in Suspensionskulturen.

Λ b b 2 zeigt ein Fermentationsgefäß zur Anwendung des Verfahrens gemäß der Frfindung zur Züchtung von Wirbekierzellen in Suspensions- sowie Monola\erkulturen.

In Abb. I ist das Fermentationsgefäß ein Glasrohrabschnitt (I) aus Borsilikatglas. de' durch einen Boden (7) und einen Deckel (2) aus Edelstahl abgeschlossen wird. -\m Deckel (2) ist cn Wärmetauscher (3) angebracht, der hier als mäanderförmiges Stahlrohr ausgebildet ist. Auf dieses Stahlrohr ist ein Schlauch (4) .!us Silikongummi so gewickelt, daß die Windungen HK ht ganz aneinander anliegen. Mit den Oliven (5) wird lic Druckluft durch den Silikonschlauch geleitet. Mit ι den Oliven (6) wird dem Wärmetauscherrohr das Temperiermedium zugeführt. Der Boden (7) des Fer-nenlation.sgefäßes ist ebenso wie der Deckel über einen Dichtung (8) mit dem Glasrohrabschnitt verbunden. Der Motor (9) treibt über eine Welle (10) den : Propeller (II) an. Der Propeller (II) rotiert mit ca. 60 UpM ind gewährleistet durch seine konstruktive Ausbildung und seine geringe Umdrehungszahl die u'i-onende Makrodurchmischung des Fermentorinhaltes (12). Die Mikrodurchmischung entsteht durch ■ Turbulenzen an dem spiraiig aufgewickelten Kunststoff schlauch. Der in Jie Flüssigkeit diffundierte Sauerstoff wird mittels dieser Mikrodurchmischung vorverteil! und mit der Propellerströmung über das gesamte Gefäß verteilt. Die durch den gewickelten Schlauch erzeugten Turbulenzen in der Gesamtströmung und durch die G-csarntsirömung selbst wird außerdem gewährleisten. da3 die Nährstoffe und Zellen sich gleichmäßig über das Fermentations volumen verteilen.

in A b b. 2 i-t das Fermentationsgefäß ein Glasrohr- abschnitt M) au¹, Borsilikatglas. der durch einen Boden (7) und einen Deckel (2) aus Edelstahl abgeschlossen wird. Am Deckel (2) ist ein Wärmetauscher (3) angebracht, der hier als Doppelzylinder aus zwei konzentrischen, oben und unten miteinander durch je e'ren Kreisring verbundenen Doppelrohrhohlkörper ausgebildet ist. Auf die Außenfläche dieses Stahlrohres ;s! ein Sch auch (4) aus Silikongummi so gewickelt, daß die Windungen nicht ganz aneinander anliegen. Mit den Oliven (5) wird die Druckluft durch den Silikonschlauch geleitet. Mit den Oliven (6) wird dem Wärmetauscherrohr das Temperiermedium zugeführt. Der Boden (7) des Fermentationsgefäßes ist ebenso wie der Deckel über einen Dichtring (8) mit dem Glasrohrabschnitt verbunden. Der Motor (9) treibt über eine Welle (10) den Propeller (11) an. Der Propeller (11) muß durch adäquate Umdrehungszahl (50—200 UpM) die schonen-

■ de Makrodurchmischung des Fermentorinhaltes (12) gewährleisten — hier in der Hauptsache die Kulturflüs-MgV.eit mit dem Niihrmediiim. die im Ringspalt (13) abwart«, strömt und sich mit Sauerstoff anreichern konnte. Die Kulturflüssigkeit (12) durchströmt das Sieb (14) und umspült die Kügelchen (15), auf denen die /eilen wachsen. Durch eine entsprechende Ausbildung des Siebes, durch die Wahl der Kugelgröße (Strömungswiderstand der Kugelpackung), durch das spezifische (iewii In der Kugeln und durch die Umdrehungszahl des i'ropcilers kann erreicht werden. daU die Kugclpackung nicht scdimentiert, sondern in Schwebe gehalten wird. Somit wird verhindert, daß sich in den Kontaktflächen Kugel/Kugel. Kugel/Sieb und Kugel/Zylinderwand an Nährmedium und Sauerstoff verarmte Zonen bilden, in denen die Zellen absterben würden.

Zur Erzielung der Mikrodurchmischung dient der spiraiig aufgewickelte Schlauch mit seinen Zwischenräumen und das inhomogene Strömungsfeld in der Kugelpjckung. Die Umlaufzeit der Strömung durch den Ringspalt (13) und die Kugelpackung kann so eingestellt werden, daß die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Kugclpackung von unten nach oben nicht nennenswert absinkt.

Bei der Durchführung von Versuchen gemäß der Erfindung wurde das F.inperlen von Luftblasen völlig vermieden. Die einzige Sauerstoffzufuhr erfolgte durch das Schlauchsystem aus Silikonschlauch. der um den Wärmeaustauscher gewickelt war. Der mit der Sauerstoffelektrode kontinuierlich gemessene Oi-Gehalt . konnte auf diese Weise über mehrere Tage auf gleicher Höhe gehalten werden. Dies bedeutet, daß der Sauerstoff aus der strömenden Luft im Silikonschlauch in das Nährmedium übertritt und auch bei zunehmender Zeitzahl in der sich vermehrenden Kultur immer in ausreichender Menge zur Verfügung stand. Durch Erhöhung der Durchströmgeschwindigkeit der Luft im Schlauch bzw. durch Erhöhung des Druckes würde sich bei sehr stark Sauerstoff verbrauchenden Kulturen der Übergang des O2 in das Nährmedium noch erhöhen lassen. In Versuchen mit Zellkultursuspensionen von 4 und 10 1 konnte mit dieser Methode eine stetige Vermehrung der Mamestra brassicae-Zellen erreicht werden Im Vergleich zu allen bisher verwendeten Suspensionskulturmethoden war es damit erstmals

■ möglich, in einem Nährmediumvolumen von 10 1 Zellen nicht nur zu vermehren, sondern eine 30fache Zeüvermehrung zu erreichen. Die bisher in Volumina bis zu 31 erreichte Vermehrung war 4- bis 5fach. Weiterhin ist tu bemerken, daß das morphologische Aussehen der Zellen optimal war und daß der Prozentsatz an toten Zellen bei nur höchstens 10% lag. In Suspensionskulturen kleinerer Volumina (1 bis 3 i) liegt dieser Prozentsatz oft wesentlich höher.

Die Methode der 02-Anreicherung von Nährmedien

= über Oj-permeable Materialien in Form von Folien oder Schläuchen aus Teflon. Silikon o. ä. macht es daher möglich. Insektenzellen in Suspensionskultur-Volumina von 101 und mehr optimal zu vermehren. Die Zellen

können sich dabei auf dem Silikonschlauch nicht festsetzen (und damit den Übergang des O2 nach und nach blockieren), weil Silikon eine zum Anheften der Zellen nicht geeignete Oberfläche hat. Auch setzen sich daher zwischen den Schlauchwindungen keine Zellen fest, die dort absterben, zerfallen und das Nährmedium mit toxischen Zerfallprodukten anreichern könnten.

Beispiel t

Verwendet wurde die Insektenzellinie IZD-Mb 0503 (IZD = Institut für Zoologie Darmstadt; Mb = Mamestrn brassiae = Kohleule, eine Schmetterlingsart; 0503 = Code-Nummer der Zellinie; Lepidopteren-Zellinie ATCC Nr. CRl. 8003). Von dieser Zellinie wurde eine Suspensionskultur angesetzt, d. h. in einem sog. Spinnergefäß werden — unter ständigem Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers — die Zellen frei schwebend im Nährmedium zur Vermehrung gebracht. Bei einer für die VLimchrung notwendigen Ausgangszahl von etwa

1 χ IU¹ Zeilen/ml Nährmedium erreicht man in der Regel nach 3 Tagen eine Zellkonzentration von etwa 6 bis 10 χ 10⁵ Zellen, d. h. eine 3 bis 5fache Vermehrung. Wegen Nährmediumserschöpfung und »Alterung« dieser Kultur ist auch bei längerer Bebrütung eine höhere Zellzahl nicht erreichbar.

Von dieser »Stammkultur« wird der Ansatz entnommen, um die Zellkultur im Fermenter anzusetzen.

Die O:- und pH-Meßelektroden wurden geeicht, autoklaviert und nachgeeicht. Danach wurden sie in den Deckel des Fermenters eingesetzt. Als Membran wurde ein Schlauch aus Silikongummi verwendet und auf den Wärmeaustauscher gewickelt. Der Deckel (mit den Elektroden) und alle Teile des Fermenters, die mit der Zellsuspension und dem zu- und ablaufenden Nährmedium in Berührung kommen sowie die Luft zu- und abführenden Systeme müssen sterilisiert werden. Dies geschah im Autoklaven.

Das Fermentergefäß wurde unter Beachtung der Sterilbedingungen zusammengesetzt und die gewünschte Nährmediummenge wurde durch vorgesehene Öffnungen im Deckel des Fermentergefäßes eingefüllt. Bei einem Gefäß mit Gesamtinhalt 12 1 wurden zunächst

2 I eingefüllt. In dieser Nährmediummenge sind die Zellen bereits vor dem Einfüllen zugegeben worden. Die Konzentration ist 10⁵ Zellen/ml.

Dann wurde der Fermenter in Betrieb gesetzt und folgende Bedingungen eingehalten:

Druck von 0,5— 1,0 At eingeleitet. Bei Bedarf kann der Druck bis auf 2,0 At gesteigert werden.

Durch die erfindungsgemäße O2-Diffusionsmethode wurde die Zahl der Zellen pro ml Nährmedium in 4 Tagen von 10⁵ auf 2 bis 3 χ 10⁶ Zellen gebracht.

Nach 2—3 Tagen ist das Optimum der Zellvermehrung überschritten, d. h. daß die Zellkultur in die stationäre Phase übergeht, in der die Zellen nach und nach ihre Teilungsaktivität einstellen. Jeder ml enthält jetzt 2 —3 χ 10* Zellen. Es wurden dann 6 bis 7 I frisches Nährmedium steril zugegeben. Dadurch wird die Zellkonzentration entsprechend herabgesetzt. Die Zellen gehen aus der Stationärphase wieder in eine Vermehrungsphase über. Innerhalb von 2 — 3 Tagen führte dies wieder zu Zellkonzentrationen von 2 bis 3 χ 10⁶ZmI. In einem Gesamtvolumen von 10 1 sind somit aus anfänglich 3 χ 10» Zellen/3 1 bis etwa 10" Zellen entstanden.

Mit der Luftblasen-Methode des Standes der Technik wäre eine Vermehrung in Volumina über 4 I überhaupt nicht möglich gewesen. Die Züchtung in 4 χ 2,5 I-Volumina hätte jedoch ingesamt höchstens nur etwa 4 χ 10" Zellen ergeben. Die erfindungsgemäße Memhran-Methode erbringt also eine etwa 20fach höhere Zellzahl.

Vom 10 I-Volumen wurden etwa 51 der Zellsusp<;nsion abgezogen, wenn die Stationärphase wieder erreicht ist (2. bis 3. Tag). Dann wurden 5 I frisches Nährmedium steril in den Fermenter gegeben. Dadurch wird die verbliebene Suspension verdünnt und die Zellen beginnen sich durch erneuten Eintritt in eine Vermehrungsphase wieder zu teilen. Wiederholungen dieser Verdünnungs-Vermehrungsphasen können — bei Erhaltung steriler Bedingungen im Fermentergefäß — so lange durchgeführt werden, wie es der Gesamtzustand der Zellen erlaubt. Bei stabilisierten Zellinien kann dies zu einem kontinuierlichen Dauerbetrieb werden.

Beispiel 2

Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren können auch folgende andere Zellinien für eine Massenproduktion eingesetzt werden:

— IZD-Mb 2006 = Mamestra brassicae

— IZD-Mb 1203 = Mamestra brassicae
— IZD-Mb 0504 = Mamestra brassicae

— IZD-Ld 1307 = Lymantria dispar

— IZD-Ld 1407 = Lymantria dispar

— Rühren mit 60—70 UpM

— Einregulieren der Temperatur in der Suspension auf 28° C. wobei die

— O2- und pH-Wert-Regulierung über die Meßelektroden erfolgte.

In den ersten 16—24 Stunden nach Beginn der Kultivierung ist eine 02-Anreicherung des Nährmedi ums nicht unbedingt erforderlich. Sie wird jedoch notwendig, wenn die Zellkultur in die logarithmische Wachstumsphase eintritt und durch Zunahme der Zellzahl und durch erhöhte Stoffwechselleistungen der im Nährmedium vorhandene Sauerstoff verbraucht wird.

Die Zufuhr des O2 erfolgt dann über den Silikonschlauch als »Membran«, durch die O2 aus der atmosphärischen Luft oder aus 02/Luft-Gemischen in das Nährmedium eindiffundiert

Zur Anreicherung des Nährmediums nach den ersten 16 bis 24 Stunden wurde Kompressorluft bei einem Nach entsprechender Selektion können auch alle anderen Insektenzellinien, die als Suspensionskulturen wachsen, mit der Membran-Methode vermehrt werden. Eine ähnlich gute Vermehrungsrate wie bei IZD-Mb 0503 ist für alle diese angeführten Insektenzellinien zu erwarten.

Da es sich bei der Membran-Methode um eine grundsätzliche Verbesserung der Milieubedingungen bei ZellkuHuren handelt, ist zu erwarten, daß auch bei allen anderen Suspensionskulturen von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren bessere Zellvermehrungsraten erzielt werden. Von den Wirbeltier-Zellinieii seien beispielhaft vor allem diejenigen genannt, die zur Produktion von Bio-Produkten wie Immunfaktoren, Hormonen, Enzymen, antiviralen Agenzien, Viruspräparaten/Vaccinen u. dgL im industriellen Maßstab einge setzt werden. Dies sind z. B. die Säugerzellinien BHK 21, NAMALWA und 1301-Zellinie (aus der Leukämie-Linie CCRF-CEMT).

Die Verwendung von Zellen, die nicht als Suspen-

sionskultur vermehrbar sind, ist in neuerer Zeit auch in Fermentern möglich. Durch Einsatz der sog. microcarrier, das sind z. B. kleine Polystyrol-Harzkugeln mit in der Regel weniger als 1 mm Durchmesser, können Zellen, die nur in Form eines Zellrasens auf einer festen Unterlage wachsen, auf der Oberfläche dieser Kugeln vermehrt werden. Etwa 5 g dieser Kugeln/l Nährmedium in einen Fermenter eingebracht ergibt eine Oberfläche \ jn bis zu 30 000 cm². Versuche mit nichtdiploiden Säugerzellen haben in einer Suspensionskultur mit micro-carrier Zellzahlen von 4 χ IO*/ml Nährmedium ergeben. Dadurch, daß beim Einsatz der

10

micro-carrier große Zellzahlen entstehen können, wird der O2-Verbrauch entsprechend hoch. Mit der Luftblasen-Methode des Standes der Technik ist dieser erhöhte 02-Bedarf wesentlich schlechter zu decken als mit der erfindungsgemäßen Membran-Methode. Mit der Mem· bran-Mcthodc können daher die auf den micro-carrier-Kugeln wachsenden Zellen insgesamt zu besseren Stoffwechselleistungen gebracht werden, was mehr und schnellere Teilungen bedeutet. Die Zellzahl nimmt dann pro Zeiteinheit schneller zu, d. h. auch Fermenteransätze mit micro-carrier-Kulturen liefern mehr Zellen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen mit einem Inhalt von größer als 3 Liter in üblichen Nähmedien unter Zufuhr von Sauerstoff, wobei die Zuführung des Sauerstoffs über permeable Membranen erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung des Sauerstoffs allein über permeable Membranen aus gasdurchlässigem synthetischem Material, auf dem fast kein Zellenwachstum stattfindet, erfolgt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die permeable Membran aus Silikongummi besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran als Oberfläche eines in Spiralform gewickelten Schlauches vorliegt.