DE2940446A1 - Verfahren zur zuechtung von tierischen zellen in suspensions- und monolayerkulturen in fermentationsgefaessen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkultüren in Fermentationsgefäßen.

Die Vermehrung bestimmter tierischer fellen in Gefäßen mit einem größeren Volumen als 3 Liter wurde bisher durch das Problem der SauerstoffVersorgung behindert. Ganz gleich, ob diese Zellen in der Kulturlösung des Fermentors schweben oder ob sie an den Oberflächen des Fermentorgefäßes anwachsen, von einem gewissen Verhältnis A/V an stagniert das Wachstum (wobei A = Fläche für die Sauerstoffdiffusion aus der Gasphase in die gelöste Phase und V = Fermentationsvolumen bedeuten).

Die Vermehrung von beispielsweise Insektenzellen in größerer Menge ist eine der Voraussetzungen für eine Massenproduktion von Insektenviren, die in neuerer Zeit zunehmend genauer untersucht werden. Gerade über die Gruppe der zu den Insektenviren gehörenden Baculoviren sind in verschiedenen Arbeitsgruppen seit einigen Jahren Forschungsprojekte in Angriff genommen worden, weil diese Viren evtl. als biologische Insektizide mit Speziesspezifischer Wirkung eingesetzt werden können. Die Produktion der Baculoviren in Zellkulturen würde die Möglichkeit eröffnen, jederzeit unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen standardisierte Viruspräparate für den Einsatz in der Schädlingsbekämpfung herstellen zu können. Die Vermehrung von Insektenzellen in Suspensionskulturen als Substrat für die Virusvermehrung in größerem Umfang ist also hierfür eine wichtige Voraussetzung.

Die Vermehrung von Insektenzellen in Suspensionskulturen kann - wie bei Vertebratenzellen - in geschüttelten Gefäßen, in sog. "Roller"-Flaschen, in "Spinner"-Flaschen oder in ähnlichen Gefäßen erfolgen. Meistens ist die

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"Massenproduktion" aber 1) begrenzt durch die Größe der Gefäße, die handlich und manipulierbar bleiben müssen, und 2) durch den mit zunehmendem Nährmedium-Volumen relativ schlechter werdenden C^-Partialdruck im Nährmedium. In der Regel reicht die in einem geschlossenen Gefäß über dem Nährmedium befindliche Luft nur für eine gegrenzte Zeit aus, um im Nährmedium den Sauerstoff zu ersetzen, der durch die sich vermehrenden Zellen verbraucht wird. Es kommt dann zur Sauerstoffverarmung im Nährmedium und als Konsequenz davon zur Verminderung der ZeIl-Vermehrung und zum vermehrten Absterben von Zellen. Aus diesem Grunde ist für größere Nährmediumvolumina neben mechanischer Umwälzung des Nährmediums auch das Einblasen von steril gefilterter Luft in Form von fein verteilten Luftblasen eine notwendige und gängige Methode geworden. Damit wird der Sauerstoffgehalt des Nährmediums angereichert.

Dieses in der Fermentationstechnik gängige Verfahren, die Sauerstoffdiffusionsrate durch Einblasen von entkeimter Luft in die Kulturlösung zu steigern, versagt hier aus mehreren Gründen.

Bei diesem Verfahren wird durch eine oder mehrere öffnungen im Luftzuführungsrohr unterhalb des Flüssigkeitsspiegels erreicht, daß die Luft in Form von Blasen zur Oberfläche hin aufperlt. Je mehr Blasen dabei aus einem Liter Luft entstehen, desto größer ist die Phasengrenzfläche Luft/Flüssigkeit. Die Blasengröße und Blasenzahl lässt sich nur in Grenzen variieren.

Sind die öffnungen und damit die Blasen zu groß, vereinigen diese sich möglicherweise noch vor Erreichen des Flüssigkeitsspiegels. Sind die Öffnungen sehr klein, um viele kleine Blasen zu erzeugen, so besteht die Gefahr des Zuwachsens der öffnungen. Außerdem ist die Herstellung sehr vieler und sehr kleiner Öffnungen ein technisches Problem.

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Daher muss man von einer mittleren Blasenzahl und Blasengröße und damit von einer unbefriedigenden Phasengrenzfläche ausgehen.

Die Phasengrenzfläche wird nachträglich dadurch auf das geforderte Maß gebracht, daß die Blasen mittels eines Rührwerks zerteilt und über das Volumen der Kulturlösung im Fermentor verteilt werden. Die damit verbundenen Druck- und Zugkräfte (Schubspannungen und Scherkräfte) schädigen tierische Zellen vielfach so stark, daß sie absterben können.

Außerdem enthalten die Kulturflüssigkeiten Mindestmengen von Kälberserum oder anderen eiweißhaltigen Nährmedien, so daß das Lufteinblasen zu einer unerträglichen Schaumbildung führt, die den Versuchsablauf außerordentlich stark stören und behindern kann.

Weiter treten zusätzliche Scherkräfte auf, wenn die Gasblasen an der Grenzfläche (Kulturflüssigkeit/Gasraum) zerplatzen. Auch diese Kräfte schädigen die Zellen, so daß das Verhältnis von intakten zu geschädigten und abgestorbenen Zellen immer ungünstiger wird, obwohl die Gesamtzahl noch zunehmen kann.

Im Falle einer notwendigen stärkeren Luft-(Sauerstoff-) Zufuhr, d.h. bei zunehmender Menge an Luftblasen, steigt somit die Anzahl an geschädigten und absterbenden Zellen, was nicht nur der erstrebten Zellvermehrung entgegenläuft, sondern auch zunehmend zur Anreicherung von toxischen Zell-Zerfallprodukten führt. Diese können die Zellvermehrung zusätzlich beeinträchtigen. Außerdem haben Messungen in Spinner-Gefäßen von mehreren Litern ergeben, daß ab einer Nährmediummenge von etwa 3 Litern derO^-Gehalt im Nährmedium auch durch stärkeres Einblasen von Luft nicht mehr auf einem Niveau gehalten werden kann, das für normal proliferierende Zellen erforderlich wäre.

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Wird die Oberfläche, an denen animale Zellen bestimmter Zellstämme bevorzugt wachsen, künstlich vergrößert, indem man z.B. den Fermenterinhalt mit Kunststoffkügelchen füllt, die dann in der Kulturlösung schweben oder sedimentieren, treten beim Lufteinblasen und Rühren noch größere Probleme auf, da die Kugeln gegen die Rührblätter und/oder gegeneinander stoßen, so daß die scha digenden Scherkräfte und Schaumbildung vorhanden sind.

Die Konstanthaltung des pH-Wertes, der Kultivierungstemperatur und der Nährmediumqualität (durch Zugabe frischen Nährmediums) ist zwar wichtig, doch ist der begrenzende Faktor für die Volumina der Fermentationsgefäße der im Nährmedium gelöste Sauerstoff.

Zu betonen sei noch, daß zwar auch die mechanische Umwälzung durch ein Rührwerk standardisiert vorgenommen werden muss (ca 7o Umdrehungen/Minute), daß aber die Verarmung an 0_ von Nährmediumkompartimenten durch die mechanische Umwälzung nicht beseitigt wird.

Die Aufgabe der Erfinduna besteht nun darin, die Sauerstoffversorgung der Zellen sicherzustellen, ohne die oben aufgezählten gravierenden Nachteile des Lufteinblasens in Kauf nehmen zu müssen.

Bei der Lösung der Aufgabe der Erfindung muss außerdem sichergestellt werden, daß die erforderliche Mikro- und Makrodurchmischung des Fermentorinhalts (Kulturflüssigkeit) erhalten bleibt. Das heisst, es muss gewährleistet bleiben, daß pro Volumen vom Liter- bis zum u-Litermaßstab immer gleich viel Zellen, Nährmedium und Sauerstoff vorhanden sind. Unter Mikrodurchmischung wird die Durchmischung in Zellumgebung von 1 - 1o Zelldurchmessern und unter Makrodurchmischung die Durchmischung des ganzen Gefäßes verstanden.

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Uberraschenderweise wurde nun gefunden, daß es möglich ist, den für die Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen zum·Stoffwechsel erforderlichen Sauerstoff allein über permeable Membranen zuzuführen, ohne das Einperlen von Luftblasen oder sonstige Sauerstoffzufuhr nach den bekannten Verfahren zu benötigen. Beim Verfahren gemäss der Erfindung werden nicht nur die Scherkräfte vermieden, die beim Einblasen von Luft entstehen, sondern es findet auch keine Schaumbildung statt und Probleme der Dimensionierung der öffnungen für die Luftblasen fallen fort.

Darüber hinaus ist ein ganz wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung darin zu sehen, daß es mit dem Verfahren gemäss der Erfindung erstmals möglich ist, Züchtungen von tierischen Zellen und insbesondere von Insektenzellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen durchzuführen, deren Volumen die bisher üblichen Volumina in Flaschen oder sonstigen Gefäßen bei weitem überschreiten. So ist es z.B. möglich, in Suspensionskulturvolumina von 1o Litern und mehr zu arbeiten, wobei sich die Zellen optimal vermehren. Auch

·'* Volumina von 15, 2o oder mehr Litern sind ohne weiteres

mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung realisierbar, was bisher nicht möglich war.Selbst Volumina von 5o und sogar 1oo Litern sind nicht ausgeschlossen.

Der Sauerstoff diffundiert durch die aus Kunststoff bestehenden permeablen Membranen, wobei es wesentlich ist, daß die Zellen nicht auf dem Kunststoff wachsen, weil sonst die Sauerstoffzufuhr verringert und schließlich unterbrochen würde. Daher ist es wesentlich, daß das zu verwendende Material einerseits gasdurchlässig, d.h. sauerstoffdurchlässig und andererseits so beschaffen ist, daß auf ihm kein Zellwachstum oder Anwachsen von Zellen stattfindet. Zumindest sollte sichergestellt werden,

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daß das Zellwachstum auf dem Material, aus dem die permeablen Membranen bestehen, nur so wenig erfolgt, daß die nötige Sauerstoffversorgung des Systems nicht gestört wird.

Geeignete Kunststoffe für die permeablen Membranen sind z.B. die Silikonkunststoffe oder Silikon-beschichtete Kunststoffe. Als Kunststoffe kommen außerdem andere ver-7 fügbare Kunststoffe infrage, wobei jedoch darauf zu ! achten ist, daß tierische Zellen nicht auf den sauerstoffpermeablen Kunststoffen anhaften und auf ihnen wachsen können. Silikonfolie und Silikonschläuche haben eine Oberfläche, auf der sich Zellen nicht oder nur sehr schwer festsetzen können. Daher ist Silikonkunststoff ein bevorzugtes Material.

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß das Material und die geometrische Ausbildung der Kunststoffmembranen sowie ihre konstruktive Einfügung in die Fermentationsgefäße den üblichen biotechnologischen Forderungen angepasst sein müssen.

Als Sauerstoffquelle kommt üblicherweise Luft infrage. Es kann jedoch auch ein Luft/Sauerstoff-Gemisch verwendet werden. Auch ist es möglich, ein Sauerstoff/Stickstoff-Gemisch zu verwenden.

Die Verwendung von ausschließlich permeablen Membranen zur Zuführung des Sauerstoffs in die Kulturbrühe hat den weiteren Vorteil, daß eine Filterwirkung durch die Membran eintritt, wodurch die in der Luft enthaltenen Keime zurückgehalten werden.

Es versteht sich von selbst, daß bei der Durchführung des Fermentationsverfahrens gemäss der Erfindung die ge-

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samte Apparatur und die verwendeten Kulturflüssigkeiten steril gemacht sind.

Die Form der permeablen Membran kann beliebig sein, muss jedoch so gewählt werden, daß eine ausreichende Sauerstoffdiffusion zur Versorgung des Zellstoffwechsels möglich ist und die Anordnung die Zellvermehrung nicht stört. Als geeignet haben sich als permeable Membranen z.B. solche aus Silikongummi erwiesen. Zum Beispiel kann man einen Silikongummi-Schlauch um einen Träger, der sich im Fermentationsgefäß befindet, wickeln. Als Träger bieten sich normalerweise z.B. Wärmeaustauscher an.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Abbildungen und der Ausführungsbeispiele weiter erläutert.

Abb. 1 zeigt ein Fermentationsgefäß für die Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung bei

der Züchtung von Insektenzellen in Suspensionskulturen.

Abb. 2 zeigt ein Fermentationsgefäß zur Anwendung

des Verfahrens gemäss der Erfindung zur Züchtung von Wirbeltierzellen in Suspensions-

sowie Monolayerkultüren.

In Abb. 1 ist das Fermentationsgefäß ein Glasrohrabschnitt (1) aus Borsilikatglas, der durch einen Boden (7) und einen Deckel (2) aus Edelstahl abgeschlossen wird. Am Deckel (2) ist ein Wärmetauscher (3) angebracht, der hier als mäanderförmiges Stahlrohr ausgebildet ist* Auf dieses Stahlrohr ist ein Schlauch (4) aus Silikongummi so gewickelt, daß die Windungen nicht ganz aneinander anliegen. Mit den Oliven (5) wird die Druckluft durch den Silikonschlauch geleitet. Mit den Oliven (6) wird dem Wärmetauscherrohr das Tmperiermedium zugeführt. Der Boden (7) des Fermentationsgefäßes ist ebenso wie der Deckel über einen Dichtring (8) mit dem Glasrohrab-

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-Ιο-

schnitt verbunden. Der Motor (9) treibt über eine Welle (1o) den Propeller (11) an. Der Propeller (11) rotiert mit ca 6o UpM und gewährleistet durch seine konstruktive Ausbildung und seine geringe Umdrehungszahl die schonende Makrodurchmischung des Fermentorinhaltes (12). Die Mikrodurchmischung entsteht durch Turbulenzen an dem spiralig aufgewickelten Kunststoffschlauch. Der in die Flüssigkeit diffundierte Sauerstoff wird mittels dieser Mikrodurchmischung vorverteilt und mit der Propellerströmung über das gesamte Gefäß verteilt. Die durch den gewickelten Schlauch erzeugten Turbulenzen in der Gesamtströmung und durch die Gesamtströmung selbst wird außerdem gewährleisten, daß die Nährstoffe und Zellen sich gleichmässig über das Fermentationsvolumen verteilen.

In Abb. 2 ist das Fermentationsgefäß ein Glasrohrabschnitt (1) aus Borsilikatglas, der durch einen Boden (7) und einen Deckel (2) aus Edelstahl abgeschlossen wird. Am Deckel (2) ist ein Wärmetauscher (3) angebracht, der hier als Doppelzylinder aus zwei konzentrischen, oben und unten miteinander durch je einen Kreisring verbundenen Doppelrohrhohlkörper ausgebildet ist.

O Auf die Außenfläche dieses Stahlrohres ist ein Schlauch

(4) aus Silikongummi so gewickelt, daß die Windungen nicht ganz aneinander anliegen. Mit den Oliven (5) wird die Druckluft durch den Silikonschlauch geleitet. Mit den Oliven (6) wird dem Wärmetauscherrohr das Temperiermedium zugeführt. Der Boden (7) des Fermentationsgefäßes ist ebenso wie der Deckel über einen Dichtring

(8) mit dem Glasrohrabschnitt verbunden. Der Motor (9) treibt über eine Welle (1o) den Propeller (11) an. Der Propeller (11) muss durch adäquate Umdrehungszahl (5o - 2oo UpM) die schonende Makrodurchmischung des Fermentorinhaltes 12) gewährleisten - hier in der Hauptsache die Kulturflüssigkeit mit dem Nährmedium, die im Ringspalt (13) abwärts strömt und sich mit Sauerstoff anreichern konnte. Die Kulturflüssigkeit (12) durch-

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strömt das Sieb (14) und umspült die Kügelchen (15), auf denen die Zellen wachsen. Durch eine entsprechende Ausbildung des Siebes, durch die Wahl der Kugelgröße (Strömungswiderstand der Kugelpackung), durch das spezifische Gewicht der Kugeln und durch die Umdrehungszahl des Propellers kann erreicht werden, daß die Kugelpackung nicht sedimentiert, sondern in Schwebe gehalten wird. Somit wird verhindert, daß sich in den Kontaktflächen Kugel/Kugel, Kugel/Sieb und Kugel/Zylinderwand an Nährmedium und Sauerstoff verarmte Zonen bilden, in denen die Zellen absterben wurden.

Zur Erzielung der Mikrodurchmischung dient der spiralig aufgewickelte Schlauch mit seinen Zwischenräumen und das inhomogene Strömungsfeld in der Kugelpackung. Die Umlaufzeit der Strömung durch den Ringspalt (13) und die Kugelpackung kann so eingestellt werden, daß die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Kugelpackung von unten nach oben nicht nennenswert absinkt.

Bei der Durchführung von Versuchen gemäss der Erfindung wurde das Einperlen von Luftblasen völlig vermieden.

Die einzige Sauerstoffzufuhr erfolgte durch das Schlauchsystem aus Silikonschlauch, der um den Wärmeaustauscher gewickelt war. Der mit der Sauerstoffelektrode kontinuierlich gemessene O₂~Gehalt konnte auf diese Weise über mehrere Tage auf gleicher Höhe gehalten werden. Dies bedeutet, daß der Sauerstoff aus der strömenden Luft im Silikonschlauch in das Nährmedium übertritt und auch bei zunehmender Zellzahl in der sich vermehrenden Kultur immer in ausreichender Menge zur Verfügung stand. Durch Erhöhung der Durchströmungsgeschwindigkeit der Luft im Schlauch bzw. durch Erhöhung der Druckes würde sich bei sehr stark Sauerstoff verbrauchenden Kulturen der Übergang des 0_? in das Nährmedium noch erhöhen lassen. In Versuchen mit Zellkultursuspensionen von 4 unc! 1o 1 konnte mit dieser Methode eine stetige Vermehrung der

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Mamestra brassicae-Zellen erreicht werden. Im Vergleich zu allen bisher verwendeten Suspensionskulturmethoden war es damit erstmals möglich, in einem Nährmediumvolumen von 1o 1 Zellen nicht nur zu vermehren, sondern eine 3ofache &llvermehrung zu erreichen. Die bisher in Volumina biszu 3 1 erreichte Vermehrung war 4-bis 5fach. Weiterhin ist zu bemerken, daß das morphologische Aussehen der Zellen optimal war, und daß der Prozentsatz an toten Zellen bei nur höchstens 1o % lag. In Suspensionskulturen kleinerer Volumina (1 bis 3 1) liegt dieser Prozentsatz oft wesentlich höher.

Die Methode der (^-Anreicherung von Nährmedien über (^-permeable Materialien in Form von Folien oder Schläuchen aus Teflon, Silikon o.a. macht es daher möglieh, Insektenzellen in Suspensionskultur-Volumina von 1o 1 und mehr optimal zu vermehren. Die Zellen können sich dabei auf dem Silikonschlauch nicht festsetzen (und damit den Übergang des O« nach und nach blockieren) , weil Silikon eine zum Anheften der Zellen nicht geeignete Oberfläche hat. Auch setzen sich daher zwischen den Schlauchwindungen keine Zellen fest, die dort absterben, zerfallen und das Nährmedium mit toxischen Zerfallprodukten anreichern könnten.

Beispiel 1

Verwendet wurde die Insektenzellinie IZD-Mb o5o3 (IZD = Institut für Zoologie Darmstadt; Mb = Mamestra brassicae Kohleule, eine Schmetterlingsart; o5o3 = Code-Nummer der Zellinie; Lepidopteren-Zellinie ATCC Nr. CRL 8ΟΟ3) Von dieser Zellinie wurde eine Suspensionskultur angesetzt, d.h. in einem sog. Spinnergefäß werden - unter ständigem Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers - die Zellen frei schwebend im Nährmedium zur Vermehrung gebracht. Bei einer für die Vermehrung notwendigen Ausgangszahl von etwa 2 χ 1o Zellen/ml Nährmedium erreicht man in der Regel nach 3 Tagen eine Zellkonzentration

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von etwa 6 bis 1o χ 1o Zellen, d.h. eine 3 bis 5fache Vermehrung. Wegen Nährmediumserschöpfung und "Alterung" dieser Kultur ist auch bei längerer Bebrütung eine höhere Zellzahl nicht erreichbar.

Von dieser "Stammkultur" wird der Ansatz entnommen, um die Zellkultur im Fermenter anzusetzen.

Die O„- und pH-Meßelektroden wurden geeicht, autoklaviert und nachgeeicht. Danach wurden sie in den Deckel des Fermenters eingesetzt. Als Membran wurde ein SGChlauch aus Silikongummi verwendet und auf den Wärmeaustauscher gewickelt. Der Deckel (mit den Elektroden) und alle Teile des Fermenters, die mit der Zellsuspension und dem zu- und ablaufenden Nährmedium in Berührung kommen sowie die Luft zu- und abführenden Systeme müssen sterilisiert werden. Dies geschah im Autoklaven.

Das Fermentergefäß wurde unter Beachtung der Storilbedingungen zusammengesetzt und die gewünschte Nährmediummenge wurde durch vorgesehene öffnungen im Deckel des Fermentergefäßes eingefüllt. Bei einem Gefäß mit Gesamtinhalt 12 1 wurden zunächst 2 1 eingefüllt. In diese Nährmediummenge sind die Zellen bereits vor dem Einfüllen zugegeben worden. Die Konzentration ist 1o ' Zellen/ml.

Dann wurde der Fermenter in Betrieb gesetzt und folgende Bedingungen eingehalten:

- Rühren mit 6o - 7o UpM

- Einregulieren der Temperatur in der Suspension auf 28°C, wobei die

- O~- und pH-Wert-Regulierung über die Meßelektroden erfolgte.

In den ersten 16-24 Stunden nach Beginn der Kulti- |

vierung ist eine O_o-Anreicherung des Nährmediums nicht ' _ . !

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unbedingt erforderlich. Sie wird jedoch notwendig, j wenn die Zellkultur in die logarithmische Wachstums- _{ phase eintritt und durch Zunahme der Zellzahl und durch erhöhte Stoffwechselleistungen der im Nährmedium vor- j handene Sauerstoff verbraucht wird. ;

Die Zufuhr des O₂ erfolgt dann über den Silikonschlauch als "Membran", durch die 0„ aus der atmosphärischen j Luft oder aus O~/Luft-Gemischen in das Nährmedium ein- :

2. ι

diffundiert.

Zur Anreicherung des Nährmediums nach den ersten 16 bis 24 Stunden wurde Kompressorluft bei einem Druck von o,5 - 1,o At eingeleitet. Bei Bedarf kann der ; Druck bis auf 2,ο At gesteigert werden.

Durch die erfindungsgemässe O_?-Diffusionsmethode wurde die Zahl der Zellen pro ml Nährmedium in 4 Tagen von 1o auf 2 bis 3 χ 1ο Zellen gebracht.

Nach 2-3 Tagenist das Optimum der ZeilVermehrung überschritten, d.h. daß die Zellkultur in die stationäre Phase übergeht, in der die Zellen nach und nach , ihre Teilungsaktivität einstellen. Jeder ml enthält jetzt 2 - 3 χ 1o Zellen. Eswurden dann 6 bis 7 1 frisches Nährmedium steril zugegeben. Dadurch wird die Zellkonzentration entsprechend herabgesetzt. Die Zellen gehen aus der Stationärphase wieder in eine Vermehrungsphase über. Innerhalb von 2-3 Tagen führte ■ dies wieder zu Zellkonzentrationen von 2 bis 3 χ 1o In einem Gesamtvolumen von 1o 1 sind somit aus anfäng-J lieh
den.

dies wieder zu Zellkonzentrationen von 2 bis 3 χ 1o /mi,

jsamtvolumen von 1o 1 sind : lieh 3 χ 1o⁸ Zellen/3 1 bis etwa 1o¹¹ Zellen entstan-

Mit der Luftblasen-Methode des Standes der Technik wäre eine Vermehrung in Volumina über 4 1 überhaupt nicht möglich gewesen. Die Züchtung in 4 χ 2,5 1-Vo-

lumina hätte jedoch insgesamt höchstens nur etwa .en ergeben. Die

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4 x 1o Zellen ergeben. Die erfindungsgemässe Membran-

Methode erbringt also eine etwa 2ofach höhere Zellzahl.

Vom 1o 1-Volumen wurden etwa 5 1 der Zellsuspension ab- !

gezogen, wenn die Stationärphase wieder erreicht ist

(2. bis 3. Tag). Dann wurden 5 1 frisches Nährmedium '

\ 5 steril in den Fermenter gegeben. Dadurch wird die verbliebene Suspension verdünnt und die Zellen beginnen sich durch erneuten Eintritt in eine Vermehrungsphase j wieder zu teilen. Wiederholungen dieser Verdünnungs-Vermehrungsphasen können - bei Erhaltung steriler Bedingungen im Fermentergefäß - so lange durchgeführt werden, wie es der Gesamtzustand der Zellen erlaubt. Bei stabilisierten Zellinien kann dies zu einem kontinuierlichen Dauerbetrieb werden.

Beispiel 2
Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren kennen

auch folgende andere Zellinien für eine Massenproduktion eingesetzt werden:
: - IZD-Mb 2006 = Mamestra brassicae

- IZD-Mb 1203 =
2o - IZD-Mb 0504 =

- IZD-Ld 1307 = Lymantria dispar

- IZD-Ld 1407 =

Nach entsprechender Selektion können auch alle anderen Insektenzellinien, die als Suspensionskulturen wachsen, mit der Membran-Methode vermehrt werden. Eine ähnlich

! gute Vermehrungsrate wie bei IZD-Mb 0503 ist für alle

ι ^:

diese angeführten Insektenzellinien zu erwarten.

j

ι Da es sich bei der Membran-Methode um eine grundsätz-

liehe Verbesserung der Milieubedingungen bei Zellkul- ι

türen handelt, ist zu erwarten, daßauch bei allen |

ί anderen Suspensionskulturen von wirbellosen Tieren und j

Wirbeltieren bessere Zellvemehrungsraten erzielt werden.

., i

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Von den Wirbeltier-Zellinien seien beispielhaft vor allem diejenigen genannt,die zur Produktion von Bio-Produkten wie Immunfaktoren, Hormonen, Enzymen, antiviralen Agenzien, Viruspräparaten/Vaccinen u.dgl. im industriellen Maßstab eingesetzt werden. Dies sind z.B. die Säugerzellinien BHK 21, NAMALWA und 1301-Zellinie (aus der Leukämie-Linie CCRF-CEMT).

Die Verwendung von Zellen, die nicht als Suspensionskultur vermehrbar sind, ist in neuerer Zeit auch in Fermentern möglich. Durch Einsatz der sog. microcarrier, das sind z.B. kleine Polystyrol-Harzkugeln mit in der Regel weniger als 1 mm Durchmesser, können Zellen, die nur in Form eines Zellrasens auf einer festenünterlage wachsen, auf der Oberfläche dieser Kugeln vermehrt werden. Etwa 5 g dieser Kugeln/l Nährmedium in einen Fermenter eingebracht ergibt eine

2 Oberfläche von bis zu 30 000 cm . Versuche mit nichtdiploiden Säugerzellen haben in einer Suspensionskultur mit micro-carrier Zellzahlen von 4 χ 1o /ml Nährmedium ergeben. Dadurch, daß beim Einsatz der microcarrier große Zellzahlen entstehen können, wird der 0₂~Verbrauch entsprechend hoch. Mit der Luftblasen-Methode des Standes der Technik ist dieser erhöhte 0₂~Bedarf wesentlich schlechter zu decken als mit der erfindungsgemässen Membran-Methode. Mit der Membran-Methode können daher die auf den micro-carrier-Kugeln wachsenden Zellen insgesamt zu besseren Stoffwechsel- ' leistungen gebracht werden, was mehr und schnellere Teilungen bedeutet. Die Zellzahl nimmt dann pro Zeit- ,

einheit schneller zu, d.h. auch Fermenteransätze i mit micro-carrier-Kulturen liefern mehr Zellen. ι

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Claims (6)

VON KREISLER SCHONWAlD MfcYER EI5HOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTI 2G940U6 PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler f 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln 5 KÖLN 1 DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF AvK/IM 4.1O.79 B.Braun Melsungen Aktiengesellschaft, Melsungen Verfahren zur Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen Patentansprüche

1. Verfahren zur Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen in Fermentationsgefäßen in üblichen Nährmedien unter Zufuhr von Sauerstoff, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung des Sauerstoffs allein über permeable Membranen erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die permeablen Membranen aus gasdurchlässigem synthetischem Material bestehen, auf dein fast kein Zellwachstum stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die permeable Membran aus Silikongummi besteht.

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Telefon: Ό221) 13 IQ41 Telex: 8882307 dopa d Telegramm: Dompotont Köln

ORIGINAL INSPECTED

4· Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran als Oberfläche eines in Spiralform gewickelten Schlauches vorliegt.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß Insektenzellen gezüchtet werden.

6. Verwendung permeabler Membranen aus Kunststoff,

fast
auf denen/kein Zellwachstum stattfindet, zur Zuführung von Sauerstoff in Fermentationsgefäße zur Züchtung von tierischen Zellen in Suspensions- und Monolayerkulturen.

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