BRPI0803630B1

BRPI0803630B1 - biorreator de escoamento em vórtices de taylor para cultivo celular

Info

Publication number: BRPI0803630B1
Application number: BRPI0803630A
Authority: BR
Inventors: Alberto Torres Suazo Claudio; Aparecida Santiago Patricia; De Campos Giordano Roberto
Original assignee: Fundacao Univ Federal De Sao Carlos Ufscar
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2018-11-06
Also published as: BRPI0803630A2; WO2010006393A8; US20110117639A1; WO2010006393A1; EP2300593A1

Abstract

biorreator de escoa~nto em vôrtices de taylor para cultivo celular é descrito um biorreator (100) de escoamento em vórtices de taylor, o dito biorreator sendo constituído dedois corpos de forma essencíalmente cilíndrica, concêntricos, sendo o interno (2) rotante e o externo (1) estacionário. a partir da rotação do dito cilindro interno (2) acima de um determinado valor crítico, inicia-se a formação de vórtices toroidaís sobrepostos sobre o fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular (d) entre os ditos dois cilindros. o escoamento em vórtices é determinado pela velocidade de rotação do corpo interno, pela razão entre os raios dos cilindros e pela viscosidade cínemática do meio. o corpo interno rotante (2) é dotado de parede externa e fixado a um eixo tubular (5) vazado para introdução de gases que deverão ser absorvidos pelo meio de cultura após difundirem através da parede de membrana tubular polimérica (6) enrolada ao redor do cilindro interno. o espaço anular (d) é ocupado em parte pela membrana tubular (6) e em parte pelo meio de cultura contendo as células em suspensão ou ancoradas a microcarregadores. o biorreator pode ser facilmente escalonado desde que seja aumentado o comprimento da membrana tubular e respeitadas as relações geométricas entre os raios dos ilindros interno r~int~ e externo r~ext~ e a razão de aspecto nos limites razão entre os raios: n= r~int~/r~ext~, variando tipicamente de 0,1 a 0,99 e razão de aspecto: r= l/d variando tipicamente de 0,5 a 100.

Description

(54) Título: BIORREATOR DE ESCOAMENTO EM VÓRTICES DE TAYLOR PARA CULTIVO CELULAR (51) IntCI.: C12M 3/00; C12M 1/10.

(73) Titular(es): FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS UFSCAR.

(72) Inventor(es): CLÁUDIO ALBERTO TORRES SUAZO; ROBERTO DE CAMPOS GIORDANO; PATRÍCIA APARECIDA SANTIAGO.

(57) Resumo: BIORREATOR DE ESCOA-NTO EM VÓRTICES DE TAYLOR PARA CULTIVO CELULAR É descrito um biorreator (100) de escoamento em vórtices de Taylor, o dito biorreator sendo constituído dedois corpos de forma essencíalmente cilíndrica, concêntricos, sendo o interno (2) rotante e o externo (1) estacionário. A partir da rotação do dito cilindro interno (2) acima de um determinado valor crítico, inicia-se a formação de vórtices toroidaís sobrepostos sobre o fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular (d) entre os ditos dois cilindros. O escoamento em vórtices é determinado pela velocidade de rotação do corpo interno, pela razão entre os raios dos cilindros e pela viscosidade cínemática do meio. O corpo interno rotante (2) é dotado de parede externa e fixado a um eixo tubular (5) vazado para introdução de gases que deverão ser absorvidos pelo meio de cultura após difundirem através da parede de membrana tubular polimérica (6) enrolada ao redor do cilindro interno. O espaço anular (d) é ocupado em parte pela membrana tubular (6) e em parte pelo meio de cultura contendo as células em suspensão ou ancoradas a microcarregadores. O biorreator pode ser facilmente escalonado desde que seja aumentado o comprimento da membrana tubular e respeitadas as relações geométricas entre os raios dos (...).

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BIORREATOR DE ESCOAMENTO EM VÓRTICES DE TAYLOR PARA CULTIVO

CELULAR CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção pertence ao campo dos biorreatores usados para o cultivo de células animais e vegetais, mais especificamente, a um biorreator baseado em escoamento em Vórtices de Taylor.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] O confinamento de um fluido entre dois cilindros concêntricos, com o interno (e talvez o cilindro externo) em rotação, e um tema clássico em dinâmica dos fluidos e foi descrito pela primeira vez por Taylor no trabalho Taylor, G. I. “Stability of a viscous liquid between rotating cylinders”. Philosophical Transactions of Royal Society A, v. 223, p. 289s343, 1923. Em seus estudos, o pesquisador examinou o início da formação de um escoamento secundário no espaço anular entre dois cilindros concêntricos em rotação simultânea ou separadamente. Taylor comprovou experimentalmente que em velocidades de rotação do cilindro interno abaixo de um determinado valor, denominado de valor crítico, o fluido simplesmente movia-se tangencialmente no espaço anular. Mas, no momento em que a velocidade de rotação excedia esse limite, o movimento, antes tangencial (escoamento principal de Couette), era sobreposto por uma trajetória helicoidal em várias camadas e com. sentidos alternados de rotação. Esse padrão de escoamento de fluxo foi denominado de “escoamento em Vórtices”. Outro resultado observado foi que apenas a rotação do cilindro externo, enquanto o interno permanece estacionário, não possibilita a formação dos vórtices. Taylor, através de estudos teóricos, desconsiderou os termos não-lineares das equações de Navier-Stokes e resolveu as equações para as perturbações do escoamento básico (de Couette) usando séries de Bessel-Fourier. [003] Desta forma, Taylor pode calcular as condições mínimas para o estabelecimento dos vórtices e ampliar a análise anterior de estabilidade proposta por Rayleigh, em 1916, expandindo a para escoamentos rotacionais e fluidos viscosos incompressíveis. [004] Outro resultado obtido por Taylor foi a possibilidade de determinar o tamanho dos vórtices e seu sentido de rotação, uma vez que, essencialmente, a amplitude do escoamento secundário é igual ao dobro do espaço anular.

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2/21 [005] Assim, cada par de vórtices girando em sentido alternado constitui uma unidade que se reproduz de maneira estável ao longo de todo o espaço anular, e cada vórtice individualmente está confinado em região de seção aproximadamente quadrada, com altura igual a largura do espaço anular. A partir desses resultados, pesquisadores passaram a denominar de escoamento em vórtices de Taylor ou escoamento de TaylorCouette, o escoamento secundário produzido quando o cilindro interno gira enquanto o externo conservar-se estacionário. A referência dos pesquisadores a Couette deve-se ao dispositivo estudado por Maurice Couette, em 1890, que era composto por dois cilindros concêntricos, mas, nesse caso, o cilindro interno encontrava-se suspenso e o externo em rotação, segundo Donnelly, R. J. “TaylorCouette Flow: The Early Days”. American Institute of Physics. Physics Today, p. 3238, november 1991.

[006] Ao longo dos anos, publicações sobre o escoamento em Vórtices de Taylor se multiplicaram nas mais diversas áreas. Entre elas, trabalhos envolvendo a. caracterização dos regimes de escoamento, conforme Coles, D. “Transition in circular Couette flow” Journal of Fluid Mechanics, V. 21, n.3, p. 385-425, 1965 e Davey, A. “The growth of Taylor vórtices in flow between rotating cylinders”. Journal of Fluid Mechanics, v. 14, p. 336-368. 1962, e o estudo da transferência de nassa (& de calor, segundo os trabalhos: Kataoka, K. “Heat transfer in a Taylor vortex flow”. Journal of Chemical Engineering Japan, 8, 472-476, 1975; Legrand, J. et al. “Overall mass transfer to the rotating inner electrode of a concentric cylindrical reactor with axial flow”. Electrochimica Acta, 25, 669-673, 1980; Kataoka, K. et al. “Mass transfer in the annulus between two coaxial rotating cylinders”. Heat and Mass Transfer in Rotating Machinery (eds. Metzger, D. E. and Afagan, N. H.) 143-153, Hemisphere, New York, 1984; Legrand, J. e Coeuret, F. “Transferí de Matiêre Liquide-Paroi et Hydrodynamique de TEcoulement de CouetteTaylor-Poiseuille Biphasique”. Can. J. Chem. Engine. 65, 237-243,1987; Moore, C.M.V. “Characterization of a Taylor-Couette vortex flow reactor. 239 p. Thesis (Doctor of Philosophy in Chemical Engineering), Massachusetts Institute of Technology (MIT), United States of America. 1994; Desmet, G. et al. “Local and global dispersion effects in Couette-Taylor flow II: Quantitative measurements and discussion of reactor performance”. Chemical Engineering Science, V. 5, n. 8, p. 1299-1309.1996; Wronski, S.

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3/21 et al. “Mass transfer in gas-liquid Couette-Taylor flow in nenbrane reactor”. Chemical Engineering Science, v. 54, p. 2963-2967. 1999; Giordano, R.C, et al. “Analysis of a Taylor-Poiseuille vortex flow reactor-l: Flow patterns and mass transfer characteristics”. Chemical Engineering Science, v. 53, n. 20, p. 3635-3652, 1998; Resende, Μ. M et al. “Estimation of mass transfer parameters in a Taylor-Couette-Poiseuille heterogeneous reactor”. Brazilian Journal of Chemical Engineering, V. 21, n, 02, p. 175-184, 2004.

[007] Como mencionado anteriormente, publicações voltadas a aplicações do escoamento em vórtices de Taylor aumentaram consideravelmente desde o estudo realizado por Taylor em 1923, sendo que nas últimas duas décadas o emprego desse tipo de fluxo se estendeu aos biorreatores de bancada, conforme Giordano, R.L.C. et al. “Analysis of a 'TaylorPoiseuille vortex flow reactor II: reactor modeling and performance assessment using glucose-fructose isomerization as test reaction. Chemical Engineering Science, v. 55, p. 3611-3626. 2000; Dutta, P. K; Ray, A. K. “Experimental investigation of Taylor vortex photocatalytic reactor for water purification”. Chemical Engineering Science, vol. 59, p. 5249 - 5259. 2004.

[008] Na década de 1990, com base na concepção de cilindros concêntricos, foram desenvolvidos, pela Agência Espacial Norte-americana (NASA), biorreatores denominados de RWVB - rotating wall vessel bioreactor. Esses equipamentos são atualmente comercializados pela empresa Synthecon (HoustonEUA) e têm como objetivo obter “microgravidade” (ausência de gravidade), ou seja, minimizar as tensões de cisalhamento presentes no ambiente fluido-dinâmico dos biorreatores durante o cultivo celular, principalmente de células animais e vegetais. Para isto ocorrer, esses equipamentos são operados no regime de escoamento de Couette, com eixo de rotação disposto horizontalmente. Nesse caso, o cilindro externo é rotante, enquanto o interno é estacionário ou gira na mesma velocidade de rotação do externo.

[009] Outra característica dos RWVB é a oxigenação do meio de cultura, sendo esta efetuada por membrana plana fixada no cilindro interno. Esses equipamentos não apresentanl características geométricas e não operam com o intuito de formar o escoamento de TaylorCouette. Trabalhos referentes a esse tipo de biorreator foram publicados, sendoé Unsworth, B.R. e Lelkes, P.l “Growing tissues in microgravity”. Nature

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Medicine. V. 4, n.8, p. 901-907. 1998; Cowger, N. L. et al. “Characterization of bimodal cell death of insect cells in a rotating-wall vessel and shaker flash”. Biotechnology and Bioengineering, v. 64, n. 1, p. 14-26. 1999; Sun, X e Linden, J.C. “Shear stress effects on plant cell suspension cultures in a rotating wall vessel bioreactor”. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 22, p. 44-47. 1999; Hammond, T.G. e Hammond J.M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel”. AJP - Renal, v. 281, p. 12-25. 2001; 0'Connor, K.C et al. “Prolonged shearing of insect cells in a Couette bioreactor” Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 600-608. 2002; Saini, S. e Wick , T. M. “Concentric cylinder bioreactor for production of tissue engineered cartilage: effect of seeding density and hydrodynamic loading on construct development”. Biotechnology Progress, v. 19, p. 510-521, (2003); Klement, B.J. et al. Skeletal tissue growth, differentiation and mineralization in the NASA Rotating Wall Vessel”. Bone, V. 34, p. 487498. 2004; Liu, T et al. “Analysis on forces and movement of cultivated particles in a rotating wall vessel bioreactor”. Biochemical Engineering Journal, v. 18, p. 97- 104 (2004); Martin, Y e Vermette, P. “Bioreactors for tissue mass culture: Design, characterization, and recent advances”. Biomaterials, v. 26, p. 7481-7503. 2005.

[010] Outros biorreatores do tipo RWVB, mas operando no regime de escoamento em vórtices de Taylor, são avaliados em Haut, B. et al. Hydrodynamics and mass transfer in a Couette-Taylor bioreactor for the culture of animal cells”. Chemical Engineering Science, v. 58, p. 777-784. 2003; Curran, S.J. e Black, R.A. “Quantitative experimental study of shear stresses and mixing in Progressive flow regimes within annular-flow bioreactors” Chemical Engineering Science, v. 59, p. 5839-5868 .2004 e Curran, S.J. e Black, R.A. “Oxygen transport and cell viability in an annularflow bioreactor: comparison of laminar Couette and TaylorVortex flow regimes”. Biotechnology and Bioengineering, V. 89, n. 7, p. 766-774, March 30, 2005. Nesses trabalhos, embora sejam propostas inovações no que se refere à utilização do biorreator para o cultivo de células animais e vegetais, sérios obstáculos impedem, seu escalonamento. Essas limitações envolvem a ausência de dispositivos para promover transferências de massa e calor tão eficientes quanto as do biorreator da presente invenção. Nos RWVB, o fornecimento dos gases para o meio de cultura pode ocorrer superficialmente na interface gás-liquido ou através

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5/21 de oxigenador localizado externamente. Esses sistemas de oxigenação ocasionam a restrição na capacidade volumétrica (100 mL) dos equipamentos, visto que essas técnicas não são adequadas para cultivos com elevada densidade celular (>106 células.mL^aU. A limitação ao transporte de calor ocorre devido à ausência de trocador de calor na estrutura dos biorreatores.

[011] Todas essas restrições são superadas no biorreator da invenção, denominado de “Biorreator de Escoamento em Vórtices de Taylor” (BEVT), como será visto adiante no presente relatório. O BEVT possui eficientes sistemas para a transferência de massa e calor possibilitando seu escalonamento.

[012] A literatura de patentes apresentam vários documentos sobre o assunto.

[013] A patente JP 07-117088 refere-se a um procedimento de cultivo células animais aderentes empregando e comparando o desempenho (principalmente no que se refere a viabilidade celular) entre biorreatores do tipo tanque agitado e do tipo cilindros concêntricos. A patente em questão enfoca um procedimento para o cultivo de células, não fornecendo qualquer detalhe construtivo ou de concepção inovadora de um biorreator de escoamento em vórtices de Taylor. Cabe destacar que a relevante vantagem do fluxo de Taylore Couette são as baixas tensões de cisalhamento que o caracterizam, e que provêem um ambiente mais favorável ao cultivo celular. Assim, o objetivo da patente JP 2752918 e apenas comparar dois sistemas de agitação, sendo um deles o método convencional, composto por impelidor e presente em biorreator do tipo tanque agitado, e outro por escoamento em vórtices de Taylor em biorreator de cilindros concêntricos.

[014] Na publicação JP 2001-192215 é descrito o instrumento e o método empregado para regeneração de uma proteína. O equipamento em questão é composto por dois cilindros concêntricos sendo o interno rotante e o externo estacionário. O equipamento está disposto de forma a girar horizontalmente. Entre o cilindro interno e externo há um tubo constituído por uma membrana permeável a passagem da proteína regenerada. É no espaço anular entre o cilindro interno e a membrana que se forma o escoamento em Vórtices de Taylor. A concepção do equipamento e sua aplicação biotecnológica são diferentes do biorreator apresentado no presente pedido.

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6/21 [015] A patente GB20978I7 cita um biorreator de escoamento em Vórtices de Taylor utilizado para o cultivo de células animais e vegetais. O biorreator é formado por uma câmara constituída por cilindro externo, fabricado em aço vazado no qual foi colocada uma membrana plana permeável. No interior da membrana são montados pares de tubos cilíndricos concêntricos. A oxigenação do meio de cultura ocorre através dessa membrana. Com isso, tem-se uma limitação na relação área de troca de oxigênio por volume de reator. É, portanto, uma concepção distinta da presente invenção.

[016] Na patente U.S. 3.647.632 é descrito um biorreator de perfusão para cultivo celular. [017] O equipamento é composto por uma dorna de vidro e no seu interior encontra-se, próximo à base, um filtro rotativo confeccionado em tela de aço inox responsável por reter células no seu interior. O biorreator em questão tem uma concepção bastante distinta da presente invenção, não possibilitando a formação de vértices de Taylor.

[018] Assim como a patente anterior, & U.S. 5.057.428 apresenta a descrição de biorreator com concepção diferente da presente invenção. O documento em questão refere-se a um biorreator tipo leito fixo para cultivo de células animais e vegetais. O equipamentC) é composto por dois cilindros concêntricos, sendo que o interno é composto por um feixe de tubos distribuídos e fixados por um disco espaçador. As células ficam contidas em um recipiente cilíndrico, fabricado em material inoxidável vazado e disposto paralelamente ao longo de todo o cilindro interno, possibilitando o contato com o meio de cultura e oxigênio.

[019] O pedido publicado norte-americano U.S. 2006/0240544 descreve IHU biorreator para (3 cultivo de Inicrorganismos, células animais e vegetais. O equipamento é composto por dois cilindros concêntricos, sendo o interno rotante e dividido em três compartimentos para separar meio de cultura, células e solução de nutrientes. O biorreator descrito nesse documento pode ser classificado como biorreator de perfusão, diferenciando-se assim do objeto da presente invenção, pois não adota a concepção de escoamento em vórtices de Taylor.

[020] A patente U.S. 5.155.035 apresenta um biorreator de perfusão baseado no ambiente de microgravidade para o cultivo de células de mamíferos e um método para efetuar os cultivos nesse tipo de sistema. No biorreator, o meio de cultura gira ao redor

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7/21 do eixo horizontal e as partículas são mantidas suspensas no liquido a baixas tensões de cisalhamento. O documento não objetiva o projeto e construção de um biorreator de escoamento em vórtices de Taylor.

[021] Seguindo a premissa de descrição de procedimento, a publicação WO 2005/007269 relata a metodologia e o instrumento empregados para a produção de proteínas. Essa publicação utiliza um biorreator de perfusão para o cultivo de células de mieloma e, combinado ao equipamento um sistema de filtração externo possibilita a separação da proteína expressada no meio de cultura. O invento descrito no documento apresenta um conceito diferente de um biorreator de escoamento em vórtices de Taylor. [022] Na patente U.S. 4.876.013 são descritos o Inétodo e vários instrumentos a serem utilizados durante um processo de filtração, preferencial mente através do uso de membranas semipermeáveis. Esse método e seus vários dispositivos são empregados em processos como ultrafiltração, osmose reversa, diálise, pervaporação e núcrofiltração utilizando o regime de escoamento em vórtices de Taylor. O equipamento é composto por dois cilindros concêntricos, sendo o interno rotante através da utilização de um motor. [023] A membrana plana semipermeável está localizada na parede do cilindro interno e o material a ser filtrado é transportado axialmente através do espaço anular. O transporte de massa pode aumentar em. uma ordenl de grandeza o fluxo de filtração (i.e., a velocidade de escoamento do filtrado por unidade de área de filtro) com relação à filtração tangencial convencional. Além disso, o escoamento em vórtices é empregado para ajudar a Inanter a superfície da membrana desobstruída durante processos contínuos de filtração. O equipamento descrito no documento U.S. 4.876.013 é empregark) no processo de filtração e não para o cultivo celular.

[024] A patente U.S. 5.968.355 refere-se à construção de um equipamento baseado no conceito de escoamento em vórtices de Taylor e empregado no processamento asséptico de materiais farmacêuticos ou biológicos, incluindo colágeno, géis e semisólidos. O equipamento tem a função de filtrar e concentrar esses materiais. O equipamento é composto por dois cilindros concêntricos, sendo que no espaço anular encontra-se uma membrana semipermeável responsável por separar substâncias.

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8/21 [025] Novamente, trata-se de um instrumento para filtração e concentração asséptica de material biológico e não de um biorreator para o cultivo de células animais e vegetais. [026] A patente U.S. 6.099.730 apresenta a descrição de um equipamento e a metodologia empregada no tratamento do sangue. O instrumento é composto por dois cilindros concêntricos, sendo o interno rotante e o externo estacionário. No espaço anular entre os cilindros é formado o escoamento em vórtices de Taylor. Tanto nas paredes externa do cilindro interno como na interna do cilindro externo estão localizadas membranas semipermeáveis empregadas na remoção de substâncias do sangue consideradas tóxicas. O equipamento utiliza os princípios de separação e reação simultâneas dentro do mesmo com o objetivo de aumentar a eficiência do processo de desintoxicação ou purificação do sangue sem prejudicar as células nele existentes. Como pode ser avaliado, o equipamento em questão, mesmo aplicando o escoamento em vórtices de Taylor, não é utilizado para cultivo de células animais e sim para tratamento clínico.

[027] Conforme pode ser observado, há diversos artigos e patentes empregando o escoamento em vórtices de Taylor em processos biotecnológicos. No entanto, analisando as referências presentes na literatura, não foi encontrado biorreator com as características descritas no presente pedido.

[028] A necessidade por vacinas Virais humanas em meados da década de 1950, especialmente contra a poliomielite, impulsionou os bioprocessos em larga escala de células animais, pois foi o primeiro processo a ser realizado industrialmente, conforme Griffiths, J.B. “Animal cell products, overview” in: Spier, R.E. (Ed.) Encyclopedia of cell technology, New York: John Willey & Sons, V. 1, p. 71- 76. 2000.

[029] Nos últimos 20 anos, tem-se observado um rápido crescimento no número e na demanda por produtos biofarmacêuticos produzidos em processos envolvendo o cultivo de células animais. Atualmente, existem mais de 30 produtos licenciados, sendo a grande parte proteínas recombinantes. Esse aumento deve-se principalmente à eficácia comprovada na obtenção de compostos terapêuticos conforme Butler, M. “Animal cell cultures: recentachievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals”. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 68, p. 283-291, 2005.

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9/21 [030] Com o crescente desenvolvimento de produtos derivados de culturas celulares, a necessidade de desenvolvimento e otimização dos processos de produção torna-se evidente.

[031] Os primeiros biorreatores utilizados para o cultivo de células animais derivavam de fermentadores desenvolvidos para a produção de microrganismos, con1 pouca ou nenhuma modificação na sua estrutura. Essa característica tornavaos inadequados para o cultivo devido às tensões de cisalhamento geradas pelos sistemas de agitação e aeração e que acarretavam danos às células, conforme Cartwright, T. “Animal Cells as Bioreactors”. New York: Cambridge University Press, 1994.184 p.

[032] Assim, com o intuito a atender essa demanda tecnológica, é proposto aqui um biorreator baseado no conceito de escoamento em Vórtices de Taylor para cultivo celular, com eficiente transferência de calor e massa e baixas tensões de cisalhamento. O dito biorreator é composto basicamente por dois cilindros concêntricos, sendo o interno rotante e o externo estacionário. A partir da rotação do cilindro interno acima de um valor crítico, inicia-se a formação de vórtices toroidais sobrepostos ao fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular entre os dois cilindros. Esse biorreator é descrito e reivindicado no presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [033] De um modo amplo, a invenção trata de um biorreator de escoamento em Vórtices de Taylor (BEVT), dito biorreator compreendendo:

a) um corpo interno rotante de forma essencialmente cilíndrica dotado de parede externa e fixado a um eixo tubular vazado para passagem dos gases a serem absorvidos pelo meio de cultura;

b) de modo concêntrico ao dito corpo interno, um corpo externo estacionário de forma essencial mente cilíndrica, dotado de parede interna separada da parede externa do corpo interno rotante, de modo a definir um espaço anular a ser ocupado pelo meio de cultura que contém as células em cultivo, a parte inferior do dito corpo externo sendo dotada de trocador de calor e de receptáculos tubulares laterais para permitir a introdução dos eletrodos (pH e oxigênio dissolvido) e um duto pequeno para coleta de amostras;

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c) uma membrana tubular polimérica, densa e altamente permeável aos gases, tal como as fabricadas em silicone, a dita membrana estando enrolada ao redor de todo o dito corpo interno, possibilitando eficiente transferência, por difusão, dos gases contidos no interior da membrana para o meio de cultura;

d) tampa superior afixada a ditos corpos interno e externo, a dita tampa sendo dotada de orifícios para a introdução de soluções e para saída de gases presentes no espaço superior interno do biorreator;

e) tampa inferior;

f) selo mecânico e mancai fixados na parte superior da dita tampa superior, sendo o mancai dotado de orifícios para entrada dos gases; e

g) dispositivo de agitação responsável por girar o dito corpo interno através de acionamento magnético e composto por um disco na base do cilindro interno contendo ímãs permanentes, enquanto outro disco semelhante é localizado externamente em uma estrutura de metal, também com ímãs permanentes, mas de polaridades opostas, exercendo uma força de atração, dito disco externo sendo acionado pela ação de motor elétrico, de modo que quando a .rotação do dito corpo interno superar um valor crítico, inicia-se a formação de vórtices toroidais sobrepostos sobre o fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular entre os dois ditos cilindros interno e externo, e onde

h) as relações geométricas entre os raios dos cilindros interno e externo e a razão de aspecto, não estando limitadas a essas, são como segue:

Razão entre os raios:

Razão de aspecto:

r-i d

[034] Com razão entre os raios (n) variando tipicamente de 0,1 a 0,99 e a razão de aspecto (F) variando tipicamente de 0,5 a 100.

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11/21 [035] Ar, oxigênio, gás carbônico, nitrogênio ou mistura qualquer de gases são injetados no biorreator através dos orifícios existentes no mancai, percorrem todo o eixo tubular vazado e se difundem do interior da membrana tubular de silicone para o meio de cultura. [036] A invenção provê um biorreator de escoamento em vórtices de Taylor que compreende, basicamente: cilindro externo, cilindro interno, membrana tubular, trocador de calor e o conjunto formado por selo mecânico e mancai, localizado no topo da tampa superior.

[037] A invenção provê também um biorreator com escoamento tipo vórtices de Taylor dotado de eficientes dispositivos para a transferência de calor e massa, apresentando baixas tensões de cisalhamento.

[038] A invenção provê também um biorreator com escoamento tipo Vórtices de Taylor com ausência de rompimento de bolhas na interface gás-líquido devido à utilização de membrana tubular polimérica densa e altamente permeável aos gases, como as fabricadas em silicone.

[039] A invenção provê também um biorreator com escoamento tipo Vórtices de Taylor de fácil escalonamento do sistema de aeração através do uso de membranas tubulares mais extensas.

[040] A invenção provê, adicionalmente, UHI biorreator com escoamento tipo Vórtices de Taylor onde o escalonamento depende da manutenção das relações geométricas que permitem a formação dos Vórtices.

[041] A invenção provê também um biorreator de escoamento em Vórtices de Taylor favorável para os cultivos de células animais, mas não limitado a essas, tanto em suspensão como ancoradas a microcarregadores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [042] A FIGURA 1. anexa <ê uma representação esquemática do biorreator objeto da invenção.

[043] A FIGURA 2 anexa é um desenho esquemático em corte frontal do biorreator da invenção. A FIGURA ZA ilustra a tampa superior do biorreator. A FIGURA 2B é o corte do próprio biorreator.

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12/21 [044] A FIGURA 3 anexa é uma reprodução esquemática da tampa superior do biorreator da invenção contendo orifícios, mancai e selo mecânico.

[045] A FIGURA 4 anexa apresenta os resultados experimentais dos valores do coeficiente volumétrico global de transferência de oxigênio (Bga), obtidos no BEVT, em função do número de Reynolds rotacional e em diferentes vazões de ar no interior da membrana tubular. As barras de erro correspondem ao desvio padrão dos experimentos efetuados em triplicatas.

[046] O ANEXO 1 é uma fotografia do biorreator objeto da presente invenção. O biorreator é composto por dois corpos cilíndricos concêntricos. O corpo cilíndrico ou cilindro externo permanece estacionário enquanto o interno é rotante. Abaixo do BEVT, encontra-se o acionador mecânico com o sistema de controle da velocidade de rotação do cilindro interno.

[047] O ANEXO 2 é outra fotografia do BEVT.

[048] O ANEXO 13 é uma fotografia da invenção com destaque para o cilindro interno rotante, a tampa superior do biorreator e a membrana tubular ao redor do dito cilindro interno.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [049] O escoamento em vórtices de Taylor e adequado principalmente para os cultivos envolvendo células sensíveis ao cisalhamento, como as células animais e vegetais, pois a transição do escoamento de Couette para o fluxo de Taylor gera como efeito global a redução do cisalhamento. Essa diminuição da tensão de cisalhamento (tangencial) devese a decomposição, pelo vórtice, da tensão aplicada pelo cilindro interno nos três componentes: axial, radial e tangencial.

[050] Essa condição proporciona um padrão de escoamento bem definido e com adequada mistura do meio de cultura, garantindo condições favoráveis de pH, oxigênio dissolvido, temperatura e nutrientes para as células. Fato diferente do observado em outros sistemas empregados para o cultivo celular, como frasco do tipo Spinner, garrafas giratórias (também denominadas de roller bottles) e biorreatores convencionais, como do tipo tanque agitado.

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13/21 [051] Os modelos de escoamento em vórtices de Taylor baseiam-se no número de Taylor (Ta) ou no número de Reynolds rotacional (Re_e). Ambos os números são adimensionais e refletem o mesmo conteúdo de informação sobre a condição fluidodinâmica do sistema, que consiste na razão entre forças centrífugas e Viscosas.

[052] No decorrer das pesquisas da Requerente que conduziram aos resultados que compõem o presente pedido, foi selecionado o número de Reynolds rotacional (Re_e), conforme Equação 1.

V sendo, o a velocidade de rotação do cilindro interno; rh“ o raio do cilindro interno; d o espaço anular entre os dois cilindros e v a Viscosidade cinemática do fluido em questão. Com Re_e de pelo menos 90.

[053] Os bioprodutos a serem obtidos com auxílio do presente biorreator são aqueles produzidos a partir do cultivo de células, como proteínas recombinantes, anticorpos monoclonais, vacinas virais e produtos obtidos de ácidos nucléicos, assim como também as próprias células, que é o caso típico da expansão de células tronco.

[054] Um aspecto da invenção é um biorreator de escoamento em vórtices de Taylor para o cultivo celular.

[055] O dispositivo objeto da presente invenção, denominado de biorreator de escoamento em vórtices de Taylor (BEVT), resultou das pesquisas da requerente destinadas a suprir a atual carência de biorreatores apropriados para o cultivo celular. [056] As principais características do BEVT são as eficientes transferências de calor e massa associada a baixas tensões de cisalhamento. [0001] Tais características têm como finalidades proporcionar elevada densidade celular e consequentemente, aumento da produtividade do produto desejado.

[057] O BEVT possui configuração não-convencional quando comparado com outros biorreatores convencionais, como os do tipo tanque agitado e os com agitação pneumática (“airlift” e coluna de bolhas).

[058] O BEVT é composto por dois corpos de forma essencialmente cilíndrica, concêntricos, sendo o interno rotante e o externo estacionário. A partir da rotação do

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14/21 cilindro interno acima de um determinado valor crítico, inicia-se a formação de vórtices toroidais sobrepostos ao fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular entre os dois cilindros. 0 escoamento em Vórtices é determinado pela velocidade de rotação do corpo interno, pela razão entre os raios dos cilindros e pela viscosidade cinemática do meio.

[059] O corpo interno rotante é dotado de parede externa e fixado a um eixo tubular vazado para fornecimento de gases absorvidos pelo meio de cultura. O corpo externo estacionário é dotado de parede interna separada da parede externa do corpo rotante, de modo a definir um espaço anular a ser ocupado em parte pela membrana tubular e em parte pelo meio de cultura contendo as células.

[060] Vantajosamente, a invenção utiliza uma membrana tubular polimérica densa e altamente permeável aos gases, localizada ao redor de todo o corpo cilíndrico interno. [061] O objetivo do emprego dessa, membrana e C) de fornecer, por difusão para o HEiO de cultura, os gases necessários ao cultivo celular e assim evitar a destruição celular devido ao rompimento de bolhas na interface gás-líquido do biorreator.

[062] O biorreator compreende adicionalmente um dispositivo que possibilita girar o dito corpo interno através de acionamento magnético, pois o dito corpo interno possui ímãs permanentes em sua base, enquanto outro disco semelhante, também COHI ímãs permanentes, com polaridades opostas aos do dito corpo interno, localizado externamente em uma estrutura de metal, é acionado pela ação de motor elétrico e que permite controlar a velocidade de rotação do dito corpo interno.

[063] A invenção será descrita a seguir por referência às Figuras e anexos. No entanto, deve ficar claro para os especialistas que, muitas modificações e variações são possíveis a partir das modalidades apresentadas dentro do escopo da invenção.

[064] Na Figura 1, é apresentado o desenho esquemático do biorreator da invenção, denominado de biorreator de escoamento em. vórtices de Taylor (BEVT). O biorreator é designado de modo geral pelo numeral (100).

[065] Na modalidade apresentada, o BEVT foi projetado com volume útil de 1,0 L sendo esse definido pelo espaço anular (d) entre os dois cilindros concêntricos (1) e (2). O cilindro externo (1) é constituído na parte superior por uma dorna fabricada em vidro

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15/21 boro-silicato e na parte inferior por trocador de calor (24) confeccionado em material, inoxidável, como aço inox 316L, não estando limitado a esse. A função do trocador de calor (24) é manter a temperatura, dentro do biorreator (100), no valor selecionado para o cultivo que se pretende efetuar. Para isto, água derivada de um banho termostático externo (não representado na Figura) é empregada para circular pelo trocador de calor (24). O trajeto do líquido pode ser visualizado na Figura 1, sendo a entrada (10) e saída (11) do trocador de calor (24) através dos orifícios presentes no dito biorreator (100). [066] Nos receptáculos tubulares fixados à parede vertical do corpo inferior metálico (24) do biorreator são introduzidos os eletrodos de pH (12) e de oxigênio dissolvido (13). Um pequeno duto (14), também fixado nessa parede, serve para coleta de amostras. Os eletrodos ((12) e (13)) são acoplados a medidores/transmissores externos (não representados na Figura) comercial mente disponíveis.

[067] O cilindro interno (2) é fabricado em polímero resistente à alta temperatura, como polipropileno, sem estar limitado a esse, e fixado a um eixo tubular vazado (5) fabricado em material inoxidável, como o aço inox 3I6L, sem estar limitado a esse.

[068] Ao redor de todo o cilindro interno (2), encontra-se enrolada uma membrana tubular polimérica densa (6) e altamente permeável aos gases, como ar, gás carbônico, oxigênio, nitrogênio (Ml mistura ck; qualquer de gases. O percurso dos gases (ar, gás carbônico, oxigênio, nitrogênio ou mistura de qualquer de gases) no interior do BEVT (100) pode ser acompanhado na Figura 2.

[069] Os gases introduzidos no biorreator (100) pelos orifícios (7) presentes no mancai (8), escoam pelo interior do dito eixo tubular (5), sente na base (22) do cilindro interno (2) e através de uma conexão (25) passam para a dita membrana tubular (6). A transferência dos gases para o interior do biorreator e, consequentemente, para o meio de cultura se faz através do mecanismo de difusão através da parede da dita membrana tubular polimérica (6).

[070] Esse sistema, além de proporcionar o provimento dos gases para o meio de cultura, evita o surgimento e, consequentemente, o rompimento de bolhas de ar na interface gáslíquido.

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16/21 [071] Após circularem por toda a membrana tubular (6) parte dos gases são liberados no espaço superior interno (26) do biorreator (100). Nesse local, os gases são liberados para o meio externo através de filtros esterilizáveis (28) (vide Anexo 1), instalados nos orifícios (21) existentes na tampa superior (16) do mesmo.

[072] Na Figura 2, é possível visualizar o sistema de agitação do biorreator (100). O cilindro interno (2) é impulsionado pelo acionamento magnético do disco (23) localizado na sua base, fabricado em material inoxidável, como aço inox 316L, sem estar limitado a esse, e contendo no seu interior ímãs permanentes (4).

[073] Outro disco semelhante está localizado externamente na estrutura de Retal (15) (vide Figura 1) também com ímãs permanentes, mas de polaridades opostas, exercendo uma força de atração, e é acionado pela ação de motor elétrico (contido na estrutura de metal (15) e não representado na Figura), possibilitando o controle da velocidade de rotação do cilindro interno (2).

[074] A Figura 3 ilustra o desenho esquemático da tampa superior (16) do biorreator (100). A tampa é fabricada em material inoxidável, como aço inox, sem estar limitada a esse, e possui aberturas (21) que são utilizadas para a adição de soluções, como base, ácido, inóculo e meio de cultura, no interior do biorreator (100). Essas soluções, acondicionadas em recipientes (29) apropriados para esse propósito (Vide Anexo 1), são inseridas no biorreator (100) com o auxílio de bomba peristáltica (30) (vide Anexo 1). Na parte superior da tampa (16) estão fixados o selo mecânico (9) e o mancai (8). Nesse último, aberturas permitem a entrada dos gases (7) (ar, gás carbônico, oxigênio, nitrogênio ou mistura de qualquer de gases) no interior do dito biorreator como mostrado na Figura 2.

[075] Os anexos I, 2 e 3 são fotografias do “Biorreator de Escoamento em Vórtices de Taylor” (BEVT) e detalhes do mesmo.

[076] Na Tabela 1 são mencionadas, como exemplo, características geométricas do BEVT, não estando necessariamente limitadas a essas.

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TABELA 1

Características geométricas

Razão entre os raios: >7 = —

Razão de aspecto: Γ = — d onde, rmt corresponde ao raio do cilindro interno, r_ext é o raio do cilindro externo (1), L corresponde ao comprimento axial do cilindro interno (2) e ci corresponde ao espaço anular entre cilindro interno (2) e cilindro externo (1). A razão entre os raios (n) pode variar de 0,1 a 0,99 e a razão de aspecto (P), por exemplo, de 0,5 a 100, com valores típicos (n=rint/rext), sendo rmt (raio interno) e r_ext (raio externo) está entre 0,30 e 0,90 e a razão de aspecto (r=L/d), sendo L (comprimento do reator) e d (espaço anular entre os dois cilindros) está entre 10 e 60.

[077] Após a conclusão das etapas de projeto e construção do biorreator foram avaliadas as transferências de calor e oxigênio dentro do mesmo.

[078] No decorrer de 10 dias (240h) o biorreator permaneceu ligado e no seu interior foi adicionado meio de cultura DMEM (Dulbeco's Mbdified Eagle's Médium) estéril.

[079] Durante os experimentos, as velocidades selecionadas de rotação do cilindro interno, 50, 100 e 200 rpm, mantiveram-se constantes. Pôde-se observar com os resultados que a temperatura selecionada (37°C) manteve-se constante e que através de coletas diárias de amostras, o meio de cultura permaneceu estéril.

[080] O biorreator (100) apresenta adequada capacidade de transferência de oxigênio para o meio reacional. Essa característica é consequência da formação do escoamento em vórtices de Taylor e da utilização da membrana tubular (6), ao redor de todo o cilindro interno (2).

[081] A determinação do coeficiente volumétrico global de transferência de oxigênio (Ki_a) no BEVT baseou-se no método dinâmico, que utiliza o sinal de resposta do eletrodo de oxigênio imerso no líquido submetido à aeração, conforme Blanch, H. W.; Clark, D. S. “Biochemical Engineering” New York: M. Dekker Inc., 1997. Cap.5, p. 343-452.

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18/21 [082] No BEVT, a determinação de Kha consistiu em experimentos realizados na ausência de células e em diferentes condições de agitação (velocidade de rotação do cilindro interno) e aeração (vazão de ar que escoava no interior da membrana tubular de silicone).

[083] Em um exemplo típico, o biorreator (100) foi operado com 800 mL de meio de cultura DMEM e temperatura de 37°C. As condições operacionais foram: velocidades de rotações do cilindro interno variando entre 25 e 300 rpm e vazões de ar no interior da membrana tubular variando entre 80 e 550 mL.min-¹.

[084] Ao analisar os dados apresentados pelo gráfico da Figura 4, pode-se verificar que o regime de escoamento em Vórtices de Taylor aumenta o transporte de oxigênio quando comparado com outros biorreatores que também empregam esse tipo de membrana. [085] Como exemplo de comparação, experimentos realizados com biorreator do tipo tanque agitado, operado à 80 rpm e com membrana tubular de 50m, (diâmetro externo de 3,2 mm e a espessura da parede de 0,6 mm), resultaram em valores de Kia entre 2 e 3 h1 , conforme publicado em Tonso, A. “Monitoramento e operação de cultivos de células animais em sistemas de perfusão” Tese (Doutorado em Engenharia Química) Departamento de Engenharia Química, Escola Politécnica da Universidade de São Paulo, São Paulo. 2000. Valores semelhantes de lha foram apresentados em Qi, H.N. et al. “Experimental and theoretical analysis of tubular membrane aeration for mammalian cell bioreactors”. Biotechnology Progress, v. 19, p. 1183-1189. 2003.

[086] Nesse trabalho a extensão da membrana tubular foi de 80 m e a espessura da parede da membrana tubular de 0,55 mm.

[087] No experimento realizado no BEVT, operado em condições semelhantes aos biorreatores do tipo de tanque agitado, o valor de Bga foi de 5,5 h'l. ZX vantagenl da invenção foi possibilitar a redução no comprimento da membrana tubular para apenas 7,5 m,.

[088] Um outro aspecto da invenção é o seu funcionamento.

[089] Basicamente, o funcionamento do biorreator da invenção envolve fechá-lo e a seguir introduzir as células (inóculo) através da entrada apropriada, além de soluções de base e ácido para controle do pH, e ainda os gases que são difundidos para o meio de

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19/21 cultura com auxílio de membrana tubular, que provê transferência de oxigênio aperfeiçoada dentro do biorreator.

[090] O bioprocesso inicia acionando o biorreator através de rotação do cilindro interno, de modo que quando esta rotação supera um valor crítico do número de Reynolds rotacional crítico () acima de 90, inicia-se a formação de vórtices toroidais sobrepostos ao fluxo principal e que preenchenl todo o espaço anular entre os dois cilindros, favorecendo o cultivo de células a baixas taxas de cisalhamento. Após a cessação da rotação do motor o cultivo das células é recuperado.

[091] Primeiramente, o biorreator (100) dever ser corretamente fechado (ou vedado) antes de ser autoclavado. Esse procedimento de fechamento é como se segue: o cilindro externo de vidro (1) é composto, em suas extremidades, por flanges (27). As tampas, superior (16) e inferior (17), apresentam sulcos nas faces internas onde são acomodados anéis de vedação (não representados na Figura) autoclaváveis de Viton ou material similar, sem estar limitado a este. Para o fechamento das tampas (16) e (17), os anéis de vedação são encostados nas flanges (27) e quatro parafusos recartilhados e rosqueados (18) são empregados para unir as ditas tampas (16) e (17) aos anéis de fixação (19) e (20), fabricados de material inoxidável, como alumínio e aço inoxidável prensando assim as flanges (27).

[092] Após as etapas anteriores, meio de cultura, células (inóculo), base, ácido são introduzidos pelos orifícios (21) no biorreator (100) através de bomba peristáltica (30). [093] O fornecimento dos gases e através dos orifícios (7) localizados na parte superior do mancai (8). Os gases escoam via o eixo tubular vazado (5), saem na base (22) do cilindro interno (2) e, através de uma conexão (25), passam para a membrana tubular (6). A membrana tubular (6) possibilita o provimento de gases para o meio de cultura por difusão sem o aparecimento de bolhas de ar. Os gases, após circularem por toda a membrana tubular (6), são liberados na parte superior (26) do biorreator. [091] Nesse local, os gases são liberados para o meio externo através de filtros esterilizáveis (28) presentes nos orifícios (21) da tampa superior (16). A temperatura do interior do biorreator é mantida na faixa adequada com auxílio de um trocador de calor (24).

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20/21 [094] Para colocar em andamento o bioprocesso, é acionado o sistema de agitação do biorreator (100). Esse mecanismo é gerado pela rotação do cilindro interno (2), impulsionado pelo acionamento magnético do disco (23) contendo no seu interior quatro ímãs permanentes (4) enquanto outro disco semelhante, também contendo ímãs permanentes, porém com polaridades opostas, e localizado externamente na estrutura de metal (15), é acionado por motor elétrico. A partir da rotação do cilindro interno (2) acima de um valor crítico, inicia-se a formação de Vórtices toroidais sobrepostos sobre o fluxo principal e que preenchem todo o espaço anular (d) entre os dois cilindros. 0 escoamento em vórtices é determinado pela velocidade de rotação do cilindro interno (2), pela razão entre os raios dos cilindros e pela viscosidade cinemática do meio.

[095] Durante os experimentos, amostras são coletadas através da abertura (14) existente na parte inferior do cilindro externo (1). Após o término da reação, há interrupção na rotação do motor, o biorreator e aberto assepticamente e os produtos são coletados e devidamente armazenados.

[096] O biorreator (100) além de apresentar uma concepção inovadora baseada no conceito do escoamento em vórtices de Taylor, tem as vantagens de baixo custo, fácil construção e escalonamento, e mecanismos eficientes de transferência de calor (devido ao trocador de calor situado na parte inferior do equipamento) e de massa.

[097] O biorreator da invenção ainda conta com a possibilidade de instalação de periféricos para monitorar e controlar os parâmetros do cultivo celular.

[098] O presente biorreator emprega o escoamento em vórtices de Taylor para o cultivo tanto de células em suspensão, quanto as dependentes de ancoramento em microcarregadores.

[099] A inovação do biorreator consiste no desenvolvimento de um dispositivo que permite o escalonamento do sistema de oxigenação, aumentando consideravelmente a transferência de oxigênio dentro do equipamento, quando comparado com outros biorreatores de escoamento em vórtices de Taylor que não empregam essa concepção.

[100] Nesse dispositivo, uma membrana tubular é instalada ao redor de todo o cilindro interno.

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21/21 [101] Desta forma, a geometria da área de contato membrana-meio de cultivo é mais favorável, permitindo aumentar a razão área de transferência por volume de reator apenas aumentando a extensão da membrana tubular. A eficiência dessa concepção foi extensamente comprovada por experimentos apresentados na Figura 4 que compõe o presente relatório.

[102] Outra vantagem da invenção em relação ao estado da técnica são as baixas tensões de cisalhamento (entre 0,02 e 0,15 N nr²) e mistura homogênea para possibilitar que nutrientes, geradas no ambiente fluido-dinâmico e a ausência de rompimento de bolhas na interface gás-líquido devido à presença da membrana tubular.

[103] Além disso, tem-se a facilidade do escalonamento do biorreator, desde que mantidas as relações geométricas que possibilitam a formação do escoamento em Vórtices.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

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Anexo 1

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1) Biorreator de escoamento em vórtice de Taylor, caracterizado por possibilitar cultivos de células sensíveis ao cisalhamento e por gerar altas taxas de transferência de oxigênio, compreendendo:

a) um reservatório (26) cilíndrico definido pelo espaço anular (d) situado entre um corpo cilíndrico interno (2) rotante e um corpo cilíndrico externo (1) estacionário, possuindo uma tampa (16) apoiada no corpo cilíndrico externo (1) provida de orifícios (21);

b) um corpo interno rotante (2) cilíndrico dotado de uma parede externa, fixado a um eixo tubular vazado (5), terminando no extremo inferior num disco blindado de aço inox contendo imãs (23);

c) um corpo externo estacionário (1) cilíndrico concêntrico ao dito corpo interno rotante (2), dotado de uma parede interna separada da parede externa do corpo interno rotante (2), por uma distância ou espaço anular (d);

d) base cilíndrica (24) separada do reservatório por parede metálica tendo a função de trocador de calor ao permitir o escoamento de liquido aquecedor para controle da temperatura da fase biótica sendo processada no espaço anular (d); dotado de receptáculos tubulares laterais (12 e 13) para alojar eletrodos de pH e oxigênio dissolvido, respectivamente; um pequeno duto (14) para coleta de amostras e mais dois dutos pequenos(ft) e 11) para permitir a entrada e saída de líquido aquecedor;

e) uma membrana tubular polimérica (6) permeável aos gases, enrolada ao redor de todo o dito corpo interno rotante (2), onde há uma conexão (25) no extremo inferior para possibilitar o direcionamento do ar alimentado pelo extremo superior do eixo (7) para o interior da dita membrana, onde o oxigênio é transferido através da parede por difusão ao meio de cultura sem o aparecimento de bolhas de ar;

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2 - d

20 17

2/3

Anexo 2

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3/4

FIGURA 3

4/4

FIGURA 4

2) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito disco externo ser acionado por um motor elétrico (15), de modo que quando a rotação do dito corpo interno (2) induzida pela ação magnética, superar um valor do número de Reynolds rotacional crítico (Re*^)) acima de 90, inicia-se a formação de vórtices toroidais (ou de Taylor) sobrepostos ao fluxo principal para preenchimento do espaço anular (d), onde a razão entre os raios dos cilindros internos e externos (rnt /r_ext) varia entre 0,1 e 0,99 e a razão de aspecto L/D ou comprimento/diâmetro (L/D) varia entre 0,5 e 100.

3) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o cultivo asséptico de células vegetais e animais em suspensão ou células animais ancoradas a microcarreadores.

4) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão entre os raios (n=r_int/rext), sendo rmt (raio interno) e r_ext (raio externo) está entre 0,30 e 0,90 e a razão de aspecto (r=L/d), sendo L (comprimento do reator) e d (espaço anular entre os dois cilindros) está entre 10 e 60.

5) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o escalonamento do sistema de aeração compreender aumento no comprimento da membrana tubular (6), enquanto são obedecidas as relações geométricas entre os raios dos cilindros interno e externo.

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6) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser possível a instalação de periféricos para monitorar e controlar os parâmetros (tais, como pH, temperatura e oxigênio dissolvido) do cultivo celular.

7) Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser ainda provido de dispositivos para a transferência de calor e massa, operar com baixas tensões de cisalhamento e possuir um simplificado aumento de escala do sistema de aeração através do uso de membranas tubulares mais compridas e desta forma, prover uma ausência de rompimento de bolhas na interface gás-líquido para evitar morte celular.

8) Bioprocesso para cultivo celular caracterizado por ser conduzido pelo biorreator de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 e compreender:

i. introduzir aos orifícios (21) o meio de cultura, células (inóculo), soluções de base e ácido; e introduzir os gases esterilizados por filtração através dos orifícios (7);

ii. escoar o ar introduzido segundo o item i pelo interior do eixo tubular (5) até que este seja escoado pelo extremo inferior (22) do corpo interno rotante (2);

iii. passar o material liberado segundo o item ii através da conexão (25) para a dita membrana tubular (6);

iv. manter a temperatura do interior do biorreator em faixa adequada (entre 20 e 37 °C) com auxílio de trocador de calor (24) na base cilíndrica mediante circulação de líquido para aquecimento/refrigeração;

v. agitar o líquido ao girar o disco (23) no extremo inferior do corpo interno rotante (2) através de força magnética originada ao fazer girar o disco externo com um motor elétrico (15);

vi. coletar assepticamente amostras através do duto (14);

vii. interromper a rotação do motor e, após o término do bioprocesso, abrir o biorreator assepticamente; e viii. coletar e armazenar os produtos do bioprocesso.

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9) Bioprocesso de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por um gás ou uma mistura de gases percorrerem o eixo tubular vazado (5) e pelo interior da membrana tubular (6) para depois se difundir pela parede permeável da dita membrana em direção ao meio de cultura sem o aparecimento de bolhas de ar para evitar a destruição de células.

10) Bioprocesso de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por os gases serem liberados pelo extremo final da membrana tubular (6) no espaço superior interno do reservatório(26) e subsequente, esse ar é retirado do biorreator através de orifício na tampa (21).

11) Bioprocesso de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pela rotação do cilindro interno (2) gerar movimentação da fase biótica líquida com baixas tensões de cisalhamento (entre 0,02 e 0,15 N nr²) e mistura homogênea para possibilitar que nutrientes, oxigênio dissolvido e temperatura estejam distribuídos homogeneamente.

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f) uma parte superior (26) constituída de uma tampa (16) apoiada sobre o corpo externo (1), provida de orifício no centro para passagem do eixo rotante (5) apoiado no mancai (9) com selo mecânico e de outros orifícios em volta para permitir saída de gases (21), assim como alimentação de meio de cultura, inóculo e solução de ácido e base;

g) dispositivo de agitação magnética composto por um primeiro disco (23) localizado no extremo inferior do cilindro interno (2) contendo ímãs (4) e um segundo disco localizado bem próximo, externamente, embaixo da base cilíndrica do biorreator (15) e contendo ímãs de polaridades opostas.

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Anexo 3