KR102355018B1 - 세포배양장치 - Google Patents

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Abstract

간단한 구조로, 세포에 충분한 영양 공급 및 세포의 충분한 산소 섭취를 가능하게 함으로써, 세포의 대량 배양을 가능하게 하는 세포배양장치를 제공한다. 하단에 평탄한 저부를 구비하는 대략 원주체인 세포배양용기와, 복수의 자성부착체를 주변부에 등간격으로 구비하며, 세포배양용기의 중공 공간부 내에 비접촉 상태에서 수평으로 배치되는 대략 원반형의 접시체와, 복수의 자성부착체를 구비하고 세포배양용기의 외측에 위치하여, 고리 내부에 세포배양용기를 위치시키는 환상체를 구비한다. 환상체와 접시체는, 자력에 의해 연동하여 상하 이동을 하여, 배지의 교반 및 세포에 영양 공급을 실행한다.

Description

세포배양장치
본 발명은, 단순한 동작으로 배지의 교반, 그리고 세포에 영양 공급 및 세포의 산소 섭취를 가능하게 하여, 대량의 세포 배양을 가능하게 하는 세포배양장치에 관한 것이다.
다능성 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기(iPS)세포)는, 그 무한 증식능 및 다분화능으로, 재생의료의 중요한 세포 소스로 인식되고 있다. 줄기세포를 이용한 재생의료로는, 예를 들어, 간경변이나 혈액 질환, 심근경색의 치료, 혈관의 구축, 뼈나 각막의 재생, 이식용 피부의 확보 등을 생각할 수 있다. 재생의료에서는, 배양접시 내에서 줄기세포 등으로부터 목적으로 하는 세포나 장기를 증식시켜, 사람에게 이식하도록 하고 있다. 최근에는, 골수 유래 줄기세포로부터 혈관 신생을 실시하여, 협심증, 심근경색 등의 치료에 성공하였다.
최근, 의약품의 생산이나, 유전자 치료, 재생의료, 면역 요법 등의 분야에서, 줄기세포를 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량 배양하는 세포배양장치가 요구되고 있다.
도 11은, 종래의 세포배양장치를 설명하는 것이다. 도 11에 나타내는 바와 같이, 종래의 세포배양장치는, 제 1 챔버(810), 다공성 스캐폴드(820), 및 제 2 챔버(830)를 구비한다. 제 2 챔버(830)는, 압축 및 감압 가능한 벨로스 형상을 갖는다. 도 11에서는, 제 2 챔버(830)는 비압축 형상이며, 제 2 챔버에 배양용액이 충전된 상태이고, 스캐폴드(820)는 가스 환경에 간접적으로 노출되어 세포는 산소를 섭취한다. 도 12에서는, 제 2 챔버(830)가 압축 형상이 되는 것으로, 배양용액은 위쪽으로 밀어 올려져 제 1 챔버(810) 내로 이동하고, 스캐폴드(820)는 배양용액에 침지되어, 세포는 영양 공급을 받는다. 다시, 도 11로 돌아와, 제 2 챔버(830)가 비압축 형상이 됨으로써, 배양용액은 아래쪽으로 이동하여 제 2 챔버(830)에 배양용액이 충전된 상태가 된다.
그러나, 전술한 세포배양장치에서는, 제 2 챔버(830)는 벨로스 형상이기 때문에, 제 2 챔버(830)로 이동한 세포가 벨로스 형상 외측으로의 볼록 부분으로 들어가고, 그 후에는 제 2 챔버(830)의 압축 및 비압축에 따른 배양용액의 상하 이동의 영향을 받기 어려워져, 산소 섭취가 곤란해질 우려가 있다. 또, 제 2 챔버(830), 특히 중심부는, 압축 상태의 벨로스 형상이더라도, 그 구조로부터 배양액을 제 1 챔버(810)로 완전히 되돌리지 못한다. 그러므로, 다공성 스캐폴드(820)에 세포를 파종하기 위해서는, 제 1 챔버(810)에 세포 현탁액을 넣어 정치시키거나, 혹은 벨로스 형상을 압축 및 비압축시키면서 세포 접착을 시키는데, 사공간(死空間) 및 사용량(死容量)이 발생함에 따라, 접착시킬 수 없는 세포 현탁액이 존재하게 되어 비효율적이다.
특허문헌 1 : 일본 특허 제4430317호
본 발명은, 이러한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 간단한 구조이면서도 세포에 충분한 영양 공급 및 세포의 충분한 산소 섭취를 가능하게 하여, 줄기세포의 대량 배양이 가능한 세포배양장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 관한 세포배양장치는, 하단에 평탄한 저부를 구비하며, 세포를 배양하는 스캐폴드가 충전되는 중공의 공간부를 구비하는 대략 원주체인 세포배양용기와, 자석 또는 강자성체로 이루어지는 복수의 자성부착체를 주변부에 등간격으로 구비하고, 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 수평으로 배치된, 상기 세포배양용기의 대략 원주체의 직경보다도 미소한 직경의 대략 원반형의 접시체와, 상기 접시체 각각의 자성부착체를 자력에 의해 끌어당기도록, 상기 접시체 각각의 자성부착체와 대응하는 자석으로 이루어지는 복수의 자성부착체를 구비하며, 상기 세포배양용기의 외측에 위치하여 고리 내부에 상기 세포배양용기를 위치시키고, 윗방향으로 이동함으로써 자력에 의해 연동하여 상기 접시체를 윗방향으로 이동시켜 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 충전된 스캐폴드를 아래쪽으로부터 밀어 올리고, 아랫방향으로 이동함으로써 자력에 의해 연동하여 상기 접시체를 아랫방향으로 이동시켜 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 충전된 스캐폴드를 중력 낙하시키는, 상하 방향으로 이동하는 대략 링 형상의 환상체를 구비하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 간단한 구조이면서도 세포에 충분한 영양 공급 및 세포의 충분하 산소 섭취를 가능하게 하여, 줄기세포의 대량 배양이 가능해진다.
도 1은, 본 실시형태에 관한 세포배양장치의 외관을 설명하는 도면이다.
도 2는, 본 실시형태에 관한 세포배양장치의 접시체 부근을 상세히 설명하는 도면이다.
도 3은, 본 실시형태에 관한 세포배양장치의 세포배양용기의 저부 부근을 상세히 설명하는 도면이다.
도 4는, 지방 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다.
도 5는, 지방 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, (A)는 배양일수 8일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, (B)는 배양일수 8일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다.
도 6은, 골수 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다.
도7은, 골수 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, (A)는 배양일수 6일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, (B)는 배양일수 6일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다.
도 8은, 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다.
도 9는, 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, (A)는 배양일수 7일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, (B)는 배양일수 7일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다.
도 10은, 본 발명의 세포배양장치를 사용하여 대량 배양한 세포가 다분화 가능함을 나타내는 사진이며, 그 중 (A)는 연골 세포로의 분화를 나타내는 도면이고, (B)는 지방 세포로의 분화를 나타내는 도면이며, (C)는 골 세포로의 분화를 나타내는 도면이다.
도 11은, 벨로스 형상의 챔버가 비압축 형상인 종래의 세포배양장치를 설명하는 도면이다.
도 12는, 벨로스 형상의 챔버가 압축 형상인 종래의 세포배양장치를 설명하는 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태에 대하여 구체적으로 설명하는데, 본 실시형태는 본 발명의 원리 이해를 용이하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 하기 실시형태에 한정되는 것이 아니고, 당업자가 이하의 실시형태의 구성을 적절히 치환시킨 다른 실시형태도, 본 발명의 범위에 포함된다.
본 실시형태에 관한 세포배양장치(900)는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 대략 원주체인 세포배양용기(100)와, 대략 원반형의 접시체(200), 및 대략 링 형상의 환상체(300)를 구비한다. 대략 원주체란, 수평면에서의 단면이 원형일 뿐만 아니라, 타원형이나 엽전 형상 등도 포함하는 기둥체이다. 대략 원반형이란, 평면시에서 원형일 뿐만 아니라, 타원형이나 엽전 형상 등도 포함하는 형상이다. 대략 링 형상이란, 평면시에서 원형 환상체일 뿐만 아니라, 타원형 환상체나 엽전 형상의 환상체도 포함하는 형상이다.
세포배양용기(100)는, 상단에 도시되지 않는 개구부를 구비하며, 하단에 평탄한 저부(120)를 구비한다. 세포배양용기(100)는, 세포를 배양하기 위한 스캐폴드가 충전되는 중공의 공간부(130)를 구비한다. 세포배양용기(100)의 상단 개구부로부터는 스캐폴드, 배지, 배양 대상인 세포를 넣을 수 있다.
배양 대상이 되는 세포는, 특별히 한정되는 것이 아니며, 세포 장애를 받기 어려운 세포 및 세포 장애를 받기 쉬운 세포 모두 가능한데, 바람직하게는 세포 장애를 받기 쉬운 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 배아줄기(ES)세포, iPS 세포, 체성줄기세포 등을 들 수 있다. 체성줄기세포로는, 예를 들어 지방 유래나 골수 유래의 간엽계 줄기세포가 바람직하다. 또, 사용되는 배지는 액체 배지이며, 예를 들어 글루코스 등을 포함한다.
세포배양용기(100)의 치수는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 용적이 250㎖(구경 100㎜, 높이 50㎜, 바닥 100㎜), 500㎖(구경 100㎜, 높이 100㎜, 바닥 100㎜) 또는 1000㎖(구경 100㎜, 높이 200㎜, 바닥 100㎜) 등으로 할 수 있다.
세포배양용기(100)는, 세포가 용기 내벽에 부착하기 어려운 세포 비접착성 용기이며, 예를 들어 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 등 부착성이 낮은 플라스틱제, 혹은, 불소 가공, 실리콘 가공과 같은 소수성 표면 가공을 한 플라스틱제 또는 유리제 용기이다.
세포배양용기(100)에서 배양된 세포에는, 진동장치(700)의 진동부(710)에 의해 상하 방향의 진동이 가해진다. 진동장치(700)는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 볼텍스(Vortex)이다.
세포배양용기(100)의 공간부(130)에 충전되는 스캐폴드는, 예를 들어 3차원 다공성 스캐폴드이다. 3차원 다공성 스캐폴드는, 예를 들어 평균 간극률이 50 ~ 90%, 바람직하게는 80 ~ 90%이며, 평균 기공 크기가 10 ~ 800㎛, 바람직하게는 200 ~ 400㎛이다. 스캐폴드는, 단일 스캐폴드, 또는, 복수의 세포 지지 소편의 집합체로 이루어지는 스캐폴드이다. 스캐폴드의 배양 면적은 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 800 ~ 900000㎠이며, 바람직하게는 800 ~ 45000㎠이다. 스캐폴드가 복수의 세포 지지 소편의 집합체로 이루어지는 스캐폴드인 경우, 예를 들어, 열가소성 수지제 섬유로 이루어진 섬유 집합체(부직포, 직물, 편물 등)여도 되고, 열가소성 수지를 미리 혼련한 후, 성형하여 제작한 시트의 집합체여도 된다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 접시체(200)는, 복수의 자성부착체(210)를 주변부에 등간격으로 구비한다. 접시체(200)는, 예를 들어 두께 15㎜, 외경 95㎜, 내경 68㎜이다. 자성부착체(210)는, 자석 또는 강자성체로 이루어진다. 자석은 영구자석 또는 전자석이며, 강자성체는, 예를 들어 철, 코발트, 니켈을 주성분으로 하는 금속이다. 자성부착체(210)의 형상은, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 직경 10㎜, 높이 10㎜의 원주체로 할 수 있다. 본 실시형태에서는, 6개의 자성부착체(210)를 대략 원반형 접시체(200)의 주변부에 60도 등간격으로 구비한다. 자성부착체(210)의 자력은, 예를 들어 영구자석은 4500 ~ 4800가우스이며, 철의 경우는 0가우스이다. 접시체(200)는, 세포배양용기(100)의 중공 공간부 내에 수평으로 배치된다. 대략 원반형의 접시체(200)는, 세포배양용기(100)의 대략 원주체의 직경보다도 미소한 직경을 갖는다. 구체적으로는, 세포배양용기(100)의 대략 원주체의 내경을 D1이라 하면, 대략 원반형의 접시체(200)의 직경(D2)은 0.90D1 ~ 0.998D1이라 할 수 있다. 이 때문에, 대략 원반형의 접시체(200)는, 세포배양용기(100)의 내면에 접촉하지 않는다. 또한, 대략 원반형의 접시체(200)의 외주부에 등간격으로 배치된 바퀴를 설치하고, 이들 바퀴와 세포배양용기(100)의 내면을 접촉시키는 것은 가능하다.
대략 링 형상의 환상체(300)는, 세포배양용기(100)의 외측에 위치하여 고리 내부에 세포배양용기(100)를 위치시킨다. 환상체(300)의 두께는, 예를 들어 접시체(200)와 같으며 15㎜이다. 대략 링 형상의 환상체(300)는, 접시체(200) 각각의 자성부착체(210)와 대응하도록 자석으로 이루어진 복수의 자성부착체(310)를 구비한다. 자성부착체(310)의 형상은, 특별히 한정되는 것은 아니나, 자성부착체(210)와 마찬가지로, 예를 들어 직경 10㎜, 높이 10㎜의 원주체로 할 수 있다. 자성부착체(310)의 자력은, 예를 들어 영구자석은 4500 ~ 4800가우스이다. 접시체(200) 각각의 자성부착체(210)가 자석이며, 각각의 자석은 한쪽 극을 용기 외측 방향으로 향하게 하여 접시체(200)에 배치되고, 또, 환상체(300) 각각의 자석인 자성부착체(310)는 접시체(200)의 자석과 대응하도록, 다른 쪽 극을 용기 내측 방향으로 향하게 하여 환상체(300)에 배치될 수도 있다. 예를 들어, 접시체(200)가, S극을 용기 외측 방향으로 향하게 한 6개의 영구자석을 구비하는 경우, 환상체(300)는, 이들 6개의 영구자석과 각각 대응하도록, N극을 용기 내측 방향으로 향하게 한 6개의 영구자석을 구비한다. 또, 예를 들어 자성부착체(210)가 철이고, 극성을 갖지 않는 경우, 자성부착제(310)는 용기 내측 방향에 대하여, N극 또는 S극의 어느 쪽이든 상관없다. 접시체(200)의 자성부착체(210)의 한쪽(예를 들어 자석의 S극) 단부와, 환상체(300)의 자성부착체(310)의 다른 쪽(예를 들어 자석의 N극) 단부 사이의 거리는, 예를 들어 0.1㎜ ~ 10.0㎜이다. 환상체(300) 각각의 자성부착체(310)와, 접시체(200) 각각의 자성부착체(210)는 대응하기 때문에, 환상체(300)의 높이(즉, 연직방향의 위치)와 접시체(200)의 높이는 일치한다.
접시체(200)의 중앙부에는 복수의 관통공(220)이 형성된다. 관통공(220)의 구멍 지름은, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 1㎜ ~ 5㎜로 할 수 있다.
환상체(300)는, 승강장치(320)에 의해 지지되며 또한 상하 이동을 한다. 환상체(300)는 상하 이동하기 때문에, 자력에 의해 환상체(300)와 연동되는 접시체(200)도 상하 이동한다. 이에 의해, 배지의 교반, 그리고 세포의 산소 섭취 및 세포로의 영양 공급이 가능해진다. 환상체(300)의 상하 이동 운동은, 예를 들어 단진동 운동, 또는 대략 단진동 운동이다. 환상체(300)의 상하 이동 주기는, 예를 들어 0.5회/시간 ~ 12.0회/시간으로 할 수 있다. 대략 단진동 운동은, 예를 들어, 아래쪽으로부터 위쪽으로 이동하여 일정 시간 정지한 다음, 위쪽으로부터 아래쪽으로 이동하여 일정 시간 정지하고, 다시 아래쪽으로부터 위쪽으로 이동하는 운동의 반복운동이다. 환상체(300)의 상하 이동 스트로크 길이는, 세포배양용기(100)의 높이보다도 작으며, 예를 들어 20㎜ ~ 120㎜로 할 수 있다. 환상체(300)의 윗방향 또는 아랫방향으로의 이동 속도는, 예를 들어 0.5㎜/초 ~ 10.0㎜/초로 할 수 있다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 세포배양용기(100)는, 그 저부(120)의 중앙부에 위쪽으로 돌출하는 내부가 공간부인 저부 볼록부(125)를 구비한다. 바꾸어 말하면, 세포배양용기(100)는, 그 저부(120)의 중앙부에 저부 볼록부(125)에 대응하는 형상의 저부 오목부(126)를 구비한다. 예를 들어, 세포배양용기(100)의 저부(120) 직경이 100㎜일 경우, 저부 오목부(126)의 깊이는 8㎜이며, 저부 오목부(126)의 내부 직경은 60㎜이다. 진동장치(700)의 진동부(710)는, 저부 오목부(126)에 틈새없이 끼워진다.
접시체(200)는, 세포배양용기(100)의 저부 볼록부(125)가 끼워지는 접시 오목부(230)를 그 하면 중앙부에 구비한다. 또한, 도 3에서는, 세포배양용기(100)의 저부 볼록부(125)와, 접시체(200)의 접시 오목부(230)와의 사이에는 간극이 기재되어 있으나, 저부 볼록부(125)는 접시 오목부(230)에 간극 없이 끼워지는 것이어도 된다.
다음으로, 본 실시형태에 관한 세포배양장치의 사용 양태에 대하여 설명한다.
먼저, 세포배양용기(100)의 중공 공간부(130) 내에 배치된 접시체(200)를, 세포배양용기(100)의 하부 근방에 위치시킨다. 이 경우, 환상체(300)의 높이와 접시체(200)의 높이는 일치하기 때문에, 환상체(300)도 세포배양용기(100)의 하부 근방에 위치한다. 그리고, 세포배양용기(100)의 상단의 도시되지 않은 개구부로부터, 세포배양용기(100)의 공간부(130)로 스캐폴드, 배지, 및 배양 대상인 세포를 넣는다.
다음으로, 세포배양용기(100)의 하부 근방에 위치해 있던 환상체(300)를 윗방향으로 이동시킨다. 환상체(300) 각각의 자성부착체(310)와 접시체(200) 각각의 자성부착체(210)는 대응하며, 자력에 의해 환상체(300)와 접시체(200)가 연동하여, 접시체(200)도 윗방향으로 이동한다. 접시체(200)가 윗방향으로 이동함으로써, 세포배양용기(100)의 중공 공간부(130) 내에 충전된 스캐폴드 및 스캐폴드에 부착된 세포는, 접시체(200)에 의해 아래쪽으로부터 밀어 올려져 위쪽으로 이동한다. 접시체(200)는 위쪽으로 이동하지만, 접시체(200)의 중앙부에는 복수의 관통공(220)이 형성되어 있기 때문에, 세포배양용기(100)의 공간부(130) 내의 배지는 위쪽으로 밀려 올라가지 않고 관통공(220)을 통과하며, 이 때 배지가 교반된다.
다음으로, 환상체(300)는, 접시체(200)를 세포배양용기(100)의 상부 근방에 위치시키고 이동을 멈춘다. 접시체(200)가 세포배양용기(100)의 상부 근방에 위치한다는 것은, 세포배양용기(100)의 높이를 L(높이(L)는, 세포배양용기(100)의 상단 개구부로부터 저부(120)까지의 거리로 함)로 하면, 접시체(200)가 세포배양용기(100)의 상단으로부터 아래쪽으로, 예를 들어 0.3L ~ 0.7L의 거리만큼 떨어진 위치이다. 접시체(200)가 세포배양용기(100)의 상부 근방에 위치하는 경우, 배지는 위쪽으로 밀어 올려지지 않기 때문에, 예를 들어 세포는 산소를 섭취할 수 있다.
다음으로, 환상체(300)를 아랫방향으로 이동시킨다. 자력에 의해 환상체(300)와 접시체(200)가 연동하여, 접시체(200)도 아랫방향으로 이동한다. 접시체(200)가 아랫방향으로 이동함으로써, 스캐폴드 및 스캐폴드에 부착된 세포는 중력 낙하하고, 배지에 침지되어 세포는 영양 공급을 받는다.
환상체(300)는, 접시체(200)를 세포배양용기(100)의 하부 근방에 위치시키고 이동을 멈춘다. 접시체(200)가 세포배양용기(100)의 하부 근방에 위치한다는 것은, 접시체(200)의 접시 오목부(230)가 세포배양용기(100)의 저부 볼록부(125)에 틈새없이 끼워진 위치로부터, 세포배양용기(100)의 저부(120)로부터 위쪽으로, 예를 들어 0.01L ~ 0.2L의 거리만큼 떨어진 위치까지를 포함한다.
그 후 다시, 환상체(300)를 윗방향으로 이동시킨다. 이와 같이, 환상체(300) 및 자력에 의해 연동하는 접시체(200)는 함께 상하 이동한다.
배양 후에는, 접시체(200)의 접시 오목부(230)를 세포배양용기(100)의 저부 볼록부(125)에 틈새없이 끼우고, 또, 진동장치(700)의 진동부(710)를 세포배양용기(100)의 저부 오목부(126)에 틈새없이 끼운다. 이 상태에서 진동장치(700)를 작동시켜, 진동부(710)로부터, 예를 들어 상하 방향의 진동을 세포배양용기(100) 내의 배양 세포에 전달한다. 이로써, 3차원 다공성 스캐폴드 깊숙이 매몰된 배양 세포를 회수하기 쉬워진다.
실시예
(실시예 1)
세포배양용기의 중공 공간부 내에 배치된 접시체를, 세포배양용기의 하부 근방에 위치시켰다. 세포배양용기의 상단 개구부로부터, 세포배양용기의 공간부에 스캐폴드, 배지, 및 배양 대상인 세포를 넣었다. 세포는 5.0×107개의 지방 유래 간엽계 줄기세포(ADSC)였다. 스캐폴드는, CESCO사의 BioNOC II 매트릭스를 5000장 사용하였다(3D 배양). 환상체의 상하 이동 스트로크 길이는 60㎜, 환상체의 윗방향 또는 아랫방향으로의 이동 속도는 1.0㎜/초로 하였다. 환상체의 상하 이동 주기는 1.0회/시간으로 하였다. 배양일수는 8일이었다.
도 4는, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다. 세포의 당소비량은, GlucCell 핸디 글루코스 모니터(CESCO사)를 이용하여 측정하였다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 적절히 세포가 배양된 것으로 나타났다.
8일째에, 세포배양용기 내로부터 3.2×108개의 대량의 ADSC를 회수하였다. 또한, 3차원 다공성 스캐폴드의 깊숙이 매몰된 배양 세포에 손상을 주지 않고 효율적으로 회수하기는 곤란하지만, 배양 후에, 세포배양용기 내에 트립신-EDTA 및 카제이나제를 갖는 효소 용액을 첨가하여 배양 세포에 효소 처리를 실시함으로써, 세포배양용기로부터 대량으로 배양 세포를 회수할 수 있다. 도 5(A)는, 배양일수 8일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, 도 5(B)는, 배양일수 8일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다. 도 5로부터, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 대량의 배양 세포가 적절히 회수되었음을 이해할 수 있다.
비교예로서, 스미토모 베이클라이트사의 세포 배양용 샬레(2D 배양)에 5.0×107개의 ADSC를 파종하고, 배양일수 8일로 배양하였다 하기 표 1은, 본 실시예에 관한 세포배양장치(3D 배양)를 사용한 배양 세포의 성질과, 비교예에 관한 배양접시(2D 배양)를 사용한 배양 세포의 성질을 나타낸다. 표 1에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용하여 배양된 세포는, 종래의 배양 접시에 의해 배양된 세포와 성질은 동일하였다.
[표 1]
Figure 112020004336046-pct00001
(실시예 2)
실시예 1에서는 세포가 ADSC였지만, 실시예 2에서는 골수 유래 간엽계 줄기세포(BMSC)의 배양을 시도한다.
세포배양용기의 중공 공간부 내에 배치된 접시체를, 세포배양용기의 하부 근방에 위치시켰다. 세포배양용기의 상단 개구부로부터, 세포배양용기의 공간부에 스캐폴드, 배지, 및 배양 대상인 세포를 넣었다. 세포는 3.0×107개의 BMSC였다. 스캐폴드는 CESCO사의 BioNOC II 매트릭스를 2000장 사용하였다(3D 배양). 환상체의 상하 이동 스트로크 길이는 40㎜, 환상체의 윗방향 또는 아랫방향으로의 이동 속도는 1.0㎜/초로 하였다. 환상체의 상하 이동 주기는 1.0회/시간으로 하였다. 배양일수는 6일이었다.
도 6은, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다. 세포의 당소비량은, GlucCell 핸디 글루코스 모니터(CESCO사)를 이용하여 측정하였다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 적절히 세포가 배양된 것으로 나타났다.
6일째에, 세포배양용기 내로부터 5.42×108개의 대량의 BMSC를 회수하였다. 배양 후에, 세포배양용기 내에 트립신-EDTA 및 카제이나제를 갖는 효소 용액을 첨가하여 배양 세포에 효소 처리를 실시함으로써, 세포배양용기로부터 대량으로 배양 세포를 회수하였다. 도 7(A)는, 배양일수 6일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, 도 7(B)는, 배양일수 6일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다. 도 7로부터, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 대량의 배양 세포가 적절히 회수되었음을 이해할 수 있다.
비교예로서, 스미토모 베이클라이트사의 세포 배양용 샬레(2D 배양)에 3.0×107개의 BMSC를 파종하고, 배양일수 6일로 배양하였다. 하기 표 2는, 본 실시예에 관한 세포배양장치(3D 배양)를 사용한 배양 세포의 성질과, 비교예에 관한 배양 접시(2D 배양)를 사용한 배양 세포의 성질을 나타낸다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용하여 배양된 세포는, 종래의 배양 접시에 의해 배양된 세포와 성질은 동일하였다.
[표 2]
Figure 112020004336046-pct00002
(실시예 3)
활막 유래 간엽계 줄기세포는, 매우 높은 연골 분화능 및 증식능을 갖고 있어, 연골이나 반월판 재생에 유용하다. 실시예 3에서는, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 배양을 시도한다.
세포배양용기의 중공 공간부 내에 배치된 접시체를, 세포배양용기의 하부 근방에 위치시켰다. 세포배양용기의 상단 개구부로부터, 세포배양용기의 공간부에 스캐폴드, 배지, 및 배양 대상인 세포를 넣었다. 세포는 1.5×107개의 활막 유래 간엽계 줄기세포였다. 스캐폴드는, CESCO사의 BioNOC II 매트릭스를 3000장 사용하였다(3D 배양). 환상체의 상하 이동 스트로크 길이는 45㎜, 환상체의 윗방향 또는 아랫방향으로의 이동 속도는 1.0㎜/초로 하였다. 환상체의 상하 이동 주기는 1.0회/시간으로 하였다. 배양일수는 7일이었다.
도 8은, 배양일수별 세포의 당소비량(㎎/㎗/일)을 나타내는 도면이다. 세포의 당소비량은, GlucCell 핸디 글루코스 모니터(CESCO사)를 이용하여 측정하였다. 도 8에 나타내는 바와 같이, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 적절히 세포가 배양된 것으로 나타났다.
7일째에, 세포배양용기 내로부터 1.2×108개의 대량의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 회수하였다. 배양 후에, 세포배양용기 내에 트립신-EDTA, 카제이나제 및 콜라게나제를 갖는 효소 용액을 첨가하여 배양 세포에 효소 처리를 실시함으로써, 세포배양용기로부터 대량으로 배양 세포를 회수하였다. 효소 용액 중에 있어서, 트립신-EDTA는 1㎎/㎖, 카제이나제는 3.334㎎/㎖, 콜라게나제는 1㎎/㎖였다. 도 9(A)는, 배양일수 7일째의 세포배양용기로부터 회수하기 전의 현미경 사진이고, 도 9(B)는, 배양일수 7일째의 세포배양용기로부터 회수한 후의 현미경 사진이다. 도 9로부터, 본 실시예에 관한 세포배양장치를 사용함으로써, 대량의 배양 세포가 적절히 회수되었음을 이해할 수 있다.
(실시예 4)
대량 배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포의 줄기세포 성질의 유지 및 다분화능을 확인하기 위하여, 실시예 3에 따른 대량 배양 및 회수 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 이용하여, 지방 세포, 연골 세포, 골 세포로의 분화 유도를 실시하였다. 분화 유도에는, R&D System사의 Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit를 사용하였다. 24웰 배양 플레이트에 각각 104개의 세포를 접착시킨 후, 지방 세포로의 분화 유도에는, 키트에 부속된 Adipogenic Supplement와 ITS Supplement를 DMEM 기초 배지 50㎖에 첨가한 분화 배지를 이용하여 14일간 배양하였다. 연골 세포로의 분화 유도에는, 키트에 부속된 Chondrogenic Supplement와 ITS Supplement를 DMEM 기초 배지 50㎖에 첨가한 분화 배지를 이용하여 21일간 배양하였다. 골 세포로의 분화 유도에는, 키트에 부속된 Osteogenic Supplement와 ITS Supplement를 DMEM 기초 배지 50㎖에 첨가한 분화 배지를 이용하여 21일간 배양하였다. 분화 유도 후의 지방 세포, 연골 세포, 골 세포를 동정하기 위하여, 4% 파라포름알데히드 고정 후에 OilRed-O, Alcian Blue, Alizarin Red 염색을 실시하였다. 도 10은, 본 발명의 세포배양장치를 사용하여 대량 배양한 세포가 다분화 가능함을 보여주는 사진이며, 그 중 (A)는 연골 세포로의 분화를 나타내는 사진이고, (B)는 지방 세포로의 분화를 나타내는 사진이며, (C)는 골 세포로의 분화를 나타내는 사진이다. (A)는 Alcian Blue에 의한 염색이며, (B)는 Oil Red O에 의한 염색이고, (C)는 Alizarin Red에 의한 염색이다. 도 10과 같이, 대량 배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 줄기세포 성질 및 다분화능을 유지하였으며, 지방 세포, 연골 세포, 골 세포로 분화하였다.
세포 배양에 이용할 수 있다.
100 : 세포배양용기
120 : 저부
125 : 저부 볼록부
126 : 저부 오목부
130 : 공간부
200 : 접시체
220 : 관통공
230 : 접시 오목부
210 : 자성부착체
300 : 환상체
310 : 자성부착체
320 : 승강장치
700 : 진동장치
710 : 진동부
900 : 세포배양장치

Claims (5)

  1. 하단에 평탄한 저부를 구비하며, 세포를 배양하기 위한 스캐폴드가 충전되는 중공의 공간부를 구비하는 세포배양용기와,
    자석 또는 강자성체로 이루어지는 복수의 자성부착체를 주변부에 등간격으로 구비하고 중앙부에 복수의 관통공을 구비하며, 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 상기 세포배양용기의 내벽과 비접촉 상태에서 수평으로 배치되는, 상기 세포배양용기의 내경보다도 미소한 접시체와,
    상기 접시체 각각의 자성부착체를 자력에 의해 끌어당기도록, 상기 접시체 각각의 자성부착체와 대응하는 자석으로 이루어지는 복수의 자성부착체를 구비하며, 상기 세포배양용기의 외측에 위치하여 고리 내부에 상기 세포배양용기를 위치시키고, 윗방향으로 이동함으로써 자력에 의해 연동하여 상기 접시체를 윗방향으로 이동시켜 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 충전된 스캐폴드를 아래쪽으로부터 밀어 올리고, 아랫방향으로 이동함으로써 자력에 의해 연동하여 상기 접시체를 아랫방향으로 이동시켜, 상기 세포배양용기의 중공 공간부 내에 충전된 스캐폴드를 중력 낙하시키는, 상하 방향으로 이동하는 환상체를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포배양장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 접시체 각각의 자성부착체는 자석이며, 각각의 자석은 한쪽 극을 용기 외측방향으로 향하게 하여 상기 접시체에 배치되며,
    상기 환상체 각각의 자석은 상기 접시체의 자석과 대응하도록, 다른 쪽 극을 용기 내측 방향으로 향하게 하여 상기 환상체에 배치되는 것을 특징으로 하는, 세포배양장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포배양용기는, 그 저부 중앙부에 위쪽으로 돌출하는 내부가 공간부인 저부 볼록부를 구비함과 더불어, 배양된 세포에 상하 방향의 진동을 가하는 진동장치의 진동부가 끼워지는, 상기 저부 볼록부에 대응하는 형상의 저부 오목부를 상기 저부 중앙부에 구비하며,
    상기 접시체는, 상기 세포배양용기의 저부 볼록부가 끼워지는 접시 오목부를 그 하면 중앙부에 구비하는 것을 특징으로 하는, 세포배양장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포배양용기 내에 충전되는 스캐폴드는, 복수의 세포 지지 소편의 집합체인 것을 특징으로 하는, 세포배양장치.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 배양되는 세포는 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 세포배양장치.
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