JP6699837B2 - ３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法 - Google Patents
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Description
本発明は、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法に関し、より詳しくは培養面積の広い３次元多孔性足場から大量の培養細胞を効率的に回収する培養細胞回収方法に関する。
多能性幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞）は、その無限増殖能及び多分化能から、再生医療の重要な細胞ソースとして認識されている。iPS細胞技術は、薬物毒性試験や疾患モデルの確立によって病態解明への応用が可能であることから、近年世界中で研究開発が進められている。多能性幹細胞を用いた再生医療及び創薬研究への応用においては、大量かつ安定的な未分化細胞及び分化細胞の供給が不可欠である。
プレート上で細胞を単層培養する二次元培養に対して、縦方向の厚みを持たせて細胞を培養する手法を三次元培養という。三次元培養は二次元培養よりも生体内の細胞の状態に近いため生体内環境を模した実験モデルの確立に適しているのみならず、大量の細胞培養が可能となる。
特許文献１には、所定直径及び見かけ密度を有する生体適合性ポリマー性繊維の集合体からなる３次元多孔性足場（なお、本明細書において足場をマトリックスと記載することがある。）が記載されており、この３次元多孔性足場を使用する細胞培養方法が記載されている。
特許文献２には、細胞が播種された３次元多孔性足場を密封細胞培養容器内に入れ、その３次元多孔性足場に対してピストンで加圧を行うことで３次元多孔性足場の圧縮変形を行う細胞培養方法が記載されている。
特許文献３には、細胞が播種された３次元多孔性足場が記載されており、その３次元多孔性足場表面に対してマイクロ流体チャンネルを通してマイクロ流体を流動させる細胞培養方法が記載されている。
しかし、上述の３次元多孔性足場にて細胞の大量培養は可能ではあるが、培養された細胞を足場から効率的に回収することは困難である。特に３次元多孔性足場の奥深くに埋没した培養細胞にダメージを与えることなく効率的に回収することは極めて困難である。
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、３次元多孔性足場にて培養された細胞にダメージを与えること無く効率的に回収する、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法を提供することを目的とする。
本発明にかかる培養細胞回収方法は、培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する培養工程と、前記培養容器にトリプシン-EDTA及びカゼイナーゼを有する酵素溶液を添加して、前記培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、水平面内を円運動する台座と前記培養容器とを接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、を有することを特徴とする。
本発明によれば、細胞にダメージを与えること無く、３次元多孔性足場から培養細胞を効率的に回収できる。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
本実施形態にかかる培養細胞回収方法は、細胞を培養する培養工程と、培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、培養細胞に対して振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、を有する。
培養工程では、培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する。培養対象となる細胞は、特に限定されるものでなく、細胞障害を受けにくい細胞及び細胞障害を受けやすい細胞のいずれも可能であるが、好ましくは細胞障害を受けやすい細胞であり、具体的には、ヒト胚性幹(ES)細胞、iPS細胞、体性幹細胞（脂肪や骨髄由来の間葉系幹細胞等）等が挙げられる。
細胞を培養する培養容器は、培養した細胞が容器内壁に付着しにくい細胞非接着性の容器であり、例えばポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の付着性の低いプラスチック製あるいは、フッ素加工、シリコン加工のような疎水性表面加工を施したプラスチック製又はガラス製の容器である。
培養容器の大きさや形状は特に限定されるものではなく、例えばボトル状、フラスコ状、バック状、ウェル状、ディッシュ状等のように培養する細胞に応じて任意の形状及び大きさを選択することが可能であるが、好ましくはボトル状である。例えば底部の外底面が平坦状であるボトル状の培養容器であり、また例えば全体の外観が略円柱形状であり、底部の外底面が平坦状である培養容器である。全体の外観が略円柱形状であり、底部の外底面が平坦状である培養容器としては、例えば容積が250 ml(口径39mm、高さ117mm、底72mm)、500 ml(口径39mm、高さ137mm、底92mm)又は1000 ml(口径39mm、高さ156mm、底107mm)等の培養容器を使用することができる。
３次元多孔性足場は、単一又は複数の足場の集合体のいずれも可能であり、３次元多孔性足場の培養面積は特に限定されるものではないが、例えば800〜900000 cm2であり、好ましくは800〜45000 cm2である。また、３次元多孔性足場は、例えば平均間隙率が50〜90％、好ましくは80〜90％であり、平均ポアサイズが10〜800μm、好ましくは200〜400μmである。
３次元多孔性足場は、例えば、熱可塑性樹脂製の繊維からなる繊維集合体（不織布、織物、編み物等）であってもよいし、熱可塑性樹脂を予め混練した後、成形して作製したシート（例えば、フィルム、プレート、ボード等）であってもよい。熱可塑性樹脂は、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート等が挙げられる。
培養期間は、特に限定されるものではなく、細胞の種類、細胞の播種数等により適宜選択可能であるが、例えば、細胞を播種後５日〜３０日である。通常の培養期間としては、例えば、５日〜１４日、好ましくは７日〜１０日とすることができる。長期の培養期間としては、例えば、１５日〜３０日、好ましくは２２日〜２６日とすることができる。
次に酵素処理工程では、培養容器に、トリプシン-EDTA(以下「T」と表記することがある。)と、カゼイナーゼ(以下「D」と表記することがある。)及び／又はコラゲナーゼ(以下「C」と表記することがある。)と、を有する酵素溶液を添加して、培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う。トリプシン-EDTAにおけるEDTAの含有量は、特に限定されるものではなく例えば1.0w/v％ トリプシンにおいて4.0〜12.0mmol/L EDTAであり、例えば0.05w/v％ トリプシン-0.53mmol/L EDTA、0.25w/v％ トリプシン-1.0mmol/L EDTA、又は、0.5w/v％ トリプシン-5.3mmol/L EDTA等が挙げられる。
コラゲナーゼは、特に限定されるものではなく例えば、MMP（Matrix metalloproteinase）１、２、３、９、１３、１４等のMMPファミリー等が挙げられる。
コラゲナーゼは、特に限定されるものではなく例えば、MMP（Matrix metalloproteinase）１、２、３、９、１３、１４等のMMPファミリー等が挙げられる。
酵素溶液がトリプシン-EDTA及びカゼイナーゼの双方を包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝0.5〜４：１〜２であり、好ましくは２：１である。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5 mg/mlであり、カゼイナーゼでは×１が1000 units (1mg/ml ＝300 units)である。そのため、トリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝２：１とは、1.0 mg/mlのトリプシン-EDTAと3.334 mg/mlのカゼイナーゼとの混合液を意味する。
酵素溶液がトリプシン-EDTA及びコラゲナーゼの双方を包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ＝0.5〜４：１〜４であり、好ましくは２：１である。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5 mg/mlであり、コラゲナーゼでは×１が300 units (1mg/ml ＝300 units)である。
酵素溶液がトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの全てを包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５〜４：１〜６：１〜６である。通常の培養期間の場合はT：C：Dは例えば０．５〜２：１〜２：１〜２であり、好ましくは２：１：１である。長期の培養期間の場合はT：C：Dは例えば２〜４：１〜６：２〜６であり、好ましくは２：４：４である。長期の培養期間の場合、細胞が増殖するため細胞周囲に新たに細胞外マトリックスが産生することがある。そしてこの産生した細胞外マトリックスにより細胞を回収しにくくなるが、後述の実施例で示されているように、本発明者は酵素処理工程における酵素溶液の配合比率を検討することにより、長期の培養期間の場合でも容易な細胞の回収を可能とした。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5mg/mlであり、コラゲナーゼでは×１が300 units (1mg/ml ＝300 units)であり、カゼイナーゼでは×１が1000 units (1mg/ml ＝300 units)である。
なお、培養容器内の溶液量は、３次元多孔性足場が複数の足場の集合体の場合、各足場10個あたり1 mlとすることが可能である。
酵素処理の条件は特に限定されるものではないが、例えば10〜30分、36〜38℃であり、好ましくは15分、37℃である。
なお、酵素溶液には、更に、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン又はプロナーゼ等のタンパク質分解酵素を包含させることも可能である。
次に振動処理工程では、水平面内を円運動する台座と酵素溶液が添加された培養容器の底面とを面接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う。
円運動は好ましくは等速円運動であり、その周波数は例えば20〜100 Hzであり、好ましくは40〜70 Hzである。台座の形状は特に限定されるものではなく、例えば板状、椀状等があげられる。水平面内を円運動する台座は、例えばボルテックスミキサー(以下「V」と表記することがある。)の上部に設けられたゴム製の台座とすることが可能である。板状の台座の場合、台座の上部に凸部を設けることができる。そして、底部が平坦状であるボトル状培養容器の外底面に、その凸部に密着して嵌合する凹部を設けることができる。台座上部の凸部がボトル状培養容器の底部の凹部に密着して嵌合挿入されて、台座の上面と培養容器の底面とが面接触している状態で、台座が水平面内を円運動する場合、台座の円運動が的確に培養容器に伝わる。また、椀状の台座の場合も台座の上部に凸部を設け、そして培養容器の外底面にその凸部に密着して嵌合する凹部を設けることができる。なお、ボルテックスミキサーは、容器の底部を高速旋回して内容液を撹拌する実験器具であり、上向きの電動機に駆動軸の中心からずれた位置にゴム製の台座がついている。
培養容器はその底部を台座に密着させて載置されることが可能であり、また培養容器を逆さまにして容器上部にある蓋部を台座に密着させて載置されることも可能である。更には、培養容器を逆さまにして底部を水平面内を円運動する台座に接触させつつ、蓋部に固定部材を接触させて該固定部材と台座とで培養容器を挟持することも可能である。
水平面内を円運動する台座と接触している培養容器内では、培養細胞に対して鉛直方向の振動が与えられるが、これは下記理由によるものと考えられる。例えば、底部の外底面が平坦状である円柱形状の培養容器をボルテックスミキサーの台座に載置させて振動を培養容器に与えた場合、ボルテックスミキサーの台座は等速円運動しており、容器下部では容器内部の酵素溶液に水平方向の振動が伝わる。容器底部の水平方向の振動により、容器内部の酵素溶液は容器内壁に衝突して、鉛直上向きに移動し、その後重力により鉛直下向きに落下し、これを繰り返すことにより、容器内部の酵素溶液は鉛直上向き及び鉛直下向きの移動を繰り返す。容器内部の酵素溶液の動きは容器内部の３次元多孔性足場に伝わり、その結果、培養細胞に対して鉛直方向の振動が与えられるのである。なお、底部の外底面が円錐状の場合は、渦巻状に内容液が撹拌され、マトリックスも同様に内容液の渦巻流に伴って動作する為、鉛直方向への移動が発生しない。また、容器内部に渦巻流が発生すると容器内部の３次元多孔性足場が酵素溶液の上方へ浮上し、渦巻流中心付近に留まることになり、３次元多孔性足場に振動が伝わりにくいため、振動処理工程では渦巻流の発生を極力抑制することが好ましい。
振動処理の時間は特に限定されるものではないが、例えば10秒〜30分である。
振動処理の時間は特に限定されるものではないが、例えば10秒〜30分である。
なお、振動処理工程では、培養細胞を包含する酵素溶液をノズルにより吸引・吐出を繰り返し行うピペッティング(以下「P」と表記することがある。)により培養細胞に振動を与える振動処理を行うことも可能である。
本実施形態にかかる培養細胞回収方法によれば、例えば培養容器として500 mlのボトルを使用し、その培養容器内に例えば合計培養面積34000 cm2の３次元多孔性足場を封入させ、例えば1x107個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を入れることができる。そして培養後、酵素処理及び振動処理を経ることにより３次元多孔性足場の深部に位置する細胞であっても効率的に３次元多孔性足場から回収できる。しかも本実施形態にかかる発明によれば下記実施例で示すように高い生存率にて効率的に細胞を回収できる。培養容器を複数設置するか又は培養容器の内容積を増大することにより、更に大量の細胞培養及び細胞回収も可能となり、本発明により得られる利益は計り知れない。
（１）実施例１
実施例１では、本実施例にかかる培養細胞回収方法と、酵素処理も振動処理も行わない比較例にかかる培養細胞回収方法とを比較する。
実施例１では、本実施例にかかる培養細胞回収方法と、酵素処理も振動処理も行わない比較例にかかる培養細胞回収方法とを比較する。
許可を得た被験者の腹部から皮下脂肪組織を無菌的に採取した。脂肪組織をコラゲナーゼで処理することで細胞を分散して遠心に供してSVF(Stromal vascular fraction)を回収した。PBS（-）でSVFを洗浄後、DMEM/F12に20 μg/mlの還元型グルタチオン、５ μg/mlのフィブロネクチン及び100 nMのエコチンを加えた初代培養用無血清培地に懸濁し、Tフラスコに播種したうえで、37℃／5％CO2条件下で95％コンフルエントに達するまで培養した。
その後、剥離剤を用いて細胞を剥離回収し、PBS(-)による洗浄の後、DMEM/F12に20 μg/mlの還元型グルタチオンを加えた継代培養用無血清培地に懸濁してTフラスコに播種して、37℃／5％CO2条件下で培養した。この継代作業を繰り返し、1x108個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を得た。
細胞培養にはCESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用した。1本のBelloCell-500ディスポーザブル培養ボトルには、900個のBioNOC IIマトリックスが入っていた。ボトルの容量は500ｍｌ(口径39mm、高さ137mm、底92mm)であった。1ボトル内のマトリックス全ての表面積は15,600cm2であった。ボトル内に1x107個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を入れた。BelloCellシステムの機器内エレベーターの昇降により、BelloCellボトル内の培地の水位が上下し、これにより細胞へのエアレーションと栄養供給、代謝産物（CO2）の排出が行われ、ボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養が行われた。その後PBS(-)を加えて洗浄した。
PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液は、トリプシン-EDTA及びカゼイナーゼの混合液であった。混合割合は、トリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝２：１(T2D1)であった。ボトル内の液量は90 mlであった。
その後、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。即ち、酵素処理を行った細胞が入っているBelloCellボトルをボルテックスミキサー装置のゴム製の台座の上に載置し、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行った。その後ボトルを手動にて鉛直方向に緩やかに振り、再度、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離された1x108個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収した。
ヒト脂肪組織由来間葉系細胞が剥離後のマトリックスを染色して写真撮影した。染色は、4％ パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、5mg/ml クリスタルバイオレットで染色し、余剰分のクリスタルバイオレットを洗浄後、乾燥させ、2％ SDS溶液によりクリスタルバイオレットを溶出し、その後に撮影した。結果を図1に示す。なお、細胞の生存率は９７．６％であった。
剥離された多量のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を細胞懸濁液の状況で、20μm（細胞径より大きい、かつ、異物破片より小さい）のフィルタに通し、50 ml遠心管4本へ細胞懸濁液を回収した。
遠心管内の細胞懸濁液と等量の培地を加え、400ｇ 5min、4℃の条件で遠心し、細胞ペレットの状態にするため、上清を破棄した。
20 mlの培地にヒト脂肪組織由来間葉系細胞を懸濁・浮遊させた。
50 mlの遠心管内にて、比重1.20（なおヒト脂肪組織由来間葉系細胞の比重は1.075、異物破片の比重は1.36）のショ糖溶液の上に、細胞懸濁液を静かに加える事で、重層化した。
その状態で、400ｇ 10min 4℃の条件で遠心し、比重の重い異物破片はショ糖溶液内、かつ遠心管の最下部へ沈殿し、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞はショ糖溶液より上層に細胞層を形成した。
細胞層のみを50 ml遠心管に回収し、等量以上の培地を加え、400ｇ 5min、4℃の条件で遠心し、細胞ペレットの状態にしたのち、必要量の培地や生理食塩水に再懸濁し、細胞懸濁液を作製した。
次に、比較例として、上記と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。上記の酵素処理も振動処理も行わずにマトリックスをクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した。結果を図２に示す。本実施例にかかる培養細胞回収方法によれば、効率的に細胞回収が可能であることが示された。
（２）実施例２
実施例２では、酵素処理工程で使用する酵素溶液について検討した。
実施例２では、酵素処理工程で使用する酵素溶液について検討した。
実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。
PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液は、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液であった。混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)であった。
その後、実施例１と同様に、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図３(A)）。なお、細胞の生存率は９８．５％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ＝２：１(T2C1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図３(B)）。なお、細胞の生存率は９６．９％であった。
酵素処理工程で、混合割合がコラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１(C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図３(C)）。なお、細胞の生存率は９３．２％であった。
比較例として、実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄し、酵素処理も振動処理も行わずにマトリックスをクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図３(D)）。
次に図４に、成分が異なる酵素溶液の場合における細胞回収率の比較を示す。図４では、酵素溶液T2C1D1の場合の細胞回収を100とした場合の相対値で示す。
実施例１及び実施例２の結果から、酵素処理に使用する酵素溶液は、トリプシン-EDTAと、カゼイナーゼ及び／又はコラゲナーゼと、を包含する必要があり、トリプシン-EDTAとコラゲナーゼとカゼイナーゼとを含む酵素溶液である場合は更に効率的に回収可能であることが示された。
（３）実施例３
実施例３では、通常の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
実施例３では、通常の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。
PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２(T2C2D2)であった。
その後、実施例１と同様に、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図５(A)）。細胞の生存率は９５．４％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(B)）。なお、この混合割合は実施例２の図３(A)で示したものと同一である。細胞の生存率は９４．８％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５：２：２(T0.5C2D2)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(C)）。細胞の生存率は９６．２％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１(T1C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(D)）。細胞の生存率は９３．１％であった。
なお参考例として、振動処理工程をピペッティングにて行った。即ち、実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２(T2C2D2)であった。その後パスツールピペットにてピペッティングにより振動処理を行った。PBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図６(A)）。細胞の生存率は９９．１％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(B)）。細胞の生存率は９５．３％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５：２：２(T0.5C2D2)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(C)）。細胞の生存率は８５．５％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１(T1C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(D)）。細胞の生存率は９０．５％であった。
次に図７は、振動処理工程をボルテックスミキサー装置で行う場合とピペッティングで行う場合とにおいて、細胞回収率の比較を示す。図７では、酵素溶液T2C1D1の場合でボルテックスミキサー装置を使用する場合の細胞回収を100とした場合の相対値で示す。
実施例３の結果から、通常の培養期間の場合において、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１の酵素溶液を使用した場合が細胞回収率において最も優れていることが示された。
（４）実施例４
実施例４では、長期の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
実施例４では、長期の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
細胞は、Lonza社から購入したヒト脂肪組織由来間葉系細胞を使用した。培養はボトル型の培養ボトル内にて行われた。ボトルの容量は1500ｍｌ(口径100mm、高さ210mm、底110mm)であった。培養ボトル内には、培養液及び高分子素材の不織布から形成されたマトリックスが充填され、そのマトリックスにヒト脂肪組織由来間葉系細胞が播種された。細胞へのエアレーションと栄養供給、代謝産物（CO２）の排出が行われ、細胞を播種後２５日間の細胞培養が行われた。その後PBS(-)を加えて洗浄した。
PBS(-)を回収し、酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：４(T2C4D4)であった。
その後、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、30 sec底面)を使用して振動処理を行った。即ち、酵素処理を行った細胞が入っている培養ボトルをボルテックスミキサー装置のゴム製の台座の上に載置し、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行った。その後ボトルを手動にて鉛直方向に緩やかに振り、再度、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、30 sec底面)を使用して振動処理を行った。
次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、クリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(A)）。細胞の生存率は９６．３％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：４(T2C1D4)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(B)）。細胞の生存率は９７．２％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：１(T2C4D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(C)）。細胞の生存率は９７．７％であった。
酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(D)）。細胞の生存率は９６．０％であった。
なお、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞を、培養液及び高分子素材の不織布から形成されたマトリックスが充填された培養ボトル内に播種し、播種後２５日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄し、酵素処理を行わない段階を比較例として写真撮影した（図８(E)）。図８(E)を参照するにマトリックスには多数のヒト脂肪組織由来間葉系細胞が付着していた。図８(A)を参照するにマトリックスにはヒト脂肪組織由来間葉系細胞はほとんど付着していなかった。図８(A)、図８(B)、図８(C)、図８(D)の順番にマトリックスに付着しているヒト脂肪組織由来間葉系細胞の数は多いものであった。図９には酵素溶液の混合割合がT2C4D4、T2C1D4、T2C4D1、T2C1D1の場合における回収された細胞数を示す。図９に示されるように、T2C4D4、T2C1D4、T2C4D1、T2C1D1の順番に回収された細胞数は多いものであった。この実験結果から細胞の培養期間が長い場合、酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：４(T2C4D4)の酵素溶液を使用した場合、最も細胞の回収率が優れることが判明した。
大量培養した細胞の足場からの回収に利用できる。
Claims (8)
- 培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する培養工程と、
前記培養容器に、トリプシン−ＥＤＴＡと、コラゲナーゼと、カゼイナーゼと、を有する酵素溶液を添加して、前記培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、
水平面内を円運動する台座と前記酵素溶液が添加された培養容器の底面とを面接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行い、培養された細胞を前記３次元多孔性足場から剥離する振動処理工程と、を有し、
前記酵素処理工程における酵素の溶液の比率は、トリプシン−ＥＤＴＡ：コラゲナーゼ：カゼイナーゼが０．２５〜２．０ｍｇ／ｍＬ：１〜６ｍｇ／ｍＬ：３．３３〜２０ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法。 - 前記培養工程における細胞の培養期間が５日〜１４日の場合、前記酵素処理工程における酵素の溶液の比率は、トリプシン−ＥＤＴＡ：コラゲナーゼ：カゼイナーゼが０．２５〜１．０ｍｇ／ｍＬ：１〜２ｍｇ／ｍＬ：３．３３〜６．６６ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞回収方法。
- 前記培養工程における細胞の培養期間が１５日〜３０日の場合、前記酵素処理工程における酵素の溶液の比率は、トリプシン−ＥＤＴＡ：コラゲナーゼ：カゼイナーゼが１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬ：１〜６ｍｇ／ｍＬ：６．６６〜２０ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞回収方法。
- 前記培養容器は底部の外底面が平坦状であることを特徴とする請求項３又は４に記載の培養細胞回収方法。
- 前記台座の水平面内の円運動は周波数２０〜１００Ｈｚであることを特徴とする請求項３乃至５の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
- 前記細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は体性幹細胞である請求項３乃至６の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
- 前記３次元多孔性足場は、平均間隙率８０％以上且つ平均ポアサイズ１０〜８００μｍであることを特徴とする請求項３乃至７の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
- 前記３次元多孔性足場の培養面積は８００〜９０００００ｃｍ２であることを特徴とする請求項３乃至８の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
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